JP2006284335A - Chlorophyll fluorescence measuring method and chlorophyll fluorescence measuring device - Google Patents

Chlorophyll fluorescence measuring method and chlorophyll fluorescence measuring device Download PDF

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Toshiro Saino
敏郎 才野
Takashi Kimoto
岳志 紀本
Hideshi Kimoto
英志 紀本
Takahiko Suzue
崇彦 鈴江
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Nagoya University NUC
Kimoto Electric Co Ltd
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Nagoya University NUC
Kimoto Electric Co Ltd
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a chlorophyll fluorescence measuring method capable of measuring in real time primary productivity of phytoplankton in a measuring field. <P>SOLUTION: In this chlorophyll fluorescence measuring method for irradiating phytoplankton in the water with light and measuring chlorophyll fluorescence emitted from the phytoplankton, the chlorophyll fluorescence emitted from the phytoplankton is received and detected, and received light detection data are read, and a parameter of a photosynthesis electron transfer system of the phytoplankton is calculated based on the received light detection data (s1-s5), and the primary productivity of the phytoplankton is calculated based on the parameter of the photosynthesis electron transfer system (s6). Each procedure is executed continuously in time series. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、たとえば海水中に存在する植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を測定するクロロフィル蛍光測定方法およびクロロフィル蛍光測定装置に関する。   The present invention relates to a chlorophyll fluorescence measuring method and a chlorophyll fluorescence measuring apparatus for measuring chlorophyll fluorescence emitted from, for example, phytoplankton present in seawater.

二酸化炭素（ＣＯ２）は、大気中の含有量が増加すると、温室効果によって地球を温暖化する気体成分として知られている。ＣＯ２は、工業生産活動に伴う燃料の燃焼および動物の生命維持活動に伴う排出によって大量に生成される。このようにして生産されるＣＯ２は、陸上においては樹木等の植物による光合成、水中においては主に植物プランクトンによる光合成によって消費される。光合成作用は、ＣＯ２の炭素（Ｃ）を固定して有機物を生産するとともに、副産物として酸素（Ｏ）を生産するので、大気中のＣＯ２増加に対して抑制する効果がある。 Carbon dioxide (CO 2 ) is known as a gas component that warms the earth due to the greenhouse effect when the content in the atmosphere increases. CO 2 is produced in large quantities by the combustion of fuels associated with industrial production activities and emissions associated with animal life support activities. The CO 2 produced in this way is consumed on the land by photosynthesis by plants such as trees, and in water by photosynthesis mainly by phytoplankton. The photosynthetic action produces an organic substance by fixing carbon (C) of CO 2 and produces oxygen (O) as a by-product, and therefore has an effect of suppressing the increase in CO 2 in the atmosphere.

したがって、陸上植物および水中の植物プランクトンの光合成は、地球規模におけるＣＯ２の循環系において、極めて重要な役割を果たしている。光合成作用を発現する陸上植物および水中の植物プランクトンの中でも、特に地球上の表面積の約７０％を占める海洋中に存在する植物プランクトンが、大きな抑制効果を有することは容易に推測されることであり、その有機物と酸素とを生産する能力である基礎生産力（光合成速度とも呼ぶ）を正確に把握することは、地球規模の環境対策上において重要な課題である。 Therefore, the photosynthesis of terrestrial plants and underwater phytoplankton plays an extremely important role in the global CO 2 circulation. Among terrestrial plants and underwater phytoplankton that express photosynthetic action, phytoplankton existing in the ocean, which occupies about 70% of the surface area on the earth, has a great inhibitory effect. Accurately grasping the basic productivity (also called photosynthesis rate), which is the ability to produce organic matter and oxygen, is an important issue for global environmental measures.

水中の植物プランクトンの基礎生産力の測定は、従来炭素固定速度によって見積もられてきた。たとえば放射性炭素１４Ｃを用いて炭素固定速度を測定する方法が知られているけれども、日本では放射性元素を屋外で用いることに厳しい制限が有るので、汎用することはできないという問題がある。 Measurement of basic productivity of phytoplankton in water has been estimated by the carbon fixation rate. For example, although a method for measuring the carbon fixation rate using radioactive carbon 14 C is known, there is a problem that in Japan there is a strict limitation on the use of radioactive elements outdoors, so there is a problem that they cannot be used widely.

このような問題に対して放射性炭素１４Ｃの代わりに、炭素安定同位体１３Ｃを用いる方法がある。しかしながら、炭素安定同位体１３Ｃを用いる方法では、植物プランクトンを含む水を培養容器に入れて、一定時間培養しなければならないので、測定に長時間を要しかつ実験操作が煩雑であり、植物プランクトンの基礎生産力が環境変化に応じて時空間的に変動するにも関らず、迅速に測定することができないという問題がある。 For such a problem, there is a method of using a stable carbon isotope 13 C instead of the radioactive carbon 14 C. However, in the method using the carbon stable isotope 13 C, water containing phytoplankton must be placed in a culture vessel and cultured for a certain period of time, so that it takes a long time for measurement and the experimental operation is complicated. Although plankton's basic productivity varies in spatio-temporal in response to environmental changes, there is a problem that it cannot be measured quickly.

このようなことから、植物プランクトンの基礎生産力の測定に関し、植物プランクトン細胞内のクロロフィルの生体内蛍光（以後、クロロフィル蛍光と略称する）を利用することが提案されている。クロロフィル蛍光を利用する測定法としては、太陽光によって励起された植物プランクトン細胞内のクロロフィル蛍光を利用するパッシブ蛍光法と、人工光源によって励起された植物プランクトン細胞内のクロロフィル蛍光の量子収率を測定するアクティブ蛍光法とがある（非特許文献１参照）。   For this reason, it has been proposed to use in vivo fluorescence of chlorophyll in phytoplankton cells (hereinafter abbreviated as chlorophyll fluorescence) for measurement of basic productivity of phytoplankton. Measurement methods using chlorophyll fluorescence include passive fluorescence using chlorophyll fluorescence in phytoplankton cells excited by sunlight and quantum yield of chlorophyll fluorescence in phytoplankton cells excited by artificial light sources. Active fluorescence method (see Non-Patent Document 1).

パッシブ蛍光法は、太陽光によって励起された植物プランクトンの生体内のクロロフィルが発する波長６８５ｎｍ付近の自然蛍光をたとえば水中分光放射計で測定し、該自然蛍光の放射輝度を用い、各種の演算式に従って基礎生産力を算出するものである。パッシブ蛍光法では、基礎生産力の算出に必要なパラメータ（たとえば蛍光の量子収率など）であって、水中分光放射計で測定できないパラメータの決定いかんによっては、データ精度が変動するので、適用に検討の余地があるとされる。   In the passive fluorescence method, natural fluorescence in the vicinity of a wavelength of 685 nm emitted from chlorophyll in living organisms of phytoplankton excited by sunlight is measured with, for example, an underwater spectroradiometer, and the radiance of the natural fluorescence is used according to various arithmetic expressions. The basic productivity is calculated. In the passive fluorescence method, the accuracy of data varies depending on the determination of parameters that are necessary for calculation of basic productivity (for example, the quantum yield of fluorescence) and cannot be measured with an underwater spectroradiometer. There is room for consideration.

アクティブ蛍光法は、暗所に適応させた植物プランクトンに対して光合成に有効な光を照射し、光合成電子伝達系（厳密には光合成電子伝達系ＩＩであり、以後ＰＳＩＩと略記することがある）の電子受容体を酸化した状態から還元した状態へと変化させて、生体内クロロフィル蛍光の誘導曲線（Kautsky曲線）を描かせるものであり、ＰＡＭ（Pulse
Amplitude Modulation）法、Ｐ＆Ｐ（Pump & Probe）法、ＦＲＲ（Fast Repetition
Rate）法の３つがある。 In the active fluorescence method, phytoplankton adapted to a dark place is irradiated with light effective for photosynthesis, and is a photosynthesis electron transfer system (strictly, photosynthesis electron transfer system II, hereinafter abbreviated as PSII). The electron acceptor is changed from an oxidized state to a reduced state, and an induction curve (Kautsky curve) of in vivo chlorophyll fluorescence is drawn. PAM (Pulse
Amplitude Modulation method, P & P (Pump & Probe) method, FRR (Fast Repetition)
There are three methods: Rate).

アクティブ蛍光法のうちＦＲＲ法は、コルバーらによって開発されたものであり、測定装置を水中たとえば海水中に沈め、測定現場における植物プランクトンの光合成電子伝達系ＩＩ（ＰＳＩＩ）のパラメータを求めることができる（非特許文献２、特許文献１参照）。このＦＲＲ法に基づく測定装置は、ＦＲＲ式蛍光光度計（ＦＲＲ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ；英国チェルシー・インスツルメント（Chelsea Instruments）社製）として製品化されている。   Among the active fluorescence methods, the FRR method was developed by Kolver et al., And the measurement device can be submerged in water, for example, in seawater, and the parameters of the phytoplankton photosynthetic electron transfer system II (PSII) at the measurement site can be obtained. (See Non-Patent Document 2 and Patent Document 1). This measuring apparatus based on the FRR method is commercialized as an FRR fluorometer (FRR Fluorometer; manufactured by Chelsea Instruments, UK).

図６は、ＦＲＲ式蛍光光度計１の典型的な構成を簡略化して示す図である。先行技術のＦＲＲ式蛍光光度計１（以後、ＦＲＲＦ１と略記する）は、大略、装置本体２と、太陽光を浴びた状態のクロロフィル蛍光の量子収率を測るための明室３と、太陽光の影響を受けない状態のクロロフィル蛍光の量子収率を測るための暗室４と、電源であるバッテリ５と、日射センサ６とを含んで構成される。   FIG. 6 is a diagram showing a typical configuration of the FRR fluorometer 1 in a simplified manner. A prior art FRR type fluorometer 1 (hereinafter abbreviated as FRRF1) is roughly composed of a device body 2, a bright room 3 for measuring the quantum yield of chlorophyll fluorescence in the sunlight, and sunlight. The dark room 4 for measuring the quantum yield of chlorophyll fluorescence in a state not affected by the above, a battery 5 as a power source, and a solar radiation sensor 6 are configured.

装置本体２は、たとえばアルミニウムなどからなる耐圧性のケーシング１１の中に測定に必要とされる機器を収容する。ケーシング１１は、略円筒形状を有し、軸線方向の一方の端部１１ａにはフランジ１２が設けられ、他端部１１ｂには底板１３が設けられて、密閉空間１４が形成される。フランジ１２には、ケーシング１１の軸線を含む仮想平面に対して面対称の位置に、フランジ１２を貫通する第１開口部と第２開口部とが形成され、第１および第２開口部には、透光性のたとえばガラスから成る第１耐水窓１７および第２耐水窓１８がそれぞれ装着される。   The apparatus main body 2 accommodates equipment required for measurement in a pressure-resistant casing 11 made of, for example, aluminum. The casing 11 has a substantially cylindrical shape, and a flange 12 is provided at one end 11a in the axial direction, and a bottom plate 13 is provided at the other end 11b to form a sealed space 14. The flange 12 is formed with a first opening and a second opening that penetrate the flange 12 at positions that are plane-symmetric with respect to a virtual plane including the axis of the casing 11, and the first and second openings A first water-resistant window 17 and a second water-resistant window 18 made of translucent glass, for example, are mounted.

フランジ１２には、前記第１および第２耐水窓１７，１８の形成される部分以外の部分に、軸線方向に突出すなわちフランジ１２に対して垂直に立ち上がるようにして蛍光受光部１５が設けられる。蛍光受光部１５は、内部空間１６を有する箱状に形成され、内部空間１６がケーシング１１の密閉空間１４に連通する。蛍光受光部１５のフランジ１２からの立ち上がり部分には、該部分を貫通し対向して第３開口部と第４開口部とが形成され、第３および第４開口部には、透光性のたとえばガラスから成る第３耐水窓１９および第４耐水窓２０がそれぞれ装着される。   The flange 12 is provided with a fluorescent light receiving portion 15 at a portion other than the portion where the first and second water-resistant windows 17 and 18 are formed so as to protrude in the axial direction, that is, stand up perpendicular to the flange 12. The fluorescence light receiving unit 15 is formed in a box shape having an internal space 16, and the internal space 16 communicates with the sealed space 14 of the casing 11. A third opening portion and a fourth opening portion are formed at the rising portion from the flange 12 of the fluorescence light receiving portion 15 so as to penetrate and face the portion, and the third and fourth openings have a light-transmitting property. For example, a third water-resistant window 19 and a fourth water-resistant window 20 made of glass are respectively mounted.

フランジ１２の第２耐水窓１８が装着される部分と、蛍光受光部１５の第４耐水窓２０が装着される部分とを覆うようにして暗室カバー部材２１が装着される。暗室カバー部材２１が装着されることによって、暗室カバー部材２１、フランジ１２の第２耐水窓１８が装着される部分および蛍光受光部１５の第４耐水窓２０が装着される部分によって、外光が遮蔽される空間である暗室４が構成される。暗室カバー部材２１には、測定試料であるたとえば海水の流入口２２と、海水の流出口２３とが形成され、海水を暗室４内に収容し、また暗室４内を流過できるように構成される。   The dark room cover member 21 is mounted so as to cover the portion of the flange 12 where the second water-resistant window 18 is mounted and the portion of the fluorescent light receiving unit 15 where the fourth water-resistant window 20 is mounted. When the dark room cover member 21 is mounted, the dark room cover member 21, the portion where the second water-resistant window 18 of the flange 12 is mounted, and the portion where the fourth water-resistant window 20 of the fluorescent light receiving unit 15 is mounted cause external light. A dark room 4 which is a shielded space is configured. The dark room cover member 21 is formed with, for example, a seawater inlet 22 and a seawater outlet 23 which are measurement samples, so that the seawater can be accommodated in the dark room 4 and can flow through the dark room 4. The

一方、フランジ１２の第１耐水窓１７が装着される部分と、蛍光受光部１５の第３耐水窓１９が装着される部分とは、外方に対して開放されたままの状態に保たれ、外光であるたとえば太陽光が自由に到達し得るので、フランジ１２の第１耐水窓１７が装着される部分と蛍光受光部１５の第３耐水窓１９が装着される部分とが臨む部分に明室３が構成される。   On the other hand, the portion where the first water-resistant window 17 of the flange 12 is mounted and the portion where the third water-resistant window 19 of the fluorescent light receiving unit 15 is mounted are kept open to the outside. Since, for example, sunlight, which is external light, can freely reach, the portion where the first water-resistant window 17 of the flange 12 is attached and the portion where the third water-resistant window 19 of the fluorescent light receiving portion 15 is attached are clearly exposed. Chamber 3 is configured.

ケーシング１１の密閉空間１４内において、第１耐水窓１７を臨み、第１耐水窓１７を通して明室３の海水中の植物プランクトンに対して光を照射できるように第１光源２４が設けられ、第２耐水窓１８を臨み、第２耐水窓１８を通して暗室４内の海水中の植物プランクトンに対して光を照射できるように第２光源２５が設けられる。第１および第２光源２４，２５は、いずれも波長：４６０〜５００ｎｍの青色光を出射することのできるたとえば発光ダイオードである。第１および第２光源２４，２５は、ｏｎ／ｏｆｆ動作によって閃光（パルス光）を発するように動作し、パルス光の発光動作における発光間隔すなわち発光周波数は、後述する中央処理装置（ＣＰＵ）３０によって制御される。   A first light source 24 is provided in the sealed space 14 of the casing 11 so as to face the first water-resistant window 17 and irradiate the phytoplankton in the seawater in the bright room 3 through the first water-resistant window 17. The 2nd light source 25 is provided so that light may be irradiated with respect to the phytoplankton in the seawater in the dark room 4 through the 2nd water-resistant window 18 through the 2nd water-resistant window 18. FIG. Each of the first and second light sources 24 and 25 is, for example, a light emitting diode that can emit blue light having a wavelength of 460 to 500 nm. The first and second light sources 24 and 25 operate to emit flash light (pulse light) by an on / off operation, and the light emission interval, that is, the light emission frequency in the light emission operation of the pulse light is a central processing unit (CPU) 30 described later. Controlled by.

明室３の海水中に存在し太陽光を浴びた状態の植物プランクトンが、第１光源２４から出射される光で照射されることによって発するクロロフィル蛍光は、第３耐水窓１９を通して蛍光受光部１５の内部空間１６へ入射し、内部空間１６に設けられる第１反射ミラー２６によって、ケーシング１１の密閉空間１４へ向けて反射される。暗室４の海水中に存在し太陽光の影響を受けない状態の植物プランクトンが、第２光源２５から出射される光で照射されることによって発するクロロフィル蛍光は、第４耐水窓２０を通して蛍光受光部１５の内部空間１６へ入射し、内部空間１６に設けられる第２反射ミラー２７によって、ケーシング１１の密閉空間１４へ向けて反射される。第１および第２反射ミラー２６，２７でそれぞれ反射された光は、蛍光バンドパスフィルタ２８によって、クロロフィル蛍光に該当する光成分である波長６８５ｎｍ付近の赤色光のみが透過されて光電子増倍管２９によって受光検知される。光電子増倍管２９によって受光検知された検知結果は、処理回路であるＣＰＵ３０に入力される。したがって、第１および第２反射ミラー２６，２７、蛍光バンドパスフィルタ２８および光電子増倍管２９が受光検知手段を構成する。   Chlorophyll fluorescence emitted when the phytoplankton present in the seawater of the light room 3 and exposed to sunlight is irradiated with light emitted from the first light source 24 passes through the third water-resistant window 19 to receive the fluorescence light receiving unit 15. The first reflection mirror 26 provided in the internal space 16 is reflected toward the sealed space 14 of the casing 11. Chlorophyll fluorescence emitted when the phytoplankton that is present in the seawater of the dark room 4 and is not affected by sunlight is irradiated with light emitted from the second light source 25 is transmitted through the fourth water-resistant window 20 to the fluorescence light receiving unit. 15 is incident on the internal space 16, and is reflected toward the sealed space 14 of the casing 11 by the second reflecting mirror 27 provided in the internal space 16. The light reflected by the first and second reflecting mirrors 26 and 27 is transmitted by the fluorescent band-pass filter 28 only for red light having a wavelength of about 685 nm, which is a light component corresponding to chlorophyll fluorescence, so that the photomultiplier tube 29 is transmitted. The received light is detected by. The detection result detected by the photomultiplier tube 29 is input to the CPU 30 which is a processing circuit. Accordingly, the first and second reflecting mirrors 26 and 27, the fluorescent band pass filter 28, and the photomultiplier tube 29 constitute a light receiving detection means.

ケーシング１１の内部空間１４には、さらに前記ＣＰＵ３０と、メモリ３１と、電源基板３２とが収容される。メモリ３１は、たとえばリードオンリィメモリ（ＲＯＭ）およびランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）によって実現される記憶手段であり、装置全体を動作制御するためのプログラム、また詳細を後述する植物プランクトンの光合成電子伝達系ＩＩ（ＰＳＩＩ）のパラメータ算出プログラムなどが格納される。ＣＰＵ３０は、装置全体の測定動作を制御するとともに、上記パラメータの算出処理を実行する。   In the internal space 14 of the casing 11, the CPU 30, the memory 31, and the power supply substrate 32 are further accommodated. The memory 31 is a storage means realized by, for example, a read-only memory (ROM) and a random access memory (RAM). The memory 31 is a program for controlling the operation of the entire apparatus, and a phytoplankton photosynthetic electron transfer system II described later in detail. (PSII) parameter calculation program and the like are stored. The CPU 30 controls the measurement operation of the entire apparatus and executes the parameter calculation process.

電源基板３２は、ケーシング１１の底板１３に設けられる電源接続端子３３を介して装置本体２外に配されるバッテリ５に接続され、バッテリ５から供給される電力を、ＣＰＵ３０、第１および第２光源２４，２５、光電子増倍管２９などの密閉空間１４内の各部に配する。なお、電源基板３２が、上記各部に電力を配するための接続回路の図示は省略する。   The power supply board 32 is connected to the battery 5 disposed outside the apparatus main body 2 via the power supply connection terminal 33 provided on the bottom plate 13 of the casing 11, and the power supplied from the battery 5 is supplied to the CPU 30, the first and second power supplies. The light sources 24 and 25, the photomultiplier tube 29, and the like are arranged in each part in the sealed space. In addition, illustration of the connection circuit for the power supply board 32 to distribute electric power to each said part is abbreviate | omitted.

また装置本体２には、ケーシング１１の底板１３に、外方を臨むようにして圧力センサ３４が設けられる。ＦＲＲＦ１は、海水中に浸漬されて測定に使用されるので、圧力センサ３４によって、浸漬深さを測定する。圧力センサ３４による浸漬深さの測定結果は、ＣＰＵ３０に入力される。また装置本体２の外部に配置される日射センサ６は、ケーシング１１の底板１３に設けられる日射センサ接続端子３５を介して電源基板３２から配される電力によって動作し、明室３の海水に注がれる太陽光の光量を検知する。   Further, the apparatus main body 2 is provided with a pressure sensor 34 facing the outside on the bottom plate 13 of the casing 11. Since FRRF1 is immersed in seawater and used for measurement, the pressure sensor 34 measures the immersion depth. The measurement result of the immersion depth by the pressure sensor 34 is input to the CPU 30. The solar radiation sensor 6 disposed outside the apparatus main body 2 is operated by the electric power distributed from the power supply board 32 via the solar radiation sensor connection terminal 35 provided on the bottom plate 13 of the casing 11, and poured into the seawater in the bright room 3. It detects the amount of sunlight coming off.

このＦＲＲＦ１は、海水中に浸漬され、光源２４，２５を高速（高い周波数）で点滅させて、光源２４，２５から出射される光を海水中の植物プランクトンに対して照射し、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を光電子増倍管２９で受光検知し、該受光検知出力に基づいて植物プランクトンのＰＳＩＩのパラメータを測定することに用いられる測定装置であり、高速フラッシュ励起蛍光光度計と呼ばれることもある。   This FRRF1 is immersed in seawater, blinks the light sources 24 and 25 at high speed (high frequency), irradiates light emitted from the light sources 24 and 25 to phytoplankton in the seawater, and phytoplankton emits. It is a measuring device used to detect chlorophyll fluorescence with a photomultiplier tube 29 and measure PSII parameters of phytoplankton based on the received light detection output, and is sometimes called a high-speed flash excitation fluorometer.

以下、ＦＲＲＦ１による植物プランクトンのＰＳＩＩのパラメータ測定の概要について説明する。   Hereinafter, an outline of PSII parameter measurement of phytoplankton by FRRF1 will be described.

まず飽和過程では、光源２４，２５から青色の励起光を、μｓｅｃオーダーの閃光（パルス光）として出射し、明室３および暗室４にある海水中の植物プランクトンに照射して、植物プランクトンのＰＳＩＩの電子受容体（ＱＡ）を再酸化させることなく還元する。この電子受容体を再酸化させることなく還元するために、電子受容体が再酸化するために必要とする時間よりもパルス間隔が短くなるように設定される。植物プランクトンに対して励起光のパルスを照射したときのクロロフィル蛍光強度の瞬時の変化を光電子増倍管２９で受光検知する。パルスを照射した回数と、受光検知した蛍光強度との関係から、誘導曲線（Kautsky曲線）が得られる。 First, in the saturation process, blue excitation light is emitted from the light sources 24 and 25 as flash light (pulse light) on the order of μsec, irradiated to the phytoplankton in the seawater in the light room 3 and the dark room 4, and PSII of the phytoplankton. The electron acceptor (Q A ) is reduced without reoxidation. In order to reduce the electron acceptor without reoxidation, the pulse interval is set to be shorter than the time required for the electron acceptor to be reoxidized. The photomultiplier tube 29 detects and detects an instantaneous change in the chlorophyll fluorescence intensity when the phytoplankton is irradiated with a pulse of excitation light. An induction curve (Kautsky curve) is obtained from the relationship between the number of pulse irradiations and the detected fluorescence intensity.

図７は、誘導曲線４１を例示する図である。パルス光を照射した回数と、受光検知した蛍光強度との関係を示すデータを連ねるライン４１が誘導曲線である。飽和過程における誘導曲線４１によって、蛍光強度の最小値：Ｆ０、蛍光強度の最大値：Ｆｍとが求められ、前記Ｆ０，Ｆｍから、ＰＳＩＩのパラメータの一つである量子収率Ｆ＝Ｆｖ／Ｆｍ（＝（Ｆｍ−Ｆ０）／Ｆｍ）が求められる。 FIG. 7 is a diagram illustrating the induction curve 41. A line 41 connecting data indicating the relationship between the number of times pulsed light is applied and the fluorescence intensity detected and received is the induction curve. The minimum value of fluorescence intensity: F 0 and the maximum value of fluorescence intensity: Fm are obtained from the induction curve 41 in the saturation process, and the quantum yield F = Fv, which is one of the parameters of PSII, from the above F 0 , Fm. / Fm (= (Fm−F 0 ) / Fm) is obtained.

また誘導曲線４１を、ワンヒットポアソン関数で近似させることにより、式（１）により、ＰＳＩＩのもう一つのパラメータである有効光吸収断面積（σＰＳＩＩ）が求められる。
Ｆ＝Ｆ０＋Ｆｖ・［１−ｅｘｐ（−σＰＳＩＩ・Ｅ）］ …（１）
ここで、Ｆ：クロロフィル蛍光の量子収率、Ｅ：積算閃光エネルギであり、有効光吸収断面積（σＰＳＩＩ）は、誘導曲線４１の傾き（勾配）として与えられる。 Further, by approximating the induction curve 41 with a one-hit Poisson function, the effective light absorption cross section (σ PSII ), which is another parameter of PSII, is obtained from the equation (1).
F = F 0 + Fv · [1−exp (−σ PSII · E)] (1)
Here, F: quantum yield of chlorophyll fluorescence, E: accumulated flash energy, and effective light absorption cross section (σ PSII ) is given as the slope (gradient) of the induction curve 41.

さらに飽和過程の後に続いて行われる緩和過程では、５０〜１０，０００μｓｅｃ間隔で植物プランクトンに対して励起光のパルスが照射される。図８は、緩和過程における閃光回数とクロロフィル蛍光強度との関係を示す図である。図８に示す緩和過程における閃光回数とクロロフィル蛍光強度との関係を示すライン４２から、蛍光強度が減衰して一定値に収束するまで時間として、ＰＳＩＩのパラメータである電子受容体（ＱＡ）の再酸化時定数：τＱＡが求められる。これらのＰＳＩＩのパラメータである量子収率（Ｆ＝Ｆｖ／Ｆｍ）、有効光吸収断面積（σＰＳＩＩ）、再酸化時定数：τＱＡの算出は、ＣＰＵ３０において実行される。 Furthermore, in the relaxation process performed after the saturation process, the phytoplankton is irradiated with excitation light pulses at intervals of 50 to 10,000 μsec. FIG. 8 is a diagram showing the relationship between the number of flashes and the chlorophyll fluorescence intensity in the relaxation process. From the line 42 showing the relationship between the number of flashes and the chlorophyll fluorescence intensity in the relaxation process shown in FIG. 8, the time until the fluorescence intensity attenuates and converges to a constant value is measured as the time of the electron acceptor (Q A ) that is a parameter of PSII. Re-oxidation time constant: τ QA is determined. The calculation of the quantum yield (F = Fv / Fm), the effective light absorption cross section (σ PSII ), and the re-oxidation time constant: τ QA , which are these PSII parameters, is executed by the CPU 30.

ＦＲＲＦ１では、明室３および暗室４の両者において、パラメータである量子収率（Ｆ）、有効光吸収断面積（σＰＳＩＩ）、再酸化時定数：τＱＡを求め、これらのパラメータを用いることによって植物プランクトンの基礎生産力を求めることができる。 In FRRF1, the quantum yield (F), effective light absorption cross section (σ PSII ), and reoxidation time constant: τ QA that are parameters are obtained in both the bright room 3 and the dark room 4, and these parameters are used. The basic productivity of phytoplankton can be obtained.

しかしながら、先行技術のＦＲＲＦ１では、ＰＳＩＩのパラメータを求めるところまでは装置内で実行可能であるけれども、パラメータを用いた基礎生産力の算出は、別途演算装置を用いて行わなければならないので、測定現場の基礎生産力をリアルタイムで得ることができないという問題がある。   However, in the prior art FRRF1, the PSII parameters can be executed in the apparatus up to the point, but the calculation of the basic productivity using the parameters must be performed using a separate arithmetic unit. There is a problem that it is impossible to obtain the basic production capacity in real time.

また海中の環境によっては、植物プランクトンにとどまらず、光合成細菌が光合成作用を発現することが往々にしてあり、植物プランクトンの基礎生産力の測定だけでは、海洋の基礎生産力を正確に評価し得ないことがあるので、光合成細菌のバクテリオクロロフィル蛍光も測定することが求められている。しかしながら、先行技術のＦＲＲＦ１では、このような光合成細菌の基礎生産力を求める構成を有しておらず、光合成細菌の基礎生産力を求めることについては全く示唆もしていない。   In addition, depending on the marine environment, it is often the case that photosynthetic bacteria develop not only phytoplankton but also photosynthetic effects, and simply measuring the basic productivity of phytoplankton can accurately evaluate the basic productivity of the ocean. There is a need to measure bacteriochlorophyll fluorescence of photosynthetic bacteria as well. However, FRRF1 of the prior art does not have such a configuration for determining the basic productivity of photosynthetic bacteria, and does not suggest any attempt to determine the basic productivity of photosynthetic bacteria.

鈴木光次，吉川尚，古谷研，才野敏郎，クロロフィル蛍光による植物プランクトンの光合成活性の測定，「日本プランクトン学会報」，日本プランクトン学会，２００２年，４９（１），ｐ．２７−３６Koji Suzuki, Nao Yoshikawa, Ken Furuya, Toshiro Saino, Measurement of photosynthetic activity of phytoplankton by chlorophyll fluorescence, "Report of the Japan Plankton Society", Japan Plankton Society, 2002, 49 (1), p. 27-36 コルバー（Zbigniew S. Kolber），プレイジル（Ondrej Prasil），ファルコウスキィ（Paul G. Falkowski），高速フラッシュ励起法を用いたクロロフィル蛍光の測定：方法論と実験的プロトコルの定義（Measurements of Variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques : defining methodology and experimental protocols），「生化学と生物理（Biochim.Biopys.Acta.）」，１９９８年，１３６７，ｐ．８８−１０６Measurement of chlorophyll fluorescence using Zbigniew S. Kolber, Ondrej Prasil, Paul G. Falkowski, fast flash excitation: Methodology and definition of experimental chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques: defining methodology and experimental protocols), "Biochim. Biopys. Acta.", 1998, 1367, p. 88-106 米国特許第５，４２６，３０６号明細書US Pat. No. 5,426,306

本発明の目的は、測定現場における植物プランクトンの基礎生産力をリアルタイムで測定することができるクロロフィル蛍光測定方法およびクロロフィル蛍光測定装置を提供することである。   The objective of this invention is providing the chlorophyll fluorescence measuring method and chlorophyll fluorescence measuring apparatus which can measure the basic productivity of the phytoplankton in a measurement field in real time.

本発明は、水中の植物プランクトンに対して光を照射し、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を測定するクロロフィル蛍光測定方法において、
植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光が受光検知されることによって得られる受光検知データを読込む手順と、
受光検知データに基づいて植物プランクトンの光合成電子伝達系のパラメータを算出する手順と、
光合成電子伝達系のパラメータに基づいて植物プランクトンの基礎生産力を算出する手順とを含み、
前記の手順を時系列的に連続してリアルタイムで実行することを特徴とするクロロフィル蛍光測定方法である。 The present invention is a method for measuring chlorophyll fluorescence by irradiating light to phytoplankton in water and measuring chlorophyll fluorescence emitted by phytoplankton,
A procedure for reading received light detection data obtained by detecting chlorophyll fluorescence emitted by phytoplankton;
A procedure for calculating the parameters of the photosynthetic electron transport system of phytoplankton based on the received light detection data,
Calculating the basic productivity of phytoplankton based on the parameters of the photosynthetic electron transport system,
It is a chlorophyll fluorescence measuring method characterized by executing the above-mentioned procedure continuously in time series in real time.

また本発明は、受光検知データを読込む手順においては、植物プランクトンに対して光を照射する光源である発光ダイオードのｏｎ／ｏｆｆをフィールドプログラマブルゲートアレイによって高速で制御し、発光ダイオードから出射される光が照射される植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を光検出器で受光して受光検知データを読込み、
光合成電子伝達系のパラメータを算出する手順においては、読込んだ受光検知データをフィールドプログラマブルゲートアレイから中央処理装置へ転送し、中央処理装置によって光合成電子伝達系のパラメータを算出することを特徴とする。 Further, according to the present invention, in the procedure of reading the received light detection data, on / off of the light emitting diode which is a light source for irradiating light to the phytoplankton is controlled at high speed by the field programmable gate array, and emitted from the light emitting diode. The chlorophyll fluorescence emitted from the phytoplankton irradiated with light is received by a photodetector and the received light detection data is read.
In the procedure for calculating the parameters of the photosynthetic electron transfer system, the read light reception detection data is transferred from the field programmable gate array to the central processing unit, and the parameters of the photosynthetic electron transfer system are calculated by the central processing unit. .

また本発明は、水中の植物プランクトンに対して光を照射し、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を測定するクロロフィル蛍光測定装置において、
水中の植物プランクトンに対して連続光を光量可変に照射する連続光光源と、
水中の植物プランクトンに対してパルスを照射するパルス光光源と、
光量可変の連続光とパルス光とが照射される植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を受光検知する受光検知手段と、
受光検知手段の検知出力に基づいて、植物プランクトンに対して照射される光強度と、植物プランクトンの基礎生産力を表す光合成速度との関係を求める光合成能算出手段とを含むことを特徴とするクロロフィル蛍光測定装置である。 In the chlorophyll fluorescence measuring apparatus for irradiating light to phytoplankton in water and measuring chlorophyll fluorescence emitted from the phytoplankton,
A continuous light source that irradiates the phytoplankton underwater with a variable amount of continuous light;
A pulsed light source that irradiates the phytoplankton in water with a pulse;
A light receiving detection means for receiving and detecting chlorophyll fluorescence emitted by phytoplankton irradiated with continuous light and pulsed light with variable light quantity;
A chlorophyll comprising photosynthesis ability calculating means for obtaining a relationship between light intensity irradiated to the phytoplankton and a photosynthetic rate representing basic productivity of the phytoplankton based on a detection output of the light receiving detection means It is a fluorescence measuring device.

また本発明は、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光よりも波長が長い蛍光を受光検知するもう一つの受光検知手段を含み、
もう一つの受光検知手段が、光合成細菌が発するバクテリオクロロフィル蛍光を受光検知することを特徴とする。 In addition, the present invention includes another light receiving detection means for receiving and detecting fluorescence having a wavelength longer than that of chlorophyll fluorescence emitted by phytoplankton,
Another received light detection means is characterized by receiving and detecting bacteriochlorophyll fluorescence emitted by photosynthetic bacteria.

本発明によれば、水中の植物プランクトンに対して光を照射し、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を測定するクロロフィル蛍光測定方法において、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光が受光検知されることによって得られる受光検知データを読込み、受光検知データに基づいて植物プランクトンの光合成電子伝達系のパラメータを算出し、光合成電子伝達系のパラメータに基づいて植物プランクトンの基礎生産力を算出する手順を時系列的に連続して実行するので、測定現場における植物プランクトンの基礎生産力をリアルタイムで測定することができる方法が実現される。   According to the present invention, in the chlorophyll fluorescence measurement method for irradiating light to phytoplankton in water and measuring chlorophyll fluorescence emitted by phytoplankton, light reception detection obtained by detecting chlorophyll fluorescence emitted by phytoplankton is received and detected The process of reading the data, calculating the phytoplankton photosynthetic electron transfer system parameters based on the photodetection data, and calculating the basic productivity of the phytoplankton based on the photosynthetic electron transfer system parameters in time series As a result, a method capable of measuring the basic productivity of phytoplankton at the measurement site in real time is realized.

また本発明によれば、植物プランクトンに対して光を照射する光源である発光ダイオードのｏｎ／ｏｆｆをフィールドプログラマブルゲートアレイ（以後、ＦＰＧＡと略称する）によって高速で制御し、発光ダイオードから出射される光が照射される植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を光検出器で受光して受光検知データを読込み、読込んだ受光検知データをＦＰＧＡから中央処理装置へ転送し、中央処理装置によって光合成電子伝達系のパラメータを算出するので、大量の受光検知データを読込み、該受光検知データを迅速かつ高精度で処理し、リアルタイムで測定することが可能になる。   Further, according to the present invention, on / off of a light emitting diode, which is a light source for irradiating light to phytoplankton, is controlled at high speed by a field programmable gate array (hereinafter abbreviated as FPGA), and emitted from the light emitting diode. The chlorophyll fluorescence emitted from the phytoplankton irradiated with light is received by a photodetector, and the received light detection data is read. The read light detection data is transferred from the FPGA to the central processing unit. Since the parameters are calculated, it is possible to read a large amount of received light detection data, process the received light detection data quickly and with high accuracy, and measure in real time.

また本発明によれば、水中の植物プランクトンに対して連続光を光量可変に照射する連続光光源と、パルス光を照射するパルス光光源とを含み、光量可変の連続光とパルス光とが照射される植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を、受光検知手段によって受光検知するので、該受光検知出力に基づいて、光強度と基礎生産力を表す光合成速度との関係を求めることができる。   Further, according to the present invention, the continuous light source that irradiates the phytoplankton in water with a variable amount of continuous light and the pulsed light source that irradiates the pulsed light, and the continuous light of variable light amount and the pulsed light are irradiated. Since the chlorophyll fluorescence emitted from the phytoplankton is detected by the light receiving detection means, the relationship between the light intensity and the photosynthetic rate representing the basic productivity can be obtained based on the received light detection output.

また本発明によれば、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光よりも波長が長いバクテリオクロロフィル蛍光を受光検知するもう一つの受光検知手段を含むので、植物プランクトンの基礎生産力と、光合成細菌の基礎生産力とを同時に測定することができる。   In addition, according to the present invention, since it includes another light receiving detection means for detecting and detecting bacteriochlorophyll fluorescence having a wavelength longer than that of chlorophyll fluorescence emitted from phytoplankton, the basic productivity of phytoplankton and the basic productivity of photosynthetic bacteria Can be measured simultaneously.

図１は、本発明の測定方法に好適に用いられるクロロフィル蛍光測定装置５０の構成を簡略化して示す図である。クロロフィル蛍光測定装置５０は、前述した図６に示すクロロフィル蛍光装置（ＦＲＲＦ）１に類似するので、対応する部分については同一の参照符号を付して説明を省略する。なお、クロロフィル蛍光測定装置５０は、前述のＦＲＲＦ１と同様にＦＲＲ式光度計（ＦＲＲＦ）であるので、以後ＦＲＲＦ５０と略記する。   FIG. 1 is a diagram showing a simplified configuration of a chlorophyll fluorescence measurement apparatus 50 that is preferably used in the measurement method of the present invention. Since the chlorophyll fluorescence measuring apparatus 50 is similar to the chlorophyll fluorescence apparatus (FRRF) 1 shown in FIG. 6 described above, the corresponding parts are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted. Since the chlorophyll fluorescence measuring device 50 is an FRR photometer (FRRF) similarly to the above-described FRRF1, it is hereinafter abbreviated as FRRF50.

ＦＲＲＦ５０において注目すべきは、植物プランクトンの光合成電子伝達系ＩＩ（ＰＳＩＩ）のパラメータに基づいて植物プランクトンの基礎生産力を演算する演算手段５１を含むことである。演算手段５１は、中央処理回路（ＣＰＵ）３０と、フラッシュロム５７とスタティックラム５８とから成るメモリ３１と、プログラミングすることのできる大規模集積回路（ＬＳＩ）であるＦＰＧＡ５２と、アナログ／デジタル変換器であるＡ／Ｄコンバータ５３と、デジタル／アナログ変換器であるＤ／Ａコンバータ５４とを含んで構成される。また、ＦＲＲＦ５０は、その他増幅器であるアンプ基板５５と、後述する光源をｏｎ／ｏｆｆ動作させるドライバ基板５６とを含む。   What should be noted in the FRRF 50 is that it includes calculation means 51 for calculating the basic productivity of phytoplankton based on the parameters of the photosynthetic electron transfer system II (PSII) of phytoplankton. The arithmetic means 51 includes a central processing circuit (CPU) 30, a memory 31 composed of a flash ROM 57 and a static ram 58, an FPGA 52 which is a programmable large scale integrated circuit (LSI), and an analog / digital converter. A / D converter 53 and a D / A converter 54 which is a digital / analog converter. Further, the FRRF 50 includes an amplifier board 55 that is another amplifier, and a driver board 56 that performs on / off operation of a light source described later.

ＦＰＧＡ５２には、クロロフィル蛍光の測定目的に応じた光源の動作制御プログラムが予め格納される。クロロフィル蛍光測定時には、ＦＰＧＡ５２から光源を動作させる指令がＤ／Ａコンバータ５４に対して出力され、該出力信号がアナログ信号に変換されてドライバ基板５６に与えられる。ドライバ基板５６が、ＦＰＧＡ５２からの動作指令に従って光源のｏｎ／ｏｆｆを高速で動作させる。   The FPGA 52 stores in advance a light source operation control program according to the purpose of measuring chlorophyll fluorescence. At the time of chlorophyll fluorescence measurement, a command for operating the light source is output from the FPGA 52 to the D / A converter 54, and the output signal is converted into an analog signal and applied to the driver board 56. The driver board 56 operates the light source on / off at a high speed in accordance with an operation command from the FPGA 52.

ＦＲＲＦ５０の光源としては、２つの第１および第２光源６１，６２が備えられ、いずれの光源も青色発光ダイオード（青色ＬＥＤ）で構成される。第１光源６１と第１耐水窓１７との間、および第２光源６２と第２耐水窓１８との間には、第１および第２光学フィルタ６３，６４がそれぞれ設けられる。第１および第２光学フィルタ６３，６４は、第１および第２光源６１，６２からそれぞれ出射される光のうち、波長５５０ｎｍ以上の赤色光成分をカットするフィルタである。ＦＲＲＦ５０は、基本的に人工的な励起光を用いるアクティブ蛍光法であり、そのために人工的な励起光源として青色ＬＥＤから成る第１および第２光源６１，６２を備えるけれども、青色ＬＥＤは単一波長成分の光を発するのではなく、わずかながら長波長側の赤色成分をも含むので、第１および第２光学フィルタ６３，６４によって励起に不用な赤色成分をカットするものである。   As the light source of the FRRF 50, two first and second light sources 61 and 62 are provided, and both light sources are configured by blue light emitting diodes (blue LEDs). First and second optical filters 63 and 64 are provided between the first light source 61 and the first water-resistant window 17 and between the second light source 62 and the second water-resistant window 18, respectively. The first and second optical filters 63 and 64 are filters that cut red light components having a wavelength of 550 nm or more out of light emitted from the first and second light sources 61 and 62, respectively. The FRRF 50 is basically an active fluorescence method using artificial excitation light, and for this purpose, the first and second light sources 61 and 62 composed of blue LEDs are provided as artificial excitation light sources. It does not emit component light, but also includes a slight red component on the longer wavelength side, and therefore the red component unnecessary for excitation is cut by the first and second optical filters 63 and 64.

以下、ＦＲＲＦ５０を用いて、試料海水中の植物プランクトンのクロロフィル蛍光を測定する方法について説明する。図２は、クロロフィル蛍光測定動作を説明するフローチャートである。   Hereinafter, a method for measuring chlorophyll fluorescence of phytoplankton in sample seawater using FRRF50 will be described. FIG. 2 is a flowchart for explaining the chlorophyll fluorescence measurement operation.

スタートでは、ＦＲＲＦ５０が、測定現場の海洋において、測定対象とする深度に浸漬され、バッテリ５から電力供給されて測定動作の準備が完了している状態である。ステップｓ１では、ＦＰＧＡ５２から動作指令を出力し、Ｄ／Ａコンバータ５４およびドライバ基板５６を介して第１光源６１を動作させて所定の周波数、たとえば飽和過程では２００ｋＨｚ〜５００ｋＨｚ、緩和過程では１００Ｈｚ〜２０ｋＨｚでパルス状の励起光を明室３の試料海水に対して照射させる。   In the start, the FRRF 50 is immersed in the depth to be measured in the ocean at the measurement site, and is supplied with power from the battery 5 and is ready for the measurement operation. In step s1, an operation command is output from the FPGA 52, the first light source 61 is operated via the D / A converter 54 and the driver board 56, and a predetermined frequency, for example, 200 kHz to 500 kHz in the saturation process, and 100 Hz to 20 kHz in the relaxation process. Then, the sampled seawater in the bright room 3 is irradiated with pulsed excitation light.

ステップｓ２では、明室３の試料海水中に存在する植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光が、光電子増倍管２９で受光検知されて得られる蛍光強度の変化値を受光検知データとして、アンプ基板５５およびＡ／Ｄコンバータ５３を介してＦＰＧＡ５２へ読込む。ＦＰＧＡ５２は、読込んだ受光検知データをＣＰＵ３０へ転送し、ＣＰＵ３０において、受光検知データとパルス光照射回数とから明室３の誘導曲線を作成する。   In step s2, the chlorophyll fluorescence emitted from the phytoplankton present in the sample seawater in the bright room 3 is received and detected by the photomultiplier tube 29, and the change value of the fluorescence intensity is used as the received light detection data. Read into the FPGA 52 via the / D converter 53. The FPGA 52 transfers the received light reception detection data to the CPU 30, and the CPU 30 creates an induction curve for the bright room 3 from the light reception detection data and the number of times of pulsed light irradiation.

ステップｓ３では、上記ステップｓ１と同様に、ＦＰＧＡ５２から出力される動作指令によって第２光源６２を動作させて所定の周波数で励起光を暗室４の試料海水に対して照射させる。ステップｓ４では、暗室４の試料海水中に存在する植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光が、光電子増倍管２９で受光検知されて得られる蛍光強度の変化値を受光検知データとして、アンプ基板５５およびＡ／Ｄコンバータ５３を介してＦＰＧＡ５２へ読込む。ＦＰＧＡ５２は、読込んだ受光検知データをＣＰＵ３０へ転送し、ＣＰＵ３０において、受光検知データとパルス光照射回数とから暗室４の誘導曲線を作成する。   In step s3, similarly to step s1, the second light source 62 is operated by the operation command output from the FPGA 52, and the sample seawater in the dark room 4 is irradiated with the excitation light at a predetermined frequency. In step s4, the chlorophyll fluorescence emitted from the phytoplankton present in the sample seawater in the dark room 4 is received and detected by the photomultiplier tube 29, and the change value of the fluorescence intensity is used as the received light detection data. Reading into the FPGA 52 via the D converter 53. The FPGA 52 transfers the received light reception detection data to the CPU 30, and the CPU 30 creates an induction curve for the dark room 4 from the light reception detection data and the number of pulsed light irradiations.

ステップｓ５では、ＣＰＵ３０が、受光検知データに基づいて作成される誘導曲線から、植物プランクトンのＰＳＩＩのパラメータである量子収率（Ｆ）、有効光吸収断面積（σＰＳＩＩ）、電子受容体（ＱＡ）の再酸化時定数（τＱＡ）などを算出する。なお、このパラメータの算出については、前述の非特許文献２、特許文献１に詳述されているので、ここでは省略する。 In step s5, the CPU 30 calculates the quantum yield (F), the effective light absorption cross section (σ PSII ), the electron acceptor (Q), which are PSII parameters of the phytoplankton, from the induction curve created based on the received light detection data. A ) re-oxidation time constant (τ QA ) and the like are calculated. The calculation of this parameter is described in detail in Non-Patent Document 2 and Patent Document 1 described above, and is omitted here.

ステップｓ６では、ＣＰＵ３０が、ＰＳＩＩのパラメータに基づいて植物プランクトンの基礎生産力（ＰｂＯ）を算出する。基礎生産力（ＰｂＯ）の演算は、メモリ３１に予め格納される演算式（２）を読出すとともに、ステップｓ５で得られるパラメータ、受光検知データおよび光合成有効放射（ＰＡＲ）を用いて行われる。なお、光合成有効放射（ＰＡＲ）とは、藻類の光合成に必要なエネルギ３５０〜７００ｎｍの波長域の光量子数である。   In step s6, the CPU 30 calculates the basic productivity (PbO) of the phytoplankton based on the PSII parameters. The calculation of the basic productivity (PbO) is performed by reading the calculation formula (2) stored in advance in the memory 31 and using the parameters, the received light detection data, and the photosynthetic effective radiation (PAR) obtained in step s5. In addition, photosynthetic effective radiation (PAR) is a photon number in a wavelength region of energy 350 to 700 nm necessary for photosynthesis of algae.

また明室３で得られる受光検知データおよびパラメータには「Ｌ」を付して表し、暗室４で得られる受光検知データおよびパラメータには「Ｄ」を付して表す。
ＰｂＯ[l/sec]＝ＰＡＲ×σＰＳＩＩＬ×Ｑｐ×φｅ×ｎＰＳ２
×（ＦｖＤ／ＦｍＤ／０．６５） …（２）
ここで、ＦｖＤ＝Ｆ０Ｄ−ＦｍＤ
Ｑｐ＝（ＦｍＤ−Ｆ´）／（ＦｍＤ−Ｆ０Ｄ）
Ｆ´＝Ｆ０Ｄ＋（ＦｍＤ−Ｆ０Ｄ）×Ｃ（Ｅ）
Ｃ（Ｅ）＝ＰＡＲ×σＰＳＩＩＬ／（ＰＡＲ×σＰＳＩＩＬ＋１／τ１Ｌ）
φｅ；ＰＡＲ×σＰＳＩＩＬ×Ｑｐ≦１／τｐであるとき、
φｅ＝０．２５０
ＰＡＲ×σＰＳＩＩＬ×Ｑｐ＞１／τｐであるとき、
φｅ＝０．２５０／（ＰＡＲ×σＰＳＩＩＬ×Ｑｐ）／τｐ
τｐ＝Ｅｋ×σＰＳＩＩＬ
Ｅｋ＝１．２０４Ｅ＋２０［ｑｕａｎｔａ ｍ−２ ｓ−１］
ｎＰＳ２＝０．００２ The light reception detection data and parameters obtained in the bright room 3 are represented by “L”, and the light reception detection data and parameters obtained in the dark room 4 are represented by “D”.
PbO [l / sec] = PAR × σ PSII L × Qp × φe × nPS2
× (FvD / FmD / 0.65) (2)
Here, FvD = F 0 D−FmD
Qp = (FmD−F ′) / (FmD−F 0 D)
F ′ = F 0 D + (FmD−F 0 D) × C (E)
C (E) = PAR × σ PSII L / (PAR × σ PSII L + 1 / τ 1 L)
φe; when PAR × σ PSII L × Qp ≦ 1 / τp,
φe = 0.250
When PAR × σ PSII L × Qp> 1 / τp,
φe = 0.250 / (PAR × σ PSII L × Qp) / τp
τp = Ek × σ PSII L
Ek = 1.204E + 20 [quant m −2 s −1 ]
nPS2 = 0.002

本クロロフィル蛍光測定方法においては、図２のフローに示す手順を、時系列的に連続して実行するので、植物プランクトンの基礎生産力をリアルタイムで測定することが可能である。なお、ステップｓ５およびステップｓ６で求められるパラメータおよび基礎生産力の求められた結果は、装置本体２の底板１３に設けられる接続端子６５にケーブルを接続し、陸上または船上に設営されるたとえば測定制御室にリアルタイムで伝送されるように構成されることが望ましい。また、測定結果の伝送は、接続端子６５に接続する有線通信に限定されることなく、無線通信手段をＦＲＲＦ５０に設け、衛星回線を利用して遠方へリアルタイムで行うことができるように構成されてもよい。   In the present chlorophyll fluorescence measurement method, the procedure shown in the flow of FIG. 2 is continuously performed in time series, so that the basic productivity of phytoplankton can be measured in real time. Note that the parameters obtained in step s5 and step s6 and the results obtained for the basic productivity are obtained by connecting a cable to a connection terminal 65 provided on the bottom plate 13 of the apparatus main body 2, for example, measuring control installed on land or on a ship. It is desirable to be configured to be transmitted in real time to the room. In addition, the transmission of the measurement result is not limited to the wired communication connected to the connection terminal 65, but the wireless communication means is provided in the FRRF 50, and is configured so that it can be performed in real time using a satellite line. Also good.

図３は、本発明の実施の形態であるクロロフィル蛍光測定装置７０の構成を簡略化して示す斜視図である。本実施の形態のクロロフィル蛍光測定装置７０は、前述のＦＲＲＦ５０に類似するので、全体構成を省略して励起系と検出系とのみを図示するとともに、対応する部分については同一の参照符号を付して説明を省略する。またクロロフィル蛍光測定装置７０は、ＦＲＲＦ５０のような水中浸漬タイプとは異なり、陸上組立式のいわゆるベンチトップタイプである。しかしながら、図３に示す励起系と検出系とを、水中浸漬タイプの装置本体内に組込んで水中に浸漬して測定できる構成とすることも可能である。   FIG. 3 is a perspective view showing a simplified configuration of the chlorophyll fluorescence measuring apparatus 70 according to the embodiment of the present invention. Since the chlorophyll fluorescence measuring apparatus 70 of the present embodiment is similar to the above-described FRRF 50, the entire configuration is omitted and only the excitation system and the detection system are illustrated, and corresponding portions are denoted by the same reference numerals. The description is omitted. Further, the chlorophyll fluorescence measuring device 70 is a so-called bench-top type of an on-shore assembly type, unlike an underwater immersion type such as FRRF50. However, the excitation system and the detection system shown in FIG. 3 can be incorporated in an apparatus body of an underwater type and immersed in water for measurement.

本実施形態のクロロフィル蛍光測定装置７０において注目すべきは、水中の植物プランクトンに対して連続光を光量可変に照射する連続光光源７１と、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光よりも波長が長い蛍光を受光検知するもう一つの受光検知手段７２と、ＰＳＩＩのリセットを行うための赤ＬＥＤ７９とを含むことである。   It should be noted in the chlorophyll fluorescence measuring apparatus 70 of the present embodiment that a continuous light source 71 that irradiates continuous light to the phytoplankton in water in a variable amount of light, and fluorescence that has a longer wavelength than the chlorophyll fluorescence emitted by the phytoplankton Another light receiving detection means 72 for detecting and a red LED 79 for resetting PSII are included.

なお、クロロフィル蛍光測定装置７０が、励起光をパルス光として出射し水中の植物プランクトンに対してパルス光を照射するパルス光光源である第１光源６１と、光量可変の連続光とパルス光とが照射される植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を受光する受光検知手段である光電子増倍管２９と、光電子増倍管２９の検知出力に基づいて、植物プランクトンの基礎生産力をあらわす光合成速度との関係を求める光合成能算出手段である演算手段５１とを備えることは、前述のＦＲＲＦ５０と同じである。   The chlorophyll fluorescence measuring device 70 emits excitation light as pulsed light and irradiates the phytoplankton in water with pulsed light, a first light source 61, continuous light with variable light quantity, and pulsed light. Based on the detection output of the photomultiplier tube 29, a photomultiplier tube 29, which is a light-receiving detector that receives chlorophyll fluorescence emitted from the irradiated phytoplankton, and the relationship between the photosynthesis rate representing the basic productivity of the phytoplankton It is the same as the above-mentioned FRRF 50 that it includes the calculating means 51 which is the required photosynthetic ability calculating means.

クロロフィル蛍光測定装置７０は、ベンチトップタイプであるので、植物プランクトンを含む試料海水は、光を透過するたとえばガラス製の容器である試料セル７３に収容されて測定される。第１光源６１から出射されて第１光学フィルタ６３で赤色光がカットされたパルス光８１が、試料セル７３の海水中に存在する植物プランクトンに照射される。なお、このときの第１光源６１から出射される励起光であるパルス光８１の強度は、試料セル７３の上方に設けられるＬＥＤモニタセンサ７４によって測定される。   Since the chlorophyll fluorescence measuring device 70 is of a bench top type, the sample seawater containing phytoplankton is measured by being accommodated in a sample cell 73 that is a glass container that transmits light. The phytoplankton present in the seawater of the sample cell 73 is irradiated with the pulsed light 81 emitted from the first light source 61 and having the red light cut by the first optical filter 63. At this time, the intensity of the pulsed light 81 that is the excitation light emitted from the first light source 61 is measured by the LED monitor sensor 74 provided above the sample cell 73.

試料セル７３中において励起光を照射された植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光７５は、蛍光バンドパスフィルタ２８を通過することによって、波長６８５ｎｍ付近の光が選択透過され、光電子増倍管２９によって受光検知される。光電子増倍管２９によって受光検知された蛍光強度に基づいて、光合成能算出手段である演算手段５１によって植物プランクトンのＰＳＩＩのパラメータおよび基礎生産力が求められる。   The chlorophyll fluorescence 75 emitted from the phytoplankton irradiated with the excitation light in the sample cell 73 passes through the fluorescence bandpass filter 28, so that light around a wavelength of 685 nm is selectively transmitted and received and detected by the photomultiplier tube 29. The Based on the fluorescence intensity detected and detected by the photomultiplier tube 29, PSII parameters and basic productivity of the phytoplankton are obtained by the calculation means 51 which is a photosynthesis ability calculation means.

もう一つの受光検知手段７２は、波長８００ｎｍ以上の光を選択的に透過させるロングパス光学フィルタ７６と、もう一つの長波長用光電子増倍管７７とを含んで構成される。試料セル７３の海水中に植物プランクトンだけでなく光合成細菌も存在するとき、第１光源６１からの励起光が試料セル７３中の海水に照射されると、光合成細菌がバクテリオクロロフィル蛍光を発する。この光合成細菌から発せられるバクテリオクロロフィル蛍光７８は、植物プランクトンによるクロロフィル蛍光７５の波長（６８５ｎｍ付近）よりも波長が長く、波長が８００ｎｍ以上である。   Another received light detection means 72 includes a long-pass optical filter 76 that selectively transmits light having a wavelength of 800 nm or more, and another long-wavelength photomultiplier tube 77. When not only phytoplankton but also photosynthetic bacteria are present in the seawater of the sample cell 73, when the excitation light from the first light source 61 is irradiated to the seawater in the sample cell 73, the photosynthetic bacteria emit bacteriochlorophyll fluorescence. The bacteriochlorophyll fluorescence 78 emitted from this photosynthetic bacterium has a wavelength longer than that of chlorophyll fluorescence 75 (around 685 nm) by phytoplankton, and the wavelength is 800 nm or more.

したがって、長波長用光電子増倍管７７の前に、波長８００ｎｍ以上の光を選択的に透過させるロングパス光学フィルタ７６を設けることによって、バクテリオクロロフィル蛍光７８を受光検知することができる。このバクテリオクロロフィル蛍光７８を受光検知することによって、植物プランクトンの場合と同様の処理をして光合成細菌の基礎生産力を求めることができる。すなわち、クロロフィル蛍光測定装置７０によれば、植物プランクトンと光合成細菌との両方の基礎生産力を求めることが可能になる。   Accordingly, the bacteriochlorophyll fluorescence 78 can be received and detected by providing a long-pass optical filter 76 that selectively transmits light having a wavelength of 800 nm or more before the long wavelength photomultiplier tube 77. By detecting and detecting the bacteriochlorophyll fluorescence 78, it is possible to obtain the basic productivity of the photosynthetic bacteria by performing the same processing as in the case of phytoplankton. That is, according to the chlorophyll fluorescence measuring apparatus 70, it becomes possible to obtain the basic productivity of both phytoplankton and photosynthetic bacteria.

本実施形態のクロロフィル蛍光測定装置７０では、連続光光源７１が試料セル７３の下方に設けられ、連続光光源７１から出射される連続光８２が試料セル７３中の試料海水に対して光量可変に照射される。連続光光源７１は、たとえば白色ＬＥＤであり、常時点灯させることによって連続光を出射できる。   In the chlorophyll fluorescence measuring apparatus 70 of this embodiment, the continuous light source 71 is provided below the sample cell 73, and the continuous light 82 emitted from the continuous light source 71 is variable in amount of light with respect to the sample seawater in the sample cell 73. Irradiated. The continuous light source 71 is, for example, a white LED, and can emit continuous light by always lighting.

図４は、第１光源６１によるパルス光と連続光光源７１による連続光とが重畳されている状態を示す図である。パルス光光源である第１光源６１からパルス光８１を出射して試料セル７３中の試料海水に照射するとともに、連続光源７１から連続光８２を出射して試料セル７３中の試料海水に照射して、植物プランクトンおよび／または光合成細菌の基礎生産力（光合成速度）を測定する。この光合成速度の測定に際し、連続光光源７１から出射される連続光８２の光量（光強度）を変化させることによって、試料海水に照射される光強度と光合成速度との関係を求めることが可能になる。   FIG. 4 is a diagram illustrating a state in which the pulsed light from the first light source 61 and the continuous light from the continuous light source 71 are superimposed. A pulsed light 81 is emitted from a first light source 61 that is a pulsed light source to irradiate the sample seawater in the sample cell 73, and a continuous light 82 is emitted from the continuous light source 71 to irradiate the sample seawater in the sample cell 73. The basic productivity (photosynthesis rate) of phytoplankton and / or photosynthetic bacteria is measured. In measuring the photosynthesis speed, it is possible to determine the relationship between the light intensity irradiated on the sample seawater and the photosynthesis speed by changing the light quantity (light intensity) of the continuous light 82 emitted from the continuous light source 71. Become.

図５は、光強度と光合成速度との関係を例示する図である。図５に示す光強度と光合成速度との関係を求めることによって、試料海水中の植物プランクトンおよび／または光合成細菌の量子収率Ｆに相当する立ち上がり勾配、最大光合成速度、総光合成Ｐｇ、総光合成から呼吸Ｒを引いた純光合成Ｐｎを求めることができる。   FIG. 5 is a diagram illustrating the relationship between light intensity and photosynthesis speed. By obtaining the relationship between the light intensity and the photosynthetic rate shown in FIG. 5, the rising slope corresponding to the quantum yield F of phytoplankton and / or photosynthetic bacteria in the sample seawater, the maximum photosynthetic rate, the total photosynthesis Pg, and the total photosynthesis Pure photosynthesis Pn obtained by subtracting respiration R can be obtained.

本発明の測定方法に好適に用いられるクロロフィル蛍光測定装置５０の構成を簡略化して示す図である。It is a figure which simplifies and shows the structure of the chlorophyll fluorescence measuring apparatus 50 used suitably for the measuring method of this invention. クロロフィル蛍光測定動作を説明するフローチャートである。It is a flowchart explaining the chlorophyll fluorescence measurement operation | movement. 本発明の実施の形態であるクロロフィル蛍光測定装置７０の構成を簡略化して示す斜視図である。It is a perspective view which simplifies and shows the structure of the chlorophyll fluorescence measuring apparatus 70 which is embodiment of this invention. 第１光源６１によるパルス光と連続光光源７１による連続光とが重畳されている状態を示す図である。It is a figure which shows the state with which the pulsed light by the 1st light source 61 and the continuous light by the continuous light source 71 are superimposed. 光強度と光合成速度との関係を例示する図である。It is a figure which illustrates the relationship between light intensity and photosynthesis speed. ＦＲＲ式蛍光光度計１の典型的な構成を簡略化して示す図である。It is a figure which simplifies and shows the typical structure of the FRR type fluorophotometer 1. 誘導曲線を例示する図である。It is a figure which illustrates an induction curve. 緩和過程における閃光回数とクロロフィル蛍光強度との関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between the frequency | count of a flash in a relaxation process, and chlorophyll fluorescence intensity.

符号の説明Explanation of symbols

５０，７０ クロロフィル蛍光測定装置
２ 装置本体
３ 明室
４ 暗室
５ バッテリ
６ 日射センサ
１１ ケーシング
１５ 蛍光受光部
１７，１８ 耐水窓
２１ 暗室カバー部材
２４，２５，６１，６２ 光源
２６，２７ 反射ミラー
２８ 蛍光バンドパスフィルタ
２９ 光電子増倍管
３０ ＣＰＵ
３１ メモリ
３２ 電源基板
３４ 圧力センサ
５１ 演算手段
７１ 連続光光源
７２ 受光検知手段
７３ 試料セル
７６ ロングパス蛍光フィルタ
７７ 長波長用光電子増倍管 50, 70 Chlorophyll fluorescence measuring device 2 Device main body 3 Bright room 4 Dark room 5 Battery 6 Solar sensor 11 Casing 15 Fluorescent light receiving part 17, 18 Water resistant window 21 Dark room cover member 24, 25, 61, 62 Light source 26, 27 Reflecting mirror 28 Fluorescence Bandpass filter 29 Photomultiplier tube 30 CPU
Reference Signs List 31 Memory 32 Power Supply Board 34 Pressure Sensor 51 Calculation Unit 71 Continuous Light Source 72 Light Receiving Detection Unit 73 Sample Cell 76 Long Pass Fluorescent Filter 77 Long Wavelength Photomultiplier Tube

Claims (4)

水中の植物プランクトンに対して光を照射し、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を測定するクロロフィル蛍光測定方法において、
植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光が受光検知されることによって得られる受光検知データを読込む手順と、
受光検知データに基づいて植物プランクトンの光合成電子伝達系のパラメータを算出する手順と、
光合成電子伝達系のパラメータに基づいて植物プランクトンの基礎生産力を算出する手順とを含み、
前記の手順を時系列的に連続してリアルタイムで実行することを特徴とするクロロフィル蛍光測定方法。 In a chlorophyll fluorescence measurement method for irradiating light to phytoplankton in water and measuring chlorophyll fluorescence emitted by phytoplankton,
A procedure for reading received light detection data obtained by detecting chlorophyll fluorescence emitted by phytoplankton;
A procedure for calculating the parameters of the photosynthetic electron transport system of phytoplankton based on the received light detection data,
Calculating the basic productivity of phytoplankton based on the parameters of the photosynthetic electron transport system,
A method for measuring chlorophyll fluorescence, wherein the above-mentioned procedure is executed in real time continuously in time series. 受光検知データを読込む手順においては、植物プランクトンに対して光を照射する光源である発光ダイオードのｏｎ／ｏｆｆをフィールドプログラマブルゲートアレイによって高速で制御し、発光ダイオードから出射される光が照射される植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を光検出器で受光して受光検知データを読込み、
光合成電子伝達系のパラメータを算出する手順においては、読込んだ受光検知データをフィールドプログラマブルゲートアレイから中央処理装置へ転送し、中央処理装置によって光合成電子伝達系のパラメータを算出することを特徴とする請求項１記載のクロロフィル蛍光測定方法。 In the procedure for reading the received light detection data, on / off of the light emitting diode which is a light source for irradiating light to the phytoplankton is controlled at high speed by the field programmable gate array, and the light emitted from the light emitting diode is irradiated. The chlorophyll fluorescence emitted by phytoplankton is received by a photodetector and the received light detection data is read.
In the procedure for calculating the parameters of the photosynthetic electron transfer system, the read light reception detection data is transferred from the field programmable gate array to the central processing unit, and the parameters of the photosynthetic electron transfer system are calculated by the central processing unit. The chlorophyll fluorescence measuring method according to claim 1. 水中の植物プランクトンに対して光を照射し、植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を測定するクロロフィル蛍光測定装置において、
水中の植物プランクトンに対して連続光を光量可変に照射する連続光光源と、
水中の植物プランクトンに対してパルスを照射するパルス光光源と、
光量可変の連続光とパルス光とが照射される植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光を受光検知する受光検知手段と、
受光検知手段の検知出力に基づいて、植物プランクトンに対して照射される光強度と、植物プランクトンの基礎生産力を表す光合成速度との関係を求める光合成能算出手段とを含むことを特徴とするクロロフィル蛍光測定装置。 In a chlorophyll fluorescence measuring device that irradiates light to phytoplankton in water and measures chlorophyll fluorescence emitted by phytoplankton,
A continuous light source that irradiates the phytoplankton underwater with a variable amount of continuous light;
A pulsed light source that irradiates the phytoplankton in water with a pulse;
A light receiving detection means for receiving and detecting chlorophyll fluorescence emitted by phytoplankton irradiated with continuous light and pulsed light with variable light quantity;
A chlorophyll comprising photosynthesis ability calculating means for obtaining a relationship between light intensity irradiated to the phytoplankton and a photosynthetic rate representing basic productivity of the phytoplankton based on a detection output of the light receiving detection means Fluorescence measuring device. 植物プランクトンが発するクロロフィル蛍光よりも波長が長い蛍光を受光検知するもう一つの受光検知手段を含み、
もう一つの受光検知手段が、光合成細菌が発するバクテリオクロロフィル蛍光を受光検知することを特徴とする請求項３記載のクロロフィル蛍光測定装置。 Including another light receiving and detecting means for receiving and detecting fluorescence having a wavelength longer than that of chlorophyll fluorescence emitted by phytoplankton,
4. The chlorophyll fluorescence measuring apparatus according to claim 3, wherein the other light receiving detection means detects and detects bacteriochlorophyll fluorescence emitted by photosynthetic bacteria.
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