JP2004527210A - Evaluation method of endothelial cell expression pattern - Google Patents

Abstract

To better understand tumor angiogenesis, new techniques have been developed to isolate endothelial cells (ECs) and evaluate gene expression patterns. Comparison of transcripts from ECs from normal and malignant colorectal tissues with transcripts from non-endothelial cells identified over 170 genes that are predominantly expressed in the endothelium. Comparison of normal and tumor-derived endothelium revealed 79 differentially expressed genes, including 46 genes that were specifically increased in tumor-associated endothelium. Experiments with representative genes from this group have demonstrated that most are similarly expressed in endothelium of primary lung, breast, brain, and pancreatic cancers, as well as in metastatic foci of the liver. Was. These results demonstrate that neoplastic and normal endothelium in humans differ at the molecular level and have significant implications for the development of future anti-angiogenic therapies.

Description

【００４９】
以下に記載の研究は、公平かつ一般的に、ＥＣの最初の最も信頼のおける分子的特徴付けをもたらす。これらの研究は、血管形成についての長年にわたる仮説と直接的な関係がある、いくつかの重要な結論を導いた。第１に、正常内皮よび腫瘍内皮は高度に関連しており、多くの内皮細胞特異的マーカーを共有していることは明らかである。第２に、腫瘍に由来する内皮は同じタイプの正常組織に由来する内皮と質的に異なり、初代内皮培養物とも異なることは同様に明らかである。第３に、これらの遺伝子は、いくつかの異なる組織タイプに由来する腫瘍において特徴的に発現しており、このことは、腫瘍内皮が、概して、正常内皮とは異なることを証明している。第４に、腫瘍内皮において差次的に発現している遺伝子はまた、黄体形成および創傷治癒などの他の血管形成プロセス中にも発現している。従って、腫瘍における新しい血管の形成を「腫瘍の血管形成」ではなく「血管新生」それ自体とみなすことがより適している。この区別は様々な観点から重要であり、腫瘍が、他の生理学的または病理学的なプロセスの間に生成されるシグナルの多く、または基本的に同じシグナルを用いて脈管構造を回復させるという考えと一致している。腫瘍が「治癒していない創傷」に相当するというのは、癌生物学における最も古い考えの１つである。
【００５０】
本明細書で同定された腫瘍内皮マーカー（ＴＥＭ）の多くの性質および正確な生物学的機能は未知である。表２に示した以前に特徴付けられた遺伝子のうち、いくつかの遺伝子が細胞外マトリックス形成または再構築に関与するタンパク質をコードすることは興味深い（ＴＥＭ６、ＴＥＭ６、ＴＥＭ１０、ＴＥＭ７、ＴＥＭ１１、ＴＥＭ１２、ＴＥＭ１４、ＴＥＭ２０、ＴＥＭ２４、ＴＥＭ２５、ＴＥＭ２７、ＴＥＭ３７、ＴＥＭ３８、およびＴＥＭ４０）。細胞外マトリックスの沈着は新しい血管の成長に重要である可能性が高い。最後に、本明細書で同定された内皮特異的転写物の大多数が、新生脈管構造でしか発現していなくても概して内皮にしか発現していなくても、以前に特徴付けられておらず、一部がＥＳＴデータベースにさえ表示されないことは、恐らく、驚くべきことではない。これは、１つには、ＥＳＴデータベースがある特定の組織にかなり偏っていることが原因である可能性があるが、さらに、高度に脈管化した組織でさえも、内皮細胞が依然として集団の中で比較的少ないことが原因である可能性がある。従って、ＳＡＧＥ法の感度は特に適したツールである。
【００５１】
配列および文献の研究によって、ＴＥＭタンパク質ファミリー間で以下の同定を行うことができた。膜貫通領域を含むＴＥＭタンパク質が同定された。これらの膜貫通領域を含むＴＥＭタンパク質として、ＴＥＭ１、ＴＥＭ３、ＴＥＭ９、ＴＥＭ１３、ＴＥＭ１７、ＴＥＭ１９、ＴＥＭ２２、ＴＥＭ３０、およびＴＥＭ４４が挙げられる。分泌型タンパク質であるＴＥＭタンパク質が同定された。これらの分泌型タンパク質として、ＴＥＭ４、ＴＥＭ６、ＴＥＭ７、ＴＥＭ１０、ＴＥＭ１２、ＴＥＭ１４、ＴＥＭ２０、ＴＥＭ２５、ＴＥＭ２７、ＴＥＭ３１、ＴＥＭ３６、ＴＥＭ３７、ＴＥＭ３８、およびＴＥＭ３９が挙げられる。ＨｅｙＬ（ＴＥＭ８）は、１つまたはそれ以上のグループとしてのＴＥＭの調節に関与する可能性のある転写因子である。ＴＥＭ４４のタグに対応するタンパク質は公的データベースにおいて発見されたが、その生物学的機能はまだ割り当てられていない。
【００５２】
ＴＥＭ１は文献においてエンドシアリンと名付けられていた。これは、アミノ酸１−１７にシグナル配列およびアミノ酸６８６−７０８に膜貫通ドメインを有する。従って、ＴＥＭ１は細胞表面タンパク質である。その細胞外ドメインは残基１−６８５にある。エンドシアリンはエンドサイトーシスに関与している可能性がある。このマウスオルソログは、残基１−２１にシグナルペプチドを有すると予測された。
【００５３】
ＴＥＭ２は２６６アミノ酸のデキサメタゾン誘導性ｒａｓ関連タンパク質相同体である。これにはシグナル配列も膜貫通ドメインもない。従って、ＴＥＭ２は細胞表面タンパク質でも分泌型タンパク質でもない。ＴＥＭ２はシグナル伝達において役割を果たす。ＴＥＭ２は、細胞形態形成の変化、増殖、および細胞と細胞外マトリックスとの相互作用を調節する。
【００５４】
ＴＥＭ３（当初、ＴＥＭ７Ｒと名付けられていた）はシグナル配列（残基１−２４または１−３０）および膜貫通ドメイン（残基４５６−４７７）の両方を有する。従って、ＴＥＭ３は細胞表面タンパク質である。このタンパク質の細胞外部分はアミノ酸１−４５５である。ＴＥＭ３は、インテグリン、プレキシン、および接着分子と相同性を有するドメインを有する。ＴＥＭ３は、原形質膜受容体とアクチン細胞骨格をつなぐシグナル伝達経路を制御するＧＴＰアーゼを調節する可能性がある。マウスオルソログにおいて、シグナルペプチドは残基１−３０であると予測された。
【００５５】
ＴＥＭ４はＤＫＫ−３としても知られている。ＴＥＭ４にはシグナル配列（残基１−１６）があり、このことは、ＴＥＭ４が分泌型タンパク質であることを示唆している。ＴＥＭ４はｗｎｔシグナル伝達を調節し、内皮成長のための脈管形成およびｗｎｔ依存性シグナル伝達に関与している可能性がある。ＴＥＭ４はＷｎｔ癌遺伝子阻害因子であり、このような阻害はアッセイ法によって測定することができる。ツジ（Ｔｓｕｊｉ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２６８：２０−４、２０００。
【００５６】
ＴＥＭ５は分泌型タンパク質でも細胞表面タンパク質でもないように思われる。ＴＥＭ５は、Ｇタンパク質−ＧＴＰアーゼシグナル伝達経路の一成分であるように思われる。
【００５７】
ＴＥＭ６はストロメリシン−３／マトリックスメタロプロテイナーゼ１１（ＭＭＰ−１１）としても知られている。ＴＥＭ６には残基１−３１にシグナル配列があるが、膜貫通ドメインはない。ＴＥＭ６は、残基１０８−１０９にシグナルペプチドの選択的スプライス部位を有する。従って、ＴＥＭ６は分泌型タンパク質であるように思われる。ＴＥＭ６は、マトリキシンサブファミリーとしても知られる亜鉛メタロプロテアーゼファミリーに属する。ＴＥＭ６は、ほとんどの浸潤癌において発現している。α１−プロテアーゼ阻害因子はＭＭＰ１１の天然基質である。ＴＥＭ６はコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質を分解し、細胞外マトリックスの再構築および細胞移動に関与している。ストロメリシンは、例えば、カゼイン−リソルフィン基質を用いてアッセイすることができる。トルトレラ（Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ）およびアルナー（Ａｒｎｅｒ）、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６ Ｓｕｐｐ．２：Ｓ１２２−３、１９９７を参照のこと。
【００５８】
ＴＥＭ７は、多くの名前のタンパク質であり、マトリックスメタロプロテイナーゼ２、ゼラチナーゼＡ、および７２ＫＤ ＩＶ型コラゲナーゼとしても知られている。ＴＥＭ７は残基１−２６にシグナル配列を有し、分泌型タンパク質である。ＴＥＭ６と同様に、ＴＥＭ７はマトリキシンサブファミリー（亜鉛メタロプロテイナーゼ）に属する。ＴＥＭ７は、ゼラチンＩ型、コラーゲンＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、およびＸ型を切断する。ＴＥＭ７は内皮細胞表面上のインテグリンと結合し、血管浸潤を促進する。ＴＥＭ７は組織再構築に関与する。ＴＥＭ７は、例えば、ザイモグラフィーまたは消光蛍光基質加水分解（ｑｕｅｎｃｈｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）を用いてアッセイすることができる。ガルベット（Ｇａｒｂｅｔｔ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ５３：９９−１０６、２０００。α２（Ｉ）コラーゲン切断部位のセプタペプチド類似体を含むメトキシクマリンを用いる、マトリックスメタロプロテイナーゼ蛍光原基質アッセイ法も使用することができる。ブハイド（Ｂｈｉｄｅ）ら、Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ ７１：６９０−７００、２０００を参照のこと。
【００５９】
ＴＥＭ８はＨＥＹＬタンパク質である。ＴＥＭ８にはシグナル配列も膜貫通ドメインもない。ＴＥＭ８は、ヘアリー（ｈａｉｒｙ）／エンハンサーオブスプリット（Ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｓｐｌｉｔ）遺伝子に関連している。ＴＥＭ８は、転写因子としての役割を有する核タンパク質である可能性が高い。ＴＥＭ８はノッチ（Ｎｏｔｃｈ）シグナル伝達物質の新しいクラスに属し、血管発生、体形成、および神経発生などの様々な発生プロセスにおいて重要な役割を果たしている。残基６１５および２２０１のＳＮＰにはシトシン塩基がある。ノッチ３の変異はＣＡＤＡＳＩＬ血管障害の根底をなしている。Ｍｅｔｈ Ｄｅｖ ２０００ Ｎｏｖ；９８（１−２）：１７５を参照のこと。
【００６０】
ＴＥＭ９はＧタンパク質共役受容体相同体であり、残基１−２６のシグナル配列および７つの膜貫通ドメインを両方とも有する。従って、ＴＥＭ９は細胞表面タンパク質である。その細胞外領域はアミノ酸１−７６９に存在する。その膜貫通ドメインは残基８１７−８２９（ＴＭ２およびＴＭ３）、残基８９９−９２９（ＴＭ４およびＴＭ５）、ならびに残基１０３４−１０４０（ＴＭ６およびＴＭ７）にある。ＴＥＭ９は、細胞接着タンパク質に特有の細胞外ドメインを有するＧタンパク質共役受容体として働く。そのスプライス異型の１つは可溶性受容体として機能する可能性がある。ＴＥＭ９は、細胞極性および細胞移動を調節する可能性がある。ＴＥＭ９は、ラトロフィリン機能に基づいてエキソサイトーシスに関与する可能性がある。マウスオルソログには、残基１−２９に予測シグナルペプチドがある。
【００６１】
ＴＥＭ１０は、残基１−２２にシグナル配列を有するコラーゲンＩ型α２（ＣＯＬ１Ａ２）である。ＴＥＭ１０は、合成の後に分泌される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質である。ＴＥＭ１０は、他のＥＣＭタンパク質、ある特定の増殖因子、およびマトリックスメタロプロテアーゼを含む多数のタンパク質と相互作用する。ＴＥＭ１０は内皮管形成の誘導に必要とされ、組織再構築に関与している。Ａで置換するヌクレオチド３２３３での変異は骨形成不全症ＩＶ型と関連している。Ａで置換するヌクレオチド４３２１での変異は野生型表現型を維持する。ヌクレオチド７１５は多型部位である。エーレルス−ダンロー症候群においてヌクレオチド６９５−７４８は欠失されている。他の変異は、特発性骨粗鬆症および非定型マルファン症候群に関連している。ヌクレオチド

での変異が知られている。ポリＡ部位はヌクレオチド４４５０、４５５０、４８８５、および５０８２に位置する。ポリＡシグナルは４４２０−４４２４、４５１５−４５２０、４５２９−４５３４、４８６６−４８７１、５０３２−５０３７、５０５３−５０５８に位置する。ＴＥＭ１０、２０、および４０は同じ遺伝子に由来するが、異なる長さを有する異なるアイソフォームである。
【００６２】
ＴＥＭ１１はナイドジェン／エンタクチンである。ＴＥＭ１１は、残基１−２８にシグナル配列を有する分泌型タンパク質である。ＴＥＭ１１は、基底膜の一成分である細胞外マトリックスタンパク質である。ＴＥＭ１１は、ラミニンおよびコラーゲンＩＶおよび他の細胞外マトリックスタンパク質に結合する。ＴＥＭ１１は毛細血管形成を調節し、組織再構築に関与している。ヌクレオチド４２６５（Ｔ、Ｃ）、４２６７（Ｇ、Ｃ、Ｔ）、および４７３８（Ｔ、Ｇ）に変異が観察されている。ナイドジェンは、星状細胞の形態に及ぼす影響によってアッセイすることができる。グリンプ（Ｇｒｉｍｐｅ）ら、ＧＬＩＡ ２８：１３８−４９、１９９９を参照のこと。
【００６３】
ＴＥＭ１２はコラーゲンＶＩ型α３鎖である。ＴＥＭ１２は残基１−２５にシグナル配列を有する。分泌型タンパク質ＴＥＭ１２は細胞外マトリックスタンパク質である。ＴＥＭ１２はスプライス異型を有する。ＴＥＭ１２は血管内皮下層の主成分であり、組織再構築に関与している。ＴＥＭ１２は血小板の活性化および凝集を調節する。または、スプライシングされるドメインは、ヌクレオチド３４７−９６４、９６５−１５６７、２１５３−３７５２、および４５４１−５０４１に位置する。
【００６４】
ＴＥＭ１３はＴｈｙ−１糖タンパク質としても知られている。ＴＥＭ１３は、シグナル配列（残基１−１９）および膜貫通ドメイン（残基１４３−１５９）を両方とも有する。このタンパク質の変異形態では残基１３１−１６１は除去される。タンパク質の細胞外領域は残基１−１４２または残基１−１３０である。ＴＥＭ１３は、残基１３０に、ＴＥＭ１３を膜に固定するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを有する。ＴＥＭ１３は、ヒト血清中で可溶型で検出することができる。ＴＥＭ１３は、活性化内皮細胞のマーカー（成人血管形成のマーカーであるが、胚血管形成のマーカーではない）であることが報告されている。血管内皮細胞上のＴＥＭ１３は、可能性のある血管透過モジュレーターとして機能する可能性がある。Ｔｈｙ１に対する抗体は、ＣＤ４＋ＣＤ４５＋細胞およびＣＤ８＋ＣＤ４５＋細胞の分裂促進シグナルであるが、ＣＤ４５−Ｔ細胞では増殖を誘導しない。ピンゲル（Ｐｉｎｇｅｌ）ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：１６９−７８、１９９４。Ｔｈｙ−１は、このようなシグナルの阻害因子としてアッセイすることができる。
【００６５】
ＴＥＭ１４はシスタチンＳとしても知られている。ＴＥＭ１４は、残基１−２０にシグナル配列および残基１−１４１に細胞外領域を有する分泌型タンパク質である。ＴＥＭ１４はシステインプロテアーゼ阻害因子である。ＴＥＭ１４は、血管形成および組織再構築に関与するシステインプロテアーゼ機能を調節する可能性がある。ＴＥＭ１４はパパイン活性の阻害因子であり、このような阻害はアッセイすることができる。ヒルトケ（Ｈｉｌｔｋｅ）ら、Ｊ．Ｄｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７８：１４０１−９、１９９９。
【００６６】
ＴＥＭ１５はコラーゲンＩＩＩ型α１（ＣＯＬ３Ａ１）である。ＴＥＭ１５はシグナル配列（残基１−２３）を有し、分泌される。ＩＩＩ型コラーゲンはフォン・ウィルブランド因子に結合する。ＴＥＭ１５は、細胞間接着、増殖、および移動活性に関与している。ヌクレオチド

での変異が観察されている。
【００６７】
ＴＥＭ１６はテンシン相同体であり、これは見かけ上、細胞内タンパク質である。ＴＥＭ１６はスプライス異型またはアイソフォームを有する可能性がある。１７０４アミノ酸を有する一形態には、腫瘍サプレッサータンパク質、ホスファターゼ、およびテンシン相同体（ＰＴＥＮ）に似たＮ末端ドメイン領域がある。テンシンは、アクチンおよびリン酸化タンパク質に結合する焦点結合分子である。これは、シグナル伝達経路と細胞骨格をつなぐ細胞移動に関与している。ＰＴＥＮは腫瘍誘導性の血管形成を調節する。
【００６８】
ＴＥＭ１７（ＢＳＣ−ＴＥＭ７）は、残基１−１８を含むシグナル配列および残基４２７−４４５の膜貫通ドメインを有する。ＴＥＭ１７は、残基１−４２６を含む細胞外領域を有する細胞表面マーカーである。ＴＥＭ１７は、マウスおよび線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の両方において相同体を有する。残基１３７−２４４はナイドジェンと弱い相同性を有する。残基２８０−３４４は、プレキシン、セマフォリン、およびインテグリンβサブユニットに見出されるＰＳＩドメインと相同性を有する。ヌクレオチド１８９３（Ａ、Ｇ）、１９５０（Ｃ、Ｇ）、２０４２（Ａ、Ｇ）、および２２２０（Ｇ、Ａ）に変異が観察されている。マウスＴＥＭ１７において、シグナル配列は残基１−１９を含む。
【００６９】
ＴＥＭ１９は、当初、腫瘍内皮マーカー８（すなわち、ＢＳＣ−ＴＥＭ８）であると報告された。ＴＥＭ１９は、残基１−２７にシグナル配列および残基３２２−３４３に膜貫通ドメインを有する。ＴＥＭ１９は、残基１−３２１に細胞外領域を有する細胞表面タンパク質である。ＴＥＭ１９は、残基４４−２１６にフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）Ａドメイン、残基３４−２５３にロイコインテグリンαＤ鎖に見出されるドメイン、および残基４０８−５６０にビンキュリンファミリーのＰＲＡＭ−１またはアダプター分子−１に見出されるドメインを有する。ＴＥＭ１９の機能は接着に関連している。フォン・ウィルブランド因子ドメインは、一般的に、血管プロセスを含む様々な機能に関与している。ＴＥＭ１９は、血管内皮細胞の移動において役割を果たしている可能性がある。マウスオルソログには残基１−２７に予測シグナルペプチドがある。
【００７０】
ＴＥＭ２０はコラーゲンＩ型α２（ＣＯＬ１Ａ２）である。ＴＥＭ２０は残基１−２２にシグナル配列を有し、分泌型細胞外マトリックスタンパク質である。ＴＥＭ２０はインビトロで内皮管形成を誘導し、組織再構築に関与している。ヌクレオチド

に変異が観察されている。
【００７１】
ＴＥＭ２１は、細胞内タンパク質であるフォルミン様タンパク質相同体である。フォルミン関連タンパク質は、Ｒｈｏファミリー低分子量ＧＴＰアーゼ、プロフィリン、および他のアクチン関連タンパク質と相互作用する。フォルミン結合タンパク質は、そのＷＷドメインを用いてＦＨ１ドメインに結合する。ＴＥＭ２１は、残基２２１−４４９にプロリンリッチＦＨ１ドメインを有する。フォルミン関連タンパク質は、形態形成、細胞極性、細胞質分裂、およびアクチン細胞骨格の認識において重要な役割を果たしている。フォルミン関連タンパク質はまた、アポトーシス、細胞接着、および移動を調節する可能性がある。
【００７２】
ＴＥＭ２２は、マクロファージマンノース受容体ファミリーのエンドサイトーシス受容体である。ＴＥＭ２２は、残基１−３０にシグナル配列および残基１４１５−１４３５に膜貫通ドメインを両方とも有し、細胞表面上に存在する。その細胞外ドメインはアミノ酸１−１４１４である。ＴＥＭ２２は可溶型（分泌型）として存在し、阻害因子として作用する可能性がある。ＴＥＭ２２は分泌型ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）を結合し、ｓＰＬＡ２によって誘発される生物学的応答を媒介する可能性がある。ＴＥＭ２２はｓＰＬＡ２のエンドサイトーシス特性を有し、内皮関連タンパク質のエンドサイトーシスを媒介する可能性がある。ＴＥＭ２２は細胞接着を促進し、細胞間伝達に関与する可能性がある。ヌクレオチド５３８９（Ａ、Ｇ）に変異が観察されている。ＴＥＭ２２は、微生物および宿主由来糖タンパク質の取り込みを媒介する。グロガー（Ｇｒｏｇｅｒ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６５：５４２８−３４、２０００。
【００７３】
ＴＥＭ２４は、細胞内タンパク質であるテンシンである。ＴＥＭ２４はアクチンフィラメントに結合する焦点結合分子であり、ホスホチロシン含有タンパク質と相互作用する。ＴＥＭ２４はキナーゼシグナル伝達活性を媒介し、細胞の形質転換を調節する可能性がある。ヌクレオチド２５０２（Ａ、Ｇ）、２６２２（Ａ、Ｇ）、６０２７（Ａ、Ｇ）に変異が観察されている。ＴＥＭ２４はアクチンフィラメントに結合し、ホスホチロシン含有タンパク質と相互作用する。チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５１ Ｐｔ２：４０３−１１、２０００。ＴＥＭ２４はホスホイノシチド３−キナーゼにも結合する。アウガー（Ａｕｇｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７１：２３４５２−７、１９９６。ＴＥＭ２４は核タンパク質ｐ１３０にも結合する。ロー（Ｌｏ）ら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １６：８１７−２３、１９９４。
【００７４】
ＴＥＭ２５は、残基１−２２にシグナル配列を有する骨形成タンパク質１（ＢＭＰ−１）である。ＴＥＭ２５は分泌型タンパク質である。少なくとも６つのＢＭＰ−１アイソフォームならびにカルボキシ末端ＣＵＢドメインおよびさらなるＥＧＦドメインを付加するスプライス異型が存在する。ＴＥＭ２５はメタロプロテアーゼ酵素である。ＴＥＭ２５は、コラーゲンＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ型ならびに血管プロセスに重要なタンパク質であるラミニン５γ２のＣ末端ペプチドを切断する。ＴＥＭ２５は軟骨形成に関与する。ヌクレオチド３１０６（Ｃ、Ｔ）、３２４８（Ｇ、Ａ）、３３６９（Ｇ、Ａ）に変異が観察されている。ＴＥＭ２５はプロバイグリカンを一箇所切断し、プロペプチドを除去し、組織において見出される成熟形態と同じＮＨ（２）末端を有するバイグリカン分子を生成する。スクット（Ｓｃｔｔ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３０５０４−１１、２０００。ラミニンα３およびγ２短鎖はＴＥＭ２５の基質である。アマノ（Ａｍａｎｏ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２７２８−３５、２０００。
【００７５】
ＴＥＭ２７は、残基１−２７にシグナル配列を有する分泌型タンパク質Ｓｌｉｔ相同体３として知られている。ＴＥＭ２７は、移動、反発、およびパターン形成に関与する分泌型ガイドタンパク質である。ＴＥＭ２７は「ラウンドアバウト（ｒｏｕｎｄ ａｂｏｕｔ）」受容体（Ｒｏｂｏ受容体）と相互作用する。ＴＥＭ２７は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質と相互作用し、細胞接着に関与する可能性がある。ヌクレオチド４７７２（Ｃ、Ｔ）に変異が観察されている。
【００７６】
ＴＥＭ２８はマウスナドリン （ニューロン特異的ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質）に似ている。ＴＥＭ２８は、ＲｈｏＧＡＰドメインを有する細胞内タンパク質である。ＲｈｏＧＡＰドメインは、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、およびＣｄｃ４２ ＧＴＰアーゼを活性化する。ＴＥＭ２８は、アクチンフィラメントの再編成およびエキソサイトーシスの促進に関与している。ＴＥＭ２８は細胞シグナル伝達にも関与する可能性がある。ヌクレオチド３９６９（Ａ、Ｃ）に変異が観察されている。
【００７７】
ＴＥＭ２９は、細胞内タンパク質であるプロテインチロシンホスファターゼＩＶＡ型、メンバー３、アイソフォーム１である。ＴＥＭ２９には選択的スプライス異型がある。ＴＥＭ２９はプレニル化プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）の小さなクラスに属する。ＴＥＭ２９は、プレニル化によって膜に結合することができる。ＰＴＰは細胞シグナル伝達分子であり、様々な細胞プロセスにおいて調節的な役割を果たし、細胞増殖を促進する。ＰＴＰ ＰＲＬ−３はアンギオテンシンＩＩ誘導性シグナル伝達現象を調節する。
【００７８】
ＴＥＭ３０は、シグナル配列（残基１−２８）および膜貫通ドメイン（残基１１４２−１１６４）を両方とも有する細胞表面タンパク質インテグリンα１である。その細胞外領域はアミノ酸１−１１４１を含む。ＴＥＭ３０はラミニンおよびコラーゲンの受容体である。ＴＥＭ３０は様々な接着相互作用を媒介する。ＴＥＭ３０は、微小血管内皮細胞において豊富に発現している。ＴＥＭ３０は内皮細胞増殖および血管新生を刺激する。ＴＥＭ３０はアンギオスタチン産生を調節する可能性がある。ヌクレオチド４１８（Ｃ、Ｔ）に変異が観察されている。ＴＥＭ３０は、線維芽細胞の細胞増殖を促進するＲａｓ／Ｓｈｃ／分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ経路を活性化する。ＴＥＭ３０はまた、コラーゲンおよびメタロプロテイナーゼ合成を阻害するように働く。ポジ（Ｐｏｚｚｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：２２０２−７、２０００。
【００７９】
ＴＥＭ３１は、分泌型タンパク質コラーゲンＩＶα１（ＣＯＬ４Ａ１）（残基１−２７）である。ＴＥＭ３１は基底膜の一成分である。ＴＥＭ３１はα３β１インテグリンに結合し、インテグリンを介した細胞接着を促進する。ＩＶ型サブユニットの非コラーゲンドメインは腫瘍の血管形成に関与している。ＴＥＭ３１は組織再構築に関与する。ヌクレオチド４４７０（Ｃ、Ｔ）に変異が観察されている。
【００８０】
ＴＥＭ３３は、ミトコンドリアマトリックスに局在するタンパク質であるメチルマロニルＣｏ−Ａムターゼである。ＴＥＭ３３は、いくつかのアミノ酸、奇数酸の脂肪酸、およびコレステロールを分解してトリカルボン酸回路に向ける。ＴＥＭ３３欠損は、メチルマロン酸尿症（ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｃ ａｃｉｄｕｒｅａ）と呼ばれる致死性の有機酸代謝障害を引き起こす。ヌクレオチド

に変異が観察されている。ＴＥＭ３３はＬ−メチルマロニルＣｏＡをスクシニルＣｏＡに変換する。この反応は、当技術分野において周知のようにアッセイすることができる。例えば、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１（８ Ｐｔ １）：１１６４−７０、１９９５を参照のこと。
【００８１】
ＴＥＭ３６は、残基１−２３または２４にシグナル配列を有する細胞外マトリックスタンパク質コラーゲンＸＩＩ型α１（ＣＯＬ１２Ａ１）である。ＴＥＭ３６は、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）Ａ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、およびトロンボスポンジンＮ末端様ドメインを有する。ＴＥＭ３６はストレス環境に反応して発現される。ＴＥＭ３６は細胞外マトリックス構造を組織化し、マトリックスの再構築に関与する可能性がある。このタンパク質の２つのアイソフォーム（長い形態および短い形態）が存在する。短い形態にはアミノ酸２５−１１８８、従って、ヌクレオチド７３−３５６４が無い。両形態ともシグナル配列を共有し、従って、分泌される。
【００８２】
ＴＥＭ３７は、残基１−１８にシグナル配列を有する細胞外マトリックス硫酸化プロテオグリカンであるルミカンである。ルミカンは、マトリックス集合に関与するタンパク質（例えば、コラーゲンＩ型およびＶＩ型）と相互作用し、細胞増殖および組織形態形成に関与する。ルミカンは、コラーゲン繊維集合の調節に重要な役割を果たしている。ヌクレオチド１０２１（Ｇ、Ｔ）、１０３５（Ａ、Ｇ）、１２０９（Ａ、Ｇ）、１２５９（Ａ、Ｃ）、１４１８（Ｃ、Ａ）、１５１９（Ｔ、Ａ）に変異が観察されている。ＴＥＭ３７はＴＧＦ−βの結合パートナーである。ＦＡＳＥＢ Ｊ．１５：５５９−６１、２０００を参照のこと。ＴＥＭ３７活性を測定するのに使用することができる１つのアッセイ法は、コラーゲン原繊維形成／沈降アッセイ法である。スベンソン（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７０：１７８−８２、２０００。
【００８３】
ＴＥＭ３８は、残基１−２２にシグナル配列を有する細胞外マトリックスタンパク質コラーゲンＩ型α１（ＣＯＬ１Ａ１）である。Ｉ型コラーゲンは内皮細胞移動および血管新生を促進し、管形成を誘導し、組織再構築に関与する。テロペプチド誘導体が、ある特定の癌タイプの悪性度および浸潤のマーカーとして用いられる。ヌクレオチド

に変異が観察されている。
【００８４】
ＴＥＭ３９はトランスフォーミング成長因子β−３（ＴＧＦ−β３）である。ＴＥＭ３９は残基１−２３にシグナル配列を有する。ＴＥＭ３９は分泌型タンパク質である。ＴＥＭ３９は細胞増殖および分化を調節する。ＴＧＦ−βアイソフォームは血管修復プロセスおよび再構築において主要な役割を果たしている。ヌクレオチド２０２０（Ｇ、Ｔ）に変異が観察されている。
【００８５】
ＴＥＭ４１はオルファクトメジン様タンパク質に似ている。ＴＥＭ４１は、明らかな予測シグナル配列がないので細胞内タンパク質であるように思われる。オルファクトメジンは、嗅覚上皮の細胞外粘性マトリックスの主要な糖タンパク質である。ＴＥＭ４１は、細胞接着型ドメインを有するラトロフィリン （細胞外領域）と相同性を有する。ＴＥＭ４１は接着機能に関与する可能性がある。
【００８６】
ＴＥＭ４２は、残基４２−６１に膜貫通ドメインを有する細胞表面タンパク質ＭＳＴＰ０３２タンパク質である。ＴＥＭ４２は、その機能が未知であり、他のタンパク質とほとんど相同性を有さない。ヌクレオチド４１８（Ａ、Ｔ）、７２４（Ｃ、Ａ）に変異が観察されている。
【００８７】
ＴＥＭ４４は、残基１２１−１４３および１７６−１９７に２つの予測膜貫通ドメインを有する推定タンパク質ＦＬＪ１１１９０（ＮＭ ０１８３５４）である。残基１４４−１７５は細胞外領域を形成する可能性がある。ＴＥＭ４４の機能は未知であり、他の既知のタンパク質と相同性を有さない。
【００８８】
ＴＥＭ４５は細胞内タンパク質トロポミオシン１（α）である。ＴＥＭ４５はβサブユニットと二量体を形成する。ＴＥＭ４５はアクチン機能に影響を及ぼす。ＴＥＭ４５は、内皮細胞の細胞骨格再編成に関与する可能性がある。ヌクレオチド５０９（Ａ、Ｃ）、６２１（Ａ、Ｃ）、６３５（Ｔ、Ｇ）、６４２（Ｃ、Ｇ）、１０５９（Ｇ、Ｔ）に変異が観察されている。
【００８９】
ＴＥＭ４６は、セプチンファミリーに属するピーナッツ様１タンパク質／セプチン５である。セプチンファミリーのタンパク質は、ＧＴＰおよびホスファチジルイノシトール４，５二リン酸に結合する。セプチンファミリーのタンパク質は、細胞質分裂および細胞分裂を制御するシグナル伝達カスケードに関与する。
【００９０】
ＮＥＭ４は、低分子誘導性サイトカインサブファミリー（ｓｍａｌｌ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ）Ａ（ｃｙｓ−ｃｙｓ）の一員であるメンバー１４（ＳＣＹＡ１４）である。ＮＥＭ４は、２つの隣接するシステイン残基を特徴とする分泌型タンパク質である。あるアイソフォームには、アイソフォーム２と比較して内部１６アミノ酸が無い。
【００９１】
ＮＥＭ２２はグアニル酸キナーゼ相互作用タンパク質１（マグイン−１）と相同性を有する。ＮＥＭ２２は膜結合タンパク質である。
【００９２】
ＮＥＭ２３はヒトシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）である。ＮＥＭ２３は残基１−２０にシグナル配列を有する。細胞外ドメインは残基２１−２３７に存在する可能性がある。このタンパク質の分泌型アイソフォームが存在する。
【００９３】
ＮＥＭ３３はネトリン４である。ＮＥＭ３３は軸索突起の成長を誘導し、血管発生を促進する。高濃度では、軸索突起の成長は阻害される。
【００９４】
ＥＣは正常組織または腫瘍組織の総細胞のわずかな部分しか相当せず、未分画組織から構築されたライブラリーでは、最も高いレベルで発現されたＥＣ転写物しか表されないと予想される。従って、本研究で説明した遺伝子は、将来、ヒト血管形成の基礎研究および臨床研究のための価値のある手段を提供するはずである。腫瘍内皮マーカー（ＴＥＭ）として同定された遺伝子は、配列番号：９４−１３９、１７３−１７６、１８０−１８６に示されるタグに対応する。正常内皮マーカー（ＮＥＭ）として同定された遺伝子は、配列番号：１４０−１７２に示されるタグに対応する。全内皮マーカー（ＰＥＭ）として同定された（すなわち、腫瘍内皮細胞および正常内皮細胞の両方で発現する）遺伝子は、配列番号：１−９３に示されるタグに対応する。内皮において優勢に発現していると以前に同定された遺伝子は、配列番号：１−６、８、１０−１５に示されるＰＥＭタグに対応する。各クラスのマーカーは、何らかの目的のために区別なく使用することができる。
【００９５】
本発明による単離および精製された核酸は、これらの核酸がヒトゲノムにおいて連結している遺伝子と連結していない核酸である。さらに、単離および精製された核酸は、混合物（例えば、別個の遺伝子に由来する多数の別個の配列を含むライブラリー）に存在しない。しかしながら、単離および精製された核酸は、これらの核酸が天然では隣接していない他の遺伝子（例えば、ベクター配列または他の遺伝子の配列）に連結していてもよい。本明細書で開示されたタグは、タグが作成された方法のために、ＳＡＧＥタグを作成するのに用いられたタギング酵素の最も３’側の制限酵素認識部位の３’配列である。この場合、タグは、ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ分子における最も３’側のＮｌａＩＩＩ部位の３’である。タグに対応する核酸は、例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡでもよい。このような対応する核酸は、配列同一性を確かめるための配列データベースとの比較によって決定することができる。配列比較は、任意の入手可能な技術（例えば、米国立医学図書館の米国立生物工学情報センターから入手可能なＢＬＡＳＴ）を用いて行うことができる。タグは、タグが得られた遺伝子を同定するために、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用することもできる。従って、配列比較もしくはクローニングまたはこれらの方法の組み合わせを用いて、当業者は完全長核酸配列を入手することができる。タグに対応する遺伝子は、コード配列の３’末端または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のタグ配列（タグを作成するのに用いられた制限エンドヌクレアーゼの、ｃＤＮＡにおいて最も３’側の認識部位の３’）を含む。核酸はセンス鎖でもアンチセンス鎖でもよい。核酸およびタンパク質は、配列の詳細な内容と共に本明細書で開示されているが、単一の個体に由来するものでもよい。ヒト集団において生じる対立遺伝子変異体は、このような核酸およびタンパク質の範囲内に含まれる。当業者は、同じ遺伝子またはタンパク質のように対立遺伝子変異体を同定することができる。核酸があれば、当業者は、存在するオープンリーディングフレームを容易に決定し、その結果、オープンリーディングフレームによりコードされるポリペプチドの配列を容易に決定し、当技術分野において周知の技術を用いて、このようなタンパク質を適切な宿主において発現させることができる。このようなポリペプチドを含むタンパク質は、天然に生じるタンパク質、ヒトまたは他の種に由来する他の遺伝子からの外因性配列を含む融合タンパク質、エピトープタグを付けられたポリペプチドなどでもよい。単離および精製されたタンパク質は細胞内にはなく、核酸、脂質などの通常の細胞成分から分離されている。一般的に、タンパク質は、組成物中で最も優勢なタンパク質種を構成する（例えば、存在するタンパク質の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％さえも超える）程度まで精製される。
【００９６】
本発明によるタンパク質を用いて、当業者は、そのタンパク質に特異的に結合する抗体を容易に作成することができる。このような抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または全てヒトの抗体でもよい。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’２、および単鎖可変領域を含む、抗体の任意の機能的な断片または誘導体を使用することができる。断片または誘導体は内皮マーカータンパク質に対する結合特異性を保持する限り、使用することができる。ある特定の条件セット下での適切な抗原との結合と無関係の抗原または抗原混合物との結合を比較することによって、抗体の結合特異性を試験することができる。抗体が、無関係の抗原または抗原混合物より少なくとも２倍、５倍、７倍、好ましくは１０倍以上、適切な抗原に結合すれば、特異的であるとみなされる。
【００９７】
このような部分的にヒトの抗体から完全にヒトの抗体を作成する技術は当技術分野において周知であり、任意のこのような技術を使用することができる。１つの特に好ましい態様によれば、完全にヒトの抗体の配列は、ヒト重鎖および軽鎖抗体遺伝子を発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおいて作成される。異なるクラスの抗体を産生することができる、このようなトランスジェニックマウスの複数の系統が作成されている。所望の抗体の連続産生用のハイブリドーマ細胞系を作成するために、所望の抗体を産生するトランスジェニックマウスからのＢ細胞を融合することができる。例えば、ニナＤ．ラッセル（Ｎｉｎａ Ｄ．Ｒｕｓｓｅｌ）、ホセＲ．Ｆ．カルバラン（Ｊｏｓｅ Ｒ．Ｆ．Ｃｏｒｖａｌａｎ）、ミカエルＬ．ガロ（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｌ．Ｇａｌｌｏ）、Ｃ．ゲオフィレイ・デイビス（Ｃ．Ｇｅｏｆｆｒｅｙ Ｄａｖｉｓ）、リーズアン・ピロフスキー（Ｌｉｉｓｅ−Ａｎｎｅ Ｐｉｒｏｆｓｋｉ）「ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスによるヒト抗肺炎球菌防御抗体の産生（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｏｃｉ）」Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ａｐｒｉｌ ２０００、１８２０−１８２６頁；ミカエルＬ．ガロ、バラジミルＥ．イワノフ（Ｖｌａｄｉｍｉｒ Ｅ．Ｉｖａｎｏｖ）、アヤ・ヤコボビッツ（Ａｙａ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ）、およびＣ．ゲオフィレイ・デイビス、「マウスに導入されたヒト免疫グロブリン遺伝子座：ヒト成人に似たＶ（Ｄ）およびＪ遺伝子セグメントの有用性（Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｏｃｉ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ｍｉｃｅ：Ｖ（Ｄ） ａｎｄ Ｊ ｇｅｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔ ｕｓａｇｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎｓ）」Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：５３４−５４０、２０００；ラリーＬ．グリーン（Ｌａｒｒｙ Ｌ．Ｇｒｅｅｎ）「マウス遺伝子操作を介した抗体操作：異種マウス系統は、治療用ヒトモノクローナル抗体を容易に作成するための媒体である（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ： ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ ａｒｅ ａ ｖｅｈｉｃｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆａｃｉｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１ １１−２３、１９９９；ヤンＸ−Ｄ（Ｙａｎｇ Ｘ−Ｄ）、コルバランＪＲＦ（Ｃｏｒｖａｌａｎ ＪＲＦ）、ワンＰ（Ｗａｎｇ Ｐ）、ロイＣＭ−Ｎ（Ｒｏｙ ＣＭ−Ｎ）、およびデイビスＣＧ（Ｄａｖｉｓ ＣＧ）「完全にヒトの抗インターロイキン−８モノクローナル抗体：炎症性疾患状態を治療するための可能性のある治療法（Ｆｕｌｌｙ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｔａｔｅｓ）」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６６巻、４０１−４１０頁（１９９９）；ヤンＸ−Ｄ、ジアＸ−Ｃ（Ｊｉａ Ｘ−Ｃ）、コルバランＪＲＦ、ワンＰ、ＣＧデイビス、およびヤコボビツＡ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ）「併用化学療法を用いない、上皮増殖因子受容体に対する完全にヒトのモノクローナル抗体による確立された腫瘍の根絶（Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ Ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ａ Ｆｕｌｌｙ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９巻、６号、ｌ２３６−１２４３頁（１９９９）；ヤコボビツＡ、「ヒトＩｇ遺伝子座を用いて遺伝子操作されたマウス由来の完全にヒトの抗原特異的なモノクローナル抗体の作成および選択（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ Ｉｇ ｌｏｃｉ）」Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３１巻、３３−４２頁（１９９８）；グリーンＬおよびヤコボビツＡ、「ヒト免疫グロブリン酵母人工染色体を用いて再構成されたマウスにおける可変遺伝子複雑性によるＢ細胞発達の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８巻、３号、４８３−４９５頁（１９９８）；ヤコボビツＡ、「待望の特効薬：トランスジェニックマウス由来の治療用ヒトモノクローナル抗体（Ｔｈｅ ｌｏｎｇ−ａｗａｉｔｅｄ ｍａｇｉｃ ｂｕｌｌｅｔｓ： ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ）」Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ７（４）巻、６０７−６１４頁（１９９８）；ツダＨ（Ｔｓｕｄａ Ｈ）、メイナードクリーＫ（Ｍａｙｎａｒｄ−Ｃｕｒｒｉｅ Ｋ）、レイドＬ（Ｒｅｉｄ Ｌ）、ヨシダＴ（Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ）、エダムラＫ（Ｅｄａｍｕｒａ Ｋ）、マエダＮ（Ｍａｅｄａ Ｎ）、スミシーズＯ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ Ｏ）、ヤコボビツＡ、「２０３ｂｐレトロトランスポゾン挿入および５５ｋｂ遺伝子標的化欠失によるマウスＨＰＲＴ遺伝子座の不活化：新たなＨＰＲＴ欠損マウス胚性幹細胞系の樹立（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ ＨＰＲＴ ｌｏｃｕｓ ｂｙ ａ ２０３−ｂｐ ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ ａ ５５−ｋｂ ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ： ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｗ ＨＰＲＴ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ）」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４２巻、４１３−４２１頁（１９９７）；シェルマンゴールド、Ｒ（Ｓｈｅｒｍａｎ−Ｇｏｌｄ，Ｒ）「モノクローナル抗体：臨床治療薬としての成熟した主流の用途に対する８０年代の特効薬からの進展（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｔｈｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｆｒｏｍ’８０ｓ Ｍａｇｉｃ Ｂｕｌｌｅｔｓ Ｔｏ Ｍａｔｕｒｅ Ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ １７巻、１４号（Ａｕｇｕｓｔ １９９７）；メンデツ（Ｍｅｎｄｅｚ Ｍ）、グリーンＬ、コルバランＪ、ジアＸ−Ｃ、メイナードクリーＣ、ヤンＸ−ｄ、ガロＭ、ルイＤ（Ｌｏｕｉｅ Ｄ）、リーＤ（Ｌｅｅ Ｄ）、エリクソンＫ（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ Ｋ）、ルナＪ（Ｌｕｎａ Ｊ）、ロイＣ（Ｒｏｙ Ｃ）、アブデラヒムＨ（Ａｂｄｅｒｒａｈｉｍ Ｈ）、キルシェンバウムＦ（Ｋｉｒｓｃｈｅｎｂａｕｍ Ｆ）、ノグチＭ（Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｍ）、スミスＤ（Ｓｍｉｔｈ Ｄ）、フクシマＡ（Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ Ａ）、ホールズＪ（Ｈａｌｅｓ Ｊ）、フィナーＭ（Ｆｉｎｅｒ Ｍ）、デイビスＣ（Ｄａｖｉｓ Ｃ）、セボＫ（Ｚｓｅｂｏ Ｋ）、ヤコボビツＡ、「メガ塩基のヒト免疫グロブリン遺伝子座の機能的な移植はマウスにおいてヒト抗体反応を繰り返す（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｏｆ ｍｅｇａｂａｓｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｏｃｉ ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｍｉｃｅ）」Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５巻、１４６−１５６頁（１９９７）；ヤコボビツＡ、「ヒト免疫グロブリンＹＡＣで遺伝子操作されたマウス：自己免疫治療用の完全にヒトの抗体を作成するための新技術（Ｍｉｃｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＹＡＣｓ ： Ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｈｅｒａｐｙ）」ウェアの実験免疫学ハンドブック、統合免疫系（Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｎａｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ）」ＩＶ巻、１９４．１−１９４．７頁（１９９６）；ヤコボビツＡ、「トランスジェニックマウスによる完全にヒトの抗体の作成（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ）」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６巻、５号、５６１−５６６頁（１９９５）；メンデツＭ、アブデラヒムＨ、ノグチＭ（Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｍ）、デイビッドＮ（Ｄａｖｉｄ Ｎ）、ハーディＭ（Ｈａｒｄｙ Ｍ）、グリーンＬ、ツダＨ（Ｔｓｕｄａ Ｈ）、ヨーストＳ（Ｙｏａｓｔ Ｓ）、メイナードクリーＣ、ガルザＤ（Ｇａｒｚａ Ｄ）、ジェミルＲ（Ｇｅｍｍｉｌｌ Ｒ）、ヤコボビツＡ、クラポルツＳ（Ｋｌａｐｈｏｌｚ Ｓ）「酵母および胚性幹細胞におけるヒト免疫グロブリン遺伝子を含むＹＡＣｓの構造完全性の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ＹＡＣｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６巻、２９４−３０７頁（１９９５）； ヤコボビツＡ、「ＹＡＣベクター：マウスゲノムのヒト化（ＹＡＣ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ）」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４巻、８号、７６１−７６３頁（１９９４）；アルボネスＭ（Ａｒｂｏｎｅｓ Ｍ）、オルドＤ（Ｏｒｄ Ｄ）、レイＫ（Ｌｅｙ Ｋ）、ラテシュＨ（Ｒａｔｅｃｈ Ｈ）、メイナードクリーＫ、オッテンＧ（Ｏｔｔｅｎ Ｇ）、カポンＤ（Ｃａｐｏｎ Ｄ）、テダーＴ（Ｔｅｄｄｅｒ Ｔ）、「リンパ球ホーミングならびにリンパ球ローリングおよび移動がＬ−セレクチン欠損マウスにおいて損なわれている（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｈｏｍｉｎｇ ａｎｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｒｏｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｒｅ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｉｎ Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ）」Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １巻、４号、２４７−２６０頁（１９９４）；グリーンＬ、ハーディＭ、メイナードクリーＫ、ツダＨ、ルイＤ、メンデツＭ、アブデラヒムＨ、ノグチＭ、スミスＤ、ゼン（Ｚｅｎｇ Ｙ）ら、「ヒトＩｇ重鎖および軽鎖ＹＡＣｓで遺伝子操作されたマウスからの抗原特異的ヒトモノクローナル抗体（Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ Ｉｇ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ＹＡＣｓ）」Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７巻、１号、１３−２１頁（１９９４）；ヤコボビツＡ、ムーアＡ（Ｍｏｏｒｅ Ａ）、グリーンＬ、ベルガラＧ（Ｖｅｒｇａｒａ Ｇ）、メイナードクリーＫ、オースチンＨ（Ａｕｓｔｉｎ Ｈ）、クラポルツＳ、「ヒト由来酵母人工染色体の生殖系列伝達および発現（Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）」Ｎａｔｕｒｅ ３６２巻、６４１７号、２５５−２５８頁（１９９３）；ヤコボビツＡ、ベルガラＧ、ケネディＪ（Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｊ）、ホールズＪ、マクギネスＲ（ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ Ｒ）、カセンチニボロクツＤ（Ｃａｓｅｎｔｉｎｉ−Ｂｏｒｏｃｚ Ｄ）、ブレナーＤ（Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｄ）、オッテンＧ（Ｏｔｔｅｎ Ｇ）、「ホモ接合変異体キメラマウスの解析：免疫グロブリン重鎖結合領域の欠失はＢ細胞発達および抗体産生をブロックする（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｍｕｔａｎｔ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｉｃｅ： ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ ｊｏｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｂｌｏｃｋｓ Ｂ−ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ９０巻、６号、２５５１−２５５５頁（１９９３）；クチェルラパティ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）ら、米国特許第６，１０７５，１８１号を参照のこと。
【００９８】
抗体はまた、ファージディスプレイ技術を使用して作成することができる。このような技術は、最初の抗体を単離するために、または特異性またはアビディティ特性が変化した異型を作成するために使用することができる。単鎖Ｆｖもまた、使いやすいように使用することができる。抗体は、所望であれば、ワクチン接種されたトランスジェニックマウスから作成することができる。抗体は、細胞培養、ファージ、またはウシ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、類人猿を含むが、これに限定されない様々な動物において生成することができる。
【００９９】
抗体は、放射性原子、発色団、発蛍光団などの検出可能な部分で標識することができる。このような標識された抗体は、インビボでの、または単離された試験試料中での診断技術のために使用することができる。抗体を、例えば、化学療法薬または毒素などの医薬品に結合することもできる。抗体を、サイトカイン、リガンド、別の抗体に連結することができる。抗腫瘍効果を達成するために抗体と結合するのに適した薬剤として、サイトカイン（例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２））および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；光線力学的療法に使用するための光増感剤（アルミニウム（ＩＩＩ）フタロシアニンテトラスルホネート、ヘマトポルフィリン、およびフタロシアニンを含む）；放射性核種（例えば、ヨウ素−１３１（^１３１Ｉ）、イットリウム−９０（^９０Ｙ）、ビスマス−２１２（^２１２Ｂｉ）、ビスマス−２１３（^２１３Ｂｉ）、テクネチウム−９９ｍ（^９９ｍＴｃ）、レニウム−１８６（^１８６Ｒｅ）、およびレニウム−１８８（^１８８Ｒｅ））；抗生物質（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、メトトレキセート、ダウノマイシン、ネオカルチノスタチン、およびカルボプラチン）；細菌毒素、植物毒素、および他の毒素（例えば、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシンＡ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、アブリンＡ毒素、リシンＡ（脱グリコシル化リシンＡおよび未変性のリシンＡ）、ＴＧＦ−α毒素、タイワンコブラ（ｎａｊａ ｎａｊａ ａｔｒａ）細胞毒素、およびゲロニン（植物毒素））；植物、細菌、および菌類に由来するリボソーム不活化タンパク質（例えば、レストリクトシン（アスペルギルス−レストリクツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ）により産生されるリボソーム不活化タンパク質）、サポリン（サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）に由来するリボソーム不活化タンパク質）、およびＲＮアーゼ）；チロシンキナーゼ阻害因子；ｌｙ２０７７０２（二フッ化プリンヌクレオシド）；抗腫瘍剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、毒素をコードするプラスミド、メトトレキセートなど）を含むリポソーム；ならびに他の抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ））が挙げられる。
【０１００】
当業者は、このような抗体誘導体が当技術分野において周知なように、このような抗体誘導体を容易に理解し、作成することができるであろう。抗体は、それ自体で細胞毒性があってもよく、細胞毒性薬剤を体内の特定の位置に送達するのに使用してもよい。抗体は、受動免疫の形として抗体を必要とする個体に投与することができる。
【０１０１】
タンパク質配列から細胞表面タンパク質の細胞外領域および分泌型タンパク質を特徴付けることは、シグナル配列、膜貫通ドメイン、および機能ドメインの予測に基づいている。好ましくは、抗体は、膜結合タンパク質（特に、このようなタンパク質の細胞外ドメイン）または分泌型タンパク質に特異的に免疫反応する。このような標的は抗体に容易に接近することができ、抗体は、一般的に、細胞の内部または核に接近しない。しかしながら、用途によっては、細胞内タンパク質に対する抗体も有用な場合がある。さらに、診断目的のために、全細胞アッセイ法の代わりに細胞溶解産物を使用することがあるので、細胞内タンパク質は同様に優れた標的である場合がある。
【０１０２】
配列が既知のタンパク質の細胞外ドメインを特定するために、コンピュータプログラムを使用することができる。このようなプログラムとして、ＳＭＡＲＴソフトウェア（シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：５８５７−５８６４、１９９８）およびＰｆａｍソフトウェア（ベイトマン（Ｂａｔｅｍａｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２６３−２６６、２０００）、ならびにＰＳＯＲＴＩＩが挙げられる。一般的に、このようなプログラムは膜貫通ドメインを特定する。細胞外ドメインは膜貫通ドメインのすぐ近くに隣接しているとして特定される。細胞外領域およびシグナル切断部位の予測は概算でしかない。この予測には±５残基の誤差範囲があることがある。高い精度のために３つの異なる方法（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：１−６、１９９７、ジャグラ（Ｊａｇｌａ）ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：２４５−２５０、２０００、ナカイ（Ｎａｋａｉ）、Ｋおよびホルトン（Ｈｏｒｔｏｎ， Ｐ．）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４：３４−３５、１９９９）を用いて、シグナル配列を予測することができる。同様に、複数の予測法によって膜貫通（ＴＭ）ドメインを特定することができる（パスキュール（Ｐａｓｑｕｉｅｒ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２：３８１−３８５、１９９９、ソンハマー（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ）ら、Ｉｎ Ｐｒｏｃ． ｏｆ Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔ． Ｃｏｎｆ． ｏｎ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７５−１８２頁、Ｊ．グラスゴー（Ｊ．Ｇｌａｓｇｏｗ）、Ｔ．リトルジョン（Ｔ．Ｌｉｔｔｌｅｊｏｈｎ）、Ｆ．メジャー（Ｆ．Ｍａｊｏｒ）、Ｒ．ラスロップ（Ｒ．Ｌａｔｈｒｏｐ）、Ｄ．サンコフ（Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ）、およびＣ．センセン（Ｃ．Ｓｅｎｓｅｎ）編、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ：ＡＡＡＩ Ｐｒｅｓｓ、１９９８、クレイン（Ｋｌｅｉｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、８１５：４６８、１９８５、ナカイ（Ｎａｋａｉ）およびカネヒサ（Ｋａｎｅｈｉｓａ）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１４：８９７−９１１、１９９２）。不明瞭な場合、十分に特徴付けられたタンパク質における機能ドメインの位置が、細胞局在を指定するための指標として用いられる。
【０１０３】
新規タンパク質の推定機能または機能ドメインを、ＢＬＡＳＴ検索（アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、１９９７）によって特定されたデータベース内の相同領域から、ならびに／または保存ドメインデータベース（例えば、Ｐｆａｍ（ベイトマンら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２６０−２６２、１９９９）、ＢＬＯＣＫＳ（ハインホフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２２８−２３０、２０００）、およびＳＭＡＲＴ（ポンティング（Ｐｏｎｔｉｎｇ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２７、２２９−２３２、１９９９））から推測することができる。１回膜貫通ドメインタンパク質（アウトインまたはＩ型クラス）では、細胞外ドメインは１つの膜貫通ドメインに隣接した領域を含む。複数回膜貫通ドメインタンパク質の場合は、細胞外ドメインは２つの隣接する膜貫通ドメイン間の領域（インアウトおよびアウトイン）も含む。Ｎ末端領域が細胞質にあるＩＩ型膜貫通ドメインタンパク質の場合は、膜貫通ドメインの後ろの領域は一般的に細胞外にある。他方、分泌型タンパク質には膜貫通ドメインがなく、従って、タンパク質全体が細胞外にあると考えられる。
【０１０４】
膜貫通ドメインを欠失させ、従って、リガンドに結合できる細胞外部分を残すように、膜結合タンパク質を操作することができる。膜貫通受容体タンパク質のこのような可溶型は、リガンドとの結合について天然型と競合させるために使用することができる。従って、このような可溶型は阻害因子として作用し、抗血管形成剤として治療に、天然リガンドを定量するための診断ツールとして、およびＴＥＭ：リガンド複合体活性を調節または模倣する低分子を特定するためのアッセイ法において使用することができる。
【０１０５】
または、内皮マーカーそれ自体が、ワクチン接種される動物またはヒトにおいて免疫応答を惹起するためのワクチンとして使用することができる。このような用途のために、関心対象の細胞内ＴＥＭ、細胞外ＴＥＭ、または分泌型ＴＥＭに対応する、タンパク質またはこのようなタンパク質の免疫原性断片が被検体に投与される。この免疫原性薬剤は精製された調製物として供給されてもよく、適切に発現する細胞内に入った状態で供給されてもよい。投与は、被検体に免疫原性薬剤を送達することによって直接的に行われてもよく、被検体において関心対象の免疫原性薬剤の発現をもたらす条件下で、免疫原性薬剤をコードする核酸を送達することによって間接的に行われてもよい。関心対象のＴＥＭは、発現細胞（例えば、精製された腫瘍内皮細胞集団または融合した腫瘍内皮細胞および樹状細胞の集団）に入った状態で送達されてもよい。関心対象のＴＥＭをコードする核酸は、ウイルス性または非ウイルス性の送達ベクターまたはビヒクルに入った状態で送達されてもよい。ヒト被検体において所望の免疫応答を誘導するために、関心対象のヒトＴＥＭをコードする非ヒト配列または他の哺乳動物相同体を使用することができる。本発明のＴＥＭのいくつかのマウス、ラット、または他のオルソログ配列が本明細書で述べられている。または、オルソログ配列は文献から、もしくは当技術の範囲内の技術を用いて入手することができる。
【０１０６】
内皮細胞特異的であると本明細書で開示されたマーカーを用いて、内皮細胞を特定することができる。これらのマーカーとして、配列番号：１−１７２によって特定されるヒトマーカー（すなわち、正常内皮マーカー、全内皮マーカー、および腫瘍内皮マーカー）が挙げられる。相同なマウスマーカーとして、配列番号：１８２−１８６および１９０−１９４の腫瘍内皮マーカーが挙げられる。このようなマーカーに特異的な抗体と、内皮細胞を含む細胞集団を接触させることによって、このような細胞を特定するために、このような抗体を使用することができる。抗体と交差反応する物質が存在することによって特定の細胞が内皮細胞と特定される。同様に、細胞溶解産物を、交差反応物質が存在するかどうかについて試験することができる。イムノブロット、ラジオイムノアッセイ法、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、および免疫組織化学を含む、交差反応物質を検出するための任意の既知の形式または技術を使用することができる。さらに、内皮細胞を特定するために、これらのマーカーの核酸プローブも使用することができる。ノザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイハイブリダイゼーション、およびインサイチューハイブリダイゼーションを含む、当技術分野において周知の任意のハイブリダイゼーション技術を使用することができる。
【０１０７】
１つまたはそれ以上のＴＥＭを含むと思われる細胞を試験することによって、診断目的で、腫瘍内皮細胞を特定することができる。被検体の組織および体液を試験することができる。例えば、細胞内ＴＥＭおよび膜結合ＴＥＭならびに分泌型ＴＥＭの証拠があるかどうか患者の血液を試験することができる。細胞内ＴＥＭおよび／または膜結合ＴＥＭは、これらの因子の高レベル発現の結果として、および／またはＴＥＭを発現する細胞の溶解によって体液中に存在してもよい。
【０１０８】
本発明の内皮マーカーに対する抗体を用いて、様々なタイプの内皮細胞の集団を作成することもできる。当技術分野において周知の任意の技術に従って、細胞集団を精製するのに抗体を使用することができる。このような技術として蛍光活性化細胞選別が挙げられるが、これに限定されない。このような技術を用いると、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらに９９％が所望の内皮細胞タイプである集団の単離が（所望の内皮細胞タイプが正常内皮細胞でも腫瘍内皮細胞でも全内皮細胞でも）可能になる。抗体は、このような集団を正に選択および負に選択するのに使用することができる。好ましくは、適切なマーカーのうちの少なくとも１個、５個、１０個、１５個、２０個、または２５個が内皮細胞集団によって発現される。
【０１０９】
本明細書で記載のように作成された内皮細胞集団は、腫瘍脈管構造成長の阻害による腫瘍増殖の阻害に適した薬物を特定するための薬物のスクリーニングに使用することができる。
【０１１０】
本明細書で説明したように作成された内皮細胞集団は、内皮細胞増殖の阻害（例えば、腫瘍もしくは他の望ましくない脈管構造の成長の阻害）による腫瘍増殖の阻害などの血管形成の調節に適した候補薬物を特定するための候補薬物スクリーニングに、または内皮細胞増殖を促進し、従って、新しいもしくはさらなる大きな血管もしくは微小脈管構造の成長を刺激するための候補薬物スクリーニングに使用することができる。
【０１１１】
内皮細胞増殖の阻害は、正常な系と比較した、処理された系における既に存在している脈管構造の退縮または新たな血管新生の発達の遅れもしくは新たな血管新生が発達しないことを意味する。内皮細胞増殖を刺激することによって、新たな（血管新生）またはさらなる脈管構造の発達（血管再生）に影響を及ぼすことができる。ある特定の候補薬物の血管形成性および／または抗血管形成性を試験するために様々なモデルスクリーニング系を利用することができる。一般的な試験は、ある特定の候補薬物の内皮細胞応答（例えば、増殖、移動、分化、および／または細胞内相互作用）を測定するアッセイ法を含む。このような試験によって、試験刺激のシグナルおよび影響を研究することができる。一般的なスクリーニングの中には、ヘパラナーゼ阻害、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）上での内皮管形成、引っかきにより誘導される内皮細胞の運動性、血小板由来成長因子による血管平滑筋細胞の増殖、およびラット大動脈輪アッセイ法（これは、１つだけの細胞タイプではなく毛細血管が形成する利点をもたらす）の測定を含むものもある。
【０１１２】
腫瘍内皮細胞および／または正常内皮細胞の増殖を模倣または調節、阻害または刺激する能力について、薬物をスクリーニングすることができる。腫瘍内皮の成長を阻害するが、正常内皮の成長または生存を阻害しない能力について、薬物をスクリーニングすることができる。同様に、ヒト細胞集団（例えば、正常内皮集団または腫瘍内皮細胞集団）と試験物質を接触させ、腫瘍内皮マーカーおよび／または正常内皮マーカーの発現を測定することができる。腫瘍内皮マーカー（ＴＥＭ）の発現を減少させる試験物質は腫瘍の血管形成および増殖を阻害するための候補である。逆に、正常内皮にだけ発現し、腫瘍内皮において発現しないマーカー（ＮＥＭ）をモニターすることができる。このようなＮＥＭの発現を腫瘍内皮および他のヒト細胞において増加させる試験物質は、抗腫瘍薬または抗血管形成薬の候補として特定することができる。ＴＥＭまたはＮＥＭの活性が分かっている場合、活性を減少または増加させる能力について薬剤をスクリーニングすることができる。
【０１１３】
膜貫通領域を含むと特定された腫瘍内皮マーカーの場合、細胞表面で見出されるＴＥＭ受容体に結合することができる薬物候補を特定することが望ましい。ある用途について、未変性のリガンドからの、ＴＥＭ受容体をブロックすることができる薬物候補の特定が望ましい。ある用途について、ＴＥＭ受容体に結合することができる薬物候補の特定は、治療薬または診断薬を送達するための手段として使用することができる。他の用途について、未変性のリガンドの活性を模倣することができる薬物候補の特定が望ましい。従って、膜貫通ＴＥＭ受容体：リガンド複合体の結合を操作することによって、内皮細胞のさらなる発達を促進または阻害し、従って、血管新生を促進または阻害することができる可能性がある。
【０１１４】
分泌型タンパク質であると特定された腫瘍内皮マーカーの場合、分泌型ＴＥＭタンパク質に結合することができる薬物候補を特定することが望ましい。ある用途について、分泌型ＴＥＭとその未変性の受容体との結合を妨げることができる薬物候補の特定が望ましい。他の用途について、未変性の受容体の活性を模倣することができる薬物候補の特定が望ましい。従って、分泌型ＴＥＭ：受容体複合体の結合を操作することによって、内皮細胞のさらなる発達を促進または阻害し、従って、血管新生を促進または阻害することができる場合がある。
【０１１５】
任意の簡便な方法に従って、発現をモニターすることができる。タンパク質またはｍＲＮＡをモニターすることができる。特異的な遺伝子発現をモニターするための当技術分野において周知の任意の技術を使用することができる。このような技術として、ＥＬＩＳＡ、ＳＡＧＥ、マイクロアレイハイブリダイゼーション、ウエスタンブロットが挙げられるが、これに限定されない。単一マーカーの発現変化は、潜在的な血管形成促進剤、抗血管形成剤、または抗腫瘍剤としての有意な影響の基準として使用することができる。しかしながら、腫瘍内皮マーカーまたは正常内皮マーカーなどの関連マーカーのうちの少なくとも５個、１０個、１５個、または２０個の発現を調節することができる試験物質をスクリーニングすることが望ましい場合もある。ＴＥＭタンパク質活性の阻害は薬物スクリーニングとして使用することもできる。この目的のために、ヒトおよびマウスのＴＥＭＳを使用することができる。
【０１１６】
スクリーニング用の試験物質は任意の供給源に由来してもよい。試験物質は、天然産物ライブラリー、コンビナトリアル化学物質ライブラリー、組換えライブラリーによって作成された生物学的産物などでもよい。試験物質の供給源は本発明にとって重要でない。本発明は、他のスクリーニング法において以前に見落とされていた可能性のある化合物および組成物をスクリーニングするための手段を提供する。本発明のマーカーの核酸およびコードされる対応タンパク質は様々な形式で治療に使用することができる。ＮＥＭは、腫瘍または他の異常な脈管構造もしくは望ましくない脈管構造の増殖を制限し、小さくし、縮小し、または阻害するのに使用することができる。ＴＥＭは、脈管構造の成長を刺激するために（例えば、創傷治癒のために）、または閉塞した血管を迂回するために使用することができる。核酸およびコードされるタンパク質は当技術分野において周知の任意の手段によって投与することができる。このような方法として、ポリカチオンを含むリポソーム、ナノスフェア、ウイルスベクター、非ウイルスベクターなどを使用する方法が挙げられるが、これに限定されない。適切なウイルスベクターとして、アデノウイルス、レトロウイルス、およびシンドビスウイルスが挙げられる。投与の形式は、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、局所投与、鼻腔内投与、直腸内投与、気管支内投与などを含む当技術分野において周知の任意のものでよい。
【０１１７】
ＴＥＭの特異的な生物学的拮抗薬もまた、治療上の利益を得るために使用することができる。腫瘍または他の異常な脈管構造もしくは望ましくない脈管構造の成長を制限し、阻害し、縮小し、および／または小さくするために、例えば、抗体、ＴＥＭに特異的なＴ細胞、ＴＥＭに対するアンチセンス、およびＴＥＭに特異的なリボザイムを使用することができる。このような拮抗薬は、一般的にこれらのクラスの拮抗薬について当技術分野において周知なように投与することができる。腫瘍増殖を阻害するために、ならびに糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）、および病理のために血管形成を必要とする他の疾患を治療するために、抗血管形成性の薬物および薬剤を使用することができる。
【０１１８】
潜在的な抗血管形成化合物もしくは抗腫瘍化合物または抗血管形成療法もしくは抗腫瘍療法を評価するために、ヒトＴＥＭＳに対するマウス対応物をマウス癌モデルまたは細胞系またはインビトロにおいて使用することができる。これらの発現は、効果の表れとしてモニターすることができる。マウスＴＥＭは配列番号：１８２−１８６および１９０−１９４に開示される。マウスＴＥＭは、マウス腫瘍モデルにおいて試験することができる抗体を惹起するための抗原として使用することができる。膜貫通ドメインを有するマウスＴＥＭが、この目的のために特に好ましい。マウスＴＥＭもまた、ヒトオルソログに対してヒトにおいて免疫応答を惹起するためのワクチンとして使用することができる。
【０１１９】
前記の開示は本発明を大まかに説明している。本明細書で開示された全ての参考文献は参照としてはっきりと組み入れられる。以下の特定の実施例を参照することによって、さらに完璧に理解することができる。以下の特定の実施例は例示のためだけに本明細書で示され、本発明の範囲を限定することが意図されない。
【０１２０】
実施例１
結腸直腸癌の脈管構造の視覚化
腫瘍血管形成の問題に取り組むために、ヒト結腸直腸癌の内皮が、これらの癌の発生率が高いこと、増殖が比較的遅いこと、抗新生物薬に対して耐性があることに基づいて選択された。グリア芽細胞腫などの稀に見られる腫瘍タイプが高度に血管化しており、抗血管形成治療の良い標的であると考えられるが、その一方で、ヒト結腸直腸癌および他の一般的な固形腫瘍タイプが増殖するための血管形成の重要性は十分に書類に記録されていない。
【０１２１】
本発明者らは、マーカーとしてフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）を使用して結腸直腸癌の血管を染色することから始めた。６個の結腸直腸腫瘍のそれぞれにおいて、この検査は、腫瘍実質全体にわたる高密度の血管を明らかにした（図１ＡおよびＢの例）。興味深いことに、多くの場合、内皮が生細胞の血管周囲カフに囲まれており、周囲に壊死細胞の環がはっきりと分かったので、これらの解析はこれらの血管が腫瘍増殖のために重要であることも実証した（図１Ａの例）。これらの予備研究から結腸腫瘍は血管形成依存性であることが示唆されたが、結腸癌の血管と正常結腸の血管とを区別することができる信頼性の高いマーカーは現在ない。このようなマーカーが存在するかどうかを確かめる１つの方法は、正常組織および新生物組織に由来する内皮における遺伝子発現プロファイルを解析することによる方法である。
【０１２２】
実施例２
内皮細胞の精製
腫瘍内皮および正常内皮における遺伝子発現の包括的な系統立った解析は、少なくとも３つの実験上の障害によって妨げられていた。第１に、内皮は、血管壁成分、ストロマ細胞、および新生物細胞からなる複雑な組織において絡み合っており、このため、解析のためにＥＣを精製する高度な選択手段が必要される。第２に、最近まで、包括的な遺伝子発現プロファイルを明確にするための技術を利用できなった。第３に、腫瘍内で内皮細胞はわずかしかなく、このため、比較的わずかな細胞からの包括的な遺伝子プロファイルの解析に適した方法の開発が必要とされる。
【０１２３】
第１の障害を克服するために、最初に、本発明者らは、ＥＣ精製のために一般的に用いられる内皮マーカーＣＤ３１を用いて、分散されたヒト結腸直腸組織からＥＣを精製することを試みた。これによってＥＣがかなり濃縮されたが、調製物が造血細胞によって汚染もされた（マクロファージによるＣＤ３１の発現が原因である可能性が最も高い）。従って、本発明者らは、最近述べられたＥＣマーカーであるＰ１Ｈ１２を用いてヒト組織からＥＣを精製する新たな方法を開発した。ＣＤ３１と異なり、Ｐ１Ｈ１２は、結腸直腸腫瘍および正常結腸直腸粘膜の両方のＥＣにおいて特異的に発現していた。さらに、既知の細胞表面内皮マーカーパネル（例えば、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、およびＣＤ３４）を用いた正常結腸および結腸癌の免疫蛍光染色によって、Ｐ１Ｈ１２は、微細血管を含む全ての血管を染色したので独特のものであることが明らかになった（図２Ａを参照のこと。データ示さず）。Ｐ１Ｈ１２を用いた選択に加えて、細胞表面タンパク質を破壊することなく隣接するものからＥＣを剥離するのを最適化すること、ならびに抗体カクテルを使用して正および負の親和性精製を使用することが必要であった（図２Ｂ）。正常結腸直腸粘膜および結腸直腸癌から精製されたＥＣは、ＲＴ−ＰＣＲ（図２Ｃ）およびその後の遺伝子発現解析（以下を参照のこと）によって判断されたように上皮細胞および造血細胞を本質的に含まなかった。
【０１２４】
実施例３
腫瘍内皮細胞発現パターンと正常内皮細胞発現パターンの比較
残りの障害を克服するために、ＳＡＧＥ法を改良したものを使用した。ＳＡＧＥでは、個々のｍＲＮＡ転写物と、その３’末端近くの特定の位置に由来する１４塩基対タグを結合させる。各タグの量によって、研究されたｍＲＮＡ集団に存在する転写物レベルの量的尺度が得られる。ＳＡＧＥは既存の発現遺伝子データベースに依存せず、従って、偏りのない遺伝子発現プロファイル図をもたらす。これらの細胞に由来する転写物が、現存するＥＳＴデータベースにおいて十分に示されていることはありそうにもないので、この特徴は、研究中の組織のわずかな部分しか構成しない細胞の解析において特に重要である。本発明者らは、図２Ｂにおいて概説した手順から得られた少数の精製ＥＣに対して使用できるようにＳＡＧＥプロトコールを改良した。結腸直腸癌の精製ＥＣに由来する約１００，０００タグのライブラリーおよび同じ患者からの正常結腸粘膜ＥＣに由来する同様のライブラリーを作成した。これらの約１９３，０００のタグは３２，５００を超える独特の転写物に対応した。造血マーカー、上皮マーカー、および内皮マーカーの発現パターンの調査によって、調製物の純度が確かめられた（図２Ｄ）。
【０１２５】
実施例４
正常内皮マーカーおよび腫瘍内皮マーカー
本発明者らは、次に、全内皮マーカー（ＰＥＭ）（すなわち、他の組織と比較して正常内皮および腫瘍関連内皮の両方で非常に高レベルで発現している転写物）を特定しようとした。このようなＰＥＭを特定するために、腫瘍ＥＣおよび正常ＥＣの両方で同じようなレベルで発現していたタグを、非内皮起源の腫瘍から得られた様々な細胞系に由来する約１８０万のタグと比較した。この単純な比較によって、際立ってＥＣ特異的な（すなわち、非内皮培養細胞と比較してインビボでＥＣにおいて少なくとも２０倍高いレベルで発現している）９３の転写物が特定された。内皮において最も高度かつ特異的に発現していた特徴付けられた遺伝子に対応する１５のタグを表１Ａに示す。これらの１５の最も豊富な内皮転写物のうち１２が、内皮において優勢に発現していると以前に示されているのに対して、他の３つの遺伝子は過去において内皮と関連付けられていなかった（表１Ａ）。これらのデータセットから、タグ発現レベルが減少するにつれてますます優勢になる多くの新規ＰＥＭも明らかになった（表１Ｂ）。これらの転写物の多くについて、その内皮起源が、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）の初代培養物から得られた約４０１，０００転写物のＳＡＧＥ解析によって確かめられた（表１ＡおよびＢ）。これらのＰＥＭのインビボでの発現をさらに実証するために、本発明者らは、比較的低レベルで発現する転写物をヒト組織の凍結切片において検出するのを可能にする、高感度非放射性インサイチューハイブリダイゼーション法を開発した。この解析のために、２つの特徴付けられていないマーカーＰＥＭ３およびＰＥＭ６を選択した。どちらの場合でも、高度に特異的な発現は、正常組織および新生物組織の血管ＥＣにはっきりと限定された（図３ＡおよびＢ。データ示さず）。これらのデータは、培養状態で維持されているＥＣが、インビボで観察される発現パターンを完全に繰り返さないことも示唆している。例えば、ヘビン（Ｈｅｖｉｎ）および他のいくつかのＰＥＭはインビボで腫瘍ＥＣおよび正常ＥＣの両方で高レベルで発現していたが、培養ＨＵＶＥＣまたはＨＭＶＥＣにおいて検出される転写物はほとんどないか、または全くなかった（表１）。ヘビン転写物の供給源は、正常結腸直腸組織および悪性結腸直腸組織でのインサイチューハイブリダイゼーションによって内皮であることが確かめられた（図３Ｃ）。
【０１２６】
表１において報告されたマーカーの多くは、ＥＣと一般的に関連している以前に特徴付けられた遺伝子より著しく高いレベルで発現していた。例えば、上位２５のマーカーは全て細胞１個につき２００コピーを超えて発現していた。対照的に、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２）は細胞１個につき２０コピー未満で発現していた。興味深いことに、結腸癌進行中に血管において上方制御されると以前に報告されたＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）は、正常結腸直腸組織および新生物結腸直腸組織の両方で発現することが見出された（図３ＤおよびＥ）。この遺伝子の特異性の欠如は、ＶＥＧＦＲが正常内皮および腫瘍内皮の両方で細胞１個につき１２コピーで発現していることを示したＳＡＧＥデータと一致した。
【０１２７】
実施例５
腫瘍内皮対正常内皮
本発明者らは、次に、正常組織または新生物組織から得られた内皮において差次的に発現している転写物を特定することを試みた。この比較によって、腫瘍由来内皮より少なくとも１０倍高いレベルで正常由来内皮において優勢に発現する３３のタグが明らかになった。逆に、４６のタグが腫瘍血管において１０倍またはそれ以上高いレベルで発現していた。腫瘍内皮において高レベルで発現していた転写物は、診断目的および治療目的で将来有用である可能性が最も高いので、本発明者らの後の研究はこのクラスに焦点を合わせた。最も差次的に発現していた上位２５のタグのうち、１２のタグが、以前に同定されていた１１個の遺伝子（１つは選択的ポリアデニル化部位を有する）に対応する （表２を参照のこと）。これらの１０個の遺伝子のうち、６個は血管形成中の血管と関連するマーカーとして認められている。残りの１４のタグは特徴付けられていない遺伝子に対応し、これらの大部分がＥＳＴとして寄託されているだけであった（表２）。
【０１２８】
これらの遺伝子の発現パターンを実証するために、本発明者らは、ＥＳＴ配列は入手できるが、他の情報は入手できない９つの腫瘍内皮マーカー（ＢＳＣ−ＴＥＭ１−９；ＴＥＭ１、２、５、９、１６、１７、１９、および２２）に焦点を当てることにした（表２）。これらのタグは、リストに載っている最も差次的に発現しているものの中に含まれ、本発明者らが適切なプローブを入手することができたというだけの理由で選択された。多くの場合、これは、複数回の配列決定およびｃＤＮＡウォーキングによって完全長に近い配列を得ることを必要とした（表２のアクセッション番号を参照のこと）。次いで、ＳＡＧＥライブラリーを構築するために用いられた患者とは異なる２人の患者の正常組織および腫瘍組織から得られた精製ＥＣにおける対応する転写物の発現を評価するために、ＲＴ−ＰＣＲ解析が用いられた。図４Ａに示すように、ＳＡＧＥデータならびに以前の研究に基づいて正常内皮および腫瘍内皮の両方で発現していると予想されたｖＷＦ遺伝子は、両患者からの正常ＥＣおよび腫瘍ＥＣにおいてほぼ同じレベルで発現していたが、精製された腫瘍上皮細胞では発現していなかった。予想通り、ＰＥＭ２はｖＷＦと同様のパターンを示した。対照的に、この解析のために選択された９つ全てのＴＥＭは腫瘍ＥＣにおいて顕著に発現していたが、正常ＥＣでは存在しないか、またはほとんど検出することができなかった（表３および図４Ａの例）。これらのＲＴ−ＰＣＲアッセイ法が極端に感度の高い発現指標であったことに留意することは重要であり、正常内皮において検出可能な転写物が存在しないことと、１００倍に希釈した時でさえも腫瘍内皮ＲＮＡにおいて検出可能な転写物が存在することは、これらの差次的な発現の説得力のある確証的な証拠をもたらす。これらの結果から、これらの転写物は、単に、最初の患者のＥＣにおいて差次的に発現していたのではなく、結腸直腸癌内皮の特徴を一般的に示したことも分かる。
【０１２９】
少数の非内皮細胞がＳＡＧＥおよびＲＴ−ＰＣＲ解析に用いられた細胞集団を汚染し、これらの非内皮細胞が、述べられた転写物の発現の顕著な差の原因となった可能性によって、前記の結果を信用できなくなったと論じることができる。この可能性を排除するために、本発明者らは、正常結腸組織および新生物結腸組織においてインサイチューハイブリダイゼーションを行った。転写物を検出することができたどの場合でも（ＢＳＣ−ＴＥＭ１、３、４、５、７、８、および９；ＴＥＭ１、５、９、１７、および１９）、転写物はＥＣに特異的に局在していた（表３ならびに図４ＢおよびＣの例）。負のインサイチューハイブリダイゼーション結果を解釈する時に注意しなければならないが、どのＴＥＭも、ｖＷＦおよびヘビンがはっきりと発現していても正常結腸直腸組織と関連する血管ＥＣにおいて発現していなかった（表３）。
【０１３０】
実施例６
腫瘍内皮マーカーは複数の腫瘍タイプにおいて発現している
これらの転写物は原発結腸直腸癌の内皮において特異的に発現していたのか、または腫瘍内皮の特徴を一般的に示したのか？この問題に取り組むために、本発明者らは、結腸直腸癌からの肝臓転移、肉腫、ならびに肺、膵臓、乳房、および脳の原発腫瘍において、代表的なＴＥＭ（ＢＳＣ−ＴＥＭ７；ＴＥＭ１７）の発現を研究した。図４に示すように、転写物は、転移癌（図４Ｄ）でも原発癌（図４Ｅ−Ｉ）でも、これらの癌のそれぞれの内皮において特異的に発現することが見出された。他の６つのＴＥＭ（ＢＳＣ−ＴＥＭ１、３、４、５、７、８、および９；ＴＥＭ１、５、９、１７、および１９）の解析から、肺腫瘍、脳腫瘍、および肝臓の転移病巣において同様のパターンが明らかになった（表３を参照のこと）。
【０１３１】
実施例７
腫瘍内皮マーカーは血管新生性である
最後に、本発明者らは、これらの転写物が、腫瘍形成に関連する血管形成状態以外の血管形成状態において発現しているかどうかを問うた。従って、本発明者らは、黄体組織ならびに治癒過程にある創傷に対してインサイチューハイブリダイゼーションを行った。例外はあるが、本発明者らは、これらの転写物が、黄体、および治癒過程にある創傷の肉芽組織の両方において一般的に発現していることを発見した（表３および図４Ｊの例）。研究した全ての組織において、遺伝子の発現は存在しないか、またはＥＣ区画にのみ限定された。
【０１３２】
参考文献および注釈
引用された各参考文献の開示は本明細書にはっきりと組み入れられる。

８． 元々のＥＣ単離プロトコールは、分散された細胞が抗Ｐ１Ｈ１２の代わりに抗ＣＤ３１抗体で染色され、ＣＤ６４およびＣＤ１４に対する磁気ビーズが負の選択に含まれなかった以外は図２Ｂに示すプロトコールと同じであった。これらの２つのＥＣ集団から１２０，０００のＳＡＧＥタグを作成した後に、ＳＡＧＥデータの注意深い解析によって、内皮特異的マーカーに加えて、いくつかのマクロファージ特異的マーカーも存在することが明らかになった。

１１． 必要とされる出発物質の最小量を約５０００万個の細胞から約５０，０００個の細胞（すなわち約１／１０００）に減らすために、本発明者らおよび他の人（３８）は元々のＳＡＧＥプロトコールにいくつかの改良点を導入した。本発明者らの改良「マイクロＳＡＧＥ」プロトコールの詳細な説明は、請求すれば著者から入手することができる。
１２． ９６，６９４および９６，５８８のＳＡＧＥタグ（それぞれ、正常なＥＣおよび腫瘍由来ＥＣに由来する）が解析され、５０，２９８の独特のタグを示した。現行のデータセットにおいて、またはヒトトランスクリプトームで以前に同定された１３４，０００個の転写物（３９）において２回以上観察されたタグだけを考慮することによって、３２，７０３の独特の転写物の控えめな見積りが得られた。
１３． 内皮特異的転写物を同定するために、本発明者らは、各グループにおいて解析されるタグの数を１００，０００に標準化し、本発明者らの解析を、非内皮培養細胞系よりＥＣにおいて少なくとも２０倍高いレベルで発現し、非内皮細胞系および造血画分（約５７，０００タグ）（４１）において転写物１００，０００個につき５コピーより少ない数で存在する転写物に限定した。非内皮細胞系は、合計１４個の異なる癌細胞系（結腸癌、乳癌、肺癌、および膵臓癌を含む）ならびに１つの非形質転換ケラチノサイト細胞系、２つの腎臓上皮細胞系、および正常単球から得られた１．８×１０６のタグからなった。ＰＥＭの完全なリストは、ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｅｔ．ｏｒｇ／ａｎｇｉｏ／ｔａｂｌｅ．ｈｔｍで入手することができる。

２６． 非放射性インサイチューハイブリダイゼーションのために、ジコキシゲニン（ＤＩＧ）標識センスリボプローブおよびアンチセンスリボプローブを、５００〜６００ｂｐ産物を増幅し、Ｔ７プロモーターをアンチセンスプライマーに組み込むことによってＰＣＲにより作成した。インビトロ転写は、ＤＩＧ ＲＮＡ標識試薬およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて行った。凍結組織切片を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ペプシンで透過化し、２００ｎｇ／ｍｌのリボプローブと５５℃で一晩インキュベートした。シグナル増幅のために、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ウサギ抗ＤＩＧ抗体（ダコ（ＤＡＫＯ）、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を使用して、ビオチン−チラミド（Ｇｅｎｐｏｉｎｔキット、ダコ）の沈着を触媒した。さらなる増幅は、ＨＲＰウサギ抗ビオチン（ダコ）、ビオチン−チラミド、次いで、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）ウサギ抗ビオチン（ダコ）を添加することによって達成された。シグナルは、ＡＰ基質ファーストレッドＴＲ／ナフトール（ＡＰ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ／Ｎａｐｔｈｏｌ ＡＳ−ＭＸ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて検出され、細胞は、特に指定のない限りヘマトキシリンで対比染色された。プローブを作成するために用いられたプライマーのリストを含む詳細なプロトコールは、請求すれば著者から入手することができる。
２７． 平均的な細胞が３００，０００個の転写物を含むと仮定して、細胞１個当たりの転写物コピーを計算した。

３１．内皮特異的転写物は、非内皮培養細胞系（１３）よりインビボでＥＣにおいて少なくとも５倍高いレベルで発現し、非内皮細胞系および造血細胞画分（４１）において転写物１００，０００個につきわずか５コピーで存在する転写物と定義された。次いで、統計学的に異なるレベルの発現（Ｐ＜０．０５）を示す転写物が、以前に説明されたように（４０）、モンテカルロ解析を用いて同定された。次いで、正常内皮において優勢に発現する転写物は、腫瘍内皮より正常内皮において少なくとも１０倍高いレベルで発現する転写物と定義された。逆に、腫瘍内皮転写物は、正常内皮と比較して腫瘍において少なくとも１０倍高かった。差次的に発現する遺伝子の完全なリストについては、ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｅｔ．ｏｒｇ／ａｎｇｉｏ／ｔａｂｌｅ２．ｈｔｍおよびｗｗｗ．ｓａｇｅｎｅｔ．ｏｒｇ／ａｎｇｉｏ／ｔａｂｌｅ３．ｈｔｍを参照のこと。

４１． ヒト結腸組織は、患者から外科的に取り出された後、３０分以内に入手した。粘膜固有層を完全な状態のままにして、上皮細胞層を、５ｍＭ ＤＤＴ、次いで１０ｍＭ ＥＤＴＡで処理した後にガラススライドを用いて正常組織から剥がした。コラゲナーゼ中で３７℃で２時間インキュベートした後、細胞を、４００μｍ、１００μｍ、５０μｍ、および２５μｍメッシュに連続して通して濾過し、ＲＢＣをペレット化するために、前もって形成した３０％パーコール勾配に通して遠心分離した。上皮細胞（上皮画分）（これは磁気ビーズに非特異的に結合することが分かっている）を、ＢｅｒＥＰ４結合ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（ダイナル（Ｄｙｎａｌ）、Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ、ＮＹ）を用いて除去した。その後、マクロファージおよび他の白血球（造血画分）を、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ１４、および抗ＣＤ６４結合ビーズ（ダイナル）のカクテルを用いて除去した。残りの細胞をＰ１Ｈ１２抗体を用いて染色し、抗マウスＩｇＧ結合磁気ビーズを用いて精製し、ｍＲＮＡ溶解緩衝液中で溶解した。詳細なプロトコールは、請求すれば著者から入手することができる。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【図面の簡単な説明】
【図１】結腸直腸癌におけるｖＷＦ発現。インサイチューハイブリダイゼーションによってｖＷＦ（赤色の染色）が血管において検出された。低倍率（図１．Ａ）では、多くの場合、血管は生細胞の血管周囲カフに囲まれており（赤色の矢印）、周囲に壊死細胞の環がはっきりと分かった（黒色の矢印）。高倍率（図１．Ｂ）では、ｖＷＦ（赤色）の発現は血管にはっきりと局在していた。切片をメチルグリーンで対比染色した。
【図２】ヒトの正常組織および悪性組織からの内皮細胞（ＥＣ）の精製。（図２Ａ）。凍結切片の血管（赤色）を、Ｐ１Ｈ１２モノクローナル抗体（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を用いた免疫蛍光法によって染色し、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体、その後にローダミン結合ストレプトアビジンを用いて検出した。染色された領域は、正常な結腸粘膜の粘膜固有層の中からの領域である。大きな血管（矢じり）および毛細血管（矢印）が陽性であり、造血細胞の染色は検出できなかったことに留意のこと。ウサギポリクローナル抗体（サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、その後に、アレキサ（ａｌｅｘａ）で標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（モレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を用いて、陰窩の端にあるＥ−カドヘリン陽性上皮細胞（緑色）を同時に視覚化した。共焦点顕微鏡を用いて、切片を６０倍の倍率で画像化した。（図２．Ｂ）コラゲナーゼで分散させた組織から純粋な集団を単離するために、上皮細胞および造血細胞の画分を、磁気ビーズを用いた負の選択によって連続的に除去した。残った細胞をＰ１Ｈ１２で染色し、ＥＣを、磁気ビーズを用いた正の選択によって単離した。（図２．Ｃ）ＥＣ調製物の純度を評価するために用いられたＲＴ−ＰＣＲ解析。半定量ＰＣＲ解析を、結腸直腸癌組織（未分画腫瘍）または正常結腸粘膜から単離された精製ＥＣ（正常ＥＣ画分）もしくは結腸直腸癌から単離された精製ＥＣ（腫瘍ＥＣ画分）から直接作成されたｃＤＮＡに対して行った。上皮特異的マーカーサイトケラチン２０（ＣＫ２０）のＰＣＲ増幅によって、その発現が未分画腫瘍に限定されることが証明された。２つの内皮特異的マーカーであるｖＷＦおよびＶＥ−カドヘリン（ＶＥ−Ｃａｄ）は内皮画分でしか強い増幅を示さず、これによって、純度および（図２．Ｂ）に示された濃縮プロトコールが実証された。遍在性ハウスキーピング酵素ＧＡＰＤＨが全ての試料において観察された。非鋳型（ＮＴ）対照においてシグナルは検出されなかった。ｃＤＮＡ鋳型を、先細のＶ字によって示されるように１：１０、１：１００、１：１０００、１：４０００、および１：４０，０００に希釈した。（図２．Ｄ）４つのグループにまとめられた数種類のＳＡＧＥライブラリーからのタグの量を測定することによって、選択された遺伝子の相対的な発現レベルを求めた。１番目は、２つのインビボ由来ＥＣ調製物（内皮細胞画分）からの約１９３，０００個のタグからなったのに対して、２番目は、負の選択から得られたマクロファージおよび他の白血球（造血画分）を含む約５７，０００個のタグの単一ライブラリーを含んだ。４番目のライブラリーは、培養ＨＵＶＥＣおよびＨＭＶＥＣ（培養内皮細胞）からの約４０１，０００個のタグを含み、４番目は、６つの培養結腸癌細胞系（上皮細胞）からの約７４８，０００個のタグからなった。標準化の後、各マーカーについて最大のタグ数を有するライブラリーに１００％の値を与え、残りの３つのライブラリーの対応する相対的な発現レベルを縦座標にプロットした。高レベルのＣＤ３１が造血細胞に存在することに留意のこと（これは、Ｐ１Ｈ１２の選択性に比べて最初の内皮選択の純度が低いことに起因する可能性が高い）。
【図３】全内皮マーカー（ＰＥＭ）の発現はＥＣに限定される。ＳＡＧＥによって特定されたＰＥＭの内皮起源が、高感度インサイチューハイブリダイゼーションアッセイ法を用いて確かめられた。２つの代表的なＰＥＭであるＰＥＭ３（図３Ａ）およびＰＥＭ６（図３Ｂ）を、それぞれ肺癌および結腸癌において調べることによって、新規ＰＥＭはＥＣに局在することが証明された。ヘビンの発現は、培養ＥＣにおける低レベルの発現にもかかわらず、結腸腫瘍（図３Ｃ）のＥＣにおいて容易に検出された。ＶＥＧＦＲ２の発現は、正常結腸組織（図３Ｄ）および悪性結腸組織（図３Ｅ）のＥＣにおいて容易に検出することができた。
【図４】腫瘍内皮マーカー（ＴＥＭ）の発現。（図４Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ解析によって、選択された新規ＴＥＭの腫瘍特異的発現が確かめられた。２人の異なる患者に由来する、負の対照としての精製上皮細胞（対照）または正常結腸粘膜から単離された精製ＥＣ（正常ＥＣ）もしくは結腸直腸癌から単離された精製ＥＣ （腫瘍ＥＣ）から作成されたｃＤＮＡに対して、半定量ＰＣＲ解析を行った。２つの内皮特異的マーカーｖＷＦおよびＰＥＭ６は内皮画分でしか強い増幅を示さなかったが、遍在性ハウスキーピング酵素ＧＡＰＤＨは全ての試料において観察された。ＴＥＭ１（ＢＳＣ−ＴＥＭ１）、ＴＥＭ１７（ＢＳＣ−ＴＥＭ７）、およびＴＥＭ２２（ＢＳＣ−ＴＥＭ９）は、正常ＥＣと比較して腫瘍において特異的に発現していた。ｃＤＮＡ鋳型を、先細のＶ字によって示されるように１：１０、１：１００、１：１０００、および１：１０，０００に希釈した。（図４Ｂ−４Ｊ）ＳＡＧＥによって特定されたＴＥＭの内皮起源が、図３のようにインサイチューハイブリダイゼーションアッセイ法を用いて確かめられた。ＴＥＭ１（ＢＳＣ−ＴＥＭ１）（図４Ｂ）およびＴＥＭ１７（ＢＳＣ−ＴＥＭ７）（図４Ｃ）の発現は、結腸直腸癌のＥＣに高度に特異的であることが証明された。腫瘍の非内皮細胞において検出可能な発現が完全に無いことを示すために、切片を対比染色の非存在下で画像化した。ＥＣにおけるＴＥＭ１７（ＢＳＣ−ＴＥＭ７）の発現は、原発性結腸直腸癌からの肝臓転移病巣（図４Ｄ）、肺癌（図４Ｅ）、乳癌（図４Ｆ）、膵臓癌（図４Ｇ）、および脳癌（図４Ｈ）において、ならびに肉腫（図４Ｉ）において証明された。ＴＥＭ１７（ＢＳＣ−ＴＥＭ７）はまた、黄体の正常な生理学的血管形成中の血管にも局在していた（図４Ｊ）。[0001]
No. 60 / 222,599 filed on Aug. 2, 2000, and US Ser. No. 60 / 224,360 filed on Aug. 11, 2000, and Apr. 11, 2001. I claim the benefit of the application Ser. No. 60 / 282,850, filed on Jan. 10, 2009. These disclosures are expressly incorporated herein.
[0002]
The United States Government has certain rights in the invention under the provisions of the National Institutes of Health Grant Nos. CA57345 and CA43460 that supported this study.
[0003]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to the field of angiogenesis and anti-angiogenesis. In particular, the invention relates to genes that are characteristically expressed in tumor and normal endothelial cells.
[0004]
Background of the Invention
It is now widely accepted that tumors require a blood supply to grow widely. This recognition has stimulated many studies on tumor angiogenesis based on the idea that tumor vasculature is a potential therapeutic target. However, some basic questions about tumor endothelium remain unanswered. For example, are tumor vessels qualitatively different from normal vessels of the same tissue? What is the relationship between the tumor endothelium and other healing wounds or other physiological or pathological forms of angiogenesis? The answers to these questions have significant implications for the potential of new therapies that specifically inhibit angiogenesis.
[0005]
There is a continuing need in the art to characterize tumor vasculature as compared to normal vasculature so that any differences can be used for therapeutic and diagnostic benefits.
[0006]
One technique that can be used to characterize gene expression, or more precisely, gene transcription, is continuous analysis of gene expression (srialaanalysis ofgeneexpress) (SAGE). Briefly, the SAGE method is a method for rapid, quantitative and qualitative analysis of mRNA transcripts based on the isolation and analysis of short defined sequence tags (SAGE tags) corresponding to expressed genes. is there. Each tag is a short nucleotide sequence (9-17 base pairs in length) from a defined position in the transcript. In the SAGE method, tags are dimerized to reduce the bias inherent in cloning or amplification reactions (see US Pat. No. 5,695,937). SAGE is particularly suitable for characterizing genes involved in stimulating or inhibiting vasculature because it can detect rare sequences, allowing multiple sequences to be evaluated at one time. It is particularly suitable to provide a basis for identifying genes that have not been identified.
[0007]
Summary of the Invention
One aspect of the invention is a TEM selected from the group consisting of 1, 3, 9, 17, 19, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 200, 212, 230, 232, and 271 respectively). Provided is an isolated molecule comprising an antibody variable region that specifically binds to an extracellular domain of a protein. The molecule can be, for example, an intact antibody molecule, a single chain variable region (ScFv), a monoclonal antibody, a humanized antibody, or a human antibody. The molecule may be optionally linked to a cytotoxic moiety, may be linked to a therapeutic moiety, may be linked to a detectable moiety, or may be linked to an antitumor agent. .
[0008]
According to another aspect of the present invention, there is provided a method of inhibiting angiogenesis. Extracellular of a TEM protein selected from the group consisting of 1, 3, 9, 17, 19, 22, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 200, 212, 230, 232, 238, and 271, respectively) An effective amount of an isolated molecule comprising an antibody variable region that specifically binds to a domain is administered to a subject in need of inhibiting angiogenesis. As a result, angiogenesis is inhibited. The subject may have, for example, a neovascularized tumor, may have polycystic kidney disease, may have diabetic retinopathy, may have rheumatoid arthritis, You may have psoriasis.
[0009]
Another aspect of the present invention is a method for inhibiting tumor growth. Extracellular of a TEM protein selected from the group consisting of 1, 3, 9, 17, 19, 22, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 200, 212, 230, 232, 238, and 271, respectively) An effective amount of an isolated molecule comprising an antibody variable region that specifically binds to a domain is administered to a tumor-bearing human subject. As a result, tumor growth is inhibited.
[0010]
Yet another aspect of the invention is specific for a TEM protein selected from the group consisting of 3, 9, 17, 19, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 200, 212, 230, 232, and 271 respectively). Provided is an isolated molecule comprising an antibody variable region that specifically binds. The molecule can be, for example, an intact antibody molecule, a single chain variable region (ScFv), a monoclonal antibody, a humanized antibody, or a human antibody. The molecule may be optionally linked to a cytotoxic moiety, may be linked to a therapeutic moiety, may be linked to a detectable moiety, or may be linked to an antitumor agent. .
[0011]
According to yet another aspect of the present invention, there is provided an isolated and purified human transmembrane protein. The protein is selected from the group consisting of TEM3, 9, 17, and 19 (shown in SEQ ID NOs: 200, 212, 230, and 232, respectively).
[0012]
Yet another aspect of the invention includes a transmembrane TEM coding sequence selected from the group consisting of TEMs 3, 9, 17, and 19 (shown in SEQ ID NOs: 200, 212, 230, and 232, respectively). An isolated and purified nucleic acid molecule. The isolated and purified nucleic acid molecule may optionally comprise a coding sequence selected from the coding sequences set forth in SEQ ID NOs: 199, 211, 229, and 231.
[0013]
Yet another aspect of the invention is a recombinant host cell containing the nucleic acid molecule. The nucleic acid molecule comprises a transmembrane TEM coding sequence selected from the group consisting of TEMs 3, 9, 17, and 19 (shown in SEQ ID NOs: 200, 212, 230, and 232, respectively). The recombinant host cell optionally comprises a coding sequence selected from the coding sequences set forth in SEQ ID NOs: 199, 211, 229, and 231.
[0014]
According to one aspect of the invention, there is provided a method of inducing an immune response in a mammal. A nucleic acid molecule comprising a human transmembrane protein coding sequence selected from the group consisting of TEM1, 3, 9, 13, 17, 19, 22, 30, and 44 (each shown in SEQ ID NO :) is present in a mammal. Is administered. Thereby, an immune response against the human transmembrane protein is induced in the mammal. Alternatively, the coding sequence is shown in SEQ ID NOs: 196, 200, 212, 220, 230, 232, 238, 250, and 271.
[0015]
According to yet another aspect of the present invention, there is provided a method of inducing an immune response in a mammal. From the group consisting of TEMs 1, 3, 9, 13, 17, 19, 22, 30, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 200, 212, 220, 230, 232, 238, 250, and 271 respectively). The selected purified human transmembrane protein is administered to a mammal. Thereby, an immune response against the human transmembrane protein is induced in the mammal.
[0016]
Another aspect of the present invention is a method for identifying a ligand involved in the regulation of endothelial cells. The test compound is selected from the group consisting of 1, 3, 9, 13, 17, 30, 19, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 200, 212, 220, 230, 232, 250, and 271). Contacted with the isolated and purified human transmembrane protein. The isolated and purified human transmembrane proteins also include 1, 3, 9, 13, 17, 30, 19, and 44 (SEQ ID NOs: 196, 200, 212, 220, 230, 232, 250, and 271) is also contacted with a molecule comprising an antibody variable region that specifically binds to an extracellular domain of a TEM protein selected from the group consisting of: The binding between the molecule containing the antibody variable region and the human transmembrane protein is measured. Test compounds that decrease the binding of a molecule comprising the antibody variable region to a human transmembrane protein are identified as ligands involved in endothelial cell regulation.
[0017]
Yet another aspect of the invention is a method for identifying a ligand involved in the regulation of endothelial cells. A test compound is contacted with a cell comprising a human transmembrane protein selected from the group consisting of 1, 3, 9, 17, and 19 (shown in SEQ ID NOs: 196, 200, 212, 230, and 232). . The cell is also specific for an extracellular domain of a TEM protein selected from the group consisting of 1, 3, 9, 17, and 19 (shown in SEQ ID NOs: 196, 200, 212, 230, and 232, respectively). It is also contacted with a molecule containing an antibody variable region that binds specifically. The binding between the molecule containing the antibody variable region and the cell is measured. Test compounds that decrease the binding of the cell to a molecule containing the antibody variable region are identified as ligands involved in the regulation of endothelial cells.
[0018]
Yet another aspect of the invention is a method for identifying a ligand involved in the regulation of endothelial cells. The test compounds were 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 40, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 45, and 46 (SEQ ID NOs: 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 223 and 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 358, 257, 259, 261, 263, 267, 269, 271, 273, and 275) are contacted with a human transmembrane protein selected from the group consisting of: The binding between the test compound and the human transmembrane protein is measured. Test compounds that bind to the protein are identified as ligands involved in the regulation of endothelial cells.
[0019]
Another aspect of the invention is TEMs 1, 3, 9, 17, 19, 22, 30, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 200, 212, 230, 232, 238, 250, and 271 respectively). And a soluble form of a human transmembrane protein selected from the group consisting of: The soluble form has no transmembrane domain. The soluble form may consist of the extracellular domain of a human transmembrane protein.
[0020]
A method for inhibiting angiogenesis in a patient is also provided by the present invention. A soluble form of the human transmembrane protein is administered to the patient. As a result, angiogenesis in the patient is inhibited. Patients may have, for example, neovascularized tumors, polycystic kidney disease, diabetic retinopathy, rheumatoid arthritis, psoriasis May be provided.
[0021]
Another aspect of the invention provides a method of inhibiting angiogenesis in a patient. A soluble form of the human transmembrane protein is administered to the patient. As a result, angiogenesis in the patient is inhibited. Patients may have, for example, neovascularized tumors, polycystic kidney disease, diabetic retinopathy, rheumatoid arthritis, psoriasis May be provided.
[0022]
According to yet another aspect of the present invention, there is provided a method of identifying an area of neovascularization in a patient. 1, 3, 9, 13, 17, 19, 22, 30, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 200, 212, 220, 230, 232, 238, 250, and 271 respectively). A molecule comprising an antibody variable region that specifically binds to the extracellular domain of the TEM protein of choice is administered to the patient. The molecule is attached to a detectable moiety. A detectable portion in the patient is detected, thereby identifying angiogenesis.
[0023]
According to another aspect of the present invention, there is provided a method of inducing an immune response against tumor endothelial cells in a patient. 1, 2, 3, 9, 13, 17, 19, 22, and 30 (shown in SEQ ID NOs: 291, 293, 299, 295, 303, 297, 301, 305, and 307). Mouse TEM protein is administered to a patient in need of inducing an immune response against tumor endothelial cells. As a result, an immune response against the human TEM protein is induced.
[0024]
Yet another aspect of the invention is a method of screening for angiogenesis in a patient. A TEM wherein the body fluids collected from the patient are selected from the group consisting of 1, 3, 9, 17, 19, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 200, 212, 230, 232, and 271 respectively). It is contacted with a molecule that includes an antibody variable region that specifically binds to the extracellular domain of the protein. Detection of cross-reactants in body fluids using the molecule indicates angiogenesis in the patient.
[0025]
Yet another aspect of the invention provides a method of inhibiting angiogenesis in a patient. 4, 6, 7, 10, 12, 14, 20, 25, 27, 31, 36, 37, 38, 39, and 40 (202, 206, 208, 214, 218, 223 and 224, 234, 242, 244) 252, 257, 259, 261, 263, and 265) are administered to the patient. As a result, angiogenesis in the patient is inhibited.
[0026]
Yet another aspect of the invention is a method of screening for angiogenesis in a patient. The body fluids collected from the patients were 4, 6, 7, 10, 12, 14, 20, 25, 27, 31, 36, 37, 38, 39, and 40 (SEQ ID NOs: 202, 206, 208, 214, 218, 223 and 224, 234, 242, 244, 252, 257, 259, 261, 263, and 265), comprising an antibody variable region that specifically binds to a TEM protein selected from the group consisting of: Contacted with molecules. Detection of cross-reactants in body fluids using the molecule indicates angiogenesis in the patient.
[0027]
A method for promoting angiogenesis in a patient is also provided by the present invention. 4, 6, 7, 10, 12, 14, 20, 25, 27, 31, 36, 37, 38, 39, and 40 (SEQ ID NOs: 202, 206, 208, 214, 218, 223 and 224, 234, A TEM protein selected from the group consisting of 242, 244, 252, 257, 259, 261, 263, and 265) is administered to a patient in need of angiogenesis. As a result, angiogenesis in the patient is stimulated.
[0028]
One aspect of the present invention provides a method for promoting angiogenesis in a patient. 4, 6, 7, 10, 12, 14, 20, 25, 27, 31, 36, 37, 38, 39, and 40 (SEQ ID NOs: 201, 205, 207, 213, 217, 221 and 222, 233, 241, 243, 251, 256, 258, 260, 262, and 264) is administered to a patient in need of angiogenesis. As a result, TEM protein is expressed and angiogenesis in the patient is stimulated.
[0029]
Another aspect of the invention provides a method of screening for angiogenesis in a patient. 4, 6, 7, 10, 12, 14, 20, 25, 27, 31, 36, 37, 38, 39, and 40 (SEQ ID NOs: 202, 206, 208, 214, 218, 223 and 224, respectively) 234, 242, 244, 252, 257, 259, 261, 263, and 265) are detected in the body fluids collected from the patient. Detection of the TEM protein indicates angiogenesis in the patient.
[0030]
Another aspect of the invention is a method of screening for angiogenesis in a patient. A nucleic acid encoding a TEM protein selected from the group consisting of 4, 6, 7, 10, 12, 14, 20, 25, 27, 31, 36, 37, 38, 39, and 40 was collected from a patient. Detected in body fluids. The nucleic acid is selected from the group consisting of the nucleic acids set forth in SEQ ID NOs: 201, 205, 207, 213, 217, 221 and 222, 233, 241, 243, 251, 256, 258, 260, 262, and 264. Detection of the TEM protein indicates angiogenesis in the patient.
[0031]
Yet another aspect of the present invention provides a method for encoding a NEM protein selected from the group consisting of 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289). Isolated and purified nucleic acid molecules. The nucleic acid molecule optionally comprises a coding sequence as set forth in SEQ ID NOs: 278, 282, 284, and 288. The nucleic acid may be maintained in a recombinant host cell.
[0032]
The present invention also provides an isolated and purified NEM protein selected from the group consisting of 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289). I do.
[0033]
The invention further provides an antibody that specifically binds to a NEM protein selected from the group consisting of 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289). Provided is an isolated molecule comprising a variable region.
[0034]
A further aspect of the invention is a method of inhibiting angiogenesis. An effective amount of a NEM protein selected from the group consisting of 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289) requires inhibition of angiogenesis Administered to the subject. Thereby, angiogenesis is inhibited.
[0035]
Yet a further method of the invention is a method of identifying a candidate drug for treating a tumor. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 40, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 45, and 46 (SEQ ID NOs: 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, respectively) 213, 215, 217, 221 and 222, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 256, 258, 260, 262, 266, 268, 270, 272, and 274) are contacted with a test compound that expresses one or more TEM genes selected from the group consisting of:Expression of one or more TEM genes is measured by hybridization of cellular mRNA with a nucleic acid probe complementary to the mRNA. If a test compound reduces the expression of one or more TEM genes, it is identified as a candidate drug for treating a tumor. Alternatively, the cells are endothelial cells. Alternatively or additionally, the cells are recombinant host cells transfected with an expression construct encoding one or more TEMs. Test compounds that increase expression can be identified as candidates for promoting wound healing.
[0036]
Yet another aspect of the invention is a method of identifying a candidate drug for treating a tumor. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 40, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 45, and 46 (SEQ ID NOs: 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, respectively) 214, 216, 218, 223 and 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 358, 257, 259, 261, 263, 267, 269, 271, 273, and 275), wherein cells expressing one or more TEM proteins selected from the group consisting of That. The amount of one or more TEM proteins in the cell is measured. A test compound is identified as a candidate drug for treating a tumor if it reduces the amount of one or more TEM proteins in the cells. Alternatively, the cells are endothelial cells. Alternatively or additionally, the cells are recombinant host cells transfected with an expression construct encoding one or more TEMs. Alternatively, test compounds that increase the amount of one or more TEM proteins in a cell are identified as candidates for treating wound healing.
[0037]
According to another aspect of the present invention, there is provided a method of identifying a candidate drug for treating a tumor. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 40, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 45, and 46 (SEQ ID NOs: 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, respectively) 214, 216, 218, 223 and 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 358, 257, 259, 261, 263, 267, 269, 271, 273, and 275), wherein cells expressing one or more TEM proteins selected from the group consisting of That. The activity of one or more TEM proteins in the cells is measured. A test compound is identified as a candidate drug for treating a tumor if it reduces the activity of one or more TEM proteins in the cells. Alternatively, the cells are endothelial cells. Alternatively or additionally, the cells are recombinant host cells transfected with an expression construct encoding one or more TEMs. Alternatively, the cells are endothelial cells. If a test compound increases the activity of one or more TEM proteins in a cell, it can be identified as a candidate for treating wound healing.
[0038]
A further aspect of the invention is a method of identifying a candidate drug for treating a patient having a tumor. The test compound is 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 40, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 45, and 46 (SEQ ID NOs: 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, respectively) 214, 216, 218, 223 and 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 358, 257, 259, 261, 263, 267, 269, 271, 273, and 275) with an expression construct encoding one or more TEM proteins selected from the group consisting of It is contacted with transfected recombinant host cells. Cell proliferation is measured. Test compounds that inhibit cell growth are identified as candidate drugs for treating patients with tumors. Test compounds that stimulate cell proliferation are identified as candidate drugs to promote angiogenesis (eg, for use in wound healing).
[0039]
Another aspect of the invention provides a method of identifying a candidate drug for treating a tumor. Cells expressing one or more NEM genes selected from the group consisting of 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 278, 282, 284, and 288, respectively) comprise a test compound and Contacted. Expression of one or more NEM genes is measured by hybridization of cellular mRNA with a nucleic acid probe complementary to the mRNA. If a test compound increases the expression of one or more NEM genes, it is identified as a candidate drug for treating a tumor. Alternatively, the cells are endothelial cells. Alternatively or additionally, the cell is a recombinant host cell transfected with an expression construct encoding one or more NEMs.
[0040]
According to another aspect of the present invention, there is provided a method of identifying a candidate drug for treating a tumor. Cells expressing one or more NEM proteins selected from the group consisting of 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289) are tested. Contacted with the compound. The amount of one or more NEM proteins in the cell is measured. If a test compound increases the amount of one or more NEM proteins in a cell, it is identified as a candidate drug for treating a tumor. Alternatively, the cells are endothelial cells. Alternatively or additionally, the cell is a recombinant host cell transfected with an expression construct encoding one or more NEMs.
[0041]
A further aspect of the invention is a method of identifying a candidate drug for treating a tumor. Cells expressing one or more NEM proteins selected from the group consisting of 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289) are tested. Contacted with the compound. The activity of one or more NEM proteins in the cell is measured. If a test compound increases the activity of one or more NEM proteins in a cell, it is identified as a candidate drug for treating a tumor. Alternatively, the cells are endothelial cells. Alternatively or additionally, the cell is a recombinant host cell transfected with an expression construct encoding one or more NEMs.
[0042]
Yet another aspect of the invention provides a method of identifying a candidate drug for treating a patient having a tumor. The test compound encodes one or more NEM proteins selected from the group consisting of 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289). Contacting a recombinant host cell transfected with the expression construct. Cell proliferation is measured. Test compounds that stimulate cell proliferation are identified as candidate drugs for treating patients with tumors.
[0043]
Another aspect of the present invention is a method for identifying an endothelial cell. TEMs 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 45, and 46 (SEQ ID NOs: 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 223 and 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 358, 257, 259, 261, 263, 267, 269, 271; 273, and 275) and NEMs 14, 22, 23, and 33 (SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289). One or more antibodies that specifically bind to TEM protein or NEM protein selected from the group consisting of that) is contacted with the population of cells. Cells in the population that have bound to the antibody are detected. Cells that have bound to the antibody are identified as endothelial cells. Alternatively, cells that have bound to the antibody are isolated from cells that have not bound.
[0044]
Yet another aspect of the present invention is a method for identifying an endothelial cell. TEMs 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 45, and 46 (SEQ ID NOs: 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 223 and 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 358, 257, 259, 261, 263, 267, 269, 271; 273, and 275) and NEMs 14, 22, 23, and 33 (SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289). One or more nucleic acid hybridization probes complementary to TEM gene or NEM gene nucleic acid sequences selected from the group consisting of that) is contacted with the nucleic acid of the population of cells. A nucleic acid specifically hybridized to the nucleic acid hybridization probe is detected. Cells to which nucleic acids specifically hybridize are identified as endothelial cells.
[0045]
Yet another aspect of the invention is a method of inhibiting angiogenesis. Specific to the extracellular domain of mouse TEM protein selected from the group consisting of 1, 2, 3, 9, 17, and 19 (shown in SEQ ID NOs: 291, 293, 299, 295, 297, and 301, respectively) An effective amount of an isolated molecule containing an antibody variable region that specifically binds is administered to a subject in need of inhibiting angiogenesis. Thereby, angiogenesis is inhibited. The subject may be, for example, a mouse, may have a neovascularized tumor, may have polycystic kidney disease, may have diabetic retinopathy, has rheumatoid arthritis, And may have psoriasis.
[0046]
These and other aspects will be apparent to those of skill in the art upon reading the present specification, and include the detection, diagnosis, and diagnosis of angiogenesis and pathological processes involving or requiring angiogenesis. Reagents and methods for therapy and drug screening are provided in the art.
[0047]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
We found that 46 human genes are expressed at much higher (more than 10-fold) levels in tumor endothelium than normal endothelium, and at much lower levels in human tumors compared to normal endothelium. Thirty-three genes were identified. See Table 2 and Table 4, respectively. Most of these genes were either not expressed or expressed at relatively low levels in endothelial cells (EC) maintained in culture. In addition, we have identified 93 genes that are expressed on both normal and tumor human endothelium. Interestingly, the tumor endothelial gene was expressed in all tumors tested, regardless of tissue or organ origin. Most tumor endothelial genes were also expressed in the corpus luteum and wounds.
[0048]
As the study progressed, we identified our 46 first tumor endothelial markers (tumorendotherialmarcer) was refined and classified. We named these markers TEM and renumbered them according to the prevalence of the tags in our SAGE analysis. Initially, we did not use a serial numbering scheme. Our non-serialized scheme has been re-named BSC-TEM. We now provide full length nucleic acid and protein sequences for most of the first 46 SAGE tags. In some cases, sequences were obtained through public databases, and in other cases, sequences were obtained through cloning and use of gene prediction tools. In some cases, we have discovered SAGE tags that correspond to genes with different splice variants or known polymorphisms. For example, in one example, the SAGE tag BSC-TEM3 has been found to hybridize to an alternatively spliced form of a transcript encoding BSC-TEM7. The proteins encoded by these two transcripts are the same. Therefore, they are cumulatively called TEM7. A highly related sequence BSC-TEM7R was found by homology search. Currently, this paralog sequence is called TEM3. See Table 2 below, which shows tumor endothelial markers by order of predominance (except TEM3). Column 1 shows the dominant number. Column 2 shows the first name. Column 3 shows short tags. Column 4 shows the long tag. Column 5 shows Genbank accession numbers. Column 6 shows sequence identifiers for short tags, long tags, full length nucleic acids, and proteins. Column 7 describes the functions, which are described below in the text.

[0049]
The studies described below provide, fairly and generally, the first and most reliable molecular characterization of EC. These studies have drawn some important conclusions that have a direct bearing on long-standing hypotheses about angiogenesis. First, it is clear that normal and tumor endothelium are highly related and share many endothelial cell-specific markers. Second, it is equally clear that endothelium from tumors is qualitatively different from endothelium from the same type of normal tissue, and also different from primary endothelial cultures. Third, these genes are characteristically expressed in tumors from several different tissue types, demonstrating that tumor endothelium is generally different from normal endothelium. Fourth, genes that are differentially expressed in tumor endothelium are also expressed during other angiogenic processes such as luteinization and wound healing. Therefore, it is more appropriate to consider the formation of new blood vessels in the tumor as "angiogenesis" itself, rather than "tumor angiogenesis". This distinction is important from a variety of perspectives, with tumors restoring the vasculature using many, or essentially the same, signals generated during other physiological or pathological processes. Consistent with thoughts. It is one of the oldest ideas in cancer biology that tumors represent "unhealed wounds".
[0050]
The nature and exact biological function of many of the tumor endothelial markers (TEMs) identified herein are unknown. It is interesting that among the previously characterized genes shown in Table 2, some genes encode proteins involved in extracellular matrix formation or remodeling (TEM6, TEM6, TEM10, TEM7, TEM11, TEM12, TEM14, TEM20, TEM24, TEM25, TEM27, TEM37, TEM38, and TEM40). Extracellular matrix deposition is likely to be important for new blood vessel growth. Finally, the majority of the endothelium-specific transcripts identified herein, whether expressed only in neovasculature or generally only in the endothelium, have been previously characterized. Perhaps not surprisingly, some are not even displayed in the EST database. This may be due, in part, to the fact that the EST database is heavily biased to certain tissues, but furthermore, even in highly vascularized tissues, endothelial cells remain in the population. This may be due to relatively low levels within. Therefore, the sensitivity of the SAGE method is a particularly suitable tool.
[0051]
Sequence and literature studies have allowed the following identifications between the TEM protein families. A TEM protein containing a transmembrane region was identified. TEM proteins containing these transmembrane regions include TEM1, TEM3, TEM9, TEM13, TEM17, TEM19, TEM22, TEM30, and TEM44. The secreted TEM protein was identified. These secretory proteins include TEM4, TEM6, TEM7, TEM10, TEM12, TEM14, TEM20, TEM25, TEM27, TEM31, TEM36, TEM37, TEM38, and TEM39. HeyL (TEM8) is a transcription factor that may be involved in the regulation of TEM as one or more groups. A protein corresponding to the TEM44 tag was found in public databases, but its biological function has not been assigned yet.
[0052]
TEM1 was named endosialin in the literature. It has a signal sequence at amino acids 1-17 and a transmembrane domain at amino acids 686-708. Thus, TEM1 is a cell surface protein. Its extracellular domain is at residues 1-685. Endosialin may be involved in endocytosis. This mouse ortholog was predicted to have a signal peptide at residues 1-21.
[0053]
TEM2 is a 266 amino acid dexamethasone-inducible ras-related protein homolog. It has no signal sequence or transmembrane domain. Therefore, TEM2 is neither a cell surface protein nor a secreted protein. TEM2 plays a role in signal transduction. TEM2 regulates changes in cell morphogenesis, proliferation, and interaction of cells with the extracellular matrix.
[0054]
TEM3 (originally named TEM7R) has both a signal sequence (residues 1-24 or 1-30) and a transmembrane domain (residues 456-477). Thus, TEM3 is a cell surface protein. The extracellular portion of this protein is amino acids 1-455. TEM3 has domains with homology to integrins, plexins, and adhesion molecules. TEM3 has the potential to regulate GTPases that control signaling pathways that connect the plasma membrane receptor to the actin cytoskeleton. In the mouse ortholog, the signal peptide was predicted to be residues 1-30.
[0055]
TEM4 is also known as DKK-3. TEM4 has a signal sequence (residues 1-16), suggesting that TEM4 is a secreted protein. TEM4 regulates wnt signaling and may be involved in angiogenesis and wnt-dependent signaling for endothelial growth. TEM4 is a Wnt oncogene inhibitor, and such inhibition can be measured by assays. Tsuji et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 268: 20-4, 2000.
[0056]
TEM5 does not appear to be a secreted or cell surface protein. TEM5 appears to be a component of the G protein-GTPase signaling pathway.
[0057]
TEM6 is also known as stromelysin-3 / matrix metalloproteinase 11 (MMP-11). TEM6 has a signal sequence at residues 1-31, but no transmembrane domain. TEM6 has an alternative splice site for the signal peptide at residues 108-109. Thus, TEM6 appears to be a secreted protein. TEM6 belongs to the zinc metalloprotease family, also known as the Matrixin subfamily. TEM6 is expressed in most invasive cancers. α1-protease inhibitor is a natural substrate of MMP11. TEM6 degrades extracellular matrix proteins such as collagen and is involved in extracellular matrix remodeling and cell migration. Stromelysin can be assayed, for example, using a casein-resorufin substrate. Tortorella and Arner, Inflammation Research 46 Supp. 2: See S122-3, 1997.
[0058]
TEM7 is a protein of many names, also known as matrix metalloproteinase 2, gelatinase A, and 72KD type IV collagenase. TEM7 has a signal sequence at residues 1-26 and is a secreted protein. Like TEM6, TEM7 belongs to the Matrixin subfamily (zinc metalloproteinase). TEM7 cleaves gelatin I, collagen I, IV, V, VII, and X. TEM7 binds to integrins on endothelial cell surfaces and promotes vascular invasion. TEM7 is involved in tissue remodeling. TEM7 can be assayed using, for example, zymography or quenched fluoresced substrate hydrolysis. Garbett, Molecular Pathology 53: 99-106, 2000. A matrix metalloproteinase fluorogenic substrate assay using methoxycoumarin containing a septapeptide analog of the α2 (I) collagen cleavage site can also be used. Bhide et al. See Periodontology 71: 690-700, 2000.
[0059]
TEM8 is a HEYL protein. TEM8 has no signal sequence or transmembrane domain. TEM8 is associated with the hairy / enhancer of split gene. TEM8 is likely to be a nuclear protein that has a role as a transcription factor. TEM8 belongs to a new class of Notch signal transducers and plays an important role in various developmental processes such as angiogenesis, somatogenesis, and neurogenesis. The SNP at residues 615 and 2201 has a cytosine base. Notch 3 mutations underlie CADASIL vasculopathy. See Meth Dev 2000 Nov; 98 (1-2): 175.
[0060]
TEM9 is a G protein-coupled receptor homolog and has both a signal sequence at residues 1-26 and seven transmembrane domains. Thus, TEM9 is a cell surface protein. Its extracellular region is at amino acids 1-769. The transmembrane domains are at residues 817-829 (TM2 and TM3), residues 899-929 (TM4 and TM5), and residues 1034-1040 (TM6 and TM7). TEM9 acts as a G protein-coupled receptor with an extracellular domain unique to cell adhesion proteins. One of the splice variants may function as a soluble receptor. TEM9 may regulate cell polarity and cell migration. TEM9 may be involved in exocytosis based on latrophilin function. The mouse ortholog has a predicted signal peptide at residues 1-29.
[0061]
TEM10 is collagen type I α2 (COL1A2) having a signal sequence at residues 1-22. TEM10 is an extracellular matrix (ECM) protein secreted after synthesis. TEM10 interacts with a number of proteins, including other ECM proteins, certain growth factors, and matrix metalloproteases. TEM10 is required for inducing endothelial tube formation and is involved in tissue remodeling. The mutation at nucleotide 3233 replacing A has been associated with osteogenesis imperfecta type IV. Mutation at nucleotide 4321 replacing A maintains the wild-type phenotype. Nucleotide 715 is a polymorphic site. Nucleotides 695-748 have been deleted in Ehlers-Danlo syndrome. Other mutations are associated with idiopathic osteoporosis and atypical Marfan syndrome. nucleotide

Mutations in are known. Poly A sites are located at nucleotides 4450, 4550, 4885, and 5082. Poly A signals are located at 4420-4424, 4515-4520, 4529-4534, 4866-4871, 5032-5037, 5053-5058. TEMs 10, 20, and 40 are different isoforms from the same gene, but with different lengths.
[0062]
TEM11 is a naidogen / entactin. TEM11 is a secreted protein having a signal sequence at residues 1-28. TEM11 is an extracellular matrix protein that is a component of the basement membrane. TEM11 binds laminin and collagen IV and other extracellular matrix proteins. TEM11 regulates capillary formation and is involved in tissue remodeling. Mutations have been observed at nucleotides 4265 (T, C), 4267 (G, C, T), and 4738 (T, G). Naidogens can be assayed by their effect on astrocyte morphology. See Grimp et al., GLIA 28: 138-49, 1999.
[0063]
TEM12 is a collagen type VI α3 chain. TEM12 has a signal sequence at residues 1-25. Secreted protein TEM12 is an extracellular matrix protein. TEM12 has a splice variant. TEM12 is the main component of the subendothelial layer and is involved in tissue reconstruction. TEM12 regulates platelet activation and aggregation. Alternatively, the domains to be spliced are located at nucleotides 347-964, 965-1567, 2153-3752, and 4541-5041.
[0064]
TEM13 is also known as Thy-1 glycoprotein. TEM13 has both a signal sequence (residues 1-19) and a transmembrane domain (residues 143-159). Residues 131-161 are removed in a mutated form of this protein. The extracellular region of the protein is at residues 1-142 or 1-130. TEM13 has a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor at residue 130 that anchors TEM13 to the membrane. TEM13 can be detected in soluble form in human serum. TEM13 has been reported to be a marker of activated endothelial cells (a marker of adult angiogenesis but not embryonic angiogenesis). TEM13 on vascular endothelial cells may function as a potential vascular permeability modulator. Antibodies to Thy1 are mitogenic signals for CD4 + CD45 + and CD8 + CD45 + cells, but do not induce proliferation in CD45-T cells. Pingel et al., International Immunology 6: 169-78, 1994. Thy-1 can be assayed as an inhibitor of such a signal.
[0065]
TEM14 is also known as Cystatin S. TEM14 is a secreted protein having a signal sequence at residues 1-20 and an extracellular region at residues 1-141. TEM14 is a cysteine protease inhibitor. TEM14 may regulate cysteine protease functions involved in angiogenesis and tissue remodeling. TEM14 is an inhibitor of papain activity, and such inhibition can be assayed. J. Hiltke et al. Dental Research 78: 1401-9, 1999.
[0066]
TEM15 is collagen type III α1 (COL3A1). TEM15 has a signal sequence (residues 1-23) and is secreted. Type III collagen binds to von Willebrand factor. TEM15 is involved in cell-cell adhesion, proliferation, and migration activities. nucleotide

Mutations have been observed.
[0067]
TEM16 is a tensin homolog, which is apparently an intracellular protein. TEM16 may have a splice variant or isoform. One form having 1704 amino acids has an N-terminal domain region similar to tumor suppressor proteins, phosphatases, and tensin homologs (PTEN). Tensins are focal binding molecules that bind actin and phosphorylated proteins. It is involved in cell migration that connects signaling pathways to the cytoskeleton. PTEN regulates tumor-induced angiogenesis.
[0068]
TEM17 (BSC-TEM7) has a signal sequence including residues 1-18 and a transmembrane domain from residues 427-445. TEM17 is a cell surface marker with an extracellular region containing residues 1-426. TEM17 has homologs in both mice and nematodes (C. elegans). Residues 137-244 have weak homology to naidogen. Residues 280-344 have homology to PSI domains found in plexins, semaphorins, and integrin beta subunit. Mutations have been observed at nucleotides 1893 (A, G), 1950 (C, G), 2042 (A, G), and 2220 (G, A). In mouse TEM17, the signal sequence contains residues 1-19.
[0069]
TEM19 was originally reported to be tumor endothelial marker 8 (i.e., BSC-TEM8). TEM19 has a signal sequence at residues 1-27 and a transmembrane domain at residues 322-343. TEM19 is a cell surface protein with an extracellular region at residues 1-321. TEM19 contains the von Willebrand factor (vWF) A domain at residues 44-216, the domain found in the leukointegrin αD chain at residues 34-253, and the PRAM-1 of the vinculin family at residues 408-560. Or it has the domain found in adapter molecule-1. The function of TEM 19 is related to adhesion. The von Willebrand factor domain is generally involved in various functions, including vascular processes. TEM19 may play a role in vascular endothelial cell migration. The mouse ortholog has a predicted signal peptide at residues 1-27.
[0070]
TEM20 is collagen type I α2 (COL1A2). TEM20 has a signal sequence at residues 1-22 and is a secreted extracellular matrix protein. TEM20 induces endothelial tube formation in vitro and is involved in tissue remodeling. nucleotide

Mutations have been observed in
[0071]
TEM21 is a formin-like protein homolog that is an intracellular protein. Formin-related proteins interact with the Rho family small GTPases, profilins, and other actin-related proteins. The formin binding protein uses its WW domain to bind to the FH1 domain. TEM21 has a proline-rich FH1 domain at residues 221-449. Formin-related proteins play important roles in morphogenesis, cell polarity, cytokinesis, and recognition of the actin cytoskeleton. Formin-related proteins may also regulate apoptosis, cell adhesion, and migration.
[0072]
TEM22 is an endocytic receptor of the macrophage mannose receptor family. TEM22 has both a signal sequence at residues 1-30 and a transmembrane domain at residues 1415-1435, and is present on the cell surface. Its extracellular domain is amino acids 1-1414. TEM22 exists as a soluble (secreted) form and may act as an inhibitor. TEM22 binds secreted phospholipase A2 (sPLA2) and may mediate sPLA2-induced biological responses. TEM22 has the endocytic properties of sPLA2 and may mediate endocytosis of endothelial-associated proteins. TEM22 promotes cell adhesion and may be involved in intercellular communication. Mutations have been observed at nucleotide 5389 (A, G). TEM22 mediates the uptake of microbial and host-derived glycoproteins. See Groger et al. Immunology 165: 5428-34, 2000.
[0073]
TEM24 is tensin, an intracellular protein. TEM24 is a focal binding molecule that binds actin filaments and interacts with phosphotyrosine-containing proteins. TEM24 may mediate kinase signaling activity and regulate cell transformation. Mutations have been observed at nucleotides 2502 (A, G), 2622 (A, G), and 6027 (A, G). TEM24 binds to actin filaments and interacts with phosphotyrosine-containing proteins. Chen et al., Biochem. J. 351 Pt2: 403-11, 2000. TEM24 also binds phosphoinositide 3-kinase. Auger et al. Bio. Chem. 271: 23452-7, 1996. TEM24 also binds to nuclear protein p130. Lo et al., Bioessays 16: 817-23, 1994.
[0074]
TEM25 is a bone morphogenetic protein 1 (BMP-1) having a signal sequence at residues 1-22. TEM25 is a secreted protein. There are at least six BMP-1 isoforms and a splice variant that adds a carboxy-terminal CUB domain and an additional EGF domain. TEM25 is a metalloprotease enzyme. TEM25 cleaves the C-terminal peptide of collagen types I, II, and III and laminin 5γ2, a protein important in vascular processes. TEM25 is involved in cartilage formation. Mutations have been observed at nucleotides 3106 (C, T), 3248 (G, A) and 3369 (G, A). TEM25 cleaves proviglycan at one point and removes the propeptide, producing a biglycan molecule with the same NH (2) terminus as the mature form found in tissues. Sctt et al. Biol. Chem. 275: 30504-11, 2000. Laminin α3 and γ2 short chains are substrates for TEM25. Amano et al. Biol. Chem. 275: 22728-35, 2000.
[0075]
TEM27 is known as secreted protein Slit homolog 3, which has a signal sequence at residues 1-27. TEM27 is a secreted guide protein involved in migration, repulsion, and pattern formation. TEM27 interacts with the "round about" receptor (Robo receptor). TEM27 interacts with extracellular matrix (ECM) proteins and may be involved in cell adhesion. Mutations have been observed at nucleotide 4772 (C, T).
[0076]
TEM28 is similar to mouse nadolin, a neuron-specific GTPase activating protein. TEM28 is an intracellular protein with a RhoGAP domain. The RhoGAP domain activates RhoA, Rac1, and Cdc42 GTPase. TEM28 is involved in promoting actin filament reorganization and exocytosis. TEM28 may also be involved in cell signaling. Mutations have been observed at nucleotide 3969 (A, C).
[0077]
TEM29 is an intracellular protein, protein tyrosine phosphatase type IVA, member 3, isoform 1. TEM29 has an alternative splice variant. TEM29 belongs to a small class of prenylated protein tyrosine phosphatases (PTPs). TEM29 can be attached to the membrane by prenylation. PTP is a cell signaling molecule that plays a regulatory role in various cellular processes and promotes cell growth. PTP PRL-3 regulates angiotensin II-induced signaling events.
[0078]
TEM30 is a cell surface protein integrin α1 that has both a signal sequence (residues 1-28) and a transmembrane domain (residues 1142-1164). Its extracellular region contains amino acids 1-11141. TEM30 is a receptor for laminin and collagen. TEM30 mediates various adhesion interactions. TEM30 is abundantly expressed in microvascular endothelial cells. TEM30 stimulates endothelial cell proliferation and angiogenesis. TEM30 may regulate angiostatin production. Mutations have been observed at nucleotide 418 (C, T). TEM30 activates the Ras / Shc / mitogen activated protein kinase pathway that promotes fibroblast cell proliferation. TEM30 also serves to inhibit collagen and metalloproteinase synthesis. Pozzi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. ScL USA 97: 2202-7, 2000.
[0079]
TEM31 is the secreted protein collagen IVα1 (COL4A1) (residues 1-27). TEM 31 is a component of the basement membrane. TEM31 binds to α3β1 integrin and promotes integrin-mediated cell adhesion. The non-collagen domain of the type IV subunit is involved in tumor angiogenesis. TEM31 is involved in tissue remodeling. Mutations have been observed at nucleotide 4470 (C, T).
[0080]
TEM33 is methylmalonyl-Co-A mutase, a protein located in the mitochondrial matrix. TEM33 breaks down some amino acids, fatty acids of odd acids, and cholesterol and directs them to the tricarboxylic acid cycle. TEM33 deficiency causes a lethal organic acid metabolism disorder called methylmalonic aciduria. nucleotide

Mutations have been observed in TEM33 converts L-methylmalonyl-CoA to succinyl-CoA. This reaction can be assayed as is well known in the art. For example, Clin. Chem. 41 (8 Pt 1): 1164-70, 1995.
[0081]
TEM36 is an extracellular matrix protein collagen XII type α1 (COL12A1) having a signal sequence at residues 1-23 or 24. TEM36 has a von Willebrand factor (vWF) type A domain, a fibronectin type III domain, and a thrombospondin N-terminal-like domain. TEM36 is expressed in response to a stress environment. TEM36 organizes extracellular matrix structures and may be involved in matrix remodeling. There are two isoforms of this protein, a long form and a short form. The short form lacks amino acids 25-1188 and thus nucleotides 73-3564. Both forms share a signal sequence and are therefore secreted.
[0082]
TEM37 is lumican, an extracellular matrix sulfated proteoglycan with a signal sequence at residues 1-18. Lumican interacts with proteins involved in matrix assembly (eg, collagen type I and type VI) and is involved in cell proliferation and tissue morphogenesis. Lumican plays an important role in regulating collagen fiber assembly. Mutations have been observed at nucleotides 1021 (G, T), 1035 (A, G), 1209 (A, G), 1259 (A, C), 1418 (C, A), and 1519 (T, A). TEM37 is a binding partner for TGF-β. FASEB J. 15: 559-61, 2000. One assay that can be used to measure TEM37 activity is the collagen fibril formation / sedimentation assay. Svensson et al., FEBS Letters 470: 178-82, 2000.
[0083]
TEM38 is an extracellular matrix protein collagen type I α1 (COL1A1) having a signal sequence at residues 1-22. Type I collagen promotes endothelial cell migration and angiogenesis, induces tube formation, and is involved in tissue remodeling. Telopeptide derivatives are used as markers for malignancy and invasion of certain cancer types. nucleotide

Mutations have been observed in
[0084]
TEM39 is transforming growth factor β-3 (TGF-β3). TEM39 has a signal sequence at residues 1-23. TEM39 is a secreted protein. TEM39 regulates cell proliferation and differentiation. TGF-β isoforms play a major role in vascular repair processes and remodeling. Mutations have been observed at nucleotide 2020 (G, T).
[0085]
TEM41 resembles an olfactomedin-like protein. TEM41 appears to be an intracellular protein because there is no apparent predicted signal sequence. Olfactomedin is the major glycoprotein of the extracellular viscous matrix of the olfactory epithelium. TEM41 has homology to latrophilin (extracellular region) having a cell adhesion type domain. TEM 41 may be involved in the adhesive function.
[0086]
TEM42 is a cell surface protein MSTP032 protein with a transmembrane domain at residues 42-61. TEM42 is unknown in its function and has little homology to other proteins. Mutations have been observed at nucleotides 418 (A, T) and 724 (C, A).
[0087]
TEM44 is a putative protein FLJ11190 (NM) with two predicted transmembrane domains at residues 121-143 and 176-197. 018354). Residues 144-175 may form an extracellular region. The function of TEM44 is unknown and has no homology to other known proteins.
[0088]
TEM45 is the intracellular protein tropomyosin 1 (α). TEM45 forms a dimer with the β subunit. TEM45 affects actin function. TEM45 may be involved in endothelial cell cytoskeletal rearrangement. Mutations have been observed at nucleotides 509 (A, C), 621 (A, C), 635 (T, G), 642 (C, G), and 1059 (G, T).
[0089]
TEM46 is a peanut-like 1 protein / Septin 5 belonging to the Septin family. Septin family proteins bind to GTP and phosphatidylinositol 4,5 diphosphate. Septin family proteins are involved in cytokinesis and signaling cascades that control cell division.
[0090]
NEM4 is a member 14 (SCYA14) which is a member of the small inducible cytokine subfamily A (cys-cys). NEM4 is a secreted protein characterized by two adjacent cysteine residues. Certain isoforms have no internal 16 amino acids as compared to isoform 2.
[0091]
NEM22 has homology to guanylate kinase interacting protein 1 (Magin-1). NEM22 is a membrane-bound protein.
[0092]
NEM23 is a human signaling lymphocyte activating molecule (SLAM). NEM23 has a signal sequence at residues 1-20. The extracellular domain may be at residues 21-237. There are secreted isoforms of this protein.
[0093]
NEM33 is Netrin-4. NEM33 induces axon outgrowth and promotes vascular development. At high concentrations, axonal growth is inhibited.
[0094]
EC represents only a small fraction of the total cells of normal or tumor tissue, and libraries constructed from unfractionated tissue are expected to represent only the highest levels of expressed EC transcripts. Therefore, the genes described in this study should provide a valuable tool for basic and clinical studies of human angiogenesis in the future. Genes identified as tumor endothelial markers (TEM) correspond to the tags shown in SEQ ID NOs: 94-139, 173-176, 180-186. The gene identified as a normal endothelial marker (NEM) corresponds to the tag shown in SEQ ID NO: 140-172. Genes identified as total endothelial markers (PEMs) (ie, expressed on both tumor and normal endothelial cells) correspond to the tags set forth in SEQ ID NOs: 1-93. Genes previously identified as being predominantly expressed in the endothelium correspond to the PEM tags shown in SEQ ID NOs: 1-6, 8, 10-15. Each class of marker can be used interchangeably for any purpose.
[0095]
Isolated and purified nucleic acids according to the present invention are nucleic acids whose nucleic acids are not linked to the gene to which they are linked in the human genome. In addition, isolated and purified nucleic acids are not present in mixtures (eg, libraries containing a number of distinct sequences from distinct genes). However, the isolated and purified nucleic acids may be linked to other genes to which they are not naturally adjacent (eg, vector sequences or sequences of other genes). The tag disclosed herein is the 3 'sequence of the 3'-most restriction enzyme recognition site of the tagging enzyme used to create the SAGE tag for the method by which the tag was created. In this case, the tag is 3 'of the 3'-most NlaIII site in the cDNA molecule corresponding to the mRNA. The nucleic acid corresponding to the tag may be, for example, RNA, cDNA, or genomic DNA. Such corresponding nucleic acids can be determined by comparison to a sequence database to confirm sequence identity. Sequence comparisons can be performed using any available technique, for example, BLAST, available from the National Center for Biotechnology at the National Library of Medicine. Tags can also be used as hybridization probes to genomic or cDNA libraries to identify the gene from which the tag was obtained. Thus, using sequence comparison or cloning or a combination of these methods, one skilled in the art can obtain the full-length nucleic acid sequence. The gene corresponding to the tag is the 3 'end of the coding sequence or the tag sequence of the 3' untranslated region (UTR) (the 3 'end of the cDNA recognition site of the restriction endonuclease used to create the tag). 3 '). The nucleic acid may be a sense strand or an antisense strand. Nucleic acids and proteins are disclosed herein with the detailed content of the sequence, but may be from a single individual. Allelic variants arising in the human population are included within such nucleic acids and proteins. One skilled in the art can identify allelic variants such as the same gene or protein. Given the nucleic acid, one of skill in the art can readily determine the open reading frame present, and thus easily determine the sequence of the polypeptide encoded by the open reading frame, using techniques well known in the art. Such a protein can be expressed in a suitable host. Proteins containing such polypeptides can be naturally occurring proteins, fusion proteins containing exogenous sequences from other genes from humans or other species, epitope-tagged polypeptides, and the like. Isolated and purified proteins are not intracellular, but are separated from normal cellular components such as nucleic acids, lipids, and the like. Generally, proteins are to the extent that they constitute the most prevalent protein species in the composition (eg, greater than 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or even 95% of the protein present). Purified.
[0096]
Using the protein according to the present invention, those skilled in the art can easily generate an antibody that specifically binds to the protein. Such antibodies may be monoclonal or polyclonal. The antibodies may be chimeric, humanized, or all human. Any functional fragment or derivative of an antibody can be used, including Fab, Fab ', Fab2, Fab'2, and single chain variable regions. Fragments or derivatives can be used as long as they retain the binding specificity for the endothelial marker protein. By comparing binding to an appropriate antigen or binding to an unrelated antigen or antigen mixture under a particular set of conditions, the binding specificity of the antibody can be tested. An antibody is considered specific if it binds to the appropriate antigen at least 2-fold, 5-fold, 7-fold, preferably 10-fold or more than an unrelated antigen or mixture of antigens.
[0097]
Techniques for making such fully human antibodies from partially human antibodies are well known in the art, and any such technique can be used. According to one particularly preferred embodiment, fully human antibody sequences are generated in transgenic mice that have been engineered to express human heavy and light chain antibody genes. Multiple strains of such transgenic mice have been created that are capable of producing different classes of antibodies. To create a hybridoma cell line for continuous production of the desired antibody, B cells from a transgenic mouse producing the desired antibody can be fused. For example, Nina D. Russell (Nina D. Russel), Jose R. F. Carvalan (Jose RF Corvalan), Michael L. Gallo (Michael L. Gallo), C.I. C. Geoffrey Davis, Liise-Anne Pirovski, "Production of a Human Antibody Outcome Antibody Protective Antibody Protective Antibody Protective Antibody Protective Antibody Protective Antibody Protective Antibody Protective Antibody Protective Antibody Protective Antibody against Protective Antibody Protective Antibody Protective Antibody Protective Antibody Protective Antibody Protective Antibody Protective Antibodies Human Immunoglobulin Loci) "Infection and Immunity April 2000, pp. 1820-1826; Gallo, Barajimiru E. Ivanov (Vladimir E. Ivanov), Aya Jakobovits, and C.I. Geoffrey Davis, “Human immunoglobulin loci introduced into mice: Utility of the V (D) and J gene segments resembling human adults (The human immunoglobulin loci introduced into mic: V (D) and J gene segment age. similar to that of adult humans) "European Journal of Immunology 30: 534-540, 2000; Green (Larry L. 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Opinion in Biotechnology, Vol. 6, No. 5, pp. 561-566 (1995); Mendez M, Abderahim H, Noguchi M, David N, Hardy M, Hardy M, Green L, Tsudah H (Noguchi M) Tsuda H), Yoast S, Maynard Cree C, Garza D, Gemmill R, Jacobovitsu A, Krapo Tus S (Klapolz S) "Analysis of the structural integrity of YACs comprising human immune system medicine in genomic medicine in germ institutional medicine in gastroinstitutional medicine in genomic medicine in linguistic analysis of yeast and embryonic stem cells. Jakobovitsu A, "YAC Vectors: Humanizing the mouse genome", Current Biology 4, 8, 761-763 (1994); Albones M (1994). Arbones M), Old D (Old D), Ray K (Ley ), Ratech H, Maynard Cree K, Otten G, Capon D, Tedder T, "Lymphocyte homing and lymphocyte rolling and migration are L-selectin deficient mice. (Lymphocyte homing and leukocyte rolling and migration are impaired in L-selectin-deficient mice), Immunity 1, 4, 247-260 (1994 K; M. Derdy, Greene, L.M. 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[0098]
Antibodies can also be made using phage display technology. Such techniques can be used to isolate the original antibody, or to create variants with altered specificity or avidity properties. Single-chain Fv can also be used for ease of use. Antibodies can be made from the vaccinated transgenic mice, if desired. Antibodies can be produced in cell culture, phage, or a variety of animals including, but not limited to, bovine, rabbit, goat, mouse, rat, hamster, guinea pig, sheep, dog, cat, monkey, chimpanzee, ape. it can.
[0099]
Antibodies can be labeled with a detectable moiety, such as a radioactive atom, a chromophore, a fluorophore, or the like. Such labeled antibodies can be used for diagnostic techniques in vivo or in an isolated test sample. Antibodies can also be conjugated to pharmaceuticals such as, for example, chemotherapeutic drugs or toxins. An antibody can be linked to a cytokine, ligand, another antibody. Suitable agents for binding to the antibody to achieve anti-tumor effect include cytokines (eg, interleukin 2 (IL-2)) and tumor necrosis factor (TNF); light for use in photodynamic therapy. Sensitizers (including aluminum (III) phthalocyanine tetrasulfonate, hematoporphyrin, and phthalocyanine); radionuclides (e.g., iodine-131 (¹³¹I), yttrium-90 (⁹⁰Y), bismuth-212 (²¹²Bi), bismuth-213 (²¹³Bi), technetium-99m (^99mTc), rhenium-186 (¹⁸⁶Re), and rhenium-188 (¹⁸⁸Re)); antibiotics (eg, doxorubicin, adriamycin, daunorubicin, methotrexate, daunomycin, neocarzinostatin, and carboplatin); bacterial toxins, plant toxins, and other toxins (eg, diphtheria toxin, pseudomonas exotoxin A, grape) Streptococcal enterotoxin A, abrin A toxin, ricin A (deglycosylated ricin A and native ricin A), TGF-α toxin, taiwan cobra (naja naja atra) cytotoxin, and gelonin (plant toxin); And ribosome-inactivating proteins derived from fungi (eg, restrictocin (ribosome-inactivating protein produced by Aspergillus restrictus), saposome (Ribosome-inactivating protein from Saponaria officinalis) and RNase); tyrosine kinase inhibitor; ly207702 (purine difluoride nucleoside); antitumor agents (eg, antisense oligonucleotides, encoding toxins) Liposomes, including plasmids, methotrexate, etc.); and other antibodies or antibody fragments (eg, F (ab)).
[0100]
One of skill in the art would readily understand and make such antibody derivatives, as are well known in the art. Antibodies may be cytotoxic in and of themselves, and may be used to deliver cytotoxic agents to specific locations in the body. Antibodies can be administered to an individual in need thereof as a form of passive immunization.
[0101]
Characterizing the extracellular region of cell surface proteins and secreted proteins from protein sequences is based on prediction of signal sequences, transmembrane domains, and functional domains. Preferably, the antibody specifically immunoreacts with a membrane-bound protein (especially the extracellular domain of such a protein) or a secreted protein. Such targets are readily accessible to antibodies, which generally do not access the interior or nucleus of cells. However, for some applications, antibodies to intracellular proteins may also be useful. In addition, intracellular proteins may be excellent targets as well, since cell lysates may be used instead of whole cell assays for diagnostic purposes.
[0102]
Computer programs can be used to identify the extracellular domain of a protein of known sequence. Such programs include SMART software (Schultz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 5857-5864, 1998) and Pfam software (Bateman et al., Nucleic acids Res. 28: 263-). 266, 2000), and PSORTII. Generally, such programs specify transmembrane domains. The extracellular domain is identified as immediately adjacent to the transmembrane domain. The prediction of extracellular regions and signal cleavage sites is only approximate. This prediction may have an error range of ± 5 residues. Three different methods for high accuracy (Nielsen et al., Protein Engineering 10: 1-6, 1997, Jagla et al., Bioinformatics 16: 245-250, 2000, Nakai, K and Holton ( Horton, P.) Trends in Biochem. Sci. 24: 34-35, 1999) can be used to predict the signal sequence. Similarly, transmembrane (TM) domains can be identified by multiple prediction methods (Pasquier et al., Protein Eng. 12: 381-385, 1999; Sonnhammer et al., In Proc. Of Sixth). Int. Conf. On Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 175-182, J. Glasgow, T. Littlejohn, T. Littlejohn, F. Major (R. Rasp) Lathrop), D. Sankoff, and C. Sensen, eds., Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998, Klein. , Biochim.Biophys.Acta, 815: 468,1985, Nakai (Nakai) and Kanehisa (Kanehisa) Genomics, 14: 897-911,1992). Where ambiguous, the location of a functional domain in a well-characterized protein is used as an indicator to specify cellular localization.
[0103]
Putative functions or functional domains of the novel protein can be determined from homologous regions in databases identified by BLAST searches (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997) and / or from conserved domain databases (eg, Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Res. 27: 260-262, 1999), BLOCKS (Henikoff et al., Nucl. Acids Res. 28: 228-230, 2000), and SMART (Ponting et al.). , Nucleic Acid Res. 27, 229-232, 1999)). In single transmembrane domain proteins (out-in or type I class), the extracellular domain includes the region adjacent to one transmembrane domain. In the case of multiple transmembrane domain proteins, the extracellular domain also includes the region between two adjacent transmembrane domains (in-out and out-in). In the case of type II transmembrane domain proteins where the N-terminal region is in the cytoplasm, the region behind the transmembrane domain is generally extracellular. On the other hand, secreted proteins do not have a transmembrane domain, and thus the entire protein is considered extracellular.
[0104]
The membrane-associated protein can be engineered to delete the transmembrane domain, thus leaving the extracellular portion capable of binding the ligand. Such a soluble form of the transmembrane receptor protein can be used to compete with the native form for binding to a ligand. Thus, such soluble forms act as inhibitors, identifying therapeutics as anti-angiogenic agents, as diagnostic tools for quantifying natural ligands, and identifying small molecules that modulate or mimic TEM: ligand complex activity. To perform the assay.
[0105]
Alternatively, the endothelial marker itself can be used as a vaccine to raise an immune response in the vaccinated animal or human. For such use, a protein or immunogenic fragment of such a protein, corresponding to an intracellular, extracellular, or secreted TEM of interest, is administered to the subject. The immunogenic agent may be supplied as a purified preparation, or may be supplied inside a cell that expresses appropriately. Administration may be directly by delivering the immunogenic agent to the subject, and under conditions that result in the expression of the immunogenic agent of interest in the subject, the nucleic acid encoding the immunogenic agent. May be performed indirectly by delivering The TEM of interest may be delivered in an expressing cell (eg, a population of purified or fused tumor endothelial cells and dendritic cells). The nucleic acid encoding the TEM of interest may be delivered in a viral or non-viral delivery vector or vehicle. Non-human sequences encoding a human TEM of interest or other mammalian homologs can be used to induce a desired immune response in a human subject. Some mouse, rat, or other orthologous sequences of the TEMs of the invention are described herein. Alternatively, orthologous sequences can be obtained from the literature or using techniques within the skill of the art.
[0106]
The markers disclosed herein as being endothelial cell-specific can be used to identify endothelial cells. These markers include the human markers identified by SEQ ID NOs: 1-172 (ie, normal endothelial markers, total endothelial markers, and tumor endothelial markers). Homologous mouse markers include the tumor endothelial markers of SEQ ID NOs: 182-186 and 190-194. Such antibodies can be used to identify such markers by contacting a cell population containing endothelial cells with an antibody specific for such a marker. Specific cells are identified as endothelial cells by the presence of a substance that cross-reacts with the antibody. Similarly, cell lysates can be tested for the presence of cross-reactants. Any known format or technique for detecting cross-reactants can be used, including immunoblots, radioimmunoassays, ELISAs, immunoprecipitations, and immunohistochemistry. In addition, nucleic acid probes for these markers can be used to identify endothelial cells. Any hybridization technique known in the art can be used, including Northern blotting, RT-PCR, microarray hybridization, and in situ hybridization.
[0107]
By testing cells suspected of containing one or more TEMs, tumor endothelial cells can be identified for diagnostic purposes. The tissues and fluids of the subject can be tested. For example, a patient's blood can be tested for evidence of intracellular and membrane-bound TEM and secreted TEM. Intracellular TEM and / or membrane-bound TEM may be present in body fluids as a result of high level expression of these factors and / or by lysis of cells expressing TEM.
[0108]
Populations of various types of endothelial cells can also be generated using antibodies to the endothelial markers of the present invention. Antibodies can be used to purify a cell population according to any technique known in the art. Such techniques include, but are not limited to, fluorescence activated cell sorting. Using such a technique, at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% and even 99% of the desired endothelial cells Isolation of a population that is a type (whether the desired endothelial cell type is normal endothelial cells, tumor endothelial cells, or whole endothelial cells) is enabled. Antibodies can be used to positively and negatively select such populations. Preferably, at least one, five, ten, fifteen, twenty, or twenty-five of the appropriate markers are expressed by the endothelial cell population.
[0109]
Endothelial cell populations generated as described herein can be used in drug screening to identify drugs suitable for inhibiting tumor growth by inhibiting tumor vasculature growth.
[0110]
Endothelial cell populations generated as described herein can be used to modulate angiogenesis, such as inhibiting tumor growth by inhibiting endothelial cell proliferation (eg, inhibiting the growth of tumors or other undesirable vasculature). Can be used in candidate drug screening to identify suitable candidate drugs or to promote endothelial cell proliferation and thus stimulate the growth of new or additional large blood vessels or microvasculature .
[0111]
Inhibition of endothelial cell proliferation means regression of pre-existing vasculature or delayed development of new angiogenesis or no development of new angiogenesis in the treated system compared to the normal system . By stimulating endothelial cell proliferation, the development of new (angiogenesis) or additional vasculature (revascularization) can be affected. Various model screening systems can be utilized to test the angiogenic and / or anti-angiogenic properties of a particular candidate drug. Common tests include assays that measure the endothelial cell response (eg, proliferation, migration, differentiation, and / or intracellular interactions) of a particular candidate drug. Such tests allow one to study the signals and effects of the test stimulus. Common screens include heparanase inhibition, endothelial tube formation on Matrigel, endothelial cell motility induced by scratching, proliferation of vascular smooth muscle cells by platelet-derived growth factor, and rat aortic ring Some involve the measurement of assays, which provide the advantage of forming capillaries rather than just one cell type.
[0112]
Drugs can be screened for their ability to mimic or modulate, inhibit or stimulate the growth of tumor and / or normal endothelial cells. Drugs can be screened for their ability to inhibit tumor endothelial growth but not normal endothelial growth or survival. Similarly, a test substance can be contacted with a human cell population (eg, a normal endothelial population or a tumor endothelial cell population) and the expression of a tumor endothelial marker and / or a normal endothelial marker can be measured. Test substances that reduce the expression of tumor endothelial markers (TEMs) are candidates for inhibiting tumor angiogenesis and growth. Conversely, markers (NEM) that are expressed only on normal endothelium but not on tumor endothelium can be monitored. Test substances that increase NEM expression in tumor endothelium and other human cells can be identified as candidates for anti-tumor or anti-angiogenic agents. If the activity of the TEM or NEM is known, the agent can be screened for its ability to decrease or increase the activity.
[0113]
For tumor endothelial markers identified as containing a transmembrane region, it is desirable to identify drug candidates that can bind to TEM receptors found on the cell surface. For certain applications, it is desirable to identify drug candidates capable of blocking TEM receptors from native ligands. For certain applications, identifying drug candidates that can bind to the TEM receptor can be used as a means to deliver therapeutic or diagnostic agents. For other uses, it is desirable to identify drug candidates that can mimic the activity of the native ligand. Thus, by manipulating the binding of the transmembrane TEM receptor: ligand complex, it may be possible to promote or inhibit the further development of endothelial cells and thus promote or inhibit angiogenesis.
[0114]
For tumor endothelial markers identified as secreted proteins, it is desirable to identify drug candidates that can bind to secreted TEM proteins. For certain applications, it is desirable to identify drug candidates that can prevent the binding of secreted TEM to its native receptor. For other uses, it is desirable to identify drug candidates that can mimic the activity of the native receptor. Thus, by manipulating the binding of the secreted TEM: receptor complex, it may be possible to promote or inhibit the further development of endothelial cells and thus promote or inhibit angiogenesis.
[0115]
Expression can be monitored according to any convenient method. The protein or mRNA can be monitored. Any technique known in the art for monitoring specific gene expression can be used. Such techniques include, but are not limited to, ELISA, SAGE, microarray hybridization, Western blot. Altered expression of a single marker can be used as a measure of significant effect as a potential pro-angiogenic, anti-angiogenic, or anti-tumor agent. However, it may be desirable to screen for test substances that can modulate the expression of at least 5, 10, 15, or 20 of related markers, such as tumor endothelial markers or normal endothelial markers. Inhibition of TEM protein activity can also be used as a drug screen. For this purpose, human and mouse TEMS can be used.
[0116]
Test substances for screening may be from any source. The test substance may be a natural product library, a combinatorial chemical library, a biological product created by a recombinant library, and the like. The source of the test substance is not critical to the invention. The present invention provides a means for screening compounds and compositions that may have been previously overlooked in other screening methods. The marker nucleic acids and the corresponding encoded proteins of the present invention can be used therapeutically in a variety of formats. NEM can be used to limit, reduce, shrink, or inhibit the growth of tumors or other abnormal or undesirable vasculature. TEM can be used to stimulate vasculature growth (eg, for wound healing) or to bypass obstructed blood vessels. Nucleic acids and encoded proteins can be administered by any means known in the art. Such methods include, but are not limited to, methods using liposomes, nanospheres, viral vectors, non-viral vectors, etc. containing polycations. Suitable viral vectors include adenovirus, retrovirus, and Sindbis virus. The mode of administration may be any known in the art, including parenteral, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, topical, intranasal, rectal, intrabronchial, and the like.
[0117]
Specific biological antagonists of TEM can also be used to achieve therapeutic benefit. To limit, inhibit, reduce and / or reduce the growth of tumors or other abnormal or undesirable vasculature, for example, antibodies, T cells specific for TEM, anti- Ribozymes specific to sense and TEM can be used. Such antagonists can generally be administered as is well known in the art for these classes of antagonists. To inhibit tumor growth and to treat diabetic retinopathy, rheumatoid arthritis, psoriasis, polycystic kidney disease (PKD), and other diseases that require angiogenesis due to pathology, Formable drugs and drugs can be used.
[0118]
The mouse counterpart to human TEMS can be used in a mouse cancer model or cell line or in vitro to evaluate potential anti-angiogenic or anti-tumor compounds or anti-angiogenic or anti-tumor therapies. Their expression can be monitored as an indication of the effect. Mouse TEM is disclosed in SEQ ID NOs: 182-186 and 190-194. Mouse TEM can be used as an antigen to raise antibodies that can be tested in a mouse tumor model. Mouse TEM having a transmembrane domain is particularly preferred for this purpose. Mouse TEM can also be used as a vaccine to raise an immune response in humans against human orthologs.
[0119]
The foregoing disclosure broadly describes the present invention. All references disclosed herein are expressly incorporated by reference. A more complete understanding can be obtained by reference to the following specific examples. The following specific examples are set forth herein by way of illustration only and are not intended to limit the scope of the invention.
[0120]
Example 1
Visualization of the vasculature of colorectal cancer
To address the issue of tumor angiogenesis, the endothelium of human colorectal cancers was selected based on the high incidence of these cancers, their relatively slow growth, and resistance to antineoplastic drugs Was done. Rare tumor types, such as glioblastoma, are highly vascularized and may be good targets for antiangiogenic therapy, while human colorectal cancer and other common solid tumors The importance of angiogenesis for type proliferation is not well documented.
[0121]
We started by staining the blood vessels of colorectal cancer using von Willebrand factor (vWF) as a marker. In each of the six colorectal tumors, this examination revealed dense blood vessels throughout the tumor parenchyma (examples of FIGS. 1A and B). Interestingly, these analyzes are important because these endothelium are often surrounded by perivascular cuffs of living cells, with a clear circle of necrotic cells around them. This was also demonstrated (example of FIG. 1A). Although these preliminary studies suggest that colon tumors are angiogenesis-dependent, there is currently no reliable marker that can distinguish between colon cancer vessels and normal colon vessels. One way to determine whether such markers are present is by analyzing gene expression profiles in endothelium from normal and neoplastic tissues.
[0122]
Example 2
Endothelial cell purification
A comprehensive, systematic analysis of gene expression in tumor and normal endothelium has been hampered by at least three experimental obstacles. First, the endothelium is entangled in a complex tissue consisting of vascular wall components, stromal cells, and neoplastic cells, which requires sophisticated means of purifying ECs for analysis. Second, until recently, techniques were not available to define a comprehensive gene expression profile. Third, few endothelial cells are present in tumors, which requires the development of suitable methods for the analysis of comprehensive gene profiles from relatively few cells.
[0123]
To overcome the first obstacle, we first purify EC from dispersed human colorectal tissue using the endothelial marker CD31 commonly used for EC purification. Tried. This considerably enriched the EC, but also contaminated the preparation with hematopoietic cells (most likely due to the expression of CD31 by macrophages). Accordingly, the present inventors have developed a new method for purifying EC from human tissue using the recently described EC marker P1H12. Unlike CD31, P1H12 was specifically expressed in ECs of both colorectal tumors and normal colorectal mucosa. In addition, immunofluorescence staining of normal colon and colon cancer using known cell surface endothelial marker panels (eg, VE-cadherin, CD31, and CD34) makes P1H12 unique because it stained all blood vessels, including microvessels. (See FIG. 2A; data not shown). In addition to selection with P1H12, to optimize stripping of ECs from neighbors without destroying cell surface proteins, and to use positive and negative affinity purification using antibody cocktails Was required (FIG. 2B). EC purified from normal colorectal mucosa and colorectal cancer essentially contained epithelial and hematopoietic cells as judged by RT-PCR (FIG. 2C) and subsequent gene expression analysis (see below). Not included.
[0124]
Example 3
Comparison of tumor endothelial cell expression pattern and normal endothelial cell expression pattern
To overcome the remaining obstacles, a modified version of the SAGE method was used. In SAGE, an individual mRNA transcript is linked to a 14 base pair tag from a specific location near its 3 'end. The amount of each tag provides a quantitative measure of the level of transcript present in the studied mRNA population. SAGE does not rely on existing expressed gene databases and thus provides unbiased gene expression profile diagrams. This feature is particularly useful in the analysis of cells that make up only a small portion of the tissue under study, as transcripts from these cells are unlikely to be well represented in existing EST databases. is important. We have modified the SAGE protocol so that it can be used on a small number of purified ECs obtained from the procedure outlined in FIG. 2B. A library of about 100,000 tags from purified colorectal cancer EC and a similar library from normal colon mucosal EC from the same patient were made. These approximately 193,000 tags corresponded to more than 32,500 unique transcripts. Examination of the expression patterns of hematopoietic, epithelial and endothelial markers confirmed the purity of the preparation (FIG. 2D).
[0125]
Example 4
Normal and tumor endothelial markers
We next seek to identify whole endothelial markers (PEMs), ie transcripts that are expressed at very high levels in both normal and tumor-associated endothelium compared to other tissues. did. To identify such PEMs, tags that had been expressed at similar levels in both tumor and normal ECs had approximately 1.8 million tags derived from various cell lines derived from tumors of non-endothelial origin. Compared to tags. This simple comparison identified 93 transcripts that were markedly EC-specific (ie, expressed at least 20-fold higher levels in ECs in vivo compared to non-endothelial cultured cells). The 15 tags corresponding to the characterized genes that were most highly and specifically expressed in the endothelium are shown in Table 1A. Twelve of these fifteen most abundant endothelial transcripts have previously been shown to be predominantly expressed in endothelium, while the other three genes have not previously been associated with endothelium. (Table 1A). These datasets also revealed a number of new PEMs that became increasingly dominant as tag expression levels decreased (Table 1B). For many of these transcripts, their endothelial origin was confirmed by SAGE analysis of approximately 401,000 transcripts obtained from primary cultures of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and human dermal microvascular endothelial cells (HMVEC). (Tables 1A and B). To further demonstrate the in vivo expression of these PEMs, we have developed a sensitive, non-radioactive in situ, which allows relatively low levels of expressed transcripts to be detected in frozen sections of human tissue. A Chu hybridization method was developed. For this analysis, two uncharacterized markers PEM3 and PEM6 were selected. In both cases, highly specific expression was clearly restricted to normal and neoplastic vascular ECs (FIGS. 3A and B; data not shown). These data also suggest that ECs maintained in culture do not completely repeat the expression patterns observed in vivo. For example, Hevin and some other PEMs were expressed at high levels in both tumor and normal ECs in vivo, but few or no transcripts were detected in cultured HUVECs or HMVECs None (Table 1). The source of the Hevin transcript was confirmed to be the endothelium by in situ hybridization in normal and malignant colorectal tissues (FIG. 3C).
[0126]
Many of the markers reported in Table 1 were expressed at significantly higher levels than previously characterized genes commonly associated with EC. For example, the top 25 markers were all expressed in excess of 200 copies per cell. In contrast, VEGF receptors (VEGFR-1 and VEGFR-2) were expressed at less than 20 copies per cell. Interestingly, VEGFR2 (KDR), previously reported to be up-regulated in blood vessels during colon cancer progression, was found to be expressed in both normal and neoplastic colorectal tissues (Fig. 3D and E). The lack of specificity of this gene was consistent with SAGE data indicating that VEGFR was expressed at 12 copies per cell in both normal and tumor endothelium.
[0127]
Example 5
Tumor endothelium vs. normal endothelium
The inventors then attempted to identify transcripts that are differentially expressed in endothelium obtained from normal or neoplastic tissue. This comparison revealed 33 tags that are predominantly expressed in normal-derived endothelium at levels at least 10-fold higher than tumor-derived endothelium. Conversely, 46 tags were expressed at 10-fold or higher levels in tumor vessels. Our later work focused on this class because transcripts that were expressed at high levels in tumor endothelium are most likely to be useful in the future for diagnostic and therapeutic purposes. Of the top 25 most differentially expressed tags, 12 tags correspond to the 11 genes previously identified, one with a selective polyadenylation site (see Table 2). See). Of these ten genes, six have been identified as markers associated with angiogenic blood vessels. The remaining 14 tags corresponded to uncharacterized genes, most of which were only deposited as ESTs (Table 2).
[0128]
To demonstrate the expression pattern of these genes, we found nine tumor endothelial markers (BSC-TEM1-9; TEM1,2,5,9) where EST sequences were available but no other information was available. , 16, 17, 19, and 22) (Table 2). These tags were among the most differentially expressed ones on the list and were chosen merely because we were able to obtain suitable probes. In many cases, this required obtaining near full-length sequences by multiple rounds of sequencing and cDNA walking (see accession numbers in Table 2). RT-PCR analysis was then performed to evaluate the expression of the corresponding transcripts in purified ECs obtained from normal and tumor tissues of two patients different from those used to construct the SAGE library. Was used. As shown in FIG. 4A, the vWF gene, which was predicted to be expressed on both normal and tumor endothelium based on SAGE data and previous studies, was at approximately the same level in normal and tumor ECs from both patients. It was expressed but not in purified tumor epithelial cells. As expected, PEM2 showed a similar pattern as vWF. In contrast, all nine TEMs selected for this analysis were significantly expressed in tumor ECs, but were absent or barely detectable in normal ECs (Table 3 and FIG. Example of 4A). It is important to note that these RT-PCR assays were extremely sensitive expression indicators, with no detectable transcripts in normal endothelium and even at a 100-fold dilution. The presence of detectable transcripts in tumor endothelial RNA also provides compelling corroborative evidence of these differential expressions. These results also indicate that these transcripts were not merely differentially expressed in the EC of the first patient, but rather were generally characteristic of colorectal cancer endothelium.
[0129]
Due to the possibility that a small number of non-endothelial cells contaminated the cell populations used for SAGE and RT-PCR analysis, these non-endothelial cells may have contributed to the marked differences in the expression of the transcripts mentioned. Can be argued that the result has become unreliable. To rule out this possibility, we performed in situ hybridization on normal and neoplastic colon tissue. In each case where transcripts could be detected (BSC-TEM 1, 3, 4, 5, 7, 8, and 9; TEM 1, 5, 9, 17, and 19), transcripts were specific for EC. It was localized (example in Table 3 and FIGS. 4B and C). Care must be taken when interpreting the negative in situ hybridization results, but none of the TEMs was expressed in vascular ECs associated with normal colorectal tissue even though vWF and hevin were clearly expressed (Table 3). ).
[0130]
Example 6
Tumor endothelial markers are expressed in multiple tumor types
Are these transcripts specifically expressed in the endothelium of primary colorectal carcinomas, or did they generally exhibit characteristics of tumor endothelium? To address this issue, we expressed representative TEM (BSC-TEM7; TEM17) in liver metastases from colorectal cancer, sarcomas, and primary tumors of the lung, pancreas, breast, and brain. Studied. As shown in FIG. 4, transcripts were found to be specifically expressed on the endothelium of each of these metastases, both metastatic (FIG. 4D) and primary (FIG. 4E-I). Analysis of the other six TEMs (BSC-TEMs 1, 3, 4, 5, 7, 8, and 9; TEMs 1, 5, 9, 17, and 19) showed similar results in lung tumors, brain tumors, and metastatic foci of the liver. (See Table 3).
[0131]
Example 7
Tumor endothelial markers are angiogenic
Finally, we asked whether these transcripts are expressed in angiogenic conditions other than those associated with tumorigenesis. Therefore, we performed in situ hybridization on luteal tissue as well as healing wounds. With exceptions, we have found that these transcripts are commonly expressed both in the corpus luteum and in the granulation tissue of healing wounds (examples in Table 3 and FIG. 4J). ). In all tissues studied, expression of the gene was absent or restricted to the EC compartment only.
[0132]
References and annotations
The disclosure of each cited reference is expressly incorporated herein.

8. The original EC isolation protocol is the same as the protocol shown in FIG. 2B, except that dispersed cells were stained with anti-CD31 antibody instead of anti-P1H12, and magnetic beads for CD64 and CD14 were not included in the negative selection. there were. After generating 120,000 SAGE tags from these two EC populations, careful analysis of the SAGE data revealed that in addition to endothelial-specific markers, there were also some macrophage-specific markers.

11. To reduce the minimum amount of starting material required from about 50 million cells to about 50,000 cells (ie, about 1/1000), we and others (38) have Several improvements were introduced to the SAGE protocol. A detailed description of our improved "Micro SAGE" protocol is available from the authors upon request.
12. 96,694 and 96,588 SAGE tags (derived from normal and tumor-derived ECs, respectively) were analyzed, revealing 50,298 unique tags. By considering only tags that were observed more than once in the current dataset or in the 134,000 transcripts (39) previously identified in the human transcriptome, 32,703 unique transcripts A conservative estimate of was obtained.
13. To identify endothelial-specific transcripts, we standardized the number of tags analyzed in each group to 100,000 and performed our analysis in EC from non-endothelial cell lines. It was expressed at at least 20-fold higher levels and was restricted to transcripts present in less than 5 copies per 100,000 transcripts in non-endothelial cell lines and hematopoietic fractions (about 57,000 tags) (41). Non-endothelial cell lines consisted of a total of 14 different cancer cell lines (including colon, breast, lung, and pancreatic cancer) and one non-transformed keratinocyte cell line, two renal epithelial cell lines, and normal monocytes. It consisted of the 1.8 x 106 tags obtained. A complete list of PEMs can be found at www. sagenet. org / angio / table. available at http://www.htm.com.

26. For non-radioactive in situ hybridization, dicoxygenin (DIG) -labeled sense and antisense riboprobes were generated by PCR by amplifying the 500-600 bp product and incorporating the T7 promoter into the antisense primer. In vitro transcription was performed using DIG RNA labeling reagent and T7 RNA polymerase (Roche, Indianapolis, IN). Frozen tissue sections were fixed with 4% paraformaldehyde, permeabilized with pepsin, and incubated with 200 ng / ml riboprobe at 55 ° C. overnight. For signal amplification, horseradish peroxidase (HRP) rabbit anti-DIG antibody (DAKO, Carpinteria, CA) was used to catalyze the deposition of biotin-tyramide (Genpoint kit, Dako). Further amplification was achieved by adding HRP rabbit anti-biotin (Dako), biotin-tyramide, followed by alkaline phosphatase (AP) rabbit anti-biotin (Dako). The signal was detected using the AP substrate Fast Red TR / Naphthol (AP substrate Fast TR / Napthol AS-MX) (Sigma St. Louis, MO) and cells were compared with hematoxylin unless otherwise specified. Stained. Detailed protocols, including a list of primers used to generate the probes, are available from the authors upon request.
27. Transcript copies per cell were calculated, assuming that the average cell contained 300,000 transcripts.

31. Endothelial-specific transcripts are expressed at at least 5-fold higher levels in ECs in vivo than non-endothelial cell lines (13) and only a small percentage per 100,000 transcripts in non-endothelial cell lines and the hematopoietic cell fraction (41). It was defined as a transcript present in 5 copies. Transcripts showing statistically different levels of expression (P <0.05) were then identified using Monte Carlo analysis as previously described (40). Transcripts that were predominantly expressed in normal endothelium were then defined as transcripts that were expressed at levels at least 10-fold higher in normal endothelium than tumor endothelium. Conversely, tumor endothelial transcripts were at least 10-fold higher in tumors compared to normal endothelium. For a complete list of differentially expressed genes, see www. sagenet. org / angio / table2. htm and www. sagenet. org / angio / table3. See htm.

41. Human colon tissue was obtained within 30 minutes after surgical removal from the patient. With the lamina propria left intact, the epithelial cell layer was treated with 5 mM DDT and then 10 mM EDTA before being detached from normal tissue using a glass slide. After 2 hours incubation at 37 ° C. in collagenase, the cells were filtered sequentially through 400 μm, 100 μm, 50 μm, and 25 μm mesh and passed through a pre-formed 30% Percoll gradient to pellet RBCs. And centrifuged. Epithelial cells (epithelial fraction), which are known to bind non-specifically to magnetic beads, were removed using BerEP4-conjugated Dynabeads (Dynal, Lake Success, NY). . Thereafter, macrophages and other leukocytes (hematopoietic fraction) were removed using a cocktail of anti-CD45, anti-CD14, and anti-CD64 conjugated beads (Dinal). The remaining cells were stained with the P1H12 antibody, purified using anti-mouse IgG conjugated magnetic beads, and lysed in mRNA lysis buffer. Detailed protocols can be obtained from the authors upon request.

[Table 1]

[Table 2]

[Table 3]

[Table 4]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1. vWF expression in colorectal cancer. VWF (red stain) was detected in the blood vessels by in situ hybridization. At low magnification (FIG. 1.A), in many cases, blood vessels were surrounded by perivascular cuffs of live cells (red arrows), and a circle of necrotic cells was clearly visible around them (black arrows). At high magnification (FIG. 1.B), the expression of vWF (red) was clearly localized to blood vessels. Sections were counterstained with methyl green.
FIG. 2. Purification of endothelial cells (EC) from human normal and malignant tissues. (FIG. 2A). Blood vessels (red) of the frozen sections were stained by immunofluorescence using a P1H12 monoclonal antibody (Chemicon, Temecula, Calif.) Using a biotinylated goat anti-mouse IgG secondary antibody followed by rhodamine-conjugated streptavidin. Detected. The stained area is an area from within the lamina propria of normal colonic mucosa. Note that large vessels (arrowheads) and capillaries (arrows) were positive and no staining of hematopoietic cells could be detected. Rabbit polyclonal antibody (Santa Cruz, Santa Cruz, CA) followed by Alexa-labeled goat anti-rabbit IgG secondary antibody (Molecular Probe, Eugene, OR) E-cadherin-positive epithelial cells (green) at the edge of the crypts were simultaneously visualized. Sections were imaged at 60 × magnification using a confocal microscope. (FIG. 2.B) To isolate pure populations from collagenase dispersed tissue, epithelial and hematopoietic cell fractions were continuously removed by negative selection using magnetic beads. The remaining cells were stained with P1H12 and ECs were isolated by positive selection using magnetic beads. (FIG. 2.C) RT-PCR analysis used to evaluate the purity of the EC preparation. Semi-quantitative PCR analysis was performed using colorectal cancer tissue (unfractionated tumor) or purified EC isolated from normal colorectal mucosa (normal EC fraction) or purified EC isolated from colorectal cancer (tumor EC fraction) Performed directly on cDNAs prepared from PCR amplification of the epithelial specific marker cytokeratin 20 (CK20) demonstrated that its expression was restricted to unfractionated tumors. The two endothelial-specific markers, vWF and VE-cadherin (VE-Cad), showed strong amplification only in the endothelial fraction, demonstrating the purity and the enrichment protocol shown in (FIG. 2.B). Was. The ubiquitous housekeeping enzyme GAPDH was observed in all samples. No signal was detected in the non-template (NT) control. The cDNA template was diluted 1:10, 1: 100, 1: 1000, 1: 4000, and 1: 40,000 as indicated by the tapering V. (FIG. 2.D) The relative expression levels of the selected genes were determined by measuring the amount of tags from several SAGE libraries organized into four groups. The first consisted of about 193,000 tags from two in vivo derived EC preparations (endothelial cell fraction), while the second consisted of macrophages and other leukocytes obtained from negative selection. A single library of approximately 57,000 tags, including the (hematopoietic fraction). The fourth library contains about 401,000 tags from cultured HUVECs and HMVECs (cultured endothelial cells) and the fourth contains about 748,000 tags from six cultured colon cancer cell lines (epithelial cells). Made of tags. After normalization, the library with the largest number of tags for each marker was given a value of 100%, and the corresponding relative expression levels of the remaining three libraries were plotted on the ordinate. Note that high levels of CD31 are present on hematopoietic cells (this is likely due to the lower purity of the initial endothelial selection compared to P1H12 selectivity).
FIG. 3. Expression of whole endothelial markers (PEM) is restricted to EC. The endothelial origin of the PEM identified by SAGE was confirmed using a sensitive in situ hybridization assay. Examination of two representative PEMs, PEM3 (FIG. 3A) and PEM6 (FIG. 3B), in lung and colon cancer, respectively, demonstrated that the novel PEM was localized in EC. Hevin expression was easily detected in colon tumor (FIG. 3C) EC, despite low levels of expression in cultured EC. VEGFR2 expression could be easily detected in EC of normal colon tissue (FIG. 3D) and malignant colon tissue (FIG. 3E).
FIG. 4. Expression of tumor endothelial markers (TEM). (FIG. 4A) RT-PCR analysis confirmed the tumor-specific expression of the selected novel TEM. Purified epithelial cells as negative control (control) or purified EC isolated from normal colon mucosa (normal EC) or purified EC isolated from colorectal cancer (tumor EC) from two different patients Was subjected to semi-quantitative PCR analysis. While the two endothelial-specific markers vWF and PEM6 showed strong amplification only in the endothelial fraction, the ubiquitous housekeeping enzyme GAPDH was observed in all samples. TEM1 (BSC-TEM1), TEM17 (BSC-TEM7), and TEM22 (BSC-TEM9) were specifically expressed in tumors compared to normal EC. The cDNA template was diluted 1:10, 1: 100, 1: 1000, and 1: 10,000 as indicated by the tapering V. (FIGS. 4B-4J) The endothelial origin of the TEM identified by SAGE was confirmed using an in situ hybridization assay as in FIG. Expression of TEM1 (BSC-TEM1) (FIG. 4B) and TEM17 (BSC-TEM7) (FIG. 4C) proved to be highly specific for colorectal cancer EC. Sections were imaged in the absence of counterstaining to show complete absence of detectable expression in non-endothelial cells of the tumor. Expression of TEM17 (BSC-TEM7) in ECs was demonstrated in liver metastatic lesions from primary colorectal cancer (FIG. 4D), lung cancer (FIG. 4E), breast cancer (FIG. 4F), pancreatic cancer (FIG. 4G), and brain cancer (FIG. 4G). 4H) as well as in sarcomas (FIG. 4I). TEM17 (BSC-TEM7) was also localized to blood vessels during normal physiological angiogenesis of the corpus luteum (FIG. 4J).

Claims (86)

An antibody variable that specifically binds to an extracellular domain of a TEM protein selected from the group consisting of 1, 9, 17, 19 and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 212, 230, 232, and 271, respectively) An isolated molecule comprising a region. 2. The isolated molecule of claim 1, which is an intact antibody molecule. 2. The isolated molecule of claim 1, which is a single chain variable region (ScFv). 2. The isolated molecule of claim 1, which is a monoclonal antibody. 2. The isolated molecule of claim 1, which is a humanized antibody. 2. The isolated molecule of claim 1, which is a human antibody. 2. The isolated molecule of claim 1, wherein said molecule is linked to a cytotoxic moiety. 2. The isolated molecule of claim 1, wherein said molecule is linked to a therapeutic moiety. 2. The isolated molecule of claim 1, wherein said molecule is attached to a detectable moiety. 2. The isolated molecule of claim 1, wherein the molecule is linked to an antitumor agent. A method of inhibiting angiogenesis, comprising the following steps:
Subjects in need of inhibition of angiogenesis include those from the group consisting of 1, 9, 17, 19, 22, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 212, 230, 232, 238, and 271 respectively). Administering an effective amount of the isolated molecule comprising an antibody variable region that specifically binds to the extracellular domain of the selected TEM protein, thereby inhibiting angiogenesis. 12. The method of claim 11, wherein the subject has a neovascularized tumor. 12. The method of claim 11, wherein the subject has polycystic kidney disease. 12. The method of claim 11, wherein the subject has diabetic retinopathy. 12. The method of claim 11, wherein the subject has rheumatoid arthritis. 12. The method of claim 11, wherein the subject has psoriasis. A method of inhibiting tumor growth, comprising the following steps:
In a human subject with a tumor, a TEM selected from the group consisting of 1, 9, 17, 19, 22, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 212, 230, 232, 238, and 271 respectively). Administering an effective amount of the isolated molecule comprising an antibody variable region that specifically binds to the extracellular domain of the protein, thereby inhibiting tumor growth. 9, 17, 19, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 212, 230, 232, and 271 respectively), comprising an antibody variable region that specifically binds to a TEM protein selected from the group consisting of: Molecule. 19. The isolated molecule of claim 18, which is a single chain variable region (ScFv). 19. The isolated molecule of claim 18, which is a monoclonal antibody. 19. The isolated molecule of claim 18, which is a humanized antibody. 19. The isolated molecule of claim 18, which is a human antibody. 19. The isolated molecule of claim 18, wherein said molecule is linked to a cytotoxic moiety. 20. The isolated molecule of claim 18, which is linked to a therapeutic moiety. 20. The isolated molecule of claim 18, wherein said molecule is attached to a detectable moiety. 20. The isolated molecule of claim 18, which binds to an anti-tumor agent. 20. The isolated molecule of claim 18, which is an intact antibody molecule. An isolated and purified human transmembrane protein selected from the group consisting of TEM 9, 17, and 19 (shown in SEQ ID NOs: 212, 230, and 232, respectively). An isolated and purified nucleic acid molecule comprising a transmembrane TEM coding sequence selected from the group consisting of TEMs 9, 17, and 19 (shown in SEQ ID NOs: 212, 230, 232, respectively). 30. The isolated and purified nucleic acid molecule of claim 29, comprising a coding sequence selected from the coding sequences set forth in SEQ ID NOs: 211, 229, and 231. A recombinant host cell comprising a nucleic acid molecule comprising a transmembrane TEM coding sequence selected from the group consisting of TEM 9, 17, and 19 (shown in SEQ ID NOs: 212, 230, and 232, respectively). 32. The recombinant host cell of claim 31, comprising a coding sequence selected from the coding sequences set forth in SEQ ID NOs: 211, 229, and 231. A method of inducing an immune response in a mammal, comprising the steps of:
In mammals, the group consisting of TEMs 1, 9, 13, 17, 19, 22, 30, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 212, 220, 230, 232, 238, 250, and 271 respectively). Administering a nucleic acid molecule comprising a coding sequence for a selected human transmembrane protein, whereby an immune response to the human transmembrane protein is induced in the mammal. 34. The method of claim 33, wherein the coding sequence is set forth in SEQ ID NOs: 195, 211, 219, 229, 231, 237, 249, 270. A method of inducing an immune response in a mammal, comprising the steps of:
In mammals, the group consisting of TEMs 1, 9, 13, 17, 19, 22, 30, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 212, 220, 230, 232, 238, 250, and 271 respectively). Administering a selected, purified human transmembrane protein, whereby an immune response against the human transmembrane protein is induced in the mammal. A method for identifying a ligand involved in the regulation of endothelial cells, comprising the following steps:
An isolated and selected from the group consisting of a test compound and 1, 9, 13, 17, 19, 30, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 212, 220, 230, 250, 232, and 271). Contacting the purified human transmembrane protein;
Isolated and purified human transmembrane proteins and 1, 9, 13, 17, 19, 30, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 212, 220, 230, 250, 232, and 271 respectively) Contacting a molecule comprising an antibody variable region that specifically binds to an extracellular domain of a TEM protein selected from the group consisting of:
A step of measuring the binding between the molecule containing the antibody variable region and the human transmembrane protein, wherein a test compound that reduces the binding between the molecule containing the antibody variable region and the human transmembrane protein is used as a ligand involved in the regulation of endothelial cells. Identified as A method for identifying a ligand involved in the regulation of endothelial cells, comprising the following steps:
Contacting a test compound with a cell comprising a human transmembrane protein selected from the group consisting of 1, 9, 17, and 19 (shown in SEQ ID NOs: 196, 212, 230, and 232);
An antibody variable that specifically binds to a cell and an extracellular domain of a TEM protein selected from the group consisting of 1, 9, 17, and 19 (shown in SEQ ID NOs: 196, 212, 230, and 232, respectively) Contacting a molecule containing the region;
Measuring the binding of the molecule containing the antibody variable region to the cell, wherein the test compound that reduces the binding of the molecule containing the antibody variable region to the cell is identified as a ligand involved in the regulation of endothelial cells. Selected from the group consisting of TEMs 1, 9, 17, 19, 22, 30, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 212, 230, 232, 238, 250, and 271 respectively) and lacking a transmembrane domain , A soluble form of the human transmembrane protein. 39. The soluble form of claim 38, comprising the extracellular domain of a human transmembrane protein. A method of inhibiting angiogenesis in a patient, comprising the steps of:
39. Administering a soluble form of the human transmembrane protein of claim 38 to a patient, thereby inhibiting angiogenesis in the patient. A method of inhibiting angiogenesis in a patient, comprising the steps of:
40. Administering a soluble form of the human transmembrane protein of claim 39 to a patient, thereby inhibiting angiogenesis in the patient. 41. The method of claim 40, wherein the patient has a neovascularized tumor. 42. The method of claim 41, wherein the patient has a neovascularized tumor. 41. The method of claim 40, wherein the patient has polycystic kidney disease. 41. The method of claim 40, wherein the patient has diabetic retinopathy. 41. The method of claim 40, wherein the patient has rheumatoid arthritis. 41. The method of claim 40, wherein the patient has psoriasis. 42. The method of claim 41, wherein the patient has polycystic kidney disease. 42. The method of claim 41, wherein the patient has diabetic retinopathy. 42. The method of claim 41, wherein the patient has rheumatoid arthritis. 42. The method of claim 41, wherein the patient has psoriasis. A method of identifying an area of neovascularization in a patient, comprising the steps of:
The patient is selected from the group consisting of 1, 9, 13, 17, 19, 22, 30, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 212, 220, 230, 232, 238, 250, and 271 respectively). Administering a molecule comprising an antibody variable region that specifically binds to the extracellular domain of the TEM protein, wherein the molecule is bound to a detectable moiety; and Detecting and thereby identifying angiogenesis. A method of screening for angiogenesis in a patient, comprising the steps of:
Extracellular of a body fluid collected from the patient and a TEM protein selected from the group consisting of 1, 9, 17, 19, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 212, 230, 232, and 271 respectively) Contacting a molecule comprising an antibody variable region that specifically binds to a domain, wherein detection of a cross-reactant in a body fluid using the molecule indicates angiogenesis in the patient. A method of screening for angiogenesis in a patient, comprising the steps of:
Body fluids collected from patients and 4, 6, 7, 10, 12, 14, 25, 27, 31, 36, 37, 38, 39 (SEQ ID NOs: 202, 206, 208, 214, 218, 223, respectively) And 224, 242, 244, 252, 257, 259, 261 and 263), comprising contacting a molecule comprising an antibody variable region that specifically binds to a TEM protein selected from the group consisting of The detection of a cross-reactant in a body fluid using, indicates angiogenesis in the patient. A method of promoting angiogenesis in a patient, comprising the steps of:
For patients in need of angiogenesis, 4, 6, 7, 10, 12, 14, 20, 25, 27, 31, 36, 37, 38, 39, and 40 (SEQ ID NOs: 202, 206, 208, 214) 218, 223 and 224, 234, 242, 244, 252, 257, 259, 261, 263, and 265), whereby the blood vessel in the patient is The stage where new birth is stimulated. A method of promoting angiogenesis in a patient, comprising the steps of:
For patients in need of angiogenesis, 4, 6, 7, 10, 12, 14, 20, 25, 27, 31, 36, 37, 38, 39, and 40 (SEQ ID NOs: 202, 206, 208, 214) 218, 223 and 224, 234, 242, 244, 252, 257, 259, 261, 263, and 265), wherein the nucleic acid molecule encodes a TEM protein selected from the group consisting of: The stage where the TEM protein is expressed and stimulates angiogenesis in the patient. A method of screening for angiogenesis in a patient, comprising the steps of:
4, 6, 7, 10, 12, 14, 20, 25, 27, 31, 36, 37, 38, 39, and 40 in body fluids collected from patients (SEQ ID NOs: 202, 206, 208, respectively) , 214, 218, 223 and 224, 234, 242, 244, 252, 257, 259, 261, 263, and 265) of the TEM protein. The stage where detection indicates angiogenesis in the patient. A method of screening for angiogenesis in a patient, comprising the steps of:
Encodes a TEM protein selected from the group consisting of 4, 6, 7, 10, 12, 14, 20, 25, 27, 31, 36, 37, 38, 39, and 40 in a body fluid collected from a patient In which the nucleic acids correspond to SEQ ID NOs: 201, 205, 207, 213, 217, 221 and 222, 233, 241, 243, 251, 256, 258, 260, 262, and 264, respectively. A stage selected from the group consisting of the indicated nucleic acids, wherein detection of the TEM protein indicates angiogenesis in the patient. An isolated and purified nucleic acid molecule encoding a NEM protein selected from the group consisting of 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289). 61. The nucleic acid molecule of claim 60, comprising the coding sequence set forth in SEQ ID NOs: 278, 282, 284, and 288. A recombinant host cell comprising the nucleic acid of claim 60. 14. An isolated and purified NEM protein selected from the group consisting of 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289, respectively). 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289) comprising an antibody variable region that specifically binds to a NEM protein selected from the group consisting of: Isolated molecule. A method of inhibiting angiogenesis, comprising the following steps:
A subject in need of inhibition of angiogenesis may have an effective amount of a drug selected from the group consisting of 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289). Administering the NEM protein, thereby inhibiting angiogenesis. A method of identifying a candidate drug for treating a tumor, comprising the steps of:
1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 45, and 46 (SEQ ID NOs: 195, 197, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, respectively) 217, 219, 221 and 222, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 256, 258, 260, 262, 266, Contacting a test compound with a cell expressing one or more TEM genes selected from the group consisting of: 268, 270, 272, and 274).
Measuring the expression of one or more TEM genes by hybridization of the mRNA of the cell with a nucleic acid probe complementary to the mRNA; and the test compound reduces expression of the one or more TEM genes Identifying the test compound, if any, as a candidate drug for treating a tumor. 67. The method of claim 66, wherein the cells are endothelial cells. 67. The method of claim 66, wherein the cell is a recombinant host cell that has been transfected with an expression construct encoding one or more TEMs. A method of identifying a candidate drug for treating a tumor, comprising the steps of:
2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 45, and 46 (SEQ ID NOs: 198, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 223, respectively) 224,226,228,230,232,234,236,238,240,242,244,246,248,250,252,254,358,257,259,261,263,267,269,271,273, And 275) contacting a test compound with a cell that expresses one or more TEM proteins selected from the group consisting of:
Measuring the amount of one or more TEM proteins in the cells; and if the test compound reduces the amount of one or more TEM proteins in the cells, the test compound is used to treat a tumor. Identifying as a candidate drug. 70. The method of claim 69, wherein the cells are endothelial cells. 70. The method of claim 69, wherein the cell is a recombinant host cell that has been transfected with an expression construct encoding one or more TEMs. A method of identifying a candidate drug for treating a tumor, comprising the steps of:
2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 40, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 45, and 46 (SEQ ID NOs: 198, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 223, respectively) 224,226,228,230,232,234,236,238,240,242,244,246,248,250,252,254,358,257,259,261,263,267,269,271,273, And 275) contacting a test compound with a cell that expresses one or more TEM proteins selected from the group consisting of:
Measuring the activity of one or more TEM proteins in the cell; and if the test compound reduces the activity of one or more TEM proteins in the cell, the test compound is used to treat a tumor. Identifying as a candidate drug. 73. The method of claim 72, wherein the cells are endothelial cells. 73. The method of claim 72, wherein the cell is a recombinant host cell that has been transfected with an expression construct encoding one or more TEMs. A method for identifying a candidate drug for treating a patient having a tumor, comprising the steps of:
A test compound and 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 40, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 45, and 46 (SEQ ID NOs: 198, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, respectively) 218, 223 and 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 358, 257, 259, 261, 263, 267, 269, 271, 273, and 275), wherein the set is transfected with an expression construct encoding one or more TEM proteins selected from the group consisting of: The step of contacting the example host cell;
Measuring cell proliferation; and identifying a test compound that inhibits the cell proliferation as a candidate drug for treating a patient with a tumor. A method of identifying a candidate drug for treating a tumor, comprising the steps of:
A cell that expresses one or more NEM genes selected from the group consisting of 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 278, 282, 284, and 288, respectively), and a test compound. Contacting;
Measuring the expression of one or more NEM genes by hybridization of the mRNA of the cell with a nucleic acid probe complementary to the mRNA; and the test compound increases expression of the one or more NEM genes Identifying the test compound, if any, as a candidate drug for treating a tumor. 77. The method of claim 76, wherein the cells are endothelial cells. 77. The method of claim 76, wherein the cell is a recombinant host cell that has been transfected with an expression construct encoding one or more NEMs. A method of identifying a candidate drug for treating a tumor, comprising the steps of:
Cells expressing one or more NEM proteins selected from the group consisting of 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289); Contacting the compound;
Measuring the amount of one or more NEM proteins in the cells; and if the test compound increases the amount of one or more NEM proteins in the cells, the test compound can be used to treat a tumor. Identifying as a candidate drug. 80. The method of claim 79, wherein the cells are endothelial cells. 80. The method of claim 79, wherein the cell is a recombinant host cell that has been transfected with an expression construct encoding one or more NEMs. A method of identifying a candidate drug for treating a tumor, comprising the steps of:
Cells expressing one or more NEM proteins selected from the group consisting of 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289); Contacting the compound;
Measuring the activity of one or more NEM proteins in the cell; and if the test compound increases the activity of the one or more NEM proteins in the cell, the test compound can be used to treat a tumor. Identifying as a candidate drug. 83. The method according to claim 82, wherein the cells are endothelial cells. 83. The method of claim 82, wherein the cell is a recombinant host cell that has been transfected with an expression construct encoding one or more NEMs. A method for identifying a candidate drug for treating a patient having a tumor, comprising the steps of:
Encodes a test compound and one or more NEM proteins selected from the group consisting of 14, 22, 23, and 33 (shown in SEQ ID NOs: 279, 283, 285, 286, 287, and 289). Contacting a recombinant host cell transfected with the expression construct;
Measuring cell proliferation; and identifying a test compound that stimulates cell proliferation as a candidate drug for treating a patient with a tumor. A method for identifying a ligand involved in the regulation of endothelial cells, comprising the following steps:
The test compound and 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 40, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 45, and 46 (SEQ ID NOs: 196, 198, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 223 and 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 358, 257, 259, 261, 263, 267, Contacting a human transmembrane TEM protein selected from the group consisting of: 269, 271, 273, and 275);
Measuring the binding of the test compound to the human transmembrane protein, wherein the test compound binding to the protein is identified as a ligand involved in the regulation of endothelial cells. A method of inducing an immune response in a mammal, comprising the steps of:
The mammal has the following group consisting of TEMs 1, 9, 13, 17, 19, 22, 30, and 44 (shown in SEQ ID NOs: 196, 212, 220, 230, 232, 238, 250, and 271 respectively). Administering a cell expressing the selected transmembrane protein, whereby an immune response against the human transmembrane protein is induced in the mammal, wherein the cell is a recombinant cell comprising a vector encoding the transmembrane protein. A stage that is or is a fusion of dendritic cells and tumor endothelial cells.

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