JP2005102628A - Method for immobilization and collection of cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、感熱応答性ポリマーを用いた細胞の固定化および採取方法に関する。 The present invention relates to a cell immobilization and collection method using a thermosensitive polymer.
ポリマーをコーティングして生体材料を固定化する方法については報告があり、ポリマーとして感熱応答性ポリマーを用いることも知られている(特開2003-102466号公報(特許文献1)、特開平9-23876号公報(特許文献2))。 There is a report on a method for immobilizing a biomaterial by coating a polymer, and it is also known to use a thermosensitive polymer as a polymer (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-102466 (Patent Document 1), Japanese Patent Laid-Open No. No. 23876 (Patent Document 2)).
一方、細胞を1つ1つのレベルで特定し、選別し、選別された細胞を用いる試みがなされている。例えば、１つ１つのリンパ球の抗原特異性を個別に検出し、さらに検出された1つの抗原特異的リンパ球を回収し、回収された1つの抗原特異的リンパ球を用いて、例えば、抗体を製造することが検討されている（民谷ら、BIO INDUSTRY, p60-67, Vol.20, No.7, 2003 (非特許文献1)。
しかし、従来は、１つ１つのリンパ球の抗原特異性を個別に検出し、さらに検出された抗原特異的リンパ球を回収することは容易でなかった。非特許文献1では、細胞単位で細胞を特定することが確認されたと記載され、かつ特定された細胞を回収することも可能であると記載されている。しかし、実際に1つの細胞を回収するとなると、熟練者が相当の注意を図って初めて可能なことであり、この方法を汎用するには、さらなる改良が求められていた。特に、集積度を挙げたチップでは、細胞を格納するウェル間の距離が非常に短くなり、狙った細胞のみを他の細胞の混入なしに確実に回収することは、容易ではなかった。 However, conventionally, it was not easy to individually detect the antigen specificity of each lymphocyte and collect the detected antigen-specific lymphocytes. Non-Patent Document 1 describes that it has been confirmed that cells are identified in cell units, and describes that the identified cells can also be collected. However, when one cell is actually collected, this is possible only by a skilled person with considerable care, and further improvement has been required to make this method universal. In particular, in a chip with a high degree of integration, the distance between wells for storing cells becomes very short, and it is not easy to reliably collect only the targeted cells without mixing with other cells.
また、細胞以外にも、生体組織（組織断片を含む）から、特定の生体組織のみを選択し、回収したいという要望があった。例えば、ある特定の機能を有するタンパク質や酵素を含む(ある活性を示す)組織(または組織断片)のみを回収したい場合があり、その場合、活性染色などを行い、目的物質を含む組織(または組織断片)を回収することがある。 In addition to cells, there has been a demand to select and collect only a specific living tissue from living tissue (including tissue fragments). For example, there are cases where it is desired to collect only tissue (or tissue fragment) containing a protein or enzyme having a specific function (showing a certain activity) .In this case, the tissue (or tissue) containing the target substance is subjected to activity staining or the like. Fragment) may be recovered.
そこで本発明は、特定の細胞または生体組織を個別に、必要により1つずつでも、回収できる新たな方法を提供することを目的とする。
特に、隣り合う細胞間の距離または生体組織間の距離が短い、高い集積度の場合にも、狙った細胞または生体組織のみを他の細胞または生体組織の混入なしに確実に回収することができる方法を提供することが、本発明の目的である。
Accordingly, an object of the present invention is to provide a new method capable of collecting specific cells or biological tissues individually, if necessary, one by one.
In particular, even in the case of a high degree of integration where the distance between adjacent cells or the distance between living tissues is short, only the targeted cells or living tissues can be reliably recovered without mixing with other cells or living tissues. It is an object of the present invention to provide a method.
上記課題を解決するための本発明は以下の通りである。
[請求項１]感熱応答性ポリマーを用いて固定化した細胞または生体組織を感熱応答性ポリマーから採取する方法であって、
感熱応答性ポリマーの採取すべき細胞または生体組織を包埋する部分に、感熱応答性ポリマーの下限臨界溶解温度未満の温度の液体を、採取すべき細胞数または生体組織数に応じた量で供給し、次いで、前記液体を供給した感熱応答性ポリマーの部分から細胞または生体組織を採取する前記方法。
[請求項２]採取すべき細胞数または生体組織数が１である請求項１に記載の方法。
[請求項３]液体の供給量が0.5〜5マイクロリットルである請求項２に記載の方法。
[請求項４]感熱応答性ポリマーが基板上に層として設けられている請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
[請求項５]感熱応答性ポリマーがウェルを有する基板上の少なくともウェル中に設けられている請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
[請求項６]各ウェル中の感熱応答性ポリマーに１つの細胞または１つの生体組織が包埋している請求項５に記載の方法。
[請求項７]液体の供給及び細胞または生体組織の採取を同一のマイクロピペットで行う請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
[請求項８]感熱応答性ポリマーがN-イソプロピルアクリルアミドであり、下限臨界溶解温度３２℃である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
The present invention for solving the above problems is as follows.
[Claim 1] A method of collecting cells or living tissue immobilized using a thermosensitive polymer from the thermosensitive polymer,
Supply liquid with a temperature lower than the lower critical solution temperature of the thermosensitive polymer to the part of the thermosensitive polymer to embed the cell or biological tissue to be collected in an amount corresponding to the number of cells or biological tissue to be collected. Then, the method of collecting cells or living tissue from a part of the thermosensitive polymer supplied with the liquid.
[2] The method according to [1], wherein the number of cells or biological tissues to be collected is 1.
[3] The method according to [2], wherein the supply amount of the liquid is 0.5 to 5 microliters.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the thermosensitive polymer is provided as a layer on the substrate.
[5] The method according to any one of [1] to [3], wherein the thermosensitive polymer is provided in at least the well on the substrate having the well.
[6] The method according to [5], wherein one cell or one biological tissue is embedded in the thermosensitive polymer in each well.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the supply of liquid and the collection of cells or biological tissue are performed with the same micropipette.
[8] The method according to any one of [1] to [7], wherein the thermosensitive polymer is N-isopropylacrylamide and has a lower critical solution temperature of 32 ° C.
本発明によれば、特定の細胞または生体組織を個別に、必要により1つずつでも、回収できる新たな方法を提供することができる。
特に、本発明によれば、隣り合う細胞間の距離または生体組織間の距離が短い、高い集積度の場合にも、狙った細胞または生体組織のみを他の細胞または生体組織の混入なしに確実に回収することができる。
According to the present invention, it is possible to provide a new method capable of recovering specific cells or living tissues individually, even if one by one.
In particular, according to the present invention, even when the distance between adjacent cells or the distance between living tissues is short and the degree of accumulation is high, it is possible to ensure that only the targeted cells or living tissues are not mixed with other cells or living tissues. Can be recovered.
本発明の方法では、例えば、ガラス上などでは吸着が強くなり過ぎて採取困難な細胞または生体組織でも、細胞または生体組織にダメージを与えることなく、目的とする細胞または生体組織のみを迅速にかつ簡単に採取できる。 In the method of the present invention, for example, even for cells or biological tissues that are difficult to be collected due to excessive adsorption on glass or the like, only the target cells or biological tissues are rapidly and without damaging the cells or biological tissues. Easy to collect.
本発明は、感熱応答性ポリマーを用いて固定化した細胞または生体組織を感熱応答性ポリマーから採取する方法である。そして、本発明は、感熱応答性ポリマーの採取すべき細胞または生体組織を包埋する部分に、感熱応答性ポリマーの下限臨界溶解温度未満の温度の液体を、採取すべき細胞数または生体組織数に応じた量で供給し、次いで、前記液体を供給した感熱応答性ポリマーの部分から細胞または生体組織を採取することを特徴とする。 The present invention is a method for collecting cells or living tissue immobilized with a thermosensitive polymer from the thermosensitive polymer. Then, in the present invention, a liquid having a temperature lower than the lower critical solution temperature of the heat-responsive polymer is embedded in the portion of the cell or biological tissue to be collected of the heat-responsive polymer, and the number of cells or biological tissue to be collected. The cell or the living tissue is collected from the portion of the thermosensitive polymer supplied with the liquid.
本発明の方法で用いる感熱応答性ポリマーは、感熱応答性を有するポリマー、即ち、温度に応答性を有するポリマーであれば制限はない。感熱応答性ポリマーは、例えば、N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）であることができる。N-イソプロピルアクリルアミドの下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）は３２℃である。N-イソプロピルアクリルアミド以外に感熱応答性ポリマーとして利用できるポリマーとしては、例えば、以下のものを挙げることができる。 The heat-responsive polymer used in the method of the present invention is not limited as long as it is a polymer having heat-responsiveness, that is, a polymer having responsiveness to temperature. The thermosensitive polymer can be, for example, N-isopropylacrylamide (NIPAAm). The lower critical solution temperature (LCST) of N-isopropylacrylamide is 32 ° C. Examples of polymers that can be used as heat-sensitive polymers other than N-isopropylacrylamide include the following.
本発明においては、使用用途に応じて、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）の異なる感熱応答性ポリマーを選択し、細胞の固定化及び回収をすることができる。また、ＬＣＳＴの異なる感熱応答性ポリマーを複数組み合わせて、ＬＣＳＴを調整することもできる。 In the present invention, a thermosensitive polymer having a different lower critical solution temperature (LCST) can be selected depending on the intended use, and cells can be fixed and recovered. In addition, LCST can be adjusted by combining a plurality of heat-responsive polymers having different LCSTs.
感熱応答性ポリマーとしてN-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）を用いる細胞の固定化及び採取方法について説明する。 A cell immobilization and collection method using N-isopropylacrylamide (NIPAAm) as a thermosensitive polymer will be described.
32℃前後で膨潤収縮する感熱応答性N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）ポリマーを、基板、例えば、スライドグラスにコーティングする。ポリマーのコーティング量は、例えば、5〜10mg/m2の範囲とすることができる。あるいは、コーティング層の厚みは、例えば、20〜100nmの範囲であることができる。本発明においては、感熱応答性ポリマーが基板上に層として設けられている態様以外に、感熱応答性ポリマーがウェルを有する基板上の少なくともウェル中に設けられている態様も含まれる。 A substrate such as a slide glass is coated with a heat-responsive N-isopropylacrylamide (NIPAAm) polymer that swells and shrinks at around 32 ° C. Coating weight of the polymer, for example, can range from 5 to 10 mg / m 2. Alternatively, the thickness of the coating layer can be in the range of 20-100 nm, for example. In the present invention, in addition to the embodiment in which the thermosensitive polymer is provided as a layer on the substrate, an embodiment in which the thermosensitive polymer is provided in at least the well on the substrate having wells is also included.
ウェルを有する基板は、例えば、複数個のマイクロウェルを有し、各マイクロウェルに１個の細胞または生体組織を格納して用いられるマイクロウェルアレイチップであって、前記マイクロウェルは、１つのマイクロウェルに１つの細胞または生体組織のみが格納される形状及び寸法を有するマイクロウェルアレイチップであることができる。上記マイクロウェルは、円筒形、直方体、逆円錐形、若しくは逆角錐形またはこれらの2つ以上を組合せた形状であることができる。また、マイクロウェルの平面形状に内接する最大円の直径が、マイクロウェルに格納しようとする細胞または生体組織の直径の1〜5倍の範囲であり、かつマイクロウェルの深さは、マイクロウェルに格納しようとする細胞または生体組織の高さの1〜5倍の範囲であることができる。 The substrate having wells is, for example, a microwell array chip that has a plurality of microwells and stores one cell or biological tissue in each microwell, and the microwell includes one microwell. It can be a microwell array chip having a shape and size in which only one cell or biological tissue is stored in a well. The microwell may have a cylindrical shape, a rectangular parallelepiped shape, an inverted conical shape, an inverted pyramid shape, or a combination of two or more thereof. The diameter of the largest circle inscribed in the planar shape of the microwell is in the range of 1 to 5 times the diameter of the cell or biological tissue to be stored in the microwell, and the depth of the microwell is in the microwell. It can range from 1 to 5 times the height of the cell or biological tissue to be stored.
ポリマーがコーティングされた基板は、ヒーターなどを用いて温度をN-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）ポリマーが収縮する温度である32℃以上に保ちながら、細胞あるいは生体組織を固定化する。(図1(A)) The substrate coated with the polymer immobilizes cells or living tissue using a heater or the like while maintaining the temperature at 32 ° C. or higher, which is the temperature at which the N-isopropylacrylamide (NIPAAm) polymer contracts. (Figure 1 (A))
基板がマイクロウェルを有する基板である場合、予め各ウェルに細胞あるいは生体組織を格納し、その後に、32℃以上に保持した基板にN-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）ポリマーをコーティングすることもできる。あるいは、マイクロウェル内及び基板表面にN-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）ポリマーを予めコーティングしておき、NIPAAmが膨潤する温度である32℃以上に保ちながら、マイクロウェル内に細胞あるいは生体組織を固定化することもできる。 When the substrate is a substrate having microwells, cells or biological tissues can be stored in advance in each well, and then the substrate kept at 32 ° C. or higher can be coated with N-isopropylacrylamide (NIPAAm) polymer. Alternatively, N-isopropylacrylamide (NIPAAm) polymer is coated in advance in the microwell and on the substrate surface, and cells or biological tissues are immobilized in the microwell while maintaining the temperature at which NIPAAm swells at 32 ° C or higher. You can also.
ここで固定化する細胞は、特に制限されないが、例えば、リンパ球、赤血球だけではなく、接着性を有する細胞(例えば、癌細胞、神経細胞など)にも有効である。また、本発明の方法は、細胞以外にも、生体組織に適用することもできる。生体組織としては、例えば、生体膜（またはその断片）、細胞小器官（オルガネラ）等を挙げることができる。また、生体組織には、生体組織断片を含み、生体組織及び生体組織断片ともに、大きさが、例えば、１〜１００μｍの範囲のものが、本発明の方法の対象とするのに適している。 The cells to be immobilized here are not particularly limited, but are effective not only for lymphocytes and erythrocytes but also for cells having adhesion (for example, cancer cells, nerve cells, etc.). Moreover, the method of this invention can also be applied to a biological tissue besides a cell. Examples of biological tissues include biological membranes (or fragments thereof), organelles (organelles), and the like. The biological tissue includes a biological tissue fragment, and both the biological tissue and the biological tissue fragment having a size in the range of, for example, 1 to 100 μm are suitable for the object of the method of the present invention.
固定化された細胞を採取するために、例えば、マイクロマニュピレーターを用いて目的の細胞付近に、温度が32℃未満の冷水を加える（図1(B)）。これによって、冷水を加えた部分付近のみのNIPAAmを膨潤化（柔らかく）して、冷水を加えたマイクロマニュピレーターを吸引あるいは冷水の供給を停止することで毛細管現象により、目的の細胞のみをそのままマイクロマニュピレーターによって採取することができる（図1(C)）。この方法では、ポリマーコーティング中に細胞が適当な距離を置いて分散していれば、冷水の添加量をコントロールすることで採取すべき細胞数を１とすることができる。ポリマーコーティング中に分散される細胞間の適当な距離は、例えば、15μm以上であり、液体(冷水)の供給量は、例えば、0.5〜5マイクロリットルであることができる。 In order to collect the immobilized cells, for example, cold water having a temperature of less than 32 ° C. is added near the target cells using a micromanipulator (FIG. 1 (B)). As a result, the NIPAAm only in the vicinity of the part where cold water is added is swollen (softened), and the micromanipulator with the cold water is sucked or the supply of cold water is stopped, so that only the target cells are directly intact by the capillary phenomenon. (Fig. 1 (C)). In this method, if cells are dispersed at an appropriate distance in the polymer coating, the number of cells to be collected can be set to 1 by controlling the amount of cold water added. A suitable distance between cells dispersed in the polymer coating is, for example, 15 μm or more, and the supply amount of liquid (cold water) can be, for example, 0.5 to 5 microliters.
本発明の方法では、コーティングされたNIPAAm等の感熱応答性ポリマーの温度を液体の添加で局所的に制御することにより、その膨潤収縮性（疎水親水性）をコントロールし、ターゲット（細胞または生体組織）を簡単に採取できる。特に、本発明では上述のように、液体の供給及びターゲット（細胞または生体組織）の採取を同一のマイクロピペットで行うことが好ましい。 In the method of the present invention, the temperature of the heat-responsive polymer such as coated NIPAAm is locally controlled by the addition of a liquid, thereby controlling the swelling / shrinkage property (hydrophobic hydrophilicity) and the target (cell or biological tissue). ) Can be collected easily. In particular, in the present invention, as described above, it is preferable to supply the liquid and collect the target (cell or biological tissue) with the same micropipette.
尚、本発明の方法においては、採取するターゲット（細胞または生体組織）の特定方法には特に制限はない。例えば、細胞を蛍光標識し、刺激を加えることによって蛍光が変化することで、特定の細胞を検知し、採取することができる。但し、蛍光に限らず、例えば、吸光度（通常の発色反応）を追うこともできる。本発明の方法では、ターゲットの検出方法にどのような方法を採用しても、顕微鏡を使って検出できうる系であれば実施は可能である。また、蛍光標識を使用する場合には、蛍光スキャナー等を使用することもできる。 In the method of the present invention, the method for specifying the target (cell or biological tissue) to be collected is not particularly limited. For example, specific cells can be detected and collected by fluorescently changing the cells by fluorescently labeling the cells and applying a stimulus. However, not only fluorescence, but also absorbance (normal color development reaction) can be followed, for example. In the method of the present invention, any method can be used as long as it can be detected using a microscope, regardless of the target detection method. In addition, when a fluorescent label is used, a fluorescent scanner or the like can be used.
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
スライドガラス程度の厚み（約1mm）のガラス上に、スティック型のヒーターを2本設置し、その間に感熱応答性N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）ポリマーをコーティングしたカバーガラスを置き、2本のヒーターを55℃に設定することによって、ヒーター間の温度を32℃以上（実際には34-37℃）になるように設定し、NIPAAmの環境を疎水環境にする。なお、載せているカバーガラスは、34-35℃になるように制御できていた。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
Two stick-type heaters are placed on a glass slide (thickness: about 1 mm), and a cover glass coated with heat-responsive N-isopropylacrylamide (NIPAAm) polymer is placed between them. By setting the temperature to 55 ° C, the temperature between the heaters is set to 32 ° C or higher (actually 34-37 ° C), and the NIPAAm environment is made hydrophobic. The cover glass placed on the cover glass could be controlled to be 34-35 ° C.
次に、NIPAAmのカバーガラスへの固定化方法は、スピンコーターを用いて、3000rpm、20秒の条件で、0.05-0.1mg/μlのNIPAAmポリマー溶液100μlをカバーガラスへ滴下して、均一にガラス上にコーティングし、恒温槽にて40℃で乾燥させた。出来上がった薄膜は、膜厚が約50nm程度であった。 Next, the NIPAAm is fixed to the cover glass by using a spin coater and dropping 100 μl of 0.05-0.1 mg / μl NIPAAm polymer solution onto the cover glass under the conditions of 3000 rpm and 20 seconds. It was coated on top and dried at 40 ° C. in a thermostatic bath. The completed thin film had a thickness of about 50 nm.
上記のような環境を顕微鏡のステージ上に設定した後、細胞溶液をNIPAAmポリマーでコーティングしたカバーガラス上に展開し、細胞が沈殿するのを待った（約10分間）。細胞間の距離は20-30μmであった。冷水（氷水、約0-4℃）を吸わせたマイクロマニュピレーター（口径20μm程度のガラス製のマニュピレーター）を用いて、顕微鏡を覗きながら目的の細胞付近までマニュピレーターの先端を近づけて、含まれていた冷水を一滴（1μl以下）出して、目的の細胞付近の温度を低下させた。マイクロマニュピレーターから一滴冷水を落とすと目的部分周辺の温度が29℃まで低下することも確認できた。［これによって、目的細胞周辺のNIPAAmポリマーが32℃以下になって膨潤していると考えられる。］その後、すぐにそのマイクロマニュピレーターによって目的の細胞のみを回収した。この際、近くに存在していた（細胞間距離20-30μm）細胞を取ることなく、目的の一細胞を回収できたことを確認した。 After setting the above environment on the microscope stage, the cell solution was developed on a cover glass coated with NIPAAm polymer and waited for the cells to settle (about 10 minutes). The distance between cells was 20-30 μm. Using a micromanipulator (glass manipulator with a diameter of about 20μm) sucked in cold water (ice water, about 0-4 ° C), the tip of the manipulator was brought close to the target cell while looking through the microscope. One drop (1 μl or less) of cold water was discharged to lower the temperature near the target cell. It was also confirmed that when a drop of cold water was dropped from the micromanipulator, the temperature around the target part dropped to 29 ° C. [Thus, the NIPAAm polymer around the target cell is considered to swell at 32 ° C. or lower. Then, immediately, only the target cells were collected by the micromanipulator. At this time, it was confirmed that one cell of interest could be recovered without removing cells that were present in the vicinity (distance between cells 20-30 μm).
本発明の方法によれば、例えば、１つ１つのリンパ球の抗原特異性を個別に検出し、さらに検出された抗原特異的リンパ球を回収することができる。この場合、感染症に対しては、病原体特異的リンパ球を検出し、病原体特異的抗体遺伝子をクローニングすることにより、がんに対しては腫瘍特異的リンパ球を検出し、腫瘍特異的抗体遺伝子、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体遺伝子をクローニングすることにより、抗体を用いた抗体療法、また、Ｔ細胞受容体遺伝子を用いた遺伝子治療が可能になると期待される。 According to the method of the present invention, for example, the antigen specificity of each lymphocyte can be individually detected, and the detected antigen-specific lymphocyte can be recovered. In this case, for infectious diseases, pathogen-specific lymphocytes are detected, and by cloning pathogen-specific antibody genes, tumor-specific lymphocytes are detected for cancer, and tumor-specific antibody genes By cloning a tumor-specific T cell receptor gene, antibody therapy using an antibody and gene therapy using a T cell receptor gene are expected.
また、本発明の方法は、細胞のみならずタンパク質などの生体組織を固定した後、再び回収さらには解析するためには、非常に有効な技術である。また、吸着力の制御によっては、チップをアレー化せずともそのまま細胞チップとしても利用できる可能性もある。 In addition, the method of the present invention is a very effective technique for recovering and analyzing again after immobilizing not only cells but also biological tissues such as proteins. Further, depending on the control of the adsorption force, there is a possibility that the chip can be used as it is without being arrayed.
Claims (8)
感熱応答性ポリマーの採取すべき細胞または生体組織を包埋する部分に、感熱応答性ポリマーの下限臨界溶解温度未満の温度の液体を、採取すべき細胞数または生体組織数に応じた量で供給し、次いで、前記液体を供給した感熱応答性ポリマーの部分から細胞または生体組織を採取する前記方法。 A method of collecting cells or living tissue immobilized using a thermosensitive polymer from the thermosensitive polymer,
Supply liquid with a temperature lower than the lower critical solution temperature of the thermosensitive polymer to the part of the thermosensitive polymer to embed the cell or biological tissue to be collected in an amount corresponding to the number of cells or biological tissue to be collected. Then, the method of collecting cells or living tissue from a part of the thermosensitive polymer supplied with the liquid.
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