【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、病巣部位を確実にターゲッティングして、目的病巣部位の細胞内に薬物を安全にかつ効率良く送達するドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）として有用な、特に遺伝子の細胞質伝達・発現に実用的な薬物担体、およびその調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
薬剤、ＤＮＡ（遺伝子）、ペプチドあるいはタンパク質などの治療および／または診断のための薬物投与において、薬効を最大限に引き出すためには、癌、リンパ腫、肺炎、肝炎、腎炎、血管内皮損傷部位などの病巣部位を確実にターゲッティングし、薬物を安全にかつ効率良く送達するために、薬物送達の正確なコントロールが望まれる。近年、このようなドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）における運搬体（担体）として、リポソーム、エマルジョン、リピッドマイクロスフェアなどの閉鎖小胞を応用しようとする研究が盛んに行われている。
【０００３】
特に細胞内で活性を発現するタンパク質、ＤＮＡ（遺伝子）、アンチセンス分子などの生理活性物質を有効に働かせるためには、これらを細胞質中に導入する必要があるが、細胞膜は、多くの水溶性物質、高分子を透過させないため、薬物を細胞質まで送達するための運搬体（ベクター）を必要とする。遺伝子デリバリーシステムにおいては、ウイルスベクターを用い、感染により遺伝子を細胞内に導入するが、危険性を伴うウイルスベクターに代わる安全な非ウィルス（合成）ベクターの使用が望まれている。
【０００４】
合成ベクターとして、上記リポソームの利用が具体的に検討されており、たとえば遺伝子を補足し、かつ細胞内に高い導入率で取り込ませるために、リポソーム脂質膜成分をカチオン化した脂質ＤＮＡ複合体（以下、リポプレックスと称す）が知られている（たとえば特許文献１〜４など参照）。またすでにＤＣ−ｃｈｏｌ：３−β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’− ジメチルアミノエタン） カルバモイル） コレステロールなどのカチオン性脂質の製品を入手することもできる。しかしながら上記カチオン化リポプレックスなど、従来の開発技術によるリポプレックスによる細胞内への遺伝子導入率は充分とはいえず、このため実用的に応用しうるレベルで遺伝子発現させることが困難である。このため細胞内への遺伝子導入率が高く、かつ発現率が高く、遺伝子を効率よくトランスフェクションしうる安全で高機能な合成ベクターの開発が切望されている。
【０００５】
そこで、上記カチオン化リポプレックスに、生体膜と相互作用を示す化合物を組み合わせることで、細胞内への遺伝子導入を促進することも試みられている。このような生体膜と相互作用を示す化合物として、たとえばＨＶＪ（センダイウィルス）の膜エンベロープや、インフルエンザウィルスのＨＡタンパク質等が提案されている。
また一方、核内での遺伝子発現を促進する薬理作用を示す因子として、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が知られている。しかしながらリポフレックスの構造は、ＤＮＡで構成される層と脂質で構成される層とが交互に積重なったサンドイッチ状の緻密な層状構造体で、全体として球に近い形態をとることが最近明らかにされている。このようなリポプレックスは、内部に薬物を封入しうるリポソームとは異なって、構造上薬物を封入することは困難である。このためヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が遺伝子発現を促進する薬理作用を示す因子であるとしても、これをリポプレックスに封入することは極めて困難であり、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を遺伝子と同時に細胞内に導入することは困難であった。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４８９７３５５号
【特許文献２】米国特許第５３３４７６１号
【特許文献３】特開平２−２９２２４６号公報
【特許文献４】特開平４−１０８３９１号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このため本発明は、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体などの細胞内で薬理作用を示す生理活性物質の細胞へのトランスフェクションを、安全にかつ効率良く行うことができる導入システムを達成できるベクターとして有効な薬物担体、またたとえば腎ガン、肺ガン、肝ガン、膵ガンなどの癌、リンパ腫、肺炎、肝炎、腎炎、血管内皮損傷部位などの病巣部位を確実にターゲッティングし、該部位に、治療および／または診察するための薬物を安全にかつ効率良く送達するＤＤＳ療法の運搬体として有効な薬物担体、さらにはそのような薬物担体と薬物との複合製剤の開発が強く望まれている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく検討する過程で、生体膜と相互作用を示す化合物として、サクシニル化ポリグリシドール（以下、ＳｕｃＰＧと称することもある。）について検討し、ＳｕｃＰＧがｐＨ感受性の膜融合能をもち、弱酸性下で膜融合能を発現することを見出した。つまりＳｕｃＰＧをリポプレックスの膜成分として含ませることにより、ＳｕｃＰＧの細胞膜あるいはエンドソーム膜との融合により、リポプレックスに捕捉されていた遺伝子は効率よく細胞質内に移行することができる。このＳｕｃＰＧを膜成分とすることにより、細胞内への遺伝子導入を促進することが確認できた。なおサクシニル化ポリグリシドールには核内での遺伝子発現を促進する薬理作用はない。このような結果に基づき検討を続けたところ、上記ＳｕｃＰＧを膜成分として含む担体であれば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を内包することができ、これと、リポフレックスとは複合体としての薬物担体を形成し、遺伝子導入促進作用と、細胞内での遺伝子発現促進作用との複作用を発現することができ、すなわち上記課題を解決することができることを見出した。
【０００９】
上記のような課題は、下記（１）〜（１１）の本発明により解決することができる。
（１）本発明は、膜で形成される閉鎖空間内に薬物を内包する構造体であり、前記膜の構成成分として少なくとも下記（ａ）〜（ｃ）で示される単位を（ａ）：（ｂ）：（ｃ）＝４０〜９５モル％：０〜３０モル％：０〜３０モル％（ただし（ａ）〜（ｃ）各単位の合計を１００モル％とする）の量比で含むサクシニル化ポリグリシドールを含み、前記薬物として少なくともヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む薬物担体である。
【化２】
【００１０】
（２）上記（１）の薬物担体は、通常、上記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とともに診断および／または治療ための薬物をさらに内包する。
【００１１】
本発明の薬物担体は、脂質またはその誘導体、安定化剤、酸化防止剤および表面修飾剤などの他の成分をさらに含むことができる。特に膜構成材料として、上記ＳｕｃＰＧとともに脂質を含むことが好ましい。脂質は、リン脂質であってもリン脂質以外の脂質であってもよく、それらの誘導体であってもよい。
（３）具体的には、上記（１）または（２）において、上記膜の少なくとも一部が、ＳｕｃＰＧで修飾された脂質からなる薬物担体は好ましい態様である。
このような本発明の薬物担体の好ましい態様例としては、少なくとも一部がＳｕｃＰＧで修飾された脂質からなる膜から形成される閉鎖空間内にヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む第１の薬物担体と、診断および／または治療ための薬物を内包する第２の薬物担体との複合体が挙げられる。
【００１２】
（４）担体の粒径は、０．０２〜２５０μｍ程度である上記（１）ないし（３）のいずれかの薬物担体。
【００１３】
（５）上記（１）ないし（４）のいずれかの薬物担体において、担体は、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソームおよびエマルジョンからなる群より選ばれる少なくとも１種の形態から構成されることが望ましい。
【００１４】
（６）上記（２）ないし（５）のいずれかの薬物担体において、診断および／または治療ための薬物として、細胞内で薬理作用を発現する生理活性物質を含む態様が好ましい。具体的には、該薬物として、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む薬物担体は、本発明の特に好ましい態様である。
【００１５】
（７）また上記診断および／または治療ための薬物として、グリコサミノグリカンおよびその誘導体、オリゴ糖、多糖およびそれらの誘導体、タンパク質およびペプチドから選ばれる少なくとも１種の生理活性物質を含むこともできる。
【００１６】
（８）上記（２）ないし（５）のいずれかの薬物担体において、診断および／または治療ための薬物として薬理的活性物質を含む態様も好ましい。このような薬物としては、抗炎症剤、ステロイド剤、抗癌剤、酵素剤、酵素阻害剤、抗生物質、抗酸化剤、脂質取り組み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウィルス剤、抗凝固剤、血管拡張剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、ＮＯＳ阻害剤、ＡＧＥｓ阻害剤およびラジカルスカベンジャーからなる群より選ばれる少なくとも１種を挙げることができる。
【００１７】
（９）上記（２）ないし（５）のいずれかの薬物担体において、上記診断および／または治療ための薬物として体内診断薬を挙げることもできる。体内診断薬としては、Ｘ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬および核磁気共鳴診断用診断薬などが挙げられる。
【００１８】
（１０）本発明は、少なくとも上記（１）で規定されるサクシニル化ポリグリシドールを含む膜で形成される担体（ｉ） の閉鎖空間内に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を内包させた第１の薬物担体と、脂質膜で形成される担体（ｉｉ）の閉鎖空間内に、診断および／または治療のための薬物を内包させた第２の薬物担体とを、それぞれ調製し、上記第１の薬物担体と、第２の薬物担体とを複合化する上記（２）ないし（９）のいずれかの薬物担体の製造方法を提供する。
【００１９】
（１１）上記（１０）の薬物担体の製造方法において、上記第２の薬物担体中に内包させる薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の生理活性物質である態様例は好ましい。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の薬物担体は、膜で形成される閉鎖空間内に薬物を内包する構造体であり、このような構造体の構成成分として、以下に示すサクシニル化ポリグリシドール（ＳｕｃＰＧ）と、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とを少なくとも含む。具体的には、ＳｕｃＰＧを膜成分として含み、担体に内包される薬物としてヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む。
本発明における膜構成成分のＳｕｃＰＧは、具体的に、下記で示されるサクシニル変性ポリグリシドール単位（ａ）を必須成分として含み、好ましくは該単位（ａ）とともに長鎖アルキル基含有単位（ｂ）を含む。さらにはこれら（ａ）および（ｂ）とともに未変性ポリグリシドール単位（ｃ）を含んでいてもよい。
【化３】
【００２１】
ＳｕｃＰＧは、上記（ａ）〜（ｃ）各単位の合計を１００モル％とするとき、具体的に、サクシニル変性ポリグリシドール単位（ａ）を４０〜９５モル％、好ましくは７０〜９０モル％の量で含む。長鎖アルキル基含有単位（ｂ）を０〜３０モル％、好ましくは５〜３０モル％、より好ましくは５〜１５モル％の量で含むことが望ましい。また未変性ポリグリシドール単位（ｃ）の含有量は、通常０〜３０モル％であり、好ましくは０〜１０モル％である。
ＳｕｃＰＧは、このような構成により、ｐＨ感受性の膜融合能を発現することができる。
【００２２】
ＳｕｃＰＧは、上記構成とすることができれば、ＳｕｃＰＧの製法は特に限定されないが、たとえばポリグリシドールのサクシニル化変性、さらには該サクシニル残基の部分アルキル化によって得られる。
上記ポリグリシドールは、たとえばコーエン，Ｈ．Ｌ． ：Ｊ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ．， Ｐｏｌｙｍ． Ｃｈｅｍ． Ｅｄ． １３，１９９３−２００３（１９７５） の方法に準拠してポリエピクロロヒドリンの転化により合成することができる。これにより得られるポリグリシドールの分子量は、高速液体クロマトグラフィー（Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−５１０ カラム）により、ポリエチレングリコール換算分子量で、通常７６００にピークをもつ分子量として測定される。
【００２３】
ポリグリシドールのサクシニル化、さらにサクシニル残基の部分アルキル化は、たとえばＢｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９４；１１９３：１−９に記載された方法により調製することができる。具体的には、カルボキシル（サクシニル）変性ポリグリシドールは、ポリグリシドールと無水コハク酸とを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中、６０℃で３時間反応させることにより得ることができ、カルボキシル変性量は、無水コハク酸の使用量を変化させることにより調製することができる。
導入したサクシニル残基は、ｐＨメーター（堀場製作所社製Ｍ−８）を使用して、電位差滴定により決定することができる。
カルボキシル変性ポリグリシドールは、そのカルボキシル基の一部と、ｎ−デシルアミンなどの上記（ｂ）中のＲに対応するアルキルアミンとの結合により、長鎖アルキル基をもたせることができる。
【００２４】
上記で使用するポリエピクロロヒドリンおよびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドは、使用前に、蒸留精製することが望ましい。
上記Ｊ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ．およびＢｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａの各記載は、これを引用することにより本明細書中にも記載されているものとするが、本発明におけるＳｕｃＰＧの製造方法は、これら方法に限定されるものではない。
【００２５】
薬物担体としては様々な形態が考えられ、特に制限されないが、特にその内部に薬物を高濃度封入することのできる潜在的機能を有する、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソームおよびエマルジョンのうちより選ばれる少なくとも一種以上からなることが望ましい。
【００２６】
本発明の薬物担体は、上記の形態を形成できるものであれば、ＳｕｃＰＧおよびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含むこと以外に特にその構成成分は制限されないが、たとえば膜構成成分として、脂質またはその誘導体、安定化剤、酸化防止剤および表面修飾剤などの他の成分をさらに含むことができる。
特に膜構成材料として、上記ＳｕｃＰＧとともに脂質を含むことが好ましい。脂質は、リン脂質であってもリン脂質以外の脂質であってもよく、それらの誘導体であってもよい。
【００２７】
リン脂質としては、フォスファチジルコリン（＝レシチン）、フォスファジルグリセロール、フォスファチジン酸、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリビン等の天然あるいは合成のリン脂質、またはこれらの常法にしたがって水素添加したもの等を挙げることができる。
【００２８】
本発明の薬物担体の膜材料として、このような脂質を含む場合、すなわちＳｕｃＰＧリポソームでは、たとえば卵黄フォスファチジルコリン（ＥＹＰＣ）を膜材料とするリポソームの外側に、ＳｕｃＰＧがその長鎖アルキル基含有単位（ｂ）のアルキル基をアンカーとして覆う構造が考えられ、さらにＳｕｃＰＧが内水相側も覆う構造も考えられる。
【００２９】
安定化剤としては、膜流動性を低下させるコレステロールなどのステロール、あるいはグリセロール、シュクロースなどの糖類が挙げられる。
酸化防止剤としては、トコフェロール同族体すなわちビタミンＥなどが挙げられる。コトフェロールには、α、β、γ、δの４個の異性体が存在するが本発明においてはいずれも使用できる。
表面修飾剤としては、ＳｕｃＰＧ以外の親水性高分子、グルクロン酸、シアル酸、デキストランなどの水溶性多糖類の誘導体が挙げられる。
【００３０】
上記他の親水性高分子としては、ポリエチレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、合成ポリアミノ酸、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどが挙げられる。これらの中でも、ポリエチレングリコールは血中滞留性を向上させる効果が顕著である。
【００３１】
また上記親水性高分子は、長鎖脂肪族アルコール、ステロール、ポリオキシプロピレンアルキルまたはグリセリン脂肪酸エステル等の疎水性化合物を結合させた誘導体として用いることができ、これら疎水性化合物部位を、薬物担体（たとえばリポシーム）の膜中へ安定に挿入することができる。そのことにより、薬物担体表面に親水性高分子を存在させることができる。親水性高分子誘導体として、ポリエチレングリコール−ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等を好ましく使用することができる。
【００３２】
本発明の薬物担体中に内包させるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としては、たとえば酪酸、ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ、Ｃａイオンなどが挙げられる。
【００３３】
本発明の薬物担体は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に加え、通常、診断および／または治療のための薬物を内包する。この薬物としては、診断および／または治療の目的に応じて薬学的に許容し得る薬理的活性物質、生理的活性物質または診断用物質である。
【００３４】
治療のための薬剤の種類としては、薬物担体の形成を損ねない限り特に限定されないが、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体、グリコサミノグリカンおよびその誘導体、オリゴ糖、多糖およびそれらの誘導体、タンパク質およびペプチドなどの生理活性的物質；抗炎症剤、ステロイド剤、抗癌剤、酵素剤、抗生物質、抗酸化剤、脂質取り組み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウィルス剤、抗凝固剤、血管拡張剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、ＮＯＳ阻害剤、ＡＧＥｓ阻害剤およびラジカルスカベンジャーの薬理的活性物質が挙げられる。
【００３５】
また診断の薬剤としては、薬物担体の形成を損ねないかぎり特に限定されないが、たとえばＸ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬などの体内診断薬挙げられる。
【００３６】
本発明では、これらのうちでも細胞内で生理的活性を発現する生理活性的物質が好ましく、なかでも核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体、とりわけ遺伝子を内包することが好ましい。
【００３７】
このような薬物担体の好ましい実施態様例としては、具体的に、少なくとも一部がＳｕｃＰＧで修飾された脂質からなる膜から形成される閉鎖空間内にヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む第１の薬物担体（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ修飾リポソーム）と、診断および／または治療ための薬物を内包する第２の薬物担体（薬物封入リポソーム）との複合体が挙げられる。
本発明の薬物担体は、粒径が０．０２〜２５０μｍ、とりわけ０．０５〜０．４μｍの大きさが好ましい。特に第１の薬物担体（ＳｕｃＰＧ修飾リポソーム）単独での大きさは、通常粒径５０ｎｍ程度であり、一般的なリポソームよりもかなり小さい。このため、第２の薬物担体（たとえば後述のリポプレックス）が第１の薬物担体よりも大きな粒径を有していることが多く、この場合には大径のリポプレックス球体の外周表面に第１の薬物担体が担持されているような複合構造が考えられる。
【００３８】
本発明では、膜の少なくとも一部が、ＳｕｃＰＧで修飾された脂質からなる薬物担体は好ましい態様であるが、特に上記第１の薬物担体の膜がＳｕｃＰＧで修飾される脂質からなることが好ましい。ここでのＳｕｃＰＧで修飾される脂質としては、リン脂質を好ましく挙げることができる。
また第２の薬物担体は、好ましくは遺伝子を内包するリポプレックスであり、この場合の第２の薬物担体の膜は、たとえばＤＣ−ｃｈｏｌなどのカチオン化コレステロールからなる。すなわち本発明の薬物担体の好ましい態様例として、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ・リポプレックス複合体が好ましく例示される。この場合、ＳｕｃＰＧリポソーム（第１の薬物担体）の有するマイナスチャージと、リポプレックスとが双方の構造を保ったまま穏やかにチャージで結合するような比で複合体が形成されることが望ましい。
【００３９】
通常生体のｐＨは７以上であるが、細胞内のライソゾーム内では酸性条件になるため、ＳｕｃＰＧリポソームは膜融合性を示す。その作用機序は、次のように説明される。ＳｕｃＰＧリポソームがエンドサイト−シスで細胞に取り込まれた場合、ライソゾーム内で細胞内消化が始まり、プロトンポンプの作用でｐＨが低下する。そのときＳｕｃＰＧリポソームは、膜融合性を発揮してライソゾーム膜と融合し、その結果内包する物質が細胞質内へ放出される。
したがって上記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ・リポプレックス複合体において、ＳｕｃＰＧのｐＨ感受性の膜融合能により、ＳｕｃＰＧリポソームに内包されるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とリポプレックスを構成するＤＮＡとは、同時に細胞内に導入される。
【００４０】
上記のような第１の薬物担体と、第２の薬物担体との複合体としての薬物担体は、たとえば上記ＳｕｃＰＧで修飾された脂質からなる膜で形成される担体（ｉ） の閉鎖空間内に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を内包させた第１の薬物担体と、脂質膜で形成される担体（ｉｉ）の閉鎖空間内に、診断および／または治療のための薬物を内包させた第２の薬物担体とを、それぞれ調製し、次いで、第１の薬物担体と、第２の薬物担体とを複合化することにより容易に得ることができる。
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ複合体としての薬物担体の一例をより具体的に以下に示す。
【００４１】
まず、フラスコ内に、リン脂質等の担体膜構成材料を、クロロホルム等の有機溶媒により混合し、有機溶媒を留去後真空乾燥することによりフラスコ内壁に薄膜を形成させる。次にＳｕｃＰＧのメタノール溶液を加え、有機溶媒を留去後、真空乾燥させることによりフラスコ内壁に脂質−ＳｕｃＰＧ混合薄膜を形成させる。当該フラスコ内に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤水溶液を加え、激しく攪拌することにより、ＳｕｃＰＧ修飾リポソームを形成する。次いでこれをゲルろ過することにより、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ修飾リポソーム（第１の薬物担体）を得ることができる。
また第１の薬物担体は、上記方法以外にも上記の各構成成分を混合し、高圧吐出型入乳化機により高圧吐出させる方法によっても得ることができる。
【００４２】
次に、別のフラスコ内に、カオチン化脂質およびリン脂質等の他の担体構成成分を、クロロホルム等の有機溶媒により混合し、有機溶媒を留去後真空乾燥することによりフラスコ内壁に脂質の薄膜を形成させる。当該フラスコ内に、薬物溶液を加え、激しく攪拌することにより、リポソーム分散液を得る。得られたリポソーム分散液を遠心分離し、上清をデカンテーションし、封入されなかった薬物を除去することにより、薬物封入リポソーム（第２の薬物担体）を薬物担体の分散液として得ることができる。
また第２の薬物担体は、上記方法以外にも、上記各構成成分を混合し、高圧吐出型入乳化機により高圧吐出させることにより得ることもできる。
【００４３】
このようにして得られた、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ修飾リポソーム（第１の薬物担体）と薬物封入リポソーム（第２の薬物担体）とを複合化することにより、薬物担体、すなわちヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ複合体を形成することができる。
【００４４】
【実施例】
次に実施例および試験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例および試験例に限定されるものではない。
（実施例１）
下記１）〜３）の工程により、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体としての薬物担体を調製した。
１）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ修飾リポソーム（第１の薬物担体）の調製
卵黄フォスファチジルコリン（ＥＹＰＣ）（１０ｍｇ／ｍｌ）のクロロホルム溶液７００μｌをナス型フラスコに装入し、クロロホルムをロータリーエバポレーターで減圧留去してＥＹＰＣの薄膜を形成させた。
【００４５】
これにＳｕｃＰＧ（サクシニル変性ポリグリシドール単位（ａ）：８０モル％、長鎖アルキル基含有単位（Ｒ＝Ｃ１０）（ｂ）：１２モル％、未変性ポリグリシドール単位単位（ｃ）：８モル％で含むサクシニル化ポリグリシードル）のメタノール溶液（３ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、再び溶媒を減圧留去し、脂質−ＳｕｃＰＧ混合薄膜を形成させた。
これを約２時間真空乾燥した後、２ｍｌの、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤溶液としてＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ （２．２ｍＭ）または酪酸（１５０ｍＭ）を加え、バス型超音波照射装置を用いて３０秒間超音波照射して脂質−ＳｕｃＰＧ混合膜を分散させた。この分散液のｐＨを７に調整した後、凍結−融解を３回行って、ＳｕｃＰＧ修飾リポソームを形成した。さらに、エクストルーダーを用いて孔径５０ｎｍのポリカーボネート膜を通して、リポソームの粒径を揃えた。
【００４６】
そしてＳｕｃＰＧ修飾リポソーム分散液のｐＨを６に調製し、４℃においてサクシニル変性ポリグシリドール単位（ａ）に対して０．３当量のＥＤＣ（１−エチル−３− （３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を加えて２時間反応させた後、トランスフェリン水溶液（トランスフェリン３μｇを水５０μｌに溶解させ、５００ｍＭクエン酸（ＩＩＩ ）溶液５μｌを加えたもの）を加え、４℃で一晩反応させた。
その後、ＳｕｃＰＧ修飾リポソームの分散液のｐＨを７．４に調製し、セファロース４Ｂカラムを用いて遊離トランスフェリンを除去し、さらに、この分散液をろ過滅菌した。
【００４７】
２）リポプレックス（第２の薬物担体）の調製
２−１）カオチン性リポソームの調製
リポプレックス調製のためのカオチン化脂質としてＤＣ−ｃｈｏｌを用いた。
ＤＣ−ｃｈｏｌ（１６５μｇ）および中性脂質ＤＯＰＥ（ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン）（３００μｇ）をクロロホルム（０．３２ｍｌ）に溶解させ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去して混合脂質の薄膜を形成させた。そして、これにＰＢＳ（２．５ｍｌ）を加え、バス型超音波照射装置で２分間分散させてカオチン性リポソームを得た。
【００４８】
２−２）リポプレックス（第２の薬物担体）の調製
プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液（５０μｌ）に溶解させた溶液を、カチオン化脂質とＤＮＡの電化（＋／−）比が６になるように量を調製したカオチン性リポソーム分解液と混合し、氷冷下で１０分間インキュベーションすることによってリポプレックス（第２の薬物担体）を調製した。
【００４９】
３）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ・リポプレックス複合体の調製
上記２−２）で得られたリポプレックス分散液に、種々の量のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ修飾リポソーム分散液（ＥＹＰＣ濃度：０．２ｍＭ）を加え、氷冷下で１０分間インキュベーションして、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ・リポプレックス複合体を得た。
【００５０】
（試験例１）
上記で得られたヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ・リポプレックス複合体を用いて遺伝子導入試験を行った。
＜細胞の調製とトランスフェクション＞
ＨｅＬａ細胞を２４穴ディッシュに１穴当たり５万個撒き、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ変法イーグル倍地（ＤＭＥＭ）１ｍｌを加えて、３７℃で一晩培養した。その後ＰＢＳで２回洗浄した後１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ１ｍｌを加えた後、１穴当たり０．５μｇのプラスミドＤＮＡを含むヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ複合体またはリポプレックスを加え、１２時間インキュベーションした。その後、再びＰＢＳで２回洗浄し、１０％ＦＢＳ含有ＭＤＥＭ１ｍｌを加えて１２時間培養した。
【００５１】
＜ルシフェラーゼアッセイによる遺伝子導入の評価＞
遺伝子導入の細胞をＰＢＳ（＋）で２回洗浄し、さらにＰＢＳ（−）で１回洗浄した後、１穴当たり５０μｌの溶解剤を加えて細胞を溶解させた。得られた細胞溶解液を遠心チューブに回収し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離して不溶成分を除去した。細胞溶解液１０μｌを用いて、タンパク質の定量を行った。タンパク質の定量はｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた。また、細胞溶解液２０μｌを用いて、ルシフェラーゼ活性を評価した。結果を表１に示す。
【００５２】
【００５３】
【発明の効果】
上述した通り、本発明により新規な高効率遺伝子導入ベクターが供給される。本発明の、ＳｕｃＰＧとヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を構成成分とする薬物担体は、試験例に示されように、従来の薬物担体に比べ遺伝子の細胞での導入効率がきわめて高いことが明らかとなった。
このような特徴から、薬学的に許容し得る薬理的活性物質、生理的活性物質または診断用物質を封入させた本発明の薬物担体は、治療および診断という目的に対して非常に効果的である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful as a drug delivery system (DDS) for securely targeting a lesion site and safely and efficiently delivering a drug into cells at a target lesion site, and particularly practical for cytoplasmic transfer / expression of a gene. The present invention relates to a drug carrier and a method for preparing the same.
[0002]
[Prior art]
In the administration of drugs for treatment and / or diagnosis of drugs, DNAs (genes), peptides or proteins, etc., in order to maximize the efficacy, cancer, lymphoma, pneumonia, hepatitis, nephritis, vascular endothelial damage site, etc. Accurate control of drug delivery is desired to reliably target lesion sites and deliver drugs safely and efficiently. In recent years, studies have been actively conducted to apply closed vesicles such as liposomes, emulsions, and lipid microspheres as carriers (carriers) in such drug delivery systems (DDS).
[0003]
Particularly, in order to effectively use physiologically active substances such as proteins, DNAs (genes), and antisense molecules that express activities in cells, it is necessary to introduce them into the cytoplasm. A carrier (vector) for delivering the drug to the cytoplasm is required to prevent the permeation of substances and macromolecules. In a gene delivery system, a virus vector is used to introduce a gene into cells by infection. However, it is desired to use a safe non-viral (synthetic) vector instead of a dangerous viral vector.
[0004]
The use of the above liposome as a synthetic vector has been specifically studied. For example, a lipid DNA complex (hereinafter, referred to as a liposome lipid membrane component cationized) in order to complement a gene and incorporate it into cells at a high transduction rate. , Lipoplexes) are known (for example, see Patent Documents 1 to 4). In addition, products of cationic lipids such as DC-chol: 3-β- (N- (N ′, N′-dimethylaminoethane) carbamoyl) cholesterol can also be obtained. However, the rate of gene transfer into cells by lipoplexes by conventional development techniques such as the above-mentioned cationized lipoplexes is not sufficient, and it is therefore difficult to express genes at a practically applicable level. Therefore, development of a safe and high-functional synthetic vector capable of efficiently transfecting a gene with a high gene transfer rate and a high expression rate into cells has been desired.
[0005]
Thus, attempts have been made to promote gene transfer into cells by combining the cationized lipoplex with a compound that interacts with a biological membrane. As a compound that interacts with such a biological membrane, for example, a membrane envelope of HVJ (Sendai virus) and an HA protein of influenza virus have been proposed.
On the other hand, a histone deacetylase inhibitor is known as a factor exhibiting a pharmacological action for promoting gene expression in the nucleus. However, it has recently become clear that the structure of lipoflex is a sandwich-like dense layered structure in which layers composed of DNA and layers composed of lipids are alternately stacked, and the overall shape is close to a sphere. Have been. Such lipoplexes, unlike liposomes that can encapsulate a drug inside, are difficult to encapsulate a drug in structure. For this reason, even if a histone deacetylase inhibitor is a factor exhibiting a pharmacological action that promotes gene expression, it is extremely difficult to encapsulate it in a lipoplex. It was difficult to introduce it into cells.
[0006]
[Patent Document 1] US Pat. No. 4,897,355
[Patent Document 2] US Patent No. 5,334,761
[Patent Document 3] JP-A-2-292246
[Patent Document 4] Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-108391
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, the present invention can achieve an introduction system that can safely and efficiently transfect a cell with a physiologically active substance having a pharmacological action in a cell, such as a nucleic acid, a polynucleotide, a gene, and an analog thereof. A drug carrier effective as a vector, for example, renal cancer, lung cancer, liver cancer, cancer such as pancreatic cancer, lymphoma, pneumonia, hepatitis, nephritis, vascular endothelial lesion site and the like, and reliably target the site, There is a strong demand for the development of a drug carrier effective as a carrier of DDS therapy for safely and efficiently delivering a drug for treatment and / or examination, and a composite preparation of such a drug carrier and a drug.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
In the course of studying to solve the above problems, the present inventors studied succinylated polyglycidol (hereinafter sometimes referred to as SucPG) as a compound that interacts with a biological membrane, and SucPG is pH-sensitive. It was found that it has membrane fusion ability and expresses membrane fusion ability under weak acidity. In other words, by including SucPG as a membrane component of the lipoplex, the gene captured by the lipoplex can be efficiently transferred into the cytoplasm by fusing SucPG with the cell membrane or endosomal membrane. It was confirmed that the use of SucPG as a membrane component promoted gene transfer into cells. Succinylated polyglycidol has no pharmacological action to promote gene expression in the nucleus. As a result of continued study based on these results, a carrier containing the above SucPG as a membrane component can include a histone deacetylase inhibitor, and this and lipoflex are a drug as a complex. It has been found that a carrier can be formed to exhibit a dual effect of a gene transfer promoting action and a gene expression promoting action in a cell, that is, the above-mentioned problem can be solved.
[0009]
The above problems can be solved by the following (1) to (11) of the present invention.
(1) The present invention is a structure including a drug in an enclosed space formed by a membrane, and at least a unit represented by the following (a) to (c) as a component of the membrane: (a) :( b): Succinyl containing (c) = 40 to 95 mol%: 0 to 30 mol%: 0 to 30 mol% (however, the total of (a) to (c) units is 100 mol%) And a drug carrier comprising at least a histone deacetylase inhibitor as the drug.
Embedded image
(2) The drug carrier of (1) usually further contains a drug for diagnosis and / or treatment together with the histone deacetylase inhibitor.
[0011]
The drug carrier of the present invention may further include other components such as a lipid or a derivative thereof, a stabilizer, an antioxidant, and a surface modifier. In particular, it is preferable to contain a lipid together with the above SucPG as a membrane constituent material. The lipid may be a phospholipid or a lipid other than a phospholipid, or a derivative thereof.
(3) Specifically, in the above (1) or (2), a drug carrier in which at least a part of the membrane is made of a lipid modified with SucPG is a preferred embodiment.
A preferred embodiment of such a drug carrier of the present invention is a first drug carrier comprising a histone deacetylase inhibitor in an enclosed space formed at least in part of a membrane made of a lipid modified with SucPG. And a second drug carrier containing a drug for diagnosis and / or treatment.
[0012]
(4) The drug carrier according to any one of the above (1) to (3), wherein the particle size of the carrier is about 0.02 to 250 μm.
[0013]
(5) In the drug carrier according to any one of the above (1) to (4), the carrier is at least one selected from the group consisting of macromolecules, microaggregates, microparticles, microspheres, nanospheres, liposomes, and emulsions. It is desirable to be comprised from the form of.
[0014]
(6) It is preferable that the drug carrier according to any one of the above (2) to (5) contains, as a drug for diagnosis and / or treatment, a physiologically active substance exhibiting a pharmacological action in cells. Specifically, a drug carrier containing, as the drug, at least one selected from the group consisting of nucleic acids, polynucleotides, genes and analogs thereof is a particularly preferred embodiment of the present invention.
[0015]
(7) The drug for diagnosis and / or treatment may also contain at least one physiologically active substance selected from glycosaminoglycans and derivatives thereof, oligosaccharides, polysaccharides and derivatives thereof, proteins and peptides. .
[0016]
(8) In the drug carrier according to any one of the above (2) to (5), a mode containing a pharmacologically active substance as a drug for diagnosis and / or treatment is also preferable. Such drugs include anti-inflammatory agents, steroid agents, anti-cancer agents, enzyme agents, enzyme inhibitors, antibiotics, antioxidants, lipid work inhibitors, hormonal agents, angiotensin converting enzyme inhibitors, angiotensin receptor antagonists, Smooth muscle cell proliferation / migration inhibitor, platelet aggregation inhibitor, chemical mediator release inhibitor, vascular endothelial cell growth or inhibitor, aldose reductase inhibitor, mesangial cell growth inhibitor, lipoxygenase inhibitor, immunosuppressant At least one selected from the group consisting of immunostimulants, antiviral agents, anticoagulants, vasodilators, Maillard reaction inhibitors, amyloidosis inhibitors, NOS inhibitors, AGEs inhibitors and radical scavengers. .
[0017]
(9) In the drug carrier according to any one of the above (2) to (5), the drug for diagnosis and / or treatment may include an in-vivo diagnostic drug. Examples of the in-vivo diagnostic agent include an X-ray contrast agent, a radioisotope-labeled nuclear medicine diagnostic agent, and a diagnostic agent for nuclear magnetic resonance diagnosis.
[0018]
(10) The present invention relates to a carrier (i) formed of a membrane containing at least succinylated polyglycidol as defined in (1) above, wherein a first histone deacetylase inhibitor is encapsulated in a closed space. And a second drug carrier containing a drug for diagnosis and / or treatment in a closed space of the carrier (ii) formed of a lipid membrane, respectively, and A method for producing a drug carrier according to any one of the above (2) to (9), wherein the drug carrier is complexed with a second drug carrier.
[0019]
(11) In the method for producing a drug carrier according to the above (10), the drug encapsulated in the second drug carrier is at least one kind of physiological activity selected from the group consisting of nucleic acids, polynucleotides, genes and analogs thereof. Embodiments that are substances are preferred.
[0020]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The drug carrier of the present invention is a structure that encloses a drug in a closed space formed by a membrane. The components of such a structure include succinylated polyglycidol (SucPG) shown below and histone deacetyl At least an enzyme inhibitor. Specifically, it contains SucPG as a membrane component, and contains a histone deacetylase inhibitor as a drug included in the carrier.
The SucPG of the membrane component in the present invention specifically contains a succinyl-modified polyglycidol unit (a) shown below as an essential component, and preferably contains a long-chain alkyl group-containing unit (b) together with the unit (a). Including. Further, it may contain an unmodified polyglycidol unit (c) together with (a) and (b).
Embedded image
SucPG is, when the total of the above units (a) to (c) is 100 mol%, specifically, 40 to 95 mol%, preferably 70 to 90 mol% of the succinyl-modified polyglycidol unit (a). Include in quantity. It is desirable to include the long-chain alkyl group-containing unit (b) in an amount of 0 to 30 mol%, preferably 5 to 30 mol%, more preferably 5 to 15 mol%. The content of the unmodified polyglycidol unit (c) is usually 0 to 30 mol%, preferably 0 to 10 mol%.
With such a configuration, SucPG can express pH-sensitive membrane fusion ability.
[0022]
SucPG can be obtained by, for example, a method for producing SucPG, as long as it can have the above-mentioned structure, by, for example, modifying succinylation of polyglycidol and further partially alkylating the succinyl residue.
The polyglycidol is described, for example, in Cohen, H .; L. : J. Polym. Sci. , Polym. Chem. Ed. 13, 1993-2003 (1975) by conversion of polyepichlorohydrin. The molecular weight of the polyglycidol thus obtained is measured by high performance liquid chromatography (Asahipak GS-510 column) as a molecular weight in terms of polyethylene glycol, usually having a peak at 7600.
[0023]
Succinylation of polyglycidol and further partial alkylation of succinyl residues can be prepared, for example, by the method described in Biochim Biophys Acta 1994; 1193: 1-9. Specifically, the carboxyl (succinyl) -modified polyglycidol can be obtained by reacting polyglycidol and succinic anhydride in N, N-dimethylformamide at 60 ° C. for 3 hours. It can be prepared by changing the amount of succinic anhydride used.
The introduced succinyl residue can be determined by potentiometric titration using a pH meter (M-8, manufactured by Horiba, Ltd.).
The carboxyl-modified polyglycidol can have a long-chain alkyl group by bonding a part of the carboxyl group to an alkylamine corresponding to R in the above (b) such as n-decylamine.
[0024]
The polyepichlorohydrin and N, N-dimethylformamide used above are desirably purified by distillation before use.
The above J. Polym. Sci. The description of Biochim Biophys Acta and that of Biochim Biophys Acta are also described herein by reference thereto, but the method for producing SucPG in the present invention is not limited to these methods.
[0025]
The drug carrier may take various forms, and is not particularly limited, but in particular, macromolecules, microaggregates, microparticles, microspheres, nanospheres having a potential function of encapsulating a drug in a high concentration therein. , Liposomes and emulsions.
[0026]
The drug carrier of the present invention is not particularly limited in its constituent components except that it contains SucPG and a histone deacetylase inhibitor, as long as it can form the above-mentioned form. Other components such as derivatives, stabilizers, antioxidants and surface modifiers can be further included.
In particular, it is preferable to contain a lipid together with the above SucPG as a membrane constituent material. The lipid may be a phospholipid or a lipid other than a phospholipid, or a derivative thereof.
[0027]
Examples of the phospholipid include phosphatidylcholine (= lecithin), phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, sphingomyelin, cardioribine and the like. Examples thereof include natural or synthetic phospholipids, and those obtained by hydrogenation according to a conventional method.
[0028]
When such a lipid is contained as the membrane material of the drug carrier of the present invention, that is, in the case of SucPG liposomes, for example, outside the liposome using yolk phosphatidylcholine (EYPC) as a membrane material, SucPG contains its long-chain alkyl group. A structure in which the alkyl group of the unit (b) is covered as an anchor is conceivable, and a structure in which SucPG also covers the inner aqueous phase side is also conceivable.
[0029]
Stabilizers include sterols such as cholesterol that reduce membrane fluidity, or saccharides such as glycerol and sucrose.
Antioxidants include tocopherol homologs, such as vitamin E. Cotopherol has four isomers of α, β, γ, and δ, and any of them can be used in the present invention.
Examples of the surface modifier include hydrophilic polymers other than SucPG, and derivatives of water-soluble polysaccharides such as glucuronic acid, sialic acid, and dextran.
[0030]
As the other hydrophilic polymer, polyethylene glycol, dextran, pullulan, ficoll, polyvinyl alcohol, styrene-maleic anhydride alternating copolymer, divinyl ether-maleic anhydride alternating copolymer, synthetic polyamino acid, amylose, amylopectin , Chitosan, mannan, cyclodextrin, pectin, carrageenan and the like. Among these, polyethylene glycol has a remarkable effect of improving blood retention.
[0031]
Further, the hydrophilic polymer can be used as a derivative in which a hydrophobic compound such as a long-chain aliphatic alcohol, sterol, polyoxypropylene alkyl, or glycerin fatty acid ester is bonded. For example, it can be stably inserted into the membrane of liposea). This allows the hydrophilic polymer to be present on the drug carrier surface. As the hydrophilic polymer derivative, polyethylene glycol-distearoylphosphatidylethanolamine or the like can be preferably used.
[0032]
Examples of the histone deacetylase inhibitor encapsulated in the drug carrier of the present invention include butyric acid, Trichostatin A, Ca ions and the like.
[0033]
The drug carrier of the present invention usually contains a drug for diagnosis and / or treatment in addition to the histone deacetylase inhibitor. The drug is a pharmaceutically acceptable pharmacologically active substance, physiologically active substance or diagnostic substance depending on the purpose of diagnosis and / or treatment.
[0034]
The type of drug for treatment is not particularly limited as long as the formation of the drug carrier is not impaired, but nucleic acids, polynucleotides, genes and analogs thereof, glycosaminoglycans and derivatives thereof, oligosaccharides, polysaccharides and derivatives thereof , Bioactive substances such as proteins and peptides; anti-inflammatory drugs, steroid drugs, anti-cancer drugs, enzyme drugs, antibiotics, antioxidants, lipid-binding inhibitors, hormonal drugs, angiotensin-converting enzyme inhibitors, angiotensin receptor antagonists, Smooth muscle cell proliferation / migration inhibitor, platelet aggregation inhibitor, chemical mediator release inhibitor, vascular endothelial cell growth or inhibitor, aldose reductase inhibitor, mesangial cell growth inhibitor, lipoxygenase inhibitor, immunosuppressant , Immunostimulants, antivirals, anticoagulants, vasodilators, Maillard応抑 suppressant, amyloidosis inhibitors, NOS inhibitors include pharmacologically active substances AGEs inhibitor and radical scavengers.
[0035]
The diagnostic agent is not particularly limited as long as the formation of the drug carrier is not impaired, and examples thereof include in-vivo diagnostic agents such as X-ray contrast agents, radioisotope-labeled nuclear medicine diagnostic agents, and diagnostic agents for nuclear magnetic resonance diagnosis.
[0036]
In the present invention, among these, a bioactive substance that expresses a physiological activity in a cell is preferable, and among them, it is preferable to include a nucleic acid, a polynucleotide, a gene and its analogs, especially a gene.
[0037]
As a preferred embodiment of such a drug carrier, specifically, a first carrier containing a histone deacetylase inhibitor in an enclosed space formed at least in part by a membrane made of a lipid modified with SucPG. A complex of a drug carrier (a SucPG-modified liposome encapsulated with a histone deacetylase inhibitor) and a second drug carrier (a drug-encapsulated liposome) containing a drug for diagnosis and / or treatment may be used.
The drug carrier of the present invention preferably has a particle size of 0.02 to 250 μm, particularly 0.05 to 0.4 μm. In particular, the size of the first drug carrier (SucPG-modified liposome) alone usually has a particle size of about 50 nm, which is considerably smaller than a general liposome. For this reason, the second drug carrier (for example, a lipoplex described later) often has a larger particle size than the first drug carrier, and in this case, the second drug carrier is attached to the outer peripheral surface of the large-diameter lipoplex sphere. A composite structure in which one drug carrier is supported can be considered.
[0038]
In the present invention, a drug carrier in which at least a part of the membrane is composed of a lipid modified with SucPG is a preferred embodiment, and it is particularly preferable that the membrane of the first drug carrier is composed of a lipid modified with SucPG. As the lipid modified by SucPG here, phospholipid can be preferably exemplified.
The second drug carrier is preferably a lipoplex containing a gene. In this case, the membrane of the second drug carrier is made of, for example, cationized cholesterol such as DC-chol. That is, as a preferred embodiment of the drug carrier of the present invention, a SucPG-lipoplex complex containing a histone deacetylase inhibitor is preferably exemplified. In this case, it is desirable that a complex is formed in such a ratio that the minus charge of the SucPG liposome (first drug carrier) and the lipoplex are gently charged together while maintaining both structures.
[0039]
Normally, the pH of a living body is 7 or more, but in a lysosome in a cell, acidic conditions are present, so that SucPG liposomes exhibit fusogenicity. The mechanism of action is explained as follows. When SucPG liposomes are taken up into cells by endocytosis, intracellular digestion starts in lysosomes, and the pH is reduced by the action of a proton pump. At that time, the SucPG liposome exerts fusogenicity and fuses with the lysosomal membrane, and as a result, the contained substance is released into the cytoplasm.
Therefore, in the Histone deacetylase inhibitor-encapsulated SucPG-lipoplex complex, the DNA constituting the lipoplex with the histone deacetylase inhibitor encapsulated in the SucPG liposome is due to the pH-sensitive membrane fusion ability of SucPG. At the same time.
[0040]
The drug carrier as a complex of the first drug carrier and the second drug carrier as described above is, for example, in the closed space of the carrier (i) formed of a membrane made of a lipid modified with SucPG. A first drug carrier containing a histone deacetylase inhibitor and a second drug containing a drug for diagnosis and / or treatment in a closed space of a carrier (ii) formed of a lipid membrane. Can be easily obtained by preparing each of the following drug carriers and then complexing the first drug carrier and the second drug carrier.
An example of a drug carrier as a SucPG complex encapsulating a histone deacetylase inhibitor is shown below more specifically.
[0041]
First, a carrier membrane constituent material such as a phospholipid is mixed in an organic solvent such as chloroform in a flask, and the organic solvent is distilled off, followed by vacuum drying to form a thin film on the inner wall of the flask. Next, a methanol solution of SucPG is added, and the organic solvent is distilled off, followed by vacuum drying to form a lipid-SucPG mixed thin film on the inner wall of the flask. A SucPG-modified liposome is formed in the flask by adding a histone deacetylase inhibitor aqueous solution and stirring vigorously. Then, this is subjected to gel filtration to obtain a SucPG-modified liposome (first drug carrier) encapsulating a histone deacetylase inhibitor.
Further, the first drug carrier can be obtained by a method other than the above method, in which the above-mentioned respective components are mixed, and the mixture is discharged at a high pressure by a high-pressure discharge type emulsifier.
[0042]
Next, in a separate flask, other carrier components such as a cationized lipid and a phospholipid are mixed with an organic solvent such as chloroform, and the organic solvent is distilled off. Is formed. A drug solution is added to the flask and stirred vigorously to obtain a liposome dispersion. The obtained liposome dispersion is centrifuged, the supernatant is decanted, and the unencapsulated drug is removed, whereby the drug-encapsulated liposome (second drug carrier) can be obtained as a drug carrier dispersion. .
In addition to the above-mentioned method, the second drug carrier can also be obtained by mixing the above components and discharging the mixture by a high-pressure discharge emulsifier.
[0043]
By complexing the SucPG-modified liposome (first drug carrier) and the drug-encapsulated liposome (second drug carrier) obtained as described above, the drug carrier, that is, histone A SacPG complex encapsulating the deacetylase inhibitor can be formed.
[0044]
【Example】
Next, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Test Examples, but the present invention is not limited to these Examples and Test Examples.
(Example 1)
According to the following steps 1) to 3), a drug carrier as a SucPG-modified liposome-lipoplex complex containing a histone deacetylase inhibitor was prepared.
1) Preparation of SucPG-modified liposome (first drug carrier) encapsulating histone deacetylase inhibitor
700 μl of a chloroform solution of egg yolk phosphatidylcholine (EYPC) (10 mg / ml) was charged into an eggplant-shaped flask, and chloroform was distilled off under reduced pressure using a rotary evaporator to form a thin film of EYPC.
[0045]
To this, SucPG (succinyl-modified polyglycidol unit (a): 80 mol%, long-chain alkyl group-containing unit (R = C10) (b): 12 mol%, unmodified polyglycidol unit (c): 8 mol% Then, 1 ml of a methanol solution (3 mg / ml) of the succinylated polyglycidol) was added, and the solvent was again distilled off under reduced pressure to form a lipid-SucPG mixed thin film.
After vacuum drying for about 2 hours, 2 ml of Trichostatin A (2.2 mM) or butyric acid (150 mM) as a histone deacetylase inhibitor solution was added, and ultrasonic irradiation was performed for 30 seconds using a bath-type ultrasonic irradiation apparatus. Then, the lipid-SucPG mixed membrane was dispersed. After adjusting the pH of this dispersion to 7, freeze-thaw was performed three times to form SucPG-modified liposomes. Furthermore, the particle size of the liposome was adjusted through a polycarbonate membrane having a pore size of 50 nm using an extruder.
[0046]
Then, the pH of the SucPG-modified liposome dispersion was adjusted to 6, and at 4 ° C., 0.3 equivalent of EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) was added to succinyl-modified polyglycidol unit (a). After an additional reaction for 2 hours, an aqueous transferrin solution (3 μg of transferrin dissolved in 50 μl of water and 5 μl of a 500 mM citric acid (III) solution added) was added, and the reaction was allowed to proceed at 4 ° C. overnight.
Thereafter, the pH of the dispersion of the SucPG-modified liposome was adjusted to 7.4, free transferrin was removed using a Sepharose 4B column, and the dispersion was sterilized by filtration.
[0047]
2) Preparation of lipoplex (second drug carrier)
2-1) Preparation of chaotic liposome
DC-chol was used as a lipoplex-prepared lipid.
DC-chol (165 μg) and neutral lipid DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine) (300 μg) were dissolved in chloroform (0.32 ml), and the solvent was distilled off using a rotary evaporator to form a thin film of the mixed lipid. Was formed. Then, PBS (2.5 ml) was added thereto, and the mixture was dispersed with a bath-type ultrasonic irradiation device for 2 minutes to obtain a chaotic liposome.
[0048]
2-2) Preparation of lipoplex (second drug carrier)
A solution of plasmid DNA (1 μg) dissolved in a 20 mM Tris-HCl buffer (50 μl) was used to prepare a solution of a liposome in the form of a chaotic liposome prepared such that the electrification (+/−) ratio of cationized lipid to DNA was 6. And incubated for 10 minutes under ice-cooling to prepare a lipoplex (second drug carrier).
[0049]
3) Preparation of SucPG-lipoplex complex containing histone deacetylase inhibitor
Various amounts of the SucPG-modified liposome dispersion (EYPC concentration: 0.2 mM) containing the histone deacetylase inhibitor were added to the lipoplex dispersion obtained in 2-2), and the mixture was incubated under ice-cooling for 10 minutes. Thus, a SucPG-lipoplex complex containing a histone deacetylase inhibitor was obtained.
[0050]
(Test Example 1)
A gene transfer test was performed using the SucPG-lipoplex complex containing the histone deacetylase inhibitor obtained above.
<Cell preparation and transfection>
HeLa cells were seeded in a 24-well dish at 50,000 cells per well, and 1 ml of Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing 10% FBS was added thereto, followed by culturing at 37 ° C. overnight. After washing twice with PBS, 1 ml of DMEM containing 10% FBS was added, and then a SucPG complex or a lipoplex containing a histone deacetylase inhibitor containing 0.5 μg of plasmid DNA per well was added, followed by incubation for 12 hours. . Thereafter, the plate was washed twice with PBS again, and 1 ml of MDEM containing 10% FBS was added thereto, followed by culturing for 12 hours.
[0051]
<Evaluation of gene transfer by luciferase assay>
The transfected cells were washed twice with PBS (+) and once with PBS (-), and then lysed by adding 50 μl of a lysis agent per well. The obtained cell lysate was collected in a centrifuge tube, and centrifuged at 12,000 rpm for 2 minutes to remove insoluble components. Protein quantification was performed using 10 μl of cell lysate. The protein was quantified using coomassie Protein Assay Reagent (Pierce). In addition, luciferase activity was evaluated using 20 μl of the cell lysate. Table 1 shows the results.
[0052]
【The invention's effect】
As described above, the present invention provides a novel high-efficiency gene transfer vector. The drug carrier of the present invention comprising SucPG and a histone deacetylase inhibitor as components of the present invention, as shown in the test examples, has a significantly higher gene transfer efficiency in cells than conventional drug carriers. became.
Due to such characteristics, the drug carrier of the present invention in which a pharmaceutically acceptable pharmacologically active substance, physiologically active substance or diagnostic substance is encapsulated is very effective for therapeutic and diagnostic purposes. .