JP2008216237A - Immunodiagnostic drug with reduced nonspecific reaction - Google Patents
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Abstract
Description
この発明は、測定検体試料を、抗原又は抗体固相化磁性体含有微粒子を免疫測定試薬として使用して免疫測定する場合に、非磁性微粒子を共存させることにより、非特異的に磁性体含有微粒子表面に結合する物質の結合を低減させ、その結果として非特異反応を低減させることのできる、免疫測定試薬並びにその測定法に関する。 The present invention provides a non-specifically magnetic substance-containing fine particle by allowing a non-magnetic fine particle to coexist when an immunoassay is performed using an antigen or antibody-immobilized magnetic substance-containing fine particle as an immunoassay reagent. The present invention relates to an immunoassay reagent capable of reducing the binding of a substance that binds to a surface and, as a result, reducing a nonspecific reaction, and a measurement method thereof.
磁性微粒子を利用した免疫学的に抗原または抗体を測定する測定方法は、サンプル中の目的物質と特異的に反応する抗体または抗原を固相化した固相化磁性微粒子を用意し、該固相化微粒子を検体中の目的物質と抗原抗体反応させた後、B/F分離、洗浄を経た後に、該目的物質と特異的に反応する標識された抗原・抗体などを反応させ、適宜、当該標識を利用した発光等を検出して、目的物質を測定する方法である。磁性微粒子を利用した免疫学的測定は、全自動化に適しており、ごく最近では、大量の検体を扱えるように、これらの操作が自動化された測定機器を利用してなされている。 A measurement method for immunologically measuring an antigen or antibody using magnetic microparticles is to prepare solid-phase magnetic microparticles on which an antibody or antigen that specifically reacts with a target substance in a sample is immobilized. After subjecting the activated microparticles to an antigen-antibody reaction with the target substance in the sample, B / F separation, washing, and then reacting with a labeled antigen / antibody that specifically reacts with the target substance, This is a method for measuring a target substance by detecting luminescence or the like by using the. Immunological measurement using magnetic microparticles is suitable for full automation, and very recently, these operations have been performed using automated measuring instruments so that a large amount of specimens can be handled.
免疫学的測定法における偽陽性シグナルの存在は古くから知られ、その原因として、標識物質と特異的に反応する、検体中の非目的物質の固相表面への非特異的な結合が知られている。従来は、固相表面を蛋白質やポリマーなどのオーバーコート物質で覆うなどの方策が採られていたが、十分とは言えなかった。
血液、血清、血漿などのヒト検体中の抗原特異的に反応するヒト免疫グロブリンを測定することは、抗原であるウイルス、感染性細菌・原虫あるいは寄生性生物などによる感染の有無を判定する意味から非常に重要となっている。こうした抗原特異的に反応するヒト免疫グロブリンの測定において、陰性と判定されるべき検体が、誤って陽性と判定される（以下、「偽陽性」）ことは、大きな問題となる。例えば、HIV抗体の検査では、このような偽陽性の結果は人道上の問題とも直結することにもなりかねない。また、輸血用血液などのスクリーニングなどでは、誤って貴重な血液を廃棄することとなり重大な損失といった問題となる。
The existence of false positive signals in immunoassay has been known for a long time, and the cause is known to be nonspecific binding of non-target substances in the sample to the solid phase surface, which reacts specifically with the labeling substance. ing. Conventionally, measures such as covering the solid surface with an overcoat substance such as a protein or a polymer have been taken, but it has not been sufficient.
Measuring human immunoglobulins that react specifically with antigens in human specimens such as blood, serum, plasma, etc., from the meaning of determining the presence or absence of infection by antigen viruses, infectious bacteria / protozoa, or parasitic organisms It has become very important. In the measurement of such human immunoglobulin that reacts specifically with an antigen, it is a serious problem that a sample to be determined as negative is erroneously determined as positive (hereinafter, “false positive”). For example, in HIV antibody testing, these false positive results can also be directly linked to humanitarian problems. In screening of blood for blood transfusion and the like, valuable blood is accidentally discarded, resulting in a serious loss.
梅毒は、病原性スピロヘーターの一種であるTreponema pallidum (TP)の感染によって引き起こされる全身性の性感染症である。梅毒感染を疑う場合には、通常、血清学的検査法として、TP菌体成分を抗原に用いたTP抗体測定法などを行うのが一般的で、抗原としてもリコンビナントタンパク質を使用することが行われる〔特許文献１:米国特許第6,479,248号明細書〕。
TP抗体測定法としては、Treponema pallidum hemagglutination (TPHA), Treponema pallidum particle agglutination(TPPA), Chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA), Fluorescent treponemal antibody absorpton (FTA-ABS)などが知られている。そして、全自動化化学発光免疫測定装置を利用した試薬並びに方法もなされている〔非特許文献１:Prog. Med., 25: pp.1424-1427 (2005)、非特許文献２:医学と薬学（別刷）、53(5), pp.649-654 (2005)〕
Syphilis is a systemic sexually transmitted disease caused by infection with Treponema pallidum (TP), a type of pathogenic spirocheter. When syphilis infection is suspected, TP antibody measurement method using TP cell component as antigen is generally performed as serological test, and recombinant protein is also used as antigen. [Patent Document 1: US Pat. No. 6,479,248].
Known methods for measuring TP antibodies include Treponema pallidum hemagglutination (TPHA), Treponema pallidum particle agglutination (TPPA), Chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA), Fluorescent treponemal antibody absorpton (FTA-ABS), and the like. Reagents and methods using a fully automated chemiluminescence immunoassay device have also been made [Non-patent document 1: Prog. Med., 25: pp. 1424-1427 (2005), Non-patent document 2: Medicine and pharmacy ( (Reprint), 53 (5), pp.649-654 (2005)]
PIVKA-II〔Protein Induced by Vitamin K Absence (ビタミンK欠乏により生じる異常プロトロンビン)〕は肝細胞癌との関連が高い血中蛋白質であり、肝細胞癌の診断補助として用いられている血中癌マーカーである。PIVKA-IIのプロトロンビンとの相違点が、Ｎ末端部位に認められるいくつかのグルタミン酸に付加したカルボキシル基の違いのみに存在し、またその相違部分が小さいことから、固相表面、標識に用いられる両抗体をともにPIKVA-II特異的なものにすることは難しく、固相表面にはPIVKA-IIに特異的な抗体を利用するが、標識抗体としては、PIVKA-II特異的ではないプロトロンビンに結合する抗体が用いられている。この測定系においては、標識抗プロトロンビン抗体がサンプル中のトロンビンまたはプロトロンビンとも反応してしまうことから、血液凝固の過程で発生した、トロンビン、またはその前駆体であるプロトロンビンの磁性固相微粒子表面への非特異的反応が、標識抗体との特異反応により極めて高い偽陽性シグナルを生じさせていた〔特許文献２：特許第2,702,616号明細書〕。
米国特許第5,856,182号明細書（特許文献３）では、Kuus-Reichel らは、マクロタイタープレート中におけるPSA〔Prostate specific antigen (前立腺特異抗原)〕-ACT（α1-アンチキモトリプシン）を検出する免疫測定で、微粒子を添加することにより非特異結合を減少させる方法を示している〔特許文献３：米国特許第5,856,182号明細書〕。当該特許文献３（米国特許第5,856,182号明細書）によれば、Kuus-Reichelらの方法に使用される固相体は、一つのビーズ、シリンダー、試験管の内側表面、ひとつの棒の外側表面、テストシートまたはテスト片といったものでありいずれも、微粒子に比較し非常に大きいものである。すなわち、微粒子を、一旦、反応中に添加した後に、微粒子を特異的固相表面から分離するのは、もっぱら、大きさの違いによってなされるのであり、それにより、結果として、微粒子中に結合した非特異物質を除去するといった方法である。
PIVKA-II (Protein Induced by Vitamin K Absence) is a blood protein that is highly associated with hepatocellular carcinoma and is used as a diagnostic aid for hepatocellular carcinoma. It is. PIVKA-II differs from prothrombin only in the difference of the carboxyl groups added to some glutamic acids found at the N-terminal site, and since the difference is small, it is used for solid surface and labeling. It is difficult to make both antibodies specific to PIKVA-II, and PIVKA-II-specific antibodies are used on the solid surface, but the labeled antibodies bind to prothrombin that is not PIVKA-II-specific. Antibodies are used. In this measurement system, the labeled anti-prothrombin antibody also reacts with thrombin or prothrombin in the sample, so that thrombin or its precursor prothrombin generated during the blood coagulation process on the surface of the magnetic solid phase fine particle The non-specific reaction produced an extremely high false positive signal due to the specific reaction with the labeled antibody [Patent Document 2: Patent No. 2,702,616].
In US Pat. No. 5,856,182 (Patent Document 3), Kuus-Reichel et al. Describe an immunoassay for detecting PSA [Prostate specific antigen] -ACT (α 1 -antichymotrypsin) in a macrotiter plate. Shows a method for reducing non-specific binding by adding fine particles [Patent Document 3: US Pat. No. 5,856,182]. According to Patent Document 3 (US Pat. No. 5,856,182), the solid phase used in the method of Kuus-Reichel et al. Is one bead, cylinder, inner surface of a test tube, outer surface of one rod. The test sheet or test piece is very large compared to the fine particles. That is, once the microparticles are added during the reaction, the microparticles are separated from the specific solid surface only by the difference in size, and as a result, bound to the microparticles. This is a method of removing non-specific substances.
上記したような免疫診断薬において、固相化磁性微粒子に対する非特異的な反応に起因して陰性と判定されるべき検体が、誤って陽性と判定される（以下、「偽陽性」）ことが知られており、この偽陽性を減少させるために、界面活性剤を反応中に添加したり、磁性微粒子に抗原固相化後タンパク質やポリマーをオーバーコートするなどの様々な手法が用いられてきたが、磁性微粒子表面への非特異的な結合に起因する偽陽性を減少させることには限界があった。これら偽陽性を減少させることは、測定が大量の検体を迅速処理する目的で自動化免疫測定装置を利用してなされるにつれ、ますます問題と成ってきており、これを解決すること、すなわち、少なくとも磁性微粒子表面に対する非特異的反応を減少させることが強く求められている。
前述したとおり免疫学的にPIVKA-II を測定する場合、プロトロンビンに対する抗体が、標識抗体として用いられるのだが、この標識抗体はプロトロンビンまたはトロンビンに特異的に結合してしまうため、血液サンプル中に多量に存在するプロトロンビン・トロンビンの一部が磁性微粒子表面に非特異的に結合してしまうことにより、偽陽性シグナルを生じさせていた。特に血清サンプル中に存在するトロンビンの非特異的な結合は深刻であり、この問題を回避するために、抗プロトロンビン抗体からトロンビンに反応する抗体を精製し除いた後に測定に使用される方法が使用されているが〔特許文献１：特許第2,702,616号明細書〕、極めて煩雑であるため、決して有効な方法とは言えなかった。
上記Kuus-Reichel の方法は、大きな固相物質にのみにしか適応することができないため、固相物質に微粒子を用いる方法は全自動化を考慮すると極めて有効な方法であるにも拘わらず、Kuus-Reichel の方法を微粒子を固相に用いた全自動測定に使用することはできなかった。
In the immunodiagnostics as described above, a sample that should be determined to be negative due to a non-specific reaction to the solid-phased magnetic microparticle may be erroneously determined to be positive (hereinafter, “false positive”). In order to reduce this false positive, various methods have been used such as adding a surfactant during the reaction or overcoating proteins or polymers after solidifying the antigen on magnetic particles. However, there is a limit to reducing false positives due to non-specific binding to the surface of the magnetic fine particles. Reducing these false positives has become an increasingly problematic problem as measurements are made using automated immunoassays for the purpose of expediting the processing of large volumes of specimens. There is a strong demand to reduce nonspecific reactions on the surface of magnetic fine particles.
As described above, when PIVKA-II is measured immunologically, an antibody against prothrombin is used as a labeled antibody, but this labeled antibody specifically binds to prothrombin or thrombin, so that a large amount in the blood sample. A part of prothrombin / thrombin existing in the membrane is non-specifically bound to the surface of the magnetic fine particles, thereby generating a false positive signal. In particular, the nonspecific binding of thrombin present in serum samples is serious, and in order to avoid this problem, the method used for the measurement after purifying and removing the antibody that reacts with thrombin from the anti-prothrombin antibody is used. [Patent Document 1: Japanese Patent No. 2,702,616], however, it is extremely complicated and cannot be said to be an effective method.
The Kuus-Reichel method described above can only be applied to large solid phase materials, so the method using microparticles for the solid phase material is extremely effective in consideration of full automation. Reichel's method could not be used for fully automated measurements using microparticles as the solid phase.
上記問題に鑑み、本発明者は、鋭意研究を進め、様々な検討を加えた結果、検体と抗原または抗体が固相化されており且つ磁性体を含む微粒子（例えば、ポリマー微粒子）とを抗原抗体反応させる場合に、該磁性体を含む微粒子の素材と同じ素材を有し（例えば、ポリマー微粒子と同じポリマーを用いて製造されており）または該微粒子の素材と類似の素材を有し（例えば、該ポリマー微粒子のポリマーと類似のポリマーを用いて製造されており）且つ磁性体を含まない微粒子（例えば、ポリマー粒子）を共存させると、非特異的に磁性微粒子表面に結合する物質に起因する免疫診断薬の偽陽性を低減させることができることを見出すことに成功した。かくして、本発明者は、同じ微粒子でありながらも、抗原や抗体を固相化する微粒子には磁性微粒子を用い、非特異物質を取り除くための粒子には非磁性微粒子を用いるという２つの異なる性質を有する微粒子を用いることによって非特異物質を除去する方法を完成させた。そして、当該方法は、Kuus−Reichelの方法とは異なることのみならず全自動測定装置に極めて適した優れた方法であることを認め、本発明を完成した。 In view of the above problems, the present inventor has conducted extensive research and made various studies. As a result, the specimen and the fine particles (for example, polymer fine particles) in which the antigen or antibody is solid-phased and containing a magnetic substance are used as the antigen. When the antibody is reacted, it has the same material as the material of the fine particles containing the magnetic substance (for example, manufactured using the same polymer as the polymer fine particles) or has a material similar to the material of the fine particles (for example, Produced by using a polymer similar to the polymer of the polymer fine particles) and fine particles not containing a magnetic substance (for example, polymer particles) coexist with the substance that binds to the surface of the magnetic fine particles non-specifically. We have succeeded in finding that false positives of immunodiagnostic drugs can be reduced. Thus, the present inventor uses two different properties, that is, the same fine particles, but magnetic particles are used as the fine particles for solidifying the antigen or antibody, and nonmagnetic fine particles are used as the particles for removing non-specific substances. A method for removing non-specific substances was completed by using fine particles having sucrose. The present invention was completed by recognizing that this method is not only different from the Kuus-Reichel method but also an excellent method that is extremely suitable for a fully automatic measuring apparatus.
本発明は、以下を提供する。
〔１〕測定検体試料を、抗原又は抗体が固相化されており且つ磁性体を含む微粒子を含有する免疫測定試薬で処理する場合に、該磁性体を含む微粒子の表面素材と同じかまたは類似の素材表面を持ち且つ磁性体を含まない微粒子を、反応混合物中に共存させることを特徴とする免疫測定方法。
〔２〕固相微粒子が、ポリマーを用いて製造されているもので、免疫測定試薬が、抗原特異的に反応するヒト免疫グロブリン測定試薬であり、抗原が固相化されており且つ磁性体を含むポリマー微粒子を含有するもので、免疫測定方法が抗原特異的ヒト免疫グロブリン測定法であることを特徴とする上記〔１〕に記載の免疫測定方法。
〔３〕抗原が、HIV、HTLV-1、HCV、HBs抗原、HBc抗原、HBe抗原、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスI、水痘ヘルペス、麻疹、カンジダ、トキソプラズマ、マイコプラズマ、風疹、及び梅毒からなる群から選択されたものであることを特徴とする上記〔２〕に記載の免疫測定方法。
〔４〕抗原特異的ヒト免疫グロブリン測定法が、抗原固定化磁性微粒子と標識化抗ヒト免疫グロブリン抗体とを用いるサンドイッチ法であることを特徴とする上記〔２〕又は〔３〕に記載の免疫測定方法。
〔５〕検体が血清、又は血漿などの血液検体である上記〔２〕〜〔４〕のいずれか一に記載の記載の免疫測定方法。
〔６〕ヒト免疫グロブリンがヒトIgG及び／又はヒトIgMである上記〔２〕〜〔５〕のいずれか一に記載の記載の免疫測定方法。
〔７〕測定検体試料を、抗原が固相化されている磁性微粒子と、該磁性微粒子の構成ポリマーと同じポリマーまたは類似のポリマーを含み且つ磁性体を含まないポリマー微粒子の共存下、接触せしめる工程、磁石の影響下にB/F分離及び洗浄処理する工程、磁性微粒子固相に結合している抗原-ヒト免疫グロブリン複合体（コンプレックス）と標識化された抗ヒト免疫グロブリン抗体とを接触せしめる工程、磁石の影響下にB/F分離及び洗浄処理する工程、標識を指標に抗原特異的ヒト免疫グロブリンを定量する工程、
を含んでいることを特徴とする上記〔２〕に記載の免疫測定方法。
〔８〕測定検体試料を、抗原又は抗体が固相化されている磁性微粒子と、該磁性微粒子の表面素材と同じかまたは類似の素材表面を持ち且つ磁性体を含まない微粒子の共存下、接触せしめる工程、磁石の影響下にB/F分離及び洗浄処理する工程、磁性微粒子固相に結合している測定する物質-抗原又は抗体の結合物と標識化された抗体とを接触せしめる工程、磁石の影響下にB/F分離及び洗浄処理する工程、標識を指標に測定する物質を定量する工程、
を含んでいることを特徴とする上記〔１〕に記載の免疫測定方法。
〔９〕測定する物質が、血液凝固因子関連物質またはその分解物であることを特徴とする上記〔１〕又は〔８〕に記載の免疫測定方法。
〔10〕測定する物質が、PIVKA-IIであることを特徴とする上記〔１〕、〔８〕又は〔９〕に記載の免疫測定方法。
〔11〕微粒子表面がポリマー素材であることを特徴とする上記〔１〕及び〔８〕〜〔10〕のいずれか一に記載の免疫測定方法。
〔12〕少なくとも、(a)抗原または抗体が固相化されており且つ磁性体を含む微粒子、(b)該磁性体を含む微粒子の表面素材と同じかまたは類似の素材表面を持ち且つ磁性体を含まない微粒子、及び(c)標識化された抗体とからなることを特徴とする免疫測定試薬。
〔13〕固相微粒子がポリマーを用いて製造されているもので、微粒子の表面素材が当該ポリマーであることを特徴とする上記〔12〕に記載の免疫測定試薬。
〔14〕少なくとも、(a)抗原が固相化されている磁性微粒子、(b)該磁性微粒子の構成ポリマーと同じポリマーまたは類似のポリマーを含み且つ磁性体を含まないポリマー微粒子、及び(c)標識化された抗ヒト免疫グロブリン抗体とからなることを特徴とする上記〔12〕又は〔13〕に記載の免疫測定試薬。
The present invention provides the following.
[1] When a measurement specimen is treated with an immunoassay reagent in which an antigen or antibody is solid-phased and contains fine particles containing a magnetic substance, it is the same as or similar to the surface material of the fine particles containing the magnetic substance A method for immunoassay, characterized in that fine particles having a material surface and containing no magnetic substance are allowed to coexist in a reaction mixture.
[2] Solid phase microparticles are manufactured using a polymer, the immunoassay reagent is a human immunoglobulin measurement reagent that reacts specifically with an antigen, the antigen is immobilized, and a magnetic substance is used. The immunoassay method according to [1] above, wherein the immunoassay method is an antigen-specific human immunoglobulin assay method.
[3] From the group consisting of HIV, HTLV-1, HCV, HBs antigen, HBc antigen, HBe antigen, cytomegalovirus, herpes simplex I, chickenpox herpes, measles, Candida, toxoplasma, mycoplasma, rubella, and syphilis The immunoassay method according to [2] above, wherein the method is selected.
[4] The immunity described in [2] or [3] above, wherein the antigen-specific human immunoglobulin measurement method is a sandwich method using an antigen-immobilized magnetic microparticle and a labeled anti-human immunoglobulin antibody. Measuring method.
[5] The immunoassay method according to any one of [2] to [4], wherein the specimen is a blood specimen such as serum or plasma.
[6] The immunoassay method according to any one of [2] to [5], wherein the human immunoglobulin is human IgG and / or human IgM.
[7] A step of bringing a sample to be measured into contact in the presence of magnetic fine particles on which an antigen is immobilized and polymer fine particles containing the same polymer as the constituent polymer of the magnetic fine particles or a similar polymer and not containing a magnetic substance. , B / F separation and washing treatment under the influence of magnet, Step of contacting antigen-human immunoglobulin complex (complex) bound to magnetic fine particle solid phase with labeled anti-human immunoglobulin antibody , B / F separation and washing treatment under the influence of a magnet, quantifying antigen-specific human immunoglobulin using the label as an indicator,
The immunoassay method according to [2] above, comprising:
[8] A sample to be measured is contacted in the presence of a magnetic fine particle on which an antigen or antibody is solid-phased and a fine particle having the same or similar material surface as that of the magnetic fine particle and not containing a magnetic substance. A step of B / F separation and washing under the influence of a magnet, a step of contacting a labeled substance with a substance to be measured-antigen or antibody bound to a magnetic solid phase, and a magnet B / F separation and washing process under the influence of
The immunoassay method according to the above [1], comprising:
[9] The immunoassay method according to [1] or [8] above, wherein the substance to be measured is a blood coagulation factor-related substance or a degradation product thereof.
[10] The immunoassay method according to [1], [8] or [9] above, wherein the substance to be measured is PIVKA-II.
[11] The immunoassay method according to any one of [1] and [8] to [10], wherein the fine particle surface is a polymer material.
[12] At least (a) a fine particle on which an antigen or antibody is solid-phased and containing a magnetic material, (b) a magnetic material having the same or similar material surface as the surface material of the fine particle containing the magnetic material And (c) a labeled antibody. An immunoassay reagent comprising:
[13] The immunoassay reagent according to [12], wherein the solid phase microparticles are produced using a polymer, and the surface material of the microparticles is the polymer.
(14) at least (a) magnetic fine particles in which an antigen is solid-phased, (b) polymer fine particles containing the same polymer as the constituent polymer of the magnetic fine particles or a similar polymer and not containing a magnetic substance, and (c) The immunoassay reagent according to [12] or [13] above, which comprises a labeled anti-human immunoglobulin antibody.
本発明の技術で、抗体又は抗原固相化磁性微粒子を使用する免疫診断薬及び免疫測定法における、磁性微粒子（例えば、磁性ポリマー微粒子）に対する偽陽性の問題を減少せしめることができて、より信頼性の高い測定結果を得ることができ、より優れた免疫診断薬並びに測定法を提供できる。これらの免疫測定法は、全自動スクリーニングシステムの利用により、低コストで血液スクリーニングのような多数検体の検査にも応用可能である。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
The technology of the present invention can reduce the problem of false positive for magnetic fine particles (for example, magnetic polymer fine particles) in immunodiagnostic drugs and immunoassays using antibody or antigen-immobilized magnetic fine particles, and is more reliable. A highly reliable measurement result can be obtained, and a more excellent immunodiagnostic drug and measurement method can be provided. These immunoassays can be applied to the examination of a large number of specimens such as blood screening at low cost by using a fully automatic screening system.
Other objects, features, excellence and aspects of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the following description. However, it is understood that the description of the present specification, including the following description and the description of specific examples and the like, show preferred embodiments of the present invention and are presented only for explanation. I want. Various changes and / or modifications (or modifications) within the spirit and scope of the present invention disclosed herein will occur to those skilled in the art based on the following description and knowledge from other parts of the present specification. Will be readily apparent. All patent documents and references cited herein are cited for illustrative purposes and are not to be construed as a part of this specification. is there.
本発明は、試料中の目的物質（抗原特異的に反応するヒト免疫グロブリンを包含する）をより精度良く（磁性ポリマー微粒子に対する偽陽性を減少せしめて）検出若しくは測定する方法並びにそのための試薬を提供するものである。本発明の技術では、血液、例えば、献血血液について、それを測定検体試料として、全自動血液スクリーニングシステムを利用可能とし、大量且つ迅速に測定して、特定の抗原や抗体の量（臨床上や医学上などで問題となる癌マーカー等の血中物質などの量）を調べるのに適し、より正確に検出若しくは測定結果を与えるものである。また、本発明は、特定の抗原特異的ヒト免疫グロブリンの有無（臨床上や医学上などで問題となるウイルスなどの抗原による汚染の有無）を調べるのにも適し、より正確に検出若しくは測定結果を与えるものである。
免疫診断薬では、磁性体を含む微粒子（本明細書中、「磁性微粒子」）（例えば、ポリマー微粒子）に目的物質と特異的に反応する抗原または抗体を固相化し（本明細書中、これを「固相化磁性微粒子」と称する）、それに目的物質を含む検体試料を抗原抗体反応させた後に固相化磁性微粒子を洗浄し、それに発光試薬（アクリニジウムなど）を標識したマウスモノクローナル抗体（以下、「標識抗体」）を反応させ、目的物質を検出するという技術が汎用されている。
例えば、抗原特異的ヒト免疫グロブリンを測定する免疫血清診断薬では、磁性粒子に抗原を固相化し、この抗原固相化磁性粒子にヒト免疫グロブリンを抗原抗体反応させた後に抗原固相化磁性粒子を洗浄し、それに標識抗体を反応させ、抗原特異的ヒト免疫グロブリンを検出する。
The present invention provides a method for detecting or measuring a target substance (including human immunoglobulin that reacts specifically with an antigen) in a sample more accurately (by reducing false positives for magnetic polymer microparticles) and a reagent therefor To do. In the technique of the present invention, blood, for example, blood donated blood, can be used as a measurement specimen sample, and a fully automatic blood screening system can be used. It is suitable for investigating the amount of a blood substance such as a cancer marker that is a problem in medicine, and gives a more accurate detection or measurement result. The present invention is also suitable for examining the presence or absence of a specific antigen-specific human immunoglobulin (presence or absence of contamination with an antigen such as a virus that is clinically or medically problematic), and results of detection or measurement more accurately. Is to give.
In an immunodiagnostic agent, an antigen or antibody that specifically reacts with a target substance is immobilized on a microparticle (hereinafter referred to as a “magnetic microparticle”) containing a magnetic substance (for example, a polymer microparticle). (Hereinafter referred to as “solid-phase magnetic fine particles”), a specimen sample containing the target substance is reacted with an antigen-antibody, and then the solid-phase magnetic fine particles are washed and labeled with a luminescent reagent (such as acrinidium). , "Labeled antibody") and a technique for detecting a target substance is widely used.
For example, in an immunoserodiagnostic drug that measures antigen-specific human immunoglobulin, an antigen is immobilized on magnetic particles, and the antigen-immobilized magnetic particles are allowed to undergo antigen-antibody reaction with human immunoglobulin, followed by antigen-immobilized magnetic particles. Is washed and reacted with a labeled antibody to detect antigen-specific human immunoglobulin.
このような技術の場合、磁性微粒子表面に対する非特異物質の吸着反応が起こった場合に、それに対し標識抗体が反応し、検出されることが多かった。また、磁性微粒子表面に対するヒト免疫グロブリンの吸着反応あるいは抗原抗体反応が起こった場合に、それに対し標識抗体が反応し、検出されることも多かった。
特に、PIVKA-IIを測定する免疫測定試薬においては、血清中に存在する血液凝固因子IIの活性化体であるトロンビンの磁性粒子表面への非特異結合により、それに対し標識抗体が反応し、血清で偽高値を示すことがあった。あるカットオフ値を設けて陰性/陽性を判定する免疫診断薬の場合、この磁性微粒子表面のポリマーに対する非特異物質（例えば、ヒト免疫グロブリン、トロンビンなど）の吸着反応が甚だしく起こった場合には、特異的に反応する目的物質が極めて少なく、陰性と判定されるべき検体が、誤って陽性と判定される（以下、「偽陽性」）場合があった。この偽陽性を減少させるために、界面活性剤、磁性微粒子に抗原または抗体を固相化後タンパク質をオーバーコートするなどの様々な手法が用いられてきたが、磁性微粒子（例えば、磁性ポリマー微粒子）に対する偽陽性を減少させることには限界があった。
In the case of such a technique, when an adsorption reaction of a non-specific substance on the surface of the magnetic fine particle occurs, the labeled antibody often reacts and is detected. In addition, when an adsorption reaction or antigen-antibody reaction of human immunoglobulin occurs on the surface of the magnetic fine particle, the labeled antibody reacts and is often detected.
In particular, in the immunoassay reagent for measuring PIVKA-II, the labeled antibody reacts with the non-specific binding of thrombin, which is an activated form of blood coagulation factor II present in the serum, to the surface of the magnetic particles, and the serum In some cases, a false high was shown. In the case of an immunodiagnostic drug that determines negative / positive by setting a certain cut-off value, if an adsorption reaction of a non-specific substance (for example, human immunoglobulin, thrombin, etc.) to the polymer on the surface of the magnetic microparticle occurs, There are cases where the target substance that specifically reacts is extremely few and the sample that should be determined to be negative is erroneously determined to be positive (hereinafter, “false positive”). In order to reduce this false positive, various methods have been used such as surfactant, magnetic fine particles with antigen or antibody immobilized thereon and protein overcoating, but magnetic fine particles (for example, magnetic polymer fine particles) There were limits to reducing false positives for.
本発明では、磁性体を含む微粒子の表面素材と同じかまたは類似の素材表面を持つといった、磁性体を含まない微粒子（以下、「非磁性微粒子」）を、固相化磁性微粒子と共存させる。それにより、磁性微粒子表面に対する非特異物質の非特異的吸着反応を低減させ、特異的に反応する目的物質（測定する物質）を測定する免疫診断薬の偽陽性を低減させることに成功した。
典型的な態様では、磁性微粒子を構成するポリマーと同じまたは類似のポリマーを用いた、磁性体を含まないポリマー微粒子を、抗体又は抗原固相化磁性粒子と共存させる。かくして、磁性微粒子表面に対するヒト免疫グロブリンの非特異的吸着反応を低減させ、抗原特異的に反応するヒト免疫グロブリンを測定する免疫血清診断薬の偽陽性を低減させることもできる。
In the present invention, fine particles not containing a magnetic material (hereinafter referred to as “non-magnetic fine particles”) having a material surface that is the same as or similar to the surface material of fine particles containing a magnetic material are allowed to coexist with solid-phase magnetic fine particles. As a result, the non-specific adsorption reaction of the non-specific substance on the surface of the magnetic fine particles was reduced, and the false positive of the immunodiagnostic drug for measuring the target substance (substance to be measured) specifically reacting was successfully reduced.
In a typical embodiment, polymer fine particles containing no magnetic substance and using the same or similar polymer as that constituting the magnetic fine particles are allowed to coexist with the antibody or antigen-immobilized magnetic particles. Thus, non-specific adsorption reaction of human immunoglobulin on the surface of magnetic fine particles can be reduced, and false positives of immunoserodiagnostics for measuring human immunoglobulin that reacts specifically with antigen can be reduced.
要約すると、汎用される免疫診断薬の検出の流れは以下のようであるが、この(2)の工程で非磁性微粒子を共存させることにより、免疫診断薬の偽陽性を低減させることに成功した。
(1)検体（血清または血漿）を採取し、これを反応ウェルに入れる。
(2)このウェルに固相化磁性微粒子を含む液および検体希釈液を入れ、ある定めた温度である定めた時間反応させる（この反応を「一次反応」と称す）。この間に、検体中の抗原特異的に反応する目的物質の固相化磁性微粒子に対する特異的な抗原抗体反応が起こる。
(3)一次反応後に、磁性微粒子を磁石で引きつけ、検体、検体希釈液、その他の反応液を吸引して除く。さらに、洗浄液を入れて洗浄後、磁性微粒子を磁石で引きつけ、洗浄液を吸引して除き、磁性微粒子に付着していた反応液を除く。
(4)洗浄後の磁性微粒子に標識抗体を加え、ある定めた温度である定めた時間反応させる（この反応を「二次反応」と称す）。
(5)二次反応後に、磁性微粒子を磁石で引きつけ、それ以外の反応液を除く。さらに、洗浄液を入れて洗浄後、磁性微粒子を磁石で引きつけ、洗浄液を吸引して除き、磁性微粒子に付着していた反応液を除く。
(6)発光試薬を発光させ、そのシグナルの強さにより、検体中に存在する目的物質を測定する。
上記一次反応中に、非磁性微粒子を加える。具体的には、非磁性微粒子は固相化磁性微粒子を含む液と検体希釈液のどちらに添加しても良い。非磁性微粒子は、磁性微粒子表面に結合するはずであった検体中の非特異物質と反応した後、非磁性という特徴により、(3)の工程で反応液とともに吸引除去される。
In summary, the flow of detection of commonly used immunodiagnostic drugs is as follows, but by coexisting non-magnetic fine particles in the step (2), we succeeded in reducing false positives of immunodiagnostic drugs. .
(1) Collect a sample (serum or plasma) and place it in a reaction well.
(2) A solution containing solid-phased magnetic fine particles and a sample diluent are placed in the well and reacted at a predetermined temperature for a predetermined time (this reaction is referred to as “primary reaction”). During this time, a specific antigen-antibody reaction of the target substance that reacts specifically with the antigen in the sample with the solid-phased magnetic fine particles occurs.
(3) After the primary reaction, the magnetic fine particles are attracted with a magnet, and the specimen, specimen diluent, and other reaction liquid are aspirated and removed. Further, after washing with a cleaning solution, the magnetic fine particles are attracted with a magnet, and the cleaning solution is removed by suction to remove the reaction solution adhering to the magnetic fine particles.
(4) A labeled antibody is added to the magnetic fine particles after washing, and the reaction is performed for a predetermined time at a predetermined temperature (this reaction is referred to as “secondary reaction”).
(5) After the secondary reaction, attract the magnetic fine particles with a magnet and remove the other reaction solution. Further, after washing with a cleaning solution, the magnetic fine particles are attracted with a magnet, and the cleaning solution is removed by suction to remove the reaction solution adhering to the magnetic fine particles.
(6) The luminescent reagent is caused to emit light, and the target substance present in the specimen is measured based on the intensity of the signal.
Nonmagnetic fine particles are added during the primary reaction. Specifically, the non-magnetic fine particles may be added to either the liquid containing the solid-phased magnetic fine particles or the sample diluent. The non-magnetic fine particles react with the non-specific substance in the specimen that should have bound to the surface of the magnetic fine particles, and are then aspirated and removed together with the reaction solution in the step (3) due to the non-magnetic feature.
具体的な態様の一つでは、本発明は、ヒト検体中の特定の抗原特異的ヒト免疫グロブリンの測定検出法において、測定検体試料を、抗原特異的ヒト免疫グロブリン検出試薬で処理し、測定結果を得るに際し、抗原が固相化されており且つ磁性体を含むポリマー粒子と該磁性体を含むポリマー粒子と同じポリマーまたは類似のポリマーを用いて製造されており且つ磁性体を含まないポリマー粒子とを共存させることを特徴とする。より具体的な態様では、本発明は、血液検体などの測定検体試料のヒトTP抗体などの抗原特異的ヒト免疫グロブリンの測定検出法において、測定検体試料を、磁性粒子に固相化された抗原（特定の抗原）と、該磁性粒子の構成ポリマーと同じポリマーまたは類似のポリマーを含み且つ磁性体を含まないポリマー粒子の共存下、接触せしめる工程、磁石の影響下にB/F分離及び洗浄処理する工程、磁性粒子固相に結合している抗原-抗原特異的ヒト免疫グロブリン複合体（コンプレックス）と標識化された抗ヒト免疫グロブリン抗体とを接触せしめる工程、磁石の影響下にB/F分離及び洗浄処理する工程、標識を指標に抗原特異的ヒト免疫グロブリンを定量する工程、を含んでいる抗原特異的ヒト免疫グロブリン免疫学的測定方法を行うものである。 In one specific embodiment, the present invention relates to a measurement and detection method for a specific antigen-specific human immunoglobulin in a human sample, wherein the measurement sample is treated with an antigen-specific human immunoglobulin detection reagent, and the measurement result And a polymer particle containing a magnetic substance and an antigen is solid-phased, and a polymer particle which is produced using the same polymer as the polymer particle containing the magnetic substance or a similar polymer, and does not contain a magnetic substance, It is characterized by coexisting. In a more specific embodiment, the present invention relates to a method for measuring and detecting an antigen-specific human immunoglobulin such as a human TP antibody in a measurement sample sample such as a blood sample, and the antigen that is immobilized on magnetic particles. (Specific antigen) and polymer particles containing the same or similar polymer as the constituent polymer of the magnetic particle and not containing a magnetic substance, contacting step, B / F separation and washing treatment under the influence of a magnet The step of contacting the antigen-antigen-specific human immunoglobulin complex (complex) bound to the solid phase of the magnetic particle with the labeled anti-human immunoglobulin antibody. B / F separation under the influence of a magnet And an antigen-specific human immunoglobulin immunoassay method comprising a step of washing treatment and a step of quantifying antigen-specific human immunoglobulin using the label as an indicator.
別の具体的な態様の一つでは、本発明は、ヒト検体中の特定の目的物質の測定検出法において、測定検体試料を、免疫測定し、測定結果を得るに際し、抗原または抗体が固相化されており且つ磁性体を含むポリマー微粒子と該磁性体を含むポリマー粒子と同じポリマーまたは類似のポリマーを用いて製造されており且つ磁性体を含まないポリマー微粒子とを共存させることを特徴とする。より具体的な態様では、本発明は、血液検体などの測定検体試料のPIVKA-IIなどの測定検出法において、測定検体試料を、磁性微粒子に固相化された抗体（特定の抗体）と、該磁性微粒子の構成ポリマーと同じポリマーまたは類似のポリマーを含み且つ磁性体を含まないポリマー微粒子の共存下、接触せしめる工程、磁石の影響下にB/F分離及び洗浄処理する工程、磁性微粒子固相に結合している抗原-抗原特異的複合体（コンプレックス）と標識化された特異的抗体とを接触せしめる工程、磁石の影響下にB/F分離及び洗浄処理する工程、標識を指標に目的物質を定量する工程、を含んでいる免疫学的測定方法を行うものである。
当該方法において使用する免疫測定方法は、競合法、サンドイッチ法等の公知のいずれの方法であってもよいが、特にサンドイッチ法が好ましい。化学発光免疫測定法(chemiluminescent immunoassay: CLIA)が好適に使用できる。
In another specific embodiment, the present invention relates to a method for measuring and detecting a specific target substance in a human specimen. When a measurement specimen sample is subjected to immunoassay and a measurement result is obtained, the antigen or antibody is in a solid phase. And a polymer fine particle containing a magnetic substance and a polymer fine particle produced using the same polymer as the polymer particle containing the magnetic substance or a similar polymer and not containing a magnetic substance . In a more specific embodiment, the present invention relates to a measurement detection method such as PIVKA-II of a measurement sample sample such as a blood sample, and the measurement sample sample is an antibody (specific antibody) immobilized on magnetic fine particles, A step of contacting in the presence of polymer fine particles containing the same polymer or a similar polymer as the constituent polymer of the magnetic fine particles and not containing a magnetic substance, a step of performing B / F separation and washing under the influence of a magnet, a magnetic fine particle solid phase The step of bringing the antigen-antigen-specific complex (complex) bound to the substance into contact with the labeled specific antibody, the step of B / F separation and washing under the influence of the magnet, and the target substance using the label as an indicator An immunological measurement method comprising the step of quantifying
The immunoassay method used in this method may be any known method such as a competitive method or a sandwich method, but the sandwich method is particularly preferred. A chemiluminescent immunoassay (CLIA) can be preferably used.
該免疫学的抗原特異的ヒト免疫グロブリン(IgG、IgMを包含してよい)測定は、検体を固相化抗原で処理して、固相に抗原特異的ヒト免疫グロブリン（抗TP IgG、抗TP IgMを含む）を捕捉した後、標識された抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応せしめ、標識を測定することにより、抗原特異的ヒト免疫グロブリンを測定（定量測定を含む）するものであってよい。この場合、例えば、免疫学的に抗原特異的ヒト免疫グロブリンを測定する方法は、検体を固相化抗原、すなわち、固相化組換え抗原で処理して、固相に抗原特異的ヒト免疫グロブリンを捕捉した後、標識された抗ヒト免疫グロブリン抗体、例えば、ペルオキシダーゼ標識あるいはアクリジニウム誘導体標識マウスモノクローナル抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応せしめ、標識を測定することにより、抗原特異的ヒト免疫グロブリンを測定（定量測定を含む）できる。
本発明で使用できる抗原としては、抗原特異的ヒト免疫グロブリン測定の対象として当業者に知られたものであれば特には限定されるものではないが、例えば、ウイルス、感染性細菌・原虫あるいは寄生性生物など(以下、「ウイルス等」と記す)による感染の有無を判定する目的で行われるものが含まれる。ウイルス等としては、HIV、HTLV-1、HCV、HBs抗原、HBc抗原、HBe抗原、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスI、水痘ヘルペス、麻疹、カンジダ、トキソプラズマ、マイコプラズマ、風疹、梅毒などが挙げられる。該抗原としては、培養したウイルス等から精製したタンパク質や、組換えタンパク質として産生されたものが挙げられ、後者の例として、大腸菌発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系などを使用して得られたものが挙げられる。組換えTP抗原としては、TpN15、TpN17及びTpN47、それらのN末端側あるいはC末端側ペプチド、それらの任意の混合物などが挙げられる。また、米国特許第6,479,248号明細書に開示のものなどが挙げられる。
The immunological antigen-specific human immunoglobulin (which may include IgG and IgM) is measured by treating a specimen with a solid-phased antigen and applying the antigen-specific human immunoglobulin (anti-TP IgG, anti-TP) to the solid phase. After capturing (including IgM), antigen-specific human immunoglobulin may be measured (including quantitative measurement) by reacting with a labeled anti-human immunoglobulin antibody and measuring the label. In this case, for example, a method for immunologically measuring an antigen-specific human immunoglobulin is performed by treating a specimen with an immobilized antigen, that is, an immobilized recombinant antigen, and the antigen-specific human immunoglobulin is immobilized on the solid phase. Then, labeled anti-human immunoglobulin antibody, for example, peroxidase-labeled or acridinium derivative-labeled mouse monoclonal anti-human immunoglobulin antibody is reacted, and the label is measured to measure antigen-specific human immunoglobulin (quantitative determination). Including measurement).
The antigen that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is known to those skilled in the art as an antigen-specific human immunoglobulin measurement target. For example, viruses, infectious bacteria / protozoa, or parasites can be used. Those performed for the purpose of determining the presence or absence of infection by sex organisms (hereinafter referred to as "viruses") are included. Examples of the virus include HIV, HTLV-1, HCV, HBs antigen, HBc antigen, HBe antigen, cytomegalovirus, herpes simplex I, varicella herpes, measles, Candida, toxoplasma, mycoplasma, rubella, syphilis and the like. Examples of the antigen include proteins purified from cultured viruses and the like, and those produced as recombinant proteins. Examples of the latter are obtained using an E. coli expression system, a yeast expression system, a baculovirus expression system, and the like. Are listed. Recombinant TP antigens include TpN15, TpN17 and TpN47, their N-terminal or C-terminal peptides, any mixtures thereof, and the like. Further, those disclosed in US Pat. No. 6,479,248 may be mentioned.
本測定方法において用いる固相化抗体・標識抗体用の抗体（標識抗体用の抗ヒト免疫グロブリン抗体を包含する）は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれであってもよいが、通常、モノクローナル抗体が好適に使用される。また、これら抗体はFab’、F(ab’)2等の抗体フラグメントであってもよい。また遺伝子組み替えによって作成された抗体または抗体フラグメントであってもよい。
本免疫測定法において使用する固相、特にはサンドイッチ法で用いる固相としては、磁性微粒子が挙げられ、特に好ましくは磁性マイクロ粒子（マイクロパーティクル）が挙げられる。本免疫測定法において使用する磁性微粒子、または非磁性微粒子としては、ポリマー微粒子が最も好適ではあるが、全自動測定に適した微粒子であれば、例えば、シリカ微粒子などであってもよい。全自動免疫測定に有効な微粒子サイズとしては、10 nm から 100μm の範囲の微粒子が好適である。また、直径100μm を越える粒子については本発明で述べる微粒子には相当しない。
標識物質としては、蛍光物質、発光物質、酵素、放射性同位元素等が挙げられ、特に好ましくはアクリジニウム誘導体、例えば、10-(3-スルホプロピル)-N-(p-トルエンスルホニル)-N-(カルボキシエチル)-9-アクリジニウムカルボキサミドなどが挙げられる。アクリジニウム誘導体は、米国特許明細書第5,468,646号、同第5,543,524号などに記載のものなどが挙げられる。固相又は標識物への抗体や抗原を結合させる方法としては、周知の物理的吸着方法、化学的な反応による結合方法などが挙げられる。
The antibody for the immobilized antibody / labeled antibody (including the anti-human immunoglobulin antibody for the labeled antibody) used in this measurement method may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Preferably used. These antibodies may be antibody fragments such as Fab ′ and F (ab ′) 2 . Moreover, the antibody or antibody fragment produced by gene recombination may be sufficient.
The solid phase used in the present immunoassay method, particularly the solid phase used in the sandwich method, includes magnetic fine particles, and particularly preferably magnetic micro particles (micro particles). As the magnetic fine particles or non-magnetic fine particles used in the present immunoassay method, polymer fine particles are most suitable, but silica fine particles may be used as long as they are fine particles suitable for fully automatic measurement. A particle size in the range of 10 nm to 100 μm is suitable as a particle size effective for fully automatic immunoassay. Further, particles having a diameter exceeding 100 μm do not correspond to the fine particles described in the present invention.
Examples of the labeling substance include fluorescent substances, luminescent substances, enzymes, radioisotopes and the like, and particularly preferably an acridinium derivative such as 10- (3-sulfopropyl) -N- (p-toluenesulfonyl) -N- ( Carboxyethyl) -9-acridinium carboxamide and the like. Examples of the acridinium derivative include those described in US Pat. Nos. 5,468,646 and 5,543,524. Examples of a method for binding an antibody or an antigen to a solid phase or a labeled substance include a well-known physical adsorption method and a binding method using a chemical reaction.
代表的なサンドイッチ法として、例えば、２ステップサンドイッチ法が挙げられる。該
２ステップサンドイッチ法では、抗原（例えば、TP抗原、HIV抗原、HCV抗原、それらのリコンビナント抗原など）を磁性微粒子（磁性マイクロパーティクル; μ-P）に結合してある固相化抗原（抗原固相化磁性微粒子）、あるいは、抗体（例えば、抗PIVKA-II抗体）を磁性微粒子に結合してある固相化抗体（固相化磁性微粒子）を、検体と接触せしめるが、その時、該磁性体を含むポリマー微粒子と同じポリマーまたは類似のポリマーを用いて製造されており且つ磁性体を含まないポリマー微粒子を共存させ、インキュベーション処理後、磁石の影響下、B/F分離及び洗浄を行い（この操作で該磁性体を含まないポリマー微粒子は除かれる）、次に該固相化磁性微粒子をアクリジニウム誘導体で標識されている特異抗体コンジュゲートと接触せしめ、インキュベーション処理し、その後、磁石の影響下、B/F分離及び洗浄を行い、標識を測定することにより、目的物質（抗原特異的ヒト免疫グロブリンなどを含めた、測定する物質）を測定（定量測定を含む）する。
標識の測定は、例えば、プレトリガー液やトリガー液を使用して標識アクリジニウムを化学発光を起こす分子種に変換するなどして達成される。プレトリガー液としては、例えば、過酸化水素を含む酸性溶液などが挙げられ、アクリジニウム標識抗体を磁性マイクロパーティクル上から切り離し、アクリジニウムを溶液中に均一に溶出させる。トリガー液としては、例えば、Triton X-100を含む水酸化ナトリウム溶液などが挙げられ、発光反応を発生させる。
A typical sandwich method is, for example, a two-step sandwich method. In the two-step sandwich method, an immobilized antigen (antigen-fixed antigen) in which an antigen (for example, TP antigen, HIV antigen, HCV antigen, or their recombinant antigen) is bound to magnetic microparticles (magnetic microparticle; μ-P). (Phase-phase magnetic fine particles) or a solid-phase antibody (solid-phase magnetic fine particles) in which an antibody (for example, an anti-PIVKA-II antibody) is bound to the magnetic fine particles is brought into contact with the specimen. Polymer fine particles that are manufactured using the same polymer as or similar to the polymer fine particles containing, and that do not contain magnetic substances, coexist, and after the incubation process, B / F separation and washing are performed under the influence of a magnet (this operation And the polymer fine particles not containing the magnetic substance are removed), and then the solid-phased magnetic fine particles are contacted with a specific antibody conjugate labeled with an acridinium derivative, Measure the target substance (substance to be measured, including antigen-specific human immunoglobulin, etc.) (quantitative measurement) by incubating, then performing B / F separation and washing under the influence of a magnet, and measuring the label Including).
The measurement of the label is achieved, for example, by converting the labeled acridinium into a molecular species that causes chemiluminescence using a pre-trigger solution or a trigger solution. Examples of the pre-trigger solution include an acidic solution containing hydrogen peroxide, and the acridinium-labeled antibody is separated from the magnetic microparticles so that acridinium is eluted in the solution uniformly. Examples of the trigger solution include a sodium hydroxide solution containing Triton X-100, and generates a luminescence reaction.
本免疫測定は、免疫検査に必要な機能を備えた全自動免疫測定装置、例えば、全自動化学発光免疫装置で行うのに適したものであることができる。該全自動化学発光免疫装置は、普通、検体の受け入れと測定部位への移送を行うサンプラートラック機構、化学発光測定を行うプロセッシング機構、消耗品である洗浄液、反応試薬などの補給と廃棄物の処理を行うサプライ機構、システム全体の操作並びに制御を行うシステムコントロール機構を備えているようなものが好ましい。該サンプラートラック機構のうちには、各種のサンプルカップや試験管に対応し、さらに様々な大きさのものに対応している形態のものとされ、少量検体についても、バーコード読み取り機構を利用して検体の同定管理が可能とされており、さらに、ランダムアクセスや継続的なアクセスによるサンプリングが可能とされ、緊急的な検体測定も可能とされているなどの機構が挙げられる。検体の追加、取り外しがいつでも、当該装置全面から行うことが可能とされ、さらに検体IDユニットを備えバーコード情報が読み取り可能とされていることが好ましく、例えば、検体ラックをセットすると直ちにバーコード情報が読み取られ、測定を開始できるようにされている装置であってよい。また、検体ラックトランスポータは、検体ラックをセットすると直ちに動作可能とされ、３次元での検体ラック搬送を実現できるような機構を備えたものが好ましく、処理効率に応じた最適検体ラックポジションへの移送、サンプリングのための検体ラックの各モジュールへの分配、優先処理の最適化を図ることが可能な機構を備えているものとすることも可能である。 This immunoassay can be suitable for performing with a fully automatic immunoassay device having a function necessary for an immunological test, for example, a fully automatic chemiluminescence immunodevice. The fully automatic chemiluminescent immunity device is usually equipped with a sampler track mechanism that accepts specimens and transports them to the measurement site, a processing mechanism that performs chemiluminescence measurements, replenishment of cleaning liquids, reaction reagents, etc., and waste disposal. It is preferable to include a supply mechanism that performs the above-described operation and a system control mechanism that performs the operation and control of the entire system. The sampler track mechanism is compatible with various types of sample cups and test tubes, and is also compatible with a variety of sizes. For small samples, a bar code reading mechanism is used. Sample identification management is possible, and further, sampling by random access or continuous access is possible, and urgent sample measurement is also possible. It is preferable that the sample can be added or removed from the entire surface of the device at any time, and it is preferable that the sample ID unit is provided so that the barcode information can be read. Can be read and the device can be started to measure. The sample rack transporter preferably has a mechanism that can be operated immediately after setting the sample rack and can realize three-dimensional sample rack transport. It is also possible to provide a mechanism capable of optimizing the priority rack processing and the distribution of sample racks for transfer and sampling to each module.
該プロセッシング機構としては、多数の試薬ボトルを同時搭載可能とされ、１モジュールで莫大な数のテストが可能とされているものが好適であり、例えば、25個の試薬ボトルを同時搭載し、500テスト用の試薬ボトルが使用可能になっていて、１モジュール最大12,500テストが可能となっている能力を備えるものとされていることもできる。該プロセッシング機構には、冷却機能付き試薬カセロールにより、試薬を搭載したまま長時間安定に保持できる機能、試薬につき、項目名、ロットナンバー、テストサイズ、使用期限、マスターキャリブレーション情報などをバーコード自動読み取りにより管理可能とされる機能、検体量不足、気泡、血餅などの異常を感知できるプレシャーモニタリング機能、キャリーオーバーを低減するサンプルピペッタなどが含まれていることができる。キャリーオーバーの低減は、サンプルプローブの洗浄を強化せしめたり、また、自動位置調整機能を備えることにより達成されるものであることができる。該プレシャーモニタリング機能では、例えば、サンプリング・分注時の液圧の常時モニタリングにより、プローブの詰まりや気泡を検知可能とされ、誤った報告を防止できるようにされることが挙げられる。該サプライ機構には、化学発光に適した試薬、例えば、多くの数のテストに対応する数のトリガー試薬（希釈緩衝液）、プレトリガー試薬（希釈緩衝液）を保管可能とする機能、固型廃棄物用の廃物コンテナを備えるとともに、廃液については検査室の廃液口に自動廃液可能とする機能などが含まれていることができる。該システムコントロール機構としては、モニター画面上のスクリーンにタッチすることで操作可能となっている機能、各モジュールの状況が一目で判別可能とされているスナップショット画面形成機能、多数のテストの測定結果並びに多数のテストのQC結果を保存する機能などが含まれているものであってよい。全自動化学発光免疫装置の例としては、免疫測定装置アーキテクトTMアナライザーシリーズ（アボットジャパン（株））、例えば、アボット アーキテクトTMi2000 (Abbott ARCHITECTTMi2000)などが挙げられる。 As the processing mechanism, it is possible to mount a large number of reagent bottles at the same time, and it is preferable that a huge number of tests can be performed in one module. Test reagent bottles can be used and can be equipped with the ability to allow up to 12,500 tests per module. The processing mechanism uses a reagent casserole with a cooling function that can hold the reagent stably for a long time with the reagent mounted, and the item name, lot number, test size, expiration date, master calibration information, etc., for each reagent. A function that can be managed by reading, a pressure monitoring function that can detect abnormalities such as insufficient sample volume, bubbles, and blood clots, a sample pipettor that reduces carryover, and the like can be included. The reduction of carryover can be achieved by enhancing the cleaning of the sample probe or by providing an automatic positioning function. In the pressure monitoring function, for example, it is possible to detect clogging of the probe and air bubbles by constantly monitoring the fluid pressure at the time of sampling and dispensing, and to prevent erroneous reporting. The supply mechanism has a function capable of storing a reagent suitable for chemiluminescence, for example, a trigger reagent (dilution buffer) corresponding to a large number of tests, a pre-trigger reagent (dilution buffer), and a solid type In addition to having a waste container for waste, the waste liquid can include a function for enabling automatic liquid discharge at the waste liquid outlet of the laboratory. The system control mechanism includes a function that can be operated by touching the screen on the monitor screen, a snapshot screen forming function that enables the status of each module to be discriminated at a glance, and a number of test measurement results. In addition, a function for storing QC results of a large number of tests may be included. As an example of a fully automatic chemiluminescent immunity apparatus, immunoassay apparatus Architect TM analyzer series (Abbott Japan KK), for example, Abbott Architect TM i2000 (Abbott ARCHITECT TM i2000) and the like can be mentioned.
本発明の技術は、ARCHITECT TP Abに好適に適用できる。ARCHITECT TP Abは、アクリジニウム標識抗ヒトIgGおよびIgMモノクローナル抗体と磁性微粒子（マイクロパーティクル）上に固相化されたリコビナントTP抗原（TpN15, TpN17, TpN47）を使用した化学発光免疫測定法による２ステップサンドイッチ法を原理としている。初めに検体、およびリコビナントTP抗原が固相化されたマイクロパーティクルを混合する。検体中にTP抗体が存在する場合には、TP抗原固相化マイクロパーティクルに結合し、洗浄後、TP抗体＋TP抗原固相化マイクロパーティクルの結合物が形成される。次にアクリジニウム標識抗ヒトIgGおよびIgMモノクローナル抗体が添加され、抗ヒトIgGあるいはIgMモノクローナル抗体＋TP抗体＋TP抗原固相化マイクロパーティクルのサンドイッチ複合体が形成される。再び洗浄の後、プレトリガー、トリガーを反応セルに添加し、その結果生じる化学発光反応を発光強度(RLU)として測定する。この検体のRLUが、あらかじめ測定しておいたキャリブレーションのカットオフ値以上を示した場合を陽性、カットオフ値未満の場合を陰性と判定する。 The technique of the present invention can be suitably applied to ARCHITECT TP Ab. ARCHITECT TP Ab is a two-step sandwich by chemiluminescence immunoassay using acridinium-labeled anti-human IgG and IgM monoclonal antibodies and recombinant TP antigens (TpN15, TpN17, TpN47) immobilized on magnetic particles (microparticles). It is based on the law. First, the specimen and the microparticles on which the recombinant TP antigen is immobilized are mixed. When TP antibody is present in the specimen, it binds to TP antigen-immobilized microparticles, and after washing, a conjugate of TP antibody + TP antigen-immobilized microparticles is formed. Next, acridinium-labeled anti-human IgG and IgM monoclonal antibody are added to form a sandwich complex of anti-human IgG or IgM monoclonal antibody + TP antibody + TP antigen-immobilized microparticles. After washing again, a pre-trigger and a trigger are added to the reaction cell, and the resulting chemiluminescence reaction is measured as luminescence intensity (RLU). A case where the RLU of the sample shows a calibration cutoff value that is measured in advance or more is determined to be positive, and a case where the RLU is less than the cutoff value is determined to be negative.
また、本発明の技術は、上述した ARCHITECT システムを用いた PIVKA-II 測定に好適に適用できる。初めに検体、および抗PIVKA-IIモノクローナル抗体が固相化された磁性微粒子を混合する。検体中にPIVKA-IIが存在する場合には、該固相化微粒子に結合する。このとき表面積換算で過剰量の非磁性微粒子を共存させることにより、主要な非特異物質であるトロンビンのほとんどが非磁性微粒子に結合する。磁石を利用したB/F分離・洗浄の後、PIVKA-II＋PIVKA-II抗体固相化磁性微粒子の結合物が形成される。このときトロンビンを始めとする非特異物質と結合した非磁性微粒子は、磁石により捕捉されないため、反応液等とともに洗浄中にあって除去される。次にアクリジニウム標識抗ヒトプロトロンビン抗体が添加され、標識抗ヒトプロトンビン抗体＋PIVKA-II＋抗PIVKA-II抗体固相化磁性微粒子のサンドイッチ複合体が形成される。抗ヒトプロトロンビン抗体は、プロトロンビンの一部に含まれるトロンビンとも反応性を有するが、ほとんどのトロンビンは非磁性微粒子により取り除かれているため、トロンビン由来の偽陽性シグナルは生じない。再び洗浄の後、プレトリガー、トリガーを反応セルに添加し、その結果生じる化学発光反応を発光強度(RLU)として測定する。この検体のRLUが、あらかじめ測定しておいたキャリブレーションのカットオフ値以上を示した場合を陽性、カットオフ値未満の場合を陰性と判定する。
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
In addition, the technology of the present invention can be suitably applied to PIVKA-II measurement using the ARCHITECT system described above. First, a sample and magnetic fine particles on which an anti-PIVKA-II monoclonal antibody is immobilized are mixed. When PIVKA-II is present in the specimen, it binds to the solid-phased microparticles. At this time, by coexisting an excessive amount of non-magnetic fine particles in terms of surface area, most of the main non-specific substance thrombin binds to the non-magnetic fine particles. After B / F separation / washing using a magnet, a conjugate of PIVKA-II + PIVKA-II antibody-immobilized magnetic fine particles is formed. At this time, the non-magnetic fine particles bound to the non-specific substance such as thrombin are not captured by the magnet, and thus are removed while being washed together with the reaction solution and the like. Next, an acridinium-labeled anti-human prothrombin antibody is added to form a sandwich complex of labeled anti-human proton bin antibody + PIVKA-II + anti-PIVKA-II antibody-immobilized magnetic fine particles. The anti-human prothrombin antibody is also reactive with thrombin contained in a part of prothrombin, but since most thrombin is removed by nonmagnetic fine particles, no false positive signal derived from thrombin is generated. After washing again, a pre-trigger and a trigger are added to the reaction cell, and the resulting chemiluminescence reaction is measured as luminescence intensity (RLU). A case where the RLU of the sample shows a calibration cutoff value that is measured in advance or more is determined to be positive, and a case where the RLU is less than the cutoff value is determined to be negative.
The present invention will be described in detail with reference to the following examples, which are provided merely for the purpose of illustrating the present invention and for reference to specific embodiments thereof. These exemplifications are for explaining specific specific embodiments of the present invention, but are not intended to limit or limit the scope of the invention disclosed in the present application. In the present invention, it should be understood that various embodiments based on the idea of the present specification are possible. All examples were performed or can be performed using standard techniques, except as otherwise described in detail, and are well known and routine to those skilled in the art. .
ABBOTT ARCHITECT TM システム
アボットジャパン（株）のARCHITECTTMアナライザーi2000を用いて実施した実施例を示す。本免疫測定装置は、システムコントロールセンター(System Control Center, SCC)、プロセッシングモジュール(Processing Module, PM)、そしてサンプルハンドラー(Sample Handler, SH)から構成され、さらにプロセッシングモジュールの主要部分はプロセッシングセンターと呼ばれ、25項目の試薬を同時搭載できる試薬カローセルを備え、その周りにプロセスパスがあって、該プロセスパス内を反応セルが移動し、周りにサンプルピペッター、試薬ピペッター、内部攪拌装置、ウオッシュゾーンなどが配置されている。反応セルは、プロセスパス内を１ステップずつ移動しながら、それぞれのポジションへ移送される。プロセッシングセンター内には1200個の反応セルを収容できる。また、ダブルトレーも利用可能とされている。本装置は、輸血用血液の安全性を向上させ、効率的な血液供給を行うに適して全自動血液スクリーニングシステムである。独自の化学発光免疫測定法による優れた感度と特異性に加え、大量検体の処理を実現する。
本システムでは、高発光量の得られるアクリジニウム誘導体を標識に使用しているので、試薬の高い安定性（検量線の安定化、日差再現性の向上）、高い発光収率（感度の向上、測定範囲の拡張）が達成できる。また、磁性マイクロパーティクルを利用しているので、固相を磁石で押さえた状態で短時間のB/F分離、洗浄が可能となっており、内部攪拌装置で簡単に磁性マイクロパーティクルを分散させるので、均一な免疫反応が得られ、さらにプラスチック性消耗品の損耗が大幅に低減し、大量のテストを連続的に行うことができ、短時間で大量の検体の測定が可能である。
ABBOTT ARCHITECT ™ system An example carried out using ARCHITECT ™ analyzer i2000 of Abbott Japan Co., Ltd. is shown. This immunoassay device consists of a System Control Center (SCC), a processing module (Processing Module, PM), and a sample handler (Sample Handler, SH). The main part of the processing module is called a processing center. It is equipped with a reagent carousel that can be loaded with 25 items of reagents at the same time, and there is a process path around it. The reaction cell moves through the process path, and a sample pipetter, reagent pipetter, internal stirrer, wash zone, etc. Is arranged. The reaction cell is transferred to each position while moving step by step in the process path. The processing center can accommodate 1200 reaction cells. Double trays are also available. This device is a fully automatic blood screening system suitable for improving the safety of blood for transfusion and providing an efficient blood supply. In addition to the excellent sensitivity and specificity of our original chemiluminescence immunoassay, we can process a large amount of samples.
This system uses an acridinium derivative that provides a high amount of luminescence for labeling, so the reagent has high stability (stabilization of calibration curve, improvement of daily reproducibility), high luminescence yield (improvement of sensitivity, Expansion of the measurement range). In addition, because magnetic microparticles are used, B / F separation and cleaning can be performed in a short time with the solid phase held by a magnet, and magnetic microparticles can be easily dispersed with an internal stirring device. A uniform immune reaction can be obtained, the wear of plastic consumables can be greatly reduced, a large number of tests can be performed continuously, and a large number of specimens can be measured in a short time.
本法の原理は、検体をサンプルピペッターが反応セルに分注した後、試薬ピペッターが試薬カローセルから磁性マイクロパーティクル液をその反応セルに分注する。次に内部攪拌装置で反応セル内の混合液を攪拌した後に、適温、例えば、37℃に維持されたプロセスパス内を移動しながら所要時間インキュベーションされる。かくして、検体、検体希釈液、及び抗原あるいは抗体を固相化した磁性マイクロパーティクル懸濁液をインキュベーションして、検体中の抗体あるいは抗原を特異的にマイクロパーティクル上の抗原あるいは抗体に反応させる(一次反応)。次に反応セルはウオッシュゾーンを通過し、永久磁石などを使用しての磁場の影響下にB/F分離及び磁性マイクロパーティクルの洗浄が希釈緩衝液を使用して行われる。次にアクリジニウム誘導体で標識された特異抗体の入ったコンジュゲート溶液を反応セルに分注し、内部攪拌装置で攪拌した後に、プロセスパス内を移動しながら所要時間インキュベーションされる。標識抗体は、磁性マイクロパーティクル上の測定目的物と結合する。すなわち、反応生成物は、アクリジニウム標識コンジュゲートにより検出される(二次反応)。このコンジュゲートは、アクチベータ溶液の存在下で化学発光を引き起こし、それを光電子増倍管で検出するものである。典型的には当該アクチベータ溶液としては、プレトリガー液とトリガー液とから構成されていてよく、該プレトリガー液は、アクリジニウム標識抗体を磁性マイクロパーティクル上から切り離して、アクリジニウムを反応溶液中に均一な状態で存在するように溶出せしめる働きのものであり、該トリガー液は、アクリジニウムを活性化して、例えば、アクリジニウムを酸化して、発光反応を生ぜしめる働きを持つものが挙げられる。 The principle of this method is that after a sample pipetter dispenses a specimen into a reaction cell, the reagent pipetter dispenses magnetic microparticle liquid from the reagent carousel into the reaction cell. Next, after the liquid mixture in the reaction cell is stirred with an internal stirring device, the mixture is incubated for a required time while moving in a process path maintained at an appropriate temperature, for example, 37 ° C. Thus, the sample, the sample diluent, and the magnetic microparticle suspension in which the antigen or antibody is immobilized are incubated, and the antibody or antigen in the sample specifically reacts with the antigen or antibody on the microparticle (primary reaction). Next, the reaction cell passes through the wash zone, and B / F separation and magnetic microparticle cleaning are performed using a dilution buffer under the influence of a magnetic field using a permanent magnet or the like. Next, a conjugate solution containing a specific antibody labeled with an acridinium derivative is dispensed into a reaction cell, stirred with an internal stirring device, and then incubated for a required time while moving through the process path. The labeled antibody binds to the measurement target on the magnetic microparticle. That is, the reaction product is detected by the acridinium labeled conjugate (secondary reaction). This conjugate causes chemiluminescence in the presence of an activator solution and detects it with a photomultiplier tube. Typically, the activator solution may be composed of a pre-trigger solution and a trigger solution. The pre-trigger solution separates the acridinium-labeled antibody from the magnetic microparticles, and acridinium is uniformly mixed in the reaction solution. The trigger solution is one that has a function of activating acridinium, for example, oxidizing acridinium to cause a luminescence reaction.
〔自動化抗TP抗体の測定〕
ABBOTT ARCHITECTTM システムに適した測定系を構築する。
１）一次反応 反応セルで、以下に示す容量の検体、検体希釈液、及びTP抗原を固相化したマイクロパーティクル懸濁液を混合する。
検体(血清、または血漿) 30μL
検体希釈液 90μL
TP抗原固相化マイクロパーティクル懸濁液
＋
非磁性マイクロパーティクル懸濁液 50μL
２）第一回インキュベーション 攪拌装置で攪拌した後、37℃、18分間インキュベーションし、検体中の抗体を特異的にマイクロパーティクル上の抗原に反応させる。
３）B/F分離／洗浄 反応セルを次のステップに移送する間に磁石により磁性マイクロパーティクルを反応セルの内壁に押し付けておいて未反応物及び非磁性マイクロパーティクルを除去（B/F分離）し、洗浄液で、反応セル内を洗浄する。
[Measurement of automated anti-TP antibody]
Constructing a measurement system suitable for the ABBOTT ARCHITECT TM system.
1) In a primary reaction reaction cell, a sample having the following volume, a sample diluent, and a microparticle suspension in which a TP antigen is immobilized are mixed.
Sample (serum or plasma) 30 μL
Sample dilution 90μL
TP antigen-immobilized microparticle suspension
+
Nonmagnetic microparticle suspension 50μL
2) After stirring with the first incubation stirrer, incubate at 37 ° C. for 18 minutes to specifically react the antibody in the specimen with the antigen on the microparticle.
3) While transferring the B / F separation / washing reaction cell to the next step, the magnetic microparticles are pressed against the inner wall of the reaction cell by a magnet to remove unreacted substances and nonmagnetic microparticles (B / F separation). Then, the inside of the reaction cell is washed with a washing solution.
４）二次反応 アクリジニウム標識コンジュゲート（アクリジニウム化抗ヒト免疫グロブリン抗体、あるいはアクリジニウム化抗ヒトIgM抗体及び／又はアクリジニウム化抗ヒトIgG抗体）溶液 50μLを反応セルに分注する。
５）インキュベーション 攪拌装置で攪拌した後、37℃、4分間インキュベーションし、反応生成物とアクリジニウム標識コンジュゲートの反応を進行させ、検体中にヒト抗TP抗体が存在した場合、TP抗原固相化マイクロパーティクル−ヒト抗TP抗体−標識抗ヒト抗体コンジュゲート複合体を形成させる。
６）B/F分離／洗浄 反応セルを次のステップに移送する間に磁石により磁性マイクロパーティクルを反応セルの内壁に押し付けておいて未反応標識コンジュゲートを除去（B/F分離）し、洗浄液で、未反応のコンジュゲートを洗い流し、複合体を浄化する。
７）アクリジニウムの活性化 プレトリガー液を100μL、次いでトリガー液300μLを加え、複合体上のアクリジニウムを活性化する。
８）検出 アクリジニウムの活性化により引き起こされた化学発光を光電子増倍管で検出する（化学発光度は、RLU（相対的化学発光単位）値として数値化される）。
4) Dispense 50 μL of secondary reaction acridinium-labeled conjugate (acridinized anti-human immunoglobulin antibody or acridinized anti-human IgM antibody and / or acridinized anti-human IgG antibody) into the reaction cell.
5) After stirring with an incubation stirrer, incubate at 37 ° C for 4 minutes to allow the reaction product to react with the acridinium-labeled conjugate. If human anti-TP antibody is present in the specimen, A particle-human anti-TP antibody-labeled anti-human antibody conjugate complex is formed.
6) While transferring the B / F separation / washing reaction cell to the next step, the magnetic microparticles are pressed against the inner wall of the reaction cell by a magnet to remove unreacted labeled conjugate (B / F separation), and the washing solution The unreacted conjugate is washed away and the complex is purified.
7) Activation of acridinium 100 μL of pre-trigger solution and then 300 μL of trigger solution are added to activate acridinium on the complex.
8) The chemiluminescence caused by the activation of the detected acridinium is detected with a photomultiplier tube (the chemiluminescence is quantified as an RLU (relative chemiluminescence unit) value).
アーキテクト Syphilis TP試薬の検体希釈液に、英国ポリマーラボラトリーズ社の非磁性粒子を粒子重量濃度として0%（図１の表示では、0.001%のところにプロットされている）、0.0025%、0.005%、0.010%、0.025%、0.05%、0.1%および0.2%添加し、陽性キャリブレーター液(Calibrator)、陰性コントロール液(Neg control)、陽性コントロール液(Pos control)、市販セロコンバージョンパネル(Bleed 3 1/3)および従来試薬では偽陽性を示す傾向があった検体（以下、「偽陽性検体」）８種(310053, 309463, 309187, 310428, 309057, 310944, 342473, 308941)を測定した。測定値はシグナルの強さ(RLU)として示した。
結果を図１に示した。陽性キャリブレーターの結果は示されていないが、そのシグナルの1/5である、Cut-off（陽性/陰性の判定基準となるシグナル）が示されている。非磁性粒子を加えて行くにつれて、陰性コントロール液（図１の表示ではNeg control。以下同じ）、陽性コントロール液(Pos control)、市販セロコンバージョンパネル(Bleed 3 1/3)およびCut-offのシグナルには、変化がなかったが、偽陽性検体８種(310053, 309463, 309187, 310428, 309057, 310944, 342473, 308941)のシグナルはいずれも大きく減少した。これにより、非磁性粒子を添加することによるヒト免疫グロブリンの非特異的反応の減少効果を示すことが認められた。
In the specimen dilution of Architect Syphilis TP reagent, non-magnetic particles from UK Polymer Laboratories, Inc., 0% (plotted at 0.001% in the display of FIG. 1), 0.0025%, 0.005%, 0.010%, 0.025%, 0.05%, 0.1% and 0.2% added, positive calibrator solution (Calibrator), negative control solution (Neg control), positive control solution (Pos control), commercially available seroconversion panel (Bleed 3 1/3 ) And 8 samples (hereinafter, “false positive samples”) (310053, 309463, 309187, 310428, 309057, 310944, 342473, 308941), which had a tendency to show false positives with conventional reagents, were measured. The measured value was shown as signal intensity (RLU).
The results are shown in FIG. Although the result of the positive calibrator is not shown, Cut-off (signal that is a criterion for positive / negative), which is 1/5 of the signal, is shown. As non-magnetic particles are added, negative control solution (Neg control in the display of Fig. 1; the same applies hereinafter), positive control solution (Pos control), commercially available seroconversion panel (Bleed 3 1/3) and Cut-off signal There was no change, but the signals of 8 false positive specimens (310053, 309463, 309187, 310428, 309057, 310944, 342473, 308941) all decreased greatly. Thereby, it was recognized that the non-specific reaction of human immunoglobulin was reduced by adding non-magnetic particles.
アーキテクト Syphilis TP試薬の抗原固相化磁性粒子を含む液に、英国ポリマーラボラトリーズ社の非磁性粒子に以下の処理（＊）をして、粒子重量濃度として0%および0.36%添加した。
＊：非磁性粒子を含む液にカゼイン4%を含む液を等量加えて室温で1時間攪拌後、遠心して溶液を除き、さらに緩衝液で洗浄した。こうして得られたものを抗原固相化磁性粒子を含む液に分散させた。
この２種類の試薬、すなわち、アーキテクト Syphilis TP試薬の抗原固相化磁性粒子を含む液（以下、「通常試薬」と称する）および該アーキテクト Syphilis TP試薬の抗原固相化磁性粒子を含む液にカゼイン処理した非磁性粒子を分散させた液（以下、「非磁性粒子含有試薬」と称する）について、陽性検体に対する感度、陰性であることが確認された検体に対する特異性、およびかつて偽陽性を示した検体に対する特異性を測定した。
市販セロコンバージョンパネルを使った比較では、２種類の試薬の感度には違いが見られなかった（図２：通常試薬はCurrent(A)およびCurrent (B)）。また陽性検体のシグナル強度は、差がなかった（図３）。陰性であることが確認された検体の特異性は、通常試薬(Current assay)が99.72% (5335/5350)であったのに対し、非磁性粒子含有試薬(Improved assay)は99.91% (5345/5350)と大きな改善が認められた。（表１）
The following treatment (*) was performed on non-magnetic particles of UK Polymer Laboratories Co., Ltd. to a liquid containing antigen-immobilized magnetic particles of Architect Syphilis TP reagent, and 0% and 0.36% were added as particle weight concentrations.
*: An equal amount of a solution containing 4% casein was added to a solution containing nonmagnetic particles, stirred at room temperature for 1 hour, centrifuged to remove the solution, and further washed with a buffer solution. The product thus obtained was dispersed in a liquid containing antigen-immobilized magnetic particles.
These two types of reagents, namely, a liquid containing antigen-immobilized magnetic particles of Architect Syphilis TP reagent (hereinafter referred to as “ordinary reagent”) and a liquid containing antigen-immobilized magnetic particles of Architect Syphilis TP reagent. For a liquid in which non-magnetic particles treated with casein are dispersed (hereinafter referred to as “non-magnetic particle-containing reagent”), sensitivity to positive samples, specificity to negative samples, and false positive Specificity for the indicated specimens was measured.
In comparison using a commercially available seroconversion panel, there was no difference in sensitivity between the two types of reagents (FIG. 2: normal reagents are Current (A) and Current (B)). Moreover, there was no difference in the signal intensity of the positive specimen (FIG. 3). The specificity of the specimen confirmed to be negative was 99.72% (5335/5350) for the usual reagent (Current assay), whereas 99.91% (5345/5%) for the reagent containing nonmagnetic particles (Improved assay). 5350), a significant improvement was observed. (Table 1)
さらに、かつて偽陽性を示した検体に対する偽陽性率は、通常試薬(Current assay)が89.0% (105/118)であったのに対し、非磁性粒子含有試薬(Verif Lot 1A)は32.2% (38/118)と大きな改善が認められた（表２）。 Furthermore, the false positive rate for the specimen that once showed false positive was 89.0% (105/118) for the normal reagent (Current assay), whereas 32.2% (Verif Lot 1A) for the nonmagnetic particle-containing reagent (Verif Lot 1A) 38/118), a significant improvement was observed (Table 2).
また偽陽性検体のシグナル強度にも改善が認められた（図４、NegativeはFTA-ABS法で陰性と判定された検体、FTA-ABS Indeterm.は同法で判定保留と判定された検体、Improved productは非磁性粒子含有試薬、Current productは通常試薬を示す）。 The signal intensity of false-positive samples was also improved (Fig. 4, Negative is a sample determined to be negative by the FTA-ABS method, FTA-ABS Indeterm. Is a sample determined to be pending by the same method, Improved product is a non-magnetic particle-containing reagent, and Current product is a normal reagent).
また、この非特異抑制効果の安定性について検討を行った。本来の保管温度5℃に対し、37℃ストレス条件下で１ヶ月保管した後に、かつて偽陽性を示した18例の検体を測定した。通常試薬２ロット(Ref 1およびRef 2)で17例が偽陽性を示したのに対し、非磁性粒子含有試薬３ロット(Ver 1、Ver 2 およびVer 5)では偽陽性は1〜2例のみであり、抑制効果が安定であることが示された（図５）。 In addition, the stability of this non-specific suppression effect was examined. Eighteen specimens that once showed false positives were measured after one month storage at 37 ° C. under the original storage temperature of 5 ° C. In normal reagent 2 lots (Ref 1 and Ref 2), 17 cases showed false positive, whereas in non-magnetic particle containing reagents 3 lots (Ver 1, Ver 2 and Ver 5), only 1 or 2 false positives It was shown that the suppression effect is stable (FIG. 5).
〔トロンビン非特異反応の検出測定〕
特許第2,702,616号明細書（特許文献２）で示されるように、PIVKA-II測定においてトロンビンに由来する非特異シグナルは深刻な問題である。ここでは、PIVKA-IIとは関係ないモノクローナル抗体を磁性微粒子に結合させ、また、標識抗体として抗トロンビン抗体を用いることにより、非特異的に磁性微粒子に結合するトロンビンを検出した。そして非磁性微粒子の添加による、非特異的トロンビンシグナルの減少を観察した。また測定にはABBOTT ARCHITECTTM システムを用いた。
１）一次反応 反応セルで、以下に示す容量の検体、検体希釈液（アッセイ緩衝液）、及びマウスモノクローナル抗体を固相化した磁性微粒子懸濁液を混合する。非磁性粒子は、アッセイ緩衝液または、固相化磁性微粒子懸濁液中に添加した。非特異結合を十分に減らせるように、固相化微粒子には牛血清アルブミンがオーバーコートされまた、アッセイ緩衝液および磁性微粒子縣濁液中には界面活性剤が添加されている。磁性微粒子には英国ポリマーラボ社製カルボキシル基修飾磁性微粒子を、非磁性微粒子には、米国セラディン社製、カルボキシル基修飾ラテックス微粒子を用いた。粒子直径はそれぞれ、約5μm（磁性微粒子）, 約0.5μm（非磁性粒子）である。非特異物質の反応は微粒子表面で生じるため、非磁性粒子の粒子径を小さいものにし、添加量当たりの表面積を増やした方が有効であることは言うまでも無い。この検討では、固相化磁性微粒子は0.025%、非磁性粒子は1.25％添加されているため、各微粒子が真球であるとした場合の表面積は非磁性微粒子が磁性微粒子の500倍になっている。またこの検討にはトロンビンの非特異シグナルが観察される血清検体をサンプルとして用いた。
血清検体 50μL
アッセイ緩衝液 50μL
マウスモノクローナル抗体固相化磁性微粒子縣濁液 50μL
[Detection and measurement of non-thrombin specific reaction]
As shown in Japanese Patent No. 2,702,616 (Patent Document 2), the nonspecific signal derived from thrombin is a serious problem in the PIVKA-II measurement. Here, a monoclonal antibody unrelated to PIVKA-II was bound to the magnetic microparticles, and thrombin binding to the magnetic microparticles was detected nonspecifically by using an antithrombin antibody as the labeled antibody. A decrease in non-specific thrombin signal due to the addition of non-magnetic fine particles was observed. The ABBOTT ARCHITECT ™ system was used for the measurement.
1) In a primary reaction reaction cell, a sample having the following volume, a sample diluent (assay buffer), and a magnetic fine particle suspension in which a mouse monoclonal antibody is immobilized are mixed. Nonmagnetic particles were added in assay buffer or solid phase magnetic microparticle suspension. In order to sufficiently reduce non-specific binding, the immobilized microparticles are overcoated with bovine serum albumin, and a surfactant is added to the assay buffer and the magnetic microparticle suspension. As magnetic fine particles, carboxyl group-modified magnetic fine particles manufactured by UK Polymer Labs were used, and as non-magnetic fine particles, carboxyl group-modified latex fine particles manufactured by Celadin, USA were used. The particle diameters are about 5 μm (magnetic fine particles) and about 0.5 μm (nonmagnetic particles), respectively. Since the reaction of the non-specific substance occurs on the surface of the fine particles, it goes without saying that it is more effective to reduce the particle diameter of the non-magnetic particles and increase the surface area per added amount. In this study, 0.025% solid-phase magnetic fine particles and 1.25% non-magnetic particles are added, so the surface area when each fine particle is a true sphere is 500 times that of magnetic fine particles. Yes. In this study, a serum specimen in which a non-specific signal of thrombin was observed was used as a sample.
Serum sample 50μL
Assay buffer 50 μL
Mouse monoclonal antibody solid phase magnetic particle suspension 50μL
２）第一回インキュベーション 攪拌装置で攪拌した後、37℃、18分間インキュベーションし、検体中の抗体を特異的にマイクロパーティクル上の抗原に反応させる。
３）B/F分離／洗浄 反応セルを次のステップに移送する間に磁石により磁性マイクロパーティクルを反応セルの内壁に押し付けておいて未反応物及び非磁性マイクロパーティクルを除去（B/F分離）し、洗浄液で、反応セル内を洗浄する。
４）二次反応 アクリジニウム標識コンジュゲート（アクリジニウム化抗ヒトトロンビン）溶液 50μLを反応セルに分注する。
５）インキュベーション 攪拌装置で攪拌した後、37℃、4分間インキュベーションし、反応生成物とアクリジニウム標識コンジュゲートの反応を進行させ、磁性微粒子上にトロンビンが非特異的に結合した場合に、磁性微粒子上のトロンビン−標識抗ヒトトロンビン抗体コンジュゲート複合体を形成させる。
６）B/F分離／洗浄 反応セルを次のステップに移送する間に磁石により磁性マイクロパーティクルを反応セルの内壁に押し付けておいて未反応標識コンジュゲートを除去（B/F分離）し、洗浄液で、未反応のコンジュゲートを洗い流し、複合体を浄化する。
７）アクリジニウムの活性化 プレトリガー液を100μL、次いでトリガー液300μLを加え、複合体上のアクリジニウムを活性化する。
８）検出 アクリジニウムの活性化により引き起こされた化学発光を光電子増倍管で検出する（化学発光度は、RLU（相対的化学発光単位）値として数値化される）。
2) After stirring with the first incubation stirrer, incubate at 37 ° C. for 18 minutes to specifically react the antibody in the specimen with the antigen on the microparticle.
3) While transferring the B / F separation / washing reaction cell to the next step, the magnetic microparticles are pressed against the inner wall of the reaction cell by a magnet to remove unreacted substances and nonmagnetic microparticles (B / F separation). Then, the inside of the reaction cell is washed with a washing solution.
4) Secondary reaction Acridinium-labeled conjugate (acridinized anti-human thrombin) solution 50 μL is dispensed into the reaction cell.
5) After stirring with an incubation stirrer, incubate at 37 ° C for 4 minutes to allow the reaction product to react with the acridinium-labeled conjugate, and when thrombin binds nonspecifically on the magnetic microparticles, A thrombin-labeled anti-human thrombin antibody conjugate complex.
6) While transferring the B / F separation / washing reaction cell to the next step, the magnetic microparticles are pressed against the inner wall of the reaction cell by a magnet to remove unreacted labeled conjugate (B / F separation), and the washing solution The unreacted conjugate is washed away and the complex is purified.
7) Activation of acridinium 100 μL of pre-trigger solution and then 300 μL of trigger solution are added to activate acridinium on the complex.
8) The chemiluminescence caused by the activation of the detected acridinium is detected with a photomultiplier tube (the chemiluminescence is quantified as an RLU (relative chemiluminescence unit) value).
測定結果を図６に示した。非磁性微粒子未添加時に比べ、非磁性微粒子を固相化磁性微粒子縣濁液中に添加したとき、アッセイ緩衝液中に添加したときにおいて、非特異的トロンビン由来のシグナルを極めて顕著に減少させる効果が認められた。 The measurement results are shown in FIG. Compared to when no non-magnetic fine particles are added, when non-magnetic fine particles are added to the solid-phase magnetic fine particle suspension and when added to the assay buffer, the effect of significantly reducing the signal derived from non-specific thrombin Was recognized.
実施例３と同様に、７３検体の血清検体を用いて、非特異トロンビンシグナルを観察した。非磁性微粒子未添加時と非磁性微粒子をアッセイ緩衝液に添加したときの比較を行った。
測定結果を図７（非磁性微粒子、未添加時）、図８（非磁性微粒子、添加時）に示した。非磁性微粒子添加時に極めて顕著に、非特異的トロンビンシグナルを減少させる効果が認められた。
As in Example 3, non-specific thrombin signals were observed using 73 serum samples. Comparison was made when non-magnetic fine particles were not added and when non-magnetic fine particles were added to the assay buffer.
The measurement results are shown in FIG. 7 (when non-magnetic fine particles are not added) and FIG. 8 (when non-magnetic fine particles are added). The effect of reducing the non-specific thrombin signal was observed remarkably when the non-magnetic fine particles were added.
本発明の技術は、免疫測定で問題となっていた固相化磁性微粒子に対する非特異的な反応などに起因して発生する偽陽性を簡単な手法で効率的に且つ効果的に減少せしめるので、より信頼性の高い測定結果を得ることができて、臨床検査、血液検査の分野で有用である。また、本技術は、全自動測定システムの利用による低コストで多数検体の検査にも応用可能である。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
Since the technique of the present invention can effectively and effectively reduce false positives caused by non-specific reactions to solid-phased magnetic microparticles, which has been a problem in immunoassay, with a simple method, A more reliable measurement result can be obtained, which is useful in the fields of clinical tests and blood tests. In addition, the present technology can be applied to examination of a large number of samples at a low cost by using a fully automatic measurement system.
It will be apparent that the invention may be practiced otherwise than as particularly described in the foregoing description and examples. Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, and thus are within the scope of the claims appended hereto.
Claims (14)
を含んでいることを特徴とする請求項２に記載の免疫測定方法。 A step of bringing a sample to be measured into contact with a magnetic fine particle in which an antigen is immobilized and a polymer fine particle containing the same polymer as the constituent polymer of the magnetic fine particle or a similar polymer and not containing a magnetic substance; B / F separation and washing treatment under the influence, the step of contacting the antigen-human immunoglobulin complex (complex) bound to the magnetic fine particle solid phase with the labeled anti-human immunoglobulin antibody, A step of B / F separation and washing treatment under the influence, a step of quantifying antigen-specific human immunoglobulin using the label as an indicator,
The immunoassay method according to claim 2, comprising:
を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の免疫測定方法。 A step of bringing a sample to be measured into contact with a magnetic fine particle on which an antigen or an antibody is solid-phased and a fine particle having the same or similar material surface as that of the magnetic fine particle and not containing a magnetic substance; B / F separation and washing treatment under the influence of a magnet, contact of a substance to be measured-antigen or antibody bound to a magnetic fine particle solid phase with a labeled antibody, under the influence of a magnet B / F separation and washing process, quantifying substances to be measured using the label as an indicator,
The immunoassay method according to claim 1, comprising:
At least (a) a magnetic fine particle on which an antigen is immobilized, (b) a polymer fine particle containing the same polymer as the constituent polymer of the magnetic fine particle or a similar polymer and not containing a magnetic substance, and (c) labeled. The immunoassay reagent according to claim 12 or 13, comprising an anti-human immunoglobulin antibody.
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