JP2008104432A

JP2008104432A - Flow cytometer having cell sorting and treating function and method for sorting and treating live cell

Info

Publication number: JP2008104432A
Application number: JP2006292561A
Authority: JP
Inventors: Noriaki Kimura; 憲明木村; Kenji Yasuda; 賢二安田
Original assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd
Current assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd
Priority date: 2006-10-27
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2026-10-27
Also published as: JP4838094B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a flow cytometer having a live-cell sorting and treating function to enable the sorting and treatment of unnecessary live cells from a live cell group containing a large number of live cells in a short time and high precision absolutely without applying any damage on the objective live cells. <P>SOLUTION: A sample liquid flow containing the live cell group is irradiated with a measuring laser beam to collect optical information on the scattered light and/or the fluorescent light emitted by the application of the laser beam from each live cell in the sample liquid flow; the live cell corresponding to the optical information is judged as an unnecessary live cell or the objective live cell based on the collected optical information, and exclusively the live cell judged as the unnecessary live cell in the live cell group in the sample liquid is irradiated with a femtosecond laser light according to the judged result to damage and kill the unnecessary live cell. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、複数の不要生細胞と複数の目的生細胞とが混合してなる生細胞群のうち、特定の生細胞に処理を行うフローサイトメータ、および、上記生細胞群から目的生細胞を分別して回収する生細胞分別処理方法に関する。 The present invention provides a flow cytometer for processing a specific living cell among a group of living cells formed by mixing a plurality of unnecessary living cells and a plurality of living target cells, and a living target cell from the living cell group. The present invention relates to a living cell sorting method for sorting and collecting.

例えば癌などの研究における細胞や染色体の解析には、従来は顕微鏡が用いられていた。しかし、顕微鏡による解析では、大量のデータを集めて統計的に検討するのに、非常に多くの手間と時間を要していた。現在、多くの場合、このような細胞や染色体の解析には、短時間に多くのサンプル（細胞や染色体）について解析し、信頼性の高い統計データを得ることを可能とする、フローサイトメータが用いられている。フローサイトメータでは、抗体が蛍光染色された細胞などのサンプル粒子を含むサンプル液の流れであるサンプル液流を形成し、このサンプル液流にレーザ光を照射して、流れていく大量のサンプル粒子の１つ１つから放出される蛍光や散乱光を測定し、信頼性の高い統計データを得ることができる。このようなフローサイトメータは、医療分野における研究などに広く利用されている。 For example, a microscope has been conventionally used for analysis of cells and chromosomes in studies such as cancer. However, analysis with a microscope requires a great deal of time and effort to collect a large amount of data for statistical analysis. Currently, in many cases, analysis of such cells and chromosomes involves the use of flow cytometers that can analyze a large number of samples (cells and chromosomes) in a short time and obtain highly reliable statistical data. It is used. A flow cytometer forms a sample liquid flow that is a flow of sample liquid containing sample particles such as cells that have been fluorescently stained with antibodies, and irradiates the sample liquid flow with laser light to flow a large amount of sample particles. It is possible to measure the fluorescence and scattered light emitted from each of the above and obtain statistical data with high reliability. Such a flow cytometer is widely used for research in the medical field.

ところで、今後の医療分野において大きな期待がかかっているのは、再生細胞ともいわれる幹細胞（ｓｔｅｍｃｅｌｌ）を用いた治療である。幹細胞とは、生体を構成する細胞の生理的な増殖・分化などの過程において、自己増殖能と、特定の機能を持つ細胞に分化する能力とをあわせ有する細胞である。すなわち、幹細胞は、自分自身が増える複製能力と、ほかの細胞になる能力を備えている細胞である。幹細胞には、胚から取り出される胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、成人から取り出される成体幹細胞、胎児から取り出される胎児性幹細胞など、様々な種類がある。この幹細胞を、けがや病気で傷んだ臓器などの細胞に分化させることができれば、移植して修復に使えることから、再生医療の分野等で研究が盛んになっている。 By the way, what is highly expected in the future medical field is treatment using stem cells, also called regenerative cells. A stem cell is a cell having both the ability of self-proliferation and the ability to differentiate into a cell having a specific function in a process such as physiological growth and differentiation of cells constituting a living body. That is, a stem cell is a cell that has the ability to replicate itself and the ability to become another cell. There are various types of stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) taken out from embryos, adult stem cells taken out from adults, and fetal stem cells taken out from fetuses. If these stem cells can be differentiated into cells such as organs damaged by injury or illness, they can be transplanted and used for repair. Therefore, research is actively conducted in the field of regenerative medicine.

胚性幹細胞や胎児性幹細胞などから幹細胞を取り出すには、胚を壊してしまう（殺してしまう）必要があるといった倫理的な問題を有している。このため、現在の再生医療に関する研究の多くは、生きている人（子どもまたは成人）から、その体を傷つけることなく幹細胞を採取することができる成体幹細胞に関するものとなっている。成体幹細胞の研究には、当然ながら、成体肝細胞が必要である。成体幹細胞は、骨髄や血液、目の角膜や網膜、肝臓、皮膚などで見つかるものであるが、見つかることは非常にまれであり、通常、採取した大量の細胞サンプルの中から、ごく微量しか見つけることはできない。例えば、骨髄間質の中には、骨、軟骨、脂肪、筋肉、腱、神経など多くの組織に分化できる間葉系幹細胞と呼ばれ細胞が存在しており、病気や外傷などによる組織欠損に対する再生医療において注目されている。しかしながらこの細胞は骨髄中には１０万個に１個の割合でしか存在していない。そのため欠損組織の再生を行うためには一度体外で培養して細胞を増やす必要がある。そのためには、この骨髄中の複数の細胞の中から、ごく微量の幹細胞を分離・抽出する必要がある。大量の細胞サンプルの中から、なるべく短時間に、ごく微量の成体幹細胞を分離・抽出するために、現在、上記フローメータを用いた細胞の分離・回収システム（セルソータ）が利用されている。 In order to extract stem cells from embryonic stem cells, fetal stem cells, etc., there is an ethical problem that it is necessary to destroy (kill) embryos. For this reason, much of the current research on regenerative medicine relates to adult stem cells that can collect stem cells from living people (children or adults) without damaging the body. Of course, adult hepatocytes are necessary for the study of adult stem cells. Adult stem cells can be found in the bone marrow, blood, cornea of the eye, retina, liver, skin, etc., but are rarely found, and usually only a very small amount is collected from a large sample of cells collected. It is not possible. For example, in the bone marrow stroma, there are cells called mesenchymal stem cells that can differentiate into many tissues such as bone, cartilage, fat, muscle, tendon, nerve, etc. It is attracting attention in regenerative medicine. However, these cells are present in the bone marrow at a rate of only 1 in 100,000. Therefore, in order to regenerate a defective tissue, it is necessary to increase the number of cells by in vitro culture. For that purpose, it is necessary to isolate and extract a very small amount of stem cells from the plurality of cells in the bone marrow. Currently, a cell separation / recovery system (cell sorter) using the flow meter is used to separate and extract a very small amount of adult stem cells from a large amount of cell samples in as short a time as possible.

例えば、下記非特許文献１には、このようなセルソータの一例について記載されている。図４は、下記非特許文献１記載のセルソータ１００について説明する概略構成図である。セルソータ１００では、大量の細胞サンプル１０２を含んだサンプル液を、ノズル１０３からジェット流１０４として出射する。これら大量の細胞サンプル１０２には、わずかながら幹細胞が含まれており、大量の細胞サンプル１０２には、このような幹細胞を特徴づけるための蛍光ラベリングが施されている。セルソータ１００は、このジェット流１０４に測定用のレーザ光１０６を照射して、大量の細胞サンプル１０２に対して順次レーザ光１０６を照射する。そして、光電子増倍管１０８および光電子増倍管１１０を有する図示しない評価手段によって、個々の細胞サンプル１０２から発せられる各種散乱光や蛍光の情報を取得する。そして、図示しない評価手段において、レーザ光１０６を照射した細胞サンプルが、幹細胞サンプルであるか否かを判定する（なお、下記非特許文献１では、幹細胞を多く含んだサンプル細胞の集団部分を特定している）。ここまでは、一般的なフローサイトメータの構成であるが、セルソータ１００では、特定した細胞を分離（ソーティング）する機能を有している。セルソータ１００では、例えば図示しない圧電素子等によってノズル１０３を高周波で振動させ、ジェット流１０４を強制的に液滴１１２とする。この液滴１１２を形成する際、幹細胞サンプルなどの特定の細胞サンプルが液滴に入った瞬間に、この特定液滴に対して、プラス（＋）またはマイナス（−）（図示例ではプラス）の電荷をかける（チャージする）。 For example, the following non-patent document 1 describes an example of such a cell sorter. FIG. 4 is a schematic configuration diagram illustrating a cell sorter 100 described in Non-Patent Document 1 below. In the cell sorter 100, a sample liquid containing a large amount of cell sample 102 is emitted as a jet stream 104 from a nozzle 103. These large amount of cell samples 102 contain a small amount of stem cells, and the large amount of cell samples 102 are subjected to fluorescent labeling for characterizing such stem cells. The cell sorter 100 irradiates the jet stream 104 with a laser beam 106 for measurement, and sequentially irradiates a large amount of cell samples 102 with the laser beam 106. Then, various scattered light and fluorescence information emitted from each cell sample 102 are acquired by an evaluation unit (not shown) having the photomultiplier tube 108 and the photomultiplier tube 110. Then, in an evaluation means (not shown), it is determined whether or not the cell sample irradiated with the laser beam 106 is a stem cell sample (In Non-Patent Document 1 below, a population portion of sample cells containing many stem cells is specified. is doing). Up to this point, the configuration of a general flow cytometer has been described, but the cell sorter 100 has a function of separating (sorting) specified cells. In the cell sorter 100, for example, the nozzle 103 is vibrated at a high frequency by a piezoelectric element (not shown) or the like, and the jet stream 104 is forcibly formed into a droplet 112. When the droplet 112 is formed, a positive (+) or a negative (−) (plus in the illustrated example) is added to the specific droplet at a moment when a specific cell sample such as a stem cell sample enters the droplet. Charge (charge).

液滴１１２は、２枚の電場形成電極板１１４および１１６によって形成された水平方向の電場１１８の間を順次通過する。この際、チャージされた液滴１１２のみが、この水平方向の電場によって落下方向を変えて（偏向して）落下し、所望の試験管１２０に回収される。このようにして、幹細胞サンプルなどの特定の細胞サンプル１０２のみが、試験管１２０に回収される。チャージされなかったその他の細胞サンプル１０２は、鉛直に落下して、廃液受け１２２に回収される。 The droplet 112 sequentially passes between the horizontal electric field 118 formed by the two electric field forming electrode plates 114 and 116. At this time, only the charged droplet 112 is dropped (deflected) by changing the dropping direction by the horizontal electric field, and collected in a desired test tube 120. In this way, only a specific cell sample 102 such as a stem cell sample is collected in the test tube 120. Other cell samples 102 that have not been charged fall vertically and are collected in the waste liquid receiver 122.

“超高速セルソータＭｏＦｌｏＴＭによる幹細胞の新しい分析・分離方法”、［ｏｎｌｉｎｅ］、［平成１８年１０月３日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.takara-bio.co.jp/goods/bioview/pdfs/42/42_15-16.pdf＞“New analysis and separation method of stem cells using ultra-high-speed cell sorter MoFlo ™”, [online], [October 3, 2006 search], Internet <URL: http://www.takara-bio.co.jp/goods/ bioview / pdfs / 42 / 42_15-16.pdf>

しかし、上記非特許文献１のように、細胞サンプルが含まれる液滴をチャージして、しかも高電場をかけた場合、幹細胞などの必要な細胞にまで電気的な衝撃が加わり、この必要な細胞まで損傷を受けてしまうといった問題があった。このようなセルソータを用いて幹細胞サンプルを分離して、所望の臓器などの細胞に分化させるとしても、分離した幹細胞サンプルが損傷を受けている場合、うまく分化しなかったり、あるいは不良細胞（例えば癌細胞）が発現してしまうなど、多様かつ危険な問題が発生する可能性を完全には排除できない。このため、細胞に損傷を与えることができないような慎重を要する研究分野では、依然としてこのような高速セルソータを用いることができなかった。 However, as in Non-Patent Document 1 described above, when a droplet containing a cell sample is charged and a high electric field is applied, an electric shock is applied to necessary cells such as stem cells. There was a problem of being damaged. Even if a stem cell sample is separated using such a cell sorter and differentiated into cells of a desired organ or the like, if the separated stem cell sample is damaged, it does not differentiate well or a defective cell (for example, cancer) The possibility of various and dangerous problems such as the expression of cells) cannot be completely excluded. For this reason, such a high-speed cell sorter has not been able to be used in a sensitive research field in which cells cannot be damaged.

このような分野では、例えば、上記セルソータ１００の試験管１２０自体を、所定のタイミングで移動させることで、液滴１１２に含まれて落下する特定細胞サンプルを、分離・回収していた。しかし、試験管１２０自体の移動速度は、ジェット流１０４が液滴化された液滴１１２の落下速度に比べて著しく小さい速度しか達成できない。大量のサンプルを高速度に流した場合、大量の細胞サンプルに対して、ごくわずかな特定細胞サンプルしか取得することしかできない。また、試験管１２０の１２０の移動速度に応じて、サンプルの流速度を著しく低くした場合は、細胞の分離・抽出に多くの時間を要する。 In such a field, for example, by moving the test tube 120 of the cell sorter 100 at a predetermined timing, the specific cell sample falling in the droplet 112 is separated and collected. However, the moving speed of the test tube 120 itself can achieve only a significantly lower speed than the falling speed of the droplet 112 in which the jet stream 104 is formed into droplets. When a large amount of sample is flowed at a high speed, only a few specific cell samples can be obtained for a large amount of cell sample. Further, when the flow rate of the sample is remarkably lowered according to the moving speed of 120 of the test tube 120, it takes a lot of time to separate and extract cells.

本発明は、上記従来の問題点に着目してなされたものであり、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に、不要生細胞を分別して処理することを可能とする、生細胞分別処理機能を有するフローサイトメータを提供することを目的とする。また、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、目的生細胞のみを分別して回収することを可能とする、生細胞分別処理方法を提供することを目的とする。また、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、目的生細胞のみを分別して培養することを可能とする、生細胞分別処理方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made paying attention to the above-mentioned conventional problems, and from a living cell group containing a large amount of living cells, without damaging the target living cells at all, in a short time and at a high level. It is an object of the present invention to provide a flow cytometer having a living cell sorting process function, which can accurately process unnecessary living cells. It is another object of the present invention to provide a living cell sorting method that enables only target living cells to be separated and collected from a living cell group containing a large number of living cells. It is another object of the present invention to provide a living cell sorting method that enables only target living cells to be separated and cultured from a living cell group containing a large number of living cells.

上記問題を解決するために、本発明は、細胞分別処理機能を有するフローサイトメータであって、複数の不要生細胞と複数の目的生細胞とが混合してなる生細胞群を含むサンプル液の流れを形成するサンプル液流形成手段と、前記サンプル液流に測定用レーザ光を照射するレーザ光照射手段と、前記測定用レーザ光の照射を受けて、前記サンプル液流の各生細胞それぞれから発する、散乱光および蛍光の少なくともいずれか一方の光情報それぞれを取得する光情報取得手段と、前記光情報取得手段によって取得された光情報に基づき、各光情報に対応する前記生細胞が、前記不要生細胞または前記目的生細胞のいずれであるか、をそれぞれ判別する生細胞判別手段と、前記生細胞判別手段における判別結果に応じて、前記サンプル液中の前記生細胞群のうち前記不要生細胞と判別された生細胞に対してのみフェムト秒レーザ光を照射し、前記不要生細胞に損傷を与えて死細胞とするフェムト秒レーザ光照射手段と、を有することを特徴とする細胞分別処理機能を有するフローサイトメータを提供する。 In order to solve the above problems, the present invention is a flow cytometer having a cell sorting processing function, and a sample liquid containing a group of living cells formed by mixing a plurality of unnecessary living cells and a plurality of target living cells. Sample liquid flow forming means for forming a flow, laser light irradiation means for irradiating the sample liquid flow with measurement laser light, and irradiation of the measurement laser light, from each living cell of the sample liquid flow Based on the optical information acquired by the optical information acquired by the optical information acquisition means, the optical information acquisition means for acquiring each of the optical information of at least one of scattered light and fluorescence emitted, the living cells corresponding to each optical information, A live cell discriminating means for discriminating whether it is an unnecessary live cell or the target live cell, and according to the discrimination result in the live cell discriminating means, the sample in the sample liquid Femtosecond laser light irradiation means for irradiating femtosecond laser light only to the living cells identified as the unnecessary living cells in the cell group and damaging the unnecessary living cells to make them dead cells. A flow cytometer having a cell sorting processing function is provided.

本発明は、また、生細胞分別処理方法であって、複数の不要生細胞と複数の目的生細胞とが混合してなる生細胞群を含むサンプル液の流れを形成するステップと、前記サンプル液流に測定用レーザ光を照射するステップと、前記測定用レーザ光の照射を受けて、前記サンプル液流の各生細胞それぞれから発する、散乱光および蛍光の少なくともいずれか一方の光情報それぞれを取得するステップと、前記取得するステップによって取得された光情報に基づき、各光情報に対応する前記生細胞が、前記不要生細胞または前記目的生細胞のいずれであるかをそれぞれ判別するステップと、前記判別するステップにおける判別結果に応じて、前記サンプル液中の前記生細胞群のうち前記不要生細胞と判別された生細胞に対してのみフェムト秒レーザ光を照射し、前記不要生細胞に損傷を与えて死細胞とするステップと、を有することを特徴とする生細胞分別処理方法を、併せて提供する。 The present invention is also a living cell sorting method, the step of forming a flow of a sample solution including a group of living cells formed by mixing a plurality of unnecessary living cells and a plurality of target living cells, and the sample solution Irradiating the measurement laser beam to the flow, and receiving the measurement laser beam to obtain at least one of light information of scattered light and fluorescence emitted from each living cell of the sample liquid flow Determining, based on the optical information acquired by the acquiring step, whether the living cells corresponding to each optical information are the unnecessary living cells or the target living cells, respectively, The femtosecond laser is applied only to the living cells determined as the unnecessary living cells in the living cell group in the sample solution according to the determination result in the determining step. Irradiating the steps of: a dead cell damaging to the unnecessary living cells, living cells fractionation method characterized by having, together offer.

本発明の生細胞分別処理方法は、さらに、前記フェムト秒レーザ光の照射によって損傷を受けた前記死細胞と前記目的生細胞とが含まれる、前記フェムト秒レーザ光が照射された後の前記サンプル液を回収容器に回収するステップと、前記サンプル液中、前記回収容器の内壁面に付着した細胞を、前記目的生細胞として回収するとともに、前記回収容器の内壁面に付着せず前記サンプル液に浮遊する細胞を、前記死細胞として分別して回収するステップと、を有することが好ましい。 The live cell sorting method according to the present invention further includes the dead cell damaged by irradiation with the femtosecond laser light and the target living cell, and the sample after being irradiated with the femtosecond laser light. Recovering the liquid in a recovery container, and collecting the cells adhering to the inner wall surface of the recovery container in the sample liquid as the target living cells and not attaching to the inner wall surface of the recovery container. It is preferable to separate and collect floating cells as the dead cells.

本発明の生細胞分別処理方法では、さらに、前記フェムト秒レーザ光の照射によって損傷を受けた前記死細胞と前記目的生細胞とが含まれる、前記フェムト秒レーザ光が照射された後の前記サンプル液を回収容器に回収するステップと、前記回収容器中の前記サンプル液に対して生細胞を培養可能な培養処理を施し、前記サンプル液中の前記目的生細胞のみを分別して培養することで、前記サンプル液中の前記死細胞の割合を減少させるステップと、を有することも、また好ましい。 In the live cell sorting method of the present invention, the sample after being irradiated with the femtosecond laser light, further comprising the dead cells damaged by the irradiation with the femtosecond laser light and the target living cells. Collecting the liquid in a collection container, and subjecting the sample liquid in the collection container to a culture treatment capable of culturing viable cells, and separating and culturing only the target living cells in the sample liquid, It is also preferable to have a step of reducing the ratio of the dead cells in the sample solution.

本発明の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータによれば、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に不要生細胞を分別し、この不要生細胞に損傷を与えて死細胞とすることができる。また、本発明の生細胞分別処理方法の一態様によれば、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に、目的生細胞を分別して回収することができる。また、本発明の生細胞分別処理方法の他の態様によれば、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に、目的生細胞を分別して培養することができる。 According to the flow cytometer having the cell sorting processing function of the present invention, it is unnecessary from a group of living cells containing a large amount of living cells in a short time and with high accuracy without causing any damage to the target living cells. Living cells can be sorted, and the unnecessary living cells can be damaged to become dead cells. In addition, according to one aspect of the living cell sorting method of the present invention, from a living cell group containing a large number of living cells, in a short time and with high accuracy, without damaging the target living cells. The target living cells can be sorted and collected. In addition, according to another aspect of the living cell sorting method of the present invention, a target cell can be quickly and accurately obtained from a group of living cells containing a large amount of living cells without causing any damage to the target living cells. In addition, target living cells can be sorted and cultured.

以下、本発明の、細胞分別処理機能を有するフローサイトメータ、および細胞分別処理方法について、添付の図面に示される好適実施例を基に詳細に説明する。図１は、本発明の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータの一例である、フローサイトメータ１０について説明する概略斜視図である。 Hereinafter, the flow cytometer having a cell sorting processing function and the cell sorting processing method of the present invention will be described in detail based on preferred embodiments shown in the accompanying drawings. FIG. 1 is a schematic perspective view illustrating a flow cytometer 10 which is an example of a flow cytometer having a cell sorting processing function of the present invention.

フローサイトメータ１０は、液流形成ユニット２０、光学ユニット４０、分析ユニット５０、および各部の動作シーケンスを制御する制御装置７０、回収容器８０とを有して構成されている。フローサイトメータ１０は、大量の不要生細胞（幹細胞以外の細胞）に、目的生細胞である幹細胞がごく僅かだけ含まれる生細胞群について、各細胞毎に幹細胞であるか否かを判別し、幹細胞でない（すなわち不要生細胞）と判別された生細胞に対してのみフェムト秒レーザ光を照射し、不要生細胞に損傷を与えて死細胞とする装置である。フローサイトメータ１０は、また、フェムト秒レーザ光が照射された後の、死細胞と幹細胞とが含まれるサンプル液を回収するための回収容器８０を備えており、回収容器８０の内壁面に付着せずサンプル液に浮遊する細胞を、死細胞として分別して回収する機能や、回収容器８０中のサンプル液に対して生細胞を培養可能な培養処理を施し、サンプル液中の幹細胞のみを分別して培養することで、サンプル液中の死細胞の割合を減少させる機能も有する。 The flow cytometer 10 includes a liquid flow forming unit 20, an optical unit 40, an analysis unit 50, a control device 70 that controls an operation sequence of each unit, and a collection container 80. The flow cytometer 10 determines whether or not each cell is a stem cell for a living cell group in which a large number of unnecessary living cells (cells other than stem cells) contain only a few stem cells that are target living cells, This is a device that irradiates femtosecond laser light only to living cells that are determined not to be stem cells (that is, unnecessary living cells), thereby damaging unnecessary living cells to make them dead cells. The flow cytometer 10 also includes a recovery container 80 for recovering a sample solution containing dead cells and stem cells after being irradiated with femtosecond laser light, and is attached to the inner wall surface of the recovery container 80. A function that separates and collects cells that are not attached to the sample solution as dead cells and collects them, or a culture treatment that allows culturing of living cells is performed on the sample solution in the collection container 80, and only the stem cells in the sample solution are separated. By culturing, it also has a function of reducing the proportion of dead cells in the sample solution.

フローサイトメータ１０は、例えば、ヒトの骨髄から抽出した生細胞群など、大量の生細胞の中に、ごく少ない割合ながら幹細胞を含んだ（含む可能性が高い）生細胞群から、幹細胞を分別する、いわゆるソーティング機能を有する装置（ソーティングシステム）である。本実施形態では、このように、フローサイトメータ１０を用いて、例えば、ヒトの骨髄から抽出した生細胞群など、大量の生細胞の中に、ごく少ない割合ながら幹細胞を含んだ（含む可能性が高い）生細胞群から、幹細胞を分別し、各種の処理を施す。なお、本発明における目的生細胞は、幹細胞であることに限定されない。 The flow cytometer 10 separates stem cells from a group of living cells that contain (highly likely to contain) stem cells in a large proportion of living cells such as a group of living cells extracted from human bone marrow, for example. It is a device (sorting system) having a so-called sorting function. In the present embodiment, in this way, the flow cytometer 10 is used to contain stem cells in a very small proportion in a large number of living cells such as a group of living cells extracted from human bone marrow (possibility of including them). The stem cells are separated from the viable cell group and subjected to various treatments. In addition, the objective living cell in this invention is not limited to being a stem cell.

例えば、上述したように、ヒトの骨髄の中には、間葉系幹細胞と呼ばれ細胞が、１０万個に１個の割合でしか存在していない。フローサイトメータ１０を用いて行なう細胞分別処理においては、このような生細胞群に対して、予め、蛍光色素を用いて一様に染色処理（蛍光ラベル）を施すことで、幹細胞とその他の不要生細胞とを識別可能に特徴付けておく。幹細胞は、いわゆるＭＤＲ（ＭｕｌｔｉＤｒｕｇＲｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の働きで、細胞内に取り込んだ色素を吐き出す性質をもっている。特定の蛍光色素を用い、所定の条件で生細胞群を染色処理した場合、このＭＤＲの機能によって、幹細胞についてはほとんど染色されない（色素を吐き出した）状態となる。フローサイトメータ１０で行う細胞分別処理には、このように、細胞における蛍光色素の染色状態の違いによって、幹細胞１２ａとその他の不要生細胞１２ｂとを識別可能に特徴付けた生細胞群１１を用いる。生細胞群１１において、各細胞が、それぞれ幹細胞１２ａであるか不要生細胞１２ｂであるかについては、生細胞群１１をフローサイトメータ１０に導入する時点では不明であることは言うまでもない。本明細書では、幹細胞１２ａと不要生細胞１２ｂとを、（特に、幹細胞であるか不要生細胞であるか不明である状態において）共に分析サンプル１２として記載する。なお、本実施形態では、幹細胞の有するＭＤＲ機能を利用して、幹細胞とその他の不要生細胞とを識別可能に特徴付けているが、本発明において、蛍光色素によって目的細胞とその他の不要生細胞とを識別可能に特徴付ける手法は、特に限定されない。 For example, as described above, in human bone marrow, there are only cells called mesenchymal stem cells at a ratio of 1 in 100,000. In the cell sorting process performed using the flow cytometer 10, such a living cell group is preliminarily stained uniformly with a fluorescent dye (fluorescent label), so that stem cells and other unnecessary cells are unnecessary. Characterize live cells in a distinguishable way. Stem cells have the property of expelling dyes taken into cells by the action of so-called MDR (Multi Drug Resistance). When a specific fluorescent dye is used and a living cell group is stained under predetermined conditions, stem cells are hardly stained (the dye is discharged) by this MDR function. The cell sorting process performed by the flow cytometer 10 uses the living cell group 11 characterized in such a manner that the stem cells 12a and other unnecessary living cells 12b can be discriminated by the difference in the staining state of the fluorescent dye in the cells. . It goes without saying that in the living cell group 11, whether each cell is a stem cell 12a or an unnecessary living cell 12b is unknown at the time when the living cell group 11 is introduced into the flow cytometer 10. In the present specification, the stem cell 12a and the unnecessary living cell 12b are both described as the analysis sample 12 (particularly in a state where it is unknown whether it is a stem cell or an unnecessary living cell). In the present embodiment, the stem cells and other unnecessary living cells are characterized by utilizing the MDR function of the stem cells, but in the present invention, the target cells and other unnecessary living cells are used by the fluorescent dye. There is no particular limitation on the method for characterizing the above.

液流形成ユニット２０は、液体供給装置２２と、流管部３０とを有して構成されている。液体供給装置２２と流管部３０は、配管２４によって接続されている。液体供給装置２２内には、分析サンプル液を貯溜しておく分析サンプル液タンク２５、シース液を貯溜しておくシース液タンク２７とを有している。流管部３０は、サンプル液がシース液に囲まれて内部を流れるフローセル３２と、フローセル３２にシース液を供給するフローセル３２と連続した外部管路３４と、外部管路３４の内部に設けられて、フローセル３２にサンプル液を供給するサンプル液流管３６とを有している。液体供給装置２２のサンプル液タンク２５はサンプル液流管３６に、シース液タンク２７は外部管路３４に、配管２４を介してそれぞれ接続されている。フローセル３２の出口には、回収容器８０が設けられている。 The liquid flow forming unit 20 includes a liquid supply device 22 and a flow pipe unit 30. The liquid supply device 22 and the flow pipe unit 30 are connected by a pipe 24. The liquid supply device 22 includes an analysis sample liquid tank 25 that stores an analysis sample liquid and a sheath liquid tank 27 that stores a sheath liquid. The flow tube portion 30 is provided inside the flow cell 32 in which the sample liquid is surrounded by the sheath liquid and flows inside, the external pipe 34 continuous with the flow cell 32 that supplies the sheath liquid to the flow cell 32, and the external pipe 34. And a sample liquid flow pipe 36 for supplying the sample liquid to the flow cell 32. The sample liquid tank 25 of the liquid supply device 22 is connected to the sample liquid flow pipe 36, and the sheath liquid tank 27 is connected to the external pipe line 34 via the pipe 24. A recovery container 80 is provided at the outlet of the flow cell 32.

この液体供給装置２２は、図示しないエアポンプを各タンク毎に備えている。フローサイトメータ１０では、シース液タンク２７内部を図示しないエアポンプによって加圧することで外部管路３４内部にシース液を供給し、外部管路３４およびフローセル３２内を図１中上側から下側に向けて流れるシース流を形成する。そして、サンプル液タンク２５を図示しないエアポンプによって加圧することで、サンプル液流管３６の内部にサンプル液を供給し、サンプル液流管３６の図中下側の開口端である吐出口３８から、シース液の流れの中にサンプル液を吐出する。 The liquid supply device 22 includes an air pump (not shown) for each tank. In the flow cytometer 10, the sheath liquid tank 27 is pressurized by an air pump (not shown) to supply sheath liquid into the external conduit 34, and the inside of the external conduit 34 and the flow cell 32 are directed from the upper side to the lower side in FIG. 1. Forming a flowing sheath flow. Then, the sample liquid tank 25 is pressurized by an air pump (not shown) to supply the sample liquid to the inside of the sample liquid flow pipe 36, and from the discharge port 38 that is the lower open end of the sample liquid flow pipe 36 in the figure, The sample liquid is discharged into the sheath liquid flow.

フローセル３２では、サンプル液は、シース液に吐出された段階で流体力学的絞り込みが生じ、シース流に囲まれたサンプル液流は非常に細くなり、分析サンプル１２が１列に並んだサンプル液流を形成する。すなわち、フローセル３２では、分析サンプル１２は１列となり、１個ずつ順番に所定の速さＶ（ｍ／ｓ）でフローセル３２中を流れる。このフローセル３２には、光学ユニット４０の測定レーザ光照射手段４２によってレーザ光が照射されており、このレーザ光を横切るようにして分析サンプル１２は１個づつ順番に流れる。 In the flow cell 32, the fluid dynamic narrowing occurs when the sample liquid is discharged into the sheath liquid, the sample liquid flow surrounded by the sheath flow becomes very thin, and the sample liquid flow in which the analysis samples 12 are arranged in a row. Form. That is, in the flow cell 32, the analysis samples 12 are arranged in a row and flow through the flow cell 32 one by one at a predetermined speed V (m / s). The flow cell 32 is irradiated with laser light by the measurement laser light irradiation means 42 of the optical unit 40, and the analysis samples 12 flow one by one so as to cross the laser light.

光学ユニット４０は、フローセル３２にむけて測定用のレーザ光を照射する測定レーザ光照射手段４２と、フローセル３２を流れる分析サンプル１２による散乱光を受光し、受光した散乱光に応じた信号を出力する受光部４４と、フローセル３２を流れる分析サンプル１２から発光した蛍光を受光し、受光した蛍光に応じた信号を出力する受光部４６と、後述するデータ処理・判別部５４において不要生細胞と判別された分析サンプル１２に対してのみフェムト秒レーザ光を照射するフェムト秒レーザ光照射手段４８と、を有している。受光部４４および４６は分析ユニット５０に接続されており、出力された光信号は分析ユニット５０に送られる。 The optical unit 40 receives the measurement laser light irradiation means 42 that irradiates the measurement laser light toward the flow cell 32 and the scattered light from the analysis sample 12 flowing through the flow cell 32, and outputs a signal corresponding to the received scattered light. A light receiving unit 44 that receives fluorescence emitted from the analysis sample 12 flowing through the flow cell 32, and outputs a signal corresponding to the received fluorescence, and a data processing / discriminating unit 54, which will be described later, discriminates from unnecessary living cells. And femtosecond laser light irradiation means 48 for irradiating femtosecond laser light only to the analyzed sample 12. The light receivers 44 and 46 are connected to the analysis unit 50, and the output optical signal is sent to the analysis unit 50.

図２は、光学ユニット４０の構成および動作についてより詳細に説明する、概略側面図である。測定レーザ光照射手段４２は、フローセル３２を流れるサンプル流に向けて特定波長のレーザ光を出射する測定レーザ光源部６２と、測定レーザ光源部６２から出射された測定用レーザ光を整形してフローセル３２内のサンプル液流に導く、レンズなどからなるレーザ光整形・調整部６４とを備えて構成されている。測定レーザ光源部６２は、図示しないレーザ電源に接続されており、制御装置１０の制御の下、フローセル３２内を流れる、分析サンプル１２が１列に並んだサンプル液流に向けて、測定用レーザ光を連続的に出射する。測定レーザ光源部６２から出射される測定用レーザ光は、分析サンプル１２に付着された（特に不要生細胞１２ｂ内に取り込まれて付着している）蛍光色素を励起させて特定波長範囲の蛍光を発生させる、特定波長のレーザ光である。レーザ光源部６２としては、固体レーザや半導体レーザなどの、周知のレーザ装置を用いればよい。 FIG. 2 is a schematic side view for explaining the configuration and operation of the optical unit 40 in more detail. The measurement laser light irradiating means 42 shapes the measurement laser light source 62 that emits laser light of a specific wavelength toward the sample flow that flows through the flow cell 32, and the measurement laser light emitted from the measurement laser light source 62 to flow cell And a laser beam shaping / adjusting unit 64 made of a lens or the like that guides the sample liquid flow in the lens 32. The measurement laser light source unit 62 is connected to a laser power source (not shown), and measures lasers toward the sample liquid stream in which the analysis sample 12 flows in the flow cell 32 under the control of the control device 10 and is arranged in a line. Light is emitted continuously. The measurement laser light emitted from the measurement laser light source 62 excites the fluorescent dye attached to the analysis sample 12 (particularly, taken in and attached to the unnecessary living cells 12b) to emit fluorescence in a specific wavelength range. It is a laser beam having a specific wavelength to be generated. As the laser light source 62, a known laser device such as a solid-state laser or a semiconductor laser may be used.

受光部４４は、フローセル３２を挟んで測定レーザ光照射手段４２と対向するように配置されており、フローセル３２を通過する分析サンプル１２によるレーザ光の前方散乱光を連続して受光し、受光した前方散乱光の強度に応じたアナログ電気信号を出力する。一方、受光部４６は、レーザ光源部４２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ、外部管路３０中の分析サンプル１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、レーザ光を受けて分析サンプル１２から発せられた蛍光を受光して、受光した蛍光の強度に応じたアナログ電気信号を出力する。受光部４４および受光部４６における光検出およびアナログ電気信号の出力には、ＰＭＴ（photomultiplier tube）を用いればよい。 The light receiving unit 44 is disposed so as to face the measurement laser light irradiation unit 42 with the flow cell 32 interposed therebetween, and continuously receives and receives the forward scattered light of the laser light from the analysis sample 12 passing through the flow cell 32. An analog electrical signal corresponding to the intensity of the forward scattered light is output. On the other hand, the light receiving unit 46 is arranged in a direction perpendicular to the emitting direction of the laser light emitted from the laser light source unit 42 and perpendicular to the moving direction of the analysis sample 12 in the external conduit 30. And receiving the laser beam and receiving the fluorescence emitted from the analysis sample 12, and outputting an analog electric signal corresponding to the intensity of the received fluorescence. A PMT (photomultiplier tube) may be used for light detection and output of an analog electric signal in the light receiving unit 44 and the light receiving unit 46.

分析ユニット５０は、データ取得部５２と、データ処理・判別部５４とを有して構成されている。データ取得部５２は、受光部４４および受光部４６から出力されたアナログ信号を受け取り、このアナログ信号をＡＤ変換してデジタル信号として出力する。データ処理・判別部５４は、データ取得部５２から出力されたデジタル情報を処理して、例えば、各分析サンプル１２の染色具合（生細胞中の蛍光色素量の程度）を示す情報（染色量情報）を導出する。データ処理・判別部５４は、さらに、この染色量情報に基づいて、染色量情報に対応する分析サンプル１２が、不要生細胞または幹細胞のいずれであるか判別する。本実施形態では、上述のように、不要生細胞１２ｂに比べて、幹細胞１２ａは染色具合（生細胞中の蛍光色素量の程度）が低いので、比較的染色具合が低いことを表す染色量情報（例えば、染色量の表す値が所定の閾値以下など）に対応する分析サンプル１２を、幹細胞１２ａであると判別する。 The analysis unit 50 includes a data acquisition unit 52 and a data processing / discrimination unit 54. The data acquisition unit 52 receives the analog signals output from the light receiving unit 44 and the light receiving unit 46, AD-converts the analog signals and outputs them as digital signals. The data processing / discriminating unit 54 processes the digital information output from the data acquisition unit 52 and, for example, information (staining amount information) indicating the degree of staining of each analytical sample 12 (degree of fluorescent dye amount in living cells). ) Is derived. The data processing / determination unit 54 further determines whether the analysis sample 12 corresponding to the staining amount information is an unnecessary living cell or a stem cell based on the staining amount information. In the present embodiment, as described above, since the stem cell 12a has a lower degree of staining (a degree of the amount of fluorescent dye in the living cells) than the unnecessary living cells 12b, the amount of staining information indicating that the degree of staining is relatively low. The analysis sample 12 corresponding to (for example, the value represented by the staining amount is equal to or less than a predetermined threshold) is determined to be the stem cell 12a.

データ処理・判別部５４は、判別結果を、制御装置７０の照射タイミング制御部７２（タイミング制御部７２）に送信する。なお、分析ユニット５０には、ディスプレイやプリンタなど、図示しない出力装置が接続されており、データ処理部５４における解析結果を表示出力することが可能となっている。なお、本実施形態では、光情報から細胞の染色具合の程度を導出することで、幹細胞であるか不要生細胞であるかを判別していたが、本発明の生細胞判別手段における、目的生細胞と不要生細胞との判別基準については、特に限定されない。本発明の生細胞判別手段において、取得した蛍光情報などの光情報に加える処理の内容や、目的細胞を特定するためのアルゴリスムなどは、特に限定されない。 The data processing / determination unit 54 transmits the determination result to the irradiation timing control unit 72 (timing control unit 72) of the control device 70. Note that an output device (not shown) such as a display and a printer is connected to the analysis unit 50, and the analysis result in the data processing unit 54 can be displayed and output. In the present embodiment, the degree of cell staining is derived from the optical information to determine whether the cell is a stem cell or an unnecessary living cell. There are no particular limitations on the criteria for discriminating between cells and unnecessary living cells. In the viable cell discriminating means of the present invention, the contents of the process to be added to the optical information such as the acquired fluorescence information, the algorithm for specifying the target cell, etc. are not particularly limited.

フェムト秒レーザ光照射手段４８は、フローセル３２を流れるサンプル流に向けて特定波長のフェムト秒レーザ光を出射するフェムト秒レーザ光源部６６と、フェムト秒レーザ光源部６６から出射されたフェムト秒レーザ光を変調するレーザ変調部６８と、変調されたフェムト秒レーザ光を整形してフローセル３２内のサンプル液流に導く、レンズなどからなるレーザ光整形・調整部６９とを備えて構成されている。フェムト秒レーザ光源部６６は、パルス時間幅が１０００（ｆｓ）未満（すなわち、数百フェムトセカンド（ｆｓ））の超短パルスレーザ光（いわゆるフェムト秒レーザ光）を出射することができる、いわゆる公知のフェムト秒レーザ発振装置である。本実施形態のフローサイトメータ１０では、例えば、パルス時間幅が１００（ｆｓ）程度、パルスエネルギー最大３（ｍＪ／ｐｕｌｓｅ）程度のフェムト秒レーザ光を用いる。 The femtosecond laser light irradiation unit 48 emits a femtosecond laser light source 66 having a specific wavelength toward the sample stream flowing through the flow cell 32, and the femtosecond laser light emitted from the femtosecond laser light source 66. And a laser beam shaping / adjusting unit 69 composed of a lens or the like that shapes the modulated femtosecond laser beam and guides it to the sample liquid flow in the flow cell 32. The femtosecond laser light source unit 66 can emit ultrashort pulse laser light (so-called femtosecond laser light) having a pulse time width of less than 1000 (fs) (that is, several hundred femtoseconds (fs)). This is a femtosecond laser oscillation device. In the flow cytometer 10 of the present embodiment, for example, femtosecond laser light having a pulse time width of about 100 (fs) and a maximum pulse energy of about 3 (mJ / pulse) is used.

このようなフェムト秒レーザ光では、パルスエネルギー自体は少ないものの、そのエネルギーを１００（ｆｓ）という時間に圧縮しており、Ｉ＝Ｅ／（Ｓ・ｔ）（Ｅ；パルスエネルギー、Ｓ；レーザビームスポットの面積、ｔ：レーザパルスの時間幅）で表されるレーザー強度Ｉ（空間エネルギー密度）を、例えば１００（ＴＷ／ｃｍ^２）と、非常に大きくできる。フェムト秒レーザ光源部６６から出射されたばかりの状態のフェムト秒レーザ光は、レーザビームのスポット面積Ｓが比較的大きく、それほど大きなレーザ強度（具体的には、レーザ変調部６８やフローセル３２の管壁を損傷してしまう程度のレーザ強度）にはなっていない。 In such a femtosecond laser beam, although the pulse energy itself is small, the energy is compressed to a time of 100 (fs), and I = E / (S · t) (E: pulse energy, S: laser beam) The laser intensity I (spatial energy density) represented by the area of the spot, t: time width of the laser pulse) can be very large, for example, 100 (TW / cm ² ). The femtosecond laser light just emitted from the femtosecond laser light source unit 66 has a relatively large spot area S of the laser beam and has a very large laser intensity (specifically, the tube wall of the laser modulator 68 or the flow cell 32). The laser intensity is not high enough to damage the surface.

レーザ変調部６８は、例えば、圧電素子を用いた高速の（１．０（μｓ）未満の応答速度で、レーザ光を透過／遮断できる）音響光変調器など、公知のレーザ変調手段であって、制御装置７０の照射タイミング制御部７２と接続している。照射タイミング制御部７２が、データ処理・判定部５４が受け取った判定結果に応じてレーザ変調部６８の動作を制御することで、データ処理・判定部５４における判定結果に応じた所定のタイミングで、フェムト秒レーザ光源部６６からサンプル液流に向けて出射したレーザ光を透過または遮断させる。照射タイミング制御部７２の動作については、後に詳述する。 The laser modulation unit 68 is a known laser modulation unit such as a high-speed acoustic light modulator using a piezoelectric element (which can transmit / block laser light at a response speed of less than 1.0 (μs)). The irradiation timing control unit 72 of the control device 70 is connected. The irradiation timing control unit 72 controls the operation of the laser modulation unit 68 according to the determination result received by the data processing / determination unit 54, so that the irradiation timing control unit 72 has a predetermined timing according to the determination result in the data processing / determination unit 54. The laser light emitted from the femtosecond laser light source unit 66 toward the sample liquid flow is transmitted or blocked. The operation of the irradiation timing control unit 72 will be described in detail later.

レーザ光整形・調整部６４は、例えば複数のレンズ等を備えて構成されており、フェムト秒レーザ光源部６６から出射されて、レーザ変調部６８を透過したフェムト秒レーザ光を、所定のスポット面積でサンプル液流に集光させることで、サンプル液流中の分析サンプル１２に対し、所定のレーザ強度でフェムト秒レーザ光を照射させる。 The laser light shaping / adjusting unit 64 includes, for example, a plurality of lenses and the like, and emits femtosecond laser light emitted from the femtosecond laser light source unit 66 and transmitted through the laser modulation unit 68 to a predetermined spot area. Then, the analysis sample 12 in the sample liquid flow is irradiated with femtosecond laser light with a predetermined laser intensity.

光学ユニット４０において、フェムト秒レーザ光は、測定レーザ光の照射位置Ａ（図２参照）に対して、サンプル液流の流方向の下流側に照射されており、フェムト秒レーザ光の照射位置Ｂ（図２参照）と測定レーザ光の照射位置Ａとは、予め設定された距離Ｄ（ｍ）だけ離間している。サンプル液流の速度、すなわち分析サンプル１２の移動速度Ｖ（ｍ／ｓ）であるので、１つの分析サンプル１２は、測定レーザ光の照射を受けたタイミングからＴ＝Ｄ／Ｖ（ｓ）だけ経過したタイミングで、フェムト秒レーザ光の照射位置を通過することになる。分析ユニット５０では、光情報を取得してから、少なくともこのＴ（ｓ）経過するまでの間に、所得した光情報に対応する分析サンプルが、不要生細胞か幹細胞かを判別して、照射タイミング制御部７２に判別結果を送信する。 In the optical unit 40, the femtosecond laser light is irradiated to the downstream side in the flow direction of the sample liquid flow with respect to the measurement laser light irradiation position A (see FIG. 2). (See FIG. 2) and the irradiation position A of the measurement laser beam are separated by a preset distance D (m). Since the speed of the sample liquid flow, that is, the moving speed V (m / s) of the analysis sample 12, one analysis sample 12 has elapsed by T = D / V (s) from the timing of receiving the measurement laser light. At this timing, the irradiation position of the femtosecond laser beam is passed. The analysis unit 50 determines whether the analysis sample corresponding to the obtained optical information is an unnecessary living cell or a stem cell at least until this T (s) elapses after acquiring the optical information, and the irradiation timing. The determination result is transmitted to the control unit 72.

照射タイミング制御部７２は、分析ユニット５０のデータ処理・判別部５４から、測定レーザ光に照射された分析サンプル１２が不要生細胞１２ｂであるとの判別結果を受け取った場合、この不要生細胞１２ｂにフェムト秒レーザ光が照射されるよう、レーザ変調部６８の動作を制御する。逆に、分析ユニット５０のデータ処理・判別部５４から、測定レーザ光に照射された分析サンプル１２が幹細胞１２ａであるとの判別結果を受け取った場合、この幹細胞１２ａにはフェムト秒レーザ光が照射されないよう、レーザ変調部６８の動作を制御する。 When the irradiation timing control unit 72 receives a determination result from the data processing / discrimination unit 54 of the analysis unit 50 that the analysis sample 12 irradiated with the measurement laser beam is an unnecessary living cell 12b, the irradiation living cell 12b The operation of the laser modulator 68 is controlled so that the femtosecond laser beam is irradiated to the laser beam. On the contrary, when the determination result that the analysis sample 12 irradiated with the measurement laser beam is the stem cell 12a is received from the data processing / discrimination unit 54 of the analysis unit 50, the stem cell 12a is irradiated with the femtosecond laser beam. The operation of the laser modulator 68 is controlled so as not to occur.

具体的には、照射タイミング制御部７２は、分析ユニット５０のデータ処理・判別部５４から、測定レーザ光に照射された分析サンプル１２が不要生細胞１２ｂであるとの判別結果を受け取ると、所定の時間範囲（対応する分析サンプル１２が、レーザ光の照射位置Ｂを確実に通過している時間範囲）だけ、レーザ変調部６８にフェムト秒レーザ光を透過させる。また、照射タイミング制御部７２は、分析ユニット５０のデータ処理・判別部５４から、測定レーザ光に照射された分析サンプル１２が不要生細胞１２ｂであるとの判別結果を受け取ると同時に、所定の時間範囲（対応する分析サンプル１２が、レーザ光の照射位置Ｂを確実に通過している時間範囲）だけ、レーザ変調部６８にフェムト秒レーザ光を遮断させる。 Specifically, when the irradiation timing control unit 72 receives a determination result from the data processing / determination unit 54 of the analysis unit 50 that the analysis sample 12 irradiated with the measurement laser beam is an unnecessary living cell 12b, the irradiation timing control unit 72 The femtosecond laser beam is transmitted through the laser modulator 68 only in the time range (a time range in which the corresponding analysis sample 12 is surely passing the laser beam irradiation position B). The irradiation timing control unit 72 receives the determination result that the analysis sample 12 irradiated with the measurement laser light is the unnecessary living cell 12b from the data processing / discrimination unit 54 of the analysis unit 50, and at the same time, The femtosecond laser beam is blocked by the laser modulator 68 only within a range (a time range in which the corresponding analysis sample 12 is reliably passing through the irradiation position B of the laser beam).

上記所定の時間範囲は予め設定されていてもよく、例えば、照射タイミング制御部７２に上記Ｔ＝Ｄ／Ｖ（ｓ）の情報も設定されており、照射タイミング制御部７２が比較的高い処理能力を有する場合など、以下のようにしてフェムト秒レーザ光の照射を制御すればよい。例えば、照射タイミング制御部７２は、送信された判別結果を受け取ったタイミングから、分析ユニット５０における各処理時間の影響を加味して、この判別結果に対応する分析サンプル１２（すなわち幹細胞１２ａ）が測定レーザ光の照射位置Ａを通過したタイミングを同定する。さらに、照射タイミング制御部７２は、幹細胞１２ａであるとの判別結果を受け取った場合は、少なくとも、この同定したタイミングからＴ＝Ｄ／Ｖ（ｓ）だけ経過したタイミング（すなわち、上記対応する分析サンプル１２が、フェムト秒レーザ光の照射位置Ｂを通過するタイミング）を同定し、このタイミングを含む所定の時間範囲（対応する１つの分析サンプル１２が、レーザ光の照射位置Ｂを通過している時間範囲）において、レーザ変調部６８にフェムト秒レーザ光を遮断させる。また、照射タイミング制御部７２は、不要生細胞１２ｂであるとの判別結果を受け取った場合は、少なくとも、この同定したタイミングからＴ＝Ｄ／Ｖ（ｓ）だけ経過したタイミングを含む所定の時間範囲（対応する１つの分析サンプル１２が、レーザ光の照射位置Ｂを通過している時間範囲）で、レーザ変調部６８にフェムト秒レーザ光を透過させる。 The predetermined time range may be set in advance. For example, the information of T = D / V (s) is also set in the irradiation timing control unit 72, and the irradiation timing control unit 72 has a relatively high processing capability. For example, the irradiation with femtosecond laser light may be controlled as follows. For example, the irradiation timing control unit 72 takes into account the influence of each processing time in the analysis unit 50 from the timing at which the transmitted discrimination result is received, and the analysis sample 12 (that is, the stem cell 12a) corresponding to this discrimination result is measured. The timing at which the laser beam irradiation position A is passed is identified. Furthermore, when the irradiation timing control unit 72 receives the determination result that it is the stem cell 12a, at least the timing when T = D / V (s) has elapsed from the identified timing (that is, the corresponding analysis sample) 12 identifies a timing at which the irradiation position B of the femtosecond laser light passes through, and a predetermined time range including this timing (time at which the corresponding one analysis sample 12 passes through the irradiation position B of the laser light). In the range), the laser modulator 68 blocks the femtosecond laser light. Moreover, when the irradiation timing control part 72 receives the determination result that it is the unnecessary living cell 12b, it is a predetermined time range including at least the timing when T = D / V (s) has elapsed from the identified timing. The femtosecond laser beam is transmitted through the laser modulator 68 in the time range in which the corresponding one analysis sample 12 passes through the irradiation position B of the laser beam.

図３は、フローセル３２内を移動する不要生細胞１２ｂに対する、フェムト秒レーザ光の照射について説明する概略図である。フェムト秒レーザ光は、分析サンプル１２よりもさらに小さい数μｍのスポット径で、分析サンプル１２に照射されるよう、レーザ光整形・調整部６４によって集光されている。フェムト秒レーザ光は、上述のように、非常に大きなレーザ強度を持つ超短パルスレーザ光であり、充分なレーザ強度のフェムト秒レーザ光を物質に照射すると、照射された光エネルギーが熱エネルギーとして周辺部分に拡散することなく、光エネルギーによって照射部分の分子結合が切断されて瞬時に分子が除去される現象（一般的に、アブレーションと呼ばれる）が生じる。分析サンプル１２への照射部分では、レーザ光が集光されて充分小さなスポット径となっているので、分析サンプル１２の細胞壁や細胞壁を瞬時に破壊してしまう程度に充分なレーザ強度となっている。これに対し、フローセル３２の管壁では、フェムト秒レーザ光のビームスポット径が、フローセルの壁面を瞬時に破壊する程度には充分に小さくないので、フローセル３２の管壁については、破壊されることはない。 FIG. 3 is a schematic diagram for explaining the irradiation of the femtosecond laser light with respect to the unnecessary living cells 12b moving in the flow cell 32. FIG. The femtosecond laser light is condensed by the laser light shaping / adjusting unit 64 so that the analysis sample 12 is irradiated with a spot diameter of several μm smaller than that of the analysis sample 12. As described above, the femtosecond laser beam is an ultrashort pulse laser beam having an extremely large laser intensity. When a femtosecond laser beam having a sufficient laser intensity is irradiated onto a substance, the irradiated light energy is converted into thermal energy. A phenomenon (generally called ablation) occurs in which molecules are instantaneously removed by breaking the molecular bond of the irradiated portion by light energy without diffusing to the peripheral portion. In the irradiated portion of the analysis sample 12, the laser beam is condensed and has a sufficiently small spot diameter, so that the laser intensity is sufficient to destroy the cell wall and the cell wall of the analysis sample 12 instantaneously. . In contrast, on the tube wall of the flow cell 32, the beam spot diameter of the femtosecond laser light is not small enough to instantaneously destroy the wall surface of the flow cell. There is no.

ここで、サンプル液流の速度、すなわち分析サンプル１２の移動速度を１０．０（ｍ／ｓ）、分析サンプル１２（不要生細胞１２ｂ）の直径を１．０×１０^−５（ｍ）とする。この場合、分析サンプル１２が、フェムト秒レーザ光の照射位置Ｂを通過してしまうまでにかかる時間は、１．０×１０^−６（ｓ）となる。フェムト秒レーザ光のパルス周期を５０×１０^６（Ｈｚ）とすると、分析サンプル１２（不要生細胞１２ｂ）が、フェムト秒レーザ光の照射位置を通過してしまうまでに、５０個の超短パルスが、この分析サンプル１２（不要生細胞１２ｂ）に照射される。これにより、分析サンプル１２（不要生細胞１２ｂ）には、５０箇所もの損傷箇所が形成され、この分析サンプル（不要生細胞１２ｂ）は、確実に死亡細胞１３（図２参照）とされる。照射タイミング制御部７２が、分析ユニット５０のデータ処理・判別部５４から、測定レーザ光に照射された分析サンプル１２が不要生細胞１２ｂであるとの判別結果を受け取った場合、この不要生細胞１２ｂにフェムト秒レーザ光が照射されるよう、レーザ変調部６８の動作を制御することで、サンプル群１２のうちの不要生細胞１２ｂは、確実に死亡細胞とされる。また、逆に、分析ユニット５０のデータ処理・判別部５４から、測定レーザ光に照射された分析サンプル１２が幹細胞１２ａであるとの判別結果を受け取った場合、この幹細胞１２ａにはフェムト秒レーザ光が照射されないよう、レーザ変調部６８の動作を制御するので、サンプル群１２のうちの幹細胞１２ａは、損傷を一切受けることなく、確実にフェムト秒レーザ光照射位置Ｂを通過する。 Here, the speed of the sample liquid flow, that is, the moving speed of the analysis sample 12 is 10.0 (m / s), and the diameter of the analysis sample 12 (unnecessary living cells 12b) is 1.0 × 10 ⁻⁵ (m). . In this case, the time taken for the analysis sample 12 to pass through the irradiation position B of the femtosecond laser light is 1.0 × 10 ⁻⁶ (s). When the pulse period of the femtosecond laser beam is 50 × 10 ⁶ (Hz), 50 ultrashort pulses are required until the analysis sample 12 (unnecessary living cells 12b) passes through the irradiation position of the femtosecond laser beam. Is irradiated to the analysis sample 12 (unnecessary living cells 12b). As a result, as many as 50 damaged portions are formed in the analysis sample 12 (unnecessary living cells 12b), and the analysis sample (unnecessary living cells 12b) is reliably regarded as dead cells 13 (see FIG. 2). When the irradiation timing control unit 72 receives a determination result from the data processing / discrimination unit 54 of the analysis unit 50 that the analysis sample 12 irradiated with the measurement laser light is the unnecessary living cell 12b, the unnecessary living cell 12b. By controlling the operation of the laser modulation unit 68 so that the femtosecond laser beam is irradiated to the femtosecond laser beam, the unnecessary living cells 12b in the sample group 12 are surely made dead cells. Conversely, when the determination result that the analysis sample 12 irradiated with the measurement laser beam is the stem cell 12a is received from the data processing / discrimination unit 54 of the analysis unit 50, the stem cell 12a receives the femtosecond laser beam. Therefore, the stem cell 12a of the sample group 12 passes through the femtosecond laser beam irradiation position B without being damaged at all.

フェムト秒レーザ光の照射位置を通過した分析サンプル１２は、回収容器８０内に落下する。例えば、生細胞は、一般的に、接触した物体に付着（着床）する性質を有している。このため、回収容器８０の壁面には、フェムト秒レーザ光の照射によって死亡細胞１３となっていない分析サンプル１２、すなわち幹細胞１２ａのみが付着している状態となる。フェムト秒レーザ光の照射によって死亡細胞１３となった細胞は、回収容器８０内のサンプル液に浮遊している状態となる。この浮遊状態の死亡細胞１３（不要生細胞１２ｂであったもの）を除去することで、回収容器８０内に目的生細胞である幹細胞１２ａのみを分離して、回収することができる。フローサイトメータ１０は、このような、回収容器８０の内壁面に付着せずサンプル液に浮遊する細胞を、死亡細胞１３として分別して回収し、回収容器８０内に目的生細胞である幹細胞１２ａのみを分離・回収する、図示しない分離・回収手段を有していることが好ましい。 The analysis sample 12 that has passed through the irradiation position of the femtosecond laser beam falls into the collection container 80. For example, a living cell generally has a property of attaching (implanting) to a contacted object. For this reason, only the analysis sample 12, which is not the dead cell 13, that is, the stem cell 12a is attached to the wall surface of the collection container 80 by the irradiation of the femtosecond laser light. Cells that have become dead cells 13 by irradiation with femtosecond laser light are in a state of floating in the sample solution in the collection container 80. By removing the floating dead cells 13 (which were unnecessary live cells 12b), only the stem cells 12a, which are target live cells, can be separated and collected in the collection container 80. The flow cytometer 10 separates and collects cells that do not adhere to the inner wall surface of the collection container 80 and float in the sample solution as dead cells 13, and only the stem cells 12 a that are target living cells are collected in the collection container 80. It is preferable to have separation / recovery means (not shown) for separating / recovering.

また、回収容器８０中のサンプル液に対して生細胞を培養可能な培養処理を施せば、サンプル液中の死亡細胞（不要生細胞１２ｂであったもの）は培養される（増殖する）ことなく、サンプル液中の生細胞のみが培養される（増殖する）。このように、サンプル群１１中の不要生細胞１２ｂを、フェムト秒レーザ光によって確実に死亡細胞としているので、サンプル液に培養処理を施すことで、サンプル群１１中の幹細胞１２ａのみを分別して培養することができ、サンプル液中の死亡細胞１３の割合を減少させることができる。このような培養処理によって、ほとんど全ての細胞が幹細胞１２ａからなる細胞群を得ることができる。フローサイトメータ１０は、このような、回収容器８０中のサンプル液に対して生細胞を培養可能な培養処理を施すことができる、図示しない培養手段を有していることが好ましい。フローサイトメータ１０は、以上のような構成となっている。 In addition, if the sample solution in the collection container 80 is subjected to a culture process capable of culturing living cells, dead cells in the sample solution (those that were unnecessary living cells 12b) are not cultured (grow). Only living cells in the sample solution are cultured (proliferated). In this way, the unnecessary living cells 12b in the sample group 11 are surely made dead cells by the femtosecond laser beam, so that only the stem cells 12a in the sample group 11 are separated and cultured by subjecting the sample solution to culture treatment. And the proportion of dead cells 13 in the sample solution can be reduced. By such a culture treatment, a cell group in which almost all cells are stem cells 12a can be obtained. The flow cytometer 10 preferably has a culture means (not shown) that can perform such a culture treatment that can culture live cells on the sample solution in the collection container 80. The flow cytometer 10 is configured as described above.

以上、細胞分別処理機能を有するフローサイトメータ、および細胞分別処理方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施例に限定はされず、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良および変更を行ってもよいのはもちろんである。 As described above, the flow cytometer having a cell sorting treatment function and the cell sorting treatment method have been described in detail. However, the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various improvements and modifications can be made without departing from the gist of the present invention. Of course, changes may be made.

本発明の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータの一例について説明する概略斜視図である。It is a schematic perspective view explaining an example of the flow cytometer which has a cell classification processing function of this invention. 図１に示すフローサイトメータの光学ユニットの構成および動作について説明する概略側面図である。It is a schematic side view explaining the structure and operation | movement of an optical unit of the flow cytometer shown in FIG. 図１に示すフローサイトメータのフローセル内を移動する不要生細胞に対する、フェムト秒レーザ光の照射について説明する概略図である。It is the schematic explaining irradiation of the femtosecond laser beam with respect to the unnecessary living cell which moves in the flow cell of the flow cytometer shown in FIG. 従来の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータの一例である、セルソータについて説明する概略構成図である。It is a schematic block diagram explaining the cell sorter which is an example of the flow cytometer which has the conventional cell classification processing function.

Explanation of symbols

１０フローサイトメータ
１１生細胞群
１２分析サンプル
１２ａ幹細胞
１２ｂ不要生細胞
１３死亡細胞
２０液流形成ユニット
２２液体供給装置
２５分析サンプル液タンク
２７シース液タンク
３２フローセル
３４外部管路
３６サンプル液流管
４０光学ユニット
４２測定レーザ光照射手段
４４、４６受光部
４８フェムト秒レーザ光照射手段
５０分析ユニット
５２データ取得部
５４データ処理・判別部
６２測定レーザ光源部
６４、６９レーザ光整形・調整部
６６フェムト秒レーザ光源部
６８レーザ変調部
７０制御装置
７２照射タイミング制御部
８０回収容器
１００セルソータ
１０２細胞サンプル
１０３ノズル
１０４ジェット流
１０６レーザ光
１０８、１１０光電子増倍管
１１２液滴
１１４、１１６電場形成電極板
１２０試験管 DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Flow cytometer 11 Living cell group 12 Analysis sample 12a Stem cell 12b Unnecessary living cell 13 Dead cell 20 Liquid flow formation unit 22 Liquid supply apparatus 25 Analytical sample liquid tank 27 Sheath liquid tank 32 Flow cell 34 External pipe line 36 Sample liquid flow pipe 40 Optical unit 42 Measurement laser light irradiation means 44, 46 Light receiving section 48 Femtosecond laser light irradiation means 50 Analysis unit 52 Data acquisition section 54 Data processing / discrimination section 62 Measurement laser light source section 64, 69 Laser light shaping / adjustment section 66 Femtosecond Laser light source unit 68 Laser modulation unit 70 Control device 72 Irradiation timing control unit 80 Collection container 100 Cell sorter 102 Cell sample 103 Nozzle 104 Jet flow 106 Laser beam 108, 110 Photomultiplier tube 112 Droplet 114, 116 Electron Forming electrode plate 120 tubes

Claims

A flow cytometer having a cell sorting function,
Sample liquid flow forming means for forming a flow of sample liquid containing a group of living cells formed by mixing a plurality of unnecessary living cells and a plurality of living target cells;
Laser light irradiation means for irradiating the sample liquid flow with measurement laser light;
Optical information acquisition means for receiving each of the light information of scattered light and fluorescence emitted from each living cell of the sample liquid stream upon receiving the measurement laser light,
Based on the optical information acquired by the optical information acquisition means, the live cell discrimination means for discriminating whether each of the live cells corresponding to each optical information is the unnecessary live cell or the target live cell;
According to the discrimination result in the viable cell discrimination means, the femtosecond laser light is irradiated only to the viable cells that are discriminated as the unnecessary viable cells in the viable cell group in the sample solution, A femtosecond laser light irradiation means for damaging and dead cells;
A flow cytometer having a cell sorting process function.

A live cell sorting method,
Forming a flow of a sample solution containing a group of living cells formed by mixing a plurality of unnecessary living cells and a plurality of target living cells;
Irradiating the sample liquid flow with a measuring laser beam;
Receiving at least one of the scattered light and fluorescence light information emitted from each of the living cells of the sample liquid stream upon receiving the measurement laser light; and
Based on the optical information acquired by the acquiring step, determining whether each of the living cells corresponding to each optical information is the unnecessary living cells or the target living cells,
Irradiating femtosecond laser light only to the living cells determined as the unnecessary living cells in the group of living cells in the sample liquid according to the determination result in the determining step, and damaging the unnecessary living cells Giving a dead cell,
A viable cell sorting method comprising the steps of:

Furthermore, the step of collecting the sample liquid after being irradiated with the femtosecond laser light, including the dead cells damaged by irradiation with the femtosecond laser light and the target living cells, in a collection container;
Cells that adhere to the inner wall surface of the collection container in the sample solution are collected as the target living cells, and cells that do not adhere to the inner wall surface of the collection container and float in the sample solution are classified as the dead cells. The method of claim 2, further comprising the step of collecting separately.

Furthermore, the step of collecting the sample liquid after being irradiated with the femtosecond laser light, including the dead cells damaged by irradiation with the femtosecond laser light and the target living cells, in a collection container;
A ratio of the dead cells in the sample solution is obtained by subjecting the sample solution in the collection container to a culture treatment capable of culturing living cells, and separating and culturing only the target living cells in the sample solution. The method of claim 2, further comprising the step of: