JP2005514137A - 黄斑色素のラマン画像を作成する方法と装置 - Google Patents

Abstract

黄斑色素のような、生物組織中のカロチノイドおよび関連する化学物質のラマン画像を作成する方法と装置が提供される。本方法および装置は、共鳴ラマン分光法の技法を利用して、組織中のカロチノイドおよび同様な物質の水準の画像を作成する。この技法では、光が、眼球の網膜のような、対象とする組織領域上に向けられる。散乱光のわずかな部分が、非弾性的に散乱され、入射光とは異なる振動数にあるカロチノイドのラマン信号を生成する。ラマン信号は、非弾性散乱光中のラマン信号の空間位置と強度を決定するために、回収され、濾過され、かつ分析される。次いで、ラマン信号の画像は、出力装置上に作成され、その画像は、組織中のカロチノイドの空間分布と濃度水準を表す。

Description

本発明は一般に、生物組織中に見られる化学化合物の水準を検出しかつ測定するための技術に関する。さらに詳細には、本発明は、疾患の危険度を評価するために診断上の補助として使用可能な、黄斑のカロチノイド色素のような生物組織中のカロチノイドおよび関連する化学物質のラマン画像を作成するための方法と装置に関する。

ここ数年来、ヒトの網膜における黄斑のカロチノイド色素の役割の研究に関心が高まっている。このような黄斑色素は、黄斑中に集中するカロチノイド種のルテインおよびゼアキサンチンからなる。黄斑は、最高の視力および色覚に必須の直径約５ｍｍの領域を含む。黄斑色素は、高齢者の失明の主要な原因である老化関連黄斑変性（ＡＭＤ）の治療と予防において基本的に重要であり得る。これらの色素は、青緑色のスペクトル域内の光を吸収すると、網膜に達する青／緑色光成分の光毒効果によって引き起こされる光化学的損傷および／または結像劣化を弱めるフィルタとして働くものと考えられている。さらには、これらの色素は、遊離基を除去する抗酸化物として、保護的な役割を果たし得ると推測されている。

ＡＭＤの研究を促進するために、ヒトの生体黄斑中の黄斑色素を検出する、非観血的で、確実であり、かつ客観的な方法が必要とされている。眼球の黄斑組織中のカロチノイド水準を測定するための非観血的方法が、米国特許第５，８７３，８３１号に説明されており、その開示は参照として本明細書に組み込まれる。この方法では、カロチノイドおよび関連物質の水準は、共鳴ラマン分光法として知られる技法によって測定される。これは、（適切な較正を行えば）一定の化学化合物の存在および濃度を識別できる技法である。この技法では、単色に近い光が測定すべき試料に入射し、この入射光とは異なる振動数の非弾性散乱光が検出されかつ測定される。入射光と散乱光の間における振動数のずれは、ラマンシフトとして知られており、このずれは、いくつかの分子の振動または回転エネルギー状態の「指紋」であるエネルギーに対応する。典型的には、分子は、いくつかの特有のラマン活性振動または回転エネルギー状態を示し、したがって、分子のラマンスペクトルの測定は分子の指紋を提供する。すなわち、それは、分子に特有の連続的なスペクトルの鋭い振動または回転ピークを提供する。ラマン散乱光の強度は、対象とする１つまたは複数の分子の濃度に直接対応する。米国特許第５，８７３，８３１号に説明の共鳴ラマン技法を用いてカロチノイド種のルテインおよびゼアキサンチン（この２つの化学物質はヒトの眼球の健康な黄斑組織に関連する）の水準を測定することができる。

現在最も一般的に用いられている、黄斑色素水準を測定する非観血的方法は、中心窩に向けられた光線と周中心窩に向けられた別の光線の色強度の一致判定を伴う、精神物理学的な異色フリッカ測光試験である。しかし、この方法は、主観的で、時間集約的であり、かつ適正な視力を有する注意深く協力的な被験者を必要とする。その再現性は、被験者の当該任務に関する理解に左右される。したがって、ほとんどＡＭＤの危険性にさらされている高齢母集団および黄斑の病変を有する被験者における黄斑色素水準を評価するこの方法の有用性は、著しく限定される。

別の方策では、スペクトル眼底反射率に基づく黄斑色素の客観的な検出方法が用いられる。この方法は、正常なヒトの網膜と異常なヒトの網膜の両方に対して使用可能である利点を有する。この方法の１変形では、可視スペクトル全体にわたる反射率が、ほぼ同時に測定され、かつ黄斑色素の濃度に関する推計値は、中心窩の反射と吸収に関する詳細な光学モデルに由来する算定スペクトルと測定スペクトルの一致から得られる。この技法の画像作成の変形では、撮像眼底反射率計または改良型の走査レーザ検眼鏡（ＳＬＯ）を使用して、２つの異なる走査レーザ波長に関する反射率マップを作成し、黄斑色素の分布と濃度がデジタル減法画像によって導き出される。黄斑色素のＳＬＯ測定は、スペクトル中心窩反射率または精神物理学的測定よりも信頼性のある結果を提供することが証明されている。しかし、スペクトル中心窩反射率およびＳＬＯ手法は、網膜中のいくつもの広範な吸収物質の存在によって、それらの測定は化学的特定性に欠けるきらいがある。

本発明は、黄斑のカロチノイド色素のような生物組織中のカロチノイドおよび関連する化学物質のラマン画像を作成するための方法と装置に関する。本方法および装置は、共鳴ラマン分光法を利用して、組織中のカロチノイドおよび同様の物質の水準と分布の画像を作成する。この技法では、入射光は、眼球の網膜のような、対象とする組織領域上に向けられる。この組織からの散乱光は、入射光と同じ振動数を有する散乱光の主要部分を含む。散乱光のわずかな部分は、入射光とは異なる振動数で非弾性的に散乱されるが、これがラマン信号である。ラマン散乱光は、典型的には波長の選択的濾過によって回収されかつ分離され、さらに、得られるラマン信号は、敏感な光学検出装置を使用して測定される。次いで、ラマン信号は、非弾性散乱光中のラマン信号の空間位置と強度を決定するために分析される。ラマン信号の画像は出力装置上に作成され、その画像は組織中のカロチノイドの空間分布と濃度を表す。

本発明は、変性の眼病のような疾患の危険度を評価するために、診断上の補助として使用可能である。本発明のラマン画像技法は、生体被験者の黄斑カロチノイド水準を非観血的かつ迅速に決定する。したがって、本発明は、個人の進行中の老化関連黄斑変性に関する危険度を評価し、かつ同変性の予防計画案を決定する際の助けになり得る、大きな母集団に応用可能な貴重な診断上の情報を提供する。

本発明の以上の利点および他の利点は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から十二分に明白になるか、または以下に記載の本発明の実施によって知ることができる。
本発明の上述の特徴および他の特徴が得られる方法を例示するために、添付の図面に例示されている本発明の特定の実施例を参照することによって、上で簡単に説明した本発明をさらに詳細に説明する。これらの図面は本発明の典型的な実施例を示すものにすぎず、したがって範囲を限定するものと考えるべきではないという理解の下に、添付の図面を使用することによって、本発明をさらに具体的にまた詳細に記述しかつ説明する。

本発明は、疾患の危険度または存在を評価するために診断上の補助として使用可能な、黄斑のカロチノイド色素のような生物組織中のカロチノイドおよび関連する化学物質のラマン画像を作成する方法と装置に関する。本発明は、被験者が眼球の中の黄斑組織に関する疾患を患う危険度を評価するのに特に適切である。本発明のラマン画像作成技法は、生体被験者中の黄斑カロチノイド水準を非観血的に、迅速に、かつ客観的に決定する。したがって、本発明は、個人の進行中の老化関連黄斑変性に関する危険度を評価し、かつ同変性の予防計画案を決定する際の助けになり得る、大きな母集団に応用可能な貴重な診断上の情報を提供する。

本発明は、ラマン画像を作成するために、眼球の中の黄斑カロチノイドなど、生物組織中のカロチノイドおよび同様な物質を識別しかつ定量化するために使用される共鳴ラマン分光法の技法を用いる。カロチノイドの場合には、濃度を測定する現在の唯一の方法は、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）化学分析法を用いるものであり、この方法は、膨大な量の生検組織と長時間の試料調製が必要である欠点を有する。さらには、ＨＰＬＣ法および伝統的なラマン分光法は、本来的に単点測定であり、したがって有用な濃度マップまたは画像を作成することができない。本発明は、伝統的なラマン分光法計器よりも実質的に低コストである利点をさらに有する。

本発明の技法では、実質的な単色光が組織上に向けられ、次いで、その散乱光がスペクトル濾過されて検出される。この散乱光は、レイリー散乱光とラマン散乱光の両方を含む。レイリー散乱光は、弾性的に散乱される光である。すなわち、それは入射光と同じ波長で散乱される。散乱光のほとんどは、弾性的に散乱される。この光のわずかな残りは、非弾性的な様式で散乱され、したがって、入射光とは振動数が異なる。このような非弾性的に散乱される光は、ラマン信号を形成する。入射光とラマン散乱光の間における振動数の差は、ラマンシフトとして知られ、典型的には、波数の差（または振動数もしくは波長の差）として測定される。ラマンシフトの大きさは、存在する化学物質の種類を表すものであり、ラマン信号のピークの強度は、化学物質の濃度に直接対応する。ラマンシフトは、使用される入射光の波長に依存せず、したがって、この技法では、任意の強力で適切な単色光を使用することができる。

このようにラマン分光法が有用な理由の１つは、特定の波数の変化が、特定の化学構造に関連する振動または回転エネルギー状態の一定のモードに対応し、したがって、これらの化学構造の「指紋」を提供するからである。例えば、黄斑カロチノイド種のルテインおよびゼアキサンチンは、固有のラマン散乱を示し、その結果は、明確なスペクトル位置、信号強さ、およびスペクトル幅として現出する。ルテインおよびゼアキサンチンは、１１６０ｃｍ^−１および１５２５ｃｍ^−１付近の強力で固有のラマン散乱信号と、１０００ｃｍ^−１付近のより弱い信号を発生する。さらに、得られるピークのいずれか１つまたはすべての分離が可能である。ルテインおよびゼアキサンチンは、交互する炭素−炭素の二重結合（Ｃ＝Ｃ）と単結合（Ｃ−Ｃ）を有する、ラマン活性のπ電子共役炭素主鎖を特徴とするポリエン様の分子である。両色素では、電子吸収は、強力であり、約４５０ｎｍに集中する広帯域（約１００ｎｍの幅）内で生じ、かつ約１４００ｃｍ^−１の間隔を有する分解振電下部構造を示す。これらの分子中のより高いエネルギー準位の秩序化によって、蛍光遷移がパリティ禁制される。これによって、蛍光を妨害する恐れもなく共鳴ラマン散乱が実行可能になる。

本発明に用いられる共鳴ラマン分光法の技法は、本来的に弱いラマン信号を測定することに伴う困難を克服する助けになる。共鳴ラマン分光法では、対象とする分子の電子遷移に対応する吸収帯の中にある波長の光源が利用される。対象とする分子の電子吸収振動数に入射光を近づけて共鳴させることによって、ラマン信号は実質的に増強されるが、これは、より低い入射レーザ出力を使用できる利点を提供し、その結果として、このような低い出力は、組織損傷を最小限にし、また検出要件の感度に要求される厳しい条件の緩和をもたらす。

共鳴ラマン分光法に関するさらなる詳細が米国特許第６，２０５，３５４号に説明されており、その開示は参照として本明細書に組み込まれる。
本発明の方法と装置は、共鳴ラマン分光法を利用して、生体被験者の黄斑カロチノイドを測定する際に特に有用である。網膜を低い光出力にさらすことによって、黄斑組織をそれほど傷めることなく、使用可能な黄斑カロチノイドのラマン信号を発生させる。

本発明による、黄斑カロチノイドの空間分布と濃度水準の画像を作成する方法は、１つまたは複数の検出すべき黄斑カロチノイドに関する波長変化を伴うラマン応答を引き起こす光源を入手することを含む。光が、黄斑カロチノイド水準を測定すべき眼球の黄斑組織上に光源から向けられる。黄斑組織から散乱した光が回収されるが、この散乱光は弾性散乱光および非弾性散乱光を含む。非弾性散乱光は、１つまたは複数の黄斑カロチノイドに対応する複数のラマン信号を有する。弾性散乱光は除去され、非弾性散乱光中のラマン信号の空間位置と強度が分析される。次いで、ラマン信号の画像が作成されるが、その画像は、黄斑組織中の１つまたは複数の黄斑カロチノイドの空間位置と濃度水準を表す。

本発明の方法と装置を使用して、網膜組織中に存在する他の物質の検出、または他の生物組織中のカロチノイドおよび関連物質の検出が可能であることも理解されたい。
同様の構造には同様の参照符号が付けられている図面を参照すると、図１は、全体的に１０によって示されている、本発明の装置の１実施例を示す模式図である。装置１０は、共鳴ラマン分光法を用いて、黄斑のカロチノイドのような組織中のカロチノイド水準を測定しかつ画像を作成するように構成されている。装置１０は、１実施例では水銀アーク燈であり得る光源１２を備える。別法として、光源１２は、低出力の固体レーザまたはアルゴンイオンレーザのような単色に近い光を発生するための他の装置を含んでもよい。光源１２は、対象とするカロチノイドの吸収帯と重なる波長の光を発生するように構成されている。光源１２からの光は、黄斑組織を破壊することもなく、また黄斑組織中のカロチノイド水準も実質的に変更することがない強度を有することが好ましい。

光源１２は、光学モジュール１４のような光の送出および回収手段と光学的に連通するが、この光学モジュールは、測定すべき組織に光を向け、かつその組織からの散乱光を回収するための様々な光学素子を含むことができる。図１に示すように、光学モジュール１４は、光ファイバ束１６または他の適切な光伝送装置など、光伝送装置を介して光源１２と光学的に連通可能である。光学モジュール１４中に伝送された光は、散光器（図示せず）、コリメータ集光レンズ１８、帯域通過フィルタ２０、ダイクロイックまたはホログラフィックビーム分割器２２、およびレンズ２４（光を被験者の組織上に合焦する）を含めて、内部の様々な光学素子によって透過されるかまたは反射される。レンズ２４は、被験者の組織から散乱されて戻ってくる光も回収し、このような光はビーム分割器２２を介して透過される。

透過された光は、回収された散乱光からラマンシフト光を選択する波長選択手段によって、ラマンピーク、例えば、対象とするカロチノイドのＣ＝Ｃ収縮振動数を選択するために濾過される。例えば、波長選択手段は、図１に示す狭帯域干渉フィルタ２８および広帯域干渉フィルタ３０のような、１つまたは複数の波長選択装置、または完全遮断狭帯域フィルタのような他の光学フィルタ構成を含むことができる。さらには、波長選択装置は、音響光学的可同調フィルタ（ＡＯＴＦ）または分散に基づく装置（例えば、分光写真器）等々でもよい。

フィルタ２８は、ラマンピークに対応する波長位置（「オンピーク」位置）にあるラマン散乱光を交互に透過したり、またはラマンピークにわずかに達しない波長位置（「オフピーク」位置）にある背景光を透過したりするように角度調節可能である。別法として、波長選択手段は、オンピーク波長位置にあるラマンシフト光を同時に透過し、かつオフピーク波長位置にある光を透過するように適合可能である。フィルタ２８の帯域幅は、ラマン信号処理量を最大化するために、励起光の帯域幅と一致するように選択される。ビーム分割器２２がホログラフィックビーム分割器であるとき、ビーム分割器２２は、励起光の約９９％を反射し、ラマンシフト光の約９０％を透過するように選択可能である。

光学モジュール１４は、光学検出装置３２のような検出手段と光学的に連通するが、この光学検出装置は、ラマン散乱光の強度を、眼球または他の組織におけるカロチノイドに固有の振動数のような、対象とする振動数範囲内の振動数の関数として測定可能である。光学検出装置３２は、例えば、黄斑組織からのラマン散乱光を、ＣＣＤ（電荷結合素子）カメラ３８の画素アレイ３６のような光学検出器アレイ上に結像するために使用されるカメラレンズ３４を含むことができる。

ラマンシフト光の中のラマン信号の空間位置と強度を決定する分析手段は、光学検出装置３２に作用的に接続されている。この分析手段は、パーソナルコンピュータ４０のようなコンピュータまたは他のデータ処理装置でよい。検出された光は、光学検出装置３２によって、信号データを処理するためのコンピュータ４０に伝送される信号に変換される。例えば、信号データは、空間位置に対する、ＣＣＤ画素アレイによって受け取られたラマン信号水準の出力画像を作成するソフトウェアによって処理可能である。このような出力画像は、濃淡階調または擬似（偽性）色「正面」マップおよび／または空間構造図（「表面プロット」）として表示可能である。様々な出力装置などの出力手段を使用してラマン信号の画像を作成することが可能であり、その画像は１つまたは複数のカロチノイドの空間分布と濃度水準を表す。出力装置を使用してラマン画像を表示したり、または印刷したりすることができる。例えば、画像は、コンピュータのモニタ４２のような視覚表示モニタ上に表示可能であるし、または画像を印刷するためにコンピュータ４０に接続されたプリンタに送出可能である。

装置１０の動作時に、光ビーム５０が光源１２から発生され、光ファイバ束１６を介して光学モジュール１４の中に誘導される。例えば、光ビーム５０は、約３５０ｎｍから約５５０ｎｍ、好ましくは約４２５ｎｍから約５００ｎｍまでの波長範囲内で発生され得る。このような波長は一般に、黄斑カロチノイドの吸収特性に対応する。光ビーム５０は、約５マイクロメートルから約１０ミリメートル、好ましくは約１０マイクロメートルから約５ミリメートルまでの照射スポットサイズで発生され得る。光ビーム５０はまた、約０．００１秒から約１００秒、好ましくは約１秒から約１０秒までの照射時間を有するように発生され得る。ビーム５０の出力密度または光の強度は、約１ｍＷ／ｃｍ^２から約２００ｍＷ／ｃｍ^２、好ましくは約５ｍＷ／ｃｍ^２から約５０ｍＷ／ｃｍ^２であり得る。

光ビーム５０は、散光器を介して送られ、光学モジュール１４中の集光レンズ１８によって平行にされる。次いで光ビーム５０は、フィルタ２０を通過することによってスペクトル濾過され、ビーム分割器２２によって反射され、かつレンズ２４によって被験者の眼球６０のような被験者の組織上に投射される。眼球の組織における光の位置は、適切な光学系を介して操作者により直接確認することによって検証可能である。光は、黄斑カロチノイド色素が沈着する主領域を網羅するために選択的に向けられることが好ましい。

眼球６０のような被験者の組織から散乱されて戻ってくる光は、レンズ２４によって回収され、ビーム分割器２２を介して透過され、干渉フィルタ２８および３０を通過することによって濾過される。次いで濾過された光は、光学検出装置３２に進み、そこでレンズ３４がラマン散乱光をＣＣＤカメラ３８の検出器画素アレイ３６上に合焦する。次いで検出された光は、信号データを処理するためにコンピュータ４０に伝送される信号に変換され、そこでラマン信号水準（すなわち、ラマンピーク信号と背景散乱光の間の差）が決定される。次いで、被験者の組織におけるカロチノイドの空間分布と濃度を表す、ラマン信号水準の画像が、コンピュータ４０によって視覚表示器またはプリンタに出力される。

図２は、生体眼球中の黄斑カロチノイドのような、組織中のカロチノイド水準を測定しかつ画像作成するための、全体的に１００で示す、本発明の装置の別の１実施例を示す模式図である。装置１００は、光源１２と、光ファイバ束１６を介して光源１２と光学的に連通する光学モジュール１４を含めて、装置１０に関して上に論じたものと同様の構成要素を含む。装置１００で使用される光源１２の配向は、装置１００を被験者の患者の生きた眼球を測定するのにさらに適切にするために、装置１０で使用された配向に対して変更されている。光学モジュール１４は、コリメータ集光レンズ１８、帯域通過フィルタ２０、およびダイクロイックまたはホログラフィックビーム分割器２２のような様々な光学素子を含む。装置１０で使用されたレンズ２４は、そのレンズ２４が生体のヒトの眼球１１０の中にあるヒトの眼球レンズによって置き換えられているので、装置１００では必要とされない。したがって、光ビーム１２０は、被験者の患者に光を見つめさせることによって、眼球１１０の黄斑領域上に投射可能である。

装置１００の動作時に、眼球１１０から散乱されて戻ってくる光は、ビーム分割器２２を介して透過される。この透過光は、回収した散乱光からラマンシフトした光を選択するための波長選択手段によって、ラマンピーク、例えば、対象とするカロチノイドのＣ＝Ｃ収縮振動数を選択するように濾過される。例えば、波長選択手段は、狭帯域干渉フィルタ２８および広帯域干渉フィルタ３０、または他の光学フィルタ構成を含むことができる。

装置１００の光学モジュール１４は光学検出装置３２と光学的に連通するが、この検出装置は、例えば、黄斑組織からのラマン散乱光をＣＣＤカメラ３８の画素アレイ３６上に結像するために使用されるカメラレンズ３４を含み得る。コンピュータ１４０または他のデータ処理装置は、ラマンシフト光の中のラマン信号の空間位置と強度を決定するために、光学検出装置３２に作用的に接続されている。コンピュータ１４０は、ラマン信号水準の画像を作成するために、視覚表示器およびプリンタなどの１つまたは複数の出力装置を含むのが典型である。

図３は、黄斑のカロチノイドのような組織中のカロチノイド水準を測定しかつ画像作成するための、全体的に２００で示す、本発明の装置の他の１実施例を示す模式図である。装置２００は、連続（逐点）データ回収技法を用いるように構成されている。装置２００は、好ましくはレーザ２１０である光源と、このレーザ２１０と光学的に連通する光学モジュール２２０を含む。光学モジュール２２０は、コリメータ集光レンズ１８、帯域通過フィルタ２０、およびダイクロイックまたはホログラフィックビーム分割器２２を含めて、装置１０の光学モジュール１４に関して先に論じたような光学素子を備える。

さらには、光学モジュール２１０は、ビーム分割器２２と生体のヒトの眼球１１０位置の間に位置決めされた走査光学素子２３０のような走査型機器を含む。走査光学素子２３０は、眼球１１０の黄斑領域を横切るｘ−ｙ格子中のビームを走査するために、レーザ２１０からの光ビーム２４０の向きを操作する。走査光学素子２３０は、ラスタ走査のような、ミラー構成またはビームの向きを操作するための他の標準的な技法を使用することができる。ビームの走査は、黄斑領域のそれぞれの別個の走査点に基づいてデータが生成される連続データ回収技法を用いることができる。

装置２００の動作時に、眼球１１０から散乱されて戻ってくる光のそれぞれのビームは、ビーム分割器２２を介して透過される。この透過光は、波長選択手段によって、ラマンピーク、例えば、対象とするカロチノイドのＣ＝Ｃ伸縮振動数を選択するように濾過される。例えば、波長選択手段は、狭帯域干渉フィルタ２８および広帯域干渉フィルタ３０、または他の光学フィルタ構成を含むことができる。

装置２００の光学モジュール２２０は、光増殖管（ＰＭＴ）またはアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）であり得る別個の光検出器２５０のような、検出手段と光学的に連通する。レンズ２５２は、ピンホール開口２５４を介して光検出器２５０上に、黄斑からのラマン散乱光を合焦するように構成されている。コンピュータ１４０または他のデータ処理装置は、黄斑中のそれぞれの走査点におけるラマンシフト光の中のラマン信号の強度を記録するために、光検出器２５０に作用的に接続されている。

装置２００の動作時に、レーザ２１０からの光ビームは、走査光学素子２３０によって黄斑組織を横切って逐点的に順次に走査されて、組織の画像に処理するためのラマンデータを生成する。別法として、装置２００の光学組立体全体が、黄斑組織を横切って逐点的に光ビームを順次に走査するように構成可能である。

図１〜３の実施例は、波長選択が、図示したように装置の検出側ではなく、装置の励起（光源）側で実行可能なように変更可能であることを理解されたい。主要な問題は、それぞれの画像データ点に関するラマンシフト光（「オンピーク」）と背景光（「オフピーク」）の間の差を測定することにあるので、波長選択装置が検出側にあるのかそれとも励起側にあるのかは問題ではない。例えば、固定式の非調節フィルタがビーム分割器と検出器の間に位置決め可能であり、かつ光源フィルタが角度調節型の波長選択フィルタであり得る。これによって、ラマンピークを非調節フィルタの通過帯域の内と外に交互にシフトさせて、それぞれの画像データ点に関してラマン散乱光と背景光の差を同じように算定することができよう。

本発明の方法と装置は、共鳴ラマン効果に基づいて分光データを簡単にかつ低コストで入手しやすくする。得られるデータを使用して、選択された化学化合物の濃度と分布に基づいて高度の空間分解能画像を作成する。このように本発明によって作成される画像は、黄斑色素構造と、臨床ばかりでなく基礎的な生物学的応用例の間の相関を可能にする。

本発明によってラマン検出による画像作成モードが作成可能になることによって、数多くの利益および利点が提供される。本発明は、老化関連黄斑変性ならびに他の先天的および後天的網膜変性の研究に利用可能である。例えば、本発明は、視覚的および黄斑の色素分布の空間構造における個人的なばらつきを考察するための母集団研究に使用可能である。臨床研究では、それは網膜の老衰に関する意味合いを含み、またＡＭＤ患者における視覚喪失の空間範囲と黄斑色素の空間構造を相関させることもできよう。例えば、本発明は可能性として、ＡＭＤによる視覚喪失の恐れがある大きな母集団の黄斑色素を測定するための迅速な選別方法に使用可能である。基礎的な研究では、黄斑色素の個人的な空間的ばらつきは、早期視覚処理のモデルおよび色覚の定量モデルに関して重要であり得る。

本発明はまた、黄斑色素の絶対的な水準および空間構造における個人差に関する詳細な情報を提供する。臨床応用例では、このような情報を使用して、食事および喫煙などの生活様式の変数、ならびに中心窩の幅、無血管野の大きさ、網膜の厚み、および円錐体の密度などの解剖学的パラメータを網膜の病状に相関させることができる。

本発明はまた、いくつかの他の疾患の非接触で、非観血的診断を行うための臨床的状況に応用可能である。例えば、いくつかのカロチノイドおよび関連する化合物の濃度と分布は、様々な疾患の存在または危険性を示すものと見なされており、したがって本発明を診断手段として使用して、これらの疾患を迅速にかつ無痛で検査したり、またはそれらの治療効果を追跡したりできる。

本発明は、黄斑カロチノイドの画像作成に限定されないことを理解されたい。本発明の方法は、網膜内部に集中しかつ沈着する、βカロチンならびに、カンタキサンチン、アスタキサンチン、クロロキン、ハイドロキシクロロキン、チオリダジン、およびタモキシフェンのような薬物の測定にも応用可能である。さらに、本発明を使用して皮膚または他の組織中のカロチノイドおよび他の関連物質を撮像することもできる。

以下の実施例は、本発明を例示するために挙げられており、本発明の範囲を限定しようとするものではない。

先に論じた、眼球のような生物組織中のカロチノイドのラマン測定に適切な図１に示されている装置と同様の実験装置を組み立てて次のように動作させた。水銀アーク燈からの光は、光ファイバ束を介して光の送出および回収モジュールの中に通した。このアーク燈からの光は、狭帯域幅の青色光であった。このモジュールの内側で、光は、散光器を介して送られ、集光レンズによって平行にされ、さらに１．２５ｎｍの帯域通過フィルタによって４８８ｎｍでスペクトル濾過され、ホログラフィックビーム分割器によって反射され、かつレンズ（３０ｍｍの焦点長さ）によって、摘出した眼杯の中心窩上を中心とする直径約４ｍｍのスポット上に投射された。中心窩における青色濾過した励起光出力は、３２０μＷであり、２．５５ｍＷ／ｃｍ^２の励起光の強度に対応するものであった。網膜から散乱されて戻ってきた光は、レンズによって回収され、ビーム分割器を介して透過され、Ｃ＝Ｃ伸縮振動数（４８８ｎｍ励起の場合は５２７ｎｍ）で濾過された。この濾過は、狭帯域干渉フィルタと広帯域干渉フィルタ（それぞれ１ｎｍと１０ｎｍの帯域幅を有する）の組合せによって行われた。

カメラレンズを使用して、ＣＣＤカメラ（Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．社のＭｏｄｅｌ ＳＴ−６ｕｖ画素サイズ２３×２７μｍ）の３７５×２４１画素アレイ上にラマン散乱光を結像し、１６ビットの濃淡階調でデジタル画像を得ることができた。狭帯域フィルタは、５２７ｎｍ（「オンピーク」位置）のラマン散乱光を交互に透過させたり、またはわずかにラマンピークに達しない５２９ｎｍの波長位置（「オフピーク」位置）の背景光を透過させたりするように角度調節された。狭帯域フィルタの帯域幅は、ラマン信号の処理量を最大にするために、励起光の帯域幅と一致するように選択された。励起光の約９９％を反射しかつラマンシフト光の約９０％を透過するホログラフィックビーム分割器が使用された。ラマン励起波長（４８８ｎｍ）で１０^−６の吸光度を与えるように、ビーム分割器と狭帯域／広帯域フィルタの反射率が組み合わされた。

ヒトの網膜中の黄斑カロチノイド色素の空間分布と濃度水準を示すラマン画像が作成された。このラマン画像は、２つの画像データセット間の差を使用して作成された。第１のデータセットは「オンピーク」位置に調整された狭帯域フィルタによって得られ、第２のデータセットは、このフィルタを「オフピーク」位置に調整することによって得られた。両方のデータセットに関して、同一の露光時間（２５秒）と画像作成条件が適用された。すべてのデータセットは、ＣＣＤ画素アレイによって受け取られたラマン信号水準を空間位置の関数として表示できる、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ画像１．６２）から入手したソフトウェアによって処理された。濃淡階調および擬似（偽性）色の「正面」マップならびに空間構造図（表面プロット）が作成された。

１２個の摘出された死後のヒトの眼杯試料が、実施例１で説明された装置を使用して測定され、絶対水準と空間的なばらつきの両方に関して、有意に変化するラマン画像がもたらされた。このようなばらつきには、回転非対称、黄斑色素分布の様々な空間範囲幅、いくつかの場合では、中心黄斑の色素水準の欠乏さえも含まれた。１つの試料測定の結果が図４に正面マップとして示されており、ヒトの中心窩中の黄斑色素分布のラマン画像を図示する。ラマンデータ点の数は６，２３２であり、網膜上の空間分解能は５５×４３マイクロメートルであった。相対的なラマン信号強度は、図４の左側に示されている階調にしたがって符号化された濃淡階調である。図４の画像は、非対称であり、かつ中心においてではなく、中心から離れたところで最大水準に達する黄斑色素分布を明らかにする。黄斑色素の水準は、ノイズフロアと分布極大値に比較して、少なくとも１桁異なっていた。

図５では、図４のデータが、黄斑色素の分布の空間構造を強調するために、表面プロット画像として示されている。相対的なラマン信号強度は、図５の左側に示されている階調にしたがって符号化された濃淡階調である。このラマン画像は、非対称的で円錐形の色素分布を明らかに示すが、中心域（約１ｍｍの最大半減の全幅）全体にわたって集中する高い色素水準と円錐の翼部に向かって急速に減少する色素水準を有する。分布の中心は、色素濃度の約半分の「穴」の深さを有する、直径２５０μｍの色素密度中の欠乏部を有するのが見える。

実施例１で説明した装置を使用する別の試料測定によって、空間構造的な表面プロット画像である図６に示す、ヒトの中心窩における黄斑色素分布のラマン画像が作成された。図６のラマン画像は、尾根形の色素分布を明らかにし、高い色素分布が狭い領域（約０．２５ｍｍの最大半減の全幅）に集中し、中心に欠乏部はいずれもなかった。図６に示すピーク黄斑色素水準は、図５のそれとほとんど同じ高さであるが、この中心窩における色素の全体量は、約３分の１にすぎない。

図７および８は、それぞれ図５および６の２つの色素分布画像に関するラマン信号強度の空間的ばらつきを示すグラフである。図７および８のグラフは、図５および６に示した分布の中心を通過する水平線に沿って作成された。

図４〜６の画像は、本発明の共鳴ラマン分光法の技法が、非レーザ光源によるラマン励起を利用して、適切な信号対雑音比を有する、ヒトの眼杯中の生理学的な黄斑色素分布の画像が作成可能であることを証明する。このようなラマン画像の作成は、黄斑色素分布のミクロンスケールの空間情報を提供し、かつ色素水準を定量化する。

本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で実施可能である。説明された実施例は、あらゆる態様において、例示であり、限定と見なされるべきではない。したがって、本発明の範囲は、以上の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求範囲の均等性の趣旨と範囲の中に入る変形は、すべて特許請求範囲内に包含される。

並行していくつかのラマンデータ点を得るためにＣＣＤアレイ検出器を使用し、生体のまたは摘出されたヒトの組織で使用するようになされている、本発明の装置の１実施例を示す模式図である。 並行してラマンデータを得るためにＣＣＤアレイ検出器を使用し、生体のヒトの眼球で使用するようになされている、本発明の装置の別の１実施例を示す模式図である。 連続して（逐点的に）ラマンデータを得るために別個の光検出器を使用し、生体のヒトの眼球で使用するようになされている、本発明の装置の別の１実施例を示す模式図である。 黄斑色素の分布をマッピングする、１つの摘出したヒト眼杯の黄斑領域におけるヒトの中心窩の正面ラマン画像を示す図である。 黄斑色素分布の空間構造を示す、図４のラマン画像の表面プロットを示す図である。 摘出した別のヒトの眼杯のヒトの中心窩における黄斑色素分布のラマン画像の表面プロットを示す図である。 図５および６の２つの色素分布画像に関するラマン信号強度の空間的ばらつきを示すグラフである。 図５および６の２つの色素分布画像に関するラマン信号強度の空間的ばらつきを示すグラフである。

Claims (45)

1. 黄斑カロチノイドの空間分布と濃度水準の画像を作成する方法であって、
   １つまたは複数の検出すべき黄斑カロチノイドに関する波長変化を伴うラマン応答を引き起こす波長にある光を発生する光源を入手するステップと、
   黄斑カロチノイド水準を測定すべき眼球の黄斑組織上に前記光源からの光を向けるステップと、
   前記黄斑組織から散乱された光を回収するステップであって、前記散乱光は、弾性散乱光および非弾性散乱光を含み、前記非弾性散乱光は、前記１つまたは複数の黄斑カロチノイドに対応する複数のラマン信号を有する、回収するステップと、
   前記弾性散乱光を選択的に除去するステップと、
   前記非弾性散乱光の中の前記ラマン信号の空間位置と強度を分析するステップと、
   前記ラマン信号の画像を作成するステップであって、前記画像は、前記黄斑組織中の前記１つまたは複数の黄斑カロチノイドの空間分布と濃度水準を表す、作成するステップとを含む方法。
2. 前記光源が、前記１つまたは複数の検出すべき前記カロチノイドの吸収帯域に重なる波長にある光を発生する、請求項１に記載の方法。
3. 前記光源が、約３５０ｎｍから約５５０ｎｍまでの波長範囲内にある光を発生する、請求項１に記載の方法。
4. 前記光源からの前記光が、前記黄斑組織を破壊せず、また前記黄斑組織中のカロチノイド水準も実質的に変更しない強度を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記光源が、約５ミクロンから約１０ミリメートルの照射スポットサイズで光を発生する、請求項１に記載の方法。
6. 前記光源が、約０．００１秒から約１００秒の照射時間で光を発生する、請求項１に記載の方法。
7. 前記黄斑組織が、生体被検者の中に存在する、請求項１に記載の方法。
8. 前記非弾性散乱光が、黄斑カロチノイドに固有の振動数で分析される、請求項１に記載の方法。
9. 前記ラマン信号の前記画像が正面マップである、請求項１に記載の方法。
10. 前記ラマン信号の前記画像が空間構造的な表面プロットである、請求項１に記載の方法。
11. 生物組織中のカロチノイドの空間分布と濃度水準の画像を作成する方法であって、
    １つまたは複数の検出すべきカロチノイドに関する波長変化を伴うラマン応答を引き起こす波長にある光を発生する光源を入手するステップと、
    カロチノイド水準を測定すべき生物組織上に前記光源からの光を向けるステップと、
    前記生物組織から散乱された光を回収するステップであって、前記散乱光は、弾性散乱光および非弾性散乱光を含み、前記非弾性散乱光は、前記１つまたは複数のカロチノイドに対応する複数のラマン信号を有する、回収するステップと、
    前記弾性散乱光を選択的に除去するステップと、
    前記非弾性散乱光の中の前記ラマン信号の空間位置と強度を分析するステップと、
    前記ラマン信号の画像を作成するステップであって、前記画像は、前記生物組織中の前記１つまたは複数のカロチノイドの空間分布と濃度水準を表す、作成するステップとを含む方法。
12. 網膜組織中の選択物質の空間分布と濃度水準の画像を作成する方法であって、
    検出すべき物質に関する波長変化を伴うラマン応答を引き起こす波長にある光を発生する光源を入手するステップと、
    前記物質の水準を測定すべき眼球の網膜組織上に前記光源からの光を向けるステップと、
    前記網膜組織から散乱された光を回収するステップであって、前記散乱光は、弾性散乱光および非弾性散乱光を含み、前記非弾性散乱光は、前記物質に対応する複数のラマン信号を有する、回収するステップと、
    前記弾性散乱光を選択的に除去するステップと、
    前記非弾性散乱光の中の前記ラマン信号の空間位置と強度を分析するステップと、
    前記ラマン信号の画像を作成するステップであって、前記画像は、前記網膜組織中の前記物質の空間分布と濃度水準を表す、作成するステップとを含む方法。
13. 画像を作成する装置であって、
    １つまたは複数の検出すべきカロチノイドに関する波長変化を伴うラマン応答を与える波長にある光を発生する光源と、
    光を組織上に向けかつ前記組織からの散乱光を回収するための、前記光源と光学的に連通する光の送出および回収手段と、
    回収された散乱光からラマンシフト光を選択する波長選択手段と、
    前記１つまたは複数の検出すべきカロチノイドに固有の振動数にある前記ラマンシフト光の強度を測定する検出手段と、
    前記ラマンシフト光の中のラマン信号の空間位置と強度を決定する分析手段と、
    前記ラマン信号の画像を作成する出力手段であって、前記画像は、前記１つまたは複数のカロチノイドの空間分布と濃度を表す、出力手段とを備える画像を作成する装置。
14. 前記光源が、前記１つまたは複数の検出すべきカロチノイドの吸収帯域に重なる波長にある光を発生する、請求項１３に記載の画像を作成する装置。
15. 前記光源が、約３５０ｎｍから約５５０ｎｍまでの波長範囲内にある光を発生する、請求項１３に記載の画像を作成する装置。
16. 前記光源が、約５ミクロンから約１０ミリメートルの照射スポットサイズで光を発生する、請求項１３に記載の画像を作成する装置。
17. 前記光源が、約０．００１秒から１００秒の照射時間で光を発生する、請求項１３に記載の画像を作成する装置。
18. 前記波長選択手段が、オンピーク波長位置にあるラマンシフト光を交互に透過するか、またはオフピーク波長位置にある光を透過するように、角度調節されるようになされている、請求項１３に記載の画像を作成する装置。
19. 前記波長選択手段が、オンピーク波長位置にあるラマンシフト光を同時に透過し、かつオフピーク波長位置にある光を透過するようになされている、請求項１３に記載の画像を作成する装置。
20. 前記検出手段が、電荷結合素子カメラ上の光学検出器アレイを含む、請求項１３に記載の画像を作成する装置。
21. 前記検出手段が別個の光検出器を含む、請求項１３に記載の画像を作成する装置。
22. 前記分析手段がコンピュータを含む、請求項１３に記載の画像を作成する装置。
23. 前記出力手段が視覚的表示モニタを含む、請求項１３に記載の画像を作成する装置。
24. 前記出力手段がプリンタを含む、請求項１３に記載の画像を作成する装置。
25. 前記出力手段によって作成された前記画像が、正面マップである、請求項１３に記載の画像を作成する装置。
26. 前記出力手段によって作成された前記画像が、空間構造的な表面プロットである、請求項１３に記載の画像を作成する装置。
27. 画像を作成する装置であって、
    １つまたは複数の検出すべきカロチノイドに関する波長変化を伴うラマン応答を与える波長にある光を発生する光源と、
    前記光源と光学的に連通し、組織上に光を向けかつ前記組織からの散乱光を回収するように構成されている光学モジュールと、
    回収された散乱光からラマンシフト光を選択しかつ透過するように構成された１つまたは複数の波長選択装置と、
    前記１つまたは複数の検出すべきカロチノイドに固有の振動数にあるラマンシフト光の強度を測定するように構成された光学検出装置と、
    前記光学検出装置に作用的に接続され、前記ラマンシフト光の中のラマン信号の空間位置と強度を決定するようになされたデータ処理装置と、
    前記ラマン信号の画像を表示するようになされた出力装置であって、前記画像は、前記１つまたは複数のカロチノイドの空間分布と濃度を表す、出力装置とを備える画像を作成する装置。
28. 前記光源が水銀アーク燈を含む、請求項２７に記載の画像を作成する装置。
29. 前記光源がアルゴンイオンレーザを含む、請求項２７に記載の画像を作成する装置。
30. 前記光源が、約３５０ｎｍから約５５０ｎｍまでの波長範囲内の光を発生する、請求項２７に記載の画像を作成する装置。
31. 前記光源と前記光学モジュールの間の光学的連通が、光ファイバ束によって提供される、請求項２７に記載の画像を作成する装置。
32. 前記光学モジュールが、
    コリメータ集光レンズと、
    前記集光レンズと光学的に連通する帯域通過フィルタと、
    前記帯域通過フィルタと光学的に連通するダイクロイックまたはホログラフィックビーム分割器とを備える、請求項２７に記載の画像を作成する装置。
33. 前記光学モジュールが、前記ビーム分割器と光学的に連通し、光を前記組織上に合焦しかつ前記組織から散乱されて戻ってくる光を回収するように構成されているレンズをさらに備える、請求項３２に記載の画像を作成する装置。
34. 前記光学モジュールが、前記ビーム分割器と光学的に連通し、前記組織を横切って逐点的に光ビームを順次に走査するように構成されている走査型機器をさらに含む、請求項３２に記載の画像を作成する装置。
35. 前記１つまたは複数の波長選択装置が、狭帯域干渉フィルタおよび広帯域干渉フィルタを含む、請求項２７に記載の画像を作成する装置。
36. 前記狭帯域干渉フィルタが角度調節されるようになされている、請求項３５に記載の画像を作成する装置。
37. 前記１つまたは複数の波長選択装置が、完全遮断狭帯域フィルタを含む、請求項２７に記載の画像を作成する装置。
38. 前記１つまたは複数の波長選択装置が、音響光学的可同調フィルタ、および分散に基づく装置からなる群から選択される、請求項２７に記載の画像を作成する装置。
39. 前記光学検出装置が、電荷結合素子カメラ上の光学検出器アレイを含む、請求項２７に記載の画像を作成する装置。
40. 前記光学検出装置が別個の光検出器を含む、請求項２７に記載の画像を作成する装置。
41. 前記別個の光検出器が、光増殖管、およびアバランシェフォトダイオードからなる群から選択される、請求項４０に記載の画像を作成する装置。
42. 前記別個の光検出器の前に配置されたピンホール開口をさらに備える、請求項４０に記載の画像を作成する装置。
43. 前記データ処理装置がコンピュータを含む、請求項２７に記載の画像を作成する装置。
44. 前記出力装置が視覚的表示モニタを含む、請求項２７に記載の画像を作成する装置。
45. 前記出力装置がプリンタを含む、請求項２７に記載の画像を作成する装置。

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