JP2007129973A - Method for producing unsaturated fatty acid-containing phospholipid - Google Patents
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Abstract
Description
構成脂肪酸として不飽和脂肪酸を含有するリン脂質の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a phospholipid containing an unsaturated fatty acid as a constituent fatty acid.
生体膜の主要な成分であるリン脂質は、リン酸化アルコールと脂肪酸とから構成される化合物である。リン脂質はそのリン酸化アルコール成分の違いにより複数の分子種があり、たとえばホスファチジルコリン（ＰＣ）やホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）は生体膜リン脂質の主要な組成を占めている。また別のリン脂質であるホスファチジルグリセロール（ＰＧ）は、その高い乳化性から食品素材などとしても有用性が高い。さらにホスファチジルセリン（ＰＳ）は、脳機能に深く関わるリン脂質であり、その摂取により、加齢とともに低下する脳機能の改善効果が知られている。 Phospholipids, which are main components of biological membranes, are compounds composed of phosphorylated alcohols and fatty acids. Phospholipids have multiple molecular species depending on their phosphorylated alcohol components. For example, phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) occupy the main composition of biological membrane phospholipids. Another phospholipid, phosphatidylglycerol (PG), is highly useful as a food material because of its high emulsifiability. Furthermore, phosphatidylserine (PS) is a phospholipid that is deeply related to brain function, and its effect of improving brain function that decreases with aging is known.
リン脂質は分子内に２つの脂肪酸を結合しているが、脂肪酸群のうちの一部はヒトを含む動物の体内では合成できないため、食事や他の動植物の補食により摂取する必要がある。しかしながら、ＰＳやＰＧのようなリン脂質の一般食品中の含有量は微量であるため、十分量を食事から摂取することは困難である。 Phospholipids bind two fatty acids in the molecule, but some of the fatty acid groups cannot be synthesized in the body of animals, including humans, and therefore must be ingested by diet and other animal and plant supplements. However, since the content of phospholipids such as PS and PG in general foods is very small, it is difficult to take a sufficient amount from a meal.
そこで、従来、牛脳から抽出されたリン脂質が市販されていたが、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）問題の発生により安全な供給源が必要とされ、大豆レシチンから抽出されたリン脂質も市販されるようになった。さらに、大豆リン脂質を原料として、ホスホリパーゼＤによる塩基交換反応により、純度のより高いＰＳが製造可能となっている。 Thus, phospholipids extracted from bovine brain have been commercially available, but a safe source is required due to the occurrence of bovine spongiform encephalopathy (BSE), and phospholipids extracted from soybean lecithin are also commercially available. It became so. Furthermore, PS with higher purity can be produced by soybean-phospholipid as a raw material by a base exchange reaction with phospholipase D.
また、従来からの動物や植物由来の原料を用いる代わりに、微生物を培養して、その微生物の細胞膜から脂質を抽出する方法も知られていた。 In addition, instead of using conventional animal or plant-derived materials, a method of culturing a microorganism and extracting lipids from the cell membrane of the microorganism has also been known.
一方、リン脂質の生理活性は、リン脂質を構成する脂肪酸（本願では、構成脂肪酸と称する）の成分にも大きく左右されることが示されている。脂肪酸のうち、例えば分子内に不飽和炭素結合を有する不飽和脂肪酸、中でも不飽和度の高い高度不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、循環器系や神経系に対する効果が注目されている。そこで、高度不飽和脂肪酸を豊富に含有する魚卵（例えば特許文献１、２を参照）やイカ皮（例えば特許文献３を参照）をリン脂質の原料として用いることが提案されている。
このように、動物、植物、及び微生物由来の原料を用いたリン脂質の製造方法が開発されてきたが、これらの従来技術においてはいずれの場合も、リン脂質を構成する脂肪酸の組成には原料リン脂質の脂肪酸組成が反映されるため、脂肪酸組成を任意に幅広くコントロールすることはできなかった。 As described above, methods for producing phospholipids using raw materials derived from animals, plants, and microorganisms have been developed. In any of these conventional techniques, the composition of fatty acids constituting phospholipids is the raw material. Since the fatty acid composition of phospholipids is reflected, the fatty acid composition could not be controlled arbitrarily and widely.
本発明は、上記の問題点に鑑み、脂肪酸組成をコントロールできるリン脂質の製造方法を提供するものである。 In view of the above problems, the present invention provides a method for producing a phospholipid capable of controlling the fatty acid composition.
本発明者らは、リン脂質を構成する不飽和脂肪酸の組成をコントロールする方法を見いだそうと鋭意努力した結果、微生物を培養する際、培地に不飽和脂肪酸を添加することにより、抽出されるリン脂質の組成をコントロールできることを見いだし、本発明の完成に至った。 As a result of diligent efforts to find a method for controlling the composition of unsaturated fatty acids constituting phospholipids, the present inventors have obtained phospholipids extracted by adding unsaturated fatty acids to the medium when culturing microorganisms. It was found that the composition of the composition can be controlled, and the present invention was completed.
本発明に係るリン脂質の製造方法は、リン脂質を構成する脂肪酸に不飽和脂肪酸を含有するリン脂質の製造方法であって、不飽和脂肪酸またはその化合物を添加した培養液中で微生物を培養する培養工程と、培養した微生物から脂質を抽出する抽出工程とを含むことを特徴とする。 The method for producing a phospholipid according to the present invention is a method for producing a phospholipid containing an unsaturated fatty acid in a fatty acid constituting the phospholipid, and culturing the microorganism in a culture solution to which the unsaturated fatty acid or a compound thereof is added. It includes a culturing step and an extraction step for extracting lipid from the cultured microorganism.
上記の製造方法によって得られたリン脂質に、アルコール化合物とホスホリパーゼＤを添加して、塩基置換反応をさらに行わせることよって、不飽和脂肪酸含有リン脂質を製造することもできる。 Unsaturated fatty acid-containing phospholipids can also be produced by adding an alcohol compound and phospholipase D to the phospholipids obtained by the above production method and further performing a base substitution reaction.
本発明に係るアルコール化合物はセリンであってもよい。 The alcohol compound according to the present invention may be serine.
本発明に係る不飽和脂肪酸の化合物は、不飽和脂肪酸のエステル、不飽和脂肪酸の塩、及び不飽和脂肪酸のアミドからなる群から選ばれた少なくとも一つであってもよい。 The unsaturated fatty acid compound according to the present invention may be at least one selected from the group consisting of unsaturated fatty acid esters, unsaturated fatty acid salts, and unsaturated fatty acid amides.
本発明に係る不飽和脂肪酸は、オレイン酸、リノール酸、α−リノレイン酸、γ−リノレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、ジホモ−γ−リノレイン酸、共役リノール酸、共役リノレイン酸、共役アラキドン酸、共役エイコサペンタエン酸、共役ドコサペンタエン酸、及び共役ドコサヘキサエン酸からなる群から選ばれた少なくとも一つであってもよい。 The unsaturated fatty acid according to the present invention includes oleic acid, linoleic acid, α-linolenic acid, γ-linolenic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, docosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, dihomo-γ-linolenic acid, conjugated linoleic acid And at least one selected from the group consisting of conjugated linolenic acid, conjugated arachidonic acid, conjugated eicosapentaenoic acid, conjugated docosapentaenoic acid, and conjugated docosahexaenoic acid.
本発明に係る微生物は、バクテリア、酵母、糸状菌、微細藻類、及びラビリンチュラからなる群から選ばれた少なくとも一つであってもよい。 The microorganism according to the present invention may be at least one selected from the group consisting of bacteria, yeast, filamentous fungi, microalgae, and Labyrinthula.
本発明の方法によって、脂肪酸組成をコントロールできるリン脂質の製造方法を提供することができる。 The method of the present invention can provide a method for producing phospholipids capable of controlling the fatty acid composition.
上述したように、微生物を培養し、その微生物の細胞膜から脂質を抽出することにより、リン脂質を製造することができる。本発明に係るリン脂質の製造方法によると、こうした製造方法において、不飽和脂肪酸またはその化合物を添加した培養液で微生物を培養することによって、微生物の脂質代謝を利用することができ、所望の不飽和脂肪酸を含有したリン脂質を得ることができる。 As described above, a phospholipid can be produced by culturing a microorganism and extracting the lipid from the cell membrane of the microorganism. According to the method for producing phospholipid according to the present invention, in such a production method, by culturing a microorganism in a culture solution to which an unsaturated fatty acid or a compound thereof is added, the lipid metabolism of the microorganism can be utilized, and a desired disorder can be utilized. A phospholipid containing a saturated fatty acid can be obtained.
ここで、この培養に用いる微生物は、その細胞膜から脂質を抽出することのできる微生物であればどんなものであってもよい。そのような微生物の例としては、バクテリア、酵母、糸状菌、微細藻類、及びラビリンチュラ（ラビリンチュラ科、ヤブレツボカビ科のいずれの科をも含む）などが挙げられるが、クロレラやユーグレナなどの微細藻類が好ましい。 Here, the microorganism used for the culture may be any microorganism as long as it can extract lipids from the cell membrane. Examples of such microorganisms include bacteria, yeasts, filamentous fungi, microalgae, and Labyrinthula (including any of Labyrinthaceae and Jaburebicaceae), but fine microbes such as Chlorella and Euglena. Algae are preferred.
また、脂質を抽出するための方法は、細胞膜から脂質を抽出するための一般的な方法であればよく、例えばBligh & Dyer法を用いることができる。 The method for extracting lipids may be any general method for extracting lipids from cell membranes. For example, the Bligh & Dyer method can be used.
次に、リン脂質に含有させるための不飽和脂肪酸は、微生物が代謝することができるものであればいずれのものでもよく、その例としてはオレイン酸、リノール酸、α−リノレイン酸、γ−リノレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、ジホモ−γ−リノレイン酸、共役リノール酸、共役リノレイン酸、共役アラキドン酸、共役エイコサペンタエン酸、共役ドコサペンタエン酸、及び共役ドコサヘキサエン酸、またはこれらを組み合わせたものが挙げられる。 Next, the unsaturated fatty acid to be contained in the phospholipid may be any fatty acid that can be metabolized by microorganisms. Examples thereof include oleic acid, linoleic acid, α-linolenic acid, and γ-linolein. Acids, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, docosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, dihomo-γ-linolenic acid, conjugated linoleic acid, conjugated linolenic acid, conjugated arachidonic acid, conjugated eicosapentaenoic acid, conjugated docosapentaenoic acid, and conjugated docosahexaene An acid or a combination of these may be used.
しかしそれらのうちでも、リン脂質に含有させる不飽和脂肪酸としてより好ましいのは、動物に対して生理活性を持つ脂肪酸であり、たとえばエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、またはそれらの共役酸である。 However, among them, more preferable unsaturated fatty acids to be contained in phospholipids are fatty acids having physiological activity on animals, such as eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), or a conjugate thereof. It is an acid.
一方、リン脂質に含有させるために培地に添加する不飽和脂肪酸は、微生物が細胞内に取り込むことができればよく、上述の不飽和脂肪酸の遊離の形のものであってもよいし、あるいは上述の不飽和脂肪酸の化合物、例えばエステル、塩、またはアミド、もしくはそれらの組み合わせであってもよい。 On the other hand, the unsaturated fatty acid added to the medium for inclusion in the phospholipid is not limited as long as the microorganism can be taken into the cells, and may be in the above-mentioned unsaturated fatty acid free form, or may be It may be a compound of an unsaturated fatty acid, such as an ester, salt, or amide, or a combination thereof.
また、上述の不飽和脂肪酸を培地に添加する際には、ビタミンEやビタミンCなどの抗酸化成分を共存させることもできる。さらに不飽和脂肪酸を培地に効率よく分散させるため、天然あるいは合成の乳化剤を用いることは差し支えない。 Moreover, when adding the above-mentioned unsaturated fatty acid to a culture medium, antioxidant components, such as vitamin E and vitamin C, can also coexist. Furthermore, natural or synthetic emulsifiers can be used to efficiently disperse unsaturated fatty acids in the medium.
そして、培地に添加する不飽和脂肪酸またはそれらの化合物の含量は、微生物を培養してそれらを取り込ませることを妨げない範囲であればよく、例えば、培地の重量に対して０．００５重量％〜５重量％の範囲内であってよい。 The content of unsaturated fatty acids or their compounds added to the medium may be in a range that does not prevent the microorganisms from being cultivated and taken in, for example, 0.005% by weight to the weight of the medium. It may be in the range of 5% by weight.
また、不飽和脂肪酸を添加する際の培地のｐHは、微生物が不飽和脂肪酸を取り込む事を妨げない範囲であればよく、微生物の増殖が可能であるｐHに限定されない。例えばｐH2.0〜9.0の範囲であってよい。 Further, the pH of the medium when adding the unsaturated fatty acid may be in a range that does not prevent the microorganism from taking in the unsaturated fatty acid, and is not limited to a pH at which the microorganism can grow. For example, it may be in the range of pH 2.0 to 9.0.
さらに、前述の抽出方法によって得られたリン脂質に対し、アルコール化合物を添加して塩基交換反応をさらに行わせることにより、その化合物由来のアルコールを含むような所望の分子種の不飽和脂肪酸含有リン脂質を製造することもできる。この反応を行わせるにはリン脂質の塩基交換反応を促進する触媒の添加が望ましく、そのような触媒の好ましい例としては、取り扱いの容易なホスホリパーゼＤ（酵素番号 EC 3.1.4.4）があり、例えば放線菌の一種Actinomadura sp.由来のものが市販されている。 Furthermore, by adding an alcohol compound to the phospholipid obtained by the extraction method described above to further perform a base exchange reaction, an unsaturated fatty acid-containing phospholipid having a desired molecular species containing an alcohol derived from the compound is obtained. Lipids can also be produced. In order to carry out this reaction, it is desirable to add a catalyst that promotes the base exchange reaction of phospholipids. A preferable example of such a catalyst is phospholipase D (enzyme number EC 3.1.4.4) which is easy to handle. A product derived from Actinomadura sp., A kind of actinomycetes, is commercially available.
そして、添加するアルコール化合物としては、例えばセリンを用いることができ、この場合、反応の産物としてホスファチジルセリンが得られる。また別の例として、グリセリンやエタノールアミンを用いることができ、この場合はそれぞれ天然型リン脂質であるホスファチジルグリセロールやホスファチジルエタノールアミンを得ることができるし、あるいはその他のアルコール化合物を用いて、有機合成では一般に合成が困難な新規リン脂質分子種を製造することもできる。 And as an alcohol compound to add, serine can be used, for example, In this case, phosphatidylserine is obtained as a product of reaction. As another example, glycerin and ethanolamine can be used. In this case, phosphatidylglycerol and phosphatidylethanolamine, which are natural phospholipids, can be obtained, respectively, or other alcohol compounds can be used for organic synthesis. Thus, it is also possible to produce new phospholipid molecular species that are generally difficult to synthesize.
以下に、本発明の好ましい実施の態様を実施例を用いてより詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びアイデアは、本明細書の記載により当業者には明らかであり、本明細書の記載に基づき、当業者が本発明を再現することは容易である。以下に記載された具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すための例示又は説明として示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in more detail with reference to examples. The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and it is easy for those skilled in the art to reproduce the present invention based on the description of the present specification. . The specific examples and the like described below are provided as examples or explanations for illustrating preferred embodiments of the present invention, and the present invention is not limited thereto. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
＝＝＝ＤＨＡ含有リン脂質の製造＝＝＝
［実施例１］ ５００ｍｌ容振とうフラスコで、グルコースを炭素源、尿素を窒素源とする従属栄養培養液（１L中にグルコース20g、リン酸１カリウム1.2g、硫酸マグネシウム７水和物0.6g、尿素1.5g、EDTA-Fe-Na 15mg、A5金属塩溶液2mlを含む）を用いて、クロレラ（Chlorella vulgaris C-30）（国立環境研究所より入手）を２８℃、暗所にて振とう培養した。増殖が定常期に達した４８時間後に、培養液１００ｍｌに対して０．５重量％のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）（遊離脂肪酸、備前化成（株）より入手）（純度９９．０％）を無菌的に添加し、さらに振とう培養を２４時間継続した。次に、遠心分離３０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）によりクロレラ細胞を回収し、凍結乾燥後、Bligh & Dyer法に従い、乾燥細胞１５００ｍｇから、クロロホルム−メタノール混液（クロロホルム：メタノール：水 (1:2:0.7)）３０ｍｌで３回繰り返し総脂質を抽出した。
=== Production of DHA-containing phospholipids ===
[Example 1] In a 500 ml shake flask, a heterotrophic culture solution containing glucose as a carbon source and urea as a nitrogen source (20 g glucose, 1.2 g monopotassium phosphate, 0.6 g magnesium sulfate heptahydrate in 1 liter, Chlorella vulgaris C-30 (obtained from National Institute for Environmental Studies) is shaken in the dark at 28 ° C using urea 1.5g, EDTA-Fe-Na 15mg and A5 metal salt solution 2ml) did. 48 hours after the growth reached a stationary phase, 0.5% by weight of docosahexaenoic acid (DHA) (free fatty acid, obtained from Bizen Kasei Co., Ltd.) (purity 99.0%) was aseptically per 100 ml of the culture solution. And further shaking culture was continued for 24 hours. Next, chlorella cells were collected by centrifugation (3000 rpm × 10 min), lyophilized, and then dried according to Bligh & Dyer method, from 1500 mg of dried cells to 30 ml of chloroform-methanol mixture (chloroform: methanol: water (1: 2: 0.7)) The total lipid was extracted three times.
得られた総脂質２３０ｍｇから、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、以下のようにリン脂質混合物を分画した。まず、クロロホルムに懸濁したシリカゲル１０ｇを、内径２０ｍｍのオープンカラムに充填し、２ｍｌのクロロホルムに溶解した総脂質をシリカゲルに吸着させた。次に、クロロホルム３００ｍｌ、アセトン２００ｍｌ、メタノール３００ｍｌの順にカラムに流し、メタノール溶出画分をリン脂質混合物とした。これにより、８５ｍｇのリン脂質混合物を得た。このリン脂質混合物の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーで測定した。まず、リン脂質混合物２０ｍｇをスクリューキャップ付き試験管にとり、１０％塩化水素−メタノール溶液を１ｍｌ加えて８０℃で３時間加熱してメタノリシスを行った。放冷後、蒸留水６ｍｌとヘキサン１ｍｌを添加して激しく振とうしてヘキサン層に脂肪酸メチルエステルを抽出し、ガスクロマトグラフィー用試料とした。ガスクロマトグラフィーは（ガスクロマトグラフ シマヅ GC-2000、カラム HR-Thermon 3000B, 30m X 0,25mm ID、カラム温度 150→220℃ 2℃/min、インジェクション温度 250℃、検出器 FID、検出器温度 250℃、キャリアーガス ヘリウム）の条件で分析した。結果は（C16:0 10.3%、C16:1 1.1%、C16:2 3.1%、C16:3 4.7%、C18:0 1.6%、C18:1 4.1%、C18:2 14.2%、C18:3 1.1%、C20:5 0.9%、C22:6 55.0%、その他 3.9%）となり、総脂肪酸の５５％がＤＨＡであった。また、リン脂質組成を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定したところ、リン脂質中の５７％がホスファチジルコリン（ＰＣ）、３２％がホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）であった。 A phospholipid mixture was fractionated from 230 mg of the total lipid obtained by silica gel column chromatography as follows. First, 10 g of silica gel suspended in chloroform was packed in an open column having an inner diameter of 20 mm, and the total lipid dissolved in 2 ml of chloroform was adsorbed onto the silica gel. Next, 300 ml of chloroform, 200 ml of acetone, and 300 ml of methanol were passed through the column in this order, and the methanol elution fraction was used as a phospholipid mixture. This gave 85 mg of a phospholipid mixture. The fatty acid composition of this phospholipid mixture was measured by gas chromatography. First, 20 mg of a phospholipid mixture was placed in a test tube with a screw cap, 1 ml of a 10% hydrogen chloride-methanol solution was added, and the mixture was heated at 80 ° C. for 3 hours for methanolysis. After allowing to cool, 6 ml of distilled water and 1 ml of hexane were added and shaken vigorously to extract the fatty acid methyl ester in the hexane layer, which was used as a sample for gas chromatography. Gas Chromatography (Gas Chromatograph Shima-GC-2000, Column HR-Thermon 3000B, 30m X 0,25mm ID, Column temperature 150 → 220 ℃ 2 ℃ / min, Injection temperature 250 ℃, Detector FID, Detector temperature 250 ℃ And carrier gas helium). The results are (C16: 0 10.3%, C16: 1 1.1%, C16: 2 3.1%, C16: 3 4.7%, C18: 0 1.6%, C18: 1 4.1%, C18: 2 14.2%, C18: 3 1.1% C20: 5 0.9%, C22: 6 55.0%, others 3.9%), and 55% of the total fatty acids were DHA. Further, when the phospholipid composition was measured by high performance liquid chromatography (HPLC), 57% of the phospholipid was phosphatidylcholine (PC) and 32% was phosphatidylethanolamine (PE).
[比較例１］ 実施例１と同様に、５００ｍｌ容振とうフラスコ内で培養定常期に達したクロレラの培養液１００ｍｌを、さらに２４時間振とう培養し、遠心分離（３０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）によりクロレラ細胞を回収し、凍結乾燥後、実施例１と同様に総脂質を抽出し、得られた総脂質１４５ｍｇを分画・分析したところ、結果は（C16:0 25.8%、C16:1 3.7%、C16:2 6.8%、C16:3 8.2%、C18:0 4.6%、C18:1 7.6%、C18:2 29.7%、C18:3 6.3%、C22:6 0.0%その他 7.3%）となり、リン脂質混合物の総脂肪酸中にＤＨＡは検出されなかった。しかし、リン脂質組成は、５９％がＰＣ、３０％がＰＥであり、実施例１と同様、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンが主成分であった。 [Comparative Example 1] As in Example 1, 100 ml of the chlorella culture solution that reached the stationary culture phase in a 500 ml shake flask was further cultured with shaking for 24 hours, and chlorella cells were centrifuged (3000 rpm x 10 min). After lyophilization, total lipids were extracted in the same manner as in Example 1, and 145 mg of the obtained total lipids were fractionated and analyzed. The results were (C16: 0 25.8%, C16: 1 3.7%, C16 : 2 6.8%, C16: 3 8.2%, C18: 0 4.6%, C18: 1 7.6%, C18: 2 29.7%, C18: 3 6.3%, C22: 6 0.0%, etc. DHA was not detected in total fatty acids. However, the phospholipid composition was 59% PC and 30% PE, and phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine were the main components as in Example 1.
＝＝＝ＤＨＡ含有ＰＳの製造＝＝＝
［実施例２］ 上記実施例１あるいは比較例１で得られたリン脂質混合物それぞれ１００ｍｇを別のスクリューキャップつき試験管に入れ、各試験管に酢酸エチル２ｍｌ、Ｌ−セリン１２０ｍｇを含有する水溶液５００μｌ、ホスホリパーゼＤ（名糖産業製）２０ｕｎｉｔを含有する水溶液５００μｌを加えた後、ヘッドスペースを窒素置換して５０℃で１２時間激しく振とうすることにより塩基交換反応を行った。反応終了後、各試験管を氷冷し、クロロホルムを２ｍｌ添加してリン脂質混合物を溶解した。クロロホルム層をＨＰＬＣにより分析してリン脂質組成を確認したところ、実施例１で得られたリン脂質は（PS 43%、PC 21%、PE 12%、その他 24%）、比較例１で得られたリン脂質は（PS 45%、PC 19%、PE 13%、その他 22%）を含有していた。それぞれのリン脂質混合物より、以下のように薄層クロマトグラフィーを用いてＰＳ画分を単離し、それぞれのＰＳの脂肪酸組成を測定した。すなわち、シリカゲルHPTLCプレート（メルク製）にリン脂質混合物をスポットし、クロロホルム／1-プロパノール／酢酸エチル／メタノール／0.25%塩化カリウム水溶液(23:25:25:15:9)を展開溶媒として展開し、PS標品(Dittmer試薬で発色)と同様のRf値のシリカゲル層を書き取った。シリカゲルからクロロホルム：メタノール(2:1)によりPSを抽出した。結果は（C16:0 9.7%、C16:1 2.1%、C16:2 2.7%、C16:3 5.1%、C18:0 1.9%、C18:1 5.1%、C18:2 16.0%、C18:3 1.0%、C20:5 0.3%、C22:6 53.0%、その他 3.1%）となり、実施例１により得られたリン脂質混合物を原料としたＰＳには、ＤＨＡが総脂肪酸の53％含まれていた。一方、比較例１により得られたリン脂質混合物を原料としたＰＳの脂肪酸組成は（C16:0 23.0%、C16:1 2.9%、C16:2 8.9%、C16:3 9.2%、C18:0 4.9%、C18:1 8.6%、C18:2 29.0%、C18:3 7.0%、C22:6 0.0%その他 6.5%）であり、ＤＨＡが全く検出されなかった。
=== Production of DHA-containing PS ===
[Example 2] 100 mg of each phospholipid mixture obtained in Example 1 or Comparative Example 1 was put in a separate test tube with a screw cap, and 500 μl of an aqueous solution containing 2 ml of ethyl acetate and 120 mg of L-serine in each test tube. After adding 500 μl of an aqueous solution containing 20 units of phospholipase D (manufactured by Meito Sangyo), the base space was replaced with nitrogen, and the base exchange reaction was performed by shaking vigorously at 50 ° C. for 12 hours. After completion of the reaction, each test tube was ice-cooled, and 2 ml of chloroform was added to dissolve the phospholipid mixture. When the chloroform layer was analyzed by HPLC to confirm the phospholipid composition, the phospholipid obtained in Example 1 was obtained in Comparative Example 1 (PS 43%, PC 21%, PE 12%, and other 24%). The phospholipids contained (PS 45%, PC 19%, PE 13%, others 22%). From each phospholipid mixture, the PS fraction was isolated using thin layer chromatography as follows, and the fatty acid composition of each PS was measured. That is, phospholipid mixture was spotted on silica gel HPTLC plate (Merck) and developed with chloroform / 1-propanol / ethyl acetate / methanol / 0.25% potassium chloride aqueous solution (23: 25: 25: 15: 9) as developing solvent. A silica gel layer having the same Rf value as that of the PS sample (colored with Dittmer reagent) was written. PS was extracted from silica gel with chloroform: methanol (2: 1). The results are (C16: 0 9.7%, C16: 1 2.1%, C16: 2 2.7%, C16: 3 5.1%, C18: 0 1.9%, C18: 1 5.1%, C18: 2 16.0%, C18: 3 1.0% C20: 5 0.3%, C22: 6 53.0%, and others 3.1%), and PS using the phospholipid mixture obtained in Example 1 contained 53% of DHA in total fatty acids. On the other hand, the fatty acid composition of PS made from the phospholipid mixture obtained in Comparative Example 1 was (C16: 0 23.0%, C16: 1 2.9%, C16: 2 8.9%, C16: 3 9.2%, C18: 0 4.9 %, C18: 1 8.6%, C18: 2 29.0%, C18: 3 7.0%, C22: 6 0.0% and other 6.5%), and no DHA was detected.
＝＝＝ＥＰＡ含有リン脂質の製造＝＝＝
［実施例３］ ５００ｍｌ容振とうフラスコで、グルコース−ペプトン培地（1L中にグルコース20g、ペプトン5g、硫酸アンモニウム0.25g、リン酸１カリウム0.25g、硫酸マグネシウム７水和物0.6g、炭酸カルシウム0.12g、Na2EDTA 50mg、モール塩50mg、硫酸マンガン18mg、硫酸亜鉛25mg、塩酸チアミン2.5mg、シアノコバラミン 0.5mgを含む）を用いて、ユーグレナ（Euglena gracilis Z）（国立環境研究所より入手）を28℃、暗所にて振とう培養し、増殖が定常期に達した48時間後に、培養液１００ｍｌに対して０．５重量％のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）（遊離脂肪酸、備前化成（株）より入手）（純度９９．０％）を無菌的に添加し、さらに振とう培養を２４時間継続した。以下、実施例１と同様に、総脂質を抽出し、得られた総脂質２４０ｍｇから、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分画したリン脂質混合物９５ｍｇを得た。このリン脂質混合物の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーで測定したところ、結果は（C16:0 4.1%、C16:1 0.1%、C18:0 2.2%、C18:1 8.1%、C18:2 5.9%、C18:3 4.0%、C20:4 5.8%、C20:5 59.0%、C22:6 6.3%、その他 4.5%）となり、総脂肪酸の５９％がＥＰＡであった。また、リン脂質組成をＨＰＬＣで測定したところ、結果は（PC 49%、PE 31%、その他 20%）となり、ＰＣ及びＰＥが主成分であった。
=== Production of EPA-containing phospholipids ===
[Example 3] In a 500 ml shake flask, glucose-peptone medium (20 g glucose, 1 g glucose, 0.25 g ammonium sulfate, 0.25 g ammonium sulfate, 0.25 g potassium phosphate, 0.6 g magnesium sulfate heptahydrate, 0.12 g calcium carbonate) , Euglena gracilis Z (obtained from the National Institute for Environmental Studies) at 28 ° C, dark using 48 hours after growth reached a stationary phase, 0.5% by weight of eicosapentaenoic acid (EPA) (free fatty acid, obtained from Bizen Kasei Co., Ltd.) (Purity 99.0%) was aseptically added, and shaking culture was continued for 24 hours. Thereafter, in the same manner as in Example 1, total lipid was extracted, and 95 mg of a phospholipid mixture fractionated by silica gel column chromatography was obtained from 240 mg of the obtained total lipid. When the fatty acid composition of this phospholipid mixture was measured by gas chromatography, the results were (C16: 0 4.1%, C16: 1 0.1%, C18: 0 2.2%, C18: 1 8.1%, C18: 2 5.9%, C18 : 3 4.0%, C20: 4 5.8%, C20: 5 59.0%, C22: 6 6.3%, others 4.5%), and 59% of the total fatty acids were EPA. When the phospholipid composition was measured by HPLC, the result was (PC 49%, PE 31%, other 20%), and PC and PE were the main components.
［比較例２］ 実施例３と同様に、５００ｍｌ容振とうフラスコ内で培養定常期に達したユーグレナの培養液１００ｍｌを、さらに２４時間振とう培養し、遠心分離（３０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）によりユーグレナ細胞を回収し、実施例１と同様に、凍結乾燥後、総脂質を抽出し、得られた総脂質１２２ｍｇを分画・分析したところ、結果は（C16:0 16.7%、C16:1 3.6%、C18:0 7.5%、C18:1 14.1%、C18:2 9.9%、C18:3 8.9%、C20:4 22.3%、C20:5 3.2%、C22:6 1.0%、その他 12.8%）となり、リン脂質混合物の総脂肪酸中にＥＰＡは3.2%、ＤＨＡは１％のみしか検出されなかった。しかし、リン脂質組成は（PC 47%、PE 36%、その他 17%）であり、実施例１と同様、ＰＣ及びＰＥが主成分であった。 [Comparative Example 2] As in Example 3, 100 ml of Euglena culture solution that reached the stationary culture period in a 500 ml shake flask was further cultured with shaking for 24 hours, and Euglena cells were centrifuged (3000 rpm x 10 min). In the same manner as in Example 1, after lyophilization, the total lipid was extracted, and 122 mg of the obtained total lipid was fractionated and analyzed. The results were (C16: 0 16.7%, C16: 1 3.6%, C18: 0 7.5%, C18: 1 14.1%, C18: 2 9.9%, C18: 3 8.9%, C20: 4 22.3%, C20: 5 3.2%, C22: 6 1.0%, others 12.8%), phospholipids Only 3.2% EPA and 1% DHA were detected in the total fatty acids of the mixture. However, the phospholipid composition was (PC 47%, PE 36%, others 17%), and as in Example 1, PC and PE were the main components.
＝＝＝ＥＰＡ含有ＰＳの製造＝＝＝
［実施例４］ 実施例２と同様に、実施例３あるいは比較例２で得られたリン脂質混合物それぞれ１００ｍｇを別のスクリューキャップつき試験管に入れ、各試験管に酢酸エチル２ｍｌ、Ｌ−セリン１２０ｍｇを含有する水溶液５００μｌ、ホスホリパーゼＤ２０ｕｎｉｔを含有する水溶液５００μｌを加えた後、ヘッドスペースを窒素置換して５０℃で１２時間激しく振とうすることにより塩基交換反応を行った。反応終了後、各試験管を氷冷し、クロロホルムを２ｍｌ添加してリン脂質混合物を溶解した。クロロホルム層をＨＰＬＣにより分析してリン脂質組成を確認したところ、実施例3で得られたリン脂質は（PS 42%、PC 22%、PE 16%、その他 20%）、比較例2で得られたリン脂質は（PS 46%、PC 17%、PE 15%、その他 22%）を含有していた。それぞれのリン脂質混合物より、薄層クロマトグラフィーによりＰＳ画分を単離し、それぞれのＰＳの脂肪酸組成を測定したところ、結果は（C16:0 4.6%、C16:1 0.9%、C18:0 3.1%、C18:1 9.0%、C18:2 5.0%、C18:3 4.7%、C20:4 5.0%、C20:5 56.0%、C22:6 4.1%、その他 7.6%）となり、実施例３により得られたリン脂質混合物を原料としたＰＳにはＥＰＡが、総脂肪酸の５６％含まれていた。一方、比較例２により得られたリン脂質混合物を原料としたＰＳの脂肪酸組成は（C16:0 17.4%、C16:1 4.1%、C18:0 6.2%、C18:1 14.7%、C18:2 8.8%、C18:3 7.9%、C20:4 24.6%、C20:5 2.0%、C22:6 1.7%、その他 12.6%）であり、ＥＰＡが２％しか検出されなかった。
=== Production of EPA-containing PS ===
[Example 4] In the same manner as in Example 2, 100 mg of each phospholipid mixture obtained in Example 3 or Comparative Example 2 was placed in a separate test tube with a screw cap, and 2 ml of ethyl acetate and L-serine were added to each test tube. After adding 500 μl of an aqueous solution containing 120 mg and 500 μl of an aqueous solution containing phospholipase D20unit, the headspace was replaced with nitrogen, and the base exchange reaction was performed by shaking vigorously at 50 ° C. for 12 hours. After completion of the reaction, each test tube was ice-cooled, and 2 ml of chloroform was added to dissolve the phospholipid mixture. When the chloroform layer was analyzed by HPLC to confirm the phospholipid composition, the phospholipid obtained in Example 3 (PS 42%, PC 22%, PE 16%, other 20%) was obtained in Comparative Example 2. Phospholipids contained (PS 46%, PC 17%, PE 15%, others 22%). PS fractions were isolated from each phospholipid mixture by thin layer chromatography, and the fatty acid composition of each PS was measured. The results were (C16: 0 4.6%, C16: 1 0.9%, C18: 0 3.1% C18: 1 9.0%, C18: 2 5.0%, C18: 3 4.7%, C20: 4 5.0%, C20: 5 56.0%, C22: 6 4.1%, others 7.6%), and obtained in Example 3 PS made from a phospholipid mixture contained 56% of EPA in total fatty acids. On the other hand, the fatty acid composition of PS made from the phospholipid mixture obtained in Comparative Example 2 was (C16: 0 17.4%, C16: 1 4.1%, C18: 0 6.2%, C18: 1 14.7%, C18: 2 8.8 %, C18: 3 7.9%, C20: 4 24.6%, C20: 5 2.0%, C22: 6 1.7%, other 12.6%), and only 2% of EPA was detected.
＝＝＝結論＝＝＝
上記の実施例および比較例の結果から、微生物培養を用いたリン脂質の製造方法において、培養液に不飽和脂肪酸を添加することにより、未添加の場合はほとんどみられなかった所望の不飽和脂肪酸を含有したリン脂質が合成できることが分かった。従って、本発明のリン脂質の製造方法によって、リン脂質を構成する脂肪酸の組成をコントロールすることができるようになる。さらに、エタノール化合物を添加して塩基交換反応を行わせることにより、所望の分子種のリン脂質に転換することも可能となる。
=== Conclusion ===
From the results of the above Examples and Comparative Examples, in the method for producing phospholipids using microbial culture, by adding unsaturated fatty acids to the culture solution, desired unsaturated fatty acids that were hardly seen when not added It has been found that phospholipids containing can be synthesized. Therefore, the composition of fatty acids constituting the phospholipid can be controlled by the method for producing phospholipids of the present invention. Furthermore, it is also possible to convert to a phospholipid of a desired molecular species by adding an ethanol compound to cause a base exchange reaction.
Claims (6)
前記不飽和脂肪酸または前記不飽和脂肪酸の化合物を添加した培養液中で微生物を培養する培養工程と、
前記培養した微生物から前記リン脂質を抽出する抽出工程と、
を含むことを特徴とする製造方法。 A method for producing a phospholipid containing an unsaturated fatty acid as a constituent fatty acid,
A culture step of culturing the microorganism in a culture solution to which the unsaturated fatty acid or the compound of the unsaturated fatty acid is added;
An extraction step of extracting the phospholipid from the cultured microorganism;
The manufacturing method characterized by including.
The production method according to claim 1, wherein the microorganism is at least one selected from the group consisting of bacteria, yeast, filamentous fungi, microalgae, and Labyrinthula.
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