JP2008512121A - Compositions and methods for diagnosis and treatment of tumors - Google Patents

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ベリンダ ケーンズ，
ルイファン チェン，
アナン チュンタラパイ，
グレッチェン フランツ，
ケネス ヒラン，
カートムト ケッペン，
ヘイディ フィリップス，
ポール ポラキス，
チャエ ジャネカ リード，
チエ サカナカ，
ビクトリア スミス，
スーザン スペンサー，
ピー． ミッキー ウィリアムス，
トーマス ウー，
ツオーミン チャン，
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Abstract

本発明は、哺乳動物における腫瘍の診断および治療で有用な組成物、およびそのために該組成物を用いる方法に関する。１以上のタイプの正常な非−癌細胞によるか、またはその表面におけると比較して１以上のタイプの癌細胞による、またはその表面でより大きな程度発現される種々の細胞ポリペプチド（およびそれらをコードする核酸またはその断片）を同定が記載される。本発明の１つの具体例において、本発明は、腫瘍−関連抗原性標的ポリペプチドまたはその断片（「ＴＡＴ」ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を提供する。The present invention relates to compositions useful in the diagnosis and treatment of tumors in mammals and methods of using the compositions therefor. Various cellular polypeptides (and theirs) that are expressed to a greater extent by or on one or more types of cancer cells compared to or on the surface of one or more types of normal non-cancer cells. Identification of the encoding nucleic acid or fragment thereof is described. In one embodiment of the invention, the invention provides an isolated nucleic acid molecule having a nucleotide sequence encoding a tumor-associated antigenic target polypeptide or fragment thereof (“TAT” polypeptide).

Description

（関連出願）
本願は、一部継続出願であり、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２０の下で２００２年６月１９日に出願された米国特許出願第１０／１７７，４８８号に対する優先権を主張する。この米国特許出願第１０／１７７，４８８号は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２００１年６月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／２９９，５００号、２００１年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／３０１，８８０号、および２００１年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／３２３，２６８号に対する優先権を主張する。これらの開示は、本明細書中に参考として援用される。 (Related application)
This application is a continuation-in-part application. S. C. Claims priority to US patent application Ser. No. 10 / 177,488, filed Jun. 19, 2002 under §120. This US patent application Ser. No. 10 / 177,488 is disclosed in US Pat. S. C. Under §119 (e), US Provisional Patent Application No. 60 / 299,500 filed June 20, 2001, US Provisional Patent Application No. 60/301, filed June 29, 2001, Claims priority to 880, and US Provisional Patent Application No. 60 / 323,268, filed Sep. 18, 2001. These disclosures are incorporated herein by reference.

（発明の分野）
本発明は、哺乳動物における腫瘍の診断および治療で有用な組成物、およびそのために該組成物を用いる方法に向けられる。 (Field of Invention)
The present invention is directed to compositions useful in the diagnosis and treatment of tumors in mammals, and methods of using the compositions therefor.

悪性腫瘍（癌）は心臓病の後に合衆国における死亡の第二の主な原因である（Ｂｏｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＣＡ Ｃａｎｃｅｌ Ｊ． Ｃｌｉｎ． ４３：７（１９９３））。癌は増殖して腫瘍塊を形成する正常な組織に由来する異常なまたは新形成細胞の数の増加、これらの新形成腫瘍細胞による隣接組織への侵入、および血液またはリンパ系を介して地域的リンパ節へ、および転移と呼ばれるプロセスを介して離れた部位へ結局は拡大する悪性細胞の発生によって特徴付けられる。癌状態においては、細胞は、正常な細胞が成長しないであろう条件下で増殖する。癌は、異なる程度の侵入性および攻撃性によって特徴付けられる広く種々の形態で自己を発現する。   Malignant tumors (cancers) are the second leading cause of death in the United States after heart disease (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43: 7 (1993)). Cancer grows and increases the number of abnormal or neoplastic cells from normal tissues that form a tumor mass, invasion of adjacent tissues by these newly formed tumor cells, and regional through the blood or lymphatic system Characterized by the development of malignant cells that eventually spread to the lymph nodes and to distant sites through a process called metastasis. In a cancerous state, the cells proliferate under conditions in which normal cells will not grow. Cancer expresses itself in a wide variety of forms characterized by different degrees of invasiveness and aggressiveness.

癌の診断および治療用の効果的な細胞標的を発見する試みにおいて、研究者は、１以上の正常な非−癌細胞と比較して、１以上の特定タイプの癌細胞の表面に特異的に発現される膜貫通またはそうでなければ会合ポリペプチドを同定しようと求めてきた。しばしば、そのような膜−会合ポリペプチドは、非−癌細胞の表面と比較して、癌細胞の表面でより豊富に発現される。そのような腫瘍−関連細胞表面抗原ポリペプチドの同定は抗体−ベースの療法を介して破壊のために癌細胞を特異的に標的とする能力を生起させてきた。この点に関し、抗体−ベースの療法は、ある種の癌の治療で非常に有効なことが判明していることを注記する。例えば、（共にＧｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ製の）ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）は、各々乳癌および非−ホジキンリンパ腫を治療するのに成功して用いられてきた抗体である。より具体的には、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）はヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）プロト−オンコジーンの細胞外ドメインに選択的に結合する組換えＤＮＡ−由来ヒト化モノクローナル抗体である。ＨＥＲ２蛋白質の過剰発現は、原発性乳癌の２５ないし３０％で観察される。ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）は正常および悪性Ｂリンパ球の表面に見出されるＣＤ２０抗原に対して向けられた遺伝子工学により作成されたキメラネズミ／ヒトモノクローナル抗体である。これらの抗体は共にＣＨＯ細胞において組換えにより生産される。   In an attempt to find an effective cellular target for cancer diagnosis and therapy, researchers specifically target the surface of one or more specific types of cancer cells as compared to one or more normal non-cancer cells. There has been a desire to identify transmembrane or otherwise associated polypeptides that are expressed. Often, such membrane-associated polypeptides are more abundantly expressed on the surface of cancer cells compared to the surface of non-cancer cells. The identification of such tumor-associated cell surface antigen polypeptides has generated the ability to specifically target cancer cells for destruction via antibody-based therapy. In this regard, it is noted that antibody-based therapies have proven very effective in the treatment of certain cancers. For example, HERCEPTIN® and RITUXAN® (both from Genentech Inc., South San Francisco, California) are antibodies that have been used successfully to treat breast cancer and non-Hodgkin lymphoma, respectively. is there. More specifically, HERCEPTIN® is a recombinant DNA-derived humanized monoclonal antibody that selectively binds to the extracellular domain of human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) proto-oncogene. Overexpression of HER2 protein is observed in 25-30% of primary breast cancers. RITUXAN® is a chimeric murine / human monoclonal antibody engineered against the CD20 antigen found on the surface of normal and malignant B lymphocytes. Both of these antibodies are produced recombinantly in CHO cells.

癌の診断および治療用の有効な細胞標的を発見するための他の試みにおいて、研究者は、（１）１以上の特定のタイプの非−癌性正常細胞によるのと比較して、１以上の特定のタイプの癌細胞によって特異的に生産される非−膜−会合ポリペプチド、（２）１以上の正常な非−癌細胞のそれよりもかなり高い発現レベルにて癌細胞によって生産されるポリペプチド、または（３）その発現が、癌および（例えば、正常な前立腺および前立腺腫瘍組織）の双方において単一の（または非常に限定された数の異なる）組織タイプのみに特異的に制限されるポリペプチドを同定するのを求めてきた。そのようなポリペプチドは細胞内に位置したままであり得、あるいは癌細胞によって分泌され得る。さらに、そのようなポリペプチドは、癌細胞に対して増強または成長を高める効果を有するポリペプチドを生産しおよび／または分泌する細胞によるよりはむしろ、癌細胞それ自体によって発現されないであろう。そのような分泌されたポリペプチドはしばしば、正常な細胞よりは成長利点を持つ癌細胞を供する蛋白質であり、例えば、脈管形成因子、細胞接着因子、増殖因子等のようなものを含む。そのような非−膜会合ポリペプチドのアンタゴニストの同定がそのような癌の治療用の有効な治療剤として働くことが予測されよう。さらに、そのようなポリペプチドの発現パターンの同定は、哺乳動物における特定の癌の診断および治療で有用であろう。   In other attempts to find effective cellular targets for cancer diagnosis and therapy, researchers have (1) one or more compared to one or more specific types of non-cancerous normal cells. A non-membrane-associated polypeptide that is specifically produced by certain types of cancer cells, (2) produced by cancer cells at a significantly higher expression level than that of one or more normal non-cancer cells A polypeptide, or (3) its expression is specifically restricted to only a single (or very limited number of different) tissue types in both cancer and (eg, normal prostate and prostate tumor tissue) Have been asked to identify polypeptides that Such polypeptides can remain in the cell or can be secreted by cancer cells. Furthermore, such polypeptides will not be expressed by the cancer cells themselves, rather than by cells that produce and / or secrete polypeptides that have an effect of enhancing or growing on cancer cells. Such secreted polypeptides are often proteins that provide cancer cells with growth advantages over normal cells, including, for example, angiogenic factors, cell adhesion factors, growth factors, and the like. It would be expected that identification of antagonists of such non-membrane associated polypeptides would serve as effective therapeutic agents for the treatment of such cancers. Furthermore, identification of such polypeptide expression patterns would be useful in the diagnosis and treatment of specific cancers in mammals.

哺乳動物における遺伝子発現を変調する能力は依然として困難である。伝統的には、それは、宿主が欠如するポリペプチドを発現するであろうウイルスベクターのようなツールを用いてなされてきた。ウイルスベクターを遺伝子発現を低下させるであろう宿主に導入する能力は完成されていない。遺伝子発現の抑制は、伝統的には、「ノックアウト」様式で哺乳動物においてなされており、そこでは、テスト哺乳動物、通常はマウスは相同組換えの技術を介して切除され、「ノックアウトされた」遺伝子を有する。マウスにおけるこの技術は、ヒトにおいては遅く、煩わしくかつ困難であって、非現実的である。従って、出願人らは、干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現して、遺伝子発現を低下させるであろうベクター系に目を転じた。   The ability to modulate gene expression in mammals remains difficult. Traditionally, it has been done using tools such as viral vectors that will express a polypeptide that the host lacks. The ability to introduce viral vectors into a host that would reduce gene expression is not complete. Suppression of gene expression has traditionally been done in mammals in a “knock-out” fashion, where the test mammal, usually a mouse, has been excised and “knocked out” via homologous recombination techniques. Have a gene. This technique in mice is slow, cumbersome and difficult in humans and unrealistic. Therefore, Applicants turned to a vector system that would express interfering RNA (siRNA) and reduce gene expression.

ｓｉＲＮＡは、小分子または抗体のような伝統的なアンタゴニストが失敗した遺伝子発現を変調する研究でのツールとして有用なことが判明した。（非特許文献１）。長さが２１ないし２３ヌクレオチドであるイン・ビトロで合成された二本鎖ＲＮＡは干渉性ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）として作用することができ、特異的に遺伝子発現を阻害することができる（非特許文献２）。これらのｉＲＮＡは、それらの標的ＲＮＡの分解を媒介することによって作用する。それらは長さが３０ヌクレオチド未満であるが、それらは細胞の抗ウイルス防御メカニズムをトリガーしない。そのようなメカニズムはインターフェロンの生産、および宿主細胞蛋白質合成の一般的な遮断を含む。現実的には、ｓｉＲＮＡを合成し、次いで、ＤＮＡベクターにクローン化することができる。そのようなベクターをトランスフェクトし、高いレベルにて、および／または組織特異的にｓｉＲＮＡを発現するようにすることができる。ｓｉＲＮＡ発現の高いレベルを用いて、細胞で生産される蛋白質の量を「ノックダウンし」または有意に低下させ、かくして、それは、蛋白質の過剰発現が癌のような障害にリンクすると考えられている実験で有用である。哺乳動物癌療法の進歩にかかわらず、遺伝子発現の低下を介して新形成細胞増殖を効果的に阻害することができる治療剤に対して大きな要望が存在する。従って、本発明の目的は、遺伝子発現を変調するシステムを同定することにある。   siRNA has proved useful as a tool in studies to modulate gene expression where traditional antagonists such as small molecules or antibodies have failed. (Non-Patent Document 1). Double-stranded RNA synthesized in vitro having a length of 21 to 23 nucleotides can act as an interfering RNA (iRNA) and can specifically inhibit gene expression (Non-patent Document 2). ). These iRNAs act by mediating the degradation of their target RNA. Although they are less than 30 nucleotides in length, they do not trigger cellular antiviral defense mechanisms. Such mechanisms include interferon production and general blockade of host cell protein synthesis. In practice, siRNA can be synthesized and then cloned into a DNA vector. Such vectors can be transfected to express siRNA at high levels and / or tissue-specifically. It is believed that high levels of siRNA expression are used to “knock down” or significantly reduce the amount of protein produced in the cell, thus, protein overexpression is linked to disorders such as cancer. Useful in experiments. Despite advances in mammalian cancer therapy, there is a great need for therapeutic agents that can effectively inhibit neoplastic cell proliferation through reduced gene expression. Accordingly, it is an object of the present invention to identify systems that modulate gene expression.

イン・ビボおよびイン・ビトロ双方において、薬物および他の細胞、組織および腫瘍を標的として、最大効率および最小毒性を達成する薬物および他の剤の送達の改良は長年の間、かなりの研究の焦点であった。生物学的に活性な分子を細胞に輸入するための効果的な方法を開発するために多くの試みがなされてきたが、完全に満足ができることが判明したものは無い。薬物の、例えば、隣接する細胞への細胞間再分布を最小としつつ、薬物とその細胞内標的との会合を最適化することは、しばしば、困難であるかまたは不十分である。   Improvements in the delivery of drugs and other agents that target drugs and other cells, tissues, and tumors to achieve maximum efficiency and minimum toxicity, both in vivo and in vitro, have been a significant research focus for many years Met. Many attempts have been made to develop effective methods for importing biologically active molecules into cells, but none have been found to be completely satisfactory. It is often difficult or insufficient to optimize the association of a drug with its intracellular target while minimizing intercellular redistribution of the drug to, for example, adjacent cells.

現在患者に非経口投与されるほとんどの剤は標的化されておらず、その結果、それが不必要であり、しばしば望ましくない身体の細胞および組織への剤の全身送達が行われる。この結果、有害な薬物副作用がもたらされかねず、しばしば、投与できる薬物（例えば、化学療法剤（抗癌）、細胞傷害性の酵素阻害剤および抗ウイルスまたは抗微生物薬物）の用量を制限する。比較により、薬物の経口投与は便宜かつ経済的な投与形態と考えられるが、一旦薬物が全身循環系に吸収されると、それは冒されていない細胞に対して非−特異的毒性の同一の関心を有する。更に複雑なことは、経口生物学的利用性および薬物への腸のさらなる暴露および、よって腸毒性の危険性に導く腸における薬物の滞留に関する問題を含む。従って、主な目標は、剤を特異的に細胞および組織に対して標的化するための方法を開発するものであった。そのような治療の利点は、そのような剤の感染していない細胞のような他の細胞および組織への不適切な送達の一般的な生理学的効果を回避することを含む。細胞内標的化は、細胞内での生物学的に活性な剤、すなわち、活性な代謝産物の蓄積または滞留を可能とする方法、化合物および処方によって達成することができる。   Most agents currently administered parenterally to patients are not targeted, which results in their unnecessary and often undesired systemic delivery of the agent to cells and tissues of the body. This can result in adverse drug side effects and often limits the dose of drugs that can be administered (eg, chemotherapeutic agents (anticancer), cytotoxic enzyme inhibitors and antiviral or antimicrobial drugs) . By comparison, oral administration of a drug is considered a convenient and economical mode of administration, but once the drug is absorbed into the systemic circulatory system, it has the same interest of non-specific toxicity to unaffected cells. Have Further complications include problems with oral bioavailability and drug retention in the intestine leading to further intestinal exposure to the drug and thus risk of enterotoxicity. Thus, the main goal was to develop a method for targeting agents specifically to cells and tissues. The benefits of such treatment include avoiding the general physiological effects of inadequate delivery of such agents to other cells and tissues, such as uninfected cells. Intracellular targeting can be achieved by methods, compounds and formulations that allow the accumulation or retention of biologically active agents, ie active metabolites, in the cell.

モノクローナル抗体療法が、癌、免疫学的および脈管形成障害を持つ患者の標的化治療のために確立されている。   Monoclonal antibody therapy has been established for targeted treatment of patients with cancer, immunological and angiogenic disorders.

種々の入手可能な有用なトキシンがある。例えば、アウリスタチンペプチド、アウリスタチンＥ（ＡＥ）およびモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）、ドラスタチンの合成アナログは（ｉ）（癌腫上のＬｅｗｉｓ Ｙに特異的な）キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６；（ｉｉ）血液学的悪性疾患でのＣＤ３０に対して特異的なｃＡＣ１０（非特許文献３；非特許文献４；“Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ Ｌｉｇａｎｄｓ”；非特許文献５；ＵＳ ２００４／００１８１９４）；（ｉｉｉ）ＣＤ２０−発現癌および免疫障害の治療のためのリツキサン（ＷＯ０４／０３２８２８）のような抗−ＣＤ２０抗体；（ｉｖ）結直腸癌の治療のための抗−ＥｐｈＢ２抗体２Ｈ９および抗−ＩＬ−８（非特許文献６）；（ｖ）Ｅ−セレクチン抗体（非特許文献７）；および（ｖｉ）他の抗−ＣＤ３０抗体（ＷＯ０３／０４３５８３）に結合体化されたモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）は２Ｈ９、マウスおよびヒトの間で密接な相同性がある１型ＴＭチロシンキナーゼ受容体であって、結直腸癌細胞で過剰発現されるＥｐｈＢ２Ｒに対しても結合体化された（非特許文献６）。   There are a variety of useful toxins available. For example, auristatin peptide, auristatin E (AE) and monomethyl auristatin (MMAE), a synthetic analog of dolastatin is (i) a chimeric monoclonal antibody cBR96 (specific for Lewis Y on carcinoma); (ii) hematology CAC10 specific for CD30 in malignant disease (Non-patent document 3; Non-patent document 4; “Monomethylvalent Compounds Capable of Conjugation to Ligands”; Non-patent document 5; US 2004/0018194); (iii) CD20-expression Anti-CD20 antibodies such as Rituxan (WO 04/032828) for the treatment of cancer and immune disorders; (iv) anti-EphB2 antibody 2H9 and anti-IL-8 for the treatment of colorectal cancer (non-patent literature) 6); (v) E-selectin antibody (Non-Patent Document 7); and (vi) Monomethyl auristatin (MMAE) conjugated to other anti-CD30 antibodies (WO03 / 043583) is 2H9, mouse and human. Is a type 1 TM tyrosine kinase receptor that is closely homologous to EphB2R that is overexpressed in colorectal cancer cells (Non-patent Document 6).

モノメチルアウリスタチンＭＭＡＦ、Ｃ−末端においてフェニルアラニンを持つアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の変種（特許文献１；特許文献２）は、ＭＭＡＥよりも優れていないが、モノクローナル抗体に結合体化した場合にはより優れていると報告されている（非特許文献８）。アウリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）；ＭＭＡＥのフェニルアラニン変種は、フェニレンジアミンスペーサーを介して１Ｆ６のＣ−末端を介して抗−ＣＤ７０ ｍＡＢ、１Ｆ６に連結された（非特許文献９）。   Monomethyl auristatin MMAF, a variant of auristatin E (MMAE) with phenylalanine at the C-terminus (Patent Document 1; Patent Document 2) is not superior to MMAE, but more when conjugated to a monoclonal antibody It is reported to be excellent (Non-patent Document 8). Auristatin F phenylenediamine (AFP); a phenylalanine variant of MMAE was linked to anti-CD70 mAB, 1F6 via the C-terminus of 1F6 via a phenylenediamine spacer (9).

哺乳動物癌療法における前記で確認された進歩にもかかわらず、各々、哺乳動物において腫瘍の存在を検出することができるさらなる診断および治療剤に対する、および新形成細胞増殖を効果的に阻害することに対する大きな要求が存在する。従って、本発明の目的は；（１）正常な細胞、または他の異なる癌と比較して、１以上のタイプの癌細胞でより豊富に発現される細胞膜−会合ポリペプチド、（２）１以上の特定のタイプの非−癌性正常細胞によるのと比較して１以上の特定のタイプの癌細胞によって（または癌細胞の成長に対して増強効果を有するプリペプチドを生産する他の細胞によって）特異的に生産される非−膜−会合ポリペプチド、（３）１以上の正常な非−癌細胞のそれよりも有意に高い発現レベルで癌細胞によって生産される非−膜−会合ポリペプチド、または（４）その発現が、癌および非−癌双方の状態（例えば、正常な前立腺および前立腺腫瘍組織）において単一の（または非常に限定された数の異なる）組織タイプのみに特異的に限定されるポリペプチドを同定し、それらのポリペプチドおよびそれらをコードする核酸を用い、哺乳動物における癌の治療的処置および診断検出で有用な組成物を生産することにある。また、本発明の目的は、その発現が単一または非常に限定された数の組織に制限される細胞膜−会合分泌または細胞内ポリペプチドを同定し、それらのポリペプチド、およびそれらをコードする核酸を用い、哺乳動物における癌の治療的処置および診断検出で有用な組成物を生産することにある。
米国特許第５，７６７，２３７号明細書 米国特許第６，１２４，４３１号明細書 Ｓｈｉ Ｙ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００３），１９（１）：９−１２ Ｆｉｒｅ Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９），３９１；８０６−８１０ Ｋｌｕｓｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４），１５（４）：７６５−７７３ Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００３），２１（７）：７７８−７８４ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（２００３）．１０２（４）：１４５８−１４６５ Ｍａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００４），６４（３）：７８１−７８８ Ｂｈａｓｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００３）６３：６３８７−６３９４ Ｓｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４年３月２８日プレゼンテーション，Ｖｏｌｕｍｅ４５ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６２３ Ｌａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４年３月２８日プレゼンテーション、Ｖｏｌｕｍｅ ４５ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６２５ Despite the above-identified advances in mammalian cancer therapy, each against further diagnostic and therapeutic agents that can detect the presence of a tumor in a mammal and against effectively inhibiting neoplastic cell proliferation There is a big demand. Accordingly, the objects of the present invention are: (1) a cell membrane-associated polypeptide that is expressed more abundantly in one or more types of cancer cells compared to normal cells or other different cancers, (2) one or more By one or more specific types of cancer cells as compared to by certain types of non-cancerous normal cells (or by other cells that produce prepeptides that have an enhancing effect on the growth of the cancer cells) A specifically produced non-membrane-associated polypeptide, (3) a non-membrane-associated polypeptide produced by a cancer cell at a level of expression significantly higher than that of one or more normal non-cancer cells; Or (4) its expression is specifically restricted to only a single (or very limited number of different) tissue types in both cancerous and non-cancerous conditions (eg, normal prostate and prostate tumor tissue) Polypep Identified de, using these polypeptides and nucleic acids encoding them, you are to produce a composition useful in the therapeutic treatment and diagnostic detection of cancer in mammals. It is also an object of the present invention to identify cell membrane-associated secreted or intracellular polypeptides whose expression is restricted to a single or very limited number of tissues, and to identify those polypeptides and the nucleic acids that encode them. To produce compositions useful in the therapeutic treatment and diagnostic detection of cancer in mammals.
US Pat. No. 5,767,237 US Pat. No. 6,124,431 Shi Y. , Trends in Genetics (2003), 19 (1): 9-12. Fire A. , Trends in Genetics (1999), 391; 806-810. Klussman, et al. Bioconjugate Chemistry (2004), 15 (4): 765-773 Doronina et al. Nature Biotechnology (2003), 21 (7): 778-784. Francisco et al. Blood (2003). 102 (4): 1458-1465 Mao, et al. Cancer Research (2004), 64 (3): 781-788 Bhaskar et al. , Cancer Res. (2003) 63: 6387-6394 Senter et al. , Proceedings for the American Association for Cancer Research, March 28, 2004 presentation, Volume 45 Abstract Number 623 Law et al. , Proceedings of the American Association for Cancer Research, March 28, 2004 Presentation, Volume 45 Abstract Number 625

Ａ．具体例
本明細書中において、出願人らは、１以上のタイプの正常な非−癌細胞によるか、またはその表面におけると比較して１以上のタイプの癌細胞による、またはその表面でより大きな程度発現される種々の細胞ポリペプチド（およびそれらをコードする核酸またはその断片）を同定を初めて記載する。あるいは、そのようなポリペプチドは、癌細胞に対する増強または成長−促進効果を有するポリペプチドを生産し、および／または分泌する細胞によって発現される。またあるいは、そのようなポリペプチドは同一組織タイプの正常な組織細胞と比較して腫瘍細胞によって過剰発現できないが、むしろ、単一または非常に限定された数の組織タイプ（好ましくは、生命に必須ではない組織、例えば、前立腺等）のみの腫瘍細胞および正常細胞双方によって特異的に発現され得る。前記ポリペプチドの全ては本明細書中においては、腫瘍−関連抗原性標的ポリペプチド（Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｔａｒｇｅｔ ｐｏｒｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）（「ＴＡＴ」ポリペプチド）といい、これは、哺乳動物において癌の治療および診断のための有効な標的として働くと予測される。 A. Specific Examples As used herein, Applicants are greater than or at the surface of one or more types of cancer cells as compared to or at the surface of one or more types of normal non-cancer cells. The identification of various cellular polypeptides (and the nucleic acids encoding them or fragments thereof) for the first time is described. Alternatively, such polypeptides are expressed by cells that produce and / or secrete polypeptides that have potentiating or growth-promoting effects on cancer cells. Alternatively, such polypeptides cannot be overexpressed by tumor cells as compared to normal tissue cells of the same tissue type, but rather are a single or a very limited number of tissue types (preferably essential for life) Non-tissue (eg, prostate, etc.) only and can be specifically expressed by both tumor cells and normal cells. All of these polypeptides are referred to herein as Tumor-associated Antigen Target Target Peptides (“TAT” polypeptides), which is used to treat and diagnose cancer in mammals. Is expected to serve as an effective target for.

従って、本発明の１つの具体例において、本発明は、腫瘍−関連抗原性標的ポリペプチドまたはその断片（「ＴＡＴ」ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を提供する。   Accordingly, in one embodiment of the invention, the invention provides an isolated nucleic acid molecule having a nucleotide sequence encoding a tumor-associated antigenic target polypeptide or fragment thereof (“TAT” polypeptide).

ある態様において、単離された核酸分子は、（ａ）本明細書中に開示されたアミノ酸配列を有する全長ＴＡＴポリペプチド、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを含むまたは含まない膜貫通ＴＡＴポリペプチドの細胞の細胞外ドメインまたは本明細書中に開示された全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列のいずれかの他の具体的に規定された断片をコードするＤＮＡ分子、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に対して少なくとも約８０％核酸配列同一性、別法として少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。   In some embodiments, an isolated nucleic acid molecule comprises (a) a full-length TAT polypeptide having an amino acid sequence disclosed herein, a TAT polypeptide amino acid sequence lacking a signal peptide disclosed herein, The cellular extracellular domain of a transmembrane TAT polypeptide with or without a signal peptide disclosed herein or any other specific of any of the full-length TAT polypeptide amino acid sequences disclosed herein A DNA molecule encoding a defined fragment, or (b) at least about 80% nucleic acid sequence identity to the complement of the DNA molecule of (a), alternatively at least about 81%, 82%, 83%, 84 %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 Or a nucleotide sequence having 100% nucleic acid sequence identity.

他の態様において、単離された核酸分子は、（ａ）本明細書中で開示された全長ＴＡＴポリペプチドｃＤＮＡのコーディング配列、本明細書中で開示されたシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドのコーディング配列、本明細書中で開示されたシグナルペプチドを含むまたは含まない膜貫通ＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメインのコーディング配列、または本明細書中で開示された全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列のいずれかの他の具体的に定義された断片のコーディング配列を含むＤＮＡ分子、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、別法として、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。   In other embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises (a) a coding sequence for a full-length TAT polypeptide cDNA disclosed herein, a coding for a TAT polypeptide that lacks a signal peptide disclosed herein. Other than any of the sequences, coding sequences for the extracellular domain of the transmembrane TAT polypeptide with or without the signal peptide disclosed herein, or the full-length TAT polypeptide amino acid sequence disclosed herein At least about 80% nucleic acid sequence identity to a DNA molecule comprising the coding sequence of a specifically defined fragment of, or the complement of the DNA molecule of (b) (a), alternatively at least about 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 4%, 95%, 96%, 97%, 98%, comprising a nucleotide sequence having 99% or 100% nucleic acid sequence identity.

さらなる態様において、本発明は、（ａ）本明細書中に開示されたＡＴＣＣに寄託されたヒト蛋白質ｃＤＮＡのいずれかの全長コーディング領域によってコードされた同一の成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に対して、少なくとも約８０％核酸配列同一性、別法として、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％核酸配列同一性を
有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。 In a further aspect, the invention provides: (a) a DNA molecule that encodes the same mature polypeptide encoded by the full-length coding region of any of the human protein cDNAs deposited with the ATCC disclosed herein, or (B) at least about 80% nucleic acid sequence identity to the complement of the DNA molecule of (a); alternatively, at least about 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87 %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleic acid sequence identity
It relates to an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence having.

本発明のもう１つの態様は、膜貫通ドメイン−欠失または膜貫通ドメイン−不活化されたＴＡＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供し、あるいはそのようなコーディングヌクレオチド配列に相補的であり、ここに、そのようなポリペプチドの膜貫通ドメインは本明細書中で開示する。従って、ここに記載されたＴＡＴポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考えられる。   Another aspect of the invention provides an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a transmembrane domain-deleted or transmembrane domain-inactivated TAT polypeptide, or such a coding nucleotide. Complementary to the sequence, where the transmembrane domain of such a polypeptide is disclosed herein. Thus, the soluble extracellular domain of the TAT polypeptides described herein is contemplated.

他の態様において、本発明は、（ａ）本明細書中に開示された全長アミノ酸配列を有するＴＡＴポリペプチド、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを含むまたは含まない膜貫通ＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン、または本明細書中に開示された全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列のいずれかの他の具体的に規定された断片をコードするヌクレオチド配列、あるいは（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする単離された核酸分子に向けられる。この点に関し、本発明の具体例は、例えば、診断プローブ、アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとして有用な、あるいは抗−ＴＡＴポリペプチド抗体、ＴＡＴ結合オリゴヌクレオチド、またはＴＡＴポリペプチドに結合する他の小さな有機分子用の結合部位を含むポリペプチドを所望によりコードしていてもよい全長ＴＡＴポリペプチドのコーディング断片のための、例えば、ハイブリダイゼーションプローブとして用途を見出すことができる。本明細書中に開示された、全長ＴＡＴポリペプチドコーディング配列の断片またはその相補体に向けられる。そのような核酸断片は、通常、長さが少なくとも５ヌクレオチド、別法として、長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００ヌクレオチドであり、ここに、この関係では、用語「約」はその参照される長さの±１０％の参照されたヌクレオチド配列の長さを意味する。ＴＡＴポリペプチド−コーディングヌクレオチド配列の新規な断片は、多数のよく知られた配列整列プログラムのいずれかを用いてＴＡＴポリペプチド−コーディングヌクレオチド配列を他の公知のヌクレオチド配列と整列させ、いずれのＴＡＴポリペプチド−コーディングヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することによって、ルーチン的に決定することができることを注記する。ＴＡＴポリペプチド−コーディングヌクレオチド配列のそのような新規な断片の全てがここで考えられる。また、これらのヌクレオチド分子断片によってコードされるＴＡＴポリペプチド断片、好ましくは、抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、またはＴＡＴに結合する他の小さな有機分子用の結合部位を含むＴＡＴポリペプチド断片も考えられる。   In other embodiments, the invention provides: (a) a TAT polypeptide having the full length amino acid sequence disclosed herein, a TAT polypeptide amino acid sequence lacking the signal peptide disclosed herein, The extracellular domain of a transmembrane TAT polypeptide with or without the signal peptide disclosed therein, or other specifically defined fragment of any of the full-length TAT polypeptide amino acid sequences disclosed herein Or an isolated nucleic acid molecule that hybridizes to the complement of (b) the nucleotide sequence of (a). In this regard, embodiments of the present invention are useful, for example, as diagnostic probes, antisense oligonucleotide probes, or anti-TAT polypeptide antibodies, TAT binding oligonucleotides, or other small organic molecules that bind to TAT polypeptides. Applications may be found, for example, as hybridization probes, for coding fragments of full-length TAT polypeptides that may optionally encode polypeptides containing binding sites for use. It is directed to a fragment of the full-length TAT polypeptide coding sequence disclosed herein or its complement. Such nucleic acid fragments are typically at least 5 nucleotides in length, alternatively, at least about 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 in length. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 , 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240 , 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 44 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940 , 950, 960, 970, 980, 990 or 1000 nucleotides, where in this context the term “about” means the length of the referenced nucleotide sequence ± 10% of its referenced length . A novel fragment of a TAT polypeptide-coding nucleotide sequence can be used to align a TAT polypeptide-coding nucleotide sequence with other known nucleotide sequences using any of a number of well-known sequence alignment programs. Note that it can be routinely determined by determining whether the peptide-coding nucleotide sequence fragment is novel. All such novel fragments of TAT polypeptide-coding nucleotide sequences are contemplated herein. Also, TAT polypeptide fragments encoded by these nucleotide molecule fragments, preferably TAT polypeptide fragments comprising binding sites for anti-TAT antibodies, TAT binding oligopeptides, or other small organic molecules that bind to TAT. Conceivable.

もう１つの具体例において、本発明は、前記にて同定された単離された核酸配列のいずれかによってコードされる単離されたＴＡＴポリペプチドを提供する。   In another embodiment, the present invention provides an isolated TAT polypeptide encoded by any of the isolated nucleic acid sequences identified above.

ある具体例において、本発明は、本明細書中に開示された全長アミノ酸配列を有するＴＡＴポリペプチド、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを含むまたは含まない膜貫通ＴＡＴポリペプチド蛋白質の細胞外ドメイン、本明細書中に開示された核酸配列のいずれかによってコードされるアミノ酸配列、あるいは本明細書中に開示された全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列のいずれかの他の具体的に規定された断片に対して、少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、別法として、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＴＡＴポリペプチドに関する。   In certain embodiments, the invention provides a TAT polypeptide having the full-length amino acid sequence disclosed herein, a TAT polypeptide amino acid sequence lacking the signal peptide disclosed herein, disclosed herein. An extracellular domain of a transmembrane TAT polypeptide protein with or without an encoded signal peptide, an amino acid sequence encoded by any of the nucleic acid sequences disclosed herein, or a full length disclosed herein At least about 80% amino acid sequence identity to any other specifically defined fragment of the TAT polypeptide amino acid sequence, alternatively at least about 81%, 82%, 83%, 84%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 , An isolated TAT polypeptide comprising an amino acid sequence having 99% or 100% amino acid sequence identity.

更なる態様において、本発明は、本明細書中に開示されたＡＴＣＣに寄託されたヒト蛋白質ｃＤＮＡのいずれかによってコードされたアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、別法として、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＴＡＴポリペプチドに関する。   In a further aspect, the invention provides at least about 80% amino acid sequence identity to the amino acid sequence encoded by any of the human protein cDNAs deposited with the ATCC disclosed herein, alternatively, At least about 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, It relates to an isolated TAT polypeptide comprising an amino acid sequence having 97%, 98% or 99% amino acid sequence identity.

特別な態様において、本発明は、Ｎ−末端シグナル配列無しの、および／または開始メチオニン無しの単離されたＴＡＴポリペプチドを提供し、これは、前記したそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。それを生産する方法も本明細書中で記載され、ここに、その方法は、ＴＡＴポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコーディング核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養し、細胞培養からＴＡＴポリペプチドを回収することを含む。   In a particular embodiment, the present invention provides an isolated TAT polypeptide without an N-terminal signal sequence and / or without an initiating methionine, which comprises a nucleotide sequence encoding such an amino acid sequence as described above. Coded by. A method for producing it is also described herein, wherein the method comprises culturing a host cell comprising a vector comprising a suitable coding nucleic acid molecule under conditions suitable for expression of a TAT polypeptide, and cell culture. Recovering the TAT polypeptide from.

本発明のもう１つの態様は、膜貫通ドメイン−欠失、または膜貫通ドメイン−不活化された単離されたＴＡＴポリペプチドを提供する。それを生産する方法も本明細書中に記載され、ここに、その方法は、ＴＡＴポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコーディング核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養し、細胞培養からＴＡＴポリペプチドを回収することを含む。   Another aspect of the invention provides a transmembrane domain-deletion or transmembrane domain-inactivated isolated TAT polypeptide. A method for producing it is also described herein, wherein the method comprises culturing a host cell comprising a vector comprising a suitable coding nucleic acid molecule under conditions suitable for expression of a TAT polypeptide, and cell culture. Recovering the TAT polypeptide from.

本発明の他の具体例において、本発明は、ここに記載されたポリペプチドのいずれかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。いずれかのそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。その例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、または酵母細胞であり得る。ここに記載されたポリペプチドのいずれかを生産する方法がさらに提供され、それは、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養から所望のポリペプチドを回収することを含む。   In other embodiments of the invention, the invention provides a vector comprising DNA encoding any of the polypeptides described herein. A host cell comprising any such vector is also provided. Examples thereof are CHO cells, E. coli. E. coli cells, or yeast cells. Further provided is a method of producing any of the polypeptides described herein, comprising culturing host cells under conditions suitable for expression of the desired polypeptide and recovering the desired polypeptide from the cell culture. including.

他の具体例において、本発明は、異種（非−ＴＡＴ）ポリペプチドに融合した本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドのいずれかを含む単離されたキメラポリペプチドを提供する。そのようなキメラ分子の例は、例えば、エピトープタグ配列または免疫グロブリンのＦｃ領域のような異種ポリペプチドに縮合した本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドのいずれかを含む。   In other embodiments, the invention provides an isolated chimeric polypeptide comprising any of the TAT polypeptides described herein fused to a heterologous (non-TAT) polypeptide. Examples of such chimeric molecules include any of the TAT polypeptides described herein fused to a heterologous polypeptide such as, for example, an epitope tag sequence or an Fc region of an immunoglobulin.

もう１つの具体例において、本発明は、前記したまたは後に記載するポリペプチドのいずれかに好ましくは特異的に結合する抗体を提供する。所望により、抗体は、モノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、単一鎖抗体、あるいはその各抗原性エピトープへの抗−ＴＡＴポリペプチド抗体の結合を競合的に阻害する抗体である。本発明の抗体は、所望により、例えば、メイタンシノイドまたはカリケアミシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素等を含めた、トキシンのような成長阻害剤または細胞傷害性剤に結合体化することができる。本発明の抗体は、所望により、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において生産することができ、好ましくは、それらが結合する細胞の死滅を誘導する。診断目的では、本発明の抗体は、個体支持体に結合して、検出可能に標識することができる。   In another embodiment, the present invention provides an antibody that preferably specifically binds to any of the polypeptides described above or below. Optionally, the antibody is a monoclonal antibody, antibody fragment, chimeric antibody, humanized antibody, single chain antibody, or an antibody that competitively inhibits binding of the anti-TAT polypeptide antibody to its respective antigenic epitope. The antibodies of the invention are optionally conjugated to growth inhibitors or cytotoxic agents such as toxins, including, for example, maytansinoids or calicheamicins, antibiotics, radioisotopes, nucleolytic enzymes, and the like. be able to. The antibodies of the invention can be produced, if desired, in CHO cells or bacterial cells and preferably induce the death of the cells to which they bind. For diagnostic purposes, the antibodies of the invention can be detectably labeled by binding to an individual support.

サイトトキシンに結合体化した抗体を含む本発明のもう１つの具体例において、トキシンは当該分野で知られたトキシンのいずれかから選択することができる。１つの具体例において、トキシンはペプチドまたはペプチドミメティックリンカーによって抗体に連結される。１つの具体例において、トキシンは、バリン−シトルリン（−ｖｃ−）を含むリンカーを介して抗体に連結される。１つの具体例において、トキシンはＭＭＡＥである。１つの具体例において、トキシンはＭＭＡＥである。１つの具体例において、トキシンはアウリスタチンペプチドである。   In another embodiment of the invention comprising an antibody conjugated to a cytotoxin, the toxin can be selected from any of the toxins known in the art. In one embodiment, the toxin is linked to the antibody by a peptide or peptidomimetic linker. In one embodiment, the toxin is linked to the antibody via a linker comprising valine-citrulline (-vc-). In one embodiment, the toxin is MMAE. In one embodiment, the toxin is MMAE. In one embodiment, the toxin is an auristatin peptide.

本発明の他の具体例において、本発明は、本明細書中に記載された抗体のいずれかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。いずれかのそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。その例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、または酵母細胞であり得る。本明細書中で記載された抗体のいずれかを生産する方法もさらに提供され、それは、所望の抗体の発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養から所望の抗体を回収することを含む。   In other embodiments of the invention, the present invention provides vectors comprising DNA encoding any of the antibodies described herein. A host cell comprising any such vector is also provided. Examples thereof are CHO cells, E. coli. E. coli cells, or yeast cells. Also provided is a method of producing any of the antibodies described herein, comprising culturing host cells under conditions suitable for expression of the desired antibody and recovering the desired antibody from the cell culture. including.

もう１つの具体例において、本発明は、前記した、または後に記載するＴＡＴポリペプチドのいずれかに好ましくは特異的に結合するオリゴヌクレオチド（「ＴＡＴ結合オリゴヌクレオチド」）を提供する。所望により、本発明のＴＡＴ結合オリゴヌクレオチドは、例えば、メイタンシノイドまたはカリケアミシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素等を含めた、トキシンのような成長阻害剤または細胞傷害剤に結合体化させることができる。本発明のＴＡＴ結合オリゴヌクレオチドは、所望により、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において生産させることができ、好ましくは、それらが結合する細胞の死滅を誘導する。診断目的では、本発明のＴＡＴ結合オリゴペプチドは、固体支持体に結合して検出可能に標識することができる。   In another embodiment, the present invention provides oligonucleotides (“TAT binding oligonucleotides”) that specifically bind specifically to any of the TAT polypeptides described above or below. Optionally, the TAT binding oligonucleotides of the invention are conjugated to growth inhibitors or cytotoxic agents such as toxins, including, for example, maytansinoids or calicheamicins, antibiotics, radioisotopes, nucleolytic enzymes, etc. It can be made. The TAT-binding oligonucleotides of the invention can be produced in CHO cells or bacterial cells, if desired, and preferably induce the death of the cells to which they bind. For diagnostic purposes, the TAT binding oligopeptides of the invention can be detectably labeled by binding to a solid support.

本発明の他の具体例において、本発明は、本明細書中に記載されたＴＡＴ結合オリゴペプチドのいずれかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。いずれかのそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。その例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、または酵母細胞であってよい。本明細書中に記載されたＴＡＴ結合オリゴペプチドのいずれかを生産する方法がさらに提供され、それは、所望のオリゴペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養から所望のオリゴペプチドを回収することを含む。   In other embodiments of the present invention, the present invention provides vectors comprising DNA encoding any of the TAT binding oligopeptides described herein. A host cell comprising any such vector is also provided. Examples thereof are CHO cells, E. coli. E. coli cells, or yeast cells. Further provided is a method of producing any of the TAT binding oligopeptides described herein, wherein the host cells are cultured under conditions suitable for expression of the desired oligopeptide and the desired oligos are obtained from the cell culture. Recovering the peptide.

もう１つの具体例において、本発明は、前記した、または後に記載するＴＡＴポリペプチドのいずれかに好ましくは特異的に結合する小さな有機分子（「ＴＡＴ結合有機分子」）を提供する。所望により、本発明のＴＡＴ結合有機分子は、例えば、メイタンシノイドまたはカリケアミシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素等を含めた、トキシンのような成長阻害剤または細胞傷害性剤に結合体化させることができる。本発明のＴＡＴ結合有機分子は、好ましくは、それらが結合する細胞の死滅を誘導する。診断目的では本発明のＴＡＴ結合有機分子は検出可能に標識し、固体支持体に結合させ、等できる。   In another embodiment, the present invention provides small organic molecules (“TAT binding organic molecules”) that bind specifically, preferably specifically, to any of the TAT polypeptides described above or below. If desired, the TAT binding organic molecules of the invention bind to growth inhibitors or cytotoxic agents such as toxins, including, for example, maytansinoids or calicheamicins, antibiotics, radioisotopes, nucleolytic enzymes, etc. Can be embodied. The TAT binding organic molecules of the present invention preferably induce killing of the cells to which they bind. For diagnostic purposes, the TAT-binding organic molecules of the invention can be detectably labeled, bound to a solid support, etc.

なお、さらなる具体例において、本発明は、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載されたキメラＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載された抗−ＴＡＴ抗体、本明細書中に記載されたＴＡＴ結合オリゴヌクレオチド、または本明細書中に記載されたＴＡＴ結合有機分子を、キャリアと組み合わせて含む組成物に関する。所望により、キャリアは薬学的に受容可能なキャリアである。   In still further embodiments, the present invention provides a TAT polypeptide described herein, a chimeric TAT polypeptide described herein, an anti-TAT antibody described herein, The present invention relates to a composition comprising a TAT-binding oligonucleotide as described herein or a TAT-binding organic molecule as described herein in combination with a carrier. If desired, the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier.

なおさらなる具体例において、本発明は、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載されたキメラＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載された抗−ＴＡＴ抗体、本明細書中に記載されたＴＡＴ結合オリゴペプチド、本明細書中に記載されたＴＡＴ結合干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＴＡＴ結合有機分子を、キャリアと組み合わせて含む組成物に関する。所望により、キャリアは薬学的に受容可能なキャリアである。具体的には、ＴＡＴポリペプチドは本明細書中においてはＥ１６またはＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ともいうＴＡＴ１８８である。本発明の１つの具体例の（抗−Ｅ１６または抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）とも言う）抗−ＴＡＴ１８８は、限定されるものではないが、本明細書中に記載される３Ｂ５、１２Ｂ９、および１２Ｇ１２を含む。該具体例のｓｉＲＮＡは、本明細書中に記載された（ｓｉＥ１６またはｓｉＴＡＴ１８８（Ｅ１６またはＴＡＴ１８８ ｓｉＲＮＡまたはＥ１６ ｓｉＲＮＡまたはＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ｓｉＲＮＡ）ともいわれる）ｓｉＴＡＴ１８８を含む。   In still further embodiments, the present invention relates to a TAT polypeptide as described herein, a chimeric TAT polypeptide as described herein, an anti-TAT antibody as described herein, It relates to a composition comprising a TAT binding oligopeptide as described herein, a TAT binding interfering RNA (siRNA) or a TAT binding organic molecule as described herein in combination with a carrier. If desired, the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier. Specifically, the TAT polypeptide is TAT188, also referred to herein as E16 or TAT188 (E16). One embodiment of the present invention, anti-TAT188 (also referred to as anti-E16 or anti-TAT188 (E16)), includes, but is not limited to, 3B5, 12B9, and 12G12 described herein. Including. The siRNA of the specific example includes siTAT188 (also referred to herein as siE16 or siTAT188 (also referred to as E16 or TAT188 siRNA or E16 siRNA or TAT188 (E16) siRNA)).

なおもう１つの具体例において、本発明は、容器、および該容器内に含まれる組成物を含む製品に関し、ここに、該組成物は本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載されたキメラＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載された抗−ＴＡＴ抗体、本明細書中に記載されたＴＡＴ結合オリゴヌクレオチドまたは本明細書中に記載されたＴＡＴ結合有機分子を含むことができる。該製品は、さらに、所望により、該容器に付着されたラベル、または該容器内に含まれる添付文書を含むこともでき、これは、腫瘍の治療的処置または診断検出のための組成物の使用に言及する。   In yet another embodiment, the present invention relates to a product comprising a container and a composition contained within the container, wherein the composition comprises a TAT polypeptide as described herein, the present specification. A chimeric TAT polypeptide as described herein, an anti-TAT antibody as described herein, a TAT-binding oligonucleotide as described herein or a TAT-binding organic molecule as described herein. be able to. The product may further optionally include a label attached to the container, or a package insert contained within the container, which may be used for therapeutic treatment or diagnostic detection of a tumor. To mention.

本発明のもう１つの具体例は、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載されたキメラＴＡＴポリペプチド、本明細書中に記載された抗−ＴＡＴポリペプチド抗体、本明細書中に記載されたＴＡＴ結合オリゴヌクレオチド、または本明細書中に記載されたＴＡＴ結合有機分子の、該ＴＡＴポリペプチド、キメラＴＡＴポリペプチド、抗−ＴＡＴポリペプチド抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、またはＴＡＴ結合有機分子に応答性である疾患の治療で有用な医薬の製造のための使用に向けられる。
Ｂ．さらなる具体例
本発明のもう１つの具体例はＴＡＴポリペプチドを発現する細胞の成長を阻害する方法に向けられ、ここに、該方法は細胞を、ＴＡＴポリペプチドと結合する抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子と接触させることを含み、およびここに、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子のＴＡＴポリペプチドへの結合はＴＡＴポリペプチドを発現する細胞の成長の阻害を引き起こす。好ましい具体例において、細胞は癌細胞であって、ＴＡＴポリペプチドへの該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の結合はＴＡＴポリペプチドを発現する細胞の死滅を引き起こす。所望により、該抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、または単一−鎖抗体である。本発明の方法で使用される抗体、ＴＡＴ結合オリゴヌクレオチド、およびＴＡＴ結合有機分子は、所望により、例えば、マンタンシノイドまたはカリケアミシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素等を含めたトキシンのような成長阻害剤または細胞傷害性剤と結合体化させることができる。本発明の方法で使用される抗体およびＴＡＴ結合オリゴヌクレオチドは、所望により、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において生産させることができる。 Another embodiment of the present invention is a TAT polypeptide described herein, a chimeric TAT polypeptide described herein, an anti-TAT polypeptide antibody described herein, A TAT-binding oligonucleotide described herein, or a TAT-binding organic molecule described herein, said TAT polypeptide, chimeric TAT polypeptide, anti-TAT polypeptide antibody, TAT-binding oligopeptide, Or directed to use for the manufacture of a medicament useful in the treatment of diseases responsive to TAT-binding organic molecules.
B. Further embodiments Another embodiment of the invention is directed to a method of inhibiting the growth of a cell expressing a TAT polypeptide, wherein the method binds the cell to an antibody, oligopeptide or small molecule that binds to the TAT polypeptide. Contacting with an organic molecule, and wherein binding of the antibody, oligopeptide or organic molecule to a TAT polypeptide causes inhibition of growth of cells expressing the TAT polypeptide. In a preferred embodiment, the cell is a cancer cell and binding of the antibody, oligopeptide or organic molecule to the TAT polypeptide causes the death of the cell expressing the TAT polypeptide. Optionally, the antibody is a monoclonal antibody, antibody fragment, chimeric antibody, humanized antibody, or single-chain antibody. The antibodies, TAT-binding oligonucleotides, and TAT-binding organic molecules used in the methods of the present invention may optionally comprise toxins including, for example, mantansinoids or calicheamicins, antibiotics, radioisotopes, nucleolytic enzymes, etc. It can be conjugated with such growth inhibitors or cytotoxic agents. The antibodies and TAT-binding oligonucleotides used in the methods of the invention can be produced in CHO cells or bacterial cells if desired.

本発明のなおもう１つの具体例は、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞を含む癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置する方法に向けられ、ここに、該方法は、哺乳動物に治療上有効量の、ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴヌクレオチドまたは小さな有機分子を投与し、それにより、その結果、腫瘍の効果的な治療的処置がもたらされることを含む。所望により、抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、または単一−鎖抗体である。本発明の方法で使用される抗体、ＴＡＴ結合オリゴヌクレオチドおよびＴＡＴ結合有機分子は、所望により、例えば、マンタンシノイドまたはカリケアミシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素等を含めた、トキシンのような成長阻害剤または細胞傷害性剤に結合体化させることができる。本発明の方法で使用される抗体およびオリゴペプチドは、所望により、ＣＨＯ細胞または細菌細胞で生産させることができる。   Yet another embodiment of the present invention is directed to a method of therapeutically treating a mammal having a cancerous tumor comprising cells expressing a TAT polypeptide, wherein the method therapeutically treats the mammal. Including administering an effective amount of an antibody, oligonucleotide or small organic molecule that binds to a TAT polypeptide, thereby resulting in an effective therapeutic treatment of the tumor. Optionally, the antibody is a monoclonal antibody, an antibody fragment, a chimeric antibody, a humanized antibody, or a single-chain antibody. The antibodies, TAT-binding oligonucleotides and TAT-binding organic molecules used in the methods of the present invention may optionally comprise toxins, including, for example, mantansinoids or calicheamicins, antibiotics, radioisotopes, nucleolytic enzymes, etc. Such growth inhibitors or cytotoxic agents can be conjugated. The antibodies and oligopeptides used in the methods of the invention can be produced in CHO cells or bacterial cells if desired.

本発明のなおもう１つの具体例は、ＴＡＴポリペプチドを含有することが疑われる試料中のＴＡＴポリペプチドの存在を判断する方法に向けられ、ここに、該方法は、試料を、ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子に暴露し、試料中のＴＡＴポリペプチドへの該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の結合を判断することができることを含み、ここに、そのような結合の存在は試料中でのＴＡＴポリペプチドの存在を示す。所望により、試料は、ＴＡＴポリペプチドを発現することが疑われる（癌細胞であり得る）細胞を含有することができる。該方法で使用される該抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子は、所望により、検出可能に標識し、固体支持体に結合させ、等ができる。   Yet another embodiment of the invention is directed to a method of determining the presence of a TAT polypeptide in a sample suspected of containing a TAT polypeptide, wherein the method comprises analyzing the sample with the TAT polypeptide. Can be exposed to antibodies, oligopeptides or small organic molecules that bind to and determine the binding of the antibodies, oligopeptides or organic molecules to the TAT polypeptide in the sample, wherein Presence indicates the presence of TAT polypeptide in the sample. If desired, the sample can contain cells suspected of expressing a TAT polypeptide (which can be cancer cells). The antibody, TAT-binding oligopeptide or TAT-binding organic molecule used in the method can be detectably labeled, bound to a solid support, etc., if desired.

本発明のさらなる具体例は哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法に向けられ、ここに、該方法は、（ａ）該哺乳動物から得られた組織細胞のテスト試料における、および（ｂ）同一組織起源またはタイプの公知の正常な非−癌細胞における、ＴＡＴポリペプチドをコードする遺伝子の発現のレベルを検出することを含み、ここに、対照試料と比較して、テスト試料中のＴＡＴポリペプチドの高レベルの発現はテスト試料がそれから得られた哺乳動物における腫瘍の存在を示す。   Further embodiments of the present invention are directed to a method of diagnosing the presence of a tumor in a mammal, wherein the method comprises (a) a test sample of tissue cells obtained from the mammal, and (b) the same Detecting the level of expression of a gene encoding a TAT polypeptide in a known normal non-cancer cell of tissue origin or type, wherein the TAT polypeptide in the test sample is compared to the control sample A high level of expression indicates the presence of a tumor in the mammal from which the test sample was obtained.

本発明のもう１つの具体例は哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法に向けられ、ここに、該方法は（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞を含むテスト試料を、ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子と接触させ、次いで、（ｂ）テスト試料中での、該抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子とＴＡＴポリペプチドとの間の複合体の形成を検出することを含み、ここに、複合体の形成は哺乳動物における腫瘍の存在を示す。所望により、使用される該抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、またはＴＡＴ結合有機分子は検出可能に標識され、固体支持体に結合され、等され、および／または組織細胞のテスト試料は、癌性腫瘍を有することが疑われる個人から得られる。   Another embodiment of the invention is directed to a method of diagnosing the presence of a tumor in a mammal, wherein the method comprises: (a) applying a test sample comprising tissue cells obtained from the mammal to a TAT polypeptide. Contacting with an antibody, oligopeptide or small organic molecule that binds, then (b) detecting the formation of a complex between the antibody, oligopeptide or small organic molecule and the TAT polypeptide in the test sample Wherein the formation of the complex indicates the presence of a tumor in the mammal. If desired, the antibody, TAT-binding oligopeptide, or TAT-binding organic molecule used is detectably labeled, bound to a solid support, etc., and / or the test sample of tissue cells can be a cancerous tumor. Obtained from an individual suspected of having.

本発明のなおもう１つの具体例は、ＴＡＴポリペプチドの改変された、好ましくは増加された発現または活性に関連した細胞増殖性障害を治療または予防する方法に向けられ、該方法はそのような治療を必要とする被験体に有効量のＴＡＴポリペプチドのアンタゴニストを投与することを含む。好ましくは、該細胞増殖性障害は癌であって、該ＴＡＴポリペプチドのアンタゴニストは抗−ＴＡＴポリペプチド抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ結合有機分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。細胞増殖性障害の効果的な治療および予防は、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞の直接的殺傷または増殖阻害の結果であり得るか、またはＴＡＴポリペプチドの細胞成長増強活性に拮抗することによるものであろう。   Yet another embodiment of the invention is directed to a method of treating or preventing a cell proliferative disorder associated with altered, preferably increased expression or activity of a TAT polypeptide, said method comprising Administering an effective amount of an antagonist of a TAT polypeptide to a subject in need of treatment. Preferably, the cell proliferative disorder is cancer and the antagonist of the TAT polypeptide is an anti-TAT polypeptide antibody, a TAT binding oligopeptide, a TAT binding organic molecule or an antisense oligonucleotide. Effective treatment and prevention of cell proliferative disorders can be the result of direct killing or inhibition of proliferation of cells expressing the TAT polypeptide or by antagonizing the cell growth enhancing activity of the TAT polypeptide. I will.

本発明のなおもう１つの具体例は、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞へ抗体、オリゴヌクレオチドまたは小さな有機分子を結合させる方法に向けられ、ここに、該方法は、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞を、該抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子の該ＴＡＴポリペプチドへの結合に適した条件下で該抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子と接触させ、その間での結合を行わせることを含む。   Yet another embodiment of the invention is directed to a method of conjugating an antibody, oligonucleotide or small organic molecule to a cell that expresses a TAT polypeptide, wherein the method comprises the step of expressing a cell that expresses a TAT polypeptide. Contacting the antibody, oligopeptide or small organic molecule with the antibody, oligopeptide or small organic molecule under conditions suitable for binding to the TAT polypeptide to effect binding between them.

本発明の他の具体例は、（ｉ）癌または腫瘍の治療的処置または診断検出、または（ｉｉ）細胞増殖性障害の処置または予防で有用な医薬の調製における、（ａ）ＴＡＴポリペプチド、（ｂ）ＴＡＴポリペプチドをコードする核酸、またはその核酸を含むベクターまたは宿主細胞、（ｃ）抗−ＴＡＴポリペプチド抗体、（ｄ）ＴＡＴ−結合オリゴペプチド、または（ｅ）ＴＡＴ−結合小有機分子の使用に向けられる。   Other embodiments of the invention include (a) a TAT polypeptide in (i) the therapeutic treatment or diagnostic detection of a cancer or tumor, or (ii) the preparation of a medicament useful in the treatment or prevention of a cell proliferative disorder, (B) a nucleic acid encoding a TAT polypeptide, or a vector or host cell comprising the nucleic acid, (c) an anti-TAT polypeptide antibody, (d) a TAT-binding oligopeptide, or (e) a TAT-binding small organic molecule Directed to use.

本発明のもう１つの具体例は、癌細胞の成長を阻害するための方法に向けられ、ここに、該癌細胞の成長は、少なくとも部分的には、ＴＡＴポリペプチドの成長増強効果に依存し（ここに、ＴＡＴポリペプチドは、癌細胞それ自体、あるいは癌細胞に対して成長増強効果を有するポリペプチドを生産する細胞いずれかによって発現され得る）、ここに、該方法はＴＡＴポリペプチドを、ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子と接触させ、それにより、ＴＡＴポリペプチドの成長−増強効果に拮抗し、今度は、癌細胞の成長を阻害することを含む。好ましくは、癌細胞の成長は完全に阻害される。なおより好ましくは、該抗体、オリゴペプチド、または小さな有機分子のＴＡＴポリペプチドへの結合は、癌細胞の死滅を誘導する。所望により、該抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、または単一−鎖抗体である。本発明の方法で使用される抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドおよびＴＡＴ結合有機分子は、所望により、例えば、メイタンシノイドまたはカリケアミシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素等を含めた、トキシンのような成長阻害剤または細胞傷害剤に結合体化することができる。本発明の方法で使用される抗体およびＴＡＴ結合オリゴペプチドは、所望により、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において生産され得る。   Another embodiment of the invention is directed to a method for inhibiting the growth of cancer cells, wherein the growth of the cancer cells depends at least in part on the growth enhancing effect of the TAT polypeptide. (Wherein the TAT polypeptide can be expressed either by the cancer cell itself or by a cell that produces a polypeptide having a growth enhancing effect on the cancer cell), wherein the method comprises: Contact with an antibody, oligopeptide or small organic molecule that binds to the TAT polypeptide, thereby antagonizing the growth-enhancing effect of the TAT polypeptide and, in turn, inhibiting the growth of cancer cells. Preferably, the growth of cancer cells is completely inhibited. Even more preferably, binding of the antibody, oligopeptide, or small organic molecule to the TAT polypeptide induces death of the cancer cell. Optionally, the antibody is a monoclonal antibody, antibody fragment, chimeric antibody, humanized antibody, or single-chain antibody. The antibodies, TAT-binding oligopeptides and TAT-binding organic molecules used in the methods of the present invention may optionally be of toxins including, for example, maytansinoids or calicheamicins, antibiotics, radioisotopes, nucleolytic enzymes, etc. Such growth inhibitors or cytotoxic agents can be conjugated. The antibodies and TAT-binding oligopeptides used in the methods of the invention can be produced in CHO cells or bacterial cells as desired.

本発明のなおもう１つの具体例は、哺乳動物において腫瘍を治療的に処置する方法に向けられ、ここに、該腫瘍の成長は、少なくとも部分的には、ＴＡＴポリペプチドの成長増強効果に依存し、ここに、該方法は哺乳動物に治療上有効量の、ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドまたは小さな有機分子を投与し、それにより、該ＴＡＴポリペプチドの成長増強活性に拮抗し、その結果、腫瘍の効果的な治療的処置がもたらされることを含む。所望により、該抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、または単一−鎖抗体である。本発明の方法で使用される抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドおよびＴＡＴ結合有機分子は、所望により、例えば、メイタンシノイドまたはカリケアミシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素等を含めた、トキシンのような成長阻害剤または細胞傷害剤に結合体化させることができる。本発明の方法で使用される抗体およびオリゴペプチドは、所望により、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において生産することができる。
Ｃ．さらなる追加の具体例
なおさらなる具体例において、本発明は本出願についての潜在的請求項の以下の組に向けられる：
１．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡ分子；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡ分子；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域；または
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）の相補体；
に対して少なくとも８０％核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する単離された核酸。
２．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域；または
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）の相補体；
を有する単離された核酸。
３．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードする核酸；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードする核酸；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードする核酸；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードする核酸；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域；または
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）の相補体；
にハイブリダイズする単離された核酸。
４．ハイブリダイゼーションがストリンジェントな条件下で起こる請求項３記載の核酸。
５．長さが少なくとも約５ヌクレオチドである請求項３記載の核酸。
６．請求項１、２または３の核酸を含む発現ベクター。
７．該核酸が、該ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される対照配列に操作可能に連結された請求項６記載の発現ベクター。
８．請求項７記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
９．ＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞または酵母細胞である請求項８記載の宿主細胞。
１０．ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項８記載の宿主細胞を培養し、細胞培養から該ポリペプチドを回収することを含む、ポリペプチドを生産する方法。
１１．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
１２．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する単離されたポリペプチド。
１３．異種ポリペプチドに融合された請求項１１または１２記載のポリペプチドを含むキメラポリペプチド。
１４．該異種ポリペプチドがエピトープタグ配列または免疫グロブリンＦｃ領域である請求項１３記載のキメラポリペプチド。
１５．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する単離された抗体。
１６．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有するポリペプチドに結合する単離された抗体。
１７．モノクローナル抗体である請求項１５または１６の抗体。
１８．抗体断片である請求項１５または１６の抗体。
１９．キメラまたはヒト化である請求項１５または１６の抗体。
２０．成長抑制剤に結合体化した請求項１５または１６の抗体。
２１．細胞傷害性剤に結合体化した請求項１５または１６の抗体。
２２．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項２１記載の抗体。
２３．該細胞傷害性剤がトキシンである請求項２１記載の抗体。
２４．該トキシンがメイタンシノイドまたはカリケアミシンよりなる群から選択される請求項２３記載の抗体。
２５．該トキシンがメイタンシノイドである請求項２３記載の抗体。
２６．細菌において生産される請求項１５または１６記載の抗体。
２７．ＣＨＯ細胞において生産される請求項１５または１６記載の抗体。
２８．それが結合する細胞の死滅を誘導する請求項１５または１６記載の抗体。
２９．検出可能に標識された請求項１５または１６記載の抗体。
３０．請求項１５または１６の抗体をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸。
３１．当該ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される対照配列
に操作可能に連結された請求項３０記載の核酸を含む発現ベクター。
３２．請求項３１記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
３３．ＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞または酵母細胞である請求項３２記載の宿主細胞。
３４．抗体の発現に適した条件下で請求項３２記載の宿主細胞を培養し、細胞培養から該抗体を回収することを含む、抗体を生産する方法。
３５．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する単離されたオリゴペプチド。
３６．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有するポリペプチドに結合する単離されたオリゴペプチド。
３７．成長抑制剤に結合体化した請求項３５または３６記載のオリゴペプチド。
３８．細胞傷害性剤に結合体化した請求項３５または３６記載のオリゴペプチド。
３９．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項３８記載のオリゴペプチド。
４０．該細胞傷害性剤トキシンである請求項３８記載のオリゴペプチド。
４１．該トキシンがメイタンシノイドおよびカリケアミシンよりなる群から選択される請求項４０記載のオリゴペプチド。
４２．該トキシンがメイタンシノイドである請求項４０記載のオリゴペプチド。
４３．それが結合する細胞の死滅を誘導する請求項３５または３６記載のオリゴペプチド。
４４．検出可能に標識された請求項３５または３６記載のオリゴペプチド。
４５．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合するＴＡＴ結合有機分子。
４６．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有するポリペプチドに結合する請求項４５記載の有機分子。
４７．成長抑制剤に結合体化した請求項４５または４６記載の有機分子。
４８．細胞傷害性剤に結合体化した請求項４５または４６記載の有機分子。
４９．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項４８記載の有機分子。
５０．該細胞傷害性剤トキシンである請求項４８記載の有機分子。
５１．該トキシンがメイタンシノイドおよびカリケアミシンよりなる群から選択される請求項５０記載の有機分子。
５２．該トキシンがメイタンシノイドである請求項５０記載の有機分子。
５３．それが結合する細胞の死滅を誘導する請求項４５または４６記載の有機分子。
５４．検出可能に標識された請求項４５または４６記載の有機分子。
５５．キャリアと組み合わせた、
（ａ）請求項１１記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項１２記載のポリペプチド；
（ｃ）請求項１３記載のキメラポリペプチド；
（ｄ）請求項１５記載の抗体；
（ｅ）請求項１６記載の抗体；
（ｆ）請求項３５記載のオリゴペプチド；
（ｇ）請求項３６記載のオリゴペプチド；
（ｈ）請求項４５記載のＴＡＴ結合有機分子；または
（ｉ）請求項４６記載のＴＡＴ結合有機分子；
を含む組成物。
５６．該キャリアが薬学的に受容可能なキャリアである請求項５５記載の組成物。
５７．（ａ）容器；および
（ｂ）該容器内に含まれる請求項５５記載の組成物を含む製品。
５８．さらに、癌の治療的処置または診断検出用の該組成物の使用に言及する、該容器に付着された標識、または該容器に含まれる添付文書を含む請求項５７記載の製品。
５９．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質を発現する細胞の成長を阻害する方法であって、該細胞を、該蛋白質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子と接触させることを含み、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の該蛋白質への結合が、それにより、該細胞の成長の阻害を引き起こすことを特徴とする該方法。
６０．該抗体がモノクローナル抗体である請求項５９記載の方法。
６１．該抗体が抗体断片である請求項５９記載の方法。
６２．該抗体がキメラまたはヒト化抗体である請求項５９記載の方法。
６３．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が成長阻害剤に結合体化した請求項５９記載の方法。
６４．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が細胞傷害性剤に結合体化した請求項５９記載の方法。
６５．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項６４記載の方法。
６６．該細胞傷害性剤がトキシンである請求項６４記載の方法。
６７．該トキシンがメイタンシノイドおよびカリケアミシンからなる群から選択される請求項６６記載の方法。
６８．該トキシンがメイタンシノイドである請求項６６記載の方法。
６９．該抗体が細菌において生産される請求項５９記載の方法。
７０．該抗体がＣＨＯ細胞において生産される請求項５９記載の方法。
７１．該細胞が癌細胞である請求項５９記載の方法。
７２．該癌細胞がさらに、放射線治療または化学療法剤に暴露される請求項７１記載の方法。
７３．該癌細胞が、乳癌細胞、結直腸癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、中枢神経系癌細胞、肝臓癌細胞、膀胱癌細胞、膵臓癌細胞、頚癌細胞、メラノーマ細胞および白血病細胞よりなる群から選択される請求項７１記載の方法。
７４．該蛋白質が、同一組織起源の正常な細胞と比較して、該癌細胞によってより豊富に発現される請求項７１記載の方法。
７５．該細胞の死滅を引き起こす請求項５９記載の方法。
７６．該蛋白質が：
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する請求項５９記載の方法。
７７．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質を発現する細胞を含む癌性腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、該哺乳動物に、治療上有効量の、該蛋白質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を投与し、それにより、該哺乳動物を効果的に治療することを含む該方法。
７８．該抗体がモノクローナル抗体である請求項７７記載の方法。
７９．該抗体が抗体断片である請求項７７記載の方法。
８０．該抗体がキメラまたはヒト化抗体である請求項７７記載の方法。
８１．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が成長阻害剤に結合体化した請求項７７記載の方法。
８２．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が細胞傷害性剤に結合体化した請求項７７記載の方法。
８３．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体、ヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項８２記載の方法。
８４．該細胞傷害性剤がトキシンである請求項８２記載の方法。
８５．該トキシンがメイタンシノイドおよびカリケアミシンからなる群から選択される請求項８４記載の方法。
８６．該トキシンがメイタンシノイドである請求項８４記載の方法。
８７．該抗体が細菌において生産される請求項７７記載の方法。
８８．該抗体がＣＨＯ細胞において生産される請求項７７記載の方法。
８９．該腫瘍がさらに、放射線治療または化学療法剤に暴露される請求項７７記載の方法。
９０．該腫瘍が乳房腫瘍、結直腸腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、中枢神経系腫瘍、肝臓腫瘍、膀胱腫瘍、膵臓腫瘍、または頚部腫瘍である請求項７７記載の方法。
９１．該蛋白質が、同一組織起源の正常な細胞と比較して、該腫瘍の癌性細胞によってより豊富に発現される請求項７７記載の方法。
９２．該蛋白質が：
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する請求項７７記載の方法。
９３．蛋白質を含有することが疑われる試料中の蛋白質の存在を測定する方法であって、ここに、該蛋白質は；
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有し、該方法は、該試料を該蛋白質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子に暴露し、該試料中の該蛋白質への該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の結合を測定することを含み、ここに、該蛋白質への抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の結合は該試料中の該蛋白質の存在を示すことを特徴とする該方法。
９４．該試料は該蛋白質を発現することが疑われる細胞を含む請求項９３記載の方法。
９５．該細胞が癌細胞である請求項９４記載の方法。
９６．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が検出可能に標識される請求項９３記載の方法。
９７．該蛋白質が；
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する請求項９３記載の方法。
９８．哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法であって、該方法は、該哺乳動物から得られた組織細胞のテスト試料における、および同一組織起源の公知の正常な細胞の対照試料における、
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現のレベルを測定することを含み、ここに、対照試料と比較した、テスト試料中の該蛋白質の発現のより高いレベルはテスト試料がそれから得られた哺乳動物における腫瘍の存在を示すことを特徴とする該方法。
９９．該蛋白質をコードする遺伝子の発現のレベルを測定する抗体が、イン・サイチュハイブリダイゼーションまたはＲＴ−ＰＣＲ分析においてオリゴヌクレオチドを使用することを含む請求項９８記載の方法。
１００．該蛋白質をコードする遺伝子の発現のレベルを測定する工程が、免疫組織化学またはウエスタンブロット分析を使用することを含む請求項９８記載の方法。
１０１．該蛋白質が：
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する請求項９８記載の方法。
１０２．哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法であって、該方法は、該哺乳動物から得られた組織細胞のテスト試料を、
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子と接触させ、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子と、テスト試料中の該蛋白質との間の複合体の形成を検出することを含み、ここに、複合体の形成は該哺乳動物における腫瘍の存在を示すことを特徴とする該方法。
１０３．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が検出可能に標識された請求項１０２記載の方法。
１０４．組織細胞の該テスト試料が、癌性腫瘍を有することが疑われる個体から得られる請求項１０２記載の方法。
１０５．該蛋白質が：
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する請求項１０２記載の方法。
１０６．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質の増大した発現または活性に関連した細胞増殖性障害を治療または予防する方法であって、該方法は、そのような処置を必要とする被験体に有効量の該蛋白質のアンタゴニストを投与し、それにより、該細胞増殖性障害を効果的に治療または予防することを特徴とする該方法。
１０７．該細胞増殖性障害が癌である請求項１０６記載の方法。
１０８．該アンタゴニストが抗−ＴＡＴポリペプチド抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ結合有機分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項１０６記載の方法。
１０９．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質を発現する細胞へ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を結合させる方法であって、該方法は、該細胞を、該蛋白質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子と接触させ、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の該蛋白質への結合を起こさせ、それにより、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を該細胞に結合させることを特徴とする該方法。
１１０．該抗体がモノクローナル抗体である請求項１０９記載の方法。
１１１．該抗体が抗体断片である請求項１０９記載の方法。
１１２．該抗体がキメラまたはヒト化抗体である請求項１０９記載の方法。
１１３．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が成長阻害剤に結合体化した請求項１０９記載の方法。
１１４．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が細胞傷害性剤に結合体化した請求項１０９記載の方法。
１１５．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体、およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項１１４記載の方法。
１１６．該細胞傷害性剤がトキシンである請求項１１４記載の方法。
１１７．該トキシンがメイタンシノイドおよびカリケアミシンからなる群から選択される請求項１１６記載の方法。
１１８．該トキシンがメイタンシノイドである請求項１１６記載の方法。
１１９．該抗体が細菌において生産される請求項１０９記載の方法。
１２０．該抗体がＣＨＯ細胞において生産される請求項１０９記載の方法。
１２１．該細胞が癌細胞である請求項１０９記載の方法。
１２２．該癌細胞が、さらに、放射線治療または化学療法剤に暴露される請求項１２１記載の方法。
１２３．該癌細胞が、乳癌細胞、結直腸癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、中枢神経系癌細胞、肝臓癌細胞、膀胱癌細胞、膵臓癌細胞、頚癌細胞、メラノーマ細胞および白血病細胞よりなる群から選択される請求項１２１記載の方法。
１２４．該蛋白質が、同一組織起源の正常な細胞と比較して、該癌細胞によってより豊富に発現される請求項１２３記載の方法。
１２５．該細胞の死滅を引き起こす請求項１０９記載の方法。
１２６．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項１ないし５または３０いずれか記載の核酸の使用。
１２７．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項１ないし５または３０いずれか記載の核酸の使用。
１２８．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項１ないし５または３０いずれか記載の核酸の使用。
１２９．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項６、７または３１いずれか記載の発現ベクターの使用。
１３０．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項６、７または３１いずれか記載の発現ベクターの使用。
１３１． 細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項６、７または３１いずれか記載の発現ベクターの使用。
１３２．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項８、９、３２または３３いずれか記載の宿主細胞の使用。
１３３．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項８、９、３２または３３いずれか記載の宿主細胞の使用。
１３４．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項８、９、３２または３３いずれか記載の宿主細胞の使用。
１３５．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項１１ないし１４いずれか記載のポリペプチドの使用。
１３６．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項１１ないし１４いずれか記載のポリペプチドの使用。
１３７．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項１１ないし１４いずれか記載のポリペプチドの使用。
１３８．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項１５ないし２９いずれか記載の抗体の使用。
１３９．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項１５ないし２９いずれか記載の抗体の使用。
１４０．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項１５ないし２９いずれか記載の抗体の使用。
１４１．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項３５ないし４４いずれか記載のオリゴペプチドの使用。
１４２．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項３５ないし４４いずれか記載のオリゴペプチドの使用。
１４３．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項３５ないし４４いずれか記載のオリゴペプチドの使用。
１４４．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項４５ないし５４いずれか記載のＴＡＴ結合有機分子の使用。
１４５．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項４５ないし５４いずれか記載のＴＡＴ結合有機分子の使用。
１４６．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項４５ないし５４いずれか記載のＴＡＴ結合有機分子の使用。
１４７．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項５５または５６いずれか記載の組成物の使用。
１４８．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項５５または５６いずれか記載の組成物の使用。
１４９．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項５５または５６いずれか記載の組成物の使用。
１５０．癌の治療的処置または診断検出用の医薬の調製における請求項５７または５８いずれか記載の製品の使用。
１５１．腫瘍を治療するための医薬の調製における請求項５７または５８いずれか記載の製品の使用。
１５２．細胞増殖性障害の治療または予防用の医薬の調製における請求項５７または５８いずれか記載の製品の使用。
１５３．細胞の成長を阻害する方法であって、該細胞の増殖が、
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質の成長増強効果に少なくとも部分的に依存し、該方法は、該蛋白質を、該蛋白質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子と接触させ、それにより、該細胞の増殖を阻害することを特徴とする該方法。
１５４．該細胞が癌細胞である請求項１５３記載の方法。
１５５．該蛋白質が該細胞によって発現される請求項１５３記載の方法。
１５６．該蛋白質への該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の結合が、該蛋白質の細胞成長−増強活性に拮抗する請求項１５３記載の方法。
１５７．該蛋白質への該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の結合が該細胞の死滅を誘導する請求項１５３記載の方法。
１５８．該抗体がモノクローナル抗体である請求項１５３記載の方法。
１５９．該抗体が抗体断片である請求項１５３記載の方法。
１６０．該抗体がキメラまたはヒト化抗体である請求項１５３記載の方法。
１６１．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が成長阻害剤に結合体化した請求項１５３記載の方法。
１６２．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が細胞傷害性剤に結合体化した請求項１５３記載の方法。
１６３．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体、およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項１６２記載の方法。
１６４．該細胞傷害性剤がトキシンである請求項１６２記載の方法。
１６５．該トキシンがメイタンシノイドおよびカリケアミシンからなる群から選択される請求項１６４記載の方法。
１６６．該トキシンがメイタンシノイドである請求項１６４記載の方法。
１６７．該抗体が細菌において生産される請求項１５３記載の方法。
１６８．該抗体がＣＨＯ細胞において生産される請求項１５３記載の方法。
１６９．該蛋白質が；
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する請求項１５３記載の方法。
１７０．哺乳動物において腫瘍を治療的に処置する方法であって、ここに、該腫瘍の成長は；
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する蛋白質の成長増強効果に少なくとも部分的に依存し、該方法は、該蛋白質を該蛋白質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子と接触させ、それにより、該腫瘍を効果的に治療することを特徴とする該方法。
１７１．該蛋白質が該腫瘍の細胞によって発現される請求項１７０記載の方法。
１７２．該蛋白質への該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の結合が、該蛋白質の細胞成長−増強活性に拮抗する請求項１７０記載の方法。
１７３．該抗体がモノクローナル抗体である請求項１７０記載の方法。
１７４．該抗体が抗体断片である請求項１７０記載の方法。
１７５．該抗体がキメラまたはヒト化抗体である請求項１７０記載の方法。
１７６．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が成長阻害剤に結合体化した請求項１７０記載の方法。
１７７．該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が細胞傷害性剤に結合体化した請求項１７０記載の方法。
１７８．該細胞傷害性剤がトキシン、抗生物質、放射性同位体、およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項１７７記載の方法。
１７９．該細胞傷害性剤がトキシンである請求項１７７記載の方法。
１８０．該トキシンがメイタンシノイドおよびカリケアミシンからなる群から選択される請求項１７９記載の方法。
１８１．該トキシンがメイタンシノイドである請求項１７９記載の方法。
１８２．該抗体が細菌において生産される請求項１７０記載の方法。
１８３．該抗体がＣＨＯ細胞において生産される請求項１７０記載の方法。
１８４．該蛋白質が；
（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有する請求項１７０記載の方法。
１８５．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する単離された抗体。
１８６．（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるアミノ酸配列；
を有するポリペプチドに結合する単離された抗体。
１８７．モノクローナル抗体である請求項１８５記載の抗体。
１８８．抗体断片である請求項１８５記載の抗体。
１８９．キメラまたはヒト化抗体である請求項１８５記載の抗体。
１９０．成長阻害剤に結合体化した請求項１８５記載の抗体。
１９１．細胞傷害性剤に結合体化した請求項１８５記載の抗体。
１９２．該細胞傷害性剤がトキシン、抗体、放射性同位体およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される請求項１９１記載の抗体。
１９３．該細胞傷害性剤がトキシンである請求項１９１記載の抗体。
１９４．該トキシンがアウリスタチン、メイタンシノイドおよびカリケアミシンよりなる群から選択される請求項１９３記載の抗体。
１９５．該トキシンがメイタンシノイドである請求項１９３記載の抗体。
１９６．細菌において生産される請求項１８５記載の抗体。
１９７．ＣＨＯ細胞において生産される請求項１８５記載の抗体。
１９８．それが結合する細胞の死滅を誘導する請求項１８５記載の抗体。
１９９．検出可能に標識される請求項１８５記載の抗体。
２００．該トキシンがＭＭＡＥ（モノ−メチルアウリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ、（アウリスタチンＥバレリルベンジルヒドラゾン）、およびＡＦＰ（アウリスタチンＦフェニレンジアミン）よりなる群から選択される請求項１９３記載の抗体。
２０１．該トキシンが、リンカーによって抗体に共有結合している請求項１９３記載の抗体。
２０２．該リンカーがマレイミドカプロイル（ＭＣ）バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ、ｖｃ）シトルリン（２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸）、ＰＡＢ（Ｐ−アミノベンジルカルバモイル）、Ｍｅ（Ｎ−メチル−バリンシトルリン）、ＭＣ（ＰＥＧ）６−ＯＨ（マレイミドカプロイル−ポリエチレングリコール）、ＳＰＰ（４−（２−ピリジルチオ）ペンタン酸Ｎ−スクシンイミジル）、ＳＭＣＣ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボン酸Ｎ−スクシンイミジル）、およびＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢよりなる群から選択される請求項２０１記載の抗体。
２０３．該トキシンがＭＭＡＥである請求項２００記載の抗体。
２０４．該トキシンがＭＭＡＦである請求項２００記載の抗体。
２０５．該リンカーがＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢであって、該トキシンがＭＭＡＥまたはＭＭＦＥである請求項２０２記載の抗体。
２０６．該抗体がＴＡＴ１８８ポリペプチドに結合する請求項１８５ないし２０５いずれか１項に記載の抗体。
２０７．該抗体が増殖を阻害し、あるいはＴＡＴ１８８を発現する細胞の細胞死滅を促進する請求項２０６記載の抗体。
２０８．該細胞が癌細胞である請求項２０７記載の抗体。
２０９．該癌細胞が乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される請求項２０８記載の方法。
２１０．３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体によって結合されたＴＡＴ１８８ポリペプチドのエピトープへの結合に競合する単離された抗体。
２１１．３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体の生物学的活性を有する単離された抗体であって、ここに、該生物学的活性が細胞増殖の阻害、あるいはＴＡＴ１８８を発現する細胞における細胞死滅の促進であることを特徴とする該単離された抗体。
２１２．３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体のＣＤＲの少なくとも１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するアミノ酸配列を、対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）中に含む単離された抗体。
２１３．該抗体が、対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）中に、３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体のＣＤＲの少なくとも１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するアミノ酸配列を含む請求項１８５ないし２０５いずれか１項に記載の抗体。
２１４．該抗体が、３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体の生物学的活性を呈し、ここに、該生物学的活性は細胞増殖の阻害、またはＴＡＴ１８８を発現する細胞における細胞死滅の促進である請求項１８５ないし２０５いずれか１項に記載の抗体。
２１５．細胞が癌細胞である、請求項２１４記載の抗体。
２１６．該癌細胞が乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される請求項２１５記載の抗体。
２１７．ＴＡＴ１８８を発現する細胞の成長を阻害する方法であって、該方法は該細胞を請求項１８５ないし２０５いずれか１項に記載の抗体と接触させることを含む該方法。
２１８．該細胞が癌細胞である請求項２１７記載の方法。
２１９．該癌細胞が乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される請求項２１８記載の方法。
２２０．該癌細胞が哺乳動物細胞である請求項２１９記載の方法。
２２１．該哺乳動物細胞がヒト細胞である請求項２２０記載の方法。
２２２．ＴＡＴ１８８を発現する細胞の成長を阻害する方法であって、該方法は請求項１８５ないし２０５いずれか１項に記載の抗体と該細胞とを接触させることを含み、ここに、該抗体は対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）において、３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体のＣＤＲの少なくとも１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする該方法。
２２３．対照細胞に対する試験細胞で発現されるＴＡＴ１８８ポリペプチドのレベルを検出する方法であって、該方法は：
（ａ）該試験細胞および対照細胞を、請求項２１０記載の単離された抗−ＴＡＴ１８８抗体と接触させ；
（ｂ）該抗体の結合を検出し；次いで、
（ｃ）該テストおよび対照細胞への該抗体の相対的結合を測定する；
ことを特徴とする該方法。
２２４．該試験細胞および対照細胞が溶解される請求項２２３記載の方法。
２２５．該試験細胞が組織中のものである請求項２２３記載の方法。
２２６．該組織が腫瘍組織である請求項２２５記載の方法。
２２７．該腫瘍組織が乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される請求項２２６記載の方法。
２２８．対照細胞に対するＴＡＴ１８８ポリペプチド、または試験細胞における図１１５（配列番号１１５）に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドのレベルを検出する方法であって該方法は：
（ａ）該試験細胞および該対照細胞を、請求項１８５ないし１８９、１９６ないし１９９、および２１０ないし２１２いずれか１項に記載の単離された抗体と接触させ；
（ｂ）該抗体の結合を検出し；次いで、
（ｃ）該テストおよび対照細胞への該抗体の相対的結合を測定する；
ことを特徴とする該方法。
２２９．該試験細胞におけるＴＡＴ１８８ポリペプチドのレベルが、対照細胞におけるそれよりも大きい請求項２２８記載の方法。
２３０．該方法が、試験細胞を含有する、または含有された試験細胞を有する組織における癌を診断する請求項２２９記載の方法。
２３１．（ａ）図３７（配列番号３７）に示されたヌクレオチド配列；および
（ｂ）（ａ）の相補体；
に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸に結合するＴＡＴ結合干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であって、ここに、該ｓｉＲＮＡはＴＡＴ１８８の発現を低下させることを特徴とする該ｓｉＲＮＡ。
２３２．請求項２３１記載のｓｉＲＮＡを含む発現ベクター。
２３３．該ｓｉＲＮＡが当該ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞によって認識される対照配列に操作可能に連結された請求項２３２記載の発現ベクター。
２３４．請求項２３３記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
２３５．キャリアと組み合わせて、
（ａ）請求項１８５記載の抗体、または
（ｂ）請求項２３１記載のｓｉＲＮＡ；
を含む組成物。
２３６．該キャリアが薬学的に受容可能なキャリアである請求項２３５記載の組成物。
２３７．（ａ）容器；および
（ｂ）該容器内に含有された請求項２３５記載の組成物；
を含む製品。
２３８．さらに、癌の治療的処置または診断検出のための該組成物の使用に言及する、該容器に付着されたラベルまたは該容器に含まれた添付文書を含む請求項２３７記載の製品。
２３９．図１１５（配列番号１１５）に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを発現する癌細胞の成長を阻害する方法であって、該方法は該癌細胞において該アミノ酸をコードする核酸に結合するｓｉＲＮＡと該癌細胞とを接触させ、それにより、該癌細胞の成長を阻害することを特徴とする該方法。
２４０．該核酸が図３７（配列番号３７）に示された配列を有する請求項２３９記載の方法。
２４１．該ポリペプチドの発現のレベルの検出が、免疫組織化学分析において抗体を試用することを含む請求項２２８記載の方法。
２４２．図１１５（配列番号１１５）に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドの増大した発現または活性に関連する細胞増殖性障害を治療または予防する方法であって、該方法は、そのような処置を必要とする被験体に有効量のＴＡＴ１８８ポリペプチドのアゴニストを投与することを特徴とする該方法。
２４３．該アンタゴニストが請求項１ないし２１および２３ないし２８いずれか１項に記載の単離された抗−ＴＡＴ１８８ポリペプチド抗体である請求項２４２記載の方法。
２４４．該細胞増殖性障害が癌である請求項２４３記載の方法。
２４５．該癌が乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚及び肝臓よりなる群から選択される請求項２４４記載の方法。 Yet another embodiment of the invention is directed to a method of therapeutically treating a tumor in a mammal, wherein the growth of the tumor depends at least in part on the growth enhancing effect of the TAT polypeptide. Wherein the method administers to the mammal a therapeutically effective amount of an antibody, oligopeptide or small organic molecule that binds to the TAT polypeptide, thereby antagonizing the growth enhancing activity of the TAT polypeptide; This results in an effective therapeutic treatment of the tumor. Optionally, the antibody is a monoclonal antibody, antibody fragment, chimeric antibody, humanized antibody, or single-chain antibody. The antibodies, TAT-binding oligopeptides and TAT-binding organic molecules used in the methods of the present invention may optionally be of toxins including, for example, maytansinoids or calicheamicins, antibiotics, radioisotopes, nucleolytic enzymes, etc. Such growth inhibitors or cytotoxic agents can be conjugated. The antibodies and oligopeptides used in the methods of the invention can be produced in CHO cells or bacterial cells if desired.
C. More specific examples
In still further embodiments, the present invention is directed to the following set of potential claims for this application:
1. (A) a DNA molecule encoding the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) a DNA molecule encoding the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) a DNA molecule encoding the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) a DNA molecule encoding the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154), lacking its associated signal peptide;
(E) the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78);
(F) the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NO: 1 to 78); or
(G) the complement of (a), (b), (c), (d), (e) or (f);
An isolated nucleic acid having a nucleotide sequence having at least 80% nucleic acid sequence identity to.
2. (A) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) a nucleotide sequence encoding the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) with its associated signal peptide;
(D) a nucleotide sequence encoding the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78);
(F) the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NO: 1 to 78); or
(G) the complement of (a), (b), (c), (d), (e) or (f);
An isolated nucleic acid having
3. (A) a nucleic acid encoding the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) a nucleic acid encoding the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) a nucleic acid encoding the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) a nucleic acid encoding the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78);
(F) the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NO: 1 to 78); or
(G) the complement of (a), (b), (c), (d), (e) or (f);
An isolated nucleic acid that hybridizes to.
4). The nucleic acid according to claim 3, wherein the hybridization occurs under stringent conditions.
5. 4. The nucleic acid of claim 3, wherein the nucleic acid is at least about 5 nucleotides in length.
6). An expression vector comprising the nucleic acid of claim 1, 2, or 3.
7). The expression vector of claim 6, wherein the nucleic acid is operably linked to a control sequence recognized by a host cell transformed with the vector.
8). A host cell comprising the expression vector according to claim 7.
9. CHO cells, E. coli. The host cell according to claim 8, which is an E. coli cell or a yeast cell.
10. A method for producing a polypeptide, comprising culturing a host cell according to claim 8 under conditions suitable for expression of the polypeptide, and recovering the polypeptide from the cell culture.
11. (A) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) a polypeptide encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) a polypeptide encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78);
An isolated polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity to.
12 (A) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(C) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) having its associated signal peptide sequence;
(D) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of Figures 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(E) an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) an amino acid sequence encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78);
An isolated polypeptide having
13. A chimeric polypeptide comprising the polypeptide of claim 11 or 12 fused to a heterologous polypeptide.
14 The chimeric polypeptide according to claim 13, wherein the heterologous polypeptide is an epitope tag sequence or an immunoglobulin Fc region.
15. (A) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(E) a polypeptide encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) a polypeptide encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78);
An isolated antibody that binds to a polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity to.
16. (A) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking the relevant signal peptide sequence;
(C) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) having its associated signal peptide sequence;
(D) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of Figures 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(E) an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) an amino acid sequence encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78);
An isolated antibody that binds to a polypeptide having
17. The antibody according to claim 15 or 16, which is a monoclonal antibody.
18. The antibody of claim 15 or 16, which is an antibody fragment.
19. The antibody of claim 15 or 16, which is chimeric or humanized.
20. The antibody of claim 15 or 16 conjugated to a growth inhibitor.
21. The antibody of claim 15 or 16 conjugated to a cytotoxic agent.
22. 22. The antibody of claim 21, wherein the cytotoxic agent is selected from the group consisting of toxins, antibiotics, radioisotopes and nucleolytic enzymes.
23. The antibody of claim 21, wherein the cytotoxic agent is a toxin.
24. 24. The antibody of claim 23, wherein the toxin is selected from the group consisting of maytansinoids or calicheamicins.
25. 24. The antibody of claim 23, wherein the toxin is a maytansinoid.
26. The antibody according to claim 15 or 16, which is produced in bacteria.
27. The antibody according to claim 15 or 16, which is produced in CHO cells.
28. 17. An antibody according to claim 15 or 16 that induces death of cells to which it binds.
29. The antibody according to claim 15 or 16, which is detectably labeled.
30. An isolated nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the antibody of claim 15 or 16.
31. Control sequences recognized by host cells transformed with the vector
32. An expression vector comprising the nucleic acid of claim 30 operably linked to.
32. A host cell comprising the expression vector of claim 31.
33. CHO cells, E. coli. The host cell according to claim 32, which is an E. coli cell or a yeast cell.
34. A method for producing an antibody, comprising culturing a host cell according to claim 32 under conditions suitable for expression of the antibody, and recovering the antibody from the cell culture.
35. (A) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) a polypeptide encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) a polypeptide encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78);
An isolated oligopeptide that binds to a polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity to.
36. (A) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(C) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) having its associated signal peptide sequence;
(D) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of Figures 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(E) an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) an amino acid sequence encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78);
An isolated oligopeptide that binds to a polypeptide having
37. 37. The oligopeptide of claim 35 or 36 conjugated to a growth inhibitor.
38. 37. The oligopeptide of claim 35 or 36 conjugated to a cytotoxic agent.
39. 39. The oligopeptide of claim 38, wherein said cytotoxic agent is selected from the group consisting of toxins, antibiotics, radioisotopes and nucleolytic enzymes.
40. 39. The oligopeptide of claim 38, which is the cytotoxic agent toxin.
41. 41. The oligopeptide of claim 40, wherein the toxin is selected from the group consisting of maytansinoids and calicheamicins.
42. 41. The oligopeptide of claim 40, wherein the toxin is a maytansinoid.
43. 37. The oligopeptide of claim 35 or 36 that induces the death of the cell to which it binds.
44. 37. The oligopeptide of claim 35 or 36, which is detectably labeled.
45. (A) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) a polypeptide encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) a polypeptide encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78);
A TAT-binding organic molecule that binds to a polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity to.
46. (A) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(C) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) having its associated signal peptide sequence;
(D) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of Figures 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(E) an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) an amino acid sequence encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78);
46. The organic molecule of claim 45, which binds to a polypeptide having
47. 47. The organic molecule according to claim 45 or 46 conjugated to a growth inhibitor.
48. 47. The organic molecule of claim 45 or 46 conjugated to a cytotoxic agent.
49. 49. The organic molecule of claim 48, wherein said cytotoxic agent is selected from the group consisting of toxins, antibiotics, radioisotopes and nucleolytic enzymes.
50. 49. The organic molecule according to claim 48, which is the cytotoxic agent toxin.
51. 51. The organic molecule of claim 50, wherein the toxin is selected from the group consisting of maytansinoids and calicheamicins.
52. 51. The organic molecule of claim 50, wherein the toxin is a maytansinoid.
53. 47. The organic molecule of claim 45 or 46 that induces death of the cell to which it binds.
54. 47. The organic molecule of claim 45 or 46, which is detectably labeled.
55. In combination with a career,
(A) the polypeptide of claim 11;
(B) the polypeptide of claim 12;
(C) the chimeric polypeptide according to claim 13;
(D) the antibody according to claim 15;
(E) the antibody of claim 16;
(F) the oligopeptide of claim 35;
(G) the oligopeptide of claim 36;
(H) the TAT-binding organic molecule of claim 45; or
(I) the TAT-binding organic molecule of claim 46;
A composition comprising
56. 56. The composition of claim 55, wherein the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier.
57. (A) a container; and
(B) A product comprising the composition of claim 55 contained within the container.
58. 58. The product of claim 57, further comprising a label attached to the container, or a package insert contained in the container, which refers to the use of the composition for therapeutic treatment or diagnostic detection of cancer.
59. (A) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) a polypeptide encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) a polypeptide encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78);
A method of inhibiting the growth of a cell that expresses a protein having at least 80% amino acid sequence identity to the cell, comprising contacting the cell with an antibody, oligopeptide or organic molecule that binds to the protein, The method wherein binding of the antibody, oligopeptide or organic molecule to the protein thereby causes inhibition of the growth of the cell.
60. 60. The method of claim 59, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
61. 60. The method of claim 59, wherein the antibody is an antibody fragment.
62. 60. The method of claim 59, wherein the antibody is a chimeric or humanized antibody.
63. 60. The method of claim 59, wherein said antibody, oligopeptide or organic molecule is conjugated to a growth inhibitor.
64. 60. The method of claim 59, wherein said antibody, oligopeptide or organic molecule is conjugated to a cytotoxic agent.
65. 65. The method of claim 64, wherein said cytotoxic agent is selected from the group consisting of toxins, antibiotics, radioisotopes, nucleolytic enzymes.
66. 65. The method of claim 64, wherein the cytotoxic agent is a toxin.
67. 68. The method of claim 66, wherein the toxin is selected from the group consisting of maytansinoids and calicheamicins.
68. 68. The method of claim 66, wherein the toxin is a maytansinoid.
69. 60. The method of claim 59, wherein said antibody is produced in bacteria.
70. 60. The method of claim 59, wherein said antibody is produced in CHO cells.
71. 60. The method of claim 59, wherein the cell is a cancer cell.
72. 72. The method of claim 71, wherein the cancer cells are further exposed to radiation therapy or a chemotherapeutic agent.
73. The cancer cell is a group consisting of breast cancer cells, colorectal cancer cells, lung cancer cells, ovarian cancer cells, central nervous system cancer cells, liver cancer cells, bladder cancer cells, pancreatic cancer cells, cervical cancer cells, melanoma cells and leukemia cells. 72. The method of claim 71, selected from:
74. 72. The method of claim 71, wherein the protein is expressed more abundantly by the cancer cells as compared to normal cells of the same tissue origin.
75. 60. The method of claim 59, wherein the method causes death of the cell.
76. The protein is:
(A) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(C) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) having its associated signal peptide sequence;
(D) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of Figures 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(E) an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) an amino acid sequence encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78);
60. The method of claim 59, comprising:
77. (A) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) a polypeptide encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) a polypeptide encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78);
A method of therapeutically treating a mammal having a cancerous tumor comprising cells that express a protein having a protein having at least 80% amino acid sequence identity to the mammal, wherein the mammal has a therapeutically effective amount of the Administering the antibody, oligopeptide or organic molecule that binds to the protein, thereby effectively treating the mammal.
78. 78. The method of claim 77, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
79. 78. The method of claim 77, wherein the antibody is an antibody fragment.
80. 78. The method of claim 77, wherein said antibody is a chimeric or humanized antibody.
81. 78. The method of claim 77, wherein said antibody, oligopeptide or organic molecule is conjugated to a growth inhibitor.
82. 78. The method of claim 77, wherein said antibody, oligopeptide or organic molecule is conjugated to a cytotoxic agent.
83. 83. The method of claim 82, wherein said cytotoxic agent is selected from the group consisting of toxins, antibiotics, radioisotopes, nucleolytic enzymes.
84. 83. The method of claim 82, wherein the cytotoxic agent is a toxin.
85. 85. The method of claim 84, wherein the toxin is selected from the group consisting of maytansinoids and calicheamicins.
86. 85. The method of claim 84, wherein the toxin is a maytansinoid.
87. 78. The method of claim 77, wherein said antibody is produced in bacteria.
88. 78. The method of claim 77, wherein said antibody is produced in CHO cells.
89. 78. The method of claim 77, wherein the tumor is further exposed to radiation therapy or a chemotherapeutic agent.
90. 78. The method of claim 77, wherein the tumor is a breast tumor, a colorectal tumor, a lung tumor, an ovarian tumor, a central nervous system tumor, a liver tumor, a bladder tumor, a pancreatic tumor, or a cervical tumor.
91. 78. The method of claim 77, wherein the protein is expressed more abundantly by cancerous cells of the tumor as compared to normal cells of the same tissue origin.
92. The protein is:
(A) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(C) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) having its associated signal peptide sequence;
(D) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of Figures 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(E) an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) an amino acid sequence encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78);
78. The method of claim 77, comprising:
93. A method for determining the presence of a protein in a sample suspected of containing a protein, wherein the protein is:
(A) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) a polypeptide encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) a polypeptide encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78);
Having at least 80% amino acid sequence identity to the method, wherein the method comprises exposing the sample to an antibody, oligopeptide or organic molecule that binds to the protein, wherein the antibody, oligopeptide to the protein in the sample Or measuring the binding of organic molecules, wherein the binding of an antibody, oligopeptide or organic molecule to the protein indicates the presence of the protein in the sample.
94. 94. The method of claim 93, wherein the sample comprises cells suspected of expressing the protein.
95. 95. The method of claim 94, wherein the cell is a cancer cell.
96. 94. The method of claim 93, wherein said antibody, oligopeptide or organic molecule is detectably labeled.
97. The protein is;
(A) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(C) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) having its associated signal peptide sequence;
(D) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of Figures 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(E) an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) an amino acid sequence encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78);
94. The method of claim 93, comprising:
98. A method of diagnosing the presence of a tumor in a mammal, wherein the method is in a test sample of tissue cells obtained from the mammal and in a control sample of known normal cells of the same tissue origin.
(A) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) a polypeptide encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) a polypeptide encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78);
Measuring the level of expression of a gene encoding a protein having at least 80% amino acid sequence identity, wherein the higher level of expression of the protein in the test sample compared to the control sample is The method wherein the test sample indicates the presence of a tumor in a mammal derived therefrom.
99. 99. The method of claim 98, wherein the antibody that measures the level of expression of the gene encoding the protein comprises using an oligonucleotide in an in situ hybridization or RT-PCR analysis.
100. 99. The method of claim 98, wherein the step of measuring the level of expression of the gene encoding the protein comprises using immunohistochemistry or Western blot analysis.
101. The protein is:
(A) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(C) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) having its associated signal peptide sequence;
(D) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of Figures 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(E) an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) an amino acid sequence encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78);
99. The method of claim 98, comprising:
102. A method for diagnosing the presence of a tumor in a mammal comprising the step of: obtaining a tissue cell test sample obtained from the mammal;
(A) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) a polypeptide encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) a polypeptide encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78);
Contact with an antibody, oligopeptide or organic molecule that binds to a protein having at least 80% amino acid sequence identity to the Detecting the formation, wherein the formation of the complex indicates the presence of a tumor in the mammal.
103. 105. The method of claim 102, wherein the antibody, oligopeptide or organic molecule is detectably labeled.
104. 105. The method of claim 102, wherein the test sample of tissue cells is obtained from an individual suspected of having a cancerous tumor.
105. The protein is:
(A) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(C) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) having its associated signal peptide sequence;
(D) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of Figures 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(E) an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) an amino acid sequence encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78);
103. The method of claim 102, comprising:
106. (A) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) a polypeptide encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) a polypeptide encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78);
A method of treating or preventing a cell proliferative disorder associated with increased expression or activity of a protein having at least 80% amino acid sequence identity to a subject, said method comprising a subject in need of such treatment And administering an effective amount of an antagonist of the protein, thereby effectively treating or preventing the cell proliferative disorder.
107. 107. The method of claim 106, wherein the cell proliferative disorder is cancer.
108. 107. The method of claim 106, wherein said antagonist is an anti-TAT polypeptide antibody, a TAT binding oligopeptide, a TAT binding organic molecule or an antisense oligonucleotide.
109. (A) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) a polypeptide encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) a polypeptide encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78);
A method of binding an antibody, oligopeptide or organic molecule to a cell expressing a protein having at least 80% amino acid sequence identity to the antibody, the method comprising the step of binding the cell to the protein, the antibody or oligopeptide Or contacting the organic molecule to cause the antibody, oligopeptide or organic molecule to bind to the protein, thereby binding the antibody, oligopeptide or organic molecule to the cell.
110. 110. The method of claim 109, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
111. 110. The method of claim 109, wherein the antibody is an antibody fragment.
112. 110. The method of claim 109, wherein said antibody is a chimeric or humanized antibody.
113. 110. The method of claim 109, wherein said antibody, oligopeptide or organic molecule is conjugated to a growth inhibitor.
114. 110. The method of claim 109, wherein said antibody, oligopeptide or organic molecule is conjugated to a cytotoxic agent.
115. 115. The method of claim 114, wherein said cytotoxic agent is selected from the group consisting of toxins, antibiotics, radioisotopes, and nucleolytic enzymes.
116. 115. The method of claim 114, wherein the cytotoxic agent is a toxin.
117. 117. The method of claim 116, wherein the toxin is selected from the group consisting of maytansinoids and calicheamicins.
118. 117. The method of claim 116, wherein the toxin is a maytansinoid.
119. 110. The method of claim 109, wherein said antibody is produced in bacteria.
120. 110. The method of claim 109, wherein said antibody is produced in CHO cells.
121. 110. The method of claim 109, wherein the cell is a cancer cell.
122. 122. The method of claim 121, wherein the cancer cells are further exposed to radiation therapy or a chemotherapeutic agent.
123. The cancer cell is a group consisting of breast cancer cells, colorectal cancer cells, lung cancer cells, ovarian cancer cells, central nervous system cancer cells, liver cancer cells, bladder cancer cells, pancreatic cancer cells, cervical cancer cells, melanoma cells and leukemia cells. 122. The method of claim 121, selected from:
124. 124. The method of claim 123, wherein the protein is expressed more abundantly by the cancer cells as compared to normal cells of the same tissue origin.
125. 110. The method of claim 109, wherein the method causes death of the cell.
126. Use of the nucleic acid according to any one of claims 1 to 5 or 30 in the preparation of a medicament for therapeutic treatment or diagnostic detection of cancer.
127. 31. Use of a nucleic acid according to any of claims 1 to 5 or 30 in the preparation of a medicament for treating a tumor.
128. Use of the nucleic acid according to any one of claims 1 to 5 or 30 in the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a cell proliferative disorder.
129. 32. Use of an expression vector according to any of claims 6, 7 or 31 in the preparation of a medicament for therapeutic treatment or diagnostic detection of cancer.
130. 32. Use of an expression vector according to any of claims 6, 7 or 31 in the preparation of a medicament for treating a tumor.
131. Use of the expression vector according to any of claims 6, 7 or 31 in the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a cell proliferative disorder.
132. 34. Use of a host cell according to any of claims 8, 9, 32 or 33 in the preparation of a medicament for therapeutic treatment or diagnostic detection of cancer.
133. 34. Use of a host cell according to any of claims 8, 9, 32 or 33 in the preparation of a medicament for treating a tumor.
134. 34. Use of a host cell according to any of claims 8, 9, 32 or 33 in the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a cell proliferative disorder.
135. Use of the polypeptide according to any of claims 11 to 14 in the preparation of a medicament for therapeutic treatment or diagnostic detection of cancer.
136. Use of a polypeptide according to any of claims 11 to 14 in the preparation of a medicament for treating a tumor.
137. Use of the polypeptide according to any of claims 11 to 14 in the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a cell proliferative disorder.
138. 30. Use of an antibody according to any of claims 15 to 29 in the preparation of a medicament for therapeutic treatment or diagnostic detection of cancer.
139. 30. Use of an antibody according to any of claims 15 to 29 in the preparation of a medicament for treating a tumor.
140. 30. Use of an antibody according to any of claims 15 to 29 in the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a cell proliferative disorder.
141. 45. Use of an oligopeptide according to any of claims 35 to 44 in the preparation of a medicament for therapeutic treatment or diagnostic detection of cancer.
142. 45. Use of an oligopeptide according to any of claims 35 to 44 in the preparation of a medicament for treating a tumor.
143. 45. Use of the oligopeptide according to any of claims 35 to 44 in the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a cell proliferative disorder.
144. Use of a TAT binding organic molecule according to any of claims 45 to 54 in the preparation of a medicament for therapeutic treatment or diagnostic detection of cancer.
145. Use of a TAT-binding organic molecule according to any of claims 45 to 54 in the preparation of a medicament for treating a tumor.
146. Use of a TAT binding organic molecule according to any of claims 45 to 54 in the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a cell proliferative disorder.
147. 57. Use of a composition according to any of claims 55 or 56 in the preparation of a medicament for therapeutic treatment or diagnostic detection of cancer.
148. 57. Use of a composition according to any of claims 55 or 56 in the preparation of a medicament for treating a tumor.
149. 57. Use of a composition according to any of claims 55 or 56 in the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a cell proliferative disorder.
150. 59. Use of a product according to any of claims 57 or 58 in the preparation of a medicament for therapeutic treatment or diagnostic detection of cancer.
151. 59. Use of a product according to any of claims 57 or 58 in the preparation of a medicament for treating a tumor.
152. 59. Use of a product according to any of claims 57 or 58 in the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a cell proliferative disorder.
153. A method of inhibiting cell growth, wherein proliferation of the cell comprises
(A) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) a polypeptide encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) a polypeptide encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78);
Relying at least in part on the growth enhancing effect of a protein having at least 80% amino acid sequence identity to the method, wherein the method comprises contacting the protein with an antibody, oligopeptide or organic molecule that binds to the protein; To inhibit the proliferation of the cells.
154. 154. The method of claim 153, wherein the cell is a cancer cell.
155. 154. The method of claim 153, wherein said protein is expressed by said cell.
156. 154. The method of claim 153, wherein binding of the antibody, oligopeptide or organic molecule to the protein antagonizes the cell growth-enhancing activity of the protein.
157. 154. The method of claim 153, wherein binding of the antibody, oligopeptide or organic molecule to the protein induces death of the cell.
158. 154. The method of claim 153, wherein said antibody is a monoclonal antibody.
159. 154. The method of claim 153, wherein said antibody is an antibody fragment.
160. 154. The method of claim 153, wherein said antibody is a chimeric or humanized antibody.
161. 154. The method of claim 153, wherein said antibody, oligopeptide or organic molecule is conjugated to a growth inhibitor.
162. 154. The method of claim 153, wherein said antibody, oligopeptide or organic molecule is conjugated to a cytotoxic agent.
163. 163. The method of claim 162, wherein said cytotoxic agent is selected from the group consisting of toxins, antibiotics, radioisotopes, and nucleolytic enzymes.
164. 163. The method of claim 162, wherein the cytotoxic agent is a toxin.
165. 165. The method of claim 164, wherein said toxin is selected from the group consisting of maytansinoids and calicheamicins.
166. 166. The method of claim 164, wherein the toxin is a maytansinoid.
167. 154. The method of claim 153, wherein said antibody is produced in bacteria.
168. 154. The method of claim 153, wherein said antibody is produced in CHO cells.
169. The protein is;
(A) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(C) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) having its associated signal peptide sequence;
(D) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of Figures 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(E) an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) an amino acid sequence encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78);
154. The method of claim 153, comprising:
170. A method of therapeutically treating a tumor in a mammal, wherein the growth of the tumor is;
(A) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) a polypeptide encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) a polypeptide encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78);
Depending at least in part on the growth enhancing effect of a protein having at least 80% amino acid sequence identity to the method, wherein the method comprises contacting the protein with an antibody, oligopeptide or organic molecule that binds to the protein, thereby And the method of treating the tumor effectively.
171. 178. The method of claim 170, wherein the protein is expressed by the tumor cells.
172. 170. The method of claim 170, wherein binding of the antibody, oligopeptide or organic molecule to the protein antagonizes the cell growth-enhancing activity of the protein.
173. 170. The method of claim 170, wherein said antibody is a monoclonal antibody.
174. 171. The method of claim 170, wherein the antibody is an antibody fragment.
175. 171. The method of claim 170, wherein said antibody is a chimeric or humanized antibody.
176. 171. The method of claim 170, wherein said antibody, oligopeptide or organic molecule is conjugated to a growth inhibitor.
177. 170. The method of claim 170, wherein said antibody, oligopeptide or organic molecule is conjugated to a cytotoxic agent.
178. 178. The method of claim 177, wherein said cytotoxic agent is selected from the group consisting of toxins, antibiotics, radioisotopes, and nucleolytic enzymes.
179. 178. The method of claim 177, wherein said cytotoxic agent is a toxin.
180. 179. The method of claim 179, wherein the toxin is selected from the group consisting of maytansinoids and calicheamicins.
181. 178. The method of claim 179, wherein the toxin is a maytansinoid.
182. 171. The method of claim 170, wherein said antibody is produced in bacteria.
183. 171. The method of claim 170, wherein said antibody is produced in CHO cells.
184. The protein is;
(A) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(C) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) having its associated signal peptide sequence;
(D) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of Figures 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(E) an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) an amino acid sequence encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78);
170. The method of claim 170, comprising:
185. (A) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) a polypeptide encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) a polypeptide encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78);
An isolated antibody that binds to a polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity to.
186. (A) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(C) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) having its associated signal peptide sequence;
(D) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of Figures 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(E) an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or
(F) an amino acid sequence encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78);
An isolated antibody that binds to a polypeptide having
187. 186. The antibody of claim 185, which is a monoclonal antibody.
188. 186. The antibody of claim 185, which is an antibody fragment.
189. 186. The antibody of claim 185, which is a chimeric or humanized antibody.
190. 186. The antibody of claim 185, conjugated to a growth inhibitor.
191. 186. The antibody of claim 185, conjugated to a cytotoxic agent.
192. 191. The antibody of claim 191, wherein said cytotoxic agent is selected from the group consisting of toxins, antibodies, radioisotopes and nucleolytic enzymes.
193. 191. The antibody of claim 191, wherein the cytotoxic agent is a toxin.
194. 196. The antibody of claim 193, wherein the toxin is selected from the group consisting of auristatin, maytansinoid and calicheamicin.
195. 196. The antibody of claim 193, wherein the toxin is maytansinoid.
196. 186. The antibody of claim 185, produced in bacteria.
197. 186. The antibody of claim 185, which is produced in CHO cells.
198. 186. The antibody of claim 185, wherein said antibody induces death of cells to which it binds.
199. 186. The antibody of claim 185, which is detectably labeled.
200. 196. The antibody of claim 193, wherein the toxin is selected from the group consisting of MMAE (mono-methyl auristatin E), MMAF, (auristatin E valeryl benzylhydrazone), and AFP (auristatin F phenylenediamine).
201. 196. The antibody of claim 193, wherein the toxin is covalently bound to the antibody by a linker.
202. The linker is maleimidocaproyl (MC) valine-citrulline (val-cit, vc) citrulline (2-amino-5-ureidopentanoic acid), PAB (P-aminobenzylcarbamoyl), Me (N-methyl-valine citrulline) MC (PEG) 6-OH (maleimidocaproyl-polyethylene glycol), SPP (4- (2-pyridylthio) pentanoic acid N-succinimidyl), SMCC (4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1carboxylic acid N- 202. The antibody of claim 201, selected from the group consisting of succinimidyl) and MC-vc-PAB.
203. 200. The antibody of claim 200, wherein the toxin is MMAE.
204. 200. The antibody of claim 200, wherein the toxin is MMAF.
205. 203. The antibody of claim 202, wherein the linker is MC-vc-PAB and the toxin is MMAE or MMFE.
206. 206. The antibody of any one of claims 185 to 205, wherein the antibody binds to a TAT188 polypeptide.
207. 207. The antibody of claim 206, wherein the antibody inhibits proliferation or promotes cell death of cells expressing TAT188.
208. 207. The antibody of claim 207, wherein the cell is a cancer cell.
209. 209. The method of claim 208, wherein said cancer cell is selected from the group consisting of breast, colon, rectum, endometrium, kidney, lung, ovary, skin and liver.
An antibody produced by a hybridoma selected from the group consisting of 210.3B5.1 (ATCC accession number PTA-6193), 12B9.1 (ATCC accession number PTA-6194) and 12G12.1 (ATCC accession number PTA-6195) An isolated antibody that competes for binding to an epitope of a TAT188 polypeptide bound by.
An antibody produced by a hybridoma selected from the group consisting of 211.3B5.1 (ATCC accession number PTA-6193), 12B9.1 (ATCC accession number PTA-6194) and 12G12.1 (ATCC accession number PTA-6195) An isolated antibody having the biological activity of wherein the biological activity is inhibition of cell proliferation or promotion of cell death in cells expressing TAT188. Released antibody.
Antibody produced by a hybridoma selected from the group consisting of 212.3B5.1 (ATCC accession number PTA-6193), 12B9.1 (ATCC accession number PTA-6194) and 12G12.1 (ATCC accession number PTA-6195) At least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% of at least 1, 2, 3, 4, 5 or 6 amino acid sequences of the CDRs of An isolated antibody comprising an amino acid sequence having 98%, 99% or 100% in the corresponding complementarity determining region (CDR).
213. In the corresponding complementarity-determining regions (CDRs), the antibodies are 3B5.1 (ATCC accession number PTA-6193), 12B9.1 (ATCC accession number PTA-6194) and 12G12.1 (ATCC accession number PTA-6195). ) At least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93 of the amino acid sequence of at least 1, 2, 3, 4, 5 or 6 of the CDRs of an antibody produced by a hybridoma selected from the group consisting of 207. The antibody of any one of claims 185 to 205, comprising an amino acid sequence having%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%.
214. The antibody is produced by a hybridoma selected from the group consisting of 3B5.1 (ATCC accession number PTA-6193), 12B9.1 (ATCC accession number PTA-6194) and 12G12.1 (ATCC accession number PTA-6195). 205. The antibody of any one of claims 185 to 205, wherein said antibody exhibits a biological activity, wherein said biological activity is inhibition of cell proliferation or promotion of cell death in cells expressing TAT188. .
215. 215. The antibody of claim 214, wherein the cell is a cancer cell.
216. 218. The antibody of claim 215, wherein the cancer cell is selected from the group consisting of breast, colon, rectum, endometrium, kidney, lung, ovary, skin and liver.
217. 207. A method of inhibiting the growth of a cell expressing TAT188, said method comprising contacting said cell with an antibody of any one of claims 185-205.
218. 218. The method of claim 217, wherein the cell is a cancer cell.
219. 219. The method of claim 218, wherein the cancer cells are selected from the group consisting of breast, colon, rectum, endometrium, kidney, lung, ovary, skin and liver.
220. 220. The method of claim 219, wherein the cancer cell is a mammalian cell.
221. 223. The method of claim 220, wherein the mammalian cell is a human cell.
222. 209. A method of inhibiting the growth of a cell expressing TAT188, comprising contacting the cell with an antibody according to any one of claims 185 to 205, wherein the antibody corresponds to In the complementarity determining region (CDR), selected from the group consisting of 3B5.1 (ATCC accession number PTA-6193), 12B9.1 (ATCC accession number PTA-6194) and 12G12.1 (ATCC accession number PTA-6195) At least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% of the amino acid sequence of at least 1, 2, 3, 4, 5 or 6 of the CDRs of the antibody produced by the hybridoma , 96%, 97%, 98%, 99% or 100%.
223. A method of detecting the level of TAT188 polypeptide expressed in a test cell relative to a control cell, the method comprising:
(A) contacting the test and control cells with the isolated anti-TAT188 antibody of claim 210;
(B) detecting binding of the antibody;
(C) measuring the relative binding of the antibody to the test and control cells;
The method characterized by the above-mentioned.
224. 224. The method of claim 223, wherein the test cell and control cell are lysed.
225. 224. The method of claim 223, wherein the test cell is in tissue.
226. 226. The method of claim 225, wherein the tissue is a tumor tissue.
227. 227. The method of claim 226, wherein the tumor tissue is selected from the group consisting of breast, colon, rectum, endometrium, kidney, lung, ovary, skin and liver.
228. A method of detecting the level of a TAT188 polypeptide relative to a control cell or a polypeptide having at least 80% sequence identity to the amino acid sequence shown in FIG. 115 (SEQ ID NO: 115) in a test cell comprising:
(A) contacting the test cell and the control cell with the isolated antibody of any one of claims 185-189, 196-199, and 210-212;
(B) detecting binding of the antibody;
(C) measuring the relative binding of the antibody to the test and control cells;
The method characterized by the above-mentioned.
229. 229. The method of claim 228, wherein the level of TAT188 polypeptide in the test cell is greater than that in a control cell.
230. 229. The method of claim 229, wherein the method diagnoses cancer in a tissue containing or having test cells contained therein.
231. (A) the nucleotide sequence shown in FIG. 37 (SEQ ID NO: 37); and
(B) the complement of (a);
A TAT-binding interfering RNA (siRNA) that binds to a nucleic acid having at least 80% sequence identity to the siRNA, wherein the siRNA decreases the expression of TAT188.
232. 244. An expression vector comprising the siRNA of claim 231.
233. 235. The expression vector of claim 232, wherein said siRNA is operably linked to a control sequence that is recognized by a host cell transfected with the vector.
234. 234. A host cell comprising the expression vector of claim 233.
235. In combination with the carrier
(A) the antibody of claim 185, or
(B) the siRNA of claim 231;
A composition comprising
236. 236. The composition of claim 235, wherein the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier.
237. (A) a container; and
(B) The composition of claim 235 contained in said container;
Including products.
238. 238. The product of claim 237, further comprising a label attached to the container or a package insert contained in the container, which refers to the use of the composition for therapeutic treatment or diagnostic detection of cancer.
239. 115. A method of inhibiting the growth of cancer cells that express a polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity to the amino acid sequence shown in FIG. 115 (SEQ ID NO: 115), said method comprising: The method comprising contacting the cancer cell with siRNA that binds to a nucleic acid encoding an amino acid, thereby inhibiting the growth of the cancer cell.
240. 240. The method of claim 239, wherein the nucleic acid has the sequence shown in Figure 37 (SEQ ID NO: 37).
241. 229. The method of claim 228, wherein detecting the level of expression of the polypeptide comprises trying the antibody in an immunohistochemical analysis.
242. 115. A method of treating or preventing a cell proliferative disorder associated with increased expression or activity of a polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity to the amino acid sequence shown in FIG. 115 (SEQ ID NO: 115), comprising: The method comprises administering to a subject in need of such treatment an effective amount of an agonist of a TAT188 polypeptide.
243. 245. The method of claim 242, wherein said antagonist is the isolated anti-TAT188 polypeptide antibody of any one of claims 1-21 and 23-28.
244. 244. The method of claim 243, wherein the cell proliferative disorder is cancer.
245. 245. The method of claim 244, wherein said cancer is selected from the group consisting of breast, colon, rectum, endometrium, kidney, lung, ovary, skin and liver.

本発明のなおさらなる具体例は、本明細書を読むと当業者に明らかであろう。   Still further embodiments of the invention will be apparent to those skilled in the art upon reading this specification.

Ｉ．定義
本明細書中で用い、かつ数字表示が直後に続く場合、用語「ＴＡＴポリペプチド」および「ＴＡＴ」は、種々のポリペプチドをいい、ここに、完全な表示（すなわち、ＴＡＴ／数字）とは、本明細書中に記載された具体的なポリペプチド配列をいう。本明細書中で用いるように用語「数字」が現実の数字表示として供される用語「ＴＡＴ／数字ポリペプチド」および「ＴＡＴ／数字」は、天然配列ポリペプチド、天然配列ポリペプチド変種、ならびに天然配列ポリペプチドおよび（さらに本明細書中で定義される）ポリペプチド変種の断片を含む。本明細書中で記載されるＴＡＴポリペプチドは、ヒト組織タイプから、またはもう１つの源からのように、種々の源から単離することができ、あるいは組換えまたは合成方法によって調製することができる。用語「ＴＡＴポリペプチド」とは、本明細書中に開示された各個々のＴＡＴ／数ポリペプチドをいう。「ＴＡＴポリペプチド」をいう本明細書中における全ての開示は、個々にならびに一緒にポリペプチドの各々をいう。例えば、病気の処置を含む組成物の調製、精製、誘導、それに対する抗体の形成、それに対するＴＡＴ結合オリゴペプチドの形成、それに対するＴＡＴ結合有機分子の形成、その投与は、個々に、本発明の各ポリペプチドに関する。用語「ＴＡＴポリペプチド」は、本明細書中に開示されたＴＡＴ／数ポリペプチドの変種も含む。 I. Definitions As used herein and when the numerical designation follows immediately, the terms “TAT polypeptide” and “TAT” refer to the various polypeptides, where the full designation (ie, TAT / number) and Refers to the specific polypeptide sequence described herein. As used herein, the term “TAT / number polypeptide” and “TAT / number”, where the term “number” serves as a real number representation, refers to native sequence polypeptides, native sequence polypeptide variants, and natural Includes fragments of sequence polypeptides and polypeptide variants (as further defined herein). The TAT polypeptides described herein can be isolated from a variety of sources, such as from human tissue types or from another source, or can be prepared by recombinant or synthetic methods. it can. The term “TAT polypeptide” refers to each individual TAT / number polypeptide disclosed herein. All disclosures herein that refer to “TAT polypeptides” refer to each of the polypeptides individually as well as together. For example, the preparation, purification, induction, formation of antibodies thereto, the formation of antibodies thereto, the formation of TAT-binding oligopeptides thereto, the formation of TAT-binding organic molecules, the administration thereof, individually, according to the invention It relates to each polypeptide. The term “TAT polypeptide” also includes variants of the TAT / number polypeptide disclosed herein.

「天然配列ＴＡＴポリペプチド」は、天然に由来する対応するＴＡＴポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ＴＡＴポリペプチドは天然から単離することができるか、あるいは組換えまたは合成手段によって生産することができる。用語「天然配列ＴＡＴポリペプチド」は、具体的には、特定のＴＡＴポリペプチドの天然に生じる切形されたまたは分泌された形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、ポリペプチドの天然に生じる変種形態（例えば、別法として、スプライスされた形態）および天然に生じる対立遺伝子変種を含む。本発明のある具体例において、本明細書中に開示される天然配列ＴＡＴポリペプチドは、添付の図面に示された全長アミノ酸配列を含む成熟または全長天然配列ポリペプチドである。（もし示されていれば）開始および停止コドンは、太文字のフォントで示され、および図面中では下線が施される。添付の図面中で、「Ｎ」と示される核酸残基はいずれかの核酸残基である。しかしながら、添付の図面に開示されたＴＡＴポリペプチドは、図面中のアミノ酸位置１としてのここに指定されるメチオニン残基で開始することが示されるが、図面中のアミノ酸位置１から上流または下流に位置する他のメチオニン残基を、ＴＡＴポリペプチドについての開始アミノ酸残基として使用することができると考えられ、かつそれが可能である。   A “native sequence TAT polypeptide” includes a polypeptide having the same amino acid sequence as the corresponding TAT polypeptide derived from nature. Such native sequence TAT polypeptides can be isolated from nature or can be produced by recombinant or synthetic means. The term “native sequence TAT polypeptide” specifically includes naturally occurring truncated or secreted forms (eg, extracellular domain sequences) of a particular TAT polypeptide, naturally occurring variant forms of a polypeptide. (Eg, alternatively, spliced form) and naturally occurring allelic variants. In certain embodiments of the invention, the native sequence TAT polypeptide disclosed herein is a mature or full-length native sequence polypeptide comprising the full-length amino acid sequence shown in the accompanying drawings. Start and stop codons (if indicated) are shown in bold font and are underlined in the figure. In the accompanying drawings, the nucleic acid residue indicated as “N” is any nucleic acid residue. However, the TAT polypeptide disclosed in the accompanying figures is shown to start at the methionine residue designated herein as amino acid position 1 in the figure, but upstream or downstream from amino acid position 1 in the figure. It is contemplated and possible that other located methionine residues can be used as starting amino acid residues for the TAT polypeptide.

ＴＡＴポリペプチド「細胞該ドメイン」または「ＥＣＤ」とは、膜貫通および細胞質ドメインを実質的に含まないＴＡＴポリペプチドの形態をいう。通常、ＴＡＴポリペプチドＥＣＤは１％未満のそのような膜貫通および／または細胞質ドメインを有し、好ましくは、０．５％未満のそのようなドメインを有する。本発明のＴＡＴポリペプチドで同定されるいずれの膜貫通ドメインも疎水性ドメインのそのタイプを同定するための当該分野でルーチン的に使用される基準に従って同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの正確な境界は変化し得るが、最もありそうには、本明細書中において最初に同定されたドメインのいずれかの末端において約５以下のアミノ酸だけである。所望により、従って、ＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメインは、実施例および明細書中で同定された膜貫通ドメイン／細胞外ドメイン境界のいずれか側に約５以下のアミノ酸を含有することができ、会合するシグナルペプチドを含むまたは含まないそのようなポリペプチドおよびそれをコードする核酸が本発明で考えられる。   The TAT polypeptide “cell said domain” or “ECD” refers to a form of a TAT polypeptide that is substantially free of transmembrane and cytoplasmic domains. Usually, a TAT polypeptide ECD has less than 1% of such transmembrane and / or cytoplasmic domains, preferably less than 0.5% of such domains. It will be understood that any transmembrane domain identified in the TAT polypeptide of the present invention is identified according to criteria routinely used in the art to identify that type of hydrophobic domain. The exact boundaries of the transmembrane domain can vary, but most likely is no more than about 5 amino acids at either end of the domain originally identified herein. Optionally, the extracellular domain of the TAT polypeptide can therefore contain no more than about 5 amino acids on either side of the transmembrane domain / extracellular domain boundary identified in the Examples and specification Such polypeptides with and without signal peptides and nucleic acids encoding them are contemplated by the present invention.

本明細書中で開示された種々のＴＡＴポリペプチドの「シグナルペプチド」の近似的な位置は、本明細書および／または添付の図面中で示すことができる。しかしながら、シグナルペプチドのＣ−末端境界は変化し得るが、最もありそうには、本明細書中で最初に同定されたシグナルペプチドＣ−末端境界のいずれか側において約５以下のアミノ酸だけであり、他方、シグナルペプチドのＣ−末端境界は、アミノ酸配列の要素のそのタイプを同定するための当該分野でルーチン的に使用される基準に従って同定できることを注記する（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：１−６（１９９７）およびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９６（１９８６））。さらに、ある場合には、分泌されたポリペプチドからのシグナル配列の切断は全く均一というのではなく、その結果、１を超える分泌された種が生じることも認識される。シグナルペプチドは本明細書中で同定されたシグナルペプチドのＣ−末端境界いずれか側で約５以下のアミノ酸内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドが本発明で考えられる。   The approximate location of the “signal peptide” of the various TAT polypeptides disclosed herein can be indicated herein and / or in the accompanying drawings. However, the C-terminal boundary of the signal peptide can vary, but most likely is no more than about 5 amino acids on either side of the signal peptide C-terminal boundary originally identified herein. On the other hand, note that the C-terminal boundary of the signal peptide can be identified according to criteria routinely used in the art for identifying that type of element of an amino acid sequence (see, eg, Nielsen et al., Prot. Eng.10: 1-6 (1997) and von Heinje et al., Nucl.Acids.Res.14: 4683-4696 (1986)). Furthermore, it is recognized that in some cases, cleavage of the signal sequence from the secreted polypeptide is not quite uniform, resulting in more than one secreted species. Signal peptides are contemplated by the present invention as those mature polypeptides that are cleaved within about 5 amino acids or less on either side of the C-terminal boundary of the signal peptides identified herein, and polynucleotides encoding them. It is done.

「ＴＡＴポリペプチド変種」は、ＴＡＴポリペプチド、好ましくは、本明細書中に開示される全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列に対して少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有するとここに定義されるＴＡＴポリペプチド、本明細書中に開示されるシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチド配列、本明細書中で開示されるシグナルペプチドを含むまたは含まないＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン、または（全長ＴＡＴポリペプチドについての完全なコーディング配列の一部のみを表す核酸によってコードされるもののような）本明細書中で開示される全長ＴＡＴポリペプチド配列のいずれかの他の断片を意味する。そのようなＴＡＴポリペプチドは、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ−またはＣ−末端において、１以上のアミノ酸残基が付加され、または欠失されたＴＡＴポリペプチドを含む。通常、ＴＡＴポリペプチド変種は、本明細書中に開示された全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、本明細書中で開示されたシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチド配列、本明細書中で開示されたシグナルペプチドを含むまたは含まないＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン、または本明細書中で開示された全長ＴＡＴポリペプチド配列のいずれかの他の具体的に定義された断片に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％アミノ酸配列同一性を有するであろう。通常、ＴＡＴ変種ポリペプチドは長さが少なくとも約１０アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００アミノ酸またはそれ以上である。所望により、ＴＡＴ変種ポリペプチドは、天然ＴＡＴポリペプチド配列と比較して、１以下保存的アミノ酸置換、あるいは天然ＴＡＴポリペプチド配列と比較して２、３、４、５、６、７、８、９または１０以下の保存的アミノ酸置換を有するであろう。   A “TAT polypeptide variant” is a TAT polypeptide, preferably a TAT as defined herein having at least about 80% amino acid sequence identity to the full-length native sequence TAT polypeptide sequence disclosed herein. A polypeptide, a TAT polypeptide sequence lacking a signal peptide disclosed herein, an extracellular domain of a TAT polypeptide with or without a signal peptide disclosed herein, or (for a full-length TAT polypeptide Other fragments of any of the full-length TAT polypeptide sequences disclosed herein (such as those encoded by nucleic acids that represent only a portion of the complete coding sequence). Such TAT polypeptides include, for example, TAT polypeptides with one or more amino acid residues added or deleted at the N- or C-terminus of the full-length natural amino acid sequence. Typically, a TAT polypeptide variant is a full-length native sequence TAT polypeptide sequence disclosed herein, a TAT polypeptide sequence that lacks a signal peptide disclosed herein, a signal disclosed herein. At least about 80% relative to the extracellular domain of a TAT polypeptide with or without a peptide, or any other specifically defined fragment of any of the full-length TAT polypeptide sequences disclosed herein. Amino acid sequence identity, or at least about 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 98% or 99% amino acid sequence identity. Typically, the TAT variant polypeptide is at least about 10 amino acids in length, or at least about 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, in length. 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 amino acids or more. Optionally, the TAT variant polypeptide has no more than one conservative amino acid substitution compared to the native TAT polypeptide sequence, or 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, compared to the native TAT polypeptide sequence. It will have no more than 9 or 10 conservative amino acid substitutions.

本明細書中で確認されるＴＡＴポリペプチド配列に関して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要であれば、ギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成した後、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮せず、特定のＴＡＴポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的での整列は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ （ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを用い、当該分野における技量内の種々の方法で達成することができる。当業者であれば、比較すべき配列の全長にわたって最大整列を達成するのに必要ないずれかのアルゴリズムを含めた、整列を測定するための適当なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的では、％アミノ酸配列同一性値は配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて作り出され、ここに、ＡＬＩＧＮ−２プログラムのための完全な源コードは後に表１に供される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著作されており、後の表１に示される源コードは合衆国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９のユーザードキュメンテーションに申請されており、そこで、それは合衆国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通じて公に入手可能であり、あるいは後の表１に供される源コードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＵＮＩＸ（登録商標）操作システム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄで用いるためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変化しない。   “Percent (%) amino acid sequence identity” with respect to the TAT polypeptide sequences identified herein is after aligning the sequences and, if necessary, introducing gaps to achieve maximum percent sequence identity. , Defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to amino acid residues in a particular TAT polypeptide sequence, without considering any conservative substitutions as part of sequence identity. Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be accomplished using a variety of methods within the skill in the art, using publicly available computer software such as, for example, BLAST, BLAST-2, ALIGN, or Megalign (DNASTAR) software. Can be achieved in a way. One skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences to be compared. However, for purposes herein,% amino acid sequence identity values are generated using the sequence comparison computer program ALIGN-2, where the complete source code for the ALIGN-2 program is provided later in Table 1. . The ALIGN-2 sequence comparison computer program is available from Genentech, Inc. The source codes shown in Table 1 below are U.S. Copyright Office, Washington D. C. , 20559, which is registered under US copyright registration number TXU510087. The ALIGN-2 program is available from Genentech, Inc. , South San Francisco, California, or can be compiled from the source code provided in Table 1 below. The ALIGN-2 program should be compiled for use with a UNIX operating system, preferably digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not change.

ＡＬＩＧＮ−２をアミノ酸配列比較で使用する状況では、（与えられたアミノ酸配列Ｂに対してある％アミノ酸配列同一性を有し、またはそれを含む与えられたアミノ酸配列Ａと別法として表現できる）与えられたアミノ酸配列Ｂに対する与えられたアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性は以下のように計算される：
１００×分率Ｘ／Ｙ
ここに、Ｘは、ＡおよびＢのそのプログラムの整列における配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２による同一マッチとしてスコアが与えられたアミノ酸残基の数であり、およびここに、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の合計数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが認識されよう。この方法を用いる％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２および３は、「ＴＡＴ」と命名されたアミノ酸配列に対する「比較蛋白質」と命名されたアミノ酸配列の％アミノ酸配列同一性をどのようにして計算するかを示し、ここに、「ＴＡＴ」は注目する仮定ＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較蛋白質」は、それに対して注目する「ＴＡＴ」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を表し、および「Ｘ」、「Ｙ」および「Ｚ」は、各々、異なる仮定アミノ酸残基を表す。特に断りのない限り、本明細書中で用いる全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて直前のパラグラフに記載したように得られる。 In situations where ALIGN-2 is used in amino acid sequence comparisons (which can alternatively be expressed with a given amino acid sequence A having or containing a certain amino acid sequence B) The% amino acid sequence identity of a given amino acid sequence A to a given amino acid sequence B is calculated as follows:
100 x fraction X / Y
Where X is the number of amino acid residues scored as an identical match by the sequence alignment program ALIGN-2 in that program alignment of A and B, and where Y is the number of amino acid residues in B The total number. It will be appreciated that if the length of amino acid sequence A is not equal to the length of amino acid sequence B, then the% amino acid sequence identity of A to B is not equal to the% amino acid sequence identity of B to A. As an example of calculating% amino acid sequence identity using this method, Tables 2 and 3 show how the% amino acid sequence identity of the amino acid sequence named “Comparative Protein” relative to the amino acid sequence named “TAT”. Where “TAT” represents the amino acid sequence of the hypothetical TAT polypeptide of interest and “comparison protein” refers to the polypeptide of the polypeptide to which the “TAT” polypeptide of interest is compared. Represents the amino acid sequence, and "X", "Y" and "Z" each represent a different hypothetical amino acid residue. Unless otherwise noted, all% amino acid sequence identity values used herein are obtained as described in the immediately preceding paragraph using the ALIGN-2 computer program.

「ＴＡＴ変種ポリヌクレオチド」または「ＴＡＴ変種核酸配列」は、本明細書中で定義されたＴＡＴポリペプチド、好ましくは活性ＴＡＴポリペプチドをコードし、かつ本明細書中に開示された全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを含むまたは含まないＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン、または（全長ＴＡＴポリペプチドについての完全なコーディング配列の一部のみを表す核酸によってコードされたもののような）本明細書中に開示された全長ＴＡＴポリペプチド配列のいずれかの他の断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常、ＴＡＴ変種ポリヌクレオチドは、本明細書中に開示された全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、本明細書中に開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＴＡＴポリペプチド配列、本明細書中で開示されたシグナル配列を含むまたは含まないＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン、または本明細書中で開示された全長ＴＡＴポリペプチド配列のいずれかの他の断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％核酸配列同一性、別法として、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％核酸配列同一性を有するであろう。変種は天然ヌクレオチド配列を含まない。   A “TAT variant polynucleotide” or “TAT variant nucleic acid sequence” encodes a TAT polypeptide as defined herein, preferably an active TAT polypeptide, and the full-length native sequence TAT disclosed herein. A polypeptide sequence, a full length native sequence TAT polypeptide sequence lacking the signal peptide disclosed herein, an extracellular domain of a TAT polypeptide with or without a signal peptide disclosed herein, or (full length A nucleic acid sequence encoding any other fragment of any of the full-length TAT polypeptide sequences disclosed herein (such as that encoded by a nucleic acid that represents only a portion of the complete coding sequence for a TAT polypeptide). By means meant a nucleic acid molecule having at least about 80% nucleic acid sequence identity. Typically, a TAT variant polynucleotide is a full-length native sequence TAT polypeptide sequence disclosed herein, a full-length native sequence TAT polypeptide sequence lacking the signal peptide disclosed herein, disclosed herein. At least about 80% relative to the nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of a TAT polypeptide with or without a rendered signal sequence, or any other fragment of any of the full-length TAT polypeptide sequences disclosed herein Nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, It will have 96%, 97%, 98% or 99% nucleic acid sequence identity. Variants do not contain the native nucleotide sequence.

通常、ＴＡＴ変種ポリヌクレオチドは長さが少なくとも５ヌクレオチドであり、別法として、長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００ヌクレオチドであり、ここに、この関係では用語「約」は言及されたヌクレオチド配列長さ±その言及された長さの１０％を意味する。   Typically, a TAT variant polynucleotide is at least 5 nucleotides in length, and alternatively, is at least about 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 in length. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 , 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240 , 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 30, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 or 1000 nucleotides, where in this context the term “about” means the nucleotide sequence length referred to ± 10% of the mentioned length .

本明細書中で確認されるＴＡＴ−コーディング核酸配列に関して「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列を整列させ、もし必要であればギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後に、注目するＴＡＴ核酸配列におけるヌクレオチドに対して同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージと定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的での整列は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを用い、当該分野における技量内である種々の方法で達成することができる。しかしながら、この目的では、％核酸配列同一性は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて作り出され、ここに、ＡＬＩＧＮ−２プログラムについての完全な源コードを後に表１に供する。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著作され、後の表１に示された源コードは合衆国著作権局，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９におけるユーザードキュメンテーションに申請され、そこで、それは合衆国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通じて公に入手可能であり、あるいは後の表１に供された源コードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＵＮＩＸ（登録商標）操作システム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄで用いるためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変化しない。   “Percent (%) nucleic acid sequence identity” with respect to the TAT-encoding nucleic acid sequence identified herein is after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve maximum percent sequence identity. , Defined as the percentage of nucleotides in the candidate sequence that are identical to the nucleotides in the TAT nucleic acid sequence of interest. Alignment for the purpose of determining percent nucleic acid sequence identity can be accomplished within the skill of the art using publicly available computer software such as, for example, BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software. Can be achieved by For this purpose, however,% nucleic acid sequence identity was created using the sequence comparison computer program ALIGN-2, where the complete source code for the ALIGN-2 program is provided later in Table 1. The ALIGN-2 sequence comparison computer program is available from Genentech, Inc. And the source codes shown later in Table 1 are from the United States Copyright Office, Washington D .; C. , 20559, where it is registered under US copyright registration number TXU510087. The ALIGN-2 program is available from Genentech, Inc. , South San Francisco, California, or can be compiled from the source code provided in Table 1 below. The ALIGN-2 program should be compiled for use with a UNIX operating system, preferably digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not change.

ＡＬＩＧＮ−２が核酸配列比較で使用される状況では、（与えられた核酸配列Ｄに対してある％核酸配列同一性を有する、またはそれを含む与えられた核酸配列Ｃと別法としていうことができる）与えられた核酸配列Ｄに対して与えられた核酸配列Ｃの％核酸配列同一性は以下のように計算される：
１００×分率Ｗ／Ｚ
ここに、Ｗは、ＣおよびＤのそのプログラムの整列における配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一のマッチとしてスコアが与えられたヌクレオチドの数であり、およびここに、ＺはＤにおけるヌクレオチドの合計数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さが等しくない場合、Ｄに対するＣの％核酸配列同一性はＣに対するＤの％核酸配列同一性に等しくないことが認識されよう。％核酸配列同一性計算の例として、表４および５は、「ＴＡＴ−ＤＮＡ」と命名された核酸配列に対する「比較ＤＮＡ」と命名された核酸配列の％核酸配列同一性をどのようにして計算するかを示し、ここに、「ＴＡＴ−ＤＮＡ」は注目する仮定ＴＡＴ−コーディング核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」は、それに対して注目する「ＴＡＴ−ＤＮＡ」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を表し、および「Ｎ」、「Ｌ」および「Ｖ」は、各々、異なる仮定ヌクレオチドを表す。特に断りのない限り、本明細書中で用いる全ての％核酸配列同一性は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて直前のパラグラフに記載されたようにして得られる。 In situations where ALIGN-2 is used in nucleic acid sequence comparisons (alternatively referred to as a given nucleic acid sequence C having or including a certain nucleic acid sequence identity to a given nucleic acid sequence D) The% nucleic acid sequence identity of a given nucleic acid sequence C to a given nucleic acid sequence D can be calculated as follows:
100 x fraction W / Z
Where W is the number of nucleotides scored as an identical match by the sequence alignment program ALIGN-2 in that program alignment of C and D, and where Z is the total number of nucleotides in D is there. It will be appreciated that if the length of nucleic acid sequence C is not equal to the length of nucleic acid sequence D, then the percent nucleic acid sequence identity of C to D is not equal to the percent nucleic acid sequence identity of D to C. As an example of% nucleic acid sequence identity calculation, Tables 4 and 5 show how% nucleic acid sequence identity of a nucleic acid sequence named “Comparative DNA” relative to a nucleic acid sequence named “TAT-DNA” is calculated. Where “TAT-DNA” represents the hypothetical TAT-coding nucleic acid sequence of interest and “comparison DNA” is the nucleic acid molecule to which the “TAT-DNA” nucleic acid molecule of interest is compared. Represents a nucleotide sequence and “N”, “L” and “V” each represent a different hypothesized nucleotide. Unless otherwise noted, all% nucleic acid sequence identity used herein is obtained as described in the immediately preceding paragraph using the ALIGN-2 computer program.

他の具体例において、ＴＡＴ変種ポリヌクレオチドは、ＴＡＴポリペプチドをコードし、かつ好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、本明細書中に開示された全長ＴＡＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる核酸分子である。ＴＡＴ変種ポリペプチドはＴＡＴ変種ポリヌクレオチドによってコードされるものであり得る。   In other embodiments, the TAT variant polynucleotide encodes a TAT polypeptide, and preferably a nucleotide that encodes the full-length TAT polypeptide disclosed herein under stringent hybridization and wash conditions. A nucleic acid molecule that can hybridize to a sequence. The TAT variant polypeptide can be one encoded by a TAT variant polynucleotide.

用語「全長コーディング領域」とは、ＴＡＴポリペプチドをコードする核酸に言及して用いられる場合、（添付の図面において、包括的に、開始および停止コドンの間にしばしば示される）本発明の全長ＴＡＴポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列をいう。用語「全長コーディング領域」とは、ＡＴＣＣ寄託核酸に言及して用いられる場合、（添付の図面において、包括的に、開始および停止コドンの間でしばしば示される）ＡＴＣＣに寄託されたベクターに挿入されるｃＤＮＡのＴＡＴポリペプチド−コーディング部分をいう。   The term “full length coding region” when used in reference to a nucleic acid encoding a TAT polypeptide, the full length TAT of the present invention (which is often shown generally between start and stop codons in the accompanying drawings). The sequence of nucleotides encoding a polypeptide. The term “full length coding region”, when used in reference to an ATCC deposited nucleic acid, is inserted into a vector deposited with the ATCC (shown generically between the start and stop codons generically in the accompanying drawings). Refers to the TAT polypeptide-coding portion of the cDNA.

「単離された」は、本明細書中に開示された種々のＴＡＴポリペプチドを記載するのに用いる場合、その天然環境の成分から同定され、かつ分離されおよび／または回収されたポリペプチドを意味する。その天然環境の汚染成分は、典型的には、ポリペプチドについての診断または治療用途に典型的には干渉する材料であり、酵素、ホルモン、および他の蛋白質性または非−蛋白質性溶質を含むことができる。好ましい具体例において、ポリペプチドは、（１）スピニングカップセケネータの使用によってＮ−末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、あるいは（２）クーマシーブルー、あるいは好ましくは銀染色を用いて、非−還元または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一となるまで精製されるであろう。単離されたポリペプチドは、組換え細胞内のイン・サイチュポリペプチドを含む。というのは、ＴＡＴポリペプチド天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないからである。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。   “Isolated”, as used to describe the various TAT polypeptides disclosed herein, refers to polypeptides that have been identified and separated and / or recovered from components of their natural environment. means. Contaminant components of its natural environment are typically materials that typically interfere with diagnostic or therapeutic uses for polypeptides and include enzymes, hormones, and other proteinaceous or non-proteinaceous solutes. Can do. In preferred embodiments, the polypeptide is (1) sufficient to obtain at least 15 residues of the N-terminal or internal amino acid sequence by use of a spinning cup sequenator, or (2) Coomassie blue, or preferably Will be purified to homogeneity by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using silver staining. Isolated polypeptide includes the polypeptide in situ within recombinant cells. This is because there is no at least one component of the TAT polypeptide natural environment. Ordinarily, however, isolated polypeptide will be prepared by at least one purification step.

「単離された」ＴＡＴポリペプチド−コーディング核酸または他のポリペプチド−コーディング核酸は、それが、通常は、ポリペプチド−コーディング核酸の天然源において会合する少なくとも１つの汚染核酸分子から同定され、分離された核酸分子である。単離されたポリペプチド−コーディング核酸分子は、天然で見出される形態または設定以外である。従って、単離されたポリペプチド−コーディング核酸分子は、特定のポリペプチド−コーディング核酸分子から区別される。というのは、それは天然細胞に存在するからである。しかしながら、単離されたポリペプチド−コーディング核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のそれとは異なる染色体位置にある場合に、通常はポリペプチドを発現する細胞に含有されたポリペプチド−コーディング核酸分子を含む。   An “isolated” TAT polypeptide-encoding nucleic acid or other polypeptide-encoding nucleic acid is identified and separated from at least one contaminating nucleic acid molecule with which it normally associates in the natural source of the polypeptide-encoding nucleic acid. Nucleic acid molecule. An isolated polypeptide-encoding nucleic acid molecule is other than in the form or setting in which it is found in nature. Thus, an isolated polypeptide-encoding nucleic acid molecule is distinguished from a particular polypeptide-encoding nucleic acid molecule. This is because it exists in natural cells. However, an isolated polypeptide-encoding nucleic acid molecule is typically a polypeptide-encoding nucleic acid molecule contained in a cell that expresses the polypeptide, for example when the nucleic acid molecule is in a chromosomal location different from that of natural cells. including.

用語「制御配列」とは、特定の宿主生物において操作可能に連結されたコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列を言う。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモータ、所望によりオペレータ配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞はプロモータ、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。   The term “control sequence” refers to a DNA sequence necessary for the expression of a coding sequence operably linked in a particular host organism. The control sequences that are suitable for prokaryotes, for example, include a promoter, optionally an operator sequence, and a ribosome binding site. Eukaryotic cells are known to utilize promoters, polyadenylation signals, and enhancers.

核酸は、それがもう１つの核酸配列とで機能的な関係に入った場合に、「操作可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのＤＮＡは、もしそれがポリペプチドの分泌に参画するプレ蛋白質として発現されるならば、ポリペプチドについてのＤＮＡに操作可能に連結されており；プロモータまたはエンハンサーは、もしそれが配列の転写に影響するならば、コーディング配列に操作可能に連結されており；あるいはリボソーム結合部位は、もしそれが転写を促進するように位置しているならば、コーディング配列に操作可能に連結されている。一般に、「操作可能に連結された」は、連結されるＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には、連続しており、かつリーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要はない。連結は便宜な制限部位における連結によって達成される。もしそのような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを慣用的なプラクティスに従って用いられる。   A nucleic acid is “operably linked” when it enters a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, the DNA for a presequence or secretion leader is operably linked to the DNA for the polypeptide if it is expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide; If it affects the transcription of the sequence, it is operably linked to the coding sequence; or the ribosome binding site is operable to the coding sequence if it is positioned to promote transcription It is connected to. In general, “operably linked” means that the DNA sequences to be linked are contiguous and, in the case of a secretory leader, are contiguous and in the reading phase. However, enhancers do not have to be contiguous. Ligation is accomplished by ligation at convenient restriction sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used according to conventional practice.

ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者によって決定可能であり、一般には、プローブの長さ、洗浄温度および塩濃度に依存した経験的な計算である。一般に、より長いプローブは適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、他方、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般には、相補的なストランドがその融解温度未満の環境に存在する場合に、再度アニールする変性ＤＮＡの能力に依存する。プローブおよびハイブリダイゼーション配列の間の所望の相同性の程度がより高くなれば、用いることができる相対的温度がより高くなる。その結果、より高い相対的温度は反応条件をよりストリンジェントとする傾向があり、他方、より低い温度は余りストリンジェントではないということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）参照。   The “stringency” of a hybridization reaction can be determined by one skilled in the art and is generally an empirical calculation that depends on probe length, wash temperature, and salt concentration. In general, longer probes require higher temperatures for proper annealing, while shorter probes require lower temperatures. Hybridization generally depends on the ability of denatured DNA to anneal again when complementary strands are present in an environment below its melting temperature. The higher the degree of desired homology between the probe and the hybridization sequence, the higher the relative temperature that can be used. As a result, higher relative temperatures tend to make the reaction conditions more stringent, while lower temperatures are less stringent. For further details and explanation of the stringency of hybridization reactions, see Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

本明細書中で定義される「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は；（１）洗浄のために低いイオン強度および高温、例えば、５０℃における０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用し；（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドのような変性剤、例えば、４２℃における、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を使用し；あるいは（３）０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中での４２℃における１０分間の洗浄を伴う、４２℃において５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロ硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）０．１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸を使用する溶液中での一晩のハイブリダイゼーション、引き続いての、５５℃における、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣよりなる１０分間の高−ストリンジェンシー洗浄を使用することによって同定することができる。   “Stringent conditions” or “high stringency conditions” as defined herein are: (1) 0.015 M sodium chloride / 0.0015 M at low ionic strength and high temperature for washing, eg, 50 ° C. Sodium citrate / 0.1% sodium dodecyl sulfate; (2) a denaturing agent such as formamide during hybridization, eg, containing 750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate at 42 ° C., 0.1 Use 50 mM sodium phosphate buffer of% bovine serum albumin / 0.1% Ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / pH 6.5; or (3) in 0.2 × SSC (sodium chloride / sodium citrate) 50% form at 42 ° C. with a 10 minute wash at 42 ° C. Mid, 5 × SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 6.8), 0.1% sodium pyrosulfate, 5 × Denhardt's solution, sonicated salmon sperm DNA (50 μg / Ml) overnight hybridization in a solution using 0.1% SDS, 10% dextran sulfate, followed by 10 min high consisting of 0.1 × SSC containing EDTA at 55 ° C. It can be identified by using stringency washing.

「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって記載されているように同定することができ、それは前記したものより余りストリンジェントでない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での３７℃における一晩のインキュベーション、続いての、約３７ないし５０℃における１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄である。当業者であれば、温度、イオン強度等をどのようにして調整して、必要であれば、プローブ長等のような因子を受け入れるかを認識するであろう。   “Moderately stringent conditions” are described in Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, which is less stringent than those described above and hybridization conditions (eg, temperature, Use of ionic strength and% SDS). Examples of moderately stringent conditions are 20% formamide, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 × Denhardt's solution 10% dextran sulfate, and 20 mg Overnight incubation at 37 ° C. in a solution containing / ml denatured sheared salmon sperm DNA, followed by washing of the filter in 1 × SSC at about 37-50 ° C. One skilled in the art will recognize how to adjust temperature, ionic strength, etc., and accept factors such as probe length, if necessary.

用語「エピトープタグド」は、本明細書中で用いる場合、「タグポリペプチド」に融合したＴＡＴポリペプチドまたは抗−ＴＡＴ抗体を含むキメラポリペプチドをいう。タグポリペプチドは、それに対して抗体を作成することができるエピトープを供するのに十分な残基を有するが、それが、縮合するポリペプチドの活性に干渉しないように十分短い。タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープに実質的に交差しないようにかなりユニークである。適当なタグポリペプチドは、一般には、少なくとも６のアミノ酸残基、通常、約８および５０アミノ酸の間の残基（好ましくは、約１０および２０アミノ酸の間の残基）を有する。   The term “epitope tagged” as used herein refers to a chimeric polypeptide comprising a TAT polypeptide or anti-TAT antibody fused to a “tag polypeptide”. The tag polypeptide has sufficient residues to provide an epitope against which antibodies can be generated, but short enough so that it does not interfere with the activity of the condensing polypeptide. The tag polypeptide is preferably fairly unique so that the antibody does not substantially cross other epitopes. Suitable tag polypeptides generally have at least 6 amino acid residues, usually between about 8 and 50 amino acids (preferably between about 10 and 20 amino acids).

ここでの目的のためには「活性な」または「活性」とは、天然または天然に生じるＴＡＴの生物学的および／または免疫学的値を保持するＴＡＴポリペプチドの形態を言い、ここに、「生物学的」活性とは、天然または天然に生じるＴＡＴによって保有された抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘導する能力以外の天然または天然に生じるＴＡＴによって引き起こされた生物学的機能（阻害性または刺激性いずれか）をいい、「免疫学的」活性とは、天然または天然に生じるＴＡＴによって保有される抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘導する能力をいう。   For purposes herein, “active” or “activity” refers to a form of a TAT polypeptide that retains the biological and / or immunological values of a naturally occurring or naturally occurring TAT, wherein A “biological” activity is a biological function (inhibitory or natural) caused by a natural or naturally occurring TAT other than the ability to induce the production of antibodies to antigenic epitopes carried by the natural or naturally occurring TAT. “Immunological” activity refers to the ability to induce the production of antibodies to an antigenic epitope carried by a naturally occurring or naturally occurring TAT.

用語「アンタゴニスト」は最も広い意味で用いられ、本明細書中に開示される天然ＴＡＴポリペプチドの生物学的活性を部分的にまたは十分にブロックし、阻害し、中和するいずれの分子も含む。同様に、用語「アゴニスト」は最も広い意味で用いられ、本明細書中に開示された天然ＴＡＴポリペプチドの生物学的活性を模倣するいずれの分子も含む。適当なアゴニストまたはアンタゴニスト分子は、具体的には、アゴニストまたはアンタゴニスト抗体または抗体断片、天然ＴＡＴポリペプチドの断片またはアミノ酸配列変種、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小有機分子等を含む。ＴＡＴポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための方法は、ＴＡＴポリペプチドを候補アゴニストまたはアンタゴニスト分子と接触させ、次いで、ＴＡＴポリペプチドに通常は関連する１以上の生物学的活性における検出可能な変化を測定することを含むことができる。   The term “antagonist” is used in the broadest sense and includes any molecule that partially or fully blocks, inhibits, and neutralizes the biological activity of a native TAT polypeptide disclosed herein. . Similarly, the term “agonist” is used in the broadest sense and includes any molecule that mimics the biological activity of a native TAT polypeptide disclosed herein. Suitable agonist or antagonist molecules specifically include agonist or antagonist antibodies or antibody fragments, fragments or amino acid sequence variants of natural TAT polypeptides, peptides, antisense oligonucleotides, small organic molecules, and the like. A method for identifying an agonist or antagonist of a TAT polypeptide involves contacting the TAT polypeptide with a candidate agonist or antagonist molecule and then detecting a detectable change in one or more biological activities normally associated with the TAT polypeptide. Can be measured.

「治療する」または「治療」または「軽減」とは、治療的処置および予防的または予防手段を共にいい、ここに、目的は標的となる病理学的状態または障害を妨げ、または遅延させる（低める）ことにある。処置を必要とする者は、障害を既に持つ者、ならびに障害を有する傾向がある者、障害を予防すべき者を含む。被験体または哺乳動物は、もし、本発明の方法に従った治療量の抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子を受けた後に、患者が以下の：癌細胞の数の低下、または癌細胞の不存在；腫瘍サイズの低下；柔軟組織または骨への癌の拡大を含めた、末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度遅くすること、好ましくは停止させること）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度遅くすること、好ましくは停止させること）；腫瘍成長のある程度の阻害；および／または特定の癌に関連する徴候の１以上のある程度までの緩和；低下した罹患率および死亡率および生活の質の論点の改善の１以上における観察可能なおよび／または測定可能な低下、あるいはその不存在を示せば、ＴＡＴポリペプチド−発現癌について首尾よく「治療」されている。抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴ結合オリゴペプチドが存在する癌細胞の成長を妨げ、および／または死滅させることができる程度に、それは細胞静止および／または細胞傷害性であり得る。これらの徴候または症状の低下もまた患者は感じることができるであろう。   “Treat” or “treatment” or “reduction” refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures, where the purpose is to prevent or delay (reduce) the targeted pathological condition or disorder. ) That is. Those in need of treatment include those who already have a disability, as well as those who tend to have a disability, and those who should be prevented. The subject or mammal should receive a therapeutic amount of an anti-TAT antibody, TAT-binding oligopeptide or TAT-binding organic molecule according to the method of the present invention, after the patient: Or absence of cancer cells; reduction of tumor size; inhibition of cancer cell invasion into peripheral organs, including expansion of cancer to soft tissue or bone (ie slowing, preferably stopping to some extent); Inhibition of tumor metastasis (ie slowing down, preferably stopping); some inhibition of tumor growth; and / or alleviation to one or more symptoms associated with a particular cancer; reduced morbidity and TAT polypeptide-expression if an observable and / or measurable decrease in one or more of the improvements in mortality and quality of life issues, or the absence thereof It has been successfully "treatment" for. To the extent that an anti-TAT antibody or TAT-binding oligopeptide can prevent and / or kill the growth of cancer cells, it can be cytostatic and / or cytotoxic. The patient may also feel a decrease in these signs or symptoms.

成功した処置および病気の改善を評価するための前記パラメータは、医師が精通したルーチン的な手法によって容易に測定可能である。癌療法では、効率は、例えば、病気進行までの時間（ＴＴＰ）を評価することによって、および／または応答速度（ＲＲ）を決定することによって測定することができる。転移は、ステージグテストによって、および骨スキャン、ならびに骨への拡大を決定するためのカルシウムレベルおよび他の酵素についてのテストによって決定することができる。ＣＴスキャンを行って、当該領域における骨盤およびリンパ節への拡大を探すこともできる。胸部Ｘ−線、および公知の方法による肝臓酵素レベルの測定を用いて、各々、肺および肝臓への転移を探す。病気をモニターするための他のルーチン的な方法は、経肛門ウルトラソノグラフィー（ＴＲＵＳ）および経肛門ニードルバイオプシー（ＴＲＮＢ）を含む。   Said parameters for assessing successful treatment and disease improvement can be easily measured by routine methods familiar to physicians. In cancer therapy, efficiency can be measured, for example, by assessing time to disease progression (TTP) and / or determining response rate (RR). Metastasis can be determined by staging tests and by bone scans and tests for calcium levels and other enzymes to determine spread to bone. A CT scan can also be performed to look for enlargement to the pelvis and lymph nodes in the area. Chest X-rays and measurement of liver enzyme levels by known methods are used to look for metastases to the lung and liver, respectively. Other routine methods for monitoring the disease include transanal ultrasonography (TRUS) and transanal needle biopsy (TRNB).

より局所化された癌である膀胱癌では、病気の進行を判断するための方法は、膀胱鏡検査による泌尿器細胞学的評価、尿中の血液の存在についてのモニタリング、ソノグラフィーまたは静脈内腎盂Ｘ線像による生殖器上皮管の可視化、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、および磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を含む。遠く離れた転移の存在は、腹部のＣＴ、胸部Ｘ−線、または骨格の放射性核種イメージングによって評価することができる。   For bladder cancer, a more localized cancer, methods for determining disease progression include urological cytological assessment by cystoscopy, monitoring for the presence of blood in the urine, sonography or intravenous pelvic X Includes visualization of genital epithelial ducts by line images, computed tomography (CT), and magnetic resonance imaging (MRI). The presence of distant metastases can be assessed by abdominal CT, chest x-ray, or skeletal radionuclide imaging.

「慢性」投与とは、長時間の初期治療効果（活性）を維持するような、急性様式とは反対の連続的様式での剤の投与をいう。「間歇的」投与は、中断することなく連続的には行われず、むしろ性質としてサイクル的である処置である。   “Chronic” administration refers to administration of the agent in a continuous mode as opposed to the acute mode so as to maintain a long-term initial therapeutic effect (activity). “Intermittent” administration is treatment that is not performed continuously without interruption, but rather is cyclic in nature.

癌の治療、癌の徴候の軽減、または癌の診断の目的での「哺乳動物」とは、ヒト、家畜および農場動物、ならびにイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどのような動物園、スポーツまたは愛玩動物を含めた、哺乳動物に分類されるいずれの動物もいう。   “Mammals” for purposes of cancer treatment, reduction of cancer symptoms, or diagnosis of cancer include humans, livestock and farm animals, and dogs, cats, cows, horses, sheep, pigs, goats, rabbits, etc. Any animal classified as a mammal, including such zoos, sports or pets.

１以上の更なる治療剤「と組み合わせた」投与は、同時（共働）およびいずれかの順序での順次の投与を含む。   Administration “in combination with” one or more further therapeutic agents includes simultaneous (cooperative) and sequential administration in any order.

本明細書中で用いられる「キャリア」は、使用される用量および濃度においてそれに暴露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、安定化剤を含む。しばしば、生理学的に受容可能なキャリアはｐＨ緩衝化水溶液である。生理学的に受容可能なキャリアの例は、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような蛋白質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩−形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）のような非イオン性界面活性剤を含む。   As used herein, a “carrier” is a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, stabilizer that is non-toxic to cells or mammals exposed to it at the dosage and concentration used. including. Often the physiologically acceptable carrier is an aqueous pH buffered solution. Examples of physiologically acceptable carriers are buffers such as phosphate, citrate, and other organic acids; antioxidants such as ascorbic acid; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides Proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulin; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; monosaccharides including glucose, mannose, or dextrin; Sugars, and other carbohydrates; chelating agents such as EDTA; sugar alcohols such as mannitol or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; and / or TWEEN®, polyethylene glycol (PEG), and PLURONICS Non-ion like (registered trademark) It comprises a surfactant.

「固相」または「固体支持体」は、それに対して本発明の抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子が接着し、または結合することができる非−水性マトリックスを意味する。ここに含まれる固相の例は、ガラス（例えば、制御されたポアのガラス）、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンから部分的にまたは全体が形成されたものを含む。ある具体例においては、文脈に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを含むことができ；他の具体例においては、それは精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語は米国特許第４，２７５，１４９号に記載されたもののような、離散的な粒子の不連続的固相を含む。   “Solid phase” or “solid support” means a non-aqueous matrix to which an antibody, TAT-binding oligopeptide or TAT-binding organic molecule of the invention can adhere or bind. Examples of solid phases included here are those partially or wholly formed from glass (eg, controlled pore glass), polysaccharides (eg, agarose), polyacrylamide, polystyrene, polyvinyl alcohol and silicone. Including. In certain embodiments, depending on the context, the solid phase can include the wells of an assay plate; in other embodiments, it is a purification column (eg, an affinity chromatography column). The term includes a discontinuous solid phase of discrete particles, such as those described in US Pat. No. 4,275,149.

「リポソーム」は、（ＴＡＴポリペプチド、それに対する抗体、またはＴＡＴ結合オリゴペプチドのような）薬物の哺乳動物への送達でいうような種々のタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小さな小胞である。リポソームの成分は、生物学的膜の脂質配置と同様に、通常は、二層形成にて配置される。   “Liposomes” are composed of various types of lipids, phospholipids and / or surfactants such as in the delivery of drugs (such as TAT polypeptides, antibodies thereto, or TAT-binding oligopeptides) to mammals. Is a small vesicle. The components of the liposome are usually arranged in bilayer formation, similar to the lipid arrangement of biological membranes.

「小」分子または「小」有機分子は、本明細書中においては、約５００ダルトン未満の分子量を有すると定義される。   A “small” molecule or “small” organic molecule is defined herein as having a molecular weight of less than about 500 Daltons.

本明細書中で開示されるポリペプチド、抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ結合有機分子、あるいはそのアゴニストもしくはアンタゴニストの「有効量」は、具体的に述べられた目的を実行するのに十分な量である。「有効量」は、述べられた目的との関連で、経験的に、およびルーチン的に決定することができる。   An “effective amount” of a polypeptide, antibody, TAT-binding oligopeptide, TAT-binding organic molecule, or agonist or antagonist thereof disclosed herein is an amount sufficient to carry out a specifically stated purpose. It is. An “effective amount” can be determined empirically and routinely in the context of the stated purpose.

用語「治療上有効量」とは、被験体または哺乳動物において病気または障害を「治療」するのに有効な、抗体、ポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ結合有機分子、または他の薬物の量をいう。癌の場合には、薬物の治療上有効量は、癌細胞の数を低下させ；腫瘍のサイズを低下させ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害し（すなわち、ある程度遅くし、好ましくは停止させ）；腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度遅くし、好ましくは停止させ）；腫瘍の成長をある程度阻害し；および／または癌に伴う徴候の１以上をある程度軽減することができる。「治療する」の定義を参照。薬物が存在する癌細胞の成長を妨げ、および／または該細胞を殺傷することができる程度に、それは細胞静止性および／または細胞傷害性であり得る。   The term “therapeutically effective amount” refers to an amount of an antibody, polypeptide, TAT-binding oligopeptide, TAT-binding organic molecule, or other drug effective to “treat” a disease or disorder in a subject or mammal. Say. In the case of cancer, a therapeutically effective amount of the drug reduces the number of cancer cells; reduces the size of the tumor; inhibits the invasion of cancer cells into peripheral organs (ie slows down somewhat, preferably stops) Tumor metastasis can be inhibited (ie slowed, preferably stopped); tumor growth can be inhibited to some extent; and / or one or more of the symptoms associated with cancer can be alleviated to some extent. See definition of “treat”. To the extent that the drug can prevent the growth of cancer cells in which they are present and / or kill them, it can be cytostatic and / or cytotoxic.

抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、（ＴＡＴ１８８ ｓｉＲＮＡのような）ＴＡＴ ｓｉＲＮＡ、またはＴＡＴ結合有機分子の「成長阻害量」は、イン・ビトロまたはイン・ビボいずれかにて、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の成長を阻害できる量である。新形成細胞成長を阻害する目的での、抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、（ＴＡＴ１８８ ｓｉＲＮＡのような）ＴＡＴ ｓｉＲＮＡ、またはＴＡＴ結合有機分子の「成長阻害量」は、経験的に、およびルーチン的に決定することができる。   The “growth inhibitory amount” of an anti-TAT antibody, TAT polypeptide, TAT-binding oligopeptide, TAT siRNA (such as TAT188 siRNA), or TAT-binding organic molecule can be expressed either in vitro or in vivo. In particular an amount capable of inhibiting the growth of tumors, eg cancer cells. The “growth inhibitory amount” of an anti-TAT antibody, TAT polypeptide, TAT-binding oligopeptide, TAT siRNA (such as TAT188 siRNA), or TAT-binding organic molecule for the purpose of inhibiting neoplastic cell growth is empirical. And can be determined routinely.

抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、（ＴＡＴ１８８ ｓｉＲＮＡのような）ＴＡＴ ｓｉＲＮＡ、またはＴＡＴ結合有機分子の「細胞傷害性量」は、イン・ビトロまたはイン・ビボいずれかで、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の破壊を引き起こすことができる量である。新形成細胞成長を阻害する目的での、抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、（ＴＡＴ１８８ ｓｉＲＮＡのような）ＴＡＴ ｓｉＲＮＡ、またはＴＡＴ結合有機分子の「細胞傷害性量」は、経験的に、およびルーチン的に決定することができる。   The “cytotoxic amount” of an anti-TAT antibody, TAT polypeptide, TAT-binding oligopeptide, TAT siRNA (such as TAT188 siRNA), or TAT-binding organic molecule is either in vitro or in vivo. In particular, an amount that can cause destruction of tumors, eg cancer cells. A “cytotoxic amount” of anti-TAT antibody, TAT polypeptide, TAT-binding oligopeptide, TAT siRNA (such as TAT188 siRNA), or TAT-binding organic molecule for the purpose of inhibiting neoplastic cell growth is And routinely.

用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、具体的には、例えば、それらが所望の生物学的または免疫学的活性を呈する限り、（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体を含めた）単一の抗−ＴＡＴモノクローナル抗体、ポリエピトープ特異性を持つ抗−ＴＡＴ抗体組成物、ポリクローニル抗体、単一鎖抗−ＴＡＴ抗体、および抗−ＴＡＴ抗体の断片（後記参照）を網羅する。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書中においては、抗体と総合交換可能に用いられる。   The term “antibody” is used in the broadest sense and specifically includes, for example, a single (including agonists, antagonists, and neutralizing antibodies) as long as they exhibit the desired biological or immunological activity. Anti-TAT monoclonal antibodies, anti-TAT antibody compositions with polyepitope specificity, polyclonyl antibodies, single chain anti-TAT antibodies, and fragments of anti-TAT antibodies (see below). The term “immunoglobulin” (Ig) is used herein interchangeably with antibody.

「単離された抗体」は、その天然環境の成分から同定され、分離されおよび／または回収されたものである。その天然環境の汚染成分は、抗体についての診断または治療用途に干渉するであろう物質である、酵素、ホルモン、および他の蛋白質性または非蛋白質性溶質を含むことができる。好ましい具体例において、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ方法によって測定して抗体の９５重量％を超えるまで最も好ましくは９９重量％を超えて、（２）スピニングカップセケネータの使用によってＮ−末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに十分な程度まで、あるいは（３）クーマシーブルー、または好ましくは銀染色を用いる、還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一となるまで精製されるであろう。単離された抗体は、組換え細胞内のイン・サイチュ抗体を含む。というのは、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないだろうからである。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。   An “isolated antibody” is one that has been identified, separated and / or recovered from a component of its natural environment. Contaminating components of its natural environment can include enzymes, hormones, and other proteinaceous or non-proteinaceous solutes, substances that would interfere with diagnostic or therapeutic applications for antibodies. In a preferred embodiment, the antibody is (1) more than 95% by weight of the antibody as measured by the Lowry method, most preferably more than 99%, and (2) N-terminal or internal by use of a spinning cup Purification to a degree sufficient to obtain at least 15 residues of the amino acid sequence, or (3) purification to homogeneity by SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions using Coomassie blue, or preferably silver staining Will be done. Isolated antibody includes the antibody in situ within recombinant cells. This is because at least one component of the antibody's natural environment will not be present. Ordinarily, however, isolated antibody will be prepared by at least one purification step.

基本的な４−鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽鎖（Ｌ）および２つの同一の重鎖（Ｈ）から構成されるヘテロテトラマー糖蛋白質である（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる更なるポリペプチドと共に、５つの基本的なヘテロテトラマーユニットからなり、従って、１０の抗原結合部位を含有し、他方、分泌されたＩｇＡ抗体は、重合して、Ｊ鎖と共に基本的な４−鎖ユニットの２ないし５を含む多価アセンブラージを形成することができる）。ＩｇＧの場合には４−鎖ユニットは、一般には、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は１つの共有結合ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結され、他方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖イソタイプに応じて、１以上のジスルフィド結合によって相互に連結される。各ＨおよびＬ鎖は、規則的に感覚が設けられた鎖内ジスルフィドブリッジも有する。各Ｈ鎖はＮ−末端、可変ドメイン（ＶＨ）、続いて、αおよびγ鎖の各々についての３つの定常ドメイン（ＣＨ）、およびμおよびεイソタイプについての４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ−末端、可変ドメイン（ＶＬ）、続いてのその他の端部における定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列する。特別なアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメインの間で界面を形成すると考えられている。ＶＨおよびＶＬの対合は、一緒になって、単一の抗原−結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｍｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，ｐａｇｅ ７１ ａｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ ６参照。 The basic 4-chain antibody unit is a heterotetrameric glycoprotein composed of two identical light chains (L) and two identical heavy chains (H). (An IgM antibody is a further termed J chain. Along with the polypeptide, it consists of five basic heterotetramer units and thus contains 10 antigen binding sites, while the secreted IgA antibody polymerizes and combines with the J chain the basic 4-chain unit. Multivalent assembles containing 2 to 5 can be formed). In the case of IgG, the 4-chain unit is generally about 150,000 daltons. Each L chain is linked to the H chain by one covalent disulfide bond, while the two H chains are linked to each other by one or more disulfide bonds, depending on the H chain isotype. Each H and L chain also has an intrachain disulfide bridge with regular sensations. Each heavy chain has an N-terminus, a variable domain (V H ), followed by three constant domains (C H ) for each of the α and γ chains, and four C H domains for the μ and ε isotypes. Each light chain has an N-terminus, a variable domain (V L ) followed by a constant domain (C L ) at the other end. V L aligns with V H and C L aligns with the first constant domain (C H 1) of the heavy chain. Special amino acid residues are thought to form an interface between the light and heavy chain variable domains. The V H and V L pairing together form a single antigen-binding site. For the structure and properties of different classes of antibodies, see, eg, Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Damiel P. et al. States, Abba I. et al. Terr and Tristram G. See Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6.

いずれの脊椎動物種からのＬ鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる、２つの明瞭に区別されるタイプの１つに帰属させることができる。それらの重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを異なるクラスまたはイソタイプに帰属させることができる。５つのクラスの免疫グロブリン：各々、α、δ、ε、γおよびμと命名される重鎖を有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがある。該γおよびαクラスは、ＣＨ配列および機能の比較的重要でない差に基づいてサブクラスにさらに分けられ、例えば、ヒトは以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を表す。 Light chains from any vertebrate species can be assigned to one of two distinct types, called kappa and lambda, based on the amino acid sequence of their constant domains. Depending on the amino acid sequence of the constant domain of their heavy chains (C H ), immunoglobulins can be assigned to different classes or isotypes. There are five classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, each with heavy chains designated α, δ, ε, γ and μ. The γ and α classes are further divided into subclasses on the basis of a difference relatively unimportant of the C H sequence and function, e.g., humans following subclasses: represents an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2.

用語「可変」とは、可変ドメインのあるセグメントが抗体の間で配列がかなり異なる事実をいう。Ｖドメインは抗原の結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの１１０−アミノ酸スパンを横切って均一には分布しない。その代わり、Ｖ領域は、各々９ないし１２アミノ酸の長さである「超可変領域」と呼ばれる極端な可変性のより短い領域によって分離された１５ないし３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチよりなる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、β−シート構造を結合し、ある場合には該構造の一部を形成するループを形成する、３つの超可変領域によって連結された、β−シート立体配置を大いに採用する４つのＦＲを含む。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって近接して一緒に保持され、他の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原−結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接的には関与しないが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体の参画のような種々のエフェクター機能を呈する。   The term “variable” refers to the fact that certain segments of a variable domain differ significantly in sequence between antibodies. The V domain mediates antigen binding and defines the specificity of a particular antibody for that particular antigen. However, variability is not evenly distributed across the 110-amino acid span of variable domains. Instead, the V region is a comparison region called a 15-30 amino acid framework region (FR) separated by shorter regions of extreme variability called “hypervariable regions”, each 9 to 12 amino acids long. It consists of a stretch that is constant. The natural heavy and light chain variable domains each join a β-sheet structure and in some cases form a loop that forms part of the structure, linked by three hypervariable regions, β -Includes four FRs that greatly adopt the sheet configuration. The hypervariable regions in each chain are held together in close proximity by FRs and together with hypervariable regions from other chains contribute to the formation of antibody antigen-binding sites (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological (See, Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Constant domains are not directly involved in antibody binding to antigen, but exhibit various effector functions such as antibody participation in antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC).

用語「超可変領域」は、本明細書中で用いる場合、抗原−結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域（ＨＶＲ）は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬ中の約残基２４ないし３４（Ｌ１）、５０ないし５６（Ｌ２）および８９ないし９７（Ｌ３）、およびＶＨ中の約１ないし３５（Ｈ１）、５０ないし６５（Ｈ２）および９５ないし１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））、および／または「超可変ループ」からの残基（例えば、ＶＬ中の残基２６ないし３２（Ｌ１）、５０ないし５２（Ｌ２）および９１ないし９６（Ｌ３）、およびＶＨ中の２６ないし３２（Ｈ１）、５３ないし５５（Ｈ２）および９６ないし１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＨＶＲは、ここに引用してその全体を援用する、２００４年２月１９日に出願された米国出願番号に開示された配列を含むようにも定義され、ここに、拡大されたＨＶＲは、複雑な結晶構造の分析に基づいて、抗体の結合したリガンドと接触していると定義される可変領域内のアミノ酸配列位置のいくつかを含む。本明細書中で用いるように、用語「ＨＶＲ」および「ＣＤＲ」は、以下のように定義される拡大したＨＶＲを含むように相互交換的に用いられる。 The term “hypervariable region” when used herein refers to the amino acid residues of an antibody which are responsible for antigen-binding. The hypervariable region (HVR) generally comprises amino acid residues from the “complementarity determining region” or “CDR” (eg, about residues 24 to 34 (L1), 50 to 56 (L2) and 89 in VL ). To 97 (L3), and about 1 to 35 (H1), 50 to 65 (H2) and 95 to 102 (H3) in V H ; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health. Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) and / or residues from “hypervariable loops” (eg, residues 26 to 32 (L1), 50 to 52 (L2) in VL ) And 91 or 6 (L3), and V to 26 not in H 32 (H1), 53 to 55 (H2) and 96 to 101 (H3); Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196: 901-917 (1987)). HVRs are also defined to include the sequences disclosed in the US application number filed February 19, 2004, which is incorporated herein by reference in its entirety, where the expanded HVRs are complex It includes some of the amino acid sequence positions within the variable region that are defined to be in contact with the bound ligand of the antibody based on analysis of the crystal structure. As used herein, the terms “HVR” and “CDR” are used interchangeably to include an expanded HVR defined as follows.

用語「超可変領域」は本明細書中で用いる場合、配列が超可変であり、および／または構造的に規定されるループを形成する抗体可変ドメインの領域をいう。一般には、抗体は６つの超可変領域；ＶＨにおける３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、およびＶＬにおける３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。多数の超可変領域の表示が用いられており、それらはここに含まれる。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列可変性に基づき、最も普通に用いられる（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、その代わり、構造ループの位置に言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ長可変領域はＫａｂａｔ ＣＤＲおよびＣｈｏｔｈｉａ構造ループの間の折衷を表し、これは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられる。「接触」長超可変領域は、入手可能な複雑な結晶の構造の分析に基づく。これらの超可変領域の各々からの残基を以下に示す。   The term “hypervariable region” when used herein refers to a region of an antibody variable domain that is hypervariable in sequence and / or forms a structurally defined loop. In general, antibodies comprise six hypervariable regions; three in VH (H1, H2, H3) and three in VL (L1, L2, L3). A number of hypervariable region representations have been used and are included here. Kabat complementarity-determining regions (CDRs) are based on sequence variability and are most commonly used (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Institute, 5th Ed. Pulse Health Institute National Health Institute. )). Chothia instead refers to the location of the structural loop (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). The AbM long variable region represents a compromise between the Kabat CDR and Chothia structural loop, which is used by the Oxford Molecular's AbM antibody modeling software. The “contact” length hypervariable region is based on the analysis of the structure of the complex crystals available. The residues from each of these hypervariable regions are shown below.

Figure 2008512121
超可変領域は以下のように「拡大された超可変領域」を含むことができる：ＶＬ中の２４ないし３４（Ｌ１）、５０ないし５６（Ｌ２）および８９ないし９７（Ｌ３）、およびＶＨ中の２６ないし３５（Ｈ１）、５０ないし６５または４９なし６５（Ｈ２）、および９３ないし１０２、９４ないし１０２または９５ないし１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、それらの定義の各々につき、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａに従ってナンバリングされる。
Figure 2008512121
 Hypervariable regions can include “expanded hypervariable regions” as follows: 24-34 (L1), 50-56 (L2) and 89-97 (L3) in VL, and in VH 26-35 (H1), 50-65 or 49 none 65 (H2), and 93-102, 94-102 or 95-102 (H3). Variable domain residues are defined by Kabat et al. , Supra.

「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義された超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。   “Framework” or “FR” residues are those variable domain residues other than the hypervariable region residues as herein defined.

本明細書中で用いられる用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、微量で存在しえる可能な天然に生じる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、抗原部位に対して向けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含むポリクローナル抗体集団とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらは他の抗体によって汚染されていない合成できる点で有利である。修飾語「モノクローナル」はいずれかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明で言うようなモノクローナル抗体は、最初、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されたハイリドーマ方法によって調製させることができるか、あるいは細菌、真核生物動物または植物細胞において、組換えＤＮＡ方法を用いて作成することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することができる。   As used herein, the term “monoclonal antibody” refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, ie, individual antibodies comprising the population can be present in trace amounts. Except for mutations that occur in Monoclonal antibodies are highly specific and are directed against the antigenic site. Furthermore, in contrast to polyclonal antibody populations comprising different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen. In addition to their specificity, monoclonal antibodies are advantageous in that they can be synthesized without being contaminated by other antibodies. The modifier “monoclonal” should not be construed as requiring production of the antibody by any particular method. For example, monoclonal antibodies as referred to in the present invention were first described in Kohler et al. , Nature, 256: 495 (1975), or can be prepared using recombinant DNA methods in bacteria, eukaryotes or plant cells (eg, U.S. Pat. No. 4,816,567). “Monoclonal antibodies” are described, for example, in Clackson et al. , Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al. , J .; Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), and can be isolated from a phage antibody library.

ここに、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖が、特定の種に由来する、あるいは特定の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一である、またはそれと相同であり、他方、該鎖の残りは、もう１つの種に由来する、あるいはもう１つの抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であり、またはそれと相同である「キメラ」抗体、ならびに所望の生物学的活性を呈する限りそのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）参照）。ここに、注目するキメラ抗体は、非−ヒト霊長類（例えば、旧世界のサル、猿人など）に由来する可変ドメイン抗原−結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む。   Here, a monoclonal antibody is heavy or / and light chain identical or homologous to the corresponding sequence in an antibody from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, The remainder of the chain is a “chimeric” antibody that is identical to or homologous to the corresponding sequence in an antibody from another species or belonging to another antibody class or subclass, as well as the desired organism Fragments of such antibodies are included so long as they exhibit biological activity (see US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)) . Here, the chimeric antibodies of interest include “primatized” antibodies comprising variable domain antigen-binding sequences and human constant region sequences derived from non-human primates (eg, Old World monkeys, monkeys, etc.).

「無傷」抗体は、抗原−結合部位、ならびにＣＬおよび少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変種であり得る。好ましくは、無傷抗体は１以上のエフェクター機能を有する。 An “intact” antibody is one that includes an antigen-binding site and C L and at least a heavy chain constant domain, C H 1, C H 2 and C H 3. The constant domain can be a native sequence constant domain (eg, a human native sequence constant domain) or an amino acid sequence variant thereof. Preferably, the intact antibody has one or more effector functions.

「抗体断片」は、無傷抗体の一部、好ましくは無傷抗体の抗原結合もしくは可変領域を含む。抗体断片の例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディー；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］参照）；単一−鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多特異的抗体を含む。 “Antibody fragments” comprise a portion of an intact antibody, preferably the antigen binding or variable region of the intact antibody. Examples of antibody fragments are Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , and Fv fragments; diabodies; linear antibodies (US Pat. No. 5,641,870, Example 2; Zapata et al., Plotin Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995]); single-chain antibody molecules; and multispecific antibodies formed from antibody fragments.

抗体のパパイン消化は、２つの同一の抗原−結合断片、いわゆる「Ｆａｂ」断片、および残りの「Ｆｃ」断片を生じ、表示は容易に結晶化する能力を反映する。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）および１つの重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）と共に全Ｌ鎖よりなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合に関して一価であり、すなわち、それは単一の抗原−結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、二価抗原−結合活性を有する２つのジスルフィド連結Ｆａｂ断片に大まかに対応し、依然として、抗原を架橋させることができる単一の大きなＦ（ａｂ‘）２断片を生じる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含めた、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において更なる少数の残基を有することによってＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書中においては、定常ドメインのシステイン残基が有利チオール基を担うＦａｂ’についての表示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、それらの間でヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生じた。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。 Papain digestion of the antibody yields two identical antigen-binding fragments, the so-called “Fab” fragment, and the remaining “Fc” fragment, the display reflecting the ability to easily crystallize. The Fab fragment consists of the entire light chain with the variable region domain of the heavy chain (V H ) and the first constant domain of one heavy chain (C H 1). Each Fab fragment is monovalent for antigen binding, ie it has a single antigen-binding site. Pepsin treatment of the antibody roughly corresponds to two disulfide-linked Fab fragments with divalent antigen-binding activity and still yields a single large F (ab ′) 2 fragment that can crosslink the antigen. Fab ′ fragments differ from Fab fragments by having an additional minor number of residues at the carboxy terminus of the C H 1 domain, including one or more cysteines from the antibody hinge region. Fab′-SH is an indication herein for Fab ′ in which the cysteine residues of the constant domain bear an advantageous thiol group. F (ab ′) 2 antibody fragments originally generated as pairs of Fab ′ fragments which have hinge cysteines between them. Other chemical couplings of antibody fragments are also known.

Ｆｃ断片は、ジスルフィドによって一緒に保持された双方のＨ鎖のカルボキシ−末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域における配列によって決定され、その領域は、細胞のあるタイプで見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。   The Fc fragment contains the carboxy-terminal portions of both heavy chains held together by disulfides. Antibody effector functions are determined by sequences in the Fc region, which is also the portion recognized by Fc receptors (FcR) found in certain types of cells.

「Ｆｖ」は、完全な抗原−認識および−結合部位を含有する最小抗体断片である。この断片は、密に非共有結合を会合した、１つの重鎖および１つの軽鎖可変領域ドメインのダイマーよりなる。これらの２つのドメインの折畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗原結合特異性を抗体に付与する６つの超可変ループ（各々、ＨおよびＬ鎖からの３つのループ）が放出される。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、完全な結合部位よりも低い親和性においてではあるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。   “Fv” is the minimum antibody fragment which contains a complete antigen-recognition and -binding site. This fragment consists of a dimer of one heavy and one light chain variable region domain in tight non-covalent association. From the folding of these two domains, six hypervariable loops (three loops from the H and L chains, respectively) that contribute to amino acid residues for antigen binding and confer antigen binding specificity to the antibody are released. Is done. However, even a single variable domain (or half of an Fv containing only three CDRs specific for the antigen) recognizes and binds to the antigen, albeit at a lower affinity than the complete binding site. Have the ability to

「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも省略される「単一−鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖へと連結されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能とする、ＶＨおよびＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖのレビューについては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ １９９５，ｉｎｆｒａ参照。 “Single-chain Fv”, also abbreviated as “sFv” or “scFv”, is an antibody fragment comprising V H and V L antibody domains linked to a single polypeptide chain. Preferably, the sFv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains that allows the sFv to form the desired structure for antigen binding. For reviews of sFv, see Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Activities, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.

用語「ダイアボディー」とは、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間の対合が達成され、その結果、二価断片、すなわち、２つの抗原−結合部位を有する断片がもたらされるように、ＶＨおよびＶＬドメインの間の短いリンカー（約５ないし１０残基）でｓＦｖ断片（先のパラグラフ参照）を構築することによって調製された小さな抗体断片をいう。二特異的ダイアボディーは、２つの抗体のＶＨおよびＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖に存在する２つの「クロスオーバー」ｓＦｖ断片のヘテロダイマーである。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により十分に記載されている。 The term “diabody” refers to V H such that pairing rather than within the V domain is achieved, resulting in a bivalent fragment, ie, a fragment having two antigen-binding sites. And a small antibody fragment prepared by constructing an sFv fragment (see previous paragraph) with a short linker (approximately 5-10 residues) between the VL domain. Bispecific diabodies are heterodimers of two “crossover” sFv fragments in which the V H and V L domains of the two antibodies are present in different polypeptide chains. Diabodies are described, for example, in EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

非−ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非−ヒト抗体に由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域が、所望の抗体特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非−ヒト霊長類のような非−ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非−ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体またはドナー抗体に見いだされない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらに精巧なものとするようになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的には全てを含む。ここに、超可変ループの全てまたは実質的に全ては非−ヒト免疫グロブリンのものに対応し、およびＦＲの全てまたは実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、所望により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）参照。   “Humanized” forms of non-human (eg, rodent) antibodies are chimeric antibodies that contain minimal sequence derived from the non-human antibody. In most cases, humanized antibodies are non-human species (donors) such as mice, rats, rabbits or non-human primates in which the recipient's hypervariable region has the desired antibody specificity, affinity, and ability. Antibody) is a human immunoglobulin (receptor antibody) replaced by residues from the hypervariable region of the antibody. In some cases, framework region (FR) residues of the human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues. Furthermore, humanized antibodies can comprise residues that are not found in the recipient antibody or donor antibody. These modifications are made to further refine antibody performance. In general, a humanized antibody comprises substantially all of at least one, and typically two variable domains. Here, all or substantially all of the hypervariable loops correspond to those of non-human immunoglobulin, and all or substantially all of the FRs are of human immunoglobulin sequences. The humanized antibody will optionally comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of a human immunoglobulin. For further details, see Jones et al. , Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al. , Nature 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

「種−依存性抗体」、例えば、哺乳動物非−ヒトＩｇＥ抗体は、それが第二の哺乳動物種からのその抗原のホモロブのために有するよりも、第一の哺乳動物種からの抗原に対するより強い結合親和性を有する抗体である。通常、種−依存性抗体はヒト抗原に対して「特異的に結合する」（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは１×１０−８、最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有し）が、ヒト抗原に対するその結合親和性よりも弱い、少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍である第二の非−ヒト哺乳動物種からの抗原のホモロブに対する結合親和性を有する。種−依存性抗体は、前記定義の種々のタイプの抗体のいずれかであり得るが、好ましくは、ヒト化またはヒト抗体である。 A “species-dependent antibody”, eg, a mammalian non-human IgE antibody, is directed against an antigen from a first mammalian species than it has for a homolob of that antigen from a second mammalian species. An antibody having a stronger binding affinity. In general, species-dependent antibodies “bind specifically” to human antigens (ie, about 1 × 10 −7 M or less, preferably 1 × 10 −8 , most preferably about 1 × 10 −9 M). A second non-human having a binding affinity (Kd) value of at least about 50-fold, or at least about 500-fold, or at least about 1000-fold less than its binding affinity for a human antigen Has binding affinity for homolobes of antigens from mammalian species. The species-dependent antibody can be any of the various types of antibodies defined above, but is preferably a humanized or human antibody.

「ＴＡＴ結合オリゴペプチ」は、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合するオリゴペプチドである。ＴＡＴ結合オリゴペプチドは、公知のオリゴペプチド合成方法を用いて化学的に合成することができるか、あるいは組換え技術を用いて精製することができる。ＴＡＴ結合オリゴペプチドは、通常、長さが少なくとも５アミノ酸であり、別法として、長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００アミノ酸以上であり、ここに、そのようなオリゴペプチドは本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができる。ＴＡＴ結合オリゴペプチドは、よく知られた技術を用いて過度な実験無くして同定することができる。この点に関して、ポリペプチド標的に特異的に結合することができるオリゴペプチドについてのオリゴペプチドライブラリをスクリーミングする技術は当該分野で良く知られていることを注記する（例えば、米国特許第５，５５６，７６２号、第５，７５０，３７３号、第４，７０８，８７１号、第４，８３３，０９２号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５７１，６８９号、第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ８４／０３５０６およびＷＯ ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：３９９８−４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１７８−１８２（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，１３０−１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：６１１−６１６（１９８８），Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３，およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８参照）。   A “TAT binding oligopeptide” is an oligopeptide that preferably specifically binds to a TAT polypeptide described herein. TAT-linked oligopeptides can be chemically synthesized using known oligopeptide synthesis methods, or can be purified using recombinant techniques. TAT-binding oligopeptides are typically at least 5 amino acids in length, alternatively, at least about 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100 And the amino acid or, where such oligopeptides may be preferably in the TAT polypeptides described herein specifically bind. TAT-binding oligopeptides can be identified without undue experimentation using well-known techniques. In this regard, it is noted that techniques for squeezing oligopeptide libraries for oligopeptides that can specifically bind to a polypeptide target are well known in the art (see, eg, US Pat. No. 5,556,556). 762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689 No. 5,663,143; PCT publication numbers WO 84/03506 and WO 84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3998-4002 (1984). Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 178-182; Geysen et al., In Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysan et al., J. Immunol. Meth., 102: 259-274 (1987); 140, 611-616 (1988), Cwirla, SE et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378; Lowman, H. B. et al. 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, JD et al. (1991), J. Mol. ... 581; Kang, A.S.et al (1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88: 8363, and Smith, G.P (1991) Current Opin.Biotechnol, 2: See 668).

「ＴＡＴ結合有機分子」は、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合する本明細書中に提示されたオリゴポリペプチとまたは抗体以外の有機分子である。ＴＡＴ結合有機分子は、公知の方法を用いて同定し、化学的に合成することができる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ００／００８２３およびＷＯ ００／３９５８５参照）。ＴＡＴ結合有機分子は、通常、サイズが約２０００ダルトン未満、あるいはサイズが約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトン未満であり、ここに、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができるそのような有機分子は、よく知られた技術を用い過度な実験なくして同定することができる。この点に関し、ポリペプチド標的に結合することができる分子についての有機分子ライブラリをスクリーニングするための技術は当該分野で良く知られていることを注記する（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ００／００８２３およびＷＯ ００／３９５８５参照）。   A “TAT binding organic molecule” is an organic molecule other than the oligopolypeptides and / or antibodies presented herein that bind specifically, preferably specifically, to the TAT polypeptides described herein. TAT-binding organic molecules can be identified and chemically synthesized using known methods (see, eg, PCT publication numbers WO 00/00823 and WO 00/39585). The TAT-binding organic molecule is typically less than about 2000 Daltons in size, or less than about 1500, 750, 500, 250 or 200 Daltons in size, preferably in the TAT polypeptides described herein. Such organic molecules that can specifically bind can be identified without undue experimentation using well-known techniques. In this regard, it is noted that techniques for screening organic molecular libraries for molecules that can bind to polypeptide targets are well known in the art (eg, PCT Publication Nos. WO 00/00823 and WO 00/39585).

「干渉性ＲＮＡ」または「小さな干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」は、標的遺伝子の発現を低下させる長さが３０ヌクレオチド未満の二本鎖ＲＮＡ分子である。「ＴＡＴ干渉性ＲＮＡ」または「ＴＡＴ ｓｉＲＮＡ」はＴＡＴ核酸に好ましくは特異的に結合し、その発現を低下させる。これは、干渉性ＲＮＡが存在しない対照におけるＴＡＴ分子の発現と比較して、ＴＡＴ分子の発現が存在する干渉性ＲＮＡでより低いことを意味する。ＴＡＴ干渉性ＲＮＡは公知の方法を用いて同定し、合成することができる（Ｓｈｉ Ｙ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（１）：９−１２（２００３）、ＷＯ ２００３０５６０１２およびＷＯ ２００３０６４６２１）。   An “interfering RNA” or “small interfering RNA (siRNA)” is a double-stranded RNA molecule of less than 30 nucleotides in length that reduces expression of a target gene. “TAT interfering RNA” or “TAT siRNA” preferably binds specifically to a TAT nucleic acid and reduces its expression. This means that the expression of the TAT molecule is lower with the interfering RNA present compared to the expression of the TAT molecule in the control where no interfering RNA is present. TAT interfering RNA can be identified and synthesized using known methods (Shi Y. Trends in Genetics 19 (1): 9-12 (2003), WO 20030556012 and WO 2003064621).

注目する抗原、例えば、腫瘍−関連ポリペプチド抗原標的に「結合する」抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは他の有機分子は、該抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子が、該抗原を発現する細胞または組織を標的化するにおいて、診断および／または治療剤として有用であり、他の蛋白質と有意には交差反応しないように、十分な親和性でもって抗原と結合するものである。そのような具体例において、「非−標的」蛋白質への抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは他の有機分子の結合の程度は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析または放射性免疫沈澱（ＲＩＡ）によって測定して、その特定の標的蛋白質への抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは他の有機分子の結合の約１０％未満であろう。標的分子への抗原、オリゴペプチドまたは他の有機分子の結合に関しては、用語「特異的結合」、あるいは特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープ「に特異的に結合する」または「に対して特異的である」は、非−特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般には、結合活性を有しない同様な構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的、例えば、過剰な非−標識標的と同様な対照分子との競合によって決定することができる。この場合、もしプローブへの標識標的の結合が過剰な非標識標的によって競合的に阻害されるならば、特異的結合が示される。用語「特異的結合」、あるいは本明細書中で用いられる特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」または「に対して特異的である」は、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれ以上の標的に対するＫｄを有する分子によって阻害されえる。１つの具体例において、用語「特異的結合」は、分子が、いずれかの他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合をいう。 An antibody, oligopeptide, siRNA or other organic molecule that “binds” to an antigen of interest, eg, a tumor-associated polypeptide antigen target, is a cell or a cell in which the antibody, oligopeptide or other organic molecule expresses the antigen or It is useful as a diagnostic and / or therapeutic agent in targeting tissue and binds an antigen with sufficient affinity so that it does not significantly cross-react with other proteins. In such embodiments, the extent of antibody, oligopeptide, siRNA or other organic molecule binding to the “non-target” protein is measured by fluorescence activated cell sorting (FACS) analysis or radioimmunoprecipitation (RIA). Thus, it will be less than about 10% of the binding of an antibody, oligopeptide, siRNA or other organic molecule to that particular target protein. With respect to binding of an antigen, oligopeptide or other organic molecule to a target molecule, the term “specific binding” or against a specific polypeptide or an epitope on a specific polypeptide “specifically binds” or “ By “specific” is meant binding that is measurably different from non-specific interactions. Specific binding can be measured, for example, by determining the binding of a molecule relative to the binding of a control molecule, which is generally a molecule of similar structure that does not have binding activity. For example, specific binding can be determined by competition with a target, for example, a control molecule similar to excess unlabeled target. In this case, specific binding is indicated if the binding of the labeled target to the probe is competitively inhibited by excess unlabeled target. The term “specific binding” or “specifically binds” or “specific for” an epitope on a particular polypeptide or a particular polypeptide target as used herein, for example, At least about 10 −4 M, alternatively at least about 10 −5 M, alternatively at least about 10 −6 M, alternatively at least about 10 −7 M, alternatively at least about 10 −8 M, alternatively at least about 10 −9 M, alternatively at least about It can be inhibited by molecules having a Kd for a target of 10 −10 M, alternatively at least about 10 −11 M, alternatively at least about 10 −12 M, or more. In one embodiment, the term “specific binding” refers to a molecule or epitope on a particular polypeptide without substantially binding to any other polypeptide or polypeptide epitope. A bond that binds.

「ＴＡＴポリペプチドを発現する腫瘍細胞の成長を阻害する」抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは他の有機分子、あるいは「成長阻害性」抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子は、適当なＴＡＴポリペプチドを発現する、または過上発現する癌細胞の測定可能な成長阻害をもたらすものである。ＴＡＴポリペプチドは癌細胞の表面で発現される膜貫通ポリペプチドであり得るか、あるいは癌細胞によって生産され、分泌されるポリペプチドでありえる。好ましい成長阻害性抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、適当な対照と比較して、２０％を超えて、好ましくは約２０％ないし約５０％だけ、なおより好ましくは５０％を超えて（例えば、約５０％ないし約１００％だけ）ＴＡＴ−発現腫瘍細胞の成長を阻害し、該対照は、典型的には、テストすべき抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子で処理されていない腫瘍細胞である。１つの具体例において、成長阻害は、細胞培養中の約０．１ないし３０μｇ／ｍｌまたは約０．５ｎＭないし２００ｎＭの抗体濃度にて測定することができ、ここに、成長阻害は抗体への腫瘍細胞の暴露から１ないし１０日後に測定される。イン・ビボでの腫瘍細胞の成長阻害は、後に実験実施例セクションに記載されるように、種々の方法で測定することができる。もし、約１μｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ体重における抗−ＴＡＴ抗体の投与の結果、抗体の最初の投与から約５日ないし３ヶ月以内に、好ましくは約５ないし３０日以内に腫瘍のサイズまたは腫瘍細胞の増殖の低下がもたらされれば、該抗体はイン・ビボにて成長阻害性である。   An antibody, oligopeptide, siRNA or other organic molecule that "inhibits the growth of tumor cells expressing a TAT polypeptide" or a "growth inhibitory" antibody, oligopeptide or other organic molecule may contain an appropriate TAT polypeptide It leads to measurable growth inhibition of cancer cells that are expressed or overexpressed. The TAT polypeptide can be a transmembrane polypeptide expressed on the surface of a cancer cell, or it can be a polypeptide produced and secreted by a cancer cell. Preferred growth inhibitory anti-TAT antibodies, oligopeptides or organic molecules are greater than 20%, preferably only about 20% to about 50%, even more preferably greater than 50% compared to a suitable control. A tumor that inhibits the growth of TAT-expressing tumor cells (eg, by about 50% to about 100%) and the control is typically a tumor that has not been treated with the antibody, oligopeptide or other organic molecule to be tested It is a cell. In one embodiment, growth inhibition can be measured at an antibody concentration of about 0.1 to 30 μg / ml or about 0.5 nM to 200 nM in cell culture, wherein growth inhibition is a tumor to antibody. Measured 1 to 10 days after cell exposure. In vivo growth inhibition of tumor cells can be measured in a variety of ways, as described later in the Experimental Examples section. If the anti-TAT antibody administration at about 1 μg / kg to about 100 mg / kg body weight results in a tumor size or within about 5 to 3 months, preferably within about 5 to 30 days from the first administration of the antibody, If a reduction in tumor cell proliferation results, the antibody is growth inhibitory in vivo.

「アポトーシスを誘導する」抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは他の有機分子は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の膨張、細胞断片化、および／または膜小胞（アポトーシス体と呼ばれる）の形成によって測定して、プトグラムされた細胞の死滅を誘導するものである。該細胞は、通常、ＴＡＴポリペプチドを過剰発現するものである。好ましくは、該細胞は腫瘍細胞、例えば、前立腺、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、肺、腎臓、結腸、結直腸、膀胱細胞である。アポトーシスに伴う細胞事象を評価するために種々の方法が利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）トランスローケイションはアネキシン結合によって測定することができ；ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダリングを介して評価することができ；およびＤＮＡ断片化に伴う核／クロマチン凝縮はハイポジプロイド細胞のいずれかの増加によって評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子は、アネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞に対するアネキシン結合の約２ないし５０倍、好ましくは約５ないし５０倍、最も好ましくは約１０ないし５０倍の誘導をもたらすものである。   An antibody, oligopeptide, siRNA or other organic molecule that “induces apoptosis” binds to annexin V, DNA fragmentation, cell contraction, endoplasmic reticulum swelling, cell fragmentation, and / or membrane vesicles (apoptotic bodies) Inducing the death of ptogrammed cells. The cell is usually one that overexpresses a TAT polypeptide. Preferably, the cells are tumor cells such as prostate, breast, ovary, stomach, endometrium, lung, kidney, colon, colorectal, bladder cells. Various methods are available to assess cellular events associated with apoptosis. For example, phosphatidylserine (PS) translocation can be measured by annexin binding; DNA fragmentation can be assessed via DNA laddering; and nuclear / chromatin condensation associated with DNA fragmentation is high positive Can be assessed by any increase in cells. Preferably, the antibody, oligopeptide or other organic molecule that induces apoptosis is about 2 to 50 times, preferably about 5 to 50 times, most preferably about 10 to about annexin binding to untreated cells in an annexin binding assay. This leads to a 50-fold induction.

抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変種Ｆｃ領域）に帰すことができる生物学的活性をいい、抗体イソタイプで変化する。抗体エフェクター機能の例は：Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害性；Ｆｃ受容体結合；抗体−依存性細胞−媒介細胞傷害性（ＡＴＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；およびＢ細胞活性化を含む。   Antibody “effector functions” refer to those biological activities attributable to the Fc region (a native sequence Fc region or amino acid sequence variant Fc region) of an antibody, and vary with the antibody isotype. Examples of antibody effector functions are: C1q binding and complement dependent cytotoxicity; Fc receptor binding; antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ATCC); phagocytosis; cell surface receptors (eg, B cells Receptor) down-regulation; and B cell activation.

「抗体−依存性細胞−媒介細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を担う標的細胞に特異的に結合し、引き続いて、サイトトキシンで標的細胞を殺すのを可能とする細胞傷害性の形態をいう。抗体は細胞傷害性細胞を「同伴し」、それはそのような殺傷に絶対的に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞、ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、他方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。注目する分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されたもののようなイン・ビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。そのようなアッセイについての有用なエフェクター細胞は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。別法として、あるいは加えて、注目する分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されたもののような動物モデルにおいてイン・ビボで評価することができる。   “Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity” or “ADCC” refers to Fc receptors (such as natural killer (NK) cells, neutrophils, and macrophages) that are present on certain cytotoxic cells ( The secreted Ig bound to (FcR) binds specifically to the target cells to which these cytotoxic effector cells carry the antigen, and subsequently allows the cytotoxic cells to be killed by cytotoxins. Refers to the form. Antibodies “entrain” cytotoxic cells, which are absolutely required for such killing. Primary cells for mediating ADCC, NK cells express FcγRIII only, whereas monocytes express FcγRI, FcγRII and FcγRIII. FcR expression in hematopoietic cells is described in Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991), page 464, summarized in Table 3. To assess the ADCC activity of the molecule of interest, an in vitro ADCC assay such as those described in US Pat. Nos. 5,500,362 or 5,821,337 can be performed. Useful effector cells for such assays include peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and natural killer (NK) cells. Alternatively or additionally, the ADCC activity of the molecule of interest can be determined, for example, according to Clynes et al. (USA) 95: 652-656 (1998) and can be evaluated in vivo in animal models.

「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマー受容体）に結合するものであり、これらの受容体の対立遺伝子変種、あるいはスプライスされた形態を含めた、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、その細胞質ドメインにおいて主として異なる同様なアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシン−ベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシン−ベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｍ．Ｄａeｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）中のレビュー参照）。ＦｃＲはＲａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４（１９９４）；およびＨａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）にレビューされている。将来同定されるものを含めた他のＦｃＲは、本明細書中における用語「ＦｃＲ」によって含まれる。該用語は、母性ＩｇＧの胎児への移動を担う新生児受容体ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。   “Fc receptor” or “FcR” describes a receptor that binds to the Fc region of an antibody. A preferred FcR is a native sequence human FcR. Furthermore, preferred FcRs are those that bind to IgG antibodies (gamma receptors) and include receptors of the FcγRI, FcγRII and FcγRIII subclasses, including allelic variants or spliced forms of these receptors. FcγRIII receptors include FcγRIIA (an “activating receptor”) and FcγRIIB (an “inhibiting receptor”), which have similar amino acid sequences that differ primarily in their cytoplasmic domains. Activating receptor FcγRIIA contains an immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) in its cytoplasmic domain. The inhibitory receptor FcγRIIB contains an immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM) in its cytoplasmic domain (see review in M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). . FcR is described in Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991); Capel et al. , Immunomethods 4: 25-34 (1994); and Haas et al. , J .; Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Other FcRs, including those to be identified in the future, are encompassed by the term “FcR” herein. The term also includes the neonatal receptor FcRn responsible for the transfer of maternal IgG to the fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994). )).

「ヒトエフェクター細胞」は１以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を行う白血球である。好ましくは、該細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球を含み；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、天然源から、例えば、血液から単離することができる。   “Human effector cells” are leukocytes that express one or more FcRs and perform effector functions. Preferably, the cell expresses at least FcγRIII and performs ADCC effector function. Examples of human leukocytes that mediate ADCC include peripheral blood mononuclear cells (PBMC), natural killer (NK) cells, monocytes, cytotoxic T cells and neutrophils; PBMC and NK cells are preferred. Effector cells can be isolated from natural sources, for example from blood.

「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解をいう。古典的な補体経路の活性化は、それらの同族抗原に結合する（適当なサブクラスの）抗体への補体系（Ｃ１ｑ）の最初の成分の結合によって開始される。補体活性化を評価するためには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されたＣＤＣアッセイを行うことができる。   “Complement dependent cytotoxicity” or “CDC” refers to lysis of a target cell in the presence of complement. Activation of the classical complement pathway is initiated by binding of the first component of the complement system (C1q) to (appropriate subclass) antibodies that bind their cognate antigen. To assess complement activation, see, for example, Gazzano-Santoro et al. , J .; Immunol. The CDC assay described in Methods 202: 163 (1996) can be performed.

用語「癌」および「癌性」とは、典型的には調節されていない細胞成長によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的疾患をいい、またはそれを記載する。癌の例は、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞種、肉腫、および白血病またはリンパ系悪性疾患を含む。そのような癌のより特別な例は扁平細胞（例えば、上皮扁平細胞癌）、小細胞肺癌、非−小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平癌腫を含めた肺癌、腹腔の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含めた胃癌、膵臓癌、神経膠芽細胞種、頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、泌尿器管の癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、子宮内膜または子宮癌種、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌種、肛門癌腫、陰茎癌、メラノーマ、多発性骨髄腫およびＢ−細胞リンパ腫、脳、ならびに頭部および首癌、および関連する転移を含む。   The terms “cancer” and “cancerous” refer to or describe the physiological disorder in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth. Examples of cancer include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia or lymphoid malignancy. More specific examples of such cancers are squamous cells (eg, epithelial squamous cell carcinoma), small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma and lung squamous carcinoma, lung cancer, liver cancer, liver Cell cancer, gastric cancer including gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, urinary tract cancer, liver cancer, breast cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, Endometrial or uterine cancer type, salivary gland carcinoma, kidney cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver cancer type, anal carcinoma, penile cancer, melanoma, multiple myeloma and B-cell lymphoma, brain, and head And neck cancer, and related metastases.

用語「細胞増殖性障害」および「増殖性傷害」とは、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害をいう。１つの具体例において、細胞増殖性障害は癌である。   The terms “cell proliferative disorder” and “proliferative injury” refer to disorders associated with some degree of abnormal cell proliferation. In one embodiment, the cell proliferative disorder is cancer.

本明細書中で用いる「腫瘍」とは、悪性または良性を問わず全て新形成細胞成長および増殖、および全てのプレ−癌性および癌性の細胞および組織をいう。   As used herein, “tumor” refers to all neoplastic cell growth and proliferation, whether malignant or benign, and all pre-cancerous and cancerous cells and tissues.

「細胞の死滅を誘導する」抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子は、生存細胞が生存しなくなるようにするものである。該細胞は、ＴＡＴポリペプチドを発現するもの、好ましくは、同一組織タイプの正常な細胞と比較して、ＴＡＴポリペプチドを過剰発現する細胞である。ＴＡＴポリペプチドは、癌細胞の表面に発現された膜貫通ポリペプチドでありえ、あるいは癌細胞によって生産され、分泌されたポリペプチドでありえる。好ましくは、該細胞は癌細胞、例えば、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、結直腸、胸腺、膵臓または膀胱細胞である。イン・ビトロでの細胞死滅は、補体および免疫エフェクター細胞の存在下で測定して、抗体−依存性細胞−媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によって誘導される細胞死滅を区別することができる。かくして、細胞死滅についてのアッセイは、（補体不存在下で）加熱不活化血清を用い、免疫エフェクター細胞の不存在下で行うことができる。抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子が細胞死滅を誘導できるか否かを判断するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１−１１（１９９５））または７ＡＡＤの接種によって評価される膜一体性の喪失は、未処理細胞に対して評価することができる。好ましい細胞死滅−誘導抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子は、ＢＴ４７４細胞におけるＰＩ接種アッセイでのＰＩ接種を誘導するものである。   An antibody, oligopeptide or other organic molecule that “induces cell death” is one that prevents viable cells from surviving. The cell is one that expresses a TAT polypeptide, preferably a cell that overexpresses a TAT polypeptide as compared to normal cells of the same tissue type. The TAT polypeptide can be a transmembrane polypeptide expressed on the surface of a cancer cell, or it can be a polypeptide produced and secreted by a cancer cell. Preferably, the cell is a cancer cell, such as a breast, ovary, stomach, endometrium, salivary gland, lung, kidney, colon, colorectal, thymus, pancreas or bladder cell. In vitro cell death is induced by antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC), as measured in the presence of complement and immune effector cells. Cell death can be distinguished. Thus, an assay for cell death can be performed using heat-inactivated serum (in the absence of complement) and in the absence of immune effector cells. To determine whether antibodies, oligopeptides or other organic molecules can induce cell death, propidium iodide (PI), trypan blue (Moore et al., Cytotechnology 17: 1-11 (1995)) or The loss of membrane integrity assessed by 7AAD inoculation can be assessed against untreated cells. Preferred cell killing-inducing antibodies, oligopeptides or other organic molecules are those that induce PI inoculation in a PI inoculation assay in BT474 cells.

「ＴＡＴ−発現細胞」は、細胞表面での、または分泌された形態における内因性またはトランスフェクトされたＴＡＴポリペプチドを発現する細胞である。「ＴＡＴ−発現癌」は、細胞表面に存在するＴＡＴポリペプチドを有する、あるいはＴＡＴポリペプチドを生産し分泌する細胞を含む癌である。「ＴＡＴ−発現癌」は、抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子がそれに結合でき、癌に関する治療効果を有するように、所望により、その細胞の表面で十分なレベルのＴＡＴポリペプチドを生産する。もう１つの具体例において、「ＴＡＴ−発現癌」は、抗−ＴＡＴ抗体、オリゴヌクレオチドまたは他の有機分子アゴニストがそれに結合でき、癌に関する治療効果を有するように、所望により、十分なレベルのＴＡＴポリペプチドを生産し、分泌する。後者に関しては、アンタゴニストは、腫瘍細胞によって分泌されたＴＡＴポリペプチドの生産および分泌を低下させ、阻害し、または妨げるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。ＴＡＴポリペプチドを「過剰発現」する癌は、同一組織タイプの非癌性細胞と比較して、その細胞表面で有意により高いレベルのＴＡＴポリペプチドを有し、あるいはそれを生産し、分泌するものである。そのような過剰発現は、遺伝子増幅によって、または増大した転写または翻訳によって引き起こされる。ＴＡＴポリペプチド過剰発現は、（例えば、ＴＡＴポリペプチドをコードする単離された核酸から組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる単離されたＴＡＴポリペプチドに対して調製された抗−ＴＡＴ抗体を用いる免疫組織化学アッセイ；ＦＡＣＳ分析などを介して）細胞の表面に存在する、または該細胞によって分泌されたＴＡＴ蛋白質の増大したレベルを評価することによって、診断または予後アッセイで測定することができる。別法として、あるいは加えて、例えば、ＴＡＴ−コーディング核酸に対応する核酸ベースのプローブ、またはその相補体を用いる蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公表されたＷＯ ９８／４５４７９参照）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、またはリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のようなポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術を介して、細胞中でのＴＡＴポリペプチド−コーディング核酸またはｍＲＮＡのレベルを測定することができる。また、例えば、抗体−ベースのアッセイを用い、血清のような生物学的流体中の放出された抗原を測定することによって、ＴＡＴポリペプチド過剰発現を調べることもできる（例えば、１９９０年６月１２日に発行された米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日に公開されたＷＯ ９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に発行された米国特許第５，４０１，６３８号；およびＳｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３２：７３−８０（１９９０）も参照。前記アッセイとは別に、種々のイン・ビボアッセイが当業者に利用できる。例えば、患者の身体内の細胞を、検出可能な標識、例えば、放射性同位体で所望により標識された抗体へ暴露することができ、患者における細胞への抗体の結合は、例えば、放射能についての外部スキャンニングによって、あるいは抗体に先に暴露された患者から採取したバイオプシーを分析することによって評価することができる。   A “TAT-expressing cell” is a cell that expresses an endogenous or transfected TAT polypeptide at the cell surface or in a secreted form. A “TAT-expressing cancer” is a cancer comprising cells that have a TAT polypeptide present on the cell surface or that produce and secrete a TAT polypeptide. A “TAT-expressing cancer” optionally has a sufficient level of TAT polypeptide on the surface of its cells so that anti-TAT antibodies, oligopeptides or other organic molecules can bind to it and have a therapeutic effect on the cancer. Produce. In another embodiment, a “TAT-expressing cancer” is an optionally sufficient level of TAT so that an anti-TAT antibody, oligonucleotide or other organic molecule agonist can bind to it and have a therapeutic effect on the cancer. Produce and secrete the polypeptide. With respect to the latter, the antagonist can be an antisense oligonucleotide that reduces, inhibits or prevents the production and secretion of TAT polypeptide secreted by tumor cells. A cancer that “overexpresses” a TAT polypeptide has, or produces and secretes, a significantly higher level of TAT polypeptide on its cell surface compared to non-cancerous cells of the same tissue type. It is. Such overexpression is caused by gene amplification or by increased transcription or translation. A TAT polypeptide overexpression is an anti-TAT prepared against an isolated TAT polypeptide that can be prepared using, for example, recombinant DNA technology from an isolated nucleic acid encoding the TAT polypeptide. Immunohistochemical assays using antibodies (such as via FACS analysis) may be measured in diagnostic or prognostic assays by assessing increased levels of TAT protein present on or secreted by the cells it can. Alternatively or additionally, for example, fluorescence in situ hybridization using a nucleic acid based probe corresponding to a TAT-encoding nucleic acid, or its complement; (FISH; WO 98 / published in October 1998) 45479), measuring the level of TAT polypeptide-encoding nucleic acid or mRNA in cells via polymerase chain reaction (PCR) techniques such as Southern blotting, Northern blotting, or real-time quantitative PCR (RT-PCR). can do. TAT polypeptide overexpression can also be examined by measuring released antigen in biological fluids such as serum using, for example, antibody-based assays (see, eg, June 1990). U.S. Pat. No. 4,933,294 issued April 18, 1991; WO 91/05264 published April 18, 1991; U.S. Pat. No. 5,401,638 issued Mar. 28, 1995; See also, and Sias et al., J. Immunol. The antibody can be exposed to a detectable label, eg, an antibody that is optionally labeled with a radioisotope, and binding of the antibody to cells in the patient is For example, it can be evaluated by analyzing the external scanning for radioactivity or taken from a patient exposed to previously antibodies biopsy.

本明細書中で用いるように、用語「免疫アドヘシン」は、異種蛋白質（「アドヘシン」）の結合特異性を、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせる抗体−様分子を示す。構造的には、免疫アドヘシンは、抗体の抗原認識部位および結合部位以外である（すなわち、「異種」である）所望の結合特異性を持つアミノ酸配列、および免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合を含む。免疫アドヘシン分子のアドヘシン部分は、典型的には、受容体またはリガンドの少なくとも結合部位を含む連続アミノ酸配列である。免疫アドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４サブタイプ、（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２を含めた）ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭのようないずれかの免疫グロブリンから得ることができる。   As used herein, the term “immunoadhesin” refers to an antibody-like molecule that combines the binding specificity of a heterologous protein (“adhesin”) with the effector function of an immunoglobulin constant domain. Structurally, an immunoadhesin comprises a fusion of an amino acid sequence with a desired binding specificity other than the antigen recognition and binding sites of an antibody (ie, “heterologous”), and an immunoglobulin constant domain sequence. The adhesin portion of an immune adhesin molecule is typically a contiguous amino acid sequence that includes at least the binding site of a receptor or ligand. Immunoglobulin constant domain sequences in immunoadhesins are IgG-1, IgG-2, IgG-3, or IgG-4 subtypes, such as IgA (including IgA-1 and IgA-2), IgE, IgD or IgM. Can be obtained from any immunoglobulin.

用語「標識」は、本明細書中で用いる場合には、抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子に著癖区的にまたは間接的に結合体化して、「標識された」抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子を生じる検出可能な化合物または組成物をいう。該標識はそれ自体によって検出でき（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、あるいは酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒することができる。   The term “label”, as used herein, is significantly or indirectly conjugated to an antibody, oligopeptide or other organic molecule to form a “labeled” antibody, oligopeptide or A detectable compound or composition that produces other organic molecules. The label can be detected by itself (eg, a radioisotope label or a fluorescent label), or in the case of an enzyme label, it can catalyze a chemical change in the detectable substrate compound or composition.

本明細書中で用いる用語「細胞傷害性剤」は、細胞の機能を阻害し、または妨げ、および／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。該用語は放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレーディング剤、ヌクレオ溶解酵素のような酵素およびその断片、抗生物質、小分子トキシン、あるいはその断片および／または変種を含めた細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性なトキシンのようなトキシン、および後に開示する種々の抗腫瘍または抗癌剤を含める意図である。他の細胞傷害性剤を以下に記載する。殺腫瘍剤は腫瘍細胞の破壊を引き起こす。サイトトキシンは抗体に共有結合させて、トキシンを、抗原を発現する注目する特定の細胞へ標的化することができる。有用なサイトトキシンは、限定されるものではないが、以下のものを含めたそれらのリンカーである：
リンカー：
ＭＣ＝マレイミドカプロイル
Ｖａｌ Ｃｉｔ＝バリン−シトルリン、プロテアーゼ切断可能リンカーにおけるジペプチド部位
シトルリン＝２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸
ＰＡＢ＝ｐ−アミノベンジルカルバモイル（リンカーの「自己犠牲」部分）
Ｍｅ＝リンカーペプチド結合が修飾されて、カテプシンＢによるその切断を妨げるＮ−メチル−バリンシトルリン
ＭＣ（ＰＥＧ）６−ＯＨ＝抗体システインに結合したマレイミドかプロイド−ポリエチレングリコール
ＳＰＰ＝４−（２−ピリジルチオ）ペンタン酸Ｎ−スクシンイミジル
ＳＭＣＣ＝Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート
細胞傷害性薬物：
ＭＭＡＥ＝モノ−メチルアウリスタチンＥ（ＭＷ７１８）
ＭＭＡＦ＝薬物のＣ−末端にフェニルアラニンを持つアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の変種（ＭＷ７３１．５）
ＡＥＶＢ＝アウリスタチンＥバレリルベンジルヒドラゾン、ＡＥのＣ−末端を通る酸不安定リンカー（ＭＷ７３２）
ＡＦＰ＝アウリスタチンＦフェニレンジアニン；（フェニレンジアニンスペーサーを介してＣ−末端を通じて抗体に連結されたフェニルアラニン変種）（ＭＷ７３２）
「成長阻害剤」は、本明細書中で用いる場合、イン・ビトロまたはイン・ビボいずれかにて、細胞、特にＴＡＴ−発現癌細胞の成長を阻害する化合物または組成物をいう。かくして、成長阻害剤は、Ｓ相においてＴＡＴ−発現細胞のパーセンテージを有意に低下させるものであり得る。成長阻害剤の例は、Ｇ１阻止およびＭ−相阻止を誘導する剤のような、（Ｓ相以外の場所で）細胞周期の進行をブロックする剤を含む。古典的なＭ−相ブロッカーは、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキセン、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンのようなトポイソベラーゼＩＩ阻害剤を含む。ＧＩを阻止する剤は、Ｓ−相阻止を破壊する。例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−ＣのようなＤＮＡアルキル化剤。更なる情報はＴｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ａｎｄ Ｉｓｒａｅｌ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １，Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．による表題“Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｒａｔｉｏｎ， ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ”（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）、特に１３ページに見出すことができる。タキセン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、共にイチイ樹木に由来する抗癌薬剤である。セイヨウイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成アナログである。パクリタキセルおよびドセタキセルはチューブリンダイマーからの微小管の組立を促進し、脱重合を阻害することによって微小管を安定化させ、その結果、細胞における有糸分裂の阻害がもたらされる。 The term “cytotoxic agent” as used herein refers to a substance that inhibits or prevents the function of cells and / or causes destruction of cells. The term includes radioisotopes (eg, radioisotopes of At 211 , I 131 , I 125 , Y 90 , Re 186 , Re 188 , Sm 153 , Bi 212 , P 32 , and Lu), chemotherapeutic agents, such as Methotrexate, adriamycin, vinca alkaloids (vincristine, vinblastine, etoposide), doxorubicin, melphalan, mitomycin C, chlorambucil, daunorubicin, or other intercalating agents, enzymes such as nucleolytic enzymes and fragments thereof, antibiotics, small molecules Toxins, or toxins such as enzymatically active toxins of bacterial, fungal, plant or animal origin, including fragments and / or variants thereof, and various antitumor or anticancer agents disclosed later are intended to be included. Other cytotoxic agents are described below. Tumoricides cause destruction of tumor cells. Cytotoxins can be covalently attached to antibodies to target the toxin to specific cells of interest that express the antigen. Useful cytotoxins are those linkers including, but not limited to:
Linker:
MC = maleimidocaproyl Val Cit = valine-citrulline, dipeptide site citrulline in protease-cleavable linker = 2-amino-5-ureidopentanoic acid PAB = p-aminobenzylcarbamoyl (the “self-sacrificing” part of the linker)
Me = N-methyl-valine citrulline MC (PEG) 6-OH = maleimide or ploidy-polyethylene glycol SPP = 4- (2-pyridylthio conjugated to antibody cysteine, modified linker peptide bond to prevent its cleavage by cathepsin B ) N-succinimidyl pentanoate SMCC = N-succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1carboxylate cytotoxic drug:
MMAE = mono-methyl auristatin E (MW 718)
MMAF = variant of auristatin E (MMAE) with phenylalanine at the C-terminus of the drug (MW731.5)
AEVB = Auristatin E valeryl benzylhydrazone, acid labile linker through the C-terminus of AE (MW732)
AFP = Auristatin F phenylene dianine; (Phenylalanine variant linked to antibody through C-terminus via phenylene dianine spacer) (MW732)
“Growth inhibitory agent” as used herein refers to a compound or composition that inhibits the growth of cells, particularly TAT-expressing cancer cells, either in vitro or in vivo. Thus, a growth inhibitor may be one that significantly reduces the percentage of TAT-expressing cells in the S phase. Examples of growth inhibitory agents include agents that block cell cycle progression (at places other than S phase), such as agents that induce G1 arrest and M-phase arrest. Classic M-phase blockers include vinca (vincristine and vinblastine), taxane, and topoisoverase II inhibitors such as doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposide, and bleomycin. Agents that block GI destroy the S-phase block. For example, DNA alkylating agents such as tamoxifen, prednisone, dacarbazine, mechloretamine, cisplatin, methotrexate, 5-fluorouracil, and ara-C. Further information can be found in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds. , Chapter 1, Murakami et al. Can be found in the title “Cell cycle registration, oncogenes, and antineoplastic drugs” (WB Saunders: Philadelphia, 1995), in particular. Taxene (paclitaxel and docetaxel) are both anticancer drugs derived from yew trees. Docetaxel (TAXOTERE (registered trademark), Rhone-Poulenc Roller) derived from yew is a semi-synthetic analog of paclitaxel (TAXOL (registered trademark), Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel and docetaxel promote the assembly of microtubules from tubulin dimers and stabilize microtubules by inhibiting depolymerization, resulting in inhibition of mitosis in the cells.

「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学的名称は（８Ｓ−シス）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキサピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラー６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオンである。   “Doxorubicin” is an anthracycline antibiotic. The full chemical name for doxorubicin is (8S-cis) -10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl) oxy] -7,8,9,10-tetra- 6,8,11-trihydroxy-8- (hydroxyacetyl) -1-methoxy-5,12-naphthacenedione.

用語「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとしてもう１つの細胞に作用する１つの細胞集団によって放出される蛋白質についての総称用語である。そのようなサイトカインの例はリンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体ホルモン（ＬＨ）のような糖蛋白質ホルモン；肝臓成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよびβ；ヌレリアン−阻害物質；マウスゴナドトロピン−関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＨ−βのような神経成長因子；血小板−成長因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン−用成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスドポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、−βおよび−γのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、Ｉｌ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｉｌ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のようなインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βのような腫瘍壊死因子；ＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含めた他のポリペプチド因子がある。本明細書中で用いるように用語サイトカインは、天然源からの、または組換え細胞培養からの蛋白質、および生物学的に活性な当量の天然配列サイトカインを含む。   The term “cytokine” is a generic term for proteins released by one cell population that act on another cell as an intercellular mediator. Examples of such cytokines are lymphokines, monokines, and traditional polypeptide hormones. Cytokines include growth hormones such as human growth hormone, N-methionyl human growth hormone, and bovine growth hormone; parathyroid hormone; thyroxine; insulin; proinsulin; relaxin; prorelaxin; follicle stimulating hormone (FSH), thyroid Glycoprotein hormones such as stimulating hormone (TSH) and luteinizing hormone (LH); liver growth factor; fibroblast growth factor; prolactin; placental lactogen; tumor necrosis factor-α and β; nulerian-inhibitor; Inhibin; Activin; Vascular Endothelial Growth Factor; Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nerve Growth Factor such as NGH-β; Platelet-Growth Factor; Transforming Growth Factor (TGF) such as TGF-α and TGF-β ); Growth factors for insulin-I and -II; erythodopoietin (EPO); osteoinductive factors; interferons such as interferon-α, -β and -γ; colony stimulating factors such as macrophage-CSF (M-CSF) (CSF); granulocyte-macrophage-CSF (GM-CSF); and granulocyte-CSF (G-CSF); IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, Il-4, IL-5 IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-12, tumor necrosis factor such as TNF-α or TNF-β; LIF and kit There are other polypeptide factors including a ligand (KL). As used herein, the term cytokine includes proteins from natural sources or from recombinant cell culture, and biologically active equivalents of native sequence cytokines.

用語「添付文書」は、治療製品の使用に関しての症例、用法、投与量、投与、禁忌および／または警告についての情報を含む、治療製品の商業的パッケージに慣用的に含ませる指示書をいうように用いる。   The term “package insert” refers to instructions that are routinely included in commercial packages of therapeutic products, including information about cases, usage, dosages, administration, contraindications and / or warnings regarding the use of the therapeutic products. Used for.

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％アミノ酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって判断された２つのポリペプチドの間の同一にマッチするアミノ酸残基の数）÷（ＴＡＴポリペプチドのアミノ酸残基の合計数）＝
５÷１５＝３３．３％
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 % Amino acid sequence identity =
(Number of identically matched amino acid residues between the two polypeptides as determined by ALIGN-2) / (total number of amino acid residues of the TAT polypeptide) =
5 ÷ 15 = 33.3%

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％アミノ酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって判断された２つのポリペプチドの間の同一にマッチするアミノ酸残基の数）÷（ＴＡＴポリペプチドのアミノ酸残基の合計数）＝
５÷１０＝５０％
Figure 2008512121
 % Amino acid sequence identity =
(Number of identically matched amino acid residues between the two polypeptides as determined by ALIGN-2) / (total number of amino acid residues of the TAT polypeptide) =
5 ÷ 10 = 50%

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％アミノ酸配列同一性＝
（ＡＬＩＧＮ−２によって判断された２つの核酸配列の間の同一にマッチするヌクレオチドの数）÷（ＴＡＴ−ＤＮＡ核酸配列のヌクレオチドの合計数）＝
９÷１４＝４２．９％
Figure 2008512121
 % Amino acid sequence identity =
(Number of identically matched nucleotides between two nucleic acid sequences determined by ALIGN-2) / (total number of nucleotides of TAT-DNA nucleic acid sequence) =
9 ÷ 14 = 42.9%

Figure 2008512121
（２）％核酸配列同一性＝
（３）（ＡＬＩＧＮ−２によって判断された２つの核酸配列の間の同一にマッチするヌクレオチドの数）÷（ＴＡＴ−ＤＮＡ核酸配列のヌクレオチドの合計数）＝
４÷１２＝３３．３％
ＩＩ．本発明の組成物および方法
Ａ．抗−ＴＡＴ抗体
１つの具体例において、本発明は、治療および／または診断剤としてここに用途を見い出すことができる抗−ＴＡＴ抗体を提供する。例示的な抗体はポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二特異的、およびヘテロ結合体化抗体を含む。
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 (2)% nucleic acid sequence identity =
(3) (number of identically matched nucleotides between two nucleic acid sequences determined by ALIGN-2) / (total number of nucleotides of TAT-DNA nucleic acid sequence) =
4 ÷ 12 = 33.3%
II. Compositions and Methods of the Invention Anti-TAT Antibodies In one embodiment, the present invention provides anti-TAT antibodies that may find use herein as therapeutic and / or diagnostic agents. Exemplary antibodies include polyclonal, monoclonal, humanized, bispecific, and heteroconjugated antibodies.

１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物において生起させる。関連する抗原を（特に、合成ペプチドを用いる場合に）免疫化すべき種において免疫原性である蛋白質に結合体化させるのが有用であろう。例えば、抗原は、二官応性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲおよびＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロビン、または大豆トリプシン阻害剤に結合体化することができる。 1. Polyclonal antibodies Polyclonal antibodies are preferably raised in animals by multiple subcutaneous (sc) or intraperitoneal (ip) injections of the relevant antigen and adjuvant. It may be useful to conjugate the relevant antigen (especially when using synthetic peptides) to a protein that is immunogenic in the species to be immunized. For example, antigens can be bimodal or derivatizing agents such as maleimidobenzoylsulfosuccinimide ester (conjugation via cysteine residues), N-hydroxysuccinimide (via lysine residues), glutaraldehyde, succinic anhydride, with R 1 N = C = NR a SOCl 2, or R and R 1, are different alkyl groups, keyhole limpet hemocyanin (KLH), serum albumin, Ushichirogurobin or be conjugated to soybean trypsin inhibitor, Can do.

例えば、１００μｇまたは５μｇの蛋白質または結合体化（各々、ウサギまたはマウス用）を３容量のフロイントの完全アジュバントと組み合わせ、溶液を複数部位にて皮内注射することによって、動物を抗原、免疫原性結合体化、または誘導体に対して免疫化する。１ケ月後、複数部位における皮下注射によって、フロイントの完全アジュバント中の元の量の１／５ないし１／１０のペプチドまたは結合体化をブースター注射する。７ないし１４日後、動物を出血させ、血清を抗体力価についてアッセイする。力価がプラトーとなるまで動物をブースター注射する。結合体化は、蛋白質融合として組換え細胞培養においても作成することができる。また、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答を促進するのに適切に用いられる。   For example, animals can be made antigenic, immunogenic by combining 100 μg or 5 μg protein or conjugate (for rabbits or mice, respectively) with 3 volumes of Freund's complete adjuvant and injecting the solution intradermally at multiple sites. Immunize against conjugates or derivatives. One month later, booster injection of the original amount of 1/5 to 1/10 peptide or conjugation in Freund's complete adjuvant is given by subcutaneous injection at multiple sites. Seven to 14 days later, the animals are bled and the serum is assayed for antibody titer. Animals are boosted until the titer reaches a plateau. Conjugation can also be made in recombinant cell culture as a protein fusion. Also, aggregating agents such as alum are suitably used to promote an immune response.

２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法を用いて作成することができ、あるいは組換えＤＮＡ方法によって作成することができる（米国特許第４，８１６，５６７号）。 2. Monoclonal antibodies Monoclonal antibodies are described in Kohler et al. , Nature, 256: 495 (1975), or may be made using recombinant DNA methods (US Pat. No. 4,816,567).

ハイブリドーマ方法において、マウス、またはハムスターのような他の適当な宿主細胞を、前記したように、免疫化して、免疫化で用いる蛋白質に特異的に結合する抗体を生産する、または生産することができるリンパ球を誘導する。別法として、リンパ球をイン・ビトロにて免疫化することができる。免疫化の後、リンパ球を単離し、次いで、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて、骨髄腫細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｈｒｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｌａｃｅ，１９８６））。   In the hybridoma method, other suitable host cells such as mice or hamsters can be immunized as described above to produce or produce antibodies that specifically bind to the protein used in the immunization. Inducing lymphocytes. Alternatively, lymphocytes can be immunized in vitro. After immunization, lymphocytes are isolated and then fused with a myeloma cell line using a suitable fusion agent such as polyethylene glycol to form hybridoma cells (Goding, Monochron Antibodies: Principles and Practices, pp. 59-103 (Academic Place, 1986)).

かく調製したハイブリドーマを、適当な培養基に撒き、そこで増殖させ、その培地は、好ましくは、（融合パートナーともいう）融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１以上の物質を含有する。例えば、もし親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＡＴまたはＨＰＲＴ）を欠くならば、ハイブリドーマのための選択培養基は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、その物質は、ＨＧＰＲＴ−欠乏細胞の成長を妨げる。   The hybridoma thus prepared is seeded in an appropriate culture medium and grown there, and the medium preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of unfused parent myeloma cells (also referred to as fusion partners). To do. For example, if the parent myeloma cells lack the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRAT or HPRT), selective culture media for hybridomas are typically hypoxanthine, aminopterin, and thymidine (HAT medium). The substance prevents the growth of HGPRT-deficient cells.

好ましい融合パートナー骨髄腫細胞は、効果的に融合し、選択された抗体−生産細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支持し、融合していない親細胞に対して選択される選択培地に対して感受性であるものである。好ましい骨髄腫細胞系は、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｕｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、ＳＰ−２および誘導体、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃａｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから入手可能なＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞のようなネズミ骨髄腫系である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系もまた、ヒトモノクローナル抗体の生産について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；およびＢｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。   Preferred fusion partner myeloma cells are those that fuse effectively, support stable high level production of antibodies by the selected antibody-producing cells, and are directed against a selective medium selected for non-fused parent cells. And sensitive. Preferred myeloma cell lines are those derived from MOPC-21 and MPC-11 mouse tumors available from the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, SP-2 and derivatives such as the American Type Culture Collection, A murine myeloma line such as X63-Ag8-653 cells available from Virginia, USA. Human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines have also been described for the production of human monoclonal antibodies (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); and Brodeur et al., Monoclonal Production Technologies and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

ハイブリドーマ細胞が増殖している培養基を、抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の生産についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈澱によって、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のような、イン・ビトロ結合アッセイによって測定される。   Culture medium in which hybridoma cells are growing is assayed for production of monoclonal antibodies directed against the antigen. Preferably, the binding specificity of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells is measured by immunoprecipitation or by in vitro binding assays such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). .

モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｌａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）に記載されたＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって測定することができる。   The binding affinity of a monoclonal antibody is described, for example, in Munson et al. Alal. Biochem. 107: 220 (1980).

一旦、所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞が同定されたならば、限界希釈手法によってクローンをサブクローンし、標準的な方法によって増殖させる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的での適当な培養基は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。加えて、ハイブリドーマ細胞は、例えば、該細胞のマウスへの腹腔内注射によって、動物における腹水腫瘍としてイン・ビボで増殖させることができる。   Once a hybridoma cell that produces an antibody of the desired specificity, affinity, and / or activity is identified, the clone is subcloned by limiting dilution techniques and grown by standard methods (Goding, Monoclonal Antibodies). : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Suitable culture media for this purpose include, for example, D-MEM or RPMI-1640 medium. In addition, hybridoma cells can be grown in vivo as ascites tumors in animals, for example, by intraperitoneal injection of the cells into mice.

サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いる）アフィニティークロマトグラフィー、またはイオン−交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などのような慣用的な抗体精製手法によって培養基、腹水液、または血清から適切に分離される。   Monoclonal antibodies secreted by the subclone are, for example, affinity chromatography (eg using protein A or protein G-Sepharose), or ion-exchange chromatography, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, etc. It is suitably separated from the culture medium, ascites fluid, or serum by conventional antibody purification techniques.

モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）慣用的な手法を用いて容易に単離し、配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい源として供される。一旦単離されれば、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いで、これを、そうでなければ抗体蛋白質を生産しないＥ．ｃｏｌｉ細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現についてのレビュー論文は、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６−２６２（１９９３）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｌｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１−１８８（１９９２）を含む。   DNA encoding a monoclonal antibody can be easily isolated using conventional techniques (eg, by using oligonucleotide probes that can specifically bind to the genes encoding the heavy and light chains of murine antibodies). Released and sequenced. Hybridoma cells serve as a preferred source of such DNA. Once isolated, the DNA can be placed into an expression vector which is then E. coli that does not otherwise produce an antibody protein. E. coli cells, Simian COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells are transfected to obtain monoclonal antibody synthesis in recombinant host cells. Review articles on recombinant expression in bacteria of DNA encoding the antibody can be found in Skerra et al. Curr. Opinion in Immunol. , 5: 256-262 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188 (1992).

更なる具体例において、モノクローナル抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）を用いて生じさせた抗体ファージライブラリから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）は、ファージライブラリを用いる、各々、ネズミおよびヒト抗体の単離を記載する。引き続いての刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の生産（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに非常に大きなファージライブラリを構築するための戦略としてのコンビナトーリアル感染およびイン・ビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））を記載する。かくして、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する有力な代替方である。   In further embodiments, monoclonal antibodies or antibody fragments can be obtained from McCafferty et al. , Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al. , Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al. , J .; Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) describe the isolation of murine and human antibodies, respectively, using phage libraries. Subsequent publications produced high affinity (nM range) human antibodies by chain shuffling (Marks et al., Bio / Technology, 10: 779-783 (1992)), as well as construction of very large phage libraries Combinatorial infection and in vivo recombination (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21: 2265-2266 (1993)) are described as strategies for achieving this. Thus, these techniques are a powerful alternative to traditional monoclonal antibody hybridoma technology for the isolation of monoclonal antibodies.

該抗体をコードするＤＮＡを修飾して、例えば、相同ネズミ配列に代えてヒト重鎖および軽鎖定常ドメイン（ＣＨおよびＣＬ）配列で置き換えることによって（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、あるいは免疫グロブリンコーディング配列を、非−免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）についてのコーディング配列の全てまたは一部と融合させることによって、キメラまたは融合抗体ポリペプチドを生産することができる。非−免疫グロブリンポリペプチド配列を抗体の定常ドメインに代えて置き換えることができる、あるいはそれらを抗体の１つの抗原−組合せ部位の可変ドメインに代えて置き換えて、異なる抗原についての特異性を有する抗原およびもう１つの抗原−組合せ部位に対する特異性を有する１つの抗原−組合せ部位を含むキメラ二価抗体を作成する。 DNA encoding the antibody may be modified, eg, by replacing it with human heavy and light chain constant domain (C H and C L ) sequences in place of homologous murine sequences (US Pat. No. 4,816,567; And Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. By fusing with a portion, a chimeric or fusion antibody polypeptide can be produced. Non-immunoglobulin polypeptide sequences can be substituted for the constant domains of antibodies, or they can be substituted for the variable domains of one antigen-combination site of an antibody, and antigens with specificity for different antigens and A chimeric bivalent antibody is made comprising one antigen-combination site with specificity for another antigen-combination site.

３．ヒトおよびヒト化抗体
本発明の抗−ＴＡＴ抗体は、さらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含むことができる。非−ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態は、非−ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、あるいは（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原−結合サブ配列のような）その断片である。ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非−ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられた免疫グロブリン（受容者抗体）を含む。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非−ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体は、受容者抗体においても、あるいは輸入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見出されない残基を含むこともできる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここに、ＣＤＲ領域の全て、または実質的に全ては非−ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、およびＦＲ領域の全て、または実質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。 3. Human and humanized antibodies The anti-TAT antibodies of the present invention can further comprise humanized antibodies or human antibodies. Humanized forms of non-human (eg, murine) antibodies are chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains, or (Fv, Fab, Fab ′, F (ab ′)) that contain minimal sequence derived from non-human immunoglobulin. 2 or fragments thereof (such as other antigen-binding subsequences of an antibody). Humanized antibodies are derived from the CDRs of a non-human species (donor antibody) such as a mouse, rat or rabbit whose residues from the complementarity determining region (CDR) of the recipient have the desired properties, affinity and ability. Including immunoglobulins (receptor antibodies) replaced by the residues of In some cases, Fv framework residues of the human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues. Humanized antibodies may also comprise residues that are found neither in the recipient antibody nor in the imported CDR or framework sequences. Generally, a humanized antibody comprises substantially all of at least one, typically two variable domains, wherein all or substantially all of the CDR regions correspond to those of non-human immunoglobulin. , And all or substantially all of the FR region is that of a human immunoglobulin consensus sequence. A humanized antibody optimally will comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of a human immunoglobulin [Jones et al. , Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al. , Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)].

非−ヒト抗体をヒト化する方法は当該分野で良く知られている。一般に、ヒト化抗体は、非−ヒトである源からそれに導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非−ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入」残基といい、これは、典型的には、「輸入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、実質的には、ヒト抗体の対応する配列に代えてげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置き換えることによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］に従って行うことができる。従って、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、そこでは、実質的に無傷ヒト可変ドメイン未満が、非−ヒト種からの対応する配列によって置き換えられている。現実には、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり、そこでは、いくつかのＣＤＲ残基および、おそらくは、いくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体において同様な部位からの残基によって置き換えられている。   Methods for humanizing non-human antibodies are well known in the art. Generally, a humanized antibody has one or more amino acid residues introduced into it from a source that is non-human. These non-human amino acid residues are often referred to as “import” residues, which are typically taken from an “import” variable domain. Humanization is substantially performed by the method of Winter and co-workers by replacing rodent CDR or CDR sequences in place of the corresponding sequences of human antibodies [Jones et al. , Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al. , Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al. , Science, 239: 1534-1536 (1988)]. Accordingly, such “humanized” antibodies are chimeric antibodies (US Pat. No. 4,816,567), wherein substantially less than an intact human variable domain is represented by the corresponding sequence from a non-human species. Has been replaced. In reality, humanized antibodies are typically human antibodies in which some CDR residues and possibly some FR residues are due to residues from similar sites in rodent antibodies. Has been replaced.

ヒト化抗体を作成するにおいて用いるべき重鎖および軽鎖双方のヒト可変ドメインの選択は、抗体をヒト治療用途で意図している場合には、抗原性およびＨＡＭＡ応答（ヒト抗−マウス抗体）を低下させるのに非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」方法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。げっ歯類のそれに最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、それ内のヒトフレームワーク領域（ＲＦ）は、ヒト化抗体について受容可能である（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。もう１つの方法は、軽鎖または重鎖の特定の亜群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を用いる。同一のフレームワークは、いくつかの異なるヒト化抗体について用いることができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９０）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３））。   The selection of both the heavy and light chain human variable domains to be used in making a humanized antibody is based on antigenicity and HAMA response (human anti-mouse antibody) if the antibody is intended for human therapeutic use. It is very important to lower. According to the so-called “best fit” method, the sequence of the variable domain of a rodent antibody is screened against the entire library of known human variable domain sequences. The human V domain sequence closest to that of rodents is identified, and the human framework region (RF) within it is acceptable for humanized antibodies (Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993). Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Another method uses a particular framework region derived from the consensus sequence of all human antibodies of a particular subgroup of light or heavy chains. The same framework can be used for several different humanized antibodies (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1990); Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 (1993)).

抗体は、抗原に対する高い結合親和性および他の好都合な生物学的特性を保持してヒト化されるのがさらに重要である。この目標を達成するには、好ましい方法に従うと、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いる親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析の方法によって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは通常利用でき、当業者が精通している。選択された候補免疫グロブリン配列のポータブル三次元立体配座構造を説明し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの精査は、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基のありそうな役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の分析を可能とする。このようにして、標的抗原に対する増大した親和性のような所望の抗体特徴が達成されるようにＦＲ残基を選択し、受容者および輸入配列から組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接的かつ最も実質的に関与する。   It is further important that antibodies be humanized with retention of high binding affinity for the antigen and other favorable biological properties. To achieve this goal, according to preferred methods, humanized antibodies are prepared by methods of analysis of parental sequences and various conceptual humanized products using a three-dimensional model of the parental and humanized sequences. Three-dimensional immunoglobulin models are commonly available and are familiar to those skilled in the art. Computer programs are available that describe and display portable three-dimensional conformational structures of selected candidate immunoglobulin sequences. A review of these displays allows analysis of the likely role of residues in the functionalization of candidate immunoglobulin sequences, ie, analysis of residues that affect the ability of a candidate immunoglobulin to bind its antigen. In this way, FR residues can be selected and combined from the recipient and import sequences so that the desired antibody characteristic, such as increased affinity for the target antigen (s), is achieved. In general, hypervariable region residues are directly and most substantially involved in influencing antigen binding.

ヒト化抗−ＴＡＴ抗体の種々の形態が考えられる。例えば、ヒト化抗体は、１以上の細胞傷害性剤と所望により結合体化して、免疫結合体を作成するＦａｂのようなもう１つの断片であり得る。別法として、ヒト化抗体は、無傷ＩｇＧ１抗体のような無傷抗体であり得る。   Various forms of the humanized anti-TAT antibody are contemplated. For example, a humanized antibody can be another fragment, such as a Fab, optionally conjugated with one or more cytotoxic agents to create an immunoconjugate. Alternatively, the humanized antibody can be an intact antibody, such as an intact IgG1 antibody.

ヒト化に対する代替法として、ヒト抗体を作成することができる。例えば、今や、免疫化に際して、内因性免疫グロブリンの生産の不存在下でヒト抗体の十分なレパートリーを生産することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生産することが可能である。例えば、キメラおよび生殖系突然変異体マウスにおける抗体の重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体の生産が完全に阻害されることが記載されている。ヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイの生殖系突然変異体マウスへの導入の結果、抗原の攻撃に際してヒト抗体が生産される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許５４，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，５９１，６６９（全てＧｅｎＰｈａｒｍのもの）；第５，５４５，８０７号；およびＷＯ ９７／１７８５２参照。 As an alternative to humanization, human antibodies can be generated. For example, it is now possible to produce transgenic animals (eg, mice) that can produce a sufficient repertoire of human antibodies in the absence of endogenous immunoglobulin production upon immunization. For example, it has been described that the homozygous deletion of the antibody heavy chain junction region (J H ) gene in chimeric and germ-line mutant mice results in complete inhibition of endogenous antibody production. Introduction of the human germline immunoglobulin gene array into germline mutant mice results in the production of human antibodies upon antigen challenge. See, for example, Jakobovits et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al. , Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al. Year In Immunol. 7:33 (1993); U.S. Pat. Nos. 54,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (all from GenPharm); 5,545,807; and WO 97/17852. reference.

別法として、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｗｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３［１９９０］）を用いて、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからイン・ビトロにてヒト抗体および抗体断片を生産することができる。この技術に従い、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄのようなフィラメント状バクテリオファージの主たるまたは従たる被膜蛋白質遺伝子いずれかにイン・フレームにてクローン化し、ファージ粒子の表面に機能的抗体断片として表示する。フィラメント状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有する故に、抗体の機能的特性に基づく選択の結果、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子が選択される。かくして、ファージはＢ−細胞の特性をいくらか模倣する。ファージディスプレイは、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５６４−５７１（１９９３）にレビューされた種々の様式で行うことができる。Ｖ−遺伝子セグメントのいくつかの源は、ファージディスプレイのために用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムなコンビナトーリアルライブラリからの抗−オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫化されていないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、（自己−抗原を含めた）抗原の多様なアレイに対する抗体を、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載された技術に実質的に従って単離することができる。また、米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号も参照。   Alternatively, human antibodies can be generated in vitro from an immunoglobulin variable (V) domain gene repertoire from a non-immunized donor using phage display technology (McCoffwerty et al., Nature 348: 552-553 [1990]). And antibody fragments can be produced. In accordance with this technique, antibody V domain genes are cloned in-frame into either the main or secondary coat protein genes of filamentous bacteriophages such as M13 or fd and displayed as functional antibody fragments on the surface of phage particles To do. Since filamentous particles contain a single-stranded DNA copy of the phage genome, selection based on the functional properties of the antibody results in the selection of genes encoding antibodies that exhibit those properties. Thus, the phage mimics some of the characteristics of B-cells. Phage display is described, for example, by Johnson, Kevin S. et al. and Chiswell, David J. et al. , Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Several sources of V-gene segments can be used for phage display. Clackson et al. , Nature, 352: 624-628 (1991) isolated a diverse array of anti-oxazolone antibodies from a small random combinatorial library of V genes derived from the spleens of immunized mice. Repertoires of V genes from non-immunized human donors can be constructed, and antibodies against a diverse array of antigens (including self-antigens) are described in Marks et al. , J .; Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), or Griffith et al. , EMBO J. et al. 12: 725-734 (1993) can be isolated substantially according to the technique described. See also US Pat. Nos. 5,565,332 and 5,573,905.

前記したように、ヒト抗体は、イン・ビトロ活性化Ｂ細胞によって作成することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号）。   As noted above, human antibodies can also be generated by in vitro activated B cells (US Pat. Nos. 5,567,610 and 5,229,275).

４．抗体断片
ある状況では、全抗体よりはむしろ抗体断片を用いる利点がある。断片のより小さなサイズは迅速なクリアランスを可能とし、固体腫瘍への改善されたアクセスに導くことができる。 4). Antibody Fragments In some situations there are advantages of using antibody fragments rather than whole antibodies. The smaller size of the fragments allows for rapid clearance and can lead to improved access to solid tumors.

種々の技術が、抗体断片の生産のために開発されている。伝統的には、これらの断片は無傷抗体の蛋白質分解消化を介して誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）。しかしながら、これらの断片が今や、組換え宿主細胞によって直接的に生産することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片は全てのＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、それから分泌させることができ、かくして、大量のこれらの断片の容易な生産が可能となる。抗体断片が、前記した抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ’−ＳＨ断片はＥ．Ｃｏｌｉから直接的に回収することができ、形態Ｆ（ａｂ’）２に化学的にカップリングさせることができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））。もう１つのアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２断片は組換え宿主細胞培養から直接的に単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む増大したイン・ビボ半減期を持つＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片の生産のための他の技術は当業者に明らかであろう。他の具体例において、選択された抗体は単一鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号参照。ＦｖおよびｓＦｖは定常領域を欠く無傷組合せ部位を持つ唯一の種であり；かくして、それらは、イン・ビボ使用の間の低下した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合蛋白質を構築して、ｓＦｖのアミノまたはカルボキシ末端いずれかにおいてエフェクター蛋白質の融合を得ることができる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｓｕｐｒａ参照。該抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているように「線状抗体」でもあり得る。そのような線状抗体断片は一特異的または二特異的であり得る。 Various techniques have been developed for the production of antibody fragments. Traditionally, these fragments were derived through proteolytic digestion of intact antibodies (see, eg, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); and Brennan et al.,). Science, 229: 81 (1985)). However, these fragments can now be produced directly by recombinant host cells. Fab, Fv and ScFv antibody fragments are all E. coli. can be expressed in and then secreted in E. coli, thus allowing easy production of large quantities of these fragments. Antibody fragments can be isolated from the antibody phage libraries described above. Alternatively, the Fab′-SH fragment is E. coli. It can be recovered directly from Coli and chemically coupled to form F (ab ′) 2 (Carter et al., Bio / Technology 10: 163-167 (1992)). According to another approach, F (ab ′) 2 fragments can be isolated directly from recombinant host cell culture. Fab and F (ab ′) 2 fragments with increased in vivo half-life containing salvage receptor binding epitope residues are described in US Pat. No. 5,869,046. Other techniques for the production of antibody fragments will be apparent to those skilled in the art. In other embodiments, the selected antibody is a single chain Fv fragment (scFv). See WO93 / 16185; US Pat. No. 5,571,894; and US Pat. No. 5,587,458. Fv and sFv are the only species with intact combination sites that lack a constant region; thus, they are suitable for reduced non-specific binding during in vivo use. An sFv fusion protein can be constructed to obtain an effector protein fusion at either the amino or carboxy terminus of the sFv. Antibody Engineering, Ed. See Borrebaeck, supra. The antibody fragment may also be a “linear antibody” as described, for example, in US Pat. No. 5,641,870. Such linear antibody fragments can be monospecific or bispecific.

５．二特異的抗体
二特異的抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープについての結合特異性を有する抗体である。例示的な二特異的抗体は、本明細書中に記載されるように、ＴＡＴ蛋白質の２つの異なるエピトープに結合することができる。他のそのような抗体は、もう一つの蛋白質のための結合部位とＴＡＴ結合部位とを組み合わせることができる。別法として、抗−ＴＡＴアームを、Ｔ−細胞受容体分子（例えば、ＣＤ３）のような白血球上のトリガリング分子に結合するアーム、あるいはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のようなＩｇＧのようなＦｃ受容体（ＦｃγＲ）と組み合わせて、細胞防御メカニズムをＴＡＴ−発現細胞に焦点を合わせ、そこへ局所化することができる。また、二特異的抗体を用いて、ＴＡＴを発現する細胞へ細胞傷害性剤を局所化することもできる。これらの抗体はＴＡＴ−結合アーム、および細胞傷害性剤（例えば、サポリン、抗−インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射性同位体ハプテン）に結合するアームを保有する。二特異的抗体は、全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異的抗体）として調製することができる。 5. Bispecific antibodies Bispecific antibodies are antibodies that have binding specificities for at least two different epitopes. Exemplary bispecific antibodies can bind to two different epitopes of the TAT protein, as described herein. Other such antibodies can combine a binding site for another protein with a TAT binding site. Alternatively, an anti-TAT arm binds to a triggering molecule on leukocytes such as a T-cell receptor molecule (eg, CD3), or FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) and FcγRIII (CD16) In combination with Fc receptors such as IgG (FcγR), the cytoprotective mechanism can be focused and localized to TAT-expressing cells. Bispecific antibodies can also be used to localize cytotoxic agents to cells that express TAT. These antibodies possess a TAT-binding arm and an arm that binds to a cytotoxic agent (eg, saporin, anti-interferon-α, vinca alkaloid, ricin A chain, methotrexate or radioisotope hapten). Bispecific antibodies can be prepared as full length antibodies or antibody fragments (eg F (ab ′) 2 bispecific antibodies).

ＷＯ ９６／１６６７３は二特異的抗−ＥｒｂＢ２／抗−ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載し、米国特許第５，８７３，２３４号は二特異的抗−ＥｒｂＢ２／抗−ＦｃγＲＩ抗体を開示する。二特異的抗−ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体はＷＯ９８／０２４６３に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は二特異的抗−ＥｒｂＢ２／抗−ＣＤ３抗体を教示する。   WO 96/16673 describes a bispecific anti-ErbB2 / anti-FcγRIII antibody, and US Pat. No. 5,873,234 discloses a bispecific anti-ErbB2 / anti-FcγRI antibody. Bispecific anti-ErbB2 / Fcα antibodies are shown in WO 98/02463. US Pat. No. 5,821,337 teaches a bispecific anti-ErbB2 / anti-CD3 antibody.

二特異的抗体を作成する方法は当該分野で知られている。全長二特異的抗体の伝統的な生産は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、そこでは２つの鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな分類のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）、そのうち１つのみが正しい二特異的構造を有する、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産する。通常は、アフィニティークロマトグラフィー工程によってなされる正しい分子の精製はむしろ煩雑であり、生成物の収率は低い。同様な手法は、ＷＯ ９３／０８８２９において、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。   Methods for making bispecific antibodies are known in the art. Traditional production of full-length bispecific antibodies is based on the co-expression of two immunoglobulin heavy chain-light chain pairs, where the two chains have different specificities (Millstein et al., Nature 305: 537-). 539 (1983)). Because of the random classification of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas), only one of which produces a potential mixture of 10 different antibody molecules with the correct bispecific structure. Usually, purification of the correct molecule made by an affinity chromatography step is rather cumbersome and the product yield is low. A similar approach is described in WO 93/08829 and in Traunecker et al. , EMBO J. et al. 10: 3655-3659 (1991).

異なるアプローチによると、所望の結合特異性を持つ抗体可変ドメイン（抗体―抗原組み合わせ部位）を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合させる。好ましくは、融合は、ヒンジの少なくとも一部ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインとである。融合の少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有するのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合および、所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞に共−トランスフェクトする。これは、構築で用いる３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二特異的抗体の最適な収率を供する場合の具体例において、３つのポリペプチド断片の相互の割合を調整するにおいてより大きな柔軟性を提供する。しかしながら、等しい比率の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現の結果高い収率がもたらされる場合、あるいは該比率が所望の鎖組合せの収率に対して有利な効果を有しない場合、２つのまたは全ての３つのポリペプチド鎖についてのコーディング配列を単一の発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチの好ましい具体例において、二特異的抗体は、１つのアームにおける第一の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他のアームにおける（第二の結合特異性を供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対から構成される。この非対称構造は、望まない免疫グロブリン鎖組合せからの所望の二特異的化合物の分離を容易とすることが判明した。というのは、二特異的分子の１つの半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在は、分離の容易な方法を供するからである。このアプローチはＷＯ ９４／０４６９０に開示されている。二特異的抗体を作成する更なる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０（１９８６）参照。 According to a different approach, antibody variable domains with the desired binding specificities (antibody-antigen combining sites) are fused to immunoglobulin constant domain sequences. Preferably, the fusion is with an Ig heavy chain constant domain comprising at least part of the hinge C H 2 and C H 3 regions. It is preferred to have a first heavy chain constant region (C H 1) containing the site necessary for light chain binding, present in at least one of the fusions. The immunoglobulin heavy chain fusion and, if desired, the DNA encoding the immunoglobulin light chain are inserted into separate expression vectors and co-transfected into a suitable host cell. This is greater in adjusting the mutual proportions of the three polypeptide fragments in the embodiment where the unequal ratio of the three polypeptide chains used in the construction provides the optimal yield of the desired bispecific antibody. Provide flexibility. However, if the expression of an equal ratio of at least two polypeptide chains results in a high yield, or if the ratio has no beneficial effect on the yield of the desired chain combination, two or all It is possible to insert the coding sequences for the three polypeptide chains into a single expression vector.
In a preferred embodiment of this approach, the bispecific antibody is a hybrid immunoglobulin heavy chain with a first binding specificity in one arm and a hybrid immunoglobulin (providing a second binding specificity) in the other arm. Consists of heavy-light chain pairs. This asymmetric structure has been found to facilitate separation of the desired bispecific compound from unwanted immunoglobulin chain combinations. This is because the presence of an immunoglobulin light chain in only one half of the bispecific molecule provides an easy method of separation. This approach is disclosed in WO 94/04690. For further details of generating bispecific antibodies see, for example, Suresh et al. , Methods in Enzymology 121: 210 (1986).

米国特許第５，７３１，１６８号に記載されたもう１つのアプローチによると、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大とするように作成することができる。好ましい界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法においては、第一の抗体分子の界面からの１以上の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換える。大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、大きな側鎖に対する同一または同様なサイズの補償「キャビティー」を第二の抗体分子の界面に作り出す。これは、ホモダイマーのような他の望まない最終生成物よりもヘテロダイマーの収率を増加させるメカニズムを提供する。 According to another approach described in US Pat. No. 5,731,168, the interface between pairs of antibody molecules is created to maximize the percentage of heterodimers recovered from recombinant cell culture. be able to. Preferred interfaces include at least a portion of the C H 3 domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (eg tyrosine or tryptophan). Replacing a large amino acid side chain with a smaller side chain (eg, alanine or threonine) creates a compensatory “cavity” of the same or similar size for the large side chain at the interface of the second antibody molecule. This provides a mechanism to increase the yield of heterodimers over other unwanted end products such as homodimers.

二特異的抗体は架橋したまたは「ヘテロ結合体」抗体を含む。例えば、ヘテロ結合体における抗体の１つをアビジンにカップリングさせることができ、他方、ビオチンにカップリングさせることができる。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を望まない細胞に標的化させるように（米国特許第４，６７６，９８０号）およびＨＩＶ感染の治療のために（ＷＯ ９１／００３６０、ＷＯ ９２／２００３７３、およびＥＰ ０３０８９）提案されている。ヘテロ結合体抗体は、いずれかの便宜な架橋方法を用いて作成することができる。適当な架橋剤は当該分野で良く知られており、多数の架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。   Bispecific antibodies include cross-linked or “heteroconjugate” antibodies. For example, one of the antibodies in the heteroconjugate can be coupled to avidin while it can be coupled to biotin. Such antibodies are used, for example, to target immune system cells to unwanted cells (US Pat. No. 4,676,980) and for the treatment of HIV infection (WO 91/00360, WO 92/200373). , And EP 03089). Heteroconjugate antibodies can be made using any convenient crosslinking method. Suitable crosslinking agents are well known in the art and are disclosed in US Pat. No. 4,676,980, along with a number of crosslinking techniques.

二特異的抗体を抗体断片から作成するための技術もまた文献に記載されている。例えば、二特異的抗体は科学的結合を用いて調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）は無傷抗体を蛋白質分解により切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を生じさせる手法を記載する。これらの断片はジチオール複合体化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で低下して隣接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を妨げる。次いで、生じたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをメルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再度変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二特異的抗体を形成する。生じた二特異的抗体を、酵素の選択的固定化用の剤として用いることができる。 Techniques for making bispecific antibodies from antibody fragments have also been described in the literature. For example, bispecific antibodies can be prepared using scientific linkage. Brennan et al. , Science 229: 81 (1985) describe a technique in which intact antibodies are cleaved by proteolysis to produce F (ab ′) 2 fragments. These fragments are lowered in the presence of the dithiol complexing agent sodium arsenite to stabilize vicinal dithiols and prevent intermolecular disulfide formation. The resulting Fab ′ fragment is then converted to a thionitrobenzoate (TNB) derivative. One of the Fab′-TNB derivatives is then converted back to Fab′-thiol by reduction with mercaptoethylamine and mixed with an equimolar amount of another Fab′-TNB derivative to form a bispecific antibody. The resulting bispecific antibody can be used as an agent for selective immobilization of enzymes.

最近のプログラムは、化学的にカップリングさせて二特異的抗体を形成することができる。Ｅ．ｃｏｌｉからのＦａｂ’−ＳＨ断片の直接的な回収を容易とした。Ｓａｌｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、十分にヒト化された二特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生産を記載する。各Ｆａｂ’断片を別々にＥ．Ｃｏｌｉから分泌させ、イン・ビトロでの指令された化学的カップリングに付して、二特異的抗体を形成した。かく形成された二特異的抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞、および正常なヒトＴ細胞に結合することができならびにヒト乳癌標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性をトリガーすることができる。 Recent programs can be chemically coupled to form bispecific antibodies. E. Direct recovery of the Fab′-SH fragment from E. coli was facilitated. Saleby et al. , J .; Exp. Med. 175: 217-225 (1992) describes the production of fully humanized bispecific antibody F (ab ′) 2 molecules. Each Fab ′ fragment was separately E. coli. Secreted from Coli and subjected to directed chemical coupling in vitro to form bispecific antibodies. The bispecific antibody thus formed can bind to cells that overexpress the ErbB2 receptor, and normal human T cells, and can trigger lytic activity of human cytotoxic lymphocytes against human breast cancer targets. it can.

組換え細胞培養から直接的に二特異的抗体断片を作成し、それを単離するための種々の技術も記載されている。例えば、二特異的抗体はロイシンジッパーを用いて生産されてきた。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎ蛋白質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合によって２つの異なる抗体Ｆａｂ’部分に連結した。抗体ホモダイマーをヒンジ領域において還元して、モノマーを形成し、次いで、再度酸化して、抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法は、抗体ホモダイマーの生産で利用することもできる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって記載された「ダイアボディー」技術は、二特異的抗体断片を作成するための代替メカニズムを提供している。該断片は、同一鎖上の２つのドメインの間での対合を可能とするには余りにも短いリンカーによってＶＬに連結されたＶＨを含む。従って、１つの断片のＶＨおよびＶＬドメインはもう１つの断片の相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対合させられ、それにより、２つの抗原−結合部位を形成する。単一−鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二特異的抗体断片を作成するためのもう１つの戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）参照。 Various techniques for making and isolating bispecific antibody fragments directly from recombinant cell culture have also been described. For example, bispecific antibodies have been produced using leucine zippers. Koselny et al. , J .; Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992). Leucine zipper peptides from Fos and Jun proteins were linked to two different antibody Fab ′ portions by gene fusion. Antibody homodimers were reduced at the hinge region to form monomers and then re-oxidized to form antibody heterodimers. This method can also be used in the production of antibody homodimers. Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. The “diabody” technique described by USA 90: 6444-6448 (1993) provides an alternative mechanism for making bispecific antibody fragments. The fragment contains VH linked to VL by a linker that is too short to allow pairing between two domains on the same strand. Therefore, V H and V L domains of one fragment are brought into complementary V L and V H domains paired with another fragment, thereby, two antigen - forming the binding site. Another strategy for making bispecific antibody fragments by the use of single-chain Fv (sFv) dimers has also been reported. Gruber et al. , J .; Immunol. 152: 5368 (1994).

２を超える価数を持つ抗体が考えられる。例えば、三特異的抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。   Antibodies with a valence greater than 2 are contemplated. For example, trispecific antibodies can be prepared. Tutt et al. , J .; Immunol. 147: 60 (1991).

６．ヘテロ結合体抗体
ヘテロ結合体抗体もまた本発明の範囲内にある。ヘテロ結合体抗体は２つの共有結合により連結された抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、望まない細胞に対して免疫系細胞を標的化するために［米国特許第４，６７６，９８０号］、およびＨＩＶ感染の治療のために［ＷＯ ９１／０３３６０；ＷＯ ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９］提案されている。該抗体は架橋剤に関連するものを含めた合成蛋白質化学における公知の方法を用いてイン・ビトロで調製することができると考えられる。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的で適した試薬の例は、イムノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートおよび、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されたものを含む。 6). Heteroconjugate antibodies Heteroconjugate antibodies are also within the scope of the present invention. Heteroconjugate antibodies are composed of two covalently linked antibodies. Such antibodies can be used, for example, to target immune system cells to unwanted cells [US Pat. No. 4,676,980] and for the treatment of HIV infection [WO 91/03360; WO 92/23033; EP03089]. It is believed that the antibody can be prepared in vitro using known methods in synthetic protein chemistry, including those related to cross-linking agents. For example, immunotoxins can be constructed using a disulfide exchange reaction or by forming a thioether bond. Examples of suitable reagents for this purpose include immunothiolates and methyl-4-mercaptobutyrimidate and those disclosed, for example, in US Pat. No. 4,676,980.

７．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって二価抗体よりも速く内部化（および／または異化）され得る。本発明の抗体は３以上の抗原結合部位（例えば、四価抗体）を持つ（ＩｇＭクラスのもの以外である）多価抗体とすることができ、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に生産することができる。多価抗体は、二量体化ドメインおよび３以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい二量体化ドメインはＦｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはそれよりなる）。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域、該Ｆｃ領域に対してアミノ末端側の３以上の抗原結合部位を含むであろう。好ましい多価抗体は、ここでは、３ないし約８、好ましくは４つの抗原結合部位を含む（またはそれよりなる）。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは、２つのポリペプチド鎖）を含み、そこでは、ポリペプチド鎖は２以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含むことができ、ここに、ＶＤ１は第一の可変ドメインであり、ＶＤ２は第二の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを表し、およびｎは０または１である。例えば、ポリペプチド鎖は：ＶＨ−ＣＨ１−フレキシブルリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含むことができる。本明細書中において、多価抗体は、好ましくは、さらに少なくとも２つの（好ましくは４つの）軽鎖可変ドメインポリペプチドを含む。多価抗体は、本明細書中においては、例えば、約２ないし約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含むことができる。ここに考えられる軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインおよび、所望により、さらに、ＣＬドメインを含む。 7). Multivalent antibodies Multivalent antibodies can be internalized (and / or catabolized) faster than bivalent antibodies by cells expressing the antigen to which the antibody binds. The antibody of the present invention can be a multivalent antibody (other than the IgM class) having three or more antigen-binding sites (for example, a tetravalent antibody), which is a nucleic acid encoding a polypeptide chain of the antibody Can be easily produced by recombinant expression of. A multivalent antibody can comprise a dimerization domain and three or more antigen binding sites. Preferred dimerization domains comprise (or consist of) an Fc region or a hinge region. In this scenario, the antibody will comprise an Fc region, three or more antigen binding sites amino terminal to the Fc region. Preferred multivalent antibodies here comprise (or consist of) 3 to about 8, preferably 4 antigen binding sites. A multivalent antibody comprises at least one polypeptide chain (preferably two polypeptide chains), where the polypeptide chain comprises two or more variable domains. For example, the polypeptide chain can comprise VD1- (X1) n -VD2- (X2) n -Fc, where VD1 is the first variable domain and VD2 is the second variable domain; Fc is one polypeptide chain of the Fc region, X1 and X2 represent amino acids or polypeptides, and n is 0 or 1. For example, the polypeptide chain can comprise: VH-CH1-flexible linker-VH-CH1-Fc region chain; or VH-CH1-VH-CH1-Fc region chain. Herein, the multivalent antibody preferably further comprises at least two (preferably four) light chain variable domain polypeptides. A multivalent antibody can include, for example, about 2 to about 8 light chain variable domain polypeptides herein. The light chain variable domain polypeptides contemplated here comprise a light chain variable domain and optionally further a CL domain.

８．エフェクター機能エンジニアリング
エフェクター機能に関しては、本発明の抗体を修飾して、例えば、抗体の抗原−依存性細胞−媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を高めるのが望ましいであろう。これは、１以上のアミノ酸置換を抗体のＦｃ領域に導入することによって達成することができる。別法として、または加えて、システイン残基をＦｃ領域に導入することができ、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能とすることができる。かく生じたホモダイマー抗体は、改良された内部化能力および／または増大した補体−媒介細胞殺傷および抗体−依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有することができる。Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）参照。また、増強された抗−腫瘍活性を持つホモダイマー抗体をＷｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されたようにヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することもできる。別法として、デュアルＦｃ領域を有し、それにより、増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる抗体を作り出すことができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９−２３０ （１９８９）参照。抗体の血清半減期を増加させるためには、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されたように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に、抗体断片）に一体化させることができる。本明細書中で用いるように、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」とは、ＩｇＧ分子のイン・ビボ血清半減期を増加させることを担うＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを言う。 8). Effector Function Engineering With respect to effector function, the antibodies of the present invention may be modified to enhance, for example, antibody antigen-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and / or complement dependent cytotoxicity (CDC). Would be desirable. This can be achieved by introducing one or more amino acid substitutions into the Fc region of the antibody. Alternatively or additionally, cysteine residues can be introduced into the Fc region, thereby allowing the formation of interchain disulfide bonds in this region. The resulting homodimeric antibody can have improved internalization ability and / or increased complement-mediated cell killing and antibody-dependent cytotoxicity (ADCC). Caron et al. , J .; Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, B .; J. et al. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). In addition, homodimeric antibodies with enhanced anti-tumor activity have been described by Wolff et al. , Cancer Research 53: 2560-2565 (1993), can also be used with heterobifunctional crosslinkers. Alternatively, antibodies can be created that have dual Fc regions, which can have enhanced complement lysis and ADCC capabilities. Stevenson et al. , Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989). To increase the serum half-life of the antibody, one can incorporate a salvage receptor binding epitope into the antibody (especially an antibody fragment) as described in US Pat. No. 5,739,277, for example. . As used herein, the term “salvage receptor binding epitope” refers to an IgG molecule that is responsible for increasing the in vivo serum half-life of an IgG molecule (eg, IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 , or It refers to an epitope of the Fc region of IgG 4).

９．免疫結合体
また、本発明は、化学治療剤、成長阻害剤、トキシン（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性なトキシン、またはその断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性結合体）のような細胞傷害性剤に結合体化した抗体を含む免疫結合体にも関する。 9. Immunoconjugates The invention also includes chemotherapeutic agents, growth inhibitors, toxins (eg, enzymatically active toxins of bacterial, fungal, plant or animal origin, or fragments thereof), or radioisotopes (ie, radioactive It also relates to an immunoconjugate comprising an antibody conjugated to a cytotoxic agent such as a conjugate.

そのような免疫結合体の作成に有用な化学治療剤は前記した用いることができる酵素的に活性なトキシンおよびその断片はジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非−結合性活性断片、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）エンドトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ蛋白質、ジアンチン蛋白質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを含む。種々の放射性核種が放射性結合体化された抗体の生産で利用することができる。その例は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを含む。抗体および細胞傷害性剤の結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、（ジメチルアジピミデートＨＣＬのような）イミドエステルの二官能性誘導体、（ジスクシンイミジルスベレートのような）活性エステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）ビス−アジド化合物、（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンのような）ビス−ジアゾニウム誘導体、（トリレン２，６−ジイソシアネートのような）ジイソシアネート、および（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）ビス−活性フッ素化合物のような種々の二官能性蛋白質−カップリング剤を用いて作成される。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されたように調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンゾイル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。ＷＯ ９４／１１０２６参照。 Chemotherapeutic agents useful for the preparation of such immunoconjugates can be used as described above enzymatically active toxins and fragments thereof are diphtheria A chain, non-binding active fragments of diphtheria toxin, (from Pseudomonas aeruginosa) ) Endotoxin A chain, ricin A chain, abrin A chain, modesin A chain, alpha-sarcin, Aleurites fordiii protein, diantine protein, Physolaca americana protein (PAPI, PAPII, and PAP-S), nigauri inhibitor, crucine, clotine, Includes Saponaaria officinalis inhibitors, gelonin, mitogenin, restrictocin, phenomycin, enomycin and trichothecene. A variety of radionuclides can be utilized in the production of radioconjugated antibodies. Examples include 212 Bi, 131 I, 131 In, 90 Y and 186 Re. The conjugate of the antibody and cytotoxic agent is a bifunctional N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP), iminothiolane (IT), imidoester (such as dimethyl adipimidate HCL). Derivatives, active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bis-azide compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine), (bis- (p- Of bis-diazonium derivatives (such as diazonium benzoyl) ethylenediamine), diisocyanates (such as tolylene 2,6-diisocyanate), and bis-active fluorine compounds (such as 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene) Various bifunctional protein-coupling agents such as It is created Te. For example, ricin immunotoxin can be obtained from Vitetta et al. , Science, 238: 1098 (1987). Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzoyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an exemplary chelating agent for conjugation of radionucleotides to antibodies. See WO 94/11026.

抗体、およびカリケアミシン、メイタンシノイド、トリコテン、およびＣＣ１０６５のような１以上の小分子トキシン、およびトキシン活性を有するこれらのトキシンの誘導体の結合体もまたここでは考えられる。
メイタンシンおよびメイタンシノイド
１つの好ましい具体例において、本発明の抗−ＴＡＴ抗体（全長または断片）は、１以上のメイタンシノイド分子に結合体化される。 Conjugates of antibodies and one or more small molecule toxins such as calicheamicin, maytansinoids, trichoten, and CC1065, and derivatives of these toxins having toxin activity are also contemplated herein.
Maytansine and maytansinoids In one preferred embodiment, an anti-TAT antibody (full length or fragment) of the invention is conjugated to one or more maytansinoid molecules.

メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。引き続いて、ある種の微生物もまた、メイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルのようなメイタンシノイドを生産することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノールおよびその誘導体およびアナログは、例えば、その開示をここに引用して明示的に援用する（米国特許第４，１３７，２３０号；第４，２４８，８７０号；第４，２５６，７４６号；第４，２６０，６０８号；第４，２６５，８１４号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２８号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３１７，８２１号；第４，３２２，３４８号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６４，８６６号；第４，４２４，２１９号；第４，４５０，２５４号；第４，３６２，６６３号；および第４，３７１，５３３号）に開示されている。
メイタンシノイド−抗体結合体
それらの治療指標を改良する試みにおいてメイタンシンおよびメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体に結合体化されてきた。メイタンシノイドを含有する免疫結合体、およびそれらの治療的使用は、その開示をここに引用して明示的に援用する、米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号および欧州特許ＥＰ ０ ４２５ ２３５ Ｂ１に開示されている。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３（１９９６）は、ヒト結直腸癌に対して向けられたモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結されたＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含む免疫結合体を記載した。該結合体は、培養された結腸癌細胞に対して高度に細胞傷害性であることが判明し、イン・ビボ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Ｃｈｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）は、ジスルフィドリンカーを介してメイタンシノイドが、ヒト結腸癌細胞系上の抗原に結合するネズミ抗体Ａ７、あるいはＨＥＲ−２／ｎｅｕオンコジーンに結合するもう１つのネズミモノクローナル抗体ＴＡ．１に結合体化した免疫結合体を記載する。ＴＡ．１−メイタンシノイド結合体の細胞傷害性は、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞系ＳＫ−ＢＲ−３でイン・ビトロでテストした。薬物結合体は、遊離メイタンシノイド薬物と同様な程度の細胞傷害性を達成し、これは、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることによって増加させることができた。Ａ７−メイタンシノイド結合体は、マウスにおいて低い全身細胞傷害性を示した。
抗−ＴＡＴポリペプチド抗体−メイタンシノイド結合体（免疫結合体）
抗−ＴＡＴ抗体−メイタンシノイド結合体は、抗体またはメイタンシノイド分子いずれかの生物学的活性を有意に減少させることなく、抗−ＴＡＴ抗体をメイタンシノイド分子に化学的に連結することによって調製される。抗体分子当たりの結合体化された３−４メイタンシノイド分子の平均は、トキシン−抗体の１つの分子でさえ、裸の抗体の使用よりも細胞傷害性を高めると予測されるであろうが、抗体の機能または溶解性に負に影響することなく、標的細胞の細胞傷害性を高めるにおいて効果を示した。メイタンシノイドは当該分野で良く知られており、公知の技術によって合成することができるか、あるいは天然源から単離することができる。適当なメイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号において、および先に言及した他の特許および非−特許刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノールおよび種々のメイタンシノールエステルのような、芳香族環において、またはメイタンシノール分子の他の位置において修飾されたメイタンシノールアナログである。 Maytansinoids are mitotic inhibitors that act by inhibiting tubulin polymerization. Maytansine was first isolated from the East African shrub Maytenus serrata (US Pat. No. 3,896,111). Subsequently, certain microorganisms were also found to produce maytansinoids such as maytansinol and C-3 maytansinol esters (US Pat. No. 4,151,042). Synthetic maytansinol and its derivatives and analogs are, for example, expressly incorporated herein by reference (US Pat. Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256, No. 746; No. 4,260,608; No. 4,265,814; No. 4,294,757; No. 4,307,016; No. 4,308,268; No. 4,308,269 No. 4,309,428; No. 4,313,946; No. 4,315,929; No. 4,317,821; No. 4,322,348; No. 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; and 4,371,533) Has been.
Maytansinoid-antibody conjugates In an attempt to improve their therapeutic index, maytansin and maytansinoids have been conjugated to antibodies that specifically bind to tumor cell antigens. Immunoconjugates containing maytansinoids and their therapeutic uses are described in US Pat. Nos. 5,208,020, 5,416,064 and the disclosures of which are expressly incorporated herein by reference. It is disclosed in European Patent EP 0 425 235 B1. Liu et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996) described an immunoconjugate comprising a maytansinoid designated DM1 linked to a monoclonal antibody C242 directed against human colorectal cancer. The conjugate was found to be highly cytotoxic to cultured colon cancer cells and showed anti-tumor activity in an in vivo tumor growth assay. Chrai et al. , Cancer Research 52: 127-131 (1992), maytansinoids bind to antigens on human colon cancer cell lines via disulfide linkers, or another one that binds to the HER-2 / neu oncogene. Two murine monoclonal antibodies TA. The immunoconjugate conjugated to 1 is described. TA. The cytotoxicity of 1-maytansinoid conjugates was tested in vitro on the human breast cancer cell line SK-BR-3 expressing 3 × 10 5 HER-2 surface antigen per cell. The drug conjugate achieved a similar degree of cytotoxicity as the free maytansinoid drug, which could be increased by increasing the number of maytansinoid molecules per antibody molecule. The A7-maytansinoid conjugate showed low systemic cytotoxicity in mice.
Anti-TAT polypeptide antibody-maytansinoid conjugate (immunoconjugate)
An anti-TAT antibody-maytansinoid conjugate is obtained by chemically linking an anti-TAT antibody to a maytansinoid molecule without significantly reducing the biological activity of either the antibody or the maytansinoid molecule. Prepared. The average of conjugated 3-4 maytansinoid molecules per antibody molecule would be expected to be more cytotoxic than the use of a naked antibody, even with one toxin-antibody molecule. It showed an effect in increasing the cytotoxicity of the target cells without negatively affecting the function or solubility of the antibody. Maytansinoids are well known in the art and can be synthesized by known techniques or isolated from natural sources. Suitable maytansinoids are disclosed, for example, in US Pat. No. 5,208,020 and in other patents and non-patent publications referred to above. Preferred maytansinoids are maytansinol analogs modified at the aromatic ring or at other positions of the maytansinol molecule, such as maytansinol and various maytansinol esters.

例えば、米国特許第５，２０８，０２０号またはＥＰ特許０ ４２５ ２３５ Ｂ１、およびＣｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示されたものを含めた、抗体−メイタンシノイド結合体を作成するための当該分野で知られた多くの連結基がある。連結基は、前記した特許に開示されたようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基、またはエステラーゼ不安定性基を含み、ジスルフィドおよびチオエーテル基が好ましい。   See, for example, US Pat. No. 5,208,020 or EP Patent 0 425 235 B1, and Chari et al. There are many linking groups known in the art for making antibody-maytansinoid conjugates, including those disclosed in, Cancer Research 52: 127-131 (1992). The linking group includes a disulfide group, a thioether group, an acid labile group, a photolabile group, a peptidase labile group, or an esterase labile group as disclosed in the aforementioned patents, with disulfide and thioether groups being preferred.

抗体およびメイタンシノイドの結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、（ジメチルアジピミデートＨＣＬのような）イミドエステルの二官能性誘導体、（ジスクシンイミジルスベレートのような）活性エステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）ビス−アジド化合物、（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのような）ビス−ジアゾニウム誘導体、（トルエン２，６−ジイソシアネートのような）ジイソシアネート、（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）ビス−活性フッ素化合物のような種々の二官能性蛋白質カップリング剤を用いて作成することができる。特に好ましいカップリング剤は、ジスルフィド結合を提供するためのＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７［１９７８］）、およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）を含む。   Antibodies and maytansinoid conjugates include N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, iminothiolane (IT), ( Bifunctional derivatives of imide esters (such as dimethyl adipimidate HCL), active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), (bis (p-azidobenzoyl) hexanes Bis-azide compounds (such as diamines), bis-diazonium derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine), diisocyanates (such as toluene 2,6-diisocyanate), (1,5-difluoro- 2,4-dinitrobenzene Such) bis - can be made using a variety of bifunctional protein coupling agents such as active fluorine compounds. A particularly preferred coupling agent is N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173: 723-737 [1978]) to provide a disulfide bond. And N-succinimidyl-4- (2-pyridylthio) pentanoate (SPP).

リンカーは、リンクのタイプに応じて、種々の位置においてメイタンシノイド分子に結語させることができる。例えば、エステル結合は、慣用的なカップリング技術を用い、ヒドロキシル基との反応によって形成することができる。反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位置、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位置、およびヒドロキシル基を有するＣ−２０位置で起こり得る。好ましい具体例において、結合は、メイタンシノールまたはメイタンシノールアナログのＣ−３位置において形成される。
カリケアミシン
注目するもう１つの免疫結合体は、１以上のカリケアミシン分子に結合体化した抗−ＴＡＴ抗体を含む。抗体のカリケアミシンファミリーは、ピコモラー下濃度において二本鎖ＤＮＡ破壊を生じさせることができる。カリケアミシンファミリーの結合体の調製については、（全て、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙに対する）米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、第５，８７７，２９６号参照。用いることができるカリケアミシンの構造的アナログは、限定されるものではないが、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１ Ｉ、ＰＳＡＧおよびθＩ １を含む（Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：２９２５−２９２８（１９９８）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄに対する前記した米国特許）を含む。抗体が結合体化することができるもう１つの抗−腫瘍薬物は、抗−葉酸であるＱＦＡである。カリケアミシンおよびＱＦＡは共に細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易に横切らない。従って、抗体媒介内部化を通ってのこれらの剤の細胞摂取はそれらの細胞傷害性効果を大いに増強させる。
他の細胞傷害性剤
本発明の抗−ＴＡＴ抗体に結合体化させることができる他の抗腫瘍剤はＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、第５，７７０，７１０号に記載された集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として知られた剤のファミリー、ならびにエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）を含む。 Linkers can be linked to maytansinoid molecules at various positions depending on the type of link. For example, ester bonds can be formed by reaction with hydroxyl groups using conventional coupling techniques. The reaction can occur at the C-3 position having a hydroxyl group, the C-14 position modified with hydroxymethyl, the C-15 position modified with a hydroxyl group, and the C-20 position having a hydroxyl group. In preferred embodiments, the bond is formed at the C-3 position of maytansinol or a maytansinol analog.
Calicheamicin Another immunoconjugate of interest includes an anti-TAT antibody conjugated to one or more calicheamicin molecules. The calicheamicin family of antibodies can cause double-stranded DNA breaks at sub-picomolar concentrations. For the preparation of conjugates of the calicheamicin family, see US Pat. Nos. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767 (all to the American Cyanamid Company). No. 5,285, No. 5,770,701, No. 5,770,710, No. 5,773,001, No. 5,877,296. Structural analogs of calicheamicin that can be used include, but are not limited to, γ 1 I , α 2 I , α 3 I , N-acetyl-γ 1 I , PSAG, and θ I 1 (Hinman et al , Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Rode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) and the aforementioned US patent to American Cyanamid). Another anti-tumor drug that the antibody can conjugate is QFA, which is anti-folic acid. Both calicheamicin and QFA have an intracellular site of action and do not easily cross the plasma membrane. Thus, cellular uptake of these agents through antibody-mediated internalization greatly enhances their cytotoxic effects.
Other cytotoxic agents Other anti-tumor agents that can be conjugated to the anti-TAT antibodies of the present invention are BCNU, streptozocin, vincristine and 5-fluorouracil, US Pat. No. 5,053,394, The family of agents collectively known as LL-E33288 complexes described in US Pat. No. 5,770,710, as well as esperamicins (US Pat. No. 5,877,296).

用いることができる酵素的に活性なトキシンおよびその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非−結合活性断片、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ蛋白質、ジアンチン蛋白質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを含む。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ ９３／２１２３２参照。   Enzymatically active toxins and fragments thereof that can be used include diphtheria A chain, non-binding active fragment of diphtheria toxin, exotoxin A chain, ricin A chain, abrin A chain, modesin A chain (from Pseudomonas aeruginosa) , Alpha-sarcin, Aleurites fordiii protein, diantine protein, Phytolaca americana protein (PAPI, PAPII, and PAP-S), bitter gourd inhibitor, crucin, crotin, sapaonaria officinalis, sapaonaria officinalis, inhibitor of saponiaria officinalis Includes strictin, phenomycin, enomycin and trichothecene. See, for example, WO 93/21232 published on October 28, 1993.

本発明では、さらに、抗体、およびヌクレオ溶解性活性を持つ化合物（例えば、リボヌクレアーゼ、またはデオキシリボヌクレアーゼのようなＤＮＡエンドヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）との間で形成された免疫結合体が考えられる。   The present invention further contemplates immunoconjugates formed between an antibody and a compound having nucleolytic activity (eg, a DNA endonuclease such as ribonuclease or deoxyribonuclease; DNase).

腫瘍の選択的破壊のためには、抗体は高度に放射性の原子を含むことができる。放射性結合体化抗−ＴＡＴ抗体の生産のためには、種々の放射性同位体が入手できる。その例はＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体を含む。結合体を診断で用いる場合、それは、シンチグラフィー実験用の放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、または再度ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、ヨウ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄のような、（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られた）核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング用のスピン標識を含むことができる。 For selective destruction of the tumor, the antibody can contain highly radioactive atoms. Various radioactive isotopes are available for the production of radioconjugated anti-TAT antibodies. Examples include radioactive isotopes of At 211 , I 131 , I 125 , Y 90 , Re 186 , Re 188 , Sm 153 , Bi 212 , P 32 , Pb 212 , and Lu. When the conjugate is used in diagnostics, it may be a radioactive atom for scintigraphic experiments, eg tc 99m or I 123 , or again iodine-123, iodine-131, indium-111, iodine-19, carbon-13, nitrogen- 15, spin labels for nuclear magnetic resonance (NMR) imaging (also known as magnetic resonance imaging, mri), such as oxygen-17, gadolinium, manganese or iron.

放射性または他の標識は公知の方法で結合体に取り込むことができる。例えば、ペプチドは生合成することができるか、あるいは、例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む適当なアミノ酸前駆体を用いて化学的アミノ酸合成によって合成することができる。ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１のような標識を、ペプチド中のシステイン残基を介して結合させることができる。イッテリウム−９０はリシン残基を介して結合させることができる。ＩＯＤＯＧＥＮ方法（Ｆｒａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７８） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）を用いて、ヨウ素１２３を取り込むことができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）は他の方法を詳細に記載する。
抗体および細胞傷害性剤の結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、（ジメチルアジピミデートＨＣＬのような）イミドエステルの二官能性誘導体、（ジスクシンイミジルスベレートのような）活性エステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）ビス−アジド化合物、（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのような）ビス−ジアゾニウム誘導体、（トリレン２，６−ジイソシアネートのような）ジアソシアネートおよび（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）ビス−活性フッ素化合物のような種々の二官能性蛋白質カップリング剤を用いて作成することができる。例えば、リシンイムノトキシンはＶｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンゾイル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーション用の例示的なキレート剤である。ＷＯ ９４／１１０２０参照。リンカーは、細胞中で細胞傷害性薬物の放出を容易とする「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸−不安定性リンカー、ペプチダーゼ−感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を用いることができる。 Radioactive or other labels can be incorporated into the conjugate by known methods. For example, the peptides can be biosynthesized or can be synthesized by chemical amino acid synthesis, for example using a suitable amino acid precursor containing fluorine-19 instead of hydrogen. Labels such as tc 99m or I 123 , Re 186 , Re 188 and In 111 can be attached via cysteine residues in the peptide. Yttelium-90 can be attached via a lysine residue. The IODOGEN method (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) can be used to incorporate iodine 123. “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy” (Chatal CRC Press 1989) describes other methods in detail.
Conjugates of antibody and cytotoxic agent include N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, iminothiolane (IT), Bifunctional derivatives of imide esters (such as dimethyl adipimidate HCL), active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), (bis (p-azidobenzoyl) Bis-azide compounds (such as hexanediamine), bis-diazonium derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine), diisocyanates (such as tolylene 2,6-diisocyanate) and (1,5 -Difluoro-2,4-dinitrobenzene Such) bis - can be made using a variety of bifunctional protein coupling agents such as active fluorine compounds. For example, ricin immunotoxin can be obtained from Vitetta et al. , Science 238: 1098 (1987). Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzoyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an exemplary chelating agent for conjugation of radionucleotides to antibodies. See WO 94/11020. The linker can be a “cleavable linker” that facilitates release of the cytotoxic drug in the cell. For example, acid-labile linkers, peptidase-sensitive linkers, photolabile linkers, dimethyl linkers or disulfide-containing linkers (Charai et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992); US Pat. No. 5,208,020 ) Can be used.

別法として、抗−ＴＡＴ抗体および細胞傷害性剤を含む融合蛋白質は、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作成することができる。ＤＮＡの長さは、もう１つのものに隣接するか、あるいは結合体の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離された結合体の２つの部分をコードする各領域を含むことができる。   Alternatively, a fusion protein comprising an anti-TAT antibody and a cytotoxic agent can be made, for example, by recombinant techniques or peptide synthesis. The length of the DNA may include each region encoding two parts of a conjugate that are adjacent to one another or separated by a region that encodes a linker peptide that does not destroy the desired properties of the conjugate. it can.

なおもう１つの具体例において、抗体は、抗体−受容体結合体が患者に投与される腫瘍−プレ−標的化で利用される（ストレプトアビジンのような）「受容体」に結合体化させ、続いて、キレート剤を用いて未結合結合体を循環から除去し、次いで、細胞傷害性剤（例えば、放射性ヌクレオチド）に結合体化した「リガンド」（例えば、アビジン）を投与することができる。
１０．イムノリポソーム
本明細書中で開示された抗−ＴＡＴ抗体はイムノリポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は薬物の哺乳動物への送達で有用な種々のタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小さな小胞である。リポソームの成分は、生物学的膜の脂質配置と同様に、二層形成において通常配置される。抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；および１９９７年１０月２３日に公開されたＷＯ ９７／３８７３１に記載されているように、当該分野で知られた方法によって調製される。増強された循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。 In yet another embodiment, the antibody is conjugated to a “receptor” (such as streptavidin) that is utilized in tumor-pre-targeting where the antibody-receptor conjugate is administered to the patient; Subsequently, unbound conjugates can be removed from the circulation using a chelating agent and then a “ligand” (eg, avidin) conjugated to a cytotoxic agent (eg, a radionucleotide) can be administered.
10. Immunoliposomes The anti-TAT antibodies disclosed herein can also be formulated as immunoliposomes. “Liposomes” are small vesicles composed of various types of lipids, phospholipids and / or surfactants useful in the delivery of drugs to mammals. The components of the liposome are usually arranged in a bilayer formation, similar to the lipid arrangement of biological membranes. Liposomes containing antibodies are described in Epstein et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545; and WO 97/38731 published Oct. 23, 1997, as described in U.S. Pat. Prepared by methods known in the art. Liposomes with enhanced circulation time are disclosed in US Pat. No. 5,013,556.

特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発方法によって作成することができる。リポソームは規定されたポアサイズのフィルターを通して押し出されて、所望の直径を持つリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されたようなリポソームに結合体化させることができる。化学療法剤は、所望により、リポソームに含ませる。Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４（１９８９）参照。   Particularly useful liposomes can be made by the reverse phase evaporation method with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derivatized phosphatidylethanolamine (PEG-PE). Liposomes are extruded through a defined pore size filter to obtain liposomes with the desired diameter. The Fab 'fragment of the antibody of the present invention can be obtained through Martin di al. , J .; Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) can be conjugated to liposomes. A chemotherapeutic agent is optionally included in the liposome. Gabizon et al. , J .; National Cancer Inst. 81 (19): 1484 (1989).

Ｂ．ＴＡＴ結合オリゴペプチド
本発明のＴＡＴ結合オリゴペプチドは、本明細書中に記載したように、ＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合するオリゴペプチドである。ＴＡＴ結合オリゴペプチドは、公知のオリゴペプチド合成方法を用いて化学的に合成することができるか、あるいは組換え技術を用いて調製し精製することができる。ＴＡＴ結合オリゴペプチドは長さが通常少なくとも約５アミノ酸、別法として、長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００アミノ酸以上であり、ここに、そのようなオリゴヌクレオチドは本明細書中に記載したようにＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができる。ＴＡＴ結合オリゴペプチドは、よく知られた技術を用い、過度な実験なくして同定することができる。この点に関し、ポリペプチド標的に特異的に結合することができるオリゴペプチドについてのオリゴペプチドライブラリをスクリーニングする技術は当該分野で良く知られていることを注記する（例えば、米国特許第５，５５６，７６２号、第５，７５０，３７３号、４，７０８，８７１号、第４，８３３，０９２号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５、５７１，６８９号、第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ８４／０３５０６およびＷＯ ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：３９９８−４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１７８−１８２（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，１３０−１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｏｆｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：６１１−６１６（１９８８），Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：６３７８；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：８３６３，およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８参照）。 B. TAT-binding oligopeptides The TAT-binding oligopeptides of the present invention are oligopeptides that preferably specifically bind to a TAT polypeptide as described herein. TAT-linked oligopeptides can be chemically synthesized using known oligopeptide synthesis methods or can be prepared and purified using recombinant techniques. TAT-linked oligopeptides are usually at least about 5 amino acids in length, alternatively, at least about 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 in length. 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98, 99, or 100 amino acids A top, herein, such oligonucleotides may be preferably in the TAT polypeptide as described herein specifically bind. TAT-binding oligopeptides can be identified without undue experimentation using well-known techniques. In this regard, it is noted that techniques for screening oligopeptide libraries for oligopeptides that can specifically bind to a polypeptide target are well known in the art (see, eg, US Pat. No. 5,556,556). 762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, No. 5,663,143; PCT Publication Nos. WO 84/03506 and WO 84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 178-182 (198 Geysen et al., In Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102: 259-274 (1987); 140: 611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378; Lowman, H. B. et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al (1991) Nature, 352: 624; Marks, JD et al (1991), J. Mol. Biol., 222: 581; g, AS et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8363, and Smith, GP (1991) Current Opin. Biotechnol., 2: 668. reference).

この点に関して、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリをスクリーニングして、ポリペプチド標的に特異的に結合することができるライブラリのメンバーを同定するのを可能とする１つのよく知られた技術である。ファージディスプレイは、それにより、変種ポリペプチドが、バクテリオファージ粒子の表面の被膜蛋白質への融合蛋白質としてディスプレイされる技術である（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６）。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化された蛋白質変種（またはランダムにクローン化されたｃＤＮＡ）の大きなライブラリが、高い親和性でもって標的分子に結合する配列について迅速かつ効果的にソーティングできるという事実にある。ファージについてのペプチド（Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：６３７８）または蛋白質（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：８３６３）ライブラリは、特異的結合特性を持つものについての数百万のポリペプチドまたはオリゴペプチドをスクリーニングするのに用いられてきた（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８）。ランダム突然変異体のソーティングファージライブラリは、非常に多数の変種を構築し、増殖させるための戦略、標的受容体を用いるアフィニティー精製のための手法および結合豊富化の結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５７１，６８９号および第５，６６３，１４３号。   In this regard, bacteriophage (phage) display is one well-known that allows large oligopeptide libraries to be screened to identify library members that can specifically bind to polypeptide targets. Technology. Phage display is a technique whereby variant polypeptides are displayed as fusion proteins to coat proteins on the surface of bacteriophage particles (Scott, JK and Smith, GP (1990) Science 249. : 386). The utility of phage display is that large libraries of selectively randomized protein variants (or randomly cloned cDNAs) can be quickly and effectively sorted for sequences that bind to target molecules with high affinity. It is in the fact that. Peptides for phage (Cwirla, SE et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378) or protein (Lowman, HB et al. (1991) ) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, JD et al. (1991), J. Mol. Biol., 222: 581; S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8363) libraries contain millions of polypeptides or oligopeptides for those with specific binding properties. It has been used to screen (Smith, GP. 1991) Current Opin.Biotechnol, 2:. 668). Random mutant sorting phage libraries require strategies to construct and propagate a large number of variants, techniques for affinity purification using target receptors and means to evaluate the results of binding enrichment . U.S. Pat. Nos. 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689 and 5,663,143.

ほとんどのファージディスプレイ方法はフィラメント状ファージを用いてきたが、ラムダ字形のファージディスプレイシステム（ＷＯ ９５／３４６８３；米国特許第５，６２７，０２４号）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Ｒｅｎ，Ｚ−Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｇｅｎｅ ２１５：４３９；Ｚｈｕ，Ｚ．（１９９７） ＣＡＮ ３３：５３４；Ｊｉａｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９７） １２８：４４３８０；Ｒｅｎ，Ｚ−Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９７） ＣＡＮ １２７：２１５６４４；Ｒｅｎ，Ｚ−Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．５：１８３３；Ｅｆｉｍｏｖ，Ｖ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １０：１７３）およびＴ７ファージディスプレイシステム（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７，２２８−２５７；米国特許第５，７６６，９０５号）も知られている。   Although most phage display methods have used filamentous phage, a lambda-shaped phage display system (WO 95/34683; US Pat. No. 5,627,024), T4 phage display system (Ren, ZJ. Et. (1998) Gene 215: 439; Zhu, Z. (1997) CAN 33: 534; Jiang, J. et al. (1997) 128: 44380; Ren, Z-J. et al. (1997) CAN 127. Ren, ZJ et al. (1996) Protein Sci. 5: 1833; Efimov, VP et al. (1995) Virus Genes 10: 173) and T7 phage display system (Smith, G. et al.). P. and Scott, JK (1993) Methods in Enzymology, 217, 228-257; US Pat. No. 5,766,905) are also known.

基本的なファージディスプレイ概念の多くの他の改良および変形は今日開発されている。これらの改良は、選択された標的分子への結合につきペプチドライブラリをスクリーニングし、および所望の特性につきこれらの蛋白質をスクリーニングする潜在能力を持つ機能的蛋白質をディスプレイするディスプレイシステムの能力を高める。ファージライブラリ反応についてのコンビナトーリアル反応デバイスが開発されており（ＷＯ ９８／１４２７７）、ファージディスプレイライブラリを用いて対照生体分子相互作用（ＷＯ ９８／２０１６９；ＷＯ ９８／２０１５９）および拘束された螺旋ペプチドの特性（ＷＯ ９８／２００３６）を分析し、制御するのに用いられてきた。ＷＯ ９７／３５１９６は、アフィニティーリガンドを単離する方法を記載し、ここに、ファージディスプレイライブラリが、リガンドが標的分子に結合する１つの溶液およびアフィニティーリガンドが標的分子に結合しない第２の溶液と接触されて、結合リガンドを選択的に単離する。ＷＯ ９７／４６２５１は、ランダムファージディスプレイライブラリを親和性精製抗体で培養パニングし、次いで、結合ファージを単離し、続いて、マイクロプレートウェルを用いてミクロパニングプロセスを行って、高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。Ｓｔａｐｈｌｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ蛋白質Ａのアフィニティータグとしての使用もまた報告されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：１８７）。ＷＯ ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリであり得るコンビナトーリアルライブラリを用いて酵素特異性を区別するための基質減算ライブラリの使用を記載する。ファージディスプレイを用いる洗剤で使用するのに適した酵素を選択する方法はＷＯ ９７／０９４４６に記載されている。特異的結合蛋白質を選択する更なる方法は米国特許第５，４９８，５３８号、第５，４３２，０１８号、およびＷＯ ９８／１５８３３に記載されている。   Many other improvements and variations of the basic phage display concept are being developed today. These improvements enhance the ability of the display system to display functional proteins with the potential to screen peptide libraries for binding to selected target molecules and screen these proteins for desired properties. Combinatorial reaction devices for phage library reactions have been developed (WO 98/14277) and control biomolecular interactions (WO 98/20169; WO 98/20159) and constrained helical peptides using phage display libraries Has been used to analyze and control the properties of (WO 98/20036). WO 97/35196 describes a method for isolating an affinity ligand, wherein a phage display library is contacted with one solution in which the ligand binds to the target molecule and a second solution in which the affinity ligand does not bind to the target molecule. To selectively isolate the bound ligand. WO 97/46251 pans a random phage display library with affinity purified antibodies, then isolates the bound phage, followed by a micropanning process using microplate wells to obtain high affinity bound phage. A method of isolation is described. The use of Staphylococcus aureus protein A as an affinity tag has also been reported (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9: 187). WO 97/47314 describes the use of a substrate subtraction library to distinguish enzyme specificities using a combinatorial library that can be a phage display library. A method for selecting enzymes suitable for use in detergents using phage display is described in WO 97/09446. Additional methods for selecting specific binding proteins are described in US Pat. Nos. 5,498,538, 5,432,018, and WO 98/15833.

ペプチドライブラリを作成し、これらのライブラリをスクリーニングする方法もまた、米国特許第５，７２３，２８６号、第５，４３２，０１８号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，４９８，５３０号、第５，７７０，４３４号、第５，７３４，０１８号、第５，６９８，４２６号、第５，７６３，１９２号、および第５，７２３，３２３号に開示されている。   Methods for generating peptide libraries and screening these libraries are also described in US Pat. Nos. 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, Disclosed in 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, and 5,723,323 Has been.

Ｃ．ＴＡＴ結合有機分子
ＴＡＴ結合有機分子は、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合する本明細書中で定義されたオリゴペプチドまたは抗体以外の有機分子である。ＴＡＴ結合有機分子は、公知の技術を用いて同定し、化学的に合成することができる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ００／００８２３およびＷＯ ００／３９５８５参照）。ＴＡＴ結合有機分子は長さが通常約２０００ダルトン未満、別法として、長さが約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトン未満であり、ここに、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができるそのような有機分子は、よく知られた技術を用い、過度な実験なくして同定することができる。この点に関し、ポリペプチド標的に結合することができる分子についての有機分子ライブラリをスクリーニングする技術は当該分野で良く知られていることを注記する（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ００／００８２３およびＷＯ ００／３９５８５参照）。ＴＡＴ結合有機分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、第一級アミン、第２級アミン、第３級アミン、Ｎ−置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カルボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハライド、アリールスルホネート、アルキルハライド、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、アキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニルクロライド、ジアゾ化合物、酸クロライド等であり得る。 C. TAT-binding organic molecule A TAT-binding organic molecule is an organic molecule other than an oligopeptide or antibody as defined herein that preferably specifically binds to a TAT polypeptide as described herein. TAT-binding organic molecules can be identified and chemically synthesized using known techniques (see, eg, PCT publication numbers WO 00/00823 and WO 00/39585). A TAT-binding organic molecule is typically less than about 2000 Daltons in length, alternatively less than about 1500, 750, 500, 250, or 200 Daltons, wherein a TAT polypeptide as described herein Such organic molecules that are capable of specifically binding to can be identified without undue experimentation using well-known techniques. In this regard, it is noted that techniques for screening organic molecular libraries for molecules that can bind to polypeptide targets are well known in the art (eg, PCT Publication Nos. WO 00/00823 and WO 00 / 39585). TAT-binding organic molecules include, for example, aldehydes, ketones, oximes, hydrazones, semicarbazones, carbazides, primary amines, secondary amines, tertiary amines, N-substituted hydrazines, hydrazides, alcohols, ethers, thiols, thioethers, Disulfide, carboxylic acid, ester, amide, urea, carbamate, carbonate, ketal, thioketal, acetal, thioacetal, aryl halide, aryl sulfonate, alkyl halide, alkyl sulfonate, aromatic compound, heterocyclic compound, aniline, alkene, alkyne, Diol, amino alcohol, oxazolidine, axazoline, thiazolidine, thiazoline, enamine, sulfonamide, epoxide, aziridine, isocyanate, sulfonyl chloride, diazo Compounds, may be an acid chloride or the like.

Ｄ．所望の特性を持つ抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドおよびＴＡＴ結合有機分子についてのスクリーニング
ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドおよび有機分子を作成するための技術は前記した。さらに、望むように、ある種の生物学的特徴を持つ抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子を選択することができる。 D. Screening for Anti-TAT Antibodies, TAT Binding Oligopeptides and TAT Binding Organic Molecules with Desired Properties Techniques for making antibodies, oligopeptides and organic molecules that bind to TAT polypeptides have been described above. In addition, antibodies, oligopeptides or other organic molecules with certain biological characteristics can be selected as desired.

本発明の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子の成長阻害効果は、例えば、内因的に、あるいはＴＡＴ遺伝子でのトランスフェクションに続いてＴＡＴポリペプチドを発現する細胞を用いて当該分野で公知の方法によって評価することができる。例えば、適当な腫瘍細胞系およびＴＡＴ−トランスフェクト細胞を、種々の濃度にて、本発明の抗−ＴＡＴモノクローナル抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子で数日間（例えば、２ないし７日間）処理し、クリスタルバイオレットまたはＭＴＴで染色し、あるいはいくつかの他の非色アッセイによって分析することができる。増殖を測定するもう１つの方法は、本発明の抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子の存在下または不存在下で処理された細胞による３Ｈ−チミジン摂取を比較することによるであろう。処理の後、細胞を収穫し、ＤＮＡに取り込まれた放射能の量をシンチレーションカウンターで定量する。適当な陽性対照は、その細胞系の増殖を阻害することが知られている成長阻害抗体での選択された細胞系の処理を含む。イン・ビボでの腫瘍細胞の増殖阻害は、当該分野で知られた種々の方法で測定することができる。好ましくは、腫瘍細胞はＴＡＴポリペプチドを過剰発現するものである。好ましくは、抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子は、１つの具体例において、約０．５ないし３０μｇ／ｍｌの抗体濃度において、未処理腫瘍細胞と比較して、約２５ないし１００％だけ、より好ましくは、約３０ないし１００％だけ、なおより好ましくは、５０ないし１００％、または７０ないし１００％だけ、イン・ビトロまたはイン・ビボにてＴＡＴ−発現腫瘍細胞の細胞増殖を阻害するであろう。増殖阻害は、細胞培養中の約０．５ないし３０μｇ／ｍｌ、または約０．５ｎＭないし２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、ここに、増殖阻害は腫瘍細胞の抗体への暴露から１ないし１０日後に測定される。抗体は、もし約１μｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与の結果、腫瘍サイズの低下、または腫瘍細胞増殖の低下が、抗体の最初の投与から約５日ないし３ヶ月以内、好ましくは約５ないし３０日以内にもたらせられれば、イン・ビボにて増殖阻害性である。 The growth inhibitory effects of anti-TAT antibodies, oligopeptides or other organic molecules of the invention have been demonstrated in the art using cells that express a TAT polypeptide, for example, endogenously or following transfection with a TAT gene. It can be evaluated by a known method. For example, suitable tumor cell lines and TAT-transfected cells are treated with various concentrations of anti-TAT monoclonal antibodies, oligopeptides or other organic molecules of the invention for several days (eg, 2-7 days). , Stained with crystal violet or MTT, or analyzed by some other non-color assay. Another method of measuring proliferation is by comparing 3 H-thymidine uptake by cells treated in the presence or absence of anti-TAT antibodies, TAT binding oligopeptides or TAT binding organic molecules of the invention. Will. After treatment, the cells are harvested and the amount of radioactivity incorporated into the DNA is quantified with a scintillation counter. Suitable positive controls include treatment of selected cell lines with growth inhibitory antibodies known to inhibit the proliferation of the cell line. Inhibition of tumor cell growth in vivo can be measured by various methods known in the art. Preferably, the tumor cell is one that overexpresses a TAT polypeptide. Preferably, the anti-TAT antibody, TAT binding oligopeptide or TAT binding organic molecule is in one embodiment about 25 to about 30 compared to untreated tumor cells at an antibody concentration of about 0.5 to 30 μg / ml. Only 100%, more preferably about 30-100%, even more preferably 50-100%, or 70-100%, in vitro or in vivo, cell growth of TAT-expressing tumor cells. Will inhibit. Growth inhibition can be measured at an antibody concentration of about 0.5 to 30 μg / ml, or about 0.5 nM to 200 nM in cell culture, wherein growth inhibition is 1 to 1 from exposure of tumor cells to the antibody. Measured after 10 days. The antibody may have a decrease in tumor size or decrease in tumor cell proliferation as a result of administration of about 1 μg / kg to about 100 mg / kg body weight within about 5 days to 3 months, preferably about 5 It is growth inhibitory in vivo if given within 30 days.

細胞死滅を誘導する抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子を選択するためには、例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルーまたは７ＡＡＤ摂取によって示される膜一体性の喪失を対照に対して評価することができる。ＰＩ摂取アッセイは、補体および免疫エフェクター細胞の不存在下で行うことができる。ＴＡＴポリペプチド−発現腫瘍細胞は、培地単独、あるいは（例えば、約１０μｇ／ｍｌの）適当な抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子を含有する培地と共にインキュベートする。細胞を３日間インキュベートする。各処理の後に、細胞を洗浄し、細胞クランプの除去のために、３５ｍｍストレーナー−キャップド１２×７５チューブ（チューブ当たり１ｍｌ、処理群あたり３チューブ）にアリコットする。次いで、チューブにＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を与える。ＦＡＣＳＣＡＮ（登録商標）フローサイトメーターおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（登録商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用い、試料を分析することができる。ＰＩ摂取によって測定して統計学的に有意なレベルの細胞死滅を誘導する抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子は、細胞死滅−誘導抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子として選択することができる。   To select anti-TAT antibodies, TAT-binding oligopeptides or TAT-binding organic molecules that induce cell killing, for example, control the loss of membrane integrity as indicated by propidium iodide (PI), trypan blue or 7AAD uptake. Can be evaluated against. PI uptake assays can be performed in the absence of complement and immune effector cells. TAT polypeptide-expressing tumor cells are incubated with media alone or with media containing appropriate anti-TAT antibody, TAT-binding oligopeptide or TAT-binding organic molecule (eg, about 10 μg / ml). Incubate cells for 3 days. After each treatment, the cells are washed and aliquoted into 35 mm strainer-capped 12 × 75 tubes (1 ml per tube, 3 tubes per treatment group) for removal of the cell clamp. The tube is then given PI (10 μg / ml). Samples can be analyzed using a FACSCAN® flow cytometer and FACSCONVERT® CellQuest software (Becton Dickinson). Anti-TAT antibodies, TAT-binding oligopeptides or TAT-binding organic molecules that induce statistically significant levels of cell death as measured by PI uptake are cell death-induced anti-TAT antibodies, TAT-binding oligopeptides or TAT It can be selected as a bound organic molecule.

注目する抗体によって結合されたＴＡＴポリペプチド上のエピトープに結合する抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子についてスクリーニングするためには、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されたもののようなルーチン的交差−ブロッキングアッセイを行うことができる。このアッセイを用いて、テスト抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子が公知の抗−ＴＡＴ抗体と同一の部位またはエピトープに結合するかを判断することができる。別法として、あるいは加えて、エピトープマッピングは、当該分野で知られた方法によって行うことができる。例えば、抗体配列をアラニンスキャニングによるなどして突然変異誘発させて、接触残基を同定することができる。突然変異体抗体は、まず、ポリクローナル抗体との結合についてテストして、適切な折畳みを確実とする。異なる方法において、ＴＡＴポリペプチドの異なる領域に対応するペプチドを、テスト抗体で、またはテスト抗体および特徴付けられたまたは公知のエピトープを持つ抗体での競合アッセイで用いることができる。   To screen for antibodies, oligopeptides or other organic molecules that bind to an epitope on the TAT polypeptide bound by the antibody of interest, see Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Lowand David Lane (1988). Routine cross-blocking assays such as those described in) can be performed. This assay can be used to determine whether a test antibody, oligopeptide or other organic molecule binds to the same site or epitope as a known anti-TAT antibody. Alternatively or additionally, epitope mapping can be performed by methods known in the art. For example, antibody residues can be mutagenized, such as by alanine scanning, to identify contact residues. Mutant antibodies are first tested for binding with polyclonal antibodies to ensure proper folding. In different ways, peptides corresponding to different regions of the TAT polypeptide can be used in competition assays with test antibodies or with test antibodies and antibodies with characterized or known epitopes.

Ｅ．抗体依存性酵素媒介プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）
また、本発明の抗体を、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ ８１／０１１４５参照）を活性な抗癌薬物に変換するプロドラッグ−活性化酵素へ抗体を結合体化することによって、ＡＤＥＰＴで用いることもできる。例えば、ＷＯ ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号参照。 E. Antibody-dependent enzyme-mediated prodrug therapy (ADEPT)
Alternatively, the antibody of the present invention may be conjugated by conjugating the antibody to a prodrug-activating enzyme that converts a prodrug (eg, a peptidyl chemotherapeutic agent, see WO 81/01145) into an active anticancer drug. Can also be used. See, for example, WO 88/07378 and US Pat. No. 4,975,278.

ＡＤＥＰＴで有用な免疫結合体の酵素成分は、それをそのより活性な細胞傷害性形態に変換するようにプロドラッグに作用することができるいずれの酵素も含む。   The enzyme component of the immunoconjugate useful in ADEPT includes any enzyme that can act on the prodrug to convert it to its more active cytotoxic form.

本発明の方法で有用な酵素は、限定されるものではないが、ホスフェート−含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルフェート−含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアビールスルファターゼ；非−毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬物である５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンでアミナーゼ；ペプチド−含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用な、セラチアプロテアーゼ、テルモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよび（カテプシンＢおよびＬのような）カテプシンのようなプロテアーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なβ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼのような炭水化物−切断酵素；β−ラクタムで誘導体化した薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ；および各々、フェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基でそれらのアミン窒素において誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼのようなペニシリンアミダーゼを含む。別法として、「アブザイム」として当該分野においてやはり知られている酵素活性を持つ抗体を用いて、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換することができる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ ３２８：４５７−４５８（１９８７）参照）。抗体アブザイム結合体は、アブザイムの腫瘍細胞集団への送達のために本明細書中で記載されるように調製することができる。   Enzymes useful in the methods of the invention include, but are not limited to, alkaline phosphatases useful for converting phosphate-containing prodrugs to free drugs; useful for converting sulfate-containing prodrugs to free drugs. Aberine sulfatase; a cytosine useful for converting non-toxic 5-fluorocytosine to the anti-cancer drug 5-fluorouracil; a seratase protease useful for converting peptide-containing prodrugs to free drugs; Proteases such as thermolysin, subtilisin, carboxypeptidase and cathepsin (such as cathepsin B and L); β-galactosidase and carbohydrate-cleaving enzymes such as neuraminidase useful for converting glycosylated prodrugs to free drugs; -In lactam Β-lactamases useful for converting derivatized drugs to free drugs; and penicillin V, useful for converting drugs derivatized at their amine nitrogen with phenoxyacetyl or phenylacetyl groups, respectively, to free drugs Penicillin amidases such as amidase or penicillin G amidase. Alternatively, prodrugs of the invention can be converted into free active drugs using antibodies with enzymatic activity also known in the art as “abzymes” (eg, Massey, Nature 328: 457- 458 (1987)). Antibody abzyme conjugates can be prepared as described herein for delivery of abzymes to tumor cell populations.

本発明の酵素は、前記したヘテロ二官能的架橋剤の使用のような当該分野で良く知られた技術によって、抗−ＴＡＴ抗体に共有結合させることができる。別法として、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合蛋白質は、当該分野で良く知られた組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）参照）。   The enzyme of the present invention can be covalently bound to the anti-TAT antibody by techniques well known in the art such as the use of the heterobifunctional crosslinkers described above. Alternatively, a fusion protein comprising at least the antigen binding region of the antibody of the present invention linked to at least a functionally active portion of the enzyme of the present invention can be constructed using recombinant DNA techniques well known in the art. (See, eg, Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)).

Ｆ．全長ＴＡＴポリペプチド
本発明は、ＴＡＴポリペプチドとして本出願において言及されたポリペプチドをコードする新しく同定され、かつ単離されたヌクレオチド配列も提供する。特に、種々のＴＡＴポリペプチドをコードするｃＤＮＡ（部分および全長）は、後の実施例にさらに詳細に開示するように同定され単離されている。 F. Full-length TAT polypeptides The present invention also provides newly identified and isolated nucleotide sequences that encode the polypeptides referred to in this application as TAT polypeptides. In particular, cDNAs (partial and full length) encoding various TAT polypeptides have been identified and isolated as disclosed in more detail in the examples below.

後の実施例に開示されているように種々のｃＤＮＡクローンはＡＴＣＣに寄託されている。それらのクローンの現実のヌクレオチド配列は、当該分野におけるルーチン的方法を用いて寄託されたクローンの配列決定によって、当業者によって容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列はルーチン的技量を用いてヌクレオチド配列から決定することができる。本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドおよびコーディング核酸ではいくつかの場合においては、出願人らはその時に入手可能な情報でもって最良に同定可能なリーディングフレームは何であるかと考えられるかを同定した。   Various cDNA clones have been deposited with the ATCC as disclosed in later examples. The actual nucleotide sequence of these clones can be readily determined by one skilled in the art by sequencing the deposited clones using routine methods in the art. The predicted amino acid sequence can be determined from the nucleotide sequence using routine skill. In some cases with the TAT polypeptides and coding nucleic acids described herein, applicants have identified what is considered the best identifiable reading frame with the information available at the time. did.

Ｇ．抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド変種
本明細書中で記載した抗−ＴＡＴ抗体および全長天然配列ＴＡＴポリペプチドに加えて、抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド変種を調製することができると考えられる。抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド変種は、適当なヌクレオチド変化をコーディングＤＮＡに導入し、および／または所望の抗体またはポリペプチドを合成することによって調製することができる。当業者であれば、アミノ酸の変化は、グリコシル化部位の数または位置を変化させる、または膜係留特徴を改変するような、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの翻訳後プロセスを改変することができることを認識するであろう。 G. Anti-TAT antibodies and TAT polypeptide variants In addition to the anti-TAT antibodies and full-length native sequence TAT polypeptides described herein, it is contemplated that anti-TAT antibodies and TAT polypeptide variants can be prepared. Anti-TAT antibody and TAT polypeptide variants can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the coding DNA and / or synthesizing the desired antibody or polypeptide. One skilled in the art can alter the post-translational process of an anti-TAT antibody or TAT polypeptide, such as changing the number or position of glycosylation sites or altering membrane anchoring characteristics. Will recognize.

本明細書中に記載された抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドにおける変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載された保存的および非−保存的突然変異についての技術およびガイドラインのいずれかを用いてなすことができる。変異は、天然配列の抗体またはポリペプチドと比較して、アミノ酸配列において変化をもたらす抗体またはポリペプチドをコードする１以上のコドンの置換、欠失または挿入であり得る。所望により、変異は、少なくとも１つのアミノ酸の、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドのドメインの１以上におけるいずれかの他のアミノ酸での置換による。いずれのアミノ酸残基が、所望の活性に悪影響することなく挿入、置換または欠失できるかを決定するガイドラインは、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの配列を、相同な公知の蛋白質分子のそれと比較し、高相同性の領域においてなされたアミノ酸配列変化の数を最小とすることができることによって見出すことができる。アミノ酸の置換は、ロイシンのセリンでの置換、すなわち、保存的アミノ酸置換のような、同様な構造的および／または化学的特性を有するもう１つのアミノ酸で１つのアミノ酸を置き換える結果であり得る。挿入または欠失は、所望により、約１ないし５のアミノ酸の範囲にあり得る。許された該変異は、配列中のアミノ酸の挿入、欠失または置換を系統的になし、全長または成熟天然配列によって呈される活性につき得られた変種をテストすることによって決定することができる。   Mutations in the anti-TAT antibodies and TAT polypeptides described herein are described in, for example, the techniques and guidelines for conservative and non-conservative mutations described in US Pat. No. 5,364,934. It can be done using either. A mutation may be a substitution, deletion or insertion of one or more codons encoding an antibody or polypeptide that results in a change in amino acid sequence as compared to a native sequence antibody or polypeptide. Optionally, the mutation is by substitution of at least one amino acid with any other amino acid in one or more of the domains of the anti-TAT antibody or TAT polypeptide. Guidelines for determining which amino acid residues can be inserted, substituted or deleted without adversely affecting the desired activity can be found by comparing the sequence of an anti-TAT antibody or TAT polypeptide with that of a homologous known protein molecule. However, it can be found by minimizing the number of amino acid sequence changes made in regions of high homology. An amino acid substitution may be the result of replacing one amino acid with another amino acid having similar structural and / or chemical properties, such as a substitution of leucine with serine, ie, a conservative amino acid substitution. Insertions or deletions can range from about 1 to 5 amino acids, if desired. The allowed mutations can be determined by systematically making amino acid insertions, deletions or substitutions in the sequence and testing the resulting variants for activity exhibited by the full-length or mature native sequence.

抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド断片がここに提供される。そのような断片はＮ−末端またはＣ−末端において切形することができるか、あるいは、例えば、全長天然抗体または蛋白質と比較した場合に内部残基を欠いてもよい。ある種の断片は、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの所望の生物学的活性に対して必須でないアミノ酸残基を欠く。   Anti-TAT antibody and TAT polypeptide fragments are provided herein. Such fragments can be truncated at the N-terminus or C-terminus, or may lack internal residues when compared to, for example, full-length native antibodies or proteins. Certain fragments lack amino acid residues that are not essential for a desired biological activity of the anti-TAT antibody or TAT polypeptide.

抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド断片は、多数の慣用的な技術のいずれかによって調製することができる。所望のペプチド断片は化学的に合成することができる。代替アプローチは、酵素消化によって、例えば、特定のアミノ酸残基によって規定される部位にて蛋白質を切断することが知られている酵素で蛋白質を処理することによって、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化し、所望の断片を単離することができることによって抗体またはポリペプチド断片を生じさせることを含む。なおもう１つの適当な技術は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって所望の抗体またはポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し、増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲにおいて５’および３’プライマーにおいて使用する。好ましくは、抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド断片は、本明細書中に開示された天然抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドと少なくとも１つの生物学的および／または免疫学的活性を共有する。   Anti-TAT antibody and TAT polypeptide fragments can be prepared by any of a number of conventional techniques. Desired peptide fragments can be chemically synthesized. An alternative approach is to digest the DNA by enzymatic digestion, for example by treating the protein with an enzyme known to cleave the protein at a site defined by a particular amino acid residue, or with an appropriate restriction enzyme And generating an antibody or polypeptide fragment by allowing the desired fragment to be isolated. Yet another suitable technique involves isolating and amplifying a DNA fragment encoding the desired antibody or polypeptide fragment by polymerase chain reaction (PCR). Oligonucleotides that define the desired ends of the DNA fragments are used in the 5 'and 3' primers in PCR. Preferably, the anti-TAT antibody and TAT polypeptide fragment share at least one biological and / or immunological activity with the natural anti-TAT antibody or TAT polypeptide disclosed herein.

特別な具体例において、注目する保存的置換は、好ましい置換の見出しの下で表６に示す。もしそのような置換の結果生物学的活性が変化すれば、表６における、またはアミノ酸クラスを参照してさらに以下に記載するような、より多い実質的変化、支配的な例示的置換が導入され、生成物をスクリーニングする。   In particular embodiments, the conservative substitutions of interest are shown in Table 6 under the preferred substitution headings. If the biological activity changes as a result of such a substitution, more substantial changes, dominant exemplary substitutions are introduced, as in Table 6 or as described further below with reference to the amino acid class. The product is screened.

Figure 2008512121
抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの機能または免疫学的同一性における実質的修飾は、（ａ）例えば、シートまたはラセン立体配座としての、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を維持するに対するそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に生じる残基は、通常の側鎖の特性：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の向きに影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
に基づいて群に分けられる。
Figure 2008512121
 Substantial modifications in the function or immunological identity of the anti-TAT antibody or TAT polypeptide include: (a) the structure of the polypeptide backbone in the region of substitution, eg, as a sheet or helical conformation, (b) the target The charge or hydrophobicity of the molecule at the site, or (c) their effect on maintaining side chain bulk is achieved by selecting substitutions that differ significantly. Naturally occurring residues have the usual side chain properties:
(1) Hydrophobicity: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) Neutral hydrophilicity: cys, ser, thr;
(3) Acidity: asp, glu;
(4) Basic: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Residues affecting chain orientation: gly, pro; and (6) Aromatics: trp, tyr, phe
Divided into groups.

非−保存的置換は、もう１つのクラスに代えてこれらのクラスの１つのメンバーで交換することを含むであろう。そのような置換された残基は保存的置換部位へ、より好ましくは残りの（非−）保存的部位へ導入することもできる。   Non-conservative substitutions will involve exchanging with one member of these classes instead of another class. Such substituted residues can also be introduced into conservative substitution sites, more preferably into the remaining (non-) conserved sites.

変異は、オリゴヌクレオチド−媒介（部位−特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、およびＰＣＲ突然変異誘発のような当該分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位−特異的突然変異誘発［Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）］、カセット突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５）］、制限選択突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌｏｓ，Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６）］または他の公知の技術をクローン化されたＤＮＡに対して行って、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド変種ＤＮＡを得ることができる。   Mutations can be made using methods known in the art such as oligonucleotide-mediated (site-specific) mutagenesis, alanine scanning, and PCR mutagenesis. Site-specific mutagenesis [Carter et al. , Nucl. Acids Res. 13: 4331 (1986); Zoller et al. , Nucl. Acids Res. , 10: 6487 (1987)], cassette mutagenesis [Wells et al. , Gene, 34: 315 (1985)], restriction selective mutagenesis [Wells et al. , Philos, Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)] or other known techniques can be performed on the cloned DNA to obtain anti-TAT antibody or TAT polypeptide variant DNA.

スキャンニングアミノ酸分析を使用して、連続配列に沿って１以上のアミノ酸を同定することもできる。好ましいスキャンニングアミノ酸の中には比較的小さな中性のアミノ酸がある。そのようなアミノ酸はアラニン、グリシン、セリンおよびシステインを含む。アラニンはこの群の中で好ましいスキャンニングアミノ酸である。なぜならば、それはベータ−炭素を超える側鎖を排除し、変種の主鎖立体配座を余り改変しないようだからである［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）］。アラニンもまた典型的には好ましい。なぜならば、それは最も普通のアミノ酸だからである。さらに、それは頻繁に埋もれたおよび露出した位置双方で見出される［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９７６）］。もしアラニン置換が適当な量の変種を生じないならば、等電子アミノ酸を用いることができる。   Scanning amino acid analysis can also be used to identify one or more amino acids along a contiguous sequence. Among the preferred scanning amino acids are relatively small neutral amino acids. Such amino acids include alanine, glycine, serine and cysteine. Alanine is the preferred scanning amino acid in this group. This is because it eliminates side chains beyond the beta-carbon and does not appear to alter the main chain conformation of the variant too much [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. Alanine is also typically preferred. Because it is the most common amino acid. Furthermore, it is frequently found in both buried and exposed positions [Creighton, The Proteins, (WH Freeman & Co., NY); Chothia, J .; Mol. Biol. 150: 1 (1976)]. If an alanine substitution does not produce the appropriate amount of variant, an isoelectronic amino acid can be used.

抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの適切な立体配座を維持するに関与しないいずれのシステイン残基もまた、一般には、セリンで置換して、当該分子の酸化的安定性を改良し、異常な架橋を妨げることもできる。逆に、システイン結合を抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドに加えて、（特に、抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合に）その安定性を改良することができる。   Any cysteine residues that are not involved in maintaining the proper conformation of the anti-TAT antibody or TAT polypeptide are also generally substituted with serine to improve the oxidative stability of the molecule, which is unusual. It can also prevent crosslinking. Conversely, a cysteine bond can be added to an anti-TAT antibody or TAT polypeptide to improve its stability (especially when the antibody is an antibody fragment such as an Fv fragment).

置換的変種の特に好ましいタイプは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１以上超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる開発のために選択される得られた変種は、それからそれが作られた親抗体に対して改良された生物学的特性を有するであろう。そのような置換的変種を作り出すための便宜ナ方法は、ファージディスプレイを用いるアフィニティー成熟を含む。簡単に述べれば、いくつかの超可変領域部位（例えば、６ないし７部位）を突然変異させて、各部位において全ての可能なアミノ酸置換を生じさせる。かく生じた抗体変種は、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合としてフィラメント状ファージ粒子から一価的にディスプレイされる。次いで、本明細書中に開示されたように、ファージ−ディスプレイされた変種をそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を行って、有意に抗原結合に寄与する超可変領域残基を同定することができる。別法として、あるいは加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体およびヒトＴＡＴポリペプチドの間の接触点を同定するのが便宜であろう。そのような接触残基および隣接する残基は、本明細書中における精巧な技術に従う置換のための候補である。一旦そのような変種が生じたならば、変種のパネルを本明細書中に記載されたスクリーニングに付し、１以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を持つ抗体をさらなる開発のために選択することができる。   A particularly preferred type of substitutional variant involves substituting one or more hypervariable region residues of a parent antibody (eg a humanized or human antibody). In general, the resulting variant selected for further development will have improved biological properties relative to the parent antibody from which it was made. A convenient method for creating such substitutional variants involves affinity maturation using phage display. Briefly, several hypervariable region sites (eg, 6-7 sites) are mutated to generate all possible amino acid substitutions at each site. The resulting antibody variants are monovalently displayed from the filamentous phage particles as fusions to the gene III product of M13 packaged within each particle. The phage-displayed variants are then screened for their biological activity (eg, binding affinity) as disclosed herein. In order to identify candidate hypervariable region sites for modification, alanine scanning mutagenesis can be performed to identify hypervariable region residues contributing significantly to antigen binding. Alternatively or additionally, it may be convenient to analyze the crystal structure of the antigen-antibody complex to identify contact points between the antibody and human TAT polypeptide. Such contact residues and adjacent residues are candidates for substitution according to the elaborate techniques herein. Once such a variant has occurred, the panel of variants is subjected to the screening described herein to select antibodies with superior properties in one or more related assays for further development. Can do.

抗−ＴＡＴ抗体のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、当該分野で耕地の種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変種の場合）、またはオリゴヌクレオチド−媒介または部位−特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および抗−ＴＡＴ抗体のより早く調製された変種または非−変種バージョンのカセット突然変異誘発による調製を含む。   Nucleic acid molecules encoding the amino acid sequences of anti-TAT antibodies are prepared by various methods of arable land in the art. These methods include, but are not limited to, isolation from natural sources (in the case of naturally occurring amino acid sequence variants), or oligonucleotide-mediated or site-specific) mutagenesis, PCR mutagenesis, And preparation of earlier prepared variant or non-variant versions of anti-TAT antibodies by cassette mutagenesis.

Ｈ．抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの修飾
抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合修飾の１つのタイプは、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの標的化アミノ酸残基を、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの選択された側鎖、またはＮ−またはＣ−末端残基に反応することができる。有機誘導体化剤と反応させることを含む。二官能性基での誘導体化は、例えば、抗−ＴＡＴ抗体を精製するための方法で用いられる水溶性支持体マトリックスまたは表面へ抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドを架橋するのに有用であり、その逆も成立する。通常使用される架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタロアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなジスクシンイミジルエステルを含めたホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミド、およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような剤を含む。 H. Modification of anti-TAT antibodies and TAT polypeptides Covalent modifications of anti-TAT antibodies and TAT polypeptides are included within the scope of the present invention. One type of covalent modification involves targeting amino acid residues of an anti-TAT antibody or TAT polypeptide to selected side chains of the anti-TAT antibody or TAT polypeptide, or N- or C-terminal residues. Can react. Reacting with an organic derivatizing agent. Derivatization with a bifunctional group is useful, for example, to crosslink an anti-TAT antibody or TAT polypeptide to a water soluble support matrix or surface used in a method for purifying the anti-TAT antibody; The reverse is also true. Commonly used crosslinking agents include, for example, 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide ester, for example, ester with 4-azidosalicylic acid, 3,3′- Homobifunctional imidoesters including disuccinimidyl esters such as dithiobis (succinimidylpropionate), bifunctional maleimides such as bis-N-maleimide-1,8-octane, and methyl-3 -Includes agents such as [(p-azidophenyl) dithio] propioimidate.

他の修飾は、各々、対応するグルタミルおよびアスパルチルへのグルタミルおよびアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ酸のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｅｒｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）］、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびいずれかのＣ−末端カルボキシル基のアミド化を含む。   Other modifications include deamidation of glutamyl and asparaginyl residues to the corresponding glutamyl and aspartyl, hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of the hydroxyl group of seryl or threonyl residues, lysine, arginine, and histidine side, respectively. Chain α-amino acid methylation [T. E. Cerryton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.C. H. Freeman & Co. , San Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetylation of N-terminal amines, and amidation of any C-terminal carboxyl group.

本発明の範囲内に含まれる抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの共有結合修飾のもう１つのタイプは、抗体またはポリペプチドの天然グリコシル化パターンを改変することである。「天然グリコシル化パターンを改変」は、本明細書中においては、（基礎となるグリコシル化部位を除去することによって、あるいは化学的および／または酵素的手段によりグリコシル化を欠失することによって）天然配列抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドで見出される１以上の炭水化物部位を欠失すること、および／または天然配列抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドに存在しない１以上のグリコシル化部位を加えることを意味する目的を意図する。加えて、該フレーズは、存在する種々の炭水化物部位の性質および割合の変化に関連する、天然蛋白質のグリコシル化における定性的な変化を含む。   Another type of covalent modification of an anti-TAT antibody or TAT polypeptide included within the scope of the invention is to alter the natural glycosylation pattern of the antibody or polypeptide. “Modifying the native glycosylation pattern” is used herein (naturally by removing the underlying glycosylation site or by deleting glycosylation by chemical and / or enzymatic means). Means deleting one or more carbohydrate sites found in a sequence anti-TAT antibody or TAT polypeptide and / or adding one or more glycosylation sites not present in the native sequence anti-TAT antibody or TAT polypeptide Intended for purposes. In addition, the phrase includes qualitative changes in glycosylation of natural proteins that are associated with changes in the nature and proportion of the various carbohydrate sites present.

抗体および他のポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ−結合またはＯ−結合いずれかである。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部位の付着をいう。Ｘがプロリンを除くいずれかのアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、炭水化物部位のアスパラギン側鎖への酵素的付着のための認識配列である。かくして、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。Ｏ−結合グリコシル化とは、糖のＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も普通にはセリンまたはスレオニンへの付着をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを用いることもできる。   Glycosylation of antibodies and other polypeptides is typically either N-linked or O-linked. N-linked refers to the attachment of a carbohydrate moiety to the side chain of an asparagine residue. The tripeptide sequences asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine, where X is any amino acid except proline, are recognition sequences for enzymatic attachment of the carbohydrate moiety to the asparagine side chain. Thus, the presence of any of these tripeptide sequences in a polypeptide creates a potential glycosylation site. O-linked glycosylation refers to the attachment of one of the sugars N-acetylgalactosamine, galactose or xylose to a hydroxy amino acid, most commonly serine or threonine, but using 5-hydroxyproline or 5-hydroxylysine. You can also

抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、それが（Ｎ−結合グリコシル化部位のために）前記したトリペプチド配列の１以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって便宜には達成される。該改変は、１以上のセリンまたはスレオニン残基の、（Ｏ−結合グリコシル化部位のための）元来の抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの配列への付加、あるいはそれによる置換をなすこともできる。抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列は、所望により、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生じるように、予め選択された塩基において抗−ＴＡＴまたはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによって、ＤＮＡレベルでの変化を通じて改変することもできる。   The addition of a glycosylation site to an anti-TAT antibody or TAT polypeptide is by altering the amino acid sequence such that it contains one or more of the tripeptide sequences described above (for N-linked glycosylation sites). Conveniently achieved. The modification may also add or substitute one or more serine or threonine residues to the sequence of the original anti-TAT antibody or TAT polypeptide (for O-linked glycosylation sites). it can. The amino acid sequence of the anti-TAT antibody or TAT polypeptide may, if desired, suddenly cleave the DNA encoding the anti-TAT or TAT polypeptide at a preselected base so that a codon that is translated into the desired amino acid occurs. Mutations can also be made through changes at the DNA level.

抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド上の炭水化物部位の数を増加させるもう１つの手段が、ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。そのような方法は、例えば、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ ８７／０５３３０、およびＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）において当該分野で記載されている。   Another means of increasing the number of carbohydrate sites on the anti-TAT antibody or TAT polypeptide is by chemical or enzymatic coupling of glycosides to the polypeptide. Such methods are described, for example, in WO 87/05330 published September 11, 1987, and in Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. , Pp. 259-306 (1981).

抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドに存在する炭水化物部位の除去は、化学的にまたは酵素的に、あるいはグリコシル化のための標的として働くアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異的置換によって達成することができる。化学的脱グリコシル化技術は当該分野で知られており、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）によって、およびＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部位の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０（１９８７）によって記載されているように、種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用によって達成することができる。   Removal of the carbohydrate moiety present in the anti-TAT antibody or TAT polypeptide is accomplished chemically or enzymatically or by mutational substitution of codons encoding amino acid residues that serve as targets for glycosylation. Can do. Chemical deglycosylation techniques are known in the art, see, eg, Hakimudin, et al. , Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) and by Edge et al. , Anal. Biochem. 118: 131 (1981). Enzymatic cleavage of carbohydrate sites on polypeptides is described in Thotkura et al. , Meth. Enzymol. 138: 350 (1987) can be achieved by the use of various endo- and exo-glycosidases.

抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの共有結合修飾のもう１つのタイプは、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号に記載されているような方法で、抗体またはポリペプチドを、種々の非蛋白質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンの１つに連結させることを含む。抗体またはポリペプチドは、例えば、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ−粒子およびナノカプセル）において、またはマイクロエマルジョンにおいて、コアセルベーション技術によって、または界面重合（例えば、各々、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロスフィア）によって調製されたマイクロカプセル中に捕獲することもできる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）に開示されている。   Another type of covalent modification of anti-TAT antibody or TAT polypeptide is described in US Pat. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; No. 417; 4,791,192 or 4,179,337, wherein an antibody or polypeptide is conjugated to various non-proteinaceous polymers such as polyethylene glycol (PEG), polypropylene. Linking to one of glycol or polyoxyalkylene. The antibody or polypeptide can be, for example, in a colloidal drug delivery system (eg, liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nano-particles and nanocapsules) or in microemulsions, by coacervation techniques, or interfacial polymerization (eg, Can be encapsulated in microcapsules prepared by hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly- (methyl methacrylate) microspheres, respectively. Such techniques are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. et al. Ed. , (1980).

本発明の抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドは、もう１つの異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合した抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾することもできる。   An anti-TAT antibody or TAT polypeptide of the invention can also be modified in a way that forms a chimeric molecule comprising an anti-TAT antibody or TAT polypeptide fused to another heterologous polypeptide or amino acid sequence.

１つの具体例において、そのようなキメラ分子は、抗−タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープを供するタグポリペプチドと、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的に抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に置かれている。抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドのそのようなエピトープ−タグド形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドが、エピトープタグに結合する抗−タグ抗体またはもう１つのタイプのアフィニティーマトリックスを用いるアフィニティー精製によって容易に精製されるのを可能とする。種々のタグポリペプチドおよびそれらの各抗体は当該分野で良く知られている。その例はポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６（１９８５）］；および単純疱疹ウイルス糖蛋白質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｅｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０）］を含む。他のタグポリペプチドはＦｌａｇ−ペプチド［Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｇｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２）］；α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５２６３−１５１６６（１９９１）］；およびＴ７遺伝子１０蛋白質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７（１９９０）］を含む。   In one embodiment, such a chimeric molecule comprises a fusion of an anti-TAT antibody or TAT polypeptide with a tag polypeptide that provides an epitope to which an anti-tag antibody can selectively bind. The epitope tag is generally placed at the amino terminus or carboxyl terminus of the anti-TAT antibody or TAT polypeptide. The presence of such epitope-tagged forms of anti-TAT antibody or TAT polypeptide can be detected using an antibody against the tag polypeptide. Also, provision of the epitope tag allows the anti-TAT antibody or TAT polypeptide to be readily purified by affinity purification using an anti-tag antibody or another type of affinity matrix that binds to the epitope tag. . Various tag polypeptides and their respective antibodies are well known in the art. Examples are poly-histidine (poly-his) or poly-histidine-glycine (poly-his-gly) tag; flu HA tag polypeptide and its antibody 12CA5 [Field et al. Mol. Cell. Biol. , 8: 2159-2165 (1988)]; c-myc tag and 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 and 9E10 antibodies thereto [Evan et al. , Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; and herpes simplex virus glycoprotein D (gD) tag and its antibody [Paborsky et al. , Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]. Other tag polypeptides include Flag-peptide [Hopp et al. , BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; KT3 epitope peptide [Martin et al. , Science, 255: 192-194 (1992)]; α-tubulin epitope peptide [Skinner et al. , J .; Biol. Chem. 266: 15263-15166 (1991)]; and the T7 gene 10 protein peptide tag [Lutz-Freyermuth et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)].

別の具体例において、キメラ分子は、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドと、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合を含むことができる。（「免疫接着」とも言われる）キメラ分子の二価形態では、そのような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであろう。Ｉｇ融合は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりの抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの可溶性（膜貫通ドメイン欠失または不活化）形態の置換を含む。特に好ましい具体例において、免疫グロブリン融合はＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合の生成については、１９９５年６月２７日に発行された米国特許第５，４２８，１３０号も参照。 In another embodiment, the chimeric molecule can comprise a fusion of an anti-TAT antibody or TAT polypeptide with an immunoglobulin or a specific region of an immunoglobulin. In the bivalent form of the chimeric molecule (also referred to as “immunoadhesion”), such fusion would be to the Fc region of the IgG molecule. Ig fusion preferably includes substitution of a soluble (transmembrane domain deleted or inactivated) form of an anti-TAT antibody or TAT polypeptide in place of at least one variable region within the Ig molecule. In particularly preferred embodiments, the immunoglobulin fusion comprises the hinge, CH 2 and CH 3 , or hinge, CH 1 , CH 2 and CH 3 regions of an IgG1 molecule. See also US Pat. No. 5,428,130 issued June 27, 1995 for the generation of immunoglobulin fusions.

Ｉ．抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの調製
以下の記載は、主として、抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドをコードする核酸を含有するベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を培養することによる、抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの生産に関する。もちろん、当該分野で良く知られた別の方法を使用して、抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドを調製することができるのが考えられる。例えば、適当なアミノ酸配列またはその部分は、固相技術を用いる直接的ペプチド合成によって生産することができる［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）参照］。イン・ビトロ蛋白質合成は、手動技術を用い、または自動化によって行うことができる。自動合成は、例えば、製造業者の指示を用いるＡｐｐｌｅｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて達成することができる。抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの種々の部分は別々に化学的に合成し、化学的または酵素的方法を用いて組み合わせて、所望の抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドを生産することができる。 I. Preparation of Anti-TAT Antibodies and TAT Polypeptides The following description mainly describes anti-TAT antibodies and anti-TAT antibodies by culturing cells transformed or transfected with vectors containing nucleic acids encoding anti-TAT antibodies and TAT polypeptides. It relates to the production of TAT antibodies and TAT polypeptides. Of course, it is contemplated that other methods well known in the art can be used to prepare anti-TAT antibodies and TAT polypeptides. For example, a suitable amino acid sequence or portion thereof can be produced by direct peptide synthesis using solid phase techniques [see, eg, Stewart et al. , Solid-Phase Peptide Synthesis, W .; H. Freeman Co. San Francisco, CA (1969); Merrifield, J .; Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963)]. In vitro protein synthesis can be performed using manual techniques or by automation. Automated synthesis can be achieved, for example, using an Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) using manufacturer's instructions. Various portions of the anti-TAT antibody or TAT polypeptide can be chemically synthesized separately and combined using chemical or enzymatic methods to produce the desired anti-TAT antibody or TAT polypeptide.

１．抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡは、該−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドのｍＲＮＡを保有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒト−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドＤＮＡは、便宜には、ヒト組織から調製されたＤＮＡライブラリから得ることができる。該−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードする遺伝子は、ゲノムライブラリから、あるいは公知の合成手法（例えば、自動核酸合成）によって得ることもできる。 1. Isolation of DNA encoding anti-TAT antibody or TAT polypeptide DNA encoding anti-TAT antibody or TAT polypeptide carries mRNA of the -TAT antibody or TAT polypeptide and detects it at a detectable level. It can be obtained from a cDNA library prepared from tissues thought to be expressed. Accordingly, human-TAT antibody or TAT polypeptide DNA can be conveniently obtained from a DNA library prepared from human tissue. The gene encoding the -TAT antibody or TAT polypeptide can also be obtained from a genomic library or by a known synthesis method (for example, automatic nucleic acid synthesis).

ライブラリは、注目する遺伝子、またはそれによってコードされる蛋白質を同定するために形成された（少なくとも約２０ないし８０塩基のオリゴヌクレオチドのような）プローブでスクリーニングすることができる。選択されたプローブでのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリのスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されているような標準的な手法を用いて行うことができる。抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードする遺伝子を単離するための別の手段は、ＰＣＲ方法を用いることである［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）］
ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするための技術は当該分野で良く知られている。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、擬陽性を最小とするのに十分な長さおよび十分な非不明瞭性とすべきである。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、スクリーニングされるライブラリにおけるＤＮＡへのハイブリダイゼーションに際してそれを検出することができるように標識される。標識する方法は当該分野で良く知られており、３２Ｐ−標識ＡＴＰのような放射性標識、ビオチニル化または酵素標識の使用を含む。中程度のストリンジェンシーおよび高いストリンジェンシーを含めたハイブリダイゼーション条件はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａに供される。 The library can be screened with probes (such as oligonucleotides of at least about 20 to 80 bases) formed to identify the gene of interest, or the protein encoded thereby. Screening of cDNA or genomic libraries with selected probes is described by Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Another means for isolating genes encoding anti-TAT antibodies or TAT polypeptides is to use PCR methods [Sambrook et al. , Supra; Dieffenbach et al. , PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]
Techniques for screening cDNA libraries are well known in the art. The oligonucleotide sequence selected as the probe should be long enough and obscured enough to minimize false positives. The oligonucleotide is preferably labeled such that it can be detected upon hybridization to DNA in the library being screened. Methods of labeling are well known in the art and include the use of radioactive labels such as 32 P-labeled ATP, biotinylation or enzyme labeling. Hybridization conditions, including moderate and high stringency, are described in Sambrook et al. , Supplied to supra.

そのようなライブラリスクリーニング方法で同定された配列を比較し、ＧｅｎＢａｎｋのような公のデータベースまたは他の個人的な配列データベースに寄託され、そこで入手可能な他の公知の配列に対して整列させることができる。分子の規定された領域内の、または全長配列を横切っての（アミノ酸またはヌクレオチドレベルいずれかの）配列同一性は、当該分野で知られ、かつ本明細書中に記載された方法を用いて決定することができる。   Sequences identified by such library screening methods can be compared and aligned with other known sequences deposited and available in public databases such as GenBank or other personal sequence databases. it can. Sequence identity (either at the amino acid or nucleotide level) within a defined region of the molecule or across the full length sequence is determined using methods known in the art and described herein. can do.

蛋白質コーディング配列を有する核酸は、最初に本明細書中で開示された推定アミノ酸配列を用い、もし必要であれば、ｃＤＮＡへ逆転写することができないｍＲＮＡの前駆体およびプロセッシング中間体を検出するためのＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａのような慣用的なプライマー延長手法を用い、選択されたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリによって得ることができる。   Nucleic acids with protein coding sequences initially use the deduced amino acid sequences disclosed herein to detect precursors and processing intermediates of mRNA that cannot be reverse transcribed into cDNA, if necessary. Sambrook et al. , Supra, using conventional primer extension techniques, and can be obtained with a selected cDNA or genomic library.

２．宿主細胞の選択および形質転換
宿主細胞は、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド生産のための本明細書中に記載された発現またはクローニングベクターでトランスフェクトまたは形質転換し、プロモータを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適した修飾された慣用的な栄養培地中で培養する。培地、温度、ｐＨなどのような培養条件は、過度な実験なくして当業者によって選択され得る。一般に、細胞培養の生産性を最大とするための原理、プロトコルおよび実際的な技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ；ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，ｅｄ．（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａに見出すことができる。 2. Host Cell Selection and Transformation Host cells are transfected or transformed with the expression or cloning vectors described herein for production of anti-TAT antibodies or TAT polypeptides to induce promoters and transformations. The body is selected or cultured in a modified conventional nutrient medium suitable for amplifying the gene encoding the desired sequence. Culture conditions such as medium, temperature, pH, etc. can be selected by one skilled in the art without undue experimentation. In general, the principles, protocols and practical techniques for maximizing cell culture productivity are described in Mammalian Cell Biotechnology; a Practical Approach, M .; Butler, ed. (IRL Press, 1991) and Sambrook et al. , Supra.

真核生物細胞トランスフェクションおよび原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム−媒介およびエレクトポレーションは当業者に知られている。用いる宿主細胞に依存し、形質転換はそのような細胞に対して適当な標準的な技術を用いて行う。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａに記載された塩化カルシウムを使用するカルシウム処理、またはエレクトロポレーションは一般には原核生物で用いられる。Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２３：３１５（１９８３）および１９８９年６月２９日に公開されたＷＯ ８０／０５８５９によって記載されているように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓでの感染はある種の植物細胞の形質転換で用いられる。そのような細胞壁が無い哺乳動物細胞では、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿を使用することができる。哺乳動物細胞宿主系トランスフェクションの一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６に記載されている。酵母への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１３０：９４６（１９７７）およびＨｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７６：３８２９（１９７９）の方法に従って行われる。しかしながら、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷細胞との細菌プロトプラスト融合、またはポリカチオン、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンによるような、ＤＮＡを細胞に導入する他の方法を用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７−５３７（１９９０）およびＭａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２（１９８８）参照。 Eukaryotic cell transfection and prokaryotic methods of cell transformation, e.g., CaCl 2, CaPO 4, liposome - mediated and electroporation are known to those skilled in the art. Depending on the host cell used, transformation is done using standard techniques appropriate to such cells. Sambrook et al. , Supra, calcium treatment using calcium chloride, or electroporation is generally used in prokaryotes. Shaw et al. , Gene, 23: 315 (1983) and WO 80/05859 published June 29, 1989, infection with Agrobacterium tumefaciens is used in the transformation of certain plant cells. In mammalian cells without such cell walls, calcium phosphate precipitation of Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978) can be used. General aspects of mammalian cell host system transfection are described in US Pat. No. 4,399,216. Transformation into yeast is typically performed by Van Solingen et al. , J .; Bact. , 130: 946 (1977) and Hsiao et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). However, other methods of introducing DNA into cells, such as nuclear microinjection, electroporation, bacterial protoplast fusion with intact cells, or polycations such as polybrene, polyornithine can also be used. For various techniques for transforming mammalian cells, see Keown et al. , Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) and Mansour et al. , Nature, 336: 348-352 (1988).

ここに、ベクター中のＤＮＡをクローン化する、または発現するのに適した宿主細胞は原核生物、酵母、高等真核生物細胞を含む。適当な原核生物は、限定されるものではないが、グラム−陰性またはグラム−陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのようなＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのようなユーバクテリアを含む。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）；Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）およびＫ５ ７７２（ＡＴＣＣ ５３，６３５）のような種々のＥ．ｃｏｌｉ株が公に入手可能である。他の適当な原核生物宿主細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのようなＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのようなＢａｃｉｌｌｉ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ ２６６，７１０に開示されたＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ４１Ｐ）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのようなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含む。これらの例は限定的というよりはむしろ説明的である。株Ｗ３１１０は１つの特に好ましい宿主または親宿主である。なぜならばそれは、組換えＤＮＡ産物醗酵のための普通の宿主株だからである。好ましくは、宿主細胞は最小量の蛋白質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を修飾して、宿主に対して内因性の蛋白質をコードする遺伝子において遺伝的突然変異を行うことができ、そのような宿主の例は、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｋａｎｒを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ （ａｒｇＦ−ｌａｃ（１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ ｉｌｖＧ ｋａｎｒを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非−カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失突然変異を持つ株３７Ｄ６であるＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株４０Ｂ４；および１９９０年８月７日に発行された米国特許第４，９４６，７８３号に開示された突然変異体ペリプラズムプロテアーゼを有するＥ．ｃｏｌｉ株を含む。別法として、クローニングのイン・ビトロ方法、例えば、ＰＣＲまたは他の核酸ポリメラーゼ反応が適している。 Here, suitable host cells for cloning or expressing the DNA in the vector include prokaryotes, yeast, higher eukaryote cells. Suitable prokaryotes include but are not limited to gram-negative or gram-positive organisms such as E. coli. Eubacteria such as Enterobacteriaceae such as E. coli. E. E. coli K12 strain MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli strains W3110 (ATCC 27,325) and K5 772 (ATCC 53,635). coli strains are publicly available. Other suitable prokaryotic host cells are Escherichia, for example E. coli. Enterobacteriaceae such as E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, eg, Salmonella typhimurium, Serratia, eg, Serratia marcescans, and Shigella, subtilis and B.M. Bacilli such as L. licheniformis (for example, B. licheniformis 41P disclosed in DD 266,710 published on April 12, 1989), P. Includes Pseudomonas, such as aeruginosa, and Streptomyces. These examples are illustrative rather than limiting. Strain W3110 is one particularly preferred host or parent host. Because it is a common host strain for recombinant DNA product fermentation. Preferably, the host cell secretes a minimal amount of proteolytic enzyme. For example, strain W3110 can be modified to make a genetic mutation in a gene encoding a protein that is endogenous to the host, an example of such a host is E. coli having the complete genotype tonA. E. coli W3110 strain 1A2; E. coli having the complete genotype tonA ptr3. E. coli W3110 strain 9E4; E. coli having the complete genotype tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan r . E. coli W3110 strain 27C7 (ATCC 55,244); complete genotype tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac (169 degP ompT rbs7 ilvG kan r E. coli W3110 strain 37D6; non-kanamycin resistant degP deletion mutation) E. coli W3110 strain 40B4, which is strain 37D6, and E. coli strains having mutant periplasmic proteases disclosed in US Pat. No. 4,946,783 issued Aug. 7, 1990. Alternatively, in vitro methods of cloning, such as PCR or other nucleic acid polymerase reactions are suitable.

全長抗体、抗体断片、および抗体融合蛋白質は、特に、治療抗体が細胞傷害性剤（例えば、トキシン）に結合体化された場合のような、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要でない場合に、細菌で生産することができ、免疫結合体はそれ自体が腫瘍細胞破壊において効果を示す。全長抗体は、循環においてより大きな半減期を有する。Ｅ．ｃｏｌｉにおける生産はより速く、かつよりコストが効果的である。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、発現および分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）およびシグナル配列を記載する米国特許第５，６４８，２３７号（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，，７８９，１９９号（Ｊｏｌｙ ｅｔ ａｌ．）、および米国特許第５，８４０，５２３号（Ｓｉｍｍｎｌｓ ｅｔ ａｌ．）参照（これらの特許はここに引用して援用する）。発現の後、抗体は可溶性画分中のＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストから単離され、イソタイプに応じて、例えば、プロテインＡまたはＧカラムを通して精製することができる。最終的な精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現された抗体を精製するためのプロセスと同様に行うことができる。   Full length antibodies, antibody fragments, and antibody fusion proteins are particularly useful when glycosylation and Fc effector function are not required, such as when a therapeutic antibody is conjugated to a cytotoxic agent (eg, a toxin). The immunoconjugate itself has an effect in tumor cell destruction. Full-length antibodies have a greater half-life in circulation. E. production in E. coli is faster and more cost effective. For expression of antibody fragments and polypeptides in bacteria, see, for example, US Pat. No. 5,648,237 (Carter et al.) Which describes a translation initiation region (TIR) and signal sequence to optimize expression and secretion. U.S. Pat. No. 5,789,199 (Jolly et al.) And U.S. Pat. No. 5,840,523 (Symmnls et al.), Which are incorporated herein by reference. After expression, the antibody is isolated from E. coli in the soluble fraction. It can be isolated from E. coli cell paste and purified through, for example, a protein A or G column, depending on the isotype. Final purification can be performed, for example, similar to the process for purifying antibodies expressed in CHO cells.

原核生物に加えて、フィラメント状真菌または酵母のような真核生物微生物は、抗−ＴＡＴ抗体−またはＴＡＴポリペプチドをコードするベクターのための適当なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは通常に用いられる下等真核生物宿主微生物である。他の例はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ （Ｂｅａｃｈ ａｎｄ Ｎｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０［１９８１］；１９８５年５月２日に公開されたＥＰ １３９，３８３）；例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ （ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４（２）：７３７−７４２［１９８３］）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ （ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ （ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ （ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ （ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ （ＡＴＣＣ ３６，９０６；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０））、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓのようなＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１））；ｙａｒｒｏｗｉａ （ＥＰ ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ （ＥＰ １８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，；２８：２６５−２７８［１９８８］）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ （Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９−５２６３［１９７９］）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓのようなＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ （１９９０年１０月３１日に公開されたＥＰ ３９４，５３８）；および例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ （１９９１年１月１０日公開されたＷＯ ９１／００３５７）、およびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓのようなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４−２８９［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２６：２０５−２２１［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１４７０−１４７４［１９８４］）およびＡ．ｎｉｇｅｒ（Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．，４：４７５−４７９［１９８５］）のようなフィラメント状真菌を含む。メチロ向性酵母がここでは適当であり、限定されるものではないが、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、およびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａよりなる属から選択されるメチロールでの増殖が可能な酵母を含む。このクラスの酵母の例である具体的な種のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｙｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）に見出すことができる。   In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are suitable cloning or expression hosts for anti-TAT antibody- or TAT polypeptide-encoding vectors. Saccharomyces cerevisiae is a commonly used lower eukaryotic host microorganism. Other examples are Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 published May 2, 1985); lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154 (2): 737-742 [1983]), K. et al. fragilis (ATCC 12,424), K.M. bulgaricus (ATCC 16,045), K. et al. wickeramii (ATCC 24,178), K.K. waltii (ATCC 56,500), K.M. Drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio / Technology, 8: 135 (1990)), K. et al. thermotolerans, and K.K. Kluyveromyces hosts such as marxianus (US Pat. No. 4,943,529; Freer et al., Bio / Technology, 9: 968-975 (1991)); yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183, 070; Sleekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244, 234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. USA, 76: 5259-5263 [1979]); of Schwannomycines occidentalis. Schwannomices (EP 394,538 published October 31, 1990); and, for example, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 published January 10, 1991), and Aspergillus hosts such as Nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) and A.M. filamentous fungi such as niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]). Methylotrophic yeast is suitable here and includes, but is not limited to, yeast capable of growing on methylol selected from the genera consisting of Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, and Rhodotorula . A list of specific species that are examples of this class of yeast is C.I. Anthony, The Biochemistry of Methyltrophs, 269 (1982).

グリコシル化抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９のような昆虫細胞、ならびに綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマトおよびタバコの細胞培養のような植物細胞を含む。多数のバキュロウイルス株および変種、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （青虫）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｔｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉのような宿主からの対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１変種、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株が公に入手可能であり、そのようなウイルスは、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従って、ここではウイルスとして用いることができる。   Suitable host cells for the expression of glycosylated anti-TAT antibody or TAT polypeptide are derived from multicellular organisms. Examples of invertebrate cells include insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9, and plant cells such as cotton, corn, potato, soybean, petunia, tomato and tobacco cell cultures. Numerous baculovirus strains and variants, as well as host cells of Bombyx, such as Spodoptera frugiperda (mosquito), Aedes aegypti (mosquito), Aets albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (Drosophila) and corresponding host of Bombyx cells Have been identified. Various virus strains for transfection are publicly available, such as the L-1 variant of Autographa californica NPV, and the Bm-5 strain of Bombyx mori NPV, such viruses are notably available in Spodoptera frugiperda cells. For transfection, according to the invention, it can be used here as a virus.

しかしながら、脊椎動物細胞において興味は最大であり、培養（組織培養）での脊椎動物細胞での増殖はルーチン的な手法となった。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓系（懸濁培養での増殖のためにサブクローンされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベイビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスｓｅｒｔｏｌｉ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚癌腫細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳頭腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝臓腫系（Ｈｅｐ Ｇ２）である。   However, interest has been greatest in vertebrate cells, and propagation in vertebrate cells in culture (tissue culture) has become a routine procedure. Examples of useful mammalian host cell lines are monkey kidney CV1 transformed with SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); human embryonic kidney system (293 subcloned for growth in suspension culture or 293 cells, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); Baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL10); Acad.Sci.USA 77: 4216 (1980)); mouse sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL70); (VERO-76, ATCC CRL-1587); human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2); canine kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34); buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442); human lung cells (W138, ATCC CCL75); human liver cells (Hep G2, HB 8065); mouse papillary tumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI cells (Mother et al., Anals NY Acad. Sci. 383: 44-). 68 (1982)); MRC 5 cells; FS4 cells; and the human hepatoma line (Hep G2).

宿主細胞は、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド生産のための前記した発現またはクローニングベクターで形質転換し、プロモータを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修飾された慣用的な栄養培地中で培養する。   Host cells are transformed with the expression or cloning vectors described above for the production of anti-TAT antibodies or TAT polypeptides, induce promoters, select for transformants, or amplify genes encoding the desired sequences. In order to do so, it is cultured in a conventional nutrient medium appropriately modified.

３．複製可能なベクターの選択および使用
抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を、クローニング（ＤＮＡの増幅）のための、または発現のための複製可能なベクターに挿入することができる。種々のベクターは公に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子またはファージの形態とすることができる。適当な核酸配列は、種々の手法によってベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡは、当該分野で公知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクターの成分は、一般には、限定されるものではないが、シグナル配列、複製起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモータ、および転写終止配列のうちの１以上を含む。これらの成分の１以上を含有する適当なベクターの構築は、当業者に知られた標準的な連結技術を使用する。 3. Selection and use of replicable vectors A nucleic acid (eg, cDNA or genomic DNA) encoding an anti-TAT antibody or TAT polypeptide is made into a replicable vector for cloning (amplification of DNA) or for expression. Can be inserted. Various vectors are publicly available. The vector can be, for example, in the form of a plasmid, cosmid, viral particle or phage. The appropriate nucleic acid sequence can be inserted into the vector by a variety of techniques. In general, DNA is inserted into an appropriate restriction endonuclease site using techniques known in the art. The components of the vector generally include, but are not limited to, one or more of a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. Construction of suitable vectors containing one or more of these components uses standard ligation techniques known to those skilled in the art.

ＴＡＴは、直接的のみならず、成熟蛋白質またはポリペプチドのＮ−末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドであり得る、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生産することができる。一般に、シグナル配列はベクターの成分であってよく、あるいはそれは、ベクターに挿入される抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡの一部であり得る。シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母分泌では、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ α−因子リーダーを含めた；後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）アルファ因子リーダー、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日に公開されたＥＰ ３６２，１７９）、または１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ ９０／１３６４６に記載されたシグナルでありえる。哺乳動物細胞発現では、同一または関連種の分泌されたポリペプチドからのシグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダーのような、哺乳動物シグナル配列を用いて、蛋白質の分泌を指令することができる。   TAT is produced not only directly, but also as a fusion polypeptide with a heterologous polypeptide, which can be a signal sequence or other polypeptide having a specific cleavage site at the N-terminus of the mature protein or polypeptide. Can do. In general, the signal sequence may be a component of the vector, or it may be a part of the DNA encoding the anti-TAT antibody or TAT polypeptide that is inserted into the vector. The signal sequence may be, for example, a prokaryotic signal sequence selected from the group of alkaline phosphatase, penicillinase, lpp, or thermostable enterotoxin II leader. For yeast secretion, the signal sequence can be, for example, a yeast invertase leader, an alpha factor leader (including Saccharomyces and Kluyveromyces alpha-factor leader; the latter is described in US Pat. No. 5,010,182), or acid phosphatase Leader, C.I. It may be the signal described in the albicans glucoamylase leader (EP 362,179 published April 4, 1990) or in WO 90/13646 published November 15, 1990. In mammalian cell expression, signal sequences from secreted polypeptides of the same or related species, as well as mammalian signal sequences, such as viral secretion leaders, can be used to direct protein secretion.

発現およびクローニングベクターは、該ベクターが１以上の選択された宿主細胞において複製できるようにする核酸配列を含む。そのような配列は種々の細菌、酵母およびウイルスでよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点はほとんどのグラム−陰性菌で適当であり２μプラスミド起点は酵母で適当であり、および種々のウイルスの起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターで有用である。   Expression and cloning vectors contain a nucleic acid sequence that enables the vector to replicate in one or more selected host cells. Such sequences are well known in a variety of bacteria, yeast and viruses. The origin of replication from plasmid pBR322 is appropriate for most gram-negative bacteria, the 2μ plasmid origin is appropriate for yeast, and the origins of the various viruses (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) are found in mammalian cells. Useful in cloning vectors.

発現およびクローニングベクターは、典型的には、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有するであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、または（ｃ）複合培地から利用できない臨界的な栄養素を供給する蛋白質をコードする。例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子。   Expression and cloning vectors will typically contain a selection gene, also termed a selectable marker. Typical selection genes confer resistance to (a) antibiotics or other toxins such as ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline, (b) compensate for auxotrophic defects, or (c) utilize from complex media It encodes a protein that supplies critical nutrients that cannot. For example, the gene encoding D-alanine racemase for Bacilli.

哺乳動物細胞のための適当な選択マーカーの例は、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼのような、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードする核酸を取る能力がある細胞の同定を可能とするものである。野生型ＤＨＦＲを使用する場合、適当な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）によって記載されているように調製し、増殖させた、ＤＨＦＲ活性が欠乏したＣＨＯ細胞系である。酵母で用いられる適当な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するＴＲＰ遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９ （１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異体株のための選択マーカーを提供する。例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１［Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）］。   Examples of suitable selectable markers for mammalian cells are those that allow the identification of cells capable of taking up nucleic acids encoding anti-TAT antibodies or TAT polypeptides, such as DHFR or thymidine kinase. When wild type DHFR is used, suitable host cells are described in Urlaub et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980), a CHO cell line deficient in DHFR activity, prepared and expanded. A suitable selection gene for use in yeast is the TRP gene present in the yeast plasmid YRp7 [Stinchcomb et al. , Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al. Gene, 7: 141 (1979); Tschemer et al. Gene, 10: 157 (1980)]. The trp1 gene provides a selectable marker for mutant strains of yeast lacking the ability to grow in tryptophan. For example, ATCC No. 44076 or PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

発現およびクローニングベクターは、通常、ｍＲＮＡ合成を指令するための、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードする核酸配列に操作可能に連結されたプロモータを含有する。種々の潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータはよく知られている。原核生物宿主で用いるのに適したプロモータは、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモータ系［Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９）］、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；ＥＰ ３６，７７６］、ｔａｃプロモータのようなハイブリッドプロモータ［ｄｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３）］を含む。細菌系で用いられるプロモータは、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡに操作可能に連結されたシャイン−ダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有するであろう。   Expression and cloning vectors usually contain a promoter operably linked to the nucleic acid sequence encoding the anti-TAT antibody or TAT polypeptide to direct mRNA synthesis. Promoters recognized by a variety of potential host cells are well known. Suitable promoters for use in prokaryotic hosts include the β-lactamase and lactose promoter systems [Chang et al. , Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al. , Nature, 281: 544 (1979)], alkaline phosphatase, tryptophan (trp) promoter system [Goeddel, Nucleic Acids Res. , 8: 4057 (1980); EP 36,776], hybrid promoters such as the tac promoter [deBoer et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)]. Promoters used in bacterial systems will contain a Shine-Dalgarno (SD) sequence operably linked to the DNA encoding the anti-TAT antibody or TAT polypeptide.

酵母宿主で用いられる適当な促進配列の例は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３（１９８０）］、あるいはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような他の解糖系［Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．，７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００（１９７８）］についてのプロモータを含む。   Examples of suitable facilitating sequences for use in yeast hosts include 3-phosphoglycerate kinase [Hitzeman et al. , J .; Biol. Chem. , 255: 2073 (1980)], or enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate Other glycolytic systems such as kinases, triosephosphate isomerase, phosphoglucose isomerase, and glucokinase [Hess et al. , J .; Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)].

増殖条件によって制御される転写の更なる利点を有する誘導性プロモータである他の酵母プロモータは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタルチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース資化を担う酵素についてのプロモータ領域である。酵母発現で用いる適当なベクターおよびプロモータは、さらに、ＥＰ ７３，６５７に記載されている。   Other yeast promoters, which are inducible promoters with the additional advantage of transcription controlled by growth conditions, include alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, degradation enzymes related to nitrogen metabolism, metalthionein, glyceraldehyde Promoter region for -3-phosphate dehydrogenase, and enzymes responsible for maltose and galactose utilization. Suitable vectors and promoters for use in yeast expression are further described in EP 73,657.

哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開されたＵＫ ２，２１１，５０４）、（アデノウイルス２のような）アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモータ、例えば、アクチンプロモータまたは免疫グロブリンプロモータから、および熱ショックから得られたプロモータによって制御され、但し、そのようなプロモータは宿主細胞系に適合するものとする。   Transcription of anti-TAT antibody or TAT polypeptide from a vector in mammalian host cells can be performed, for example, by polyomavirus, fowlpox virus (UK 2,211,504 published July 5, 1989), (adenovirus). 2) from the genomes of viruses such as adenovirus, bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, hepatitis B virus and simian virus 40 (SV40), eg heterologous mammalian promoters such as actin Controlled by a promoter or immunoglobulin promoter and by a promoter derived from heat shock, provided that such promoter is compatible with the host cell system.

高等真核生物による抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加させることができる。エンハンサーは、プロモータに作用してその転写を増大させる、通常は約１０ないし３００ｐｐのＤＮＡのシス−作用性エレメントである。多くのエンハンサー配列が、今日、哺乳動物遺伝子から知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）。しかしながら、典型的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを用いるであろう。その例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ １００ないし２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモータ、エンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。エンハンサーは抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドコーディング配列に対して５’または３’側の位置においてベクターにスプライスできるが、好ましくは、プロモータから５’側の部位に位置する。   Transcription of DNA encoding an anti-TAT antibody or TAT polypeptide by higher eukaryotes can be increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers are cis-acting elements of DNA, usually about 10 to 300 pp, that act on a promoter to increase its transcription. Many enhancer sequences are known today from mammalian genes (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin). Typically, however, one will use an enhancer from a eukaryotic cell virus. Examples include the late SV40 enhancer (bp 100-270) of the origin of replication, the cytomegalovirus early promoter, enhancer, the polyoma enhancer and the adenovirus enhancer of the late origin of replication. Enhancers can be spliced into the vector at a position 5 'or 3' to the anti-TAT antibody or TAT polypeptide coding sequence, but are preferably located 5 'to the promoter.

真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞）で用いられる発現ベクターもまた、転写の終止に、およびｍＲＮＡを安定化するのに必要な配列を含有するであろう。そのような配列は、通常、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および、場合によっては、３’非翻訳領域から入手できる。これらの領域は、抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。   Expression vectors used in eukaryotic host cells (nucleated cells from yeast, fungi, insects, plants, animals, humans, or other multicellular organisms) also stabilize transcription and terminate mRNA. Will contain the necessary sequences. Such sequences are usually available from the 5 'and optionally 3' untranslated region of eukaryotic or viral DNA or cDNA. These regions contain nucleotide segments that are transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated portion of the mRNA encoding the anti-TAT antibody or TAT polypeptide.

組換え脊椎動物細胞培養において抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの合成に対する適合に適したなお他の方法、ベクターおよび宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６（１９７９）；ＥＰ １１７，０６０；およびＥＰ １１７，０５８に記載されている。   Still other methods, vectors and host cells suitable for adaptation to the synthesis of anti-TAT antibodies or TAT polypeptides in recombinant vertebrate cell culture are described in Gething et al. , Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al. , Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117,060; and EP 117,058.

４．宿主細胞の培養
本発明の抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドを生産するのに用いる宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。ハムのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ））、およびダルベッコの修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）のような商業的に入手可能な培地は、宿主細胞を培養するのに適している。加えて、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；または第５，１２２，４６９号；ＷＯ ９０／０３４３０；ＷＯ ８７／００１９５；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載された培地のいずれも、宿主細胞のための培養基として用いることができる。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／または（インスリン、トランスフェリン、または表皮成長因子のような）他の成長因子、（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェートのような）塩、（ＨＥＰＥＳのような）緩衝液、（アデノシンおよびチミジンのような）ヌクレオチド、（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ薬物のような）抗生物質、（マイクロモラー範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物と定義される）微量元素、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補強することができる。いずれの他の必要な補充物も、当業者によく知られた適当な濃度で含めることもできる。温度、ｐＨ等のような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で従前用いられたものであり、当業者に明らかであろう。 4). Host Cell Culture Host cells used to produce anti-TAT antibodies or TAT polypeptides of the present invention can be cultured in a variety of media. Commercially available media such as Ham's F10 (Sigma), Minimum Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma)), and Dulbecco's Modified Eagle Medium ((DMEM), Sigma) Is suitable for culturing host cells. In addition, Ham et al. , Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al. , Anal. Biochem. 102: 255 (1980), U.S. Pat. No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; or 5,122,469; Any of the media described in WO 90/03430; WO 87/00195; or US Reissue Patent 30,985 can be used as a culture medium for host cells. Any of these media may optionally contain hormones and / or other growth factors (such as insulin, transferrin, or epidermal growth factor), salts (such as sodium chloride, calcium, magnesium and phosphate), ( Buffers (such as HEPES), nucleotides (such as adenosine and thymidine), antibiotics (such as GENTAMYCIN ™ drugs), trace elements (defined as inorganic compounds normally present at final concentrations in the micromolar range) , And glucose or an equivalent energy source. Any other necessary supplements may also be included at appropriate concentrations that are well known to those skilled in the art. Culture conditions such as temperature, pH, etc. are those previously used in the host cell selected for expression and will be apparent to those skilled in the art.

５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅および／または発現は、例えば、慣用的な本明細書中に供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用いる、慣用的なサザンブロッティングｍＲＮＡの転写を低了するためのノーザンブロッティング［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはイン・サイチュハイブリダイゼーションによって直接的に試料中で測定することができる。別法として、ＤＮＡデュプレックス、ＲＮＡデュプレックス、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドデュプレックス、またはＤＮＡ−蛋白質デュプレックスを含めた、特異的デュプレックスを認識することができる抗体を使用することができる。該抗体は、今度は、標識することができ、アッセイを行うことができ、そこでは、表面でのデュプレックスの形成に際して、デュプレックスに結合した抗体の存在を検出することができるように、デュプレックスを表面に結合させる。 5. Gene Amplification / Expression Detection Gene amplification and / or expression can be performed, for example, by transcription of conventional Southern blotting mRNA using appropriately labeled probes based on conventional sequences provided herein. Northern blotting for completion [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)], dot blotting (DNA analysis), or in situ hybridization. Alternatively, antibodies capable of recognizing specific duplexes, including DNA duplex, RNA duplex, DNA-RNA hybrid duplex, or DNA-protein duplex can be used. The antibody can now be labeled and assayed where the duplex is surfaced so that upon the duplex formation on the surface, the presence of the antibody bound to the duplex can be detected. To join.

別法として、遺伝子発現は、細胞または組織セクションの免疫組織化学的染色、および細胞培養または体液のアッセイのような免疫学的方法によって測定して、遺伝子産物の発現を直接的に定量することができる。試料流体の免疫組織化学的染色および／またはアッセイで有用な抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであってよく、いずれかの哺乳動物で調製することができる。便宜には、抗体は、天然配列ＴＡＴポリペプチドに対して、あるいは本明細書中で提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、あるいはＴＡＴ ＤＮＡに融合し、かつ特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製することができる。   Alternatively, gene expression can be measured directly by immunohistochemical staining of cells or tissue sections and immunological methods such as cell culture or body fluid assays to directly quantify gene product expression. it can. Antibodies useful in immunohistochemical staining and / or assays of sample fluids can be monoclonal or polyclonal and can be prepared in any mammal. Conveniently, the antibody is fused to the native sequence TAT polypeptide or to a synthetic peptide based on the DNA sequences provided herein, or to TAT DNA and encodes a specific antibody epitope. Can be prepared against exogenous sequences.

６．抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの精製
抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの形態は、培養基から、または宿主細胞溶解物から回収することができる。もし膜に結合すれば、それは、適当な洗剤溶液（例えば、トリトン−Ｘ１００）を用い、あるいは酵素切断によって膜から放出させることができる。抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの発現で使用される細胞は、凍結−解凍サイクリング、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤のような種々の物理的または化学的手段によって破壊することができる。 6). Purification of anti-TAT antibodies and TAT polypeptides Anti-TAT antibody and TAT polypeptide forms can be recovered from the culture medium or from host cell lysates. If bound to the membrane, it can be released from the membrane using a suitable detergent solution (eg, Triton-X100) or by enzymatic cleavage. Cells used for the expression of anti-TAT antibodies and TAT polypeptides can be disrupted by various physical or chemical means such as freeze-thaw cycling, sonication, mechanical disruption, or cytolytic agents. .

組換え細胞蛋白質またはポリペプチドから抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドを精製するのが望ましいであろう。以下の手法は適当な精製手法の例である：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ、またはＤＥＡＥのようなカチオン−交換樹脂でのクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除去するためのプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム；および抗−ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドのエピトープ−タグド形態に結合するための金属キレート化カラム。蛋白質精製の種々の方法を使用することができ、そのような方法は当該分野で知られており、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載されている。選択された精製工程は、例えば、用いる生産プロセスの性質および生産される特定の抗−ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドに依存するであろう。   It may be desirable to purify anti-TAT antibodies and TAT polypeptides from recombinant cell proteins or polypeptides. The following procedures are examples of suitable purification procedures: fractionation on ion exchange columns; ethanol precipitation; reverse phase HPLC; chromatography on cation-exchange resins such as silica or DEAE; isoelectric focusing; SDS-PAGE; ammonium sulfate precipitation; eg gel filtration using Sephadex G-75; Protein A Sepharose column to remove contaminants such as IgG; and bind to epitope-tagged forms of anti-TAT antibodies and TAT polypeptides Metal chelation column for Various methods of protein purification can be used, and such methods are known in the art, for example, Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer- Verlag, New York (1982). The purification step selected will depend, for example, on the nature of the production process used and the particular anti-TAT antibody or TAT polypeptide produced.

組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内に、ペリプラズム空間へ生産することができるか、あるいは直接的に培地に分泌させることができる。もし抗体が細胞内で生産されれば、最初の工程として、宿主細胞または溶解された断片いずれかの粒状デブリスは、例えば、遠心または限外濾過によって除去されるＣａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手法を記載する。簡単に述べれば、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）ＥＤＴＡ、およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で細胞ペーストを３０分間にわたって解凍する。細胞デブリスは遠心によって除去することができる。抗体を培地に分泌させる場合、そのような発現系からの上清は、一般には、まず、商業的に入手可能な蛋白質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮させる。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤をこれまでの工程のいずれかに含ませて、蛋白質分解を阻害することができ、抗体を含ませて、不慮の汚染物の成長を妨げることができる。   When using recombinant techniques, the antibody can be produced intracellularly, into the periplasmic space, or directly secreted into the medium. If the antibody is produced intracellularly, as a first step, particulate debris, either host cells or lysed fragments, is removed, for example, by centrifugation or ultrafiltration Carter et al. Bio / Technology 10: 163-167 (1992). A procedure for isolating antibodies secreted into the periplasmic space of E. coli is described. Briefly, the cell paste is thawed for 30 minutes in the presence of sodium acetate (pH 3.5) EDTA and phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). Cell debris can be removed by centrifugation. When the antibody is secreted into the medium, the supernatant from such an expression system is generally first concentrated using a commercially available protein concentration filter, such as an Amicon or Millipore Pellicon ultrafiltration unit. Protease inhibitors such as PMSF can be included in any of the previous steps to inhibit proteolysis and antibodies can be included to prevent inadvertent contaminant growth.

細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーは好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適当性は、抗体に存在するいずれかの免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソタイプに依存する。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスのイソタイプについておよびヒトγ３について推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７−１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドが付着されるマトリックスは最もしばしばはアガロースであるが、他のマトリックスは利用可能である。制御されたポアのガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成することができるよりも速い流速および短い処理時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂｅｒｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）は精製で有用である。イオン交換カラム、エタノールでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、（ポリアスパラギン酸カラムのような）アニオンまたはカチオン交換樹脂でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿のような蛋白質精製のための他の技術も回収すべき抗体に応じて利用できる。 Antibody compositions prepared from cells can be purified using, for example, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, and affinity chromatography, with affinity chromatography being a preferred purification technique. The suitability of protein A as an affinity ligand depends on the species and isotype of any immunoglobulin Fc domain that is present in the antibody. Protein A can be used to purify antibodies based on human γ1, γ2, or γ4 heavy chains (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Protein G is recommended for all mouse isotypes and for human γ3 (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). The matrix to which the affinity ligand is attached is most often agarose, but other matrices are available. Mechanically stable matrices such as controlled pore glass or poly (styrenedivinyl) benzene allow for faster flow rates and shorter processing times than can be achieved with agarose. Berkerbond ABX ™ resin (JT Baker, Phillipsburg, NJ) is useful for purification when the antibody contains a C H 3 domain. Ion exchange column, fractionation with ethanol, ethanol precipitation, reverse phase HPLC, chromatography on silica, chromatography on heparin, SEPHAROSE ™ chromatography on anion or cation exchange resin (such as polyaspartic acid column), Other techniques for protein purification such as isoelectric focusing, SDS-PAGE and ammonium sulfate precipitation can also be used depending on the antibody to be recovered.

いずれかの予備的な精製工程に続いて、注目する抗体および汚染物を含むマトリックスを、低塩濃度（例えば、約０ないし０．２５Ｍ塩）で好ましくは行われる、約２．５ないし４．５の間のｐＨで溶出緩衝液を用いる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに付すことができる。
Ｊ．医薬処方
本発明に従って用いられる抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ ｓｉＲＮＡ、ＴＡＴ結合有機分子および／またはＴＡＴポリペプチドの治療処方は、凍結乾燥処方または水溶液の形態にて、所望の程度の純度を有する抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を任意の薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって貯蔵用に調製される。受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は使用する用量および濃度において受容者に対して非毒性であり、酢酸塩、トリス、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンのようなアラキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールのような）保存剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのような蛋白質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含めた単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；トレハロースおよび塩化ナトリウムのような等張剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖；ポリソルベートのような界面活性剤；ナトリウムのような塩−形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−蛋白質錯体）および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非−イオン性界面活性剤を含む。該抗体は、好ましくは、５ないし２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ないし１００ｍｇ／ｍｌの間の濃度の抗体を含む。 Following any preliminary purification steps, the matrix containing the antibody of interest and contaminants is preferably performed at a low salt concentration (eg, about 0 to 0.25 M salt), about 2.5 to 4. Can be subjected to low pH hydrophobic interaction chromatography with elution buffer at a pH between 5.
J. et al. Pharmaceutical Formulations The therapeutic formulations of anti-TAT antibodies, TAT binding oligopeptides, TAT siRNAs, TAT binding organic molecules and / or TAT polypeptides used according to the present invention may be of the desired degree of purity in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions. An antibody, polypeptide, oligopeptide, siRNA or organic molecule having any pharmaceutically acceptable carrier, excipient or stabilizer (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) ) To prepare for storage. Acceptable carriers, excipients or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations used, and buffers such as acetate, tris, phosphate, citrate and other organic acids Liquid; antioxidants including ascorbic acid and methionine; (octadecyldimethylbenzylammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; aralkyl parabens such as methyl or propylparaben Catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol) preservative; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide; protein such as serum albumin, gelatin or immunoglobulin; polyvinylpyrrolidone; Like hydrophilic Amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose or dextrin; chelating agents such as EDTA; such as trehalose and sodium chloride Isotonic agents; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; surfactants such as polysorbates; salt-forming counterions such as sodium; metal complexes (eg Zn-protein complexes) and / or TWEEN® (Trademark), PLURONICS® or non-ionic surfactants such as polyethylene glycol (PEG). Said antibody preferably comprises an antibody at a concentration between 5 and 200 mg / ml, preferably between 10 and 100 mg / ml.

ここに、処方は、必要に応じて、治療すべき特定の症状のための１を超える活性化合物、好ましくは、相互に悪影響しない補充的活性を持つものを含有することもできる。例えば、抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ ｓｉＲＮＡまたはＴＡＴ結合有機分子に加えて、１つの処方に、さらなる抗体、例えば、ＴＡＴ抗体上の異なるエピトープに結合する第二の抗−ＴＡＴ抗体、または特定の癌の成長に影響する成長因子のようなある他の標的に対する抗体を含むのが望ましいであろう。別法として、あるいは加えて、組成物は、さらに、化学療法剤、細胞傷害性剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗−ホルモン剤、および／または心臓保護剤を含めることができる。そのような分子は、適切には、意図する目的で有効な量で組み合わせて存在させる。   Here, the formulations may also contain more than one active compound for the particular condition to be treated, if desired, preferably those with supplementary activities that do not adversely affect each other. For example, in addition to an anti-TAT antibody, TAT-binding oligopeptide, TAT siRNA or TAT-binding organic molecule, one formulation can include additional antibodies, eg, a second anti-TAT antibody that binds to a different epitope on the TAT antibody, Alternatively, it may be desirable to include antibodies against certain other targets such as growth factors that affect the growth of a particular cancer. Alternatively or additionally, the composition can further include a chemotherapeutic agent, cytotoxic agent, cytokine, growth inhibitory agent, anti-hormonal agent, and / or cardioprotective agent. Such molecules are suitably present in combination in amounts that are effective for the purpose intended.

有効成分は、例えば、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマイクロエマルジョンにおいて、各々、コアセルベーション技術によって、または界面重合、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルによって調製されるマイクロカプセル中に捕獲することもできる。そのような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。   The active ingredients are for example in colloidal drug delivery systems (e.g. liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or in microemulsions, respectively, by coacervation techniques or by interfacial polymerization, e.g. It can also be encapsulated in microcapsules prepared by hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly- (methyl methacrylate) microcapsules. Such techniques are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. et al. Ed. (1980).

維持−放出製剤を調製することができる。維持−放出製剤の適当な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは成型製品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。維持−放出マトリックスの例はポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非−分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリド酢酸より成る注射マイクロスフィア）のような分解性乳酸−グリコール酸子ポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。   Sustained-release formulations can be prepared. Suitable examples of sustained-release formulations include a semi-permeable matrix of solid hydrophobic polymer containing antibodies, which matrix is in the form of a molded product, such as a film or microcapsule. Examples of sustained-release matrices are polyesters, hydrogels (eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) or poly (vinyl alcohol)), polylactides (US Pat. No. 3,773,919), L-glutamic acid and gamma ethyl. Degradable lactic acid-glycolic acid polymers such as copolymers of L-glutamate, non-degradable ethylene-vinyl acetate, LUPRON DEPOT® (injection microspheres consisting of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetic acid), and Poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid is included.

イン・ビボ投与で用いるべき処方は滅菌されなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
Ｋ．抗−ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ ｓｉＲＮＡおよびＴＡＴ結合有機分子での診断および治療
癌におけるＴＡＴ発現を測定するためには種々の診断アッセイが利用できる。１つの具体例において、ＴＡＴポリペプチド過剰発現は免疫組織化学（ＩＨＣ）によって分析することができる。腫瘍バイオプシーからのパラフィン包埋組織セクションをＩＨＣアッセイに付し、以下のようにＴＡＴ蛋白質染色強度基準に従うことができる：
スコア０−染色は観察されず、または膜染色は腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋−弱い／辛うじて認識できる膜染色が腫瘍細胞の１０％を超えて検出される。細胞はその膜の一部分に染色されるに過ぎない。
スコア２＋−弱いないし中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を超えて観察される。
スコア３＋−中程度ないし強力な完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を超えて観察される。 Formulations to be used for in vivo administration must be sterilized. This is easily accomplished by filtration through sterile filtration membranes.
K. Diagnosis and treatment with anti-TAT antibodies, TAT binding oligopeptides, TAT siRNA and TAT binding organic molecules Various diagnostic assays are available to measure TAT expression in cancer. In one embodiment, TAT polypeptide overexpression can be analyzed by immunohistochemistry (IHC). Paraffin-embedded tissue sections from tumor biopsies can be subjected to IHC assay and follow the TAT protein staining intensity criteria as follows:
Score 0-no staining is observed, or membrane staining is observed in less than 10% of the tumor cells.
Score 1 + —weak / barely recognizable membrane staining is detected in more than 10% of the tumor cells. The cells are only stained on a portion of the membrane.
Score 2 + —weak to moderate complete membrane staining is observed in more than 10% of the tumor cells.
Score 3 + -moderate to strong complete membrane staining is observed in more than 10% of the tumor cells.

ＴＡＴポリペプチド発現につき０または１＋スコアを持つ腫瘍はＴＡＴを過剰発現しないと特徴付けることができ、他方、２＋または３＋スコアを持つ腫瘍はＴＡＴを過剰発現すると特徴付けることができる。   Tumors with a 0 or 1+ score for TAT polypeptide expression can be characterized as not overexpressing TAT, whereas tumors with a 2+ or 3+ score can be characterized as overexpressing TAT.

別法として、あるいは加えて、（Ｖｅｎｔａｎａ，Ａｒｉｚｏｎａによって販売される）ＩＮＦＯＲＭ（登録商標）またはＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（登録商標）（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）のようなＦＩＳＨアッセイをホルマリン−固定、パラフィン−包埋腫瘍組織で行って、腫瘍におけるＴＡＴ過剰発現の程度（もしあれば）を決定することができる。   Alternatively or in addition, FISH assays such as INFORMATION® or PATHVISION® (Vysis, Illinois) (sold by Ventana, Arizona) can be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tumor tissue. Performed to determine the extent of TAT overexpression (if any) in the tumor.

ＴＡＴ過剰発現または増幅は、イン・ビボ診断アッセイを用い、例えば、分子に結合して検出され、かつ検出可能な標識（例えば、放射性同位体または蛍光標識）のタグを付した（抗体、オリゴペプチドまたは有機分子のような）分子を投与し標識の場所について患者を外部からスキャンすることによって評価することができる。   TAT overexpression or amplification is detected using an in vivo diagnostic assay, eg, bound to a molecule and tagged with a detectable label (eg, radioisotope or fluorescent label) (antibody, oligopeptide Alternatively, molecules (such as organic molecules) can be administered and evaluated by scanning the patient externally for the location of the label.

前記したように、本発明の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドおよび有機分子は種々の非−治療適用を有する。本発明の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドおよび有機分子は、（例えば、放射性イメージングにおいて）ＴＡＴポリペプチド−発現癌の診断およびステージ決定に有用であり得る。該抗体、オリゴペプチドおよび有機分子は、他の細胞の精製における工程として混合細胞の集団からＴＡＴ−発現細胞を死滅させ、それを排除するための、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにおける、細胞からのＴＡＴポリペプチドの精製または免疫沈澱で、イン・ビトロでのＴＡＴポリペプチドの検出および定量でやはり有用である。   As noted above, the anti-TAT antibodies, oligopeptides and organic molecules of the present invention have various non-therapeutic applications. The anti-TAT antibodies, oligopeptides and organic molecules of the present invention may be useful for diagnosis and staging of TAT polypeptide-expressing cancers (eg, in radioimaging). The antibodies, oligopeptides and organic molecules can be used to kill and eliminate TAT-expressing cells from a population of mixed cells as a step in the purification of other cells, eg, in ELISA or Western blot, from cells. It is also useful for the purification and immunoprecipitation of polypeptides and for the detection and quantification of TAT polypeptides in vitro.

現在、癌のステージに依存して、癌の治療は以下の療法：癌性組織を除去するための外科的処置、放射線療法、および化学療法のうちの一つ、またはその組み合わせを含む。抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子療法は、化学療法の毒性および副作用をよく許容しない老人患者、または放射線療法が制限された有用性を有する転移性病気で特に望ましいであろう。本発明の腫瘍標的化抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡおよび有機分子は、病気の最初の診断に際して、または再発の間にＴＡＴ−発現癌を軽減するのに有用である。治療的適用では、抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子は単独で、あるいは例えば、ホルモン、抗−アンジオゲン、または放射性標識化合物との、あるいは外科的処置、低温療法および／または放射線療法との組合せで用いることができる。抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子治療は、プレ−、ポスト−または慣用的療法と同時にて、慣用的療法の他の形態と組み合わせて投与することができる。ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル）、エストラムスチンおよびマイトキサントロンのような化学療法薬物は、特に、良好な危険性の患者において癌を治療するのに用いられる。癌を治療し、または軽減するための本発明の方法において、癌患者に、１以上のこれまでの化学療法剤での処置と組み合わせて抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を投与することができる。特に、パリクタキセルおよび修飾された誘導体（例えば、ＥＰ０６００５１７）との組合せ療法が考えられる。抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子は、治療上有効量の化学療法剤と共に投与されるであろう。もう１つの具体例において、抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子は化学療法と組み合わせて投与して、化学療法剤、例えば、パクリタキセルの活性および効力を増強させる。Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ （ＰＤＲ）は、種々の癌の治療で用いられてきたこれらの剤の用量を開示する。治療的に効果的なこれらの前記化学療法薬物の投与方法および用量は、治療すべき特定の癌、病気の程度、および当該分野において技量がある医師が精通した他の因子に依存し、医師によって決定することができる。   Currently, depending on the stage of the cancer, cancer treatment includes one or a combination of the following therapies: surgical procedures to remove cancerous tissue, radiation therapy, and chemotherapy. Anti-TAT antibodies, oligopeptides, siRNA or organic molecular therapy may be particularly desirable in elderly patients who do not tolerate the toxicity and side effects of chemotherapy, or in metastatic diseases with limited utility of radiation therapy. The tumor-targeted anti-TAT antibodies, oligopeptides, siRNAs and organic molecules of the present invention are useful in reducing TAT-expressing cancers during initial diagnosis of disease or during recurrence. In therapeutic applications, anti-TAT antibodies, oligopeptides, siRNA or organic molecules alone or with, for example, hormones, anti-angiogens, or radiolabeled compounds, or with surgical procedures, cryotherapy and / or radiation therapy Can be used in combination. The anti-TAT antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecular therapy can be administered in combination with other forms of conventional therapy simultaneously with pre-, post- or conventional therapy. Chemotherapeutic drugs such as TAXOTERE® (docetaxel), TAXOL® (paclitaxel), estramustine and mitoxantrone are used to treat cancer, particularly in patients at good risk . In the methods of the invention for treating or alleviating cancer, a cancer patient is administered an anti-TAT antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecule in combination with treatment with one or more conventional chemotherapeutic agents. be able to. In particular, combination therapy with parictaxel and modified derivatives (eg EP0600517) is envisaged. The anti-TAT antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecule will be administered with a therapeutically effective amount of the chemotherapeutic agent. In another embodiment, an anti-TAT antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecule is administered in combination with chemotherapy to enhance the activity and efficacy of a chemotherapeutic agent such as paclitaxel. Physicians's Desk Reference (PDR) discloses doses of these agents that have been used in the treatment of various cancers. The method and dosage of these chemotherapeutic drugs that are therapeutically effective will depend on the specific cancer to be treated, the extent of the disease, and other factors familiar to the physician skilled in the art, Can be determined.

１つの特別な具体例において、細胞傷害性剤と組み合わせた抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ、または有機分子を含む結合体が患者に投与される。好ましくは、ＴＡＴ蛋白質に結合した免疫結合体は、細胞によって内部化され、その結果、それが結合する癌細胞を殺すにおける免疫結合体の増大した治療効果がもたらされる。好ましい具体例において、細胞傷害性剤は、癌細胞中の核酸を標的とし、それに干渉する。そのような細胞傷害性剤の例は先に記載され、メイタンシノイド、カリケアミシン、リボヌクレアーゼおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。   In one particular embodiment, a conjugate comprising an anti-TAT antibody, oligopeptide, siRNA, or organic molecule in combination with a cytotoxic agent is administered to the patient. Preferably, the immunoconjugate bound to the TAT protein is internalized by the cell, resulting in an increased therapeutic effect of the immunoconjugate in killing the cancer cell to which it binds. In preferred embodiments, the cytotoxic agent targets and interferes with nucleic acid in the cancer cell. Examples of such cytotoxic agents are described above and include maytansinoids, calicheamicins, ribonucleases and DNA endonucleases.

抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、有機分子またはそのトキシン結合体が、例えば、ボーラスとして静脈内投与のような公知の方法に従って、あるいは長時間にわたる連続的注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、クモ膜下腔内、経口、局所または吸入経路によって患者に投与される。該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の静脈内または皮下投与が好ましい。   The anti-TAT antibody, oligopeptide, organic molecule or its toxin conjugate is intramuscular, intraperitoneal, intracerebral spinal cord according to known methods such as intravenous administration as a bolus or by continuous infusion over time. Administered to patients by subcutaneous, intraarticular, intrasynovial, intrathecal, oral, topical or inhalation routes. Intravenous or subcutaneous administration of the antibody, oligopeptide or organic molecule is preferred.

他の治療方法を該抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の投与と組み合わせることができる。組み合わせた投与は、別々の処方または単一の医薬処方を用いる共投与、いずれかの順序での順次の投与を含み、ここに、好ましくは、双方（または全ての）活性な剤が同時にそれらの生物学的活性を発揮する時間がある。好ましくは、そのような組合せ療法の結果、相乗的な治療効果がもたらされる。   Other therapeutic methods can be combined with the administration of the anti-TAT antibody, oligopeptide or organic molecule. Administration in combination includes separate administration or co-administration using a single pharmaceutical formulation, sequential administration in either order, where preferably both (or all) active agents are simultaneously There is time to exert biological activity. Preferably, such combination therapy results in a synergistic therapeutic effect.

該抗−ＴＡＴ抗体または複数抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の投与を、特定の癌に関連するもう１つの腫瘍抗原に向けられた抗体の投与と組み合わせるのも望ましいであろう。   It may also be desirable to combine administration of the anti-TAT antibody or antibodies, oligopeptides or organic molecules with administration of an antibody directed against another tumor antigen associated with a particular cancer.

もう１つの具体例において、本発明の治療的処置の方法は、異なる化学療法剤のカクテルの共投与を含めた抗−ＴＡＴ抗体（または複数抗体）、オリゴペプチドまたは有機分子、および１以上の化学療法剤または成長阻害剤の組合せ投与を含む。化学療法剤はエストラムスチン硫酸、プレドニムスチン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキセン（例えば、パクリタキセルおよびドキセタキセル）および／またはアントラサイクリン抗生物質を含む。そのような化学療法剤のための調製および投与スケジュールは、製造業者の指示に従って用いることができるか、あるいは技量のある実務化によって経験的に決定することができる。そのような化学療法についての調製および投与スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９２）にも記載されている。   In another embodiment, the therapeutic treatment methods of the invention comprise an anti-TAT antibody (or multiple antibodies), oligopeptide or organic molecule, and one or more chemistries, including co-administration of a cocktail of different chemotherapeutic agents. Includes combined administration of therapeutic agents or growth inhibitors. Chemotherapeutic agents include estramustine sulfate, prednimustine, cisplatin, 5-fluorouracil, melphalan, cyclophosphamide, hydroxyurea and hydroxyurea taxene (eg, paclitaxel and doxetaxel) and / or anthracycline antibiotics. Preparation and dosing schedules for such chemotherapeutic agents can be used in accordance with the manufacturer's instructions, or can be determined empirically by skillful practice. Preparation and dosing schedules for such chemotherapy are described in Chemotherapy Service Ed. , M.M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は抗−ホルモン化合物；例えば、タモキシフェンのような抗−エストロゲン化合物；オナプリストン（ＥＰ６１６８１２）のような抗−プロゲステロン；またはフルタミドのような抗−アンドロゲンと、そのような分子について知られた用量において組み合わせることができる。治療すべき癌がアンドロゲン非依存性癌である場合、患者が先に抗−アンドロゲン療法に付されており、癌がアンドロゲン非依存性となった後に、該抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子（および、所望により、本明細書中に記載された他の剤）を患者に投与することができる。   The antibody, oligopeptide or organic molecule is an anti-hormone compound; for example, an anti-estrogenic compound such as Tamoxifen; an anti-progesterone such as onapristone (EP616812); or an anti-androgen such as flutamide, and the like Combinations can be made at doses known for the molecule. If the cancer to be treated is an androgen-independent cancer, the anti-TAT antibody, oligopeptide or organic molecule after the patient has previously been subjected to anti-androgen therapy and the cancer has become androgen independent (And other agents described herein, if desired) can be administered to the patient.

時々、（療法に関連する心筋不全を予防し、または低下させるための）心臓保護剤または１以上のサイトカインを患者に共投与するのも有益であろう。前記治療方法に加えて、患者は、抗体、オリゴペプチドまたは有機分子療法の前に、それと同時にまたはその後に、癌細胞の外科的除去および／または放射線療法に付すことができる。前記した共投与された剤のいずれかの適当な用量は現在用いられているものであり、該剤と、抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の組合せ作用（相乗作用）により低下させることができる。   Sometimes it may be beneficial to co-administer to a patient a cardioprotectant or one or more cytokines (to prevent or reduce myocardial failure associated with therapy). In addition to the method of treatment, the patient can be subjected to surgical removal of cancer cells and / or radiation therapy before, simultaneously with, or after antibody, oligopeptide or organic molecular therapy. Appropriate doses of any of the aforementioned co-administered agents are those currently used and can be reduced by the combined action (synergistic action) of the agent with an anti-TAT antibody, oligopeptide or organic molecule. it can.

病気の予防または治療では、用量および投与の形態は、公知の基準に従って医師によって選択されるであろう。抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の適当な用量は、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が予防的または治療的目的で投与されるかを問わず、前記定義の治療すべき病気のタイプ、病気の重症度およびコース、従前の療法、患者の臨床的履歴および該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子に対する応答、および主治医の裁量に依存するであろう。該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、適切には、一度に、または一連の処置にわたって患者に投与される。好ましくは、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は静脈内注入によって、または皮下注射によって投与される。病気のタイプおよび重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇないし約５０ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、約０．１ないし１５ｍｇ／ｋｇ用量）の抗体は、例えば、１以上の別々の投与によるかまたは連続的注入によるかを問わず、患者への投与のための初期の候補用量であり得る。投与方法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量、続いての、約２ｍｇ／ｋｇの抗−ＴＡＴ抗体の毎週の維持用量を投与することを含むことができる。しかしながら、他の用量方法も有用であろう。典型的な未知用量は、前記した因子に応じて、約１μｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。数日間以上の間の反復投与は、疾患に応じて、病気徴候の所望の抑制が起こるまで処置を維持する。この療法の進行は慣用的な方法およびアッセイによって、かつ医師または当該分野で技量のある他の者に公知の基準に従って容易にモニターすることができる。   In preventing or treating a disease, the dosage and mode of administration will be selected by a physician according to known criteria. The appropriate dose of the antibody, oligopeptide or organic molecule is the type of disease to be treated as defined above, the severity of the disease, regardless of whether the antibody, oligopeptide or organic molecule is administered for prophylactic or therapeutic purposes. It will depend on the degree and course, previous therapy, patient clinical history and response to the antibody, oligopeptide or organic molecule, and the discretion of the attending physician. The antibody, oligopeptide or organic molecule is suitably administered to the patient at one time or over a series of treatments. Preferably, the antibody, oligopeptide or organic molecule is administered by intravenous infusion or by subcutaneous injection. Depending on the type and severity of the disease, an antibody of about 1 μg / kg to about 50 mg / kg body weight (eg, a dose of about 0.1 to 15 mg / kg) can be administered, for example, by one or more separate administrations or continuously It may be an initial candidate dose for administration to a patient, whether by infusion. The method of administration can include administering an initial loading dose of about 4 mg / kg followed by a weekly maintenance dose of about 2 mg / kg anti-TAT antibody. However, other dose methods may be useful. A typical unknown dose will range from about 1 μg / kg to 100 mg / kg or more, depending on the factors described above. Repeated administration for several days or longer maintains treatment until the desired suppression of disease symptoms occurs, depending on the disease. The progress of this therapy is easily monitored by conventional methods and assays and according to criteria known to the physician or others skilled in the art.

患者への抗体蛋白質の投与とは別に、本発明の適用では、遺伝子治療による抗体の投与が考えられる。該抗体をコードする核酸のそのような投与は、表現「治療上有効量の抗体の投与」に含まれる。例えば、細胞内抗体を生じさせるための遺伝子治療の使用に関する１９９６年３月１４日に公開されたＷＯ ９６／０７３２１参照。   Apart from the administration of the antibody protein to the patient, the application of the present invention contemplates administration of the antibody by gene therapy. Such administration of nucleic acid encoding the antibody is included in the expression “administration of a therapeutically effective amount of an antibody”. See, for example, WO 96/07321 published March 14, 1996 regarding the use of gene therapy to generate intracellular antibodies.

（所望によりベクターに含有された）核酸を患者の細胞へイン・ビボおよびエクス・ビボにて入れる２つの主なアプローチがある。イン・ビボ送達では、核酸は、通常、抗体を必要とする部位にて患者に直接的に注射される。エクス・ビボ治療では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を直接的に患者に投与し、あるいは例えば、患者に移植される多孔性膜内にカプセル化する（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号参照）。核酸を生きた細胞に導入するために利用できる種々の技術がある。該技術は、核酸がイン・ビトロにて培養された細胞に、あるいは意図した宿主の細胞にイン・ビボにて導入されるかに応じて変化する。核酸のイン・ビトロでの哺乳動物細胞への導入に適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿方法等の使用を含む。遺伝子のエクス・ビボ送達のための通常に使用されるベクターはレトロウイルスベクターである。   There are two main approaches to getting the nucleic acid (optionally contained in a vector) into the patient's cells in vivo and ex vivo. For in vivo delivery, the nucleic acid is usually injected directly into the patient at the site where the antibody is needed. In ex vivo treatment, the patient's cells are removed, the nucleic acid is introduced into these isolated cells, the modified cells are administered directly to the patient, or, for example, in a porous membrane that is implanted in the patient (See, eg, US Pat. Nos. 4,892,538 and 5,283,187). There are various techniques that can be used to introduce nucleic acids into living cells. The technique will vary depending on whether the nucleic acid is introduced in vitro into cells cultured in vitro or into the cells of the intended host. Techniques suitable for introduction of nucleic acids into mammalian cells in vitro include the use of liposomes, electroporation, microinjection, cell fusion, DEAE-dextran, calcium phosphate precipitation methods, and the like. A commonly used vector for ex vivo delivery of genes is a retroviral vector.

現在好ましいイン・ビボ核酸導入技術は、（アデノウイルス、単純疱疹Ｉウイルス、またはアデノ−関連ウイルスのような）ウイルスベクター、および脂質−ベースの系（例えば、遺伝子の脂質−媒介導入のための有用な脂質はＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌ）でのトランスフェクションを含む。現在公知の遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコルのレビューについては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）参照。また、ＷＯ ９３／２５６７３およびそこに引用された文献参照。   Currently preferred in vivo nucleic acid transfer techniques are useful for viral vectors (such as adenovirus, herpes simplex I virus, or adeno-associated virus), and lipid-based systems (eg, for lipid-mediated transfer of genes). Lipids include transfection with DOTMA, DOPE and DC-Chol). For a review of currently known gene marking and gene therapy protocols, see Anderson et al. , Science 256: 808-813 (1992). See also WO 93/25673 and the references cited therein.

本発明の抗−ＴＡＴ抗体は、ここに、「抗体」の定義に含まれる種々の形態であり得る。かくして、抗体は全長または無傷抗体、抗体断片、天然配列抗体またはアミノ酸変種、ヒト化、キメラまたは融合抗体、免疫結合体、およびその機能的断片を含む。融合抗体において、抗体配列は異種ポリペプチド配列に融合される。抗体はＦｃ領域において修飾され、所望のエフェクター機能を供することができる。適当なＦｃ領域に関しては本明細書中のセクションにおいてより詳細に議論するように細胞表面に結合した裸の抗体は、例えば、抗体−依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して、または補体依存性細胞傷害性または何らかの他のメカニズムにて補体を動員することによって、細胞傷害性を誘導することができる。別法として、エフェクター機能を排除し、または低下させて、副作用または治療的合併症を最小化するのが望ましい場合、ある種の他のＦｃ領域を用いることができる。   The anti-TAT antibody of the present invention may be in various forms herein included within the definition of “antibody”. Thus, antibodies include full-length or intact antibodies, antibody fragments, native sequence antibodies or amino acid variants, humanized, chimeric or fusion antibodies, immunoconjugates, and functional fragments thereof. In a fusion antibody, the antibody sequence is fused to a heterologous polypeptide sequence. Antibodies can be modified in the Fc region to provide the desired effector function. Naked antibodies bound to the cell surface, as discussed in more detail in the sections herein with respect to suitable Fc regions, can be achieved via, for example, antibody-dependent cytotoxicity (ADCC) or complement dependent. Cytotoxicity can be induced by mobilizing complement through sex cytotoxicity or some other mechanism. Alternatively, certain other Fc regions can be used where it is desirable to eliminate or reduce effector function to minimize side effects or therapeutic complications.

１つの具体例において、該抗体は、本発明の抗体と同一のエピトープへの結合に対して競合し、またはそれに対して実質的に結合する。本発明の抗−ＴＡＴ抗体の生物学的特徴を有する抗体も考えられ、これは、具体的には、イン・ビボ腫瘍標的化およびいずれかの細胞の増殖阻害または細胞傷害性特徴を含む。   In one embodiment, the antibody competes for binding to, or substantially binds to, the same epitope as the antibody of the invention. Antibodies with the biological characteristics of the anti-TAT antibodies of the present invention are also contemplated, including in vivo tumor targeting and any cell growth inhibition or cytotoxic characteristics.

前記抗体を生産する方法をここに詳細に記載する。   The method of producing the antibody will now be described in detail.

本発明の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡおよび有機分子は、ＴＡＴ−発現癌を治療するのに、あるいは哺乳動物において癌の１以上の徴候を軽減するのに有用である。そのような癌は前立腺癌、生殖器管の癌、肺癌、乳癌、結腸癌、結直腸癌、および卵巣癌、より具体的には前立腺腺癌、腎臓細胞癌腫、結直腸腺癌、肺腺癌、肺扁平細胞癌腫、および腹腔中皮腫を含む。癌はこれまでのいずれの転移性癌も含む。該抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子は、哺乳動物においてＴＡＴポリペプチドを発現する癌細胞の少なくとも一部に結合することができる。好ましい具体例において、該抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子は、細胞上のＴＡＴポリペプチドへの結合に際して、イン・ビトロまたはイン・ビボにて、ＴＡＴ−発現腫瘍細胞を破壊し、または殺傷し、あるいはそのような腫瘍細胞の増殖を阻害するのに効果的である。そのような抗体は（いずれの剤にも結合体化していない）裸の抗−ＴＡＴ抗体を含む。細胞傷害性または細胞増殖阻害特性を有する裸の抗体は、細胞傷害性剤とさらに結び付けられて、それらを腫瘍細胞破壊においてより優れたものとすることができる。細胞傷害性特性は、例えば、抗体を細胞傷害性剤と結合体化させて、本明細書中で記載された免疫結合体を形成することによって、抗−ＴＡＴ抗体に付与され得る。細胞傷害性剤または増殖阻害剤は、好ましくは、小分子である。カリケアミシンまたはメイタンシノイドおよびそのアナログまたは誘導体のようなトキシンが好ましい。   The anti-TAT antibodies, oligopeptides, siRNA and organic molecules of the present invention are useful for treating TAT-expressing cancer or for reducing one or more symptoms of cancer in a mammal. Such cancers include prostate cancer, genital cancer, lung cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, and ovarian cancer, more specifically prostate adenocarcinoma, renal cell carcinoma, colorectal adenocarcinoma, lung adenocarcinoma, Includes lung squamous cell carcinoma and peritoneal mesothelioma. Cancer includes any metastatic cancer so far. The antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecule can bind to at least a portion of cancer cells that express a TAT polypeptide in a mammal. In preferred embodiments, the antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecule destroys or kills TAT-expressing tumor cells in vitro or in vivo upon binding to a TAT polypeptide on the cell. Or effective in inhibiting the growth of such tumor cells. Such antibodies include naked anti-TAT antibodies (not conjugated to any agent). Naked antibodies with cytotoxic or cytostatic properties can be further combined with cytotoxic agents to make them better at destroying tumor cells. Cytotoxic properties can be imparted to an anti-TAT antibody, for example, by conjugating the antibody with a cytotoxic agent to form an immunoconjugate as described herein. The cytotoxic agent or growth inhibitor is preferably a small molecule. Toxins such as calicheamicin or maytansinoids and analogs or derivatives thereof are preferred.

本発明は、本発明の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子、およびキャリアを含む組成物を提供する。癌を治療する目的では、組成物をそのような治療を必要とする患者に投与することができ、ここに、組成物は免疫結合体として、または裸の抗体として存在する１以上の抗−ＴＡＴ抗体を含むことができる。更なる具体例において、組成物は、化学療法剤を含めた、細胞傷害性または増殖阻害剤のような他の治療剤と組み合わせて、これらの抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ、または有機分子を含むことができる。本発明は、本発明の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子、およびキャリアを含む処方も提供する。１つの具体例において、該処方は、薬学的に受容可能なキャリアを含む治療的処方である。   The present invention provides a composition comprising an anti-TAT antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecule of the present invention, and a carrier. For purposes of treating cancer, the composition can be administered to a patient in need of such treatment, where the composition is one or more anti-TATs present as an immunoconjugate or as a naked antibody. Antibodies can be included. In further embodiments, the composition comprises these antibodies, oligopeptides, siRNA, or organic molecules in combination with other therapeutic agents, such as cytotoxic or growth inhibitors, including chemotherapeutic agents. Can do. The invention also provides a formulation comprising an anti-TAT antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecule of the invention, and a carrier. In one embodiment, the formulation is a therapeutic formulation that includes a pharmaceutically acceptable carrier.

本発明のもう１つの態様は、抗−ＴＡＴ抗体をコードする単離された核酸である。ＨおよびＬの双方の鎖、特に超可変領域残基をコードする核酸、天然配列抗体をコードする鎖、ならびに該抗体の変種、修飾およびヒト化バージョンが含まれる。   Another aspect of the invention is an isolated nucleic acid encoding an anti-TAT antibody. Included are both nucleic acids encoding both H and L chains, particularly hypervariable region residues, chains encoding native sequence antibodies, and variants, modified and humanized versions of the antibodies.

本発明は、治療上有効量の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を哺乳動物に投与することを含む。哺乳動物においてＴＡＴポリペプチド−発現癌を治療し、または該癌の１以上の徴候を軽減するのに有用な方法を提供する。該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の治療組成物は、医師によって指令されるように短期間（急性）または慢性または間欠的に投与することができる。またはＴＡＴポリペプチド−発現細胞の増殖を阻害し、およびそれを殺傷する方法も提供する。   The invention includes administering to a mammal a therapeutically effective amount of an anti-TAT antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecule. Methods are provided that are useful for treating a TAT polypeptide-expressing cancer in a mammal or for alleviating one or more symptoms of the cancer. The antibody, oligopeptide or organic molecule therapeutic composition can be administered for a short period (acute) or chronically or intermittently as directed by a physician. Alternatively, methods of inhibiting the growth of and killing TAT polypeptide-expressing cells are also provided.

また、本発明は、少なくとも１つの抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を含むキットおよび製品も提供する。抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を含有するキットは、例えば、ＴＡＴ細胞殺傷アッセイで、細胞からのＴＡＴポリペプチドの精製または免疫沈澱で用途を見出す。例えば、ＴＡＴの単離および精製のためには、該キットはビーズ（例えば、セファロースビーズ）にカップリングされた抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を含有することができる。例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにおいて、イン・ビトロでのＴＡＴの検出および定量のための該抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を含有するキットが提供され得る。検出で有用なそのような抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子は、蛍光または放射性標識のような標識と共に供することができる。   The invention also provides kits and products comprising at least one anti-TAT antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecule. Kits containing anti-TAT antibodies, oligopeptides, siRNA or organic molecules find use in purifying or immunoprecipitation of TAT polypeptides from cells, for example, in TAT cell killing assays. For example, for TAT isolation and purification, the kit can contain an anti-TAT antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecule coupled to beads (eg, sepharose beads). For example, a kit containing the antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecule for detection and quantification of TAT in vitro can be provided in an ELISA or Western blot. Such antibodies, oligopeptides, siRNA or organic molecules useful in detection can be provided with a label such as a fluorescent or radioactive label.

Ｌ．製品およびキット
本発明のもう１つの具体例は、抗−ＴＡＴ発現癌の治療で有用な材料を含有する製品である。該製品は容器、および該容器上のまたはそれに会合させたラベルまたは添付文書を含む。適当な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジなどを含む。該容器は硝子またはプラスチックのような種々の材料から形成することができる。該容器は、癌疾患を治療するのに効果的な組成物を保有し、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、該容器は皮下注射針によって刺すことができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性な剤は、本発明の抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子である。該ラベルまたは添付文書は、組成物が癌を治療するのに用いられることを示す。該ラベルまたは添付文書は、さらに、癌患者へ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子組成物を投与するための指示を含む。加えて、該製品は、さらに、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸−緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液のような薬学的に受容可能な緩衝液を含む第二の容器を含むことができる。それは、さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含めた、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料を含むことができる。 L. Products and Kits Another embodiment of the invention is a product containing materials useful in the treatment of anti-TAT expressing cancer. The product includes a container and a label or package insert on or associated with the container. Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes and the like. The container can be formed from a variety of materials such as glass or plastic. The container holds a composition effective to treat cancer disease and can have a sterile access port (eg, the container can be an intravenous solution bag with a stopper that can be pierced by a hypodermic needle or Can be a vial). At least one active agent in the composition is an anti-TAT antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecule of the invention. The label or package insert indicates that the composition is used to treat cancer. The label or package insert further includes instructions for administering the antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecular composition to the cancer patient. In addition, the product further comprises a second container containing a pharmaceutically acceptable buffer such as bacteriostatic water for injection (BWFI), phosphate-buffered saline, Ringer's solution and dextrose solution. Can be included. It can further include other materials desirable from a commercial and user standpoint, including other buffers, diluents, filters, needles, and syringes.

例えば、ＴＡＴ−発現細胞殺傷アッセイのための、ＴＡＴポリペプチドの細胞からの精製または免疫沈澱のための種々の目的で有用なキットも提供される。ＴＡＴポリペプチドの単離および精製では、該キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）にカップリングされた抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を含有することができる。例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにおける、イン・ビトロでのＴＡＴポリペプチドの検出および定量のための該抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を含有するキットが提供され得る。該製品に関しては、該キットは容器、および該容器上の、またはそれに会合させたラベルまたは添付文書を含む。該容器は、本発明の少なくとも１つの抗−ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡまたは有機分子を含む組成物を保持する。例えば、希釈剤および緩衝液、対照抗体を含有する更なる容器を含めることができる。該ラベルまたは添付文書は組成物の記載、ならびに意図したイン・ビトロまたは診断的使用のための指示を供することができる。   For example, kits useful for various purposes for purification or immunoprecipitation of TAT polypeptides from cells for TAT-expressing cell killing assays are also provided. For isolation and purification of TAT polypeptide, the kit can contain an anti-TAT antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecule coupled to beads (eg, sepharose beads). For example, a kit containing the antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecule for detection and quantification of TAT polypeptide in vitro in an ELISA or Western blot can be provided. For the product, the kit includes a container and a label or package insert on or associated with the container. The container holds a composition comprising at least one anti-TAT antibody, oligopeptide, siRNA or organic molecule of the invention. For example, additional containers containing diluents and buffers, control antibodies can be included. The label or package insert may provide a description of the composition as well as instructions for the intended in vitro or diagnostic use.

Ｍ．ＴＡＴ−ポリペプチド、およびＴＡＴ−ポリペプチドをコードする核酸の使用
ＴＡＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（またはそれらの相補体）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含めた分子生物学の分野において、染色体および遺伝子マッピングにおいて、およびアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびＤＮＡプローブの作成において種々の適用を有する。ＴＡＴ−コーディング核酸は、本明細書中に記載された組換え技術によるＴＡＴポリペプチドの調製でやはり有用であり、ここに、それらのＴＡＴポリペプチドは、例えば、本明細書中で記載されたような抗−ＴＡＴ抗体の調製で用途を見出すことができる。 M.M. Use of TAT-polypeptides and nucleic acids encoding TAT-polypeptides Nucleotide sequences encoding TAT polypeptides (or their complements) are used in the field of molecular biology, including use as hybridization probes, in chromosomes. And has various applications in gene mapping and in making antisense RNA, siRNA and DNA probes. TAT-encoding nucleic acids are also useful in the preparation of TAT polypeptides by the recombinant techniques described herein, where those TAT polypeptides are, for example, as described herein. Use can be found in the preparation of such anti-TAT antibodies.

全長天然配列ＴＡＴ遺伝子、またはその部分は、ｃＤＮＡライブラリ用のハイブリダイゼーションプローブとして用いて、全長ＴＡＴ ｃＤＮＡを単離し、あるいは本明細書中に開示された天然ＴＡＴ配列に対して所望の配列同一性を有するなお他のｃＤＮＡ（例えば、ＴＡＴの天然に生じる変種または他の種からのＴＡＴをコードするもの）を単離することができる。所望により、プローブの長さは約２０ないし約５０塩基であろう。ハイブリダイゼーションプローブは、全長天然ヌクレオチド配列の少なくとも部分的に新規な領域に由来し得、ここに、それらの領域は、過度の実験なくして、あるいは天然配列ＴＡＴのプロモータ、エンハンサーエレメントおよびイントロンを含めたゲノム配列から決定することができる。その例として、スクリーニング方法は、公知のＤＮＡ配列を用いてＴＡＴ遺伝子のコーディング領域を単離して、約４０塩基の選択されたプローブを構成することを含むであろう。ハイブリダイゼーションプローブは、アビジン／ビオチンカップリング系を介してプローブにカップリングされた、３２Ｂまたは３５Ｓのような放射性ヌクレオチド、またはアルカリ性ホスファターゼのような酵素標識を含めた種々の標識によって標識することができる。本発明のＴＡＴ遺伝子のそれに対して相補的な配列を有する標識されたプローブを用いて、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリをスクリーニングして、そのようなライブラリのいずれのメンバーがプローブにハイブリダイズするかを決定することができる。ハイブリダイゼーション技術は以下の実施例にさらに詳細に記載される。本出願で開示したいずれのＥＳＴ配列も同様に、本明細書中に開示された方法を用いてプローブとして使用することができる。 The full-length native sequence TAT gene, or portion thereof, can be used as a hybridization probe for a cDNA library to isolate full-length TAT cDNA or to provide the desired sequence identity to the native TAT sequences disclosed herein. Still other cDNAs having (eg, naturally occurring variants of TAT or those encoding TAT from other species) can be isolated. If desired, the length of the probe will be from about 20 to about 50 bases. Hybridization probes may be derived from at least partially novel regions of the full-length native nucleotide sequence, where these regions include the promoter, enhancer element and intron of the native sequence TAT without undue experimentation. It can be determined from the genomic sequence. By way of example, a screening method would include isolating the coding region of the TAT gene using a known DNA sequence to construct a selected probe of about 40 bases. Hybridization probes can be labeled with a variety of labels, including radioactive nucleotides such as 32 B or 35 S, or enzyme labels such as alkaline phosphatase, coupled to the probe via an avidin / biotin coupling system. Can do. A labeled probe having a sequence complementary to that of the TAT gene of the present invention is used to screen a library of human cDNA, genomic DNA or mRNA, and any member of such library hybridizes to the probe. You can decide what to do. Hybridization techniques are described in further detail in the examples below. Any EST sequence disclosed in this application can also be used as a probe using the methods disclosed herein.

ＴＡＴ−コーディング核酸の他の有用な断片は、標的ＴＡＴ ｍＲＮＡ（センス）またはＴＡＴ ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することができる一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、本発明に従って、ＴＡＴ ＤＮＡのコーディング領域の断片を含む。そのような断片は、一般に、少なくとも約１４のヌクレオチド、好ましくは、約１４ないし３０ヌクレオチドを含む。与えられた蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列に基づき、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを駆動する能力は、例えば、Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ （Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８）およびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８，１９８８）に記載されている。   Another useful fragment of a TAT-encoding nucleic acid is an antisense or sense oligonucleotide comprising a single stranded nucleic acid sequence (RNA or DNA) capable of binding to a target TAT mRNA (sense) or TAT DNA (antisense) sequence including. The antisense or sense oligonucleotide comprises a fragment of the coding region of TAT DNA according to the present invention. Such fragments generally comprise at least about 14 nucleotides, preferably from about 14 to 30 nucleotides. Based on the cDNA sequence encoding a given protein, the ability to drive antisense or sense oligonucleotides is described, for example, by Stein and Cohen (Cancer Res. 48: 2659, 1988) and van der Krol et al. (BioTechniques 6: 958, 1988).

標的核酸配列へのアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合の結果、デュプレックスの増強された分解、転写または翻訳の未成熟終止、または他の手段を含めたいくつかの手段の一つによって、標的配列の転写または翻訳をブロックするデュプレックスが形成される。そのような方法は本発明に含まれる。かくして、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＴＡＴ蛋白質の発現をブロックすることができ、ここに、それらのＴＡＴ蛋白質は、哺乳動物において癌の誘導において役割を演じるであろう。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、さらに、修飾された糖−ホスホジエステル骨格（ＷＯ ９１／０６６２９に記載されたような糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、ここに、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼに対して耐性である。耐性糖結合を持つそのようなオリゴヌクレオチドはイン・ビボで安定であり（すなわち、酵素分解に抵抗することができる）、しかし、標的ヌクレオチド配列に結合することができる配列特異性を保有する。   As a result of the binding of the antisense or sense oligonucleotide to the target nucleic acid sequence, by one of several means including enhanced degradation of duplex, premature termination of transcription or translation, or other means, A duplex is formed that blocks transcription or translation. Such methods are included in the present invention. Thus, antisense oligonucleotides can be used to block expression of TAT proteins, where those TAT proteins will play a role in cancer induction in mammals. Antisense or sense oligonucleotides further include oligonucleotides having modified sugar-phosphodiester backbones (sugar linkages as described in WO 91/06629), where such sugar linkages are endogenous. Resistant to nucleases. Such oligonucleotides with resistant sugar linkages are stable in vivo (ie, can resist enzymatic degradation), but possess sequence specificity that can bind to the target nucleotide sequence.

アンチセンス結合のための好ましい遺伝子内部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始／スタートコドン（５’−ＡＵＧ／５’−ＡＴＧ）または終止／停止コドン（５’−ＵＡＡ／５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ／５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡ）を取り込む領域を含む。これらの領域は、翻訳開始または終止コドンからいずれかの方向（すなわち５’または３’）いずれかに、約２５ないし約５０の連続したヌクレオチドを含むｍＲＮＡまたは遺伝子の一部をいう。アンチセンス結合のための他の好ましい領域は：イントロン；エクソン；イントロン−エクソン接合；翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの間の領域であるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コーディング領域」；５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの最も５’側の残基に接合したＮ７−メチル化グアノシン残基を含み、５’キャップ構造それ自体、ならびに該キャップに隣接した最初の５０ヌクレオチドを含むｍＲＮＡの５’キャップ；５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの部分、かくして、５’キャップ部位およびｍＲＮＡの翻訳開始コドンの間のヌクレオチド、または当該遺伝子上の対応するヌクレオチドを含み；３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、翻訳終止コドンから３’方向のｍＲＮＡの部分、かくして、翻訳終止コドンおよびｍＲＮＡの３’末端の間のヌクレオチド、または当該遺伝子上の対応するヌクレオチド；を含む。   Preferred intragenic sites for antisense binding are the translation start / start codon (5′-AUG / 5′-ATG) or stop / stop codon (5′-UAA / 5 ′) of the open reading frame (ORF) of the gene. -UAG and 5'-UGA / 5'-TAA, 5'-TAG and 5'-TGA). These regions refer to the part of the mRNA or gene that contains from about 25 to about 50 consecutive nucleotides in either direction (ie, 5 'or 3') from the translation start or stop codon. Other preferred regions for antisense binding are: intron; exon; intron-exon junction; open reading frame (ORF) or “coding region” that is the region between the translation start codon and translation stop codon; 5′-5 An mRNA containing an N7-methylated guanosine residue joined to the 5'-most residue of the mRNA via a 'triphosphate bond', including the 5 'cap structure itself, as well as the first 50 nucleotides adjacent to the cap 5 'cap; 5' untranslated region (5'UTR), part of the mRNA 5 'from the translation initiation codon, thus the nucleotide between the 5' cap site and the translation initiation codon of the mRNA, or on the gene Contains the corresponding nucleotide; 3 ′ untranslated region (3′UTR), 3 ′ from the translation stop codon Portion of the direction of the mRNA, thus, the translation termination codon and mRNA at the 3 'end between the nucleotide or corresponding nucleotides on the gene; including.

ＴＡＴ蛋白質の発現を阻害するのに有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例は、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドを含む。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、該骨格にリン原子を保有するもの、および該骨格にリン原子を有しないものを含む。本明細書の目的では、かつ当該分野で時々言及されているように、それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾されたオリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであると考えることができる。好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めたメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含めたホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常な３’−５’結合を有するセレノホスホネートおよびボラノ−ホスフェート、これらの２’−５’結合アナログ、および１以上のヌクレオチド間結合が３’から３’、５’から５’、または２’から２’の結合である逆転した極性を有するものを含む。逆転したヌクレオシド極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチド間結合において単一の３’から３’の結合、すなわち、無塩基性であり得る単一の逆転したヌクレオシド残基を含む（該ヌクレオベースは失われているか、またはその場所にヒドロキシル基を有する）。種々の塩、混合された塩および遊離酸形態も含まれる。リン−含有結合の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されるものではないが、その各々をここに引用して援用する、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５、４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５、４７６，９２５号；第５、５１９，１２６号；第５、５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，１９４，５９９号；第５，５６５，５５５号；第５，５２７，８９９号；第５，７２１，２１８号；第５，６７２，６９７号および第５，６２５，０５０号を含む。   Specific examples of preferred antisense compounds useful for inhibiting TAT protein expression include oligonucleotides containing modified backbones or non-natural internucleoside linkages. Oligonucleotides having modified backbones include those that have a phosphorus atom in the backbone and those that do not have a phosphorus atom in the backbone. For the purposes of this specification, and as sometimes mentioned in the art, modified oligonucleotides that do not have a phosphorus atom in their internucleoside backbone can also be considered to be oligonucleosides. Preferred modified oligonucleotide backbones include, for example, methyl and including phosphorothioates, chiral phosphorothioates, phosphorodithioates, phosphotriesters, aminoalkyl phosphotriesters, 3′-alkylene phosphonates, 5′-alkylene phosphonates and chiral phosphonates. Other alkyl phosphonates, phosphinates, phosphoramidates including 3'-aminophosphoramidates and aminoalkyl phosphoramidates, thionophosphoramidates, thionoalkylphosphonates, thionoalkylphosphotriesters, normal Selenophosphonates and borano-phosphates with unique 3'-5 'linkages, their 2'-5' linkage analogs, and one or more internucleotide linkages from 3 'to 3', 5 'to 5 , Or those having a polarity reversed a bond 'to 2' 2. Preferred oligonucleotides with reversed nucleoside polarities comprise a single 3 ′ to 3 ′ bond at the most 3 ′ internucleotide bond, ie a single reversed nucleoside residue that can be abasic (the said The nucleobase is lost or has a hydroxyl group in its place). Various salts, mixed salts and free acid forms are also included. Representative US patents that teach the preparation of phosphorus-containing linkages include, but are not limited to, US Pat. Nos. 3,687,808, each incorporated herein by reference. No. 863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; No. 5,455,233; No. 5,466,677; No. 5,476,925; No. 5,519,126; No. 5,536,821; No. 5,541,306; No. 550,111; No. 5,563,253; No. 5,571,799 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 and Includes 5,625,050.

その中にリン原子を含まない好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、短い鎖のアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１以上の短い鎖のヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成された）モルホリノ結合；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ置換の２成分部分を有する他のものを有するものを含む。そのようなオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は限定されるものではないが、その各々をここに引用して援用する、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５、６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；第５，７９２，６０８号；第５，６４６，２６９号および第５，６７７，４３９号を含む。   Preferred modified oligonucleotide backbones that do not contain a phosphorus atom therein are short chain alkyl or cycloalkyl internucleoside linkages, mixed heteroatoms and alkyl or cycloalkyl internucleoside linkages, or one or more short chain heterocycles. It has a skeleton formed by atomic or heterocyclic internucleoside linkages. These include morpholino bonds (partially formed from the sugar portion of the nucleoside); siloxane backbone; sulfide, sulfoxide and sulfone backbone; formacetyl and thioformacetyl backbone; methyleneformacetyl and thioformacetyl backbone; riboacetyl backbone; Including those having skeletons; sulfamate skeletons; methyleneimino and methylenehydrazino skeletons; sulfonate and sulfonamide skeletons; amide skeletons; and others with mixed N, O, S and CH substituted binary moieties. Representative US patents that teach the preparation of such oligonucleosides are, but not limited to, US Pat. Nos. 5,034,506, each incorporated herein by reference. No. 315; No. 5,185,444; No. 5,214,134; No. 5,216,141; No. 5,235,033; No. 5,264,562; No. 5,264,564 No. 5,405,938; No. 5,434,257; No. 5,466,677; No. 5,470,967; No. 5,489,677; No. 5,541,307 No. 5,561,086; No. 5,602,240; No. 5,610,289; No. 5,602,240; No. 5,608,046; No. 5,610 No. 5,289, No. 5,618,704; No. 5,62 No. 5,663,312; No. 5,633,360; No. 5,677,437; No. 5,792,608; No. 5,646,269 and No. 5,677,439 Including the issue.

他の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、糖およびヌクレオシド結合双方、すなわち、ヌクレオチドユニットの骨格は新規な基で置き換えられている。塩基ユニットは、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。一つのそのようなオリゴマー化合物、すなわち、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチドミメティックを、ペプチド核酸（ＰＮＡ）という。ＰＮＡ化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖−骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられている。ヌクレオベースは保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されるものではないが、その各々をここに引用して援用する、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号を含む。ＰＮＡ化合物の更なる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見出すことができる。   In other preferred antisense oligonucleotides, both the sugar and nucleoside linkages, ie the backbone of the nucleotide unit, are replaced with novel groups. Base units are maintained for hybridization with the appropriate nucleic acid target compound. One such oligomeric compound, ie, an oligonucleotide mimetic that has been shown to have excellent hybridization properties, is referred to as a peptide nucleic acid (PNA). In PNA compounds, the sugar-backbone of the oligonucleotide is replaced with an amide-containing backbone, in particular an aminoethylglycine backbone. The nucleobase is retained and bound directly or indirectly to the aza nitrogen atom of the backbone amide moiety. Representative US patents that teach the preparation of PNA compounds include, but are not limited to, US Pat. Nos. 5,539,082, each incorporated herein by reference. And 5,719,262. Further teachings of PNA compounds can be found in Nielsen et al. Science, 1991, 254, 1497-1500.

好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格および／またはヘテロ原子骨格、特に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知］、前記で引用した米国特許第５，４８９，６７７号に記載された−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［式中、天然ホスホジエステル骨格は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、および前記で引用した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を取り込む。また、好ましいのは、前記で引用した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。 Preferred antisense oligonucleotides are phosphorothioate backbones and / or heteroatom backbones, in particular —CH 2 —NH—O—CH 2 —, —CH 2 —N (CH 3 ) —O—CH 2 — [methylene (methylimino) Or known as the MMI skeleton], described in US Pat. No. 5,489,677 cited above, —CH 2 —O—N (CH 3 ) —CH 2 —, —CH 2 —N (CH 3 ) — N (CH 3 ) —CH 2 — and —O—N (CH 3 ) —CH 2 —CH 2 —, wherein the natural phosphodiester skeleton is represented as —O—P—O—CH 2 —; And the amide skeleton of US Pat. No. 5,602,240 cited above. Also preferred are antisense oligonucleotides having a morpholino backbone structure of US Pat. No. 5,034,506 cited above.

修飾されたオリゴヌクレオチドは、１以上の置換された糖部位も含有することができる。好ましいオリゴヌクレオチドは２’位置に以下のうちの１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、またはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、またはＮ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、またはＮ−アルキニル；またはアルキル、アルケニルおよびアルキニルが置換されたまたは置換されていないＣ１ないしＣ１０アルキルまたはＣ２ないしＣ１０アルケニルおよびアルキニルであってよいＯ−アルキル−Ｏ−アルキル。特に好ましいのはＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、ここに、ｎおよびｍは１ないし約１０である。他の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは２’位置に以下のうちの１を含む：Ｃ１ないしＣ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改良するための基、および同様な特性を有する他の置換基。好ましい修飾は２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエトキシ）または２’−ＭＯＥとしても知られた２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらに好ましい修飾は、以下の実施例に記載された、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られた、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および（当該分野においては２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られた）２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）を含む。 Modified oligonucleotides can also contain one or more substituted sugar moieties. Preferred oligonucleotides contain one of the following at the 2 ′ position: OH; F; O-alkyl, S-alkyl, or N-alkyl; O-alkenyl, S-alkenyl, or N-alkenyl; O-alkynyl , S- alkynyl or N- alkynyl; or alkyl, alkenyl and alkynyl substituted or substituted C 1 to not be a C 10 alkyl or C 2 to C 10 alkenyl and alkynyl O- alkyl -O- Alkyl. Particularly preferred is O [(CH 2 ) n O] m CH 3 , O (CH 2 ) n OCH 3 , O (CH 2 ) n NH 2 , O (CH 2 ) n CH 3 , O (CH 2 ) n ONH 2 , and O (CH 2 ) n ON [(CH 2 ) n CH 3 ] 2 , where n and m are 1 to about 10. Other preferred antisense oligonucleotides contain one of the following at the 2 ′ position: C 1 to C 10 lower alkyl, substituted lower alkyl, alkenyl, alkynyl, alkaryl, aralkyl, O-alkaryl or O— Aralkyl, SH, SCH 3 , OCN, Cl, Br, CN, CF 3 , OCF 3 , SOCH 3 , SO 2 CH 3 , ONO 2 , NO 2 , N 3 , NH 2 , heterocycloalkyl, heterocycloalkaryl, Aminoalkylamino, polyalkylamino, substituted silyl, RNA cleaving group, reporter group, intercalator, group for improving the pharmacokinetic properties of oligonucleotides, or for improving the pharmacodynamic properties of oligonucleotides Groups, and other substituents with similar properties. A preferred modification 2'-methoxyethoxy (2'-O- (2- methoxyethoxy) or also known as 2'-MOE 2'-OCH 2 CH 2 OCH 3) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), that is, it contains an alkoxyalkoxy group. Further preferred modifications are described in the examples below, 2′-dimethylaminooxyethoxy, also known as 2′-DMAOE, ie an O (CH 2 ) 2 ON (CH 3 ) 2 group, and ( 2′-dimethylaminoethoxyethoxy (also known in the art as 2′-O-dimethylaminoethoxyethyl or 2′-DMAEOE), ie 2′-O—CH 2 —O—CH 2 —N (CH 2 ).

さらなる好ましい修飾はロックされた核酸（ＬＮＡ）を含み、ここに、２’−ヒドロキシル基は糖環の３’または４’炭素原子に連結され、それにより、二環糖部位を形成する。該結合は、好ましくは、２’酸素原子および４’炭素原子を橋掛けするメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、ここに、ｎは１または２である。ＬＮＡおよびその調製はＷＯ ９８／３９３５２およびＷＯ ９９／１４２２６に記載されている。 Further preferred modifications include locked nucleic acids (LNA), wherein the 2′-hydroxyl group is linked to the 3 ′ or 4 ′ carbon atom of the sugar ring, thereby forming a bicyclic sugar moiety. The bond is preferably a methylene (—CH 2 —) n group bridging a 2 ′ oxygen atom and a 4 ′ carbon atom, where n is 1 or 2. LNA and its preparation are described in WO 98/39352 and WO 99/14226.

他の好ましい修飾は２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。該２’−修飾はアラビノ（上方）位置またはリボ（下方）位置にあってよい。好ましい２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。同様な修飾をオリゴヌクレオチド上の他の位置において、特に、３’−末端ヌクレオチド上の、または２’−５’連結オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位置において、および５’末端ヌクレオチドの５’位置においてなすこともできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部位のような糖ミメティックを有することもできる。そのような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されるものではないが、その各々をここに引用してその全体を援用する、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；第５，７９２，７４７号；および第５，７００，９２０号を含む。 Other preferred modifications include 2'-methoxy (2'-OCH 3), 2'- aminopropoxy (2'-OCH 2 CH 2 CH 2 NH 2), 2'- allyl (2'-CH 2 -CH = CH 2), including 2'-O- allyl (2'-O-CH 2 -CH = CH 2) and 2'-fluoro and (2'-F). The 2'-modification may be in the arabino (up) position or ribo (down) position. A preferred 2'-arabino modification is 2'-F. Similar modifications are made at other positions on the oligonucleotide, in particular on the 3'-terminal nucleotide or at the 3 'position of the sugar in the 2'-5' linked oligonucleotide and at the 5 'position of the 5' terminal nucleotide. You can also do it. Oligonucleotides can also have sugar mimetics such as cyclobutyl moieties instead of pentofuranosyl sugars. Representative US patents that teach the preparation of such modified sugar structures include, but are not limited to, US Pat. No. 4,981,957, each of which is hereby incorporated by reference in its entirety. No. 5,118,800; No. 5,319,080; No. 5,359,044; No. 5,393,878; No. 5,446,137; No. 5,466,786; No. 5,514,785; No. 5,519,134; No. 5,567,811; No. 5,576,427; No. 5,591,722; No. 5,597,909; No. 5,627,053; No. 5,639,873; No. 5,646,265; No. 5,658,873; No. 5,670,633; No. 5,792 , 747; and 5,700,920.

オリゴヌクレオチドは（しばしば、当該分野においては単に「塩基」と言われる）ヌクレオベース修飾または置換を含むこともできる。本明細書中で用いるように、「修飾されていない」または「天然」ヌクレオベースは、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾されたヌクレオベースは５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピミル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３または−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ）ウラシルおよびシトシン、およびピリミジン塩基の他のアルキミル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンのような他の合成および天然ヌクレオベースを含む。更なる修飾されたヌクレオベースはフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換されたフェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）のようなＧ−クランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−オン）のような三環ピリミジンを含む。修飾されたヌクレオベースは、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンで置き換えられたものも含むことができる。更なるヌクレオベースは米国特許第３，６８７，８０８号に開示されたもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されたもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されたものを含む。これらのヌクレオベースのある種のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらは５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニンを含めたＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、５−プロピニルウラシルおよびプロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、０．６ないし１．２度Ｃだけ核酸デュプレックス安定性を増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、なおより特別には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、好ましい塩基置換である。修飾されたヌクレオベースの調製を教示する代表的な米国特許は、限定されるものではないが、その各々をここに引用して援用する、米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６４５，９８５号；第５，８３０，６５３号；第５，７６３，５８８；第６，００５，０９６号；第５，６８１，９４１号；および第５，７５０，６９２号を含む。 Oligonucleotides can also contain nucleobase modifications or substitutions (often referred to simply as “bases” in the art). As used herein, an “unmodified” or “natural” nucleobase includes purine bases adenine (A) and guanine (G), and pyrimidine bases thymine (T), cytosine (C) and uracil ( U). Modified nucleobase is 5-methylcytosine (5-me-C), 5-hydroxymethylcytosine, xanthine, hypoxanthine, 2-aminoadenine, adenine and 6-methyl and other alkyl derivatives of guanine, adenine and guanine 2-propyl and other alkyl derivatives of 2-thiouracil, 2-thiothymine and 2-thiocytosine, 5-halouracil and cytosine, 5-propymil (—C≡C—CH 3 or —CH 2 —C≡CH) uracil and Cytosine, and other alkymyl derivatives of pyrimidine bases, 6-azouracil, cytosine and thymine, 5-uracil (pseudouracil), 4-thiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-thiol, 8-thioalkyl, 8-hydroxyl and Other 8-substituted adenines And guanine, 5-halo, especially 5-bromo, 5-trifluoromethyl and other 5-substituted uracils and cytosines, 7-methylguanine and 7-methyladenine, 2-F-adenine, 2-amino-adenine, 8 -Other synthetic and natural nucleobases such as azaguanine and 8-azaadenine, 7-deazaguanine and 7-deazaadenine and 3-deazaguanine and 3-deazaadenine. Further modified nucleobases are phenoxazine cytidine (1H-pyrimido [5,4-b] [1,4] benzoxazin-2 (3H) -one), phenothiazine cytidine (1H-pyrimido [5,4-b ] [1,4] benzothiazin-2 (3H) -one), substituted phenoxazine cytidine (eg, 9- (2-aminoethoxy) -H-pyrimido [5,4-b] [1,4] benzo G-clamps such as oxazine-2 (3H) -one), carbazole cytidine (2H-pyrimido [4,5-b] indol-2-one), pyridoindole cytidine (H-pyrido [3 ′, 2 ′) : 4,5] pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-one). Modified nucleobases can also include those in which the purine or pyrimidine base is replaced with other heterocycles, such as 7-deaza-adenine, 7-deazaguanosine, 2-aminopyridine and 2-pyridone. Further nucleobases are disclosed in U.S. Pat. No. 3,687,808, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. et al. I. , Ed. Disclosed in John Wiley & Sons, 1990, and Englisch et al. , Angelwandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613. Certain of these nucleobases are particularly useful for increasing the binding affinity of the oligomeric compounds of the invention. These include 5-substituted pyrimidines, 6-azapyrimidines, and N-2, N-6 and O-6 substituted purines, including 2-aminopropyladenine, 5-propynyluracil and propynylcytosine. 5-Methylcytosine substitutions have been shown to increase nucleic acid duplex stability by 0.6 to 1.2 degrees C (Sangvi et al., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), and even more particularly, a preferred base substitution when combined with a 2′-O-methoxyethyl sugar modification. Representative US patents that teach the preparation of modified nucleobases include, but are not limited to, US Pat. No. 3,687,808, each of which is incorporated herein by reference. 5,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587, No. 469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; No. 6,005,096; No. 5,681,941 ; And a No. 5,750,692.

アンチセンスオリゴヌクレオチドのもう１つの修飾は、オリゴヌクレオチドに、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞摂取を高める１以上の部位または結合体を化学的に連結させる。本発明の化合物は、第一級または第二級ヒドロキシル基のような官能基に共有結合した結合体基を含むことができる。本発明の結合体基はインターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を高める基、およびオリゴマーの薬物動態学特性を高める基を含む。典型的な結合体基はコレステロール、脂質、カチオン脂質、リン脂質、カチオン性リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料を含む。本発明との関係で、薬力学特性を高める基は、オリゴマー摂取を改善し、分解に対するオリゴマー抵抗性を高め、および／またはＲＮＡとの配列−特異的ハイブリダイゼーションを強める基を含む。本発明との関係で、薬物動態学的特性を高める基は、オリゴマー摂取、分布、代謝または排出を改善する基を含む。結合体部位は、限定されるものではないが、コレステロール部位のような脂質部位（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたは１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸トリエチル−アンモニウム（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部位（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部位を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、活性な薬物物質、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツレート、セファロスポリン、スルファ薬物、抗糖尿病剤、抗菌剤または抗生物質に結合体化することもできる。オリゴヌクレオチド−薬物結合体およびそれらの調製は米国特許出願第０９／３３４，１３０号（１９９９年６月１５日出願）および米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７号；第５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５、３７１，２４１号；第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号；第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５、５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号および第５，６８８，９４１号に記載されており、その各々を、ここに引用して援用する。   Another modification of the antisense oligonucleotide chemically links the oligonucleotide to one or more sites or conjugates that increase the activity, cell distribution or cellular uptake of the oligonucleotide. The compounds of the present invention can include a conjugate group covalently bonded to a functional group such as a primary or secondary hydroxyl group. The conjugate groups of the present invention include intercalators, reporter molecules, polyamines, polyamides, polyethylene glycols, polyethers, groups that enhance the pharmacodynamic properties of the oligomer, and groups that enhance the pharmacokinetic properties of the oligomer. Typical conjugate groups include cholesterol, lipids, cationic lipids, phospholipids, cationic phospholipids, biotin, phenazine, folic acid, phenanthridine, anthraquinone, acridine, fluorescein, rhodamine, coumarin, and dyes. In the context of the present invention, groups that enhance pharmacodynamic properties include groups that improve oligomer uptake, increase oligomer resistance to degradation, and / or enhance sequence-specific hybridization with RNA. In the context of the present invention, groups that enhance pharmacokinetic properties include groups that improve oligomer uptake, distribution, metabolism or excretion. Conjugate sites include, but are not limited to, lipid sites such as cholesterol sites (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), cholic acid (Manoharan et al. al., Bioorg.Med.Chem.Let., 1994, 4, 1053-1060), thioethers such as hexyl-S-trityl thiol (Manoharan et al., Ann. NY Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), thiocholesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res.,). 1992, 20, 533-538), aliphatic chains such as dodecanediol or undecyl residues (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), phospholipids such as di-hexadecyl-rac-glycerol or 1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero- Triethyl-ammonium 3-H-phosphonate (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), polyamine or polyethylene glycol chains (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), or adamantane acetic acid (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 95 3651-3654), a palmityl site (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), or an octadecylamine or hexylamino-carbonyl-oxycholesterol site. The oligonucleotides of the present invention are active drug substances such as aspirin, warfarin, phenylbutazone, ibuprofen, suprofen, fenbufen, ketoprofen, (S)-(+)-planoprofen, carprofen, dansylsarcosine, 2,3 , 5-triiodobenzoic acid, flufenamic acid, folinic acid, benzothiadiazide, chlorothiazide, diazepine, indomethacin, barbiturate, cephalosporin, sulfa drugs, antidiabetics, antibacterials or antibiotics it can. Oligonucleotide-drug conjugates and their preparation are described in US patent application Ser. No. 09 / 334,130 (filed Jun. 15, 1999) and US Pat. Nos. 4,828,979; 4,948,882; No. 5,218,105; No. 5,525,465; No. 5,541,313; No. 5,545,730; No. 5,552,538; No. 5,578,717; No. 5,580,731; No. 5,591,584; No. 5,109,124; No. 5,118,802; No. 5,138,045; No. 5,414 No. 077; No. 5,486,603; No. 5,512,439; No. 5,578,718; No. 5,608,046; No. 4,587,044; No. 4,605,735 No. 4,667,025; No. 4,76 No. 4,789,737; No. 4,824,941; No. 4,835,263; No. 4,876,335; No. 4,904,582; No. 4,958,013 No. 5,082,830; No. 5,112,963; No. 5,214,136; No. 5,082,830; No. 5,112,963; No. 5,214,136; No. 5,245,022; No. 5,254,469; No. 5,258,506; No. 5,262,536; No. 5,272,250; No. 5,292,873; 317,098; 5,371,241; 5,391,723; 5,416,203; 5,451,463; 5,510,475; 5,512 667; No. 5,514,785; 5,565,552; 567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599, 923; 5,599,928 and 5,688,941, each of which is incorporated herein by reference.

与えられた化合物中の全ての位置が均一に修飾されている必要は無く、事実、１を超える前記した修飾は単一の化合物に、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにおいてさえ閉じこむことができる。本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、本発明との関係では、各々が少なくとも１つのモノマーユニット、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドで構成される、２以上の化学的に区別される領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、該オリゴヌクレオチドを修飾して、該オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する増大した抵抗性、増大した細胞摂取、および／または標的核酸に対する増大した結合親和性を付与する少なくとも１つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドの更なる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質として働くことができる。その例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡデュプレックスのＲＮＡストランドを切断する細胞エンドヌクレアーゼである。ＲＮａｓｅ Ｈの活性化は、従って、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大いに高める。その結果、キメラオリゴヌクレオチドを用いる場合、同一の標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートでオキシオリゴヌクレオチドと比較して、より短いオリゴヌクレオチドで匹敵する結果がしばしば得ることができる。本発明のキメラアンチセンス化合物は、前記した２以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチドの複合構造として形成することができる。好ましいキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾糖（好ましくは、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３）を３’末端に取り込んで、ヌクレアーゼ抵抗性を付与し、少なくとも４つの連続する２’−Ｈ糖を持つ領域を取り込んで、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を付与する。そのような化合物はハイブリッドまたはギャップマーとも当該分野で言われてきた。好ましいギャップマーは、少なくとも４つの連続した２’−Ｈ糖を有する少なくとも１つの領域によって分離された３’末端および５’−末端において２’修飾糖（好ましくは、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３）の領域を有し、好ましくは、ホスホロチオエート骨格結合を取り込む。そのようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されるものではないが、その各々をここに引用してその全体を援用する、米国特許第５，０１３，８３０号；第５，１４９，７９７号；第５，２２０，００７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０３，７１１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２３，０６５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号；および第５，７００，９２２号を含む。 It is not necessary for all positions in a given compound to be uniformly modified, and in fact more than one of the above modifications can be confined to a single compound or even to a single nucleoside within an oligonucleotide. it can. The present invention also includes antisense compounds that are chimeric compounds. A “chimeric” antisense compound or “chimera” in the context of the present invention is two or more chemically distinct, each composed of at least one monomer unit, ie a nucleotide in the case of an oligonucleotide compound. Antisense compounds containing a particular region, in particular oligonucleotides. These oligonucleotides typically modify the oligonucleotide to give it increased resistance to nuclease degradation, increased cellular uptake, and / or increased binding affinity for the target nucleic acid. Contains at least one region. Additional regions of the oligonucleotide can serve as substrates for enzymes capable of cleaving RNA: DNA or RNA: RNA hybrids. As an example, RNase H is a cellular endonuclease that cleaves RNA strands of RNA: DNA duplexes. Activation of RNase H thus leads to cleavage of the RNA target, thereby greatly increasing the efficiency of oligonucleotide inhibition of gene expression. As a result, comparable results with shorter oligonucleotides can often be obtained when using chimeric oligonucleotides compared to oxyoligonucleotides with phosphorothioates that hybridize to the same target region. The chimeric antisense compound of the present invention can be formed as a composite structure of two or more oligonucleotides, modified oligonucleotides, oligonucleosides and / or oligonucleotides described above. Preferred chimeric antisense oligonucleotides incorporate at least one 2 ′ modified sugar (preferably 2′-O— (CH 2 ) 2 —O—CH 3 ) at the 3 ′ end to confer nuclease resistance; Incorporate a region with at least 4 consecutive 2'-H sugars to confer RNase H activity. Such compounds have also been referred to in the art as hybrids or gapmers. Preferred gapmers are 2′-modified sugars (preferably 2′-O— (CH 2 ) 2 -O-CH 3 ), preferably incorporating a phosphorothioate backbone bond. Representative US patents that teach the preparation of such hybrid structures include, but are not limited to, US Pat. No. 5,013,830, each of which is hereby incorporated by reference in its entirety. No. 5,149,797; No. 5,220,007; No. 5,256,775; No. 5,366,878; No. 5,403,711; No. 5,491,133; 565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; and 5,700,922.

本発明に従って用いられるアンチセンス化合物は、便宜には、固相合成のよく知られた技術を介してルーチン的に作成することができる。そのような合成のための器具は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含めたいくつかの販売業者によって販売されている。当該分野で知られたそのような合成用のいずれの他の手段も、加えてまたは別法として使用することができる。同様な技術を用いて、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを調製するのはよく知られている。本発明の化合物は、摂取、分布および／または吸収を助けるために、例えば、リポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所または他の処方としての他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合し、それでカプセル化し、それと結合体化し、またはそうでなければそれと会合させることもできる。そのような摂取、分布および／または吸収援助処方の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されるものではないが、その各々をここに引用して援用する、米国特許第５，１０８，９２１号；第５，３５４，８４４号；第５，４１６，０１６号；第５，４５９，１２７号；第５，５２１，２９１号；第５，５４３，１５８号；第５，５４７，９３２号；第５，５８３，０２０号；第５，５９１，７２１号；第４，４２６，３３０号；第４，５３４，８９９号；第５，０１３，５５６号；第５，１０８，９２１号；第５，２１３，８０４号；第５，２２７，１７０号；第５，２６４，２２１号；第５，３５６，６３３号；第５，３９５，６１９号；第５，４１６，０１６号；第５，４１７，９７８号；第５，４６２，８５４号；第５，４６９，８５４号；第５，５１２，２９５号；第５，５２７，５２８号；第５，５３４，２５９号；第５，５４３，１５２号；第５，５５６，９４８号；第５，５８０，５７５号；および第５，５９５，７５６号を含む。   Antisense compounds used in accordance with the present invention can be conveniently made routinely through the well-known techniques of solid phase synthesis. Instruments for such synthesis are sold by several vendors including, for example, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Any other means for such synthesis known in the art can additionally or alternatively be used. It is well known to prepare oligonucleotides such as phosphorothioates and alkylated derivatives using similar techniques. The compounds of the present invention may be combined with other molecules, molecular structures or mixtures of compounds, eg, as liposomes, receptor-targeted molecules, oral, rectal, topical or other formulations to aid in uptake, distribution and / or absorption It can also be mixed, so encapsulated, combined with it, or otherwise associated with it. Representative US patents that teach the preparation of such ingestion, distribution, and / or absorption aid formulations are, but not limited to, US Pat. No. 5,108, each of which is hereby incorporated by reference. No. 921, No. 5,354,844; No. 5,416,016; No. 5,459,127; No. 5,521,291; No. 5,543,158; No. 5,547,932 No. 5,583,020; No. 5,591,721; No. 4,426,330; No. 4,534,899; No. 5,013,556; No. 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; No. 417,978; No. 5,462,854; No. 5,469 No. 854; No. 5,512,295; No. 5,527,528; No. 5,534,259; No. 5,543,152; No. 5,556,948; No. 5,580,575 And 5,595,756.

センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、ＷＯ ９０／１００４８に記載されたもののような有機部位、およびポリ−（Ｌ−リシン）のような標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増大させる他の部位に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。なおさらに、エリプチシンのようなインタカレーティング剤、およびアルキル化剤または金属錯体をセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させて、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾することができる。   Other examples of sense or antisense oligonucleotides include organic sites such as those described in WO 90/10048, and others that increase the affinity of the oligonucleotide for target nucleic acid sequences such as poly- (L-lysine) Including an oligonucleotide covalently bound to the site. Still further, an intercalating agent such as ellipticine, and an alkylating agent or metal complex may be attached to the sense or antisense oligonucleotide to modify the binding specificity of the antisense or sense oligonucleotide to the target nucleotide sequence. it can.

アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４−媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含めたいずれかの遺伝子導入方法によって、あるいはエプスタイン−バールウイルスのような遺伝子導入ベクターを用いることによって、標的核酸配列を含有する細胞に導入することができる。好ましい手法において、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは適当なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含有する細胞をイン・ビボまたはエクス・ビボいずれかにて組換えレトロウイルスベクターと接触させる。適当なレトロウイルスベクターは、限定されるものではないが、ネズミレトロウイルスＭ−ＭｕＬｖ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶに由来するレトロウイルス）、またはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと命名される二重コピーベクター（ＷＯ ９０／１３６４１参照）に由来するものを含む。 Antisense or sense oligonucleotides can be synthesized by any method of gene transfer, including, for example, CaPO 4 -mediated DNA transfection, electroporation, or by using a gene transfer vector such as Epstein-Barr virus. It can be introduced into cells containing the sequence. In a preferred technique, the antisense or sense oligonucleotide is inserted into a suitable retroviral vector. Cells containing the target nucleic acid sequence are contacted with the recombinant retroviral vector either in vivo or ex vivo. Suitable retroviral vectors include, but are not limited to, murine retrovirus M-MuLv, N2 (retrovirus derived from M-MuLV), or dual copy vectors designated as DCT5A, DCT5B and DCT5C (WO 90/13641).

センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＷＯ ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との結合体の形成によって、標的ヌクレオチド配列を含有する細胞に導入することができる。適当なリガンド結合分子は、限定されるものではないが、細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子のコンジュゲーションは、その対応する分子または受容体に結合し、またはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合体化したバージョンの細胞への進入をブロックするリガンド結合分子の能力に実質的に干渉しない。   Sense or antisense oligonucleotides can be introduced into cells containing the target nucleotide sequence by formation of a conjugate with a ligand binding molecule as described in WO 91/04753. Suitable ligand binding molecules include, but are not limited to, cell surface receptors, growth factors, other cytokines, or other ligands that bind to cell surface receptors. Preferably, the conjugation of a ligand binding molecule is based on the ability of the ligand binding molecule to bind to its corresponding molecule or receptor or to block entry of a sense or antisense oligonucleotide or its conjugated version into a cell. Virtually no interference.

別法として、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９０／１０４４８に記載されているように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって、標的核酸配列を含有する細胞に導入することができる。該センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって細胞内で解離する。   Alternatively, sense or antisense oligonucleotides can be introduced into cells containing the target nucleic acid sequence by formation of oligonucleotide-lipid complexes as described in WO 90/10448. The sense or antisense oligonucleotide-lipid complex is preferably dissociated within the cell by an endogenous lipase.

アンチセンスまたはセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、一般には、長さが少なくとも約５ヌクレオチドであり、別法として、長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００ヌクレオチドであり、ここに、この関係で、用語「約」は、言及されたヌクレオチド配列の長さ±その言及された長さの１０％を意味する。   Antisense or sense RNA or DNA molecules are generally at least about 5 nucleotides in length, alternatively, at least about 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 39 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640 , 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890 , 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 nucleotides, in this context, the term “about” refers to the length of the nucleotide sequence referred to ± the reference Means 10% of the measured length.

別法として、二本鎖ＲＮＡを表示させることができる。長さが３０ヌクレオチド未満の二本鎖ＲＮＡは、細胞に導入させると、特異的な遺伝子の発現を阻害する。このメカニズムはＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）として知られており、試薬として用いられる小さな（３０ヌクレオチド未満）ＲＮＡはｓｉＲＮＡとして知られている。ＴＡＴ干渉ＲＮＡは、公知の方法を用いて同定し、合成することができる（Ｓｈｉ ＹＴｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（１）：９−１２（２００３）、ＷＯ／２００３０５６０１２およびＷＯ２００３０６４６２１）。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現の低下が疾患または病気を軽減するであろう疾患における遺伝子発現の量を低下させるのに有用である。   Alternatively, double stranded RNA can be displayed. Double-stranded RNA having a length of less than 30 nucleotides inhibits specific gene expression when introduced into cells. This mechanism is known as RNA-mediated interference (RNAi), and small (less than 30 nucleotides) RNA used as a reagent is known as siRNA. TAT interfering RNA can be identified and synthesized using known methods (Shi YTrends in Genetics 19 (1): 9-12 (2003), WO / 2003056012 and WO2003064621). siRNAs are useful for reducing the amount of gene expression in a disease where a decrease in target gene expression would alleviate the disease or condition.

プローブをＰＣＲ技術で用いて、密接に関連するＴＡＴコーディング配列の同定用の配列のプールを表示させることもできる。   Probes can also be used in PCR techniques to display a pool of sequences for identification of closely related TAT coding sequences.

ＴＡＴをコードするヌクレオチド配列を用いて、そのＴＡＴをコードする遺伝子をマッピングするための、および遺伝的障害を持つ個体の遺伝的分析のためのハイブリダイゼーションプローブを構築することもできる。本明細書中に提供されたヌクレオチド配列を、イン・サイチュハイブリダイゼーション、公知の染色体マーカーに対する連鎖分析、およびライブラリでのハイブリダイゼーションスクリーニングのような公知の技術を用いて染色体、および染色体の特異敵領域にマッピングすることができる。   The nucleotide sequence encoding TAT can also be used to construct hybridization probes for mapping the gene encoding that TAT and for genetic analysis of individuals with genetic disorders. Nucleotide sequences provided herein can be chromosomally and chromosome-specifically identified using known techniques such as in situ hybridization, linkage analysis to known chromosomal markers, and hybridization screening in libraries. Can be mapped to an area.

ＴＡＴにつてのコーディング配列がもう１つの蛋白質に結合する蛋白質をコードする場合（例えば、ＴＡＴが受容体である場合）、ＴＡＴをアッセイで用いて、結合相互作用に関与する他の蛋白質または分子を同定することができる。そのような方法によって、受容体／リガンド結合相互作用の阻害剤を同定することができる。そのような結合相互作用に関与する蛋白質を用いて、ペプチドまたは小分子阻害剤、あるいは結合相互作用のアゴニストについてスクリーニングすることもできる。また、受容体ＴＡＴを用いて、関連リガンドを単離することができる。スクリーニングアッセイは、天然ＴＡＴまたはＴＡＴについての受容体の生物学的活性を模倣するリード化合物を見出すように設計することができる。そのようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに使用できるアッセイを含み、それは、それらを小分子薬物候補を同定するのに特に適切であるようにする。考えられる小分子は、合成有機または無機化合物を含む。該アッセイは、当該分野で良く特徴付けられている、蛋白質−蛋白質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、イムノアッセイおよび細胞ベースのアッセイを含めた、種々の様式で行うことができる。   If the coding sequence for TAT encodes a protein that binds to another protein (eg, when TAT is a receptor), TAT is used in the assay to identify other proteins or molecules involved in binding interactions. Can be identified. By such methods, inhibitors of receptor / ligand binding interactions can be identified. Proteins involved in such binding interactions can be used to screen for peptides or small molecule inhibitors, or agonists of binding interactions. Receptor TAT can also be used to isolate related ligands. Screening assays can be designed to find lead compounds that mimic the biological activity of the receptor for native TAT or TAT. Such screening assays include assays that can be used for high-throughput screening of chemical libraries, which make them particularly suitable for identifying small molecule drug candidates. Possible small molecules include synthetic organic or inorganic compounds. The assay can be performed in a variety of ways, including protein-protein binding assays, biochemical screening assays, immunoassays and cell-based assays, which are well characterized in the art.

ＴＡＴまたはその修飾された形態をコードする核酸を用いて、治療的に言うような試薬の開発およびスクリーニングで言うようなトランスジェニック動物または「ノックアウト」動物を作り出すこともできる。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）は導入遺伝子を含有する細胞を有する動物であり、その導入遺伝子は誕生前、例えば、胚段階で動物、または該動物の先祖に導入された。導入遺伝子は、トランスジェニック動物がそれから発生した細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。１つの具体例において、ＴＡＴをコードするｃＤＮＡを用いて、確立された技術に従ってＴＡＴをコードするゲノムＤＮＡをクローン化することができ、ゲノミック配列を用いて、ＴＡＴをコードするＤＮＡを発現する細胞を含有するトランスジェニック動物を作り出すことができる。トランスジェニック動物、特にマウスまたはラットのような動物を作成するための方法は当該分野で慣用的になっており、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号に記載されている。典型的には、特別な細胞は、組織−特異的エンハンサーと一緒でのＴＡＴ導入遺伝子組込みのために標的化されるであろう。胚段階の動物の生殖系に導入されたＴＡＴをコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物を用いて、ＴＡＴをコードするＤＮＡの増大した発現の効果を調べることができる。そのような動物は、例えば、その過剰発現に関連する病理学的状態からの保護を付与すると考えられる試薬についてのテスター動物として用いることができる。本発明のこの局面に従い、党物を試薬で処理し、導入遺伝子を担う未処理動物と比較した、病理学的状態の低下した発生は、病理学的状態に対する潜在的治療介入を示すであろう。   Nucleic acids encoding TAT or modified forms thereof can also be used to create transgenic or “knock-out” animals as referred to in the development and screening of such therapeutic agents. Transgenic animals (eg, mice or rats) are animals that have cells that contain the transgene, and the transgene was introduced into the animal, or an ancestor of the animal, before birth, eg, at the embryonic stage. A transgene is a DNA that is integrated into the genome of a cell from which a transgenic animal has developed. In one embodiment, cDNA encoding TAT can be cloned according to established techniques using cDNA encoding TAT, and cells that express DNA encoding TAT using genomic sequences can be obtained. Transgenic animals containing can be created. Methods for generating transgenic animals, particularly animals such as mice or rats, have become conventional in the art and are described, for example, in US Pat. Nos. 4,736,866 and 4,870,009. Has been. Typically, special cells will be targeted for TAT transgene integration with tissue-specific enhancers. Transgenic animals containing a copy of a transgene encoding TAT introduced into the germ line of an embryonic stage animal can be used to examine the effect of increased expression of DNA encoding TAT. Such animals can be used, for example, as tester animals for reagents thought to confer protection from pathological conditions associated with its overexpression. In accordance with this aspect of the invention, a reduced incidence of pathological condition compared to an untreated animal that has treated the party with a reagent and carries the transgene will indicate a potential therapeutic intervention for the pathological condition. .

別法として、ＴＡＴの非−ヒトホモログを用いて、ＴＡＴをコードする内因性遺伝子、および動物の胚性幹細胞に導入されたＴＡＴをコードする改変ゲノムＤＮＡの間での相同組換えの結果としてＴＡＴをコードする欠陥または改変遺伝子を有するＴＡＴ「ノックアウト」動物を構築することができる。例えば、ＴＡＴコードするｃＤＮＡを用いて、確立された技術に従って、ＴＡＴをコードするゲノムＤＮＡをクローン化することができる。ＴＡＴをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失するか、あるいは組込みをモニターするのに用いることができる選択マーカーをコードする遺伝子のようなもう１つの遺伝子を置き換えることができる。典型的には、（５’および３’両末端の）改変されていないフランキングＤＮＡの数キロベースを、ベクターに含ませる［例えば、相同組換えベクターの記載については、Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）参照］。該ベクターは（例えば、エレクトロポレーションによって）胚性幹細胞系に導入され、導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えされた細胞を選択する［例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）参照］。次いで、選択された細胞を動物（例えば、マウスまたはラット）の芽細胞に注射して、凝集キメラを形成する［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，ｉｎ Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），ｐｐ．１１３−１５２参照］。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌借腹動物に移植し、該胚を出産予定日まで維持して、「ノックアウト」動物を作成する。その生殖細胞において相同組換えＤＮＡを保有する子孫は、標準的な技術によって同定することができ、これを用いて、動物の全ての細胞が相同組換えＤＮＡを含有する動物を育種することができる。ノックアウト動物は、例えば、ある種の病理学的状態に対して防御するその能力について、およびＴＡＴポリペプチドの不存在による病理学的状態のその発生について特徴付けることができる。   Alternatively, non-human homologues of TAT can be used as a result of homologous recombination between an endogenous gene encoding TAT and a modified genomic DNA encoding TAT introduced into an animal embryonic stem cell. TAT “knockout” animals can be constructed that have a defective or modified gene encoding. For example, TAT-encoding cDNA can be used to clone genomic DNA encoding TAT according to established techniques. A portion of the genomic DNA encoding TAT can be deleted or replaced with another gene, such as a gene encoding a selectable marker that can be used to monitor integration. Typically, several kilobases of unmodified flanking DNA (both 5 ′ and 3 ′ ends) are included in the vector [see, eg, Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987)]. The vector is introduced into an embryonic stem cell line (eg, by electroporation), and cells in which the introduced DNA is homologously recombined with endogenous DNA are selected [eg, Li et al. , Cell, 69: 915 (1992)]. The selected cells are then injected into animal (eg, mouse or rat) blasts to form aggregate chimeras [see, for example, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. et al. J. et al. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. The chimeric embryo is then transplanted into an appropriate pseudopregnant female litter and the embryo is maintained until the date of birth to create a “knockout” animal. Offspring carrying homologous recombination DNA in their germ cells can be identified by standard techniques and can be used to breed animals in which all cells of the animal contain the homologous recombination DNA. . A knockout animal can be characterized, for example, for its ability to protect against certain pathological conditions and for its occurrence of pathological conditions due to the absence of a TAT polypeptide.

ＴＡＴポリペプチドをコードする核酸を遺伝子治療に用いることもできる。遺伝子治療適用において、遺伝子を細胞に導入して、例えば、欠陥遺伝子の置き換えにつき、治療上有効な遺伝子産物のイン・ビボ合成を達成する。「遺伝子治療」は、持続する効果が、治療上有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの一回または反復投与を含む、単一処理、および遺伝子治療剤の投与によって達成される双方の慣用的遺伝子治療を含む。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡは、イン・ビボでの、ある種の遺伝子の発現をブロックするための治療剤として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜によるその制限された摂取によって引き起こされるその低い細胞内濃度にも拘らず、それらが阻害剤として作用する細胞に輸入することができるのが既に示されている（Ｚａｍｅｃｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：４１４３−４１４６［１９８６］）。オリゴヌクレオチドを修飾して、例えば、その負に荷電したホスホジエステル基を荷電していない基で置き換えることによってその取り込みを増強することができる。   Nucleic acids encoding TAT polypeptides can also be used for gene therapy. In gene therapy applications, genes are introduced into cells to achieve in vivo synthesis of therapeutically effective gene products, eg, for replacement of defective genes. “Gene therapy” includes both conventional gene therapy where sustained effects are achieved by single treatment, including single or repeated administration of therapeutically effective DNA or mRNA, and administration of gene therapy agents. Antisense RNA and DNA can be used as therapeutic agents to block the expression of certain genes in vivo. It has already been shown that short antisense oligonucleotides can be imported into cells that act as inhibitors, despite their low intracellular concentrations caused by their limited uptake by the cell membrane (Zamecnik). et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986]). An oligonucleotide can be modified to enhance its uptake, for example, by replacing its negatively charged phosphodiester group with an uncharged group.

核酸を生きた細胞に導入するのに利用できる種々の技術がある。該技術は、核酸を意図した宿主の細胞において、イン・ビトロまたはイン・ビボにて培養細胞に導入されるか否かに応じて変化する。核酸のイン・ビトロでの哺乳動物細胞への導入に適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿方法等の使用を含む。現在好ましいイン・ビボ遺伝子導入技術は、ウイルス（典型的には、レトロウイルス）ベクターでのトランスフェクション、およびウイルス被膜蛋白質−リポソーム媒介トランスフェクション（Ｄｚａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１，２０５−２１０［１９９３］）を含む。いくつかの状況においては、核酸源に、細胞表面膜蛋白質または標的細胞に対して特異的な抗体、標的細胞上の受容体に対するリガンド等のような標的細胞を標的とする剤を供給するのが望ましい。リポソームを使用する場合、エンドサイトーシスに会合した細胞表面膜蛋白質に結合する蛋白質、例えば、特定の細胞型に対して親和性のキャプシド蛋白質またはその断片、サイクリングにおいて内部化を受ける蛋白質に対する抗体、細胞内局所化を標的化し、細胞内半減期を高める蛋白質、は標的化のために、および／または取り込みを容易とするために用いることができる。受容体−媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；およびＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，３４１０−３４１４（１９９０）によって記載されている。遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコルのレビューについては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，８０８−８１３（１９９２）参照。   There are a variety of techniques that can be used to introduce nucleic acids into living cells. The technique varies depending on whether the nucleic acid is introduced into the cultured cell in vitro or in vivo in the intended host cell. Techniques suitable for introduction of nucleic acids into mammalian cells in vitro include the use of liposomes, electroporation, microinjection, cell fusion, DEAE-dextran, calcium phosphate precipitation methods, and the like. Currently preferred in vivo gene transfer techniques include transfection with viral (typically retroviral) vectors, and viral coat protein-liposome mediated transfection (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [ 1993]). In some situations, the nucleic acid source may be supplied with an agent that targets the target cell, such as a cell surface membrane protein or an antibody specific for the target cell, a ligand for a receptor on the target cell, etc. desirable. When using liposomes, proteins that bind to cell surface membrane proteins associated with endocytosis, such as capsid proteins or fragments thereof having affinity for specific cell types, antibodies against proteins that undergo internalization in cycling, cells Proteins that target internal localization and increase intracellular half-life can be used for targeting and / or to facilitate uptake. The technique of receptor-mediated endocytosis is described, for example, by Wu et al. , J .; Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); and Wagner et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). For a review of gene marking and gene therapy protocols, see Anderson et al. , Science 256, 808-813 (1992).

本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定で有用である。この点に関し、新しい染色体マーカーを同定する継続的な要望が存在する。と言うのは、比較的少数の染色体マーキング試薬しか、現実の配列データに基づいて、現在利用できないからである。本発明の各ＴＡＴ核酸分子は、染色体マーカーとして用いることができる。   Nucleic acid molecules encoding the TAT polypeptides or fragments thereof described herein are useful for chromosome identification. In this regard, there is a continuing need to identify new chromosomal markers. This is because only a relatively small number of chromosome marking reagents are currently available based on real sequence data. Each TAT nucleic acid molecule of the present invention can be used as a chromosomal marker.

本発明のＴＡＴポリペプチドおよび核酸分子は組織タイプ分けで診断的に用いることもでき、そこでは、本発明のＴＡＴポリペプチドは、もう１つのものと比較して１つの組織で異なって発現させることができ、好ましくは、同一組織タイプの正常な組織と比較して、病気の組織において異なって発現され得る。ＴＡＴ核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザーン分析およびウエスタン分析用のプローブの作成で用途が見出される。   The TAT polypeptides and nucleic acid molecules of the invention can also be used diagnostically in tissue typing, where the TAT polypeptide of the invention is expressed differently in one tissue compared to another. Preferably, it can be expressed differently in diseased tissue compared to normal tissue of the same tissue type. TAT nucleic acid molecules find use in creating probes for PCR, Northern analysis, Southern analysis and Western analysis.

本発明は、ＴＡＴポリペプチドを模倣するもの（アゴニスト）を同定し、あるいはＴＡＴポリペプチドの効果を妨げるもの（アンタゴニスト）を同定するために化合物をスクリーニングする方法を含む。アンタゴニスト薬物候補のためのスクリーニングアッセイは、本明細書中で確認される遺伝子によってコードされるＴＡＴポリペプチドに結合し、またはそれとで複合体を形成し、あるいはそうでなければ、例えば、細胞からのＴＡＴポリペプチドの発現の阻害を含めた、コードされたポリペプチドと他の細胞蛋白質との相互作用に干渉する化合物を同定するように設計される。そのようなスクリーニングアッセイは、化学ライブラリ高スループットスクリーニングに使用できるアッセイを含み、これは、それらが小分子薬物候補を同定するのに特に適したものとする。   The invention includes methods of screening compounds to identify those that mimic TAT polypeptides (agonists) or to identify those that interfere with the effects of TAT polypeptides (antagonists). Screening assays for antagonist drug candidates bind to or form a complex with the TAT polypeptide encoded by the gene identified herein, or otherwise, eg, from a cell Designed to identify compounds that interfere with the interaction of the encoded polypeptide with other cellular proteins, including inhibition of TAT polypeptide expression. Such screening assays include assays that can be used for chemical library high-throughput screening, which make them particularly suitable for identifying small molecule drug candidates.

該アッセイは、当該分野で良く特徴付けられている蛋白質−蛋白質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、および細胞ベースのアッセイを含めた種々の様式で行うことができる。   The assay can be performed in a variety of ways, including protein-protein binding assays, biochemical screening assays, immunoassays, and cell-based assays that are well characterized in the art.

アンタゴニストのための全てのアッセイは、それらが、これらの２つの成分が相互作用するようにできるのに十分な条件下で、かつ十分な時間の間、本明細書中で確認される核酸によってコードされるＴＡＴポリペプチドと薬物候補を接触させることを必要とする点で共通する。   All assays for antagonists are encoded by the nucleic acids identified herein under conditions sufficient and for a sufficient amount of time to allow these two components to interact. Common in that it requires contacting the drug candidate with the TAT polypeptide being made.

結合アッセイにおいて、相互作用は結合であって、形成される複合体を単離することができるか、あるいはそれは反応混合物中で検出することができる。特別な具体例において、本明細書中で確認される遺伝子によってコードされるＴＡＴポリペプチドまたは薬物候補は、共有結合または非共有結合によって、固相に、例えば、マイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般には、固相をＴＡＴポリペプチドの溶液でコーティングし、乾燥することによって達成される。別法として、固定化すべきＴＡＴポリペプチドに対して特異的な固定化抗体、例えば、モノクローナル抗体を用いて、それを固体表面に係留させることができる。アッセイは、検出可能な標識によって標識することができる非−固定化成分を固定化された成分、例えば、係留された成分を含有するコーティングされた表面に加えることによって行われる。反応が完了すると、例えば、洗浄によって反応しなかった成分を除去し、固体表面に係留された複合体を検出する。元来固定化されていない成分が検出可能な標識を運ぶ場合、表面に固定化された標識の検出は、複合体化が起こったことを示す。元来、固定化されていない成分が標識を運ばない場合、複合体化は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識された抗体を用いることによって検出することができる。   In binding assays, the interaction is binding and the complex formed can be isolated or it can be detected in the reaction mixture. In particular embodiments, the TAT polypeptide or drug candidate encoded by the gene identified herein is immobilized to a solid phase, eg, a microtiter plate, by covalent or non-covalent bonds. Non-covalent binding is generally achieved by coating the solid phase with a solution of TAT polypeptide and drying. Alternatively, an immobilized antibody specific for the TAT polypeptide to be immobilized, such as a monoclonal antibody, can be used to anchor it to the solid surface. The assay is performed by adding a non-immobilized component, which can be labeled with a detectable label, to an immobilized component, eg, a coated surface containing the anchored component. When the reaction is completed, for example, components that have not reacted by washing are removed, and the complex anchored on the solid surface is detected. If the originally non-immobilized component carries a detectable label, detection of the label immobilized on the surface indicates that complexation has occurred. If the originally non-immobilized component does not carry a label, complexation can be detected, for example, by using a labeled antibody that specifically binds to the immobilized complex.

もし候補化合物が本明細書中で確認される遺伝子によってコードされる特定のＴＡＴポリペプチドと相互作用するが、それに結合しなければ、そのポリペプチドとのその相互作用は、蛋白質−蛋白質相互作用を検出するためのよく知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、例えば、架橋、共免疫沈澱、およびグラジエントまたはクロマトグラフィカラムを通す共精製のような伝統的なアプローチを含む。加えて、蛋白質−蛋白質相互作用は、Ｃｈｅｖｒａｙ ａｎｄ Ｎａｔｈａｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５７８９−５７９３（１９９１）によって開示されているように、Ｆｉｅｌｄｓおよび共同研究者によって記載された酵母−ベースの遺伝子系（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３４０：２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８−９５８２（１９９１））を用いることによってモニターすることができる。酵母ＧＡＬ４のような多くの転写活性化は、２つの物理的に区別されるモジュラードメインよりなり、１つはＤＮＡ−結合ドメインとして作用し、他の一つは転写−活性化ドメインとして機能する。（一般には、「２−ハイブリッド系」と言われる）前記刊行物に記載された酵母発現系は、この特性を利用し、２つのハイブリッド蛋白質を使用し、１つは、そこでは標的蛋白質がＧＡＬ４のＤＮＡ−結合ドメインに融合されており、もう１つは、そこでは、候補活性化蛋白質が活性化ドメインに融合されている。ＧＡＬ４−活性化プロモータの制御下でのＧＡＬ１−ｌａｃＺ受容体遺伝子の発現は、蛋白質−蛋白質相互作用を介するＧＡＬ４活性の復元に依存する。相互作用ポリペプチドを含有するコロニーを、β−ガラクトシダーゼに対する発色性基質で検出する。２−ハイブリッド技術を用いる２つの特異的蛋白質の間の蛋白質−蛋白質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲＴＭ）はＣｌｏｎｔｅｃｈから商業的に入手可能である。この系を拡大して、特異的蛋白質相互作用に関与する蛋白質ドメインをマップし、ならびにこれらの相互作用で非常に重要なアミノ酸残基を突き止めることもできる。 If a candidate compound interacts with a particular TAT polypeptide encoded by the gene identified herein, but does not bind to it, its interaction with that polypeptide will cause a protein-protein interaction. It can be assayed by well-known methods for detection. Such assays include traditional approaches such as cross-linking, co-immunoprecipitation, and co-purification through a gradient or chromatographic column. In addition, protein-protein interactions are described in Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991), as described by Fields and co-workers (Fields and Song, Nature (London), 340: 245-246 (1989)). Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582 (1991)). Many transcriptional activations, such as yeast GAL4, consist of two physically distinct modular domains, one acting as a DNA-binding domain and the other functioning as a transcription-activation domain. The yeast expression system described in the publication (generally referred to as “2-hybrid system”) takes advantage of this property and uses two hybrid proteins, one of which the target protein is GAL4 The other, where the candidate activation protein is fused to the activation domain. Expression of the GAL1-lacZ receptor gene under the control of the GAL4-activated promoter depends on the restoration of GAL4 activity through protein-protein interactions. Colonies containing interacting polypeptides are detected with a chromogenic substrate for β-galactosidase. A complete kit (MATCHMAKER ™ ) for identifying protein-protein interactions between two specific proteins using two-hybrid technology is commercially available from Clontech. This system can be expanded to map protein domains involved in specific protein interactions, as well as to identify amino acid residues that are very important in these interactions.

本明細書中で確認されるＴＡＴポリペプチドをコードする遺伝子、および他の細胞内または細胞外成分の相互作用に干渉する化合物は以下のようにテストすることができる：通常、２つの蛋白質の相互作用および結合を可能とする条件および時間にて、当該遺伝子の産物および細胞内または細胞外成分を含有する反応混合物を調製する。結合を阻害する候補化合物の能力をテストするために、テスト化合物の不存在下および存在下で反応を実行する。加えて、プラセボを第３の反応混合物に加えて、陽性対照として供することができる。混合物中に存在するテスト化合物および細胞内または細胞外成分の間の結合（複合体形成）は、前記したようにモニターされる。テスト化合物を含有する反応混合物中ではなく、対照反応中での複合体の形成は、テスト化合物が、テスト化合物およびその反応パートナーの相互作用に干渉することを示す。   The genes encoding the TAT polypeptides identified herein, and compounds that interfere with the interaction of other intracellular or extracellular components can be tested as follows: usually the interaction of two proteins A reaction mixture is prepared containing the product of the gene and intracellular or extracellular components at conditions and times allowing action and binding. To test the ability of a candidate compound to inhibit binding, the reaction is performed in the absence and presence of the test compound. In addition, a placebo can be added to the third reaction mixture to serve as a positive control. Binding (complex formation) between the test compound and the intracellular or extracellular component present in the mixture is monitored as described above. Formation of the complex in the control reaction but not in the reaction mixture containing the test compound indicates that the test compound interferes with the interaction of the test compound and its reaction partner.

アンタゴニストについてアッセイするためには、パートナー活性についてスクリーニングすべき化合物と共にＴＡＴポリペプチドを細胞に加えることができ、ＴＡＴポリペプチドの存在下で注目する活性を阻害する化合物の能力は該化合物がＴＡＴポリペプチドに対してアンタゴニストであることを示す。別法として、競合阻害アッセイに適した条件下で、ＴＡＴポリペプチドおよび潜在的アンタゴニストと、膜−結合ＴＡＴポリペプチド受容体または組換え受容体と合わせることによってアンタゴニストを検出することができる。受容体に結合したＴＡＴポリペプチド分子の数を用いて、潜在的アンタゴニストの有効性を判断できるように、放射能によるように、ＴＡＴポリペプチドを標識することができる。受容体をコードする遺伝子は、当業者に知られた多数の方法、例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティングによって同定することができる。Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ ５（１９９１）。好ましくは、発現クローニングを使用し、そこでは、ポリアデニル化ＲＮＡをＴＡＴポリペプチドに応答性の細胞から調製し、このＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリをプールに分け、これを用いて、ＴＡＴポリペプチドに反応性でないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクトする。スライドグラス上で増殖させるトランスフェクトされた細胞を、標識されたＴＡＴポリペプチドに暴露する。ＴＡＴポリペプチドは、部位特異的蛋白質キナーゼ用の認識部位をヨウ素化、または該部位を含めることを包含する種々の手段によって標識することができる。固定およびインキュベーションに続いて、スライドをオートラジオグラフィー分析に付す。陽性プールを同定し、サブ−プールを調製し、反応性サブ−プールおよび再スクリーニングプロセスを用いて再度トランスフェクトし、最終的に、推定受容体をコードする単一のクローンが得られる。   To assay for an antagonist, a TAT polypeptide can be added to a cell along with the compound to be screened for partner activity, and the compound's ability to inhibit the activity of interest in the presence of the TAT polypeptide is determined by the compound's ability to inhibit the TAT polypeptide. Is an antagonist. Alternatively, antagonists can be detected by combining the TAT polypeptide and potential antagonist with a membrane-bound TAT polypeptide receptor or a recombinant receptor under conditions suitable for competitive inhibition assays. The number of TAT polypeptide molecules bound to the receptor can be used to label the TAT polypeptide, such as by radioactivity, so that the effectiveness of a potential antagonist can be determined. The gene encoding the receptor can be identified by a number of methods known to those skilled in the art, such as ligand panning and FACS sorting. Coligan et al. , Current Protocols in Immun. , 1 (2): Chapter 5 (1991). Preferably, expression cloning is used, in which polyadenylated RNA is prepared from cells responsive to TAT polypeptide, and cDNA libraries made from this RNA are divided into pools, which are used to generate TAT polypeptide. Transfect non-reactive COS cells or other cells. Transfected cells that are grown on glass slides are exposed to labeled TAT polypeptide. The TAT polypeptide can be labeled by a variety of means including iodination or inclusion of a recognition site for a site-specific protein kinase. Following fixation and incubation, the slides are subjected to autoradiographic analysis. Positive pools are identified, sub-pools are prepared and re-transfected using reactive sub-pools and a rescreening process, ultimately resulting in a single clone encoding the putative receptor.

受容体同定のための代替アプローチとして、標識されたＴＡＴポリペプチドを、受容体分子を発現する細胞膜または抽出物の調製物と光親和性−連結させることができる。架橋された材料はＰＡＧＥによって分解し、Ｘ−線フィルムに暴露する。受容体を含有する標識された複合体を切り出し、ペプチド断片に分解し、蛋白質ミクロ−配列決定に付すことができる。ミクロ−配列決定から得られたアミノ酸配列を用いて、縮重オリゴヌクレオチドプローブ組を設計して、ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングし、推定受容体をコードする遺伝子を同定することとなろう。   As an alternative approach for receptor identification, a labeled TAT polypeptide can be photoaffinity-linked with a cell membrane or extract preparation that expresses the receptor molecule. The crosslinked material is degraded by PAGE and exposed to X-ray film. The labeled complex containing the receptor can be excised, broken down into peptide fragments, and subjected to protein micro-sequencing. Using the amino acid sequence obtained from micro-sequencing, a degenerate oligonucleotide probe set will be designed to screen the cDNA library and identify the gene encoding the putative receptor.

アンタゴニストのためのもう１つのアッセイにおいて、受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物を、候補化合物の存在下で標識されたＴＡＴポリペプチドと共にインキュベートする。次いで、この相互作用を増強し、またはブロックする化合物の能力を測定できよう。   In another assay for antagonists, mammalian cells or membrane preparations that express the receptor are incubated with the labeled TAT polypeptide in the presence of the candidate compound. The ability of the compound to enhance or block this interaction could then be measured.

潜在的アンタゴニストのより具体的な例は、免疫グロブリンとＴＡＴポリペプチドの融合に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限定されるものではないが、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体および抗体断片、単一−鎖抗体、抗−イディオタイプ抗体、およびそのような抗体または断片のキメラまたはヒト化バージョン、ならびにヒト抗体または抗体断片を含めた抗体を含む。別法として、潜在的アンタゴニストは密接に関連する蛋白質、例えば、受容体を認識するが、影響を与えず、それにより、ＴＡＴポリペプチドの作用を阻害するＴＡＴポリペプチドの突然変異した形態であり得る。   More specific examples of potential antagonists are oligonucleotides that bind to fusions of immunoglobulins and TAT polypeptides, particularly but not limited to polyclonal and monoclonal antibodies and antibody fragments, single-chain antibodies, anti-antibody -Idiotype antibodies, and chimeric or humanized versions of such antibodies or fragments, as well as antibodies, including human antibodies or antibody fragments. Alternatively, a potential antagonist can be a mutated form of a TAT polypeptide that recognizes but does not affect closely related proteins, eg, receptors, thereby inhibiting the action of the TAT polypeptide. .

もう１つの潜在的ＴＡＴポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ構築体であり、ここに、例えば、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、標的化されたｍＲＮＡにハイブリダイズさせ、蛋白質翻訳を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接的にブロックするように作用する。アンチセンス技術を用いて、三重ラセン形成またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介して遺伝子発現を制御することができ、その方法は共に、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここに、成熟ＴＡＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コーディング部分を用いて、長さが約１０ないし４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に対して相補的なように設計され（三重ラセン−Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；Ｄｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１））、それにより、転写およびＴＡＴポリペプチドの生産を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはイン・ビボにてｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のＴＡＴポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８８））。前記したオリゴヌクレオチドを、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをイン・ビボで発現させて、ＴＡＴポリペプチドの生産を阻害するように、細胞に送達することもできる。アンチセンスＤＮＡを用いる場合、例えば、標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０および＋１０位置の間の、翻訳−開始部位に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。   Another potential TAT polypeptide antagonist is an antisense RNA or DNA construct prepared using antisense technology, where, for example, the antisense RNA or DNA molecule hybridizes to the targeted mRNA. Acts to directly block the translation of mRNA by allowing soybeans to interfere with protein translation. Antisense technology can be used to control gene expression through triple helix formation or antisense DNA or RNA, both of which are based on the binding of polynucleotides to DNA or RNA. For example, an antisense RNA oligonucleotide about 10-40 base pairs in length is designed here using the 5 'coding portion of the polynucleotide sequence encoding the mature TAT polypeptide. DNA oligonucleotides are designed to be complementary to a region of the gene involved in transcription (Triple-Lee et al., Nucl. Acids Res. 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), thereby preventing transcription and production of TAT polypeptides. Antisense RNA oligonucleotides hybridize to mRNA in vivo and block translation of mRNA molecules into TAT polypeptides (Antisense-Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors). of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)). The oligonucleotides described above can also be delivered to cells such that antisense RNA or DNA is expressed in vivo to inhibit TAT polypeptide production. When using antisense DNA, for example, oligodeoxyribonucleotides derived from the translation-start site between about -10 and +10 positions of the target gene nucleotide sequence are preferred.

潜在的アンタゴニストは、ＴＡＴポリペプチドの活性部位、受容体結合部位、または成長因子もしくは他の関連結合部位に結合し、それにより、ＴＡＴポリペプチドの正常な生物学的活性をブロックする小分子を含む。小分子の例は、限定されるものではないが、小さなペプチドまたはペプチド−様分子、好ましくは可溶性ペプチド、および合成非−ペプチドの有機または無機分子を含む。   Potential antagonists include small molecules that bind to the active site, receptor binding site, or growth factor or other relevant binding site of a TAT polypeptide, thereby blocking the normal biological activity of the TAT polypeptide. . Examples of small molecules include, but are not limited to, small peptides or peptide-like molecules, preferably soluble peptides, and synthetic non-peptide organic or inorganic molecules.

リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列−特異的ハイブリダイゼーション、続いてのヌクレオチド内分解切断によって作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、公知の技術によって同定することができる。さらなる詳細については、例えば、Ｒｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：４６９−４７１（１９９４）、および（１９９７年９月１８日に公開された）ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９７／３３５５１参照。   Ribozymes are enzymatic RNA molecules that can catalyze the specific cleavage of RNA. Ribozymes act by sequence-specific hybridization to complementary target RNA, followed by endonucleolytic cleavage. Specific ribozyme cleavage sites within a potential RNA target can be identified by known techniques. For further details see, eg, Rossi, Current Biology, 4: 469-471 (1994), and PCT Publication No. WO 97/33551 (published 18 September 1997).

転写を阻害するのに用いられる三重−ラセン形成された核酸分子は一本鎖であって、デオキシヌクレオチドで構成されるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般には、デュプレックスの１つのストランド上にプリンまたはピリミジンの相当の大きさのストレッチを必要とする、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基−対合則を介して三重−ラセン形成を促進するように設計される。更なる詳細については、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９７／３３５５１，ｓｕｐｒａ参照。   The triple-formed nucleic acid molecule used to inhibit transcription should be single-stranded and composed of deoxynucleotides. The base composition of these oligonucleotides generally promotes triple-helix formation via Hoogsteen base-pairing rules, which require a substantial size stretch of purine or pyrimidine on one strand of the duplex. Designed as such. For further details see, eg, PCT Publication No. WO 97/33551, supra.

これらの小さな分子は、前記したスクリーニングアッセイのいずれかの１以上によって、および／または当業者によく知られたいずれかの他のスクリーニング技術によって同定することができる。   These small molecules can be identified by one or more of any of the screening assays described above and / or by any other screening technique well known to those skilled in the art.

単離されたＴＡＴポリペプチド−コーディング核酸は、ここでは、当業者によく知られた、かつ本明細書中に記載された技術を用いてＴＡＴポリペプチドを組換えにより生産するために用いることができる。今度は、生産されたＴＡＴポリペプチドは、当該分野で良く知られ、かつ本明細書中に記載された技術を用いて抗−ＴＡＴ抗体を作成するために使用することができる。   An isolated TAT polypeptide-encoding nucleic acid is used herein to recombinantly produce a TAT polypeptide using techniques well known to those of skill in the art and described herein. it can. In turn, the produced TAT polypeptides can be used to make anti-TAT antibodies using techniques well known in the art and described herein.

本明細書中で確認されるＴＡＴポリペプチドに特異的に結合する抗体、ならびに先に開示されたスクリーニングアッセイによって同定される他の分子は、医薬組成物の形態にて、癌を含めた種々の障害の治療のために投与することができる。   Antibodies that specifically bind to the TAT polypeptides identified herein, as well as other molecules identified by the previously disclosed screening assays, can be expressed in various forms, including cancer, in the form of pharmaceutical compositions. Can be administered to treat a disorder.

もし、ＴＡＴポリペプチドが細胞内であって、全抗体を阻害剤として用いるならば内部化抗体が望ましい。しかしながら、リポフェクションまたはリポソームを用いて、抗体、または抗体断片を細胞に送達することもできる。抗体断片を用いる場合、標的蛋白質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい疎外性断片が好ましい。例えば、抗体の可変−領域配列に基づき、標的蛋白質配列に結合する能力を保有するペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは化学的に合成することができ、および／または組換えＤＮＡ技術によって生産することができる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）参照。   If the TAT polypeptide is intracellular and the whole antibody is used as an inhibitor, an internalized antibody is desirable. However, antibodies or antibody fragments can also be delivered to cells using lipofection or liposomes. When using antibody fragments, the smallest alienating fragment that specifically binds to the binding domain of the target protein is preferred. For example, peptide molecules can be designed that possess the ability to bind to a target protein sequence based on the variable-region sequence of the antibody. Such peptides can be synthesized chemically and / or produced by recombinant DNA technology. For example, Marasco et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993).

ここに、該処方は治療すべき特定の症状で必要な１を超える活性な化合物、好ましくは、相互に悪影響しない補充的な活性を持つ化合物を含有することもできる。別法として、あるいは加えて、該組成物は、例えば、細胞傷害性剤、サイトカイン、化学療法剤、または成長−阻害剤のようなその機能を高める剤を含むことができる。そのような分子は、適当には、意図した目的で効果的な量で組み合わせて存在させる。   Here, the formulation may also contain more than one active compound as required for the particular condition to be treated, preferably compounds with supplementary activity that do not adversely affect each other. Alternatively or additionally, the composition can include an agent that enhances its function, such as, for example, a cytotoxic agent, cytokine, chemotherapeutic agent, or growth-inhibitor. Such molecules are suitably present in combination in amounts that are effective for the purpose intended.

以下の実施例は説明目的のためだけに提供され、断じて、本発明の範囲を限定する意図のものではない。   The following examples are provided for illustrative purposes only, and are not intended to limit the scope of the invention in any way.

本明細書中で引用された全ての特許および刊行物文献は、ここに、引用してその全体を援用する。   All patent and publication references cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

実施例中で言及される商業的に入手可能な試薬は、特に断りのない限り、製造業者の指示に従って用いた。以下の実施例において確認され、本明細書を通じて、ＡＴＣＣ受託番号によって確認される細胞の源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡである。   Commercially available reagents referred to in the examples were used according to manufacturer's instructions unless otherwise indicated. The source of cells identified in the examples below and identified throughout the specification by ATCC accession number is American Type Culture Collection, Manassas, VA.

実施例１：ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）を用いる組織発現プロファイリング
その発現が、他の腫瘍および／または正常な組織と比較して注目する特定の腫瘍組織において有意にアップレギュレートされるポリペプチド（およびそれらをコードする核酸）を同定する試みにおいて、遺伝子発現情報を含む所有権があるデータベース（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標），Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を分析した。具体的には、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）データベースと共に用いるためのＧｅｎｅ Ｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤを通じて入手できるソフトウェア、あるいはＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）データベースと共に用いるためのＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．で書かれ、開発された所有権のあるソフトウェアいずれかを用い、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）データベースの分析を行った。分析における陽性ヒトの率は、例えば、組織特異性、腫瘍特異性、および正常な必須のおよび／または正常な増殖組織における発現レベルを含めたいくつかの基準に基づくものである。以下に、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）データベースの分析から決定されたその組織発現プロファイルは、他の腫瘍および／または正常な組織と比較して特異的腫瘍または複数腫瘍における高い組織発現および発現の有意なアップレギュレーション、および所望により、正常な必須および／または正常な増殖性組織における比較的低い発現を証明する分子のリストを示す。それ自体、以下にリストする分子は、哺乳動物における癌の診断および治療のための優れたポリペプチド標的である。 Example 1: Tissue Expression Profiling Using GeneExpress® Polypeptides whose expression is significantly upregulated in specific tumor tissues of interest compared to other tumors and / or normal tissues (and their In an attempt to identify a nucleic acid encoding (a), a proprietary database containing gene expression information (GeneExpress®, Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD) was analyzed. Specifically, Gene Logic Inc. for use with the GeneExpress® database. , Software available through Gaithersburg, MD, or Genentech, Inc. for use with the GeneExpress® database. The GeneExpress (R) database was analyzed using any proprietary software written and developed in The rate of positive humans in the analysis is based on several criteria including, for example, tissue specificity, tumor specificity, and expression levels in normal essential and / or normal proliferating tissues. Below, its tissue expression profile, determined from analysis of the GeneExpress® database, shows a significant increase in high tissue expression and expression in specific tumors or multiple tumors compared to other tumors and / or normal tissues. A list of molecules that demonstrate regulation and, optionally, relatively low expression in normal essential and / or normal proliferative tissues is shown. As such, the molecules listed below are excellent polypeptide targets for the diagnosis and treatment of cancer in mammals.

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実施例２：癌性腫瘍におけるＴＡＴポリペプチドのアップレギュレーションを検出するためのマイクロアレイ分析
しばしば数千の遺伝子配列を含有する核酸マイクロアレイは、それらの正常なカウンターパートと比較して病気の組織において異なって発現される遺伝子を同定するのに有用である。核酸マイクロアレイを用い、テストおよび対照組織試料からのテストおよび対照ｍＲＮＡ試料を逆転写し、標識してｃＤＮＡプローブを作成する。次いで、ｃＤＮＡプローブを固体支持体に固定化された核酸のアレイにハイブリダイズさせる。アレイは、該アレイの各メンバーの配列および位置が知られているように構成する。例えば、ある種の病気状態で発現されることが知られている遺伝子の選択を、固体支持体上に配列することができる。特定のアレイメンバーと標識されたプローブとのハイブリダイゼーションは、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現することを示す。もし、テスト（病気組織）試料からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルが対照（正常な組織）試料からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルよりも大きければ、病気組織において過剰発現される遺伝子または複数遺伝子が同定される。この関係の結果、病気組織における過剰発現された蛋白質は病気状態の存在についての診断マーカーとしてのみならず、病気状態の治療のための治療標的としても有用であることになる。
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 Example 2: Microarray analysis to detect up-regulation of TAT polypeptides in cancerous tumors Nucleic acid microarrays, often containing thousands of gene sequences, differ in diseased tissue compared to their normal counterparts Useful for identifying expressed genes. Using nucleic acid microarrays, test and control mRNA samples from test and control tissue samples are reverse transcribed and labeled to create cDNA probes. The cDNA probe is then hybridized to an array of nucleic acids immobilized on a solid support. The array is constructed so that the sequence and position of each member of the array is known. For example, a selection of genes known to be expressed in certain disease states can be arranged on a solid support. Hybridization of a particular array member with a labeled probe indicates that the sample from which the probe is derived expresses that gene. If the probe hybridization signal from the test (sick tissue) sample is greater than the probe hybridization signal from the control (normal tissue) sample, the gene or genes that are overexpressed in the disease tissue are identified. . As a result of this relationship, overexpressed proteins in diseased tissues will be useful not only as diagnostic markers for the presence of disease states, but also as therapeutic targets for the treatment of disease states.

核酸のハイブリダイゼーションの方法およびマイクロアレイ技術は当該分野で良く知られている。１つの例において、ハイブリダイゼーションのための核酸およびプローブの具体的調製、スライド、およびハイブリダイゼーション条件は、ここに引用して援用する。２００１年３月２０日に出願されたＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／１０４８２において全て詳細に記載されている。   Nucleic acid hybridization methods and microarray technology are well known in the art. In one example, specific preparations of nucleic acids and probes for hybridization, slides, and hybridization conditions are incorporated herein by reference. All are described in detail in PCT Patent Application No. PCT / US01 / 10482 filed on March 20, 2001.

本実施例においては、種々のヒト組織に由来する癌性腫瘍を、特定の癌性腫瘍において過剰発現されるポリペプチドを同定する試みにおいて、異なる組織タイプおよび／または非−癌性ヒト組織からの癌性腫瘍に対するアップレギュレートされた遺伝子発現について調べた。ある実験においては、（しばしば同一患者からの）同一組織タイプの癌性ヒト腫瘍組織および非−癌性ヒト腫瘍組織を入手し、ＴＡＴポリペプチド発現について分析した。加えて、種々の異なるヒト腫瘍のいずれかからの癌性ヒト腫瘍組織を入手し、肝臓、腎臓および肺を含めた上皮起源の非−癌性ヒト組織をプールすることによって調製された「普遍的な」上皮対照試料と比較した。プールされた組織から単離されたｍＲＮＡは、これらの異なる組織からの発現された遺伝子産物の混合物を表す。プールされた対照試料を用いるマイクロアレイハイブリダイゼーション実験により、２−色分析において直線プロットが作成された。次いで、２−色分析において作成された線の傾きを用いて、各実験内で（テスト：対照検出）の比率を正規化した。次いで、種々の実験からの正規化された比率を比較し、これを用いて、遺伝子発現のクラスタリングを同定した。かくして、プールされた「普遍的対照」試料は、単純な２−試料比較において有効な相対的遺伝子発現の判断を可能としたのみならず、いくつかの実験を通じての多数の試料の比較も可能とした。   In this example, cancerous tumors derived from various human tissues are identified in different tissue types and / or non-cancerous human tissues in an attempt to identify polypeptides that are overexpressed in a particular cancerous tumor. The upregulated gene expression for cancerous tumors was examined. In one experiment, cancerous and non-cancerous human tumor tissues of the same tissue type (often from the same patient) were obtained and analyzed for TAT polypeptide expression. In addition, a “universal” prepared by obtaining cancerous human tumor tissue from any of a variety of different human tumors and pooling non-cancerous human tissue of epithelial origin, including liver, kidney and lung. Compared to the "na" epithelial control sample. MRNA isolated from pooled tissue represents a mixture of expressed gene products from these different tissues. Microarray hybridization experiments using pooled control samples produced a linear plot in a two-color analysis. The slope of the line created in the 2-color analysis was then used to normalize the ratio (test: control detection) within each experiment. The normalized ratios from various experiments were then compared and used to identify gene expression clustering. Thus, the pooled “universal control” sample not only allows for effective relative gene expression judgments in a simple two-sample comparison, but also allows comparison of multiple samples through several experiments. did.

本実験においては、本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドをコードする核酸配列に由来する核酸プローブを、マイクロアレイの作成で用い、種々の腫瘍組織からのＲＮＡをそれに対するハイブリダイゼーションで用いた。以下にこれらの実験の結果を示し、これは、本発明の種々のＴＡＴポリペプチドが、それらの正常なカウンターパート組織と比較して、種々のヒト腫瘍組織で有意に過剰発現されることを示す。さらに、以下に示す分子の全ては、「普遍的」上皮対照におけるのと比較してそれらの特異的腫瘍組織で有意に過剰発現される。前記したように、これらのデータは、本発明のＴＡＴポリペプチドが、１以上の癌性腫瘍の存在についての診断マーカーとして有用であるのみならず、それらの腫瘍の治療のための治療標的として働くことも示す。   In this experiment, nucleic acid probes derived from nucleic acid sequences encoding the TAT polypeptides described herein were used in the production of microarrays, and RNA from various tumor tissues was used for hybridization thereto. The results of these experiments are shown below and indicate that the various TAT polypeptides of the present invention are significantly overexpressed in various human tumor tissues compared to their normal counterpart tissues. . In addition, all of the molecules shown below are significantly overexpressed in their specific tumor tissue compared to in the “universal” epithelial control. As noted above, these data indicate that the TAT polypeptides of the present invention not only serve as diagnostic markers for the presence of one or more cancerous tumors, but also serve as therapeutic targets for the treatment of those tumors It also shows that.

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実施例３：ＴＡＴ ｍＲＮＡ発現の定量的分析
このアッセイにおいては、５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標））およびリアルタイム定量的ＰＣＲ（例えば、ＡＢＩ Ｐｒｉｚｍ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））を用いて、他の癌性腫瘍または正常な非−癌性組織と比較して、癌性腫瘍または複数腫瘍において有意に過剰発現される遺伝子を見出した。５’ヌクレアーゼアッセイ反応は、蛍光ＰＣＲ−ベースの技術であり、これは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を利用して、リアルタイムで遺伝子発現をモニターした。（その配列が当該遺伝子または注目するＥＳＴ配列に基づく）２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンを作成する。第３のオリゴヌクレオチド、またはプローブは、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。該プローブはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって延長できず、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素で標識する。レポーター色素からのいずれのレーザー−誘導発光も、２つの色素がプローブ上にあるように一緒に近くに位置する場合、クエンチング色素によって消光される。ＰＣＲ増幅反応の間に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型−特異的にプローブを切断する。得られたプローブ断片は溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは、第２のフルオロフォアの消光効果はない。レポーター色素の１つの分子は、合成された各新しい分子について遊離され、消光されないレポーター色素の検出は、データの定量的な解釈のための基礎を提供する。
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 Example 3 Quantitative Analysis of TAT mRNA Expression In this assay, a 5 ′ nuclease assay (eg, TaqMan®) and real-time quantitative PCR (eg, ABI Prizm7700 Sequence Detection System® (Perkin Elmer Applied) Biosystems Division, Foster City, CA)) was used to find genes that are significantly overexpressed in cancerous tumors or multiple tumors compared to other cancerous tumors or normal non-cancerous tissues. The 5 ′ nuclease assay reaction is a fluorescent PCR-based technique that utilizes the 5 ′ exonuclease activity of the Taq DNA polymerase enzyme to monitor gene expression in real time. Two oligonucleotide primers (whose sequence is based on the gene or EST sequence of interest) are used to create an amplicon typical of a PCR reaction. The third oligonucleotide, or probe, is designed to detect the nucleotide sequence located between the two PCR primers. The probe cannot be extended by Taq DNA polymerase enzyme and is labeled with a reporter fluorescent dye and a quencher fluorescent dye. Any laser-induced emission from the reporter dye is quenched by the quenching dye when the two dyes are located close together so that they are on the probe. During the PCR amplification reaction, the Taq DNA polymerase enzyme cleaves the probe in a template-specific manner. The resulting probe fragment dissociates in solution and the signal from the released reporter dye has no quenching effect of the second fluorophore. One molecule of reporter dye is released for each new molecule synthesized, and detection of the unquenched reporter dye provides the basis for quantitative interpretation of the data.

５’ヌクレアーゼ手法は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ＴＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎのようなリアルタイム定量的ＰＣＲデバイスで行う。該システムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷−結合デバイス（ＣＣＤ）カメラおよびコンピュータよりなる。該システムは、サーモサイクラー上で９６−ウェル様式で試料を増幅する。増幅の間に、レーザー−誘導蛍光シグナルが全ての９６ウェルについてのファイバーオプティックスケーブルを通してリアルタイムで収集され、ＣＣＤにおいて検出される。該システムは、該機器を実行するための、およびデータを分析するためのソフトウェアを含む。   The 5 'nuclease procedure is performed with a real-time quantitative PCR device such as the ABI Prism 7700 ™ Sequence Detection. The system consists of a thermocycler, laser, charge-coupled device (CCD) camera and computer. The system amplifies the sample in a 96-well format on a thermocycler. During amplification, a laser-induced fluorescence signal is collected in real time through the fiber optics cable for all 96 wells and detected in the CCD. The system includes software for executing the instrument and for analyzing data.

スクリーニング用の出発物質は、種々の異なる癌性組織から単離されたｍＲＮＡであった。ｍＲＮＡは正確に、例えば、フルオロメトリーにより定量される。陰性対照として、ＲＮＡは、テストすべき癌性組織と同一の組織タイプの種々の正常な組織から単離した。   The starting material for screening was mRNA isolated from a variety of different cancerous tissues. mRNA is accurately quantified, for example, by fluorometry. As a negative control, RNA was isolated from various normal tissues of the same tissue type as the cancerous tissue to be tested.

５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初に、Ｃｔ、または閾値サイクルとして表す。これは、レポーターシグナルが蛍光のバックグラウンドレベルを超えて蓄積されるサイクルと定義される。ΔＣｔ値は、癌ｍＲＮＡの結果を正常なヒトｍＲＮＡの結果と比較した場合に、核酸試料中の特定の標的配列の出発コピーの相対的な数の定量的測定として用いられる。１つのＣｔ単位は、１ ＰＣＲサイクル、あるいは正常に対してほぼ２倍の相対的増加に対応し、２つの単位は４倍の相対的増加に対応し、３つの単位は８倍の相対的増加に対応し、および順次そのように対応するので、２以上の異なる組織の間のｍＲＮＡ発現の相対的倍増加を定量的に測定することができる。この技術を用い、以下にリストする分子は、（同一および異なる組織ドナー双方からの）それらの正常な非−癌性カウンターパート組織と比較して、特定の腫瘍において有意に過剰発現されると同定されており、かくして、哺乳動物における癌の診断および治療のための優れたポリペプチド標的を表す。   5 'nuclease assay data is initially expressed as Ct, or threshold cycle. This is defined as the cycle in which the reporter signal accumulates above the background level of fluorescence. The ΔCt value is used as a quantitative measure of the relative number of starting copies of a particular target sequence in a nucleic acid sample when comparing cancer mRNA results to normal human mRNA results. One Ct unit corresponds to a relative increase of almost 2 times relative to one PCR cycle or normal, 2 units correspond to a relative increase of 4 times, and 3 units a relative increase of 8 times And so on in turn, the relative fold increase in mRNA expression between two or more different tissues can be quantitatively measured. Using this technique, the molecules listed below are identified as being significantly overexpressed in certain tumors compared to their normal non-cancerous counterpart tissues (from both the same and different tissue donors) Thus representing an excellent polypeptide target for the diagnosis and treatment of cancer in mammals.

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実施例４：イン・サイチュハイブリダイゼーション
イン・サイチュハイブリダイゼーションは、細胞または組織調製物内の核酸配列の検出および突止用の強力かつ多様な技術である。例えば、遺伝子発現の部位を同定し、転写の組織分布を分析し、ウイルス感染を同定し、突き止め、特異的なｍＲＮＡ合成の変化を追跡し、および染色体マッピングを援助するのに有用であろう。
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 Example 4: In situ hybridization In situ hybridization is a powerful and diverse technique for the detection and localization of nucleic acid sequences in cell or tissue preparations. For example, it may be useful to identify the site of gene expression, analyze the tissue distribution of transcription, identify and locate viral infections, track specific mRNA synthesis changes, and assist in chromosome mapping.

イン・サイチュハイブリダイゼーションは、検出すべき標的配列に対する相同性を有するＰＣＲで生じた３３Ｐ−標識リボプローブを用い、Ｌｕ ａｎｄ Ｇｉｌｌｅｔｔ，Ｃｅｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ １：１６９−１７６（１９９４）によるプロトコルの最適化されたバージョンに従って実行した。簡単に述べれば、ホルマリン固定されたパラフィン−包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィン化し、プロテイナーゼＫ２０ｇ／ｍｌにて３７℃にて１５分間除蛋白し、Ｌｕ ａｎｄ Ｇｉｌｌｅｔｔ，ｓｕｐｒａによって記載されているイン・サイチュハイブリダイゼーションのためにさらに処理した。［３３−Ｐ］ＵＴＰ−標識アンチセンスリボプローブはＰＣＲ産物から作成し、５５℃にて一晩ハイブリダイズさせた。スライドをＫｏｄａｋ ＮＴＢ２核トラックエマルジョンに浸漬し、４週間暴露した。
３３Ｐ−リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の３３Ｐ−ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｃｈａｍ ＢＦ １００２、ＳＡ＜２０００ Ｃｉ／ミリモル）をｓｐｅｅｄ ｖａｃ乾燥した。乾燥した３３Ｐ−ＵＴＰを含有する各チューブに、以下の成分を加えた：
２．０μｌの５×転写緩衝液
１．０μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌのＮＴＰミックス（２．５ｍＭ：１０μ；１０ｍＭ ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＡＴＰの各々＋１０μｌのＨ２Ｏ）
１．０μｌのＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌのＲｎａｓｉｎ
１．０μｌのＤＮＡ鋳型（１μｇ）
１．０μｌのＨ２Ｏ
１．０μｌＲＮＡポリメラーゼ（通常、ＰＣＲ産物Ｔ３＝ＡＳ、Ｔ７＝Ｓのため）
チューブを３７℃にて１時間インキュベートした。１．０μｌのＲＱ１ ＤＮａｓｅを加え、続いて、３７℃にて１５分間インキュベートした。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭトリスｐＨ ７．６／１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を加え、混合物をＤＥ８１紙の上にピペットで移した。残存する溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−５０限外濾過ユニットに負荷し、プログラム１０を用いて回転させた（６分）。濾過ユニットを第二のチューブ上に逆さにし、プログラム２を用いて回転させた（３分）。最終回収回転の後、１００μｌのＴＥを加えた。１μｌの最終産物をＤＥ８１紙上にピペットで移し、６ｍｌのＢｉｏｆｌｕｏｒ ＩＩ中でカウントした。 In situ hybridization uses a 33 P-labeled riboprobe generated by PCR with homology to the target sequence to be detected, and optimization of the protocol according to Lu and Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994) Executed according to the version. Briefly, formalin-fixed paraffin-embedded human tissue was sectioned, deparaffinized, deproteinized with proteinase K 20 g / ml for 15 minutes at 37 ° C., and the protein described by Lu and Gillett, supra. • Further processing for in situ hybridization. [ 33 -P] UTP-labeled antisense riboprobe was prepared from the PCR product and hybridized overnight at 55 ° C. Slides were immersed in Kodak NTB2 nuclear track emulsion and exposed for 4 weeks.
33 P-riboprobe synthesis 6.0 μl (125 mCi) of 33 P-UTP (Amersham BF 1002, SA <2000 Ci / mmol) was speed vac dried. To each tube containing dried 33 P-UTP, the following ingredients were added:
2.0 μl of 5 × transcription buffer 1.0 μl of DTT (100 mM)
2.0 μl of NTP mix (2.5 mM: 10 μ; 10 mM GTP, CTP and ATP each +10 μl H 2 O)
1.0 μl of UTP (50 μM)
1.0 μl of Rnasin
1.0 μl of DNA template (1 μg)
1.0 μl H 2 O
1.0 μl RNA polymerase (usually because of PCR product T3 = AS, T7 = S)
Tubes were incubated for 1 hour at 37 ° C. 1.0 μl RQ1 DNase was added followed by a 15 minute incubation at 37 ° C. 90 μl TE (10 mM Tris pH 7.6 / 1 mM EDTA pH 8.0) was added and the mixture was pipetted onto DE81 paper. The remaining solution was loaded onto a Microcon-50 ultrafiltration unit and rotated using program 10 (6 minutes). The filtration unit was inverted over the second tube and rotated using program 2 (3 minutes). After the final collection spin, 100 μl TE was added. 1 μl of final product was pipetted onto DE81 paper and counted in 6 ml of Biofluor II.

プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で泳動させた。１ないし３μｌのプローブまたは５μｌのＲＮＡ Ｍｒｋ ＩＩＩを３μｌの負荷緩衝液に加えた。９５℃の加熱ブロック上で３分間過熱した後、プローブを直ちに氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシュし、試料を負荷し、１８０ないし２５０ボルトで４５分間泳動させた。ゲルをサランラップ中に包み、−７０℃のフリーザー中で増感スクリーンにてＸＡＲフィルムに１時間ないし一晩暴露した。
３３Ｐ−ハイブリダイゼーション
Ａ．凍結したセクションの予備処理
スライドをフリーザーから取り出し、アルミニウムトレイ上に置き、室温で５分間解凍した。トレイを５５℃のインキュベーター中に５分間おいて、凝縮を低下させた。スライドをヒュームフード中で氷上の４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、０．５×ＳＳＣ中で室温にて５分間洗浄した（２５ｍｌ ２０×ＳＳＣ＋９７５ｍｌ ＳＱ Ｈ２Ｏ）。０．５μｌ／ｍｌプロテイナーゼＫ中での３７℃における「１０分間の除蛋白後に（２５０ｍｌの予め加温したＲＮａｓｅ−フリーＲＮＡｓｅ緩衝液中の１２．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌストック）、セクションを０．５×ＳＳＣ中で室温にて１０分間洗浄した。セクションを７０％、９５％、１００％エタノール中で各々２分間脱水した。
Ｂ．パラフィン−包埋セクションの予備処理
スライドを脱パラフィン化し、ＳＱ Ｈ２Ｏ中に置き、２×ＳＳＣ中で室温にて毎回５分間２回濯いだ。セクションを２０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ−フリーＲＮａｓｅ緩衝液中の５００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ；３７℃，１５分）−ヒト胚、または８×プロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ緩衝液中１００μｌ，３７℃，３０分）−ホルマリン組織中で除蛋白した。０．５×ＳＳＣＳ中での引き続いての濯ぎおよび脱水を前記したように行った。
Ｃ．プレハイブリダイゼーション
スライドを、Ｂｏｘ緩衝液（４×ＳＳＣ，５０％ホルムアルデヒド）−飽和濾紙でライニングしたプラスチックボックス中に置いた。
Ｄ．ハイブリダイゼーション
スライド当たり１．０×１０６ｃｐｍのプローブおよび１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃にて３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、４８μｌのハイブリダイゼーション緩衝液をスライド当たり加えた。ボルテキシングの後、５０μｌの３３Ｐミックスをスライド上の５０μｌのプレハイブリダイゼーションに加えた。スライドを５５℃にて一晩インキュベートした。
Ｅ．洗浄
洗浄は室温にて２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡ（４００ｍｌの２０×ＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ，Ｖｆ＝４Ｌ）で２×１０分行い、続いて、３７℃にて３０分間ＲＮａｓｅＡ処理した（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ緩衝液中の５００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温にて２×１０分洗浄した。ストリンジェンシー洗浄条件は以下の通りであった：５５℃にて２時間、０．１×ＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０×ＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ，Ｖｆ＝４Ｌ）。
Ｆ．オリゴヌクレオチド
イン・サイチュ分析は、本明細書中に開示された種々のＤＮＡ配列で行った。これらの分析で使用したオリゴヌクレオチドは、添付の図面に示した核酸に対して相補的であるように得られた（その相補体）。
Ｅ．結果
イン・サイチュ分析は本明細書中に開示された種々のＤＮＡ配列で行った。これらの分析からの結果を以下に示す。 The probe was run on a TBE / urea gel. 1-3 μl of probe or 5 μl RNA Mrk III was added to 3 μl loading buffer. After 3 minutes of heating on a 95 ° C. heating block, the probe was immediately placed on ice. Gel wells were flushed, sample loaded and run at 180-250 volts for 45 minutes. Gels were wrapped in Saran wrap and exposed to XAR film for 1 hour to overnight with an intensifying screen in a -70 ° C freezer.
33 P-hybridization Pretreatment of frozen sections Slides were removed from the freezer, placed on an aluminum tray and thawed at room temperature for 5 minutes. The tray was placed in a 55 ° C. incubator for 5 minutes to reduce condensation. Slides were fixed in 4% paraformaldehyde on ice in a fume hood for 10 minutes and washed in 0.5 × SSC for 5 minutes at room temperature (25 ml 20 × SSC + 975 ml SQ H 2 O). “After 10 minutes of deproteinization (12.5 μl of 10 mg / ml stock in 250 ml of pre-warmed RNase-free RNAse buffer) at 37 ° C. in 0.5 μl / ml proteinase K X Washed in SSC for 10 minutes at room temperature Sections were dehydrated in 70%, 95% and 100% ethanol for 2 minutes each.
B. Pretreatment of paraffin-embedded section Slides were deparaffinized, placed in SQ H 2 O and rinsed twice in 2 × SSC at room temperature for 5 minutes each time. Sections were 20 μg / ml proteinase K (500 μl 10 mg / ml in 250 ml RNase-free RNase buffer; 37 ° C., 15 min) —human embryo, or 8 × proteinase K (100 μl in 250 ml RNase buffer, 37 ° C. , 30 minutes) -deproteinization in formalin tissue. Subsequent rinsing and dehydration in 0.5 × SSCS was performed as described above.
C. Prehybridization slides were placed in a plastic box lined with Box buffer (4 × SSC, 50% formaldehyde) -saturated filter paper.
D. Hybridization 1.0 × 10 6 cpm probe and 1.0 μl tRNA (50 mg / ml stock) per slide were heated at 95 ° C. for 3 minutes. Slides were chilled on ice and 48 μl of hybridization buffer was added per slide. After vortexing, 50 μl of 33 P mix was added to 50 μl of prehybridization on the slide. Slides were incubated overnight at 55 ° C.
E. Washing Washing was performed at room temperature with 2 × SSC, EDTA (400 ml of 20 × SSC + 16 ml of 0.25M EDTA, V f = 4 L) for 2 × 10 minutes, followed by RNase A treatment at 250 ° C. for 30 minutes (250 ml of 500 μl of 10 mg / ml = 20 μg / ml in RNase buffer). Slides were washed 2 × 10 minutes with 2 × SSC, EDTA at room temperature. Stringency wash conditions were as follows: 2 hours at 55 ° C., 0.1 × SSC, EDTA (20 ml 20 × SSC + 16 ml EDTA, V f = 4 L).
F. Oligonucleotides In situ analysis was performed on the various DNA sequences disclosed herein. The oligonucleotides used in these analyzes were obtained to be complementary to the nucleic acids shown in the accompanying drawings (its complement).
E. Results In situ analysis was performed on the various DNA sequences disclosed herein. The results from these analyzes are shown below.

（１）ＤＮＡ９５９３０（ＴＡＴ１１０）
１つの分析において、有意な発現は３／３肺腫瘍、３／３結直腸腺癌、１／１前立腺癌、３／３転移細胞癌腫および３／３子宮内膜腺癌で観察され、ここに、カウンターパート正常組織における発現のレベルは有意により低い。 (1) DNA95930 (TAT110)
In one analysis, significant expression was observed in 3/3 lung tumors, 3/3 colorectal adenocarcinoma, 1/1 prostate cancer, 3/3 metastatic cell carcinoma and 3/3 endometrial adenocarcinoma, where The level of expression in counterpart normal tissues is significantly lower.

第二の独立した分析において、有意な発現は７／７子宮内膜および１２／１５卵巣腺癌で観察され、ここに、カウンターパート正常組織における発現のレベルは有意により低い。   In a second independent analysis, significant expression is observed in 7/7 endometrium and 12/15 ovarian adenocarcinoma, where the level of expression in counterpart normal tissue is significantly lower.

第三の独立した分析において、有意な発現は２４／２６結直腸腫瘍試料で観察され、ここに、カウンターパート正常組織における発現のレベルは有意により低い。   In a third independent analysis, significant expression is observed in 24/26 colorectal tumor samples, where the level of expression in counterpart normal tissues is significantly lower.

最後に、第四の独立した分析において、発現は非−悪性前立腺組織の８／２６試料、原発性前立腺癌の５５／８２試料、および転移性前立腺癌の５／２３試料において観察される。   Finally, in a fourth independent analysis, expression is observed in 8/26 samples of non-malignant prostate tissue, 55/82 samples of primary prostate cancer, and 5/23 samples of metastatic prostate cancer.

（２）ＤＮＡ９５９３０−１（ＴＡＴ２１０）
１つの分析において、有意な発現は３／３肺腫瘍、３／３結直腸腺癌、１／１前立腺癌、３／３転移細胞癌腫および３／３子宮内膜腺癌で観察され、ここに、カウンターパート正常組織における発現のレベルは有意により低い。 (2) DNA95930-1 (TAT210)
In one analysis, significant expression was observed in 3/3 lung tumors, 3/3 colorectal adenocarcinoma, 1/1 prostate cancer, 3/3 metastatic cell carcinoma and 3/3 endometrial adenocarcinoma, where The level of expression in counterpart normal tissues is significantly lower.

第二の独立した分析において、有意な発現は７／７子宮内膜および１２／１５卵巣腺癌で観察され、ここに、カウンターパート正常組織における発現のレベルは有意により低い。   In a second independent analysis, significant expression is observed in 7/7 endometrium and 12/15 ovarian adenocarcinoma, where the level of expression in counterpart normal tissue is significantly lower.

第三の独立した分析において、有意な発現は２４／２６結直腸腫瘍試料で観察され、ここに、カウンターパート正常組織における発現のレベルは有意により低い。   In a third independent analysis, significant expression is observed in 24/26 colorectal tumor samples, where the level of expression in counterpart normal tissues is significantly lower.

最後に、第四の独立した分析において、発現は非−悪性前立腺組織の８／２６試料、原発性前立腺癌の５５／８２試料、および転移性前立腺癌の５／２３試料において観察される。   Finally, in a fourth independent analysis, expression is observed in 8/26 samples of non-malignant prostate tissue, 55/82 samples of primary prostate cancer, and 5/23 samples of metastatic prostate cancer.

（３）ＤＮＡ９６９３０（ＴＡＴ１１２）
結直腸癌における強力な発現。悪性上皮での発現は隣接する良性上皮におけるよりも有意に強く見える。加えて、強力な発現がテストした膵臓腺癌の２３試料の全ての２３で観察され、ここに、正常な膵臓組織における発現は検出できない。 (3) DNA96930 (TAT112)
Strong expression in colorectal cancer. Expression in malignant epithelium appears significantly stronger than in adjacent benign epithelium. In addition, strong expression was observed in all 23 of the 23 samples of pancreatic adenocarcinoma tested, where no expression in normal pancreatic tissue was detectable.

（４）ＤＮＡ９６９３６（ＴＡＴ１４７）
１つの分析において、強く陽性のシグナルが６／６乳房腫瘍で観察された。もう１つの独立した分析において、陽性シグナルが４／４非小細胞肺癌腫で観察され、ここに、腫瘍は正常な肺と比較してより強い発現を有するように見える。１／１子宮内膜腺癌は強い発現を示し、３／３結直腸腺癌は可変発現を示す。 (4) DNA96936 (TAT147)
In one analysis, a strong positive signal was observed in 6/6 breast tumors. In another independent analysis, a positive signal is observed in 4/4 non-small cell lung carcinoma, where the tumor appears to have stronger expression compared to normal lung. 1/1 endometrial adenocarcinoma shows strong expression and 3/3 colorectal adenocarcinoma shows variable expression.

（５）ＤＮＡ１０８８０９（ＴＡＴ１１４）
テストした全ての腎臓細胞癌腫（ｎ＝３）において陽性シグナル。他方、正常な腎臓組織において発現は観察されない。加えて、陽性発現が５／１２胃腫瘍、５／２４結直腸腫瘍、３／８膵臓腫瘍および１／３肺腫瘍で観察される。正常な非−癌性組織発現は胃および小腸に制限される。 (5) DNA108809 (TAT114)
Positive signal in all renal cell carcinomas tested (n = 3). On the other hand, no expression is observed in normal kidney tissue. In addition, positive expression is observed in 5/12 gastric tumors, 5/24 colorectal tumors, 3/8 pancreatic tumors and 1/3 lung tumors. Normal non-cancerous tissue expression is restricted to the stomach and small intestine.

（６）ＤＮＡ１７６７６６（ＴＡＴ１３２）
テストした全ての子宮内膜腺癌（ｎ＝３）において陽性シグナル。他方、正常な子宮内膜組織において発現は観察されない。 (6) DNA176766 (TAT132)
Positive signal in all endometrial adenocarcinoma tested (n = 3). On the other hand, no expression is observed in normal endometrial tissue.

（７）ＤＮＡ２３６４６３（ＴＡＴ１５０）
テストした全ての子宮内膜腺癌（ｎ＝３）において陽性シグナル。他方、正常な子宮内膜組織において発現は観察されない。 (7) DNA236463 (TAT150)
Positive signal in all endometrial adenocarcinoma tested (n = 3). On the other hand, no expression is observed in normal endometrial tissue.

（８）ＤＮＡ１８１１６２（ＴＡＴ１２９）
新形成前立腺上皮は一般には陽性であり、シグナル強度は症例の間で弱いから強いまで変化する。非−前立腺組織は陰性である。 (8) DNA181116 (TAT129)
Neoplastic prostate epithelium is generally positive and signal intensity varies from case to case from weak to strong. Non-prostate tissue is negative.

（９）ＤＮＡ１８８２２１（ＴＡＴ１１１）
悪性上皮にわたって結腸マルチ−腫瘍アレイにおいて強力なシグナルが見られる。正常な組織において、ある種のプローブは結腸陰窩の下方２／３をライニングする上皮細胞にわたって特異的シグナルを与え、シグナルの強度は結腸癌種におけるよりも有意により低く見えた。１２／１８結直腸腺癌、６／８転移性腺癌および２／９胃腺癌において陽性発現が観察される。 (9) DNA188221 (TAT111)
A strong signal is seen in colonic multi-tumor arrays across the malignant epithelium. In normal tissues, certain probes gave specific signals across epithelial cells lining the lower 2/3 of the colon crypt, and the intensity of the signal appeared significantly lower than in colon cancer types. Positive expression is observed in 12/18 colorectal adenocarcinoma, 6/8 metastatic adenocarcinoma and 2/9 gastric adenocarcinoma.

（１０）ＤＮＡ２３３８７６（ＴＡＴ１４６）
悪性上皮にわたって結腸マルチ−腫瘍アレイにおいて強力なシグナルが見られる。正常な組織において、ある種のプローブは結腸陰窩の下方２／３をライニングする上皮細胞にわたって特異的シグナルを与え、シグナルの強度は結腸癌種におけるよりも有意により低く見えた。１２／１８結直腸腺癌、６／８転移性腺癌および２／９胃腺癌において陽性発現が観察される。 (10) DNA2333876 (TAT146)
A strong signal is seen in colonic multi-tumor arrays across the malignant epithelium. In normal tissues, certain probes gave specific signals across epithelial cells lining the lower 2/3 of the colon crypt, and the intensity of the signal appeared significantly lower than in colon cancer types. Positive expression is observed in 12/18 colorectal adenocarcinoma, 6/8 metastatic adenocarcinoma and 2/9 gastric adenocarcinoma.

（１１）ＤＮＡ２１０４９９（ＴＡＴ１２３）
１つの分析において、１２／１４卵巣腺癌は陽性であって、８／９子宮内膜腺癌は陽性である。正常な卵巣支質は子宮筋層のように陰性である。他の正常な卵巣および子宮組織は陰性である。 (11) DNA210499 (TAT123)
In one analysis, 12/14 ovarian adenocarcinoma is positive and 8/9 endometrial adenocarcinoma is positive. Normal ovarian stroma is negative like the myometrium. Other normal ovary and uterine tissues are negative.

独立した分析において、１６／２７非小細胞肺癌腫は陽性であり、ここに、シグナルは中程度または強い。   In an independent analysis, 16/27 non-small cell lung carcinoma is positive, where the signal is moderate or strong.

（１２）ＤＮＡ２１９８９４（ＴＡＴ２１１）
１つの分析において。１２／１４卵巣腺癌は陽性であって、８／９子宮内膜腺癌は陽性である。正常な卵巣支質は子宮筋層のように陰性である。他の正常な卵巣および子宮組織は陰性である。 (12) DNA21894 (TAT211)
In one analysis. 12/14 ovarian adenocarcinoma is positive and 8/9 endometrial adenocarcinoma is positive. Normal ovarian stroma is negative like the myometrium. Other normal ovary and uterine tissues are negative.

独立した分析において、１６／２７非小細胞肺癌腫は陽性であり、ここに、シグナルは中程度または強い。   In an independent analysis, 16/27 non-small cell lung carcinoma is positive, where the signal is moderate or strong.

（１３）ＤＮＡ２１５６０９（ＴＡＴ１１３）
強力なシグナルが結腸癌腫で観察され、正常な結腸では非常に低いレベルのシグナルに過ぎない。肺および乳房癌腫は陰性であった。 (13) DNA215609 (TAT113)
A strong signal is observed in colon carcinoma, with only a very low level of signal in the normal colon. Lung and breast carcinomas were negative.

（１４）ＤＮＡ２２０４３２（ＴＡＴ１２８）
この遺伝子を発現する唯一の正常な成人組織は前立腺上皮である。発現は中程度ないし強い強度のものであって、病巣であり、それは過形成上皮においてより顕著である。 (14) DNA220432 (TAT128)
The only normal adult tissue that expresses this gene is the prostate epithelium. Expression is of moderate to strong intensity and is a lesion that is more prominent in hyperplastic epithelium.

原発性前立腺癌の５０の症例は入手可能である１つの分析において、２９の症例（５８％）は陽性であり、１８の症例（３６％）は陰性であって、３症例（６％）ははっきりとしない。原発性前立腺癌の３７症例がレビューのために入手可能なもう１つの分析において、３３症例（８９％）は陽性であり、４つの症例（１１％）は陰性である。最後に、転移性前立腺癌の２７症例がレビューのために入手可能なもう１つの独立した分析において、１４症例（５２％）は陽性であり、１１の症例（４１％）は陰性であって、２つの症例（７％）ははっきりしない。   Fifty cases of primary prostate cancer are available In one analysis, 29 cases (58%) are positive, 18 cases (36%) are negative, and 3 cases (6%) are Not clear. In another analysis where 37 cases of primary prostate cancer are available for review, 33 cases (89%) are positive and 4 cases (11%) are negative. Finally, in another independent analysis where 27 cases of metastatic prostate cancer are available for review, 14 cases (52%) are positive and 11 cases (41%) are negative, Two cases (7%) are unclear.

（１５）ＤＮＡ２２６２３７（ＴＡＴ１１７）
１つの分析において、３つの腎臓細胞癌腫の２つは陽性であり、ここに、正常な腎臓発現は陰性である。 (15) DNA226237 (TAT117)
In one analysis, two of the three renal cell carcinomas are positive, where normal kidney expression is negative.

（１６）ＤＮＡ２４６４５０（ＴＡＴ１６８）
１つの分析において、３つの腎臓細胞癌腫の２つは陽性であり、ここに、正常な腎臓発現は陰性である。 (16) DNA246450 (TAT168)
In one analysis, two of the three renal cell carcinomas are positive, where normal kidney expression is negative.

（１７）ＤＮＡ２２７０８７（ＴＡＴ１６３）
この分子についてのプローブは、肺、乳房、結腸、膵臓および子宮内膜癌腫の全てのテストした症例において、腫瘍−関連支質細胞の亜集団において陽性シグナルを示した。標識の強度はしばしばかなり強かった。隣接良性結腸での結腸腺癌の症例においては、標識は腫瘍−関連支質に制限され、正常な良性組織は陰性であった。乳房芽細胞の種もまたサブ上皮支質細胞の標識を示した。 (17) DNA227087 (TAT163)
The probe for this molecule showed a positive signal in a subpopulation of tumor-related stromal cells in all tested cases of lung, breast, colon, pancreas and endometrial carcinoma. The intensity of the label was often quite strong. In cases of colon adenocarcinoma in the adjacent benign colon, labeling was restricted to tumor-related stroma and normal benign tissue was negative. Mammoblast species also showed subepithelial stromal cell labeling.

（１８）ＤＮＡ２６６３０７（ＴＡＴ２２７）
この分子についてのプローブは、肺、乳房、結腸、膵臓および子宮内膜癌腫の全てのテストした症例において、腫瘍−関連支質細胞の亜集団において陽性シグナルを示した。標識の強度はしばしばかなり強かった。隣接良性結腸での結腸腺癌の症例においては、標識は腫瘍−関連支質に制限され、正常な良性組織は陰性であった。乳房芽細胞の種もまたサブ上皮支質細胞の標識を示した。 (18) DNA266307 (TAT227)
The probe for this molecule showed a positive signal in a subpopulation of tumor-related stromal cells in all tested cases of lung, breast, colon, pancreas and endometrial carcinoma. The intensity of the label was often quite strong. In cases of colon adenocarcinoma in the adjacent benign colon, labeling was restricted to tumor-related stroma and normal benign tissue was negative. Mammoblast species also showed subepithelial stromal cell labeling.

（１９）ＤＮＡ２６６３１１（ＴＡＴ２２８）
この分子についてのプローブは、肺、乳房、結腸、膵臓および子宮内膜癌腫の全てのテストした症例において、腫瘍−関連支質細胞の亜集団において陽性シグナルを示した。標識の強度はしばしばかなり強かった。隣接良性結腸での結腸腺癌の症例においては、標識は腫瘍−関連支質に制限され、正常な良性組織は陰性であった。乳房芽細胞の種もまたサブ上皮支質細胞の標識を示した。 (19) DNA266631 (TAT228)
The probe for this molecule showed a positive signal in a subpopulation of tumor-related stromal cells in all tested cases of lung, breast, colon, pancreas and endometrial carcinoma. The intensity of the label was often quite strong. In cases of colon adenocarcinoma in the adjacent benign colon, labeling was restricted to tumor-related stroma and normal benign tissue was negative. Mammoblast species also showed subepithelial stromal cell labeling.

（２０）ＤＮＡ２６６３１２（ＴＡＴ２２９）
この分子についてのプローブは、肺、乳房、結腸、膵臓および子宮内膜癌腫の全てのテストした症例において、腫瘍−関連支質細胞の亜集団において陽性シグナルを示した。標識の強度はしばしばかなり強かった。隣接良性結腸での結腸腺癌の症例においては、標識は腫瘍−関連支質に制限され、正常な良性組織は陰性であった。乳房芽細胞の種もまたサブ上皮支質細胞の標識を示した。 (20) DNA26663 (TAT229)
The probe for this molecule showed a positive signal in a subpopulation of tumor-related stromal cells in all tested cases of lung, breast, colon, pancreas and endometrial carcinoma. The intensity of the label was often quite strong. In cases of colon adenocarcinoma in the adjacent benign colon, labeling was restricted to tumor-related stroma and normal benign tissue was negative. Mammoblast species also showed subepithelial stromal cell labeling.

（２１）ＤＮＡ２６６３１３（ＴＡＴ２３０）
この分子についてのプローブは、肺、乳房、結腸、膵臓および子宮内膜癌腫の全てのテストした症例において、腫瘍−関連支質細胞の亜集団において陽性シグナルを示した。標識の強度はしばしばかなり強かった。隣接良性結腸での結腸腺癌の症例においては、標識は腫瘍−関連支質に制限され、正常な良性組織は陰性であった。乳房芽細胞の種もまたサブ上皮支質細胞の標識を示した。 (21) DNA266633 (TAT230)
The probe for this molecule showed a positive signal in a subpopulation of tumor-related stromal cells in all tested cases of lung, breast, colon, pancreas and endometrial carcinoma. The intensity of the label was often quite strong. In cases of colon adenocarcinoma in the adjacent benign colon, labeling was restricted to tumor-related stroma and normal benign tissue was negative. Mammoblast species also showed subepithelial stromal cell labeling.

（２２）ＤＮＡ２２７２２４（ＴＡＴ１２１）
発現は３つの子宮内膜腺癌の２つにおいて観察される。 (22) DNA227224 (TAT121)
Expression is observed in two of the three endometrial adenocarcinomas.

（２３）ＤＮＡ２４７４８６（ＴＡＴ１８３）
発現は３つの子宮内膜腺癌の２つにおいて観察される。 (23) DNA247486 (TAT183)
Expression is observed in two of the three endometrial adenocarcinomas.

（２４）ＤＮＡ２２７８００（ＴＡＴ１３１）
１つの分析において、４６／６４原発性前立腺癌は陽性であって、６／１４転移性前立腺癌は陽性である。弱いないし中程度の発現が前立腺上皮で観察される。 (24) DNA227800 (TAT131)
In one analysis, 46/64 primary prostate cancer is positive and 6/14 metastatic prostate cancer is positive. Weak to moderate expression is observed in the prostate epithelium.

（２５）ＤＮＡ２２８１９９（ＴＡＴ１２７）
発現は１５の卵巣腫瘍（腺癌および表面上皮腫瘍）の１３で観察される。両性の卵巣表面上皮もまた陽性である。ほとんどの陽性腫瘍における発現レベルは強力または中程度であって、かなり均一である。発現は９つの子宮腺癌の８つにおいても観察される。２３の非小細胞肺癌腫の７つは陽性である。 (25) DNA228199 (TAT127)
Expression is observed in 13 of 15 ovarian tumors (adenocarcinoma and surface epithelial tumor). Bisexual ovarian surface epithelium is also positive. The expression level in most positive tumors is strong or moderate and fairly uniform. Expression is also observed in 8 of 9 uterine adenocarcinomas. Seven of the 23 non-small cell lung carcinomas are positive.

（２６）ＤＮＡ２２８２０１（ＴＡＴ１１６）
１３／１６結直腸腺癌の悪性細胞はＴＡＴ１１６発現について陽性である。加えて、９／１０転移性腺癌は発現について陽性である。発現は正常な結腸陰窩の基底部分でも観察される。 (26) DNA228201 (TAT116)
Malignant cells of 13/16 colorectal adenocarcinoma are positive for TAT116 expression. In addition, 9/10 metastatic adenocarcinoma is positive for expression. Expression is also observed in the basal part of normal colon crypts.

（２７）ＤＮＡ２４７４８８（ＴＡＴ１８９）
１３／１６結直腸腺癌の悪性細胞はＴＡＴ１８９発現について陽性である。加えて、９／１０転移性腺癌は発現について陽性である。発現は正常な結腸陰窩の基底部分でも観察される。 (27) DNA247488 (TAT189)
Malignant cells of 13/16 colorectal adenocarcinoma are positive for TAT189 expression. In addition, 9/10 metastatic adenocarcinoma is positive for expression. Expression is also observed in the basal part of normal colon crypts.

（２８）ＤＮＡ２３６５３８（ＴＡＴ１９０）
１３／１６結直腸腺癌の悪性細胞はＴＡＴ１９０発現について陽性である。加えて、９／１０転移性腺癌は発現について陽性である。発現は正常な結腸陰窩の基底部分でも観察される。 (28) DNA236538 (TAT190)
Malignant cells of 13/16 colorectal adenocarcinoma are positive for TAT190 expression. In addition, 9/10 metastatic adenocarcinoma is positive for expression. Expression is also observed in the basal part of normal colon crypts.

（２９）ＤＮＡ２４７４８９（ＴＡＴ１９１）
１３／１６結直腸腺癌の悪性細胞はＴＡＴ１９１発現について陽性である。加えて、９／１０転移性腺癌は発現について陽性である。発現は正常な結腸陰窩の基底部分でも観察される。 (29) DNA247474 (TAT191)
Malignant cells of 13/16 colorectal adenocarcinoma are positive for TAT191 expression. In addition, 9/10 metastatic adenocarcinoma is positive for expression. Expression is also observed in the basal part of normal colon crypts.

（３０）ＤＮＡ２２８９９４（ＴＡＴ１２４）
非小細胞肺癌腫の６１症例のうち１３はＴＡＴ１２４の発現について陽性である。これらの陽性腫瘍試料における発現レベルは正常な成人組織において有意により高い。 (30) DNA228994 (TAT124)
Of 61 cases of non-small cell lung carcinoma, 13 are positive for TAT124 expression. Expression levels in these positive tumor samples are significantly higher in normal adult tissues.

（３１）ＤＮＡ２３１５４２（ＴＡＴ１００）
前記したように行ったイン・サイチュ分析は、正常な脳（および他の）組織と比較して、ヒト神経膠腫および神経膠芽細胞腫組織において有意にアップレギュレートされた発現を証明する。 (31) DNA231542 (TAT100)
In situ analysis performed as described above demonstrates significantly up-regulated expression in human glioma and glioblastoma tissues compared to normal brain (and other) tissues.

（３２）ＤＮＡ２３１５４２−１（ＴＡＴ２８４）
前記したように行ったイン・サイチュ分析は、正常な脳（および他の）組織と比較して、ヒト神経膠腫および神経膠芽細胞腫組織において有意にアップレギュレートされた発現を証明する。 (32) DNA231542-1 (TAT284)
In situ analysis performed as described above demonstrates significantly up-regulated expression in human glioma and glioblastoma tissues compared to normal brain (and other) tissues.

（３３）ＤＮＡ２３１５４２−２（ＴＡＴ２８５）
前記したように行ったイン・サイチュ分析は、正常な脳（および他の）組織と比較して、ヒト神経膠腫および神経膠芽細胞腫組織において有意にアップレギュレートされた発現を証明する。 (33) DNA231542-2 (TAT285)
In situ analysis performed as described above demonstrates significantly up-regulated expression in human glioma and glioblastoma tissues compared to normal brain (and other) tissues.

（３４）ＤＮＡ２９７３９３（ＴＡＴ２８５−１）
前記したように行ったイン・サイチュ分析は、正常な脳（および他の）組織と比較して、ヒト神経膠腫および神経膠芽細胞腫組織において有意にアップレギュレートされた発現を証明する。 (34) DNA297393 (TAT285-1)
In situ analysis performed as described above demonstrates significantly up-regulated expression in human glioma and glioblastoma tissues compared to normal brain (and other) tissues.

（３５）ＤＮＡ２３６５３４（ＴＡＴ１０２）
ＴＡＴ１０２の発現は、１５の卵巣上皮悪性疾患（腺癌、上皮細胞腫瘍、子宮内膜Ｃａ）の１４で観察される。また、子宮の９つの子宮内膜腺癌のうち８つはＴＡＴ１０２を発現する。さらに、ＴＡＴ１０２の発現は２７の非−小細胞肺癌の２４で観察され、陽性症例は扁平および腺癌を含む。これらの腫瘍組織における発現は、それらの正常組織カウンターパートにおけるよりも有意に高い。 (35) DNA236534 (TAT102)
TAT102 expression is observed in 14 of 15 ovarian epithelial malignancies (adenocarcinoma, epithelial cell tumor, endometrial Ca). Also, 8 of the 9 endometrial adenocarcinomas of the uterus express TAT102. Furthermore, TAT102 expression is observed in 24 of 27 non-small cell lung cancers, with positive cases including squamous and adenocarcinoma. Expression in these tumor tissues is significantly higher than in their normal tissue counterparts.

（３６）ＤＮＡ２４６４３０（ＴＡＴ１０９）
９２の乳房腫瘍試料のうちの１４はＴＡＴ１０９発現について陽性である。全ての正常な組織における発現は検出可能よりも低い。 (36) DNA246430 (TAT109)
14 of 92 breast tumor samples are positive for TAT109 expression. Expression in all normal tissues is lower than detectable.

（３７）ＤＮＡ２６４４５４（ＴＡＴ１０６）
ＴＡＴ１０６の発現は３８／８８乳房腫瘍で観察される。正常な乳房組織における発現は弱い、または検出可能以下である。 (37) DNA264454 (TAT106)
TAT106 expression is observed in 38/88 breast tumors. Expression in normal breast tissue is weak or sub-detectable.

（３８）ＤＮＡ９８５６５（ＴＡＴ１４５）
ＴＡＴ１４５についての陽性シグナルはほとんどの神経膠腫、神経膠芽細胞腫、いくつかのメラノーマ、および（主として神経膠星状細胞に局所化された）正常な脳で観察された。神経膠芽細胞腫におけるシグナル強度は、正常な神経膠星状細胞におけるよりも高いように見えた。テストした神経膠腫および神経膠芽細胞腫試料の大部分はＴＡＴ１４５発現について陽性であったが、テストした正常な脳試料の大部分はそのような発現について陰性であった。 (38) DNA98565 (TAT145)
Positive signals for TAT145 were observed in most gliomas, glioblastomas, some melanomas, and normal brains (primarily localized to astrocytes). The signal intensity in glioblastoma appeared to be higher than in normal astrocytes. The majority of glioma and glioblastoma samples tested were positive for TAT145 expression, while the majority of normal brain samples tested were negative for such expression.

（３９）ＤＮＡ２４６４３５（ＴＡＴ１５２）
ＴＡＴ１５２についての陽性シグナルはほとんどの神経膠芽細胞腫、いくつかのメラノーマ、および（主として神経膠星状細胞に局所化された）正常な脳で観察された。神経膠芽細胞腫におけるシグナル強度は、正常な神経膠星状細胞におけるよりも高いように見えた。テストした神経膠腫および神経膠芽細胞腫試料の大部分はＴＡＴ１５２発現について陽性であったが、テストした正常な脳試料の大部分はそのような発現について陰性であった。 (39) DNA246435 (TAT152)
A positive signal for TAT152 was observed in most glioblastomas, some melanomas, and normal brain (primarily localized to astrocytes). The signal intensity in glioblastoma appeared to be higher than in normal astrocytes. The majority of glioma and glioblastoma samples tested were positive for TAT152 expression, but the majority of normal brain samples tested were negative for such expression.

（４０）ＤＮＡ１６７２３４（ＴＡＴ１３０）
前立腺の原発性腺癌の７０症例はレビューのために利用可能であった。これらの７０の症例のうち、５６症例（８０％）はＴＡＴ１３０発現について陽性である。非−前立腺組織におけるＴＡＴ１３０発現は弱いまたは検出可能以下である。 (40) DNA167234 (TAT130)
Seventy cases of primary adenocarcinoma of the prostate were available for review. Of these 70 cases, 56 cases (80%) are positive for TAT130 expression. TAT130 expression in non-prostate tissue is weak or sub-detectable.

（４１）ＤＮＡ２３５６２１（ＴＡＴ１６６）
前立腺の原発性腺癌の７０症例がレビューのために入手可能であった。これらの７０の症例のうち、５６症例（８０％）がＴＡＴ１６６発現で陽性である。非−前立腺腫瘍におけるＴＡＴ１６６発現は弱いまたは検出可能以下である。 (41) DNA235621 (TAT166)
Seventy cases of primary adenocarcinoma of the prostate were available for review. Of these 70 cases, 56 cases (80%) are positive for TAT166 expression. TAT166 expression in non-prostate tumors is weak or sub-detectable.

（４２）ＤＮＡ２３６４９３（ＴＡＴ１４１）
陽性発現は７０／１４８乳房癌腫、２／６３結直腸腺癌、４／４２卵巣腫瘍、９／６９非小細胞肺癌腫、９／６７前立腺腺癌および５／２５神経膠細胞腫において観察される。正常な非−癌性組織における発現は前立腺および乳房上皮に制限されるように見える。 (42) DNA236493 (TAT141)
Positive expression is observed in 70/148 breast carcinoma, 2/63 colorectal adenocarcinoma, 4/42 ovarian tumor, 9/69 non-small cell lung carcinoma, 9/67 prostate adenocarcinoma and 5/25 glioma . Expression in normal non-cancerous tissue appears to be restricted to the prostate and breast epithelium.

（４３）ＤＮＡ２２６０９４（ＴＡＴ１６４）
３７の神経膠芽細胞腫試料のうち２１、および８つの神経膠腫試料はＴＡＴ１６４発現で陽性であり、他方、（正常な脳組織を含めた）調べた全ての他の腫瘍および正常な組織は陰性であった。 (43) DNA2266094 (TAT164)
Of the 37 glioblastoma samples, 21 and 8 glioma samples were positive for TAT164 expression, while all other tumors and normal tissues examined (including normal brain tissue) Negative.

（４４）ＤＮＡ２２７５７８（ＴＡＴ１６５）
テストした２５の神経膠芽細胞腫試料のうち１５は発現につき陽性であったが、有意により弱い発現がテストした正常な脳試料で観察された。 (44) DNA227578 (TAT165)
Of the 25 glioblastoma samples tested, 15 were positive for expression, but significantly weaker expression was observed in the normal brain samples tested.

実施例５：免疫組織化学分析
本明細書中で開示されたある種のＴＡＴポリペプチドに対する抗体を調製し、免疫組織化学分析を以下のように行った。組織セクションをまずアセトン／エタノール中で５分間固定した（凍結またはパラフィン−包埋）。次いで、セクションをＰＢＳ中で洗浄し、次いで、アビジンおよびビオチン（ベクターキット）で１０分間ブロックし、各々、続いてＰＢＳ中で洗浄する。次いで、セクションを１０％血清で２０分間ブロックし、次いで、ブロットして、過剰なものを除去した。次いで、初代抗体を１時間で１０μｇ／ｍｌの濃度でセクションに加え、次いで、セクションをＰＢＳ中で洗浄する。次いで、ビオチニル化二次抗体（抗−初代抗体）を３０分間でセクションに加え、次いで、セクションをＰＢＳで洗浄した。次いで、セクションをＶｅｃｔｏｒ ＡＢＣキットの試薬に３０分間暴露し、次いで、セクションをＰＢＳ中で洗浄した。次いで、セクションをジアミノベンジジン（Ｐｉｅｒｃｅ）に５分間暴露し、次いで、ＰＢＳ中で洗浄した。次いで、セクションをＭａｙｅｒｓヘマトキシリンで逆染色し、カバーグラスで被覆し、可視化した。免疫組織化学分析は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ ３．１６、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９７）に記載されているように行うこともできる。これらの分析からの結果を以下に示す。
（１）ＤＮＡ９６９３０（ＴＡＴ１１２）
有意により高い発現が、正常な結腸陰窩の先端表面よりも、結腸腫瘍の結腸陰窩の先端表面で検出された。加えて、ＴＡＴ１１２は、正常な前立腺細胞と比較して膵臓腺癌細胞において有意に過剰発現されることが判明した。最後に、前記したように行ったＩＨＣ分析は、ＴＡＴ１１２が正常な肺組織と比較して肺癌腫において、正常な肺組織と比較して非小細胞肺癌腫において、および正常な胃組織と比較して胃癌腫において有意に過剰発現されることを証明した。
（２）ＤＮＡ２２６５３９（ＴＡＴ１２６）
陽性発現は２／１０子宮腺癌，９／１７卵巣腺癌および２／２０非小細胞肺癌腫で観察される。この手法を用い、ＴＡＴ１２６の発現はいずれの正常な細胞においても観察できなかった。
（３）ＤＮＡ２３６５１１（ＴＡＴ１５１）
陽性発現は２／１０子宮腺癌，９／１７卵巣腺癌および２／２０非小細胞肺癌腫で観察される。この手法を用い、ＴＡＴ１５１の発現はいずれの正常な細胞においても観察できなかった。
実施例６：ＧＥＰＩＳによる異なるＴＡＴポリペプチド発現の確証および分析
前記した実施例の１以上で記載された腫瘍抗原として同定することができるＴＡＴポリペプチドを分析し、以下のように確証した。発現された配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標），Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）をサーチし、興味深いＥＳＴ配列をＧＥＰＩＳによって同定した。インシリコでの遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰＩＳ）は、新しい癌治療標的のための興味深い遺伝子を特徴付けるＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．で開発されたバイオインフォマティクツールである。ＧＥＰＩＳは多量のＥＳＴ配列およびライブラリ情報を利用して、遺伝子発現のプロフィールを決定する。ＧＥＰＩＳは、ＥＳＴデータベースにおけるその出現の数とのその比例した相関に基づいて遺伝子の発現プロフィールを決定することができ、それは、ストリンジェントかつ統計学的に意味のある方法で、ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）ＥＳＴ合理的データベースおよびＧｅｎｅｎｔｅｃｈの所有権のある情報を一体化することによって働く。本実施例において、ＧＥＰＩＳは非常に特異的な分析または広いスクリーニング仕事いずれかを行うように構成できるが、ＧＥＰＩＳを用いて、新規な腫瘍抗原を同定し、交差−有効化する。最初のスクリーニングにおいて、ＧＥＰＩＳを用いて、特定の組織または興味深い組織（しばしば、興味深い腫瘍組織）における発現に相関させるＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）データベースからＥＳＴ配列を同定する。次いで、この最初のスクリーニングで同定されたＥＳＴ配列（または整列多重関連から得られたコンセンサス配列、および最初のスクリーニングから得られた重複ＥＳＴ配列）を意図したスクリーニングに付して、コードされた蛋白質における少なくとも１つの膜貫通ドメインの存在を同定した。最後に、ＧＥＰＩＳを使用して、興味深い種々の配列についての完全な組織発現プロフィールを作り出した。このタイプのスクリーニングバイオインフォーマティックスを用い、種々のＴＡＴポリペプチド（およびそれらをコードする核酸分子）は、他の癌および／または正常な非−癌性組織と比較して、特定のタイプの癌またはある種の癌において有意に過剰発現すると同定された。ＧＥＰＩＳヒトの率は、例えば、組織特異性、腫瘍特異性、および正常な必須および／または正常な増殖する組織における発現レベルを含めた、いくつかの基準に基づく。以下に、ＧＥＰＩＳによって測定されたその組織発現プロフィールが、他の腫瘍および／または正常組織と比較して特定の腫瘍または複数腫瘍における高い組織発現および発現の有意なアップレギュレーション、および所望により、正常な必須および／または正常な増殖性組織における比較的低い発現を証明するリストを示す。それ自体、以下にリストする分子は、哺乳動物における癌の診断および治療のための優れたポリペプチド標的である。 Example 5: Immunohistochemical analysis Antibodies against certain TAT polypeptides disclosed herein were prepared and immunohistochemical analysis was performed as follows. Tissue sections were first fixed in acetone / ethanol for 5 minutes (frozen or paraffin-embedded). The sections are then washed in PBS, then blocked with avidin and biotin (vector kit) for 10 minutes, each subsequently washed in PBS. The sections were then blocked with 10% serum for 20 minutes and then blotted to remove excess. The primary antibody is then added to the section at a concentration of 10 μg / ml in 1 hour, and then the section is washed in PBS. Biotinylated secondary antibody (anti-primary antibody) was then added to the section in 30 minutes and then the section was washed with PBS. The sections were then exposed to Vector ABC kit reagents for 30 minutes and then the sections were washed in PBS. The sections were then exposed to diaminobenzidine (Pierce) for 5 minutes and then washed in PBS. The sections were then counterstained with Mayers hematoxylin, covered with a coverslip and visualized. Immunohistochemical analysis is performed according to Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989 and Ausubel et al. , Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). The results from these analyzes are shown below.
(1) DNA96930 (TAT112)
Significantly higher expression was detected on the colon crypt tip surface of the colon tumor than on the normal colon crypt tip surface. In addition, TAT112 was found to be significantly overexpressed in pancreatic adenocarcinoma cells compared to normal prostate cells. Finally, IHC analysis performed as described above showed that TAT112 was compared in lung carcinoma compared to normal lung tissue, in non-small cell lung carcinoma compared to normal lung tissue, and compared to normal stomach tissue. It was proved to be significantly overexpressed in gastric carcinoma.
(2) DNA226539 (TAT126)
Positive expression is observed in 2/10 uterine adenocarcinoma, 9/17 ovarian adenocarcinoma and 2/20 non-small cell lung carcinoma. Using this technique, TAT126 expression could not be observed in any normal cells.
(3) DNA236511 (TAT151)
Positive expression is observed in 2/10 uterine adenocarcinoma, 9/17 ovarian adenocarcinoma and 2/20 non-small cell lung carcinoma. Using this technique, TAT151 expression could not be observed in any normal cells.
Example 6: Validation and analysis of different TAT polypeptide expression by GEPIS TAT polypeptides that could be identified as tumor antigens described in one or more of the above examples were analyzed and confirmed as follows. The expressed sequence tag (EST) DNA database (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Calif.) Was searched and interesting EST sequences were identified by GEPIS. In silico gene expression profiling (GEPIS) has been characterized by Genentech, Inc., which characterizes interesting genes for new cancer therapeutic targets. Is a bioinformatics tool developed at GEPIS utilizes large amounts of EST sequences and library information to determine gene expression profiles. GEPIS can determine the expression profile of a gene based on its proportional correlation with its number of occurrences in the EST database, which is a stringent and statistically meaningful method in a LIFESEQ® It works by integrating EST Rational Database and Genentech proprietary information. In this example, GEPIS can be configured to perform either a very specific analysis or a broad screening task, but GEPIS is used to identify and cross-validate new tumor antigens. In the initial screen, GEPIS is used to identify EST sequences from the LIFESEQ® database that correlate with expression in specific or interesting tissues (often interesting tumor tissues). The EST sequences identified in this initial screen (or consensus sequences obtained from aligned multiple associations, and overlapping EST sequences obtained from the initial screen) are then subjected to an intended screen in the encoded protein. The presence of at least one transmembrane domain was identified. Finally, GEPIS was used to create complete tissue expression profiles for a variety of interesting sequences. Using this type of screening bioinformatics, various TAT polypeptides (and the nucleic acid molecules that encode them) can be expressed in certain types compared to other cancer and / or normal non-cancerous tissues. It was identified as significantly overexpressed in cancer or certain cancers. The rate of GEPIS humans is based on several criteria including, for example, tissue specificity, tumor specificity, and expression levels in normal essential and / or normal proliferating tissues. Below, the tissue expression profile measured by GEPIS is high upregulation of significant tissue expression and expression in a particular tumor or multiple tumors compared to other tumors and / or normal tissues, and if desired normal A list is shown that demonstrates relatively low expression in essential and / or normal proliferative tissues. As such, the molecules listed below are excellent polypeptide targets for the diagnosis and treatment of cancer in mammals.

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実施例７：ハイブリダイゼーションプローブとしてのＴＡＴの使用
以下の方法は、すなわち、哺乳動物における腫瘍の存在の診断用のハイブリダイゼーションプローブとしてのＴＡＴをコードするヌクレオチド配列の使用を記載する。
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 Example 7: Use of TAT as a hybridization probe The following method describes the use of a nucleotide sequence encoding TAT as a hybridization probe for the diagnosis of the presence of a tumor in a mammal, ie.

本明細書中に開示される全長または成熟ＴＡＴのコーディング配列を含むＤＮＡは、プローブとしても使用されて、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリまたはヒト組織ゲノムライブラリにおいて（天然に生じるＴＡＴの変種をコードするもののような）相同ＤＮＡについてスクリーニングすることができる。   DNA comprising the full-length or mature TAT coding sequences disclosed herein can also be used as a probe in human tissue cDNA libraries or human tissue genomic libraries (such as those encoding naturally occurring TAT variants). ) Can be screened for homologous DNA.

いずれかのライブラリＤＮＡを含有するフィルターのハイブリダイゼーションおよび洗浄は、以下の高ストリンジェンシー条件下で行う。放射性標識ＴＡＴ−由来プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２×デンハルトの溶液、および１０％デキストラン硫酸の溶液中で４２℃にて２０時間行う。フィルターの洗浄は、４２℃にて０．１× ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの水溶液中で行う。   Hybridization and washing of the filter containing any library DNA is performed under the following high stringency conditions. Hybridization of the radiolabeled TAT-derived probe to the filter consisted of a solution of 50% formamide, 5 × SSC, 0.1% SDS, 0.1% sodium pyrophosphate, 50 mM sodium phosphate, pH 6.8, 2 × Denhardt. And in a solution of 10% dextran sulfate for 20 hours at 42 ° C. The filter is washed at 42 ° C. in an aqueous solution of 0.1 × SSC and 0.1% SDS.

全長天然配列ＴＡＴをコードするＤＮＡに対する所望の配列同一性を有するＤＮＡを、次いで、当該分野で公知の標準的な技術を用いて同定することができる。   DNA having the desired sequence identity to the DNA encoding full-length native sequence TAT can then be identified using standard techniques known in the art.

実施例８：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＴＡＴの発現
本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換え発現によるＴＡＴのグルコシル化されていない形態の調製を説明する。 Example 8: E.I. Expression of TAT in E. coli. The preparation of the non-glucosylated form of TAT by recombinant expression in E. coli is described.

ＴＡＴをコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いてまず増幅する。プライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含有する基である。種々の発現ベクターを使用することができる。適当なベクターの例は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含有する（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する；Ｂｏｌｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２：９５（１９７７））ｐＢＲ３２２である。該ベクターを制限酵素で消化し、脱リン酸化する。次いで、ＰＣＲ増幅配列をベクターに連結する。ベクターは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモータ、（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、およびエンテロキナーゼ切断部位を含めた）ポリｈｉｓリーダー、ＴＡＴコーディング領域、ラムダ転写ターミネーター、およびａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含むであろう。   The DNA sequence encoding TAT is first amplified using selected PCR primers. A primer is a group containing a restriction enzyme site corresponding to a restriction enzyme site on a selected expression vector. Various expression vectors can be used. Examples of suitable vectors are derived from containing genes for ampicillin and tetracycline resistance (E. coli); Bolivar et al. Gene, 2:95 (1977)) pBR322. The vector is digested with restriction enzymes and dephosphorylated. The PCR amplified sequence is then ligated to the vector. The vector is preferably an antibiotic resistance gene, trp promoter, polyhis leader (including the first 6 STII codons, polyhis sequence, and enterokinase cleavage site), TAT coding region, lambda transcription terminator, and argU gene Will contain the sequence encoding.

次いで、連結混合物を用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａに記載された方法を用いて選択されたＥ．ｃｏｌｉ株を形質転換する。形質転換体を、ＬＢプレート上で増殖する能力によって同定し、次いで、抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限分析およびＤＮＡ配列決定によって確認することができる。   The ligation mixture was then used to obtain Sambrook et al. , Selected using the method described in supra. E. coli strain is transformed. Transformants are identified by their ability to grow on LB plates and then antibiotic resistant colonies are selected. Plasmid DNA can be isolated and confirmed by restriction analysis and DNA sequencing.

選択されたクローンを、抗生物質を補足したＬＢブロスのような液体培養基中で一晩増殖させることができる。一晩培養を引き続いて用いて、より大きな規模の培養を接種することができる。次いで、細胞を所望の光学密度まで増殖し、その間に、発現プロモータのスイッチを入れる。   Selected clones can be grown overnight in liquid culture medium such as LB broth supplemented with antibiotics. An overnight culture can subsequently be used to inoculate a larger scale culture. The cells are then grown to the desired optical density, during which time the expression promoter is switched on.

細胞をさらに７時間培養した後、細胞を遠心によって収穫することができる。遠心によって得られた細胞ペレットを当該分野で知られた種々の剤を用いて可溶化することができ、次いで、蛋白質の密接な結合を可能とする条件下で金属キレート化カラムを用いて精製することができる。   After culturing the cells for an additional 7 hours, the cells can be harvested by centrifugation. The cell pellet obtained by centrifugation can be solubilized using various agents known in the art, and then purified using a metal chelation column under conditions that allow tight binding of the protein. be able to.

ＴＡＴは、以下の手法を用いて、ポリ−Ｈｉｓタグド形態にてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させることができる。選択されたＰＣＲプライマーを用いて、ＴＡＴをコードするＤＮＡをまず増幅する。プライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位、および効果的かつ信頼できる翻訳開始、金属キレート化カラムでの迅速な精製、およびエンテロキナーゼでの蛋白質分解除去を供する他の有用な配列を含むであろう。次いで、ＰＣＲ増幅されたポリ−Ｈｉｓタグド配列を発現ベクターに連結し、これを用いて、株５２（Ｗ３１１０ ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ） ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ）ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ）に基づくＥ．ｃｏｌｉ宿主を形質転換する。形質転換体を、まず、３ないし５のＯ．Ｄ．６００に到達するまで、振盪しつつ３０℃において５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリンを含有するＬＢ中で増殖させる。次いで、培養を、３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ、ならびに１１０ｍＭ ＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび７ｍＭ ＭｇＳＯ４を混合することによって調製された）ＣＲＡＰ培地に５０ないし１００倍希釈し、振盪しつつ、３０℃にてほぼ２０ないし３０時間増殖させる。試料を取り出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって発現を確認し、バルク培養を遠心して、細胞をペレット化する。細胞ペレットを精製および再折畳みまで凍結する。 TAT is a poly-His tagged form of E. coli using the following procedure. It can be expressed in E. coli. Using the selected PCR primer, DNA encoding TAT is first amplified. Primers include restriction enzyme sites that correspond to the restriction enzyme sites on the selected expression vector, and others that provide efficient and reliable translation initiation, rapid purification on metal chelating columns, and proteolytic removal with enterokinase Of useful sequences. The PCR amplified poly-His tagged sequence was then ligated into an expression vector and used to transform an E. coli host based on strain 52 (W3110 fuhA (tonA) long galE rpoHts (httpRts) clpP (lacIq). Transformants are first grown in LB containing 50 mg / ml carbenicillin at 30 ° C. with shaking until reaching an OD600 of 3 to 5. The culture is then grown to 3.57 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.71 g sodium citrate · 2H 2 O, 1.07 g KCl, 5.36 g Difco yeast extract, 5.36 g Shefhyd hycase in 500 mL water, and 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55% (w / v) glucose and 7 mM 50 to the been) CRAP media prepared by mixing MgSO 4 was diluted 100-fold, with shaking, grown approximately 20 to 30 hours at 30 ° C.. A sample is removed and expression is confirmed by SDS-PAGE analysis, and the bulk culture is centrifuged to pellet the cells. The cell pellet is frozen between purification and refolding.

０．５ないし１Ｌ醗酵からのＥ．ｃｏｌｉペースト（６ないし１０ｇのペレット）を７Ｍグアニジン、２０ｍＭトリス、ｐＨ８緩衝液中に１０容量（ｗ／ｖ）にて再懸濁させる。固体亜硫酸ナトリウムおよびテトラチオン酸ナトリウムを加えて、各々、０．１Ｍおよび０．０２Ｍの最終濃度とし、溶液を４℃にて一晩攪拌する。この工程の結果、全てのシステイン残基がスルフィトール化によってブロックされた変性蛋白質が得られる。該溶液をＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ中で４０，０００ｒｐｍにて３０分間遠心する。上清を３ないし５容量の金属キレートカラム緩衝液（６Ｍグアニジン、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４）で希釈し、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過して、清澄化する。清澄化された抽出物を、金属キレートカラム緩衝液中で平衡化した５ｍｌのＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに負荷する。カラムを、５０ｍＭのイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｕｔｒｏｌグレード）、ｐＨ７．４を含有するさらなる緩衝液で洗浄する。蛋白質を、２５０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液で溶出する。所望の蛋白質を含有する画分をプールし、４℃にて貯蔵する。そのアミノ酸配列に基づき、計算された消光係数を用い、蛋白質濃度を２８０ｎｍにおけるその吸光度によって見積もる。   E. coli from 0.5 to 1 L fermentation. E. coli paste (6-10 g pellet) is resuspended in 10 volumes (w / v) in 7 M guanidine, 20 mM Tris, pH 8 buffer. Solid sodium sulfite and sodium tetrathionate are added to a final concentration of 0.1 M and 0.02 M, respectively, and the solution is stirred at 4 ° C. overnight. As a result of this step, a denatured protein in which all cysteine residues are blocked by sulfitolization is obtained. The solution is centrifuged for 30 minutes at 40,000 rpm in a Beckman Ultracentrifuge. The supernatant is diluted with 3-5 volumes of metal chelate column buffer (6M guanidine, 20 mM Tris, pH 7.4) and filtered through a 0.22 micron filter to clarify. The clarified extract is loaded onto a 5 ml Qiagen Ni-NTA metal chelate column equilibrated in metal chelate column buffer. The column is washed with additional buffer containing 50 mM imidazole (Calbiochem, Utrol grade), pH 7.4. The protein is eluted with a buffer containing 250 mM imidazole. Fractions containing the desired protein are pooled and stored at 4 ° C. Based on the amino acid sequence, using the calculated extinction coefficient, the protein concentration is estimated by its absorbance at 280 nm.

試料を、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．６、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２．５Ｎ尿素、５ｍＭシステイン、２０ｍＭグリシンおよび１ｍＭ ＥＤＴＡよりなる新たに調製された再折畳み緩衝液にゆっくりと希釈することによって、蛋白質を再度折り畳む。再折畳み容量を、最終蛋白質濃度が５０ないし１００マイクログラム／ｍｌの間となるように選択する。再折畳み溶液を４℃にて軽く１２ないし３６時間攪拌する。再折畳み反応は、ＴＦＡの０．４％の最終濃度までの添加（ほぼ３のｐＨ）によってクエンチする。蛋白質のさらなる精製前に、溶液を０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを２ないし１０％最終濃度まで加える。再度折り畳まれた蛋白質を、１０ないし８０％のアセトニトリルのグラジエントで溶出する、０．１％ＴＦＡの移動緩衝液を用いるＰｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラムでのクロマトグラフィーに付す。Ａ２８０吸光度での画分のアリコットをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、均一な再度折り畳まれた蛋白質を含有する画分をプールする。一般に、殆どの蛋白質の適切に再度折り畳まれた種は、アセトニトリルの最低濃度で溶出する。というのは、それらの種は、逆相樹脂との相互作用から守られた疎水性内部と最も緊密だからである。凝集した種は、通常、より高いアセトニトリル濃度で溶出される。所望の形態から蛋白質の誤って折り畳まれた形態を分解するに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンを除去もする。   The protein is again diluted by slowly diluting the sample into a freshly prepared refolding buffer consisting of 20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 N urea, 5 mM cysteine, 20 mM glycine and 1 mM EDTA. Fold it up. The refolding volume is selected so that the final protein concentration is between 50 and 100 micrograms / ml. The refolding solution is gently stirred at 4 ° C. for 12 to 36 hours. The refolding reaction is quenched by the addition of TFA to a final concentration of 0.4% (approximately pH 3). Prior to further purification of the protein, the solution is filtered through a 0.22 micron filter and acetonitrile is added to 2-10% final concentration. The refolded protein is chromatographed on a Poros R1 / H reverse phase column using 0.1% TFA transfer buffer eluting with a gradient of 10-80% acetonitrile. Aliquots of fractions at A280 absorbance are analyzed on an SDS polyacrylamide gel and fractions containing uniform refolded protein are pooled. In general, properly refolded species of most proteins elute at the lowest concentration of acetonitrile. This is because these species are most closely associated with a hydrophobic interior that is protected from interaction with the reverse phase resin. Aggregated species are usually eluted at higher acetonitrile concentrations. In addition to degrading the misfolded form of the protein from the desired form, the reverse phase process also removes endotoxin from the sample.

所望の折り畳まれたＴＡＴポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けられた窒素の温和な流れを用いてアセトニトリルを除去する。蛋白質は、透析によって、処方緩衝液中にて平衡化されたＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いるゲル濾過によって、０．１４Ｍ塩化ナトリウムおよび４％マンニトールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ６．８に処方し、滅菌濾過する。   Fractions containing the desired folded TAT polypeptide are pooled and the acetonitrile removed using a gentle stream of nitrogen directed at the solution. The protein is formulated by dialysis into 20 mM Hepes, pH 6.8 containing 0.14 M sodium chloride and 4% mannitol by gel filtration using G25 Superfine (Pharmacia) equilibrated in formulation buffer, and sterile filtration. To do.

本明細書中で開示されたある種のＴＡＴポリペプチドは首尾よく発現され、この技術を用いて精製される。   Certain TAT polypeptides disclosed herein are successfully expressed and purified using this technique.

実施例９：哺乳動物細胞におけるＴＡＴの発現
本実施例は、哺乳動物細胞における組換え発現によるＴＡＴの潜在的にグリコシル化された形態の調製を説明する。 Example 9: Expression of TAT in mammalian cells This example describes the preparation of a potentially glycosylated form of TAT by recombinant expression in mammalian cells.

ベクターｐＲＫ５（１９８９年３月１５日に公開されたＥＰ ３０７，２４７参照）を発現ベクターとして使用する。所望により、ＴＡＴ ＤＮＡを、選択された制限酵素でｐＲＫ５に連結して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａに記載されているような連結方法を用いるＴＡＴ ＤＮＡの挿入を可能とする。得られたベクターをｐＲＫ５−ＴＡＴと呼ぶ。   The vector pRK5 (see EP 307,247 published March 15, 1989) is used as the expression vector. If desired, TAT DNA is ligated to pRK5 with a selected restriction enzyme, and Sambrook et al. , Supra, allowing insertion of TAT DNA using a ligation method as described in supra. The resulting vector is called pRK5-TAT.

１つの具体例において、選択された宿主細胞は２９３細胞であってよい。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、胎児子牛血清および、所望により、栄養素成分および／または抗生物質を補足したＤＭＥＭのような培地での組織培養プレートで密集するまで増殖させる。約１０μｇのｐＲＫ５−ＴＡＴ ＤＮＡを、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３１：５４３（１９８２）］をコードする約１μｇのＤＮＡと混合し、５００μＬの１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ ＣａＣｌ２に溶解させる。この混合物に５０μＬの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．３５）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＮａＰＯ４を滴下し、沈殿を２５℃にて１０分間形成させる。沈殿を懸濁させ、２９３細胞に加え、３７℃にて約４時間沈降させる。培養基を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間で加える。次いで、２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を加え、細胞を約５日間インキュベートする。 In one embodiment, the selected host cell may be 293 cells. Human 293 cells (ATCC CCL 1573) are grown to confluence in tissue culture plates in a medium such as DMEM supplemented with fetal calf serum and, optionally, nutrient components and / or antibiotics. About 10 μg of pRK5-TAT DNA was added to the VA RNA gene [Thimmappaya et al. , Cell, 31: 543 (1982)] and is dissolved in 500 μL of 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl 2 . 50 μL of 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO 4 is added dropwise to the mixture, and a precipitate is formed at 25 ° C. for 10 minutes. The precipitate is suspended and added to 293 cells and allowed to settle for about 4 hours at 37 ° C. The culture medium is aspirated and 2 ml of 20% glycerol in PBS is added over 30 seconds. The 293 cells are then washed with serum free medium, fresh medium is added, and the cells are incubated for about 5 days.

トランスフェクションから約２４時間後、培養基を除去し、培養基（単独）または２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−システインおよび２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンを含有する培養基と交換する。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を集め、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに負荷する。処理されたゲルを乾燥し、ＴＡＴポリペプチドの存在を明らかにするために選択された時間の間、フィルムに暴露することができる。トランスフェクトされた細胞を含有する培養はさらに（無血清培地中での）インキュベーションを受けることができ、培地を選択されたバイオアッセイでテストする。 Approximately 24 hours after transfection, the culture medium is removed and replaced with culture medium (alone) or culture medium containing 200 μCi / ml 35 S-cysteine and 200 μCi / ml 35 S-methionine. After 12 hours of incubation, the conditioned medium is collected, concentrated on a spin filter, and loaded onto a 15% SDS gel. The treated gel can be dried and exposed to the film for a selected time to reveal the presence of the TAT polypeptide. Cultures containing transfected cells can be further incubated (in serum-free medium) and the medium is tested in the selected bioassay.

別の技術において、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２：７５７５（１９８１）によって記載されたデキストラン硫酸方法を用い、ＴＡＴを２９３細胞に一過的に導入することができる。２９３細胞をスピナーフラスコ中で最大密度まで増殖させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＴＡＴ ＤＮＡを加える。細胞を、まず、遠心によってスピナーフラスコから濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿を細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養基で洗浄し、組織培養基、５μｇ／ｍｌのウシインスリンおよび０．１μｇ／ｍｌのウシトランスフェリンを含有するスピナーフラスコに再度導入する。約４日後に、条件培地を遠心し、濾過して、細胞およびデブリスを除去する。次いで、発現されたＴＡＴを含有する試料を濃縮し、透析および／またはカラムクロマトグラフィーのようないずれかの選択された方法によって精製することができる。   In another technique, Somaryrac et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. 12: 7575 (1981) and TAT can be transiently introduced into 293 cells using the dextran sulfate method. 293 cells are grown to maximal density in a spinner flask and 700 μg pRK5-TAT DNA is added. Cells are first concentrated from the spinner flask by centrifugation and washed with PBS. The DNA-dextran precipitate is incubated for 4 hours on the cell pellet. Cells are treated with 20% glycerol for 90 seconds, washed with tissue culture medium, and re-introduced into a spinner flask containing tissue culture medium, 5 μg / ml bovine insulin and 0.1 μg / ml bovine transferrin. After about 4 days, the conditioned medium is centrifuged and filtered to remove cells and debris. The sample containing the expressed TAT can then be concentrated and purified by any selected method such as dialysis and / or column chromatography.

もう１つの具体例において、ＴＡＴをＣＨＯ細胞において発現させることができる。ＣａＰＯ４またはＤＥＡＥ−デキストランのような公知の試薬を用い、ｐＲＫ５−ＴＡＴをＣＨＯ細胞にトランスフェクトすることができる。前記したように、細胞培養をインキュベートすることができ、培地を培養基（単独）または３５Ｓ−メチオニンのような放射性標識を含有する培地で置き換えることができる。ＴＡＴポリペプチドの存在を測定した後、培養基を無血清培地で置き換えることができる。好ましくは、培養を約６日間インキュベートし、次いで、条件培地を収穫する。次いで、発現されたＴＡＴを含有する培地を濃縮し、いずれかの選択された方法によって精製することができる。 In another embodiment, TAT can be expressed in CHO cells. Using known reagents such as CaPO 4 or DEAE- dextran, it can be transfected with pRK5-TAT in CHO cells. As described above, the cell culture can be incubated and the medium can be replaced with a medium containing a culture medium (alone) or a radioactive label such as 35 S-methionine. After determining the presence of the TAT polypeptide, the culture medium can be replaced with serum-free medium. Preferably, the culture is incubated for about 6 days and then the conditioned medium is harvested. The medium containing the expressed TAT can then be concentrated and purified by any selected method.

エピトープ−タグドＴＡＴを宿主ＣＨＯ細胞において発現させることもできる。ＴＡＴをｐＲＫ５ベクターからサブクローンすることができる。サブクローンインサートはＰＣＲを受けて、ポリ−ｈｉｓタグのような選択されたエピトープとイン・フレームにてバキュロウイルス発現ベクターに融合させることができる。次いで、ポリ−ｈｉｓタグドＴＡＴインサートを、安定なクローンの選択用のＤＨＦＲのような選択マーカーを含有するＳＶ４０駆動ベクターにサブクローンすることができる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０駆動ベクターで（前記したように）トランスフェクトすることができる。標識を前記したように行って、発現を確認することができる。次いで、発現されたポリ−ＨｉｓタグドＴＡＴを含有する培養基を濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィーによる等のいずれかの選択された方法によって精製することができる。 Epitope-tagged TAT can also be expressed in host CHO cells. TAT can be subcloned from the pRK5 vector. Subclone inserts can be subjected to PCR and fused to baculovirus expression vectors in-frame with selected epitopes such as poly-his tags. The poly-his tagged TAT insert can then be subcloned into an SV40 driven vector containing a selectable marker such as DHFR for selection of stable clones. Finally, CHO cells can be transfected with an SV40 driven vector (as described above). Labeling can be performed as described above to confirm expression. The culture medium containing the expressed poly-His tagged TAT can then be concentrated and purified by any selected method such as by Ni 2+ -chelate affinity chromatography.

ＴＡＴは一過的発現手法によってＣＨＯおよび／またはＣＯＳ細胞において、あるいはもう１つの安定な発現手法によってＣＨＯ細胞において発現させることもできる。   TAT can also be expressed in CHO and / or COS cells by transient expression techniques or in CHO cells by another stable expression technique.

ＣＨＯ細胞における安定な発現は、以下の手法を用いて行われる。蛋白質はＩｇＧ構築体（イムノアドヘシン）として発現され、ここに、各蛋白質の可溶性形態（例えば、細胞外ドメイン）についてのコーディング配列を、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ２ドメインを含有するＩｇＧ１定常領域配列に融合させ、および／またはそれはポリ−Ｈｉｓタグド形態である。   Stable expression in CHO cells is performed using the following method. The protein is expressed as an IgG construct (immunoadhesin) where the coding sequence for each protein's soluble form (eg, extracellular domain) is fused to an IgG1 constant region sequence containing the hinge, CH2 and CH2 domains. And / or it is a poly-His tagged form.

ＰＣＲ増幅に続き、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ３．１６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９７）に記載されたような標準的技術を用いて、各ＤＮＡをＣＨＯ発現ベクターにサブクローンする。ＣＨＯ発現ベクターを、注目するＤＮＡの５’および３’側の適合する制限部位を有して、ｃＤＮＡの便宜なシャッフリングを可能とするように構築する。ＣＨＯ細胞における発現で用いるベクターはＬｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４：９（１７７４−１７７９（１９９６））に記載されており、注目するｃＤＮＡおよびジヒドロ葉酸レタクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現を駆動するためにＳＶ４０初期プロモータ／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、トランスフェクションに続いてのプラスミドの安定な維持のための選択を可能とする。   Following PCR amplification, Ausubel et al. Each DNA is subcloned into a CHO expression vector using standard techniques such as those described in, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). The CHO expression vector is constructed to have convenient restriction sites on the 5 'and 3' sides of the DNA of interest to allow convenient shuffling of the cDNA. Vectors used for expression in CHO cells are described in Lucas et al. , Nucl. Acids Res. 24: 9 (1774-179 (1996)), and the SV40 early promoter / enhancer is used to drive expression of the cDNA of interest and dihydrofolate reductase (DHFR). DHFR expression allows selection for stable maintenance of the plasmid following transfection.

所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、商業的に入手可能なトランスフェクション試薬Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅｎ）、Ｄｏｓｐｅｒ（登録商標）またはＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてほぼ１千万のＣＨＯ細胞に導入する。細胞をＬｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａに記載されたように増殖させる。ほぼ３×１０７細胞をさらなる増殖および生産のために後に記載するようにアンプル中で凍結させる。 Twelve micrograms of the desired plasmid DNA is approximately 10 million using the commercially available transfection reagent Superfect® (Quiagen), Dosper® or Fugene® (Boehringer Mannheim). Into CHO cells. Cells are treated with Lucas et al. , And grown as described in supra. Approximately 3 × 10 7 cells are frozen in ampoules as described later for further growth and production.

プラスミドＤＮＡを含有するアンプルを、水浴へ入れることによって解凍し、ボルテキシングによって混合する。内容物を、１０ｍＬの培地を含有する遠心管にピペットに入れ、１０００ｒｐｍにおいて５分間遠心する。上清を吸引し、細胞を１０ｍＬの選択培地（５％０．２μｍ透析濾過胎児ウシ血清を含む０．２μｍ濾過ＰＳ２０）に再懸濁させる。次いで、細胞を、９０ｍＬの選択培地を含有する１００ｍＬのスピナーにアリコットする。１ないし２日後、細胞を、１５０ｍＬの選択増殖培地を充填した２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃にてインキュベートする。さらに２ないし３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬおよび２０００ｍＬスピナーを３×１０５細胞／ｍＬで接種する。細胞培地を、遠心および生産培地における再懸濁によって新鮮な培地と交換する。いずれの適当なＣＨＯ培地を使用することもできるが、１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５，１２２，４６９号に記載された生産培地を現実に用いることができる。３Ｌ生産スピナーは１．２×１０６細胞／ｍＬで接種する。０日において、細胞数ｐＨを測定する。１日において、スピナーをサンプリングし、濾過した空気での散布を開始する。２日に、スピナーをサンプリングし、温度を３３℃にシフトし、３０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコースおよび０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば、３５％ポリジメチルシロキサンエマルジョン、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６５ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を取る。生産を通じて必要であれば、ｐＨを調整して、それを７．２程度に維持する。１０日後あるいは生存率が７０％未満まで降下するまで細胞培養を遠心および０．２２μＭフィルターを通す濾過によって収穫する。濾液を４℃にて貯蔵するか、あるいは精製のために直ちにカラムに負荷した。 Ampoules containing plasmid DNA are thawed by placing in a water bath and mixed by vortexing. The contents are pipetted into a centrifuge tube containing 10 mL of medium and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant is aspirated and the cells are resuspended in 10 mL selective medium (0.2 μm filtered PS20 with 5% 0.2 μm diafiltered fetal bovine serum). The cells are then aliquoted into a 100 mL spinner containing 90 mL selective medium. After 1-2 days, the cells are transferred to a 250 mL spinner filled with 150 mL selective growth medium and incubated at 37 ° C. After an additional 2-3 days, inoculate 250 mL, 500 mL and 2000 mL spinners at 3 × 10 5 cells / mL. The cell medium is replaced with fresh medium by centrifugation and resuspension in production medium. Any suitable CHO medium can be used, but the production medium described in US Pat. No. 5,122,469 issued Jun. 16, 1992 can be used in practice. A 3L production spinner is inoculated at 1.2 × 10 6 cells / mL. On day 0, the cell number pH is measured. At one day, the spinner is sampled and started to spray with filtered air. On day 2, spinner is sampled, temperature is shifted to 33 ° C., 30 mL of 500 g / L glucose and 0.6 mL of 10% antifoam (eg, 35% polydimethylsiloxane emulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion) I take the. If necessary throughout production, adjust the pH to maintain it at around 7.2. Cell cultures are harvested after 10 days or until viability falls below 70% by centrifugation and filtration through a 0.22 μM filter. The filtrate was stored at 4 ° C. or loaded onto the column immediately for purification.

ポリ−Ｈｉｓタグド構築体では、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて蛋白質を精製する。精製の前に、イミダゾールを５ｍＭの濃度まで条件培地に加える。０．３Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭイミダゾールを含有する２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４で平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに条件培地を４℃にて４ないし５ｍｌ／分の流速でポンプにより送液する。負荷の後、カラムを更なる平衡緩衝液で洗浄し、０．２５Ｍイミダゾールを含有する平衡緩衝液で蛋白質を溶出させる。高度に精製された蛋白質を、引き続いて、２５ｍｌのＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにて、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．１４Ｍ ＮａＣｌおよび４％マンニトールを含有する貯蔵緩衝液、ｐＨ６．８に脱塩し、−８０℃にて貯蔵する。   For poly-His tagged constructs, proteins are purified using Ni-NTA columns (Qiagen). Prior to purification, imidazole is added to the conditioned medium to a concentration of 5 mM. Condition medium is pumped through a 6 ml Ni-NTA column equilibrated with 20 mM Hepes, pH 7.4 containing 0.3 M NaCl and 5 mM imidazole at a flow rate of 4-5 ml / min at 4 ° C. After loading, the column is washed with additional equilibration buffer and the protein is eluted with equilibration buffer containing 0.25 M imidazole. The highly purified protein was subsequently desalted on a 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) column to a storage buffer containing 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl and 4% mannitol, pH 6.8, −80 Store at ° C.

イムノアドヘシン（Ｆｃ−含有）構築体は以下のように条件培地から精製する。２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８平衡化した５ｍｌプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に条件培地をポンプ送液する。負荷の後、カラムを平衡緩衝液で十分に洗浄し、その後、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５で溶出する。２７５μＬの１Ｍトリス緩衝液ｐＨ９を含有するチューブへ１ｍｌ画分を集めることによって、溶出した蛋白質を直ちに中和する。高度に精製された蛋白質を引き続いて、ポリ−Ｈｉｓタグド蛋白質について前記したように貯蔵緩衝液に脱塩する。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによって、およびエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定によって、均一性を評価する。   Immunoadhesin (Fc-containing) constructs are purified from conditioned media as follows. Pump the conditioned medium onto a 5 ml protein A column (Pharmacia) equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.8. After loading, the column is washed thoroughly with equilibration buffer and then eluted with 100 mM citric acid, pH 3.5. Immediately neutralize the eluted protein by collecting 1 ml fractions in tubes containing 275 μL of 1 M Tris buffer pH 9. The highly purified protein is subsequently desalted into storage buffer as described above for the poly-His tagged protein. Uniformity is assessed by SDS polyacrylamide gel and by N-terminal amino acid sequencing by Edman degradation.

本明細書中で開示されたある種のＴＡＴポリペプチドは首尾よく発現され、この技術を用いて精製された。   Certain TAT polypeptides disclosed herein have been successfully expressed and purified using this technique.

実施例１０：酵母におけるＴＡＴの発現
以下の方法は酵母におけるＴＡＴの組換え発現を記載する。 Example 10: Expression of TAT in yeast The following method describes recombinant expression of TAT in yeast.

まず、酵母発現ベクターは、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモータからのＴＡＴの細胞内生産または分泌のために構築する。ＴＡＴをコードするＤＮＡおよびプロモータを、選択されたプラスミドの適当な制限酵素部位へ挿入して、ＴＡＴの細胞内発現を指令する。分泌のためには、ＴＡＴをコードするＤＮＡを、ＴＡＴの発現のために、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモータ、天然ＴＡＴシグナルペプチドまたは他の哺乳動物シグナルペプチドまたは例えば、酵母アルファ−因子またはインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、および（必要であれば）リンカー配列をコードするＤＮＡと共に選択されたプラスミドにクローン化することができる。   First, a yeast expression vector is constructed for intracellular production or secretion of TAT from the ADH2 / GAPDH promoter. DNA and a promoter encoding TAT are inserted into the appropriate restriction enzyme sites of the selected plasmid to direct intracellular expression of TAT. For secretion, the DNA encoding TAT is used for the expression of TAT, the ADH2 / GAPDH promoter, the native TAT signal peptide or other mammalian signal peptides or, for example, yeast alpha-factor or invertase secretion signal / leader sequence. , And (if necessary) can be cloned into a selected plasmid with DNA encoding the linker sequence.

次いで、酵母株ＡＢ１１０のような酵母細胞を、前記した発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養することができる。形質転換された酵母上清を、１０％トリクロロ酢酸での沈殿、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離、続いての、ゲルのクーマシーブルー色素での染色によって分析することができる。   Yeast cells such as yeast strain AB110 can then be transformed with the expression plasmid described above and cultured in the selected fermentation medium. Transformed yeast supernatants can be analyzed by precipitation with 10% trichloroacetic acid and separation by SDS-PAGE followed by staining of the gel with Coomassie blue dye.

引き続いて、遠心によって発酵培地から酵母細胞を除去し、次いで、選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって組換えＴＡＴを単離し、精製することができる。ＴＡＴを含有する濃縮物を、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製することができる。   Subsequently, the recombinant TAT can be isolated and purified by removing the yeast cells from the fermentation medium by centrifugation and then concentrating the medium using a selected cartridge filter. The concentrate containing TAT can be further purified using a selected column chromatography resin.

本明細書中に開示されたある種のＴＡＴポリペプチドは、この技術を用いて首尾よく発現され、精製された。   Certain TAT polypeptides disclosed herein have been successfully expressed and purified using this technique.

実施例１１：バキュロウイルス−感染昆虫細胞におけるＴＡＴの発現
以下の方法は、バキュロウイルス−感染昆虫細胞におけるＴＡＴの組換え発現を記載する。 Example 11: Expression of TAT in baculovirus-infected insect cells The following method describes recombinant expression of TAT in baculovirus-infected insect cells.

ＴＡＴをコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクター内に含まれるエピトープタグの上流に誘導する。そのようなエピトープタグは（ＩｇＧのＦｃ領域のように）ポリ−ｈｉｓタグおよび免疫グロブリンタグを含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような商業的に入手可能なプラスミドから由来するプラスミドを含めた種々のプラスミドを使用することができる。簡単に述べれば、ＴＡＴをコードする配列あるいは膜貫通蛋白質の細胞外ドメインをコードする配列、またはもし蛋白質が細胞外であれば成熟蛋白質をコードする配列のようなＴＡＴのコーディング配列の所望の部分は、５’および３’領域に対して相補的なプライマーでのＰＣＲによって増幅される。５’プライマーはフランキング（選択された）制限酵素部位を取り込むことができる。次いで、生成物をそれらの選択された制限酵素で消化し、発現ベクターにサブクローンする。   A sequence encoding TAT is derived upstream of an epitope tag contained within a baculovirus expression vector. Such epitope tags include poly-his tags and immunoglobulin tags (like the Fc region of IgG). A variety of plasmids can be used, including plasmids derived from commercially available plasmids such as pVL1393 (Novagen). Briefly, the desired portion of the TAT coding sequence, such as the sequence encoding TAT or the extracellular domain of a transmembrane protein, or the sequence encoding a mature protein if the protein is extracellular is: Amplified by PCR with primers complementary to the 5 'and 3' regions. The 5 'primer can incorporate flanking (selected) restriction enzyme sites. The product is then digested with those selected restriction enzymes and subcloned into an expression vector.

組換えバキュロウイルスは、（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから商業的に入手可能な）リポフェクチンを用い、前記プラスミドおよびＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に共−トランスフェクトすることによって作成される。２８℃における４ないし５日間のインキュベーションの後、放出されたウイルスを収穫し、更なる増幅のために用いる。ウイルス感染および蛋白質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９４）によって記載されたように行われる。 Recombinant baculovirus uses lipofectin (commercially available from GIBCO-BRL) and co-transfects the plasmid and BaculoGold ™ viral DNA (Pharmingen) into Spodoptera frugiperda (“Sf9”) cells (ATCC CRL 1711). Created by ffecting. After 4-5 days incubation at 28 ° C., the released virus is harvested and used for further amplification. Viral infection and protein expression are described in O'Reilley et al. , Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).

次いで、発現されたポリ−ｈｉｓタグドＴＡＴは、例えば、Ｎｉ２＋キレートアフィニティークロマトグラフィによって以下のように精製することができる。抽出物は、Ｒｕｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：１７５−１７９（１９９３）によって記載されているように組換えウイルス−感染Ｓｆ９細胞から調製される。簡単に述べれば、Ｓｆ９細胞を洗浄し、音波処理緩衝液（２５ｍＬ Ｈｅｐｅｓ，ｐｈ７．９；１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％ＮＰ−４０；０．４Ｍ ＫＣｌ）に再懸濁させ、氷上で２０秒間２回音波処理する。音波処理物を遠心によって洗浄し、上清を負荷緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）中に５０倍に希釈し０．４５μｍフィルターを通して濾過する。（Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能な）Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラムを０．５ｍＬのベッド容量で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの負荷緩衝液で平衡化する。濾過された細胞抽出物を１分当たり０．５ｍＬにてカラムに負荷する。カラムを負荷緩衝液でベースラインＡ２８０まで洗浄し、その時点で画分の収集を開始する。次に、カラムを二次洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭ ＮａＣｌ，１０％グリセロール，ｐＨ６．０）で洗浄し、これは非特異的に結合した蛋白質を溶出させる。再度Ａ２８０ベースラインに到達した後、カラムを、二次洗浄緩衝液中の０ないし５００ｍＭイミダゾールグラジエントで展開する。１ｍＬ画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびアルカリ性ホスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）に結合体化したＮｉ２＋−ＮＴＡでの銀染色またはウエスタンブロットによって分析する。溶出したＨｉｓ１０−タグドＴＡＴを含有する画分をプールし、負荷緩衝液に対して透析する。 The expressed poly-his tagged TAT can then be purified by, for example, Ni 2+ chelate affinity chromatography as follows. The extract was prepared according to Rupert et al. , Nature, 362: 175-179 (1993), prepared from recombinant virus-infected Sf9 cells. Briefly, Sf9 cells were washed and sonicated buffer (25 mL Hepes, ph 7.9; 12.5 mM MgCl 2 ; 0.1 mM EDTA; 10% glycerol; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl ) And sonicated twice on ice for 20 seconds. The sonicated product is washed by centrifugation and the supernatant is diluted 50-fold in loading buffer (50 mM phosphate, 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 7.8) and filtered through a 0.45 μm filter. A Ni 2+ -NTA agarose column (commercially available from Qiagen) is prepared with 0.5 mL bed volume, washed with 25 mL water and equilibrated with 25 mL loading buffer. Load the filtered cell extract onto the column at 0.5 mL per minute. The column is washed to baseline A 280 with loading buffer, at which point fraction collection begins. The column is then washed with secondary wash buffer (50 mM phosphate; 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 6.0), which elutes non-specifically bound protein. After reaching A280 baseline again, the column is developed with a 0 to 500 mM imidazole gradient in secondary wash buffer. 1 mL fractions are collected and analyzed by SDS-PAGE and silver staining or Western blot with Ni 2+ -NTA conjugated to alkaline phosphatase (Qiagen). Fractions containing the eluted His 10 -tagged TAT are pooled and dialyzed against loading buffer.

別法として、ＩｇＧタグド（またはＦｃタグド）ＴＡＴの精製は、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含めた公知のクロマトグラフィー技術を用いて行うことができる。   Alternatively, IgG tagged (or Fc tagged) TAT can be purified using known chromatography techniques including, for example, protein A or protein G column chromatography.

本明細書中に開示したある種のＴＡＴポリペプチドは、この技術を用いて首尾よく発現され、精製された。   Certain TAT polypeptides disclosed herein have been successfully expressed and purified using this technique.

実施例１２：ＴＡＴに結合する抗体の調製
本実施例は、ＴＡＴ二特異的に結合することができるモノクローナル抗体の調製を示す。本実施例は、さらに、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体の調製を説明する。 Example 12: Preparation of an antibody that binds to TAT This example demonstrates the preparation of a monoclonal antibody capable of binding to TAT bispecific. This example further illustrates the preparation of a monoclonal antibody that specifically binds to a TAT188 (E16) polypeptide.

モノクローナル抗体を生産するための技術は当業者に知られており、例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｓｕｐｒａに記載されている。使用することができる免疫原は、精製されたＴＡＴ、ＴＡＴを含有する融合蛋白質、および組換えＴＡＴを細胞表面に発現する細胞を含む。免疫原の選択は、過度な実験なくして当業者がなすことができる。   Techniques for producing monoclonal antibodies are known to those skilled in the art and are described, for example, in Goding, Supra. Immunogens that can be used include purified TAT, fusion proteins containing TAT, and cells expressing recombinant TAT on the cell surface. The selection of the immunogen can be made by one skilled in the art without undue experimentation.

Ｂａｌｂ／ｃのようなマウスは、フロイントの完全なアジュバント中に乳化したＴＡＴ免疫原で免疫化し、１ないし１００マイクログラムの量で皮下または腹腔内注射する。別法として、免疫原はＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）中に乳化し、動物の後足に注射する。次いで、免疫化されたマウスを、１０ないし１２日後に、選択されたアジュバント中に乳化した更なる免疫原でブースター注射する。しかる後、数週間の間、マウスをさらなる免疫化注射でブースター注射することができる。ＥＬＩＳＡアッセイにおけるテストのために、血清試料を眼窩後出血によってマウスから周期的に得て、抗−ＴＡＴ抗体を検出することができる。   Mice such as Balb / c are immunized with TAT immunogen emulsified in Freund's complete adjuvant and injected subcutaneously or intraperitoneally in an amount of 1 to 100 micrograms. Alternatively, the immunogen is emulsified in MPL-TDM adjuvant (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) and injected into the animal's hind paw. The immunized mice are then boosted 10 to 12 days later with additional immunogen emulsified in the selected adjuvant. Thereafter, the mice can be boosted with additional immunization injections for several weeks. For testing in an ELISA assay, serum samples can be periodically obtained from mice by retroorbital bleeding to detect anti-TAT antibodies.

ＴＡＴ１８８ポリペプチドＥ１６は、細胞内にＣ−およびＮ−両末端が位置した１２回膜貫通蛋白質である。ＴＡＴ（Ｅ１６）は、共通重鎖４Ｆ２ｈｃ（ＣＤ９８ｈｃ）でヘテロダイマー化して、機能的ユニットを形成する、Ｎａ２＋独立大中性アミノ酸トランスポーターのサブユニットである（図１５５中のダイアグラム参照）。細胞外ドメインを標的化する抗−ＴＡＴ１８８（抗−Ｅ１６）抗体を調製するためには、内因的にはＥ１６を発現するＰＣ３細胞を免疫原として用いた。簡単に述べれば、ＰＣ３細胞（２２×１０６細胞／ｍｌ）をＢａｌｂ−ｃマウスに注射した。抗体力価は、対照２９３細胞および２９３−Ｅ１６細胞（Ｅ１６でトランスフェクトし、それを生産する２９３細胞）に対してテストした。６つのハイブリドーマが調製され、抗−Ｅ１６抗体を発現した。これらのうち、３つの抗体はＦＡＣＳ分析によってＥ１６に対する良好な特異性を有することが示され（図１５６参照）、ここに、細胞表面結合はＥ１６表面発現に平行した。具体的には、Ｅ１６ ｓｉＲＮＡトランスフェクションはＥ１６発現を阻害し（本明細書中の実施例１７参照）、ＰＣ３細胞の表面に結合した抗−１６抗体の量を減少させた。これらの抗体を、本明細書中においては、３Ｂ５．１（または３Ｂ５）、１２Ｇ１２．１（または１２Ｇ１２）、および１２Ｂ９．１（または１２Ｂ９）といい、本明細書中に開示された更なる実験で用いた。 TAT188 polypeptide E16 is a 12-transmembrane protein with C- and N-terminal ends located in the cell. TAT (E16) is a subunit of the Na2 + independent large neutral amino acid transporter that heterodimerizes with a common heavy chain 4F2hc (CD98hc) to form a functional unit (see diagram in FIG. 155). To prepare anti-TAT188 (anti-E16) antibody targeting the extracellular domain, PC3 cells endogenously expressing E16 were used as the immunogen. Briefly, PC3 cells (22 × 10 6 cells / ml) were injected into Balb-c mice. Antibody titers were tested against control 293 cells and 293-E16 cells (293 cells transfected with and producing E16). Six hybridomas were prepared and expressed anti-E16 antibody. Of these, three antibodies were shown to have good specificity for E16 by FACS analysis (see FIG. 156), where cell surface binding paralleled E16 surface expression. Specifically, E16 siRNA transfection inhibited E16 expression (see Example 17 herein) and reduced the amount of anti-16 antibody bound to the surface of PC3 cells. These antibodies are referred to herein as 3B5.1 (or 3B5), 12G12.1 (or 12G12), and 12B9.1 (or 12B9) and are further experiments disclosed herein. Used in.

本発明の抗体を発現するハイブリドーマは以下のように調製した。適当な抗体力価が検出された後、抗体に対して「陽性」である動物にＴＡＴの最終静脈内注射を注射することができる。３ないし４日後、マウスを犠牲にし、脾臓細胞を収穫する。次いで、脾臓細胞をＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １５９７から入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１のような選択されたネズミ骨髄腫細胞系に（３５％ポリエチレングリコールを用いて）融合させる。該融合によりハイブリドーマ細胞が生じ、これが、次いで、非−融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するためのＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）を含有する９６ウェル組織培養プレート中で平板培養することができる。   A hybridoma expressing the antibody of the present invention was prepared as follows. After a suitable antibody titer has been detected, animals that are “positive” for antibodies can be injected with a final intravenous injection of TAT. After 3-4 days, the mice are sacrificed and the spleen cells are harvested. Spleen cells were then ATCC No. P3X63AgU. Fusion (using 35% polyethylene glycol) to a selected murine myeloma cell line such as 1. The fusion produces hybridoma cells, which in turn contain 96 well tissue culture containing HAT (hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) to inhibit the growth of non-fusion cells, myeloma hybrids, and spleen cell hybrids. Can be plated in plates.

ハイブリドーマ細胞はＴＡＴに対する反応性について、ＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングした。ＴＡＴに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の測定は、当業者の技量内のものである。   Hybridoma cells were screened in an ELISA for reactivity to TAT. Measurement of “positive” hybridoma cells that secrete the desired monoclonal antibody to TAT is within the skill of the artisan.

陽性ハイブリドーマ細胞は同系Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射して、抗−ＴＡＴモノクローナル抗体を含有する腹水を生じさせることができる。別法として、ハイブリドーマ細胞を組織培養フラスコまたはローラーボトル中で増殖させることができる。腹水中で生産されたモノクローナル抗体の生成は、硫酸アンモニウム沈殿、続いての、ゲル排除クロマトグラフィーを用いて達成することができる。別法として、抗体のプロテインＡまたはプロテインＧへの結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーを使用することができる。   Positive hybridoma cells can be injected intraperitoneally into syngeneic Balb / c mice to produce ascites containing anti-TAT monoclonal antibodies. Alternatively, hybridoma cells can be grown in tissue culture flasks or roller bottles. Production of monoclonal antibodies produced in ascites can be achieved using ammonium sulfate precipitation followed by gel exclusion chromatography. Alternatively, affinity chromatography based on binding of antibody to protein A or protein G can be used.

本明細書中に開示されたある種のＴＡＴポリペプチドに対して向けられた抗体はこの技術を用いて首尾よく生産された。より具体的には、（標準ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳソーティング分析および／または免疫組織化学分析によって測定されたように）ＴＡＴ蛋白質を認識し、それに結合することができる機能的モノクローナル抗体は、本明細書中に開示されたように以下のＴＡＴ蛋白質に対して首尾よく作成された：ＴＡＴ１１０（ＤＮＡ９５９３０）、ＴＡＴ２１０（ＤＮＡ９５９３０−１）、ＴＡＴ１１３（ＤＮＡ２１５６０９）、ＴＡＴ１２６（ＤＮＡ２２６５３９）、ＴＡＴ１５１（ＤＮＡ２３６５１１）、ＴＡＴ１１１（ＤＮＡ１８８２２１）、ＴＡＴ１４６（ＤＮＡ２３３８７６）、ＴＡＴ１１２（ＤＮＡ９６９３０）、ＴＡＴ１４５（ＤＮＡ９８５６５）、ＴＡＴ１５２（ＤＮＡ２４６４３５）、ＴＡＴ１４１（ＤＮＡ２３６４９３）、ＴＡＴ１１４（ＤＮＡ１０８８０９）、ＴＡＴ１０４（ＤＮＡ２３６３４３）、ＴＡＴ１００（ＤＮＡ２３１５４２）、ＴＡＴ２８４（ＤＮＡ２３１５４２−１）、ＴＡＴ２８５（ＤＮＡ２３１５４２−２）、ＴＡＴ２８５−１（ＤＮＡ２９７３９３），ＴＡＴ１４４（ＤＮＡ２２６４５６）、ＴＡＴ１８８（ＤＮＡ２３７６３７）、ＴＡＴ１２３（ＤＮＡ２１０４９９）、ＴＡＴ２１１（ＤＮＡ２１９８９４）、ＴＡＴ１０２（ＤＮＡ２３６５３４）、ＴＡＴ１２７（ＤＮＡ２２８１９９）およびＴＡＴ１２８（ＤＮＡ２２０４３２）。興味深いことには、出願人らは、ＴＡＴ１１１（ＤＮＡ１８８２２１）およびＴＡＴ１４６（ＤＮＡ２３３８７６）に対して調製されたモノクローナル抗体が、その関連するリガンドポリペプチドによる、ＤＮＡ１８８２２１およびＤＮＡ２３３８７６分子によってコードされるＥｐｈＢ２Ｒ受容体の活性化をブロックすることができることを突き止めた。それ自体、その関連するリガンドによる、ＥｐｈＢ２Ｒ受容体（すなわち、ＴＡＴ１１１およびＴＡＴ１４６ポリペプチド）の活性化をブロックするための抗体を用いる抗体および方法は、現在記載された発明内に含まれる。さらに、出願人らは、ＴＡＴ１１０（ＤＮＡ９５９３０）およびＴＡＴ２１０（ＤＮＡ９５９３０−１）ポリペプチド（すなわち、ＩＬ−２０受容体アルファポリペプチド）に対して向けられたモノクローナル抗体が、ＩＬ−１９蛋白質によるＩＬ−２０受容体アルファの活性化を阻害することができることを突き止めた。それ自体、ＩＬ−１９によるＩＬ−２０受容体アルファ（すなわち、ＴＡＴ１１０およびＴＡＴ２１０ポリペプチド）の活性化を阻害するための抗体を用いる抗体および方法は、現在記載された発明に含まれる。   Antibodies directed against certain TAT polypeptides disclosed herein have been successfully produced using this technique. More specifically, functional monoclonal antibodies capable of recognizing and binding to a TAT protein (as measured by standard ELISA, FACS sorting analysis and / or immunohistochemical analysis) are described herein. Successfully disclosed for the following TAT proteins as disclosed: TAT110 (DNA95930), TAT210 (DNA95930-1), TAT113 (DNA215609), TAT126 (DNA226539), TAT151 (DNA236511), TAT111 (DNA188221), TAT146 (DNA233387), TAT112 (DNA96930), TAT145 (DNA98565), TAT152 (DNA246435), TAT141 (DNA236493), TAT11 (DNA108809), TAT104 (DNA236343), TAT100 (DNA231542), TAT284 (DNA231542-1), TAT285 (DNA231542-2), TAT285-1 (DNA297393), TAT144 (DNA226456), TAT188 (DNA237376), TAT123 (DNA210499), TAT211 (DNA21994), TAT102 (DNA236534), TAT127 (DNA228199) and TAT128 (DNA220432). Interestingly, Applicants have shown that monoclonal antibodies prepared against TAT111 (DNA188221) and TAT146 (DNA2337676) are active in the EphB2R receptor encoded by the DNA188221 and DNA233387 molecules by their associated ligand polypeptides. I found out that I could block it. As such, antibodies and methods that use antibodies to block activation of EphB2R receptors (ie, TAT111 and TAT146 polypeptides) by their associated ligands are included within the presently described invention. In addition, Applicants have reported that monoclonal antibodies directed against TAT110 (DNA95930) and TAT210 (DNA95930-1) polypeptides (ie, IL-20 receptor alpha polypeptide) have IL-20 by IL-19 protein. It has been found that activation of receptor alpha can be inhibited. As such, antibodies and methods that use antibodies to inhibit the activation of IL-20 receptor alpha (ie, TAT110 and TAT210 polypeptides) by IL-19 are included in the presently described invention.

本明細書中に記載されたＴＡＴポリペプチドに対して向けられたモノクローナル抗体の成功した調製に加えて、それらのモノクローナル抗体の多くは、（イン・ビトロおよびイン・ビボ双方で）注目するＴＡＴポリペプチドを発現する細胞（または組織）に細胞トキシンを向けるのに用いられる細胞トキシンに首尾よく結合体化されている。例えば、トキシン（例えば、ＤＭ１）誘導体化モノクローナル抗体は、以下の本明細書中に記載されるＴＡＴポリペプチドに対して首尾よく作成された：ＴＡＴ１１０（ＤＮＡ９５９３０）、ＴＡＴ２１０（ＤＮＡ９５９３０−１）、ＴＡＴ１１２（ＤＮＡ９６９３０）、ＴＡＴ１１３（ＤＮＡ２１５６０９）、ＴＡＴ１１１（ＤＮＡ１８８２２１）およびＴＡＴ１４６（ＤＮＡ２３３８７６）。後に本明細書中に示すように、他の有用な結合体トキシンはアウリスタチンＭＭＡＥおよびＭＭＡＦを含む。   In addition to the successful preparation of monoclonal antibodies directed against the TAT polypeptides described herein, many of those monoclonal antibodies are of interest (both in vitro and in vivo). It has been successfully conjugated to cellular toxins used to direct cellular toxins to cells (or tissues) that express the peptide. For example, toxin (eg, DM1) derivatized monoclonal antibodies have been successfully generated against the TAT polypeptides described herein: TAT110 (DNA95930), TAT210 (DNA95930-1), TAT112 ( DNA96930), TAT113 (DNA215609), TAT111 (DNA188221) and TAT146 (DNA233387). As will be shown later herein, other useful conjugate toxins include auristatin MMAE and MMAF.

実施例１３：特異的抗体を用いるポリペプチドの精製
天然または組換えＴＡＴポリペプチドは、蛋白質精製の分野における種々の標準的な技術によって精製することができる。例えば、プロ−ＴＡＴポリペプチド、成熟ＴＡＴポリペプチド、またはプレ−ＴＡＴポリペプチドは、注目するＴＡＴポリペプチドに対して特異的な抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは、抗−ＴＡＴポリペプチド抗体を活性化されたクロマトグラフィー樹脂に共有結合カップリングすることによって構築される。 Example 13: Purification of polypeptides using specific antibodies Natural or recombinant TAT polypeptides can be purified by various standard techniques in the field of protein purification. For example, a pro-TAT polypeptide, mature TAT polypeptide, or pre-TAT polypeptide is purified by immunoaffinity chromatography using an antibody specific for the TAT polypeptide of interest. In general, an immunoaffinity column is constructed by covalently coupling an anti-TAT polypeptide antibody to an activated chromatography resin.

ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿によってまたは固定化されたプロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）での精製によって免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿によって、または固定化されたプロテインＡでのクロマトグラフィーによってマウス腹水から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のようなクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体は樹脂にカップリングされ、樹脂はブロックされ、誘導体樹脂は製造業者の指示に従って洗浄される。 Polyclonal immunoglobulins are prepared from immune sera by precipitation with ammonium sulfate or by purification with immobilized Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). Similarly, monoclonal antibodies are prepared from mouse ascites by ammonium sulfate precipitation or by chromatography on immobilized protein A. The partially purified immunoglobulin is covalently coupled to a chromatographic resin such as CnBr-activated SEPHAROSE ™ (Pharmacia LKB Biotechnology). The antibody is coupled to the resin, the resin is blocked, and the derivative resin is washed according to the manufacturer's instructions.

そのような免疫親和性カラムは、可溶性形態のＴＡＴポリペプチドを含有する細胞から画分を調製することによってＴＡＴポリペプチドの精製で利用される。この調製は、洗剤の負荷によって、または当該分野で良く知られた他の方法によって、分別遠心を介して得られた全細胞または細胞下画分の可溶化によって誘導される。別法として、シグナル配列を含有する可溶性ＴＡＴポリペプチドは、細胞が増殖する培地に有用な量で分泌させることができる。   Such immunoaffinity columns are utilized in the purification of TAT polypeptides by preparing fractions from cells containing soluble forms of TAT polypeptides. This preparation is induced by solubilization of whole cells or subcellular fractions obtained via fractional centrifugation, by detergent loading or by other methods well known in the art. Alternatively, soluble TAT polypeptide containing a signal sequence can be secreted in a useful amount to the medium in which the cells are growing.

可溶性ＴＡＴポリペプチド−含有調製は免疫親和性カラムを通過させ、ＴＡＴポリペプチドの優先的吸収を可能とする条件下でカラムを洗浄する（例えば、洗剤の存在下での抗イオン強度緩衝液）。次いで、抗体／ＴＡＴポリペプチド結合を破壊する条件下でカラムを溶出させ（例えば、ほぼｐＨ２ないし３のような低ｐＨ緩衝液または尿素またはチオシアネートイオンのような高濃度のカオトロープ）、ＴＡＴポリペプチドを収集する。   Soluble TAT polypeptide-containing preparations are passed through an immunoaffinity column and the column is washed under conditions that allow preferential absorption of the TAT polypeptide (eg, an anti-ionic strength buffer in the presence of detergent). The column is then eluted under conditions that disrupt antibody / TAT polypeptide binding (eg, a low pH buffer such as approximately pH 2-3 or a high concentration of chaotrope such as urea or thiocyanate ions) and the TAT polypeptide is collect.

実施例１４：イン・ビトロ腫瘍細胞殺傷アッセイ
注目するＴＡＴポリペプチドを発現する哺乳動物細胞は、標準的な発現ベクターおよびクローニング技術を用いて得ることができる。別法として、注目するＴＡＴポリペプチドを発現する多くの腫瘍細胞系は、例えば、ＡＴＣＣを介して公に入手可能であり、標準的なＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析を用いてルーチン的に同定することができる。次いで、抗−ＴＡＴポリペプチドモノクローナル抗体（およびそのトキシン結合体化誘導体）をアッセイで使用して、イン・ビトロでＴＡＴポリペプチドを発現する細胞を殺傷する抗体の能力を測定することができる。 Example 14: In Vitro Tumor Cell Killing Assay Mammalian cells expressing the TAT polypeptide of interest can be obtained using standard expression vectors and cloning techniques. Alternatively, many tumor cell lines that express a TAT polypeptide of interest are publicly available, eg, via ATCC, and can be routinely identified using standard ELISA or FACS analysis . The anti-TAT polypeptide monoclonal antibody (and its toxin-conjugated derivative) can then be used in the assay to determine the ability of the antibody to kill cells that express the TAT polypeptide in vitro.

例えば、注目するＴＡＴポリペプチドを発現する細胞は前記したように得られ、９６ウェル皿に平板培養する。１つの分析において、抗体／トキシン結合体（または裸の抗体）を、４日間の間の細胞インキュベーションを通じて含ませる。第二の独立した分析において、細胞を抗体／トキシン結合体（または裸の抗体）と共に１時間インキュベートし、次いで、抗体／トキシン結合体の不存在下で４日間インキュベートする。次いで、ＰｒｏｍｅｇａからのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓｅｙ （カタログ番号Ｇ７５７１）を用いて細胞生存率を測定する。未処理細胞は陰性対照として供する。   For example, cells expressing the TAT polypeptide of interest are obtained as described above and plated in 96 well dishes. In one assay, antibody / toxin conjugate (or naked antibody) is included through a 4 day cell incubation. In a second independent analysis, cells are incubated with antibody / toxin conjugate (or naked antibody) for 1 hour and then in the absence of antibody / toxin conjugate for 4 days. Cell viability is then measured using CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Catalog Number G7571) from Promega. Untreated cells serve as negative controls.

１つの特別な分析において、ＴＡＴ１１２（ＤＮＡ９６９３０）に対して向けられたモノクローナル抗体の能力は、そのポリペプチドを発現する細胞を殺傷する能力について分析した。１つの分析において、ｇＤ．ＮＣＡと呼ばれる発現ベクターを調製した。そのベクターに挿入されたＴＡＴ１１２ポリペプチドコーディング配列は、ＳＶ４０プロモータによって駆動され、該ベクターはＳＶ４０初期ポリＡシグナルも含有する。ｇＤ．ＮＣＡベクターは、ＰＣ３細胞においてＮｅｏ耐性を発現するＳＶ４０ベクターと共にＰＣ３細胞に共−トランスフェクトし、陽性形質転換体を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８において選択した。陽性クローンは９６ウェルプレートにおいて単離し、前記したように調製され、３Ｅ６と呼ばれる抗−ＴＡＴ１１２モノクローナル抗体を用いるフローサイトメトリーによって分析した。クローン３は、その表面に高レベルのＴＡＴ１１２ポリペプチドを発現することが判明したので、該分析のために選択した。第二の独立した分析において、膵臓癌細胞系Ｈｐａｆ ＩＩはＡＴＣＣから入手し、該アッセイで使用した。   In one particular analysis, the ability of a monoclonal antibody directed against TAT112 (DNA96930) was analyzed for its ability to kill cells expressing that polypeptide. In one analysis, gD. An expression vector called NCA was prepared. The TAT112 polypeptide coding sequence inserted into the vector is driven by the SV40 promoter, which also contains the SV40 early poly A signal. gD. The NCA vector was co-transfected into PC3 cells with an SV40 vector that expresses Neo resistance in PC3 cells and positive transformants were selected at 800 μg / ml G418. Positive clones were isolated in 96 well plates, prepared as described above and analyzed by flow cytometry using an anti-TAT112 monoclonal antibody called 3E6. Clone 3 was selected for the analysis because it was found to express high levels of TAT112 polypeptide on its surface. In a second independent analysis, the pancreatic cancer cell line Hpaf II was obtained from ATCC and used in the assay.

もう１つの特別な分析においては、ＴＡＴ１８８（ＤＮＡ２３７６３７）に対して向けられたモノクローナル抗体の能力は、そのポリペプチドを発現する細胞を殺傷する能力について分析した。   In another special analysis, the ability of a monoclonal antibody directed against TAT188 (DNA237376) was analyzed for its ability to kill cells expressing that polypeptide.

まず、細胞活性に影響する裸の抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）抗体の能力を証明した。
Ａ．抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）モノクローナル抗体は、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）内部化を刺激し、アミノ酸輸送活性を低下する。 First, the ability of a naked anti-TAT188 (E16) antibody to affect cell activity was demonstrated.
A. Anti-TAT188 (E16) monoclonal antibody stimulates TAT188 (E16) internalization and reduces amino acid transport activity.

Ｅ１６蛋白質を発言する細胞への抗−Ｅ１６抗体への結合は、アミノ酸輸送の低下と平行した抗体内部化を誘導した。ＰＣ３細胞を、３７℃においてプロテアソーム阻害剤（Ｓｉｇｍａ）に関して示された時間の間、１次抗体と共にインキュベートした。次いで、抗体を除去し、細胞をＰＢＳで数回洗浄する。細胞を４％ＰＦＡで固定し、次いで、ＰＢＳ／０．１％トリトンＸ−１００で浸透させる。１０％ヤギ血清でのブロッキングの後、細胞を２次抗体（ヤギ抗−マウスＩｇＧ−Ｃｙ３結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ））で細胞を染色し、蛍光顕微鏡によって分析した。結果は、抗−Ｅ１６モノクローナル抗体が、その表面にＴＡＴ１８８（Ｅ１６）を発現するＰＣ３細胞に結合し、それによって内部化されることを示す（図１５７参照）。抗−ＴＡＴ１８８抗体内部化の証明は、抗体−Ｅ１６相互作用の有用な特徴を強調する。なぜならば、結合した抗体の内部化の結果、抗−ＴＡＴ１８８抗体に結合体化したトキシンが取り込まれ得る（この実施例１４のセクションＢおよびＣ参照）。   Binding to anti-E16 antibodies to cells that speak the E16 protein induced antibody internalization paralleled by a decrease in amino acid transport. PC3 cells were incubated with primary antibody for the times indicated for the proteasome inhibitor (Sigma) at 37 ° C. The antibody is then removed and the cells are washed several times with PBS. Cells are fixed with 4% PFA and then permeabilized with PBS / 0.1% Triton X-100. After blocking with 10% goat serum, cells were stained with a secondary antibody (goat anti-mouse IgG-Cy3 conjugate (Jackson immunolabs)) and analyzed by fluorescence microscopy. The results show that anti-E16 monoclonal antibody binds to and is internalized by PC3 cells expressing TAT188 (E16) on its surface (see FIG. 157). Demonstration of anti-TAT188 antibody internalization highlights useful features of antibody-E16 interactions. Because of the internalization of the bound antibody, toxin conjugated to the anti-TAT188 antibody can be incorporated (see section B and C of this Example 14).

ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）のアミノ酸輸送蛋白質としての機能は、抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）抗体の結合によって阻害された。ロイシン輸送機能アッセイは以下のように行った。細胞を２４ウェルプレート中で増殖させ、抗−Ｅ１６抗体で一晩処理した。次いで、細胞を温かいＮａ＋＋フリーＨｅｐｅｓ−Ｒｉｎｇｅｒで濯ぎ、３７℃にて１０分間インキュベートした。緩衝液を、放射性標識アミノ酸（Ｌ−［２，３−３Ｈ］−アルギニンまたはＬ−［３，４，５−３Ｈ（Ｎ）］−ロイシン）５μＣｉ／ｍｌ、５０μＬナトリウム−フリーＨｅｐｅｓ−リンゲル）を含有する２００μＬアッセイ緩衝液に交換した。放射性混合物を３７℃にて３０秒間インキュベートした後、緩衝液を吸引によって除去し、細胞を氷冷ナトリウム−フリーＨｅｐｅｓ−リンゲル１ｍｌ／ウェルで４回洗浄した。プレートを乾燥し、これに０．２ｍｌ／ウェルの０．２％ＳＤＳ／０．２Ｎ ＮａＯＨを加えた各試料からの溶解物の０．１ｍｌアリコットを０．１ｍｌの０．２Ｎ ＨＣｌで中和し、その後、液体シンチレーションカクテルを乾燥した。溶解物の（［３Ｈ］）放射能をシンチレーションカウンターを用いてテストした。図１５８中の結果は、細胞表面のＥ１６蛋白質に結合する抗−Ｅ１６抗体は、ほぼ２４時間後にアミノ酸輸送の低下を引き起こすことを示す。該低下は、同時のＥ１６ポリペプチドの内部化、および輸送機能についての利用可能なＥ１６の喪失によるものである。
Ｂ．ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）を発現する細胞へのトキシン−結合体化抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）抗体の結合は細胞殺傷をもたらす。 The function of TAT188 (E16) as an amino acid transport protein was inhibited by the binding of anti-TAT188 (E16) antibody. The leucine transport function assay was performed as follows. Cells were grown in 24-well plates and treated overnight with anti-E16 antibody. Cells were then rinsed with warm Na ++ free Hepes-Ringer and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. The buffer was a radiolabeled amino acid (L- [2,3- 3 H] -arginine or L- [3,4,5- 3 H (N)]-leucine) 5 μCi / ml, 50 μL sodium-free Hepes-Ringer. ) Containing 200 μL assay buffer. After incubating the radioactive mixture for 30 seconds at 37 ° C., the buffer was removed by aspiration and the cells were washed 4 times with 1 ml / well of ice-cold sodium-free Hepes-Ringer. Dry the plate and neutralize 0.1 ml aliquot of lysate from each sample with 0.2 ml / well 0.2% SDS / 0.2N NaOH added with 0.1 ml 0.2N HCl. The liquid scintillation cocktail was then dried. Lysates were tested for ([ 3 H]) radioactivity using a scintillation counter. The results in FIG. 158 indicate that anti-E16 antibodies that bind to cell surface E16 protein cause a decrease in amino acid transport after approximately 24 hours. The reduction is due to simultaneous E16 polypeptide internalization and loss of available E16 for transport function.
B. Binding of toxin-conjugated anti-TAT188 (E16) antibody to cells expressing TAT188 (E16) results in cell killing.

抗−ＴＡＴ１８８およびＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのコンジュゲーションによる抗−ＴＡＴ１８８−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの調製
抗体は、組織特異的（または病気特異的または双方の）表面蛋白質のような細胞の比較的ユニークな特徴が、健康な細胞の殺傷を回避しつつ、細胞外細胞が殺傷に対して標的化されるようにする該細胞へサイトトキシンを送達する便宜かつ高度に特異的な方法を提供する。前記で開示されたＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢリンカーを介して抗体にカップリングしたアウリスタチンサイトトキシンは、抗体−トキシン結合体のＥ１６媒介内部化からの細胞殺傷を示すのに有用である。該手法は以下のように行った。ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢリンカーを用い、ＭＭＡＥトキシンを抗−ＴＡＴ１８８抗体上のシステイン残基に共有結合した。ｐＨ８．０の５００ｍＭホウ酸ナトリウムおよび５００ｍＭ塩化ナトリウムに溶解させた抗−ＴＡＴ１８８を過剰の１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理する。３７℃における約３０分間のインキュベーション後、緩衝液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂での溶出によって交換し、１ｍＭ ＤＴＰＡを含むＰＢＳで溶出した。溶液の２８０ｎｍにおける吸光度からの低下した抗体濃度、およびＤＰＮＢ（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）との反応によるチオール濃度を測定し、および４１２ｎｍにおける吸光度を測定することによって、チオール／Ａｂ値をチェックする。ＰＢＳに溶解させた低下した抗体を氷上で冷却する。 Preparation of anti-TAT188-MC-vc-PAB-MMAE by conjugation of anti-TAT188 and MC-vc-PAB-MMAE Antibodies can be expressed in tissue-specific (or disease-specific or both) surface proteins such as Relatively unique features provide a convenient and highly specific method of delivering cytotoxin to cells that allow extracellular cells to be targeted for killing while avoiding healthy cell killing To do. Auristatin cytotoxins coupled to antibodies via the MC-vc-PAB linker disclosed above are useful for indicating cell killing from E16-mediated internalization of antibody-toxin conjugates. The method was performed as follows. The MMAE toxin was covalently linked to a cysteine residue on the anti-TAT188 antibody using MC-vc-PAB linker. Anti-TAT188 dissolved in 500 mM sodium borate and 500 mM sodium chloride at pH 8.0 is treated with excess 100 mM dithiothreitol (DTT). After about 30 minutes incubation at 37 ° C., the buffer was exchanged by elution with Sephadex G25 resin and eluted with PBS containing 1 mM DTPA. The thiol / Ab value is checked by measuring the reduced antibody concentration from the absorbance at 280 nm of the solution and the thiol concentration by reaction with DPNB (Aldrich, Milwaukee, Wis.) And measuring the absorbance at 412 nm. Cool the lowered antibody dissolved in PBS on ice.

ＤＭＳＯに溶解させた、薬物リンカー試薬、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ＰＡＢ−モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、すなわち、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを既知の濃度でアセトニトリルおよび水に希釈し、ＰＢＳ中の冷却した低下した抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）抗体に加える。約１時間後、過剰のマレイミドを加えて、反応をクエンチし、いずれの未反応の抗体チオール基もキャップする。遠心限外濾過によって反応混合物を濃縮し、ＰＢＳ中のＧ２５樹脂を通す溶出によって抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを精製し、脱塩し、滅菌条件下で０．２μｍフィルターを通して濾過し、貯蔵のために凍結した。
抗−ＴＡＴ１８８およびＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦのコンジュゲーションによる抗−ＴＡＴ１８８−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦの調製
抗−ＴＡＴ１８８−ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦは、ＭＭＡＥのコンジュゲーションについて前記で開示した手法に従い、抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）およびＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦのコンジュゲーションによって調製した。ＭＭＡＦは、薬物のＣ−末端にフェニルアラニンを持つＭＭＡＥの誘導体である。 Drug linker reagent, maleimidocaproyl-valine-citrulline-PAB-monomethylauristatin E (MMAE), ie MC-vc-PAB-MMAE, dissolved in DMSO, diluted in acetonitrile and water at known concentrations, PBS Add to the cooled reduced anti-TAT188 (E16) antibody in. After about 1 hour, excess maleimide is added to quench the reaction and cap any unreacted antibody thiol groups. Concentrate the reaction mixture by centrifugal ultrafiltration and purify anti-TAT188 (E16) -MC-vc-PAB-MMAE by elution through G25 resin in PBS, desalinate, and 0.2 μm filter under sterile conditions Filtered through and frozen for storage.
Preparation of anti-TAT188-MC-vc-PAB-MMAF by conjugation of anti-TAT188 and MC-vc-PAB-MMAF Anti-TAT188-MC-val-cit-PAB-MMAF is described above for conjugation of MMAE. Prepared by conjugation of anti-TAT188 (E16) and MC-val-cit-PAB-MMAF according to the disclosed procedure. MMAF is a derivative of MMAE with phenylalanine at the C-terminus of the drug.

トキシン−結合体化抗−ＴＡＴ１８８のイン・ビトロ細胞傷害性の測定
本実験のためのトキシン−結合体化３Ｂ５、１２Ｂ９、および１２Ｇ１２抗体は、各々、３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、１２Ｂ９−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、および３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ結合体として調製した。抗体−トキシン結合体、アルファ−ＩＬ８−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥは陰性対照として用いた。ＰＣ３細胞（ＡＴＣＣから入手可能であって、その表面にＥ１６を内因的に発現した前立腺癌細胞系）およびＣｏｌｏ２０５細胞（ＡＴＣＣから入手可能であって、その表面にＥ１６を内因的に発現するヒト結腸癌細胞系）を、増大させる濃度のトキシン−結合体化抗体と接触させ、前記したように標準的な細胞生存性培養ルミネセンスアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏＴＭキット，Ｐｒｏｍｅｇａ）によって細胞殺傷についてモニターした。図１５９Ａ（ＰＣ３細胞）および図１５９Ｂ（Ｃｏｌｏ２０５細胞）に示される結果は、３つのトキシン−結合体化抗−Ｅ１６抗体が、Ｅ１６を発現する細胞の殺傷を促進することを示す。 Measurement of in vitro cytotoxicity of toxin-conjugated anti-TAT188 Toxin-conjugated 3B5, 12B9, and 12G12 antibodies for this experiment were 3B5-MC-vc-PAB-MMAE, 12B9- Prepared as MC-vc-PAB-MMAE and 3B5-MC-vc-PAB-MMAE conjugates. An antibody-toxin conjugate, alpha-IL8-MC-vc-PAB-MMAE, was used as a negative control. PC3 cells (a prostate cancer cell line available from the ATCC and endogenously expressing E16 on its surface) and Colo205 cells (available from the ATCC and endogenously expressing E16 on its surface) Cancer cell lines) were contacted with increasing concentrations of toxin-conjugated antibodies and monitored for cell killing by standard cell viability culture luminescence assay (CellTiterGlo ™ kit, Promega) as described above. The results shown in FIGS. 159A (PC3 cells) and 159B (Colo205 cells) indicate that the three toxin-conjugated anti-E16 antibodies promote killing of cells expressing E16.

もう１つのトキシンＭＭＡＦを抗体に連結させ、細胞傷害性についてテストした。本実験のためのトキシン−連結３Ｂ５抗体は３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥおよび３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦと命名した。抗体−トキシン結合体であるアルファ−ＩＬ８−ｖｃ−ＭＭＡＥを陰性対照として用いた。各抗体に付着したトキシン分子の平均数は、図１６０に示したように、抗体当たりほぼ４トキシン分子であったヒト結腸癌細胞計Ｃｏｌｏ２０５細胞を、５０μｌの培養基中で４０００細胞／ウェルにて９６ウェルプレートに撒いた。翌日、細胞を、５０μｌの培養基に希釈した段階的濃度にて３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦまたはアルファ−ＩＬ８−ｖｃ−ＭＭＡＥと共に７２時間インキュベートした。細胞生存性は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭルミネセント細胞生存性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。図１６０に示される結果は、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥおよびＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ−結合体化抗−Ｅ１６抗体は、ＭＭＡＦトキシン（ＥＣ５０ほぼ０．０６μｇ／ｍｌ）で、Ｅ１６を発現する細胞を殺傷する能力を有することを示し、ＭＭＡＦ（ＥＣ５０ほぼ０．００７μｇ／ｍｌ）よりも大きな細胞殺傷を供する。 Another toxin MMAF was linked to the antibody and tested for cytotoxicity. The toxin-linked 3B5 antibodies for this experiment were named 3B5-MC-vc-PAB-MMAE and 3B5-MC-vc-PAB-MMAF. The antibody-toxin conjugate alpha-IL8-vc-MMAE was used as a negative control. As shown in FIG. 160, the average number of toxin molecules attached to each antibody was 96 cells / well at 4000 cells / well in 50 μl culture medium of human colon cancer Colo205 cells, which were approximately 4 toxin molecules per antibody. We spread on well plate. The next day, cells were incubated with 3B5-MC-vc-PAB-MMAE, 3B5-MC-vc-PAB-MMAF or alpha-IL8-vc-MMAE for 72 hours in serial concentrations diluted in 50 μl culture medium. Cell viability was measured using the CellTiter-Glo ™ luminescent cell viability assay kit (Promega). The results shown in FIG. 160 show that MC-vc-PAB-MMAE and MC-vc-PAB-MMAF-conjugated anti-E16 antibody express E16 with MMAF toxin (EC50 approximately 0.06 μg / ml) It has the ability to kill cells and provides greater cell killing than MMAF (EC50 approximately 0.007 μg / ml).

ヒトにおける治療剤としての本発明の抗体の開発は、サルおよび／または霊長類における初期の毒性実験を必要とする。Ｅ１６アミノ酸配列は、ヒトのような種を横切って変化し、サル、ラットおよびマウスＥ１６アミノ酸配列は各々、９６．２６％、９１．０５％および９０．６６％である。抗−ヒトＴＡＴ１８８（Ｅ１６）抗体が、やはり、サル細胞に結合し、それを殺傷することができるか否かを判断するために、以下のイン・ビトロ実験を行った。その表面で内因的にサルＥ１６を発現する（ＡＴＣＣから入手可能な）サル細胞系ＣＯＳ７を用いた。抗−Ｅ１６抗体３Ｂ５、１２Ｂ９および１２Ｇ１２を、各々、ヒト、サルおよびマウスＥ１６を内因的に発現するヒト、サルおよびマウス細胞と接触させ、標準的なＦＡＣＳ分析によって分析した。ＦＡＣＳは、３つの抗−ヒトＥ１６抗体３Ｂ５、１２Ｇ１２、および１２Ｂ９の各々が、ヒトＥ１６を発現するサルＣＯＳ７細胞（図１６１Ａ）ならびにヒトＥ１６を発現するヒト細胞（図１６１Ｂ）に結合するが、マウスＥ１６発現細胞に結合しない（図１６１Ｂ参照）ことを示した。かくして、本発明の抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）抗体は、臨床的活性、効率および毒性実験で有用である。   Development of antibodies of the invention as therapeutic agents in humans requires early toxicity experiments in monkeys and / or primates. The E16 amino acid sequence varies across species such as humans, with monkey, rat and mouse E16 amino acid sequences being 96.26%, 91.05% and 90.66%, respectively. In order to determine whether anti-human TAT188 (E16) antibody could still bind to monkey cells and kill them, the following in vitro experiments were performed. The monkey cell line COS7 (available from ATCC) that endogenously expresses monkey E16 on its surface was used. Anti-E16 antibodies 3B5, 12B9 and 12G12 were contacted with human, monkey and mouse cells that endogenously express human, monkey and mouse E16, respectively, and analyzed by standard FACS analysis. FACS binds each of the three anti-human E16 antibodies 3B5, 12G12, and 12B9 to monkey COS7 cells that express human E16 (FIG. 161A) and human cells that express human E16 (FIG. 161B). It was shown that it does not bind to E16 expressing cells (see FIG. 161B). Thus, the anti-TAT188 (E16) antibodies of the present invention are useful in clinical activity, efficiency and toxicity experiments.

実施例１５：イン・ビボ腫瘍細胞殺傷アッセイ
抗−ＴＡＴ１１２抗体：
結合体化していない抗−ＴＡＴ１１２モノクローナル抗体の効率をテストするために、抗−ＴＡＴ１１２抗体を、側腹部に皮下的に（前記実施例１４に記載したように得られた）ＰＣ３．ｇＤ．ＮＣＡクローン３細胞を受ける２４時間前にヌードマウスに腹腔内注射した。抗体注射は、実験の残りのために１週間当たり２回継続した。腫瘍容量は１週間に２回測定した。 Example 15: In vivo tumor cell killing assay Anti-TAT112 antibody:
To test the efficiency of unconjugated anti-TAT112 monoclonal antibody, anti-TAT112 antibody was administered subcutaneously (obtained as described in Example 14 above) to the flank PC3. gD. Nude mice were injected intraperitoneally 24 hours before receiving NCA clone 3 cells. Antibody injections continued twice per week for the remainder of the experiment. Tumor volume was measured twice a week.

ＤＭ１−結合体化抗−ＴＡＴ１１２抗体の効率をテストするために、（前記実施例１４に記載されたように得られた）ＰＣ３．ｇＤ．ＮＣＡクローン３細胞をヌードマウスの側腹部に接種した。腫瘍がほぼ１００ｍｍ３の平均容量に到達すると、マウスを、ＤＭ１−結合体化抗−ＴＡＴ１１２抗体で１週間当たり１回または２回静脈内処理した。   To test the efficiency of DM1-conjugated anti-TAT112 antibody, PC3 (obtained as described in Example 14 above). gD. NCA clone 3 cells were inoculated into the flank of nude mice. When tumors reached an average volume of approximately 100 mm 3, mice were treated intravenously once or twice per week with DM1-conjugated anti-TAT112 antibody.

前記分析の結果は、結合体化していない抗−ＴＡＴ１１２ならびにＤＭ１−結合体化抗−ＴＡＴ１１２抗体が、このイン・ビボモデルにおいて腫瘍容量を低下させるにおいてかなり効果的であったことを示した。これらの分析は、抗−ＴＡＴポリペプチドモノクローナル抗体が、注目するＴＡＴポリペプチドを発現する腫瘍細胞を殺傷するのに効果的であることを示す。
抗−ＴＡＴ１１８（Ｅ１６）活性：
イン・ビトロでの細胞殺傷についての結合体化していない抗−ＴＡＴ１８８モノクローナル抗体、抗−ＴＡＴ１８８抗体３Ｂ５、１２Ｂ９、および１２Ｇ１２の効率をテストするために、以下の手法を行った。Ｅ１６を内因的に発現するＰＣ３細胞を、側腹部において無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）に注射した。細胞接種と同日に、抗体を２ｍｇ／ｋｇにて１週間に２回腹腔内注射した。対照マウスを抗体を含まないＰＢＳで注射した。各群における１０匹のマウスを４週間モニターし、腫瘍容量を１週間に２回測定した。腫瘍細胞および抗−Ｅ１６抗体を同時に注射することによって、この手法は、異種移植片マウスにおいて腫瘍の確立を阻害する投与された抗体の能力をテストした。図１６２における結果は、本実験において、平均腫瘍容量が対照抗体よりも有意に低くなかったことを示す。 The results of the analysis indicated that unconjugated anti-TAT112 as well as DM1-conjugated anti-TAT112 antibody were quite effective in reducing tumor volume in this in vivo model. These analyzes indicate that anti-TAT polypeptide monoclonal antibodies are effective in killing tumor cells that express the TAT polypeptide of interest.
Anti-TAT118 (E16) activity:
To test the efficiency of unconjugated anti-TAT188 monoclonal antibody, anti-TAT188 antibodies 3B5, 12B9, and 12G12 for cell killing in vitro, the following procedure was performed. PC3 cells endogenously expressing E16 were injected into athymic nude mice (nu / nu) in the flank. On the same day as cell inoculation, antibody was injected intraperitoneally twice a week at 2 mg / kg. Control mice were injected with PBS without antibody. Ten mice in each group were monitored for 4 weeks and tumor volume was measured twice a week. By co-injecting tumor cells and anti-E16 antibody, this approach tested the ability of the administered antibody to inhibit tumor establishment in xenograft mice. The results in FIG. 162 indicate that the average tumor volume was not significantly lower than the control antibody in this experiment.

ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥおよびＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ結合体化抗−ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）抗体の効率をテストするために、Ｃｏｌｏ２０５細胞を無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）の側腹部に接種し、ほぼ１週間後、腫瘍がほぼ１００ないし２００ｍｍ３平均容量に到達すると、マウスに３ｍｇ／ｋｇにて結合体化抗体を１週間に１回注射した。以下の抗体処理を、腫瘍−含有マウスを３つの群に分けた日に行った：（１）モック対照−０．２ｍｌ以下のＰＢＳ、４週間の１週間当たり１回の静脈内注射；（２）抗体対照−０．２ｍｌ以下のＰＢＳ中の抗−ＩＬ８−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４週間の１週間当たり１回の静脈内注射；（３）抗体−０．２ｍｌ以下のＰＢＳ中の３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、４週間の１週間当たり１回の静脈内注射；（４）抗体−０．２ｍｌ以下のＰＢＳ中の３Ｂ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ、４週間の１週間当たり１回の静脈内注射。平均腫瘍容量を測定し、時間に対してプロットした。図１６３における結果は、ＭＭＡＥ−およびＭＭＡＦ−結合体化抗−Ｅ１６抗体がこのイン・ビボモデルにおいて腫瘍容量を有意に低下させたことを示す。これらの分析は、抗−１８８（Ｅ１６）抗体のような抗−ＴＡＴポリペプチドモノクローナル抗体が、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ポリペプチドのような注目するＴＡＴポリペプチドを発現する腫瘍細胞を殺傷するのに有効であることを示す。 To test the efficiency of MC-vc-PAB-MMAE and MC-vc-PAB-MMAF conjugated anti-TAT188 (E16) antibody, Colo205 cells were inoculated into the flank of athymic nude mice (nu / nu). However, after approximately one week, when the tumor reached an average volume of approximately 100-200 mm 3 , the mice were injected once a week with a conjugated antibody at 3 mg / kg. The following antibody treatments were performed on the day the tumor-containing mice were divided into 3 groups: (1) Mock control-0.2 ml PBS or less, 4 intravenous injections per week for 4 weeks; ) Antibody control-anti-IL8-MC-vc-PAB-MMAE in 0.2 ml or less PBS, 4 intravenous injections per week for 4 weeks; (3) Antibody-in 0.2 ml or less PBS 3B5-MC-vc-PAB-MMAE, 4 intravenous injections once per week for 4 weeks; (4) antibody-3B5-MC-vc-PAB-MMAF in PBS of 0.2 ml or less, 1 for 4 weeks One intravenous injection per week. Average tumor volume was measured and plotted against time. The results in FIG. 163 show that MMAE- and MMAF-conjugated anti-E16 antibodies significantly reduced tumor volume in this in vivo model. These analyzes show that anti-TAT polypeptide monoclonal antibodies, such as anti-188 (E16) antibodies, are effective in killing tumor cells that express a TAT polypeptide of interest, such as TAT188 (E16) polypeptide. Indicates that there is.

実施例１６：ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａによって記載されているように行った。ＤＮＡ２３１５４２、ＤＮＡ２３１５４２−１、ＤＮＡ２３１５４２−２およびＤＮＡ２９７３９３に由来するプローブを用いるノーザンブロット分析は、正常なヒト脳組織と比較して、ヒト神経膠組織における発現の有意なアップレギュレーションを示す。 Example 16: Northern blot analysis Northern blot analysis is substantially as described in Sambrook et al. , Supra. Northern blot analysis using probes derived from DNA231542, DNA231542-1, DNA231542-2 and DNA297393 shows significant up-regulation of expression in human glial tissue compared to normal human brain tissue.

ＤＮＡ２３７６３７（ＴＡＴ１８８、Ｅ１６）に由来するプローブを用いるノーザンブロット分析もまた行い、結果は、ヒト、乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓における発現が、同一組織タイプの正常なヒト組織と比較して、ヒト癌における発現の有意なアップレギュレーションを証明することを示した。   Northern blot analysis using probes derived from DNA237376 (TAT188, E16) was also performed, which showed that expression in human, breast, colon, rectum, endometrium, kidney, lung, ovary, skin and liver was the same tissue type. Compared to normal human tissue, it was demonstrated to demonstrate a significant up-regulation of expression in human cancer.

実施例１７：ｓｉＲＮＡによるＴＡＴ発現の変調
ｓｉＲＮＡは、小分子または抗体のような伝統的なアンタゴニストが失敗した遺伝子発現の変調の実験においてツールとして有用なことが判明した（Ｓｈｉ Ｙ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（１）：９−１２（２００３））。長さが２１ないし２３ヌクレオチドであるイン・ビトロで合成された二本鎖ＲＮＡは干渉性ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）として作用することができ、遺伝子発現を有意に阻害することができる（Ｆｉｒｅ Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９１；８０６−８１０（１９９９））。これらのｉＲＮＡは、それらの標的ＲＮＡの分解を媒介することによって作用する。それらは長さが３０ヌクレオチド未満であるので、しかしながら、それらは細胞抗ウイルス防御メカニズムをトリガーしない。そのようなメカニズムはインターフェロンの生産、および宿主細胞蛋白質合成の一般的シャットダウンを含む。現実的には、ｓｉＲＮＡを合成することができ、次いで、ＤＮＡベクターにクローン化することができる。そのようなベクターをトランスフェクトし、ｓｉＲＮＡを高レベルで発現させることができる。高レベルのｓｉＲＮＡ発現を用いて、細胞で生産された蛋白質の量を「ノックダウンさせ」または有意に低下させ、かくして、それは、蛋白質の過剰発現が癌のような障害に関連すると考えられる実験に有用である。ＴＡＴは細胞表面発現腫瘍抗原である、ＴＡＴ過剰発現はマイクロアレイ、ＴａｑｍａｎＴＭおよびイン・サイチュハイブリダイゼーション分析によって示された。ＴＡＴ１８８のようなＴＡＴに結合する抗体は、本明細書中においては、腫瘍抗原の機能を阻害し、およびトキシン−結合体化抗体に関しては、細胞殺傷を引き起こすことが示されているが、ｓｉＲＮＡは、抗原の細胞生産を制限することによってＴＡＴ蛋白質に対して有用なアンタゴニストである。
実験の方法および結果：ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）
以下の実験は、（本明細書中においてはＥ１６ともいう）ＴＡＴ１８８に特異的なｓｉＲＮＡが、ＲＮＡ発現、蛋白質生産、細胞表面発現、および蛋白質機能を低下させることを示す。同一または同様な手法は有用であり、本発明の他のＴＡＴ ＲＮＡのｓｉＲＮＡダウンレギュレーションを示す。標的配列の選択は、いずれかの適当な手法によって行うことができる（例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ，Ｍ．Ａｎｄ Ｐｒｙｄｚ，Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ３１６：１０５０−１０５８（２００４）参照）。 Example 17: Modulation of TAT expression by siRNA siRNA has been found to be useful as a tool in experiments in modulating gene expression where traditional antagonists such as small molecules or antibodies have failed (Shi Y., Trends in Genetics). 19 (1): 9-12 (2003)). Double-stranded RNA synthesized in vitro that is 21 to 23 nucleotides in length can act as an interfering RNA (iRNA) and can significantly inhibit gene expression (Fire A., Trends). in Genetics 391; 806-810 (1999)). These iRNAs act by mediating the degradation of their target RNA. However, since they are less than 30 nucleotides in length, they do not trigger cellular antiviral defense mechanisms. Such mechanisms include interferon production and a general shutdown of host cell protein synthesis. Realistically, siRNA can be synthesized and then cloned into a DNA vector. Such vectors can be transfected and siRNAs expressed at high levels. High levels of siRNA expression are used to “knock down” or significantly reduce the amount of protein produced in the cell, thus making it possible for experiments where protein overexpression is thought to be associated with disorders such as cancer. Useful. TAT is a cell surface expressed tumor antigen, TAT overexpression was shown by microarray, Taqman ™ and in situ hybridization analysis. Antibodies that bind to TAT, such as TAT188, have been shown herein to inhibit tumor antigen function and, with respect to toxin-conjugated antibodies, cause cell killing, but siRNA It is a useful antagonist to the TAT protein by limiting cellular production of antigens.
Experimental method and results: TAT188 (E16)
The following experiments show that siRNA specific for TAT188 (also referred to herein as E16) reduces RNA expression, protein production, cell surface expression, and protein function. The same or similar approach is useful and demonstrates siRNA down-regulation of other TAT RNAs of the invention. Selection of the target sequence can be done by any suitable technique (see, eg, Amarzguioui, M. And Prydz, H., Biochem Biophys Res Comm 316: 1050-1058 (2004)).

Ｅ１６ ｓｉＲＮＡの一過性トランスフェクションは、ＰＣ３−Ｅ１６−ＣＦＰ細胞におけるＥ１６−ＧＦＰの発現を低下させる。   Transient transfection of E16 siRNA reduces E16-GFP expression in PC3-E16-CFP cells.

前立腺癌細胞系であるＰＣ３を実験のこの組で用いた。というのは、それはＴＡＴ１８８を内因的に過剰発現するからである。ＰＣ３細胞は、ＴＡＴ１８８（ｓｉＴＡＴ１８８）に対して向けられた二本鎖２１量体ＲＮＡオリゴ、ラミンを用いてトランスフェクトし、あるいはモックトランスフェクトした。これらのオリゴは以下にリストする。   PC3, a prostate cancer cell line, was used in this set of experiments. This is because it overexpresses TAT188 endogenously. PC3 cells were transfected with a double stranded 21-mer RNA oligo, lamin, directed against TAT188 (siTAT188) or mock transfected. These oligos are listed below.

ｓｉＲＮＡオリゴ：
ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）
ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）のコーディング配列内の標的領域のＤＮＡ配列を以下に示し、続いて、二本鎖ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンスストランドの配列を示す。 siRNA oligos:
TAT188 (E16)
The DNA sequence of the target region within the coding sequence of TAT188 (E16) is shown below, followed by the sequence of the sense and antisense strands of the double stranded siRNA.

ＡＡＧＧＡＡＧＡＧＧＣＧＣＧＧＧＡＧＡＡＧ（配列番号１５５）は、本明細書中に開示されたＴＡＴ１８８ ｓｉＲＮＡの例で用いられるｓｉＲＮＡオリゴによって標的化されたＴＡＴ１８８コーディング領域内の核酸配列である。他の配列は、ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンシングの分野での標準的なプラクティスに従って標的として選択することができる。
ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ｓｉＲＮＡオリゴ：
センス：ｒ（ＧＧＡＡＧＡＧＧＣＧＣＧＧＧＡＧＡＡＧ）ＴＴ（配列番号１５６）
アンチセンス：ｒ（ＣＵＵＣＵＣＣＣＧＣＧＣＣＵＣＵＵＣＣ）ＴＴ（配列番号１５７）
シラミンｓｉＲＮＡオリゴ：
センス：ｒ（ＣＵＧＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡ）ＴＴ（配列番号１５８）
アンチセンス：ｒ（ＵＧＵＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＣＡＧ）ＴＴ（配列番号１５９）
（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８（２００１）参照）
トランスフェクションから２日後に、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ポリペプチド ｖｓ Ｅ１６−ＥＧＦＰ発現のノックダウンの相対的レベルを、ＥＧＦＰ蛍光の蛍光顕微鏡モニタリングによって分析した。Ｅ１６発現の現象は、検出されたＥＧＦＰ生産およびバイオルミネセンスの低下に平行する。図１６４における結果は、ｓｉＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ｓｉＲＮＡでの一過的トランスフェクションはＥ１６−ＥＧＦＰ融合発現を低下させたことを示す。図１６４および１６４において「ＧＦＰ」という融合蛋白質は、Ｅ１６遺伝子をＢＤＣｌｏｎｔｅｃｈからのｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターにクローン化することによって生産されたＥ１６−ＥＧＦＰ融合という。
Ｂ．Ｅ１６ ｓｉＲＮＡの一過的トランスフェクションは、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ポリペプチド生産を低下させる。 AAGGAAGAGGCGCGGGAGAAG (SEQ ID NO: 155) is a nucleic acid sequence within the TAT188 coding region targeted by the siRNA oligo used in the TAT188 siRNA example disclosed herein. Other sequences can be selected as targets according to standard practice in the field of siRNA gene silencing.
TAT188 (E16) siRNA oligo:
Sense: r (GGAAGAGGCGCCGGAGAAG) TT (SEQ ID NO: 156)
Antisense: r (CUUCUCCCCGCGCCUCUCUCC) TT (SEQ ID NO: 157)
Silamine siRNA oligos:
Sense: r (CUGGACUUCCAGAAGAACA) TT (SEQ ID NO: 158)
Antisense: r (UGUUCUGGAAGUCCCAG) TT (SEQ ID NO: 159)
(See Elbashir et al., Nature 411: 494-498 (2001))
Two days after transfection, the relative level of knockdown of TAT188 (E16) polypeptide vs E16-EGFP expression was analyzed by fluorescence microscopy monitoring of EGFP fluorescence. The phenomenon of E16 expression parallels the detected decrease in EGFP production and bioluminescence. The results in FIG. 164 show that transient transfection with siTAT188 (E16) siRNA reduced E16-EGFP fusion expression. In FIG. 164 and 164, the fusion protein “GFP” is referred to as an E16-EGFP fusion produced by cloning the E16 gene into the pEGFP-C1 vector from BDClontech.
B. Transient transfection of E16 siRNA reduces TAT188 (E16) polypeptide production.

Ｅ１６発現の低下は、ウエスタンブロット分析を用いてＥ１６蛋白質の低下によって示された。本実施例で用いたｓｉＴＡＴ１８８（ｓｉＥ１６）ＲＮＡオリゴ配列番号１５６および配列番号１５７、およびラミンｓｉＲＮＡオリゴ配列番号１５８および配列番号１５９は、本実施例のパートＡにて前記で示したのと同一であった。Ｅ１６−ＥＧＦＰで一過的にトランスフェクトされたＰＣ３細胞はトランスフェクションから３日後に収穫し、ウエスタンブロットをベータ−チューブリンバンドに対して行って、蛋白質負荷を示した。ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）−ＧＦＰ融合のウエスタンブロットは、検出可能に標識された抗−ＧＦＰ抗体を用いて可視化した（図１６５、左側レーン−モックトランスフェクション；右側レーン、Ｅ１６ ｓｉＲＮＡトランスフェクション参照）。結果は、Ｅ１６−ＧＦＰ融合蛋白質を発現する細胞におけるＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ｓｉＲＮＡは、Ｅ１６−ＧＦＰの発現を有意に低下させたことを示す。
Ｃ．Ｅ１６ ｓｉＲＮＡの一過的トランスフェクションは、ＰＣ３細胞において内因性Ｅ１６アミノ酸トランスポーター活性を阻害する。 A decrease in E16 expression was shown by a decrease in E16 protein using Western blot analysis. The siTAT188 (siE16) RNA oligo SEQ ID NO: 156 and SEQ ID NO: 157, and lamin siRNA oligo SEQ ID NO: 158 and SEQ ID NO: 159 used in this example were the same as those shown above in Part A of this example. It was. PC3 cells transiently transfected with E16-EGFP were harvested 3 days after transfection and Western blots were performed on the beta-tubulin band to indicate protein loading. Western blots of TAT188 (E16) -GFP fusion were visualized using detectably labeled anti-GFP antibody (see FIG. 165, left lane-mock transfection; right lane, E16 siRNA transfection). The results indicate that TAT188 (E16) siRNA in cells expressing E16-GFP fusion protein significantly reduced E16-GFP expression.
C. Transient transfection of E16 siRNA inhibits endogenous E16 amino acid transporter activity in PC3 cells.

ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ｓｉＲＮＡおよびラミンｓｉＲＮＡ（対照）の一過的トランスフェクションについて同一の手法を行った。テストおよび対照細胞は、本明細書中において前記したロイシン輸送アッセイを用いて、以下のように、アミノ酸輸送蛋白質としてのＥ１６活性についてテストした。図１６６における結果は、Ｅ１６ ＲＮＡおよび蛋白質生産におけるＥ１６ ｓｉＲＮＡ低下が、細胞におけるアミノ酸輸送での機能に対して利用できるＥ１６の量の低下と合致することを示す。
Ｄ．Ｅ１６ ｓｉＲＮＡの一過的トランスフェクションは、Ｅ１６の表面発現を低下させる。 The same procedure was performed for transient transfection of TAT188 (E16) siRNA and lamin siRNA (control). Test and control cells were tested for E16 activity as an amino acid transport protein using the leucine transport assay described hereinabove as follows. The results in FIG. 166 show that E16 siRNA reduction in E16 RNA and protein production is consistent with a reduction in the amount of E16 available for function in amino acid transport in cells.
D. Transient transfection of E16 siRNA reduces the surface expression of E16.

本実施例は以下のように行った。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションから４８時間後に、細胞をＦＡＣＳによって分析した。簡単に述べれば、細胞を一次抗体と共に氷上で１時間インキュベートした。次いで、細胞を、（非限定的例であるＣｙ−３またはＰＥのような）蛍光色素と結合体化した二次抗体で標識し、ＦＡＣＳｃａｓｉｂｅｒＴＭまたはＦＡＣＳｃａｎＴＭでデータを収集した。収集されたデータは、非限定的例であるＣｅｌｌｑｕｅｓｔＴＭ（ＢＤ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはＦｌｏｗＪｏＴＭ （Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて分析した。本明細書中において、実施例１２に開示されたように、３つの抗−Ｅ１６モノクローナル抗体、３Ｂ５、１２Ｂ９、および１２Ｇ１２は、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後にＰＣ３細胞上で余り結合しないことが示され、これは、標的化ｓｉＲＮＡの存在下におけるＥ１６蛋白質の低下した発現と合致する（図１５６参照）。
Ｅ．ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）ｓｉＲＮＡの一過的トランスフェクションは、ＰＣ３細胞増殖を阻害する。 This example was performed as follows. Cells were analyzed by FACS 48 hours after transfection of siRNA. Briefly, cells were incubated with primary antibody for 1 hour on ice. The cells were then labeled with a secondary antibody conjugated with a fluorescent dye (such as non-limiting examples Cy-3 or PE) and data was collected with a FACscasiber ™ or FACScan ™ . The collected data was analyzed using Cellquest ™ (BD Clontech) or FlowJo ™ (Tree Star, Inc.), which are non-limiting examples. Herein, as disclosed in Example 12, the three anti-E16 monoclonal antibodies, 3B5, 12B9, and 12G12 may not bind much on PC3 cells after transfection of TAT188 (E16) siRNA. This is shown and is consistent with reduced expression of the E16 protein in the presence of targeted siRNA (see FIG. 156).
E. Transient transfection of TAT188 (E16) siRNA inhibits PC3 cell proliferation.

ＴＡＴ１８８を標的化するｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＰＣ３細胞の増殖が、以下の商業的プロトコルに従ってアッセイすることができる（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＴＢ２８８；Ｍｅｎｄｏｚａ ｅｔ ａｌ．（２２０２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：５４８５−５４８８）。例えば、ＰＣ３細胞を、６ウェルプレートにおいて３．５×１０５細胞／ウェルで平板培養した。翌日、１００ｎＭの最終濃度の（ｓｉＲＮＡオリゴ配列番号１５７および配列番号１５８を用いる）二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ，配列番号１５５および配列番号１５６）またはラミン対照ｓｉＲＮＡを用いて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（インビトロゲン）を用いて細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後に、細胞を９６ウェルプレートに再度撒き、細胞生存性を、図１６７に示した時点においてＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇキット−８ＴＭ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて測定し、ここに、ＲＬＵ＝相対的ルミネセンスユニットである。この方法によってアッセイすることができる他の細胞がもしそれらが（内因的に、またはＴＡＴ１８８をコードする核酸でのトランスフェクションの後に）ＴＡＴ１８８を発現するならば、限定されるものではないが、ＳＫＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＭＣＦ７またはＭＤＡ−ＭＢ−４６８を含み、乳癌細胞におけるＥ１６発現の結果、細胞殺傷が起こり、乳癌、ならびに前立腺、結直腸および他のタイプの癌は、Ｅ１６発現ノックダウンを用いる治療で望ましい標的であることを示す。 Proliferation of PC3 cells transfected with siRNA targeting TAT188 can be assayed according to the following commercial protocol (Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendosa et al. (2202) Cancer Res. 62: 5485-). 5488). For example, PC3 cells were plated at 3.5 × 10 5 cells / well in 6 well plates. The next day, using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) with double-stranded RNA (dsRNA, SEQ ID NO: 155 and SEQ ID NO: 156) or lamin control siRNA (using siRNA oligo SEQ ID NO: 157 and SEQ ID NO: 158) at a final concentration of 100 nM Cells were transfected. Six hours after transfection, cells were seeded again into 96-well plates and cell viability was measured using the Cell Counting Kit-8 ™ (Dojindo) at the time points shown in FIG. 167, where RLU = relative It is a luminescence unit. Other cells that can be assayed by this method include, but are not limited to, SKBR − if they express TAT188 (either endogenously or after transfection with a nucleic acid encoding TAT188). 3, including BT474, MCF7 or MDA-MB-468, E16 expression in breast cancer cells results in cell killing, breast cancer, and prostate, colorectal and other types of cancer are treated with E16 expression knockdown Indicates a desirable target.

これらのデータは、ｓｉＲＮＡが、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）蛋白質のようなＴＡＴ蛋白質の発現を「ノックダウンし」または低下させることができることを示す。該低下は、（イン・サイチュハイブリダイゼーションアッセイにおける）ＲＮＡ発現の低下、（ウエスタンブロット分析に示されるような）低下した蛋白質生産、（ＦＡＣＳ分析および内部化アッセイによって示されるような）ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）の低下した細胞表面発現、および（アミノ酸輸送の低下によって示されるような）低下した機能によって示される。長時間にわたってのＴＡＴ１８８（Ｅ１６）のようなＴＡＴ蛋白質のｓｉＲＮＡ低下の結果、癌細胞系における細胞増殖の低下がもたらされる。従って、ｓｉＲＮＡは、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）のようなＴＡＴ蛋白質を低下させるのに有用である。ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）のようなＴＡＴ蛋白質のレベルの低下は、癌細胞系の増殖の低下を引き起こす。癌は細胞増殖性障害であるので、これらの結果は、ＴＡＴ１８８（Ｅ１６）のようなＴＡＴポリペプチドのアンタゴニストが、癌細胞増殖の低下で有用であろうことを示す。癌細胞増殖の低下は、哺乳動物における癌の軽減で有用であろう。   These data indicate that siRNA can “knock down” or reduce the expression of TAT proteins, such as TAT188 (E16) protein. The decrease is due to decreased RNA expression (in in situ hybridization assay), decreased protein production (as shown in Western blot analysis), TAT188 (E16 as shown by FACS analysis and internalization assay). ) Reduced cell surface expression and reduced function (as indicated by reduced amino acid transport). The reduction in siRNA of TAT proteins such as TAT188 (E16) over time results in decreased cell proliferation in cancer cell lines. Thus, siRNA is useful for reducing TAT proteins such as TAT188 (E16). A decrease in the level of TAT protein such as TAT188 (E16) causes a decrease in proliferation of the cancer cell line. Since cancer is a cell proliferative disorder, these results indicate that antagonists of TAT polypeptides such as TAT188 (E16) would be useful in reducing cancer cell growth. Reduced cancer cell growth may be useful in reducing cancer in mammals.

実施例１８：材料の寄託
以下のハイブリドーマ細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９ ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託してある：
ハイブリドーマ／抗体の命名 ＡＴＣＣ番号 寄託日
３Ｂ５．１ ＰＴＡ−６１９３ ２００４年９月８日
１２Ｂ９．１ ＰＴＡ−６１９４ ２００４年９月８日
１２Ｇ１２．１ ＰＴＡ−６１９５ ２００４年９月８日
この寄託は、特許手続の目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約、およびその下の規則（ブダペスト条約）の規定の下でなされた。これは、寄託日からの３０年の生きた培養の維持を保証する。細胞系は、ブダペスト条約の期間の下でＡＴＣＣによって利用可能とされ、（ａ）３７ ＣＦＲ §１．１４および３５ ＵＳＣ §１２２の下で、それに対して権限を有する長官によって決定されたものに対して、培養へのアクセスが特許出願の係属の間に利用可能となり、および（ｂ）そのように寄託された培養の公衆への利用可能性に対する全ての制限は特許の許可に際して最終的に解除されることを保証する、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．およびＡＴＣＣの間の合意に従う。 Example 18: Material Deposits The following hybridoma cell lines are available from American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209 USA (ATCC):
Hybridoma / antibody nomenclature ATCC number Deposit date 3B5.1 PTA-6193 September 8, 2004 12B9.1 PTA-6194 September 8, 2004 12G12.1 PTA-6195 September 8, 2004 This deposit is a patent Made under the provisions of the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purposes of the procedure, and the rules below (Budapest Treaty). This ensures maintenance of a 30 year live culture from the date of deposit. Cell lines are made available by the ATCC under the terms of the Budapest Treaty and (a) those determined by the competent secretary under 37 CFR §1.14 and 35 USC §122 Access to the culture was made available during the pending patent application, and (b) all restrictions on the public availability of such deposited culture were finally lifted upon grant of the patent Genentech, Inc. And follow the agreement between ATCC.

特許出願の譲受人は、寄託された培養がもし適当な条件下で培養した場合に死滅するか、または失われ、または破壊されるならば、それは同一培養の生きた検体で通知により迅速に置き換えられることに合意した。寄託された細胞系の入手可能性は、その特許法に従ったいずれの政府の権限の下で許可された権利に違反して本発明を実施するライセンスと解釈されるべきではない。   The assignee of a patent application will promptly replace a living specimen of the same culture with notification if the deposited culture is killed, lost or destroyed if cultured under appropriate conditions. Agreed to be. The availability of deposited cell lines should not be construed as a license to practice the invention in violation of rights granted under any governmental authority in accordance with its patent law.

これまでの書面による明細書は、当業者が本発明を実施することができるのに十分であると考えられる。本発明は寄託された構築体によってその範囲が限定されるものではない。というのは、寄託された具体例は、本発明のある態様の単一の説明として意図され、機能的に同等ないずれの構築体も本発明の範囲内にあるからである。本明細書中における材料の寄託は、ここに含まれる書面による記載が、そのベストモードを含めた本発明のいずれの態様の実施を可能とするのに不適切であることを認めるものではなく、また、それを表す具体的説明に特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきものではない。事実、本明細書中に示し記載したものに加えて本発明の種々の修飾は、前記記載から当業者に明らかであり、それは特許請求の範囲の範囲内に入る。   The previous written description is considered to be sufficient to enable one skilled in the art to practice the invention. The scope of the present invention is not limited by the deposited construct. This is because the deposited embodiments are intended as a single illustration of certain aspects of the invention, and any functionally equivalent construct is within the scope of the invention. The deposition of materials herein is not an admission that the written description contained herein is inappropriate for allowing the implementation of any aspect of the invention, including its best mode, In addition, the scope of the claims should not be construed as being limited to the specific description representing the same. Indeed, various modifications of the invention in addition to those shown and described herein will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description and are within the scope of the claims.

図１はＴＡＴ１６１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示し、ここに、配列番号１は本明細書中において「ＤＮＡ７７５０７」と命名されるクローンである。FIG. 1 shows the nucleotide sequence of TAT161 cDNA (SEQ ID NO: 1), where SEQ ID NO: 1 is a clone designated herein as “DNA77507”. 図２ＡないしＢは、ＴＡＴ１０１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）を示し、ここに、配列番号２は本明細書中において「ＤＮＡ８０８９４」と命名されるクローンである。FIGS. 2A-B show the nucleotide sequence of TAT101 cDNA (SEQ ID NO: 2), where SEQ ID NO: 2 is a clone designated herein as “DNA80894”. 図３はＴＡＴ１５７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）を示し、ここに、配列番号３は本明細書中において「ＤＮＡ８２３４３」と命名されるクローンである。FIG. 3 shows the nucleotide sequence of TAT157 cDNA (SEQ ID NO: 3), where SEQ ID NO: 3 is a clone designated herein as “DNA82343”. 図４はＴＡＴ１６０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４）を示し、ここに、配列番号４は本明細書中において「ＤＮＡ８７９９４」と命名されるクローンである。FIG. 4 shows the nucleotide sequence of TAT160 cDNA (SEQ ID NO: 4), where SEQ ID NO: 4 is a clone designated herein as “DNA87994”. 図５はＴＡＴ１５８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５）を示し、ここに、配列番号５は本明細書中において「ＤＮＡ８８１３１」と命名されるクローンである。FIG. 5 shows the nucleotide sequence of TAT158 cDNA (SEQ ID NO: 5), where SEQ ID NO: 5 is a clone designated herein as “DNA88131”. 図６はＴＡＴ１１０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６）を示し、ここに、配列番号６は本明細書中において「ＤＮＡ９５９３０」と命名されるクローンである。FIG. 6 shows the nucleotide sequence of TAT110 cDNA (SEQ ID NO: 6), where SEQ ID NO: 6 is a clone designated herein as “DNA95930”. 図７はＴＡＴ２１０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７）を示し、ここに、配列番号７は本明細書中において「ＤＮＡ９５９３０−１」と命名されるクローンである。FIG. 7 shows the nucleotide sequence of TAT210 cDNA (SEQ ID NO: 7), where SEQ ID NO: 7 is a clone designated herein as “DNA95930-1”. 図８はＴＡＴ１５９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号８）を示し、ここに、配列番号８は本明細書中において「ＤＮＡ９６９１７」と命名されるクローンである。FIG. 8 shows the nucleotide sequence of TAT159 cDNA (SEQ ID NO: 8), where SEQ ID NO: 8 is a clone designated herein as “DNA96917”. 図９はＴＡＴ１１２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号９）を示し、ここに、配列番号９は本明細書中において「ＤＮＡ９６９３０」と命名されるクローンである。FIG. 9 shows the nucleotide sequence of TAT112 cDNA (SEQ ID NO: 9), where SEQ ID NO: 9 is a clone designated herein as “DNA96930”. 図１０はＴＡＴ１４７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１０）を示し、ここに、配列番号１０は本明細書中において「ＤＮＡ９６９３６」と命名されるクローンである。FIG. 10 shows the nucleotide sequence of TAT147 cDNA (SEQ ID NO: 10), where SEQ ID NO: 10 is a clone designated herein as “DNA96936”. 図１１はＴＡＴ１４５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１１）を示し、ここに、配列番号１１は本明細書中において「ＤＮＡ９８５６５」と命名されるクローンである。FIG. 11 shows the nucleotide sequence of TAT145 cDNA (SEQ ID NO: 11), where SEQ ID NO: 11 is a clone designated herein as “DNA98565”. 図１２はＴＡＴ１５２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１２）を示し、ここに、配列番号１２は本明細書中において「ＤＮＡ２４６４３５」と命名されるクローンである。FIG. 12 shows the nucleotide sequence of TAT152 cDNA (SEQ ID NO: 12), where SEQ ID NO: 12 is a clone designated herein as “DNA246435”. 図１３はＴＡＴ１６２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１３）を示し、ここに、配列番号１３は本明細書中において「ＤＮＡ９８５９１」と命名されるクローンである。FIG. 13 shows the nucleotide sequence of TAT162 cDNA (SEQ ID NO: 13), wherein SEQ ID NO: 13 is a clone designated herein as “DNA98591”. 図１４はＴＡＴ１１４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１４）を示し、ここに、配列番号１４は本明細書中において「ＤＮＡ１０８８０９」と命名されるクローンである。FIG. 14 shows the nucleotide sequence of TAT114 cDNA (SEQ ID NO: 14), where SEQ ID NO: 14 is a clone designated herein as “DNA108809”. 図１５はＴＡＴ１１９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１５）を示し、ここに、配列番号１５は本明細書中において「ＤＮＡ１１９４８８」と命名されるクローンである。FIG. 15 shows the nucleotide sequence of TAT119 cDNA (SEQ ID NO: 15), where SEQ ID NO: 15 is a clone designated herein as “DNA119488”. 図１６はＴＡＴ１０３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１６）を示し、ここに、配列番号１６は本明細書中において「ＤＮＡ１４３４９３」と命名されるクローンである。FIG. 16 shows the nucleotide sequence of TAT103 cDNA (SEQ ID NO: 16), where SEQ ID NO: 16 is a clone designated herein as “DNA143493”. 図１７ＡないしＢはＴＡＴ１３０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１７）を示し、ここに、配列番号１７は本明細書中において「ＤＮＡ１６７２３４」と命名されるクローンである。FIGS. 17A-B show the nucleotide sequence of TAT130 cDNA (SEQ ID NO: 17), where SEQ ID NO: 17 is a clone designated herein as “DNA167234”. 図１８はＴＡＴ１６６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１８）を示し、ここに、配列番号１８は本明細書中において「ＤＮＡ２３５６２１」と命名されるクローンである。FIG. 18 shows the nucleotide sequence of TAT166 cDNA (SEQ ID NO: 18), wherein SEQ ID NO: 18 is a clone designated herein as “DNA235621”. 図１９はＴＡＴ１３２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１９）を示し、ここに、配列番号１９は本明細書中において「ＤＮＡ１７６７６６」と命名されるクローンである。FIG. 19 shows the nucleotide sequence of TAT132 cDNA (SEQ ID NO: 19), wherein SEQ ID NO: 19 is a clone designated herein as “DNA176766”. 図２０はＴＡＴ１５０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２０）を示し、ここに、配列番号２０は本明細書中において「ＤＮＡ２３６４６３」と命名されるクローンである。FIG. 20 shows the nucleotide sequence of TAT150 cDNA (SEQ ID NO: 20), where SEQ ID NO: 20 is a clone designated herein as “DNA236463”. 図２１はＴＡＴ１２９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２１）を示し、ここに、配列番号２１は本明細書中において「ＤＮＡ１８１１６２」と命名されるクローンである。FIG. 21 shows the nucleotide sequence of TAT129 cDNA (SEQ ID NO: 21), where SEQ ID NO: 21 is a clone designated herein as “DNA181162”. 図２２はＴＡＴ１１１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２２）を示し、ここに、配列番号２２は本明細書中において「ＤＮＡ１８８２２１」と命名されるクローンである。FIG. 22 shows the nucleotide sequence of TAT111 cDNA (SEQ ID NO: 22), wherein SEQ ID NO: 22 is a clone designated herein as “DNA188221”. 図２３はＴＡＴ１４６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２３）を示し、ここに、配列番号２３は本明細書中において「ＤＮＡ２３３８７６」と命名されるクローンである。FIG. 23 shows the nucleotide sequence of TAT146 cDNA (SEQ ID NO: 23), where SEQ ID NO: 23 is a clone designated herein as “DNA2333876”. 図２４はＴＡＴ１４８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２４）を示し、ここに、配列番号２４は本明細書中において「ＤＮＡ１９３８９１」と命名されるクローンである。FIG. 24 shows the nucleotide sequence of TAT148 cDNA (SEQ ID NO: 24), wherein SEQ ID NO: 24 is a clone designated herein as “DNA193891”. 図２５はＴＡＴ１８７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２５）を示し、ここに、配列番号２５は本明細書中において「ＤＮＡ２４８１７０」と命名されるクローンである。FIG. 25 shows the nucleotide sequence of TAT187 cDNA (SEQ ID NO: 25), where SEQ ID NO: 25 is a clone designated herein as “DNA248170”. 図２６はＴＡＴ１１８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２６）を示し、ここに、配列番号２６は本明細書中において「ＤＮＡ１９４６２８」と命名されるクローンである。FIG. 26 shows the nucleotide sequence of TAT118 cDNA (SEQ ID NO: 26), where SEQ ID NO: 26 is a clone designated herein as “DNA194628”. 図２７はＴＡＴ１６７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２７）を示し、ここに、配列番号２７は本明細書中において「ＤＮＡ２４６４１５」と命名されるクローンである。FIG. 27 shows the nucleotide sequence of TAT167 cDNA (SEQ ID NO: 27), where SEQ ID NO: 27 is a clone designated herein as “DNA246415”. 図２８はＴＡＴ１２３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２８）を示し、ここに、配列番号２８は本明細書中において「ＤＮＡ２１０４９９」と命名されるクローンである。FIG. 28 shows the nucleotide sequence of TAT123 cDNA (SEQ ID NO: 28), wherein SEQ ID NO: 28 is a clone designated herein as “DNA210499”. 図２９はＴＡＴ２１１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２９）を示し、ここに、配列番号２９は本明細書中において「ＤＮＡ２１９８９４」と命名されるクローンである。FIG. 29 shows the nucleotide sequence of TAT211 cDNA (SEQ ID NO: 29), wherein SEQ ID NO: 29 is a clone designated herein as “DNA219944”. 図３０はＴＡＴ１１３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３０）を示し、ここに、配列番号３０は本明細書中において「ＤＮＡ２１５６０９」と命名されるクローンである。FIG. 30 shows the nucleotide sequence of TAT113 cDNA (SEQ ID NO: 30), wherein SEQ ID NO: 30 is a clone designated herein as “DNA215609”. 図３１はＴＡＴ１２８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３１）を示し、ここに、配列番号３１は本明細書中において「ＤＮＡ２２０４３２」と命名されるクローンである。FIG. 31 shows the nucleotide sequence of TAT128 cDNA (SEQ ID NO: 31), wherein SEQ ID NO: 31 is a clone designated herein as “DNA220432”. 図３２ＡないしＢはＴＡＴ１６４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３２）を示し、ここに、配列番号３２は本明細書中において「ＤＮＡ２２６０９４」と命名されるクローンである。32A-B show the nucleotide sequence of TAT164 cDNA (SEQ ID NO: 32), where SEQ ID NO: 32 is a clone designated herein as “DNA226609”. 図３３はＴＡＴ１２２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３３）を示し、ここに、配列番号３３は本明細書中において「ＤＮＡ２２６１６５」と命名されるクローンである。FIG. 33 shows the nucleotide sequence of TAT122 cDNA (SEQ ID NO: 33), wherein SEQ ID NO: 33 is a clone designated herein as “DNA226165”. 図３４はＴＡＴ１１７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３４）を示し、ここに、配列番号３４は本明細書中において「ＤＮＡ２２６２３７」と命名されるクローンである。FIG. 34 shows the nucleotide sequence of TAT117 cDNA (SEQ ID NO: 34), where SEQ ID NO: 34 is a clone designated herein as “DNA226237”. 図３５はＴＡＴ１６８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３５）を示し、ここに、配列番号３５は本明細書中において「ＤＮＡ２４６４５０」と命名されるクローンである。FIG. 35 shows the nucleotide sequence of TAT168 cDNA (SEQ ID NO: 35), wherein SEQ ID NO: 35 is a clone designated herein as “DNA246450”. 図３６はＴＡＴ１４４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３６）を示し、ここに、配列番号３６は本明細書中において「ＤＮＡ２２６４５６」と命名されるクローンである。FIG. 36 shows the nucleotide sequence of TAT144 cDNA (SEQ ID NO: 36), wherein SEQ ID NO: 36 is a clone designated herein as “DNA226456”. 図３７はＴＡＴ１８８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３７）を示し、ここに、配列番号３７は本明細書中において「ＤＮＡ２３７６３７」と命名されるクローンである。FIG. 37 shows the nucleotide sequence of TAT188 cDNA (SEQ ID NO: 37), where SEQ ID NO: 37 is a clone designated herein as “DNA237376”. 図３８はＴＡＴ１２６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３８）を示し、ここに、配列番号３８は本明細書中において「ＤＮＡ２２６５３９」と命名されるクローンである。FIG. 38 shows the nucleotide sequence of TAT126 cDNA (SEQ ID NO: 38), wherein SEQ ID NO: 38 is a clone designated herein as “DNA226539”. 図３９はＴＡＴ１５１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３９）を示し、ここに、配列番号３９は本明細書中において「ＤＮＡ２３６５１１」と命名されるクローンである。FIG. 39 shows the nucleotide sequence of TAT151 cDNA (SEQ ID NO: 39), wherein SEQ ID NO: 39 is a clone designated herein as “DNA236511”. 図４０はＴＡＴ１１５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４０）を示し、ここに、配列番号４０は本明細書中において「ＤＮＡ２２６７７１」と命名されるクローンである。FIG. 40 shows the nucleotide sequence of TAT115 cDNA (SEQ ID NO: 40), wherein SEQ ID NO: 40 is a clone designated herein as “DNA2267671”. 図４１はＴＡＴ１６３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４１）を示し、ここに、配列番号４１は本明細書中において「ＤＮＡ２２７０８７」と命名されるクローンである。FIG. 41 shows the nucleotide sequence of TAT163 cDNA (SEQ ID NO: 41), where SEQ ID NO: 41 is a clone designated herein as “DNA227087”. 図４２はＴＡＴ２２７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４２）を示し、ここに、配列番号４２は本明細書中において「ＤＮＡ２６６３０７」と命名されるクローンである。FIG. 42 shows the nucleotide sequence of TAT227 cDNA (SEQ ID NO: 42), wherein SEQ ID NO: 42 is a clone designated herein as “DNA266307”. 図４３はＴＡＴ２２８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４３）を示し、ここに、配列番号４３は本明細書中において「ＤＮＡ２６６３１１」と命名されるクローンである。FIG. 43 shows the nucleotide sequence of TAT228 cDNA (SEQ ID NO: 43), where SEQ ID NO: 43 is a clone designated herein as “DNA26631”. 図４４はＴＡＴ２２９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４４）を示し、ここに、配列番号４４は本明細書中において「ＤＮＡ２６６３１２」と命名されるクローンである。FIG. 44 shows the nucleotide sequence of TAT229 cDNA (SEQ ID NO: 44), wherein SEQ ID NO: 44 is a clone designated herein as “DNA26631”. 図４５はＴＡＴ２３０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４５）を示し、ここに、配列番号４５は本明細書中において「ＤＮＡ２６６３１３」と命名されるクローンである。FIG. 45 shows the nucleotide sequence of TAT230 cDNA (SEQ ID NO: 45), where SEQ ID NO: 45 is a clone designated herein as “DNA266313”. 図４６はＴＡＴ１２１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４６）を示し、ここに、配列番号４６は本明細書中において「ＤＮＡ２２７２２４」と命名されるクローンである。FIG. 46 shows the nucleotide sequence of TAT121 cDNA (SEQ ID NO: 46), wherein SEQ ID NO: 46 is a clone designated herein as “DNA227224”. 図４７はＴＡＴ１８３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４７）を示し、ここに、配列番号４７は本明細書中において「ＤＮＡ２４７４８６」と命名されるクローンである。FIG. 47 shows the nucleotide sequence of TAT183 cDNA (SEQ ID NO: 47), where SEQ ID NO: 47 is a clone designated herein as “DNA247486”. 図４８はＴＡＴ１６５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４８）を示し、ここに、配列番号４８は本明細書中において「ＤＮＡ２２７５７８」と命名されるクローンである。FIG. 48 shows the nucleotide sequence of TAT165 cDNA (SEQ ID NO: 48), where SEQ ID NO: 48 is a clone designated herein as “DNA227578”. 図４９はＴＡＴ１３１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４９）を示し、ここに、配列番号４９は本明細書中において「ＤＮＡ２２７８００」と命名されるクローンである。FIG. 49 shows the nucleotide sequence of TAT131 cDNA (SEQ ID NO: 49), wherein SEQ ID NO: 49 is a clone designated herein as “DNA227800”. 図５０はＴＡＴ１４０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５０）を示し、ここに、配列番号５０は本明細書中において「ＤＮＡ２２７９０４」と命名されるクローンである。FIG. 50 shows the nucleotide sequence of TAT140 cDNA (SEQ ID NO: 50), where SEQ ID NO: 50 is a clone designated herein as “DNA227904”. 図５１はＴＡＴ１２７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５１）を示し、ここに、配列番号５１は本明細書中において「ＤＮＡ２２８１９９」と命名されるクローンである。FIG. 51 shows the nucleotide sequence of TAT127 cDNA (SEQ ID NO: 51), where SEQ ID NO: 51 is a clone designated herein as “DNA228199”. 図５２はＴＡＴ１１６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５２）を示し、ここに、配列番号５２は本明細書中において「ＤＮＡ２２８２０１」と命名されるクローンである。FIG. 52 shows the nucleotide sequence of TAT116 cDNA (SEQ ID NO: 52), wherein SEQ ID NO: 52 is a clone designated herein as “DNA228201”. 図５３はＴＡＴ１８９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５３）を示し、ここに、配列番号５３は本明細書中において「ＤＮＡ２４７４８８」と命名されるクローンである。FIG. 53 shows the nucleotide sequence of TAT189 cDNA (SEQ ID NO: 53), where SEQ ID NO: 53 is a clone designated herein as “DNA247488”. 図５４はＴＡＴ１９０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５４）を示し、ここに、配列番号５４は本明細書中において「ＤＮＡ２３６５３８」と命名されるクローンである。FIG. 54 shows the nucleotide sequence of TAT190 cDNA (SEQ ID NO: 54), wherein SEQ ID NO: 54 is a clone designated herein as “DNA236538”. 図５５はＴＡＴ１９１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５５）を示し、ここに、配列番号５５は本明細書中において「ＤＮＡ２４７４８９」と命名されるクローンである。FIG. 55 shows the nucleotide sequence of TAT191 cDNA (SEQ ID NO: 55), where SEQ ID NO: 55 is a clone designated herein as “DNA247474”. 図５６はＴＡＴ１３３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５６）を示し、ここに、配列番号５６は本明細書中において「ＤＮＡ２２８２１１」と命名されるクローンである。FIG. 56 shows the nucleotide sequence of TAT133 cDNA (SEQ ID NO: 56), where SEQ ID NO: 56 is a clone designated herein as “DNA228211”. 図５７はＴＡＴ１８６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５７）を示し、ここに、配列番号５７は本明細書中において「ＤＮＡ２３３９３７」と命名されるクローンである。FIG. 57 shows the nucleotide sequence of TAT186 cDNA (SEQ ID NO: 57), where SEQ ID NO: 57 is a clone designated herein as “DNA233937”. 図５８はＴＡＴ１２０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５８）を示し、ここに、配列番号５８は本明細書中において「ＤＮＡ２２８９９３」と命名されるクローンである。FIG. 58 shows the nucleotide sequence of TAT120 cDNA (SEQ ID NO: 58), where SEQ ID NO: 58 is a clone designated herein as “DNA228993”. 図５９はＴＡＴ１２４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５９）を示し、ここに、配列番号５９は本明細書中において「ＤＮＡ２２８９９４」と命名されるクローンである。FIG. 59 shows the nucleotide sequence of TAT124 cDNA (SEQ ID NO: 59), wherein SEQ ID NO: 59 is a clone designated herein as “DNA228994”. 図６０はＴＡＴ１０５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６０）を示し、ここに、配列番号６０は本明細書中において「ＤＮＡ２２９４１０」と命名されるクローンである。FIG. 60 shows the nucleotide sequence of TAT105 cDNA (SEQ ID NO: 60), where SEQ ID NO: 60 is a clone designated herein as “DNA229410”. 図６１ＡないしＢはＴＡＴ１０７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６１）を示し、ここに、配列番号６１は本明細書中において「ＤＮＡ２２９４１１」と命名されるクローンである。61A-B shows the nucleotide sequence of TAT107 cDNA (SEQ ID NO: 61), where SEQ ID NO: 61 is a clone designated herein as “DNA229411”. 図６２ＡないしＢはＴＡＴ１０８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６２）を示し、ここに、配列番号６２は本明細書中において「ＤＮＡ２２９４１３」と命名されるクローンである。FIGS. 62A-B show the nucleotide sequence of TAT108 cDNA (SEQ ID NO: 62), where SEQ ID NO: 62 is a clone designated herein as “DNA229413”. 図６３ＡないしＢはＴＡＴ１３９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６３）を示し、ここに、配列番号６３は本明細書中において「ＤＮＡ２２９７００」と命名されるクローンである。63A-B shows the nucleotide sequence of TAT139 cDNA (SEQ ID NO: 63), where SEQ ID NO: 63 is a clone designated herein as “DNA229700”. 図６４はＴＡＴ１４３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６４）を示し、ここに、配列番号６４は本明細書中において「ＤＮＡ２３１３１２」と命名されるクローンである。FIG. 64 shows the nucleotide sequence of TAT143 cDNA (SEQ ID NO: 64), wherein SEQ ID NO: 64 is a clone designated herein as “DNA231313”. 図６５はＴＡＴ１００ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６５）を示し、ここに、配列番号６５は本明細書中において「ＤＮＡ２３１５４２」と命名されるクローンである。FIG. 65 shows the nucleotide sequence of TAT100 cDNA (SEQ ID NO: 65), where SEQ ID NO: 65 is a clone designated herein as “DNA231542”. 図６６はＴＡＴ２８４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６６）を示し、ここに、配列番号６６は本明細書中において「ＤＮＡ２３１５４２−１」と命名されるクローンである。FIG. 66 shows the nucleotide sequence of TAT284 cDNA (SEQ ID NO: 66), wherein SEQ ID NO: 66 is a clone designated herein as “DNA231542-1”. 図６７はＴＡＴ２８５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６７）を示し、ここに、配列番号６７は本明細書中において「ＤＮＡ２３１５４２−２」と命名されるクローンである。FIG. 67 shows the nucleotide sequence of TAT285 cDNA (SEQ ID NO: 67), where SEQ ID NO: 67 is a clone designated herein as “DNA231542-2”. 図６８はＴＡＴ２８５−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６８）を示し、ここに、配列番号６８は本明細書中において「ＤＮＡ２９７３９３」と命名されるクローンである。FIG. 68 shows the nucleotide sequence of TAT285-1 cDNA (SEQ ID NO: 68), wherein SEQ ID NO: 68 is a clone designated herein as “DNA297393”. 図６９はＴＡＴ１２５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６９）を示し、ここに、配列番号６９は本明細書中において「ＤＮＡ２３２７５４」と命名されるクローンである。FIG. 69 shows the nucleotide sequence of TAT125 cDNA (SEQ ID NO: 69), wherein SEQ ID NO: 69 is a clone designated herein as “DNA232754”. 図７０はＴＡＴ１４９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７０）を示し、ここに、配列番号７０は本明細書中において「ＤＮＡ２３４８３３」と命名されるクローンである。FIG. 70 shows the nucleotide sequence of TAT149 cDNA (SEQ ID NO: 70), where SEQ ID NO: 70 is a clone designated herein as “DNA234833”. 図７１はＴＡＴ２３１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７１）を示し、ここに、配列番号７１は本明細書中において「ＤＮＡ２６８０２２」と命名されるクローンである。FIG. 71 shows the nucleotide sequence of TAT231 cDNA (SEQ ID NO: 71), where SEQ ID NO: 71 is a clone designated herein as “DNA268802”. 図７２はＴＡＴ１５３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７２）を示し、ここに、配列番号７２は本明細書中において「ＤＮＡ２３６２４６」と命名されるクローンである。FIG. 72 shows the nucleotide sequence of TAT153 cDNA (SEQ ID NO: 72), wherein SEQ ID NO: 72 is a clone designated herein as “DNA236246”. 図７３はＴＡＴ１０４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７３）を示し、ここに、配列番号７３は本明細書中において「ＤＮＡ２３６３４３」と命名されるクローンである。FIG. 73 shows the nucleotide sequence of TAT104 cDNA (SEQ ID NO: 73), where SEQ ID NO: 73 is a clone designated herein as “DNA236343”. 図７４はＴＡＴ１４１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７４）を示し、ここに、配列番号７４は本明細書中において「ＤＮＡ２３６４９３」と命名されるクローンである。FIG. 74 shows the nucleotide sequence of TAT141 cDNA (SEQ ID NO: 74), where SEQ ID NO: 74 is a clone designated herein as “DNA236493”. 図７５はＴＡＴ１０２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７５）を示し、ここに、配列番号７５は本明細書中において「ＤＮＡ２３６５３４」と命名されるクローンである。FIG. 75 shows the nucleotide sequence of TAT102 cDNA (SEQ ID NO: 75), where SEQ ID NO: 75 is a clone designated herein as “DNA236534”. 図７６はＴＡＴ１０９ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７６）を示し、ここに、配列番号７６は本明細書中において「ＤＮＡ２４６４３０」と命名されるクローンである。FIG. 76 shows the nucleotide sequence of TAT109 cDNA (SEQ ID NO: 76), where SEQ ID NO: 76 is a clone designated herein as “DNA246430”. 図７７はＴＡＴ１４２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７７）を示し、ここに、配列番号７７は本明細書中において「ＤＮＡ２４７４８０」と命名されるクローンである。FIG. 77 shows the nucleotide sequence of TAT142 cDNA (SEQ ID NO: 77), where SEQ ID NO: 77 is a clone designated herein as “DNA247480”. 図７８ＡないしＢはＴＡＴ１０６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７８）を示し、ここに、配列番号７８は本明細書中において「ＤＮＡ２６４４５４」と命名されるクローンである。78A-B shows the nucleotide sequence of TAT106 cDNA (SEQ ID NO: 78), where SEQ ID NO: 78 is a clone designated herein as “DNA264454”. 図７９は、図１に示された配列番号１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号７９）を示す。FIG. 79 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 79) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 1 shown in FIG. 図８０は、図２に示された配列番号２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８０）を示す。FIG. 80 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 80) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 2 shown in FIG. 図８１は、図３に示された配列番号３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８１）を示す。FIG. 81 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 81) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 3 shown in FIG. 図８２は、図４に示された配列番号４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８２）を示す。FIG. 82 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 82) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 4 shown in FIG. 図８３は、図５に示された配列番号５のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８３）を示す。FIG. 83 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 83) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 5 shown in FIG. 図８４は、図６に示された配列番号６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８４）を示す。FIG. 84 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 84) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 6 shown in FIG. 図８５は、図７に示された配列番号７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８５）を示す。FIG. 85 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 85) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 7 shown in FIG. 図８６は、図８に示された配列番号８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８６）を示す。FIG. 86 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 86) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 8 shown in FIG. 図８７は、図９に示された配列番号９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８７）を示す。FIG. 87 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 87) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 9 shown in FIG. 図８８は、図１０に示された配列番号１０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８８）を示す。FIG. 88 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 88) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 10 shown in FIG. 図８９は、図１１に示された配列番号１１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８９）を示す。FIG. 89 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 89) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 11 shown in FIG. 図９０は、図１２に示された配列番号１２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９０）を示す。FIG. 90 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 90) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 12 shown in FIG. 図９１は、図１３に示された配列番号１３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９１）を示す。FIG. 91 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 91) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 13 shown in FIG. 図９２は、図１４に示された配列番号１４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９２）を示す。FIG. 92 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 92) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 14 shown in FIG. 図９３は、図１５に示された配列番号１５のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９３）を示す。FIG. 93 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 93) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 15 shown in FIG. 図９４は、図１６に示された配列番号１６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９４）を示す。FIG. 94 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 94) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 16 shown in FIG. 図９５は、図１７ＡないしＢに示された配列番号１７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９５）を示す。FIG. 95 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 95) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 17 shown in FIGS. 17A-B. 図９６は、図１８に示された配列番号１８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９６）を示す。FIG. 96 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 96) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 18 shown in FIG. 図９７は、図１９に示された配列番号１９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９７）を示す。FIG. 97 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 97) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 19 shown in FIG. 図９８は、図２０に示された配列番号２０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９８）を示す。FIG. 98 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 98) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 20 shown in FIG. 図９９は、図２１に示された配列番号２１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号９９）を示す。FIG. 99 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 99) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 21 shown in FIG. 図１００は、図２２に示された配列番号２２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１００）を示す。FIG. 100 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 100) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 22 shown in FIG. 図１００は、図２２に示された配列番号２２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１００）を示す。FIG. 100 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 100) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 22 shown in FIG. 図１０１は、図２３に示された配列番号２３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０１）を示す。FIG. 101 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 101) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 23 shown in FIG. 図１０１は、図２３に示された配列番号２３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０１）を示す。FIG. 101 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 101) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 23 shown in FIG. 図１０２は、図２４に示された配列番号２４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０２）を示す。FIG. 102 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 102) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 24 shown in FIG. 図１０３は、図２５に示された配列番号２５のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０３）を示す。FIG. 103 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 103) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 25 shown in FIG. 図１０４は、図２６に示された配列番号２６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０４）を示す。FIG. 104 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 104) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 26 shown in FIG. 図１０５は、図２７に示された配列番号２７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０５）を示す。FIG. 105 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 105) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 27 shown in FIG. 図１０６は、図２８に示された配列番号２８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０６）を示す。FIG. 106 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 106) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 28 shown in FIG. 図１０７は、図２９に示された配列番号２９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０７）を示す。FIG. 107 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 107) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 29 shown in FIG. 図１０８は、図３０に示された配列番号３０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０８）を示す。FIG. 108 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 108) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 30 shown in FIG. 図１０９は、図３１に示された配列番号３１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１０９）を示す。FIG. 109 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 109) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 31 shown in FIG. 図１１０ＡないしＢは、図３２ＡないしＢに示された配列番号３２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１０）を示す。110A-B show the amino acid sequence (SEQ ID NO: 110) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 32 shown in FIGS. 32A-B. 図１１０ＡないしＢは、図３２ＡないしＢに示された配列番号３２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１０）を示す。110A-B show the amino acid sequence (SEQ ID NO: 110) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 32 shown in FIGS. 32A-B. 図１１０ＡないしＢは、図３２ＡないしＢに示された配列番号３２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１０）を示す。110A-B show the amino acid sequence (SEQ ID NO: 110) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 32 shown in FIGS. 32A-B. 図１１１は、図３３に示された配列番号３３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１１）を示す。FIG. 111 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 111) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 33 shown in FIG. 図１１２は、図３４に示された配列番号３４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１２）を示す。FIG. 112 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 112) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 34 shown in FIG. 図１１３は、図３５に示された配列番号３５のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１３）を示す。FIG. 113 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 113) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 35 shown in FIG. 図１１４は、図３６に示された配列番号３６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１４）を示す。FIG. 114 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 114) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 36 shown in FIG. 図１１５は、図３７に示された配列番号３７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１５）を示す。FIG. 115 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 115) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 37 shown in FIG. 図１１６は、図３８に示された配列番号３８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１６）を示す。FIG. 116 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 116) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 38 shown in FIG. 図１１７は、図３９に示された配列番号３９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１７）を示す。FIG. 117 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 117) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 39 shown in FIG. 図１１８は、図４０に示された配列番号４０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１８）を示す。118 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 118) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 40 shown in FIG. 図１１９は、図４１に示された配列番号４１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１１９）を示す。FIG. 119 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 119) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 41 shown in FIG. 図１２０は、図４２に示された配列番号４２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２０）を示す。120 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 120) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 42 shown in FIG. 図１２１は、図４３に示された配列番号４３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２１）を示す。FIG. 121 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 121) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 43 shown in FIG. 図１２２は、図４４に示された配列番号４４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２２）を示す。FIG. 122 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 122) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 44 shown in FIG. 図１２３は、図４５に示された配列番号４５のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２３）を示す。FIG. 123 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 123) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 45 shown in FIG. 図１２４は、図４６に示された配列番号４６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２４）を示す。FIG. 124 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 124) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 46 shown in FIG. 図１２５は、図４７に示された配列番号４７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２５）を示す。FIG. 125 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 125) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 47 shown in FIG. 図１２６は、図４８に示された配列番号４８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２６）を示す。FIG. 126 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 126) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 48 shown in FIG. 図１２７は、図４９に示された配列番号４９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２７）を示す。FIG. 127 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 127) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 49 shown in FIG. 図１２７は、図４９に示された配列番号４９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２７）を示す。FIG. 127 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 127) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 49 shown in FIG. 図１２８は、図５０に示された配列番号５０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２８）を示す。128 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 128) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 50 shown in FIG. 図１２９は、図５１に示された配列番号５１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２９）を示す。FIG. 129 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 129) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 51 shown in FIG. 図１２９は、図５１に示された配列番号５１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１２９）を示す。FIG. 129 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 129) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 51 shown in FIG. 図１３０は、図５２に示された配列番号５２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３０）を示す。FIG. 130 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 130) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 52 shown in FIG. 図１３１は、図５３に示された配列番号５３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３１）を示す。FIG. 131 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 131) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 53 shown in FIG. 図１３２は、図５４に示された配列番号５４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３２）を示す。FIG. 132 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 132) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 54 shown in FIG. 図１３３は、図５５に示された配列番号５５のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３３）を示す。FIG. 133 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 133) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 55 shown in FIG. 図１３４は、図５６に示された配列番号５６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３４）を示す。FIG. 134 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 134) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 56 shown in FIG. 図１３５は、図５７に示された配列番号５７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３５）を示す。FIG. 135 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 135) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 57 shown in FIG. 図１３６は、図５８に示された配列番号５８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３６）を示す。136 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 136) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 58 shown in FIG. 図１３７は、図５９に示された配列番号５９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３７）を示す。FIG. 137 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 137) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 59 shown in FIG. 図１３８は、図６０に示された配列番号６０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３８）を示す。FIG. 138 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 138) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 60 shown in FIG. 図１３９は、図６１ＡないしＢに示された配列番号６１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１３９）を示す。FIG. 139 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 139) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 61 shown in FIGS. 61A-B. 図１４０は、図６２ＡないしＢに示された配列番号６２のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４０）を示す。FIG. 140 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 140) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 62 shown in FIGS. 62A-B. 図１４１は、図６３ＡないしＢに示された配列番号６３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４１）を示す。FIG. 141 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 141) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 63 shown in FIGS. 63A-B. 図１４２は、図６４に示された配列番号６４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４２）を示す。FIG. 142 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 142) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 64 shown in FIG. 図１４３は、図６６に示された配列番号６６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４３）を示す。FIG. 143 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 143) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 66 shown in FIG. 図１４４は、図６７に示された配列番号６７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４４）を示す。FIG. 144 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 144) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 67 shown in FIG. 図１４５は、図６８に示された配列番号６８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４５）を示す。FIG. 145 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 145) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 68 shown in FIG. 図１４６は、図６９に示された配列番号６９のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４６）を示す。FIG. 146 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 146) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 69 shown in FIG. 図１４７は、図７０に示された配列番号７０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４７）を示す。FIG. 147 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 147) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 70 shown in FIG. 図１４７は、図７０に示された配列番号７０のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４７）を示す。FIG. 147 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 147) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 70 shown in FIG. 図１４８は、図７１に示された配列番号７１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４８）を示す。FIG. 148 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 148) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 71 shown in FIG. 図１４８は、図７１に示された配列番号７１のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４８）を示す。FIG. 148 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 148) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 71 shown in FIG. 図１４９は、図７３に示された配列番号７３のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１４９）を示す。FIG. 149 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 149) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 73 shown in FIG. 図１５０は、図７４に示された配列番号７４のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１５０）を示す。FIG. 150 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 150) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 74 shown in FIG. 図１５１は、図７５に示された配列番号７５のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１５１）を示す。FIG. 151 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 151) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 75 shown in FIG. 図１５２は、図７６に示された配列番号７６のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１５２）を示す。FIG. 152 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 152) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 76 shown in FIG. 図１５３は、図７７に示された配列番号７７のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１５３）を示す。FIG. 153 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 153) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 77 shown in FIG. 図１５４は、図７８ＡないしＢに示された配列番号７８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１５４）を示す。FIG. 154 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 154) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 78 shown in FIGS. 78A-B. 図１５４は、図７８ＡないしＢに示された配列番号７８のコーディング配列に由来するアミノ酸配列（配列番号１５４）を示す。FIG. 154 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 154) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 78 shown in FIGS. 78A-B. 図１５５は、ナトリウムイオン独立性の大きな中性アミノ酸トランスポーターのサブユニットとしてのＥ１６ポリペプチド（ＴＡＴ１８８）の三次元構造を示すダイアグラムである。FIG. 155 is a diagram showing the three-dimensional structure of E16 polypeptide (TAT188) as a subunit of a neutral amino acid transporter independent of sodium ions. 図１５６は、ＰＣ３細胞表面への抗−ＴＡＴ１８８（抗−Ｅ１６）抗体の結合（緑色プロット）およびＴＡＴ１８８発現の低下に伴う結合の低下（赤色プロット）を示すＦＡＣＳプロットのグラフ結果を示す。FIG. 156 shows graphical results of FACS plots showing anti-TAT188 (anti-E16) antibody binding to the surface of PC3 cells (green plot) and a decrease in binding with decreasing TAT188 expression (red plot). 図１５７は、ＴＡＴ１８８−発現ＰＣ３細胞の表面への結合後の抗−ＴＡＴ１８８抗体の内部化を示す。FIG. 157 shows the internalization of anti-TAT188 antibody after binding to the surface of TAT188-expressing PC3 cells. 図１５８は、経時的な、抗−ＴＡＴ１８８抗体の存在下におけるＴＡＴ１８８アミノ酸輸送活性の変化を示す棒グラフである。FIG. 158 is a bar graph showing the change in TAT188 amino acid transport activity over time in the presence of anti-TAT188 antibody. 図１５９は、ＰＣ３およびＣｏｌｏ２０５細胞における増大する量のＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥトキシン−結合体化された抗−ＴＡＴ１８８抗体の存在下での細胞生存性のプロットを供する。FIG. 159 provides a plot of cell viability in the presence of increasing amounts of MC-vc-PAB-MMAE toxin-conjugated anti-TAT188 antibody in PC3 and Colo205 cells. 図１６０は、Ｃｏｌｏ２０５細胞における、増大する量のＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥまたはＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦトキシン−結合体化された抗−ＴＡＴ１８８抗体の存在下での細胞生存性のプロットである。FIG. 160 is a plot of cell viability in the presence of increasing amounts of MC-vc-PAB-MMAE or MC-vc-PAB-MMAF toxin-conjugated anti-TAT188 antibody in Colo205 cells. . 図１６１は、Ｅ１６ポリペプチドを内因的に発現する抗−ヒトＥ１６抗体結合細胞の結果を示し、ここに、細胞はサルＣＯＳ７細胞、ヒトＭＣＦ１０Ａ乳癌細胞、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。図１６１Ａは、サルＣＯＳへの抗−Ｅ１６抗体３Ｂ５、１２Ｂ９、および１２Ｇ１２の結合のＦＡＣＳ結果を示す。図１６１Ｂは、ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ１０Ａへの抗−Ｅ１６ ３Ｂ５の結合を示し、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞への結合が無いことを示す。FIG. 161 shows the results of anti-human E16 antibody-binding cells that endogenously express E16 polypeptide, where the cells are monkey COS7 cells, human MCF10A breast cancer cells, and mouse NIH-3T3 cells. FIG. 161A shows FACS results for binding of anti-E16 antibodies 3B5, 12B9, and 12G12 to monkey COS. FIG. 161B shows binding of anti-E16 3B5 to human breast cancer cell line MCF10A and no binding to mouse NIH-3T3 cells. 図１６２は、裸の（トキシンが結合体化していない）抗−Ｅ１６抗体が投与された異種移植片マウスにおける経時的な平均腫瘍容量変化のプロットである。FIG. 162 is a plot of mean tumor volume change over time in xenograft mice administered with a naked (non-toxin conjugated) anti-E16 antibody. 図１６３は、トキシン−結合体化された抗−Ｅ１６抗体が投与された異種移植片マウスにおける経時的な平均腫瘍容量変化のグラフであり、ここに、トキシンはＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥまたはＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦいずれかであった。FIG. 163 is a graph of mean tumor volume change over time in xenograft mice administered with toxin-conjugated anti-E16 antibody, where the toxin is MC-vc-PAB-MMAE or MC -Vc-PAB-MMAF. 図１６４は、Ｅ１６−ＧＦＰ融合ポリペプチドの発現がＥ１６遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞で低下することを示す。頂部パネルは、ＧＦＰの存在についてのバイオルミネセンスアッセイの結果の写真である。下方パネルは、ＧＦＰバイオルミネセンス低下が細胞数の低下によって引き起こされなかったことを示す移送コントラスト可視化の写真である。FIG. 164 shows that expression of the E16-GFP fusion polypeptide is reduced in cells transfected with siRNA targeting the E16 gene. The top panel is a photograph of the results of a bioluminescence assay for the presence of GFP. The lower panel is a photo of transport contrast visualization showing that the GFP bioluminescence reduction was not caused by a decrease in cell number. 図１６５は、Ｅ１６−ＧＦＰ融合ポリペプチド発現が、Ｅ１６ ｓｉＲＮＡで一過的にトランスフェクトされたＰＣ３細胞で阻害されることを示すウエスタンブロットである。β−チューブリンはゲル負荷対照である。FIG. 165 is a Western blot showing that E16-GFP fusion polypeptide expression is inhibited in PC3 cells transiently transfected with E16 siRNA. β-tubulin is a gel loading control. 図１６６は、ＰＣ３細胞のＥ１６ ｓｉＲＮＡでの一過的なトランスフェクションがアミノ酸輸送機能の低下に関連し、Ｅ１６の低下した発現と合致することを示す。FIG. 166 shows that transient transfection of PC3 cells with E16 siRNA is associated with reduced amino acid transport function and is consistent with reduced expression of E16. 図１６７は、Ｅ１６ ｓｉＲＮＡでの一過的なトランスフェクションの有りおよび無しでの経時的な細胞増殖のプロットである。細胞増殖は、Ｅ１６で一過的にトランスフェクトされたＰＣ３細胞で低下する。FIG. 167 is a plot of cell growth over time with and without transient transfection with E16 siRNA. Cell proliferation is reduced in PC3 cells transiently transfected with E16.

Claims (61)

（ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されるポリペプチド；
（ｂ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されたポリペプチド；
（ｃ）その関連するシグナルペプチドを持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されたポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その関連するシグナルペプチドを欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されたポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されたヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされるポリペプチド；
に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する、単離された抗体。 (A) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(C) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) having its associated signal peptide;
(D) the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide;
(E) a polypeptide encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A-B (SEQ ID NOs: 1-78); or (f) FIGS. 1-78A-B (SEQ ID NOs: 1-78). A polypeptide encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of
An isolated antibody that binds to a polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity to. （ａ）図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されたアミノ酸配列；
（ｂ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されたアミノ酸配列；
（ｃ）その関連するシグナルペプチド配列を持つ、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その関連するシグナルペプチド配列を欠く、図７９ないし１５４（配列番号７９ないし１５４）のいずれか１つに示されたポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列；または
（ｆ）図１ないし７８ＡないしＢ（配列番号１ないし７８）のいずれか１つに示されたヌクレオチド配列の全長コーディング領域によってコードされたアミノ酸配列；
を有するポリペプチドに結合する、単離された抗体。 (A) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154);
(B) the amino acid sequence shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(C) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs: 79 to 154) having its associated signal peptide sequence;
(D) the amino acid sequence of the extracellular domain of the polypeptide shown in any one of FIGS. 79 to 154 (SEQ ID NOs 79 to 154) lacking its associated signal peptide sequence;
(E) the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in any one of FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78); or (f) FIGS. 1 to 78A to B (SEQ ID NOs: 1 to 78). An amino acid sequence encoded by the full-length coding region of the nucleotide sequence shown in any one of
An isolated antibody that binds to a polypeptide having モノクローナル抗体である、請求項１記載の抗体。   The antibody of claim 1, which is a monoclonal antibody. 抗体断片である、請求項１記載の抗体。   The antibody according to claim 1, which is an antibody fragment. キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１記載の抗体。   The antibody of claim 1, which is a chimeric antibody or a humanized antibody. 成長阻害剤に結合体化された、請求項１記載の抗体。   2. The antibody of claim 1 conjugated to a growth inhibitor. 細胞傷害性剤に結合体化された、請求項１記載の抗体。   2. The antibody of claim 1 conjugated to a cytotoxic agent. 前記細胞傷害性剤が、トキシン、抗体、放射性同位体およびヌクレオ溶解性酵素よりなる群から選択される、請求項７記載の抗体。   8. The antibody of claim 7, wherein the cytotoxic agent is selected from the group consisting of toxins, antibodies, radioisotopes and nucleolytic enzymes. 前記細胞傷害性剤がトキシンである、請求項７記載の抗体。   8. The antibody of claim 7, wherein the cytotoxic agent is a toxin. 前記トキシンが、アウリスタチン、メイタンシノイドおよびカリケアミシンよりなる群から選択される、請求項９記載の抗体。   10. The antibody of claim 9, wherein the toxin is selected from the group consisting of auristatin, maytansinoid and calicheamicin. 前記トキシンがメイタンシノイドである、請求項９記載の抗体。   The antibody according to claim 9, wherein the toxin is a maytansinoid. 細菌において生産される、請求項１記載の抗体。   2. The antibody of claim 1 produced in bacteria. ＣＨＯ細胞において生産される、請求項１記載の抗体。   2. The antibody of claim 1, wherein the antibody is produced in CHO cells. 結合する細胞の死滅を誘導する、請求項１記載の抗体。   2. The antibody of claim 1, wherein the antibody induces death of bound cells. 検出可能に標識される、請求項１記載の抗体。   2. The antibody of claim 1, wherein the antibody is detectably labeled. 前記トキシンは、ＭＭＡＥ（モノ−メチルアウリスタチンＥ）、ＭＭＡＦおよびＡＥＶＢ（アウリスタチンＥバレリルベンジルヒドラゾン）、およびＡＦＰ（アウリスタチンＦフェニレンジアミン）よりなる群から選択される、請求項９記載の抗体。   10. The antibody of claim 9, wherein the toxin is selected from the group consisting of MMAE (mono-methyl auristatin E), MMAF and AEVB (auristatin E valeryl benzylhydrazone), and AFP (auristatin F phenylenediamine). . 前記トキシンがリンカーによって抗体に共有結合した、請求項９記載の抗体。   10. The antibody of claim 9, wherein the toxin is covalently bound to the antibody by a linker. 前記リンカーが、マレイミドカプロイル（ＭＣ）、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ，ｖｃ）、シトルリン（２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸）、ＰＡＢ（ｐ−アミノベンジルカルバモイル）、Ｍｅ（Ｎ−メチル−バリンシトルリン）、ＭＣ（ＰＥＧ）６−ＯＨ（マレイミドカプロイル−ポリエチレングリコール）、ＳＰＰ（４−（２−ピリジルチオ）ペンタン酸Ｎ−スクシンイミジル）、ＳＭＣＣ（Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート）、およびＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢよりなる群から選択される、請求項１７記載の抗体。   The linker is maleimide caproyl (MC), valine-citrulline (val-cit, vc), citrulline (2-amino-5-ureidopentanoic acid), PAB (p-aminobenzylcarbamoyl), Me (N-methyl- Valine citrulline), MC (PEG) 6-OH (maleimidocaproyl-polyethylene glycol), SPP (4- (2-pyridylthio) pentanoic acid N-succinimidyl), SMCC (N-succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane -1 carboxylate), and the antibody of claim 17 selected from the group consisting of MC-vc-PAB. 前記トキシンがＭＭＡＥである、請求項１６記載の抗体。   The antibody according to claim 16, wherein the toxin is MMAE. 前記トキシンがＭＭＡＦである、請求項１６記載の抗体。   The antibody of claim 16, wherein the toxin is MMAF. 前記リンカーがＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢである、請求項１９または２０記載の抗体。   21. The antibody of claim 19 or 20, wherein the linker is MC-vc-PAB. 前記抗体がＴＡＴ１８８ポリペプチドに結合する、請求項１ないし２１いずれか１項に記載の抗体。   The antibody of any one of claims 1 to 21, wherein the antibody binds to a TAT188 polypeptide. 前記抗体が、ＴＡＴ１８８を発現する細胞の増殖を阻害するか、または該細胞の細胞死滅を誘導する、請求項２２記載の抗体。   23. The antibody of claim 22, wherein the antibody inhibits proliferation of cells expressing TAT188 or induces cell death of the cells. 前記細胞が癌細胞である、請求項２３記載の抗体。   24. The antibody of claim 23, wherein the cell is a cancer cell. 前記癌細胞が、乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚、および肝臓よりなる群から選択される請求項２４記載の抗体。   25. The antibody of claim 24, wherein the cancer cells are selected from the group consisting of breast, colon, rectum, endometrium, kidney, lung, ovary, skin, and liver. ＴＡＴ１８８ポリペプチドのエピトープとの結合に競合する単離された抗体であって、該ＴＡＴ１８８ポリペプチドは、３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体によって結合されている、抗体。   An isolated antibody that competes for binding to an epitope of a TAT188 polypeptide, wherein the TAT188 polypeptide is 3B5.1 (ATCC accession number PTA-6193), 12B9.1 (ATCC accession number PTA-6194) and An antibody bound by an antibody produced by a hybridoma selected from the group consisting of 12G12.1 (ATCC accession number PTA-6195). ３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産される抗体の生物学的活性を有する単離された抗体であって、ここで、該生物学的活性が、ＴＡＴ１８８を発現する細胞における細胞増殖の阻害または細胞死滅の促進である、抗体。   An antibody organism produced by a hybridoma selected from the group consisting of 3B5.1 (ATCC accession number PTA-6193), 12B9.1 (ATCC accession number PTA-6194) and 12G12.1 (ATCC accession number PTA-6195) An antibody having a biological activity, wherein the biological activity is inhibition of cell proliferation or promotion of cell death in cells expressing TAT188. ３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産される抗体のＣＤＲの少なくとも１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するアミノ酸配列を、対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）において含む、単離された抗体。   CDRs of antibodies produced by a hybridoma selected from the group consisting of 3B5.1 (ATCC accession number PTA-6193), 12B9.1 (ATCC accession number PTA-6194) and 12G12.1 (ATCC accession number PTA-6195) At least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% of at least 1, 2, 3, 4, 5 or 6 amino acid sequences An isolated antibody comprising an amino acid sequence having 99% or 100% in the corresponding complementarity determining region (CDR). 前記抗体が、３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産される抗体のＣＤＲの少なくとも１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するアミノ酸配列を、対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）において含む、請求項１ないし２１いずれか１項に記載の抗体。   The antibody is produced by a hybridoma selected from the group consisting of 3B5.1 (ATCC accession number PTA-6193), 12B9.1 (ATCC accession number PTA-6194) and 12G12.1 (ATCC accession number PTA-6195). At least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 of the amino acid sequence of at least 1, 2, 3, 4, 5 or 6 of the CDR of the antibody The antibody according to any one of claims 1 to 21, comprising an amino acid sequence having%, 98%, 99% or 100% in the corresponding complementarity determining region (CDR). 前記抗体が、３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産される抗体の生物学的活性を呈し、ここで、該生物学的活性は、ＴＡＴ１８８を発現する細胞における細胞増殖の阻害または細胞死滅の促進である、請求項１ないし２１いずれか１項に記載の抗体。   The antibody is produced by a hybridoma selected from the group consisting of 3B5.1 (ATCC accession number PTA-6193), 12B9.1 (ATCC accession number PTA-6194) and 12G12.1 (ATCC accession number PTA-6195). 22. The biological activity of the antibody according to claim 1, wherein the biological activity is inhibition of cell proliferation or promotion of cell death in cells expressing TAT188. antibody. 前記細胞が癌細胞である、請求項３０記載の抗体。   32. The antibody of claim 30, wherein the cell is a cancer cell. 前記癌細胞が、乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される、請求項３１記載の方法。   32. The method of claim 31, wherein the cancer cells are selected from the group consisting of breast, colon, rectum, endometrium, kidney, lung, ovary, skin and liver. ＴＡＴ１８８を発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、該細胞を請求項１ないし２１いずれか１項に記載の抗体と接触させる工程を包含する、方法。   22. A method of inhibiting the growth of a cell expressing TAT188, the method comprising contacting the cell with an antibody according to any one of claims 1 to 21. 前記細胞が癌細胞である、請求項３３記載の方法。   34. The method of claim 33, wherein the cell is a cancer cell. 前記癌細胞が、乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される、請求項３４記載の方法。   35. The method of claim 34, wherein the cancer cells are selected from the group consisting of breast, colon, rectum, endometrium, kidney, lung, ovary, skin and liver. 前記癌細胞が哺乳動物細胞である、請求項３５記載の方法。   36. The method of claim 35, wherein the cancer cell is a mammalian cell. 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項３６記載の方法。   38. The method of claim 36, wherein the mammalian cell is a human cell. ＴＡＴ１８８を発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、該細胞を、請求項１ないし２１いずれか１項に記載の抗体と接触させる工程を包含し、ここで、該抗体は、３Ｂ５．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９３）、１２Ｂ９．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９４）および１２Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９５）よりなる群から選択されるハイブリドーマによって生産された抗体のＣＤＲの少なくとも１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を有するアミノ酸配列を、対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）において含む、方法。   A method of inhibiting the growth of a cell expressing TAT188 comprising contacting the cell with an antibody according to any one of claims 1 to 21, wherein the antibody comprises Of an antibody produced by a hybridoma selected from the group consisting of 3B5.1 (ATCC accession number PTA-6193), 12B9.1 (ATCC accession number PTA-6194) and 12G12.1 (ATCC accession number PTA-6195) At least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 of at least 1, 2, 3, 4, 5 or 6 amino acid sequences of the CDR A method comprising an amino acid sequence having%, 99% or 100% in the corresponding complementarity determining region (CDR). 試験細胞で発現されるＴＡＴ１８８ポリペプチドのレベルを検出する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）試験細胞および対照細胞を、請求項２６記載の単離された抗−ＴＡＴ１８８抗体と接触させる工程；
（ｂ）該抗体の結合を検出する工程；ならびに
（ｃ）該試験細胞および対照細胞への抗体の相対的結合を決定する工程；
を包含する、方法。 A method of detecting the level of TAT188 polypeptide expressed in a test cell, the method comprising:
(A) contacting a test cell and a control cell with the isolated anti-TAT188 antibody of claim 26;
(B) detecting binding of the antibody; and (c) determining relative binding of the antibody to the test and control cells;
Including the method. 前記試験細胞および対照細胞が溶解される、請求項３９記載の方法。   40. The method of claim 39, wherein the test cell and control cell are lysed. 前記試験細胞が組織である、請求項３９記載の方法。   40. The method of claim 39, wherein the test cell is a tissue. 前記組織が腫瘍組織である、請求項４１記載の方法。   42. The method of claim 41, wherein the tissue is a tumor tissue. 前記腫瘍組織が、乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される請求項４２記載の方法。   43. The method of claim 42, wherein the tumor tissue is selected from the group consisting of breast, colon, rectum, endometrium, kidney, lung, ovary, skin and liver. 対照細胞に対する、試験細胞における、ＴＡＴ１８８ポリペプチドまたは図１１５（配列番号１１５）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドのレベルを検出する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）試験細胞および対照細胞を、請求項１ないし５、１２ないし１５、および２６ないし２８いずれか１項に記載の単離された抗体と接触させる工程；
（ｂ）該抗体の結合を検出する工程；ならびに
（ｃ）該試験細胞および対照細胞に対する抗体の相対的結合を決定する工程；
を包含する、方法。 A method of detecting the level of a TAT188 polypeptide or a polypeptide having at least 80% sequence identity to the amino acid sequence shown in FIG. 115 (SEQ ID NO: 115) in a test cell relative to a control cell, the method comprising: ,Less than:
(A) contacting a test cell and a control cell with the isolated antibody of any one of claims 1-5, 12-15, and 26-28;
(B) detecting binding of the antibody; and (c) determining relative binding of the antibody to the test and control cells;
Including the method. 前記試験細胞におけるＴＡＴ１８８ポリペプチドのレベルが、前記対照細胞におけるＴＡＴ１８８ポリペプチドのレベルよりも大きい、請求項４４記載の方法。   45. The method of claim 44, wherein the level of TAT188 polypeptide in the test cell is greater than the level of TAT188 polypeptide in the control cell. 前記方法が、試験細胞を含有する組織、または試験細胞が含有されていた組織における癌を診断する、請求項４５記載の方法。   48. The method of claim 45, wherein the method diagnoses cancer in a tissue containing or containing a test cell. （ａ）図３７（配列番号３７）に示されるヌクレオチド配列；および
（ｂ）（ａ）の相補体、
に対して、少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸に結合するＴＡＴ結合干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であって、
ここで、該ｓｉＲＮＡはＴＡＴ１８８の発現を低下させる、ｓｉＲＮＡ。 (A) the nucleotide sequence shown in FIG. 37 (SEQ ID NO: 37); and (b) the complement of (a),
Wherein the TAT-binding interfering RNA (siRNA) binds to an amino acid having at least 80% sequence identity,
Wherein the siRNA reduces TAT188 expression. 請求項４７記載のｓｉＲＮＡを含む、発現ベクター。   An expression vector comprising the siRNA according to claim 47. 前記ｓｉＲＮＡが、前記ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞によって認識される制御配列に操作可能に連結された、請求項４８記載の発現ベクター。   49. The expression vector of claim 48, wherein the siRNA is operably linked to a regulatory sequence recognized by a host cell transfected with the vector. 請求項４９記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。   50. A host cell comprising the expression vector of claim 49. （ａ）請求項１記載の抗体、または
（ｂ）請求項４７記載のｓｉＲＮＡ；
を、キャリアと組み合わせて含む、組成物。 (A) the antibody of claim 1, or (b) the siRNA of claim 47;
In combination with a carrier. 前記キャリアが、薬学的に受容可能なキャリアである、請求項５１記載の組成物。   52. The composition of claim 51, wherein the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier. （ａ）容器；および
（ｂ）該容器内に含有される請求項５１記載の組成物；
を含む、製品。 52. The composition of claim 51 contained in (a) a container; and (b) the container;
Including the products. 癌の治療的処置、または癌の診断検出のための前記組成物の使用に言及する、前記容器に付着されたラベル、または該容器に含まれた添付文書をさらに含む、請求項５３記載の製品。   54. The product of claim 53, further comprising a label attached to the container, or a package insert included in the container, which refers to the use of the composition for therapeutic treatment of cancer or diagnostic detection of cancer. . 図１１５（配列番号１１５）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを発現する癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、該癌細胞を、該癌細胞において該アミノ酸をコードする核酸に結合するｓｉＲＮＡと接触させ、それにより、該癌細胞の増殖を阻害する工程を包含する、方法。   115. A method of inhibiting the growth of cancer cells that express a polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity to the amino acid sequence shown in FIG. 115 (SEQ ID NO: 115), the method comprising: Contacting with an siRNA that binds to the nucleic acid encoding the amino acid in the cancer cell, thereby inhibiting the growth of the cancer cell. 前記核酸が図３７（配列番号３７）に示される配列を有する、請求項５５記載の方法。   56. The method of claim 55, wherein the nucleic acid has the sequence shown in Figure 37 (SEQ ID NO: 37). 前記ポリペプチドの発現のレベルの検出が、免疫組織化学分析において抗体を使用する工程を包含する、請求項４４記載の方法。   45. The method of claim 44, wherein detecting the level of expression of the polypeptide comprises using an antibody in an immunohistochemical analysis. 図１１５（配列番号１１５）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドの増大した発現または活性に関連する細胞増殖性障害を治療または予防する方法であって、該方法は、有効量のＴＡＴ１８８ポリペプチドのアンタゴニストを、そのような治療を必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。   115. A method of treating or preventing a cell proliferative disorder associated with increased expression or activity of a polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity to the amino acid sequence shown in FIG. 115 (SEQ ID NO: 115), comprising: The method comprises administering an effective amount of an antagonist of a TAT188 polypeptide to a subject in need of such treatment. 前記アンタゴニストが、請求項１ないし２１および２３ないし２８いずれか１項に記載の単離された抗−ＴＡＴ１８８ポリペプチド抗体である、請求項５８記載の方法。   59. The method of claim 58, wherein the antagonist is an isolated anti-TAT188 polypeptide antibody of any one of claims 1-21 and 23-28. 前記細胞増殖性障害が癌である、請求項５９記載の方法。   60. The method of claim 59, wherein the cell proliferative disorder is cancer. 前記癌が、乳房、結腸、直腸、子宮内膜、腎臓、肺、卵巣、皮膚および肝臓よりなる群から選択される、請求項６０記載の方法。   61. The method of claim 60, wherein the cancer is selected from the group consisting of breast, colon, rectum, endometrium, kidney, lung, ovary, skin and liver.
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