JP2008120740A - Cd8t cell activation-inhibiting agent, and therapeutic agent for rheumatism and dna vaccine for treating rheumatism comprising the same - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a CD8T cell activation-inhibiting agent, and a therapeutic agent for rheumatism and a DNA vaccine for treating rheumatism. <P>SOLUTION: The CD8T cell activation-inhibiting agent comprises a Jagged 1 gene or a Jagged 1 protein. The CD8T cell activation-inhibiting agent inhibits activation of a CD8T cell and accordingly makes prevention or treatment of rheumatism possible. Preferably, the gene above is particularly a structural gene in an extracellular region of the Jagged 1 protein. Preferably, a recombinant vector having the structural gene inserted therein is used as the DNA vaccine. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、CD8T細胞活性化抑制剤、リウマチ治療薬およびリウマチ治療用DNAワクチンに関する。   The present invention relates to a CD8 T cell activation inhibitor, a rheumatic drug, and a DNA vaccine for rheumatic therapy.

関節リウマチは、慢性持続性の多発関節炎であり、身体の多くの関節において炎症が起こって腫れるために痛みを伴い、この状態が長期にわたって進行することによって、さらに、関節の変形や機能障害を併発する、難知性の疾患である。日本国内においては100万人近くの羅患者が存在することが知られている。関節リウマチが発症するメカニズムは、以下のような免疫異常によるものと考えられている。すなわち、何らかの原因により、関節腔の内面を覆っている滑膜細胞の増殖ならびに関節の血管の増加が起こり、血管内から関節滑膜組織にリンパ球やマクロファージ等の白血球が遊走する。このため、関節局所で免疫応答が生じ、リンパ球やマクロファージが産生するサイトカインの作用によって炎症反応が引き起こり、リウマチ疾患になるというメカニズムである。しかしながら、このような免疫異常が起こる原因については未だ明らかとなっていない。   Rheumatoid arthritis is a chronic persistent polyarthritis that is painful due to inflammation and swelling in many joints of the body, and this condition progresses over a long period of time, and it is accompanied by joint deformation and dysfunction It is a refractory disease. It is known that there are nearly 1 million patients in Japan. The mechanism by which rheumatoid arthritis develops is thought to be due to the following immune abnormalities. That is, for some reason, the proliferation of synovial cells covering the inner surface of the joint cavity and the increase of joint blood vessels occur, and leukocytes such as lymphocytes and macrophages migrate from the blood vessels to the joint synovial tissue. For this reason, an immune response is generated locally in the joint, and an inflammatory reaction is caused by the action of cytokines produced by lymphocytes and macrophages, resulting in rheumatic diseases. However, the cause of such immune abnormalities has not yet been clarified.

リウマチ疾患等の膠原病においては、一般的に、患者自身のタンパク質(自己抗原)を認識するT細胞の活性化が主要な病態を形成していると考えられている。そこで、関節リウマチの治療薬としては、現在、免疫抑制剤を含む様々な種類の薬剤が使用されており、具体的に、リウマチ疾患において過剰に存在するTNFγをターゲットとする中和抗体を用いた治療薬や、TFNの受容体(細胞外ドメインのみの可溶性TNF受容体)を補充する治療薬等が販売されている。しかしながら、未だ有効性の高い治療薬は見出されていない。
Rovensky J, Svik K. Stancikova M, Istok R, Effect of immunostimulatory ribomunyl on preventive treatment of rat adjuvant arthritis with cyclosporine and methotrexate. J Rheumatol. 2003 Sep; 30(9):2027-32. Matsuura M, Imayoshi T, Chiba K, Okumoto T. Effect of FTY720, a novel immunosuppressant, on adjuvant-induced arthritis in rats. Inflamm Res. 2000 Aug; 49(8):404-10.
In collagen diseases such as rheumatic diseases, it is generally considered that the activation of T cells recognizing a patient's own protein (self-antigen) forms a major pathological condition. Therefore, various types of drugs including immunosuppressive drugs are currently used as therapeutic agents for rheumatoid arthritis. Specifically, neutralizing antibodies targeting TNFγ that are excessively present in rheumatic diseases were used. Therapeutic drugs, therapeutic drugs that supplement TFN receptors (soluble TNF receptors only in the extracellular domain), and the like are on the market. However, a highly effective therapeutic agent has not yet been found.
Rovensky J, Svik K. Stancikova M, Istok R, Effect of immunostimulatory ribomunyl on preventive treatment of rat adjuvant arthritis with cyclosporine and methotrexate.J Rheumatol. 2003 Sep; 30 (9): 2027-32. Matsuura M, Imayoshi T, Chiba K, Okumoto T. Effect of FTY720, a novel immunosuppressant, on adjuvant-induced arthritis in rats.Inflamm Res. 2000 Aug; 49 (8): 404-10.

そこで、本発明は、リウマチに対する新たな治療薬の提供を目的とする。   Therefore, an object of the present invention is to provide a new therapeutic agent for rheumatism.

前記目的を達成するために、本発明のCD8T細胞活性化抑制剤は、遺伝子およびタンパク質のいずれか一方を含むCD8T細胞の活性化抑制剤であって、前記遺伝子が、Jagged1遺伝子であり、前記タンパク質が、Jagged1タンパク質であることを特徴とする。以下、本発明において、Jagged1タンパク質を「Jag1タンパク質」、Jagged1遺伝子を「Jag1遺伝子」という。   To achieve the above object, the CD8 T cell activation inhibitor of the present invention is a CD8 T cell activation inhibitor containing either a gene or a protein, wherein the gene is a Jagged1 gene, and the protein Is a Jagged1 protein. Hereinafter, in the present invention, the Jagged1 protein is referred to as “Jag1 protein”, and the Jagged1 gene is referred to as “Jag1 gene”.

自己に対する免疫には、一般に、CD4T細胞(CD4陽性細胞)やCD8T細胞(CD8陽性細胞)が重要な役割を有することが知られている。そして、リウマチと同様に自己免疫疾患である多発筋炎は、主に細胞障害性CD8T細胞と呼ばれるキラーT細胞が、炎症を起こした筋肉に湿潤しているため、自己の筋細胞がCD8T細胞の標的となって、組織破壊が生じていると考えられる。一方、CD8T細胞は、CD4T細胞と異なり、標的組織ではなくリンパ節で抗原提示を受けて増殖し、抹消血を経由して標的組織に移ることが知られており、非特異的刺激でも増殖し易い。このため、健常人の抹消血においても、ウイルス等の外敵を攻撃するCD8T細胞が多く存在する。このようなCD8T細胞の特性を考慮すると、多発筋炎患者の抹消血には健常者よりも高頻度にCD8T細胞のクローン性増多があると推定される。そこで、本発明者は、同じように自己免疫疾患の一つであるリウマチ患者について、CD8T細胞の活性化を抑制(不活性化)することによって、その細胞応答性を抑制すれば、CD8T細胞が自己細胞(自己組織)を標的とすることを抑制でき、結果的にリウマチを予防、治療できると推測した。そして、本発明者は、鋭意研究を行った結果、T細胞のレセプターであるNotchタンパク質と、そのリガンドであるJag1タンパク質とが相互作用することによって、CD8T細胞の活性化が抑制される(不活性化する)との知見を得て、本発明を完成するに至った。   In general, it is known that CD4 T cells (CD4 positive cells) and CD8 T cells (CD8 positive cells) have an important role in immunity against self. And polymyositis, which is an autoimmune disease like rheumatism, is mainly because killer T cells called cytotoxic CD8 T cells are moistened in inflamed muscles, so that their own myocytes are the target of CD8 T cells. Thus, it is considered that organizational destruction has occurred. On the other hand, unlike CD4 T cells, CD8 T cells are known to proliferate upon receiving antigen presentation in the lymph nodes, not the target tissue, and are transferred to the target tissue via peripheral blood, and proliferate even with non-specific stimulation. easy. For this reason, there are many CD8 T cells that attack external enemies such as viruses even in peripheral blood of healthy persons. In consideration of such characteristics of CD8 T cells, it is presumed that peripheral blood of polymyositis patients has clonal increase of CD8 T cells more frequently than healthy individuals. Therefore, the present inventor, in the same way, for rheumatic patients who are one of the autoimmune diseases, by suppressing (inactivating) the activation of CD8 T cells, the CD8 T cells are It was speculated that targeting of autologous cells (self tissue) could be suppressed, and as a result, rheumatism could be prevented and treated. As a result of intensive studies, the present inventor inhibited the activation of CD8 T cells by the interaction of Notch protein, which is a receptor for T cells, and Jag1 protein, which is its ligand (inactivation). The present invention has been completed.

すなわち、本発明のCD8T細胞活性化抑制剤によれば、Jag1タンパク質(Jag1遺伝子から翻訳されたJag1タンパク質を含む)とNotchタンパク質とが相互作用することによって、CD8T細胞の活性化が抑制される。そして、CD8T細胞の不活性化により、例えば、前記T細胞の細胞応答性や、T細胞からのサイトカインの産生、T細胞の増殖等が抑制され、結果として、リウマチの予防や治療が可能となる。また、リウマチに関与すると考えられるCD8T細胞の活性化を抑制することから、従来のようなあらゆる免疫力を抑制する薬剤とは異なり、例えば、副作用を軽減し、主として治療目的であるリウマチに関与する自己免疫を抑制することが可能になると考えられる。このため、本発明のCD8T細胞活性化抑制剤は、新たなリウマチ治療剤として極めて有用である。   That is, according to the CD8 T cell activation inhibitor of the present invention, the activation of CD8 T cells is suppressed by the interaction of Jag1 protein (including Jag1 protein translated from Jag1 gene) and Notch protein. Inactivation of CD8 T cells, for example, cell responsiveness of T cells, cytokine production from T cells, proliferation of T cells, and the like are suppressed, and as a result, rheumatism can be prevented or treated. . Moreover, since it suppresses the activation of CD8 T cells which are considered to be involved in rheumatism, it is different from conventional drugs that suppress immunity, for example, it reduces side effects and is mainly involved in rheumatism, which is a therapeutic purpose. It is considered possible to suppress autoimmunity. Therefore, the CD8 T cell activation inhibitor of the present invention is extremely useful as a new therapeutic agent for rheumatism.

本発明のCD8T細胞活性化抑制剤は、前述のように、遺伝子およびタンパク質のいずれか一方を含み、前記遺伝子が、Jag1遺伝子であり、前記タンパク質が、Jag1タンパク質であることを特徴とする。   As described above, the CD8 T cell activation inhibitor of the present invention contains either a gene or a protein, wherein the gene is a Jag1 gene, and the protein is a Jag1 protein.

本発明のCD8T細胞活性化抑制剤によって、CD8T細胞の活性化が抑制される理由は、前述のように、Jag1タンパク質とT細胞のレセプターであるNotchタンパク質との相互作用によるものと考えられる。しかしながら、この推定メカニズムは、本発明を何ら制限するものではない。つまり、本発明のCD8T細胞活性化抑制剤は、Jag1タンパク質およびJag1遺伝子の少なくとも一方を含んでいればよく、メカニズムに関わらずCD8T細胞の活性化を抑制することができる。なお、後述する実施例において、本発明のCD8T細胞活性化抑制剤により、実際に、CD8T細胞が不活性化され、リウマチの症状が抑制されることは証明済みである。   The reason why CD8 T cell activation is suppressed by the CD8 T cell activation inhibitor of the present invention is considered to be due to the interaction between Jag1 protein and Notch protein, which is a receptor for T cells, as described above. However, this estimation mechanism does not limit the present invention in any way. That is, the CD8 T cell activation inhibitor of the present invention only needs to contain at least one of the Jag1 protein and the Jag1 gene, and can suppress the activation of CD8 T cells regardless of the mechanism. In the examples described below, it has been proved that the CD8 T cell activation inhibitor of the present invention actually inactivates CD8 T cells and suppresses rheumatic symptoms.

本発明において、CD8T細胞の活性化を抑制するために含まれる成分は、前述のような遺伝子およびタンパク質のいずれであってもよい。以下に、第1の実施形態として、前記遺伝子を含むCD8T細胞活性化抑制剤、第2の実施形態として、前記タンパク質を含むCD8T細胞活性化抑制剤について説明する。   In the present invention, the component contained for suppressing activation of CD8 T cells may be any of the genes and proteins as described above. Below, the CD8 T cell activation inhibitor containing the said gene as 1st Embodiment and the CD8 T cell activation inhibitor containing the said protein as 2nd Embodiment are demonstrated.

<第1の実施形態>
本実施形態は、遺伝子を含むCD8T細胞活性化抑制剤の例である。本実施形態において、CD8T細胞活性化抑制剤は、Jag1遺伝子を含んでいればよい。本発明におけるJag1遺伝子とは、例えば、非翻訳部分を含むJag1遺伝子(例えば、完全長配列)でもよいし、翻訳部分のみを含むJag1タンパク質の構造遺伝子(以下、「Jag1構造遺伝子」という)であってもよい。さらに、これには限定されず、後述するように、Jag1タンパク質における細胞内領域を部分的に、もしくは全部除去した領域(例えば、Jag1タンパク質の細胞外領域)の構造遺伝子であってもよい。本発明において「構造遺伝子」とは、転写・翻訳を受けタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列を規定する遺伝子(翻訳領域)を意味する。
<First Embodiment>
This embodiment is an example of a CD8 T cell activation inhibitor containing a gene. In the present embodiment, the CD8 T cell activation inhibitor only needs to contain the Jag1 gene. The Jag1 gene in the present invention may be, for example, a Jag1 gene containing a non-translated portion (for example, a full-length sequence), or a Jag1 protein structural gene containing only a translated portion (hereinafter referred to as “Jag1 structural gene”). May be. Furthermore, the present invention is not limited to this, and as described later, it may be a structural gene of a region where the intracellular region in Jag1 protein is partially or completely removed (for example, the extracellular region of Jag1 protein). In the present invention, “structural gene” means a gene (translation region) that undergoes transcription / translation and defines the amino acid sequence of a protein or polypeptide.

まず、Jag1構造遺伝子としては、例えば、以下の(a)〜(c)に示すいずれか一つのDNAがあげられる。
(a)配列番号3の塩基配列からなるDNA
(b)配列番号8の塩基配列からなるDNA
(c)前記(a)〜(b)において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記Jag1タンパク質と同様の機能を有するタンパク質をコードするDNA
First, examples of the Jag1 structural gene include any one of DNAs shown in the following (a) to (c).
(A) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3
(B) DNA comprising the base sequence of SEQ ID NO: 8
(C) DNA encoding a protein having a base sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the above (a) to (b) and having the same function as the Jag1 protein

前記(a)のDNAは、マウスJag1タンパク質の構造遺伝子(CDS領域)であり、配列番号2に示すマウスJag1タンパク質のアミノ酸配列(1218アミノ酸残基)をコードする。また、前記(b)のDNAは、ヒトJag1タンパク質の構造遺伝子(CDS領域)であり、配列番号7に示すヒトJag1タンパク質のアミノ酸配列(1218アミノ酸残基)をコードする。なお、Jag1構造遺伝子は、ヒトやマウス由来の配列には制限されず、例えば、他の哺乳類動物等のJag1構造遺伝子でもよい。   The DNA of (a) is a structural gene (CDS region) of mouse Jag1 protein, and encodes the amino acid sequence (1218 amino acid residues) of mouse Jag1 protein shown in SEQ ID NO: 2. The DNA of (b) is a structural gene (CDS region) of human Jag1 protein and encodes the amino acid sequence (1218 amino acid residues) of human Jag1 protein shown in SEQ ID NO: 7. The Jag1 structural gene is not limited to human or mouse-derived sequences, and may be, for example, a Jag1 structural gene from other mammals.

なお、配列番号1に、マウスJag1遺伝子の全配列を示し、配列番号6には、ヒトJag1遺伝子の全配列を示す(非翻訳領域を含む完全長配列)。また、マウスJag1遺伝子、マウスJag1構造遺伝子(CDS領域)およびマウスJag1タンパク質は、NCBIアクセッション:NM_013822に、ヒトJag1遺伝子、ヒトJag1構造遺伝子(CDS領域)およびヒトJag1タンパク質は、NCBIアクセッション:No.MN_00214に、それぞれ登録されている。   SEQ ID NO: 1 shows the entire sequence of the mouse Jag1 gene, and SEQ ID NO: 6 shows the entire sequence of the human Jag1 gene (full-length sequence including an untranslated region). In addition, mouse Jag1 gene, mouse Jag1 structural gene (CDS region) and mouse Jag1 protein are NCBI accession: NM_013822, human Jag1 gene, human Jag1 structural gene (CDS region) and human Jag1 protein are NCBI accession: No . Each is registered in MN_00214.

前記Jag1構造遺伝子は、前記(a)における配列番号3の塩基配列には限られず、例えば、配列番号2に示すマウスJag1タンパク質のアミノ酸配列をコードする他の塩基配列からなるDNAであってもよい。また、同様に、前記(b)における配列番号8の塩基配列には限られず、例えば、配列番号7に示すヒトsJag1タンパク質のアミノ酸配列をコードする他の塩基配列からなるDNAであってもよい。   The Jag1 structural gene is not limited to the base sequence of SEQ ID NO: 3 in (a), and may be, for example, a DNA consisting of another base sequence encoding the amino acid sequence of the mouse Jag1 protein shown in SEQ ID NO: 2. . Similarly, it is not limited to the base sequence of SEQ ID NO: 8 in (b), and may be, for example, DNA consisting of another base sequence encoding the amino acid sequence of human sJag1 protein shown in SEQ ID NO: 7.

さらに、本発明におけるJag1構造遺伝子は、前記(c)に示すようなDNAでもよい。前記(c)において、欠失、置換または付加が可能な塩基数は、DNAがコードするタンパク質が、Jag1タンパク質の機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。前記塩基数としては、特に制限されないが、例えば、50塩基に対して、1〜6個が好ましく、より好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜4個、特に好ましくは1〜3個である。なお、本発明において、「Jag1タンパク質と同様の機能を有する」とは、Jag1タンパク質と同様のCD8T細胞活性化抑制の機能を有することを意味する(以下、同様)。したがって、本発明における遺伝子は、この機能を有する限りにおいて、(a)や(b)のDNAの部分配列であってもよい。   Furthermore, the Jag1 structural gene in the present invention may be DNA as shown in (c) above. In (c), the number of bases that can be deleted, substituted or added is not particularly limited as long as the protein encoded by the DNA does not lose the function of the Jag1 protein. The number of bases is not particularly limited, but is preferably 1 to 6, more preferably 1 to 5, even more preferably 1 to 4, and particularly preferably 1 to 3 with respect to 50 bases. is there. In the present invention, “having the same function as Jag1 protein” means having the same function of inhibiting CD8 T cell activation as Jag1 protein (hereinafter the same). Therefore, the gene of the present invention may be a partial sequence of DNA of (a) or (b) as long as it has this function.

また、前記(c)に示すDNAは、Jag1タンパク質の機能を喪失しない範囲であれば、例えば、前記(a)および(b)のいずれかのDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであってもよいし、前記いずれかのDNAとの相同性が90%以上のDNAでもよい。ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、各配列番号で示された塩基配列のTm値の±5℃、好ましくは±2℃、より好ましくは±1℃である。条件の具体例として、5×SSC溶液、10×Denhardt溶液、100μg/mlサケ精子DNAおよび1%SDS中、65℃でのハイブリダイゼーション、0.2×SSCおよび1%SDS中、65℃、10分の洗浄(2回)があげられる。また、相同性は、例えば、90%以上であり、好ましくは95%以上、より好ましくは97.5%以上である。   In addition, the DNA shown in (c) is, for example, a DNA that hybridizes under stringent conditions with any of the DNAs of (a) and (b) as long as the function of the Jag1 protein is not lost. Alternatively, it may be a DNA having 90% or more homology with any of the above DNAs. The stringent conditions for hybridization include, for example, standard conditions in the technical field. For example, the temperature condition is ± 5 ° C., preferably ± 5 ° C. of the Tm value of the base sequence indicated by each SEQ ID NO. 2 ° C., more preferably ± 1 ° C. Specific examples of conditions include hybridization at 65 ° C. in 5 × SSC solution, 10 × Denhardt solution, 100 μg / ml salmon sperm DNA and 1% SDS, 65 ° C., 10 in 0.2 × SSC and 1% SDS. Minute washing (twice). The homology is, for example, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97.5% or more.

つぎに、本発明における遺伝子は、前述のように、Jag1構造遺伝子の部分配列であってもよい。すなわち、Jag1タンパク質は、膜貫通ドメインである細胞内領域と、細胞外領域とを有するが、本発明における遺伝子は、例えば、Jag1タンパク質における細胞内領域を部分的にもしくは全部除去した領域の構造遺伝子であってもよい。具体例として、前記細胞内領域を全部除去した、Jag1タンパク質の細胞外領域の構造遺伝子があげられる。このJag1タンパク質の細胞外領域は、疎水性に富む細胞内領域を除いた領域であり、可溶性を示すことから、可溶化Jag1タンパク質(soluble Jag1タンパク質)と呼ぶことができる(以下、「sJag1タンパク質」という)。sJag1タンパク質の構造遺伝子は、以下、「sJag1構造遺伝子」という。このようなsJag1タンパク質は、可溶性に優れるため、例えば、生体内を移動し易く、また、前述のようにCD8T細胞が多く存在する血液等にも導入され易いことから、所望の部位におけるCD8T細胞の活性化を効率良く抑制できる。したがって、前記遺伝子としては、特に、sJag1タンパク質を発現するsJag1構造遺伝子が好ましい。   Next, the gene in the present invention may be a partial sequence of the Jag1 structural gene as described above. That is, the Jag1 protein has an intracellular region that is a transmembrane domain and an extracellular region, and the gene in the present invention is, for example, a structural gene of a region in which the intracellular region in the Jag1 protein is partially or completely removed. It may be. As a specific example, there is a structural gene of the extracellular region of Jag1 protein from which all the intracellular region has been removed. The extracellular region of this Jag1 protein is a region excluding the intracellular region rich in hydrophobicity, and exhibits solubility, so that it can be referred to as a solubilized Jag1 protein (hereinafter referred to as “sJag1 protein”). Called). The structural gene of the sJag1 protein is hereinafter referred to as “sJag1 structural gene”. Since such sJag1 protein is excellent in solubility, for example, it is easy to move in the living body, and as described above, it can be easily introduced into blood or the like in which a large amount of CD8T cells are present. Activation can be suppressed efficiently. Accordingly, the gene is particularly preferably an sJag1 structural gene that expresses the sJag1 protein.

前記sJag1構造遺伝子としては、例えば、以下の(d)〜(f)に示すいずれか一つのDNAがあげられる。
(d)配列番号4の塩基配列からなるDNA
(e)配列番号9の塩基配列からなるDNA
(f)前記(d)〜(e)において、1個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記sJag1タンパク質と同様の機能を有するタンパク質をコードするDNA
Examples of the sJag1 structural gene include any one of DNAs shown in the following (d) to (f).
(D) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4
(E) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 9
(F) DNA encoding a protein having a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in (d) to (e) and having the same function as the sJag1 protein

前記(d)のDNAは、マウスsJag1タンパク質の構造遺伝子であり、配列番号2に示すマウスJag1タンパク質のアミノ酸配列(1218アミノ酸残基)における1〜1067番目の領域(配列番号5)をコードする。また、前記(e)のDNAは、ヒトsJag1タンパク質の構造遺伝子であり、配列番号7に示すヒトJag1タンパク質のアミノ酸配列(1218アミノ酸残基)における1〜930番目の領域(配列番号10)をコードする。なお、sJag1構造遺伝子は、ヒトやマウス由来の配列には制限されず、例えば、他の哺乳類動物等のsJag1構造遺伝子でもよい。   The DNA of (d) is a structural gene of mouse sJag1 protein, and encodes the 1-1067th region (SEQ ID NO: 5) in the amino acid sequence (1218 amino acid residues) of mouse Jag1 protein shown in SEQ ID NO: 2. The DNA of (e) is a structural gene of human sJag1 protein and encodes the 1st to 930th regions (SEQ ID NO: 10) in the amino acid sequence (1218 amino acid residues) of human Jag1 protein shown in SEQ ID NO: 7. To do. The sJag1 structural gene is not limited to human or mouse-derived sequences, and may be, for example, an sJag1 structural gene from other mammals.

また、sJag1構造遺伝子は、前記(d)における配列番号4の塩基配列には限られず、配列番号5に示すマウスsJag1タンパク質のアミノ酸配列をコードする他の塩基配列からなるDNAであってもよい。また、同様に、前記(e)における配列番号9の塩基配列には限られず、例えば、配列番号10に示すヒトsJag1タンパク質のアミノ酸配列をコードする他の塩基配列からなるDNAであってもよい。   The sJag1 structural gene is not limited to the base sequence of SEQ ID NO: 4 in (d) above, and may be a DNA consisting of another base sequence encoding the amino acid sequence of the mouse sJag1 protein shown in SEQ ID NO: 5. Similarly, the base sequence of SEQ ID NO: 9 in (e) above is not limited, and for example, it may be a DNA consisting of another base sequence encoding the amino acid sequence of human sJag1 protein shown in SEQ ID NO: 10.

さらに、本発明におけるsJag1遺伝子は、前記(f)に示すようなDNAでもよい。前記(f)において、欠失、置換または付加が可能な塩基数は、DNAがコードするタンパク質が、sJag1タンパク質の機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。例えば、50塩基に対して、1〜6個が好ましく、より好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜4個、特に好ましくは1〜3個である。なお、本発明において、「sJag1タンパク質と同様の機能を有する」とは、sJag1タンパク質と同様のCD8T細胞活性化抑制の機能を有することを意味する(以下、同様)。したがって、本発明における遺伝子は、この機能を有する限りにおいて、(d)や(e)のDNAの部分配列であってもよい。   Further, the sJag1 gene in the present invention may be DNA as shown in (f) above. In (f), the number of bases that can be deleted, substituted or added is not particularly limited as long as the protein encoded by the DNA does not lose the function of the sJag1 protein. For example, with respect to 50 bases, 1 to 6 are preferable, more preferably 1 to 5, further preferably 1 to 4, and particularly preferably 1 to 3. In the present invention, “having the same function as sJag1 protein” means having the same function of inhibiting CD8 T cell activation as sJag1 protein (hereinafter the same). Therefore, the gene in the present invention may be a partial sequence of DNA of (d) or (e) as long as it has this function.

前記(f)に示すDNAは、sJag1タンパク質の機能を喪失しない範囲であれば、例えば、前記(d)〜(e)のいずれかのDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであってもよいし、前記いずれかのDNAとの相同性が90%以上のDNAでもよい。また、相同性は、好ましくは95%以上、より好ましくは97.5%以上である。   The DNA shown in (f) may be, for example, a DNA that hybridizes under stringent conditions with any of the DNAs of (d) to (e) as long as it does not lose the function of the sJag1 protein. Alternatively, it may be a DNA having 90% or more homology with any of the above DNAs. The homology is preferably 95% or more, more preferably 97.5% or more.

また、本発明における遺伝子は、例えば、sJag1タンパク質の二量体をコードする配列であってもよい。   Further, the gene in the present invention may be, for example, a sequence encoding a dimer of sJag1 protein.

これらの遺伝子は、天然物でも合成物でもよく、例えば、公知であるJag1タンパク質やsJag1タンパク質のアミノ酸配列、それらの構造遺伝子の塩基配列等の情報に基づいて、PCRやRT-PCR等の従来公知の方法により、クローニングすることが可能である。また、前記(c)や(f)に示す塩基が欠失等したDNAについては、例えば、部位特異的突然変異誘発法等の従来公知の方法を適用することによって、容易に得ることができる。   These genes may be natural products or synthetic products. For example, based on information such as the amino acid sequences of the known Jag1 protein and sJag1 protein, the base sequences of their structural genes, and the like, known in the art such as PCR and RT-PCR It is possible to clone by this method. In addition, the DNA in which the base shown in (c) or (f) is deleted can be easily obtained by applying a conventionally known method such as site-directed mutagenesis.

本実施形態におけるCD8T細胞活性化抑制剤の形態としては、特に制限されないが、DNAワクチンであることが好ましい。本発明のDNAワクチンは、前述のJag1構造遺伝子やsJag1構造遺伝子等の遺伝子を含んでいればよく、その調製方法や組成、使用方法等は何ら制限されない。   Although it does not restrict | limit especially as a form of the CD8 T cell activation inhibitor in this embodiment, It is preferable that it is a DNA vaccine. The DNA vaccine of this invention should just contain genes, such as the above-mentioned Jag1 structural gene and sJag1 structural gene, The preparation method, a composition, a usage method, etc. are not restrict | limited at all.

以下、DNAワクチンの一例として、組換えベクターを例にあげて説明する。すなわち、発現ベクター等のベクターに前述のJag1構造遺伝子やsJag1構造遺伝子等の遺伝子が挿入された組換えベクターである。なお、これは一例であって、本発明を限定するものではない。   Hereinafter, a recombinant vector will be described as an example of a DNA vaccine. That is, it is a recombinant vector in which a gene such as the aforementioned Jag1 structural gene or sJag1 structural gene is inserted into a vector such as an expression vector. This is an example and does not limit the present invention.

前記ベクターとしては、特に制限されず、例えば、DNAワクチンを投与する対象細胞や対象組織、投与方法等に応じて適宜決定できるが、例えば、非ウイルスベクターとウイルスベクターがあげられる。前記非ウイルスベクターとしては、例えば、治療や予防の対象となる細胞内や生体内で前記遺伝子を発現できるベクターがあげられ、例えば、pcDNA3.1(Invitrogen社)、pZeoSV(Invitrogen社)、pBK−CMV(Stratagene社)、pCAGGS(Gene108,193−200(1991))等の発現ベクターが例示できる。通常、これらのベクターのプロモーターの下流に、発現可能なように前記遺伝子を挿入すればよい。また、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ベクター(AAVベクター;adeno associated virus)、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、SV40、免疫不全症ウイルス(HIV)等のDNAウイルスやRNAウイルスがあげられる。以上のようなベクターに、従来公知の方法に基づいて前記遺伝子を挿入することによって、組換えベクターを製造できる。   The vector is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the target cell or tissue to which the DNA vaccine is administered, the administration method, and the like, and examples thereof include non-viral vectors and viral vectors. Examples of the non-viral vector include vectors capable of expressing the gene in cells or in vivo targeted for treatment or prevention. For example, pcDNA3.1 (Invitrogen), pZeoSV (Invitrogen), pBK- Expression vectors such as CMV (Stratagene) and pCAGGS (Gene108, 193-200 (1991)) can be exemplified. Usually, the gene may be inserted downstream of the promoter of these vectors so that it can be expressed. Examples of viral vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated vectors (AAV vectors; adeno associated viruses), herpes viruses, vaccinia viruses, pox viruses, polioviruses, synbis viruses, Sendai viruses. , SV40, DNA viruses such as immunodeficiency virus (HIV), and RNA viruses. A recombinant vector can be produced by inserting the gene into the above vector based on a conventionally known method.

前記組換えベクターは、さらに、前記遺伝子の発現を調節する調節配列を含んでもよい。前記調節配列としては、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)由来のプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、シミアンウイルス−40(SV−40)、筋βアクチンプロモーター、単純ヘルペスウイルス(HSV)等の構成プロモーター、チミヂンキナーゼプロモーター等の組織特異的プロモーター、成長ホルモン調節性プロモーター、lacオペロン配列の制御下にあるプロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等の誘導性プロモーターや調節性プロモーターがあげられる。このような調節配列は、従来公知の方法に基づいて、前記遺伝子の発現を機能的に調節できる部位に配置または結合させればよい。また、この他にも、例えば、エンハンサー配列、ポリアデニル化シグナル、複製起点配列(ori)等を含んでもよい。   The recombinant vector may further include a regulatory sequence that regulates the expression of the gene. Examples of the regulatory sequence include a promoter derived from cytomegalovirus (CMV), rous sarcoma virus (RSV), simian virus-40 (SV-40), muscle β-actin promoter, herpes simplex virus (HSV) and the like. And tissue-specific promoters such as thymidine kinase promoter, growth hormone-regulated promoters, promoters under the control of the lac operon sequence, zinc-inducible metallothionein promoters and other inducible promoters and regulatory promoters. Such a regulatory sequence may be arranged or bound to a site capable of functionally regulating the expression of the gene based on a conventionally known method. In addition, for example, an enhancer sequence, a polyadenylation signal, an origin of replication sequence (ori) and the like may be included.

また、前記組換えベクターは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等の選択マーカーをコードする配列を有してもよい。また、前記組換えベクターは、例えば、CpGモチーフ(非メチル化CpGモチーフ)を有することが、遺伝子発現を効果的にする観点から好ましい。   The recombinant vector may have a sequence encoding a selection marker such as a drug resistance marker, a fluorescent protein marker, an enzyme marker, a cell surface receptor marker, and the like. In addition, the recombinant vector preferably has, for example, a CpG motif (unmethylated CpG motif) from the viewpoint of effective gene expression.

つぎに、前記組換えベクターをDNAワクチンとして被検体に導入する方法について説明する。DNAワクチンの導入方法は、特に制限されず、例えば、in vivoで直接体内に導入する方法や、被検体から取り出した目的の細胞や組織にex vivoでDNAワクチンを導入し、導入後の細胞等を被検体の体内に戻す方法等がある。   Next, a method for introducing the recombinant vector into a subject as a DNA vaccine will be described. The method for introducing the DNA vaccine is not particularly limited. For example, a method for directly introducing the DNA vaccine into the body in vivo, a method for introducing the DNA vaccine ex vivo into a target cell or tissue taken out from the subject, and a cell after the introduction, etc. There is a method of returning to the body of the subject.

前者のin vivo法の場合、例えば、前記組換えベクターを適当な溶媒に懸濁し、適宜滅菌処理を施した後、被検体に導入すればよい。導入方法は、特に制限されず、例えば、目的の細胞や組織等の種類に応じて、従来公知の方法が適宜採用できる。具体的としては、例えば、筋肉内、腹腔内等への注射、経口投与、皮下組織投与、遺伝子銃による投与、液浸等があげられる。   In the case of the former in vivo method, for example, the recombinant vector may be suspended in a suitable solvent, appropriately sterilized, and then introduced into the subject. The introduction method is not particularly limited, and for example, a conventionally known method can be appropriately employed depending on the type of the target cell or tissue. Specific examples include intramuscular, intraperitoneal injection, oral administration, subcutaneous tissue administration, gene gun administration, immersion, and the like.

後者のex vivo法の場合、例えば、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、遺伝子銃による導入法、DEAE−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、前述のようなウイルスベクターを用いた方法等があげられる。   In the case of the latter ex vivo method, for example, calcium phosphate method, polyethylene glycol method, lipofection method, electroporation method, ultrasonic nucleic acid introduction method, gene gun introduction method, DEAE-dextran method, direct using micro glass tube Examples thereof include an injection method and a method using a virus vector as described above.

DNAワクチンの組成は、特に制限されないが、前記組換ベクターの他に、例えば、補助剤等を含んでもよい。前記補助剤は、特に制限されず、例えば、公知のDNAワクチン用補助剤等を適宜用いることができる。   The composition of the DNA vaccine is not particularly limited, but may include, for example, an auxiliary agent in addition to the recombinant vector. The auxiliary agent is not particularly limited, and for example, a known auxiliary agent for DNA vaccine can be appropriately used.

DNAワクチンの投与部位は、特に制限されず、例えば、自己免疫によりCD8T細胞の活性化が生じている、もしくは、生じるおそれがある部位に投与することができる。また、目的部位への投与は、直接的な投与でもよいし、間接的な投与でもよい。間接的に投与する場合、DNAワクチンは、遺伝子としてsJag1構造遺伝子を含むことが好ましい。前述のように、sJag1構造遺伝子から発現されるsJag1は可溶性であるため、例えば、間接的な投与であっても、発現したsJag1を効率良く目的部位に流動させることが可能である。投与の対象としては、特に制限されないが、例えば、ヒト、マウス等の哺乳類動物等があげられ、また、これらの細胞や組織等を採取し、in vitroで投与することもできる。   The administration site of the DNA vaccine is not particularly limited, and for example, it can be administered to a site where CD8 T cell activation has occurred or is likely to occur due to autoimmunity. In addition, administration to the target site may be direct administration or indirect administration. When administered indirectly, the DNA vaccine preferably contains the sJag1 structural gene as a gene. As described above, since sJag1 expressed from the sJag1 structural gene is soluble, the expressed sJag1 can be efficiently flowed to the target site even by indirect administration, for example. The administration target is not particularly limited, and examples thereof include mammals such as humans and mice, and these cells and tissues can be collected and administered in vitro.

前記DNAワクチンの投与量は、特に制限されず、例えば、投与する対象、投与方法、投与形態、症状等によって適宜決定できる。具体例としては、ヒト(成人)に対して前記組換えベクターを50〜100μg投与することが好ましい。   The dose of the DNA vaccine is not particularly limited, and can be appropriately determined depending on, for example, the subject to be administered, the administration method, the administration form, the symptoms, and the like. As a specific example, it is preferable to administer 50 to 100 μg of the recombinant vector to a human (adult).

<第2の実施形態>
本実施形態は、タンパク質を含むCD8T細胞活性化抑制剤の例である。本実施形態において、CD8T細胞活性化抑制剤は、Jag1タンパク質を含んでいればよい。しかしながら、これには限定されず、後述するように、Jag1タンパク質における細胞内領域を部分的もしくは全部除去した領域(例えば、Jag1タンパク質の細胞外領域)であってもよい。
<Second Embodiment>
This embodiment is an example of a CD8 T cell activation inhibitor containing protein. In the present embodiment, the CD8 T cell activation inhibitor only needs to contain Jag1 protein. However, the present invention is not limited to this, and as described later, it may be a region where the intracellular region in Jag1 protein is partially or entirely removed (for example, the extracellular region of Jag1 protein).

まず、Jag1タンパク質としては、例えば、以下の(A)〜(C)に示すいずれかタンパク質があげられる。
(A)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列番号7のアミノ酸配列からなるタンパク質
(C)前記(A)または(B)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、Jag1タンパク質と同様の機能を有するタンパク質
First, examples of the Jag1 protein include any of the proteins shown in the following (A) to (C).
(A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (B) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (C) in the amino acid sequence of (A) or (B), wherein one or several amino acids are deleted, A protein comprising a substituted or added amino acid sequence and having the same function as Jag1 protein

前記(A)のタンパク質は、マウスJag1タンパク質であり、前記(B)のタンパク質は、ヒトJag1タンパク質である。なお、これらには制限されず、他の哺乳類動物等のJag1タンパク質も使用できる。   The protein (A) is a mouse Jag1 protein, and the protein (B) is a human Jag1 protein. In addition, it is not restrict | limited, Jag1 protein, such as another mammal animal, can also be used.

前記(C)において、欠失、置換または付加が可能なアミノ酸残基数は、前記(A)のマウスsJag1タンパク質や、前記(B)のヒトJag1タンパク質の機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。前記欠失等が可能なアミノ酸残基数は、例えば、50アミノ酸残基に対して、1〜4個が好ましく、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個である。また、配列番号2や配列番号7のアミノ酸配列に対する相同性は、例えば、70%以上である。したがって、本発明におけるタンパク質は、Jag1タンパク質と同様の機能を有する限りにおいて、前記(A)や(B)の部分配列であってもよい。   In (C), the number of amino acid residues that can be deleted, substituted or added is particularly limited as long as it does not lose the function of the mouse sJag1 protein of (A) or the human Jag1 protein of (B). Not. The number of amino acid residues that can be deleted or the like is, for example, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and still more preferably 1 to 2, with respect to 50 amino acid residues. Moreover, the homology with respect to the amino acid sequence of sequence number 2 or sequence number 7 is 70% or more, for example. Therefore, the protein of the present invention may be the partial sequence (A) or (B) as long as it has the same function as the Jag1 protein.

つぎに、本発明におけるタンパク質は、前述のように、Jag1タンパク質には制限されず、その部分配列であってもよい。すなわち、Jag1タンパク質における細胞内領域を全部もしくは部分的に除去した領域であってもよく、具体例として、前記細胞内領域を全部除去した、Jag1タンパク質の細胞外領域(sJag1タンパク質)があげられる。本発明においては、前述のような理由から、sJag1タンパク質が特に好ましい。   Next, the protein in the present invention is not limited to the Jag1 protein as described above, and may be a partial sequence thereof. That is, it may be a region in which the intracellular region in the Jag1 protein is completely or partially removed, and a specific example is the extracellular region of the Jag1 protein (sJag1 protein) from which the intracellular region has been completely removed. In the present invention, sJag1 protein is particularly preferred for the reasons described above.

sJag1タンパク質としては、例えば、以下の(D)〜(F)に示すいずれかのタンパク質があげられる。
(D)配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質
(E)配列番号10のアミノ酸配列からなるタンパク質
(F)前記(D)または(F)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、前記sJag1タンパク質と同様の機能を有するタンパク質
Examples of the sJag1 protein include any of the following proteins (D) to (F).
(D) A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (E) A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 (F) In the amino acid sequence of (D) or (F), one or several amino acids are deleted, A protein comprising a substituted or added amino acid sequence and having the same function as the sJag1 protein

前記(D)のタンパク質は、マウスsJag1タンパク質であり、配列番号2に示すマウス由来Jag1タンパク質のアミノ酸配列(1218アミノ酸残基)における1〜1067番目の領域に相当する。また、前記(E)のタンパク質は、ヒトsJag1タンパク質であり、配列番号7に示すヒト由来Jag1タンパク質のアミノ酸配列(1218アミノ酸残基)における1〜930番目の領域に相当する。なお、これらには制限されず、他の哺乳類動物等のsJag1タンパク質も使用できる。   The protein (D) is a mouse sJag1 protein, and corresponds to the 1st to 1067th regions in the amino acid sequence (1218 amino acid residues) of the mouse-derived Jag1 protein shown in SEQ ID NO: 2. The protein (E) is a human sJag1 protein and corresponds to the 1st to 930th regions in the amino acid sequence (1218 amino acid residues) of the human-derived Jag1 protein shown in SEQ ID NO: 7. In addition, it is not restrict | limited, sJag1 protein, such as another mammal animal, can also be used.

前記(F)において、欠失、置換または付加が可能なアミノ酸残基数は、前記(D)のヒトsJag1タンパク質や、前記(E)のマウスsJag1タンパク質の機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。例えば、50アミノ酸残基に対して、1〜4個が好ましく、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個である。また、配列番号5や配列番号10のアミノ酸配列に対する相同性は、例えば、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上である。したがって、本発明におけるタンパク質は、sJag1と同様の機能を有する限りにおいて、前記(D)や(E)の部分配列であってもよい。   In (F), the number of amino acid residues that can be deleted, substituted or added is not particularly limited as long as it does not lose the function of the human sJag1 protein of (D) or the mouse sJag1 protein of (E). Not. For example, with respect to 50 amino acid residues, 1 to 4 are preferable, more preferably 1 to 3, and still more preferably 1 to 2. The homology with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 10 is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more. Therefore, the protein of the present invention may be the partial sequence (D) or (E) as long as it has the same function as sJag1.

また、本発明におけるタンパク質は、例えば、sJag1タンパク質の二量体であってもよい。   The protein in the present invention may be, for example, a dimer of sJag1 protein.

このようなタンパク質は、例えば、天然物でもよいし、化学合成による合成物でもよいが、容易に大量調製が可能であることから、組換えDNA技術を用いて発現させたタンパク質であることが好ましい。このような組換えDNA技術を用いる調製方法としては、特に制限されないが、例えば、前記第1の実施形態で述べた組換えベクターを使用することが好ましい。この組換えベクターを、例えば、宿主−ベクター系に基づいて、適当な宿主に導入することにより、前記タンパク質を発現させることができる。このような方法により得られたタンパク質は、例えば、塩沈、遠心分離、カラムクロマトグラフィー等の精製処理を必要に応じて施し、回収した精製タンパク質をワクチンとして使用することができる。   Such a protein may be, for example, a natural product or a synthetic product by chemical synthesis, but is preferably a protein expressed using a recombinant DNA technique because it can be easily prepared in large quantities. . A preparation method using such a recombinant DNA technique is not particularly limited. For example, it is preferable to use the recombinant vector described in the first embodiment. The protein can be expressed by introducing the recombinant vector into an appropriate host based on, for example, a host-vector system. The protein obtained by such a method can be subjected to purification treatment such as salt precipitation, centrifugation, column chromatography, etc., if necessary, and the recovered purified protein can be used as a vaccine.

前記タンパク質をワクチンとして被検体に投与する方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。例えば、目的の細胞や組織等の種類に応じて適宜採用できるが、例えば、筋肉内、腹腔内等への注射、経口投与、皮下組織投与、遺伝子銃による投与、液浸等があげられる。   The method for administering the protein as a vaccine to a subject is not particularly limited, and conventionally known methods can be employed. For example, it can be appropriately employed depending on the type of target cells and tissues, and examples thereof include intramuscular injection, intraperitoneal injection, oral administration, subcutaneous tissue administration, gene gun administration, immersion, and the like.

前記タンパク質は、例えば、水酸化アルミニウム等の補助剤と混合したワクチン組成物として使用することが好ましい。また、目的タンパク質を、例えば、リポソーム中に封入したり、ポリマーに接合させてもよい。   The protein is preferably used as a vaccine composition mixed with an adjuvant such as aluminum hydroxide. In addition, the target protein may be encapsulated in, for example, a liposome or joined to a polymer.

前記タンパク質の投与量は、特に制限されず、例えば、投与する対象、投与方法、投与形態等によって適宜決定できるが、例えば、ヒト(成人)に対して500〜1000μgが好ましい。   The dose of the protein is not particularly limited and can be appropriately determined depending on, for example, the subject to be administered, the administration method, the dosage form, etc. For example, 500 to 1000 μg is preferable for humans (adults).

つぎに、本発明のリウマチ治療薬は、本発明のCD8T細胞活性化抑制剤を含むことを特徴とする。本発明のリウマチ治療薬によれば、例えば、ヒトやヒトを除く哺乳類動物への投与によって、CD8T細胞の活性化が抑制できるため、これによりリウマチの予防や治療を行うことができる。なお、本発明のリウマチ治療薬は、前述のCD8T細胞活性化抑制剤と同様の使用方法が採用できる。   Next, the therapeutic agent for rheumatism of the present invention comprises the CD8 T cell activation inhibitor of the present invention. According to the therapeutic agent for rheumatism of the present invention, activation of CD8 T cells can be suppressed, for example, by administration to humans or mammals other than humans, thereby preventing or treating rheumatism. In addition, the usage method similar to the above-mentioned CD8 T cell activation inhibitor can be employ | adopted for the therapeutic agent of rheumatism of this invention.

つぎに、本発明のリウマチ治療用DNAワクチンは、Jag1遺伝子を含むことを特徴とする。なお、Jag1遺伝子としては、前述のように、非翻訳領域を含むJag1遺伝子(例えば、完全長配列)でもよいし、Jag1構造遺伝子、その部分配列(例えば、sJag1構造遺伝子)であってもよい。また、その形態や使用方法も前述と同様である。   Next, the DNA vaccine for treating rheumatism of the present invention is characterized in that it contains the Jag1 gene. As described above, the Jag1 gene may be a Jag1 gene including a non-translated region (for example, a full-length sequence), a Jag1 structural gene, or a partial sequence thereof (for example, an sJag1 structural gene). Further, the form and usage are the same as described above.

[実施例]
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下記の実施例および比較例により制限されない。なお、市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールにも基づいて使用した。
[Example]
Next, examples of the present invention will be described together with comparative examples. However, the present invention is not limited by the following examples and comparative examples. In addition, unless otherwise indicated, the commercially available reagent was used based on those protocols.

<DNAワクチンの作製>
DNAワクチンとして、マウスJag1タンパク質をコードするCDS配列を挿入したベクター(Jagged1/pcDNA3.1)と、マウスJagged1タンパク質のうち細胞内領域を欠損したタンパク質部分(細胞外領域:sJag1タンパク質)をコードする配列を挿入したベクター(Soluble Jagged1/pcDNA3.1)とを、以下の方法により作製した。なお、図1(A)に、Jagged1/pcDNA3.1、図1(B)にSoluble Jagged1/pcDNA3.1の概略を示す。
<Production of DNA vaccine>
As a DNA vaccine, a vector (Jagged1 / pcDNA3.1) in which a CDS sequence encoding mouse Jag1 protein is inserted, and a sequence encoding a protein portion (extracellular region: sJag1 protein) that lacks the intracellular region of mouse Jagged1 protein A vector (Soluable Jagged1 / pcDNA3.1) into which was inserted was prepared by the following method. 1A shows an outline of Jagged 1 / pcDNA 3.1, and FIG. 1B shows an outline of Solved Jagged 1 / pcDNA 3.1.

Jagged1/pcDNA3.1は、pcDNA3.1/Zeocin(商品名、Invitrogen社製)のEcoRI/NotIサイトに、配列番号3に示す配列を挿入することによって作製した。配列番号3に示す配列は、マウスJag1タンパク質のアミノ酸1〜1218番をコードするcDNA配列である。このJagged1/pcDNA3.1は、以下、「Jag1/pcDNA」ともいう。   Jagged 1 / pcDNA3.1 was prepared by inserting the sequence shown in SEQ ID NO: 3 into the EcoRI / NotI site of pcDNA3.1 / Zeocin (trade name, manufactured by Invitrogen). The sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a cDNA sequence encoding amino acids 1-11218 of mouse Jag1 protein. This Jagged1 / pcDNA3.1 is hereinafter also referred to as “Jag1 / pcDNA”.

また、Soluble Jagged1/pcDNA3.1は、pcDNA3.1/Zeocin(商品名、Invitrogen社製)のEcoRVサイトに、配列番号4に示す配列を挿入することによって作製した。なお、配列番号4に示す配列は、マウスJag1タンパク質の細胞外領域(配列番号2に示すマウスJag1タンパク質のアミノ酸1〜1067番)をコードする配列である。このSoluble Jagged1/pcDNA3.1は、以下、「sJag1/pcDNA」ともいう。   Moreover, Soluble Jagged1 / pcDNA3.1 was prepared by inserting the sequence shown in SEQ ID NO: 4 into the EcoRV site of pcDNA3.1 / Zeocin (trade name, manufactured by Invitrogen). The sequence shown in SEQ ID NO: 4 is a sequence encoding the extracellular region of mouse Jag1 protein (amino acids 1 to 1067 of mouse Jag1 protein shown in SEQ ID NO: 2). This Soluble Jagged 1 / pcDNA 3.1 is hereinafter also referred to as “sJag1 / pcDNA”.

前記実施例1で作製したsJag1/pcDNAから発現したsJag1タンパク質を、in vitroでT細胞に接触させ、前記sJag1タンパク質と前記T細胞のレセプターであるNotchタンパク質とが相互作用するか否かを確認した。   The sJag1 protein expressed from the sJag1 / pcDNA prepared in Example 1 was contacted with a T cell in vitro, and it was confirmed whether or not the sJag1 protein interacts with the Notch protein that is a receptor of the T cell. .

<レポーターアッセイ>
トランスフェクションの前日、RPMI 1640培地を添加した6ウェルプレートに、1×10cells/wellとなるようにPlat−E細胞(一過性発現パッケージング細胞)を撒いた。このPlat−E細胞に、導入試薬(商品名Fugene、Roche社製)を用いてDNAワクチンであるsJag1/pcDNA(1μg)を導入し、24時間後、前記6ウェルプレートにおける培地を新たな培地に交換した。そして、さらに、所定時間(72時間)培養を行った後、培養液から上清を回収した。なお、比較例1として、sJag1/pcDNAに代え、sJag1のコード配列が未挿入であるpcDNA3.1(商品名、Invitrogen社製、以下同様)をPlat-E細胞に導入し、前述と同様にして培養と上清の回収を行った。なお、培養温度は37℃とした(以下同様)。なお、sJag1/pcDNAを導入した前記Plat−E細胞を培養することにより、回収した上清には、パッケージングされた感染ウイルスが含まれている。
<Reporter assay>
The day before transfection, Plat-E cells (transient expression packaging cells) were seeded in a 6-well plate to which RPMI 1640 medium was added so as to be 1 × 10 6 cells / well. To this Plat-E cell, sJag1 / pcDNA (1 μg), which is a DNA vaccine, was introduced using an introduction reagent (trade name Fugene, manufactured by Roche), and after 24 hours, the medium in the 6-well plate was replaced with a new medium. Exchanged. Further, after culturing for a predetermined time (72 hours), the supernatant was recovered from the culture solution. As Comparative Example 1, pcDNA3.1 (trade name, manufactured by Invitrogen, the same applies hereinafter) in which the coding sequence of sJag1 was not inserted was introduced into Plat-E cells instead of sJag1 / pcDNA, and the same as described above. Culture and supernatant collection were performed. The culture temperature was 37 ° C. (hereinafter the same). Note that, by culturing the Plat-E cells into which sJag1 / pcDNA has been introduced, the collected supernatant contains packaged infectious virus.

他方、RPMI 1640培地を添加した24ウェルプレートにおいて、Jurkat細胞(ヒト急性Tリンパ球性白血病由来のTリンパ球)を3.4×10cells/wellとなるように培養した。そして、この培養細胞に、導入試薬(商品名DMRIE−C、Invitrogen社製)を用いて、レポーター遺伝子(TP1)1μg、および、ルシフェラーゼレポーターベクターであるpGL4.74ベクター(商品名、Promega社製)0.2μgを導入して、48時間培養を行った。 On the other hand, Jurkat cells (T lymphocytes derived from human acute T lymphocytic leukemia) were cultured at a concentration of 3.4 × 10 5 cells / well in a 24-well plate supplemented with RPMI 1640 medium. Then, 1 μg of reporter gene (TP1) and pGL4.74 vector (trade name, manufactured by Promega), which is a luciferase reporter vector, were introduced into the cultured cells using an introduction reagent (trade name DMRIE-C, manufactured by Invitrogen). 0.2 μg was introduced and cultured for 48 hours.

96ウェルプレートに、フィーダー細胞(骨髄ストローマ細胞であるOP9細胞)を1×10cells/wellとなるように撒き、この上で、前述のJurkat細胞を、前記上清(100μl/well)の存在下、RPMI 1640培地を用いて24時間培養した。培養後のJurkat細胞を、Dual−Luciferase Reporter Assay System(商品名、Promega社製)によって溶解し、ホタルルシフェラーゼならびにウミシイタケルシフェラーゼルシフェラーゼによる発光反応の強度をルミノメーターで測定した。そして、レポーターであるホタルルシフェラーゼの強度(R1)をコントロールのウミシイタケルシフェラーゼの強度(R2)で割った値(R1/R2)を求めた。この結果を図2に示す。図2における時間(72hr)は、ベクター導入後のPlat-E細胞の培養時間である。 In a 96-well plate, feeder cells (OP9 cells, which are bone marrow stromal cells) are seeded at 1 × 10 4 cells / well, and the above-mentioned Jurkat cells are added to the supernatant (100 μl / well). Then, the cells were cultured for 24 hours using RPMI 1640 medium. The Jurkat cells after culture were lysed by Dual-Luciferase Reporter Assay System (trade name, manufactured by Promega), and the intensity of the luminescence reaction by firefly luciferase and Renilla luciferase luciferase was measured with a luminometer. Then, a value (R1 / R2) obtained by dividing the intensity (R1) of firefly luciferase, which is a reporter, by the intensity (R2) of the control Renilla luciferase was obtained. The result is shown in FIG. The time (72 hr) in FIG. 2 is the culture time of the Plat-E cells after vector introduction.

同図に示すように、sJag1/pcDNAを導入したPlat−E細胞の培養液上清を使用した結果、Jurkat細胞におけるR1/R2の値が著しく増加した。R1/R2の増加は、sJag1タンパク質がJurkat細胞のレセプターであるNotchタンパク質に結合し、これによってNotchタンパク質を介したシグナル伝達が生じたことを意味する(陽性Notchシグナル)。したがって、細胞内領域が除去された細胞外領域(sJag1タンパク質)のみであっても、Notchタンパク質との相互作用が生じることが確認できた。   As shown in the figure, as a result of using the culture supernatant of Plat-E cells into which sJag1 / pcDNA was introduced, the value of R1 / R2 in Jurkat cells was remarkably increased. An increase in R1 / R2 means that sJag1 protein binds to Notch protein, which is a receptor of Jurkat cells, thereby causing signal transduction via Notch protein (positive Notch signal). Therefore, it was confirmed that the interaction with the Notch protein occurs only in the extracellular region (sJag1 protein) from which the intracellular region has been removed.

コラーゲン誘導性関節リウマチモデルにおけるDNAワクチン(Jag1/pcDNAおよびsJag1/pcDNA)の効果を確認した。   The effect of DNA vaccines (Jag1 / pcDNA and sJag1 / pcDNA) in a collagen-induced rheumatoid arthritis model was confirmed.

まず、コラーゲン誘導の試験4日前(day−4)、DBA/1Jマウス(オス)の両足の腓腹筋に、0.25%ブピバカイン(局所麻酔薬)を含むPBS(SIGMA社製)を筋肉注射した(50μl/片足)。つぎに、試験2日前(day−2)、前記マウスの両足の腓腹筋に、DNAワクチンであるJag1/pcDNAまたはsJag1/pcDNAを、筋肉注射した(50μg/50μl/片足)。なお、比較例として、DNAワクチンに代えて、Jag1およびsJag1のコード配列が未挿入であるpcDNA3.1(以下、「pcDNA」という)を注射した。以下、Jag1タンパク質のコード配列(full length)を有するJag1/pcDNAベクターを注射したマウス群を「Jag1群」、sJag1タンパク質のコード配列を有するsJag1/pcDNAベクターを注射したマウス群を「sJag1群」といい、Jag1等のコード配列が未挿入であるpcDNAを注射したマウス群を「比較群」という。   First, 4 days before the collagen induction test (day-4), PBS (manufactured by SIGMA) containing 0.25% bupivacaine (local anesthetic) was intramuscularly injected into the gastrocnemius muscles of both legs of DBA / 1J mice (male) ( 50 μl / one leg). Next, two days before the test (day-2), Jag1 / pcDNA or sJag1 / pcDNA, which is a DNA vaccine, was intramuscularly injected into the gastrocnemius muscle of both feet of the mouse (50 μg / 50 μl / one leg). As a comparative example, pcDNA3.1 (hereinafter referred to as “pcDNA”) into which the coding sequences of Jag1 and sJag1 were not inserted was injected instead of the DNA vaccine. Hereinafter, a group of mice injected with the Jag1 / pcDNA vector having the coding sequence (full length) of Jag1 protein is referred to as “Jag1 group”, and a group of mice injected with the sJag1 / pcDNA vector having the coding sequence of sJag1 protein is referred to as “sJag1 group”. A group of mice injected with pcDNA into which a coding sequence such as Jag1 has not been inserted is referred to as a “comparison group”.

そして、コラーゲン誘導の試験当日(day0)、リウマチの誘導物質であるコラーゲン含有液を、等量のフロインド完全アジュバント(商品名M.Tuberculosis H37Ra:DIFCO社製)で乳化し、この乳化物をマウスに接種した。具体的に、Jag1群には、コラーゲン100μg/50μl/片足の条件で、両足のfootpadに接種し、sJag1群には、コラーゲン200μg/100μl/匹の条件で、尾底部の皮下に接種した。また、比較群については、さらに2群に分けて、一方には、Jag1群と同様の条件でfootpadへの接種を行い、他方には、sJag1群と同様の条件で尾底部の皮下への接種を行った。前記コラーゲン含有液は、20mM Tris/150mM NaCl(pH8.0)に4mg/mlとなるようにウシコラーゲンタイプII(コラーゲン技術研修会)を添加して調製した。また、各群に対するコントロール(コラーゲン非誘導)として、前記コラーゲン含有液に代えてPBSを使用し、同様に乳化物の投与を行った。   On the day of the collagen induction test (day 0), a collagen-containing liquid that is a rheumatoid inducer is emulsified with an equal amount of Freund's complete adjuvant (trade name: M. Tuberculosis H37Ra: manufactured by DIFCO), and this emulsion is added to the mouse. Vaccinated. Specifically, the Jag1 group was inoculated into the footpad of both legs under the condition of collagen 100 μg / 50 μl / one leg, and the sJag1 group was inoculated subcutaneously at the tail base under the condition of collagen 200 μg / 100 μl / animal. The comparison group is further divided into two groups. One is inoculated with footpad under the same conditions as the Jag1 group, and the other is inoculated subcutaneously at the base of the tail under the same conditions as the sJag1 group. Went. The collagen-containing solution was prepared by adding bovine collagen type II (collagen technology workshop) to 20 mg Tris / 150 mM NaCl (pH 8.0) to 4 mg / ml. Further, as a control for each group (collagen non-induction), PBS was used instead of the collagen-containing liquid, and the emulsion was administered in the same manner.

前記乳化物の投与後、7日おきに合計3回、試験2日前(day2)と同じ条件でDNAワクチンを筋肉注射した(追加免疫)。具体的に、Jag1群にはJag1/pcDNA、sJag1群にはsJag1/pcDNA、比較群にはpcDNAを注射した。そして、試験開始から21日目(day21)、前記コラーゲン含有液を、等量のフロインド不完全アジュバント(商品名M.Tuberculosis H37Ra:DIFCO社製)で乳化し、この乳化物をマウスの尾底部の皮下に接種した(コラーゲン200μg/100μl/匹)。また、各群に対するコントロールとして、前記コラーゲン含有液に代えてPBSを使用し、同様に乳化物の投与を行った。そして、これらのマウス群について、コラーゲン誘導性の関節炎(CIA)の兆候を、最終免疫を0日として所定期間ごと(0、2、5、7、9、11、14、16、18、21、23日)に確認し、下記評価基準に基づいてclinical scoreを評価した。   After the administration of the emulsion, the DNA vaccine was intramuscularly injected (additional immunization) three times every 7 days under the same conditions as 2 days before the test (day 2). Specifically, the Jag1 group was injected with Jag1 / pcDNA, the sJag1 group with sJag1 / pcDNA, and the comparative group with pcDNA. On the 21st day from the start of the test (day 21), the collagen-containing solution was emulsified with an equal amount of Freund's incomplete adjuvant (trade name: M. Tuberculosis H37Ra: manufactured by DIFCO), and this emulsion was added to the tail of the mouse. Inoculated subcutaneously (collagen 200 μg / 100 μl / animal). As a control for each group, PBS was used in place of the collagen-containing solution, and the emulsion was administered in the same manner. Then, for these groups of mice, the symptoms of collagen-induced arthritis (CIA) were determined at predetermined intervals (0, 2, 5, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 21, 23 days), and the clinical score was evaluated based on the following evaluation criteria.

(評価基準)
0 = 変化なし
1 = 肢の局所的な赤味、または、1本の足指の肥大および赤味
2 = 肢の軽度な肥大および紅斑、または、2本以上の足指の肥大
3 = 肢の顕著な肥大および紅斑
4 = 肢の最大肥大および紅斑、および、その後の強直症
(Evaluation criteria)
0 = no change 1 = local redness of the limb, or enlargement and redness of one toe 2 = mild enlargement and erythema of the limb, or enlargement of two or more toes 3 = limbs Marked hypertrophy and erythema 4 = Maximum limb enlargement and erythema, and subsequent ankylosia

これらの結果を図3に示す。同図(A)は、Jag1/pcDNAをfootpadに接種した結果であり、同図(B)は、sJag1/pcDNAを尾底部に接種した結果である。なお、同図(A)に示すclinical scoreは、3匹のマウスについてマウスごとに3本の足のクリニカルスコア(clinical score)を取得し、それらを合計した後に9で割った値である。同図(B)に示すclinical scoreは、3匹のマウスについてマウスごとに4本の足のクリニカルスコア(clinical score)を取得し、それらを合計した後に3で割った値である。同図における日数(day)は、最終免疫後の日数である。また、同図にプロットしているマウス群の種類を下記表に示す。なお、後述する実施例においても、マウス群は下記の通りである。   These results are shown in FIG. (A) shows the results of inoculating Footpad with Jag1 / pcDNA, and (B) shows the results of inoculating sJag1 / pcDNA at the tail. In addition, the clinical score shown in FIG. 3A is a value obtained by obtaining three paw clinical scores for each of three mice and summing them and dividing by 9. The clinical score shown in FIG. 5B is a value obtained by obtaining a clinical score (clinical score) of 4 legs for each mouse for 3 mice, summing them, and dividing by 3. The number of days in the figure is the number of days after the final immunization. In addition, the following table shows the types of mouse groups plotted in the figure. In the examples described later, the mouse groups are as follows.

Figure 2008120740
Figure 2008120740

同図(A)に示すように、Jag1/pcDNAを使用したCII/Jag1群(同図において●:実施例3−1)では、Jag1のコード配列を有さないpcDNAを使用したCII/pcDNA群(同図において□:比較例2‐1)よりも、クリニカルスコアが減少し、CIAの臨床症状が軽減された。また、同図(B)に示すように、sJag1/pcDNAを使用したCII/sJag1群(同図において■:実施例3−2)においても、sJag1のコード配列を有さないpcDNAを使用したCII/pcDNA群(同図において○:比較例2−2)よりも、クリニカルスコアが顕著に減少し、CIAの臨床症状が著しく軽減された。特に、sJag1/pcDNAによれば、Jag1/pcDNAを使用した場合よりも、さらにクリニカルスコアの減少、すなわち、CIAの臨床症状が軽減することができた。   As shown in FIG. 5A, in the CII / Jag1 group using Jag1 / pcDNA (in the figure, ●: Example 3-1), the CII / pcDNA group using pcDNA having no coding sequence of Jag1 The clinical score decreased and clinical symptoms of CIA were reduced compared to (□ in the figure: Comparative Example 2-1). Further, as shown in FIG. 4B, CII / sJag1 group using sJag1 / pcDNA (in the figure, ■: Example 3-2) also used CII using pcDNA having no coding sequence of sJag1. The clinical score was significantly reduced and clinical symptoms of CIA were remarkably reduced as compared with the / pcDNA group (in the figure, ◯: Comparative Example 2-2). In particular, according to sJag1 / pcDNA, the clinical score, that is, the clinical symptoms of CIA could be further reduced as compared with the case where Jag1 / pcDNA was used.

コラーゲン誘導性関節リウマチモデルマウスにDNAワクチン(sJag1/pcDNA)を接種し、そのモデルマウスのT細胞についてサイトカイン産生能を確認した。   Collagen-induced rheumatoid arthritis model mice were inoculated with a DNA vaccine (sJag1 / pcDNA), and cytokine production ability was confirmed for the T cells of the model mice.

前記実施例3と同様にして、sJag1/pcDNAを使用してDBA/1Jマウス(オス)に免疫を行った。そして、追加免疫の後、sJag1/pcDNAを接種した群について、25日後(最終免疫を0日として25日後)に脾臓を回収し、トリプシン処理によって、single cell suspensionを調製した。   In the same manner as in Example 3, DBA / 1J mice (male) were immunized using sJag1 / pcDNA. After booster immunization, about the group inoculated with sJag1 / pcDNA, the spleen was collected 25 days later (25 days after the final immunization was 0 days), and single cell suspension was prepared by trypsin treatment.

そして、調製したsingle cell suspensionを、所定量(0μg/ml、50μg/ml)のコラーゲン存在下で72時間培養し、コラーゲン誘導を行った。そして、この培養細胞を、1ug/ml抗CD3抗体(2C11)と1ug/ml抗CD28抗体(37.51)とでそれぞれコーティングした96ウェルプレートに、5×10cells/well/200μlとなるように撒き直し、さらに24時間培養した後、培養液の上清を回収した。なお、比較例3として、pcDNAを使用したマウス群(CII/pcDNA群)についても同様に培養液上清を回収し、実施例4および比較例に対するそれぞれのコントロールも、前記実施例3と同様とした。 The prepared single cell suspension was cultured in the presence of a predetermined amount (0 μg / ml, 50 μg / ml) of collagen for 72 hours to induce collagen. Then, this cultured cell is coated on a 96-well plate coated with 1 ug / ml anti-CD3 antibody (2C11) and 1 ug / ml anti-CD28 antibody (37.51), respectively, so that the concentration becomes 5 × 10 5 cells / well / 200 μl. Then, after further culturing for 24 hours, the culture supernatant was collected. As Comparative Example 3, the culture supernatant was also collected in the same manner for the mouse group (CII / pcDNA group) using pcDNA, and the controls for Example 4 and Comparative Example were the same as in Example 3. did.

他方、0.5μg/ml精製抗マウスIFNγ抗体(XMG1.2:eBioscience社製)、および、0.5μg/ml精製抗マウスIL−4抗体(11B11:eBioscience社製)を、それぞれ96ウェルプレート(商品名Maxisorp、Nunc社製)に添加し、4℃で一晩インキュベートした。この抗体を固定化したウェルプレートを0.05%PBST(0.05%Tween80含有PBS)で5回洗浄した後、1%BSAを含むPBSを添加して、室温で一時間インキュベートした。インキュベート後、0.05%PBSTで5回洗浄した。そして、このプレートに、前述の回収した培養液上清を添加し(100μl/well)、室温で一時間インキュベートした。前記上清は、精製抗マウスIFNγ抗体を固定化したウェルに対しては、10倍、20倍、40倍に希釈したものを添加し、精製抗マウスIL−4抗体を固定化したウェルに対しては、2倍、4倍、8倍に希釈したものを添加した。なお、希釈には、リン酸緩衝液を使用した。そして、前記ウェルプレートを0.05%PBSTで5回洗浄した後、前記各抗体を固定化したウェルに、0.5μg/mlビオチン−抗マウスIFNγ抗体(R4−6A2:eBioscience社製)と、0.5μg/mlビオチン−抗マウスIL−4抗体(BVD6−24G2:eBioscience社製)を、それぞれ100μl/wellとなるように添加し、室温で1時間インキュベートした。このウェルプレートを、0.05%PBSTで5回洗浄し、さらに、1/1000(1000倍希釈)アビジン−Horse Rradish Peroxidase(HRP)(eBioscience社製)を100μl/wellとなるように添加し、室温で30分インキュベートした。このウェルプレートを0.05%PBSTで5回洗浄した後、TMB基質(eBioscience社製)を100μl/wellとなるように添加することによって、発色反応を行った。TMBの添加から所定の時間(5〜15min)後、0.5M HSOを50μl/wellとなるように添加して発色反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにより発色の程度を測定した。 On the other hand, 0.5 μg / ml purified anti-mouse IFNγ antibody (XMG1.2: manufactured by eBioscience) and 0.5 μg / ml purified anti-mouse IL-4 antibody (11B11: manufactured by eBioscience) were each in a 96-well plate ( (Trade name Maxisorp, manufactured by Nunc) and incubated at 4 ° C. overnight. The well plate on which this antibody was immobilized was washed 5 times with 0.05% PBST (PBS containing 0.05% Tween 80), PBS containing 1% BSA was added, and incubated at room temperature for 1 hour. After incubation, the plate was washed 5 times with 0.05% PBST. Then, the collected culture supernatant was added to this plate (100 μl / well) and incubated at room temperature for 1 hour. For the wells on which the purified anti-mouse IFNγ antibody is immobilized, the supernatant is diluted 10-fold, 20-fold or 40-fold, and the well on which the purified anti-mouse IL-4 antibody is immobilized is added. In addition, diluted 2-fold, 4-fold and 8-fold were added. In addition, the phosphate buffer solution was used for the dilution. Then, after the well plate was washed 5 times with 0.05% PBST, 0.5 μg / ml biotin-anti-mouse IFNγ antibody (R4-6A2: manufactured by eBioscience) was added to the well in which each antibody was immobilized. 0.5 μg / ml biotin-anti-mouse IL-4 antibody (BVD6-24G2: manufactured by eBioscience) was added at 100 μl / well and incubated at room temperature for 1 hour. The well plate was washed 5 times with 0.05% PBST, and 1/1000 (1000-fold diluted) avidin-horse radish peroxidase (HRP) (manufactured by eBioscience) was added to 100 μl / well. Incubated for 30 minutes at room temperature. After this well plate was washed 5 times with 0.05% PBST, a TMB substrate (manufactured by eBioscience) was added at 100 μl / well to perform a color reaction. After a predetermined time (5 to 15 min) from the addition of TMB, 0.5 MH 2 SO 4 was added at 50 μl / well to stop the color reaction, and the degree of color development was measured with a microplate reader.

これらの結果を、図4に示す。同図において、(A)は、T細胞から産生されたIFNγ量を示すグラフであり、(B)は、T細胞から産生されたIL−4量を示すグラフである。同図(A)および(B)にそれぞれ示すように、sJag1のコード配列を含まないpcDNAを使用した比較例3(CII/pcDNA)は、コントロール(PBS/pcDNA)と比較して、コラーゲン誘導によってIFNγおよびIL−4の産生量が著しく増加した。これに対して、sJag1のコード配列を含むsJag1/pcDNAを使用した実施例4(CII/sJag1群)は、同図(A)および(B)にそれぞれ示すように、前記比較例3(CII/pcDNA)と比べて、IFNγおよびIL−4の産生は、いずれも十分な低下が確認できた。このようにIFNγならびにIL−4の産生が、sJag1/pcDNAを接種することによって抑制されたことから、sJag1/pcDNAによれば自己免疫に関係するT細胞の活性化を抑制できることがわかる。   These results are shown in FIG. In the figure, (A) is a graph showing the amount of IFNγ produced from T cells, and (B) is a graph showing the amount of IL-4 produced from T cells. As shown in each of FIGS. (A) and (B), Comparative Example 3 (CII / pcDNA) using pcDNA which does not contain the coding sequence of sJag1 was induced by collagen induction compared to control (PBS / pcDNA). The production of IFNγ and IL-4 was significantly increased. On the other hand, Example 4 (CII / sJag1 group) using sJag1 / pcDNA containing the coding sequence of sJag1 is shown in Comparative Example 3 (CII / s) as shown in FIGS. Compared with pcDNA), both IFNγ and IL-4 production were confirmed to be sufficiently reduced. Thus, since the production of IFNγ and IL-4 was suppressed by inoculation with sJag1 / pcDNA, it can be seen that sJag1 / pcDNA can suppress the activation of T cells related to autoimmunity.

コラーゲン誘導性関節リウマチモデルマウスにDNAワクチン(sJag1/pcDNA)を接種し、そのモデルマウスの四肢について組織学的検討を行った。   A collagen vaccine-induced rheumatoid arthritis model mouse was inoculated with a DNA vaccine (sJag1 / pcDNA), and the limbs of the model mouse were examined histologically.

前記実施例4においてsJag1/pcDNAを用いて免疫処理したDBA/1Jマウス(オス)について、25日後(最終免疫を0日として25日後)に四肢を回収した。そして、前記四肢の切片を常法に基づいて10%ホルマリン液で固定し、脱解後、パラフィン包埋ブロックを作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。また、比較例3におけるCII/pcDNAと、コントロールであるPBS/pcDNAについても、同様に染色を行った。この切片を光学顕微鏡(商品名CX31、オリンパス社製)で観察した結果を、図5に示す。同図において、(A)は、sJag1/pcDNAを用いたマウス(CII/sJag1)、(B)は、pcDNA3.1を用いたマウス(CII/pcDNA3.1)、(C)は、コラーゲン誘導しておらず且つpcDNA3.1を用いたマウス(コントロールPBS/pcDNA3.1)の結果を示す写真である。また、下記表に病変部位ならびに湿潤の程度を示す。なお、下記表における湿潤の程度は、以下のように評価した。   For DBA / 1J mice (male) immunized with sJag1 / pcDNA in Example 4, the limbs were collected 25 days later (25 days after the final immunization). Then, the limb sections were fixed with a 10% formalin solution according to a conventional method, and after disaggregation, a paraffin-embedded block was prepared and stained with hematoxylin and eosin. The CII / pcDNA in Comparative Example 3 and the control PBS / pcDNA were also stained in the same manner. The result of observing this section with an optical microscope (trade name CX31, manufactured by Olympus Corporation) is shown in FIG. In the same figure, (A) is a mouse using sJag1 / pcDNA (CII / sJag1), (B) is a mouse using pcDNA3.1 (CII / pcDNA3.1), and (C) is collagen-induced. It is a photograph which shows the result of the mouse | mouth (control PBS / pcDNA3.1) which is not shown and used pcDNA3.1. The following table shows the lesion site and the degree of wetting. In addition, the degree of wetting in the following table was evaluated as follows.

(湿潤の評価基準)
2:強度の細胞浸潤
1:軽度の細胞浸潤
0:浸潤なし
(Evaluation criteria for wetness)
2: Strong cell infiltration 1: Mild cell infiltration 0: No infiltration

Figure 2008120740
Figure 2008120740

sJag1を発現しないCII/pcDNA3.1群では、同図(B)に示すように、コラーゲン誘導による炎症性細胞湿潤が確認された。これに対して、同図(A)に示すsJag1を発現するCII/sJag1群では、炎症性の細胞湿潤が著しく抑制され、同図(C)のコントロールと同様の結果となった。この結果は、臨床症状の軽減とも合致する。このことから、コラーゲン誘導性炎症に、DNAワクチンであるsJag1/pcDNAが有用であることがわかる。   In the CII / pcDNA3.1 group not expressing sJag1, collagen-induced inflammatory cell wetting was confirmed, as shown in FIG. In contrast, in the CII / sJag1 group expressing sJag1 shown in FIG. 6A, inflammatory cell wetting was remarkably suppressed, and the results were the same as the control in FIG. This result is consistent with the reduction of clinical symptoms. This shows that sJag1 / pcDNA, which is a DNA vaccine, is useful for collagen-induced inflammation.

コラーゲン以外の物質(卵白アルブミン:OVA)に対するCD8陽性T細胞応答におけDNAワクチン(Jag1/pcDNA)の効果を確認した。   The effect of DNA vaccine (Jag1 / pcDNA) on CD8 positive T cell response to substances other than collagen (ovalbumin: OVA) was confirmed.

試験3日前(day−3)、C57Bl/6マウス(メス)の両足の腓腹筋に、0.25%5%ブピバカイン(局所麻酔薬)を含むPBS(SIGMA社製)を筋肉注射した(50μl/片足)。つぎに、試験当日(day0)、DNAワクチン(Jag1/pcDNA)50μg/25μlとOVAの発現ベクター(OVA/pCI)50μg/25μlとを混合し、この混合物を前記マウスの両足の腓腹筋に筋肉注射した(トータルボリューム50μl/片足)。さらに、14日おきに、同様の条件で、DNAワクチンとOVA発現ベクターとの混合物を用いて追加免疫を行った(day0の接種を含めて合計3回)。3回目のワクチン終了後、試験開始から33日目(day33)に、膝窩と鼠径リンパ節とを回収し、トリプシン処理によって、single cell suspensionを調製した。この他に、比較例として、OVA/pCIとpcDNAとの混合物、OVA/pCIとDelta1/pcDNAとの混合物を使用し、また、コントロールとして、pcDNAを使用し、同様にしてsingle cell suspensionを調製した。なお、OVA/pCIは、pCIベクター(プロメガ社製)のEcoRI制限酵素部位に、OVAタンパク質のCDS配列を挿入したベクターであり、Delta1/pcDNAは、pcDNA3.1ベクター(Invitrogen社製)のEcoRVとEcoRI制限酵素部位に、Delta1タンパク質のCDS配列を挿入したベクターである。   Three days before the test (day-3), PBS (manufactured by SIGMA) containing 0.25% 5% bupivacaine (local anesthetic) was intramuscularly injected into the gastrocnemius of both legs of C57B1 / 6 mice (female) (50 μl / one leg). ). Next, on the day of the test (day 0), 50 μg / 25 μl of DNA vaccine (Jag1 / pcDNA) and 50 μg / 25 μl of OVA expression vector (OVA / pCI) were mixed, and this mixture was injected intramuscularly into the gastrocnemius of both feet of the mouse. (Total volume 50 μl / one leg). Further, every 14 days, booster immunization was performed using a mixture of the DNA vaccine and the OVA expression vector under the same conditions (3 times in total including day 0 inoculation). After the third vaccine, on the 33rd day (day 33) from the start of the test, popliteal and inguinal lymph nodes were collected, and a single cell suspension was prepared by trypsinization. In addition, as a comparative example, a mixture of OVA / pCI and pcDNA, a mixture of OVA / pCI and Delta1 / pcDNA was used, and pcDNA was used as a control, and a single cell suspension was prepared in the same manner. . OVA / pCI is a vector in which the CDS sequence of the OVA protein is inserted into the EcoRI restriction enzyme site of the pCI vector (Promega). Delta1 / pcDNA is the same as EcoRV of the pcDNA3.1 vector (Invitrogen). This is a vector in which the CDS sequence of Delta1 protein is inserted into the EcoRI restriction enzyme site.

得られたsingle cell suspensionをFcRブロッキング試薬(商品名2.4G2、Becton Dickinson社製)で処理し、マウス細胞のFcレセプター(FcR)をブロッキングした。そして、ブロッキング処理済みの細胞を、FITC−抗マウスCD8抗体(53−6.7:eBioscience社製)と、OVA tetramer−PE(MBL社製)とで染色した。これらの細胞を緩衝液(商品名FACS(登録商標)buffer、Sigma社製)で洗浄した後、さらに前記緩衝液で細胞を懸濁し、フローサイトメーター(商品名FACS Calibur、Becton Dickinson社製)を用いて、OVA抗原の検出を行った。   The obtained single cell suspension was treated with an FcR blocking reagent (trade name 2.4G2, manufactured by Becton Dickinson) to block the Fc receptor (FcR) of mouse cells. Then, the blocked cells were stained with FITC-anti-mouse CD8 antibody (53-6.7: manufactured by eBioscience) and OVA tetramer-PE (manufactured by MBL). After these cells were washed with a buffer solution (trade name FACS (registered trademark) buffer, Sigma), the cells were further suspended in the buffer solution, and a flow cytometer (trade names FACS Calibur, Becton Dickinson) was used. The OVA antigen was detected.

これらの結果を、図6に示す。同図は、OVA抗原に反応するT細胞抗原受容体を持つT細胞数を表すフローサイトメトリーの図である。同図において、右下は、OVA/pCIとJag1/pcDNAとを接種したマウスの結果であり、右上は、OVA/pCIとpcDNAとを接種したマウスの結果(OVA/Jag1)であり、左下は、OVA/pCIとDelta1/pcDNAとを接種したマウスの結果(OVA/DL1)であり、左上は、OVAによる誘導を受けていないコントロールであって、pCIとPBSをワクチンした結果(pCI/PBS)を示す。   These results are shown in FIG. The figure is a flow cytometry diagram showing the number of T cells having a T cell antigen receptor that reacts with an OVA antigen. In the figure, the lower right is the result of the mouse inoculated with OVA / pCI and Jag1 / pcDNA, the upper right is the result of the mouse inoculated with OVA / pCI and pcDNA (OVA / Jag1), and the lower left is , The results of mice inoculated with OVA / pCI and Delta1 / pcDNA (OVA / DL1), and the upper left is a control that has not been induced by OVA and vaccinated with pCI and PBS (pCI / PBS) Indicates.

同図に示すように、Jag1/pcDNAを接種していないマウス、すなわち、右上のOVA/Jag1と、左下のOVA/DL1においては、OVA抗原に反応するT細胞抗原受容体を持つT細胞の割合が、1.08%および0.93%と非常に高かった。これに対して、Jag1/pcDNAを接種したマウスについては、前記T細胞の割合が0.31%と、極めて低い値に抑制することができた。この結果から、Jag1のコード配列を有するDNAワクチンによれば、コラーゲンに関わらず、どのような抗原に対してもCD8陽性T細胞応答性を低下できることが証明された。   As shown in the figure, in the mice not inoculated with Jag1 / pcDNA, that is, in the upper right OVA / Jag1 and the lower left OVA / DL1, the proportion of T cells having a T cell antigen receptor that reacts with the OVA antigen Was very high at 1.08% and 0.93%. In contrast, the mice inoculated with Jag1 / pcDNA were able to be suppressed to an extremely low value of 0.31% for the T cells. From this result, it was proved that the DNA vaccine having the coding sequence of Jag1 can reduce the CD8 positive T cell responsiveness to any antigen regardless of collagen.

ヒトT細胞に対するsJag1タンパク質の効果を確認した。   The effect of sJag1 protein on human T cells was confirmed.

ヒト末梢血から比重遠心法により単核球を分離し、24ウェルプレートに1×10個(500μl)となるように添加した。培地は、RPMI 1640/10% FCSを使用した。そして、この24ウェルプレートに、1μg/ml濃度のOKT3抗体(Becton Dickinson社)を添加して細胞を刺激し、同時に、以下のように調製したヒト由来sJag1タンパク質を含む培養上清を添加した。この上清は、Fugene 6(ロシュ社製)を用いてsJag1/pcDNAを導入した293T細胞を48時間培養し、回収することによって調製した。なお、前記培養上清の添加量は、24ウェルプレートに対し100μl/ウェルとした。抗体による刺激後60時間の時点で、[3H]−thymidineを24ウェルプレートに対し1μCi(20μl)/ウェルとなるように添加して、12時間後に[3H]−thymidinの取り込みを液体シンチレーションカウンターにより測定した。また、コントロールとしては、抗体による刺激を行わず、ヒトsJag1コード配列を挿入していないpcDNA3.1を導入した293T細胞の培養上清を添加した以外は、前記実施例6と同様に取り込みを測定した。比較例としては、ヒトsJag1のコード配列を導入していない293T細胞の培養上清を添加した以外は、前記実施例6と同様に取り込みを測定した。 Mononuclear cells were separated from human peripheral blood by specific gravity centrifugation and added to a 24-well plate at 1 × 10 6 (500 μl). As the medium, RPMI 1640/10% FCS was used. Then, cells were stimulated by adding OKT3 antibody (Becton Dickinson) at a concentration of 1 μg / ml to the 24-well plate, and at the same time, a culture supernatant containing human-derived sJag1 protein prepared as follows was added. This supernatant was prepared by culturing and recovering 293T cells introduced with sJag1 / pcDNA for 48 hours using Fugene 6 (Roche). The amount of the culture supernatant added was 100 μl / well for a 24-well plate. At 60 hours after antibody stimulation, [3H] -thymidine was added to a 24-well plate at 1 μCi (20 μl) / well, and 12 hours later, [3H] -thymidine was taken up by a liquid scintillation counter. It was measured. In addition, as a control, uptake was measured in the same manner as in Example 6 except that the culture supernatant of 293T cells introduced with pcDNA3.1 into which no human sJag1 coding sequence was inserted was added without stimulation with antibodies. did. As a comparative example, uptake was measured in the same manner as in Example 6 except that the culture supernatant of 293T cells into which no human sJag1 coding sequence was introduced was added.

これらの結果を図7に示す。同図に示すように、ヒト由来sJag1タンパク質を添加していない比較例の系(図においてOKT3)では、チミジンの取り込みが非常に高い値を示したが、これに対して、ヒトsJag1タンパク質を添加した実施例の系(OKT3+sJag1)では、取り込み量を効果的に抑制することができた。このことから、ヒトsJag1を添加した系では、著しくT細胞の増殖が抑制されたといえる。   These results are shown in FIG. As shown in the figure, the comparative system (OKT3 in the figure) to which no human-derived sJag1 protein was added showed very high thymidine incorporation, whereas human sJag1 protein was added. In the system of Example 1 (OKT3 + sJag1), the amount of uptake could be effectively suppressed. From this, it can be said that in the system to which human sJag1 was added, the proliferation of T cells was remarkably suppressed.

以上のように、各実施例において、マウスJag1構造遺伝子、マウスsJag1構造遺伝子およびヒトsJag1構造遺伝子について、in vitroならびにモデルマウスに対するin vivoでのCD8リンパ球の活性化抑制ならびにリウマチ発症の抑制を確認した。なお、これらの結果は、例えば、ヒトをはじめとする他のJag1タンパク質、sJag1タンパク質、Jag1構造遺伝子やsJag1構造遺伝子等を使用した場合であっても、ヒトをはじめとする他の動物等に対して同様の効果が得られることは明らかである。特に、ヒトJag1遺伝子やヒトsJag1遺伝子をin vivoでヒトに投与した場合にも、同様の結果が得られることは、当業者であれば容易に理解できる。また、当業者であれば、過度の試行錯誤を伴うことなく、例えば、ヒトをはじめとする他のJag1タンパク質、sJag1タンパク質やJag1構造遺伝子、sJag1構造遺伝子等を使用して、本発明のCD8T細胞活性化抑制剤ならびにリウマチ治療剤を作製し、これを使用することが可能である。   As described above, in each Example, the suppression of CD8 lymphocyte activation and the onset of rheumatism in vitro and in model mice was confirmed for the mouse Jag1 structural gene, mouse sJag1 structural gene and human sJag1 structural gene. did. These results show that, for example, even when other Jag1 protein such as human, sJag1 protein, Jag1 structural gene, sJag1 structural gene, etc. are used, other humans and other animals are used. Obviously, the same effect can be obtained. In particular, those skilled in the art can easily understand that similar results can be obtained when the human Jag1 gene or the human sJag1 gene is administered to a human in vivo. Moreover, those skilled in the art can use, for example, other Jag1 proteins including humans, sJag1 protein, Jag1 structural gene, sJag1 structural gene, and the like without excessive trial and error. Activation inhibitors and rheumatic therapeutic agents can be prepared and used.

以上のように、本発明の自己免疫疾患治療薬によれば、T細胞の活性化を抑制することによって、リウマチをはじめとする自己免疫疾患を予防または治療することが可能である。特にリウマチ疾患については、慢性持続性の多発関節炎であり治療や予防が困難であることから、本発明の自己免疫疾患治療薬は、新たな治療薬として有用性に優れるものである。   As described above, according to the therapeutic agent for autoimmune diseases of the present invention, it is possible to prevent or treat autoimmune diseases such as rheumatism by suppressing the activation of T cells. Particularly for rheumatic diseases, since it is chronic persistent polyarthritis and is difficult to treat or prevent, the therapeutic agent for autoimmune diseases of the present invention is excellent in usefulness as a new therapeutic agent.

図1は、本発明の一実施例における組換えベクターの概略を示す模式図であり、同図(A)は、Jagged1/pcDNA3.1ベクター、同図(B)は、Soluble Jagged1/pcDNA3.1ベクターである。FIG. 1 is a schematic diagram showing an outline of a recombinant vector according to one embodiment of the present invention. FIG. 1A shows a Jagged 1 / pcDNA3.1 vector, and FIG. 1B shows a Soluble Jagged 1 / pcDNA 3.1. It is a vector. 図2は、本発明の他の実施例において、sJag1タンパク質とレセプターであるNotchタンパク質との相互作用の有無を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the presence or absence of interaction between the sJag1 protein and the receptor Notch protein in another example of the present invention. 図3は、本発明のさらにその他の実施例において、DNAワクチンを添加したコラーゲン誘導性関節リウマチモデルにおけるCIAの経時的な変化を示すグラフであり、同図(A)は、DNAワクチンとしてJag1/pcDNAを使用した結果、同図(B)は、DNAワクチンとしてsJag1/pcDNAを使用した結果である。FIG. 3 is a graph showing changes in CIA over time in a collagen-induced rheumatoid arthritis model supplemented with a DNA vaccine in still another example of the present invention, and FIG. As a result of using pcDNA, the same figure (B) shows the result of using sJag1 / pcDNA as a DNA vaccine. 図4は、本発明のさらにその他の実施例において、DNAワクチンを添加したコラーゲン誘導性関節リウマチモデルにおけるIFNγならびにIL−4の経時的な効果を示すグラフであり、同図(A)は、IFNγの結果、同図(B)は、IL-4の結果である。FIG. 4 is a graph showing the effects of IFNγ and IL-4 over time in a collagen-induced rheumatoid arthritis model supplemented with a DNA vaccine in still another example of the present invention. As a result, FIG. 5B shows the result of IL-4. 図5は、本発明のさらにその他の実施例において、DNAワクチンを添加したコラーゲン誘導性関節リウマチモデルにおける組織の写真であり、同図(A)は、sJag1/pcDNAを使用した結果、同図(B)は、pcDNAを使用した比較例の結果、同図(C)は、コラーゲン誘導を行っていないコントロールの結果である。FIG. 5 is a photograph of a tissue in a collagen-induced rheumatoid arthritis model supplemented with a DNA vaccine in still another example of the present invention. FIG. 5A shows the result of using sJag1 / pcDNA. B) shows the results of a comparative example using pcDNA, and FIG. 10C shows the results of a control without collagen induction. 図6は、本発明のさらにその他の実施例において、OVAに対するCD8陽性T細胞応答におけDNAワクチンの効果を示すフローサイトメトリーの結果である。FIG. 6 is a flow cytometry result showing the effect of a DNA vaccine on CD8 positive T cell response to OVA in yet another example of the present invention. 図7は、本発明のさらにその他の実施例において、ヒト由来sJag1タンパク質によるT細胞増殖阻害を、チミジンの取り込み量で確認した結果を示すグラフである。FIG. 7 is a graph showing the results of confirming the inhibition of T cell proliferation by human-derived sJag1 protein with the amount of thymidine incorporated in still another example of the present invention.

Claims (12)

遺伝子およびタンパク質のいずれか一方を含むCD8T細胞の活性化抑制剤であって、
前記遺伝子が、Jagged1遺伝子であり、前記タンパク質が、Jagged1タンパク質であることを特徴とするCD8T細胞活性化抑制剤。
A CD8 T cell activation inhibitor comprising either a gene or a protein,
The CD8 T cell activation inhibitor, wherein the gene is a Jagged1 gene and the protein is a Jagged1 protein.
前記遺伝子が、Jagged1タンパク質の構造遺伝子である、請求項1記載のCD8T細胞活性化抑制剤。   The CD8 T cell activation inhibitor according to claim 1, wherein the gene is a structural gene of Jagged1 protein. 前記Jagged1構造遺伝子が、以下の(a)〜(c)に示すいずれか一つのDNAである、請求項2記載のCD8T細胞活性化抑制剤。
(a)配列番号3の塩基配列からなるDNA
(b)配列番号8の塩基配列からなるDNA
(c)前記(a)および(b)において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記Jagged1タンパク質と同様の機能を有するタンパク質をコードするDNA
The CD8 T cell activation inhibitor according to claim 2, wherein the Jagged 1 structural gene is any one of DNAs shown in (a) to (c) below.
(A) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3
(B) DNA comprising the base sequence of SEQ ID NO: 8
(C) DNA encoding a protein comprising a base sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in (a) and (b) and having the same function as the Jagged1 protein
前記遺伝子が、Jagged1タンパク質の細胞外領域の構造遺伝子である、請求項1記載のCD8T細胞活性化抑制剤。   The CD8 T cell activation inhibitor according to claim 1, wherein the gene is a structural gene of an extracellular region of Jagged1 protein. 前記細胞外領域の構造遺伝子が、以下の(d)〜(f)に示すいずれか一つのDNAである、請求項4記載のCD8T細胞活性化抑制剤。
(d)配列番号4の塩基配列からなるDNA
(e)配列番号9の塩基配列からなるDNA
(f)前記(d)および(e)において、1個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記Jagged1タンパク質の細胞外領域と同様の機能を有するタンパク質をコードするDNA
The CD8 T cell activation inhibitor according to claim 4, wherein the structural gene in the extracellular region is any one of DNAs shown in the following (d) to (f).
(D) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4
(E) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 9
(F) A protein having a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in (d) and (e) and having the same function as the extracellular region of the Jagged1 protein DNA encoding
さらに、ベクターを含み、前記遺伝子が前記ベクターに挿入されている、請求項1から5のいずれか一項に記載のCD8T細胞活性化抑制剤。   The CD8 T cell activation inhibitor according to any one of claims 1 to 5, further comprising a vector, wherein the gene is inserted into the vector. 前記ベクターが、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項6記載のCD8T細胞活性化抑制剤。   The CD8 T cell activation inhibitor according to claim 6, wherein the vector is a viral vector or a non-viral vector. 前記Jagged1タンパク質が、以下の(A)〜(C)に示すいずれか一つのタンパク質である、請求項1記載のCD8T細胞活性化抑制剤。
(A)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列番号7のアミノ酸配列からなるタンパク質
(C)前記(A)または(B)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、Jagged1タンパク質と同様の機能を有するタンパク質
The CD8 T cell activation inhibitor according to claim 1, wherein the Jagged 1 protein is any one of the following proteins (A) to (C).
(A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (B) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (C) in the amino acid sequence of (A) or (B), wherein one or several amino acids are deleted, A protein consisting of a substituted or added amino acid sequence and having the same function as the Jagged1 protein
前記タンパク質が、Jagged1タンパク質の細胞外領域である、請求項1記載のCD8T細胞活性化抑制剤。   The CD8 T cell activation inhibitor according to claim 1, wherein the protein is an extracellular region of Jagged1 protein. 前記Jagged1タンパク質の細胞外領域が、以下の(D)〜(F)に示すいずれか一つのタンパク質である、請求項1記載のCD8T細胞活性化抑制剤。
(D)配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質
(E)配列番号10のアミノ酸配列からなるタンパク質
(F)前記(D)または(E)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、Jagged1タンパク質の細胞外領域と同様の機能を有するタンパク質
The CD8 T cell activation inhibitor according to claim 1, wherein the extracellular region of the Jagged 1 protein is any one of the following proteins (D) to (F).
(D) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (E) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 (F) in the amino acid sequence of (D) or (E), wherein one or several amino acids are deleted, A protein comprising a substituted or added amino acid sequence and having the same function as the extracellular region of the Jagged1 protein
リウマチ治療薬であって、請求項1から10のいずれか一項に記載のCD8T細胞活性化抑制剤を含むことを特徴とするリウマチ治療薬。   A therapeutic agent for rheumatism, comprising the CD8 T cell activation inhibitor according to any one of claims 1 to 10, wherein the therapeutic agent is for rheumatism. リウマチ治療用のDNAワクチンであって、Jagged1遺伝子を含むことを特徴とするリウマチ治療用DNAワクチン。   A DNA vaccine for treating rheumatism, comprising a Jagged 1 gene.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2013167620A1 (en) * 2012-05-10 2013-11-14 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Immunomodulatory methods using notch agonists

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