JP2008309783A - Sensor chip for detection of antigen, method for its production, and sensor for detection of antigen - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、表面プラズモン共鳴角（以下、ＳＰＲという。）検出装置等を使用する際の微小領域におけるセンシングに適した高感度センサーチップ、詳しくは感染症病原体を検知し得る抗体を、金属基板上に固定し、抗原抗体反応によりウイルス、バクテリア、抗原タンパクを検出するのに適した、抗原検出用センサーチップに関するものである。またその作製方法および抗原検出用センサーに関するものである。 The present invention provides a high-sensitivity sensor chip suitable for sensing in a minute region when using a surface plasmon resonance angle (hereinafter referred to as SPR) detection device or the like, and more specifically, an antibody capable of detecting an infectious disease pathogen on a metal substrate. The present invention relates to a sensor chip for antigen detection, which is suitable for detecting viruses, bacteria, and antigen proteins by antigen-antibody reaction. The present invention also relates to a production method and an antigen detection sensor.
ＳＰＲ法用センサーチップを用いたバイオセンシングについては、多くの提案がなされている。たとえば、後掲特許文献１では、表面プラズモン共鳴法による免疫測定としてマイクロセンシングチップを開発し、高感度の検出法を提案している。
Many proposals have been made for biosensing using a sensor chip for the SPR method. For example, in
また、センサーチップの作製にあたっては、いかに非特異吸着を制御するかが課題であり、この改善策として自己組織化膜の構造を改良した提案（特許文献２）がある。 In manufacturing a sensor chip, how to control non-specific adsorption is an issue, and there is a proposal for improving the structure of the self-assembled film (Patent Document 2) as an improvement measure.
さて、新興感染症の出現や再興感染症の侵襲もあって、感染症は今なお人類に脅威を与えている。また、これらの病原体の変異や耐性化により世界的な大流行も危惧される。中でも、鳥インフルエンザをはじめ、ＳＡＲＳ、ＭＲＳＡ感染症、エイズ、ノロウイルス感染症など様々な感染症が社会問題となっており、世界的に感染症に対する関心が高まっている。特に、アジアを中心に拡大しているＨ５Ｎ１亜型トリインフルエンザにおいては人体への感染が確認され、世界的な流行が懸念されている。病原体の検査については、検査室で微生物学的手段によって検出・解析がされており、全国に約７０ある地方衛生研究所がこの疫学情報のための病原体検査を行っている。 Now, with the emergence of emerging infectious diseases and the invasion of re-emerging infectious diseases, infectious diseases still pose a threat to humanity. In addition, global epidemics are feared due to mutation and resistance of these pathogens. Among them, various infectious diseases such as avian influenza, SARS, MRSA infectious diseases, AIDS, and norovirus infectious diseases are social problems, and interest in infectious diseases is increasing worldwide. In particular, H5N1 subtype avian influenza, which is expanding mainly in Asia, has been confirmed to be infected to the human body, and there is concern about a global epidemic. Pathogen testing is detected and analyzed by microbiological means in laboratories, and approximately 70 local health laboratories nationwide conduct pathogen testing for this epidemiological information.
しかしながら、病原体検出は人手、経費、時間がかかり、全ての患者について検査を行うことができないのが実態である。また、現在臨床検査や衛生検査において使用される装置は高額であり、専門的な知識なくして簡便に扱うことができない。つまり、現在の感染症病原体の検査としてＥＬＩＳＡ法やＰＣＲ法などが用いられているが、いずれも装置は高額であり、取り扱いに専門的な知識や熟練を要し、結果を得るまでに時間がかかること、装置が大型で大掛かりであることから持ち運びすることができず、現場での測定には不向きという問題があった。また、乾燥下での使用には、不向きという問題があった。 However, pathogen detection is labor-intensive, expensive and time consuming, and the actual situation is that all patients cannot be examined. In addition, devices currently used in clinical tests and hygiene tests are expensive and cannot be handled easily without specialized knowledge. In other words, the ELISA method and the PCR method are currently used for the inspection of infectious disease pathogens, but all of them are expensive, require specialized knowledge and skill in handling, and take time to obtain results. Therefore, there is a problem that the apparatus is large and large and cannot be carried, and is not suitable for on-site measurement. In addition, there is a problem that it is unsuitable for use under dry conditions.
また上述の通り、ＳＰＲ法用センサーチップを用いたバイオセンシングについて多くの提案がなされているにも関わらず、たとえば１つの検体と１つの流路のみによって検出可能なセンサーチップなど、複数の感染症病原体を一斉に、効率よく検出できるセンサーチップは未だに存在しない。 In addition, as described above, in spite of many proposals for biosensing using a sensor chip for SPR method, a plurality of infectious diseases such as a sensor chip that can be detected only by one specimen and one flow path. There is no sensor chip that can detect pathogens simultaneously and efficiently.
同じく特許文献２のように、自己組織化膜の構造を改良した提案はあるものの、自己組織化膜以外の部分における非特異吸着を制御、防止する技術は、未だに提案されていない。
Similarly, there is a proposal for improving the structure of the self-assembled film as in
さらに、感染症病原体を検出するためのセンサーチップは乾燥に弱く、容易に失活しやすいことから、従来は水溶液での保管が必要であり、煩雑、不便、非効率的であった。 Furthermore, since a sensor chip for detecting an infectious disease pathogen is vulnerable to drying and easily deactivated, it has conventionally been required to be stored in an aqueous solution, which is cumbersome, inconvenient, and inefficient.
一方、たとえばインフルエンザ検査用としては、インフルエンザ簡易迅速診断キットがある。しかし、判定可能な種類はＡ型／Ｂ型の判別に留まり、亜型の特定は不可能であり、実用性や能力には限界がある。 On the other hand, for influenza testing, for example, there is a simple influenza rapid diagnostic kit. However, the types that can be determined are limited to discrimination between A type and B type, the subtype cannot be specified, and there is a limit to practicality and ability.
本発明の課題は、このような従来の問題点を解決するために、持ち運び可能で現場でのリアルタイムな測定が可能であるＳＰＲ検出装置を用いて、このような装置に用いるための、微小領域におけるセンシングに適し、高感度で作製方法が簡便であり、かつ乾燥下でも使用が可能な、感染症病原体その他の抗原検出用センサーチップとその作製方法を提供することである。また、持ち運び可能で現場でのリアルタイムな測定が可能であるＳＰＲ検出装置および当該センサーチップにより構成される抗原検出用センサーを提供することである。 An object of the present invention is to solve such a conventional problem by using an SPR detection device that is portable and capable of real-time measurement in the field, and is used in such a device. It is intended to provide a sensor chip for detecting an infectious disease pathogen and other antigens, and a method for producing the same, which is suitable for sensing in Japan, has a high sensitivity, a simple production method, and can be used even under dry conditions. It is another object of the present invention to provide an SPR detection device that can be carried and can be measured in real time on the spot, and an antigen detection sensor constituted by the sensor chip.
また本発明の課題は、たとえば１つの検体と１つの流路のみによって行える等、複数の感染症病原体等の抗原を一斉に効率的に検出可能な、抗原検出用センサーチップ、その作製方法および抗原検出用センサーを提供することである。 In addition, an object of the present invention is to provide an antigen detection sensor chip, a method for producing the same, and an antigen capable of efficiently detecting antigens such as a plurality of infectious disease pathogens at the same time, for example, by using only one specimen and one channel. It is to provide a sensor for detection.
また本発明の課題は、自己組織化膜以外の部分における非特異吸着を制御可能な、抗原検出用センサーチップ、その作製方法および抗原検出用センサーを提供することである。 Another object of the present invention is to provide an antigen detection sensor chip, a method for producing the same, and an antigen detection sensor capable of controlling non-specific adsorption in portions other than the self-assembled film.
本願発明者が上記課題を解決するために検討した結果、本発明に至った。すなわち本願において特許請求される発明、もしくは少なくとも開示される発明は次のとおりである。
（１） 基板と、該基板上に設けられた抗体固定化サイトとを備えてなる抗原検出用センサーチップであって、該抗体固定化サイトは、該基板上に設けられた金属膜と、該金属膜上に設けられた自己組織化膜と、該自己組織化膜上に設けられた抗体とからなり、該抗体固定化サイトには該抗体の立体構造を保持可能ならしめる保水膜が設けられている、抗原検出用センサーチップ。
（２） 前記保水膜には保水性のある糖類が用いられることを特徴とする（１）に記載の抗原検出用センサーチップ。
（３） 前記抗体固定化サイトは二以上設けられ、各抗体固定化サイトに固定化された抗体はそれぞれ異なることを特徴とする、（１）または（２）に記載の抗原検出用センサーチップ。
（４） 検出対象の抗原は病原体であり、かつウイルス、バクテリアまたは抗原タンパクのいずれかであることを特徴とする、（１）ないし（３）のいずれかに記載の抗原検出用センサーチップ。
（５） 検出対象の抗原はインフルエンザウイルスであり、前記抗体はインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に対する抗体であることを特徴とする、（１）ないし（４）のいずれかに記載の抗原検出用センサーチップ。
（６） （１）ないし（５）のいずれかに記載の抗原検出用センサーチップをセット可能な、抗原検出用センサー。
（７） 基板上に抗体固定化サイトを形成して抗原検出用センサーチップを作製する方法であって、該基板上に必要な該抗体固定化サイトの数に基づき金属膜を形成し、その上に自己組織化膜を形成し、その上に予め活性化させた抗体溶液を用いて抗体を固定化し、一方該基板上において該抗体が固定化されていない未修飾サイトに保水性物質による保水膜を設ける、抗原検出用センサーチップの作製方法。
As a result of studies by the inventor of the present application in order to solve the above problems, the present invention has been achieved. That is, the invention claimed or at least disclosed in the present application is as follows.
(1) An antigen detection sensor chip comprising a substrate and an antibody immobilization site provided on the substrate, wherein the antibody immobilization site comprises a metal film provided on the substrate, It consists of a self-assembled film provided on a metal film and an antibody provided on the self-assembled film, and a water-retaining film is provided at the antibody immobilization site so that the three-dimensional structure of the antibody can be retained. An antigen detection sensor chip.
(2) The antigen detection sensor chip according to (1), wherein a saccharide having water retention is used for the water retention film.
(3) The antigen detection sensor chip according to (1) or (2), wherein two or more antibody immobilization sites are provided, and the antibodies immobilized on each antibody immobilization site are different from each other.
(4) The antigen detection sensor chip according to any one of (1) to (3), wherein the antigen to be detected is a pathogen and is any one of a virus, a bacterium, and an antigen protein.
(5) The antigen detection sensor according to any one of (1) to (4), wherein the antigen to be detected is an influenza virus, and the antibody is an antibody against hemagglutinin (HA) of the influenza virus. Chip.
(6) An antigen detection sensor capable of setting the antigen detection sensor chip according to any one of (1) to (5).
(7) A method for producing a sensor chip for antigen detection by forming antibody immobilization sites on a substrate, wherein a metal film is formed on the substrate based on the number of antibody immobilization sites required, A self-assembled film is formed on the substrate, and the antibody is immobilized thereon using a previously activated antibody solution. On the other hand, a water-retaining film made of a water-retaining substance on an unmodified site where the antibody is not immobilized on the substrate A method for producing a sensor chip for antigen detection.
つまり本発明は、下記のような特徴を備えた抗原検出用センサーチップを提供することができる。
〈１〉抗体および糖鎖類を用いることで特異的にウイルス、バクテリア、抗原タンパクを検出できるマルチチャンネル型センサーチップ。
〈２〉１つの検体と１つの流路で複数の感染症病原体に対して一斉に検査を行えるマルチチャンネル型センサーチップ。
〈３〉鋳型とパターニングされた金基板を用いた作製方法と活性化試薬の最適化により、作製時間が短く、クリーンベンチや超純水などを用いなくても簡易に作製可能なセンサーチップ。
〈４〉新たなブロッキング剤と使用条件の最適化により良好なブロッキングとバックグランドの低下が可能で、抗原抗体反応における非特異吸着の防止を可能にしたセンサーチップ。
〈５〉保水膜の導入により気相中において抗体の乾燥による失活を防ぐことのできるセンサーチップ。
〈６〉基板上の未修飾サイトに保水性のある糖類等を吸着させることにより乾燥条件下での使用を可能としたセンサーチップ。
〈７〉圧電素子等を有するノズルを用いて作製することで、微量の抗体の固定化が可能なセンサーチップ。
That is, the present invention can provide an antigen detection sensor chip having the following characteristics.
<1> A multi-channel sensor chip that can specifically detect viruses, bacteria, and antigen proteins by using antibodies and sugar chains.
<2> A multi-channel sensor chip that can simultaneously test a plurality of infectious disease pathogens with one specimen and one flow path.
<3> A sensor chip that can be easily manufactured without using a clean bench or ultrapure water by optimizing a manufacturing method using a template and a patterned gold substrate and an activation reagent.
<4> A sensor chip that is capable of good blocking and lowering the background by optimizing a new blocking agent and use conditions, and preventing nonspecific adsorption in an antigen-antibody reaction.
<5> A sensor chip capable of preventing inactivation due to drying of the antibody in the gas phase by introducing a water retaining film.
<6> A sensor chip that can be used under dry conditions by adsorbing water-retaining saccharides or the like on unmodified sites on the substrate.
<7> A sensor chip capable of immobilizing a small amount of antibody by using a nozzle having a piezoelectric element or the like.
本発明の抗原検出用センサーチップ、その作製方法および抗原検出用センサーは上述のように構成されるため、これらによれば種々の効果がある。まず、本発明の抗原検出用センサーチップによれば、持ち運び可能で現場でのリアルタイムな測定が可能であるＳＰＲ検出装置（抗原検出用センサー）に使用することができ、微小領域におけるセンシングも容易に可能、しかも反応特性が正確であり、高感度である。また、作製方法も簡便である。さらに、乾燥下でも使用可能である。 Since the antigen detection sensor chip, the production method thereof and the antigen detection sensor of the present invention are configured as described above, they have various effects. First, according to the sensor chip for antigen detection of the present invention, it can be used in an SPR detection device (antigen detection sensor) that can be carried and can be measured in real time in the field, and sensing in a minute region is also easy. Possible, yet accurate reaction characteristics and high sensitivity. Moreover, the manufacturing method is also simple. Further, it can be used under dry conditions.
また、本発明の抗原検出用センサーチップによれば、たとえばマルチチャンネル型とすることによって、あるいは１つの検体と１つの流路のみによって検出作業を行える等の構成によって、複数の感染症病原体等の抗原を一斉に効率的に検出することが可能であり、感染症の場合はその迅速な診断、治療に貢献できる。また、自己組織化膜以外の部分における非特異吸着を低減ないしは防止することができ、一層高感度検出が可能である。 In addition, according to the antigen detection sensor chip of the present invention, a plurality of infectious disease pathogens and the like can be obtained by adopting a multi-channel type, for example, or a configuration in which a detection operation can be performed with only one specimen and one flow path. It is possible to detect antigens simultaneously and efficiently, and in the case of infectious diseases, it can contribute to rapid diagnosis and treatment. In addition, nonspecific adsorption at portions other than the self-assembled film can be reduced or prevented, and detection with higher sensitivity is possible.
また、本発明の抗原検出用センサーチップは、微量の抗体の固定化と活性化試薬の最適化により作製時間を短くできることから低コストに作製できる。また、本発明の抗原検出用センサーは、持ち運び可能で現場でのリアルタイムな、かつ詳細な測定が可能である。特に、センサーチップにレンズを形成した場合には、センサーチップをセンサー本体にセットする操作は一層簡便になる。 In addition, the sensor chip for antigen detection of the present invention can be produced at low cost because the production time can be shortened by immobilizing a small amount of antibody and optimizing the activation reagent. Further, the antigen detection sensor of the present invention is portable and can be measured in real time and in detail on site. In particular, when a lens is formed on the sensor chip, the operation of setting the sensor chip on the sensor body is further simplified.
また本発明によれば、検出対象の抗原に対する抗体を一または複数固定することで、用途に合わせてセンサーチップを作製、提供することが容易にできる。もちろん感染症のウイルス等病原体だけではなく、たとえば食品や畜産といった分野における用途にも対応可能である。 In addition, according to the present invention, it is possible to easily produce and provide a sensor chip according to the application by immobilizing one or a plurality of antibodies against the antigen to be detected. Of course, it can be applied not only to pathogens such as infectious viruses but also to applications in fields such as food and livestock.
殊にインフルエンザウイルスの場合は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に対する抗体を用いることで選択性を持たせ、インフルエンザの亜型を簡易かつ迅速に識別することが可能であり、適切な診断と治療が可能となる。 In particular, in the case of influenza virus, it is possible to provide selectivity by using an antibody against hemagglutinin (HA) of influenza virus, and to easily and quickly identify influenza subtypes. It becomes possible.
本発明について、より詳細に説明する。
まず、本発明のセンサーチップを用いる測定方であるＳＰＲ法について簡単に説明する。
プリズム上に形成した金属薄膜に光を全反射角以上の角度で入射させると、ある角度で反射光が著しく減少する。この角度は、金属薄膜表面近傍の媒質の屈折率に依存する。そこで金属薄膜上に抗体を固定した状態にすると、抗原が抗体に吸着されるに従い共鳴角度（反射光が著しく減少する角度）が変化する。それに基づき抗原の有無を検出する、というものである。
The present invention will be described in more detail.
First, the SPR method, which is a measurement method using the sensor chip of the present invention, will be briefly described.
When light is incident on the metal thin film formed on the prism at an angle greater than the total reflection angle, the reflected light is remarkably reduced at a certain angle. This angle depends on the refractive index of the medium near the surface of the metal thin film. Therefore, when the antibody is immobilized on the metal thin film, the resonance angle (the angle at which the reflected light is significantly reduced) changes as the antigen is adsorbed to the antibody. Based on this, the presence or absence of an antigen is detected.
図１は、本発明の抗原検出用センサーチップ（以下、単に「センサーチップ」ともいう。）の基本構成を示す断面説明図である。図示するように本センサーチップは、基板１と、基板１上に設けられた抗体固定化サイトとを備えてなる抗原検出用センサーチップであって、抗体固定化サイトは、基板１上に設けられた金属膜２と、金属膜２上に設けられた自己組織化膜３と、自己組織化膜３上に設けられた抗体４、５等とから、基本的に構成される。
FIG. 1 is a cross-sectional explanatory view showing a basic configuration of an antigen detection sensor chip (hereinafter also simply referred to as “sensor chip”) of the present invention. As shown in the figure, this sensor chip is an antigen detection sensor chip including a
抗体固定化サイトは二以上設けられ、各抗体固定化サイトに固定化された抗体４、５等はそれぞれ異なったものとすることができる。特に、抗体固定化サイトは三以上設けることとして、一つはブランク用（たとえば４）、残りは検出対象である特定の抗原の抗体（たとえば５、６等）とすることもできる。
Two or more antibody immobilization sites are provided, and the
金属膜２上で抗体４、５等が固定化されていないサイトのブロッキングのため、ＤＬＣ（ダイアモンド・ライク・カーボン）によるコーティングを行うこととしてもよい。また、図示しないが、基板２の下側には、表面プラズモン共鳴角検出のための測定用のレンズを設けた構成としてもよい。本発明のセンサーチップは、いわばバッチタイプであるが、センサーチップをレンズ一体型とすることで、センサーチップを抗原検出用センサーにセットして検出、測定を行う際の操作性を、格段に向上させることができる。
Coating with DLC (Diamond Like Carbon) may be performed to block sites on the
本発明の抗原検出用センサーチップは、病原体、ウイルス、バクテリア、抗原タンパクその他に広く適用でき、検出対象抗原を限定するものではない。実施例に詳述するようにインフルエンザウイルスを検出対象の抗原とする場合、抗体はインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に対する抗体とすることができる。 The sensor chip for antigen detection of the present invention can be widely applied to pathogens, viruses, bacteria, antigen proteins, and the like, and does not limit the antigen to be detected. As described in detail in the Examples, when influenza virus is used as the antigen to be detected, the antibody can be an antibody against hemagglutinin (HA) of influenza virus.
このように、センサーチップを構成するガラス基板の上面には、金または銀等の金属薄膜が形成される。これは、任意の膜厚（５〜５０ｎｍ）で形成される。たとえば金属薄膜部分は、φ２ｎｍ以下のドットつまり微粒子であり、数ｎｍ程度の大きさでもよい。１枚の基板上に、少なくとも２箇所以上の金属薄膜部分を備え、かつ図１により説明した構成を備えることによって、複数種類の抗原を同時に検出可能なマルチチャンネル型センサーチップとすることができる。 Thus, a metal thin film such as gold or silver is formed on the upper surface of the glass substrate constituting the sensor chip. This is formed with an arbitrary film thickness (5 to 50 nm). For example, the metal thin film portion is a dot of φ2 nm or less, that is, a fine particle, and may be about several nm in size. By providing at least two metal thin film portions on one substrate and having the configuration described with reference to FIG. 1, a multichannel sensor chip capable of simultaneously detecting a plurality of types of antigens can be obtained.
特にインフルエンザウイルス検出用のマルチチャンネル型センサーチップの場合、その型別（Ａ、Ｂ、Ｃ）または亜型別（Ｈ１〜Ｈ１６）のチャンネルを同一基板上に設けることによって、インフルエンザの詳細分析を一斉に行なうことができる。また、センシングのチャンネルには、感染症を検知し得る抗体、たとえば、各種インフルエンザ、ノロウイルス、結核菌、ＭＲＳＡなどの多種の抗体を固定化が可能であり、検出の対象物が異なるセンサーチップを提供することができる。 In particular, in the case of a multi-channel sensor chip for detecting influenza virus, detailed analysis of influenza is performed simultaneously by providing channels (A, B, C) or subtypes (H1 to H16) on the same substrate. Can be done. In addition, antibodies that can detect infectious diseases, for example, various antibodies such as various influenza, norovirus, tuberculosis, MRSA, etc. can be immobilized on the sensing channel, and sensor chips with different detection targets are provided. can do.
ガラス基板上の金属薄膜は蒸着法、または規則的に金ナノ粒子を配列させる方法で形成することができる。後者は金属ナノ粒子の量子サイズ効果により、数百倍〜数千倍にセンサーチップの感度を向上させる。 The metal thin film on the glass substrate can be formed by a vapor deposition method or a method of regularly arranging gold nanoparticles. The latter improves the sensitivity of the sensor chip several hundred times to several thousand times due to the quantum size effect of the metal nanoparticles.
以下の各説明は最良の実施形態の一つであり、本発明がこれらに限定されるものではない。金属薄膜上に反応物質つまり抗体を結合するために、まず、自己組織化膜（以下、ＳＡＭという）を形成する。ＳＡＭの形成に使用する化合物はチオール分子が適しており、好ましくはカルボキシル基またはアミノ基を有するチオール化合物がよい。ＳＡＭ形成条件はチオール化合物０．００１〜１．０Ｍの濃度で使用することが好ましい。 Each of the following descriptions is one of the best embodiments, and the present invention is not limited to these. In order to bind a reactive substance, that is, an antibody on a metal thin film, first, a self-assembled film (hereinafter referred to as SAM) is formed. The compound used for the formation of SAM is preferably a thiol molecule, and preferably a thiol compound having a carboxyl group or an amino group. SAM formation conditions are preferably used at a concentration of 0.001 to 1.0 M thiol compound.
ＳＡＭ上に結合する抗体の活性化を行なう。固定化する抗体と１−エチル３−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸基（以下、ＥＤＣという）０．２Ｍ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）０．０５Ｍを１時間室温で転倒混和する。抗体の末端カルボキシル基または末端アミノ基は活性化され、ＳＡＭに配列しているカルボキシル基またはアミノ基と化学結合する。 Activation of antibody binding on SAM is performed. The antibody to be immobilized, 0.2 M of 1-ethyl-3--3-dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride (hereinafter referred to as EDC) and 0.05 M of N-hydroxysuccinimide (NHS) are mixed by inversion at room temperature for 1 hour. The terminal carboxyl group or terminal amino group of the antibody is activated and chemically bound to the carboxyl group or amino group arranged in the SAM.
ここで使用する抗体は、基準としてラットのノーマルなＩｇＧを固定化する。センシングのチャンネルには、感染症を検知し得る抗体、たとえば、各種インフルエンザ、ノロウイルス、結核菌、ＭＲＳＡなどの多種の抗体を固定化できる。特にインフルエンザにおいては各種型別（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）の亜型別（Ｈ１〜Ｈ１６）チャンネルを設けることにより、インフルエンザウイルスの詳細な情報を一挙に得ることができる。さらに、固定化する抗体としては、感染症のみならず食品、畜産関係に追随するものも使用可能である。 The antibody used here immobilizes rat normal IgG as a reference. An antibody capable of detecting an infectious disease, for example, various antibodies such as various influenza, norovirus, tubercle bacilli and MRSA can be immobilized on the sensing channel. In particular, in influenza, detailed information on influenza viruses can be obtained at once by providing channels (H, H16) of various types (A, B, C) and subtypes of hemagglutinin (HA). Furthermore, as an antibody to be immobilized, not only an infectious disease but also an antibody that follows food and livestock relations can be used.
活性化した抗体を金属薄膜上のＳＡＭに滴下し、２時間室温で反応させる。その後、未反応の抗体を洗浄し、グリシンまたはエタノールアミンでＳＡＭ上の未反応末端カルボキシル基または末端アミノ基を不活性化させる。グリシンを用いる際はＥＤＣとＮＨＳで活性化することが好ましい。 The activated antibody is dropped onto the SAM on the metal thin film and reacted at room temperature for 2 hours. Thereafter, the unreacted antibody is washed, and the unreacted terminal carboxyl group or terminal amino group on the SAM is inactivated with glycine or ethanolamine. When glycine is used, it is preferably activated with EDC and NHS.
抗体の固定化されていない金属基板上のサイトすなわち未修飾サイトを乳タンパク質から調製したブロッキング剤によりブロッキングし、抗原抗体反応における非特異吸着を防ぐことができる。なお、未修飾サイトのブロッキング剤として従来用いられている牛血清アルブミンやスキムミルクは処理が面倒であるが、ＤＬＣコートを用いればより便利である。 The site on the metal substrate on which the antibody is not immobilized, that is, the unmodified site can be blocked with a blocking agent prepared from milk protein to prevent nonspecific adsorption in the antigen-antibody reaction. Although bovine serum albumin and skim milk conventionally used as blocking agents for unmodified sites are troublesome, it is more convenient to use a DLC coat.
保水膜の導入と形態
前述の方法で作製したセンサーチップは、４℃、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｌｉｎｅ）中で保存し、乾燥を避ける。しかしながら本発明では、このセンサーチップに保水膜を導入することによって、従来の乾燥に弱いという弱点を克服することができる。
Introduction and form of water-retaining film The sensor chip produced by the above-mentioned method is stored in PBS (phosphate-buffered salline) at 4 ° C. to avoid drying. However, in the present invention, by introducing a water retaining film into the sensor chip, the conventional weakness of being vulnerable to drying can be overcome.
図２は、保水膜を導入した本発明の抗原検出用センサーチップの基本構成を示す断面説明図である。図示するように本センサーチップは、基板１と、該基板１上に設けられた抗体固定化サイトとを備えてなり、該抗体固定化サイトは、該基板１上に設けられた金属膜と、該金属膜上に設けられた自己組織化膜と、該自己組織化膜上に設けられた抗体４、５等とからなり、該抗体固定化サイトには該抗体の立体構造を保持可能ならしめる保水膜８が設けられていることを、主たる構成とする。図中、一つの抗体に符号４、５、６を付しているのは、同一の図形で示される抗体はそれぞれ相違してもよいことを示すものである。
FIG. 2 is an explanatory cross-sectional view showing the basic configuration of the antigen detection sensor chip of the present invention in which a water retention film is introduced. As shown in the figure, this sensor chip comprises a
かかる構成により、水分子７が保水膜によって抗体４、５等の間に保持されて、抗体４、５等は立体構造を保つことができるため、その機能を維持することができる。つまり、保水性のある糖類の分子が水分子を周りに強く引き付け、分子集合体を形成し、抗体周辺に保水膜が形成される。これにより、存在する水分子が抗体を水和により安定化し、失活を防ぎ、乾燥条件下での使用が可能となる。また、凍結乾燥法での保存も実施できる。
With this configuration, the
保水膜８としては、保水性のある糖類を用いることができる。つまり保水膜８は、基板の未修飾サイトもしくはアミンチオールの未反応部分に水分子を直接結合可能な糖類、または保水性のある糖類を結合させて、設けることができる。保水性のある糖類としては、たとえば、トレハロースなどの保水能力が高いものを好適に用いることができる。
As the
保水膜導入の効果としては、センサーチップ保存方法の簡便化の他に、大気中での使用が可能となることも挙げられる。これにより、大気中の病原体のセンシングも行うことができる。 As an effect of introducing the water-holding film, in addition to simplifying the sensor chip storage method, it can be used in the atmosphere. Thereby, the sensing of the pathogen in air | atmosphere can also be performed.
抗体の固定化操作方法
抗体の固定化操作としては、圧電素子等を有するノズルを用いて、数ｐＬ〜数μＬの液滴を基板上に塗布し、その後、光を照射することにより、短時間でアナライトもしくはリガンドとなる抗体等の固定が成される。ノズルを複数同時に使用すれば一度に複数種の抗体等を、任意のパターンで規則正しく、かつ、等間隔で固定化することが可能である。
Antibody Immobilization Operation Method An antibody immobilization operation is performed for a short time by applying a droplet of several pL to several μL on a substrate using a nozzle having a piezoelectric element or the like and then irradiating light. The immobilization of an antibody or the like as an analyte or a ligand is performed. If a plurality of nozzles are used at the same time, it is possible to fix a plurality of types of antibodies, etc. at regular intervals in an arbitrary pattern at regular intervals.
センサーチップの抗原抗体反応の測定（評価方法）
前述の方法で作製したセンサーチップ上の抗体量および反応性評価は、落射型蛍光顕微鏡を用いて測定できる。検出目的の抗体をＦＩＴＣ標識抗体と反応させ、５２５ｎｍの蛍光を観察する。蛍光強度、分布などから抗体の定性定量を行うことができる。また、蛍光基質（たとえば、市販品のＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ）を利用して、レゾルフィンの検出による蛍光評価を行うことができる。レゾルフィンは非常に強い蛍光を発するため、検出感度が高く、ＦＩＴＣを使用した際に見られる退色が生じにくい。これらの評価方法はバッチ式で確認でき、専用のセルやフロー用シリンジポンプ等を必要としない。
Measurement of antigen-antibody reaction of sensor chip (evaluation method)
The antibody amount and reactivity evaluation on the sensor chip produced by the above-described method can be measured using an epi-illumination type fluorescence microscope. An antibody to be detected is reacted with a FITC-labeled antibody, and fluorescence at 525 nm is observed. Qualitative quantification of antibodies can be performed from fluorescence intensity, distribution, and the like. Moreover, fluorescence evaluation by detection of resorufin can be performed using a fluorescent substrate (for example, commercially available Amplex Red). Since resorufin emits very strong fluorescence, the detection sensitivity is high and the fading seen when using FITC is less likely to occur. These evaluation methods can be confirmed by a batch method and do not require a dedicated cell or a syringe pump for flow.
図３は、３チャンネルのセンサーチップを各チャンネル毎に切断し専用セルに入れ、蛍光基質（Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ）０．０５ｍＭ、Ｈ２Ｏ２１ｍＭを同量添加して測定した固定化評価結果の一例を示すグラフである。また、
図４は、３チャンネルのセンサーチップとＨ１Ｎ１抗原を反応させ、反応後の未反応抗体を蛍光基質（Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ）で検出し測定した活性化評価結果の一例を示すグラフである。
FIG. 3 shows an example of immobilization evaluation results obtained by cutting a 3-channel sensor chip for each channel and placing it in a dedicated cell, and adding and measuring the same amount of fluorescent substrate (Amplex Red) 0.05 mM and H 2 O 2 1 mM. It is a graph which shows. Also,
FIG. 4 is a graph showing an example of an activation evaluation result obtained by reacting a 3-channel sensor chip with an H1N1 antigen, and detecting and measuring the unreacted antibody after the reaction with a fluorescent substrate (Amplex Red).
本発明の抗原検出用センサーチップは、ＳＰＲ法用の特定な装置で使用する以外にも、センサーチップに発色する試薬を直接塗布することにより簡易判断することも可能である。また、対象物を増やすことにより単体あるいは多種の抗体を目的・コストに応じて選択できることから、応用範囲は広範である。もちろん、上述したように、病原体検出用途のみならず、食品や畜産分野など他分野における抗原検出にも用いることができる。したがって、産業上利用性が極めて高い発明である。 In addition to using the antigen detection sensor chip of the present invention in a specific apparatus for the SPR method, it is also possible to make a simple determination by directly applying a color developing reagent to the sensor chip. In addition, since a single substance or various kinds of antibodies can be selected according to the purpose and cost by increasing the number of objects, the application range is wide. Of course, as described above, it can be used not only for pathogen detection purposes but also for antigen detection in other fields such as food and livestock fields. Therefore, it is an invention with extremely high industrial applicability.
１…基板
２…金属膜
３…自己組織化膜
４、５、６…抗体
７…水分子
８…保水性のある糖類による保水膜
DESCRIPTION OF
Claims (7)
A method for producing a sensor chip for antigen detection by forming an antibody immobilization site on a substrate, wherein a metal film is formed on the substrate based on the number of the antibody immobilization sites required, and self-organization is formed thereon Forming a membrane and immobilizing the antibody using a pre-activated antibody solution thereon, while providing a water-retaining membrane with a water-retaining substance on an unmodified site where the antibody is not immobilized on the substrate; A method for producing a sensor chip for antigen detection.
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