JP2004508045A - Human and mouse targeting peptides identified by phage display - Google Patents

Human and mouse targeting peptides identified by phage display Download PDF

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Abstract

本発明は、インビボ及びインビトロのターゲティングのための方法及び組成物に関する。ヒトの臓器、組織、又は細胞型に対する多数のターゲティングペプチドが開示される。ペプチドは、遺伝子治療ベクターを非限定的に含む治療剤の標的化送達に有用である。遺伝子治療ベクターの新規クラスが開示される。開示されたペプチドのいくつかは、血管新生の阻害、腫瘍増殖の阻害、アポトーシスの誘導、妊娠の阻害、又は体重減少の誘導のため治療的に使用される。ヒトにおいて新規ターゲティングペプチドを同定する方法、及び内因性受容体−リガンド対を同定する方法が開示される。ヒト疾患状態の原因となる新規感染性物質を同定する方法も、開示される。アポトーシスを誘導するための新規機構がさらに開示される。The present invention relates to methods and compositions for in vivo and in vitro targeting. A number of targeting peptides to human organs, tissues, or cell types are disclosed. Peptides are useful for targeted delivery of therapeutic agents, including but not limited to gene therapy vectors. A new class of gene therapy vectors is disclosed. Some of the disclosed peptides are used therapeutically to inhibit angiogenesis, inhibit tumor growth, induce apoptosis, inhibit pregnancy, or induce weight loss. Methods for identifying novel targeting peptides and identifying endogenous receptor-ligand pairs in humans are disclosed. Methods for identifying novel infectious agents responsible for human disease states are also disclosed. New mechanisms for inducing apoptosis are further disclosed.

Description

【０００１】
発明の背景
本出願は、２０００年９月８日に提出された米国特許仮出願第６０／２３１，２６６号および２００１年１月１７日に提出された米国特許出願第０９／７６５，１０１号からの優先権を主張する。本発明は、米国陸軍の助成金ＤＡＭＤ １７−９８−１−８０４１および１７−９８−１−８５８１ならびに米国国立衛生研究所の助成金１Ｒ０１ＣＡ７８５１２−０１Ａ１、１Ｒ１ＣＡ９０８１０−０１、および１Ｒ０１ＣＡ８２９７６−０１により政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を保有する。
【０００２】
１． 発明の分野
本発明は、分子薬品および治療剤の標的化送達の分野に関する。より具体的には、本発明は、インビボまたはインビトロにおいて、臓器、組織、または細胞型を選択的に標的にするペプチドの同定および使用のための組成物および方法に関する。
【０００３】
２． 関連技術の説明
多くの疾患状態の治療的治療は、用いる治療剤の全身毒性のために制限される。癌治療剤は、特に非常に低い治療指数を示し、皮膚および骨髄のような急速に増殖する正常組織は、腫瘍細胞を殺すために用いる濃度ほど高くない薬剤の濃度で影響を受ける。癌および他の臓器、組織、または細胞型限定疾患の治療は、所望の臓器、組織、または細胞型への治療剤の標的化送達のための組成物および方法を開発することによって大きく促進されるであろう。
【０００４】
最近、マウスモデル系において臓器、組織、または細胞型ターゲティングペプチドを同定するためのファージディスプレイライブラリを用いるインビボ選択系が開発された。バクテリオファージの表面上にトランスジェニックペプチドを発現するファージディスプレイライブラリは、当初、免疫グロブリンのエピトープ結合部位をマッピングするために開発された（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、１９８６、１９９３）。そのようなライブラリは、ファージの表面タンパク質をコードするｃＤＮＡにランダムオリゴヌクレオチドを挿入すること、独自のペプチドを１０９個もの順列で示すファージ粒子のコレクションを作製することによって作製することができる（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ａｒａｐら、１９９８ｂ）。
【０００５】
ファージディスプレイライブラリをマウスに静脈内投与した後に、個々の臓器からのファージの回収を行った（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）。ファージの外部表面上に発現された特異的ターゲティングペプチド配列に基づいて、異なるマウス臓器、組織、または細胞型の血管床に選択的に回帰することができるファージを回収した（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）。多様な臓器および腫瘍回帰ペプチドがこの方法によって同定されている（Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８、１９９９；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９；Ｂｕｒｇら、１９９９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９）。それらのターゲティングペプチドはそれぞれ、マウス標的組織の血管上に選択的に発現される異なる受容体に結合した（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、２０００；Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９５；Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９７）。腫瘍回帰ペプチドはマウスの腫瘍新生血管において上方制御されている受容体に結合した（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、２０００）。臓器、組織、または細胞型に対して選択的な個々のターゲティングペプチドを同定する他に、（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９）、このシステムは、インビボでマウスに発現される内皮細胞表面マーカーを同定するために用いられている（ＲａｊｏｔｔｅおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９）。
【０００６】
ターゲティングペプチドに治療剤が結合すれば、マウスモデル系において、作用薬剤は所望の臓器、組織、または細胞型へと選択的に送達される。化学療法剤およびアポトーシス促進ペプチドを、腫瘍新生血管に存在する受容体に標的送達すると、担癌マウスモデルにおいて治療有効性の著しい増加および全身毒性の減少が起こる（Ａｒａｐら、１９９８ａ、１９９８ｂ；Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９９）。
【０００７】
いくつかの場合、従来のインビボのファージディスプレイスクリーニング法は、非特異的ファージ結合の比較的高いバックグラウンドをもたらした。これは、網膜内皮系に属する組織に特に当てはまった。ターゲティングペプチドと細胞受容体との特異的な相互作用を保持しつつ、非特異的なファージ結合を減少させる改良されたファージディスプレイ法が必要とされている。また、臓器、組織、又は細胞型の中の特異的な細胞集団に関する受容体をターゲティングする必要も存在する。多くの場合、組織又は臓器は、種々の細胞型の高度に異種性の集団を含む。ファージディスプレイスクリーニングを特異的な細胞集団へとターゲティングする能力が、必要とされている。
【０００８】
同様に、臓器および組織における受容体−リガンド対を同定する必要性も存在する。標的化受容体および受容体に対するリガンド結合を同定するためのこれまでの試みは、試験するために一度に単一のリガンドを主にターゲティングしていた。これまで未知の受容体およびまだ特徴が調べられていないリガンドの同定は、非常に遅く、骨の折れるプロセスであった。そのような新規受容体およびリガンドは、真性糖尿病、炎症疾患、関節炎、アテローム硬化症、癌、自己免疫疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、心臓血管疾患、または変性疾患のような多様な疾患状態に対する新規治療の基礎を提供する可能性がある。
【０００９】
発明の概要
本発明は、臓器、組織、又は細胞型に選択的なターゲティングペプチドを同定し、使用するための組成物及び方法を提供することにより、当技術分野における長年にわたる需要を満たす。いくつかの態様において、方法は、ファージと細胞受容体との選択的な結合を保持しつつ、非特異的なファージ結合のバックグラウンドを減少させる新規なファージディスプレイ法である、選択的相互作用リガンドのバイオパニング及び迅速な分析（Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ｌｉｇａｎｄｓ）（ＢＲＡＳＩＬ）に関する。好ましい態様において、ターゲティングペプチドは、被験者をファージディスプレイライブラリへと曝露すること、１つ又は複数の臓器、組織、又は細胞型の試料を収集すること、水相に懸濁した単離細胞又は小さい細胞塊へと試料を分離させること、水相を有機相の上に重層すること、細胞が遠心分離チューブの底にペレット化されるよう二相を遠心分離すること、及びペレットからファージを収集することにより同定される。さらに好ましい態様において、有機相はジブチルフタレートである。
【００１０】
他の態様において、標的の臓器、組織、又は細胞型、例えば胎盤と結合するファージは、その臓器、組織、又は細胞型を欠いている被験者に対してプレスクリーニング又はポストスクリーニングされうる。標的の臓器、組織、又は細胞型を欠いている被験者と結合するファージは、臓器、組織、又は細胞型を保有している被験者におけるスクリーニングの前にライブラリより除去される。好ましい態様において、臓器、組織、又は細胞型は、胎盤又は脂肪組織である。
【００１１】
好ましい態様において、ターゲティングファージは、ＰＡＬＭ（Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｂｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｌａｓｅｒ Ｍｉｃｒｏｂｅａｍｓ）による細胞型の選択の後、臓器又は組織に存在する特異的な細胞型又は亜型より回収されうる。ＰＡＬＭは、例えば臓器又は組織の薄片からの、特異的な細胞型の選択を可能にする。ファージは、選択された試料より回収されうる。
【００１２】
もう一つの態様において、抗体の抗原結合部分を表示しているファージディスプレイライブラリが被験者より調製され、ライブラリが１つ又は複数の抗原に対してスクリーニングされ、抗原と結合するファージが収集される。より好ましい態様において、抗原はターゲティングペプチドである。
【００１３】
特定の態様において、方法及び組成物は、ターゲティングペプチドの１つ又は複数の受容体を同定するために使用されうる。別の態様において、組成物及び方法は、既知の、又は新たに同定された受容体に対する天然に存在するリガンドを同定するために使用されうる。
【００１４】
いくつかの態様において、本発明の方法は、関心対象の受容体を含む臓器、組織、または細胞にターゲティングペプチドを接触させる段階、ペプチドを受容体に結合させる段階、およびペプチドに対するその結合によって受容体を同定する段階を含んでもよい。好ましい態様において、ターゲティングペプチドは、配列番号：５〜配列番号：４５、配列番号：４７〜配列番号：１２１、配列番号：１２３、および配列番号：１２５〜配列番号：２５１のいずれかから選択される少なくとも３つの連続するアミノ酸を含む。他の好ましい態様において、ターゲティングペプチドは、受容体に対する抗体の一部を含む。もう一つの態様において、ターゲティングペプチドは、ランダムアミノ酸配列を含んでもよい。当業者は、接触させる段階が臓器、組織、もしくは細胞を利用することができる、または臓器、組織、もしくは細胞のホモジネートもしくは洗浄剤抽出物を利用してもよいと認識するであろう。特定の態様において、接触させるべき細胞は、ターゲティングペプチドに関して疑われる受容体を発現するように遺伝子操作してもよい。好ましい態様において、ターゲティングペプチドは、受容体に対するその共有結合を可能にする反応部分によって改変される。より好ましい態様において、反応部分は、光によって活性化されると受容体に共有結合するようになる光反応基である。もう一つの好ましい態様において、ペプチドは、固体支持体に結合して受容体をアフィニティクロマトグラフィーによって精製する。他の好ましい態様において、固体支持体は磁気ビーズ、セファロースビーズ、アガロースビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、カラムクロマトグラフィーマトリクス、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）マトリクス、またはファストパフォーマンス（ｆａｓｔ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）マトリクスを含む。特定の態様において、ターゲティングペプチドは、受容体に結合すると、受容体の活性を阻害する。当業者は、受容体の活性を、触媒活性および結合活性を含むがこれらに限定されない当技術分野で既知の多様な方法によってアッセイすることができることを認識するであろう。もう一つの好ましい態様において、受容体は、エンドスタチン受容体、メタロプロテアーゼまたはアミノペプチダーゼである。
【００１５】
代替的態様において、関心対象の受容体の一つまたは複数のリガンドを、開示の方法および組成物によって同定してもよい。天然に存在するリガンドの一部または全てを模倣する一つまたは複数のターゲティングペプチドは、インビボまたはインビトロにおけるファージディスプレイおよびバイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）によって同定してもよい。天然に存在するリガンドは、受容体に結合する単一のターゲティングペプチド、または受容体に結合する配列のコンセンサスモチーフとの相同性によって同定してもよい。他のもう一つの態様において、関心対象の受容体に結合する一つまたは複数のターゲティングペプチドに対する抗体を調製してもよい。そのような抗体は、本来のリガンドの同定または免疫アフィニティ精製のために用いてもよい。
【００１６】
特定の態様において、本発明のターゲティングペプチドは、遺伝子治療ベクターおよび融合タンパク質を含むがこれらに限定されない治療剤を、被験者における特定の臓器、組織、または細胞型に選択的に送達するために用いられる。当業者は、使用される、主張される方法の範囲には、所望の臓器、組織、または細胞型への治療剤の標的化送達によって治療することができる任意の疾患状態も含まれることを認識するであろう。そのような疾患状態には、疾患を有する細胞が、非転移性癌のような特定の臓器、組織、または細胞型に限定される疾患が含まれるが、他の疾患状態を臓器、組織、または細胞型ターゲティングアプローチによって治療してもよい。
【００１７】
本発明の一つの態様は、配列番号：５〜配列番号：４５、配列番号：４７〜配列番号：１２１、配列番号：１２３、および配列番号：１２５〜配列番号：２５１のいずれかから選択されるターゲティングペプチド配列の少なくとも３つの連続するアミノ酸を含む、大きさがアミノ酸１００個またはそれ未満の単離ペプチドに関する。
【００１８】
好ましい態様において、単離ペプチドは、アミノ酸５０個もしくはそれ未満、より好ましくはアミノ酸３０個もしくはそれ未満、より好ましくはアミノ酸２０個もしくはそれ未満、より好ましくはアミノ酸１０個もしくはそれ未満、またはさらにより好ましくは大きさがアミノ酸５個もしくはそれ未満である。他の好ましい態様において、請求項１記載の単離ペプチドは、配列番号：５〜配列番号：４５、配列番号：４７〜配列番号：１２１、配列番号：１２３、および配列番号：１２５〜配列番号：２５１のいずれかから選択されるターゲティングペプチド配列の少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続するアミノ酸を含む。
【００１９】
特定の態様において、単離ペプチドは分子に結合する。好ましい態様において、結合は共有結合である。さらなる態様において、分子は、薬物、化学療法剤、放射性同位元素、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞障害剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のＦａｂ断片、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモンアンタゴニスト、造影剤、核酸または抗原である。それらの分子は、例示目的により挙げたに過ぎない。本発明の範囲に含まれる分子には、ターゲティングペプチドに結合して、被験者に投与してもよい実質的に任意の分子が含まれる。好ましい態様において、アポトーシス促進剤は、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン、セクロピン、（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（配列番号：１）、（ＫＬＡＫＫＬＡ）２（配列番号：２）、（ＫＡＡＫＫＡＡ）２（配列番号：３）、または（ＫＬＧＫＫＬＧ）３（配列番号：４）である。他の好ましい態様において、抗血管新生剤は、アンジオスタチン５、色素上皮由来因子、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、血小板因子４、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ポリ硫酸ペントサン、アンジオポエチン２（レジェネロン）、インターフェロン−α、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノマイド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、ドキセタクセル、ポリアミン、プロテアソーム阻害剤、キナーゼ阻害剤、シグナル伝達阻害剤（ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、Ｓｕｇｅｎ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、ＣＡ）、アキュチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４またはミノサイクリンである。さらに好ましい態様において、サイトカインは、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ（ＩＦ−γ）、ＩＦ−α、ＩＦ−β、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、またはＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）である。そのような例は、代表として示したに過ぎず、当技術分野で既知の他のアポトーシス促進剤、抗血管新生剤、またはサイトカインを除外すると解釈されない。
【００２０】
他の態様において、単離ペプチドは高分子複合体に結合する。好ましい態様において、結合は共有結合である。他の好ましい態様において、高分子複合体はウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、磁気ビーズ、酵母細胞、哺乳類細胞、細胞、または微小装置である。これらは例示目的で示したに過ぎない。本発明の範囲に含まれる高分子複合体には、ターゲティングペプチドに結合して、被験者に投与してもよい実質的に任意の高分子複合体が含まれる。他の好ましい態様において、単離ペプチドは、真核細胞発現ベクター、より好ましくは遺伝子治療ベクターに結合する。
【００２１】
もう一つの態様において、単離ペプチドは、固体支持体、好ましくは磁気ビーズ、セファロースビーズ、アガロースビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、カラムクロマトグラフィーマトリクス、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）マトリクス、またはファストパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に結合する。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、配列番号：５〜配列番号：４５、配列番号：４７〜配列番号：１２１、配列番号：１２３、および配列番号：１２５〜配列番号：２５１のいずれかから選択される配列の連続アミノ酸少なくとも３個を含む融合タンパク質に関する。
【００２３】
その他の特定の態様は、薬学的に許容される担体において主張される単離ペプチドまたは融合タンパク質を含む組成物に関する。さらなる態様は、一つまたは複数の容器において主張される単離ペプチドまたは融合タンパク質を含むキットに関する。
【００２４】
その他の態様は、所望の臓器、組織、または細胞型に対するターゲティングペプチドを選択する段階、上記のターゲティングペプチドを分子、高分子複合体、または遺伝子治療ベクターに結合させる段階、および上記の分子、複合体、またはベクターに結合した上記のペプチドを被験者に提供する段階を含む、標的化送達方法に関する。好ましくは、ターゲティングペプチドは、配列番号：５〜配列番号：４５、配列番号：４７〜配列番号：１２１、配列番号：１２３、および配列番号：１２５〜配列番号：２５１のいずれか由来の連続アミノ酸少なくとも３個を含むように選択される。特定の好ましい態様において、臓器、組織、または細胞型は、骨髄、リンパ節、前立腺癌、または骨髄に転移した前立腺癌である。他の好ましい態様において、ターゲティングペプチドに結合した分子は、化学療法剤、抗原、または造影剤である。当業者は、本明細書の範囲において、任意の臓器、組織、または細胞型が、任意の分子、高分子複合体、または遺伝子治療ベクターに結合したターゲティングペプチドを用いた送達のための標的となりうることを認識するであろう。
【００２５】
本発明のその他の態様は、ターゲティングペプチドをコードする、大きさが３００ヌクレオチドまたはそれ未満の単離核酸に関する。好ましい態様において、単離核酸は、大きさが２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、４０、３０、２０または１０ヌクレオチドまたはそれ未満である。他の好ましい態様において、単離核酸は、真核または原核細胞発現ベクターに組み入れられる。さらにより好ましい態様において、ベクターは、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ウイルスまたはバクテリオファージである。他の好ましい態様において、単離核酸は、発現されたペプチドを宿主細胞の細胞外表面に局在させるリーダー配列に機能的に結合している。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、疾患状態に関連する細胞を標的とするターゲティングペプチドを選択する段階、疾患状態を治療するために有効な一つまたは複数の分子をペプチドに結合させる段階、および疾患状態を有する被験者にペプチドを投与する段階を含む、疾患状態を治療する方法に関する。好ましくは、ターゲティングペプチドには、配列番号：５〜配列番号：４５、配列番号：４７〜配列番号：１２１、配列番号：１２３、および配列番号：１２５〜配列番号：２５１のいずれかから選択される連続アミノ酸少なくとも３個が含まれる。好ましい態様において、疾患状態は、真性糖尿病、炎症疾患、関節炎、アテローム硬化症、癌、自己免疫疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、心血管疾患、または変性疾患である。
【００２７】
本発明のもう一つの態様は、癌に対する腫瘍ターゲティングペプチドを用いる組成物および方法に関する。本出願に開示の方法によって同定された腫瘍ターゲティングペプチドは、分子または高分子群を含むがこれらに限定されない治療剤に結合させて、癌を有する被験者に投与してもよく、治療剤の有効性の増加および全身毒性の減少を提供する。本発明の範囲に含まれる治療剤には、化学療法剤、放射性同位元素、アポトーシス促進剤、細胞障害剤、細胞抑制剤、および遺伝子治療ベクターが含まれるがこれらに限定されない。そのような治療剤の腫瘍への標的化送達は、腫瘍に対する薬剤の送達を増加させながら、患者の正常な臓器および組織に対する薬剤の不適切な送達を減少させることに関して、先行技術に対する有意な改善を提供する。好ましい態様において、腫瘍ターゲティングペプチドは、ファージの送達を腫瘍血管の血管新生内皮細胞にターゲティングするためにファージ遺伝子治療ベクターのカプセルに組み入れられる。
【００２８】
特定の態様は、抗原に対する抗体を得る方法に関する。好ましい態様において、抗原は、一つまたは複数のターゲティングペプチドを含む。ターゲティングペプチドを調製して、固体支持体に固定して、抗体を含む血清を加えて、ターゲティングペプチドに結合する抗体を回収する。
【００２９】
例示的な態様の説明
本明細書において使用されるように、「一つの」（「ａ」又は「ａｎ」）とは、１以上を意味しうる。本発明の特許請求の範囲において使用されるように、「を含む」という用語と関連して、「一つの」（「ａ」又は「ａｎ」）とは、１以上を意味しうる。本発明において使用されるように、「もう一つの（ａｎｏｔｈｅｒ）」とは、少なくとも第二又はそれ以上の項目を意味しうる。
【００３０】
「ターゲティングペプチド」とは、ある臓器、組織、又は細胞型への選択的移行を特徴とする、連続的なアミノ酸の配列を含むペプチドである。選択的移行は、例えば、推定ターゲティングペプチド配列を、ファージの外表面上に表示されるタンパク質へと組み込む、後に開示される方法により、決定されうる。異なるアミノ酸配列のそのようなターゲティングペプチドを多数発現するよう遺伝学的に改変されたそのようなファージのライブラリを、被験者に投与した後、被験者から１つ又は複数の臓器、組織、又は細胞型を収集し、その臓器、組織、又は細胞型に見出されるファージを同定する。ターゲティングペプチド配列を発現するファージは、対照の組織又は臓器と比較して、より多い結合を、その組織又は臓器において示す場合、その組織又は臓器に選択的に移行するものと見なされる。好ましくは、ターゲティングペプチドの選択的移行は、対照の臓器、組織、又は細胞型と比較して２倍以上大きいファージの濃縮を、標的の臓器、組織、又は細胞型においてもたらすべきである。対照の臓器、組織、又は細胞型と比較して少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又はそれ以上の濃縮を標的臓器においてもたらす選択的移行は、より好ましい。又は、選択的移行を示すターゲティングペプチド配列を発現するファージは、好ましくは、標的臓器から回収されたファージを、次回のスクリーニングのため第二の宿主へと再注射した場合に、対照臓器と比較して増加した濃縮を標的臓器において示す。３回目のスクリーニングの後には、さらなる濃縮が示されうる。選択的移行を決定するためのもう一つの別の手段は、推定標的ペプチドを発現するファージが、非特異的ペプチドを発現するか、又は推定標的ペプチドを発現するよう遺伝学的に改変されていない対照ファージと比較して、好ましくは２倍、より好ましくは３倍、又はそれ以上の濃縮を標的臓器において示すことである。選択的移行を決定するためのもう一つの手段は、標的ペプチドを発現するファージの標的臓器への移行が、標的ペプチド配列を含む合成ペプチドの共投与により少なくとも部分的に阻止されることである。「ターゲティングペプチド」および「回帰ペプチド」とは、本明細書において同義に使用される。
【００３１】
「ファージディスプレイライブラリ」とは、その外表面上に推定のターゲティングペプチドの組を発現するように遺伝子操作されているファージのコレクションを意味する。好ましい態様において、推定のターゲティングペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ファージ被膜タンパク質をコードする遺伝子にフレームが合うように挿入される。他の好ましい態様において、推定のターゲティングペプチド配列は、一部が２０個全てのアミノ酸のランダム混合物であり、一部が非ランダム混合物である。特定の好ましい態様において、ファージディスプレイライブラリの推定のターゲティングペプチドは、ターゲティングペプチド配列内の固定位置で一つまたは複数のシステイン残基を示す。
【００３２】
「高分子複合体」とは、その配列がランダム、規則正しい、または部分的に規則正しくてもよい分子のコレクションを意味する。この用語は、バクテリオファージ、ウイルス、細菌、単細胞病原性生物、多細胞病原性生物、および原核または真核細胞のような生物を含む。この用語はまた、リポソーム、微小カプセル、微粒子、磁気ビーズおよび微小装置のような非生存分子群を含む。唯一の要件は、複合体が一つ以上の分子を含むことである。分子は同一であっても、または互いに異なっていてもよい。
【００３３】
ターゲティングペプチドのための「受容体」には、ターゲティングペプチドに結合する任意の分子または分子の複合体が含まれるがこれらに限定されない。受容体の非限定的な例には、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、エピトープ、脂質、糖質、多分子構造、一つまたは複数の分子の特異的コンフォメーションおよび形態解剖学的実体が含まれる。好ましい態様において、「受容体」とは、標的臓器、組織、または細胞型内の血管を形成する細胞の管腔表面上に存在する天然に存在する分子または分子の複合体である。
【００３４】
「被験者」とは、一般的に哺乳類を意味する。特定の好ましい態様において、被験者は、マウスまたはウサギである。さらにより好ましい態様において、被験者はヒトである。
【００３５】
ファージディスプレイ
ターゲティングペプチドを同定するための本明細書に記載の方法は、ファージディスプレイライブラリのインビトロ投与を含む。ファージディスプレイの様々な方法およびペプチドの多様な集団を作製する方法は当技術分野で周知である。例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，２２３，４０９号、第５，６２２，６９９号、および第６，０６８，８２９号は、ファージライブラリを調製する方法を開示する。ファージディスプレイ技術は、小さいペプチドがその表面上に発現されうるようにバクテリオファージを遺伝子操作することを含む（Ｓｍｉｔｈら、１９８５、１９９３）。この技術を適用できる可能性がある範囲はかなり広く、過去１０年の間に、ファージによって表示されたペプチドライブラリの構築、およびライブラリを用いてペプチドリガンドを単離するスクリーニング方法の開発にはかなりの進歩が認められている。例えば、ペプチドライブラリを用いることによって、相互作用部位、および炎症反応に関与する抗体または細胞接着を媒介するインテグリンのような多くのタンパク質における受容体−リガンド結合モチーフの特徴を調べることが可能となった。この方法は同様に、ペプチド模倣薬または造影剤を開発するためのリードとして役立つ新規ペプチドリガンドを同定するためにも用いられている（Ａｒａｐら、１９９８ａ）。ペプチドの他に、一本鎖抗体のようなより大きいタンパク質ドメインもまた、ファージ粒子の表面上に表示されうる（Ａｒａｐら、１９９８ａ）。
【００３６】
ある臓器、組織、又は細胞型に選択的なターゲティングアミノ酸配列は、「バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）」により単離されうる（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９）。簡単に説明すると、推定ターゲティングペプチドを含むファージのライブラリを動物又はヒトに投与し、ファージを含む臓器、組織、又は細胞型の試料を回収する。繊維状ファージを利用した好ましい態様においては、バイオパニングとバイオパニングの間に、線毛陽性細菌においてインビトロでファージを繁殖させることができる。この細菌は、ファージによって溶解せず、特定の挿入物を表示するファージを、多コピー、分泌する。標的分子と結合するファージは、標的の臓器、組織、又は細胞型から溶出させ、次いで宿主細菌において増殖させることにより増幅することができる。所望により、増幅されたファージを宿主に投与し、臓器、組織、又は細胞型の試料を再び収集してもよい。選択的バインダーの集団が得られるまで、複数回のバイオパニングを実施することができる。ペプチドのアミノ酸配列を、ファージゲノム内のターゲティングペプチド挿入物に相当するＤＮＡを配列決定することにより、決定する。次いで、同定されたターゲティングペプチドを、標準的なタンパク質化学技術（Ａｒａｐら、１９９８ａ、Ｓｍｉｔｈら、１９８５）により合成ペプチドとして作製することができる。この手法は、標的の性質を予想することなく、バイアスのない機能アッセイにおいて、循環ターゲティングペプチドを検出することを可能にする。候補標的がターゲティングペプチドの受容体として同定された後は、標準的な生化学的方法（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９；ＲａｊｏｔｔｅおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９）を使用することにより、それを単離、精製、クローニングすることが可能である。
【００３７】
特定の態様において、バックグラウンドファージ結合をさらに減少させるため、サブトラクションプロトコルが使用される。サブトラクションの目的は、目的の細胞以外の細胞と結合するか、又は不活化された細胞と結合するファージをライブラリから除去することである。別の態様において、ファージライブラリは、ターゲティングされた細胞、組織、又は臓器を保有していない被験者に対してプレスクリーニングされうる。例えば、胎盤結合ペプチドは、男性又は非妊娠女性に対してライブラリをプレスクリーニングした後に同定されうる。サブトラクション後、ライブラリは、目的の細胞、組織、又は臓器に対してスクリーニングされうる。もう一つの別の態様において、刺激されていない休止期の細胞型、組織、又は臓器が、ライブラリに対してスクリーニングされ、結合するファージが除去される。次いで、細胞系、組織、又は臓器が、例えばホルモン、増殖因子、サイトカイン、又はケモカインの投与によって活性化され、活性化された細胞型、組織、又は臓器が、サブトラクトされたファージライブラリに対してスクリーニングされる。
【００３８】
例えば、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第号５，８４０，８４１号、第５，７０５，６１０号、５，６７０，３１２号、及び第５，４９２，８０７号に開示されるように、他のサブトラクションプロトコルの方法も既知であり、本発明の実施において使用されうる。
【００３９】
ファージディスプレイ系の選択
マウスにおいて行われたこれまでのインビボ選択研究は、ｆＵＳＥ５ベクターにおけるＩＩＩ遺伝子被膜タンパク質との融合タンパク質として発現されたランダムペプチドのライブラリを好んで用いた（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）。所定のライブラリに存在する個々のクローンの数および多様性は、インビボ選択の成否にとって重要な要因である。欠損ファージクローンの過剰発現を有する可能性が低い一次ライブラリを用いることが好ましい（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９）。ライブラリの調製は、１０８〜１０９形質導入単位（Ｔ．Ｕ．）／ｍｌのあいだで最適化しなければならない。特定の態様において、各選択ラウンドの間にバルク増幅戦略を適用する。
【００４０】
直鎖、環状、または二環ペプチドを示すファージライブラリを、本発明の範囲内で用いてもよい。しかし、単環ペプチドは直鎖ペプチドより標的臓器に対して高い親和性を有する傾向があることから、環状挿入物（ＣＸ３−１０Ｃ）において３〜１０個のランダム残基を表示するファージライブラリが好ましい。二環ペプチドを示すライブラリ（ＣＸ３Ｃ Ｘ３ＣＸ３Ｃなど；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８）も首尾よく用いられている。しかし、同源の合成ペプチドの産生は、可能ではあるが、異なるジスルフィド架橋配列を有する多数の配座異性体のために複雑となりうる。
【００４１】
マウスにおけるインビボファージディスプレイによる回帰ペプチドおよび受容体の同定
マウスに投与されたファージディスプレイペプチドライブラリ由来のペプチドのインビボ選択を用いて、正常なマウス脳、腎臓、肺、皮膚、膵臓、網膜、腸、小腸、子宮、前立腺、および副腎に関して選択的なターゲティングペプチドを同定した（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８）。これらの結果は、正常な臓器の血管内皮が、ペプチドプローブによる異なるターゲティングを可能にするために十分に不均一であることを示している（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８）。腫瘍の新生血管に回帰するペプチドを同定する手段は、下記のように考案されている。ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の血管を標的とするペプチドモチーフのパネルが構築されている（Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９により概説）。これらのモチーフには、配列ＲＧＤ−４Ｃ、ＮＧＲ、およびＧＳＬが含まれる。ＲＧＤ−４Ｃペプチドはこれまで、選択的に結合するαｖインテグリンとして同定されており、ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の血管に回帰することが示されている（Ａｒａｐら、１９９８ａ、１９９８ｂ；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９７）。
【００４２】
腫瘍回帰ＲＧＤ４Ｃターゲティングペプチドの受容体は、αｖインテグリンとして同定されている（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９７）。αｖインテグリンは、血管新生において重要な役割を果たす。αｖβ３およびαｖβ５インテグリンは、正常な内皮細胞には存在しないか、または発現されても低レベルであるが、腫瘍の新生血管では誘導される（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４；Ｈａｍｍｅｓら、１９９６）。アミノペプチダーゼＮ／ＣＤ１３は最近、ＮＧＲモチーフの血管新生受容体であると同定されている（Ｂｕｒｇら、１９９９）。アミノペプチダーゼＮ／ＣＤ１３は、ＴＲＡＭＰにおける前立腺癌の新生血管においてだけでなく、正常上皮前立腺組織においても強く発現されている。
【００４３】
腫瘍回帰ファージは、腫瘍の新生血管においてその受容体と同時局在するが、正常組織の非新生血管には存在しない（Ａｒａｐら、１９９８ｂ）。免疫組織化学的証拠から、血管ターゲティングファージが、組織切片においてヒト腫瘍血管に結合するが（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、２０００）、正常血管には結合しないことが示されている。挿入物を有さない陰性対照ファージ（ｆｄファージ）は、正常または腫瘍組織切片に結合しなかった。血管新生受容体の発現を、細胞株、非増殖血管、および腫瘍の活性化血管、ならびに黄体のような他の血管新生組織において評価した。フローサイトメトリーおよび免疫組織化学から、これらの受容体が多くの腫瘍細胞および活性化ＨＵＶＥＣｓにおいて発現されていることが示された（データは示さない）。血管新生受容体は、マウスまたはヒト組織の正常臓器の血管において検出されなかった。
【００４４】
これらの受容体の分布を、腫瘍細胞、腫瘍血管、および正常血管において免疫組織化学によって分析した。αｖインテグリン、ＣＤ１３、アミノペプチダーゼＡ、ＮＧ２、および腫瘍血管における既知の受容体であるＭＭＰ−２／ＭＭＰ−９は、ヒトおよびマウス起源の双方の新生血管の内皮細胞および周皮細胞において特異的に発現される。新生血管は、非増殖性の内皮細胞では非常に低レベルで発現されるか、または全く発現されないマーカーを発現する（示していない）。
【００４５】
新生血管内皮のマーカーには、ＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ受容体の特異的サブタイプ、ならびに中でもαｖインテグリンのような血管増殖因子の受容体が含まれる（ＭｕｓｔｏｎｅｎおよびＡｌｉｔａｌｏ、１９９５）。これまで、新生血管の特徴である新規分子の同定および単離は、主に内皮細胞を培養で増殖させると表現型が劇的に変化するために遅れている（Ｗａｔｓｏｎら、１９９５）。
【００４６】
これらの腫瘍血管マーカーの多くはプロテアーゼであり、マーカーのいくつかは、ウイルス受容体として作用する。αｖインテグリンは、アデノウイルスの受容体であり（Ｗｉｃｋｈａｍら、１９９７ｃ）、ＣＤ１３はコロナウイルスの受容体である（Ｌｏｏｋら、１９８９）。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９は、エコーウイルスの受容体である（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９）。アミノペプチダーゼＡも同様にウイルス受容体であるように思われる。バクテリオファージは真核細胞ウイルスと同じ細胞受容体を利用する可能性がある。これらの知見は、インビボファージディスプレイによって単離された受容体が、同定されたペプチドモチーフを標的遺伝子治療担体として利用するための重要な特徴である、細胞内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）能を有することを示唆している。
【００４７】
標的化送達
腫瘍血管に回帰するペプチドを細胞障害薬またはアポトーシス促進ペプチドにカップリングさせると、腫瘍異種移植片を有する実験的マウスモデルにおいて親化合物より有効でより毒性の低い化合物が得られている（Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９９）。下記に示すように、ＲＧＤ−４Ｃペプチドをアデノウイルスの表面タンパク質に挿入すると、腫瘍標的化遺伝子治療のために用いてもよいアデノウイルスベクターが得られる（Ａｒａｐら、１９９８ｂ）。
【００４８】
ＢＲＡＳＩＬ
好ましい態様において、標的臓器、組織、または細胞型の細胞に結合したファージを未結合のファージから分離することは、ＢＲＡＳＩＬ技術を用いて行う（２０００年９月８日に提出された米国特許仮出願第６０／２３１，２６６号；参照として本明細書に組み入れられており、本明細書と共に提出された、Ａｒａｐ、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、およびＧｉｏｒｄａｎｏによる「選択的相互作用リガンドのバイオパニングおよび迅速な分析（Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ｌｉｇａｎｄｓ（ＢＲＡＳＩＬ））」と題する米国特許）。ＢＲＡＳＩＬ（選択的相互作用リガンドのバイオパニングおよび迅速な分析）では、臓器、組織、または細胞型の細胞または小さい細胞塊に穏やかに分離して、これを水相に懸濁する。水相を、適当な密度の有機相の上に層にして、遠心分離する。結合したファージに接着した細胞は遠心管の底に沈殿して、未結合のファージは水相に残ったままとなる。これによって、ファージと細胞との結合相互作用を維持しながら、結合したファージを未結合のファージからより効率よく分離することができる。臓器、組織、もしくは細胞型を静脈内投与によりファージディスプレイライブラリに曝露する、インビボプロトコールにおいて、または、細胞を水相においてファージライブラリに曝露してから遠心分離する、エクスビボプロトコールによって、ＢＲＡＳＩＬを行ってもよい。
【００４９】
タンパク質とペプチド
特定の態様において、本発明は、少なくとも一つのタンパク質またはペプチドを含む新規組成物に関する。本明細書において用いられるように、タンパク質またはペプチドは一般的に、アミノ酸２００個以上で遺伝子から翻訳された完全長の配列までのタンパク質；アミノ酸１００個以上のポリペプチド；および／またはアミノ酸約３〜約１００個のペプチドを意味するがこれらに限定されない。便宜上、「タンパク質」、「ポリペプチド、および「ペプチド」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。
【００５０】
特定の態様において、少なくとも一つのタンパク質またはペプチドの大きさは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、約２５００個のアミノ酸残基またはそれ以上を含んでもよいがこれらに限定されない。
【００５１】
本明細書において用いられるように、「アミノ酸残基」とは、当技術分野で既知の任意の天然のアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または任意のアミノ酸模倣体を意味する。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基は連続的であって、アミノ酸残基の配列を中断する任意の非アミノ酸は存在しない。他の態様において、配列は一つまたは複数の非アミノ酸部分を含んでもよい。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基の配列は、一つまたは複数のアミノ酸部分によって中断されてもよい。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基配列は、一つまたは複数のアミノ酸部分によって中断されてもよい。
【００５２】
したがって、「タンパク質またはペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質において認められる一般的なアミノ酸２０個の少なくとも一つ、または下記の表１に示すアミノ酸を含むがこれらに限定しない少なくとも一つの改変もしくはまれな（ｕｎｕｓｕａｌ）アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。
【００５３】
【表１】改変アミノ酸およびまれなアミノ酸

Figure 2004508045
【００５４】
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技術を用いたタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、タンパク質もしくはペプチドの天然資源からの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に既知の任意の技術によって作製してもよい。様々な遺伝子に対応するヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド配列がこれまでに開示されており、当業者に既知のコンピューターデータベースにおいて認められるであろう。そのような一つのデータベースは、国立バイオテクノロジー情報センターのＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベースである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。既知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示の技術を用いて、または当業者に既知であるように増幅および／または発現してもよい。または、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの様々な市販の調製物が、当業者に既知である。
【００５５】
ペプチド模倣体
本発明に従ってポリペプチドを調製するためのもう一つの態様は、ペプチド模倣体を用いることである。模倣体は、タンパク質の二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、参照として本明細書に組み入れられる、「バイオテクノロジーと薬学（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、ペズット（Ｐｅｚｚｕｔｏ）ら編、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、ニューヨーク（１９９３）内、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、「ペプチド折り返し模倣体（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｕｒｎ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」を参照のこと。ペプチド模倣体を用いる背景の基礎となる根本的理由は、タンパク質のペプチド骨格が、抗体と抗原の相互作用のような分子間相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を主に向けるように存在する点である。ペプチド模倣体は、天然の分子と類似の分子間相互作用を可能にすると予想される。これらの原理を用いて、本明細書に開示のターゲティングペプチドの天然の特性の多くを有するが、改変および改善すらされた特徴を有する第二世代の分子を操作してもよい。
【００５６】
融合タンパク質
本発明の他の態様は、融合タンパク質に関する。これらの分子は一般的に、ターゲティングペプチドの全てまたは実質的な部分が、Ｎ末端またはＣ末端で第二のポリペプチドまたはタンパク質の全てまたは実質的な部分に結合している。例えば、融合体は、異種宿主においてタンパク質の組み換え型を発現させるように他の種からのリーダー配列を用いてもよい。もう一つの有用な融合には、融合タンパク質の精製を促進するために、抗体のエピトープのような免疫学的に活性なドメインを付加することが含まれる。融合部またはその近傍に切断部位を含めると、精製後のさらなるポリペプチドの除去が促進されるであろう。他の有用な融合には、酵素からの活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞ターゲティングシグナル、または膜貫通領域のような機能的ドメインの連結が含まれる。好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、治療タンパク質またはペプチドに結合したターゲティングペプチドを含む。融合タンパク質に組み入れてもよいタンパク質またはペプチドの例には、細胞抑制タンパク質、殺細胞タンパク質、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、ペプチド薬、抗体、Ｆａｂ断片抗体、抗原、受容体タンパク質、酵素、レクチン、ＭＨＣタンパク質、細胞接着タンパク質、および結合タンパク質が含まれる。これらの例は、制限することを意味しておらず、実質的に本発明の範囲内において、タンパク質またはペプチドはターゲティングペプチドを含む融合タンパク質に組み入れることができることを意図している。融合タンパク質を作製する方法は、当業者に周知である。そのようなタンパク質は、例えば二官能架橋剤を用いる化学的結合によって、完全な融合タンパク質の新規合成によって、またはターゲティングペプチドをコードするＤＮＡ配列を第二のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合させた後、無傷の融合タンパク質を発現させることによって、産生することができる。
【００５７】
タンパク質の精製
特定の態様において、タンパク質またはペプチドは単離または精製してもよい。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、一つのレベルで細胞、組織、または臓器のポリペプチドおよび非ポリペプチド画分へのホモジナイゼーションならびに粗分画化を含む。関心対象のタンパク質またはポリペプチドは、部分的または完全な精製を得るために（または均一になるまで精製）、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いてさらに精製してもよい。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、免疫アフィニティクロマトグラフィー、および等電点電気泳動である。アフィニティクロマトグラフィーによる受容体タンパク質精製の例は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，２０６，３４７号に開示されている。ペプチドを精製する特に効率のよい方法は、速いタンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）またはＨＰＬＣである。
【００５８】
精製タンパク質またはペプチドは、タンパク質またはペプチドが、その天然に得られる状態と比較して任意の程度にも精製されている、他の成分から単離可能な組成物を意味すると解釈される。したがって、単離または精製タンパク質またはペプチドも同様に、天然に存在する可能性がある環境を含まないタンパク質またはペプチドを意味する。一般的に、「精製された」とは、様々な他の成分を除去するために分画化が行われている、および組成物がその発現された生物活性を実質的に保持しているタンパク質またはペプチド組成物を意味するであろう。「実質的に精製された」という用語を用いる場合、この用語は、タンパク質またはペプチドが、組成物におけるタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上を構成するような、組成物の主成分を形成する組成物を意味する。
【００５９】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量する様々な方法が、本開示に照らして当業者に既知である。これらには、例えば、活性な画分の比活性を決定する、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって画分内でのポリペプチドの量を評価することが含まれる。画分の純度を評価する好ましい方法は、画分の比活性を計算すること、それを最初の抽出物の比活性と比較すること、およびこのように、「〜精製倍率」によって評価して、その純度を計算することである。活性の量を示すために用いられる実際の単位は、当然、精製を行うために選択される特定のアッセイ技術、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存するであろう。
【００６０】
タンパク質精製に用いるために適した様々な技術は、当業者に周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等による沈殿、または熱変性の後に遠心；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、およびアフィニティクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー段階；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこれらおよび他の技術の組み合わせが含まれる。当技術分野で一般的に既知であるように、様々な精製段階を行う順序は、変更してもよく、または特定の段階を省略してもよいと考えられ、なおも実質的に精製されたタンパク質またはペプチドを調製するための適した方法が得られる。
【００６１】
タンパク質またはペプチドは常にその最も精製された状態で提供すべきであるという一般要件はない。実際に、実質的にあまり精製されていない産物は、特定の態様において有用であると考えられる。部分精製は、より少ない精製段階を組み合わせて用いて、または同じ一般的精製スキームの異なる型を用いて行ってもよい。例えば、ＨＰＬＣ装置を用いて行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に低圧クロマトグラフィーシステムを用いる同じ技術より大きい精製「倍率」が得られるであろうと認識される。相対的なより低い程度の精製を示す方法は、タンパク質産物の全体的な回収、または発現されたタンパク質の活性を維持するために長所を有する可能性がある。
【００６２】
アフィニティクロマトグラフィーは、単離される物質と、それが特異的に結合する分子との特異的親和性に依存するクロマトグラフィー技法である。これは、受容体−リガンドタイプの相互作用である。カラム材料は、結合パートナーの一つを不溶性のマトリクスに共有カップリングさせることによって合成される。次に、カラム材料は溶液から物質を特異的に吸収することができる。条件を結合が起こらない条件に変更すると（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度等の変化）、溶出が起こる。マトリクスは、如何なる有意な程度にもそれ自身が分子を吸収せず、しかも広い範囲の化学、物理、および熱安定性を有する物質でなければならない。リガンドはその結合特性に影響を及ぼさないようにカップリングしなければならない。リガンドは、比較的堅固な結合を提供しなければならない。そして、試料またはリガンドを破壊することなく、物質を溶出することができなければならない。
【００６３】
合成ペプチド
本発明のターゲティングペプチドは、その大きさが比較的小さいために、従来の技術に従って溶液または固体支持体上で合成することができる。様々な自動シンセサイザーが市販されており、既知のプロトコールに従って用いることができる。例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）、１９８４；タム（Ｔａｍ）ら、１９８３；メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、１９８６；およびバラニー（Ｂａｒａｎｙ）およびメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、１９７９を参照のこと。通常、アミノ酸約６個から約３５〜５０個までの短いペプチド配列は、そのような方法によって容易に合成することができる。または、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクターに挿入され、適当な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、発現に適した条件で培養される組み換え型ＤＮＡ技術を用いてもよい。
【００６４】
抗体
特定の態様において、同定されたターゲティングペプチドまたはその受容体に対する抗体を作製することが望ましいかもしれない。適当なターゲティングペプチドまたは受容体、またはその一部をリンカー、ポリリンカー、または誘導体化アミノ酸によって一つまたは複数の物質にカップリング、結合（ｂｏｎｄｅｄ）、結合（ｂｏｕｎｄ）、共役、または化学的に結合させてもよい。これは、双特異的、または多価組成物またはワクチンが産生されるように行ってもよい。これらの組成物の調製において用いられる方法は、当業者に周知であり、ヒトに投与するために適していなければならない、すなわち薬学的に許容されなければならないとさらに想像される。好ましい物質は、担体であり、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。
【００６５】
「抗体」という用語は、抗原決定領域を有する任意の抗体様分子を意味するために用いられ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖ドメイン抗体（ＤＡＢｓ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）等のような抗体断片が含まれる。様々な抗体に基づく構築物および断片を調製および用いる技術は、当技術分野で周知である。抗体を調製および特徴付けする手段も同様に、当技術分野で周知である（例えば、「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと；参照として本明細書に組み入れられる）。
【００６６】
サイトカインとケモカイン
特定の態様において、臓器、組織、または細胞型に標的化送達するために、特異的生物活性物質を一つまたは複数のターゲティングペプチドにカップリングさせることが望ましいかもしれない。そのような物質には、サイトカイン、ケモカイン、アポトーシス促進因子、および抗血管新生因子が含まれるがこれらに限定されない。「サイトカイン」という用語は、細胞間メディエータとしてもう一つの細胞に作用する、一つの細胞集団によって放出されたタンパク質の総称である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、増殖因子、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン；胎盤ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；ムレリアン阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βのような神経生長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、−β、および−γのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８のようなインターロイキン（ＩＬ）、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、キット−リガンドまたはＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子ならびにＬＴが含まれる。本明細書において用いられるように、サイトカインという用語には、天然起源からのタンパク質または組み換え型細胞培養からのタンパク質、および本来の配列サイトカインの生物活性同等物が含まれる。
【００６７】
ケモカインは、一般的に、ケモカイン発現部位に免疫エフェクター細胞を動員するための化学誘引物質として作用する。例えば、他の免疫系成分の治療部位への動員を増強するために、サイトカイン遺伝子と併用して特定のケモカイン遺伝子を発現することが有利であろう。ケモカインには、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、およびＩＰ−１０が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、特定のサイトカインも同様に化学誘引作用を有することが知られており、それらも同様にケモカインという用語の下に分類されうることを認識するであろう。
【００６８】
造影剤と放射性同位元素
特定の態様において、本発明で主張されるペプチドまたはタンパク質は、様々な疾患を有する臓器、組織、または細胞型を造影および診断するために用いられる造影剤に結合してもよい。多くの適当な造影剤が、それらをタンパク質またはペプチドに結合させる方法と共に当技術分野で既知である（例えば、いずれも参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，０２１，２３６号および第４，４７２，５０９号を参照のこと）。タンパク質またはペプチドはまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩のようなカップリング剤の存在下で酵素と反応させてもよい。蛍光マーカーとの結合物は、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製する。
【００６９】
造影剤として用いられる可能性がある常磁性イオンの非限定的な例には、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、およびエルビウム（ＩＩＩ）が含まれ、ガドリニウムが特に好ましい。Ｘ線造影のような他の状況において有用なイオンには、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）および特にビスマス（ＩＩ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００７０】
造影剤または治療剤として用いられる可能性がある放射性同位元素には、アスタチン２１１、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６７、１５２ユーロピウム、ガリウム６７、３水素、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５９鉄、３２リン、レニウム１８６、レニウム１８８、７５セレニウム、３５硫黄、テクネチウム９９ｍ、およびイットリウム９０が含まれる。１２５Ｉは、特定の態様における使用に好ましいことが多く、テクネチウム９９ｍおよびインジウム１１１も同様に、低エネルギーであって、長い範囲の検出に適しているため、好ましいことが多い。
【００７１】
本発明の放射活性標識タンパク質またはペプチドは、当技術分野で周知の方法に従って産生してもよい。例えば、それらは、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウム、および次亜塩素酸ナトリウムのような化学酸化剤またはラクトペルオキシダーゼのような酵素的酸化剤と接触させることによってヨウ化することができる。本発明によるタンパク質またはペプチドは、リガンド交換プロセスによって、例えば、ペルテクネートをスズ溶液によって還元して、還元したテクネチウムをセファデックスカラム上でキレート化して、ペプチドをこのカラムに適用することによって、または直接標識技術によって、例えばペルテクネート、ＳＮＣｌ２のような還元物質、フタル酸ナトリウムカリウム溶液のような緩衝液、およびペプチドをインキュベートすることによって、テクネチウム９９ｍによって標識してもよい。金属イオンとして存在する放射性同位元素に結合するために用いられることが多い中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート、およびレノグラフィンを含む蛍光標識も同様に用いることが考慮される。
【００７２】
特定の態様において、主張されるタンパク質またはペプチドは、色素産生基質に接触させると着色産物を生じる二次結合リガンドまたは酵素（酵素タグ）に結合してもよい。適した酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（ホースラディッシュ）水素ペルオキシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼが含まれる。好ましい二次結合リガンドはビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン化合物である。そのような標識の利用は当業者に周知であり、例えば、それぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；および第４，３６６，２４１号に記載されている。
【００７３】
架橋剤（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）
二官能架橋試薬は、アフィニティマトリクスの調製、多様な構造の改変および安定化、リガンドおよび受容体結合部位の同定、ならびに構造研究を含む多様な目的のために広く用いられている。二つの同一の官能基を有するホモ二官能試薬は、同一および異なる高分子または高分子サブユニット間の架橋を誘導するために、ならびにペプチドリガンドをその特異的結合部位に結合させるために非常に効率がよいことが判明した。ヘテロ二官能試薬は、異なる二つの官能基を含む。異なる二つの官能基の異なる反応性を利用することによって、架橋は、選択的および連続的に制御することができる。二官能架橋試薬はその官能基の特異性に従って、例えばアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、カルボキシル特異的置換基に分類することができる。これらの中で、遊離のアミノ基に対する試薬は、それらが市販されているため、合成が容易であるため、およびそれらを適用できる緩和な反応条件のために特に一般的となった。ヘテロ二官能架橋試薬の大部分は、一級アミン反応基とチオール反応基とを含む。
【００７４】
リガンドをリポソームに架橋させる例示的方法は、それぞれが特に参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，６０３，８７２号、および米国特許第５，４０１，５１１号に記載されている。様々なリガンドをアミン残基の架橋によってリポソーム表面に共有結合させることができる。リポソーム、特に、それぞれがホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含む微小乳化リポソーム（ＭＥＬ）および大きい単層リポソーム（ＬＵＶＥＴ）のような多層小胞（ＭＬＶ）または単層小胞は、確立された技法によって調製されている。リポソームにＰＥを含めこと、架橋目的のためにリポソーム表面上に活性な官能残基、１級アミンを提供する。上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）のようなリガンドは、ＰＥ−リポソームに首尾よく結合されている。リガンドは、リポソーム表面上の明確な部位に共有結合している。これらの部位の数および表面密度は、リポソーム製剤およびリポソームタイプによって決まる。リポソーム表面はまた、非共有結合部位を有してもよい。リガンドとリポソームとの共有結合体を形成するために、架橋試薬を有効性および生体適合性に関して調べられている。架橋試薬には、グルタルアルデヒド（ＧＡＤ）、二官能オキシラン（ＯＸＲ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、および水溶性カルボジイミド、好ましくは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が含まれる。架橋の複合体化学によって、認識物質のアミン残基とリポソームとの結合が確立される。
【００７５】
もう一つの例において、ヘテロ二官能架橋試薬および架橋試薬を用いる方法を記載する（特にその全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８８９，１５５号）。架橋試薬は、求核性のヒドラジド残基を求電子性のマレイミド残基と組み合わせて、それによって一つの例においてアルデヒドを遊離のチオールにカップリングさせることができる。架橋試薬は、様々な官能基を架橋するように改変することができる。
【００７６】
核酸
本発明による核酸は、ターゲティングペプチド、受容体タンパク質、または融合タンパク質をコードしてもよい。核酸は、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または合成ＤＮＡに由来してもよい。発現ベクターに組み入れることが望ましい場合、核酸はまた、天然のイントロンまたはもう一つの遺伝子に由来するイントロンを含んでもよい。そのような操作された分子は時に、「ミニ遺伝子」と呼ばれる。
【００７７】
本明細書において用いられる「核酸」には、一本鎖および二本鎖分子と共に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学改変核酸および核酸類似体が含まれる。本発明の範囲内の核酸は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、約２５００個のヌクレオチド残基またはそれ以上の長さであってもよいと考えられる。
【００７８】
ターゲティングペプチド、融合タンパク質、および受容体は、適当なアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列によってコードされうると考えられる。所望のアミノ酸配列をコードする核酸の設計および産生は、標準化コドン表を用いて当業者に周知である（下記の表２を参照のこと）。好ましい態様において、それぞれのアミノ酸をコードするために選択されたコドンは、関心対象の宿主細胞において核酸の発現を最適にするように改変してもよい。宿主細胞の様々な種のコドン選択性は当技術分野で周知である。
【００７９】
【表２】
Figure 2004508045
【００８０】
所望のターゲティングペプチド、融合タンパク質または受容体アミノ酸配列をコードする核酸の他に、本発明は、そのようなコードする核酸配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする相補的核酸を含む。核酸ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェンシー条件は当技術分野で周知である。例えば、条件は、温度約５０℃〜約７０℃で約０．０２ Ｍ〜約０．１５ Ｍ ＮａＣｌによって提供される条件のように、低い塩および／または高い温度条件を含んでもよい。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は特定の核酸、標的配列の長さおよびヌクレオチド含有量、核酸の荷電組成物、およびハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウム、または他の溶媒の存在または濃度によって部分的に決定される。
【００８１】
クローニング、遺伝子移入、および発現のためのベクター
特定の態様において、発現ベクターを用いてターゲティングペプチドまたは融合タンパク質を発現して、次にこれを精製および用いることができる。他の態様において、発現ベクターは、遺伝子治療において用いられる。発現は、適当なシグナルがベクターにおいて提供される必要があり、宿主細胞において関心対象の遺伝子の発現を促進するウイルスおよび哺乳類起源の双方からのエンハンサー／プロモーターのような様々な調節要素が含まれる。宿主細胞においてメッセンジャーＲＮＡ安定性および翻訳可能性を最適にするように設計した要素も同様に既知である。
【００８２】
調節要素
「発現構築物」または「発現ベクター」という用語は、核酸コード配列の一部または全てが転写されることが可能である遺伝子産物をコードする核酸を含む任意の種類の遺伝子構築物が含まれることを意味する。好ましい態様において、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下である。「プロモーター」とは、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識され、遺伝子の特異的転写を開始するために必要なＤＮＡ配列を意味する。「転写制御下」という用語は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御するために、核酸に対して正しい位置および方向に存在することを意味する。
【００８３】
関心対象の核酸配列の発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、標的細胞において核酸の発現を指示することができる限り、重要ではないと考えられている。このように、ヒト細胞が標的となる場合、ヒト細胞において発現されることができるプロモーターに隣接してその制御下にあるように核酸コード領域を配置することが好ましい。一般的に、そのようなプロモーターには、ヒトまたはウイルスプロモーターのいずれかが含まれてもよい。
【００８４】
様々な態様において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターを用いて、関心対象のコード配列の高レベル発現を得ることができる。関心対象のコード配列の発現を得るために、当技術分野で周知である他のウイルスもしくは哺乳類の細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターを用いることも同様に、発現レベルが所定の目的にとって十分である限り考慮される。
【００８５】
ｃＤＮＡ挿入物を用いる場合、典型的にこれは遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を行うためにポリアデニル化シグナルを含むであろう。ポリアデニル化シグナルの特性は、本発明の実践の成功にとって重要ではないと考えられ、ヒト成長ホルモン、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのようなそのような任意の配列を用いてもよい。同様に、ターミネータも発現構築物の要素として同様に考慮される。これらの要素は、メッセージレベルを増強して構築物からの他の配列への読み過ごしを最小限にするように作用しうる。
【００８６】
選択マーカー
本発明の特定の態様において、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現構築物にマーカーを含めることによってインビトロまたはインビボで同定してもよい。そのようなマーカーは、細胞に対して同定可能な変化を付与して、発現構築物を含む細胞を容易に同定できるようにするであろう。通常、薬物選択マーカーを含めると、形質転換体のクローニングおよび選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに対して抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。または、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）のような酵素、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のような酵素を用いてもよい。免疫学的マーカーも同様に用いることができる。用いられる選択マーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要ではないと考えられる。選択マーカーのさらなる例は当業者に周知である。
【００８７】
発現ベクターの送達
発現ベクターを細胞に導入する多くの方法がある。本発明の特定の態様において、発現構築物は、ウイルス、またはウイルスゲノムに由来する操作された構築物を含む。特定のウイルスは受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞内に入ることができること、宿主細胞ゲノムに組み入れられうること、およびウイルス遺伝子を安定かつ効率よく発現できることによって、それらは、哺乳類細胞に外来遺伝子を移入するための魅力的な候補物質となる（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｔｅｍｉｎ、１９８６）。一般的に、好ましい遺伝子治療ベクターはウイルスベクターである。
【００８８】
外来の遺伝子材料を許容することができるいくつかのウイルスは、それらが順応することができるヌクレオチドの数およびそれらが感染する細胞の範囲が制限されるが、これらのウイルスは遺伝子発現を首尾よく行うことができることが証明されている。しかし、アデノウイルスは、宿主ゲノムにその遺伝子材料を組み入れず、したがって、遺伝子発現のために宿主複製を必要とせず、そのためそれらは迅速で、効率のよい、異種遺伝子発現にとって理想的に適している。複製欠損ウイルスを調製する技術は当技術分野で周知である。
【００８９】
ウイルス送達系を用いる場合、それがベクター構築物を受け入れる細胞、動物または個体において望ましくない反応を引き起こさないように、欠損干渉ウイルス粒子またはエンドトキシンおよび他の発熱物質のような望ましくない混入物を本質的に含まないようにするために十分にビリオンを精製することが望ましいであろう。ベクターを精製する好ましい手段は、塩化セシウム勾配遠心のような懸濁密度勾配を用いることを含む。
【００９０】
遺伝子ベクターとして用いられるＤＮＡウイルスは、パポバウイルス（例えば、シミアンウイルス４０、ウシ乳頭腫ウイルス、およびポリオーマ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６）およびアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６）が含まれる。
【００９１】
インビボ送達のための好ましい方法の一つは、アデノウイルス発現ベクターを用いることを含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡに対する組み込み能が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによって得られる遺伝子移入効率が高いことによって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（ａ）構築物のパッケージングを支持するため、および（ｂ）その中にクローニングされているアンチセンスまたはセンスポリヌクレオチドを発現するために十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味するがこれらに限定されない。
【００９２】
発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作型を含む。アデノウイルスの遺伝子構築が、３６ ｋｂの直線状の二本鎖ＤＮＡウイルスであることを理解すれば、アデノウイルスＤＮＡの大きい断片を７ｋｂまでの外来配列に置換することが可能である（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。レトロウイルス感染症とは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染症は、アデノウイルスＤＮＡがエピソームにおいて複製できることから、染色体組み込みが起こらず、可能性がある遺伝子毒性を示さない。同様に、アデノウイルスは構造的に安定であり、十分に増幅させた後もゲノム再編成は検出されていない。アデノウイルスは、その細胞周期段階によらず、実質的に全ての上皮細胞に感染することができる。これまで、アデノウイルス感染症は、ヒトにおける急性呼吸器疾患のようにごく軽度の疾患に関係しているように思われる。
【００９３】
アデノウイルスは、そのゲノムの大きさが中等度であること、操作が容易であること、高力価、広い細胞範囲、および高い感染性のために、遺伝子移入ベクターとして用いるために特に適している。ウイルスゲノムの両端は１００塩基対〜２００塩基対の逆方向反復配列（ＩＴＲ）を含み、これはウイルスＤＮＡ複製およびパッケージングにとって必要なシス要素である。ゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される異なる転写単位を含む。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の調節に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現によって、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成が起こる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞の遮断（Ｒｅｎａｎ、１９９０）に関係している。ウイルスカプシドタンパク質の大多数を含む後期遺伝子の産物は、主要な後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じた単一の主転写物の有意なプロセシングの後に限って発現される。ＭＬＰ（１６．８ ｍ．ｕ．に存在）は、感染の後期段階において特に効率的であり、このプロモーターに由来する全てのｍＲＮＡは、５’−３連（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）配列を有し、それによってそれらは翻訳にとって好ましいｍＲＮＡとなる。
【００９４】
現在用いられている系において、組み換え型アデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの相同的組み換えによって生じる。二つのプロウイルスベクターのあいだの可能性がある組み換えにより、野生型アデノウイルスがこのプロセスから生じる可能性がある。したがって、個々のプラークからウイルスの単一のクローンを単離して、そのゲノム構造を調べることが重要である。
【００９５】
複製欠損であるアデノウイルスベクターの作製および増殖は、Ａｄ５ ＤＮＡ断片によってヒト胎児腎細胞から形質転換され、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する２９３と呼ばれる独自のヘルパー細胞株に依存する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムにとって重要ではないため（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８）、現在のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の助けを借りて、Ｅ１、Ｅ３、または双方の領域のいずれかに外来ＤＮＡを有する（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃら、１９９１）。本質的に、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージングすることができ（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７）、約２ｋｂの余分のＤＮＡの容量を提供する。Ｅ１領域およびＥ３領域において置換可能な約５．５ ｋｂのＤＮＡと組み合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大容量は７．５ ｋｂ以下、またはベクターの全長の約１５％である。アデノウイルスウイルスゲノムの８０％以上がベクター骨格に残っており、ベクター媒介細胞障害性の原因となる。同様に、Ｅ１欠失ウイルスの複製欠損も不完全である。例えば、ウイルス遺伝子発現の漏出は、現在利用可能なベクターについて高い感染多重度（ＭＯＩ）で認められる（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３）。
【００９６】
ヘルパー細胞株は、ヒト胎児腎細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胎児間葉細胞または上皮細胞のようなヒト細胞に由来してもよい。または、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスにとって許容される他の哺乳類種の細胞に由来してもよい。そのような細胞には、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、または他のサル胎児間葉もしくは上皮細胞が含まれる。考察したように、好ましいヘルパー細胞株は２９３である。
【００９７】
レイチャー（Ｒａｃｈｅｒ）ら（１９９５）は、２９３細胞を培養して、アデノウイルスを増殖させる改善された方法を開示した。一つの形式において、個々の細胞を培地１００ ｍｌ〜２００ ｍｌを含む１Ｌのシリコン処理スピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）に接種して天然の細胞凝集体を増殖させる。４０ ｒｐｍで攪拌した後、細胞生存率をトリパンブルーによって推定する。もう一つの形式において、フィブラ−セル微小担体（５ ｇ／ｌ）（Ｂｉｂｂｙ Ｓｔａｒｌｉｎ、Ｓｔｏｎｅ、ＵＫ）を以下のように用いる。培地５ｍｌに再懸濁させた細胞接種物を２５０ ｍｌアーレンマイヤーフラスコ中の担体（５０ ｍｌ）に加えて、時折攪拌しながら１時間〜４時間静置した。次に、培地を新鮮な培地５０ ｍｌに交換して振とうを開始する。ウイルスを産生するために、細胞を約８０％コンフルエントまで増殖させて、その後培地を交換して（最終容積の２５％）、アデノウイルスをＭＯＩ ０．０５で加える。培養物を一晩静置して、その後容積を１００％まで増加させて、振とうをさらに７２時間行う。
【００９８】
アデノウイルスベクターが複製欠損である、または少なくとも条件的に欠損であるという要件以外に、アデノウイルスベクターの特性は、本発明の実施の成功にとって重要ではないと考えられる。アデノウイルスは、既知の異なる血清型４２個またはサブグループＡ〜Ｆのいずれかであってもよい。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発明において用いられる条件的複製欠損アデノウイルスベクターを得るために好ましい開始材料である。これは、５型アデノウイルスが、それに関する膨大な生化学および遺伝子情報が既知であるヒトアデノウイルスであるためであり、このためこのアデノウイルスは、歴史的にアデノウイルスをベクターとして用いるほとんどの構築物について用いられている。
【００９９】
本発明を実践するために適用可能な典型的なベクターは、複製欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を有さないであろう。このように、Ｅ１コード配列が除去されている位置で遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが最も簡便である。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入位置は重要ではない。関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドも同様に、カールソン（Ｋａｒｌｓｓｏｎ）ら、１９８６によって記載されるようにＥ３置換ベクターにおいて欠失されたＥ３領域の代わりに、またはヘルパー細胞株もしくはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補う場合にはＥ４領域の代わりに挿入してもよい。
【０１００】
アデノウイルスは、増殖および操作が容易で、インビトロおよびインビボで広い宿主範囲を示す。このグループのウイルスは、高い力価、例えば、１０９〜１０１１プラーク形成単位／ｍｌで得ることができ、それらは非常に感染性である。アデノウイルスの生活環は宿主細胞ゲノムに組み入れられる必要はない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子は、エピソームであり、したがって、宿主細胞に対する遺伝子毒性は低い。野生型アデノウイルスをワクチン接種した研究では副作用は報告されておらず（Ｃｏｕｃｈ、１９６３；Ｔｏｐら、１９７１）、インビボ遺伝子移入ベクターとしてのその安全性および治療能を証明する。
【０１０１】
アデノウイルスベクターは、真核細胞遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチン開発（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１）に用いられている。動物試験から、組み換え型アデノウイルスが遺伝子治療に用いられ得ることが示唆された（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。異なる組織に組み換え型アデノウイルスを投与する研究には、気管注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３）、および脳への定位注射（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅら、１９９３）が含まれる。
【０１０２】
他の遺伝子移入ベクターは、レトロウイルスから構築してもよい。レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染細胞においてそのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換できることを特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次に、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞の染色体に安定に組み入れられ、ウイルスタンパク質の合成を指示する。組み込みによって、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含む。ｇａｇ遺伝子から上流に認められる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含む。二つの長末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強いプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、同様に、宿主細胞ゲノムへの組み込みにとって必要である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。
【０１０３】
レトロウイルスベクターを構築するために、関心対象のタンパク質をコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損であるウイルスを作製する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と共にｃＤＮＡを含む組み換え型プラスミドをこの細胞株に導入する場合（例えば、リン酸カルシウムによって）、パッケージング配列によって、組み換え型プラスミドのＲＮＡ転写物をウイルス粒子にパッケージングすることが可能となり、次に、これを培養培地に分泌する（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｔｅｍｉｎ、１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次に、組み換え型レトロウイルスを含む培地を回収して、選択的に濃縮し、遺伝子移入のために用いる。レトロウイルスベクターは広く多様な細胞型に感染することができる。しかし、組み込みおよび安定な発現には宿主細胞の分割を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。
【０１０４】
レトロウイルスベクターを用いることには特定の制限がある。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノムにおけるランダムな部位に組み入れられる。このため、宿主遺伝子の中断によって、または隣接遺伝子の機能を妨害することができるウイルス調節配列の挿入によって挿入変異誘発が起こりうる（Ｖａｒｍｕｓら、１９８１）。欠損レトロウイルスベクターを用いる場合のもう一つの懸念は、パッケージング細胞において野生型複製コンピテントウイルスが出現する可能性である。これは、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ配列から上流の組み換え型ウイルス挿入物からの無傷の配列が宿主細胞ゲノムに組み入れられる組み換え事象が原因である可能性がある。しかし、今では新しいパッケージング細胞株を利用することができ、それらは組み換えの可能性を大きく減少させるはずである（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒら、１９９０）。
【０１０５】
他のウイルスベクターを発現構築物として用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ、１９８４）、およびヘルペスウイルスのようなウイルスに由来するベクターを用いてもよい。それらは様々な哺乳類細胞にとっていくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
【０１０６】
発現構築物を培養哺乳類細胞に移入するためのいくつかの非ウイルス法もまた、本発明によって考慮される。これらには、リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）、ＤＥＡＥデキストラン（Ｇｏｐａｌ、１９８５）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）、直接マイクロインジェクション、ＤＮＡ負荷リポソーム、およびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞の超音波処理、高速微小弾丸を用いた遺伝子衝突、および受容体媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、１９８７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８）が含まれる。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエクスビボでの使用に首尾よく適合させてもよい。
【０１０７】
本発明のさらなる態様において、発現構築物はリポソームに封入してもよい。リポソームはリン脂質二重膜と内側の水性媒体とを特徴とする小胞構造である。多層リポソームは水性媒体で分かれた多数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると自然に形成する。脂質成分は閉鎖構造を形成する前に自己再配列を受けて、脂質二重層の間に水と溶存溶質とを捕獲する。同様に、リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体も考慮される。
【０１０８】
リポソーム媒介核酸送達および外来ＤＮＡのインビトロでの発現は非常に成功している。ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、（１９８０）は、培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ、および肝腫細胞において外来ＤＮＡのリポソーム媒介送達および発現の実現可能性を証明した。ニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）ら、（１９８７）は、静脈内注射後のラットにおいてリポソーム媒介遺伝子移入に成功した。
【０１０９】
ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、またはａｐａｒｔ細胞においてそれぞれ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むがこれらに限定されない多くの選択系を用いてもよい。同様に、抗代謝物抵抗性を、メソトレキセートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ、ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ、アミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ、およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏを選択するための基礎として用いることができる。
【０１１０】
薬学的組成物
臨床応用を考慮する場合、薬学的組成物発現ベクター、ウイルス保存液、タンパク質、抗体、および薬剤を意図する適用にとって適当な形で調製する必要があるかもしれない。一般的に、これは、ヒトまたは動物に対して有害となりうる不純物を本質的に含まない組成物を調製することを含むであろう。
【０１１１】
一般的に、送達ベクターを安定にして、標的細胞によって取り込まれることができるように、適当な塩および緩衝液を用いることが望まれるであろう。組み換え型細胞を患者に導入する場合には緩衝液も同様に用いる。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性培地に溶解または分散させたタンパク質またはペプチドの有効量を含む。そのような組成物も同様に、接種物と呼ばれる。「薬学的または薬理学的に許容される」という用語は、動物またはヒトに投与した場合に有害、アレルギー、またはその他の望ましくない反応を引き起こさない分子実体および組成物を意味する。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」には、任意のおよび全ての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が含まれる。そのような培地および物質を薬学的活性物質のために用いることは当技術分野で周知である。従来の培地または物質が本発明のタンパク質またはペプチドと不適合である場合を除き、治療的組成物において用いることが考慮される。補助活性成分も同様に組成物に組み入れることができる。
【０１１２】
本発明の活性組成物には、古典的な薬学的調製物が含まれてもよい。本発明によるこれらの組成物は、標的組織がその経路によって利用可能である限り、任意の一般的な経路によって投与される。これには、経口、鼻腔内、口腔内、直腸内、膣内、または局所投与が含まれる。または、投与は、正所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、または静脈内注射であってもよい。そのような組成物は通常、上記の薬学的に許容される組成物として投与されるであろう。
【０１１３】
注射によって用いるために適した薬学的剤形は、滅菌水溶液または分散液、および注射可能滅菌溶液または分散液の即時調合製剤のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、製剤は滅菌でなければならず、容易なシリンジ操作性が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、その適した混合物、および植物油を含む溶媒または分散培地となりうる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって得ることができる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において用いることによって得ることができる。
【０１１４】
注射可能滅菌溶液は、必要な量の活性化合物を、先に列挙した様々な他の成分と共に適当な溶媒において組み入れて、必要であれば濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散剤は、様々な滅菌活性成分を滅菌媒体に組み入れることによって調製される。注射可能滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および先に濾過滅菌したその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１１５】
治療剤
特定の態様において、化学療法剤を、腫瘍に選択的に送達するためのターゲティングペプチドまたは融合タンパク質に結合してもよい。用いるために適した物質または因子には、細胞に適用した場合にＤＮＡ損傷を誘導する任意の化学化合物が含まれてもよい。化学療法剤には、５−フルオロウラシル、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エストロゲン受容体結合物質、エトポシド（ＶＰ１６）、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、イフォスファミド、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリコマイシン、プロカルバジン、ラロキシフェン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水溶性型）、トランスプラチナ、ビンブラスチンおよびメソトレキセート、ビンクリスチン、または上記の任意の類似体もしくは誘導体変種が含まれるがこれらに限定されない。ほとんどの化学療法剤は以下の分類に入る：アルキル化剤、抗代謝剤、抗腫瘍抗生物質、コルチコステロイドホルモン、分裂阻害剤、およびニトロソウレア、ホルモン物質、雑多な物質、およびその任意の類似体または誘導体変種。
【０１１６】
化学療法剤および投与方法、用量等は、当業者に周知であり（例えば、関連部分が参照として本明細書に組み入れられる、「医師用添付文書集」、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎの「治療の薬理学的基礎（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、および「レミントンの薬化学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、を参照のこと）、本明細書に開示に照らして本発明と組み合わせてもよい。用量の何らかの変更は、治療すべき被験者の状態に応じて必要に応じて起こるであろう。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の被験者に関して適当な用量を決定するであろう。特定の化学療法剤および用量レジメの例も同様に本明細書に記載する。当然、これらの用量および物質および投与レジメは全て、制限するためではなく一例であって、特定の患者または適用に関して当業者は他の用量または物質を用いてもよい。これらの点のあいだの任意の用量、またはそこから誘導されうる範囲も同様に、本発明において用いられると予想される。
【０１１７】
アルキル化剤
アルキル化剤は、ゲノムＤＮＡと直接相互作用して癌細胞の増殖を防止する薬剤である。この範疇の化学療法剤は、細胞周期の全ての相に影響を及ぼす、すなわちそれらは相特異的ではない物質を表す。アルキル化剤には、ニトロジェンマスタード、エチレニメン、メチルメラミン、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、またはトリアジンが含まれてもよいがこれらに限定されない。それらには、ブスルファン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（シトキサン）、ダカルバジン、イフォスファミド、メクロレタミン（マスタージェン）、およびメルファランが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１８】
抗代謝剤
抗代謝剤はＤＮＡおよびＲＮＡ合成を破壊する。アルキル化剤とは異なり、それらは細胞周期のＳ期に特異的に影響を及ぼす。抗代謝剤は、葉酸類似体、ピリミジン類似体およびプリン類似体ならびに関連阻害化合物のような様々な範疇に分類することができる。抗代謝剤には、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、フルダラビン、ゲミシタビンおよびメソトレキセートが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１９】
天然物
天然物は一般的に、最初に天然資源から単離された化合物を意味する。そのような化合物、その類似体および誘導体は天然起源から単離してもよく、当業者に既知の任意の技術によって化学合成または組み換えによって産生してもよい。天然物には、分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、酵素および生物反応修飾剤のような分類が含まれる。
【０１２０】
分裂阻害剤には、細胞分裂または分裂に必要ないずれかのタンパク質合成を阻害することができる植物アルカロイドおよび他の天然物が含まれる。それらは、細胞周期の特定の期において作用する。分裂阻害剤には、例えば、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ１６）、テニポシド、パクリタキセル、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが含まれる。
【０１２１】
タキソイドは、トネリコ（ａｓｈ）の木であるタクサス・ブレビフォリア（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）の樹皮から単離された関連化合物の一種である。タキソイドにはドセタキセルおよびパクリタキセルのような化合物が含まれるがこれらに限定されない。パクリタキセルはチューブリンに結合して（ビンカアルカロイドによって用いられるものとは異なる部位で）、微小管の集合を促進する。
【０１２２】
ビンカアルカロイドは、薬学的活性を有すると同定された植物アルカロイドのタイプである。それらには、ビンブラスチン（ＶＬＢ）およびビンクリスチンのような化合物が含まれる。
【０１２３】
抗腫瘍抗生物質
抗腫瘍抗生物質は、抗菌および細胞障害活性の双方を有する。これらの薬剤はまた、酵素および分裂を化学的に阻害することによって、または細胞膜を変化させることによって、ＤＮＡを妨害する。これらの物質は、それらが細胞周期の全ての期において作用するため細胞周期特異的ではない。抗腫瘍抗生物質の例には、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、プリカマイシン（ミスラマイシン）、およびイダルビシンが含まれるがこれらに限定されない。
【０１２４】
ホルモン
コルチコステロイドホルモンは、それらが癌細胞を殺すまたは増殖を遅らせる場合に、化学療法剤と見なされる。コルチコステロイドホルモンは、他の化学療法剤の有効性を増加させるため、併用治療において用いられることが多い。プレドニゾンおよびデキサメタゾンは、コルチコステロイドホルモンの例である。
【０１２５】
カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロールのようなプロゲスチンは、子宮内膜および乳房の癌において用いられてきた。ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールのようなエストロゲンは、乳房および前立腺のような癌に用いられている。タモキシフェンのような抗エストロゲン剤は、乳癌のような癌に用いられてきた。プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロンのようなアンドロゲンも同様に、乳癌の治療に用いられてきた。フルタミドのような抗アンドロゲンは、前立腺癌の治療に用いられている。リュープロリドのようなゴナドトロピン放出ホルモン類似体は、前立腺癌の治療に用いられている。
【０１２６】
雑多な物質
いくつかの化学療法剤は、その活性に基づくこれまでの範疇に入らない。それらには、白金配位複合体、アントラセンジオン、置換ウレア、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アムサクリン、Ｌ−アスパラギナーゼ、およびトレチノインが含まれるがこれらに限定されない。それらは、本発明の組成物および方法において用いてもよいと考慮される。
【０１２７】
白金配位複合体には、カルボプラチンおよびシスプラチン（シス−ＤＤＰ）のような化合物が含まれる。
【０１２８】
ミトキサントロンのようなアントラセンジオンは、急性顆粒球白血病および乳癌の治療に用いられている。ヒドロキシウレアのような置換ウレアは、慢性顆粒球白血病、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、および悪性黒色腫を治療するために用いられている。プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）のようなメチルヒドラジン誘導体は、ホジキン病の治療に用いられている。ミトタンのような副腎皮質抑制剤は、副腎皮質癌を治療するために用いられており、アミノグルテチミドは、ホジキン病を治療するために用いられている。
【０１２９】
プログラムされた細胞死の調節物質
アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は、正常な胚発達の際に、成人組織において恒常性を維持し、および発癌を抑制するための本質的なプロセスである（Ｋｅｒｒら、１９７２）。Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーおよびＩＣＥ−様プロテアーゼが、他の系においてアポトーシスの重要な調節物質およびエフェクターであることが証明されている。濾胞性リンパ腫に関連して発見されたＢｃｌ−２タンパク質は、アポトーシスの制御および多様なアポトーシス刺激に反応した細胞の生存を増強するために顕著な役割を果たしている（Ｂａｋｈｓｈｉら、１９８５；ＣｌｅａｒｙおよびＳｋｌａｒ、１９８５；Ｃｌｅａｒｙら、１９８６；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏら、１９８５；ＴｓｕｊｉｍｏｔｏおよびＣｒｏｃｅ、１９８６）。進化的に保存されたＢｃｌ−２タンパク質は今では、関連タンパク質ファミリーのメンバーであると認識され、これらは死のアゴニストまたは死のアンタゴニストとして分類することができる。
【０１３０】
その発見後、Ｂｃｌ−２は、様々な刺激によって誘発された細胞死を抑制するように作用することが示された。同様に、共通の構造および配列相同性を有するＢｃｌ−２細胞死調節タンパク質のファミリーが存在することが今では明らかである。これらの異なるファミリーメンバーは、Ｂｃｌ−２と類似の機能（ＢｃｌＸＬ、Ｂｃｌｗ、Ｂｃｌｓ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂｆｌ−１）を有するか、またはＢｃｌ−２機能を相殺して細胞死を促進するか（例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ）のいずれかであることが示されている。
【０１３１】
本発明の範囲内で考慮されるアポトーシス促進剤の非限定的な例には、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン、セクロピン、（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（配列番号：１）、（ＫＬＡＫＫＬＡ）２（配列番号：２）、（ＫＡＡＫＫＡＡ）２（配列番号：３）、または（ＫＬＧＫＫＬＧ）３（配列番号：４）が含まれる。
【０１３２】
血管新生阻害剤
特定の態様において、本発明は、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、血小板因子４、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキサミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサンポリスルフェート、アンジオポエチン２（レジェネロン）、インターフェロン−α、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノマイド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４、またはミノサイクリンのような抗血管新生剤に結合したターゲティングペプチドを投与することに関してもよい。
【０１３３】
用量
当業者は、「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１５版、第３３章、特に６２４頁〜６５２頁に従う。治療すべき被験者の状態に応じて用量の何らかの変更が必然的に起こるであろう。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の被験者にとって適当な用量を決定するであろう。その上、ヒトでの投与に関して、調製物は、ＦＤＡの生物医薬品標準局によって必要とされる滅菌性、発熱性、および全身的安全性および純度標準を満たさなければならない。
【０１３４】
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含められる。以下の実施例に開示した技術は、本発明の実践において十分に機能するように本発明者らによって発見された技術を表し、このように、その実践のために好ましい様式を構成すると見なされうると、当業者によって認識されなければならない。しかし、当業者は、開示の特定の態様に多くの変更を行うことができ、それらも本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をなおも得ることができることを、本開示に照らして認識すべきである。
【０１３５】
実施例１． 骨髄ターゲティングペプチド
ターゲティングペプチドに関して特に関心対象となる臓器の非限定的な例は骨髄である。骨は、前立腺癌を有する患者の大多数において転移の好ましい部位である（Ｆｉｄｌｅｒ、１９９９）。この顕著な選択性は、癌の進行にとって必須である部位特異的相互作用の例として見なされている（Ｒａｋ、１９９５；Ｚｅｔｔｅｒ、１９９８）。臨床での関連性にもかかわらず、骨に広がった前立腺癌を制御する機構に関してはほとんどわかっていない。さらに、転移性前立腺癌の治療のために治療剤をターゲティングするための有効な戦略はなかった（Ｂｒｏｄｔら、１９９６）。
【０１３６】
体循環を通して骨髄に選択的に回帰することができるペプチドのサブセットは、骨転移形成の際に前立腺癌細胞の挙動を刺激する可能性がある。ファージディスプレイを用いることによってターゲティングされる血管マーカーも同様に、腫瘍細胞が転移するために利用される可能性がある。この考え方は既に、肺回帰ペプチドに関して当てはまることが証明されている。肺の血管に回帰するペプチドは、実験的転移を阻害する。これらの結果は、部位特異的転移の根本となっているのは、転移が選択的に起こる特定の組織の血管に回帰受容体が存在することであるという「改変された種子と土壌」モデルに適合する。そのような選択的血管マーカーを、転移カスケードの第一段階である接着の際に腫瘍細胞に曝露する。骨髄回帰ペプチドの単離は、転移プロセスの際に前立腺癌細胞回帰を媒介するそれらの血管マーカーを同定するために、および骨転移を阻止するために可能性がある治療的介入にとって、または骨に既に転移した癌を選択的に造影するおよび／または治療するために有用である。
【０１３７】
方法
マウスにおいて骨髄と結合するペプチドを単離するために、ファージライブラリのインビボスクリーニングを使用した。骨髄ターゲティングペプチドを、前立腺癌マウスモデルにおいて転移を阻害する能力に関して特徴決定した。骨髄結合ペプチドの受容体を同定するために、アフィニティクロマトグラフィ及び分子クローニングを使用した。ここに開示される組成物及び方法は、骨転移の予防及び治療に焦点を当てた、新たな抗前立腺癌治療戦略を開発するために有用であった。
【０１３８】
マウスにおける骨髄へと回帰するペプチドを単離するためのインビボスクリーニング
ファージライブラリを静脈注射した。後述の改良を施したＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ（１９８５）のプロトコルに従い、ライブラリを調製した。これらのライブラリに含まれるファージは、５残基〜１１残基の範囲の挿入物を表示していた。ガラスチューブ内の１ｍｌ ＤＭＥＭ−ＰＩへと移すことによりファージレスキューのため組織試料を処理し、グラインダーでホモジナイズした。骨髄は、ホモジナイゼーションを必要としないが、対照として使用された他の臓器は、効率的にホモジナイズされうる前に切り刻む必要があった。試料を、オートクレーブ処理された２ｍｌエッペンドルフチューブへと移した。組織を、１％ＢＳＡを含む氷冷ＤＭＥＭ−ＰＩで洗浄した。３回の洗浄後、ペレットを再懸濁させ、３７℃にした後、細胞を添加した。ファージ粒子を回収するため、洗浄された組織試料の、１．５ｍｌのコンピテントＫ９１−ｋａｎ細菌（１：１０希釈率でＯＤ６００ ０．２）との、室温における１時間のインキュベーションを使用した。
【０１３９】
複数のアリコートを、４０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ ｔｅｔ／ｋａｎプレート又はシャーレに播いた。播種は、広範囲の試料をカバーするいくつかの濃度、即ち、３ｍｌ、１ｍｌ、３００μｌ、１００μｌ、３０μｌで実施した。播種に使用されたビーズを、ビーズ表面に捕捉された可能性があるファージ感染細菌クローンを全て回収するため、２個の次の１０ｃｍ ＬＢ ｔｅｔ／ｋａｎプレートへと継代した。シャーレを３７℃で一晩インキュベートした。残りの２〜３ｍｌの感染培養物（ホモジナイズされた組織を含む）を、４０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１０ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ ｔｅｔ／ｋａｎ）へと移し、３７℃の振とう器内に２時間置いた。１２ｍｌの培養物を、１リットルのＬＢ ｔｅｔ／ｋａｎへと拡張し、３７℃の振とう器内で一晩増殖させた。１２時間〜１６時間後、標準的なプロトコルに従い、バルク増幅された細菌培養物からファージをレスキューし、２回目の選択のため取り分けた。インキュベーター内のプレート／シャーレから、骨髄由来の十分分離したコロニーを配列決定した。配列決定のため、１ウェル当たり２０μｌのＰＢＳを含む９６ウェルプレートへ、コロニーを移した。
【０１４０】
抗Ｍ１３抗体を用いた免疫組織化学的染色を、様々な組織におけるファージターゲティングを調査するために使用した（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ａｒａｐら、１９９８）。ファージをＩＶ注射し、５分間又は２４時間、循環させた。５分間の実験においては、循環系から未結合のファージを除去するため、ファージ注射の後、マウスにＤＭＥＭを灌流させた。２４時間後には、循環ファージはほとんど存在しなかった（Ａｒａｐら、１９９８ａ、１９９８ｂ）。動物を屠殺し、組織を収集し、ブワン（Ｂｏｕｉｎ）溶液で固定し、切片化し、ファージに対する抗体で染色した。
【０１４１】
結果
マウスにおけるインビボのマウス骨髄ターゲティング
ファージライブラリをマウスへと静脈注射し、骨髄よりファージを回収することにより、骨髄ターゲティング配列モチーフが同定された。ファージは、静脈注射され、骨髄より回収され、十分な濃縮が得られるまで反復的にインビトロで増幅され、再注射された。３回の選択の後、マウス骨髄へと回帰するファージ調製物が得られた。個々のファージは、静脈注射の後、プールされたファージと類似した臓器特異性を示した。いくつかのペプチドモチーフが同定され、特徴決定された。インビボで特異性を示す最も有望なモチーフを、表３に示す。
【０１４２】
【表３】インビボでマウス骨髄をターゲティングするファージ内の配列
Figure 2004508045
【０１４３】
当業者であれば、ここで同定された骨髄ターゲティングペプチド配列が、治療剤の標的化送達又は遺伝子治療、正常な又は罹患した臓器、組織、又は細胞型のインビボ画像化、臓器、組織、又は細胞型における受容体及び受容体リガンドの同定、並びに多数のヒト疾患、特に転移性前立腺癌の治療的処置を非限定的に含む、本発明の範囲内の多数の用途に有用であろうことを理解するであろう。
【０１４４】
実施例２． 前立腺及び前立腺癌に対するターゲティングペプチド
ターゲティングのための特に重要な非限定的なもう一つの臓器は、前立腺である。前立腺は、成体期の間中、増殖を継続するため、通常とは異なる臓器である。結果として、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）は、大部分の高齢の男性に、ある程度の影響を与えている。さらに重大なことに、前立腺は悪性腫瘍の好発部位である。１１人に１人の男性が、一生のうちに前立腺癌を発症するとされる。前立腺癌の血清マーカーが利用可能となったため、現在では、これらの悪性腫瘍の多くは、疾患の経過の初期に検出された。臨床的に進行するであろう者を予測するための信頼性の高い手段が存在しないため、多くは、失禁及び性交不能のような壊滅的な副作用を伴うことが多い、手術又は放射線療法により侵襲的に治療された（ＬａｎｅおよびＳｈａｈ、１９９９；Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋら、２０００）。ヒト前立腺癌の検出、診断、及び治療のための改良された方法が、明らかに必要とされている。
【０１４５】
前立腺の多くの関心対象の遺伝子が、前立腺血管系のような限定された（しかし、おそらくは高度に特異的又は到達可能な）細胞位置に発現する可能性がある。従って、微小解剖学的又は生理学的な環境に固有の分子の不均一性を考慮に入れないハイスループット配列決定法又は遺伝子アレイ法では、介入のための可能性のある標的が容易に見落とされる可能性がある。
【０１４６】
本発明の方法は、インビボで特異的な標的部位へと回帰するペプチドの同定を可能にする（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９６、１９９７、Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９）。ファージペプチドライブラリのインビボ選択は、循環系を介して標的組織の特異的受容体へと回帰することができるペプチドを与える。これらの研究は、様々な正常組織における驚くべき程の特殊化を明らかにした（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８、１９９９）。本発明は、前立腺癌ターゲティングペプチドの組成物及び使用法に関する。
【０１４７】
方法
前立腺のインビボファージターゲティング
ファージディスプレイライブラリを静脈注射した。試料は、常に、氷上に維持した。前立腺組織試料を、以下のようにして処理した。第一の試料は、バックアップとして−８０℃で保存した。第二の試料は、組織学／病理学、及びＨＥ又は抗Ｍ１３ファージ免疫染色のため処理した。第三の試料は、同じ重量の断片を３個得るため、清潔な条件下で分割した。
【０１４８】
第三の前立腺試料に由来する３通りの試料を、宿主細菌感染及びファージ回収のため処理した。前立腺試料をガラス組織グラインダー内の１ｍｌのＤＭＥＭプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）へと移し、ホモジナイズし、細胞懸濁物をオートクレーブ処理された２ｍｌエッペンドルフチューブへと移した。次に、前立腺組織試料を、１％ＢＳＡを含む氷冷ＤＭＥＭ−ＰＩで３回洗浄した。各洗浄後に、組織をＤＭＥＭ−ＰＩと混合し、３０秒間ボルテックス処理した。４，０００ｒｐｍで３分間スピンした後、上清を注意深く廃棄した（組織ペレットには触れないようにした）。次に、１．５ｍｌのＤＭＥＭ−ＰＩ／ＢＳＡを添加した。３回目の洗浄の後、ペレットを再懸濁させるため短時間ボルテックス処理し、溶解したペレットを、短時間３７℃に加温した後、宿主細菌を添加した。次いで、混合物を１．５ｍｌのコンピテントＫ９１−ｋａｎ細菌（ＯＤ６００＝２）と共に室温で１時間インキュベートした。
【０１４９】
混合物を、１０ｍｌのＬＢ培地＋０．２μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブへ、ＲＴで２０分間、移した。複数のアリコートを、４０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ ｔｅｔ／ｋａｎプレート又はシャーレに播いた。最後に、シャーレを３７℃でインキュベートし、一晩のインキュベーションの後、ファージ形質導入単位数を決定した。
【０１５０】
前立腺癌ターゲティング
腫瘍血管は、漏出性であることが知られている。マウス被験者のファージディスプレイライブラリへの比較的長期間の曝露は、ファージの遊走及び前立腺癌細胞マーカーとの結合をもたらしうる。癌細胞マーカーをターゲティングするため、マウスを、ファージライブラリと共に２４時間インキュベートした。
【０１５１】
雄ヌードマウス（４匹）に、１０６個のＤＵ−１４５細胞を含むＰＢＳを注射した。腫瘍増殖の後、マウスにいずれかのＣＸ１０Ｃファージディスプレイライブラリを注射した。ライブラリを２４時間循環させた後、マウスを屠殺し、組織試料を収集した。試料をダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーでホモジナイズし、ファージを回収するためＫ９１細菌を添加した。一連の希釈度で、細菌を３通り、ｋａｎ／ｔｅｔ ＬＢプレートに播いた。細菌を含む残りの腫瘍ホモジネートを、１０ｍｌのＬＢ／ｔｅｔ／ｋａｎと共にＲＴで１時間インキュベートした。大量のファージストックを得るため、さらに１０ｍｌのＬＫ／ｔｅｔ／ｋａｎを添加し、３７℃で振とう器内でインキュベートした。２回目のスクリーニングのための、混和されたストックを作成するため、２１６個のコロニーをプレートから選出した。クローンを増幅した後、それらをプールし、ファージをＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させた。１回目から回収されたプールされたファージを使用して、前立腺腫瘍を保持するヌードマウスを、前記と同様の２回目の選択に供した。３回目のスクリーニングを、前記と同様にして実施した。
【０１５２】
結果
正常マウス前立腺
上に開示された方法により得られたマウス前立腺ターゲティングペプチドモチーフを、表４に示す。
【０１５３】
【表４】インビボファージディスプレイにより得られたマウス前立腺ターゲティングペプチド
Figure 2004508045
【０１５４】
前立腺癌
３回目のインビボスクリーニングにより、対照正常腎組織と比較して高い腫瘍移行の選択性を示したファージが得られた（示していない）。ファージ挿入物を配列決定することにより同定された前立腺癌ターゲティング配列を、表５に挙げる。
【０１５５】
【表５】前立腺癌ターゲティングペプチド
Figure 2004508045
【０１５６】
当業者であれば、ここで同定された前立腺ターゲティングペプチド配列が、治療剤の標的化送達又は遺伝子治療、正常な又は罹患した臓器、組織、又は細胞型のインビボ画像化、臓器、組織、又は細胞型における受容体及び受容体リガンドの同定、並びに多数のヒト疾患、特に前立腺癌の治療的処置を非限定的に含む、本発明の範囲内の多数の用途に有用であろうことを理解するであろう。
【０１５７】
実施例３． マウスの胎盤、脂肪、卵巣、及び尿管に対するターゲティングペプチドの同定
胎盤回帰ペプチドの同定
マウス胎盤へと回帰するペプチドを、ファージディスプレイライブラリを使用したポストクリアリング（ｐｏｓｔ−ｃｌｅａｒｉｎｇ）プロトコルにより同定した。１回目のバイオパニングを、妊娠マウスにおいて実施した。胎盤の試料を摘出し、一つの修飾を含む前記の標準的なプロトコルに従いファージをレスキューした。典型的なバイオパニングプロトコルにおいては、単一の臓器、組織、又は細胞型から数千個のファージが回収されうる。典型的には、播種されたファージから２００個〜３００個の独立のコロニーを選択し、これらを増幅し、プールして、２回目又は３回目のバイオパニングのためのファージディスプレイライブラリを形成させた。本実施例においては、１回目のバイオパニングからレスキューされたファージ全てを固体培地上でバルク増幅し、次いで２回目のバイオパニングのためのファージディスプレイライブラリを形成させるため、プールした。即ち、１回目のバイオパニングからレスキューされたファージの制限が存在しなかった。この制限なしのインビボバイオパニングを３回（１回目〜３回目）実施し、次いでポストクリアリング法を使用した。
【０１５８】
ポストクリアリングプロトコル（４回目）においては、ファージを非妊娠マウスに投与した。胎盤以外の組織と結合したファージを、循環系から吸収した。残りのファージを非妊娠マウスの胎盤から回収した。このプロトコルは、胎盤と結合し、他のマウスの臓器、組織、又は細胞型とは結合しないファージを単離するために設計された。以下の胎盤ターゲティングペプチドが、それらの頻度と共に同定された。ＧｅｎＢａｎｋデータベースの検索は、以下に挙げた配列番号のうち、既知のペプチド配列と１００％相同なものは存在しないことを開示した。
Figure 2004508045
【０１５９】
示されている通り、ポストクリアリング法の使用は、胎盤ターゲティングペプチドを保持するファージの実質的な濃縮をもたらした。この手法は胎盤に関して使用されたが、当業者であれば、その臓器、組織、又は細胞型を欠いている被験者へとファージライブラリが投与されうる場合には、任意の臓器、組織、又は細胞型に関してポストクリアランスが実施されうることを理解するであろう。例えば、前立腺又は精巣に対するターゲティングペプチドのためのポストクリアリング法は、雌被験者において実施されうるし、卵巣、膣、又は子宮に関しては、雄被験者において実施されうる。
【０１６０】
相同性検索によって、ＴＣＲγ−１（ＴＰＫＴＳＶＴ、配列番号：３９）、テネイシン（ＲＭＤＧＰＶＲ、配列番号：４０及びＲＡＰＧＧＶＲ、配列番号：４１）、ＭＨＣクラスＩＩ（ＬＧＬＲＳＶＧ、配列番号：４４）、アンジオテンシンＩ（ＹＩＲＰＦＴＬ、配列番号：４３）、及びＭＨＣ Ｈ２−Ｄ−ｑ α鎖（ＶＧＬＨＡＲＡ、配列番号：４２）を含むいくつかの候補タンパク質が、胎盤ターゲティングペプチドの内因性類似体として、同定された。
【０１６１】
胎盤回帰ペプチドの確認及び妊娠の阻害
妊娠マウスへの注射及び胎盤からの回収により、胎盤回帰ペプチドの確認をインビボで行った。図１は、選択された胎盤回帰ファージに関する確認研究の結果を示している。ファージクローンは、ＰＡ− ＴＰＫＴＳＶＴ（配列番号：３９）、ＰＣ− ＲＡＰＧＧＶＲ（配列番号：４１）、ＰＥ− ＬＧＬＲＳＶＧ（配列番号：４４）、ＰＦ− ＹＩＲＰＦＴＬ（配列番号：４３）として同定される。ＰＡクローンが、対照ｆｄ−ｔｅｔファージで観察されたよりも１桁超大きい胎盤回帰を示したことが、示されている。ＰＣクローンも、有意に高い胎盤移行を示したが、ＰＥクローン及びＰＦクローンは、対照ファージと比較して、胎盤において実質的には濃縮されなかった。
【０１６２】
胎盤組織におけるＰＦクローンの明らかな濃縮の欠如にも関わらず、ＰＡペプチド及びＰＦペプチドは、いずれも、抗胎盤活性を示した。表６は、妊娠マウスへ注射された、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、又はファージに付着した胎盤ターゲティングペプチドＰＡ及びＰＦの効果を示している。比較的低い用量（計４５０μｇ）において、ＦＩＴＣと接合したＰＡ及びＰＦは、妊娠に対するわずかな効果を示した（表６）。比較的高い用量（８００μｇ〜１０００μｇタンパク質又は４．５×１０１０ファージ）においては、タンパク質と接合したペプチドＰＡ及びＰＦも、ファージと接合したペプチドＰＡ及びＰＦも、胎児発達を実質的に妨害し（表６）、大部分の場合に、明らかに胎児の死をもたらした。ＣＡＲＡＣペプチド（配列番号：４６）、脂肪ターゲティングペプチド（ＦＥ、ＴＲＥＶＨＲＳ、配列番号：４７）、又はｆｄ−ｔｅｔファージを、非胎盤ターゲティング対照として使用した。
【０１６３】
【表６】胎盤ターゲティングペプチドの胎児発達に対する効果
Figure 2004508045
【０１６４】
これらの結果により、上で同定された胎盤ターゲティングペプチド配列が確認される。さらに、ターゲティング配列を保持するファージの標的臓器への実質的な濃縮が欠如している場合（例えば、ペプチドＰＦ、図１）ですら、ターゲティングペプチドが、治療剤の標的臓器への標的化送達を提供しうることを証明している。この研究において、ＰＡペプチドが何倍も高レベルにファージを胎盤へと移行させたという観察にも関わらず、比較的低い用量では、ＰＦペプチドの方が、妊娠を妨害する効果がＰＡペプチドより高いようであった。
【０１６５】
当業者であれば、開示された方法及びペプチドが、胎盤を介した治療剤の胎児への標的化送達、及び妊娠を終結させるための新規手法に有用であり得ることを理解するであろう。
【０１６６】
脂肪ターゲティングペプチド
遺伝的に肥満のマウス（Ｚｈａｎｇら、１９９４；Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒら、１９９５）より、脂質ターゲティングペプチドを単離するため、正常マウスにおいて実施されたポストクリアリングを含む、類似のプロトコルを使用した。単離された脂質ターゲティングペプチドには、ＴＲＮＴＧＮＩ（配列番号：４８）、ＦＤＧＱＤＲＳ（配列番号：４９）、ＷＧＰＫＲＬ（配列番号：５０）、ＷＧＥＳＲＬ（配列番号：５１）、ＶＭＧＳＶＴＧ（配列番号：５２）、ＫＧＧＲＡＫＤ（配列番号：５３）、ＲＧＥＶＬＷＳ（配列番号：５４）、ＴＲＥＶＨＲＳ（配列番号：４７）、及びＨＧＱＧＶＲＰ（配列番号：５５）が含まれる。
【０１６７】
相同性検索によって、幹細胞増殖因子（ＳＣＧＦ）（ＫＧＧＲＡＫＤ、配列番号：５３）、アトラクチン（ａｔｔｒａｃｔｉｎ）（マホガニー（ｍａｈｏｇａｎｙ））（ＲＧＥＶＬＷＳ、配列番号：５４）、アンジオポエチン関連脂肪因子（ａｎｇｉｏｐｏｉｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｄｉｐｏｓｅ ｆａｃｔｏｒ）（ＦＩＡＦ）（ＴＲＥＶＨＲＳ、配列番号：４７）、アジポフィリン（ａｄｉｐｏｐｈｉｌｉｎ）（ＡＤＲＰ） （ＶＭＧＳＶＴＧ、配列番号：５２）、Ｆｌｔ−１又はプロコラーゲンＸＶＩＩ型（ＴＲＮＴＧＮＩ、配列番号：４８）、及びフィブリリン２もしくはトランスフェリン様タンパク質ｐ９７ （ＨＧＱＧＶＲＰ、配列番号：５５）を含むいくつかの候補タンパク質が、脂質ターゲティングペプチドの内因性類似体として同定された。
【０１６８】
脂肪ターゲティングペプチドの確認
図２に示されるように、脂質回帰ペプチドの確認を、インビボ回帰により行った。選択された脂質回帰クローンは、ＦＡ−ＫＧＧＲＡＫＤ（配列番号：５３）、ＦＣ− ＲＧＥＶＬＷＳ（配列番号：５４）、ＦＥ−ＴＲＥＶＨＲＳ（配列番号：４７）、及びＦＸ−ＶＭＧＳＶＴＧ（配列番号：５２）であった。図２に示されるように、これらのクローンは、全て、脂肪組織への回帰の上昇を示し、クローンＦＸは、対照ｆｄ−ｔｅｔファージよりも数桁高い脂肪移行を示した。クローンＦＸは、他の選択された脂質回帰クローンよりも実質的に高い移行を示した。しかしながら、上に開示された胎盤回帰ペプチドからの類推により、当業者であれば、比較的低レベルの脂肪組織移行を示す脂質回帰クローンであっても、治療剤の標的化送達に有用であり得ることを理解するであろう。
【０１６９】
当業者であれば、脂肪組織内の血管新生性血管系に選択的なターゲティングペプチドが、体重減少、又は体重増加の予防に有用であろうことを理解するであろう。抗血管新生性又は毒性の部分を脂肪ターゲティングペプチドに付着させることにより、新たな脂質組織へ栄養を供給する血管を選択的に阻害し、新たな脂質沈着物の成長を予防することが可能であり、既存の脂質沈着物を消滅させることも可能であるかもしれない。
【０１７０】
卵巣及び腹水に対するターゲティングペプチド
さらに、以下に挙げられる、マウスの卵巣及び腹水に対するターゲティングペプチド配列が同定された。
【０１７１】
マウス卵巣ターゲティングペプチドには、ＧＬＡＫＬＩＰ（配列番号：５６）、ＨＬＩＳＤＭＳ（配列番号：５７）、ＬＱＨＷＬＬＳ（配列番号：５８）、ＡＬＶＬＱＧ（配列番号：５９）、ＴＧＶＡＬＱＳ （配列番号：６０）、ＹＶＱＳＲＥＧ（配列番号：６１）、ＰＬＦＷＰＹＳ（配列番号：６２）、ＤＧＳＧ（配列番号：６３）、ＥＧＳＧ（配列番号：６４）、ＳＳＰＲＰＧＶ（配列番号：６５）、ＤＧＹＰＡＩＡ（配列番号：６６）、ＧＨＡＩＥ（配列番号：６７）、及びＩＷＳＴＳＥＲ（配列番号：６８）が含まれる。
【０１７２】
マウス腹水に対するターゲティングペプチドには、ＹＲＬＲＧ（配列番号：６９）、ＹＲＡＲＧ（配列番号：７０）、ＳＱＰＬＧ（配列番号：７１）、ＳＱＰＷＧ（配列番号：７２）、ＱＲＬＶＴＰ（配列番号：７３）、ＱＶＬＶＴＰ（配列番号：７４）、ＱＲＬＶＨＰ（配列番号：７５）、ＱＶＬＶＨＰ（配列番号：７６）、ＩＴＲＷＲＹＬ（配列番号：７７）、ＳＬＧＧＭＳＧ（配列番号：７８）、ＳＱＬＡＡＧ（配列番号：７９）、ＳＬＬＡＡＧ（配列番号：８０）、ＳＱＬＶＡＧ（配列番号：８１）、ＳＬＬＡＡＧ（配列番号：８２）、ＧＬＰＳＧＬＬ（配列番号：８３）、ＨＧＧＳＡＮＰ（配列番号：８４）、ＳＬＥＡＦＦＬ（配列番号：８５）、ＣＶＰＥＬＧＨＥＣ（配列番号：８６）、ＣＥＬＧＦＥＬＧＣ（配列番号：８７）、及びＣＦＦＬＲＤＷＦＣ（配列番号：８８）が含まれる。
【０１７３】
子宮ターゲティングペプチド
表７に開示される、Ｃ５７Ｂ１マウスにおける尿道ターゲティングペプチドを同定するため、類似のプロトコルを使用した。
【０１７４】
【表７】尿道ターゲティングペプチド
Figure 2004508045
【０１７５】
実施例４：ＢＲＡＳＩＬによるα脾臓抗体ライブラリのインビボスクリーニング
脾臓に対するターゲティングペプチドは、従来同定されていない。網膜内皮系の一部として、非特異的なファージの脾臓への移行の高いバックグラウンドのため、脾臓組織に対するバイオパニングは複雑である。ＢＲＡＳＩＬ法によるバイオパニングにおいて観察される減少したバックグラウンドは、脾臓のような組織に対するターゲティングペプチドの同定にとって有利である。
【０１７６】
本実施例は、ＢＲＡＳＩＬ法の例示的な態様を証明する。標識臓器（マウス脾臓）に対して得られた免疫グロブリンに基づくファージライブラリを開発し、次いでインビボバイオパニングに供した。免疫グロブリンライブラリを構築するため、マウス脾臓をニワトリに注射した。追加接種の後、ニワトリ脾臓を収集し、免疫グロブリン可変ドメイン配列を、ニワトリ脾臓ｍＲＮＡのＰＣＲ（商標）増幅により得た。増幅された免疫グロブリン可変配列を、ファージディスプレイライブラリへと挿入し（α−ライブラリ）、次いで、それをマウス脾臓に対するインビボバイオパニングに使用した。従って、インビボでマウス脾臓へと移行したファージから得られた脾臓ターゲティングペプチドは、マウス脾臓抗原に応答してニワトリにおいて産生された抗体断片に由来していた。本実施例の成功は、さらに、ＢＲＡＳＩＬ法の広範な利用可能性を示す。当業者であれば、本発明がここに開示された態様に限定されないこと、及びＢＲＡＳＩＬ方法論の多くのさらなる開発が本発明の範囲内に含まれることを理解するであろう。
【０１７７】
材料及び方法
ライブラリ構築
白色レグホン（ｗｈｉｔｅ ｌｅｇｈｏｒｎ）ニワトリを、還流（１０ｍｌ ＭＥＭ）されたＢａｌｂ／ｃマウスに由来する脾臓ホモジネート（注射１回当たり約１５０ｍｇ）で免疫した。初回免疫後４週目及び８週目に、脾臓ホモジネートの追加接種をニワトリに与えた。ＦＡＣＳ分析によるマウス脾臓に対する免疫応答は、ニワトリ免疫血清が、マウス細胞系（ＴＲＡＭＰ−Ｃ１）に対する抗体を含むことを示した。初回免疫後１２週目に、ニワトリを屠殺し、その脾臓をＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｃｉｎｃｉｎａｔｔｉ、ＯＨ）へと摘出した。
【０１７８】
ＴＲＩ試薬の製造業者のプロトコルを使用して、ニワトリ脾臓から全ＲＮＡを調製した。オリゴ（ｄＴ）プライマー及びスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。ニワトリ脾臓免疫グロブリン可変領域をコードするｃＤＮＡを、標準的な技術に従い、ＣＨｙｂＶＨプライマー及びＣｈｙｂＩｇＢプライマー（Ｖｈｅａｖｙ）、又はＣＳＣＶＫプライマー及びＣＨＨｙｂＬ−Ｂプライマー（Ｖκ）により増幅した。軽鎖の可変領域及び定常領域は、ＣＳＣ−Ｆプライマー及びｌｅａｄ−Ｂプライマー、並びにＶκ鋳型及びＣκ鋳型を使用して、共にＰＣＲ（商標）増幅した。重鎖の可変領域及び定常領域は、ｄｐ−ｓｅｑプライマー及びｌｅａｄ−Ｆプライマー、並びにＶｈｅａｖｙ鋳型及びＣｈｅａｖｙ鋳型を使用して、共にＰＣＲ（商標）増幅した。重鎖断片及び軽鎖断片は、ＣＳＣ−Ｆプライマー及びｄｐ−Ｅｘプライマーを用いて、共にＰＣＲ（商標）増幅した。ＰＣＲプライマーは、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー講座マニュアル「コンビナトリアル抗体ライブラリのファージディスプレイ（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」（Ｂａｒｂａｓら、２０００）（この内容は、参照として本明細書に組み込まれる）に挙げられているプライマー配列を使用して、ジェノシス（Ｇｅｎｏｓｙｓ）又はゲンベース（ＧｅｎＢａｓｅ）より購入した。
【０１７９】
ＳｆｉＩで消化した後、ファージライブラリへの挿入のため、増幅産物をＳｆｉＩ消化ｐＣｏｍｂ３ｘと連結させた。連結したｐＣｏｍｂ３−１２３プラスミドをＥＲ２５３７大腸菌へとエレクトロポレーションし、その後のＶＣＭ１３（ヘルパーファージ）感染によりファージ産生を開始させた。得られたライブラリサイズは、約５×１０６ｃｆｕであった。
【０１８０】
ＢＲＡＳＩＬを使用したα脾臓ライブラリのインビボスクリーニング
ニワトリα脾臓ライブラリを使用して、マウスにおける４回のインビボスクリーニングを実施した。約０．８〜２．０×１０１０ＴＵをＢａｌｂ／ｃマウスに注射した。ライブラリを５分間循環させた。屠殺後、マウス脾臓を回収し、７０μｍ細胞濾過ナイロンメッシュへと脾臓を通すことにより、単一細胞懸濁液を調製した。ＢＲＡＳＩＬ技術を使用して、単一細胞懸濁液を油（９：１ジブチルフタレート：シクロヘキサン）で遠心分離し、対数増殖期のＥＲ２５３７大腸菌２００μｌにペレットを感染させた。マウス脾臓から回収された増幅されたファージを、次回のスクリーニングに使用した。ＢＲＡＳＩＬの前に得られた脾臓片を使用した従来のバイオパニング法と比較して、脾臓及び脳へと回帰するファージの数に、スクリーニング中、明らかな濃縮は見られなかった。
【０１８１】
ニワトリＦａｂ挿入物の４回目のスクリーニングからのマウス脾臓に移行したファージを、ＰＣＲ（商標）増幅し、ＰＣＲ産物をＢｓｔＩで消化した。分析された９０個のクローンのうちの半分が、類似の制限パターンを与えた。そのうち、２０個のクローンを配列決定したところ、同一の制限パターンを有するものはわずか２個であった。抗体に基づくファージクローンのうちの４個（２番、６番、１０番、及び１２番）を、結合アッセイ及び移行アッセイを使用したさらなる分析に供した。
【０１８２】
ＢＲＡＳＩＬを使用したインビトロでのクローンの試験
単一細胞懸濁液を、２個のマウス脾臓より調製した。懸濁液を５個のチューブに分割し、３×１０９ＴＵのＦａｂクローン＃２、＃６、＃１０、＃１２、及び２×１０９ＴＵのｔｅｔファージと共に、氷上でインキュベートした。マウス脾細胞と結合したファージをＢＲＡＳＩＬにより回収した。２００μｌの対数増殖期ＥＲ２５３７大腸菌にペレットを感染させ、ファージ結合の評価のため、段階希釈物をＬＢ／カルベニシリンプレート及びＬＢ／テトラサイクリンプレートに播いた。ｆｄ−ｔｅｔを、全てのファージ回帰実験を規準化するための内部標準として使用した。
【０１８３】
ＢＲＡＳＩＬによるインビボでのクローンの試験
Ｆａｂクローン＃２、＃６、＃１０、＃１２のファージ（３×１０９）、及び２×１０９ＴＵのｔｅｔファージを、Ｂａｌｂ／ｃマウスの尾静脈に注射し、５分間循環させた。脾臓を回収し、全脾臓から単一細胞懸濁液を氷上で調製した。細胞結合ファージをＢＲＡＳＩＬにより回収した。２００μｌの対数増殖期ＥＲ２５３７大腸菌にペレットを感染させ、ファージ回収の評価のため、段階希釈物をＬＢ／カルベニシリンプレート及びＬＢ／テトラサイクリンプレートに播いた。
【０１８４】
ＢＲＡＳＩＬによるインビボでのクローン＃１０の試験（対照ファージＮＰＣ−３ＴＴと比較）
Ｆａｂクローン＃１０及びＮＰＣ−３ＴＴ（対照Ｆａｂファージ）のファージ（３×１０９ＴＵ）、並びに１×１０９ＴＵのＦｄ−ｔｅｔファージをマウス（ＮＰＣ−３ＴＴについて２匹、クローン＃１０について２匹）に注射し、５分間循環させた。脾臓を回収し、単一細胞懸濁液を氷上で調製した。細胞結合ファージをＢＲＡＳＩＬにより回収した。２００μｌの対数増殖期ＥＲ２５３７大腸菌にペレットを感染させ、段階希釈物をＬＢ／カルベニシリンプレート及びＬＢ／テトラサイクリンプレートに播いた。ＮＰＣ−３ＴＴファージは、ヒト抗破傷風毒素Ｆａｂ断片を表示しているファージである。
【０１８５】
脾臓へのＦａｂクローン＃１０の回帰（骨髄と比較）
Ｆａｂクローン＃１０及びＮＰＣ−３ｔｔ対照のファージ（３×１０９ＴＵ）、並びに１×１０９ＴＵのＦｄ−ｔｅｔ対照ファージをマウス（ＮＰＣ−３ＴＴについて２匹、クローン＃１０について２匹）に注射し、５分間循環させた。脾臓を回収し、単一細胞懸濁液を氷上で調製した。臓器特異的回帰の対照として、同じマウスから骨髄（両大腿骨）を回収した。細胞結合ファージをＢＲＡＳＩＬにより回収した。
【０１８６】
Ｆａｂ断片の作製
ニワトリＦａｂ挿入物を含むプラスミドｐＣｏｍｂ３を、ＥＲ２５３７大腸菌へとエレクトロポレーションした。段階希釈物をＬＢ／カルベニシリンプレートに播き、３７℃で一晩インキュベートした。Ｆａｂ産生培養物（１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むスーパーブロス（ｓｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ）中）を、単一の播種されたコロニーから開始させた。１ｍＭ ＩＰＴＧにより、３０℃で７時間、Ｆａｂ産生を誘導した。細菌上清、周辺質画分ＳＮ１及びＳＮ２、並びに細菌溶解物の中のＦａｂ濃度のＥＬＩＳＡによる決定の後、アフィニティ精製により、周辺質画分ＳＮ２からＦａｂ断片を精製した。標準的なプロトコル（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８）を使用して、α−Ｆａｂ−プロテインＧカラムに、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）をカップリングさせた（２ｍｇ／ｍｌ）。
【０１８７】
Ｆａｂ断片を精製するため、以下の方法を使用した。２時間（スーパーループ（ｓｕｐｅｒｌｏｏｐ）を用いて、５０ｍｌ未満の容量を使用する場合）又は一晩（蠕動ポンプを使用して、５０ｍｌ超の容量を用いる場合）かけて、ＳＮ２画分を１ｍｌのＨｉＴｒａｐ−プロテインＧ−α−Ｆａｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にロードした。カラムを１０〜２０ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。Ｆａｂ断片を１０ｍｌの２０ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌを用いて溶出させ、１ｍｌ画分を収集した。画分を、溶出直後に１Ｍトリスで中和した。タンパク質濃度は、Ａ２８０により定量した。
【０１８８】
血管内染色
回収されたＦａｂ断片のインビボ分布を決定するため、５０〜６０μｇのＦａｂ断片（Ｆａｂ＃１０、ＮＰＣ３−ｔｔ、又はＲ＃１６）をＢａｌｂ／ｃマウスの尾静脈に注射し、８分間循環させた。５０μｇのトマト（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）レクチン−ＦＩＴＣをマウスに注射し、２分間のレクチン循環の後、２５〜３０ｍｌの４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳの灌流によりマウス組織を固定した。組織を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで、１時間、後固定した。固定された組織を、溶液を少なくとも２回変えながら、４℃で一晩、３０％ショ糖／ＰＢＳ中でインキュベートした。組織を凍結培地で包埋し、ドライアイス上で凍結させた。
【０１８９】
固定された組織切片を、以下のようにしてＦａｂに関して染色した。凍結組織切片（５５μｍ）をミクロトーム上で切り分け、ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳ／０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／５％ヤギ血清で、室温で１時間、薄片をブロッキングした。切片を、１：４００のＣｙ３と接合したα−ヒト抗Ｆａｂ抗体と共に、室温で一晩、インキュベートした。接合した切片を、ＰＢＳ／０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で６回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。固定後、切片をＰＢＳで２回洗浄し、蒸留水で２回洗浄し、次いでベクターシールド（ＶｅｃｔｏｒＳｈｉｅｌｄ）を用いてスライドガラス上に設置した。
【０１９０】
結果
ニワトリＦａｂ断片を発現するファージクローンのマウス脾細胞へのインビトロ移行を、ＢＲＡＳＩＬにより調査した。図３に示されるように、ＢＲＡＳＩＬにより単離されたＦａｂファージクローンは、挿入物を含まないＦｄ−ｔｅｔ対照ファージと比較して、ディファレンシャルなマウス脾細胞との結合を示した。クローン＃６は、Ｆａｂ断片を含むが、マウス脾臓から単離されたのではない対照ファージＮＰＣ−３ＴＴと類似した、最も低い程度のディファレンシャル結合を示した。クローン＃２、＃１０、及び＃１２は、全て、Ｆｄ−ｔｅｔ対照と比較して、マウス脾細胞との選択的な結合を示し、クローン＃２及び＃１０については少なくとも２倍増加した結合が観察された。クローン挿入物について決定されたアミノ酸配列は、以下の通りである：
Figure 2004508045
【０１９１】
ＮＰＣ−３ＴＴと比較されたＦａｂクローンについてのインビトロファージ結合の直接比較を行った。図４に示されるように、クローン＃２及び＃１０は、最高レベルのマウス脾細胞との結合をインビトロで示した。クローン＃６及び＃１２は、ファージＮＰＣ−３ＴＴの結合よりも極わずかに高いレベルのマウス脾臓との結合を示した。
【０１９２】
ニワトリＦａｂファージクローンの優先的な結合を、ＢＲＡＳＩＬを使用したインビボ研究により確認した。図５に示されるように、マウス脾臓への選択的移行は、インビボでははるかに劇的であり、Ｆａｂクローン＃２、＃６、及び＃１０は、Ｆｄ−ｔｅｔファージと比較して、何倍にも増加した脾臓との結合を示した。対照的に、Ｆａｂクローン＃１２は、Ｆｄ−ｔｅｔファージと比較して有意に上昇したマウス脾臓との結合を示さなかった。これらの結果は、脾臓ターゲティングファージを用いて得られたインビトロの結果が、インビボで確認されることを示している。
【０１９３】
Ｆａｂクローン＃１０を、インビボのマウス脾臓への移行によるさらなる特徴決定のため、選択した。図６に示されている結果は、Ｆａｂクローン＃１０が、Ｆｄ−ｔｅｔと比較して３〜１０倍の脾臓における濃縮を示したことを確認している。Ｆａｂ対照ファージＮＰＣ−３ＴＴは、挿入物を含まないＦｄ−ｔｅｔファージと比較して選択的な脾臓移行を示さなかったため、この効果は、一般的なＦａｂ結合によるものではなかった。
【０１９４】
図７において証明されるように、Ｆａｂクローン＃１０の結合は臓器特異的であった。Ｆａｂクローン＃１０及びＮＰＣ−３ＴＴ対照に由来するファージを、同一の注射されたマウスの脾臓及び骨髄から回収した。図７より、Ｆａｂクローン＃１０は、脾臓への選択的移行を示すが、骨髄組織への選択的移行は示さなかったことが明らかである。対照ファージは、骨髄（図７）又は脾臓（示していない）への選択的移行を示さなかった。
【０１９５】
これらの結果は、Ｆａｂクローン＃１０が、インビトロにおいてもインビボにおいても結合に関してマウス脾臓組織を選択的にターゲティングすることを示している。これらの結果は、インビボファージ分布に関する血管染色によりさらに確認された。この研究に使用された対照ファージは、クローンＮＰＣ−３ＴＴ（Ｆａｂ断片）及びクローンＲ＃１６（血管新生性網膜スクリーニングより単離）であった。
【０１９６】
蛍光染色により、Ｆａｂクローン＃１０は、インビボでマウス脾臓組織と結合することが観察された（示していない）。対照ファージＮＰＣ−３ＴＴ及びＲ＃１６は、同一条件下で脾臓組織を染色しなかった。クローン＃１０及びＮＰＣ−３ＴＴのファージは、おそらくは糸球体濾過のため、注射された動物の腎臓を強く染色することが観察された（示していない）。その他の対照臓器（肺、脳、肝臓、心臓、及び骨格筋）は、クローン＃１０による染色を示さなかった（示していない）。
【０１９７】
これらの結果は、脾臓ターゲティングファージペプチドが、ＢＲＡＳＩＬ法により同定されうることを証明している。さらに、出発ファージライブラリを得るための、標的の臓器、組織、又は細胞型に対する抗体断片を使用したファージディスプレイ技術の実施可能性を示している。高い非特異的バックグラウンドのために、標準的なファージディスプレイプロトコルを使用したバイオパニングが適用できなかった組織である脾臓に対するターゲティングペプチドを得ることが可能であったことは、ＢＲＡＳＩＬ法の利点を示している。
【０１９８】
実施例５：血管新生性網膜におけるα−カポジ肉腫ライブラリのインビボスクリーニング
血管新生性網膜系は、血管新生性腫瘍組織のモデルとして開発された。新生マウスにおける低酸素は、網膜における血管新生応答を引き起こす。血管新生性網膜組織受容体は、ファージディスプレイ結合に関して血管新生性腫瘍組織との類似性を示す。
【０１９９】
材料及び方法
血管新生性モデル系
１週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、５日間、７５％酸素雰囲気に曝露し、次いでさらに５日間、大気中で維持した。６μｍ横断切片において網膜から硝子体領域へと伸長した新血管の核を計数することにより、増殖性新生血管応答を定量した。このモデルを、マウスへ静脈注射されたファージディスプレイライブラリの、新たに形成された血管新生性血管への結合を評価するために使用した。血管新生のピークは、生後１７〜２１日目に観察された。
【０２００】
ファージディスプレイ
脾臓に関して既に開示したのと同じ方法を使用して、ウサギへと免疫されたカポジ肉腫腫瘍組織に対するＦａｂファージライブラリ（α−ＫＳ）を作製した。血管新生性網膜モデル系において、α−ＫＳ ライブラリを使用して、３回のインビボスクリーニングを実施した。生後１８〜２０日目に低酸素により誘導された網膜血管新生を有する２匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、約３〜１０×１０１０ＴＵのα−ＫＳファージを注射した。ライブラリを５分間、循環させた。眼を摘出し、網膜を眼の残部から分離した。２枚のスライドガラスの間で破砕することにより、網膜から単一細胞懸濁液を調製した。単一細胞懸濁液を、前記のようなＢＲＡＳＩＬにより処理し、２００μｌの対数増殖期ＥＲ２５３７大腸菌にペレットを感染させた。一晩増幅したファージを網膜組織から回収し、次回のスクリーニングに使用した。各選択後の回収は、３４００〜５０００ＴＵであった。
【０２０１】
３回の選択後、９０個の選択されたクローンを、ＨＵＶＥＣ細胞との結合能に関して試験した。マイクロタイターウェルに、ＨＵＶＥＣを含む完全培地をコーティングした。細胞を固定し、ファージ感染細胞のＩＰＴＧ誘導培養物からの上清と共に一晩インキュベートした。α−Ｆａｂ ＥＬＩＳＡにより、Ｆａｂ産生を検出した。ＦａｂのＨＵＶＥＣとの結合は、α−Ｆａｂ−ＡＦＯＳ ＥＬＩＳＡにより検出した。
【０２０２】
図８は、α−ＫＳファージライブラリを使用したＦａｂクローンのＨＵＶＥＣとの結合の結果を示している。クローン＃１６は、インビトロでＨＵＶＥＣとよく結合するようであった。
【０２０３】
これらの結果は、ファージディスプレイライブラリの作製のため、Ｆａｂ抗体断片を使用することの可能性を確認している。そのようなライブラリは、従来のバイオパニング法において使用されてきたランダム配列ファージディスプレイライブラリと比較して、宿主動物を免疫するために使用された特定の臓器、組織、又は細胞型に対してターゲティングされるペプチド配列に富んでいるはずである。結果は、ターゲティングペプチド配列を同定するためのＢＲＡＳＩＬ法の利用可能性も確認している。
【０２０４】
実施例６． 受容体／リガンド対の同定：インテグリン受容体に対するターゲティングペプチド
本発明のいくつかの態様は、様々な用途のための受容体／リガンド対の同定に関する。臓器、組織、又は細胞型に選択的なターゲティングペプチドは、通常は標的内の血管の内腔側表面上に位置している（前記定義のような）受容体と結合する。いくつかの態様において、ターゲティングペプチドは、直接的又は間接的に、そのような受容体を同定又は特徴決定するために使用されうる。遺伝子治療ベクター、その他の治療剤、又はインビボ画像化用の造影剤の送達のための標的としての使用に加え、そのような天然に存在する受容体は、受容体自体に対する新たな治療剤の開発、受容体に対するワクチンの開発、及び様々な疾患状態の基礎となっている分子機構の理解のための可能性のある標的として有用である。当然、ターゲティングペプチド自体は、受容体に対する新たな治療剤のための基礎として有益であり得る。
【０２０５】
ターゲティングペプチドは、ターゲティングされた受容体と結合する内因性リガンドのミメオトープ（ｍｉｍｅｏｔｏｐｅｓ）として作用する場合が多い。他の態様において、開示された方法を使用して、内因性リガンドが同定され、特徴決定されうる。そのようなリガンドも、新たな治療剤の開発等のための標的として潜在的に有用である。
【０２０６】
本実施例は、受容体（この場合にはインテグリン受容体）／リガンド対の同定に関する一つの態様を例示する。インテグリンに対するターゲティングペプチドの用途の例には、細胞の増殖及び走化性の制御、アポトーシス促進、並びに抗血管新生が非限定的に含まれる。この態様においては、固体基質に付着した精製されたインテグリンを、インテグリンに対するターゲティングペプチドを同定するため、ファージディスプレイライブラリをスクリーニングするために使用した。
【０２０７】
背景
インテグリンの機能は、多様な生物学的系においてサイトカイン及びその他の可溶性因子により制御されている。最も一般的には、そのような因子の曝露は、受容体の活性化状態の変化（即ち、特定のリガンドに対する親和性の増加もしくは減少、及び／又は原形質膜内での受容体クラスター形成）をもたらすコンフォメーションの改変へと至る。インテグリン依存性接着の変化は、最終的には、様々な複雑なシグナル伝達経路を活性化する。分子レベルにおいては、誘導された細胞骨格タンパク質のインテグリン細胞質ドメインとの共局在が、シグナル伝達を調節する。
【０２０８】
細胞質ドメインは、インテグリン機能の重要な制御因子である（Ｈｙｎｅｓ、１９９２；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６の総説）。個々のαサブユニット及びβサブユニットの細胞質ドメインは、異なる種間で高度に保存されている（Ｈｅｍｌｅｒら、１９９４）。様々なβサブユニットの細胞質ドメインは、類似の一次構造を共有しているが、いくつかの機能的特徴に関しては異なっている。キメラインテグリンを用いた実験によって、β鎖の細胞質ドメインが、受容体の分布及び限局性付着（ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）部位への動員の制御を担っていることが示されている（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＨｅｍｌｅｒ、１９９４）。従って、いくつかの細胞質ドメインは、インテグリンによって媒介される細胞へのシグナル伝達（外から内へのシグナル伝達）、及びインテグリン−リガンド結合活性の活性化（内から外へのシグナル伝達）にとって重要である（Ｈｅｍｌｅｒら、１９９４）。
【０２０９】
インテグリンαｖβ３及びαｖβ５は、正常血管系には発現しておらず、血管新生性血管系に選択的に発現する（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４ａ、１９９４ｂ；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９７；Ａｒａｐら、１９９８）。さらに、αｖインテグリンアンタゴニストは、新生血管の成長を阻止することが示されている（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４ａ、１９９４ｂ、１９９５；Ｈａｍｍｅｓら、１９９６）。これらの実験において、内皮細胞のアポトーシスが、血管新生の阻害のための機構として同定された（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４ａ、１９９４ｂ、１９９５）。ｂＦＧＦにより開始する血管新生は、抗αｖβ３阻止抗体によって阻害され、ＶＥＧＦにより媒介される血管新生は、αｖβ５に対する阻止抗体によって防止されうる。インテグリンαｖβ３及びαｖβ５は、異なる型の眼新生血管疾患において優先的に表示されることが報告されている（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら、１９９５、１９９６）。従って、別個のサイトカインにより誘導される血管新生へと至る経路は、特異的なαｖインテグリンに依存していると考えられる。
【０２１０】
インテグリンαｖβ３及びαｖβ５は、いずれも、ビトロネクチンと結合するが、おそらくは、異なるリガンド結合後事象を媒介する。例えば、外因性可溶性因子の非存在下では、インテグリンαｖβ５は、細胞の接着、拡散、遊走、及び血管新生を促進することができない。他方、αｖβ３インテグリンは、サイトカインによる付加的な刺激なしに、そのような事象を誘導することができる（Ｋｌｅｍｋｅら、１９９４；Ｌｅｗｉｓら、１９９６；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら、１９９５）。
【０２１１】
サイトカインによるαｖβ５機能の制御に関する分子的基礎を研究するために設計された実験によって、固定化されたビトロネクチンとの結合時、不活化されたαｖβ５は、アクチン、α−アクチニン、テーリン、テンシン（ｔｅｎｓｉｎ）、ｐ１３０ｃａｓ、及びビンキュリンと会合して検出されることはほとんどないことが示されている。対照的に、αｖβ３は、そのような分子の局所的な蓄積を誘導する。プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化により、αｖβ５は、αｖβ３と類似の挙動を示すようになるが、テーリンを動員することはできない（Ｌｅｗｉｓら、１９９６）。さらに、ＰＫＣの阻害剤であるカルホスチン（ｃａｌｐｈｏｓｔｉｎ）Ｃは、αｖβ５により媒介される血管新生を阻止するが、αｖβ３により媒介されるものは阻止しないようである（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら、１９９５）。これらの観察は、ＰＫＣ活性化が、おそらく、β５細胞質ドメインのコンフォメーション又はリン酸化状態に影響を与えることを示唆している。細胞質タンパク質においても、類似の変化が起こりうる（ＫｏｌａｎｕｓおよびＳｅｅｄ、１９９７）。サイトカインによるαｖβ５インテグリンの制御は、リガンド結合は不変であるが、リガンド結合後の事象が異なる点で、通常とは異なる（Ｌｅｗｉｓら、１９９６）。従って、αｖβ３又はαｖβ５により媒介される細胞事象は、明らかに、異なる機構によって調節されている（ＦｉｌａｒｄｏおよびＣｈｅｒｅｓｈ、１９９４ｂ）。
【０２１２】
αｖインテグリン会合分子の検索は、技術的な問題によって妨げられてきた。第一に、含まれている物理的会合が、細胞が完全でない場合にはもはや起こらない多量体リガンドの集合に頼っている可能性が高い。第二に、それらのインテグリンとの会合は、通常、低親和性である。最後に、会合タンパク質のコンフォメーション及びリン酸化状態の変化が、これらの一時的に調整される相互作用の複雑度をさらに増大させている可能性がある。これらの問題のため、インテグリン細胞質ドメインと結合するタンパク質は、限定された数しか同定されていない。パキシリン（ｐａｘｉｌｌｉｎ）及びＩＣＡＰ−１のようなこれらのタンパク質は、主に、β１鎖と会合する（ＳｈａｔｔｉｌおよびＧｉｎｓｂｅｒｇ、１９９７）。サイトヘシン（ｃｙｔｏｈｅｓｉｎ）−１及びフィラミンは、β２の細胞質ドメインと会合する。
【０２１３】
いくつかの他のタンパク質（テーリン、フィラミン、α−アクチニン、限局性付着キナーゼ、セリン／トレオニンキナーゼＩＬＫ、及びスケルミン（ｓｋｅｌｅｍｉｎ））は、βインテグリン細胞質ドメイン全般と相互作用することが報告されている。テーリン、α−アクチニン、及び限局性付着キナーゼは、β１細胞質ドメイン内の推定結合部位を欠失させた後には、もはやβ１インテグリンと共局在しない。類似の手法により、他の細胞骨格関連タンパク質及びシグナル伝達分子が、インテグリンと共局在することが示されている。
【０２１４】
インテグリンは、増殖因子シグナル伝達に関与している分子と会合する。αｖβ３と会合して見出されうる１９０ｋＤａタンパク質及びＩＲＳ−１（ＶｕｏｒｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９４）に加え、αｖβ３インテグリンと、インスリン及びＰＤＧＦのシグナル伝達経路に関連している分子との会合の分析は、インスリン受容体及びＰＤＧＦβ受容体の両方がαｖβ３と共免疫沈降することを明らかにした。インテグリンと会合した受容体分子は、そのような分子の高度にリン酸化され高度に活性化された亜画分を表している。これらの結果は、インテグリンにより媒介される細胞接着が、増殖因子に対する細胞応答と同調しているという見解を強化するため、重要である。インテグリン依存性シグナル伝達過程は、増殖シグナルと協同している（ＦｒｉｓｃｈおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９７；ＣｌａｒｋおよびＢｒｕｇｇｅ、１９９５；ＬｏｎｇｈｕｒｓｔおよびＪｅｎｎｉｎｇｓ、１９９８）。
【０２１５】
タンパク質リン酸化は、インテグリン刺激に対する応答において検出される最初期事象の一つである。チロシンキナーゼ阻害剤が、限局性付着の形成を抑制することができることから、インテグリン受容体と連結されているシグナル伝達経路におけるチロシンリン酸化の役割が示唆される（Ｄｅｆｉｌｉｐｐｉら、１９９４）。プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）及びマイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼのようなセリン／トレオニンキナーゼファミリーも、インテグリン刺激によって活性化され、ＰＫＣの阻害剤は、いくつかの細胞システムにおける細胞の接着及び拡散を阻止する（ＶｕｏｒｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９３）。インテグリンは、やはりチロシンリン酸化に依存している応答であるプログラム細胞死を制御することにより細胞生存に影響を与えると考えられる。インテグリンタンパク質複合体と会合するいくつかのタンパク質は、タンパク質−タンパク質カップリングを特異的に媒介するＳｒｃホモロジー２（ＳＨ２）及び３（ＳＨ３）と呼ばれるモジュラードメインを含む。ＳＨ２ドメインは、ホスホチロシンを含む特異的ペプチドモチーフとの相互作用を介してタンパク質と結合し、ＳＨ３ドメインは、タンパク質標的上の短いプロリンリッチなペプチドモチーフと結合する（ＣｌａｒｋおよびＢｒｕｇｇｅ、１９９５）。インテグリンにより媒介される細胞接着は、ＭＡＰキナーゼの活性化を引き起こし、限局性付着キナーゼ（ＦＡＫ）のチロシンリン酸化を増加させる。ＦＡＫの自己リン酸化は、Ｓｒｃファミリーキナーゼ及びＧｒｂ−２−Ｓｏｓ複合体を含むＳＨ２ドメインタンパク質の結合へと至る。一つの妥当な仮説は、インテグリンにより媒介されるＦＡＫのチロシンリン酸化が、Ｒａｓカスケードの活性化に至り、最終的にはＭＡＰキナーゼ活性化へと至るというものである。しかしながら、インテグリンにより媒介されるＭＡＰキナーゼ活性化は、ＦＡＫとは無関係であることが示されており、そのことは、（ｉ）分裂促進シグナル及び生存シグナルにおいて役割を果たしうるＭＡＰキナーゼ活性化、並びに（ｉｉ）細胞骨格組織化に明らかに関与しているＦＡＫチロシンリン酸化、という少なくとも２個の別個のインテグリンシグナル伝達経路が存在することを示している（Ｌｉｎら、１９９７）。
【０２１６】
ペプチド基質及び相同性に基づく分子モデルの以前の研究より、ペプチド基質の約９〜１３残基が、キナーゼドメインの活性部位間隙と接触することが示唆された（Ｂｏｓｓｅｍｅｙｅｒら、１９９３）。ファージディスプレイ技術は、多様なコンビナトリアルペプチドライブラリを生成させ、選択するための代替的な手法を提供する（Ｓｍｉｔｈ、１９９１；ＷｅｌｌｓおよびＬｏｗｍａｎ、１９９２）。ファージディスプレイライブラリ内の化学的多様性は、複製され増幅されうるＤＮＡによってコードされているため、ファージライブラリの選択は複数回実施することが可能であり、従って稀少なモチーフですら同定することが可能である。合成化学ライブラリとは対照的に、ファージディスプレイは、プールされた種ではなく単一の種の分析を許容する。この技術の力は、大規模なコンビナトリアルライブラリからの稀少な抗体又はペプチドの選択によって主に証明されてきた。
【０２１７】
コンビナトリアルファージライブラリは、全てＳｒｃファミリーの近縁メンバーである異なるプロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）及び１個の比較的遠縁のＰＴＫ、Ｓｙｋの好ましい基質配列を決定するために使用された（Ｓｃｈｍｉｔｚら、１９９６）。組換えＰＴＫによるその後のリン酸化、及び抗ホスホチロシン抗体によるリン酸化されたファージの選択が、基質ペプチドを表示しているファージを濃縮するために使用された。数回の選択の後、試験された各ＰＴＫについて別個の基質配列が見出された。Ｓｒｃファミリーと関連したＰＴＫについては、これらの正準配列の重要な特質が、既知又は仮定のタンパク質基質において再利用された。最も注目すべきことは、不変のチロシン残基と直接隣接しているアミノ酸が、高度に保存されており、試験された各ＰＴＫに対して特異的であった点である。従って、同定されたモチーフは、ＰＴＫの触媒ドメインの小さい特異的な阻害剤を開発するための合理的基礎を提供しうる（Ｓｃｈｍｉｔｚら、１９９６）。
【０２１８】
さらなる研究は、ＳｒｃファミリーのプロテインキナーゼであるＦｙｎの基質特異性を検討するために、如何にしてペプチドライブラリが使用されうるかを示すことにより、ファージディスプレイ技術の範囲を拡大した（Ｄｅｎｔｅら、１９９７；Ｇｒａｍら、１９９７）。ファージによって表示された修飾されたペプチドが、タンパク質Ｓｈｃのホスホチロシン結合ドメイン（ＰＴＢ）のホスホチロシン特異性を決定するために使用された（Ｄｅｎｔｅら、１９９７）。他の関連する実験は、ファージ上に確立されたランダムペプチドライブラリをスクリーニングすることによる、アダプタータンパク質Ｇｒｂ２のＳｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインと相互作用するホスホペプチドリガンドの同定に焦点を当てた。ホスホチロシンキナーゼｃ−Ｓｒｃ、Ｂｌｋ、及びＳｙｋの混合物により、ファージの不変チロシン残基がインビトロでリン酸化された。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現させたＧｒｂ２の組換えＳＨ２ドメインとのライブラリの相互作用により、結合モチーフが選択された。その後の数回の選択によって、先にリン酸化された場合にのみＧＳＴ−Ｇｒｂ２ ＳＨ２ドメインと結合するファージが濃縮された。配列分析によって、選択されたファージが、全て、コンセンサスモチーフＹ＊Ｍ／ＮＷ（Ｙ＊はホスホチロシンを意味する）を含むペプチドを表示していることが明らかとなった。１個のペプチドは、天然リガンドＳｈｃに由来するペプチドモチーフＹ＊ＶＮＶ より３倍高い親和性でＧｒｂ２ ＳＨ２ドメインと結合した。これらの所見は、ファージディスプレイが、ＳＨ２ドメインに対する高親和性リガンド及びシグナル伝達に関与しているその他の相互作用タンパク質を迅速に同定するために使用されうることを示している。
【０２１９】
β５の細胞質ドメインは、他のインテグリンサブユニットと較べて構造的及び機能的に独特であり（表８）、わずか３８％というβ３の細胞質ドメインとの相同性を有している（Ｈｅｍｌｅｒら、１９９４）。αｖとの会合のための構造的要件が、β３とβ５とのさらなる一次配列の相違を防止しているが；既存の差異が、αｖβ５のテーリンとの減少した相互作用の原因となっている可能性が高いことが提唱されている（Ｌｅｗｉｓら、１９９６）。β５の細胞質ドメインを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、β１の細胞外ドメインとのキメラとして発現させた場合、キメラ受容体はβ５と同様の挙動を示し、細胞遊走及び受容体の限局性付着への局在の欠損を促進した（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＨｅｍｌｅｒ、１９９４）。しかしながら、インテグリンサブユニットβ１及びβ３の細胞質ドメインは、機能的に相互に交換可能であることが示された（Ｓｏｌｏｗｓｋａら、１９９１）。他の研究によって、αｖβ３及びαｖβ５が、限局性付着への局在及び細胞遊走への寄与に関して異なっていると考えられることが示された（Ｄｅｌａｎｎｅｔら、１９９４；Ｆｉｌａｒｄｏら、１９９５）。しかしながら、これらは、機能的相違が、特定のドメインにマッピングされていないことを報告した。
【０２２０】
【表８】類似のインテグリンβサブユニット細胞質ドメインの整列化
β３細胞質ドメインとβ５細胞質ドメインとの主要な差異が強調されている。
Figure 2004508045
【０２２１】
血管新生スイッチが誘発された後は、別個の分子が、β３又はβ５のいずれかと会合する可能性が高い。さらに、αｖ細胞質ドメインとの選択的会合も、各ヘテロダイマーの環境において可能性がある。例えば、インテグリンαｖサブユニットの細胞質テール内のβターンは、αｖβ３のコンフォメーション及びリガンド結合に影響を与えることが示されている（ＦｉｌａｒｄｏおよびＣｈｅｒｅｓｈ、１９９４）。選択的シグナル伝達特性の基礎は、それぞれの細胞質ドメインと会合する特異的分子の集合であるのかもしれない。本研究は、β３及びβ５の細胞質ドメインに対するファージディスプレイライブラリのパニング、並びに細胞質ドメイン結合ペプチドの生物学的特性の決定という新規な戦略を活用することにより、αｖβ３及びαｖβ５に選択的な血管新生シグナル伝達に関与している分子を確定する。
【０２２２】
開示された方法は、従来の手法と比していくつかの利点を有している。（ｉ）インテグリン細胞質ドメインと直接的又は間接的に相互作用する細胞内分子を特徴決定する能力；（ｉｉ）極めて少量でインテグリン細胞質ドメインと結合する分子に対する抗体の開発；及び（ｉｉｉ）ファージディスプレイライブラリスクリーニングは、細胞質ドメイン結合タンパク質を模倣するペプチドの同定に至るであろう。
【０２２３】
方法
二次元細胞培養
β３及びβ５インテグリンを発現する３個のヒト内皮細胞系：ＫＳ１７６７細胞（Ｈｅｒｎｄｉｅｒら、１９９６）、ＨＵＶＥＣ（ＡＴＣＣ）、及びＢＣＥ細胞（Ｓｏｌｏｗｓｋａら、１９９１）を使用した。異なるタンパク質（即ち、ビトロネクチン、フィブロネクチン、コラーゲン、又はラミニン）で覆われた無菌のガラス製カバーガラスを基質として使用した。細胞が接着し拡散した後、０．０５％ウシ胎仔血清を含む培地中での１２時間のインキュベーションにより、単層を休止状態にした。ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）膜透過性タグ（下記参照）を使用して、ペプチドを細胞へと導入した。細胞を、接着及び拡散のため、ＥＣＭタンパク質へと播いた。単層を、ｂＦＧＦ、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ、及びＴＧＦβを含む、αｖにより媒介される血管新生に関与している各増殖因子で６時間刺激した。未処理の細胞が、陰性対照であった。
【０２２４】
三次元細胞培養：
２４穴組織培養プレートのウェルに各１５０μｌのマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を添加し、３７℃で１０分間ゲル化させた。２％ＦＣＳが補足されたＭ１９９培地中で２４時間、ＨＵＶＥＣを枯渇状態にした後、トリプシン処理したものを使用した。１０４個の細胞を３通り、各ウェルに穏和に添加し、３７℃で３０分間、ゲルコーティングへと接着させた。次いで、培地を、ペプチドを含む完全培地に交換した。２４時間後、倒立顕微鏡（Ｃａｎｏｎ）を用いて、プレートをモニタリングし、写真撮影した。
【０２２５】
走化性アッセイ：
細胞遊走アッセイを、以下のようにして実施した。４８ウェルマイクロケモタキシスチャンバーを使用した。８μｍ孔を有する、ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に、室温で１０分間、１％ゼラチンをコーティングし、２％ＦＣＳが補足されたＭ１９９培地で平衡化した。ペプチドを含む２％ＦＣＳ、２０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）、及び１Ｕ／ｍｌヘパリンが補足されたＭ１９９を、ボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバーの下室に置いた。一晩、枯渇状態にしたサブコンフルエントの培養物を迅速にトリプシン処理し、最終濃度２×１０６個／ｍｌで、２％ＦＣＳが補足されたＭ１９９に再懸濁させた。フィルターを下チャンバーと上チャンバーの間に置いた後、５０μｌの細胞懸濁液を上室に蒔いた。５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気中で３７℃で５時間、細胞を遊走させた。次いで、フィルターを除去し、上側の細胞を、ゴムポリスマン（ｐｏｌｉｃｅｍａｎ）を用いて剥離した。遊走した細胞をメタノールで固定し、ギムザ溶液（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ、Ｂａｘｔｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｍｅ、Ｉｔａｌｙ）で染色した。各ウェル内の５個のランダムな高倍率視野（４０倍）を計数した。
【０２２６】
増殖アッセイ：
細胞増殖は、記載されているようにして（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＨｅｍｌｅｒ、１９９４）測定した。簡単に説明すると、４×１０４個のＨＵＶＥＣを２４ウェルプレート内でインキュベートした。細胞を２４時間枯渇状態にし、次いで培地を除去し、ＶＥＧＦ及び１５μＭの各ペプチドの存在下で交換し、１８時間インキュベートした。次いで、５０μｌの［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ｍｌ）を含む培地をウェルに添加し、さらに６時間３７℃でインキュベートした後、培地を除去し、細胞を１０％ＴＣＡで４℃で３０分間固定し、エタノールで洗浄し、０．５Ｎ ＮａＯＨで可溶化した。ＬＳ ６０００ＳＣベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）シンチレーションカウンターを用いて液体シンチレーションにより放射能を計数した。各実験を３通り３回実施し、結果を平均値±ＳＤで表した。
【０２２７】
アポトーシスアッセイ（ヨウ化プロピジウム染色サブジプロイド（ｓｕｂｄｉｐｌｏｉｄ）集団）
およそ１×１０６個の細胞を完全培地中に採集し、１５μＭのペプチドを４時間、８時間、又は１２時間添加した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５ｍｌのヨウ化プロピジウム溶液（５０μｇ／ｍｌ ＰＩ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％クエン酸ナトリウム）に再懸濁させた。４℃で２４時間のインキュベーションの後、細胞を、４８８ｎｍレーザーを用いてＸＬコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で計数し；各ヒストグラムについて１２，０００個の細胞を計数し、細胞周期分布をマルチサイクル（Ｍｕｌｔｉｃｙｃｌｅ）プログラムで分析した。
【０２２８】
ペプチド及び適切な対照の微小注入又はペネトラチン媒介取り込みの後、アポタグ（ＡｐｏｐＴａｇ）キットを使用して細胞アポトーシスをモニタリングした。実験は、カスパーゼ阻害剤及び特異的カスパーゼに対する抗体の存在下で実施した。
【０２２９】
サイトカイン及び腫瘍により誘導される血管新生のアッセイ
ＣＡＭへと移植された血管新生因子及び腫瘍細胞は、新たな毛細血管の成長を刺激する。１０日ニワトリ胚に由来するＣＡＭにおいて、以前には無血管であった領域に移植されたＶＥＧＦ又はｂＦＧＦのフィルターにより、血管新生を誘導した。異なる処理（ペネトラチンペプチド及び対照）を局所適用し、３日後、フィルター及び周囲のＣＡＭを切除しホルマリンで固定した。立体顕微鏡を用いて、ＣＡＭの焦平面内で、ディスクに侵入した血管の数を定量した。各群８個のＣＡＭからの血管数の平均値及び標準誤差を比較した。
【０２３０】
リン酸化及びリン酸化されたファージライブラリのパニング
ｓｒｃファミリーのプロテインキナーゼ（Ｆｙｎ、ｃ−Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、及びＳｙｃ）、並びにＭＡＰキナーゼのようなセリン／トレオニンキナーゼによるペプチドライブラリのリン酸化を、以前に記載されたようにして実施した（Ｓｃｈｍｉｔｚら、１９９６；Ｄｅｎｔｅら、１９９７；Ｇｒａｍら、１９９７）。簡単に説明すると、２０％ポリエチレングリコール８０００を含む２．５Ｍ ＮａＣｌによる二重沈殿により、培養上清からファージ粒子を収集した。粒子を１０１２個／ｍｌで溶解させた。精製されたファージ（１０μｌ）を、５０μｌの反応緩衝液容量で、異なる濃度（３５〜３，５００単位）のプロテインキナーゼと共に、室温で３時間インキュベートした。リン酸化されたペプチドを表示しているファージを選択するため、反応混合物を、１０μｇのアガロースと接合した抗Ｐ−Ｔｙｒ、抗Ｐ−Ｓｅｒ、又は抗Ｐ−Ｔｈｒモノクローナル抗体を含むチューブに移した。結合したファージを、０．３ｍｌの溶出緩衝液（０．１ Ｍ ＮａＣｌ／グリシン／１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ２．３５）でカラムを洗浄することにより溶出させた。溶出液を２Ｍトリス塩基で中和し、２ｍｌの対数増殖期中期（ｍｉｄ−ｌｏｇ）の細菌培養物と共にインキュベートした。その一部２０μｌを播種のため取り出し、記載されているようにしてファージを採集した。リン酸化から選択までの工程を繰り返した。β３及びβ５の細胞質ドメインと結合するリン酸化されたペプチドを、先のセクションに記載されたようにして分析した。
【０２３１】
β３及びβ５の細胞質ドメイン上のリン酸化部位、並びに細胞質ドメイン結合ペプチドをインビトロでマッピングするため、マトリックス支援レーザーデソープション飛行時間型（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計を使用した。融合タンパク質又はペプチドを記載されたようにしてインビトロでリン酸化し、ＲＰ−ＨＰＬＣ又はＲＰマイクロチップカラムにより精製した。リン酸化されたペプチドを、三つの方法により同定した。（１）キナーゼ反応後の８０Ｄａの質量シフト；（２）ホスファターゼ処理後の８０Ｄａの欠損；又は（３）チロシンリン酸化ペプチド又はセリン、トレオニンリン酸化ペプチドについての、リニア（ｌｉｎｅａｒ）モードに対するリフレクター（ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ）モードでのそれぞれ８０Ｄａ又は９８Ｄａの欠損。必要に応じて、ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、配列ラダーを作製するため、カルボキシペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼによる消化に供した。これは、１個のペプチドが２個またはそれ以上のリン酸化部位を内含している場合に特に有用であった。
【０２３２】
リン酸化されたＧＳＴ−融合タンパク質に対するパニング
ＧＳＴ融合タンパク質を記載されたようにしてインビトロでリン酸化した（Ｓｃｈｍｉｔｚら、１９９６；Ｄｅｎｔｅら、１９９７；Ｇｒａｍら、１９９７）。簡単に説明すると、１０μｇ／ｍｌを、５．５単位のＦｙｎプロテインキナーゼを含む反応緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５００μＭ Ｎａ３ＶＯ４、 ５００μＭ ＡＴＰ、全容量５０μｌ）と共に室温で３時間インキュベートした。４０％のＴＣＡを添加することにより、反応を停止させた。キナーゼ基質タンパク質を沈殿させた後、それをＰＢＳに再懸濁させ、マイクロタイターウェル上に１０μｇ／ウェルでコーティングした。ＣＸ７Ｃライブラリの一部（２．５×１０１１形質導入単位）をＧＳＴ融合タンパク質上でインキュベートした。ランダムに選択されたクローンから、ファージを配列決定した。
【０２３３】
質量分析研究
質量分析によるペプチド質量マッピングを、β３及び／又はβ５の細胞質ドメインの新規リガンドを同定するために使用した。細胞質ドメイン結合ペプチドに対して産生させたポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を、標的タンパク質（細胞骨格分子又はシグナル伝達分子）を精製するために使用した。これらのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＳＤＳゲルから切り出し、トリプシンでゲル内消化した。ペプチドの抽出後、ペプチド質量のリストを作製するためＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を実施した。このペプチド質量のリストは、プロテアーゼ特異性と組み合わされ、配列データベースを検索するために使用されうる比較的特異的な「サイン」を与える。タンパク質配列がデータベース内に存在する場合には、この方法により、高い信頼性でタンパク質が同定されうる。この手法の検出下限は、現在のところ、Ｎ末端エドマン配列決定法よりも少なくとも１０〜２０倍低い１ｐｍｏｌである。
【０２３４】
結果
β３及びβ５の細胞質ドメインに対するファージペプチドライブラリのパニング
β３及びβ５の細胞質ドメインと結合するタンパク質を、マイクロタイターウェルにコーティングされたＧＳＴ−β３ｃｙｔｏ又はＧＳＴ−β５ｃｙｔｏのいずれかを含む組換えＧＳＴ融合タンパク質を用いた複数のファージライブラリのスクリーニングにより単離した。固定化ＧＳＴを、各細胞質ドメインのパニングにおける濃縮についての陰性対照として使用した。他に開示されたようにして（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９５；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９５）、３回のパニングの後、ランダムに選択されたクローンからファージを配列決定した。β３又はβ５細胞質ドメインと特異的に相互作用する別個の配列が単離された（表９）。２回目及び３回目のパニングからランダムに選択されたクローンを配列決定した。ファージミドによりコードされたペプチドのアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列から推定した。示されたライブラリを用いたパニングの後、最も高頻度に見出されたモチーフが、表９に示されている。比率は、β３−ＧＳＴでコーティングされたウェルから回収されたコロニーの数を、ＧＳＴ又はＢＳＡから回収されたもので割ることにより計算した。
【０２３５】
【表９】β３又はβ５の細胞質ドメインと結合するファージにより表示された配列
Figure 2004508045
【０２３６】
β３又はβ５の細胞質ドメインとの相互作用の特異性を、細胞質ドメイン含有融合タンパク質（β３又はβ５）と結合したファージの数と、ＧＳＴ単独（陰性対照）の数との比率を計算することにより決定した。図９は、ＧＳＴ−β３ｃｙｔｏ結合ファージを用いて実施された結合アッセイからの結果を示している。２回目及び３回目のパニングにおいて最も高頻度に見出されたモチーフを表示していた６個のファージを試験した。各パネルは、示されたようなβ３細胞質ドメインと結合する異なるペプチドを表示していたファージについての結合アッセイからの結果を示している。挿入物非含有ファージ、又は未選択のライブラリが、陰性対照として使用され、それらは、バックグラウンドを超える結合を示さなかった。各アッセイについて二つの播種希釈率が示されている。
【０２３７】
β５細胞質ドメイン融合タンパク質を含むスクリーニングにおいて単離されたファージの特異性を決定するため、類似の戦略を使用した。結合アッセイは、図１０に示される個々に増幅されたファージを用いて実施した。２回目及び３回目のパニングにおいて最も高頻度に見出されたモチーフを表示していた５個のファージを試験した。各パネルは、β５細胞質ドメインと結合するペプチドを表示していたファージについての結合アッセイを示している。挿入物非含有ファージ、又は未選択のライブラリが、陰性対照として使用され、それらは、これらのアッセイにおいて、バックグラウンドを超える結合を示さなかった。
【０２３８】
選択されたモチーフの結合が各細胞質ドメインに特異的であるか否かを決定するため、個々のファージモチーフの、β１、β３、又はβ５細胞質ドメイン融合タンパク質との相互作用を比較する結合アッセイを実施した。抗ＧＳＴ抗体を用いたＥＬＩＳＡは、３個のタンパク質が、等しい効率でプラスチックへとコーティングされうること、及び従って結合の差がコーティング濃度の差を反映するのではないことを示した（示していない）。β３で選択されたファージ及びβ５で選択されたファージの両方が、最初に選択されたタンパク質と選択的に相互作用し、β３／β１＝３．９、β３／β５＝３．７、β５／β１＝４．８、及びβ５／β３＝６．９という平均結合選択性が観察された（示していない）。ＢＳＡに対するインテグリン細胞質ドメインへの平均選択性は、約１〜２桁大きかった（示していない）。試験されたファージは、いずれも、β１細胞質ドメインとは強く結合しないようであった（示していない）。
【０２３９】
インテグリン細胞質ドメイン結合ファージにより表示された配列に相当する合成ペプチドの特徴決定
結合特性に基づき、さらなる研究のため、特定のファージを選択した。各ファージにより表示された配列に相当する合成ペプチドを、結合阻害研究を実施するために使用した。このアッセイにより、ファージ結合が各ファージにより表示されたターゲティングペプチドにより完全に媒介されるのか、又は非特異的成分も含んでいるのか、が決定された。予想通り、合成ペプチドは、用量依存的に対応するファージの結合を阻害した（図１１及び図１２）。無関係のアミノ酸を含む対照ペプチドは、同一濃度で試験した場合、ファージ結合に対する効果を有していなかった。
【０２４０】
リン酸化事象が、選択されたペプチドの細胞質ドメインとの相互作用を調整する
リン酸化を含む事象は、シグナル伝達の制御において重要である。ファージディスプレイ系を、二つのレベルでチロシンリン酸化の効果を評価するために使用した。第一に、β３又はβ５の細胞質ドメインを含む組換え融合タンパク質を、チロシン含有ペプチドを表示しているファージライブラリのパニングに使用した。第二に、細胞質ドメイン自体をリン酸化した後、ファージ選択を実施した。特定のチロシンキナーゼの、選択されたペプチドの細胞質ドメインとの相互作用を調整する能力を調査するための実験を、実施した。チロシン含有ペプチドを表示しているファージライブラリのパニングにおいて得られた結果は、表１０に示されている。
【０２４１】
３回目及び４回目からランダムに選択されたクローンを、Ｆｙｎによりリン酸化されたＸ４ＹＸ４ライブラリから配列決定した。ファージミドによりコードされたペプチドのアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列から推定した。表１０は、示されたライブラリをβ３又はβ５でパニングした後、最も高頻度に見出されたモチーフを示している。β３又はβ５との結合の比率は、パニング後に見出されたβ３又はβ５コロニーの数を、ＧＳＴ又はＢＳＡコロニーの数で割ることにより計算した。β３又はβ５のＦｙｎによりリン酸化されたファージとの結合の、未リン酸化ファージとの結合に対する比率を、パニング後に見出されたコロニーの数を割ることにより計算した。
【０２４２】
【表１０】インテグリン細胞質ドメインと結合するリン酸化されたファージにより表示された配列
Figure 2004508045
【０２４３】
細胞質ドメイン結合の親和性及び特異性に対するリン酸化の効果を調査した。β３及びβ５の細胞質ドメインと結合するペプチドを表示しているファージを、Ｆｙｎキナーゼを使用して、以前に記載されたようにして（Ｓｃｈｍｉｔｚら、１９９６；Ｄｅｎｔｅら、１９９７；Ｇｒａｍら、１９９７）、インビトロでリン酸化した。ファージ表面上のチロシン含有ペプチドの特異的リン酸化を、キナーゼ反応において３２Ｐ−γｄＡＴＰを使用し、ファージｐＩＩＩタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離することにより確認した。
【０２４４】
インビトロでリン酸化されたファージは、β３インテグリン細胞質ドメインとの結合の親和性及び特異性の増加を示した（図１３）。ＴＬＲＫＹＦＨＳＳ（配列番号：１２０）ファージを、特異性を決定するため、他のＧＳＴ細胞質ドメイン融合タンパク質を含むアッセイにおいても試験した（図１４）。
【０２４５】
インテグリン結合ペプチドと既知の細胞骨格タンパク質及びシグナル伝達タンパク質との配列類似性
インテグリン細胞質ドメイン結合ファージにより表示されたペプチドは、細胞骨格タンパク質及びシグナル伝達に関与しているタンパク質に見出されるいくつかの領域と類似していた（表１１）。単離ペプチドのいくつかと、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ５のある領域（ＭＡＰＫ５、アミノ酸２２７〜２３４）との類似性は、特に興味深かった。ＭＡＰＫカスケード、細胞の接着、遊走、及び増殖を含む関連が提唱されている（Ｌｉｎら、１９９７）。
【０２４６】
【表１１】インテグリン結合ペプチドと、既知の細胞骨格タンパク質及びシグナル伝達タンパク質との配列類似性
Figure 2004508045
【０２４７】
膜透過性ペプチド
ペネトラチンは、親水性化合物に原形質膜を通過させることができるペプチドである。浸透部分との融合は、明らかな崩壊なしに、オリゴペプチドを細胞質、核、又はその両方へと直接的にターゲティングすることを可能にする（Ｄｅｒｏｓｓｉら、１９９４）。この膜透過性ペプチドは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）転写因子（Ｊｏｌｉｅｔら、１９９１ａ、１９９１ｂ ；Ｌｅ Ｒｏｕｘら、１９９３）であるアンテナペディアのホメオドメインのアミノ酸４３〜５８に相当する１６残基
Figure 2004508045
からなる。ペネトラチンにより媒介される取り込みは、３７℃及び４℃の両方で起こり、取り込まれたペプチドは細胞から完全な状態で回収されうる。
【０２４８】
β３又はβ５の細胞質ドメインと結合することが見出されたモチーフの配列と融合したペネトラチン配列を含むペプチドを設計した。ペプチドは、ｐ−ヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン（ＨＭＰ）樹脂及び標準的なＦｍｏｃ化学を使用して、４３１アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ペプチド合成機で合成した。ペプチドの取り込み及び可視化は、記載されているようにして（Ｄｅｒｏｓｓｉら、１９９４；Ｈａｌｌら、１９９６；Ｔｈｅｏｄｏｒｅら、１９９５）、実施した。
【０２４９】
簡単に説明すると、１０〜５０μｇ／ｍｌのビオチン化ペプチドを細胞培養物へ添加した。ペプチドを、播種された細胞と共にインキュベートした。２〜４時間後、培養物を組織培養培地で３回洗浄し、固定し、エタノール：酢酸（９：１）を使用して、−２０℃で５分間、透過処理した。培養物を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び０．０２％Ｔｗｅｅｎを含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）と共に３０分間インキュベートすることにより、非特異的タンパク質結合部位をブロッキングした。培養物を、ＦＩＴＣと接合したストレプトアビジン（１：２００希釈）を含む同緩衝液の中でインキュベートし、ＴＢＳで洗浄した後、共焦点顕微鏡検による視察のため設置した。ペネトラチンと連結されたペプチドは、極めて効率的に取り込まれた（データは示していない）。
【０２５０】
機能データは、β３又はβ５に対して選択された細胞質ドメイン結合ペプチドが、インテグリンにより媒介されるシグナル伝達及びその後の細胞応答（即ち、内皮細胞の接着、拡散、増殖、遊走）を妨害しうることを示した。ファージスクリーニングにより見出された合成モチーフ（ＳＤＮＲＹＩＧＳＷ、配列番号：９７；及びＣＥＱＲＱＴＱＥＧＣ、配列番号：９３；β３結合ペプチド、並びにＶＶＩＳＹＳＭＰＤ、配列番号：１１２；β５結合ペプチド）の「取り込み可能」型の市販のパネルを得た。これらの複合キメラペプチドは、ペネトラチンとカップリングした、β３又はβ５細胞質ドメイン結合ペプチドのうちの最も選択的なもの＋完全細胞へと取り込まれた後のペプチドの追跡を可能にするためのビオチン部分からなる。これらの膜透過性型のペプチドは、取り込まれ、β３及びβ５のリガンド結合後の細胞事象に影響を与え、多量のアポトーシスを誘導しうる（データは示していない）。
【０２５１】
内皮細胞の増殖、走化性、及びアポトーシス
β３及びβ５インテグリン細胞質ドメイン結合モチーフの、内皮細胞増殖に対する効果を、内皮細胞を活性化する因子による刺激の後、評価した（図１５）。細胞増殖は、パスカリーニ（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ）およびエルマー（Ｈｅｍｌｅｒ）（１９９４）に従い測定した。簡単に説明すると、４×１０４個のＨＵＶＥＣを２４ウェルプレートでインキュベートし、２４時間枯渇状態にし、その後、培地を除去し、ＶＥＧＦ及び１５μＭの各ペプチドの存在下で交換した。さらに１８時間のインキュベーションの後、５０μｌの［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ｍｌ）を含む培地をウェルに添加した。さらに６時間３７℃でインキュベートした後、培地を除去し、細胞を１０％ＴＣＡで４℃で３０分間固定し、エタノールで洗浄し、０．５Ｎ ＮａＯＨで可溶化した。ＬＳ ６０００ＳＣベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）シンチレーションカウンターを使用することにより、液体シンチレーションにより放射能を計数した。各実験を３通り３回実施し、結果を平均値±ＳＤで表した。
【０２５２】
β３及びβ５インテグリン細胞質ドメイン結合モチーフの、内皮細胞遊走に対する効果を、内皮細胞を活性化する因子による刺激の後、評価した。試験されたペプチドは、用量依存的かつ特異的に細胞機能に影響を与えた。それらの特性は、β３又はβ５細胞質ドメインに内在性のものと考えられる（図１６）。
【０２５３】
走化性アッセイ
細胞遊走は、４８ウェルマイクロケモタキシスチャンバーにおいてアッセイした。８μｍ孔を有する、ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルターを、室温で１０分間１％ゼラチンでコーティングし、２％ＦＣＳが補足されたＭ１９９培地で平衡化した。ペプチドを含む２％ＦＣＳ、２０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）、及び１Ｕ／ｍｌヘパリンが補足されたＭ１９９を、ボイデンチャンバーの下室に置いた。一晩、枯渇状態にしたサブコンフルエントの培養物を迅速にトリプシン処理し、最終濃度２×１０６個／ｍｌで、２％ＦＣＳを含むＭ１９９培地に再懸濁させた。フィルターを下チャンバーと上チャンバーの間に置いた後、５０μｌの細胞懸濁液を上室に蒔いた。５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気中で３７℃で５時間、細胞を遊走させた。次いで、フィルターを除去し、上側の細胞を、ゴムポリスマンを用いて剥離した。遊走した細胞をメタノールで固定し、ギムザ溶液で染色した。各ウェル内の５個のランダムな高倍率視野（４０倍）を計数した。結果は、両方のβ３インテグリン細胞質ドメイン結合ペプチドが細胞の遊走を増加させたが、ペネトラチンは細胞に影響を与えなかったことを示している。
【０２５４】
アポトーシスアッセイ（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色サブジプロイド集団）
およそ１×１０６個の細胞を完全培地中に採集し、１５μＭのペプチドを４時間、８時間、又は１２時間添加した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５ｍｌのヨウ化プロピジウム溶液（５０μｇ／ｍｌ ＰＩ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％クエン酸ナトリウム）に再懸濁させた。４℃での２４時間のインキュベーションの後、細胞を、４８８ｎｍレーザーを用いてＸＬコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で計数し；各ヒストグラムについて１２，０００個の細胞を計数し、細胞周期分布をマルチサイクルプログラムで分析した。
【０２５５】
ＶＩＳＹ−ペネトラチンキメラによる細胞の処理は、アポトーシスの誘導をもたらした（図１７、パネルｄ）。細胞を他の増殖因子に曝露した場合には、アポトーシス促進効果は観察されなかった（示していない）。ペネトラチン単独及び他のペネトラチンキメラも、類似の効果を誘導することができなかった（図１７、パネルｃ）。この所見は、血管新生を阻害するための新規な手法が、インテグリンターゲティングペプチドの使用に基づき開発されうることを示している。
【０２５６】
細胞質ドメイン結合ペプチドによる免疫、及び得られた抗体の特徴決定
標準的な技術を使用して、αｖβ３結合ペプチド及びαｖβ５結合ペプチドを認識するポリクローナル抗体を、合成ペプチドを用いて作製されたＫＬＨ接合体を使用して生成させた。２個の異なる合成ペプチドに対する抗体を作製した（図１８）。血清は、ウェスタンブロット分析により示されるように、固定化ペプチドを認識するだけでなく、全細胞抽出物中の特異的タンパク質も認識する（図１９）。
【０２５７】
ウサギを、ＳＤＮＲＹＩＧＳＷ（配列番号：９７）−ＫＬＨ接合体又はＧＬＤＴＹＲＧＳＰ（配列番号：９６）−ＫＬＨ接合体で免疫した。各ウサギに、２００μｇのＫＬＨと接合したペプチドを含む完全フロイントアジュバントを注射した。２０〜６０日後、ウサギに１００μｇの不完全フロイントアジュバントを注射した。３回目の免疫後、血清を収集した。最初の免疫の前に得られた免疫前血清を、実験において付加的な対照として使用した。
【０２５８】
ポリクローナル抗体をＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、及び免疫沈降により試験した。ＥＬＩＳＡアッセイにおいては、マイクロタイターウェルプレートに１０μｇ／ｍｌのペプチドをコーティングした。プレートを３７℃で乾燥させ、ＰＢＳ＋３％ＢＳＡでブロッキングし、異なる血清希釈物を含むＰＢＳ＋１％ＢＳＡと共にインキュベートした。洗浄及び二次抗体とのインキュベーションの後、アルカリホスファターゼ基質を添加し、抗体結合を４０５ｎｍで比色検出した。マウスポリクローナル抗体及びウサギポリクローナル抗体の両方で観察された反応性は、高度に特異的であった。全ての場合に、抗体結合は、免疫に使用された対応するペプチドによるプレインキュベーションにより消失したが、対照ペプチドによっては消失しなかった（図１８及び図１９）。２個のβ３細胞質ドメイン結合ペプチドに対して産生された抗体は、３５Ｓ標識抽出物を使用した免疫沈降実験において、全細胞抽出物上の特異的バンドを認識する。ポリクローナル血清及び精製されたＩｇＧで、類似の結果が得られた（示していない）。
【０２５９】
本実施例は、細胞受容体の特定のドメインに対するターゲティングペプチドが、ファージディスプレイにより同定されうることを示している。そのようなペプチドは、エンドスタチンのような細胞受容体の内因性リガンドを同定するために使用されうる。さらに、ペプチド自体が、治療効果を有する場合もあるし、又はより有効な治療剤の同定のための基礎として有益である場合もある。ここで同定されたエンドスタチンターゲティングペプチドは、細胞へと導入した場合、細胞の増殖、走化性及びアポトーシスに対する効果を示した。当業者であれば、本発明が、開示されたペプチド又は治療効果に限定されないことを理解するであろう。その他の細胞受容体及びリガンド、並びにそれらの阻害剤及び活性化剤も、開示された方法により同定されうる。
【０２６０】
実施例７． インテグリン結合ペプチドによるアポトーシスの誘導（エンドタノス（Ｅｎｄｏｔｈａｎｏｓ））
実施例９は、ペネトラチンへの付着により細胞へと輸入されたＶＩＳＹペプチド（ＶＶＩＳＹＳＭＰＤ、配列番号：１１２）が、ＨＵＶＥＣ細胞においてアポトーシスを誘導しうることを示した。ここでアネキシンＶとして同定されたペプチドの内因性細胞類似体を同定するため、ＶＩＳＹペプチドに対して産生された抗体が使用された。結果は、アネキシンＶが、新規アポトーシス経路に関与しているインテグリンの内因性リガンドであることを示している。
【０２６１】
方法
タンパク質精製
前記実施例９に記載の方法を使用して、ＶＩＳＹペプチド（ＶＶＩＳＹＳＭＰＤ、配列番号：１１２）に対するポリクローナル抗体を調製した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞を、内因性ＶＩＳＹペプチド類似体の精製のため使用した。細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、冷水で２０分間溶解させた。膜画分から細胞質画分を分離するため、細胞抽出物を１００，０００×ｇで３０分間遠心分離した。細胞質画分をゲル濾過カラム（１０〜５０ｋＤａ）及び陰イオン交換カラム（ｍｏｎｏＱ）でのカラムクロマトグラフィに供した。陰イオン交換カラムを、５０ｍＭ〜１Ｍ ＮａＣｌの塩勾配で溶出させた。１ｍｌ画分を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行し、抗ＶＩＳＹ抗体と反応性の内因性タンパク質の存在に関してウェスタンブロッティングにより試験した。３６ｋＤａの抗体反応性バンドを含む目的の画分は、約３００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。
【０２６２】
３６ｋＤａは、抗ＶＩＳＹ抗体との陽性の反応性を示す画分に必ず出現した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び２Ｄゲル電気泳動、続いてウェスタンブロッティングにより分析した。カラムクロマトグラフィの後、３６ ｋＤａタンパク質の実質的な濃縮が見られた（示していない）。３６ ｋＤａペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出し、その配列を得るため質量分析により分析した。質量分析により得られた５個のペプチド配列は、全て、報告されているアネキシンＶの配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ＿４６８８８８）との１００％の相同性を示した。４３５細胞における存在に加え、３６ ｋＤａバンドは、カポジ肉腫細胞、ＳＫＯＶ細胞、及びＨＵＶＥＣ細胞にも見られた（示していない）。
【０２６３】
市販のアネキシンＶに対する抗体を入手した（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）。抗ＶＩＳＹ抗体及び抗アネキシンＶ抗体を使用して、競合ウェスタンブロットを実施した。両方の抗体が、３６ ｋＤａタンパク質との反応性を示した（示していない）。これらの結果は、ＶＩＳＹペプチドの内因性タンパク質類似体がアネキシンＶであることを示している。
【０２６４】
アネキシンＶ及びβ５細胞質ドメインによるタンパク質−タンパク質相互作用
アネキシンＶのβ５インテグリンとの結合、及びＶＩＳＹペプチドの効果を調査するため、競合結合アッセイを実施した。プレートに様々なインテグリンの細胞質ドメインのＧＳＴ融合タンパク質をコーティングし、アネキシンＶをプレートに添加した。抗アネキシンＶ抗体を使用して、アネキシンＶの結合を決定した。図２０Ａに示されるように、アネキシンＶはＧＳＴ−β１インテグリンともＧＳＴ−β３インテグリンとも結合しなかった。アネキシンＶは、ＧＳＴ−β５インテグリンと強く結合したが、結合は使用された緩衝液に依存していた（図２０Ａ）。トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）においては低い結合が観察され、カルシウム（２ｍＭ）が添加された、又は添加されていない「細胞質緩衝液」（１００ ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＮａＣｌ、３．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、３ｍＭ ＤＴＴ）では高い結合が観察された（図２０Ａ）。カルシウムは、アネキシンＶ活性がカルシウムにより調整されることが報告されているため、使用した。アネキシンＶのＧＳＴ−β５との結合は、ＶＩＳＹペプチドの添加により阻止された（図２０Ａ）。図２０Ｂは、抗アネキシンＶ抗体の精製されたアネキシンＶ及びＶＩＳＹペプチドとの結合の相対レベルを示している。
【０２６５】
プレートのコーティングにアネキシンＶを使用し、インテグリン細胞質ドメインのＧＳＴ融合タンパク質を添加する、逆の実験を実施した。抗ＧＳＴ融合タンパク質抗体を使用して結合を評価した。予想通り、ＧＳＴ−β５のみがアネキシンＶとの実質的な結合を示し、ＧＳＴ−β１及びＧＳＴ−β３は、低レベルのアネキシンＶ結合を示した（示していない）。いくつかの実験において、カルシウムの存在下では減少した結合が観察され、カルシウムイオンは、ＧＳＴ−β５とアネキシンＶとの結合相互作用を妨害すると考えられた（示していない）。カルシウムの存在下（６７％阻害）では、カルシウムの非存在下（４５％）よりも大きい程度のＶＩＳＹペプチドによるアネキシンＶのＧＳＴ−β５との結合の阻害が観察された（図２０Ａ）。
【０２６６】
β５細胞質ドメインと結合するペネトラチンペプチドキメラはプログラム細胞死を誘導する
実施例９において示されたＶＩＳＹペプチドによるアポトーシスの誘導を確認した。１０６個のＨＵＶＥＣ細胞を１５μＭのＶＩＳＹアンテナペディア（ペネトラチン）キメラ、又は１５μＭのアンテナペディアペプチド（ペントラチン（ｐｅｎｔｒａｔｉｎ））単独で２〜４時間処理し、アガロースゲル電気泳動によりクロマチン断片化を分析した。図２１は、クロマチン断片化により示されるようなＶＩＳＹ−Ａｎｔ（ペネトラチン）によるアポトーシスの誘導を示している。ＶＩＳＹも、ペネトラチンも、単独ではアポトーシスを誘導しなかった。アポトーシスの誘導は、カスパーゼ阻害剤（ｚＶＡＤ、カスパーゼインヒビター（ｃａｓｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）Ｉ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ＃６２７６１０、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）をＶＩＳＹキメラペプチドと同時に培地へ添加した場合に、最大７０％阻害された。
【０２６７】
ＶＩＳＹペプチドにより誘導された細胞死の機構と他のアポトーシス促進剤によるものとの相違点は、細胞培養物において評価された他のアポトーシス機構には、細胞死の前に基質からの細胞の脱離が含まれる点である。対照的に、ＶＩＳＹにより誘導される細胞死においては、細胞は細胞死前に基質から脱離しない。従って、エンドタノス（内からの死）は、アノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）（ホームレスネス（ｈｏｍｅｌｅｓｓｎｅｓｓ））とは異なっていると考えられる。
【０２６８】
実施例９及び本実施例の結果は、ＶＩＳＹペプチドがインテグリン依存性アポトーシス経路を活性化することを示している。本実施例は、ＶＩＳＹペプチドの内因性類似体がアネキシンＶであることを示している。これらの結果は、アネキシンＶとβ５インテグリンとの間の相互作用により媒介され、かつカスパーゼ活性に依存している新規アポトーシス経路の存在を証明している。この新規アポトーシス機構は、エンドタノスと呼ばれる。当業者であれば、アポトーシスを誘導又は阻害するための新規機構が、癌療法のような多様な用途に有用であることを理解するであろう。
【０２６９】
実施例８． 受容体／リガンド対の同定：アミノペプチダーゼＡは内皮細胞機能及び血管新生を制御する
腫瘍血管の内皮細胞は、特異的な血管新生マーカーを発現する。アミノペプチダーゼＡ（ＡＰＡ、ＥＣ ３．４．１１．７）は、血管新生中の微小血管においてアップレギュレートされる。ＡＰＡは、オリゴペプチドからＮ末端のグルタミル残基又はアスパルチル残基を加水分解するホモダイマーの膜結合型亜鉛メタロペプチダーゼである（Ｎａｎｕｓら、１９９３）。インビボで、ＡＰＡは、アンジオテンシンＩＩをアンジオテンシンＩＩＩへと変換する。レニン−アンジオテンシン系は、いくつかの内分泌機能、心血管機能、及び行動的機能の制御において重要な役割を果たしている（Ａｒｄａｉｌｌｏｕ、１９９７；ＳｔｒｏｔｈおよびＵｎｇｅｒ、１９９９）。最近の研究は、血管新生におけるアンジオテンシンの役割も示唆しているが（Ａｎｄｒａｄｅら、１９９６）、血管新生過程におけるＡＰＡの機能は、従来検討されていない。
【０２７０】
本実施例においては、ＡＰＡ発現細胞に対してファージライブラリをスクリーニングすることにより、ＡＰＡと結合することができるターゲティングペプチドが同定された。モチーフＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）を含むＡＰＡ結合ペプチドは、ＡＰＡ酵素活性を特異的に阻害した。可溶性ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチドはインビトロで内皮細胞の遊走、増殖、及び形態形成を阻害し、ニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおいてインビボの血管新生を妨害した。さらに、ＡＰＡヌルマウスは、未成熟マウスにおける低酸素により誘導される網膜症において、野生型（ｗｔ）マウスと比較して減少した量の網膜血管新生を有していた。これらの結果は、血管新生におけるＡＰＡの役割のよりよい理解、及び新たな抗腫瘍治療戦略の開発をもたらしうる。
【０２７１】
材料及び方法
細胞培養
腎癌細胞系ＳＫ−ＲＣ−４９に、全長ＡＰＡ ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｇら、１９９８）をコードする発現ベクターをトランスフェクトした。細胞を、２ｍＭグルタミン、１％非必須アミノ酸、１％ビタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｔｕｌａｒｅ、ＣＡ）が補足されたＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）の中で維持した。安定的にトランスフェクトされた細胞を、Ｇ４１８含有培地中で維持した。ＨＵＶＥＣをコラゲナーゼ処理により単離し、１〜４代の間で使用した。細胞を、ゼラチンでコーティングされたプラスチック上で、２０％ＦＣＳ、ペニシリン（１００ Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）、ウシ脳抽出物（１００μｇ／ｍｌ）が補足されたＭ１９９培地（Ｓｉｇｍａ）の中で増殖させた。培地補助剤は、全て商業的に入手した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）。
【０２７２】
抗体及びペプチド
抗ＡＰＡ ｍＡｂ ＲＣ３８（Ｓｃｈｌｉｎｇｅｍａｎｎら、１９９６）を、トランスフェクトされた細胞溶解物からＡＰＡを免疫捕獲（ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ）するために使用した。ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）及び ＧＡＣＶＲＬＳＡＣＧＡ（配列番号：１２４）環状ペプチドを化学合成し、非還元条件下で自発的に環状化させ、質量分析（ＡｎａＳｐｅｃ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により精製した。ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチドの質量分析機分析は、おそらくは異なるジスルフィド結合の位置及びダイマーの形成を反映している６個の異なるピークを明らかにした。異なる画分のＡＰＡ酵素活性に対する生化学的挙動は類似していたため、下記の全ての手順において、６個のピークの混合物を使用した。
【０２７３】
ＡＰＡ免疫捕獲
セミコンフルエントのプレートから、１００ ｍＭ Ｎ−オクチル−β−グルコピラノシド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含む冷ＰＢＳへと細胞を剥離し、氷上で２時間溶解させ、１３，０００×ｇで１５分間遠心分離した。マイクロタイター丸底ウェル（Ｆａｌｃｏｎ）に、２μｇのＲＣ３８を室温で４時間コーティングし、室温で１時間、ＰＢＳ／３％ＢＳＡ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ＮＹ）でブロッキングし、その後、１５０μｌの細胞溶解物（１ｍｇ／ｍｌ）をｍＡｂでコーティングされたウェル上で４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ）で５回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０２７４】
ＡＰＡ酵素アッセイ
細胞及び免疫捕獲されたタンパク質を、リルン（Ｌｉｌｎ）ら（１９９８）に従い、特異的酵素活性について試験した。簡単に説明すると、接着細胞又はＲＣ３８で免疫捕獲された細胞の抽出物を、３ｍＭ α−Ｌ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド（Ｆｌｕｋａ）及び１ ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＰＢＳと共に、３７℃で２時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で４０５ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．）を読み取ることにより、酵素活性を決定した。
【０２７５】
細胞パニング
ＣＸ３ＣＸ３ＣＸ３Ｃ（Ｃはシステインであり、Ｘは任意のアミノ酸である）ライブラリを調製した（Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８）。ファージ粒子の増幅及び精製、並びにファージ表示された挿入物のＤＮＡ配列決定を、前記と同様にして実施した。２．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳとのインキュベーションにより細胞を脱離させ、結合培地（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び２％ＦＣＳが補足されたＤＭＥＭハイグルコース）で１回洗浄し、２×１０６細胞／ｍｌの濃度で同培地に再懸濁させた。１０１０ＴＵのファージを５００μｌの細胞懸濁液に添加し、混合物を穏和に回転させながら一晩（１回目）又は２時間（後続回）４℃でインキュベートした。細胞を室温で結合培地で５回洗浄し、１００μｌの同培地に再懸濁させた。１ｍｌの対数増殖期Ｋ９１ｋａｎ大腸菌を添加し、混合物を室温で１時間インキュベートすることにより、ファージをレスキューした。細菌を、１０ｍｌの０．２μｇ／ｍｌテトラサイクリンが補足されたＬＢ培地で希釈し、室温でさらに２０分間インキュベートした。段階希釈物を４０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＬＢプレートに播き、プレートを３７℃で一晩インキュベートした後、コロニーを計数した。
【０２７６】
ファージ結合特異性アッセイ
細胞パニングについて記載したようにして、１０９ＴＵの入力量を用いて細胞結合アッセイを実施した。増加性の濃度でＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチドを結合培地へ添加することにより、特異性を確認した。ファージを免疫捕獲されたＡＰＡと結合させるため、ウェルをＰＢＳ／３％ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングし、５０μｌのＰＢＳ／３％ＢＳＡ の中で１０９ＴＵと共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で８回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄した後、２００μｌの対数増殖期Ｋ９１ｋａｎ大腸菌を添加することにより、ファージをレスキューした。各実験を少なくとも３回繰り返した。
【０２７７】
ＡＰＡ結合ファージのインビボ腫瘍回帰
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５に由来する腫瘍異種移植片を、２ヶ月齢の雌ヌードマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）で確立した。マウスにアバーチン（Ａｖｅｒｔｉｎ）麻酔を施し、１０９ＴＵのファージを含む２００μｌ容量のＤＭＥＭを尾静脈から静脈注射した。ファージを５分間循環させ、５ｍｌのＤＭＥＭで心臓を通って動物を還流した。各マウスから腫瘍及び脳を切除し、計量し、等量の組織をホモジナイズした。組織ホモジネートを、プロテイナーゼ阻害剤カクテル及び０．１％ＢＳＡを含む氷冷ＤＭＥＭで３回洗浄した。結合したファージをレスキューし、細胞パニングについて記載したようにして計数した。Ｆｄ−ｔｅｔファージを、対照として同じ入力量で注射した。その実験を２回繰り返した。平行して、同組織試料の一部をブアン溶液で固定し、組織切片の調製のためパラフィン包埋した。Ｍ−１３ファージに対する抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を染色に使用した。
【０２７８】
細胞増殖アッセイ
ＨＵＶＥＣを含む完全Ｍ１９９培地を、４８ウェルプレート（１０４個／ウェル）に蒔き、２４時間付着させた。次いで、２％ＦＣＳを含むＭ１９９培地中で２４時間細胞を枯渇状態にした。ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチド又は対照ＧＡＣＶＲＬＳＡＣＧＡ（配列番号：１２４）ペプチド（１ ｍＭ）を含む、２％ＦＣＳ及び１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｂｉｎｇｄｏｍ、ＵＫ）を含む培地を、ウェルに添加した。示された時間インキュベートした後、細胞を２．５％グルタルアルデヒドで固定し、０．１％クリスタルバイオレットを含む２０％メタノールで染色し、１０％酢酸で可溶化した。全ての処理を３通り行った。細胞増殖は、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で５９０ｎｍのＯ．Ｄ．を測定することにより評価した。較正曲線を確立し、Ｏ．Ｄ．と細胞数との直線的な相関が、１０３〜１０５細胞で観察された。
【０２７９】
走化性アッセイ
細胞遊走アッセイは、ブリッソーニ（Ｂｕｓｓｏｌｉｎｉ）ら（１９９５）に従い、４８ウェルマイクロケモタキシスチャンバー（ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）において実施した。８μｍ孔を有する、ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、室温で１０分間１％ゼラチンでコーティングし、２％ＦＣＳが補足されたＭ１９９培地で平衡化した。ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチド又は対照ＧＡＣＶＲＬＳＡＣＧＡ（配列番号：１２４）ペプチド（１ｍＭ）を含む、２％ＦＣＳ及び１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）が補足されたＭ１９９培地を、ボイデンチャンバーの下室に置いた。一晩、枯渇状態にしたサブコンフルエントの培養物を、２．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに採集し、ＰＢＳで１回洗浄し、最終濃度２×１０６個／ｍｌで２％ＦＣＳを含むＭ１９９培地に再懸濁させた。フィルターを下チャンバーと上チャンバーの間に置いた後、５０μｌの細胞懸濁液を上室に蒔き、５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気中で３７℃で５時間、細胞を遊走させた。次いで、フィルターを除去し、上側の細胞を、ゴムポリスマンを用いて剥離した。遊走した細胞をメタノールで固定し、ギムザ溶液（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ、Ｂａｘｔｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｍｅ、Ｉｔａｌｙ）で染色した。各ウェル内の５個のランダムな高倍率視野（１００倍）を計数した。各アッセイを３通り実行した。
【０２８０】
三次元細胞培養
４８穴組織培養プレートのウェルに各１００μｌのマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を添加し、３７℃で１０分間、固体化させた。２％ＦＣＳが補足されたＭ１９９培地中で２４時間、ＨＵＶＥＣを枯渇状態にした後、２．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに採集した。１０４個の細胞を３通り各ウェルに穏和に添加し、３７℃で３０分間、ゲルコーティングへと接着させた。次いで、培地を、示された濃度のＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチド又はＧＡＣＶＲＬＳＡＣＧＡ（配列番号：１２４）ペプチドを含む完全培地に交換した。２４時間後、倒立顕微鏡（Ｃａｎｏｎ）を用いてプレートを写真撮影した。そのアッセイを３回繰り返した。
【０２８１】
ＣＡＭアッセイ
ＣＡＭアッセイ（Ｒｉｂａｔｔｉら、１９９４）によりインビボ血管新生を評価した。白色レグホンニワトリ由来の受精卵を一定の湿度で３７℃で維持した。インキュベーション３日目、卵殻に四角形の窓を開け、殻から発達中のＣＡＭを脱離させるために２〜３ｍｌの卵白を取り出した。同サイズのガラスプレートで窓を密封し、卵をインキュベーターに戻した。８日目、１ｍｍ３の滅菌したゼラチンスポンジ（Ｇｅｌｆｏａｍ、Ｕｐｊｏｈｎ Ｃｏ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、Ｍｉｌａｎ）に、ＶＥＧＦ−Ａ（２０ｎｇ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）と、ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）又は対照ＧＡＣＶＲＬＳＡＣＧＡ（配列番号：１２４）ペプチド（１ｍＭ）のいずれかとを含む３μｌのＰＢＳを吸収させ、無菌条件下で成長中のＣＡＭの頂部に移植した。１２日目まで毎日ＣＡＭを調査し、ライカ（Ｌｅｉｃａ）実体顕微鏡でインオボ（ｉｎ ｏｖｏ）で写真撮影した。スポンジから出現した毛細血管を計数した。そのアッセイを２回繰り返した。
【０２８２】
網膜血管新生の誘導
ＡＰＡヌルマウスは記載されている（Ｌｉｎら、１９９８）。Ｐ７（生後７日目）の仔マウスを授乳する母親と共に５日間７５％酸素に曝露した。Ｐ１２に正常酸素（大気）へとマウスを戻した。組織学的分析のため、Ｐ１７〜Ｐ２１にマウスを屠殺し、眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで＋４℃で一晩固定した。固定された眼をパラフィン包埋し、５μｍの連続切片を切り出した。切片をヘマトキシリン／エオシン（ｈ／ｅ）溶液で染色した。各眼について２０個のｈ／ｅ染色切片から、内境界膜の硝子体側の新生血管核を計数した。切片１個当たりの新生血管核数の平均値を計算し、スチューデントｔ検定を使用して動物群間で比較した。
【０２８３】
結果
ファージディスプレイによる細胞パニングによりＡＰＡ結合モチーフが選択される
ＡＰＡと結合することができるペプチドを同定するため、細胞をランダムペプチドファージライブラリでスクリーニングした。まず、天然コンフォメーションでのＡＰＡ発現のモデルを得るため、ＡＰＡを発現していないＳＫ−ＲＣ−４９腎癌細胞に、全長ＡＰＡ ｃＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの結果として発現されたＡＰＡは、ＡＰＡ酵素アッセイにより立証されたように機能的に活性であったが（示していない）、親ＳＫ−ＲＣ−４９細胞はＡＰＡの発現も活性も示さなかった（示していない）。
【０２８４】
非特異的結合を減少させるため、ＣＸ３ＣＸ３ＣＸ３Ｃファージライブラリ（１０１０形質導入単位［ＴＵ］）を親ＳＫ−ＲＣ−４９細胞に予備吸着させた。再懸濁させたＳＫ−ＲＣ−４９／ＡＰＡ細胞を、親細胞と結合しなかったファージでスクリーニングした。ＳＫ−ＲＣ−４９／ＡＰＡ結合ファージを増幅し、２回の連続的な選択のため使用した。ファージのＳＫ−ＲＣ−４９親細胞との結合と較べたファージのＳＫ−ＲＣ−４９／ＡＰＡ細胞との結合の増加が、２回目及び３回目に観察された（示していない）。
【０２８５】
それに続くファージの配列決定により、一般ライブラリ配列ＣＸ３ＣＸ３ＣＸ３Ｃのタンデム反復を含むペプチド挿入物
Figure 2004508045
の特異的な濃縮が明らかとなった。この配列は、２回目からランダムに選択され１８個のファージ挿入物の５０％を占め、３回目からのファージ挿入物の１００％を占めていた。２回目から得られた４個のペプチド挿入物は、タンデムファージとの配列類似性を有していた（表１２、太字フォント）。２回目ペプチドの中には、明らかに保存されているモチーフが他にもいくつか観察された（表１２、下線又はイタリック体）。これらのうちの１個は、タンデムリピート配列と一部重複していた。選択されたペプチドのヒトデータベースに対する配列相同性の検索は、有意な一致を与えなかった。
【０２８６】
【表１２】ＡＰＡ結合ペプチド配列
Figure 2004508045
【０２８７】
選択されたファージ挿入物は、特異的なＡＰＡリガンドである
ペプチド挿入物
Figure 2004508045
を表示しているファージを、個々にＡＰＡ結合に関して試験した。３個のファージは、全て、ＳＫ−ＲＣ−４９親細胞に対して６倍濃縮された類似のパターンで、特異的にＳＫ−ＲＣ−４９／ＡＰＡ細胞の表面と結合した（示していない）。対照の挿入物非含有ファージは、結合優先性を示さなかった（示していない）。２回目に選択されたＣＧＴＧＣＡＶＥＣＥＶＶＣ（配列番号：１２８）及びその他のファージは、ＳＫ−ＲＣ−４９／ＡＰＡ細胞との選択的結合を示さなかった（データは示していない）。ＡＰＡ結合ファージ挿入物を再現するコンセンサス配列を含む可溶性ペプチドＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）を合成した。
【０２８８】
ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチドの存在下で、ＣＰＫＶＣＰＲＥＣＥＳＮＣ（配列番号：１２７）ファージを用いて結合アッセイを実施した。可溶性ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチドは、ＳＫ−ＲＣ−４９／ＡＰＡ細胞との結合に関してＣＰＫＶＣＰＲＥＣＥＳＮＣ（配列番号：１２７）ファージと競合したが、ＳＫ−ＲＣ−４９親細胞との非特異的結合に対する効果は有していなかった（示していない）。無関係の環状ペプチドＧＡＣＶＲＬＳＡＣＧＡ（配列番号：１２４）は競合活性を有していなかった（示していない）。
Figure 2004508045
ファージの結合も、ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチドによって置換されたが、ＣＬＧＱＣＡＳＩＣＶＮＤＣ（配列番号：１２６）ファージの結合は影響を受けなかった（データは示していない）。
【０２８９】
選択されたペプチド挿入物の基質特異性をさらに確認するため、ｍＡＢ ＲＣ３８を用いた免疫捕獲により、ＡＰＡでトランスフェクトされた細胞の抽出物からＡＰＡを部分精製した。ＲＣ３８でコーティングされたマイクロウェルの上に固定化されたＡＰＡタンパク質は、酵素アッセイにより確認されたように機能性であった（示していない）。
Figure 2004508045
ファージは、ＲＣ３８免疫捕獲されたＳＫ−ＲＣ−４９親細胞由来細胞溶解物とのファージの結合と比較して１０〜１２倍の濃縮で、免疫捕獲されたＡＰＡと選択的に結合した（示していない）。
【０２９０】
ＡＰＡ結合ファージはインビボで腫瘍をターゲティングする
同定されたペプチドの、腫瘍へと回帰する能力を、ヒト乳房腫瘍異種移植片が移植されたヌードマウスをモデル系として使用して評価した。ファージを腫瘍保持マウスの尾静脈に注射し、組織ホモジネートからのファージ回収によりターゲティングを評価した。ＣＰＫＶＣＰＲＥＣＥＳＮＣ（配列番号：１２７）ファージは、対照として使用された脳組織と比較して腫瘍移植片において４倍濃縮されていた（図２２）。挿入物非含有ファージは、腫瘍をターゲティングしなかった（図２２）。ＣＹＮＬＣＩＲＥＣＥＳＩＣＧＡＤＧＡＣＷＴＷＣＡＤＧＣＳＲＳＣ（配列番号：１２５）ファージもＣＬＧＱＣＡＳＩＣＶＮＤＣ（配列番号：１２６）ファージも、腫瘍回帰優先性を示さなかった（データは示していない）。
【０２９１】
ＣＰＫＶＣＰＲＥＣＥＳＮＣ（配列番号：１２７）の回帰は、組織切片上の抗Ｍ１３免疫染色によって確認された（示していない）。腫瘍血管系には強いファージ染色が見られたが、正常血管系には見られなかった（示していない）。挿入物非含有ファージは、腫瘍血管と結合しなかった。
【０２９２】
ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）はＡＰＡ活性の特異的阻害剤である
ＡＰＡ酵素活性に対するＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）の効果を検討するため、ＳＫ−ＲＣ−４９／ＡＰＡ細胞を、増加性の濃度のＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチド又は対照ＧＡＣＶＲＬＳＡＣＧＡ（配列番号：１２４）ペプチドの存在下で、ＡＰＡ特異的基質α−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドと共にインキュベートした。３７℃での２時間のインキュベーションの後、比色アッセイにより酵素活性を評価した。ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）は、ＡＰＡ酵素活性を阻害し、試験された最高濃度では活性を６０％減少させた（図２３）。酵素阻害に関するＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）のＩＣ５０は、８００μＭと計算された。ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）は、近縁のプロテアーゼであるアミノペプチダーゼＮの活性には影響を与えなかった（データは示していない）。
【０２９３】
ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）は内皮細胞の遊走及び増殖を阻害する
抗血管新生薬としてのＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチドの可能性のある使用を決定した。まず、インビトロのＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチドによるＡＰＡ阻害の、ＶＥＧＦ−Ａ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激されたヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の遊走及び増殖に対する効果を調査した。ＨＵＶＥＣ上の機能性ＡＰＡの存在を、酵素アッセイにより評価した（示していない）。試験された最高濃度（１ｍＭ）において、ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチドは、ボイデンチャンバーアッセイにおいてＨＵＶＥＣの走化性を７０％阻害した（図２４）。同じペプチド濃度で、細胞増殖は５０％阻害された（図２５）。比較的低濃度のＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチド又はＧＡＣＶＲＬＳＡＣＧＡ（配列番号：１２４）対照ペプチドは、細胞の遊走及び増殖に対する有意な効果を有していなかった（示していない）。
【０２９４】
ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）はインビトロ及びインビボで血管新生を阻害する
異なるインビトロ及びインビボの血管新生モデルにおけるＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチドの阻害効果を調査した。三次元マトリックスゲル上に播かれたＨＵＶＥＣは、毛細血管様の構造へと分化し、インビトロ血管新生モデルを与える。増加性の濃度のＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチドは、このネットワークの形成の進行的な減損をもたらした（示していない）。１ｍＭのペプチド濃度で、血管様枝分かれ構造は、有意に少なく、かつ短くなり、結果として細胞は完全なネットワーク組織を形成することができなかった（示していない）。対照ペプチドＧＡＣＶＲＬＳＡＣＧＡ（配列番号：１２４）は、ＨＵＶＥＣ形態形成に影響を与えなかった（示していない）。
【０２９５】
一般的に使用されている単純化されたインビボ血管新生のモデルは、胚発生中に血管新生が刺激されうるニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）である。ゼラチンスポンジに吸収された適切な刺激は、新たな毛細血管のリモデリング及び分枝により達成される微小血管のスポンジそのものへの動員を誘導する。８日齢のニワトリ卵ＣＡＭをＶＥＧＦ−Ａ単独（２０ｎｇ）又はＶＥＧＦ−Ａ＋ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチド又はＧＡＣＶＲＬＳＡＣＧＡ（配列番号：１２４）ペプチド（１ｍＭ）で刺激した。１２日目にＣＡＭの写真を撮影した。ＶＥＧＦ−Ａにより誘導された血管新生は、スポンジから出現した毛細血管の数に基づき、ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）により４０％阻害された（表１３）。新生血管は、ＶＥＧＦ−Ａ刺激後に典型的に見られた高度に枝分かれした毛細血管構造を示さなかった（示していない）。対照ペプチドＧＡＣＶＲＬＳＡＣＧＡ（配列番号：１２４）又は比較的低いペプチド濃度のＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）による処理は、成長血管の数に対する効果を有していなかった（示していない）。
【０２９６】
【表１３】血管新生に関するＣＡＭアッセイ
Figure 2004508045
＊スチューデント−ニューマン−クールズ（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）検定によりｐ＜０．０１。結果は、２回の独立の実験からの平均値及び標準誤差として表されている。
【０２９７】
ＡＰＡ欠損マウスは、減損した血管新生を示す
未成熟マウスにおける低酸素網膜症のモデルにおいて、ＡＰＡ＋／−マウス及びＡＰＡ−／−ヌルマウスの血管新生能を調査した。相対的低酸素による網膜血管新生の誘導は、野生型マウスと比較してＡＰＡ＋／−マウスに既に存在していた（示していない）。ＡＰＡヌルマウスにおいて、血管新生はほぼ検出不可能であった（示していない）。血管新生は、低酸素眼の切片２０個から硝子体の突出している新生血管核を計数することにより定量した。Ｐ７〜Ｐ１２の７５％酸素処理の後、網膜血管新生の有意な誘導（眼切片１個当たり１６．１７±１．１９個の新生血管核）が生後１７日目（Ｐ１７）の野生型マウスにおいて見られた。Ｐ７〜Ｐ１２の７５％酸素曝露の後、Ｐ１７のＡＰＡ＋／−マウス（眼切片１個当たり１０．７６±１．０３個の新生血管核）及びＡＰＡヌルマウス（眼切片１個当たり４．２５±０．４５個の新生血管核）の網膜には、減少した量の新生血管核が見られた。
【０２９８】
考察
インビボで、ＡＰＡは、腫瘍を含む活性化された微小血管により過剰発現されているが、休止期血管系にはほぼ検出不可能であり、従って血管指向腫瘍療法のための適当な標的である。本実施例は、ＡＰＡの新規ターゲティングペプチドリガンドＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）を同定した。可溶性ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチドは、８００μＭのＩＣ５０でＡＰＡ酵素活性を阻害した。
【０２９９】
インビトロ血管新生モデルとして培養ＨＵＶＥＣを使用した場合、可溶性ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチドは、ＶＥＧＦ−Ａにより誘導されるＨＵＶＥＣの遊走及び増殖を阻害した。これらのデータは、血管新生中には内皮細胞の遊走及び増殖が必要であることと一致している。ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）は、マトリゲルモデルにおいても毛細血管様構造の形成を阻止し、ＶＥＧＦ−Ａにより刺激されたＣＡＭにおける血管新生を阻害した。
【０３００】
ＡＰＡヌルマウスは、野生型マウスと比較して有意に低い網膜血管新生を有していたため、ＡＰＡが、相対的低酸素により誘導された血管新生において重要な役割を果たしていることが示された。これらの結果は、腫瘍血管新生の阻害のための特異的な標的としてＡＰＡを使用することの可能性を増強する。
【０３０１】
要約すると、可溶性ペプチドＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）は、選択的なＡＰＡリガンドであり阻害剤である。ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）によるＡＰＡの阻害は、異なるインビトロ及びインビボのアッセイにおいて血管新生を阻害し、このことから、血管新生過程におけるＡＰＡの顕著な役割が初めて証明された。さらに、ＡＰＡ結合ファージは、腫瘍血管へと回帰することができ、このことは、ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）を腫瘍血管新生の阻害剤として治療的に使用することの可能性を示唆している。ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）の内因性類似体は、上に開示されたものと類似した、抗体に基づく精製又は同定の方法により同定されうる。
【０３０２】
実施例９． ＰＡＬＭによるファージライブラリのスクリーニング
特定の態様において、臓器または組織の不均一な試料から特定の細胞型を選択することができることが望ましい。そのような選択的サンプリングを行う一つの方法はＰＡＬＭ（レーザーマイクロビームによる位置決定と剥離）によることである。
【０３０３】
ＰＡＬＭロボットマイクロビームは、微量剥離のための正確なコンピューター誘導レーザーを用いる。パルス紫外線（ＵＶ）レーザーを顕微鏡にインターフェースで接続して、直径１マイクロメートル未満のビームスポットの大きさに対物鏡を通して焦点を合わせる。レーザー切断の原理は、加熱することなく局所的に制限された剥離的光分解プロセスである（Ｈｅｎｄｒｉｘ、１９９９）。有効なレーザーエネルギーは、微小な焦点スポットのみに濃縮され、ほとんどの生物学的物体は、適用されたレーザーの波長に関して透過性である。このシステムは、その後のファージ回収のために、同種の細胞集団、または単一の細胞もしくは細胞下構造を回収するための選択ツールであるように思われる。組織試料は、被験者にファージを投与後に選択域または単細胞を切除することによって回収してもよい。選択域と非選択域との明確なギャップが典型的に得られる。単離された組織標本は、対物平面から放射して、全く接触しないように、一般的な微量遠心管のキャップに直接発射することができる。このいわゆるレーザー圧発射（ＬＰＣ）方法の基礎は、正確に焦点を当てたレーザーマイクロビームの極めて高い光子密度によって引き起こされた標本の下で生じたレーザー圧力であると考えられる。この組織採取技術によって、ファージは微小切除技法から生き残って、救済することができる。
【０３０４】
ＰＡＬＭは、本実施例において、下記のようにマウス膵臓組織に関するターゲティングファージを選択するために用いた。
【０３０５】
材料および方法
インビトロおよびインサイチューパニング
ＣＸ７Ｃペプチドファージライブラリ（１０９ ＴＵ）を、Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスの尾静脈へ注射し、膵臓を採取して細菌感染によってファージを回収した。コロニー２４６個からのファージをＬＢ／カナマイシン（１００ μｇ／ｍｌ）／テトラサイクリン（４０ μｇ／ｍｌ）５ｍｌ中で３７℃の暗所で攪拌しながら個々に増殖させた。一晩培養物をプールして、ファージを別のインビボバイオパニングラウンドのためにＮａＣｌ／ＰＥＧ沈殿によって精製した。コロニー３００個を２回目のパニングラウンドから採取して、ファージを沈殿によって回収した。次に、２回目のバイオパニングラウンドからのファージをもう一回のバイオパニングラウンドのために用いて、同様に、一回のインサイチューパニングラウンドのために凍結融解したマウス膵臓切片と共にインキュベートした。
【０３０６】
３回目のインビボパニングラウンドにおいて、第二のラウンドからのファージ１０９ ＴＵを第三のマウスに注射して、６分間循環させた後、ＦＩＴＣ−レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）５０ μｌの静脈内注射を行った。２分間循環させた後、ＭＥＭ Ｅａｒｌｅ塩３ｍｌによってマウスの左心室を還流した。膵臓を採取して、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ（Ｓａｋｕｒａ）において−８０℃で凍結して、調製スライドガラス上で切片にした。
【０３０７】
第三のインサイチューラウンドに関して、第二のラウンドから単離した精製ファージを、融解したマウス膵臓切片４〜１４ μｍ切片と共に氷中で３０分間インキュベートした。切片を氷冷ＰＢＳ １００ μｌによって室温（ＲＴ）で８回すすいだ。結合したファージを、ＲＴで３０分間〜６０分間感染させるために、Ｋ９１ ＫａｎＲ（ＯＤ６００＝２．０３）１００ μｌを加えることによって各切片から回収した。感染したＫ９１ ＫａｎＲをそれぞれの切片から回収して、ＬＢ／Ｋａｎ／Ｔｅｔ（０．２ μｇ／ｍｌ）１０ ｍｌにおいて暗所で２０分間回復させた。各培養物からのアリコートをＬＢ／Ｋａｎ／Ｔｅｔ（４０ μｇ／ｍｌ）プレートに播種して、３７℃の暗所で一晩インキュベートした。各培養物の残りのテトラサイクリン濃度を４０ μｇ／ｍｌに増加して、ファージを増幅および精製するために培養物を３７℃の暗所で攪拌しながら一晩インキュベートした。
【０３０８】
ＤＮＡ増幅
ファージは、ＰＡＬＭ（レーザーマイクロビームによる位置決定と剥離）コールドレーザー圧発射システムを用いて１４ μｍ切片から微小切除した、凍結保存ＦＩＴＣ−レクチン染色マウス膵島および周辺の腺房から回収した。膵島および対照切片をｐＨ８の１ｍＭ ＥＤＴＡに発射して、ＰＣＲ増幅のために十分な材料が回収されるまで−２０℃で凍結した。ファージＤＮＡを、ｆＵＳＥ５プライマーを用いて増幅した。
Figure 2004508045
重なり合った組のプライマーを用いて、ＰＣＲ産物に、もう１回のＰＣＲラウンドを行った。第二のプライマーの組の３’末端に、配列決定目的のためにＭ１３リバースプライマーによってテールをつけた。用いた入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーセットは、
Figure 2004508045
であった。隣接するＳｆｉＩ制限部位を含むペプチド挿入物配列を作製するために、さらに２つのプライマーを用いた。
Figure 2004508045
入れ子プライマーから作製したＰＣＲ産物をゲル精製して（Ｑｉａｇｅｎ）、自動配列決定によってＭ１３リバースプライマーを用いてＣＸ７Ｃペプチド挿入物が存在することを確認した。ライブラリプライマーから生じたＰＣＲ産物をゲル精製して（Ｑｉａｇｅｎ）、ＣｓＣｌ２精製ｆＵＳＥ５／ＳｆｉＩにライゲーションして、エレクトロコンピテントＭＣ１０６１細胞にエレクトロポレーションして、ＬＢ／ストレプトマイシン（１００ μｇ／ｍｌ）／テトラサイクリン（４０ μｇ／ｍｌ）寒天プレート上に播種した。ゲル電気泳動によってＣＸ７Ｃ挿入物配列の存在を確認するために、単一のコロニーにｆＵＳＥ５プライマーを用いてコロニーＰＣＲを行った。陽性クローンをＢｉｇ Ｄｙｅターミネーター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて配列決定した。
【０３０９】
ファージ感染
膵島および対照切片を１ｍＭ ＡＥＢＳＦ、２０ μｇ／ｍｌアプロチニン、１０ μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭエラスターゼ阻害剤Ｉ、０．１ ｍＭ ＴＰＣＫ、１ｎＭペプスタチンＡのｐＨ ７．４のＰＢＳ溶液に入れて、十分な材料が収集されるまで４８時間またはそれ未満凍結させた。切片を氷中で融解して、容量をｐＨ ７．４のＰＢＳによって２００ μｌに調節した。試料をＫ９１ ＫａｎＲ（ＯＤ＝０．２２）１ｍｌと共にＲＴで旋回装置上で２時間インキュベートした。各培養物をＬＢ／Ｋａｎ／Ｔｅｔ（０．２ μｇ／ｍｌ）１．２ ｍｌに移して、ＲＴの暗所で４０分間インキュベートした。テトラサイクリンの濃度をそれぞれの培養物について４０ μｇ／ｍｌに増加して、培養物を攪拌しながら３７℃で一晩インキュベートした。翌日、各培養物をＬＢ／Ｋａｎ／Ｔｅｔ寒天プレートに播種して、３７℃の暗所で１４時間インキュベートした。陽性クローンをコロニーＰＣＲおよび自動配列決定のために採取した。
【０３１０】
結果
ＰＡＬＭを用いたインビボパニングの一般的スキームを、図２６に示す。最初のインビボ選択ラウンド後、ファージをバルク増幅するか、または膵臓、腎臓、肺、および副腎からファージの単一のコロニーを増幅して、インビボスクリーニングのさらなるラウンドを行った。マウス膵臓からのバルク増幅およびコロニー増幅ファージはいずれも、選択ラウンドが増加するにつれて連続的な濃縮を示した（示していない）。３回の選択ラウンドの後、コロニー増幅したファージは、バルク増幅したファージよりほぼ１次数高い濃縮を示した（示していない）。
【０３１１】
表１４は、膵臓スクリーニングによって同定された選択されたターゲティング配列およびコンセンサスモチーフを記載する。
【０３１２】
【表１４】膵臓のターゲティングペプチドとモチーフ
Figure 2004508045
Figure 2004508045
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【０３１３】
図２７は、ＰＡＬＭ選択薄切片材料からのファージ挿入物配列の回収の一般的プロトコールを示す。表記のように、ファージは、薄切片試料のプロテアーゼ消化後に大腸菌宿主細菌の直接感染によって回収してもよい。または、ファージ挿入物はＰＣＲ増幅によって回収してもよく、新しいベクターＤＮＡにクローニングした後、クローニングするために宿主細菌にエレクトロポレーションするか、または形質転換してもよい。
【０３１４】
ファージをＰＡＬＭ回収するいずれの方法も、膵ターゲティング配列の回収に成功した。直接細菌感染によって回収された膵配列には、
Figure 2004508045
が含まれた。ファージ挿入物の増幅およびファージへのクローニングによって回収された膵ターゲティング配列には、
Figure 2004508045
が含まれる。
【０３１５】
図２８〜図３１は、選択された膵ターゲティング配列に関して同定された配列相同性を示す。膵組織に存在することが知られているいくつかのタンパク質を同定した。本実施例の結果は、組織薄切片から細胞型を選択するため、およびターゲティングファージ配列を回収するためにＰＡＬＭ法を用いてもよいことを示している。当業者は、この方法は、異種臓器または組織における細胞の特定のタイプに向けられたターゲティング配列を得るために、実質的に任意の組織に用いることができることを認識するであろう。
【０３１６】
本明細書において開示および主張される組成物、方法、および装置は全て、本開示に照らして不適当な実験を行うことなく作製され、実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して説明してきたが、組成物、方法、および装置、ならびに本明細書に開示の段階、または段階の順序に変更を行ってもよく、それらも本発明の概念、趣旨、および範囲に含まれることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生理的に関連する特定の物質は、同じまたは類似の結果が得られれば、本明細書に記載の物質に置換してもよいことは明らかである。当業者に明らかであるそのような類似の置換基および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲、および概念の範囲内であるように思われる。
【０３１７】
参照
以下の参照は、これらが、例示的手法又は本明細書に記載されたもののその他の詳細を提供するという程度まで、本明細書において特に参照として組み入れられる。
Figure 2004508045
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【図面の簡単な説明】
添付の図面は、本明細書の一部であり、本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書に示す特定の態様の詳細説明と共にこれらの図面の一つまたは複数を参照することによってよりよく理解されるであろう。
【図１】胎盤回帰ファージの確認。実施例３で同定されたターゲティングペプチドを保持するファージを、妊娠マウスに注射し、胎盤からの回収率を、ターゲティング配列を含まない対照ｆｄ−ｔｅｔファージと比較した。胎盤回帰ファージクローンは、ＰＡ− ＴＰＫＴＳＶＴ（配列番号：３９）、ＰＣ−ＲＡＰＧＧＶＲ（配列番号：４１）、ＰＥ−ＬＧＬＲＳＶＧ（配列番号：４４）、ＰＦ−ＹＩＲＰＦＴＬ（配列番号：４３）であった。
【図２】脂肪回帰ペプチドの確認。実施例４で同定されたターゲティングペプチドを保持するファージを、妊娠マウスに注射し、脂肪組織からの回収率を、ターゲティング配列を含まない対照ｆｄ−ｔｅｔファージと比較した。
【図３】ＢＲＡＳＩＬを使用したインビトロの脾臓ターゲティング。Ｆａｂクローン＃２、＃６、＃１０、及び＃１２、並びに対照ＦａｂクローンＮＰＣ−３ＴＴの結合を、対照Ｆｄ−ｔｅｔファージと比較した。
【図４】ＢＲＡＳＩＬを使用したインビトロの脾臓ターゲティング。Ｆａｂクローン＃２、＃６、＃１０、及び＃１２、並びに対照ＦａｂクローンＮＰＣ−３ＴＴの結合を、相互に直接比較した。
【図５】ＢＲＡＳＩＬを使用したインビボの脾臓ターゲティング。Ｆａｂクローン＃２、＃６、＃１０、及び＃１２の結合を、Ｆｄ−ｔｅｔファージの結合と比較した。
【図６】ＢＲＡＳＩＬを使用したインビボの脾臓ターゲティング。Ｆａｂクローン＃１０の脾臓組織との結合を、Ｆａｂ対照クローンＮＰＣ−３ＴＴ及びＦｄ−ｔｅｔファージの結合と比較した。
【図７】Ｆｄ−ｔｅｔファージと比較したＦａｂクローン＃１０の、脾臓との結合（骨髄との比較）。
【図８】抗カポジ肉腫ライブラリ由来のＦａｂクローンの、血管新生網膜（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｒｅｔｉｎａ）との結合。
【図９】β３細胞質ドメインで選択されたファージの、固定化されたタンパク質との結合。ＧＳＴ融合タンパク質又はＧＳＴ単独を、１０μｇ／ｍｌでマイクロタイターウェルにコーティングし、エンドスタチンターゲティングペプチドを発現するファージを結合させるために使用した。表示されたペプチド配列によって、各ファージを同定した：ＧＬＤＴＹＲＧＳＰ（配列番号：９６）；ＹＤＷＷＹＰＷＳＷ（配列番号：９５）；ＣＬＲＱＳＹＳＹＮＣ（配列番号：１０４）；ＳＤＮＲＹＩＧＳＷ（配列番号：９７）；ＣＥＱＲＱＴＱＥＧＣ（配列番号：９３）；ＣＦＱＮＲＣ（配列番号：１０２）。データは、３通りのウェルからの平均コロニー数を、平均値の１０％未満の標準誤差と共に表している。
【図１０】β５細胞質ドメインで選択されたファージの、固定化されたタンパク質との結合。ＧＳＴ融合タンパク質又はＧＳＴ単独を、１０μｇ／ｍｌでマイクロタイターウェルにコーティングし、エンドスタチンターゲティングペプチドを発現するファージを結合させるために使用した。表示されたペプチド配列によって、各ファージを同定した：（Ａ） ＤＥＥＧＹＹＭＭＲ（配列番号：１１０）；（Ｂ） ＫＱＦＳＹＲＹＬＬ（配列番号：１１１）；（Ｃ）ＣＥＰＹＷＤＧＷＦＣ（配列番号：１０６）；（Ｄ） ＶＶＩＳＹＳＭＰＤ（配列番号：１１２）；及び（Ｅ）ＣＹＩＷＰＤＳＧＬＣ（配列番号：１０５）。データは、３通りのウェルからの平均コロニー数を、平均値の１０％未満の標準誤差と共に表している。
【図１１】細胞質ドメイン結合ファージの、β３固定化タンパク質との結合、及び合成ペプチドによる阻害。増加性の濃度の対応する合成ペプチド又は対照ペプチドの存在下で、ＧＳＴ−β３ｃｙｔｏでコーティングされたウェル上でファージをインキュベートした。データは、３通りのウェルからの平均コロニー数を、平均値の１０％未満の標準誤差と共に表している。
【図１２】細胞質ドメイン結合ファージの、β５固定化タンパク質との結合、及び合成ペプチドによる阻害。増加性の濃度の対応する合成ペプチド又は対照ペプチドの存在下で、ＧＳＴ−β５ｃｙｔｏでコーティングされたウェル上でファージをインキュベートした。データは、３通りのウェルからの平均コロニー数を、平均値の１０％未満の標準誤差と共に表している。
【図１３】リン酸化後のファージの、固定化されたβ３−ＧＳＴ及びβ５−ＧＳＴとの結合。ファージをＦｙｎキナーゼでリン酸化した。挿入物非含有ファージを、対照として使用した。ＧＳＴ−β３ｃｙｔｏ又はＧＳＴ−β５ｃｙｔｏでコーティングされたウェル上でファージをインキュベートした。データは、３通りのウェルからの平均コロニー数を、平均値の１０％未満の標準誤差と共に表している。
【図１４】リン酸化後のファージの、固定化されたＧＳＴ融合タンパク質との結合。ファージをＦｙｎキナーゼでリン酸化した。挿入物非含有ファージを、対照として使用した。ＧＳＴ細胞質ドメインでコーティングされたウェル上でファージをインキュベートした。データは、３通りのウェルからの平均コロニー数を、平均値の１０％未満の標準誤差と共に表している。
【図１５】インテグリン細胞質ドメイン結合ペプチドの、細胞増殖に対する効果。血清枯渇細胞を２４時間培養し、［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ｍｌ）取り込み測定により増殖を判定した。陽性対照においては、血清枯渇細胞にＶＥＧＦを戻し添加した。各実験を３通り３回実施し、結果を平均値±ＳＤとして表した。
【図１６】ペネトラチンペプチドキメラの、内皮細胞遊走に対する効果。細胞遊走アッセイを、４８ウェル微小走化性（ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）チャンバーで実施した。各ウェルにおいて、５個の無作為な高倍率視野（４０倍）を計数した。結果は、両方のβ３インテグリン細胞質ドメイン結合ペプチド（Ｙ−１８及びＴＹＲ−１１）が細胞遊走を増加させる一方で、ペネトラチンが細胞に影響を与えなかったことを示している。
【図１７】β５細胞質ドメインと結合するペネトラチンペプチドキメラは、プログラム細胞死を誘導する。１０６個のＨＵＶＥＣ細胞を完全培地中で採集し、１５μＭのペネトラチンペプチドキメラを細胞へ添加した。４時間後、８時間後、及び１２時間後に、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、アポトーシス誘導を細胞数測定分析により分析した。ａ）２４時間後に枯渇細胞を用いて得られたプロファイル。ｂ）完全培地中のコンフルエント細胞。ｃ）４時間後の１５μＭのペネトラチン。ｄ）４時間後の１５μＭのＶＩＳＹ−ペネトラチンキメラ。８時間後及び１２時間後に分析された細胞は、Ｇ０／Ｇ１比の類似したプロファイルを示した。
【図１８】β３又はβ５で選択されたファージに対して産生された抗体の特異性（ＥＬＩＳＡ）。ＫＬＨと接合したＧＬＤＴＹＲＧＳＰ（配列番号：９６）又はＳＤＮＲＹＩＧＳＷ（配列番号：９７）による３回の免疫後に得られた増加性の希釈率の血清を、１０μｇのＳＤＮＲＹＩＧＳＷ（配列番号：９７、Ｙ−１８）、ＧＬＤＴＹＲＧＳＰ（配列番号：９６、ＴＹＲ−１１）、又は対照ペプチドでコーティングされたマイクロタイターウェル上でインキュベートした。対照として免疫前血清を用いた。ヤギＨＲＰ抗ウサギ抗体とのインキュベーション後、ＯＤを４０５ｎｍで測定した。データは、３通りウェルからの平均値を、１０％未満の標準誤差と共に表している。
【図１９】β３又はβ５で選択されたファージに対して産生された抗体の特異性（ＥＬＩＳＡ）。ＫＬＨと接合したＳＤＮＲＹＩＧＳＷ（配列番号：９７、Ｙ−１８）又はＧＬＤＴＹＲＧＳＰ（配列番号：９６、ＴＹＲ−１１）による３回の免疫後に得られた血清を、１０μｇのＴＹＲ−１１又はＹ−１８でコーティングされたマイクロタイターウェルにおいてインキュベートした。ＧＬＤＴＹＲＧＳＰ（配列番号：９６）又はＳＤＮＲＹＩＧＳＷ（配列番号：９７）及び対照ペプチドを溶液に添加した。ヤギＨＲＰ抗ウサギ抗体とのインキュベーションの後、ＯＤを４０５ｎｍで測定した。データは、３通りのウェルからの平均値を、１０％未満の標準誤差と共に表している。溶液に添加されたペプチドは、固定化されたペプチドとの反応性を特異的に阻止する。
【図２０】図２０Ａは、ＶＩＳＹペプチドとの、アネキシンＶのβ５インテグリンへの競合的結合を示す。結合アッセイをＥＬＩＳＡにより実施した。図２０Ｂは、抗アネキシンＶ抗体の精製アネキシンＶタンパク質及びＶＩＳＹペプチドへの結合の相対レベルを示す。
【図２１】ペネトラチン（アンテナペディア）と連結されたＶＩＳＹペプチドを含むキメラペプチドは、アポトーシスを誘導する。ＶＩＳＹにより誘導されたアポトーシスは、カスパーゼ阻害剤（ｚＶＡＤ）の添加により阻害された。
【図２２】ＡＰＡ結合ファージは腫瘍と特異的に結合する。等量のファージをＭＤＡ−ＭＢ−４３５由来腫瘍を保持するマウスの尾静脈へ注射し、灌流後、ファージを回収した。３通りの播種からの、腫瘍又は対照組織（脳）より回収されたファージの平均値及び標準誤差が、示されている。
【図２３】ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）は、ＡＰＡ活性の特異的阻害剤である。増加性の濃度のＧＡＣＶＲＬＳＡＣＧＡ（配列番号：１２４）ペプチド（対照）又はＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチドのいずれかの存在下で、ＡＰＡ酵素活性をアッセイした。ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）によるＡＰＡ阻害に関するＩＣ５０は、８００μＭにおいて推定された。エラーバーは、３通りのウェルの平均値の標準誤差である。実験は、３回繰り返され、類似の結果を示した。
【図２４】ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）は、ＨＵＶＥＣ遊走を阻害する。ＨＵＶＥＣをＶＥＧＦ−Ａ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。アッセイを、Ｂｏｙｄｅｎ微小走化性チャンバーにおいて実施し、３７℃で５時間、８μｍ孔フィルターを介して細胞を遊走させた。ＧＡＣＶＲＬＳＡＣＧＡ（配列番号：１２４）ペプチド（対照）及びＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）ペプチドを、１ｍＭという濃度で試験した。遊走した細胞を染色し、各マイクロウェルについて５個の高倍率視野（１００倍）を計数した。エラーバーは、３通りのマイクロウェルの平均値の標準誤差である。
【図２５】ＣＰＲＥＣＥＳＩＣ（配列番号：１２３）は、ＨＵＶＥＣ増殖を阻害する。細胞をＶＥＧＦ−Ａ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、表記の時点において、クリスタルバイオレット染色に基づく比色アッセイにより増殖を評価した。エラーバーは、３通りのウェルの平均値の標準誤差である。各実験は、少なくとも２回繰り返され、類似の結果を示した。
【図２６】マウス膵臓、腎臓、肝臓、肺、及び副腎内でターゲティングされるファージ用のインビボバイオパニングのプロトコル。
【図２７】大腸菌の感染によるファージの回収、又は増幅及びサブクローニングによるファージＤＮＡの回収のプロトコル。
【図２８】膵島ターゲティングペプチド及び相同タンパク質。標準的な相同性検索により同定される、以下の膵島ターゲティングペプチドにより模倣された内因性タンパク質候補：ＣＶＳＮＰＲＷＫＣ（配列番号：１９７）、ＣＶＰＲＲＷＤＶＣ（配列番号：１９４）、ＣＱＨＴＳＧＲＧＣ（配列番号：１９５）、及びＣＲＡＲＧＷＬＬＣ（配列番号：１９６）。
【図２９】膵島ターゲティングペプチド及び相同タンパク質。標準的な相同性検索により同定される、以下の膵島ターゲティングペプチドにより模倣された内因性タンパク質候補：ＣＧＧＶＨＡＬＲＣ（配列番号：１７５）、ＣＦＮＲＴＷＩＧＣ（配列番号：１９８）、及びＣＷＳＲＱＧＧＣ（配列番号：２００）。
【図３０】膵島ターゲティングペプチド及び相同タンパク質。標準的な相同性検索により同定される、以下の膵島ターゲティングペプチドにより模倣された内因性タンパク質候補：ＣＬＡＳＧＭＤＡＣ（配列番号：２０４）、ＣＨＤＥＲＴＧＲＣ（配列番号：２０５）、ＣＡＨＨＡＬＭＥＣ（配列番号：２０６）、及びＣＭＱＧＡＲＴＳＣ（配列番号：２０８）。
【図３１】膵島ターゲティングペプチド及び相同タンパク質。標準的な相同性検索により同定される、以下の膵島ターゲティングペプチドにより模倣された内因性タンパク質候補：ＣＨＶＬＷＳＴＲＣ（配列番号：２０１）、ＣＭＳＳＰＧＶＡＣ（配列番号：２０３）、及びＣＬＧＬＬＭＡＧＣ（配列番号：２０２）。[0001]
Background of the Invention
This application claims priority from US Provisional Patent Application Ser. No. 60 / 231,266 filed Sep. 8, 2000 and US Patent Application No. 09 / 765,101 filed Jan. 17, 2001. Insist. This invention is supported by the U.S. Army grants DAMD 17-98-1-8041 and 17-98-1-8581 and the United States National Institutes of Health grants 1R01CA78512-01A1, 1R1CA90810-01, and 1RO1CA82976-01. It was made in response to. The United States government has certain rights in the invention.
[0002]
1. Field of the invention
The present invention relates to the field of targeted delivery of molecular drugs and therapeutic agents. More specifically, the invention relates to compositions and methods for the identification and use of peptides that selectively target organs, tissues, or cell types in vivo or in vitro.
[0003]
2. Description of related technology
Therapeutic treatment of many disease states is limited by the systemic toxicity of the therapeutic agent used. Cancer therapeutics exhibit particularly low therapeutic indices, and rapidly growing normal tissues such as skin and bone marrow are affected by concentrations of the drug that are not as high as those used to kill tumor cells. The treatment of cancer and other organ, tissue, or cell type limited diseases is greatly facilitated by developing compositions and methods for targeted delivery of therapeutic agents to desired organs, tissues, or cell types. Will.
[0004]
Recently, an in vivo selection system using a phage display library to identify organ, tissue, or cell type targeting peptides in a mouse model system has been developed. Phage display libraries expressing transgenic peptides on the surface of bacteriophage were originally developed to map the epitope binding sites of immunoglobulins (Smith and Scott, 1986, 1993). Such a library inserts random oligonucleotides into the cDNA encoding the phage surface protein and adds 10 unique peptides.9It can be made by creating a collection of phage particles shown in individual permutations (Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Arap et al., 1998a; Arap et al., 1998b).
[0005]
After intravenous administration of the phage display library to mice, phage recovery from individual organs was performed (Pasqualini and Ruoslahti, 1996). Based on the specific targeting peptide sequences expressed on the outer surface of the phage, phage were recovered that can selectively regress to the vascular bed of different mouse organs, tissues, or cell types (Pasqualini and Ruoslahti, 1996). . A variety of organ and tumor regression peptides have been identified by this method (Rajotte et al., 1998, 1999; Koivunen et al., 1999; Burg et al., 1999; Pasqualini, 1999). Each of these targeting peptides bound to a different receptor that was selectively expressed on blood vessels in mouse target tissues (Pasqualini, 1999; Pasqualini et al., 2000; Folkman, 1995; Folkman, 1997). Tumor regression peptides bound to receptors that were upregulated in tumor neovasculature in mice (Brooks et al., 1994; Pasqualini, 2000). In addition to identifying individual targeting peptides that are selective for organs, tissues, or cell types (Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Arap et al., 1998a; Koivunen et al., 1999), the system is expressed in mice in vivo. (Rajotte and Ruoslahti, 1999).
[0006]
Upon binding of the therapeutic agent to the targeting peptide, the active agent is selectively delivered to the desired organ, tissue, or cell type in a mouse model system. Targeted delivery of chemotherapeutic agents and pro-apoptotic peptides to receptors present in tumor neovasculature results in a marked increase in therapeutic efficacy and reduced systemic toxicity in a tumor-bearing mouse model (Arap et al., 1998a, 1998b; Ellerby et al.). , 1999).
[0007]
In some cases, conventional in vivo phage display screening methods have resulted in a relatively high background of non-specific phage binding. This was especially true for tissues belonging to the retinal endothelial system. There is a need for improved phage display methods that reduce non-specific phage binding while retaining specific interaction of the targeting peptide with the cell receptor. There is also a need to target receptors for specific cell populations within an organ, tissue, or cell type. Often, tissues or organs comprise a highly heterogeneous population of various cell types. There is a need for the ability to target phage display screens to specific cell populations.
[0008]
Similarly, there is a need to identify receptor-ligand pairs in organs and tissues. Previous attempts to identify the targeted receptor and ligand binding to the receptor have primarily targeted a single ligand at a time for testing. The identification of previously unknown receptors and uncharacterized ligands has been a very slow and laborious process. Such novel receptors and ligands can be used in diverse disease states such as diabetes mellitus, inflammatory diseases, arthritis, atherosclerosis, cancer, autoimmune diseases, bacterial infections, viral infections, cardiovascular diseases, or degenerative diseases. May provide a basis for new treatments for
[0009]
Summary of the Invention
The present invention fulfills a long-felt need in the art by providing compositions and methods for identifying and using targeting peptides that are selective for organs, tissues, or cell types. In some embodiments, the method comprises a selective interaction ligand, a novel phage display method that reduces the background of non-specific phage binding while retaining selective binding of phage to cell receptors And Rapid Analysis of Selective Interacting Ligands (BRASIL). In preferred embodiments, the targeting peptide comprises exposing the subject to a phage display library, collecting a sample of one or more organs, tissues, or cell types, isolated cells or small cells suspended in an aqueous phase. Separating the sample into clumps, overlaying the aqueous phase on top of the organic phase, centrifuging the two phases so that cells are pelleted to the bottom of the centrifuge tube, and collecting phage from the pellet Is identified by In a further preferred embodiment, the organic phase is dibutyl phthalate.
[0010]
In other embodiments, phage that bind to a target organ, tissue, or cell type, eg, placenta, can be pre-screened or post-screened against subjects lacking that organ, tissue, or cell type. Phage that bind to a subject lacking the target organ, tissue, or cell type are removed from the library prior to screening in subjects possessing the organ, tissue, or cell type. In a preferred embodiment, the organ, tissue, or cell type is placenta or adipose tissue.
[0011]
In a preferred embodiment, the targeting phage can be recovered from a specific cell type or subtype present in an organ or tissue after selection of the cell type by PALM (Positioning and Ablation with Laser Microbeams). PALM allows the selection of a specific cell type, for example, from a slice of an organ or tissue. Phage can be recovered from the selected sample.
[0012]
In another embodiment, a phage display library displaying the antigen binding portion of an antibody is prepared from a subject, the library is screened for one or more antigens, and phage that bind to the antigen are collected. In a more preferred embodiment, the antigen is a targeting peptide.
[0013]
In certain embodiments, the methods and compositions can be used to identify one or more receptors for a targeting peptide. In another aspect, the compositions and methods can be used to identify a naturally occurring ligand for a known or newly identified receptor.
[0014]
In some embodiments, the methods of the invention comprise contacting the targeting peptide with an organ, tissue, or cell containing the receptor of interest, binding the peptide to the receptor, and binding the receptor to the peptide by binding the receptor to the peptide. May be identified. In a preferred embodiment, the targeting peptide is selected from any of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 125 to SEQ ID NO: 251. Contains at least three consecutive amino acids. In another preferred embodiment, the targeting peptide comprises a portion of an antibody to the receptor. In another embodiment, the targeting peptide may include a random amino acid sequence. One skilled in the art will recognize that the step of contacting can utilize an organ, tissue, or cell, or may utilize a homogenate or detergent extract of the organ, tissue, or cell. In certain embodiments, the cells to be contacted may be engineered to express a suspected receptor for the targeting peptide. In a preferred embodiment, the targeting peptide is modified by a reactive moiety that allows its covalent attachment to the receptor. In a more preferred embodiment, the reactive moiety is a photoreactive group that becomes covalently linked to the receptor when activated by light. In another preferred embodiment, the peptide is bound to a solid support and the receptor is purified by affinity chromatography. In other preferred embodiments, the solid support is a magnetic bead, sepharose bead, agarose bead, nitrocellulose membrane, nylon membrane, column chromatography matrix, high performance liquid chromatography (HPLC) matrix, or fast performance liquid chromatography. (FPLC) matrix. In certain embodiments, the targeting peptide, when bound to the receptor, inhibits the activity of the receptor. One skilled in the art will recognize that the activity of the receptor can be assayed by a variety of methods known in the art, including, but not limited to, catalytic activity and binding activity. In another preferred embodiment, the receptor is an endostatin receptor, a metalloprotease or an aminopeptidase.
[0015]
In an alternative embodiment, one or more ligands for the receptor of interest may be identified by the disclosed methods and compositions. One or more targeting peptides that mimic some or all of the naturally occurring ligands may be identified by phage display and biopanning in vivo or in vitro. Naturally occurring ligands may be identified by a single targeting peptide that binds to the receptor, or by homology with a consensus motif of the sequence that binds to the receptor. In another alternative embodiment, antibodies may be prepared against one or more targeting peptides that bind to the receptor of interest. Such antibodies may be used for identification of the original ligand or for immunoaffinity purification.
[0016]
In certain embodiments, the targeting peptides of the invention are used to selectively deliver therapeutic agents, including but not limited to gene therapy vectors and fusion proteins, to specific organs, tissues, or cell types in a subject. . One of skill in the art will recognize that the scope of the claimed methods used also includes any disease state that can be treated by targeted delivery of a therapeutic agent to the desired organ, tissue, or cell type. Will do. Such disease states include those in which the diseased cells are restricted to a particular organ, tissue, or cell type, such as non-metastatic cancer, but include other disease states in the organ, tissue, or Treatment may be by a cell-type targeting approach.
[0017]
One embodiment of the present invention is selected from any of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 125 to SEQ ID NO: 251. It relates to an isolated peptide of 100 or less amino acids in size, comprising at least 3 consecutive amino acids of the targeting peptide sequence.
[0018]
In a preferred embodiment, the isolated peptide comprises 50 or less amino acids, more preferably 30 or less amino acids, more preferably 20 or less amino acids, more preferably 10 or less amino acids, or even more preferably Is 5 or fewer amino acids in size. In another preferred embodiment, the isolated peptide of claim 1 comprises SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 125 to SEQ ID NO: 251 of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 of a targeting peptide sequence selected from any of , 23, 24, or 25 contiguous amino acids.
[0019]
In certain embodiments, the isolated peptide binds to the molecule. In a preferred embodiment, the bond is a covalent bond. In a further aspect, the molecule is a drug, chemotherapeutic agent, radioisotope, pro-apoptotic agent, anti-angiogenic agent, hormone, cytokine, growth factor, cytotoxic agent, peptide, protein, antibiotic, antibody, Fab fragment of an antibody. , Survival factors, anti-apoptotic agents, hormone antagonists, contrast agents, nucleic acids or antigens. Those molecules are given for illustrative purposes only. Molecules within the scope of the invention include virtually any molecule that binds to a targeting peptide and may be administered to a subject. In a preferred embodiment, the pro-apoptotic agent is gramicidin, magainin, melittin, defensin, cecropin, (KLAKLAK)2(SEQ ID NO: 1), (KLAKKKLA)2(SEQ ID NO: 2), (KAAKKAA)2(SEQ ID NO: 3) or (KLGKKLG)3(SEQ ID NO: 4). In another preferred embodiment, the anti-angiogenic agent is angiostatin 5, pigment epithelium-derived factor, angiotensin, laminin peptide, fibronectin peptide, plasminogen activator inhibitor, tissue metalloproteinase inhibitor, interferon, interleukin 12, Platelet factor 4, IP-10, Gro-β, thrombospondin, 2-methoxyestradiol, proliferin-related protein, carboxamide triazole, CM101, marimastat, pentosan polysulfate, angiopoietin 2 (regeneron), interferon-α, herbimycin A, PNU145156E, 16K prolactin fragment, linomid, thalidomide, pentoxifylline, genistein, TNP-470, endostatin, paclitaxi Cells, doxetaxel, polyamines, proteasome inhibitors, kinase inhibitors, signaling inhibitors (SU5416, SU6668, Sugen, South San Francisco, CA), accutin, cidofovir, vincristine, bleomycin, AGM-1470, platelet factor 4 or minocycline is there. In a further preferred embodiment, the cytokine is interleukin 1 (IL-1), IL-2, IL-5, IL-10, IL-11, IL-12, IL-18, interferon-γ (IF-γ), IF-α, IF-β, tumor necrosis factor-α (TNF-α), or GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor). Such examples are merely representative and are not to be construed as excluding other pro-apoptotic agents, anti-angiogenic agents, or cytokines known in the art.
[0020]
In other embodiments, the isolated peptide binds to a macromolecular complex. In a preferred embodiment, the bond is a covalent bond. In other preferred embodiments, the macromolecular complex is a virus, bacteriophage, bacteria, liposome, microparticle, magnetic bead, yeast cell, mammalian cell, cell, or microdevice. These are shown for illustrative purposes only. Polymer conjugates within the scope of the present invention include virtually any polymer conjugate that may bind to the targeting peptide and be administered to a subject. In another preferred embodiment, the isolated peptide is linked to a eukaryotic expression vector, more preferably a gene therapy vector.
[0021]
In another embodiment, the isolated peptide is a solid support, preferably a magnetic bead, sepharose bead, agarose bead, nitrocellulose membrane, nylon membrane, column chromatography matrix, high performance liquid chromatography (HPLC) matrix, or fast performance. It binds to liquid chromatography (FPLC).
[0022]
A further aspect of the present invention provides a sequence selected from any of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 125 to SEQ ID NO: 251. A fusion protein comprising at least three contiguous amino acids of
[0023]
Another particular embodiment relates to a composition comprising the claimed isolated peptide or fusion protein in a pharmaceutically acceptable carrier. A further aspect relates to a kit comprising the claimed isolated peptide or fusion protein in one or more containers.
[0024]
Other embodiments include selecting a targeting peptide for a desired organ, tissue, or cell type, coupling the targeting peptide to a molecule, macromolecular conjugate, or gene therapy vector, and the molecule, conjugate described above. Or providing the above-described peptide conjugated to a vector to a subject. Preferably, the targeting peptide is at least a contiguous amino acid from any of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 125 to SEQ ID NO: 251. It is selected to include three. In certain preferred embodiments, the organ, tissue, or cell type is bone marrow, lymph node, prostate cancer, or prostate cancer that has metastasized to the bone marrow. In other preferred embodiments, the molecule attached to the targeting peptide is a chemotherapeutic, antigen, or contrast agent. One of skill in the art, within the scope of this specification, can target any organ, tissue, or cell type for delivery using a targeting peptide conjugated to any molecule, macromolecular complex, or gene therapy vector. You will recognize that.
[0025]
Another aspect of the invention relates to an isolated nucleic acid encoding a targeting peptide having a size of 300 nucleotides or less. In a preferred embodiment, the isolated nucleic acid is 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50, 40, 30, 20, or 10 nucleotides or less in size. In other preferred embodiments, the isolated nucleic acid is incorporated into a eukaryotic or prokaryotic expression vector. In an even more preferred embodiment, the vector is a plasmid, cosmid, yeast artificial chromosome (YAC), bacterial artificial chromosome (BAC), virus or bacteriophage. In another preferred embodiment, the isolated nucleic acid is operably linked to a leader sequence that localizes the expressed peptide to the extracellular surface of a host cell.
[0026]
Further aspects of the invention include selecting a targeting peptide that targets cells associated with the disease state, coupling one or more molecules effective to treat the disease state to the peptide, and determining the disease state. Administering a peptide to a subject having the disease. Preferably, the targeting peptide is selected from any of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 125 to SEQ ID NO: 251. At least three consecutive amino acids are included. In a preferred embodiment, the disease state is diabetes mellitus, inflammatory disease, arthritis, atherosclerosis, cancer, autoimmune disease, bacterial infection, viral infection, cardiovascular disease, or degenerative disease.
[0027]
Another aspect of the invention relates to compositions and methods using tumor targeting peptides for cancer. Tumor targeting peptides identified by the methods disclosed in this application may be conjugated to a therapeutic agent, including but not limited to molecules or macromolecules, and administered to a subject with cancer, and the efficacy of the therapeutic agent Provides increased and reduced systemic toxicity. Therapeutic agents within the scope of the present invention include, but are not limited to, chemotherapeutic agents, radioisotopes, apoptosis promoters, cytotoxic agents, cell suppressants, and gene therapy vectors. Targeted delivery of such therapeutic agents to tumors is a significant improvement over the prior art with respect to reducing inappropriate delivery of drugs to normal organs and tissues of patients while increasing drug delivery to tumors I will provide a. In a preferred embodiment, the tumor targeting peptide is incorporated into a phage gene therapy vector capsule to target phage delivery to neovascular endothelial cells of tumor vessels.
[0028]
Particular aspects relate to methods of obtaining antibodies to an antigen. In a preferred embodiment, the antigen comprises one or more targeting peptides. A targeting peptide is prepared, immobilized on a solid support, and serum containing the antibody is added to recover antibodies that bind to the targeting peptide.
[0029]
Description of exemplary embodiments
As used herein, “a” (“a” or “an”) may mean one or more. As used in the claims of the present invention, in connection with the term "comprising", "one" ("a" or "an") may mean one or more. As used in the present invention, "another" may mean at least a second or more items.
[0030]
A "targeting peptide" is a peptide comprising a contiguous sequence of amino acids, characterized by selective translocation to an organ, tissue, or cell type. Selective translocation can be determined, for example, by the methods disclosed below, which incorporate the putative targeting peptide sequence into a protein displayed on the outer surface of the phage. After administering to a subject a library of such phage that has been genetically modified to express a large number of such targeting peptides of different amino acid sequences, one or more organs, tissues, or cell types are obtained from the subject. Collect and identify phage found in that organ, tissue, or cell type. A phage that expresses a targeting peptide sequence is considered to be selectively transferred to a tissue or organ if it exhibits more binding in that tissue or organ as compared to a control tissue or organ. Preferably, selective transfer of the targeting peptide should result in a phage enrichment in the target organ, tissue, or cell type that is at least two times greater than that of the control organ, tissue, or cell type. Selective that results in at least a 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, or more-fold enrichment in a target organ compared to a control organ, tissue, or cell type Migration is more preferred. Alternatively, phage expressing a targeting peptide sequence that exhibits selective translocation preferably compare to control organs when phage recovered from the target organ are re-injected into a second host for the next screening. Increased enrichment is shown in the target organ. After the third screening, further enrichment may be indicated. Another means for determining selective translocation is that the phage expressing the putative target peptide either express a non-specific peptide or have not been genetically modified to express the putative target peptide. Preferably, showing a concentration of 2 times, more preferably 3 times or more in the target organ compared to the control phage. Another means for determining selective translocation is that translocation of phage expressing the target peptide to the target organ is at least partially prevented by co-administration of a synthetic peptide comprising the target peptide sequence. "Targeting peptide" and "regression peptide" are used interchangeably herein.
[0031]
By "phage display library" is meant a collection of phage that has been genetically engineered to express a putative set of targeting peptides on its outer surface. In a preferred embodiment, the DNA sequence encoding the putative targeting peptide is inserted in frame with the gene encoding the phage coat protein. In other preferred embodiments, the putative targeting peptide sequence is partly a random mixture of all 20 amino acids and partly a non-random mixture. In certain preferred embodiments, the putative targeting peptide of the phage display library displays one or more cysteine residues at fixed positions within the targeting peptide sequence.
[0032]
“Polymeric complex” means a collection of molecules whose sequence may be random, ordered, or partially ordered. The term includes bacteriophages, viruses, bacteria, unicellular pathogenic organisms, multicellular pathogenic organisms, and organisms such as prokaryotic or eukaryotic cells. The term also includes non-viable molecules such as liposomes, microcapsules, microparticles, magnetic beads and microdevices. The only requirement is that the complex contains one or more molecules. The molecules can be the same or different from each other.
[0033]
A “receptor” for a targeting peptide includes, but is not limited to, any molecule or complex of molecules that binds to the targeting peptide. Non-limiting examples of receptors include peptides, proteins, glycoproteins, lipoproteins, epitopes, lipids, carbohydrates, multimolecular structures, specific conformations of one or more molecules and morphological anatomical entities. included. In a preferred embodiment, a “receptor” is a naturally occurring molecule or complex of molecules present on the luminal surface of cells forming blood vessels in a target organ, tissue, or cell type.
[0034]
"Subject" generally means a mammal. In certain preferred embodiments, the subject is a mouse or a rabbit. In an even more preferred embodiment, the subject is a human.
[0035]
Phage display
The methods described herein for identifying targeting peptides include in vitro administration of a phage display library. Various methods of phage display and methods of making diverse populations of peptides are well known in the art. For example, U.S. Patent Nos. 5,223,409, 5,622,699, and 6,068,829, each of which is incorporated herein by reference, disclose methods of preparing phage libraries. I do. Phage display technology involves engineering a bacteriophage such that small peptides can be expressed on its surface (Smith et al., 1985, 1993). The range of potential applications of this technology is considerable, and during the past decade, considerable effort has been made in constructing peptide libraries displayed by phage and in screening methods for isolating peptide ligands using the libraries. Progress has been recognized. For example, the use of peptide libraries has made it possible to characterize interaction sites and receptor-ligand binding motifs in many proteins, such as antibodies involved in the inflammatory response or integrins that mediate cell adhesion. . This method has also been used to identify new peptide ligands that serve as leads for the development of peptidomimetics or contrast agents (Arap et al., 1998a). In addition to peptides, larger protein domains, such as single-chain antibodies, can also be displayed on the surface of phage particles (Arap et al., 1998a).
[0036]
Targeting amino acid sequences that are selective for certain organs, tissues or cell types can be isolated by "biopanning" (Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Pasqualini, 1999). Briefly, a library of phage containing a putative targeting peptide is administered to an animal or human and a sample of an organ, tissue, or cell type containing the phage is collected. In a preferred embodiment utilizing filamentous phage, phage can be propagated in vitro in fimbrial positive bacteria between biopannings. The bacterium is not lysed by the phage and secretes multiple copies of the phage displaying a particular insert. Phage that bind to the target molecule can be amplified by eluting from the target organ, tissue, or cell type and then growing in host bacteria. If desired, the amplified phage may be administered to a host and the organ, tissue, or cell type sample may be collected again. Multiple biopannings can be performed until a population of selective binders is obtained. The amino acid sequence of the peptide is determined by sequencing the DNA corresponding to the targeting peptide insert in the phage genome. The identified targeting peptide can then be made as a synthetic peptide by standard protein chemistry techniques (Arap et al., 1998a, Smith et al., 1985). This approach makes it possible to detect circulating targeting peptides in an unbiased functional assay without predicting the nature of the target. Once a candidate target has been identified as a receptor for the targeting peptide, it can be isolated, purified, and cloned using standard biochemical methods (Pasqualini, 1999; Rajotte and Ruoslahti, 1999). It is possible.
[0037]
In certain embodiments, a subtraction protocol is used to further reduce background phage binding. The purpose of the subtraction is to remove phage from the library that bind to cells other than the cell of interest or bind to inactivated cells. In another embodiment, the phage library can be prescreened against subjects who do not possess the targeted cells, tissues, or organs. For example, placenta binding peptides can be identified after pre-screening the library against male or non-pregnant women. After subtraction, the library can be screened for cells, tissues, or organs of interest. In another alternative embodiment, unstimulated resting cell types, tissues, or organs are screened against the library to remove binding phage. The cell line, tissue, or organ is then activated, for example, by administration of a hormone, growth factor, cytokine, or chemokine, and the activated cell type, tissue, or organ is screened against a subtracted phage library Is done.
[0038]
For example, as disclosed in U.S. Patent Nos. 5,840,841, 5,705,610, 5,670,312, and 5,492,807, which are incorporated herein by reference. , Other methods of subtraction protocols are also known and can be used in the practice of the present invention.
[0039]
Selection of phage display system
Previous in vivo selection studies performed in mice have favored libraries of random peptides expressed as fusion proteins with the III gene coat protein in the fUSE5 vector (Pasqualini and Ruoslahti, 1996). The number and diversity of individual clones present in a given library are important factors for successful in vivo selection. It is preferred to use a primary library that is less likely to have overexpression of the defective phage clone (Koivunen et al., 1999). Preparation of library8-109It has to be optimized between transduction units (TU) / ml. In certain embodiments, a bulk amplification strategy is applied during each selection round.
[0040]
Phage libraries displaying linear, cyclic, or bicyclic peptides may be used within the scope of the present invention. However, since monocyclic peptides tend to have higher affinity for target organs than linear peptides, the cyclic insert (CX3-10A phage library displaying 3 to 10 random residues in C) is preferred. Library showing bicyclic peptides (CX3C X3CX3C et al .; Rajotte et al., 1998) have also been used successfully. However, the production of cognate synthetic peptides, while possible, can be complicated by the large number of conformers with different disulfide bridge sequences.
[0041]
Identification of regression peptides and receptors by in vivo phage display in mice
Targeting peptides selective for normal mouse brain, kidney, lung, skin, pancreas, retina, intestine, small intestine, uterus, prostate, and adrenal gland using in vivo selection of peptides from a phage display peptide library administered to mice (Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Pasqualini, 1999; Rajotte et al., 1998). These results indicate that the vascular endothelium of normal organs is heterogeneous enough to allow different targeting by peptide probes (Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Rajotte et al., 1998). Means for identifying peptides that return to tumor neovasculature have been devised as follows. A panel of peptide motifs targeting the vessels of tumor xenografts in nude mice has been constructed (reviewed by Arap et al., 1998a; Pasqualini, 1999). These motifs include the sequences RGD-4C, NGR, and GSL. The RGD-4C peptide has previously been identified as an αv integrin that binds selectively and has been shown to regress into tumor xenograft vessels in nude mice (Arap et al., 1998a, 1998b; Pasqualini, 1997). ).
[0042]
The receptor for the tumor regression RGD4C targeting peptide has been identified as αv integrin (Pasqualini et al., 1997). αv integrins play an important role in angiogenesis. αvβ3 and αvβ5 integrins are absent or expressed at low levels in normal endothelial cells, but are induced in tumor neovasculature (Brooks et al., 1994; Hammes et al., 1996). Aminopeptidase N / CD13 has recently been identified as an angiogenic receptor for the NGR motif (Burg et al., 1999). Aminopeptidase N / CD13 is strongly expressed not only in prostate cancer neovasculature in TRAMP but also in normal epithelial prostate tissue.
[0043]
Tumor regression phage co-localizes with its receptor in tumor neovasculature, but not in non-neovascular vessels of normal tissue (Arap et al., 1998b). Immunohistochemical evidence indicates that vascular targeting phage binds to human tumor vessels in tissue sections (Pasqualini et al., 2000), but not to normal vessels. Negative control phage without insert (fd phage) did not bind to normal or tumor tissue sections. Expression of angiogenic receptors was evaluated in cell lines, non-proliferating vessels, and activated vessels of tumors, as well as other angiogenic tissues such as the corpus luteum. Flow cytometry and immunohistochemistry indicated that these receptors were expressed on many tumor cells and activated HUVECs (data not shown). Angiogenic receptors were not detected in blood vessels of normal organs of mouse or human tissues.
[0044]
The distribution of these receptors was analyzed by immunohistochemistry in tumor cells, tumor vessels, and normal vessels. αv integrin, CD13, aminopeptidase A, NG2, and MMP-2 / MMP-9, known receptors in tumor blood vessels, are specifically expressed in endothelial cells and pericytes of neovascular vessels of both human and mouse origin Is expressed. Neovascularization expresses markers that are expressed at very low or no levels on non-proliferating endothelial cells (not shown).
[0045]
Markers of neovascular endothelium include specific subtypes of VEGF and basic FGF receptors, and receptors for vascular growth factors such as αv integrins, among others (Mustonen and Alitalo, 1995). To date, the identification and isolation of novel molecules that are characteristic of neovascularization has been delayed mainly due to the phenotypic change that occurs when endothelial cells are grown in culture (Watson et al., 1995).
[0046]
Many of these tumor vascular markers are proteases and some of them act as viral receptors. αv integrin is the receptor for adenovirus (Wickham et al., 1997c) and CD13 is the receptor for coronavirus (Look et al., 1989). MMP-2 and MMP-9 are echovirus receptors (Koivunen et al., 1999). Aminopeptidase A also appears to be a viral receptor. Bacteriophages may utilize the same cell receptors as eukaryotic cell viruses. These findings suggest that the receptor isolated by in vivo phage display has the ability to internalize cells, an important feature for using the identified peptide motif as a carrier for targeted gene therapy. are doing.
[0047]
Targeted delivery
Coupling of peptides that return to tumor vessels with cytotoxic or pro-apoptotic peptides has yielded compounds that are more effective and less toxic than the parent compound in experimental mouse models with tumor xenografts (Arap et al., 1998a; Ellerby et al., 1999). Insertion of the RGD-4C peptide into an adenovirus surface protein, as shown below, results in an adenovirus vector that may be used for tumor-targeted gene therapy (Arap et al., 1998b).
[0048]
BRASIL
In a preferred embodiment, separating phage bound to cells of the target organ, tissue, or cell type from unbound phage is performed using BRASIL technology (US Provisional Application filed September 8, 2000). No. 60 / 231,266; "Biopanning and rapid analysis of selective interacting ligands" by Arap, Pasqualini, and Giordano, incorporated herein by reference and submitted herewith. U.S. Patent entitled "Rapid Analysis of Selective Interactive Ligands (BRASIL)"). In BRASIL (biopanning and rapid analysis of selective interacting ligands), gently separate into organs, tissues, or cell-type cells or small cell clumps, which are suspended in an aqueous phase. The aqueous phase is layered on top of the appropriate density organic phase and centrifuged. Cells that have adhered to the bound phage settle to the bottom of the centrifuge tube, and unbound phage remain in the aqueous phase. This allows the bound phage to be more efficiently separated from unbound phage while maintaining the binding interaction between the phage and the cells. BRASIL can also be performed in an in vivo protocol, exposing an organ, tissue, or cell type to a phage display library by intravenous administration, or by an ex vivo protocol, in which cells are exposed to a phage library in an aqueous phase and then centrifuged. Good.
[0049]
Proteins and peptides
In certain embodiments, the present invention relates to novel compositions comprising at least one protein or peptide. As used herein, a protein or peptide is generally a protein up to the full length sequence translated from a gene with 200 or more amino acids; a polypeptide with 100 or more amino acids; Means, but is not limited to, about 100 peptides. For convenience, the terms "protein," "polypeptide," and "peptide" are used interchangeably herein.
[0050]
In certain embodiments, the size of at least one protein or peptide is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, about 110, 120, about 130, about 140, about 150, about 160, about 170, about 180, about 190, about 200, about 210, about 220, about 230, about 240, about 250, about 275, about 300, about 325, About 350, about 375, about 400, about 425, about 450, about 475, about 500, about 525, about 550, about 575, about 600, about 625, about 650, about 675, about 700, about 725, about 750 , About 775, about 800, about 825, about 850, about 875, about 900, about 925, about 950, about 975, about 1000, about 1100, about 1200, about 1300, about 1400, about 1500, about 1750, about It may include, but is not limited to, 2000, about 2250, about 2500 amino acid residues or more.
[0051]
As used herein, “amino acid residue” means any naturally occurring amino acid, any amino acid derivative, or any amino acid mimic known in the art. In certain embodiments, the residues of the protein or peptide are contiguous and there are no non-amino acids interrupting the sequence of amino acid residues. In other embodiments, the sequence may include one or more non-amino acid portions. In certain embodiments, the sequence of residues of a protein or peptide may be interrupted by one or more amino acid portions. In certain embodiments, the residue sequence of a protein or peptide may be interrupted by one or more amino acid portions.
[0052]
Thus, the term “protein or peptide” refers to at least one of the 20 common amino acids found in naturally occurring proteins, or at least one modification or amino acid, including but not limited to the amino acids shown in Table 1 below. Includes amino acid sequences that include unusual amino acids.
[0053]
Table 1. Modified and rare amino acids
Figure 2004508045
[0054]
Proteins or peptides are known to those skilled in the art, including expression of the protein, polypeptide or peptide using standard molecular biology techniques, isolation of the protein or peptide from natural sources, or chemical synthesis of the protein or peptide. May be produced by any of the techniques described above. Nucleotide and protein, polypeptide, and peptide sequences corresponding to various genes have been previously disclosed and will be found in computer databases known to those of skill in the art. One such database is the National Bank for Biotechnology Information GenBank and GenPept databases (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). The coding region of a known gene may be amplified and / or expressed using the techniques disclosed herein or as known to those skilled in the art. Alternatively, various commercially available preparations of proteins, polypeptides, or peptides are known to those skilled in the art.
[0055]
Peptidomimetic
Another embodiment for preparing a polypeptide according to the present invention is to use a peptidomimetic. Mimetics are peptide-containing molecules that mimic elements of the secondary structure of proteins. See, for example, "Biotechnology and Pharmacy", edited by Pezzuto et al., Chapman and Hall, New York (1993), Johnson et al., "Peptide Fold Mimicry," which is incorporated herein by reference. See Peptide Turn Mimetics. The underlying reason behind the use of peptidomimetics exists because the peptide backbone of proteins predominantly directs amino acid side chains to promote intermolecular interactions such as antibody-antigen interactions Is a point. Peptidomimetics are expected to allow for similar molecular interactions as the naturally occurring molecules. Using these principles, a second generation molecule may be engineered that has many of the natural properties of the targeting peptides disclosed herein, but has altered and even improved characteristics.
[0056]
Fusion protein
Another aspect of the present invention relates to a fusion protein. These molecules generally have all or a substantial portion of the targeting peptide attached at the N-terminus or C-terminus to all or a substantial portion of a second polypeptide or protein. For example, fusions may use leader sequences from other species to express a recombinant form of the protein in a heterologous host. Another useful fusion involves adding an immunologically active domain, such as an antibody epitope, to facilitate purification of the fusion protein. Including a cleavage site at or near the fusion will facilitate removal of additional polypeptides after purification. Other useful fusions include the joining of functional domains, such as active sites from enzymes, glycosylation domains, cell targeting signals, or transmembrane regions. In a preferred embodiment, a fusion protein of the invention comprises a targeting peptide conjugated to a therapeutic protein or peptide. Examples of proteins or peptides that may be incorporated into the fusion protein include cytostatic proteins, cytocidal proteins, proapoptotic agents, anti-angiogenic agents, hormones, cytokines, growth factors, peptide drugs, antibodies, Fab fragment antibodies, antigens, Includes receptor proteins, enzymes, lectins, MHC proteins, cell adhesion proteins, and binding proteins. These examples are not meant to be limiting, and it is intended that the protein or peptide can be incorporated into a fusion protein comprising the targeting peptide, substantially within the scope of the invention. Methods for making fusion proteins are well-known to those of skill in the art. Such proteins can be linked, for example, by chemical conjugation using a bifunctional crosslinker, by de novo synthesis of a complete fusion protein, or by joining a DNA sequence encoding a targeting peptide to a DNA sequence encoding a second peptide or protein. After that, it can be produced by expressing an intact fusion protein.
[0057]
Protein purification
In certain embodiments, the protein or peptide may be isolated or purified. Protein purification techniques are well known to those skilled in the art. These techniques include, at one level, homogenization of cells, tissues, or organs into polypeptide and non-polypeptide fractions and crude fractionation. The protein or polypeptide of interest may be further purified using chromatographic and electrophoretic techniques to obtain partial or complete purification (or to homogeneity). Analytical methods particularly suitable for the preparation of pure peptides are ion exchange chromatography, gel exclusion chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis, affinity chromatography, immunoaffinity chromatography, and isoelectric focusing. Examples of receptor protein purification by affinity chromatography are disclosed in US Pat. No. 5,206,347, the entire text of which is incorporated herein by reference. A particularly efficient method of purifying peptides is fast protein liquid chromatography (FPLC) or HPLC.
[0058]
A purified protein or peptide is taken to mean a composition that is isolatable from other components, where the protein or peptide has been purified to any degree as compared to its naturally occurring state. Thus, an isolated or purified protein or peptide also refers to a protein or peptide that does not contain the environment that may occur in nature. Generally, "purified" refers to a protein that has been fractionated to remove various other components, and for which the composition substantially retains its expressed biological activity. Or a peptide composition. When the term "substantially purified" is used, the term means that the protein or peptide is about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 95% of the protein in the composition. % Or more of the composition that forms the major component of the composition.
[0059]
Various methods for determining the degree of protein or peptide purification are known to those of skill in the art in light of the present disclosure. These include, for example, determining the specific activity of the active fraction or assessing the amount of polypeptide within the fraction by SDS / PAGE analysis. A preferred method of assessing the purity of a fraction is to calculate the specific activity of the fraction, compare it to the specific activity of the initial extract, and thus evaluate by `` ~ purification factor '' It is to calculate its purity. The actual units used to indicate the amount of activity will, of course, depend on the particular assay technique chosen to effect purification, and whether the expressed protein or peptide exhibits detectable activity. There will be.
[0060]
Various techniques suitable for use in protein purification are well known to those of skill in the art. These include, for example, precipitation with ammonium sulfate, PEG, antibodies, etc., or centrifugation after heat denaturation; chromatographic steps such as ion exchange, gel filtration, reverse phase, hydroxyapatite, and affinity chromatography; isoelectric focusing Gel electrophoresis; and combinations of these and other techniques. As is generally known in the art, the order in which the various purification steps are performed may be varied or certain steps may be omitted, and may still be substantially purified. A suitable method for preparing a protein or peptide is obtained.
[0061]
There is no general requirement that a protein or peptide always be provided in its most purified state. In fact, substantially less purified products are considered useful in certain embodiments. Partial purification may be performed using fewer purification steps in combination or using different types of the same general purification scheme. For example, it is recognized that cation exchange column chromatography performed using HPLC equipment will generally yield greater purification "magnifications" than the same technique using low pressure chromatography systems. Methods that exhibit a relatively lower degree of purification may have advantages for maintaining the overall recovery of the protein product or the activity of the expressed protein.
[0062]
Affinity chromatography is a chromatography technique that relies on the specific affinity of the substance to be isolated and the molecule to which it specifically binds. This is a receptor-ligand type interaction. Column materials are synthesized by covalently coupling one of the binding partners to an insoluble matrix. The column material can then specifically absorb the substance from the solution. If the conditions are changed to those that do not cause binding (eg, changes in pH, ionic strength, temperature, etc.), elution occurs. The matrix must be a material that does not itself absorb molecules to any significant degree and that has a wide range of chemical, physical, and thermal stability. The ligand must be coupled so as not to affect its binding properties. The ligand must provide a relatively tight bond. And it must be possible to elute the substance without destroying the sample or the ligand.
[0063]
Synthetic peptide
Due to the relatively small size of the targeting peptide of the present invention, it can be synthesized on a solution or solid support according to conventional techniques. Various automatic synthesizers are commercially available and can be used according to known protocols. For example, Stewart and Young, 1984; Tam et al., 1983; Merrifield, 1986; and Barany and Merryfield, each of which is incorporated herein by reference. (Merrifield), 1979. Usually, short peptide sequences from about 6 to about 35 to 50 amino acids can be easily synthesized by such methods. Alternatively, a recombinant DNA technique in which a nucleotide sequence encoding the peptide of the present invention is inserted into an expression vector, transformed or transfected into a suitable host cell, and cultured under conditions suitable for expression, may be used.
[0064]
antibody
In certain embodiments, it may be desirable to generate antibodies to the identified targeting peptide or its receptor. Coupling, bonding, bonding, conjugating, or chemically bonding an appropriate targeting peptide or receptor, or a portion thereof, to one or more substances via a linker, polylinker, or derivatized amino acid You may let it. This may be done so that a bispecific or multivalent composition or vaccine is produced. The methods used in the preparation of these compositions are well known to those of skill in the art and further envision that they must be suitable for administration to humans, ie, pharmaceutically acceptable. Preferred substances are carriers, keyhole limpet hemocyanin (KLH), or bovine serum albumin (BSA).
[0065]
The term "antibody" is used to mean any antibody-like molecule having an antigenic determining region, Fab ', Fab, F (ab')2And antibody fragments such as single-chain domain antibodies (DABs), Fv, scFv (single-chain Fv) and the like. Techniques for preparing and using various antibody-based constructs and fragments are well known in the art. Means for preparing and characterizing antibodies are also well known in the art (see, eg, “Antibodies: Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; herein by reference). Incorporated in the specification).
[0066]
Cytokines and chemokines
In certain embodiments, it may be desirable to couple a specific bioactive agent to one or more targeting peptides for targeted delivery to an organ, tissue, or cell type. Such substances include, but are not limited to, cytokines, chemokines, pro-apoptotic factors, and anti-angiogenic factors. The term "cytokine" is a generic term for proteins released by one cell population that act on another cell as intercellular mediators. Examples of such cytokines are lymphokines, monokines, growth factors, and conventional polypeptide hormones. Cytokines include growth hormones such as human growth hormone, N-methionyl human growth hormone, and bovine growth hormone; parathyroid hormone; thyroxine; insulin; proinsulin; relaxin; (TSH) and glycoprotein hormones such as luteinizing hormone (LH); liver growth factor; prostaglandin, fibroblast growth factor, prolactin; placental lactogen, OB protein; tumor necrosis factor-α and tumor necrosis factor- β; Murerian inhibitor; mouse gonadotropin-related peptide; inhibin; activin; vascular endothelial growth factor; integrin; thrombopoietin (TPO); nerve growth factor such as NGF-β; platelet growth factor; and TGF-α and TGF-β. Such as transforming growth factor (TGF); insulin-like growth factor-I and insulin-like growth factor-II; erythropoietin (EPO); osteoinductive factors; interferons such as interferon-α, -β, and -γ; macrophage-CSF Colony stimulating factors (CSF) such as (M-CSF), granulocyte-macrophage-CSF (GM-CSF), and granulocyte-CSF (G-CSF); IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL- 15, interleukins (IL) such as IL-16, IL-17, IL-18, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, kit- Command or FLT-3, angiostatin, thrombospondin, endostatin, tumor necrosis factor and LT. As used herein, the term cytokine includes proteins from natural sources or proteins from recombinant cell culture, and biologically active equivalents of the native sequence cytokines.
[0067]
Chemokines generally act as chemoattractants to recruit immune effector cells to the site of chemokine expression. For example, it may be advantageous to express certain chemokine genes in combination with cytokine genes to enhance recruitment of other immune system components to the treatment site. Chemokines include, but are not limited to, RANTES, MCAF, MIP1-α, MIP1-β, and IP-10. One of skill in the art will recognize that certain cytokines are also known to have chemoattractant effects and may likewise be categorized under the term chemokine.
[0068]
Contrast agents and radioisotopes
In certain embodiments, the peptides or proteins claimed in the present invention may bind to a contrast agent used to image and diagnose organs, tissues, or cell types with various diseases. Many suitable imaging agents are known in the art, as well as methods of linking them to proteins or peptides (eg, US Pat. Nos. 5,021,236 and No. 5,021,236, both of which are incorporated herein by reference). 4,472,509). The protein or peptide may also be reacted with the enzyme in the presence of a coupling agent such as glutaraldehyde or periodate. Conjugates with fluorescent markers are prepared in the presence of these coupling agents or by reaction with isothiocyanates.
[0069]
Non-limiting examples of paramagnetic ions that may be used as contrast agents include chromium (III), manganese (II), iron (III), iron (II), cobalt (II), nickel (II) , Copper (II), neodymium (III), samarium (III), ytterbium (III), gadolinium (III), vanadium (II), terbium (III), dysprosium (III), holmium (III), and erbium (III) Gadolinium is particularly preferred. Useful ions in other situations, such as x-ray imaging, include, but are not limited to, lanthanum (III), gold (III), lead (II), and especially bismuth (II).
[0070]
Radioactive isotopes that may be used as contrast agents or therapeutics include astatine211,14carbon,51chromium,36chlorine,57cobalt,58Cobalt, copper67,152Europium, gallium67,3Hydrogen, iodine123,Iodine125,Iodine131,indium111,59iron,32Phosphorus, rhenium186,rhenium188,75Selenium,35Sulfur, technetium99mAnd yttrium90Is included.125I is often preferred for use in certain embodiments, and technetium99mAnd indium111Similarly, is also preferable because it has low energy and is suitable for detection over a long range.
[0071]
A radioactively labeled protein or peptide of the present invention may be produced according to methods well known in the art. For example, they can be iodinated by contacting with sodium or potassium iodide and a chemical oxidant such as sodium hypochlorite or an enzymatic oxidant such as lactoperoxidase. A protein or peptide according to the invention may be labeled by a ligand exchange process, for example, by reducing pertechnate with a tin solution, chelating the reduced technetium on a Sephadex column, and applying the peptide to this column, or directly. Depending on the technology, for example pertechnate, SNCl2Technetium by incubating a reducing substance such as, a buffer such as sodium potassium phthalate solution, and the peptide99mMay be labeled. Intermediate functional groups often used to bind to radioisotopes present as metal ions are diethylenetriaminepentaacetic acid (DPTA) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Fluorescent labels, including rhodamine, fluorescein isothiocyanate, and renographin, are contemplated for use as well.
[0072]
In certain embodiments, the claimed protein or peptide may be conjugated to a secondary binding ligand or enzyme (enzyme tag) that produces a colored product when contacted with a chromogenic substrate. Examples of suitable enzymes include urease, alkaline phosphatase, (horseradish) hydrogen peroxidase, and glucose oxidase. Preferred secondary binding ligands are biotin and avidin or streptavidin compounds. The use of such labels is well known to those skilled in the art, for example, U.S. Patent Nos. 3,817,837, 3,850,752, 3,939, each of which is incorporated herein by reference. Nos. 350, 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; and 4,366,241.
[0073]
Cross-linker
Bifunctional cross-linking reagents are widely used for a variety of purposes, including the preparation of affinity matrices, modification and stabilization of various structures, identification of ligand and receptor binding sites, and structural studies. Homobifunctional reagents with two identical functional groups are very efficient for inducing cross-linking between identical and different macromolecules or polymer subunits and for binding peptide ligands to their specific binding sites Turned out to be good. Heterobifunctional reagents contain two different functional groups. By exploiting the different reactivities of the two different functional groups, crosslinking can be controlled selectively and continuously. Bifunctional cross-linking reagents can be classified according to the specificity of their functional groups, for example, amino, sulfhydryl, guanidino, indole, carboxyl-specific substituents. Of these, reagents for free amino groups have become particularly popular because of their commercial availability, ease of synthesis, and the mild reaction conditions to which they can be applied. Most heterobifunctional cross-linking reagents contain a primary amine reactive group and a thiol reactive group.
[0074]
Exemplary methods of crosslinking ligands to liposomes are described in US Pat. Nos. 5,603,872 and 5,401,511, each of which is specifically incorporated herein by reference. Various ligands can be covalently attached to the liposome surface by crosslinking amine residues. Liposomes, in particular multilamellar vesicles (MLV) or unilamellar vesicles, such as microemulsified liposomes (MEL) and large unilamellar liposomes (LUVET), each containing phosphatidylethanolamine (PE), are prepared by established techniques. Have been. Inclusion of PE in the liposome provides active functional residues, primary amines on the liposome surface for crosslinking purposes. Ligands such as epidermal growth factor (EGF) have been successfully attached to PE-liposomes. The ligand is covalently linked to a distinct site on the liposome surface. The number and surface density of these sites will depend on the liposome formulation and liposome type. Liposomal surfaces may also have non-covalent sites. Crosslinking reagents have been investigated for efficacy and biocompatibility to form covalent conjugates of ligands and liposomes. Cross-linking reagents include glutaraldehyde (GAD), bifunctional oxirane (OXR), ethylene glycol diglycidyl ether (EGDE), and water-soluble carbodiimide, preferably 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) ) Is included. The complex chemistry of the cross-link establishes a bond between the amine residue of the recognition substance and the liposome.
[0075]
In another example, a heterobifunctional cross-linking reagent and a method using a cross-linking reagent are described (in particular, US Pat. No. 5,889,155, the entire text of which is incorporated herein by reference). Cross-linking reagents can combine a nucleophilic hydrazide residue with an electrophilic maleimide residue, thereby coupling an aldehyde to a free thiol in one example. Crosslinking reagents can be modified to crosslink various functional groups.
[0076]
Nucleic acid
A nucleic acid according to the present invention may encode a targeting peptide, a receptor protein, or a fusion protein. Nucleic acids may be derived from genomic DNA, complementary DNA (cDNA), or synthetic DNA. If it is desired to incorporate it into an expression vector, the nucleic acid may also include a naturally occurring intron or an intron from another gene. Such engineered molecules are sometimes called "minigenes."
[0077]
As used herein, "nucleic acid" includes single-stranded and double-stranded molecules, as well as DNA, RNA, chemically modified nucleic acids and nucleic acid analogs. Nucleic acids within the scope of the invention are 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 , 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 , 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 , 99, 100, about 110, about 120, about 130, about 140, about 150, about 160, about 17 , About 180, about 190, about 200, about 210, about 220, about 230, about 240, about 250, about 275, about 300, about 325, about 350, about 375, about 400, about 425, about 450, about 475, about 500, about 525, about 550, about 575, about 600, about 625, about 650, about 675, about 700, about 725, about 750, about 775, about 800, about 825, about 850, about 875, About 900, about 925, about 950, about 975, about 1000, about 1100, about 1200, about 1300, about 1400, about 1500, about 1750, about 2000, about 2250, about 2500 nucleotide residues or more. It is considered that the length may be used.
[0078]
It is contemplated that the targeting peptides, fusion proteins, and receptors can be encoded by any nucleic acid sequence that encodes the appropriate amino acid sequence. The design and production of nucleic acids encoding a desired amino acid sequence is well known to those skilled in the art using standardized codon tables (see Table 2 below). In a preferred embodiment, the codons selected to encode each amino acid may be modified to optimize expression of the nucleic acid in the host cell of interest. The codon preferences for various species of host cells are well known in the art.
[0079]
[Table 2]
Figure 2004508045
[0080]
In addition to nucleic acids encoding the desired targeting peptide, fusion protein or receptor amino acid sequence, the invention includes complementary nucleic acids that hybridize to such encoding nucleic acid sequences under conditions of high stringency. High stringency conditions for nucleic acid hybridization are well known in the art. For example, conditions may include low salt and / or high temperature conditions, such as those provided by about 0.02 M to about 0.15 M NaCl at a temperature of about 50 ° C. to about 70 ° C. The temperature and ionic strength of the desired stringency depends on the specific nucleic acid, the length and nucleotide content of the target sequence, the charged composition of the nucleic acid, and the presence of formamide, tetramethylammonium chloride, or other solvents in the hybridization mixture. Determined in part by the concentration.
[0081]
Vectors for cloning, gene transfer, and expression
In certain embodiments, the targeting peptide or fusion protein can be expressed using an expression vector, which can then be purified and used. In another embodiment, the expression vector is used in gene therapy. Expression requires that appropriate signals be provided in the vector and includes various regulatory elements, such as enhancers / promoters from both viral and mammalian sources, that facilitate expression of the gene of interest in the host cell. Elements designed to optimize messenger RNA stability and translatability in a host cell are also known.
[0082]
Adjustment element
The term "expression construct" or "expression vector" is meant to include any type of gene construct that includes a nucleic acid that encodes a gene product capable of transcribing some or all of the nucleic acid coding sequence. I do. In a preferred embodiment, the nucleic acid encoding the gene product is under the transcriptional control of a promoter. "Promoter" means a DNA sequence recognized by the synthetic machinery of the cell or introduced by the synthetic machinery and required to initiate specific transcription of the gene. The term "under transcriptional control" means that the promoter is in the correct position and orientation relative to the nucleic acid to control the initiation of RNA polymerase and expression of the gene.
[0083]
The particular promoter used to control the expression of the nucleic acid sequence of interest is not considered critical, as long as it can direct the expression of the nucleic acid in the target cell. Thus, where human cells are targeted, it is preferred to position the nucleic acid coding region adjacent to and under the control of a promoter that can be expressed in human cells. In general, such promoters may include either human or viral promoters.
[0084]
In various embodiments, the human cytomegalovirus (CMV) immediate early gene promoter, SV40 promoter, Rous sarcoma virus long terminal repeat, rat insulin promoter, and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter are used to encode the code of interest. High level expression of the sequence can be obtained. The use of other viral or mammalian cellular or bacterial phage promoters well known in the art to obtain expression of the coding sequence of interest is also considered, as long as the expression level is sufficient for the given purpose. Is done.
[0085]
If a cDNA insert is used, this will typically include a polyadenylation signal to effect proper polyadenylation of the gene transcript. The properties of the polyadenylation signal are not believed to be critical to the success of the practice of the invention, and any such sequence may be used, such as human growth hormone, and the SV40 polyadenylation signal. Similarly, terminators are considered as a component of the expression construct as well. These elements can act to enhance message levels and minimize overreads from the construct to other sequences.
[0086]
Selection marker
In certain aspects of the invention, cells containing a nucleic acid construct of the invention may be identified in vitro or in vivo by including a marker in the expression construct. Such a marker would impart an identifiable change to the cell so that the cell containing the expression construct could be easily identified. Usually, the inclusion of a drug selectable marker will aid in the cloning and selection of transformants. For example, genes that confer resistance to neomycin, puromycin, hygromycin, DHFR, GPT, zeocin, and histidinol are useful selectable markers. Alternatively, an enzyme such as herpes simplex virus thymidine kinase (tk) or an enzyme such as chloramphenicol acetyltransferase (CAT) may be used. Immunological markers can be used as well. The selectable marker used is not considered critical as long as it can be expressed simultaneously with the nucleic acid encoding the gene product. Further examples of selectable markers are well known to those skilled in the art.
[0087]
Delivery of expression vectors
There are many ways to introduce expression vectors into cells. In certain aspects of the invention, the expression construct comprises a virus, or an engineered construct derived from the viral genome. Certain viruses can transfer foreign genes into mammalian cells by being able to enter cells by receptor-mediated endocytosis, being able to integrate into the host cell genome, and being able to stably and efficiently express viral genes. (Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Temin, 1986). Generally, preferred gene therapy vectors are viral vectors.
[0088]
Some viruses that can tolerate exogenous genetic material limit the number of nucleotides they can accommodate and the range of cells they infect, but these viruses successfully carry out gene expression Proven that can be. However, adenoviruses do not integrate their genetic material into the host genome and, therefore, do not require host replication for gene expression, so they are ideally suited for rapid, efficient, heterologous gene expression . Techniques for preparing replication-defective viruses are well known in the art.
[0089]
When using a viral delivery system, essentially eliminate unwanted contaminants such as defective interfering virions or endotoxins and other pyrogens so that they do not cause undesired reactions in the cells, animals or individuals receiving the vector construct. It may be desirable to purify the virions sufficiently to eliminate them. A preferred means of purifying the vector involves using a suspension density gradient, such as a cesium chloride gradient centrifuge.
[0090]
DNA viruses used as gene vectors include papovaviruses (eg, simian virus 40, bovine papilloma virus, and polyoma) (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986) and adenoviruses (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986). Is included.
[0091]
One preferred method for in vivo delivery involves using an adenovirus expression vector. Adenovirus vectors are known to have low integration capacity for genomic DNA, but this feature is offset by the high gene transfer efficiencies obtained with these vectors. An "adenovirus expression vector" comprises sufficient adenovirus sequences to (a) support the packaging of the construct and (b) express the antisense or sense polynucleotide cloned therein. Is meant to include, but not be limited to, a construct.
[0092]
Expression vectors include genetically engineered forms of adenovirus. Knowing that the genetic construction of adenovirus is a 36 kb linear double-stranded DNA virus, it is possible to replace large fragments of adenovirus DNA with foreign sequences up to 7 kb (Grunhaus and Horwitz). , 1992). In contrast to retroviral infections, adenoviral infections of host cells do not exhibit chromosomal integration and exhibit no potential genotoxicity, since adenoviral DNA can replicate in episomes. Similarly, adenovirus is structurally stable, and no genomic rearrangement has been detected after sufficient amplification. Adenovirus can infect virtually all epithelial cells, regardless of their cell cycle stage. Heretofore, adenovirus infections appear to be associated with very mild disease, such as acute respiratory disease in humans.
[0093]
Adenoviruses are particularly suitable for use as gene transfer vectors because of their moderate genome size, ease of manipulation, high titer, wide cell range, and high infectivity. . Both ends of the viral genome contain 100 to 200 base pair inverted repeats (ITRs), which are cis elements required for viral DNA replication and packaging. The early (E) and late (L) regions of the genome contain different transcription units that are divided by the onset of viral DNA replication. The E1 region (E1A and E1B) encodes proteins involved in the regulation of transcription of the viral genome and several cellular genes. Expression of the E2 region (E2A and E2B) results in the synthesis of proteins for viral DNA replication. These proteins have been implicated in DNA replication, late gene expression, and host cell blockade (Renan, 1990). The products of the late genes, including the majority of the viral capsid proteins, are expressed only after significant processing of a single major transcript generated by the major late promoter (MLP). MLP (present at 16.8 mu) is particularly efficient in the late stages of infection, and all mRNAs derived from this promoter have a 5'-tripartite leader (TPL) sequence. And they are the preferred mRNAs for translation.
[0094]
In currently used systems, recombinant adenovirus is generated by homologous recombination of a shuttle vector with a proviral vector. Due to possible recombination between the two proviral vectors, wild-type adenovirus can result from this process. It is therefore important to isolate a single clone of the virus from each plaque and examine its genomic structure.
[0095]
The generation and propagation of a replication-defective adenovirus vector depends on a unique helper cell line called 293, which is transformed from human fetal kidney cells by Ad5 DNA fragments and constitutively expresses the E1 protein (Graham et al., 1977). ). Since the E3 region is not critical for the adenovirus genome (Jones and Shenk, 1978), current adenovirus vectors transfer foreign DNA to either E1, E3, or both regions with the help of 293 cells. (Graham and Prevec et al., 1991). In essence, adenovirus can package about 105% of the wild-type genome (Ghosh-Choudhury et al., 1987), providing about 2 kb of extra DNA capacity. When combined with about 5.5 kb of DNA that can be replaced in the E1 and E3 regions, the current maximum capacity of adenovirus vectors is less than 7.5 kb, or about 15% of the total length of the vector. Over 80% of the adenovirus virus genome remains in the vector backbone, causing vector-mediated cytotoxicity. Similarly, the replication deficiency of the E1-deleted virus is incomplete. For example, leakage of viral gene expression is observed at high multiplicities of infection (MOI) for currently available vectors (Mulligan, 1993).
[0096]
Helper cell lines may be derived from human cells such as human fetal kidney cells, muscle cells, hematopoietic cells, or other human fetal mesenchymal or epithelial cells. Alternatively, the helper cells may be derived from cells of other mammalian species that are acceptable for human adenovirus. Such cells include, for example, Vero cells, or other monkey fetal mesenchymal or epithelial cells. As discussed, the preferred helper cell line is 293.
[0097]
Racher et al. (1995) disclosed an improved method of growing 293 cells to propagate adenovirus. In one format, individual cells are inoculated into 1 L siliconized spinner flasks (Techne, Cambridge, UK) containing 100-200 ml of medium to grow native cell aggregates. After stirring at 40 rpm, cell viability is estimated by trypan blue. In another format, Fibrar-cell microcarriers (5 g / l) (Bibby Starlin, Stone, UK) are used as follows. The cell inoculum resuspended in 5 ml of medium was added to the carrier (50 ml) in a 250 ml Arlenmeyer flask and allowed to stand for 1-4 hours with occasional stirring. The medium is then replaced with 50 ml of fresh medium and shaking is started. To produce virus, cells are grown to approximately 80% confluence, after which the medium is changed (25% of final volume) and adenovirus is added at an MOI of 0.05. The culture is left overnight, after which the volume is increased to 100% and shaking is carried out for a further 72 hours.
[0098]
Other than the requirement that the adenovirus vector be replication-deficient, or at least conditionally defective, the properties of the adenovirus vector are not considered critical to the successful practice of the present invention. The adenovirus may be of any of the 42 different serotypes known or subgroups AF. Adenovirus type 5 of subgroup C is a preferred starting material for obtaining the conditional replication defective adenovirus vector used in the present invention. This is because type 5 adenovirus is a human adenovirus for which extensive biochemical and genetic information is known, so that this adenovirus has historically been the construct of most constructs using adenovirus as a vector. Is used for
[0099]
A typical vector applicable for practicing the invention is replication defective and will not have the adenovirus E1 region. Thus, it is most convenient to introduce the polynucleotide encoding the gene at the position where the E1 coding sequence has been removed. However, the position of insertion of the construct within the adenovirus sequence is not critical. Polynucleotides encoding the gene of interest may also be replaced by the E3 region deleted in the E3 replacement vector as described by Karlsson et al., 1986, or the helper cell line or helper virus may be E4 deficient. May be inserted instead of the E4 region.
[0100]
Adenoviruses are easy to grow and manipulate, and exhibit a wide host range in vitro and in vivo. This group of viruses has high titers, eg, 109-1011It can be obtained in plaque forming units / ml and they are very infectious. The life cycle of the adenovirus need not be integrated into the host cell genome. Foreign genes delivered by adenovirus vectors are episomal and therefore have low genotoxicity to host cells. No side effects have been reported in studies vaccinated with wild-type adenovirus (Couch, 1963; Top et al., 1971), demonstrating its safety and therapeutic potential as an in vivo gene transfer vector.
[0101]
Adenovirus vectors have been used for eukaryotic gene expression (Leverro et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) and vaccine development (Grunhaus and Horwitz, 1992; Graham and Prevec, 1991). Animal studies have suggested that recombinant adenovirus can be used for gene therapy (Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Studies administering recombinant adenovirus to different tissues include tracheal instillation (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), intramuscular injection (Ragot et al., 1993), peripheral venous injection (Herz and Gerard, 1993), and brain injection. Stereotactic injection (Le Gal La Salle et al., 1993).
[0102]
Other gene transfer vectors may be constructed from retroviruses. Retroviruses are a group of single-stranded RNA viruses characterized by their ability to convert their RNA to double-stranded DNA in infected cells by the process of reverse transcription (Coffin, 1990). The resulting DNA is then stably integrated into the chromosome of the cell as a provirus, directing the synthesis of viral proteins. Integration preserves the viral gene sequences in the recipient cell and its progeny. The retroviral genome contains three genes, gag, pol, and env, each encoding a capsid protein, a polymerase enzyme, and an envelope component. Sequences found upstream from the gag gene include signals for packaging the genome into virions. Two long terminal repeat (LTR) sequences are present at the 5 'and 3' ends of the viral genome. These contain strong promoter and enhancer sequences and are also required for integration into the host cell genome (Coffin, 1990).
[0103]
To construct a retroviral vector, a nucleic acid encoding a protein of interest is inserted into the viral genome in place of a particular viral sequence to create a replication-defective virus. To produce virions, a packaging cell line is constructed containing the gag, pol, and env genes, but without the LTR and packaging components (Mann et al., 1983). If a recombinant plasmid containing the cDNA together with the retroviral LTR and the packaging sequence is introduced into this cell line (eg, by calcium phosphate), the packaging sequence will allow the RNA transcript of the recombinant plasmid to be packaged into viral particles. It is then possible to secrete it into the culture medium (Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Next, the medium containing the recombinant retrovirus is recovered, selectively concentrated, and used for gene transfer. Retroviral vectors can infect a wide variety of cell types. However, integration and stable expression require host cell division (Paskind et al., 1975).
[0104]
The use of retroviral vectors has certain limitations. For example, retroviral vectors are usually integrated at random sites in the cell genome. Thus, insertional mutagenesis can occur by disruption of the host gene or by insertion of viral regulatory sequences that can interfere with the function of adjacent genes (Varmus et al., 1981). Another concern when using defective retroviral vectors is the potential for the appearance of wild-type replication competent virus in packaging cells. This may be due to a recombination event in which intact sequences from the recombinant viral insert upstream from the gag, pol, env sequences are integrated into the host cell genome. However, new packaging cell lines are now available, which should greatly reduce the potential for recombination (Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990).
[0105]
Other viral vectors may be used as the expression construct. Vaccinia virus (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), adeno-associated virus (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Hermonat and Muzycska viruses, such as viruses; May be used. They provide some attractive features for a variety of mammalian cells (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).
[0106]
Several non-viral methods for transferring expression constructs into cultured mammalian cells are also contemplated by the present invention. These include calcium phosphate precipitation (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990), DEAE dextran (Gopal, 1985), electroporation (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984). ), Direct microinjection, DNA-loaded liposomes, and lipofectamine-DNA complexes, sonication of cells, gene bombardment with high-speed microprojectiles, and receptor-mediated transfection (Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988). ) Is included. Some of these techniques may be successfully adapted for use in vivo or ex vivo.
[0107]
In a further aspect of the invention, the expression construct may be encapsulated in a liposome. Liposomes are vesicular structures characterized by a phospholipid bilayer and an inner aqueous medium. Multilamellar liposomes have multiple lipid layers separated by an aqueous medium. They form spontaneously when phospholipids are suspended in excess aqueous solution. The lipid component undergoes self-rearrangement before forming a closed structure, capturing water and dissolved solutes between the lipid bilayers. Similarly, lipofectamine-DNA complexes are also considered.
[0108]
Liposome-mediated nucleic acid delivery and in vitro expression of foreign DNA has been very successful. Wong et al. (1980) demonstrated the feasibility of liposome-mediated delivery and expression of foreign DNA in cultured chicken embryo, HeLa, and hepatoma cells. Nicolau et al. (1987) succeeded in liposome-mediated gene transfer in rats after intravenous injection.
[0109]
Many selection systems, including but not limited to the HSV thymidine kinase, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, and adenine phosphoribosyltransferase genes in tk, hgprt, or apart cells, respectively, may be used. Similarly, antimetabolite resistance is measured by dhfr conferring resistance to methotrexate, gpt conferring resistance to mycophenolic acid, neo conferring resistance to aminoglycoside G418, and hygro conferring resistance to hygromycin. Can be used as a basis for selecting
[0110]
Pharmaceutical composition
When considering clinical applications, pharmaceutical composition expression vectors, viral stocks, proteins, antibodies, and drugs may need to be prepared in a form suitable for the intended application. Generally, this will involve preparing a composition that is essentially free of impurities that can be harmful to humans or animals.
[0111]
In general, it will be desirable to use appropriate salts and buffers to render the delivery vector stable and capable of being taken up by target cells. When introducing recombinant cells into a patient, a buffer is used as well. The aqueous compositions of the present invention comprise an effective amount of a protein or peptide dissolved or dispersed in a pharmaceutically acceptable carrier or aqueous medium. Such a composition is also called an inoculum. The term "pharmaceutically or pharmacologically acceptable" means molecular entities and compositions that do not cause an adverse, allergic, or other untoward reaction when administered to an animal or human. As used herein, "pharmaceutically acceptable carrier" includes any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents and the like. The use of such media and materials for pharmaceutically active substances is well known in the art. Unless conventional media or materials are incompatible with the proteins or peptides of the present invention, they are contemplated for use in therapeutic compositions. Supplementary active ingredients can be incorporated into the compositions as well.
[0112]
The active compositions of the present invention may include classic pharmaceutical preparations. These compositions according to the present invention are administered by any common route, so long as the target tissue is available by that route. This includes oral, nasal, buccal, rectal, vaginal or topical administration. Alternatively, administration may be orthotopic, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, or intravenous injection. Such compositions will usually be administered as the pharmaceutically acceptable composition described above.
[0113]
Pharmaceutical dosage forms suitable for use by injection include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion. In all cases, the form must be sterile and must be fluid to the extent that easy syringability exists. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, and the like), suitable mixtures thereof, and vegetable oils. Proper fluidity can be maintained, for example, by using a coating such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersants, and by using a surfactant. Prevention of the action of microorganisms can be obtained by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride. Prolonged absorption of the injectable compositions can be brought about by the use in the compositions of agents delaying absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin.
[0114]
Injectable sterile solutions are prepared by incorporating the active compound in the required amount in the appropriate solvent with various other ingredients enumerated above and, if necessary, sterilizing by filtration. Generally, dispersions are prepared by incorporating the various sterilized active ingredients into a sterile vehicle. In the case of sterile powders for preparing injectable sterile solutions, the preferred preparation methods are vacuum drying and freeze-drying techniques which result in a powder of the active ingredient and any further desired ingredients from the previously filter sterilized solution.
[0115]
Therapeutic agent
In certain embodiments, the chemotherapeutic agent may be conjugated to a targeting peptide or fusion protein for selective delivery to the tumor. Substances or factors suitable for use may include any chemical compound that induces DNA damage when applied to cells. Chemotherapeutic agents include 5-fluorouracil, bleomycin, busulfan, camptothecin, carboplatin, chlorambucil, cisplatin (CDDP), cyclophosphamide, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, estrogen receptor binding substance, etoposide (VP16), farnesyl -Protein transferase inhibitors, gemcitabine, ifosfamide, mechlorethamine, melphalan, mitomycin, navelbine, nitrosoureas, plicomycin, procarbazine, raloxifene, tamoxifen, taxol, temazolomide (a water-soluble form of DTIC), transplatinum, vinblastine and methotrexin, vinuxtin Or any analog or derivative variant described above, including Not a constant. Most chemotherapeutic agents fall into the following categories: alkylating agents, antimetabolites, antitumor antibiotics, corticosteroid hormones, mitotic inhibitors, and nitrosoureas, hormonal substances, miscellaneous substances, and any analogs thereof. Body or derivative variant.
[0116]
Chemotherapeutic agents and methods of administration, dosages, etc. are well known to those of skill in the art (eg, “Doctors' Package Collection”, Goodman and Gilman's “Pharmacological Treatment”, the relevant portions of which are incorporated herein by reference. See "The Pharmacological Basis of Therapeutics", and "Remington's Pharmaceutical Sciences", which may be combined with the present invention in light of the disclosure herein. Any variation in dosage will occur as needed depending on the condition of the subject being treated. The person responsible for administration will, in any event, determine the appropriate dose for the individual subject. Examples of specific chemotherapeutic agents and dosage regimes are also described herein. Of course, all of these doses and substances and dosing regimes are exemplary, not limiting, and those skilled in the art may use other doses or substances for a particular patient or application. Any dose between these points, or the range derivable therefrom, is also expected to be used in the present invention.
[0117]
Alkylating agent
Alkylating agents are agents that interact directly with genomic DNA to prevent cancer cell growth. Chemotherapeutic agents in this category affect all phases of the cell cycle, ie, they represent substances that are not phase-specific. Alkylating agents may include, but are not limited to, nitrogen mustard, ethylenimene, methylmelamine, alkylsulfonates, nitrosoureas, or triazines. They include, but are not limited to, busulfan, chlorambucil, cisplatin, cyclophosphamide (cytoxan), dacarbazine, ifosfamide, mechlorethamine (mastergen), and melphalan.
[0118]
Antimetabolites
Antimetabolites disrupt DNA and RNA synthesis. Unlike alkylating agents, they specifically affect the S phase of the cell cycle. Antimetabolites can be divided into various categories, such as folate, pyrimidine and purine analogs and related inhibitory compounds. Antimetabolites include, but are not limited to, 5-fluorouracil (5-FU), cytarabine (Ara-C), fludarabine, gemicitabine and methotrexate.
[0119]
Natural products
Natural products generally refer to compounds that are initially isolated from natural resources. Such compounds, analogs and derivatives thereof, may be isolated from natural sources and may be produced by chemical synthesis or recombinant by any technique known to those skilled in the art. Natural products include classes such as mitotic inhibitors, antitumor antibiotics, enzymes and biological response modifiers.
[0120]
Mitotic inhibitors include plant alkaloids and other natural products that can inhibit any protein synthesis required for cell division or division. They operate at specific phases of the cell cycle. Mitotic inhibitors include, for example, docetaxel, etoposide (VP16), teniposide, paclitaxel, taxol, vinblastine, vincristine, and vinorelbine.
[0121]
Taxoids are a class of related compounds isolated from the bark of Taxus brevifolia, an ash tree. Taxoids include, but are not limited to, compounds such as docetaxel and paclitaxel. Paclitaxel binds to tubulin (at a different site than that used by vinca alkaloids) to promote microtubule assembly.
[0122]
Vinca alkaloids are a type of plant alkaloid that has been identified as having pharmaceutical activity. They include compounds such as vinblastine (VLB) and vincristine.
[0123]
Antitumor antibiotics
Antitumor antibiotics have both antibacterial and cytotoxic activities. These drugs also interfere with DNA by chemically inhibiting enzymes and division or by altering cell membranes. These substances are not cell cycle specific because they act at all stages of the cell cycle. Examples of anti-tumor antibiotics include, but are not limited to, bleomycin, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin (adriamycin), plicamycin (mithramycin), and idarubicin.
[0124]
hormone
Corticosteroid hormones are considered chemotherapeutic agents if they kill cancer cells or slow growth. Corticosteroid hormones are often used in combination treatments to increase the effectiveness of other chemotherapeutic agents. Prednisone and dexamethasone are examples of corticosteroid hormones.
[0125]
Progestins such as hydroxyprogesterone caproate, medroxyprogesterone acetate, and megestrol acetate have been used in endometrial and breast cancer. Estrogens such as diethylstilbestrol and ethinylestradiol have been used for cancers such as breast and prostate. Antiestrogens such as tamoxifen have been used in cancers such as breast cancer. Androgens such as testosterone propionate and fluoxymesterone have also been used in the treatment of breast cancer. Antiandrogens, such as flutamide, have been used to treat prostate cancer. Gonadotropin-releasing hormone analogs such as leuprolide have been used to treat prostate cancer.
[0126]
Miscellaneous substances
Some chemotherapeutic agents do not fall into the previous category based on their activity. They include, but are not limited to, platinum coordination complexes, anthracenediones, substituted ureas, methylhydrazine derivatives, adrenocortical inhibitors, amsacrine, L-asparaginase, and tretinoin. It is contemplated that they may be used in the compositions and methods of the present invention.
[0127]
Platinum coordination complexes include compounds such as carboplatin and cisplatin (cis-DDP).
[0128]
Anthracenediones, such as mitoxantrone, have been used to treat acute granulocyte leukemia and breast cancer. Substituted ureas, such as hydroxyurea, have been used to treat chronic granulocytic leukemia, polycythemia vera, essential thrombocytosis, and malignant melanoma. Methylhydrazine derivatives such as procarbazine (N-methylhydrazine, MIH) have been used for the treatment of Hodgkin's disease. Adrenocortical inhibitors such as mitotane have been used to treat adrenocortical cancer, and aminoglutethimide has been used to treat Hodgkin's disease.
[0129]
Regulators of programmed cell death
Apoptosis or programmed cell death is an essential process for maintaining homeostasis and suppressing carcinogenesis in adult tissues during normal embryo development (Kerr et al., 1972). The Bcl-2 protein family and ICE-like proteases have proven to be important regulators and effectors of apoptosis in other systems. The Bcl-2 protein discovered in connection with follicular lymphoma plays a prominent role in controlling apoptosis and enhancing cell survival in response to a variety of apoptotic stimuli (Bakshi et al., 1985; Cleary and Sklar). Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto and Croce, 1986). Evolutionarily conserved Bcl-2 proteins are now recognized as members of a related protein family, and they can be classified as death agonists or death antagonists.
[0130]
Since its discovery, Bcl-2 has been shown to act to suppress cell death induced by various stimuli. Similarly, it is now clear that there is a family of Bcl-2 cell death regulatory proteins with common structure and sequence homology. These different family members have functions similar to Bcl-2 (Bcl-2).XL, Bclw, Bcls, Mcl-1, A1, Bfl-1), or offset Bcl-2 function to promote cell death (eg, Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri). It is shown that
[0131]
Non-limiting examples of pro-apoptotic agents considered within the scope of the present invention include: gramicidin, magainin, melittin, defensin, cecropin, (KLAKLAK)2(SEQ ID NO: 1), (KLAKKKLA)2(SEQ ID NO: 2), (KAAKKAA)2(SEQ ID NO: 3) or (KLGKKLG)3(SEQ ID NO: 4).
[0132]
Angiogenesis inhibitor
In certain embodiments, the present invention provides angiotensin, laminin peptide, fibronectin peptide, plasminogen activator inhibitor, tissue metalloproteinase inhibitor, interferon, interleukin 12, platelet factor 4, IP-10, Gro-β, Thrombospondin, 2-methoxyestradiol, proliferin-related protein, carboxamide triazole, CM101, marimastat, pentosan polysulfate, angiopoietin 2 (regeneron), interferon-α, herbimycin A, PNU145156E, 16K prolactin fragment, linomidide, thalidomide, Pentoxifylline, genistein, TNP-470, endostatin, paclitaxel, accutin, angiostatin, cidofo It may also relate to administering a targeting peptide conjugated to an anti-angiogenic agent such as Bill, vincristine, bleomycin, AGM-1470, platelet factor 4, or minocycline.
[0133]
dose
Those skilled in the art will follow "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15th edition, Chapter 33, especially pages 624-652. Some variation in dosage will necessarily occur depending on the condition of the subject being treated. The person responsible for administration will in any event determine the appropriate dose for the individual subject. In addition, for human administration, preparations must meet sterility, pyrogenicity, and general safety and purity standards as required by FDA Office of Biopharmaceutical Standards.
[0134]
Example
The following examples are included to demonstrate preferred embodiments of the invention. The techniques disclosed in the following examples represent techniques that have been discovered by the inventors to function satisfactorily in the practice of the present invention, and thus may be considered to constitute a preferred mode for the practice. Must be recognized by those skilled in the art. However, those skilled in the art will recognize that many modifications can be made to certain aspects of the disclosure and still achieve similar or similar results without departing from the spirit and scope of the invention. Should be recognized in light of the
[0135]
Embodiment 1 FIG. Bone marrow targeting peptide
A non-limiting example of an organ of particular interest for the targeting peptide is bone marrow. Bone is the preferred site of metastasis in the majority of patients with prostate cancer (Fidler, 1999). This remarkable selectivity has been regarded as an example of a site-specific interaction that is essential for cancer progression (Rak, 1995; Zetter, 1998). Despite its clinical relevance, little is known about the mechanisms that control prostate cancer that has spread to bone. Furthermore, there has been no effective strategy for targeting therapeutics for the treatment of metastatic prostate cancer (Brodt et al., 1996).
[0136]
A subset of peptides that can selectively return to bone marrow through systemic circulation may stimulate the behavior of prostate cancer cells during bone metastasis formation. Vascular markers targeted by using phage display may also be utilized for tumor cell metastasis. This concept has already been proven to be true for pulmonary regression peptides. Peptides that return to the blood vessels of the lung inhibit experimental metastasis. These results are based on a modified seed and soil model in which site-specific metastasis is based on the presence of regression receptors in the blood vessels of specific tissues where metastasis occurs selectively. Fit. Such selective vascular markers are exposed to tumor cells during adhesion, the first step in the metastatic cascade. Isolation of bone marrow regression peptides may be used to identify those vascular markers that mediate prostate cancer cell regression during the metastatic process, and for potential therapeutic intervention to prevent bone metastasis, or Useful for selectively imaging and / or treating cancers that have already metastasized.
[0137]
Method
In vivo screening of phage libraries was used to isolate peptides that bind to bone marrow in mice. Bone marrow targeting peptides were characterized for their ability to inhibit metastasis in a prostate cancer mouse model. Affinity chromatography and molecular cloning were used to identify the receptor for the bone marrow binding peptide. The compositions and methods disclosed herein have been useful for developing new anti-prostate cancer treatment strategies that focus on the prevention and treatment of bone metastases.
[0138]
In vivo screening to isolate peptides returning to bone marrow in mice
The phage library was injected intravenously. Libraries were prepared according to the protocol of Smith and Scott (1985) with the modifications described below. Phages contained in these libraries displayed inserts ranging from 5 to 11 residues. Tissue samples were processed for phage rescue by transferring to 1 ml DMEM-PI in a glass tube and homogenized with a grinder. Bone marrow did not require homogenization, but other organs used as controls needed to be minced before they could be efficiently homogenized. The sample was transferred to an autoclaved 2 ml Eppendorf tube. Tissue was washed with ice-cold DMEM-PI containing 1% BSA. After three washes, the pellet was resuspended and brought to 37 ° C. before adding cells. To collect phage particles, 1.5 ml of competent K91-kan bacteria (1:10 dilution of OD)600 0.2) at room temperature for 1 hour was used.
[0139]
Multiple aliquots were plated on LB tet / kan plates or dishes containing 40 μg / ml tetracycline and 100 μg / ml kanamycin. Seeding was performed at several concentrations covering a wide range of samples: 3 ml, 1 ml, 300 μl, 100 μl, 30 μl. The beads used for seeding were passaged to two subsequent 10 cm LB tet / kan plates to collect any phage-infected bacterial clones that might have been captured on the bead surface. The dishes were incubated at 37 ° C. overnight. Transfer the remaining 2-3 ml of the infected culture (including the homogenized tissue) to 10 ml of LB medium (LB tet / kan) containing 40 μg / ml tetracycline and 100 μg / ml kanamycin and shake at 37 ° C. Placed in a bowl for 2 hours. The 12 ml culture was expanded to 1 liter LB tet / kan and grown overnight in a 37 ° C shaker. After 12-16 hours, phages were rescued from bulk amplified bacterial cultures according to standard protocols and set aside for a second round of selection. From the plate / dish in the incubator, well isolated colonies from bone marrow were sequenced. Colonies were transferred to 96-well plates containing 20 μl PBS per well for sequencing.
[0140]
Immunohistochemical staining with an anti-M13 antibody was used to investigate phage targeting in various tissues (Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Arap et al., 1998). Phage were injected IV and allowed to circulate for 5 minutes or 24 hours. In the 5 minute experiment, mice were perfused with DMEM after phage injection to remove unbound phage from the circulation. After 24 hours, few circulating phages were present (Arap et al., 1998a, 1998b). Animals were sacrificed, tissues were collected, fixed in Bouin's solution, sectioned, and stained with antibodies to phage.
[0141]
result
In vivo mouse bone marrow targeting in mice
The phage library was injected intravenously into mice and phage was collected from the bone marrow, thereby identifying a bone marrow targeting sequence motif. The phage was injected intravenously, recovered from bone marrow, repeatedly amplified in vitro and re-injected until sufficient enrichment was obtained. After three rounds of selection, a phage preparation that returned to the mouse bone marrow was obtained. Individual phage showed similar organ specificity to pooled phage after intravenous injection. Several peptide motifs have been identified and characterized. The most promising motifs showing specificity in vivo are shown in Table 3.
[0142]
TABLE 3 Sequences in phage targeting mouse bone marrow in vivo
Figure 2004508045
[0143]
Those skilled in the art will appreciate that the bone marrow targeting peptide sequence identified herein can be used for targeted delivery of therapeutic agents or gene therapy, in vivo imaging of normal or diseased organs, tissues, or cell types, organs, tissues, or cells. Understand that the identification of receptors and receptor ligands in the form and would be useful for a number of applications within the scope of the present invention, including but not limited to the therapeutic treatment of a number of human diseases, especially metastatic prostate cancer Will do.
[0144]
Embodiment 2. FIG. Targeting peptides for prostate and prostate cancer
Another non-limiting organ of particular interest for targeting is the prostate. The prostate is an unusual organ because it continues to proliferate throughout the adult life. As a result, benign prostatic hyperplasia (BPH) has had some impact on most elderly men. More importantly, the prostate is a common site for malignant tumors. One in 11 men is believed to develop prostate cancer in their lifetime. Due to the availability of serum markers for prostate cancer, many of these malignancies are now detected early in the course of the disease. Many are invasive by surgery or radiation therapy, often with catastrophic side effects such as incontinence and impotence because there is no reliable means to predict who will progress clinically (Lane and Shah, 1999; Mikolajczyk et al., 2000). There is a clear need for improved methods for detecting, diagnosing, and treating human prostate cancer.
[0145]
Many genes of interest in the prostate can be expressed in limited (but probably highly specific or accessible) cell locations such as the prostate vasculature. Thus, potential targets for intervention can easily be overlooked in high-throughput sequencing or gene array methods that do not take into account the molecular heterogeneity inherent in the microanatomical or physiological environment. There is.
[0146]
The method of the invention allows the identification of peptides that return to specific target sites in vivo (Pasqualini et al., 1996, 1997; Koivunen et al., 1999; Pasqualini, 1999). In vivo selection of a phage peptide library yields peptides that can return to specific receptors in target tissues via the circulation. These studies revealed a surprising specialization in various normal tissues (Pasqualini, 1999; Rajotte et al., 1998, 1999). The present invention relates to compositions and uses of prostate cancer targeting peptides.
[0147]
Method
In vivo phage targeting of the prostate
The phage display library was injected intravenously. Samples were always kept on ice. Prostate tissue samples were processed as follows. The first sample was stored at -80 C as a backup. A second sample was processed for histology / pathology and HE or anti-M13 phage immunostaining. The third sample was split under clean conditions to obtain three pieces of equal weight.
[0148]
Triplicate samples from a third prostate sample were processed for host bacterial infection and phage recovery. Prostate samples were transferred to 1 ml DMEM protease inhibitor (PI) in a glass tissue grinder, homogenized, and the cell suspension was transferred to an autoclaved 2 ml Eppendorf tube. Next, the prostate tissue sample was washed three times with ice-cold DMEM-PI containing 1% BSA. After each wash, the tissue was mixed with DMEM-PI and vortexed for 30 seconds. After spinning at 4,000 rpm for 3 minutes, the supernatant was carefully discarded (do not touch the tissue pellet). Next, 1.5 ml of DMEM-PI / BSA was added. After the third wash, the pellet was briefly vortexed to resuspend, and the dissolved pellet was briefly warmed to 37 ° C. before adding host bacteria. The mixture is then mixed with 1.5 ml of competent K91-kan bacteria (OD600= 2) for 1 hour at room temperature.
[0149]
The mixture was transferred to a Falcon tube containing 10 ml LB medium + 0.2 μg / ml tetracycline at RT for 20 minutes. Multiple aliquots were plated on LB tet / kan plates or dishes containing 40 μg / ml tetracycline and 100 μg / ml kanamycin. Finally, the dishes were incubated at 37 ° C. and after overnight incubation, the number of phage transducing units was determined.
[0150]
Prostate cancer targeting
Tumor vessels are known to be leaky. Relatively long-term exposure of mouse subjects to phage display libraries can result in phage migration and binding to prostate cancer cell markers. Mice were incubated with the phage library for 24 hours to target cancer cell markers.
[0151]
10 male nude mice (4)6PBS containing DU-145 cells was injected. After tumor growth, mice were injected with any of the CX10C phage display libraries. After circulating the library for 24 hours, the mice were sacrificed and tissue samples were collected. Samples were homogenized with a Dounce homogenizer and K91 bacteria was added to recover phage. Bacteria were plated in triplicate on kan / tet LB plates at a series of dilutions. The remaining tumor homogenate containing bacteria was incubated with 10 ml of LB / tet / kan for 1 hour at RT. To obtain a large phage stock, an additional 10 ml of LK / tet / kan was added and incubated at 37 ° C. in a shaker. 216 colonies were picked from the plate to make a mixed stock for the second round of screening. After amplifying the clones, they were pooled and the phage were precipitated with PEG / NaCl. Using the pooled phage collected from the first round, nude mice bearing prostate tumors were subjected to a second round of selection as described above. A third screening was performed as described above.
[0152]
result
Normal mouse prostate
Table 4 shows the mouse prostate targeting peptide motifs obtained by the method disclosed above.
[0153]
TABLE 4 Mouse prostate targeting peptide obtained by in vivo phage display
Figure 2004508045
[0154]
Prostate cancer
A third round of in vivo screening resulted in phage that showed high selectivity for tumor migration compared to control normal kidney tissue (not shown). Prostate cancer targeting sequences identified by sequencing the phage insert are listed in Table 5.
[0155]
[Table 5] Prostate cancer targeting peptide
Figure 2004508045
[0156]
One skilled in the art will appreciate that the prostate targeting peptide sequence identified herein can be used for targeted delivery of therapeutic agents or for gene therapy, in vivo imaging of normal or diseased organs, tissues, or cell types, organs, tissues, or cells. It will be appreciated that the identification of receptors and receptor ligands in the form and will be useful for a number of applications within the scope of the present invention, including but not limited to the therapeutic treatment of a number of human diseases, especially prostate cancer. There will be.
[0157]
Embodiment 3 FIG. Identification of targeting peptides for mouse placenta, fat, ovary, and ureter
Identification of placental regression peptides
Peptides returning to the mouse placenta were identified by a post-clearing protocol using a phage display library. The first biopanning was performed on pregnant mice. Placental samples were removed and phage rescued according to the standard protocol described above, including one modification. In a typical biopanning protocol, thousands of phage can be recovered from a single organ, tissue, or cell type. Typically, 200-300 independent colonies were selected from the seeded phage, amplified and pooled to form a phage display library for a second or third biopanning . In this example, all phage rescued from the first biopanning were bulk amplified on solid media and then pooled to form a phage display library for the second biopanning. That is, there was no restriction of phage rescued from the first biopanning. This unrestricted in vivo biopanning was performed three times (first to third times), and then the post-clearing method was used.
[0158]
In the post-clearing protocol (fourth), phages were administered to non-pregnant mice. Phage bound to tissues other than the placenta were absorbed from the circulation. The remaining phage were recovered from the placenta of non-pregnant mice. This protocol was designed to isolate phage that bind to the placenta and do not bind to other mouse organs, tissues, or cell types. The following placental targeting peptides were identified with their frequency. A search of the GenBank database disclosed that none of the SEQ ID NOs listed below were 100% homologous to the known peptide sequence.
Figure 2004508045
[0159]
As shown, use of the post-clearing method resulted in substantial enrichment of phage retaining the placental targeting peptide. Although this technique was used with the placenta, one of skill in the art would be able to administer any organ, tissue, or cell type if the phage library could be administered to a subject lacking that organ, tissue, or cell type. It will be appreciated that post clearance may be implemented for For example, post-clearing methods for targeting peptides to the prostate or testis can be performed in female subjects, and for ovaries, vagina, or uterus, can be performed in male subjects.
[0160]
By homology search, TCRγ-1 (TPKTSVT, SEQ ID NO: 39), tenascin (RMDPGPVR, SEQ ID NO: 40 and RAPGGVR, SEQ ID NO: 41), MHC class II (LGLRSVG, SEQ ID NO: 44), angiotensin I (YIRPFTL) , SEQ ID NO: 43), and several candidate proteins, including the MHC H2-Dq alpha chain (VGLHARA, SEQ ID NO: 42), were identified as endogenous analogs of the placental targeting peptide.
[0161]
Confirmation of placental regression peptide and inhibition of pregnancy
Confirmation of the placental regression peptide was performed in vivo by injection into pregnant mice and recovery from placenta. FIG. 1 shows the results of a confirmation study on selected placental regression phages. Phage clones are identified as PA-TPKTSVT (SEQ ID NO: 39), PC-RAPGGGVR (SEQ ID NO: 41), PE-LGLRRSVG (SEQ ID NO: 44), and PF-YIRPFTL (SEQ ID NO: 43). It is shown that the PA clone exhibited placental regression more than an order of magnitude greater than that observed with control fd-tet phage. The PC clone also showed significantly higher placental transfer, whereas the PE and PF clones were not substantially enriched in placenta compared to control phage.
[0162]
Despite the lack of apparent enrichment of PF clones in placental tissue, both PA and PF peptides showed anti-placental activity. Table 6 shows the effects of FITC (fluorescein isothiocyanate), GST (glutathione S-transferase), or placental targeting peptides PA and PF attached to phage injected into pregnant mice. At relatively low doses (450 μg total), PA and PF conjugated to FITC showed a slight effect on pregnancy (Table 6). Relatively high doses (800 μg to 1000 μg protein or 4.5 × 1010In phage), both peptides PA and PF conjugated to proteins as well as peptides PA and PF conjugated to phage substantially interfere with fetal development (Table 6), and in most cases apparently kill fetal death. Brought. CARAC peptide (SEQ ID NO: 46), fat targeting peptide (FE, TREVHRS, SEQ ID NO: 47), or fd-tet phage were used as non-placental targeting controls.
[0163]
TABLE 6 Effect of placental targeting peptide on fetal development
Figure 2004508045
[0164]
These results confirm the placental targeting peptide sequence identified above. Furthermore, even in the absence of substantial enrichment of phage carrying the targeting sequence into the target organ (eg, peptide PF, FIG. 1), the targeting peptide will allow targeted delivery of the therapeutic agent to the target organ. Proving that it can be provided. In this study, at relatively low doses, the PF peptide was more effective at preventing pregnancy than the PA peptide, despite the observation that the PA peptide translocated the phage to the placenta at many-fold higher levels. It seemed.
[0165]
One of skill in the art will appreciate that the disclosed methods and peptides may be useful for targeted delivery of therapeutic agents to the fetus via the placenta, and novel approaches for terminating pregnancy.
[0166]
Fat targeting peptide
A similar protocol was used to isolate lipid targeting peptides from genetically obese mice (Zhang et al., 1994; Pelleymounter et al., 1995), including post-clearing performed in normal mice. The isolated lipid targeting peptides include TRNTGNI (SEQ ID NO: 48), FDGQDRS (SEQ ID NO: 49), WGPKRL (SEQ ID NO: 50), WGERL (SEQ ID NO: 51), VMGSVTG (SEQ ID NO: 52), KGGRAKD (SEQ ID NO: 53), RGEVLWS (SEQ ID NO: 54), TREVHRS (SEQ ID NO: 47), and HGQGVRP (SEQ ID NO: 55).
[0167]
By homology search, stem cell growth factor (SCGF) (KGGRAKD, SEQ ID NO: 53), attractin (mahogany) (RGEVLWS, SEQ ID NO: 54), angiopoietin-associated fatty acid (angiopoitin-related adipase) (FIAF) (TREVHRS, SEQ ID NO: 47), adipofilin (ADRP) (VMGSVTG, SEQ ID NO: 52), Flt-1 or procollagen type XVII (TRNTGNI, SEQ ID NO: 48), and fibrillin 2 or transferrin Candidate proteins, including p97-like protein p97 (HGQGVRP, SEQ ID NO: 55), are endogenous analogs of lipid targeting peptides Identified.
[0168]
Confirmation of fat targeting peptide
As shown in FIG. 2, confirmation of the lipid regression peptide was performed by in vivo regression. The selected lipid regression clones were FA-KGGRAKD (SEQ ID NO: 53), FC-RGEVLWS (SEQ ID NO: 54), FE-TREVHRS (SEQ ID NO: 47), and FX-VMGSVTG (SEQ ID NO: 52). Was. As shown in FIG. 2, these clones all showed increased regression to adipose tissue, and clone FX showed several orders of magnitude higher fat translocation than control fd-tet phage. Clone FX showed substantially higher migration than the other selected lipid regression clones. However, by analogy with the placental regression peptides disclosed above, those skilled in the art may find that even lipid regression clones that exhibit relatively low levels of adipose tissue translocation can be useful for targeted delivery of therapeutic agents. You will understand that.
[0169]
One of skill in the art will appreciate that targeting peptides that are selective for angiogenic vasculature in adipose tissue may be useful for weight loss or prevention of weight gain. By attaching an anti-angiogenic or toxic moiety to the fat targeting peptide, it is possible to selectively inhibit blood vessels that supply nutrients to new lipid tissue and prevent the growth of new lipid deposits It may also be possible to eliminate existing lipid deposits.
[0170]
Targeting peptides for ovary and ascites
In addition, the following targeting peptide sequences for mouse ovary and ascites were identified.
[0171]
Mouse ovarian targeting peptides include GLAKLIP (SEQ ID NO: 56), HLISDMS (SEQ ID NO: 57), LQHWLLS (SEQ ID NO: 58), ALVLQG (SEQ ID NO: 59), TGVALQS (SEQ ID NO: 60), YVQSREG (SEQ ID NO: 60) No .: 61), PLFPWPYS (SEQ ID NO: 62), DGSG (SEQ ID NO: 63), EGSG (SEQ ID NO: 64), SSPRPGV (SEQ ID NO: 65), DGYPAIA (SEQ ID NO: 66), GHAIE (SEQ ID NO :: 67), and IWSTSER (SEQ ID NO: 68).
[0172]
Targeting peptides for mouse ascites include YRLRG (SEQ ID NO: 69), YRARG (SEQ ID NO: 70), SQPLG (SEQ ID NO: 71), SQPWG (SEQ ID NO: 72), QRLVTP (SEQ ID NO: 73), QVLVTP ( SEQ ID NO: 74), QRLVHP (SEQ ID NO: 75), QVLVHP (SEQ ID NO: 76), ITRWRYL (SEQ ID NO: 77), SLGGMSG (SEQ ID NO: 78), SQLAAG (SEQ ID NO: 79), SLLAAG (SEQ ID NO: : 80), SQLVAG (SEQ ID NO: 81), SLLAAG (SEQ ID NO: 82), GLPSGLL (SEQ ID NO: 83), HGGSANNP (SEQ ID NO: 84), SLEAFFL (SEQ ID NO: 85), CVPELGHEC (SEQ ID NO: 86) ), CELGFELGC (SEQ ID NO: 87) And CFFLRDWFC (SEQ ID NO: 88) are included.
[0173]
Uterine targeting peptide
A similar protocol was used to identify the urethral targeting peptide in C57B1 mice as disclosed in Table 7.
[0174]
Table 7: Urethral targeting peptides
Figure 2004508045
[0175]
Example 4: In vivo screening of alpha spleen antibody library by BRASIL
A targeting peptide for the spleen has not been previously identified. Biopanning on spleen tissue is complicated by the high background of nonspecific phage translocation to the spleen as part of the retinal endothelial system. The reduced background observed in biopanning by the BRASIL method is advantageous for the identification of targeting peptides against tissues such as spleen.
[0176]
This example demonstrates an exemplary embodiment of the BRASIL method. A phage library based on immunoglobulins obtained against a labeled organ (mouse spleen) was developed and then subjected to in vivo biopanning. Mouse spleens were injected into chickens to construct an immunoglobulin library. Following the booster, chicken spleens were harvested and immunoglobulin variable domain sequences were obtained by PCR ™ amplification of chicken spleen mRNA. The amplified immunoglobulin variable sequence was inserted into a phage display library (α-library), which was then used for in vivo biopanning on mouse spleen. Thus, the spleen targeting peptide obtained from phage that migrated into the mouse spleen in vivo was derived from antibody fragments produced in chickens in response to mouse spleen antigen. The success of this example further demonstrates the broad applicability of the BRASIL method. One skilled in the art will appreciate that the present invention is not limited to the embodiments disclosed herein, and that many further developments of the BRASIL methodology are within the scope of the present invention.
[0177]
Materials and methods
Library construction
White leghorn chickens were immunized with spleen homogenate (about 150 mg per injection) from perfused (10 ml MEM) Balb / c mice. Four and eight weeks after the first immunization, chickens were given a booster inoculation of spleen homogenate. An immune response to the mouse spleen by FACS analysis indicated that the chicken immune serum contained antibodies to the mouse cell line (TRAMP-C1). Twelve weeks after the first immunization, the chickens were sacrificed and their spleens were excised into TRI reagent (Molecular Research Center, Inc., Cincinatti, OH).
[0178]
Total RNA was prepared from chicken spleen using the TRI reagent manufacturer's protocol. CDNA was prepared from total RNA using oligo (dT) primers and Superscript enzyme (Life Technologies). The cDNA encoding the chicken spleen immunoglobulin variable region was ligated with CHybVH and ChybIgB primers (Vheavy) Or CSCVK primer and CHHybL-B primer (Vκ). The variable and constant regions of the light chain consist of the CSC-F and lead-B primers,κMold and CκBoth were PCR ™ amplified using the template. The variable and constant regions of the heavy chain are composed of dp-seq and lead-F primers,heavyMold and CheavyBoth were PCR ™ amplified using the template. The heavy and light chain fragments were both PCR ™ amplified using CSC-F primers and dp-Ex primers. PCR primers are listed in the Cold Spring Harbor Laboratory Lecture Manual, "Phage Display of Combinatorial Antibody Libraries" (Barbas et al., 2000), the contents of which are incorporated herein by reference. Using the primer sequences shown, they were purchased from Genosys or GenBase.
[0179]
After digestion with SfiI, the amplification product was ligated with SfiI digested pComb3x for insertion into a phage library. The ligated pComb3-123 plasmid was electroporated into ER2537 E. coli and phage production was initiated by subsequent VCM13 (helper phage) infection. The obtained library size is about 5 × 106cfu.
[0180]
In vivo screening of alpha spleen library using BRASIL
Four in vivo screens in mice were performed using the chicken alpha spleen library. About 0.8-2.0 × 1010TU was injected into Balb / c mice. The library was cycled for 5 minutes. After sacrifice, the mouse spleen was collected and a single cell suspension was prepared by passing the spleen through a 70 μm cell-filtered nylon mesh. Using BRASIL technology, the single cell suspension was centrifuged with oil (9: 1 dibutyl phthalate: cyclohexane) and the pellet was infected with 200 μl of exponentially growing ER2537 E. coli. The amplified phage recovered from the mouse spleen was used for the next screening. There was no apparent enrichment during screening for the number of phage returning to the spleen and brain compared to conventional biopanning methods using spleen pieces obtained prior to BRASIL.
[0181]
Phage transferred to the mouse spleen from the fourth screening of the chicken Fab insert were PCR ™ amplified and the PCR product was digested with BstI. Half of the 90 clones analyzed gave a similar restriction pattern. Of these, 20 clones were sequenced and only 2 had the same restriction pattern. Four of the antibody-based phage clones (# 2, # 6, # 10, and # 12) were subjected to further analysis using binding and migration assays.
[0182]
Testing clones in vitro using BRASIL
Single cell suspensions were prepared from two mouse spleens. The suspension was divided into 5 tubes and 3x109TU Fab clones # 2, # 6, # 10, # 12, and 2 × 109Incubated with TU tet phage on ice. Phage bound to mouse splenocytes were recovered by BRASIL. 200 μl of log phase ER2537 E. coli were infected with the pellet and serial dilutions were plated on LB / carbenicillin and LB / tetracycline plates for evaluation of phage binding. fd-tet was used as an internal standard to normalize all phage regression experiments.
[0183]
Testing clones in vivo with BRASIL
Phage of Fab clones # 2, # 6, # 10, # 12 (3 × 109), And 2 × 109TU tet phage was injected into the tail vein of Balb / c mice and allowed to circulate for 5 minutes. Spleens were harvested and single cell suspensions were prepared on ice from whole spleens. Cell-bound phages were recovered by BRASIL. 200 μl of log phase ER2537 E. coli were infected with the pellet and serial dilutions were plated on LB / carbenicillin and LB / tetracycline plates for evaluation of phage recovery.
[0184]
In vivo testing of clone # 10 with BRASIL (compared to control phage NPC-3TT)
Phage (3 × 10 4) of Fab clone # 10 and NPC-3TT (control Fab phage)9TU), and 1 × 109Mice (2 for NPC-3TT and 2 for clone # 10) were injected with TU Fd-tet phage and allowed to circulate for 5 minutes. Spleens were harvested and single cell suspensions were prepared on ice. Cell-bound phages were recovered by BRASIL. 200 μl of log phase ER2537 E. coli were infected with the pellet and serial dilutions were plated on LB / carbenicillin and LB / tetracycline plates. NPC-3TT phage is a phage displaying a human anti-tetanus toxin Fab fragment.
[0185]
Regression of Fab clone # 10 into spleen (compared to bone marrow)
Fab clone # 10 and NPC-3tt control phage (3 × 109TU), and 1 × 109Mice (2 for NPC-3TT and 2 for clone # 10) were injected with TU Fd-tet control phage and allowed to circulate for 5 minutes. Spleens were harvested and single cell suspensions were prepared on ice. Bone marrow (both femurs) was collected from the same mice as a control for organ-specific regression. Cell-bound phages were recovered by BRASIL.
[0186]
Preparation of Fab fragment
Plasmid pComb3 containing the chicken Fab insert was electroporated into ER2537 E. coli. Serial dilutions were plated on LB / carbenicillin plates and incubated at 37 ° C. overnight. Fab production cultures (in super broth containing 100 μg / ml carbenicillin) were started from single inoculated colonies. Fab production was induced with 1 mM IPTG at 30 ° C. for 7 hours. After determination of the Fab concentration in the bacterial supernatant, periplasmic fractions SN1 and SN2, and the bacterial lysate by ELISA, Fab fragments were purified from periplasmic fraction SN2 by affinity purification. Dimethylpimelimidate (DMP) was coupled to an α-Fab-Protein G column (2 mg / ml) using a standard protocol (Harlow and Lane, 1988).
[0187]
The following method was used to purify the Fab fragment. Over 2 hours (when using a volume less than 50 ml with a superloop) or overnight (when using a peristaltic pump and using a volume of more than 50 ml), the SN2 fraction was transferred to 1 ml of HiTrap. -Loaded on a protein G-α-Fab column (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). The column was washed with 10-20 ml of PBS (phosphate buffered saline). The Fab fragment was eluted with 10 ml of 20 mM glycine buffer, pH 2.2, 150 mM NaCl, and 1 ml fractions were collected. Fractions were neutralized with 1 M Tris immediately after elution. The protein concentration is A280Quantified by
[0188]
Intravascular staining
To determine the in vivo distribution of recovered Fab fragments, 50-60 μg of Fab fragments (Fab # 10, NPC3-tt, or R # 16) were injected into the tail vein of Balb / c mice and allowed to circulate for 8 minutes. . Mice were injected with 50 μg of tomato (L. esculentum) lectin-FITC, and after 2 minutes of lectin circulation, mouse tissues were fixed by perfusion with 25-30 ml of 4% paraformaldehyde / PBS. The tissues were excised and post-fixed with 4% paraformaldehyde for 1 hour. The fixed tissues were incubated in 30% sucrose / PBS at 4 ° C. overnight, changing the solution at least twice. Tissues were embedded in freezing medium and frozen on dry ice.
[0189]
Fixed tissue sections were stained for Fab as follows. Frozen tissue sections (55 μm) were cut on a microtome and washed three times with PBS. The slices were blocked with PBS / 0.3% Triton X-100 / 5% goat serum for 1 hour at room temperature. Sections were incubated overnight at room temperature with 1: 400 Cy3-conjugated α-human anti-Fab antibody. The conjugated sections were washed six times with PBS / 0.3% Triton X-100 and fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes. After fixation, the sections were washed twice with PBS, twice with distilled water, and then placed on glass slides using VectorShield.
[0190]
result
In vitro transfer of phage clones expressing chicken Fab fragments into mouse splenocytes was investigated by BRASIL. As shown in FIG. 3, Fab phage clones isolated by BRASIL showed binding to differential mouse splenocytes compared to Fd-tet control phage without insert. Clone # 6 showed the lowest degree of differential binding similar to the control phage NPC-3TT, which contained the Fab fragment but was not isolated from the mouse spleen. Clones # 2, # 10, and # 12 all show selective binding to mouse splenocytes as compared to the Fd-tet control, with at least a 2-fold increased binding for clones # 2 and # 10. Was observed. The amino acid sequence determined for the clone insert is as follows:
Figure 2004508045
[0191]
A direct comparison of in vitro phage binding for Fab clones compared to NPC-3TT was performed. As shown in FIG. 4, clones # 2 and # 10 showed the highest levels of binding to mouse splenocytes in vitro. Clones # 6 and # 12 showed very slightly higher levels of binding to the mouse spleen than the binding of phage NPC-3TT.
[0192]
Preferential binding of chicken Fab phage clones was confirmed by in vivo studies using BRASIL. As shown in FIG. 5, the selective transfer to the mouse spleen is much more dramatic in vivo, and Fab clones # 2, # 6, and # 10 are many times more in comparison to Fd-tet phage. Also showed increased spleen binding. In contrast, Fab clone # 12 did not show significantly increased binding to mouse spleen as compared to Fd-tet phage. These results indicate that the in vitro results obtained with the spleen targeting phage are confirmed in vivo.
[0193]
Fab clone # 10 was selected for further characterization by transfer to the mouse spleen in vivo. The results shown in FIG. 6 confirm that Fab clone # 10 showed a 3- to 10-fold enrichment in spleen compared to Fd-tet. This effect was not due to general Fab binding, since the Fab control phage NPC-3TT did not show selective spleen translocation as compared to Fd-tet phage without insert.
[0194]
As demonstrated in FIG. 7, the binding of Fab clone # 10 was organ-specific. Phage from Fab clone # 10 and NPC-3TT control were recovered from spleen and bone marrow of the same injected mice. It is clear from FIG. 7 that Fab clone # 10 showed selective transfer to the spleen but not to bone marrow tissue. Control phage showed no selective transfer to bone marrow (FIG. 7) or spleen (not shown).
[0195]
These results indicate that Fab clone # 10 selectively targets mouse spleen tissue for binding both in vitro and in vivo. These results were further confirmed by vascular staining for in vivo phage distribution. Control phage used in this study were clone NPC-3TT (Fab fragment) and clone R # 16 (isolated from an angiogenic retinal screen).
[0196]
By fluorescent staining, Fab clone # 10 was observed to bind to mouse spleen tissue in vivo (not shown). Control phages NPC-3TT and R # 16 did not stain spleen tissue under the same conditions. Phage of clone # 10 and NPC-3TT were observed to strongly stain the kidneys of the injected animals, probably due to glomerular filtration (not shown). Other control organs (lung, brain, liver, heart, and skeletal muscle) showed no staining with clone # 10 (not shown).
[0197]
These results demonstrate that spleen targeting phage peptides can be identified by the BRASIL method. In addition, it demonstrates the feasibility of phage display technology using antibody fragments against a target organ, tissue, or cell type to obtain a starting phage library. Due to the high non-specific background, it was possible to obtain targeting peptides to the spleen, a tissue that could not be applied to biopanning using a standard phage display protocol, showing the advantage of the BRASIL method ing.
[0198]
Example 5: In Vivo Screening of α-Kaposi's Sarcoma Library in Angiogenic Retina
The angiogenic retinal system was developed as a model for angiogenic tumor tissue. Hypoxia in neonatal mice causes an angiogenic response in the retina. Angiogenic retinal tissue receptors show similarities to angiogenic tumor tissue with respect to phage display binding.
[0199]
Materials and methods
Angiogenic model system
One week old C57BL / 6J mice were exposed to a 75% oxygen atmosphere for 5 days and then maintained in air for an additional 5 days. The proliferative neovascular response was quantified by counting the nuclei of new blood vessels that extended from the retina into the vitreous region in 6 μm transverse sections. This model was used to evaluate the binding of phage display libraries injected intravenously into mice to newly formed angiogenic blood vessels. The peak of angiogenesis was observed at 17-21 days after birth.
[0200]
Phage display
Using the same method as previously disclosed for the spleen, a Fab phage library (α-KS) for Kaposi's sarcoma tumor tissue immunized into rabbits was generated. Three in vivo screens were performed using the α-KS library in the angiogenic retinal model system. Two C57BL / 6J mice with hypoxia-induced retinal neovascularization at 18-20 days after birth had approximately 3-10 × 1010TU α-KS phage was injected. The library was cycled for 5 minutes. The eyes were enucleated and the retina was separated from the rest of the eye. A single cell suspension was prepared from the retina by breaking between two glass slides. Single cell suspensions were treated with BRASIL as described above and 200 μl of log phase ER2537 E. coli were infected with the pellet. The phage amplified overnight was recovered from retinal tissue and used for the next screening. Recovery after each selection was 3400-5000 TU.
[0201]
After three rounds of selection, 90 selected clones were tested for their ability to bind to HUVEC cells. Microtiter wells were coated with complete medium containing HUVEC. Cells were fixed and incubated overnight with supernatant from IPTG-induced cultures of phage infected cells. Fab production was detected by α-Fab ELISA. Binding of Fab to HUVEC was detected by α-Fab-AFOS ELISA.
[0202]
FIG. 8 shows the results of binding of Fab clones to HUVEC using the α-KS phage library. Clone # 16 appeared to bind well to HUVEC in vitro.
[0203]
These results confirm the possibility of using Fab antibody fragments for the construction of a phage display library. Such libraries are targeted to the particular organ, tissue, or cell type used to immunize the host animal, as compared to random sequence phage display libraries that have been used in conventional biopanning methods. Should be rich in peptide sequences. The results also confirm the feasibility of using the BRASIL method to identify targeting peptide sequences.
[0204]
Embodiment 6 FIG. Identification of receptor / ligand pairs: targeting peptide to integrin receptor
Some aspects of the invention relate to the identification of receptor / ligand pairs for various applications. A targeting peptide that is selective for an organ, tissue, or cell type binds to a receptor (as defined above), usually located on the luminal surface of a blood vessel in the target. In some embodiments, the targeting peptide can be used, directly or indirectly, to identify or characterize such a receptor. In addition to their use as targets for the delivery of gene therapy vectors, other therapeutic agents, or contrast agents for in vivo imaging, such naturally occurring receptors have led to the development of new therapeutics for the receptors themselves. It is useful as a potential target for the development of vaccines against receptors and for understanding the molecular mechanisms underlying various disease states. Of course, the targeting peptide itself may be useful as a basis for new therapeutics for the receptor.
[0205]
Targeting peptides often act as mimeotopes of endogenous ligands that bind to the targeted receptor. In other embodiments, endogenous ligands can be identified and characterized using the disclosed methods. Such ligands are also potentially useful as targets for the development of new therapeutic agents and the like.
[0206]
This example illustrates one embodiment for identifying a receptor (in this case, an integrin receptor) / ligand pair. Examples of uses for targeting peptides to integrins include, but are not limited to, controlling cell proliferation and chemotaxis, promoting apoptosis, and anti-angiogenesis. In this embodiment, purified integrin attached to a solid substrate was used to screen a phage display library to identify a targeting peptide to the integrin.
[0207]
background
Integrin function is regulated by cytokines and other soluble factors in a variety of biological systems. Most commonly, exposure of such factors will result in a change in the activation state of the receptor (ie, an increase or decrease in affinity for a particular ligand, and / or receptor cluster formation in the plasma membrane). Resulting in conformational changes. Changes in integrin-dependent adhesion ultimately activate various complex signaling pathways. At the molecular level, the induced co-localization of cytoskeletal proteins with the integrin cytoplasmic domain regulates signal transduction.
[0208]
The cytoplasmic domain is an important regulator of integrin function (Hynes, 1992; Ruoslahti, 1996). The cytoplasmic domains of individual α and β subunits are highly conserved among different species (Hemler et al., 1994). The cytoplasmic domains of the various β subunits share similar primary structures, but differ with respect to some functional characteristics. Experiments with chimeric integrins have shown that the cytoplasmic domain of the β-chain is responsible for controlling receptor distribution and recruitment to focal adhesion sites (Pasqualini and Hemler, 1994). . Thus, some cytoplasmic domains are important for integrin-mediated signal transduction to cells (signaling from outside to inside) and activation of integrin-ligand binding activity (signaling from inside to outside). (Hemler et al., 1994).
[0209]
Integrins αvβ3 and αvβ5 are not expressed in normal vasculature, but are selectively expressed in angiogenic vasculature (Brooks et al., 1994a, 1994b; Pasqualini et al., 1997; Arap et al., 1998). In addition, αv integrin antagonists have been shown to block neovascular growth (Brooks et al., 1994a, 1994b, 1995; Hammes et al., 1996). In these experiments, apoptosis of endothelial cells was identified as a mechanism for inhibition of angiogenesis (Brooks et al., 1994a, 1994b, 1995). Angiogenesis initiated by bFGF can be inhibited by anti-αvβ3 blocking antibodies and VEGF-mediated angiogenesis can be prevented by blocking antibodies to αvβ5. Integrins αvβ3 and αvβ5 have been reported to be preferentially displayed in different types of ocular neovascular diseases (Friedlander et al., 1995, 1996). Thus, the pathway to angiogenesis induced by distinct cytokines is likely to depend on specific αv integrins.
[0210]
Integrins αvβ3 and αvβ5 both bind vitronectin, but probably mediate different post-ligand binding events. For example, in the absence of exogenous soluble factors, integrin αvβ5 cannot promote cell adhesion, spread, migration, and angiogenesis. On the other hand, the αvβ3 integrin can induce such events without additional stimulation by cytokines (Klemke et al., 1994; Lewis et al., 1996; Friedlander et al., 1995).
[0211]
Experiments designed to study the molecular basis for the regulation of αvβ5 function by cytokines show that upon binding to immobilized vitronectin, inactivated αvβ5 can actin, α-actinin, tailin, and tensin. , P130casAnd vinculin are rarely detected. In contrast, αvβ3 induces local accumulation of such molecules. Activation of protein kinase C (PKC) causes αvβ5 to behave similarly to αvβ3 but cannot recruit tailin (Lewis et al., 1996). Furthermore, calphostin C, an inhibitor of PKC, appears to block αvβ5-mediated angiogenesis, but not αvβ3-mediated angiogenesis (Friedlander et al., 1995). These observations suggest that PKC activation probably affects the conformation or phosphorylation status of the β5 cytoplasmic domain. Similar changes can occur in cytoplasmic proteins (Kolanus and Seed, 1997). Regulation of αvβ5 integrin by cytokines is unusual in that ligand binding is invariant but events after ligand binding are different (Lewis et al., 1996). Thus, cellular events mediated by αvβ3 or αvβ5 are clearly regulated by different mechanisms (Filardo and Cheresh, 1994b).
[0212]
Searching for αv integrin-associated molecules has been hampered by technical problems. First, it is likely that the involved physical association relies on a multimeric ligand assembly that no longer occurs if the cell is not intact. Second, their association with integrins is usually of low affinity. Finally, changes in the conformation and phosphorylation state of the associated proteins may further increase the complexity of these transiently regulated interactions. Because of these problems, only a limited number of proteins that bind to the integrin cytoplasmic domain have been identified. These proteins, such as paxillin and ICAP-1, are primarily associated with the β1 chain (Shattil and Ginsberg, 1997). Cytohesin-1 and filamin associate with the cytoplasmic domain of β2.
[0213]
Several other proteins (tailin, filamin, α-actinin, localized adhesion kinase, serine / threonine kinase ILK, and skelmin) have been reported to interact with the entire β integrin cytoplasmic domain. Talin, α-actinin, and localized adhesion kinase are no longer co-localized with β1 integrin after deleting the putative binding site in the β1 cytoplasmic domain. Similar approaches have shown that other cytoskeletal-related proteins and signaling molecules co-localize with integrins.
[0214]
Integrins associate with molecules involved in growth factor signaling. In addition to the 190 kDa protein and IRS-1 (Vuori and Ruoslahti, 1994), which can be found in association with αvβ3, analysis of the association of αvβ3 integrin with molecules involved in the insulin and PDGF signaling pathways has Both the receptor and the PDGFβ receptor were shown to co-immunoprecipitate with αvβ3. Receptor molecules associated with integrins represent a highly phosphorylated and highly activated subfraction of such molecules. These results are important because they strengthen the view that integrin-mediated cell adhesion is in sync with the cellular response to growth factors. Integrin-dependent signaling processes cooperate with proliferation signals (Frisch and Ruoslahti, 1997; Clark and Brugge, 1995; Longhurst and Jennings, 1998).
[0215]
Protein phosphorylation is one of the earliest events detected in response to integrin stimulation. The ability of tyrosine kinase inhibitors to suppress the formation of localized adhesions suggests a role for tyrosine phosphorylation in signaling pathways linked to integrin receptors (Defilippi et al., 1994). Serine / threonine kinase families, such as protein kinase C (PKC) and mitogen-activated protein (MAP) kinase, are also activated by integrin stimulation, and inhibitors of PKC increase cell adhesion and spread in some cell systems. Block (Vuori and Ruoslahti, 1993). Integrins are thought to affect cell survival by controlling programmed cell death, a response also dependent on tyrosine phosphorylation. Some proteins that associate with the integrin protein complex contain modular domains called Src homology 2 (SH2) and 3 (SH3) that specifically mediate protein-protein coupling. The SH2 domain binds proteins via interaction with specific peptide motifs, including phosphotyrosine, and the SH3 domain binds short proline-rich peptide motifs on protein targets (Clark and Brugge, 1995). Integrin-mediated cell adhesion causes activation of MAP kinase and increases tyrosine phosphorylation of localized adhesion kinase (FAK). Autophosphorylation of FAK leads to binding of SH2 domain proteins, including the Src family kinases and the Grb-2-Sos complex. One reasonable hypothesis is that integrin-mediated tyrosine phosphorylation of FAK leads to activation of the Ras cascade and ultimately to MAP kinase activation. However, MAP kinase activation mediated by integrins has been shown to be independent of FAK, indicating that (i) MAP kinase activation may play a role in mitogenic and survival signals, and (Ii) indicates that there are at least two distinct integrin signaling pathways, FAK tyrosine phosphorylation that is clearly involved in cytoskeletal organization (Lin et al., 1997).
[0216]
Previous studies of peptide substrates and molecular models based on homology suggested that about 9-13 residues of the peptide substrate make contact with the active site cleft of the kinase domain (Bossemeyer et al., 1993). Phage display technology offers an alternative approach for generating and selecting diverse combinatorial peptide libraries (Smith, 1991; Wells and Lowman, 1992). Because the chemical diversity within a phage display library is encoded by DNA that can be replicated and amplified, phage library selection can be performed multiple times, and therefore even rare motifs can be identified It is. In contrast to synthetic chemical libraries, phage display allows the analysis of a single species rather than pooled species. The power of this technology has been largely demonstrated by the selection of rare antibodies or peptides from large combinatorial libraries.
[0217]
Combinatorial phage libraries were used to determine the preferred substrate sequences of different protein tyrosine kinases (PTKs), all close members of the Src family, and one relatively distant PTK, Syk (Schmitz et al., 1996). . Subsequent phosphorylation by recombinant PTK and selection of phosphorylated phage by anti-phosphotyrosine antibody was used to enrich phage displaying substrate peptides. After several rounds of selection, a separate substrate sequence was found for each PTK tested. For the PTKs associated with the Src family, important features of these canonical sequences were reused in known or hypothetical protein substrates. Most notably, the amino acids immediately adjacent to the invariant tyrosine residues were highly conserved and specific for each PTK tested. Thus, the identified motifs may provide a rational basis for developing small and specific inhibitors of the catalytic domain of PTK (Schmitz et al., 1996).
[0218]
Further studies have expanded the scope of phage display technology by demonstrating how peptide libraries can be used to examine the substrate specificity of Fyn, a protein kinase of the Src family (Dente et al., 1997; Gram et al., 1997). The modified peptide displayed by the phage was used to determine the phosphotyrosine specificity of the phosphotyrosine binding domain (PTB) of the protein Shc (Dente et al., 1997). Other related experiments focused on identifying phosphopeptide ligands that interact with the Src homology 2 (SH2) domain of the adapter protein Grb2 by screening established random peptide libraries on phage. A mixture of phosphotyrosine kinases c-Src, Blk, and Syk phosphorylated invariant tyrosine residues of phage in vitro. The binding motif was selected by library interaction with the recombinant SH2 domain of Grb2 expressed as a glutathione-S-transferase (GST) fusion protein. Several subsequent selections enriched for phages that bind to the GST-Grb2 SH2 domain only if previously phosphorylated. By sequence analysis, the selected phages all showed a consensus motif Y*M / NW (Y*Means phosphotyrosine). One peptide is a peptide motif Y derived from the natural ligand Shc*It bound to the Grb2 SH2 domain with an affinity three times higher than VNV. These findings indicate that phage display can be used to rapidly identify high affinity ligands for the SH2 domain and other interacting proteins involved in signal transduction.
[0219]
The cytoplasmic domain of β5 is structurally and functionally unique compared to other integrin subunits (Table 8) and has only 38% homology to the cytoplasmic domain of β3 (Hemler et al., 1994). ). Structural requirements for association with αv prevent further primary sequence differences between β3 and β5; existing differences may be responsible for the reduced interaction of αvβ5 with tailin Has been proposed to be high (Lewis et al., 1996). When the cytoplasmic domain of β5 is expressed as a chimera with the extracellular domain of β1 in Chinese hamster ovary (CHO) cells, the chimeric receptor behaves similarly to β5, resulting in cell migration and localized adhesion of the receptor. Promoted loss of localization (Pasqualini and Hemler, 1994). However, the cytoplasmic domains of integrin subunits β1 and β3 have been shown to be functionally interchangeable (Slowska et al., 1991). Other studies have shown that αvβ3 and αvβ5 appear to be different with respect to localization to localized adhesion and contribution to cell migration (Delannet et al., 1994; Filardo et al., 1995). However, they reported that the functional differences were not mapped to specific domains.
[0220]
Table 8: Alignment of similar integrin β subunit cytoplasmic domains
The major differences between the β3 and β5 cytoplasmic domains are highlighted.
Figure 2004508045
[0221]
After the angiogenic switch is triggered, a separate molecule is likely to associate with either β3 or β5. Furthermore, selective association with the αv cytoplasmic domain is also possible in the context of each heterodimer. For example, β-turns in the cytoplasmic tail of the integrin αv subunit have been shown to affect αvβ3 conformation and ligand binding (Filardo and Cheresh, 1994). The basis for selective signaling properties may be the assembly of specific molecules associated with each cytoplasmic domain. The present study exploits a novel strategy of panning a phage display library against the cytoplasmic domains of β3 and β5, and determining the biological properties of cytoplasmic domain binding peptides, to achieve angiogenic signaling selective for αvβ3 and αvβ5. Determine the molecules involved in
[0222]
The disclosed method has several advantages over conventional approaches. (I) the ability to characterize intracellular molecules that interact directly or indirectly with the integrin cytoplasmic domain; (ii) the development of antibodies to molecules that bind the integrin cytoplasmic domain in very small amounts; and (iii) a phage display library Screening will lead to the identification of peptides that mimic the cytoplasmic domain binding protein.
[0223]
Method
Two-dimensional cell culture
Three human endothelial cell lines expressing β3 and β5 integrins were used: KS1767 cells (Herndier et al., 1996), HUVEC (ATCC), and BCE cells (Slowska et al., 1991). Sterile glass coverslips covered with different proteins (ie, vitronectin, fibronectin, collagen, or laminin) were used as substrates. After the cells had adhered and spread, the monolayer was quiesced by incubation in medium containing 0.05% fetal calf serum for 12 hours. The peptide was introduced into the cells using a penetratin membrane permeable tag (see below). Cells were seeded on ECM proteins for attachment and spreading. Monolayers were stimulated for 6 hours with each growth factor involved in αv-mediated angiogenesis, including bFGF, TNFα, VEGF, and TGFβ. Untreated cells were the negative control.
[0224]
Three-dimensional cell culture:
To each well of a 24-well tissue culture plate, 150 μl of Matrigel was added and gelled at 37 ° C. for 10 minutes. HUVEC was depleted for 24 hours in M199 medium supplemented with 2% FCS, and then trypsinized. 104Individual cells were gently added to each well in triplicate and allowed to adhere to the gel coating for 30 minutes at 37 ° C. The medium was then replaced with a complete medium containing the peptide. Twenty-four hours later, the plates were monitored and photographed using an inverted microscope (Canon).
[0225]
Chemotaxis assay:
Cell migration assays were performed as follows. A 48-well microchemotaxis chamber was used. Polyvinylpyrrolidone-free polycarbonate filters (Nucleopore, Cambridge, MA) with 8 μm pores were coated with 1% gelatin for 10 minutes at room temperature and equilibrated with M199 medium supplemented with 2% FCS. M199 supplemented with 2% FCS containing peptides, 20 ng / ml VEGF-A (R & D System), and 1 U / ml heparin was placed in the lower chamber of the Boyden chamber. Overnight, depleted subconfluent cultures were rapidly trypsinized to a final concentration of 2 × 106Resuspended in M199 supplemented with 2% FCS at pcs / ml. After placing the filter between the lower and upper chambers, 50 μl of the cell suspension was seeded in the upper chamber. 5% CO2The cells were allowed to migrate for 5 hours at 37 ° C. in a humid atmosphere containing The filter was then removed and the upper cells were detached using a rubber policeman. The migrated cells were fixed with methanol and stained with Giemsa solution (Diff-Quick, Baxter Diagnostics, Rome, Italy). Five random high power fields (40x) in each well were counted.
[0226]
Proliferation assay:
Cell proliferation was measured as described (Pasqualini and Hemler, 1994). Briefly, 4 × 104HUVECs were incubated in 24-well plates. Cells were starved for 24 hours, then the media was removed, replaced in the presence of VEGF and 15 μM of each peptide, and incubated for 18 hours. Then 50 μl of [3[H] Medium containing thymidine (1 μCi / ml) was added to the wells and incubated for a further 6 hours at 37 ° C., after which the medium was removed, cells were fixed with 10% TCA at 4 ° C. for 30 minutes and washed with ethanol. , 0.5N NaOH. Radioactivity was counted by liquid scintillation using an LS 6000SC Beckman scintillation counter. Each experiment was performed three times in triplicate, and the results were expressed as mean ± SD.
[0227]
Apoptosis assay (propidium iodide stained subdiploid population)
About 1 × 106Individual cells were harvested in complete medium and 15 μM of peptide was added for 4, 8, or 12 hours. The cells were then washed with PBS and resuspended in 0.5 ml of propidium iodide solution (50 μg / ml PI, 0.1% Triton X-100, 0.1% sodium citrate). After incubation at 4 ° C. for 24 hours, cells were counted on a XL Coulter (Coulter Corporation) using a 488 nm laser; 12,000 cells were counted for each histogram, and the cell cycle distribution was multicycled. (Multicycle) program.
[0228]
Following microinjection or penetratin-mediated uptake of peptides and appropriate controls, cell apoptosis was monitored using the ApopTag kit. Experiments were performed in the presence of caspase inhibitors and antibodies to specific caspases.
[0229]
Assays for angiogenesis induced by cytokines and tumors
Angiogenic factors and tumor cells implanted in the CAM stimulate the growth of new capillaries. In CAMs derived from 10-day chicken embryos, neovascularization was induced by VEGF or bFGF filters implanted in previously avascular regions. Different treatments (penetratin peptide and control) were applied topically and after 3 days the filter and surrounding CAM were excised and fixed in formalin. Using a stereomicroscope, the number of blood vessels that penetrated the disk was quantified within the focal plane of the CAM. The average value and standard error of the number of blood vessels from 8 CAMs in each group were compared.
[0230]
Phosphorylated and phosphorylated phage library panning
Phosphorylation of peptide libraries by protein kinases of the src family (Fyn, c-Src, Lyn, and Syc), and serine / threonine kinases such as MAP kinases was performed as previously described (Schmitz et al., 1996; Dente et al., 1997; Gram et al., 1997). Briefly, phage particles were collected from the culture supernatant by double precipitation with 2.5 M NaCl containing 20% polyethylene glycol 8000. 10 particles12Cells / ml. Purified phage (10 μl) were incubated with different concentrations (35-3,500 units) of protein kinase in a 50 μl reaction buffer volume for 3 hours at room temperature. To select for phage displaying phosphorylated peptides, the reaction mixture was transferred to tubes containing anti-P-Tyr, anti-P-Ser, or anti-P-Thr monoclonal antibodies conjugated to 10 μg agarose. Bound phage were eluted by washing the column with 0.3 ml of elution buffer (0.1 M NaCl / glycine / 1 mg / ml BSA, pH 2.35). The eluate was neutralized with 2M Tris base and incubated with 2 ml of mid-log bacterial culture. An aliquot of 20 μl was removed for seeding and phage was collected as described. The steps from phosphorylation to selection were repeated. Phosphorylated peptides that bind to the cytoplasmic domains of β3 and β5 were analyzed as described in the previous section.
[0231]
Matrix-assisted laser desorption time-of-flight (MALDI-TOF) to map in vitro phosphorylation sites on the cytoplasmic domains of β3 and β5, and the cytoplasmic domain binding peptide. A mass spectrometer was used. The fusion protein or peptide was phosphorylated in vitro as described and purified by RP-HPLC or RP microchip column. Phosphorylated peptides were identified by three methods. (1) mass shift of 80 Da after kinase reaction; (2) loss of 80 Da after phosphatase treatment; or (3) reflector for tyrosine phosphorylated peptide or serine or threonine phosphorylated peptide in linear mode. ) Loss of 80 Da or 98 Da respectively in mode. If necessary, the peptide was purified by RP-HPLC and subjected to digestion with carboxypeptidase and aminopeptidase to create a sequence ladder. This was particularly useful when one peptide contained two or more phosphorylation sites.
[0232]
Panning for phosphorylated GST-fusion protein
The GST fusion protein was phosphorylated in vitro as described (Schmitz et al., 1996; Dente et al., 1997; Gram et al., 1997). Briefly, 10 μg / ml was added to a reaction buffer containing 5.5 units of Fyn protein kinase (50 mM Tris, 5 mM MgCl 2).2, 500 μM Na3VO4, 500 μM ATP, 50 μl total volume) for 3 hours at room temperature. The reaction was stopped by adding 40% TCA. After precipitation of the kinase substrate protein, it was resuspended in PBS and coated on microtiter wells at 10 μg / well. Part of CX7C library (2.5 × 1011Transduced units) were incubated on the GST fusion protein. Phages were sequenced from randomly selected clones.
[0233]
Mass spectrometry research
Peptide mass mapping by mass spectrometry was used to identify novel ligands for the cytoplasmic domains of β3 and / or β5. Polyclonal and monoclonal antibodies raised against the cytoplasmic domain binding peptide were used to purify target proteins (cytoskeletal or signaling molecules). These proteins were separated by SDS-PAGE, excised from an SDS gel, and digested in-gel with trypsin. After peptide extraction, MALDI-TOF mass spectrometry was performed to generate a list of peptide masses. This list of peptide masses, combined with protease specificity, gives a relatively specific "signature" that can be used to search sequence databases. If the protein sequence is present in the database, this method allows the protein to be identified with high reliability. The lower detection limit of this approach is currently 1 pmol, which is at least 10-20 times lower than N-terminal Edman sequencing.
[0234]
result
Panning of a phage peptide library against the cytoplasmic domains of β3 and β5
Proteins that bind to the cytoplasmic domains of β3 and β5 were isolated by screening multiple phage libraries using recombinant GST fusion proteins containing either GST-β3cyto or GST-β5cyto coated on microtiter wells. Immobilized GST was used as a negative control for enrichment in panning of each cytoplasmic domain. After three rounds of panning, phage were sequenced from randomly selected clones as described elsewhere (Koivunen et al., 1995; Pasqualini et al., 1995). Distinct sequences that interact specifically with the β3 or β5 cytoplasmic domains were isolated (Table 9). Clones randomly selected from the second and third rounds of panning were sequenced. The amino acid sequence of the peptide encoded by the phagemid was deduced from the nucleotide sequence. The most frequently found motifs after panning with the indicated libraries are shown in Table 9. The ratio was calculated by dividing the number of colonies recovered from β3-GST coated wells by that recovered from GST or BSA.
[0235]
Table 9: Phage displayed sequences binding to the cytoplasmic domain of β3 or β5
Figure 2004508045
[0236]
The specificity of the interaction with the cytoplasmic domain of β3 or β5 is determined by calculating the ratio of the number of phage bound to the cytoplasmic domain-containing fusion protein (β3 or β5) to the number of GST alone (negative control). did. FIG. 9 shows the results from binding assays performed using GST-β3cyto binding phage. Six phages displaying the most frequently found motif in the second and third pannings were tested. Each panel shows the results from a binding assay for phage that displayed different peptides that bind to the β3 cytoplasmic domain as indicated. Insert-free phage, or unselected libraries were used as negative controls and they did not show binding above background. Two seed dilutions are shown for each assay.
[0237]
A similar strategy was used to determine the specificity of the phage isolated in a screen containing the β5 cytoplasmic domain fusion protein. The binding assay was performed using individually amplified phage shown in FIG. Five phages displaying the most frequently found motif in the second and third pannings were tested. Each panel shows a binding assay for phage displaying peptides that bind to the β5 cytoplasmic domain. Insert-free phage, or unselected libraries, were used as negative controls and they showed no binding above background in these assays.
[0238]
To determine whether the binding of the selected motif is specific for each cytoplasmic domain, a binding assay is performed that compares the interaction of individual phage motifs with the β1, β3, or β5 cytoplasmic domain fusion proteins. did. ELISA with anti-GST antibody showed that the three proteins could be coated onto plastic with equal efficiency, and thus that differences in binding did not reflect differences in coating concentration (not shown) ). Both the phage selected at β3 and the phage selected at β5 interact selectively with the initially selected protein, β3 / β1 = 3.9, β3 / β5 = 3.7, β5 / β1 = 4.8 and β5 / β3 = 6.9 were observed (not shown). The average selectivity for the integrin cytoplasmic domain for BSA was approximately 1-2 orders of magnitude greater (not shown). None of the phages tested appeared to bind strongly to the β1 cytoplasmic domain (not shown).
[0239]
Characterization of synthetic peptides corresponding to sequences displayed by integrin cytoplasmic domain binding phage
Based on the binding properties, specific phages were selected for further study. Synthetic peptides corresponding to the sequences displayed by each phage were used to perform binding inhibition studies. This assay determined whether phage binding was completely mediated by the targeting peptide displayed by each phage, or whether it also contained non-specific components. As expected, the synthetic peptide dose-dependently inhibited the binding of the corresponding phage (FIGS. 11 and 12). A control peptide containing an irrelevant amino acid had no effect on phage binding when tested at the same concentration.
[0240]
Phosphorylation events regulate interactions of selected peptides with the cytoplasmic domain
Events involving phosphorylation are important in controlling signaling. The phage display system was used to evaluate the effect of tyrosine phosphorylation at two levels. First, recombinant fusion proteins containing the cytoplasmic domain of β3 or β5 were used for panning a phage library displaying tyrosine-containing peptides. Second, phage selection was performed after phosphorylation of the cytoplasmic domain itself. Experiments were performed to investigate the ability of specific tyrosine kinases to modulate the interaction with the cytoplasmic domain of selected peptides. The results obtained in panning a phage library displaying tyrosine containing peptides are shown in Table 10.
[0241]
Clones randomly selected from the third and fourth rounds were sequenced from the X4YX4 library phosphorylated by Fyn. The amino acid sequence of the peptide encoded by the phagemid was deduced from the nucleotide sequence. Table 10 shows the most frequently found motifs after panning the indicated libraries with β3 or β5. The ratio of binding to β3 or β5 was calculated by dividing the number of β3 or β5 colonies found after panning by the number of GST or BSA colonies. The ratio of binding of β3 or β5 to phage phosphorylated by Fyn to unphosphorylated phage was calculated by dividing the number of colonies found after panning.
[0242]
Table 10: Sequence displayed by phosphorylated phage binding to integrin cytoplasmic domain
Figure 2004508045
[0243]
The effect of phosphorylation on the affinity and specificity of cytoplasmic domain binding was investigated. Phage displaying peptides that bind to the cytoplasmic domains of β3 and β5 were generated using Fyn kinase as previously described (Schmitz et al., 1996; Dente et al., 1997; Gram et al., 1997). Phosphorylated in vitro. Specific phosphorylation of tyrosine-containing peptides on the phage surface in the kinase reaction32Using P-γdATP, the phage pIII protein was confirmed by separation by SDS-PAGE.
[0244]
Phages phosphorylated in vitro showed increased affinity and specificity of binding to the β3 integrin cytoplasmic domain (FIG. 13). TLRKYFHSS (SEQ ID NO: 120) phage was also tested in assays containing other GST cytoplasmic domain fusion proteins to determine specificity (FIG. 14).
[0245]
Sequence similarities between integrin-binding peptides and known cytoskeletal and signaling proteins
Peptides displayed by integrin cytoplasmic domain binding phage were similar to several regions found in cytoskeletal proteins and proteins involved in signal transduction (Table 11). The similarity between some of the isolated peptides and certain regions of mitogen-activated protein kinase 5 (MAPK5, amino acids 227-234) was of particular interest. Associations have been proposed, including the MAPK cascade, cell adhesion, migration, and proliferation (Lin et al., 1997).
[0246]
Table 11: Sequence similarities between integrin binding peptides and known cytoskeletal and signaling proteins
Figure 2004508045
[0247]
Membrane permeable peptide
Penetratin is a peptide that allows hydrophilic compounds to cross the plasma membrane. Fusion with an osmotic moiety allows oligopeptides to be targeted directly to the cytoplasm, nucleus, or both, without apparent disruption (Derossi et al., 1994). This membrane permeable peptide has 16 residues corresponding to amino acids 43-58 of the homeodomain of Antennapedia, a Drosophila transcription factor (Joliet et al., 1991a, 1991b; Le Roux et al., 1993).
Figure 2004508045
Consists of Penetratin-mediated uptake occurs at both 37 ° C. and 4 ° C., and the incorporated peptide can be recovered intact from the cells.
[0248]
A peptide containing a penetratin sequence fused to the sequence of the motif found to bind to the cytoplasmic domain of β3 or β5 was designed. Peptides were synthesized on a 431 Applied Biosystems peptide synthesizer using p-hydroxymethylphenoxymethyl polystyrene (HMP) resin and standard Fmoc chemistry. Peptide incorporation and visualization was performed as described (Derossi et al., 1994; Hall et al., 1996; Theodore et al., 1995).
[0249]
Briefly, 10-50 μg / ml of biotinylated peptide was added to the cell culture. Peptides were incubated with the seeded cells. After 2-4 hours, the cultures were washed three times with tissue culture medium, fixed, and permeabilized using ethanol: acetic acid (9: 1) at -20 ° C for 5 minutes. Non-specific protein binding sites were blocked by incubating the culture with Tris-buffered saline (TBS) containing 10% fetal calf serum (FCS) and 0.02% Tween for 30 minutes. Cultures were incubated in the same buffer containing streptavidin conjugated to FITC (1: 200 dilution), washed with TBS, and then set up for inspection by confocal microscopy. The peptide linked to penetratin was very efficiently incorporated (data not shown).
[0250]
Functional data indicates that cytoplasmic domain binding peptides selected for β3 or β5 may interfere with integrin-mediated signaling and subsequent cellular responses (ie, endothelial cell adhesion, spreading, proliferation, migration). showed that. Commercially available “incorporable” forms of synthetic motifs found by phage screening (SDNRYIGSW, SEQ ID NO: 97; and CEQRQTQEGC, SEQ ID NO: 93; β3-binding peptide, and VIVISMPD, SEQ ID NO: 112; β5-binding peptide) I got a panel. These composite chimeric peptides are coupled with penetratin from the most selective of the β3 or β5 cytoplasmic domain binding peptides plus a biotin moiety to allow tracking of the peptide after uptake into whole cells. Become. These transmembrane forms of the peptide can be taken up, affect cellular events after ligand binding of β3 and β5, and induce large amounts of apoptosis (data not shown).
[0251]
Endothelial cell proliferation, chemotaxis, and apoptosis
The effect of β3 and β5 integrin cytoplasmic domain binding motifs on endothelial cell proliferation was assessed after stimulation with factors that activate endothelial cells (FIG. 15). Cell proliferation was measured according to Pasqualini and Hemler (1994). Briefly, 4 × 104HUVECs were incubated in 24-well plates and starved for 24 hours, after which the medium was removed and replaced in the presence of VEGF and 15 μM of each peptide. After an additional 18 hours of incubation, 50 μl of [3Medium containing H] thymidine (1 μCi / ml) was added to the wells. After a further 6 hours of incubation at 37 ° C., the medium was removed and the cells were fixed with 10% TCA at 4 ° C. for 30 minutes, washed with ethanol and solubilized with 0.5 N NaOH. Radioactivity was counted by liquid scintillation by using an LS 6000SC Beckman scintillation counter. Each experiment was performed three times in triplicate, and the results were expressed as mean ± SD.
[0252]
The effect of β3 and β5 integrin cytoplasmic domain binding motifs on endothelial cell migration was assessed after stimulation with factors that activate endothelial cells. The peptides tested affected cell function in a dose-dependent and specific manner. These properties are believed to be endogenous to the β3 or β5 cytoplasmic domain (FIG. 16).
[0253]
Chemotaxis assay
Cell migration was assayed in a 48-well microchemotaxis chamber. Polyvinylpyrrolidone-free polycarbonate filters with 8 μm pores were coated with 1% gelatin for 10 minutes at room temperature and equilibrated with M199 medium supplemented with 2% FCS. M199 supplemented with 2% FCS containing peptide, 20 ng / ml VEGF-A (R & D System), and 1 U / ml heparin was placed in the lower chamber of the Boyden chamber. Overnight, depleted subconfluent cultures were rapidly trypsinized to a final concentration of 2 × 106Cells / ml were resuspended in M199 medium containing 2% FCS. After placing the filter between the lower and upper chambers, 50 μl of the cell suspension was seeded in the upper chamber. 5% CO2The cells were allowed to migrate for 5 hours at 37 ° C. in a humid atmosphere containing The filter was then removed and the upper cells were detached using a rubber policeman. The migrated cells were fixed with methanol and stained with Giemsa solution. Five random high power fields (40x) in each well were counted. The results indicate that both β3 integrin cytoplasmic domain binding peptides increased cell migration, whereas penetratin did not affect cells.
[0254]
Apoptosis assay (propidium iodide (PI) stained subdiploid population)
About 1 × 106Individual cells were harvested in complete medium and 15 μM of peptide was added for 4, 8, or 12 hours. The cells were then washed with PBS and resuspended in 0.5 ml of propidium iodide solution (50 μg / ml PI, 0.1% Triton X-100, 0.1% sodium citrate). After incubation at 4 ° C. for 24 hours, the cells were counted on a XL Coulter Corporation using a 488 nm laser; 12,000 cells were counted for each histogram, and the cell cycle distribution was measured using a multicycle program. analyzed.
[0255]
Treatment of cells with the VISY-penetratin chimera resulted in induction of apoptosis (Figure 17, panel d). When cells were exposed to other growth factors, no pro-apoptotic effect was observed (not shown). Penetratin alone and other penetratin chimeras failed to induce similar effects (Figure 17, panel c). This finding indicates that a novel approach for inhibiting angiogenesis can be developed based on the use of integrin targeting peptides.
[0256]
Immunization with cytoplasmic domain binding peptides and characterization of the resulting antibodies
Using standard techniques, polyclonal antibodies recognizing αvβ3- and αvβ5-binding peptides were generated using KLH conjugates made with synthetic peptides. Antibodies were generated against two different synthetic peptides (FIG. 18). Serum recognizes not only the immobilized peptide, but also specific proteins in whole cell extracts, as shown by Western blot analysis (FIG. 19).
[0257]
Rabbits were immunized with the SDNRYIGSW (SEQ ID NO: 97) -KLH conjugate or the GLDTYRGSP (SEQ ID NO: 96) -KLH conjugate. Each rabbit was injected with complete Freund's adjuvant containing 200 μg of KLH-conjugated peptide. Twenty to sixty days later, rabbits were injected with 100 μg incomplete Freund's adjuvant. After the third immunization, serum was collected. Pre-immune serum obtained before the first immunization was used as an additional control in the experiment.
[0258]
Polyclonal antibodies were tested by ELISA, Western blot, and immunoprecipitation. In the ELISA assay, microtiter well plates were coated with 10 μg / ml peptide. Plates were dried at 37 ° C., blocked with PBS + 3% BSA and incubated with PBS + 1% BSA with different serum dilutions. After washing and incubation with the secondary antibody, alkaline phosphatase substrate was added and antibody binding was colorimetrically detected at 405 nm. The reactivity observed with both mouse and rabbit polyclonal antibodies was highly specific. In all cases, antibody binding was abolished by preincubation with the corresponding peptide used for immunization, but not by the control peptide (FIGS. 18 and 19). Antibodies raised against the two β3 cytoplasmic domain binding peptides were:35In immunoprecipitation experiments using S-labeled extracts, specific bands on whole cell extracts are recognized. Similar results were obtained with polyclonal serum and purified IgG (not shown).
[0259]
This example shows that targeting peptides for specific domains of cell receptors can be identified by phage display. Such peptides can be used to identify endogenous ligands for cellular receptors such as endostatin. In addition, the peptides themselves may have a therapeutic effect or may be useful as a basis for the identification of more effective therapeutic agents. The endostatin targeting peptide identified here, when introduced into cells, showed effects on cell proliferation, chemotaxis and apoptosis. One skilled in the art will appreciate that the present invention is not limited to the disclosed peptides or therapeutic effects. Other cellular receptors and ligands, and their inhibitors and activators, can also be identified by the disclosed methods.
[0260]
Embodiment 7 FIG. Induction of apoptosis by integrin-binding peptide (Endothanos)
Example 9 showed that a VISY peptide (VVISYSMPD, SEQ ID NO: 112) imported into cells by attachment to penetratin could induce apoptosis in HUVEC cells. Antibodies raised against the VISY peptide were used to identify endogenous cellular analogs of the peptide identified here as Annexin V. The results indicate that Annexin V is an endogenous ligand for integrins involved in a novel apoptotic pathway.
[0261]
Method
Protein purification
Using the method described in Example 9, a polyclonal antibody against the VISY peptide (VISYSMPD, SEQ ID NO: 112) was prepared. MDA-MB-435 breast cancer cells were used for purification of the endogenous VISY peptide analog. Cells were washed three times with ice-cold PBS and lysed with cold water for 20 minutes. To separate the cytoplasmic fraction from the membrane fraction, the cell extract was centrifuged at 100,000 xg for 30 minutes. The cytoplasmic fraction was subjected to column chromatography on a gel filtration column (10-50 kDa) and an anion exchange column (monoQ). The anion exchange column was eluted with a salt gradient from 50 mM to 1 M NaCl. One ml fractions were collected, SDS-PAGE was performed, and tested by Western blotting for the presence of endogenous proteins reactive with anti-VISY antibodies. The fraction of interest containing the 36 kDa antibody-reactive band eluted at approximately 300 mM NaCl.
[0262]
36 kDa always appeared in the fraction showing a positive reactivity with the anti-VISY antibody. Fractions were analyzed by SDS-PAGE and 2D gel electrophoresis followed by Western blotting. After column chromatography, substantial enrichment of the 36 kDa protein was seen (not shown). The 36 kDa peptide was excised from the SDS-PAGE gel and analyzed by mass spectrometry to obtain its sequence. All five peptide sequences obtained by mass spectrometry showed 100% homology with the reported sequence of Annexin V (GenBank accession number GI — 468888). In addition to its presence in 435 cells, a 36 kDa band was also found in Kaposi's sarcoma, SKOV, and HUVEC cells (not shown).
[0263]
Commercially available antibodies to Annexin V were obtained (Santa Cruz Biologics, Santa Cruz, CA). Competition Western blots were performed using anti-VISY and anti-Annexin V antibodies. Both antibodies showed reactivity with the 36 kDa protein (not shown). These results indicate that the endogenous protein analog of the VISY peptide is Annexin V.
[0264]
Protein-protein interaction with annexin V and β5 cytoplasmic domain
To investigate the binding of Annexin V to β5 integrin and the effect of the VISY peptide, a competitive binding assay was performed. Plates were coated with GST fusion proteins of the cytoplasmic domains of various integrins and Annexin V was added to the plates. Annexin V binding was determined using an anti-annexin V antibody. As shown in FIG. 20A, Annexin V did not bind to GST-β1 integrin or GST-β3 integrin. Annexin V bound strongly to GST-β5 integrin, but binding was dependent on the buffer used (FIG. 20A). Low binding was observed in Tris-buffered saline (TBS), with "cytoplasmic buffer" (100 mM KCl, 3 mM NaCl, 3.5 mM MgCl) with or without calcium (2 mM) added.2, 10 mM PIPES, 3 mM DTT), high binding was observed (FIG. 20A). Calcium was used because it has been reported that Annexin V activity is regulated by calcium. The binding of Annexin V to GST-β5 was blocked by the addition of the VISY peptide (FIG. 20A). FIG. 20B shows the relative levels of anti-Annexin V antibody binding to purified Annexin V and VISY peptides.
[0265]
The reverse experiment was performed using Annexin V for coating the plate and adding the GST fusion protein of the integrin cytoplasmic domain. Binding was assessed using an anti-GST fusion protein antibody. As expected, only GST-β5 showed substantial binding to Annexin V, while GST-β1 and GST-β3 showed low levels of Annexin V binding (not shown). In some experiments, reduced binding was observed in the presence of calcium, and calcium ions were thought to interfere with the binding interaction between GST-β5 and Annexin V (not shown). In the presence of calcium (67% inhibition), a greater degree of inhibition of annexin V binding to GST-β5 by the VISY peptide was observed than in the absence of calcium (45%) (FIG. 20A).
[0266]
Penetratin peptide chimera binding to the β5 cytoplasmic domain induces programmed cell death
Induction of apoptosis by the VISY peptide shown in Example 9 was confirmed. 106HUVEC cells were treated with 15 μM of VISY antennapedia (penetratin) chimera or 15 μM of antennapedia peptide (pentratin) alone for 2 to 4 hours, and chromatin fragmentation was analyzed by agarose gel electrophoresis. FIG. 21 shows induction of apoptosis by VISY-Ant (penetratin) as shown by chromatin fragmentation. Neither VISY nor penetratin alone induced apoptosis. Induction of apoptosis was inhibited by up to 70% when a caspase inhibitor (zVAD, caspase inhibitor I, Calbiochem # 627610, San Diego, CA) was added to the medium at the same time as the VISY chimeric peptide.
[0267]
The difference between the mechanism of cell death induced by the VISY peptide and that of other pro-apoptotic agents is that other mechanisms of apoptosis assessed in cell culture include detachment of cells from the substrate prior to cell death. Is included. In contrast, in cell death induced by VISY, cells do not detach from the substrate before cell death. Thus, endothanos (death from within) is considered to be different from anoikis (homelessness).
[0268]
The results of Example 9 and this example show that the VISY peptide activates the integrin-dependent apoptotic pathway. This example shows that the endogenous analog of the VISY peptide is Annexin V. These results demonstrate the existence of a novel apoptotic pathway that is mediated by the interaction between Annexin V and β5 integrin and is dependent on caspase activity. This novel apoptotic mechanism is called endotonos. One skilled in the art will appreciate that the novel mechanisms for inducing or inhibiting apoptosis are useful for a variety of applications, such as cancer therapy.
[0269]
Embodiment 8 FIG. Identification of receptor / ligand pairs: aminopeptidase A regulates endothelial cell function and angiogenesis
Endothelial cells of tumor vessels express specific angiogenesis markers. Aminopeptidase A (APA, EC 3.4.11.7) is up-regulated in microvessels during angiogenesis. APA is a homodimeric membrane-bound zinc metallopeptidase that hydrolyzes N-terminal glutamyl or aspartyl residues from oligopeptides (Nanus et al., 1993). In vivo, APA converts angiotensin II to angiotensin III. The renin-angiotensin system plays an important role in controlling several endocrine, cardiovascular, and behavioral functions (Ardailou, 1997; Stroth and Unger, 1999). Although recent studies have also suggested a role for angiotensin in angiogenesis (Andrade et al., 1996), the function of APA in the angiogenic process has not been previously investigated.
[0270]
In this example, a targeting peptide capable of binding to APA was identified by screening a phage library against APA-expressing cells. APA binding peptides containing the motif CPRECESSIC (SEQ ID NO: 123) specifically inhibited APA enzyme activity. The soluble CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide inhibited endothelial cell migration, proliferation, and morphogenesis in vitro and prevented angiogenesis in vivo in the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) assay. Furthermore, APA null mice had reduced amounts of retinal neovascularization in hypoxia-induced retinopathy in immature mice compared to wild-type (wt) mice. These results may lead to a better understanding of the role of APA in angiogenesis and the development of new antitumor therapeutic strategies.
[0271]
Materials and methods
Cell culture
The renal carcinoma cell line SK-RC-49 was transfected with an expression vector encoding the full-length APA cDNA (Geng et al., 1998). Cells were incubated with 2 mM glutamine, 1% non-essential amino acids, 1% vitamin (Gibco BRL), 100 U / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin (Irvine Scientific), 10 mM sodium pyruvate (Sigma-Aldrich), and 10% fetal bovine serum. Maintained in MEM (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) supplemented with (FCS) (Tissue Culture Biological, Tulare, CA). Stably transfected cells were maintained in medium containing G418. HUVECs were isolated by collagenase treatment and used between 1-4 generations. Cells were supplemented with 20% FCS, penicillin (100 U / ml), streptomycin (50 μg / ml), heparin (50 μg / ml), bovine brain extract (100 μg / ml) on plastic coated with gelatin. Grown in M199 medium (Sigma). All media supplements were obtained commercially (Life Technologies, Inc., Milan, Italy).
[0272]
Antibodies and peptides
The anti-APA mAb RC38 (Schlingemann et al., 1996) was used to immunocapture APA from transfected cell lysates. CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) and GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) cyclic peptides were chemically synthesized, spontaneously cyclized under non-reducing conditions, and purified by mass spectrometry (AnaSpec San Jose, CA). Mass spectroscopy analysis of the CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide revealed six different peaks, presumably reflecting different disulfide bond positions and dimer formation. Because the biochemical behavior of different fractions on APA enzyme activity was similar, a mixture of six peaks was used in all procedures below.
[0273]
APA immunocapture
Cells were detached from the semi-confluent plate into cold PBS containing 100 mM N-octyl-β-glucopyranoside (Calbiochem), lysed on ice for 2 hours, and centrifuged at 13,000 × g for 15 minutes. Microtiter round bottom wells (Falcon) were coated with 2 μg of RC38 for 4 hours at room temperature, blocked for 1 hour at room temperature with PBS / 3% BSA (Intergen, Purchase, NY) and then 150 μl of cell lysate ( 1 mg / ml) was incubated overnight at 4 ° C. on the mAb-coated wells, washed 5 times with PBS / 0.1% Tween-20 (Sigma), and washed twice with PBS.
[0274]
APA enzyme assay
Cells and immunocaptured proteins were tested for specific enzymatic activity according to Liln et al. (1998). Briefly, extracts of adherent cells or cells immunocaptured with RC38 were extracted with 3 mM α-L-glutamyl-p-nitroanilide (Fluka) and 1 mM CaCl 2.2Was incubated for 2 hours at 37 ° C. with PBS containing Enzyme activity was determined by reading the absorbance (OD) at 405 nm on a microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
[0275]
Cell panning
CX3CX3CX3A library of C (C is cysteine and X is any amino acid) was prepared (Rajotte et al., 1998). Amplification and purification of the phage particles and DNA sequencing of the phage displayed insert were performed as described above. Cells were detached by incubation with PBS containing 2.5 mM EDTA, washed once with binding medium (DMEM high glucose supplemented with 20 mM HEPES and 2% FCS),6The cells were resuspended in the same medium at a concentration of cells / ml. 1010TU phage was added to 500 μl of the cell suspension and the mixture was incubated overnight (first) or 2 hours (following) at 4 ° C. with gentle rotation. Cells were washed five times with binding medium at room temperature and resuspended in 100 μl of the same medium. Phages were rescued by adding 1 ml of exponentially growing K91kan E. coli and incubating the mixture for 1 hour at room temperature. Bacteria were diluted in 10 ml of LB medium supplemented with 0.2 μg / ml tetracycline and incubated at room temperature for another 20 minutes. Serial dilutions were plated on LB plates containing 40 μg / ml tetracycline and the plates were incubated at 37 ° C. overnight before colonies were counted.
[0276]
Phage binding specificity assay
As described for cell panning, 109Cell binding assays were performed using the input amount of TU. Specificity was confirmed by adding CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide to the binding medium at increasing concentrations. To bind the phage to the immunocaptured APA, the wells were blocked with PBS / 3% BSA for 1 hour at room temperature and 10 μl in 50 μl PBS / 3% BSA.9Incubated with TU for 1 hour at room temperature. After washing 8 times with PBS / 1% BSA / 0.01% Tween-20 and 2 times with PBS, the phage was rescued by adding 200 μl of exponentially growing K91kan E. coli. Each experiment was repeated at least three times.
[0277]
In vivo tumor regression of APA binding phage
Tumor xenografts from MDA-MB-435 were established in 2-month-old female nude mice (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine). The mice were anaesthetized with Avertin,9A 200 μl volume of DMEM containing phages of TU was injected intravenously via the tail vein. The phage were circulated for 5 minutes and the animals were perfused through the heart with 5 ml of DMEM. The tumor and brain were excised from each mouse, weighed, and homogenized in equal amounts of tissue. Tissue homogenates were washed three times with ice-cold DMEM containing proteinase inhibitor cocktail and 0.1% BSA. Bound phage were rescued and counted as described for cell panning. Fd-tet phage was injected at the same input volume as a control. The experiment was repeated twice. In parallel, a portion of the same tissue sample was fixed in Bouin's solution and embedded in paraffin for preparation of tissue sections. Antibodies to M-13 phage (Amersham-Pharmacia) were used for staining.
[0278]
Cell proliferation assay
Complete M199 medium containing HUVECs was placed in a 48 well plate (104Per well) and allowed to attach for 24 hours. The cells were then starved for 24 hours in M199 medium containing 2% FCS. A medium containing 2% FCS and 10 ng / ml VEGF-A (R & D System, Abingdom, UK) containing the CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide or the control GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) peptide (1 mM) was added to the wells. Was added. After incubation for the indicated time, cells were fixed with 2.5% glutaraldehyde, stained with 20% methanol containing 0.1% crystal violet, and solubilized with 10% acetic acid. All treatments were performed in triplicate. Cell growth was determined using a microplate reader (Biorad, Hercules, Calif.) At 590 nm. D. Was evaluated by measuring. A calibration curve was established and the O.D. D. Is linearly correlated with cell number3-105Observed in cells.
[0279]
Chemotaxis assay
Cell migration assays were performed in a 48-well microchemotaxis chamber (NeuroProbe, Gaithersburg, MD) according to Bussollini et al. (1995). Polyvinylpyrrolidone-free polycarbonate filters (Nucleopore, Cambridge, Mass.) With 8 μm pores were coated with 1% gelatin for 10 minutes at room temperature and equilibrated with M199 medium supplemented with 2% FCS. M199 medium supplemented with 2% FCS and 10 ng / ml VEGF-A (R & D System) containing CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide or control GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) peptide (1 mM) was placed in a Boyden chamber. I put it in the lower room. Overnight, depleted subconfluent cultures are collected in PBS containing 2.5 mM EDTA, washed once with PBS, and given a final concentration of 2 × 106Cells / ml were resuspended in M199 medium containing 2% FCS. After placing the filter between the lower and upper chambers, 50 μl of the cell suspension was seeded in the upper chamber and 5% CO 22The cells were allowed to migrate for 5 hours at 37 ° C. in a humid atmosphere containing The filter was then removed and the upper cells were detached using a rubber policeman. The migrated cells were fixed with methanol and stained with Giemsa solution (Diff-Quick, Baxter Diagnostics, Rome, Italy). Five random high power fields (100 ×) in each well were counted. Each assay was performed in triplicate.
[0280]
3D cell culture
100 μl of Matrigel (Collaborative Research, Bedford, Mass.) Was added to each well of a 48-well tissue culture plate and solidified at 37 ° C. for 10 minutes. After depletion of HUVECs in M199 medium supplemented with 2% FCS for 24 hours, the cells were collected in PBS containing 2.5 mM EDTA. 104Individual cells were gently added to each well in triplicate and allowed to adhere to the gel coating at 37 ° C. for 30 minutes. The medium was then replaced with complete medium containing the indicated concentrations of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide or GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) peptide. After 24 hours, plates were photographed using an inverted microscope (Canon). The assay was repeated three times.
[0281]
CAM assay
In vivo angiogenesis was assessed by a CAM assay (Ribatti et al., 1994). Fertilized eggs from white leghorn chickens were maintained at 37 ° C. at constant humidity. On the third day of incubation, a square window was opened in the eggshell, and 2-3 ml of egg white was removed to detach the developing CAM from the shell. The window was sealed with a glass plate of the same size and the eggs were returned to the incubator. Day 8, 1mm3VEGF-A (20 ng, R & D System) and any of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) or control GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) peptide (1 mM) in sterile gelatin sponges (Gelfoam, Upjohn Co, Kalamazoo, Milan). 3 μl of PBS containing the heel was absorbed and implanted under aseptic conditions on top of the growing CAM. CAMs were examined daily until day 12 and photographed in ovo with a Leica stereomicroscope. Capillaries emerging from the sponge were counted. The assay was repeated twice.
[0282]
Induction of retinal neovascularization
APA null mice have been described (Lin et al., 1998). P7 (day 7 postnatal) pups were exposed to 75% oxygen for 5 days with lactating mothers. The mice were returned to normoxia (atmosphere) at P12. For histological analysis, mice were sacrificed at P17-P21, eyes were enucleated and fixed in 4% paraformaldehyde in PBS at + 4 ° C overnight. The fixed eyes were embedded in paraffin, and 5 μm serial sections were cut out. Sections were stained with hematoxylin / eosin (h / e) solution. Neovascular nuclei on the vitreous side of the inner limiting membrane were counted from 20 h / e stained sections for each eye. The average number of neovascular nuclei per section was calculated and compared between groups of animals using the Student's t-test.
[0283]
result
APA binding motif is selected by cell panning by phage display
Cells were screened with a random peptide phage library to identify peptides that could bind to APA. First, to obtain a model of APA expression in a natural conformation, SK-RC-49 kidney cancer cells not expressing APA were transfected with full-length APA cDNA. APA expressed as a result of transfection was functionally active as demonstrated by the APA enzyme assay (not shown), but parental SK-RC-49 cells showed no APA expression or activity (Not shown).
[0284]
To reduce non-specific binding, CX3CX3CX3C phage library (1010Transduced units [TU]) were preadsorbed to parental SK-RC-49 cells. Resuspended SK-RC-49 / APA cells were screened for phage that did not bind to parental cells. SK-RC-49 / APA binding phage were amplified and used for two successive selections. Increased binding of phage to SK-RC-49 / APA cells compared to binding of phage to SK-RC-49 parent cells was observed at the second and third rounds (not shown).
[0285]
Subsequent phage sequencing revealed that the general library sequence CX3CX3CX3Peptide insert containing a tandem repeat of C
Figure 2004508045
Specific enrichment was revealed. This sequence accounted for 50% of the 18 randomly selected phage inserts from the second round and 100% of the phage inserts from the third round. The four peptide inserts obtained from the second round had sequence similarity to tandem phage (Table 12, bold font). Several other clearly conserved motifs were observed in the second peptide (Table 12, underlined or italicized). One of these partially overlapped the tandem repeat sequence. A search of sequence homology against the human database for selected peptides did not yield a significant match.
[0286]
Table 12: APA binding peptide sequence
Figure 2004508045
[0287]
Selected phage insert is a specific APA ligand
Peptide insert
Figure 2004508045
Were individually tested for APA binding. All three phages specifically bound to the surface of SK-RC-49 / APA cells in a similar pattern, enriched 6-fold relative to SK-RC-49 parent cells (not shown). Control insert-free phage showed no binding preference (not shown). The second selection of CGTGCAVECEVC (SEQ ID NO: 128) and other phages did not show selective binding to SK-RC-49 / APA cells (data not shown). A soluble peptide CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) containing a consensus sequence that reproduced the APA binding phage insert was synthesized.
[0288]
Binding assays were performed using CPKVCPRESSNC (SEQ ID NO: 127) phage in the presence of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide. The soluble CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide competed with the CPKVCPRESSNC (SEQ ID NO: 127) phage for binding to SK-RC-49 / APA cells, but did not bind to non-specific binding to SK-RC-49 parent cells. Has no effect (not shown). The irrelevant cyclic peptide GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) had no competitive activity (not shown).
Figure 2004508045
Phage binding was also replaced by the CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide, but binding of the CLGQCASICVNDC (SEQ ID NO: 126) phage was not affected (data not shown).
[0289]
To further confirm the substrate specificity of the selected peptide insert, APA was partially purified from extracts of cells transfected with APA by immunocapture using mAB RC38. APA protein immobilized on microwells coated with RC38 was functional as confirmed by enzyme assay (not shown).
Figure 2004508045
The phage selectively bound to the immunocaptured APA with a 10- to 12-fold enrichment compared to the binding of the phage to cell lysate from the RC38 immunocaptured SK-RC-49 parent cells (shown Absent).
[0290]
APA binding phage targets tumors in vivo
The ability of the identified peptides to return to tumors was evaluated using nude mice implanted with human breast tumor xenografts as a model system. Phages were injected into the tail vein of tumor-bearing mice and targeting was assessed by phage recovery from tissue homogenates. CPKVCPRESSNC (SEQ ID NO: 127) phage was 4-fold enriched in tumor grafts compared to brain tissue used as a control (FIG. 22). Insert-free phage did not target the tumor (FIG. 22). Neither the CYNLCIRECESICGADGACWTWCCADGCRSC (SEQ ID NO: 125) phage nor the CLGQCASICVNDC (SEQ ID NO: 126) phage showed tumor regression preference (data not shown).
[0291]
Regression of CPKVCPRESSNC (SEQ ID NO: 127) was confirmed by anti-M13 immunostaining on tissue sections (not shown). Strong phage staining was seen in the tumor vasculature but not in the normal vasculature (not shown). Insert-free phage did not bind to tumor vessels.
[0292]
CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) is a specific inhibitor of APA activity
To examine the effect of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) on APA enzyme activity, SK-RC-49 / APA cells were treated with increasing concentrations of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide or control GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124). Incubated with the APA-specific substrate α-glutamyl-p-nitroanilide in the presence of the peptide. After a 2 hour incubation at 37 ° C., the enzyme activity was assessed by a colorimetric assay. CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) inhibited APA enzyme activity and reduced activity by 60% at the highest concentration tested (FIG. 23). IC of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) for enzyme inhibition50Was calculated to be 800 μM. CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) did not affect the activity of the closely related protease, aminopeptidase N (data not shown).
[0293]
CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) inhibits endothelial cell migration and proliferation
The potential use of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide as an anti-angiogenic agent was determined. First, the effect of APA inhibition by the in vitro CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide on the migration and proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) stimulated with VEGF-A (10 ng / ml) was investigated. The presence of functional APA on HUVEC was assessed by an enzyme assay (not shown). At the highest concentration tested (1 mM), the CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide inhibited HUVEC chemotaxis by 70% in the Boyden chamber assay (FIG. 24). At the same peptide concentration, cell proliferation was inhibited by 50% (FIG. 25). Relatively low concentrations of the CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide or GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) control peptide had no significant effect on cell migration and proliferation (not shown).
[0294]
CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) inhibits angiogenesis in vitro and in vivo
The inhibitory effect of the CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide in different in vitro and in vivo angiogenesis models was investigated. HUVECs seeded on three-dimensional matrix gels differentiate into capillary-like structures, providing an in vitro angiogenesis model. Increasing concentrations of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide resulted in a progressive impairment of the formation of this network (not shown). At a peptide concentration of 1 mM, the vascular-like branching structure was significantly less and shorter, so that the cells could not form a complete network tissue (not shown). The control peptide GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) did not affect HUVEC morphogenesis (not shown).
[0295]
A commonly used model of simplified in vivo angiogenesis is the chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM), which can stimulate angiogenesis during embryonic development. Appropriate stimuli absorbed by the gelatin sponge induce recruitment of microvessels to the sponge itself, which is achieved by remodeling and branching of new capillaries. Eight day old chicken egg CAMs were stimulated with VEGF-A alone (20 ng) or VEGF-A + CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide or GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) peptide (1 mM). On the 12th day, a photograph of the CAM was taken. VEGF-A-induced angiogenesis was inhibited by 40% by CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) based on the number of capillaries emerging from the sponge (Table 13). The neovessels did not show the highly branched capillary structure typically seen after VEGF-A stimulation (not shown). Treatment with the control peptide GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) or a relatively low peptide concentration of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) had no effect on the number of growing vessels (not shown).
[0296]
Table 13: CAM assay for angiogenesis
Figure 2004508045
* P <0.01 by Student-Newman-Keuls test. Results are expressed as the mean and standard error from two independent experiments.
[0297]
APA deficient mice show impaired angiogenesis
In a model of hypoxic retinopathy in immature mice, APA+/-Mouse and APA− / −The angiogenic potential of null mice was investigated. Induction of retinal neovascularization by relative hypoxia was shown by APA compared to wild-type mice.+/-It was already present in the mouse (not shown). Angiogenesis was almost undetectable in APA null mice (not shown). Angiogenesis was quantified by counting protruding neovascular nuclei from 20 sections of hypoxic eyes. After 75% oxygen treatment of P7-P12, significant induction of retinal neovascularization (16.17 ± 1.99 neovascular nuclei per eye section) was observed in wild-type mice at 17 days of age (P17). Was seen. After P7-P12 75% oxygen exposure, P17 APA+/-Decreased amounts in the retina of mice (10.76 ± 1.03 neovascular nuclei per eye section) and APA null mice (4.25 ± 0.45 neovascular nuclei per eye section) Of neovascular nuclei were found.
[0298]
Consideration
In vivo, APA is overexpressed by activated microvessels, including tumors, but is almost undetectable in resting vasculature and is therefore a suitable target for vascular directed tumor therapy. In this example, a novel targeting peptide ligand of APA, CPRECESSIC (SEQ ID NO: 123), was identified. Soluble CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide has an IC of 800 μM50Inhibited the APA enzyme activity.
[0299]
When using cultured HUVEC as an in vitro angiogenesis model, soluble CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide inhibited VEGF-A-induced HUVEC migration and proliferation. These data are consistent with the requirement for endothelial cell migration and proliferation during angiogenesis. CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) also blocked the formation of capillary-like structures in the Matrigel model and inhibited angiogenesis in CAMs stimulated by VEGF-A.
[0300]
APA null mice had significantly lower retinal neovascularization compared to wild-type mice, indicating that APA plays an important role in relative hypoxia-induced angiogenesis. These results enhance the potential of using APA as a specific target for inhibiting tumor angiogenesis.
[0301]
In summary, the soluble peptide CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) is a selective APA ligand and inhibitor. Inhibition of APA by CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) inhibited angiogenesis in different in vitro and in vivo assays, demonstrating for the first time the prominent role of APA in the angiogenic process. Furthermore, APA-binding phage can regress into tumor vessels, suggesting the potential use of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) as an inhibitor of tumor angiogenesis therapeutically. . Endogenous analogs of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) can be identified by antibody-based purification or identification methods similar to those disclosed above.
[0302]
Embodiment 9 FIG. Screening of phage library by PALM
In certain embodiments, it is desirable to be able to select a particular cell type from a heterogeneous sample of an organ or tissue. One way to perform such selective sampling is by PALM (Laser Microbeam Positioning and Debonding).
[0303]
The PALM robotic microbeam uses an accurate computer guided laser for micro exfoliation. A pulsed ultraviolet (UV) laser is interfaced to the microscope and focused through the objective to a beam spot size less than 1 micrometer in diameter. The principle of laser cutting is a locally limited exfoliative photolysis process without heating (Hendrix, 1999). Effective laser energy is concentrated only in the small focal spots, and most biological objects are transparent with respect to the applied laser wavelength. This system appears to be a selection tool for recovering homogenous cell populations or single cells or subcellular structures for subsequent phage recovery. Tissue samples may be collected by excision of selected areas or single cells after administration of phage to a subject. A clear gap between selected and unselected areas is typically obtained. The isolated tissue specimen can be emitted directly from the objective plane and directly into the cap of a common microcentrifuge tube without any contact. It is believed that the basis of this so-called laser pressure firing (LPC) method is the laser pressure generated under the specimen caused by the extremely high photon density of a precisely focused laser microbeam. This tissue harvesting technique allows phage to survive and be rescued from the micro excision technique.
[0304]
PALM was used in this example to select targeting phage for mouse pancreatic tissue as described below.
[0305]
Materials and methods
In vitro and in situ panning
CX7C peptide phage library (109 TU) was injected into the tail vein of C57BL / 6 male mice, and the pancreas was collected to recover phage by bacterial infection. Phages from 246 colonies were individually grown in 5 ml of LB / kanamycin (100 μg / ml) / tetracycline (40 μg / ml) with shaking at 37 ° C. in the dark. Overnight cultures were pooled and phages were purified by NaCl / PEG precipitation for another round of in vivo biopanning. 300 colonies were picked from the second round of panning and phage were collected by precipitation. The phage from the second biopanning round was then used for another round of biopanning, and similarly incubated with cryo-thawed mouse pancreas sections for one in situ panning round.
[0306]
In a third round of in vivo panning, phage 10 from the second round9 TU was injected into a third mouse and allowed to circulate for 6 minutes followed by an intravenous injection of 50 μl of FITC-Lectin (Vector Laboratories Inc.). After circulating for 2 minutes, the left ventricle of the mouse was perfused with 3 ml of MEM Earle's salt. Pancreas was harvested, frozen at -80 ° C in Tissue Tek (Sakura) and sectioned on prepared slides.
[0307]
For the third in situ round, purified phage isolated from the second round were incubated with thawed mouse pancreas sections 4-14 μm sections for 30 minutes on ice. Sections were rinsed eight times with 100 μl ice-cold PBS at room temperature (RT). To infect bound phage for 30-60 minutes at RT, K91 Kan was used.R(OD600= 2.03) Recovered from each section by adding 100 μl. Infected K91 KanR was recovered from each section and allowed to recover in 10 ml of LB / Kan / Tet (0.2 μg / ml) for 20 minutes in the dark. Aliquots from each culture were plated on LB / Kan / Tet (40 μg / ml) plates and incubated overnight at 37 ° C. in the dark. The remaining tetracycline concentration in each culture was increased to 40 μg / ml and the cultures were incubated overnight at 37 ° C. with shaking in the dark to amplify and purify the phage.
[0308]
DNA amplification
Phages were recovered from cryopreserved FITC-lectin-stained mouse islets and surrounding acini, microexcised from 14 μm sections using a PALM (Laser Microbeam Localization and Detachment) cold laser pressure firing system. Islets and control sections were fired into 1 mM EDTA, pH 8, and frozen at -20 ° C until sufficient material was collected for PCR amplification. Phage DNA was amplified using the fUSE5 primer.
Figure 2004508045
The PCR product was subjected to another PCR round using the overlapping set of primers. The 3 'end of the second set of primers was tailed with M13 reverse primer for sequencing purposes. The nested primer set used was
Figure 2004508045
Met. Two additional primers were used to generate a peptide insert sequence containing the adjacent SfiI restriction site.
Figure 2004508045
The PCR product made from the nested primers was gel purified (Qiagen) and CX was performed using M13 reverse primer by automated sequencing.7The presence of the C peptide insert was confirmed. The PCR product generated from the library primers was gel purified (Qiagen) to give CsCl2Ligation to purified fUSE5 / SfiI, electroporation into electrocompetent MC1061 cells and plating on LB / streptomycin (100 μg / ml) / tetracycline (40 μg / ml) agar plates. CX by gel electrophoresis7To confirm the presence of the C insert sequence, single colonies were subjected to colony PCR using the fUSE5 primer. Positive clones were sequenced using a Big Dye terminator (Perkin Elmer).
[0309]
Phage infection
Islet and control sections were placed in a PBS solution of 1 mM AEBSF, 20 μg / ml aprotinin, 10 μg / ml leupeptin, 1 mM elastase inhibitor I, 0.1 mM TPCK, 1 nM pepstatin A at pH 7.4 and sufficient material was added. Were frozen for 48 hours or less until they were collected. Sections were thawed in ice and the volume was adjusted to 200 μl with PBS pH 7.4. The sample was prepared using K91 KanR(OD = 0.22) Incubated with 1 ml at RT on a swirler for 2 hours. Each culture was transferred to 1.2 ml LB / Kan / Tet (0.2 μg / ml) and incubated for 40 minutes in the dark at RT. The concentration of tetracycline was increased to 40 μg / ml for each culture and the cultures were incubated overnight at 37 ° C. with agitation. The next day, each culture was plated on LB / Kan / Tet agar plates and incubated for 14 hours in the dark at 37 ° C. Positive clones were picked for colony PCR and automated sequencing.
[0310]
result
The general scheme of in vivo panning using PALM is shown in FIG. After the first round of in vivo selection, a further round of in vivo screening was performed with bulk amplification of phage or single colonies of phage from pancreas, kidney, lung, and adrenal gland. Both bulk and colony amplified phage from mouse pancreas showed continuous enrichment as the selection rounds increased (not shown). After three rounds of selection, colony-amplified phage showed an enrichment nearly one order higher than bulk-amplified phage (not shown).
[0311]
Table 14 lists selected targeting sequences and consensus motifs identified by pancreatic screening.
[0312]
Table 14: Pancreatic targeting peptides and motifs
Figure 2004508045
Figure 2004508045
Figure 2004508045
[0313]
FIG. 27 shows a general protocol for the recovery of phage insert sequences from PALM-selected thin section material. As indicated, phage may be recovered by direct infection of E. coli host bacteria following protease digestion of thin section samples. Alternatively, the phage insert may be recovered by PCR amplification, cloned into new vector DNA, and then electroporated or transformed into host bacteria for cloning.
[0314]
Both methods of PALM recovery of phage successfully recovered pancreatic targeting sequences. Pancreatic sequences recovered by direct bacterial infection include:
Figure 2004508045
Was included. Pancreatic targeting sequences recovered by amplification of the phage insert and cloning into phage include:
Figure 2004508045
Is included.
[0315]
Figures 28-31 show the sequence homologies identified for selected pancreatic targeting sequences. Several proteins known to be present in pancreatic tissue were identified. The results of this example indicate that the PALM method may be used to select cell types from tissue thin sections and to recover targeting phage sequences. One of skill in the art will recognize that this method can be used on virtually any tissue to obtain a targeting sequence that is directed to a particular type of cell in a heterologous organ or tissue.
[0316]
All of the compositions, methods, and devices disclosed and claimed herein can be made and executed without undue experimentation in light of the present disclosure. Although the compositions and methods of the present invention have been described in terms of preferred embodiments, the compositions, methods, and devices, and the steps or order of steps disclosed herein, may be altered and are not subject to the invention. It will be apparent to those skilled in the art that the concepts, spirit, and scope of More specifically, it is clear that certain substances that are chemically and physiologically related may be replaced by the substances described herein if the same or similar results are obtained. All such similar substitutes and modifications apparent to those skilled in the art are deemed to be within the spirit, scope and concept of the invention as defined by the appended claims.
[0317]
reference
The following references are hereby specifically incorporated by reference to the extent that they provide exemplary approaches or other details of those described herein.
Figure 2004508045
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[Brief description of the drawings]
The following drawings are part of the present specification and are included to further demonstrate certain aspects of the present invention. The present invention may be better understood with reference to one or more of these drawings, together with a detailed description of the specific embodiments set forth herein.
FIG. 1. Confirmation of placental regression phage. Phage carrying the targeting peptide identified in Example 3 were injected into pregnant mice and recovery from placenta was compared to control fd-tet phage without the targeting sequence. The placental regression phage clones were PA-TPKTSVT (SEQ ID NO: 39), PC-RAPGGGVR (SEQ ID NO: 41), PE-LGLRSVG (SEQ ID NO: 44), and PF-YIRPFTL (SEQ ID NO: 43).
FIG. 2. Confirmation of fat regression peptide. Phage bearing the targeting peptide identified in Example 4 were injected into pregnant mice and the recovery from adipose tissue was compared to control fd-tet phage without the targeting sequence.
FIG. 3. In vitro spleen targeting using BRASIL. Binding of Fab clones # 2, # 6, # 10, and # 12 and control Fab clone NPC-3TT was compared to control Fd-tet phage.
FIG. 4. In vitro spleen targeting using BRASIL. The binding of Fab clones # 2, # 6, # 10 and # 12 and the control Fab clone NPC-3TT were directly compared to each other.
FIG. 5. In vivo spleen targeting using BRASIL. Binding of Fab clones # 2, # 6, # 10, and # 12 was compared to binding of Fd-tet phage.
FIG. 6. In vivo spleen targeting using BRASIL. Binding of Fab clone # 10 to spleen tissue was compared to binding of Fab control clones NPC-3TT and Fd-tet phage.
FIG. 7. Binding of Fab clone # 10 to spleen compared to Fd-tet phage (comparison with bone marrow).
FIG. 8. Binding of Fab clones from the anti-Kaposi sarcoma library to angiogenic retina.
FIG. 9: Binding of phage selected with β3 cytoplasmic domain to immobilized protein. GST fusion protein or GST alone was coated at 10 μg / ml into microtiter wells and used to bind phage expressing endostatin targeting peptide. Each phage was identified by the indicated peptide sequence: GLDTYRGSP (SEQ ID NO: 96); YDWWYPWSW (SEQ ID NO: 95); CLRQSYSSYNC (SEQ ID NO: 104); SDNRYIGSW (SEQ ID NO: 97); CEQRQTQEGC (SEQ ID NO: 93); CFQNRC (SEQ ID NO: 102). The data represent the average number of colonies from triplicate wells with a standard error of less than 10% of the mean.
FIG. 10. Binding of phage selected with β5 cytoplasmic domain to immobilized protein. GST fusion protein or GST alone was coated at 10 μg / ml into microtiter wells and used to bind phage expressing endostatin targeting peptide. Each phage was identified by the indicated peptide sequence: (A) DEEGYYMMR (SEQ ID NO: 110); (B) KQFSYRYLLL (SEQ ID NO: 111); (C) CEPYWDGWFC (SEQ ID NO: 106); (D) VIVISSMPD (SEQ ID NO: 112); and (E) CYIWPDSGLC (SEQ ID NO: 105). The data represent the average number of colonies from triplicate wells with a standard error of less than 10% of the mean.
FIG. 11. Binding of cytoplasmic domain binding phage to β3-immobilized protein and inhibition by synthetic peptides. Phage were incubated on GST-β3cyto coated wells in the presence of increasing concentrations of the corresponding synthetic or control peptides. The data represent the average number of colonies from triplicate wells with a standard error of less than 10% of the mean.
FIG. 12: Binding of cytoplasmic domain binding phage to β5-immobilized protein and inhibition by synthetic peptides. Phage were incubated on GST-β5cyto coated wells in the presence of increasing concentrations of the corresponding synthetic or control peptide. The data represent the average number of colonies from triplicate wells with a standard error of less than 10% of the mean.
FIG. 13. Binding of phage after phosphorylation to immobilized β3-GST and β5-GST. The phage was phosphorylated with Fyn kinase. No insert-containing phage was used as a control. The phage were incubated on wells coated with GST-β3cyto or GST-β5cyto. The data represent the average number of colonies from triplicate wells with a standard error of less than 10% of the mean.
FIG. 14. Binding of phage after phosphorylation to immobilized GST fusion protein. The phage was phosphorylated with Fyn kinase. No insert-containing phage was used as a control. Phages were incubated on wells coated with the GST cytoplasmic domain. The data represent the average number of colonies from triplicate wells with a standard error of less than 10% of the mean.
FIG. 15: Effect of integrin cytoplasmic domain binding peptide on cell proliferation. Serum-depleted cells were cultured for 24 hours, [3[H] thymidine (1 μCi / ml) uptake was measured for proliferation. In the positive control, VEGF was added back to serum-depleted cells. Each experiment was performed three times in triplicate, and the results were expressed as mean ± SD.
FIG. 16: Effect of penetratin peptide chimera on endothelial cell migration. Cell migration assays were performed in 48-well microchemotaxis chambers. In each well, five random high power fields (40 ×) were counted. The results show that while both β3 integrin cytoplasmic domain binding peptides (Y-18 and TYR-11) increase cell migration, penetratin did not affect cells.
FIG. 17. Penetratin peptide chimera binding to β5 cytoplasmic domain induces programmed cell death. 106HUVEC cells were harvested in complete medium and 15 μM penetratin peptide chimera was added to the cells. At 4, 8, and 12 hours, cells were stained with propidium iodide (PI) and apoptosis induction was analyzed by cytometric analysis. a) Profile obtained with depleted cells after 24 hours. b) Confluent cells in complete medium. c) 15 μM penetratin after 4 hours. d) 15 μM VISY-penetratin chimera after 4 hours. Cells analyzed after 8 and 12 hours were G0/ G1Similar ratio profiles were shown.
FIG. 18: Specificity of antibodies produced against phages selected with β3 or β5 (ELISA). Increasing dilutions of sera obtained after three immunizations with GLDTYRGSP (SEQ ID NO: 96) or SNDRYIGSW (SEQ ID NO: 97) conjugated to KLH were combined with 10 μg of SDNRYIGSW (SEQ ID NO: 97, Y-18). , GLDTYRGSP (SEQ ID NO: 96, TYR-11), or microtiter wells coated with a control peptide. Pre-immune serum was used as a control. After incubation with goat HRP anti-rabbit antibody, the OD was measured at 405 nm. The data represent the mean from triplicate wells with a standard error of less than 10%.
FIG. 19. Specificity of antibodies produced against β3 or β5 selected phage (ELISA). Serum obtained after three immunizations with SKDRYIGSW (SEQ ID NO: 97, Y-18) or GLDTYRGSP (SEQ ID NO: 96, TYR-11) conjugated to KLH is coated with 10 μg of TYR-11 or Y-18. Incubated microtiter wells. GLDTYRGSP (SEQ ID NO: 96) or SDNRYIGSW (SEQ ID NO: 97) and a control peptide were added to the solution. After incubation with goat HRP anti-rabbit antibody, the OD was measured at 405 nm. Data represent the mean from triplicate wells with a standard error of less than 10%. The peptide added to the solution specifically blocks reactivity with the immobilized peptide.
FIG. 20A shows competitive binding of Annexin V to β5 integrin with the VISY peptide. Binding assays were performed by ELISA. FIG. 20B shows the relative levels of anti-annexin V antibody binding to purified annexin V protein and the VISY peptide.
FIG. 21. Chimeric peptide containing a VISY peptide linked to penetratin (antennapedia) induces apoptosis. Apoptosis induced by VISY was inhibited by the addition of a caspase inhibitor (zVAD).
FIG. 22. APA binding phage binds specifically to tumors. Equal amounts of phage were injected into the tail vein of mice bearing MDA-MB-435-derived tumors, and phages were collected after perfusion. The mean and standard error of phage recovered from tumor or control tissue (brain) from triplicate seedings are shown.
FIG. 23. CPRESSICS (SEQ ID NO: 123) is a specific inhibitor of APA activity. APA enzyme activity was assayed in the presence of increasing concentrations of either the GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) peptide (control) or the CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide. IC for APA inhibition by CPRECESIC (SEQ ID NO: 123)50Was estimated at 800 μM. Error bars are standard errors of the mean of triplicate wells. The experiment was repeated three times with similar results.
FIG. 24. CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) inhibits HUVEC migration. HUVEC were stimulated with VEGF-A (10 ng / ml). The assay was performed in a Boyden microchemotaxis chamber and cells were allowed to migrate through an 8 μm pore filter at 37 ° C. for 5 hours. The GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) peptide (control) and CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide were tested at a concentration of 1 mM. The migrated cells were stained and 5 high power fields (100 ×) were counted for each microwell. Error bars are standard errors of the mean of triplicate microwells.
FIG. 25. CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) inhibits HUVEC proliferation. Cells were stimulated with VEGF-A (10 ng / ml) and proliferation was assessed at the indicated time points by a colorimetric assay based on crystal violet staining. Error bars are standard errors of the mean of triplicate wells. Each experiment was repeated at least twice with similar results.
FIG. 26. In vivo biopanning protocol for phage targeted in mouse pancreas, kidney, liver, lung, and adrenal gland.
FIG. 27. Protocol for recovery of phage by infection of E. coli or recovery of phage DNA by amplification and subcloning.
FIG. 28. Islet targeting peptide and homologous proteins. Endogenous protein candidates mimicked by the following islet targeting peptides identified by standard homology searches: CVSNPRWKC (SEQ ID NO: 197), CVPRRWDVC (SEQ ID NO: 194), CQHTSGRGC (SEQ ID NO: 195), and CRARGWLLC (SEQ ID NO: 196).
FIG. 29. Islet targeting peptide and homologous proteins. Endogenous protein candidates mimicked by the following islet targeting peptides identified by standard homology searches: CGGVHARC (SEQ ID NO: 175), CFNRTWIGC (SEQ ID NO: 198), and CWSRQGGC (SEQ ID NO: 200).
FIG. 30. Islet targeting peptide and homologous proteins. Endogenous protein candidates mimicked by the following islet targeting peptides identified by standard homology searches: CLASGMDAC (SEQ ID NO: 204), CHDERTGRC (SEQ ID NO: 205), CAHHALMEC (SEQ ID NO: 206), and CMQGARTSC (SEQ ID NO: 208).
FIG. 31. Islet targeting peptide and homologous proteins. Endogenous protein candidates mimicked by the following islet targeting peptides identified by standard homology searches: CHVLWSTRC (SEQ ID NO: 201), CMSSPGVAC (SEQ ID NO: 203), and CLGLLLMAGC (SEQ ID NO: 202).

Claims (83)

ａ）ファージディスプレイライブラリを被験者へ注射する段階；
ｂ）１つ又は複数の臓器又は組織の試料を得る段階；
ｃ）試料の薄片を作製する段階；及び
ｄ）薄片からファージを回収する段階
を含む方法。a) injecting a phage display library into a subject;
b) obtaining a sample of one or more organs or tissues;
c) making a slice of the sample; and d) recovering the phage from the slice. ＰＡＬＭ（レーザーミクロビームを用いた位置決めおよび切除（Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｂｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｌａｓｅｒ Ｍｉｃｒｏｂｅａｍｓ））により薄片の１つ又は複数の部分を選択する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。The method of claim 1, further comprising selecting one or more portions of the slice by PALM (Positioning and Ablation with Laser Microbeams). 選択された部分が特異的な細胞型を含む、請求項２記載の方法。3. The method of claim 2, wherein the selected portion comprises a specific cell type. 選択された部分が同種の細胞集団を含む、請求項２記載の方法。3. The method of claim 2, wherein the selected portion comprises a homogeneous cell population. 細胞が癌細胞である、請求項３記載の方法。4. The method according to claim 3, wherein the cell is a cancer cell. ファージが、細菌にファージを感染させることにより回収される、請求項１記載の方法。The method of claim 1, wherein the phage is recovered by infecting the phage with a bacterium. 新たなファージを作製するため、ファージ挿入物を増幅すること及び増幅された挿入物をファージＤＮＡと連結することにより、ファージが回収される、請求項１記載の方法。The method of claim 1, wherein the phage is recovered by amplifying the phage insert and ligating the amplified insert with phage DNA to produce a new phage. ファージディスプレイライブラリを調製する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）標的の臓器、組織、又は細胞型により宿主動物を免疫する段階；
ｂ）宿主動物から抗体をコードするｍＲＮＡを得る段階；
ｃ）抗体をコードするｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する段階；及び
ｄ）ｃＤＮＡからファージディスプレイライブラリを調製する段階。A method for preparing a phage display library, comprising the following steps:
a) immunizing a host animal with a target organ, tissue, or cell type;
b) obtaining mRNA encoding the antibody from the host animal;
c) preparing a cDNA from the mRNA encoding the antibody; and d) preparing a phage display library from the cDNA. 抗体に特異的なプライマーを使用して抗体をコードするｃＤＮＡを増幅する段階をさらに含む、請求項８記載の方法。9. The method of claim 8, further comprising amplifying the cDNA encoding the antibody using a primer specific for the antibody. 標的の臓器、組織、又は細胞型が罹患している、請求項８記載の方法。9. The method of claim 8, wherein the target organ, tissue, or cell type is affected. 標的が癌細胞を含む、請求項１０記載の方法。11. The method of claim 10, wherein the target comprises a cancer cell. （ｉ）ファージディスプレイライブラリを被験者へ注射する段階；及び
（ｉｉ）１つ又は複数の臓器、組織、又は細胞型からファージを回収する段階
をさらに含む、請求項８記載の方法。9. The method of claim 8, further comprising: (i) injecting the phage display library into the subject; and (ii) recovering the phage from one or more organs, tissues, or cell types. 標的のタンパク質又はペプチドに対してライブラリをスクリーニングする段階をさらに含む、請求項８記載の方法。9. The method of claim 8, further comprising screening the library for a target protein or peptide. 請求項８記載の方法により調製された、ファージディスプレイライブラリ。A phage display library prepared by the method according to claim 8. 妊娠を妨害する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、又は配列番号：４５より選択される配列の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含むペプチドを得る段階；及び
ｂ）ペプチドを雌被験者に投与する段階。A method of preventing pregnancy, comprising the following steps:
a) at least three consecutive amino acids of a sequence selected from SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, or SEQ ID NO: 45 Obtaining a peptide comprising: and b) administering the peptide to a female subject. 被験者が妊娠している、請求項１５記載の方法。16. The method of claim 15, wherein the subject is pregnant. 薬剤をペプチドへ付着させる段階をさらに含む、請求項１５記載の方法。17. The method of claim 15, further comprising attaching an agent to the peptide. 胎児へ薬剤を送達する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、又は配列番号：４５より選択される配列の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含むペプチドを得る段階；
ｂ）ペプチドを薬剤へ付着させる段階；及び
ｃ）ペプチドを妊娠被験者に投与する段階。A method of delivering a drug to a fetus, comprising the following steps:
a) at least three consecutive amino acids of a sequence selected from SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, or SEQ ID NO: 45 Obtaining a peptide comprising:
b) attaching the peptide to the drug; and c) administering the peptide to a pregnant subject. 薬剤が、薬物、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、酵素、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞毒性剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のＦａｂ断片、造影剤、抗原、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモンアンタゴニスト、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、微小装置、細胞、又は発現ベクターである、請求項１７又は１８記載の方法。The drug may be a drug, an anti-apoptotic agent, an anti-angiogenic agent, an enzyme, a hormone, a cytokine, a growth factor, a cytotoxic agent, a peptide, a protein, an antibiotic, an antibody, a Fab fragment of an antibody, a contrast agent, an antigen, a survival factor, 19. The method according to claim 17 or 18, which is an apoptotic agent, a hormone antagonist, a virus, a bacteriophage, a bacterium, a liposome, a microparticle, a microdevice, a cell, or an expression vector. 脂肪組織へのターゲティング送達の方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、又は配列番号：５５より選択される少なくとも３個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列を含むターゲティングペプチドを得る段階；
ｂ）ペプチドを薬剤へ付着させて複合体を形成させる段階；及び
ｃ）複合体を被験者に投与する段階。A method of targeted delivery to adipose tissue, comprising the following steps:
a) selected from SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, or SEQ ID NO: 55 Obtaining a targeting peptide comprising an amino acid sequence of at least three consecutive amino acids;
b) attaching the peptide to the drug to form a complex; and c) administering the complex to the subject. 被験者において体重減少を誘導する段階をさらに含む、請求項２０記載の方法。21. The method of claim 20, further comprising inducing weight loss in the subject. 配列番号：５〜配列番号：４５、配列番号：４７〜配列番号：１２１、配列番号：１２３、及び配列番号：１２５〜配列番号：２５０のいずれかより選択される配列の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含む、大きさが１００アミノ酸以下の単離ペプチド。SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 125 to SEQ ID NO: 250. An isolated peptide of up to 100 amino acids in size, including amino acids. 大きさが５０アミノ酸以下の、請求項２２記載の単離ペプチド。23. The isolated peptide of claim 22, which is less than 50 amino acids in size. 大きさが２５アミノ酸以下の、請求項２２記載の単離ペプチド。23. The isolated peptide of claim 22, which is no more than 25 amino acids in size. 大きさが１０アミノ酸以下の、請求項２２記載の単離ペプチド。23. The isolated peptide of claim 22, which is no more than 10 amino acids in size. 大きさが７アミノ酸以下の、請求項２２記載の単離ペプチド。23. The isolated peptide of claim 22, having a size of 7 amino acids or less. 大きさが５アミノ酸以下の、請求項２２記載の単離ペプチド。23. The isolated peptide of claim 22, which is no more than 5 amino acids in size. 配列番号：５〜配列番号：４５、配列番号：４７〜配列番号：１２１、配列番号：１２３、及び配列番号：１２５〜配列番号：２５０のいずれかより選択される配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸を含む、請求項２２記載の単離ペプチド。SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 125 to SEQ ID NO: 250. 23. The isolated peptide of claim 22, comprising an amino acid. 分子に付着している、請求項２２記載の単離ペプチド。23. The isolated peptide of claim 22, which is attached to a molecule. 分子が、薬物、化学療法剤、放射性同位体、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞毒性剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のＦａｂ断片、造影剤、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモンアンタゴニスト、又は抗原である、請求項２９記載の単離ペプチド。The molecule is a drug, chemotherapeutic agent, radioisotope, apoptosis promoter, anti-angiogenic agent, hormone, cytokine, growth factor, cytotoxic agent, peptide, protein, antibiotic, antibody, Fab fragment of antibody, contrast agent, 30. The isolated peptide of claim 29, which is a survival factor, an anti-apoptotic agent, a hormone antagonist, or an antigen. アポトーシス促進剤が、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）、セクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）、（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（配列番号：１）、（ＫＬＡＫＫＬＡ）２（配列番号：２）、（ＫＡＡＫＫＡＡ）２（配列番号：３）、及び（ＫＬＧＫＫＬＧ）３（配列番号：４）からなる群より選択される、請求項３０記載の単離ペプチド。Apoptosis-promoting agents include gramicidin, magainin, melittin, defensin, cecropin, (KLAKLAK) 2 (SEQ ID NO: 1), (KLAKLA) 2 (SEQ ID NO: 2), and (KAAKKAA) 2 (SEQ ID NO: 2). 31. The isolated peptide of claim 30, selected from the group consisting of: (KLGKKLG) 3 (SEQ ID NO: 4). 抗血管新生剤が、トロンボスポンジン、アンジオスタチン５、色素上皮由来因子（ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ）、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、血小板因子４、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン（ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ）関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット（Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）、ペントサンポリスルフェート（ｐｅｎｔｏｓａｎ ｐｏｌｙｓｕｌｐｈａｔｅ）、アンジオポエチン２（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、インターフェロンα、ハービマイシン（ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎ）Ａ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノマイド（Ｌｉｎｏｍｉｄｅ）、サリドマイド、ペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅ）、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ポリアミン、プロテアソーム阻害剤、キナーゼ阻害剤、シグナル伝達ペプチド、アキュチン（ａｃｃｕｔｉｎ）、シドフォビル（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４、及びミノサイクリン（ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ）からなる群より選択される、請求項３０記載の単離ペプチド。Anti-angiogenic agents include thrombospondin, angiostatin 5, pigment epithelium-driven factor, angiotensin, laminin peptide, fibronectin peptide, plasminogen activator inhibitor, tissue metalloproteinase inhibitor, interferon, Interleukin 12, platelet factor 4, IP-10, Gro-β, thrombospondin, 2-methoxyestradiol, proliferin-related protein, carboxyamide triazole, CM101, marimasat, pentosan polysulfate (pentosan) polysulfate), angiopoietin 2 (Regeneron), interferon α , Herbimycin A, PNU145156E, 16K prolactin fragment, linomide, thalidomide, pentoxifylline, genistein, TNP-470, endostatin, paclitaxel, et al. 31. The inhibitor selected from the group consisting of inhibitors, kinase inhibitors, signaling peptides, accutin, cidofovir, vincristine, bleomycin, AGM-1470, platelet factor 4, and minocycline. Isolated peptide. サイトカインが、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ（ＩＦ−γ）、ＩＦ−α、ＩＦ−β、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、又はＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）からなる群より選択される、請求項３０記載の単離ペプチド。The cytokine is interleukin 1 (IL-1), IL-2, IL-5, IL-10, IL-11, IL-12, IL-18, interferon-γ (IF-γ), IF-α, IF 31. The isolated peptide of claim 30, which is selected from the group consisting of -β, tumor necrosis factor-α (TNF-α), or GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor). 高分子複合体に付着している、請求項２２記載の単離ペプチド。23. The isolated peptide of claim 22, which is attached to a polymer complex. 複合体が、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、磁性ビーズ、酵母細胞、哺乳動物細胞、又は細胞である、請求項３４記載の単離ペプチド。35. The isolated peptide of claim 34, wherein the complex is a virus, bacteriophage, bacteria, liposome, microparticle, magnetic bead, yeast cell, mammalian cell, or cell. 真核生物発現ベクターに付着している、請求項３４記載の単離ペプチド。35. The isolated peptide of claim 34, which is attached to a eukaryotic expression vector. ベクターが遺伝子治療ベクターである、請求項３６記載の単離ペプチド。37. The isolated peptide of claim 36, wherein the vector is a gene therapy vector. 固体支持体に付着している、請求項２２記載の単離ペプチド。23. The isolated peptide of claim 22, which is attached to a solid support. 薬学的に許容される担体の中に請求項２２記載の単離ペプチドを含む組成物。A composition comprising the isolated peptide of claim 22 in a pharmaceutically acceptable carrier. 単離ペプチドが、分子又は高分子複合体に付着している、請求項３９記載の組成物。40. The composition of claim 39, wherein the isolated peptide is attached to a molecule or a macromolecular complex. 配列が、配列番号：５〜配列番号：１９のいずれかより選択される、請求項２２記載の単離ペプチド。23. The isolated peptide according to claim 22, wherein the sequence is selected from any of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 19. 配列が、配列番号：２０〜配列番号：３８のいずれかより選択される、請求項２２記載の単離ペプチド。23. The isolated peptide according to claim 22, wherein the sequence is selected from any of SEQ ID NO: 20 to SEQ ID NO: 38. 配列が、配列番号：２１０〜配列番号：２３４のいずれかより選択される、請求項２２記載の単離ペプチド。23. The isolated peptide of claim 22, wherein the sequence is selected from any of SEQ ID NOs: 210-234. 配列が、配列番号：５６〜配列番号：６８のいずれかより選択される、請求項２２記載の単離ペプチド。23. The isolated peptide according to claim 22, wherein the sequence is selected from any of SEQ ID NO: 56 to SEQ ID NO: 68. 配列が、配列番号：６９〜配列番号：８８のいずれかより選択される、請求項２２記載の単離ペプチド。23. The isolated peptide according to claim 22, wherein the sequence is selected from any of SEQ ID NO: 69 to SEQ ID NO: 88. 配列が、配列番号：２３５〜配列番号：２５０のいずれかより選択される、請求項２２記載の単離ペプチド。23. The isolated peptide according to claim 22, wherein the sequence is selected from any of SEQ ID NO: 235 to SEQ ID NO: 250. 配列が、配列番号：８９、配列番号：９０、配列番号：９１、又は配列番号：９２より選択される、請求項２２記載の単離ペプチド。23. The isolated peptide of claim 22, wherein the sequence is selected from SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, or SEQ ID NO: 92. それぞれ容器内に存在する請求項２２記載の単離ペプチド及び対照ペプチドを含む、キット。A kit comprising the isolated peptide of claim 22 and a control peptide, each present in a container. 単離ペプチドが、配列番号：５〜配列番号：４５、配列番号：４７〜配列番号：１２１、配列番号：１２３、及び配列番号：１２５〜配列番号：２５０のいずれかより選択される配列の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含む、単離ペプチドと選択的に結合する抗体。The isolated peptide is at least a sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 5 to 45, SEQ ID NOs: 47 to 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NOs: 125 to 250. An antibody that selectively binds to an isolated peptide, comprising three consecutive amino acids. ａ）ファージディスプレイライブラリを被験者に注射する段階；
ｂ）少なくとも１個の臓器、組織、又は細胞型の少なくとも１個の試料を回収する段階；
ｃ）試料を、単離細胞又は細胞塊へと分離させる段階；
ｄ）ペレットを形成させるため、有機相を介して細胞を遠心分離する段階；及び
ｅ）ペレットよりファージを回収する段階
を含む方法。a) injecting a phage display library into a subject;
b) collecting at least one sample of at least one organ, tissue or cell type;
c) separating the sample into isolated cells or cell clumps;
d) centrifuging the cells through the organic phase to form a pellet; and e) recovering the phage from the pellet. 異なる臓器、組織、又は細胞型に対して、ファージディスプレイライブラリを予備選択する段階をさらに含む、請求項５０記載の方法。51. The method of claim 50, further comprising pre-selecting a phage display library for different organs, tissues, or cell types. ターゲティングペプチド配列が、配列番号：５〜配列番号：４５、配列番号：４７〜配列番号：１２１、配列番号：１２３、及び配列番号：１２５〜配列番号：２５０のいずれかより選択される少なくとも３個の連続したアミノ酸を含む、表面タンパク質の一部としてターゲティングペプチド配列を発現する、遺伝子治療ベクター。At least three targeting peptide sequences selected from any of SEQ ID NOs: 5 to 45, SEQ ID NOs: 47 to 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NOs: 125 to 250 A gene therapy vector that expresses a targeting peptide sequence as part of a surface protein, comprising a sequence of amino acids. 臓器又は組織へのターゲティング送達の方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）請求項２２記載のペプチドを得る段階；
ｂ）ペプチドを薬剤へ付着させる段階；及び
ｃ）薬剤を被験者に投与する段階。A method of targeted delivery to an organ or tissue, comprising the following steps:
a) obtaining the peptide of claim 22;
b) attaching the peptide to the drug; and c) administering the drug to the subject. 被験者がヒト又はマウスである、請求項５３記載の方法。54. The method of claim 53, wherein the subject is a human or a mouse. 薬剤が、薬物、化学療法剤、放射性同位体、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、酵素、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞毒性剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のＦａｂ断片、造影剤、抗原、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモンアンタゴニスト、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、磁性ビーズ、微小装置、酵母細胞、哺乳動物細胞、細胞、又は発現ベクターである、請求項５３記載の方法。Drug is a drug, chemotherapeutic agent, radioisotope, apoptosis promoter, anti-angiogenic agent, enzyme, hormone, cytokine, growth factor, cytotoxic agent, peptide, protein, antibiotic, antibody, Fab fragment of antibody, imaging 54. The agent, antigen, survival factor, anti-apoptotic agent, hormone antagonist, virus, bacteriophage, bacterium, liposome, microparticle, magnetic bead, microdevice, yeast cell, mammalian cell, cell, or expression vector. the method of. 薬剤が造影剤である、請求項５３記載の方法。54. The method of claim 53, wherein the agent is a contrast agent. 被験者の画像を得る段階をさらに含む、請求項５６記載の方法。57. The method of claim 56, further comprising obtaining an image of the subject. 画像が疾患の診断用である、請求項５７記載の方法。58. The method of claim 57, wherein the image is for diagnosis of a disease. 疾患が、癌、関節炎、糖尿病、炎症性疾患、動脈硬化、自己免疫疾患、細菌感染、ウイルス感染、心血管疾患、又は変性疾患である、請求項５８記載の方法。59. The method of claim 58, wherein the disease is cancer, arthritis, diabetes, inflammatory disease, arteriosclerosis, autoimmune disease, bacterial infection, viral infection, cardiovascular disease, or degenerative disease. 臓器又は組織が、骨髄、前立腺、前立腺癌、卵巣、尿管、胎盤、脂肪、脾臓、血管新生組織、又は腹水である、請求項５３記載の方法。54. The method of claim 53, wherein the organ or tissue is bone marrow, prostate, prostate cancer, ovary, ureter, placenta, fat, spleen, angiogenic tissue, or ascites. 前立腺癌へのターゲティング送達の方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）配列番号：２０〜配列番号：３８のいずれかより選択される少なくとも３個の連続したアミノ酸を含むターゲティングペプチドを得る段階；
ｂ）ペプチドを治療剤へ付着させて複合体を形成させる段階；及び
ｃ）前立腺癌を有する被験者に複合体を投与する段階。A method of targeted delivery to prostate cancer, comprising the following steps:
a) obtaining a targeting peptide comprising at least three consecutive amino acids selected from any of SEQ ID NO: 20 to SEQ ID NO: 38;
b) attaching the peptide to the therapeutic agent to form a complex; and c) administering the complex to a subject with prostate cancer. 前立腺癌を診断する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）配列番号：２０〜配列番号：３８のいずれかより選択される少なくとも３個の連続したアミノ酸を含むターゲティングペプチドを得る段階；
ｂ）前立腺癌を有すると推測される被験者にペプチドを投与する段階；及び
ｃ）前立腺癌細胞と結合したペプチドを検出する段階。A method of diagnosing prostate cancer, comprising the following steps:
a) obtaining a targeting peptide comprising at least three consecutive amino acids selected from any of SEQ ID NO: 20 to SEQ ID NO: 38;
b) administering the peptide to a subject suspected of having prostate cancer; and c) detecting the peptide bound to prostate cancer cells. 血管新生組織に対するターゲティングペプチドを同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）新生児被験者において低酸素を誘導する段階；
ｂ）ファージディスプレイライブラリを被験者に投与する段階；及び
ｃ）被験者の網膜よりファージを回収する段階。A method for identifying a targeting peptide for an angiogenic tissue, comprising:
a) inducing hypoxia in a neonatal subject;
b) administering the phage display library to the subject; and c) collecting phage from the subject's retina. 細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）配列番号：９３〜配列番号：１２１のいずれかより選択される少なくとも３個の連続したアミノ酸を含むターゲティングペプチドを得る段階；
ｂ）ペプチドを透過処理剤へ付着させて複合体を形成させる段階；及び
ｃ）複合体を細胞に投与する段階。A method of inducing apoptosis in a cell, comprising the steps of:
a) obtaining a targeting peptide comprising at least three consecutive amino acids selected from any of SEQ ID NO: 93 to SEQ ID NO: 121;
b) attaching the peptide to the permeabilizing agent to form a complex; and c) administering the complex to cells. 透過処理剤が、配列番号：１２２のアミノ酸配列を有するペプチド又はＨＩＶ Ｔａｔタンパク質より選択される、請求項６４記載の方法。65. The method of claim 64, wherein the permeabilizing agent is selected from a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122 or an HIV Tat protein. ターゲティングペプチドが配列番号：１１２のアミノ酸配列を有する、請求項６４記載の方法。65. The method of claim 64, wherein the targeting peptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112. 細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖを透過処理剤へ付着させて複合体を形成させる段階；及び
ｂ）複合体を細胞に投与する段階。A method of inducing apoptosis in a cell, comprising the steps of:
a) attaching Annexin V to the permeabilizing agent to form a complex; and b) administering the complex to cells. 透過処理剤が、配列番号：１２２のアミノ酸配列を有するペプチド又はＨＩＶ Ｔａｔタンパク質より選択される、請求項６７記載の方法。68. The method of claim 67, wherein the permeabilizing agent is selected from a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122 or an HIV Tat protein. 血管新生を調整する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）配列番号：９３〜配列番号：１３１より選択される少なくとも３個の連続したアミノ酸を含むペプチドを得る段階；及び
ｂ）ペプチドを被験者に投与する段階。A method of regulating angiogenesis, comprising the following steps:
a) obtaining a peptide comprising at least three consecutive amino acids selected from SEQ ID NO: 93 to SEQ ID NO: 131; and b) administering the peptide to a subject. 被験者が腫瘍を有し、かつペプチドが腫瘍の増殖又は生存を阻害する、請求項６９記載の方法。70. The method of claim 69, wherein the subject has a tumor and the peptide inhibits tumor growth or survival. ペプチドが薬剤に付着している、請求項６９記載の方法。70. The method of claim 69, wherein the peptide is attached to the drug. 薬剤が、トロンボスポンジン、アンジオスタチン５、色素上皮由来因子、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、血小板因子４、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサンポリスルフェート、アンジオポエチン２（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、インターフェロンα、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノマイド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４、またはミノサイクリンである、請求項７１記載の方法。The drug may be thrombospondin, angiostatin 5, pigment epithelium-derived factor, angiotensin, laminin peptide, fibronectin peptide, plasminogen activator inhibitor, tissue metalloproteinase inhibitor, interferon, interleukin 12, platelet factor 4, IP- 10, Gro-β, thrombospondin, 2-methoxyestradiol, proliferin-related protein, carboxamide triazole, CM101, marimastat, pentosan polysulfate, angiopoietin 2 (Regeneron), interferon α, herbimycin A, PNU145156E, 16K prolactin Fragment, linomid, thalidomide, pentoxifylline, genistein, TNP-470, endostatin, paclita 72. The method of claim 71, wherein the method is xcel, acutin, cidofovir, vincristine, bleomycin, AGM-1470, platelet factor 4, or minocycline. ペプチドが抗血管新生活性を有する、請求項６９記載の方法。70. The method of claim 69, wherein the peptide has anti-angiogenic activity. ペプチドが血管新生促進活性を有する、請求項６９記載の方法。70. The method of claim 69, wherein the peptide has pro-angiogenic activity. 虚血を有する被験者にペプチドを投与する段階をさらに含む、請求項７３記載の方法。74. The method of claim 73, further comprising administering the peptide to a subject having ischemia. 心血管疾患を有する被験者にペプチドを投与する段階をさらに含む、請求項７３記載の方法。74. The method of claim 73, further comprising administering the peptide to a subject having a cardiovascular disease. 癌、関節炎、糖尿病、心血管疾患、炎症、又は黄斑変性症を有する被験者にペプチドを投与する段階をさらに含む、請求項６９記載の方法。70. The method of claim 69, further comprising administering the peptide to a subject having cancer, arthritis, diabetes, cardiovascular disease, inflammation, or macular degeneration. 血管新生組織へのターゲティング送達の方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）配列番号：１２３、配列番号：１２５、配列番号：１２６、配列番号：１２７、配列番号：１２８、配列番号：１２９、配列番号：１３０、又は配列番号：１３１より選択される少なくとも３個の連続したアミノ酸を含むペプチドを得る段階；
ｂ）ペプチドを治療剤へ付着させて複合体を形成させる段階；及び
ｃ）複合体を被験者に投与する段階。A method of targeted delivery to an angiogenic tissue, comprising the following steps:
a) at least three selected from SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, or SEQ ID NO: 131 Obtaining a peptide comprising consecutive amino acids;
b) attaching the peptide to the therapeutic agent to form a complex; and c) administering the complex to the subject. ペプチドが、配列番号：１２３のアミノ酸配列を有する、請求項７８記載の方法。79. The method of claim 78, wherein the peptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 123. 血管新生組織が、癌、関節炎、糖尿病、心血管疾患、炎症、又は黄斑変性症を有する被験者に由来する、請求項７８記載の方法。79. The method of claim 78, wherein the angiogenic tissue is from a subject having cancer, arthritis, diabetes, cardiovascular disease, inflammation, or macular degeneration. エンドスタチン又はアンジオスタチンの受容体を検出する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）組織又は臓器より試料を得る段階；
ｂ）試料をエンドスタチン又はアンジオスタチンと共にインキュベートする段階；及び
ｃ）試料と結合したエンドスタチン又はアンジオスタチンの存在を検出する段階。A method for detecting a receptor for endostatin or angiostatin, comprising the steps of:
a) obtaining a sample from a tissue or organ;
b) incubating the sample with endostatin or angiostatin; and c) detecting the presence of endostatin or angiostatin bound to the sample. 試料が、組織又は臓器の薄片である、請求項８１記載の方法。82. The method of claim 81, wherein the sample is a slice of a tissue or organ. エンドスタチン又はアンジオスタチンに選択的なターゲティングペプチドを用いて結合を阻害することにより、特異性を評価する段階をさらに含む、請求項８２記載の方法。83. The method of claim 82, further comprising assessing specificity by inhibiting binding with a targeting peptide selective for endostatin or angiostatin.
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