JP2004309186A

JP2004309186A - Amelioration agent of endoplasmic reticulum stress and its evaluation method

Info

Publication number: JP2004309186A
Application number: JP2003099692A
Authority: JP
Inventors: Toshio Miyata; 敏男宮田; Kiyoshi Kurokawa; 清黒川
Original assignee: Tokai University
Current assignee: Tokai University
Priority date: 2003-04-02
Filing date: 2003-04-02
Publication date: 2004-11-04

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an evaluation method of an endoplasmic reticulum stress amerioration action, and a screening method based on the evaluation method. <P>SOLUTION: This evaluation method of the endoplasmic reticulum amerioration stress action includes a process for measuring a generation level of the endoplasmic reticulum stress in an SHR/NDmc-cp rat. A compound usable for treatment and/or prevention relative to a disease caused by production of the endoplasmic reticulum stress can be screened by selecting a test material for suppressing the generation level of the endoplasmic reticulum stress by utilizing the evaluation method. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、小胞体ストレス改善剤の評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
全ての真核生物の細胞内には複雑な網目状の膜構造体である小胞体が存在している。小胞体は、分泌タンパク質や膜タンパク質、脂質の合成やカルシウムイオンの貯留などの機能を担っている。小胞体内腔には、７８ｋＤａｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＲＰ７８）、９４ｋＤａｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＲＰ９４）、１５０ｋＤａｏｘｙｇｅｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＲＰ１５０）などの分子シャペロンと呼ばれる一連のタンパク質が局在する。分子シャペロンは分泌性のタンパク質や膜タンパク質の小胞体内での折り畳みに関与している。分泌性タンパク質や膜タンパク質は、ここで糖鎖付加、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合などの修飾を受けると同時に、正しい立体構造をとるよう折り畳まれる。
【０００３】
小胞体で正しく折り畳まれたタンパク質は、次の目的地であるゴルジ体へと運ばれる。しかし、折り畳みに失敗したタンパク質は正しい立体構造をとれるまで小胞体に留められる。これは、工場における欠陥商品を市場に出さない仕組みと似ており、「小胞体におけるタンパク質の品質管理」と呼ばれ、細胞が正常な機能を保つために極めて重要な機能と考えられている。このように小胞体にはタンパク質の折り畳みを行うという重要な役割があり、それを手助けするために多数の分子シャペロンおよびフォールディング（折り畳み）酵素が連携して働いているということが明らかになっている。
【０００４】
細胞が外界から種々のストレス（グルコース飢餓、ウイルス感染、小胞体内腔のカルシウム濃度の低下、重金属摂取、低酸素状態など）を受けると、小胞体でのタンパク質の折り畳みに不具合を生じ、高次構造の異常なタンパク質が小胞体に蓄積する。この状態を小胞体ストレスという。この状態は細胞、さらには生体にとって非常に有害である。細胞はこの状態から抜け出すため、小胞体シャペロンやフォールディング酵素の転写レベルで誘導して小胞体内の折り畳み容量を高めたり（ｕｎｆｏｌｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅ；ＵＰＲ）、タンパク質合成を抑制して小胞体の負荷を軽減したり、構造異常タンパク質を分解するといった応答を示し、小胞体への異常タンパク質の蓄積を解消しようとする。しかし、これらが破綻すると、細胞はアポトーシスにより死を迎える（非特許文献１）。
【０００５】
小胞体ストレスと疾患との関係で明らかとなっているものは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などに代表される神経変性疾患、インスリン依存性糖尿病（若年性糖尿病）、炎症性腸疾患などが挙げられる。これらの疾患では、多くの場合、細胞内にタンパク質が凝集体を形成している。
【０００６】
このように、小胞体ストレスは、異常構造タンパク質の蓄積、凝集が関与している。異常構造タンパク質の蓄積や凝集に起因する疾患の治療薬の開発や異常タンパク質の挙動の解明には、病態モデル動物が有用である。モデル動物は、異常構造タンパク質の蓄積、凝集の挙動の解明や、異常構造タンパク質の蓄積や凝集に起因する治療薬の開発において有用である。現在までにいくつかのモデル動物が公知である。
【０００７】
小胞体ストレスのモデル動物として２型糖尿病の「秋田マウス」が知られている（非特許文献２）。しかし、「秋田マウス」は性差があり、発症率が低いという欠点がある。
【０００８】
本発明者らは、オルメサルタンをはじめとするビフェニルテトラゾール基を含有する化合物がＡＧＥｓと呼ばれる糖化最終産物の生成を抑制し、ＡＧＥｓの蓄積に由来する疾患の予防／治療に有用であることを明らかにし、当該化合物が持つラジカル消去作用がＡＧＥｓの生成抑制に関与していることを明らかにした（特許文献１）。オルメサルタンをはじめとするビフェニルテトラゾール基含有化合物の多くは、アンジオテンシンＩＩタイプ１受容体拮抗作用を持つ抗高血圧剤として知られており、その血圧降下作用による腎への血流量軽減効果から、糖尿病性腎症の改善などの腎保護剤としても期待されている。
【０００９】
ＡＧＥｓが関与する疾患として、たとえば次のような疾患が報告されている。
１）糖尿病合併症である腎症（Ｈｏｒｉｅ，Ｋ．ｅｔａｌ．；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００（１２），２９９５−３００４，１９９７）、神経障害（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔａｌ．；Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，４０（１２），１３８０−１３８７，１９９７）、網膜症（Ｌｕ，Ｍ．ｅｔａｌ．；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０１（６），１２１９−１２２４）、および白内障、
２）動脈硬化（Ｐａｒｋ，Ｌ．ｅｔａｌ．；Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，４（９），１０２５−１０３１，１９９８）、
３）透析合併症である透析アミロイドーシス（Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔａｌ．；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９２，１２４３−１２５２，１９９３）、および腹膜透析患者における腹膜硬化症、
４）中枢神経疾患であるアルツハイマー病（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ａ．ｅｔａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１（１２），５７１０−５７１４，１９９４）、ピック病およびパーキンソン病、
５）リウマチ性関節炎（Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４４，４５−４９，１９９９）、
６）日光弾性線維症、
７）老化、
８）腎不全（Ｍａｋｉｔａ，Ｚ．ｅｔａｌ．；Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２５，８３６−８４２，１９９１）等
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ０２／０８３１２７
【非特許文献１】Ｍｏｒｉ，Ｋ．：Ｃｅｌｌ，１０１，４５１−４５４，２０００
【非特許文献２】Ｗａｎｇ，Ｊ．ｅｔａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０３，２７−３７，１９９９
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、小胞体ストレス改善作用の評価方法の提供である。より具体的には、たとえば生体中において、小胞体ストレスの生成を抑制する作用を有し、更に腎機能の保護作用をも評価することができる方法の提供を課題とする。また本発明は、当該評価方法に基づく、小胞体ストレスの産生に起因する疾患に対する治療および／または予防に使用し得る化合物のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、先に述べたように、オルメサルタンをはじめとするビフェニルテトラゾール基を含有する化合物がＡＧＥｓの生成を抑制し、腎疾患などのＡＧＥｓの蓄積に由来する疾患の予防／治療に有用であることを明らかにした。そして、さらに、当該抗高血圧剤の腎保護効果の機序をさらに追求する過程で、特定の自然発症高血圧ラットによる実験系を用いることにより、腎障害の発症は、血圧とは関係なく、生体内ＡＧＥｓの産生の程度に左右されること、ＡＧＥｓの産生を抑制する化合物は、腎疾患治療薬となり得ることを見出した。
【００１３】
本発明者らは、自然発症高血圧ラットとして、ＳＨＲラット及びＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットを用いた。ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットは、肥満・高脂血症・高血圧・高血糖・高インスリン血症を呈し、ＳＨＲラット及び正常血圧ラットに比べ、強い蛋白尿と腎障害を示す。しかしながら、血圧はＳＨＲラットの方が高い。このことは、腎障害の発症が血圧以外によるものであることを示している。更に、ＳＨＲラットと正常血圧ラットの腎ＡＧＥｓ含量はほぼ等しいにもかかわらず、ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットは、極めて高いＡＧＥｓ含量を示した。
これらのことより、生体内のＡＧＥｓ含量が腎障害の有力な指標となり得ることが明らかとなった。そしてＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットにおけるＡＧＥｓの産生に対する被験物質の抑制効果を指標として、ＡＧＥｓの産生に起因する疾患に対する治療または予防に使用し得る化合物のスクリーニングが可能であることを見出した。
【００１４】
そして、ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットの小胞体ストレスについて検討したところ、腎上皮細胞に抗小胞体ストレスタンパク質であるＯＲＰ１５０やＧＲＰ７８が著明に発現していることを見出した。一方、単に高血圧のみを発症するＳＨＲラットや陰性対照のＷＫＹラットでは抗小胞体ストレスタンパク質はまったく認められなかった。このことは小胞体ストレスが蛋白尿、腎機能低下に深く関与していることを示している。小胞体ストレスの腎への影響については今までまったく知られていなかった。
【００１５】
さらに、腎保護作用が確認されている化合物をＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットに投与したところ、これらの抗小胞体ストレスタンパク質は消失した。
【００１６】
すなわち本発明は、以下の小胞体ストレス改善作用の評価方法、およびこの評価方法を利用した小胞体ストレスの産生に起因する疾患に対する治療および／または予防に使用し得る化合物のスクリーニング方法に関する。
〔１〕次の工程を含む、小胞体ストレス改善剤の評価方法。
（１）２型糖尿病様症状を呈する前、および／または後のＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットに被験物質を投与する工程、
（２）ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットにおける小胞体ストレスの生成レベルを測定する工程、および
（３）被験物質が小胞体ストレスの生成レベルを抑制する作用を有するとき、当該被験物質が小胞体ストレス改善作用を有すると評価する工程
〔２〕次の工程を含む、小胞体ストレスの産生に起因する疾患に対する治療および／または予防に使用し得る化合物のスクリーニング方法。
（ａ）〔１〕に記載の方法によって被験物質の小胞体ストレス改善作用を評価する工程、および
（ｂ）対照と比較して小胞体ストレス改善作用が大きい被験物質を選択する工程
〔３〕小胞体ストレスの産生に起因する疾患が腎疾患である〔２〕記載の方法。
〔４〕〔２〕に記載の方法により選択することができる化合物を有効成分とする、小胞体ストレスの産生に起因する疾患に対する治療および／または予防用薬剤組成物。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、次の工程を含む、小胞体ストレス改善剤の評価方法に関する。
（１）２型糖尿病様症状を呈する前、および／または後のＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットに被験物質を投与する工程、
（２）ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットにおける小胞体ストレスの生成レベルを測定する工程、および
（３）被験物質が小胞体ストレスの生成レベルを抑制する作用を有するとき、当該被験物質が小胞体ストレス改善作用を有すると評価する工程
【００１８】
本発明に用いるＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットは、肥満、および本態性高血圧症のモデル動物として広く利用されている実験動物である。日本では「ＳＨＲ等疾患モデル共同研究会」（京都）で維持されており、日本エスエルシー株式会社（静岡）を通じて入手することができる。更に、高炭水化物飼料を継続して与えることにより、ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットは、２型糖尿病様症状を呈する。ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットにおける２型糖尿病様症状は、高インスリン血症、高脂血症、耐糖機能の低下、タンパク尿、および糖尿等の症状となって現れる。
【００１９】
本発明の評価方法において、（１）被験物質は２型糖尿病様症状を呈する前、および／または後のＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットに投与される。被験物質の投与経路は制限されない。たとえば、経口的に、あるいは非経口的に、被験物質を投与することができる。ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットが２型糖尿病様症状を呈していることは、高インスリン血症、高脂血症、耐糖機能の低下、タンパク尿、および糖尿などの症状を観察することによって知ることができる。
【００２０】
たとえば、高インスリン血症、高脂血症、耐糖機能の低下、タンパク尿、および糖尿のいずれかの症状を指標として観察し、その症状が見られたときに２型糖尿病症状を呈していることがわかる。尿タンパクあるいは尿糖の検査は、試料の採取が容易である。またいずれの指標も市販の測定用試薬、あるいは尿試験紙を使って簡単に測定することができることから、２型糖尿病症状の好ましい指標である。これらの指標の測定方法は公知である。
【００２１】
本発明において、被験物質は、ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットが２型糖尿病様症状を呈する前、および／または後に投与することができる。２型糖尿病様症状を呈する前に投与する場合には、被験物質の予防的な作用を評価することができる。一方、発症後の投与によって、治療効果を評価することができる。
【００２２】
本発明の評価方法は、（２）ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットにおける小胞体ストレスの生成レベルを測定する工程を含む。ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットにおける小胞体ストレスの生成レベルを測定する方法は任意である。たとえば、ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットの生体試料を採取し、小胞体ストレスの生成レベルを測定することができる。生体試料としては、血液や尿、あるいは任意の組織を用いることができる。
【００２３】
小胞体ストレスのレベルを測定するためのマーカーは公知である。一般に、小胞体ストレスは、抗小胞体ストレスタンパク質をマーカーとして検出することにより知ることができる。たとえば抗小胞体ストレスタンパク質として分子量１５０ｋＤａのＯＲＰであるＯＲＰ１５０や、分子量７８ｋＤａのＧＲＰであるＧＲＰ７８を挙げることができる。
【００２４】
細胞は低酸素状態に曝されるとＯｘｙｇｅｎＲｅｇｕｌａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎｓ（ＯＲＰｓ）と総称される一連のストレスタンパク質が誘導される（Ｈｅａｃｏｃｋ，Ｃ．Ｓ．ｅｔａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．，１２，１２８７−１２９０，１９８６）。また、グルコース飢餓条件ではＧｌｕｃｏｓｅＲｅｇｕｌａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎｓ（ＧＲＰｓ）と呼ばれるストレスタンパク質が発現する（Ｌｅｅ，Ａ．Ｓ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４，２６７−２７３，１９９２）。これらのストレスタンパク質は、小胞体ストレスに起因するアポトーシスを抑制する因子として働いていることが知られている。したがって、小胞体ストレス状態下ではこれらのストレスタンパク質の発現が多くなっている。ゆえに、ストレスタンパク質を観察することにより、小胞体ストレスの程度を知ることができる。ＯＲＰ１５０やＧＲＰ７８に対する抗体は公知であり、組織免疫染色などの常法により検出可能である。
【００２５】
ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットは、小胞体ストレスが亢進している。このような特徴を有する疾患モデル動物は、小胞体ストレスに起因する疾患のモデル動物として有用である。
【００２６】
ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットは、小胞体ストレスを呈する。小胞体ストレス状態をもたらした原因には関わらず、小胞体ストレスとなった動物は小胞体ストレス状態のモデルとして有用である。具体的には、小胞体ストレスによって生体にもたらされる様々な障害を観察することができる。また小胞体ストレスによる障害を緩和するための治療方法も、モデル動物を用いて研究することができる。
【００２７】
本発明のＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットは、短期間で高頻度に小胞体ストレス状態を再現できることから、小胞体ストレスの発生機序、小胞体ストレスの予防または治療についての研究に貢献する。具体的には、本発明のモデル動物によって、小胞体ストレス発生機構の解明や、小胞体ストレスに起因する疾患の治療薬開発のための大規模な薬剤スクリーニングを実現することができる。
【００２８】
本発明のＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットを利用して、小胞体ストレスに対する被験物質の治療効果を評価することができる。本発明による評価方法は、次の工程を含む、小胞体ストレスの抑制効果を評価する方法に関する。
（１）２型糖尿病様症状を呈する前、および／または後のＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットに被験物質を投与する工程、
（２）被験物質を投与したＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットの小胞体ストレスの生成レベルを緩和する作用を検出する工程
【００２９】
また本発明のＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットを利用して、小胞体ストレスに起因する疾患のための治療用化合物のスクリーニングを実施することができる。本発明のスクリーニング方法は、前記評価方法によって被験物質の小胞体ストレスに起因する疾患を修復する活性を測定し、被験物質を投与しない対照と比較して、前記活性が大きい化合物を選択することによって実施することができる。
【００３０】
本発明の評価方法、あるいはスクリーニング方法において、小胞体ストレスの回復の程度は、ストレスタンパク質を指標として評価することができる。たとえば次のようなストレスタンパク質が知られている。これらのストレスタンパク質を測定するための方法も公知である。
ＯＲＰ１５０
ＧＲＰ７８
ＧＲＰ９５
ＧＲＰ１７０
【００３１】
また本発明の評価方法、あるいはスクリーニング方法において、小胞体ストレスに起因する疾患の治療効果の程度は、各疾患に対応する各種マーカーを指標として評価することができる。より具体的には、糖尿病の場合は、血糖値や尿糖のレベルなどを指標として、糖尿病に対する治療効果を知ることができる。小胞体ストレスに起因する疾患としては、糖尿病のほか、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病（ハンチントン舞踏病、Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ病）などの神経変性疾患が挙げられる。
【００３２】
一方、人口の高齢化とともに、神経変性疾患の増加が大きな社会問題となっている。このような疾患は、成人における発症、慢性進行性経緯、明瞭な臨床表現型、ニューロンのサブセットに関与する特異的細胞異常、および最終的に致命的な結果を特徴とするものとして定義されている。神経変性疾患の例として、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病などが挙げられる。このような神経変性疾患では完全な治癒を期待することはできず、治療は専ら疾患の管理に限定せざるを得ない。病態の解明と治療薬の開発には疾患モデル動物が必須である。
【００３３】
本発明のＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットは、腎上皮細胞で小胞体ストレスが生じ、小胞体ストレスから腎障害を呈する。そして、この小胞体ストレスは腎保護作用を有する化合物の投与により消失する。腎上皮細胞はタンパク尿や腎機能低下に極めて重要な役割を果たしていることが指摘されており、研究、創薬上の重要なターゲットとなっている。しかしながら、これまでは、抗体や薬剤（ピューロマイシン）投与による腎上皮細胞障害モデルしか知られていなかった。ゆえに、本発明の疾患モデル動物は、腎疾患治療薬の開発に極めて有用である。
【００３４】
本発明の評価方法においては、小胞体ストレスの生成レベルが低いほど、被験物質の小胞体ストレスの生成を抑制する作用は大きいと言うことができる。したがって、一定の小胞体ストレスの生成抑制作用を有することが確認されている比較化合物を対照として用いることによって、その比較化合物が有している生成抑制作用を比較化合物のそれと比較することもできる。
【００３５】
本発明の評価方法は、スクリーニングに利用することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、小胞体ストレスの産生に起因する疾患に対する治療および／または予防に使用し得る化合物のスクリーニング方法に関する。
（ａ）前記評価方法によって被験物質の小胞体ストレス改善作用を評価する工程、および
（ｂ）対照と比較して小胞体ストレス改善作用が大きい被験物質を選択する工程
【００３６】
生体内において生成された小胞体ストレスが、さまざまな疾患の原因となっている可能性があることは既に述べたとおりである。したがって小胞体ストレス生成の抑制作用を指標として選択された化合物は、小胞体ストレスによってもたらされる種々の疾患の治療薬として有用である。
【００３７】
小胞体ストレスの生成を抑制することが、小胞体ストレスによってもたらされる疾患の治療に有用であることは既に明らかにされている。しかし、ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットのように、実際に生体内に小胞体ストレスを蓄積するモデル動物をツールとして利用することにより、より実際の疾患に近い状態で被験物質を評価することができる。たとえばＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットは、アルブミン尿あるいは糖尿などの、２型糖尿病様の症状を呈する。つまりＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットを用いることによって、実際の糖尿病患者の体内で起きている病的な状態に対する治療効果あるいは予防効果を評価することができる。
【００３８】
本発明のスクリーニングに用いる被験物質としては、例えば、天然または合成化合物、各種有機化合物、天然または合成された糖類、蛋白質、ペプチド、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、あるいは菌体成分などを挙げることができる。この他、テトラゾール基を有する化合物群を被験物質として用いることもできる。テトラゾール基を有する化合物または薬理学的に許容されるそれらの塩が蛋白質修飾生成抑制組成物として有用であることを本発明者らは明らかにしている（ＷＯ０２／０８３１２７）。本発明の評価方法を利用すれば、これらの一群の化合物について、生体内での小胞体ストレス改善作用も評価することができる。その結果、より治療効果の高い化合物をスクリーニングすることができる
【００３９】
被験物質は、２型糖尿病様症状の発症前および／または発症後のＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットに投与することができる。しかし、糖尿病症状に起因する小胞体ストレスに対してより特異的に作用する化合物を見出すためには、糖尿病症状を呈した後に被験物質を投与するのが好ましい。被験物質の投与のタイミングを変えて、小胞体ストレス生成レベルに対する作用を比較することにより、より効果的な投与時期を明らかにすることもできる。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法によって選択された被験物質は、更に安全性や安定性などを試験したうえで、小胞体ストレスの産生に起因する疾患の治療および／または予防のための医薬組成物の有効成分とすることができる。本発明の医薬組成物は、公知の製剤学的製造法により製剤化して投与することができる。また有効成分である化合物自体を直接投与することもできる。製剤化する場合は、例えば、薬剤として一般的に用いられる媒体または担体と適宜組み合わせて投与することができる。
【００４１】
また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、鼻腔内投与、気管支内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、患部への直接投与などの方法で行うことができる。投与量は、患者の体重、年齢、健康度、あるいは投与方法などの条件によって変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することができる。
【００４２】
すなわち、たとえばＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットにおいて、２型糖尿病様症状に対する治療効果を、様々な投与量の間で比較することにより有効濃度が決定される。そして、上記のような各投与ルートによって、腎における投与化合物の濃度がその有効濃度に達するような投与量を経験的に決定する。一般的な投与形態においては、有効成分が全身に分布するものとして、体重１ｋｇ当たりの投与量を決定する。実験動物における薬物動態の解析結果に基づいて腎移行性が高いと考えられる化合物であれば、投与量をより低く設定することができる。
【００４３】
本発明の医薬組成物は、決定された投与量と投与形態とを考慮して、媒体や担体と配合される。必要な投与量を達成することができるように有効成分を配合することは、当業者が通常行っている。本発明による医薬組成物の投与量は、体重１ｋｇあたり通常１μｇ〜２０ｇ、より一般的には１０μｇ〜５００ｍｇとすることができる。また、注射剤の場合は経口投与の１０分の１〜１００分の１程度を投与量の目安とすることができる。さらに特殊な製剤設計を施すことにより、投与量を調整することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、適当な担体に保持することによって徐放化製剤とすることもできるが、このような製剤においては、高い血中濃度を維持することができるので、配合量を低く設定することができる。
以下本発明を実施例として更に具体的に説明するが、本発明は該実施例に限定されるものではない。
【００４４】
【実施例】
［実施例１］実験材料および実験方法
降圧薬
降圧薬として、オルメサルタン（三共）とヒドララジン（シグマ）の２種類を使用した。
動物
自然発症高血圧／ＮＩＨ−肥満ラットのサブラインである自然発症高血圧肥満ラット（ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ））（ＳＨＲ等疾患モデル共同研究会（京都）で維持）、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）とＷｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏラット（ＷＫＹ）は日本エスエルシー（静岡）から購入した。１３週齢のＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）を以下のように、無作為に４群に分けた。
賦形剤投与群（グループ１）：１０匹、
低用量オルメサルタン投与群（１ｍｇ／ｋｇ／日）（グループ２）：９匹、
高用量オルメサルタン投与群（５ｍｇ／ｋｇ／日）（グループ３）：１０匹、
ヒドララジン投与群（ｍｇ／ｋｇ／日）（グループ４）：９匹
また１３週齢のＳＨＲ（高血圧、非糖尿病）を次の３群に分けた。
賦形剤投与群（グループ５）：１０匹、
高用量オルメサルタン投与群（５ｍｇ／ｋｇ／日）（グループ６）：１０匹
対照の賦形剤投与ＷＫＹ群（グループ７）：１０匹
薬剤の投与期間は２０週間であった。プロトコールについては、東海大学医学部における実験動物の指針に従った。
【００４５】
血圧の測定、尿採取と採血
心臓収縮期の血圧を、試験開始時、２週間後そして４週間間隔でテイルカフ法により測定した。研究の終了時に、ラットの体重を測定し、２４時間の尿採取のために代謝ケージで飼育した。屠殺前に血液を採取した。
【００４６】
血液、尿の生化学的測定
血漿中のグルコース、総コレステロール、トリグリセライド、リン脂質、クレアチニンと尿素窒素（ＢＵＮ）の測定、及び尿中の蛋白、クレアチニンの濃度については自動分析機（ＳｙｎｃｈｒｏｎＣＸ−７、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＩｎｃ製）を用いて測定した。血漿中のインスリン濃度については、市販のキット（森永生化学研究所製）を用いて測定した。
【００４７】
形態的解析
腎組識の切片（３〜４μｍ）については、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色し、光学顕微鏡を用いて観察した。糸球体の硬化については、Ｕｅｈａｒａら（Ｕｅｈａｒａ，Ｙ．ｅｔａｌ．：Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ２４，７７０−７７８，１９９４）の方法により、半定量的に評価した。すなわち、それぞれの動物の５０個の糸球体を形態学的解析のために無作為に選んだ。糸球体硬化の程度は、総面積に対する糸球体障害部位の％で示し、次の５段階に分類した。
０；障害なし
１＋；１％−２５％
２＋；５％−５０％
３＋；５０％−７５％
４＋；７５％−１００％
動物の糸球体硬化については、糸球体の硬化の程度（０〜４＋）に、その程度を示す割合（％）を掛けたものを合計した。
【００４８】
免疫組織染色
ＡＧＥの構造体であるペントシジンと脂質の過酸化で生成する４−ヒドロキシノネナール−タンパク質付加物のような酸化的蛋白付加物については、エタノール：アセトンで固定した凍結切片を用いて解析した。アビジン／ビオチンキット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を使用してバックグラウンドの染色を減らした。第一抗体を添加する前に、内因性のペルオキシダーゼ活性を除くために、ＰＢＳに溶解した３％過酸化水素液中、室温で１５分間インキュベートした。
【００４９】
切片の免疫染色には、次のウサギ抗ペントシジン抗体、またはマウス抗−４−ヒドロキシノネナールモノクローナル抗体ＮＡ５９を用い、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）検出系を用いて実施した。免疫していないウサギＩｇＧを対照として使用した。
ウサギ抗ペントシジン抗体（Ｈｏｒｉｅ，Ｋ．ｅｔａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３６，３２７−３３２，１９９７）
マウス抗−４−ヒドロキシノネナールモノクローナル抗体ＮＡ５９（Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔａｌ．：ＦＥＢＳＬｅｔｔ，４４５，２０２−２０６，１９９９）（ＷｉｔｚｔｕｍＪＬ博士から提供を受けた）
【００５０】
ＡＧＥの測定
腎臓のペントシジン濃度を測定した。腎臓組織（１００ｍｇ）を細かく切り刻み、１０％のトリクロロ酢酸で洗浄し、減圧下で乾燥した後、窒素下、５００μｌの６ＮＨＣｌ中、１１０℃で１６時間加水分解した。ペントシジンの測定は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で、以前に記載した方法（Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３，２３５３−２３５８，１９９６）により行った。すなわち、ＰＢＳにより希釈した酸加水分解物２０ μｌをＨＰＬＣシステムに注入し、Ｃ１８逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて分離した。移動相を蛍光検出器（ＲＦ−１０Ａ、島津）を用いて、励起−吸収波長（３３５／３８５ｎｍ）で測定した。合成ペントシジンを、標準品として使用した。
【００５１】
ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＡＧＥ抑制作用
ヒドララジンのＡＧＥ生成抑制作用についてはｉｎｖｉｔｒｏで測定した。インフォームドコンセントの後、非糖尿病腎不全患者の透析前ヘパリン採血し得られた新鮮なプール血漿（９００μｌ）に８、２０あるいは５０ｍＭヒドララジン（ＤＭＳＯ溶液）１００μｌを添加し、インキュベートした。インキュベーションによるペントシジンの生成については、本発明者らの以前の方法（Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３，２３５３−２３５８，１９９６）により、ＨＰＬＣ法により測定した。
【００５２】
ＡＧＥ生成抑制の作用機序、すなわちジカルボニル（グリオキサールとメチルグリオキサール）の捕捉、ピリドキサール５’−リン酸塩の捕捉、糖由来のラジカルとヒドロキシラジカルの消去、遷移金属イオンに対するキレート作用）については、以前に報告した方法（Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔａｌ．：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，ｉｎｐｒｅｓｓ．）により検討した。
【００５３】
統計学的解析
全てのデータを平均±ＳＥで示した。他の３つのグループのＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）の賦形剤投与群とＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）の他の群との比較はＤｕｎｎｅｔｔ’ｓｔｅｓｔにより行った。ＳＨＲ群とオルメサルタン投与ＳＨＲ群との検定およびＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）群とＳＨＲ群との検定、そして、ＳＨＲ群とＷＫＹ群との検定はＳｔｕｄｅｎｔｓのｔ検定により実施した。組織学的解析については、Ｓｔｅｅｌ’ｓｔｅｓｔまたはＷｉｌｃｏｘｏｎ’ｓｔｅｓｔ．により検定した。すべての計算は、ＳＡＳｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用い実施した。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意であるとした。
【００５４】
［実施例２］体重、血中グルコース及び脂質濃度
投与終了時、ＳＨＲ（表１）とは対照的に、全てのＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）は肥満となり、高血糖で高インスリン血漿、高脂血症であった。２種類の降圧薬として、レニン−アンジオテンシン系に関与するオルメサルタン（Ｉ型アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（ＡＲＢ））と、レニン−アンジオテンシン系に関与しないと考えられるヒドララジンを使用した。高用量のオルメサルタン投与群では、賦形剤を投与した対照のＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）群と比較して総コレステロールとリン脂質の血漿レベルを低下させた（Ｐ＜０．０５）が、ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）群に降圧薬を投与した他の群おいて、グルコース、インスリン、総コレステロール、リン脂質、体重、血漿レベルに関して変化は認められなかった。
【００５５】
【表１】

データは平均±ＳＥで示した。
^ａＳＨＲ（賦形剤投与群）に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０１
^ｂＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）（オルメサルタン投与群，１ｍｇ／ｋｇ）に対するＴｕｋｅｙ’ｓｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０５
^ｃＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）（賦形剤投与群）に対するＴｕｋｅｙ’ｓｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０５
^ｄＷＫＹ（賦形剤投与群）に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０１
【００５６】
［実施例３］心臓収縮期の血圧
対照のＷＫＹラットと比較して、試験開始時において、全てのＳＨＲ（Ｐ＜０．０１）とＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）ラット（Ｐ＜０．０１）は高血圧で、前者は後者より血圧は高かった（Ｐ＜０．０１）。オルメサルタンとヒドララジンは、実験の期間中、有意に収縮期の血圧を低下させた（表２）。ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）において、降圧効果はオルメサルタンの濃度に依存していた。ヒドララジン投与群の収縮期の血圧は、低用量オルメサルタン投与群の血圧とほぼ同様であった。また、最後の４週間を除いて高用量オルメサルタン投与群の血圧とほぼ同様であった。高用量オルメサルタンの降圧作用は、ＳＨＲとＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）で同様の傾向であった。
【００５７】
【表２】

データは平均±ＳＥで示した。
^ａＳＨＲ（賦形剤投与群）に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０１
^ｂＷＫＹ（賦形剤投与群）に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０１
^ｃＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）（賦形剤投与群）に対するＴｕｋｅｙ’ｓｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０５
^ｄＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）（賦形剤投与群）に対するＴｕｋｅｙ’ｓｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０１
^ｅＳＨＲ（オルメサルタン投与群，５ｍｇ／ｋｇ）に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０１
^ｆＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）（オルメサルタン投与群，１ｍｇ／ｋｇ）に対するＴｕｋｅｙ’ｓｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０５
【００５８】
［実施例４］タンパク尿と腎機能
試験終了時には、ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）は高度の蛋白尿（表３）を示した。低用量のオルメサルタン、およびヒドララジン投与群では、尿中蛋白の排泄は賦形剤投与群に比較して低かったが、統計学的には有意ではなかった。それとは対照的に、高用量オルメサルタン投与群では蛋白尿の低下は、より著しく、統計学的に有意であった（Ｐ＜０．０１）。対照のＳＨＲ群においては、蛋白尿は穏やかであった。そして、それは高用量オルメサルタンの投与により有意に減少した（Ｐ＜０．０１）。ＷＫＹは蛋白尿を呈さず正常であった。腎機能は、全ての群において正常であった。
【００５９】
【表３】

データは平均±ＳＥで示した。
^ａＳＨＲ（賦形剤投与群）に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０５
^ｂＳＨＲ（賦形剤投与群）に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０１
^ｃＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）（賦形剤投与群）に対するＴｕｋｅｙ’ｓｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０１
^ｄＷＫＹ（賦形剤投与群）に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０１
【００６０】
［実施例５］腎臓の組織学
糸球体障害はＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）ラットにおいて認められた（表４）。投与期間終了時には、ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）において、賦形剤投与群では巣状糸球体硬化症は、著しく上昇した（Ｐ＜０．０１）（図１Ｃ）。そして、オルメサルタン低用量投与群およびヒドララジン投与群おいてより低値を示したが、統計学的に有意ではなかった。それとは対照的に、高用量のオルメサルタン投与群では有意に低かった（Ｐ＜０．０１）（図１Ｄ）。巣状糸球体硬化症は、ＳＨＲ群（図１Ａ）の少数の糸球体だけに存在しており、ＷＫＹ群（図１Ｂ）には認められなかった。
【００６１】
【表４】

データは平均±ＳＥで示した。
^ａＳＨＲ（賦形剤投与群）に対するＷｉｌｃｏｘｏｎ’ｓｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０１
^ｂＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）（賦形剤投与群）に対するＴｕｋｅｙ’ｓｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０１
^ｃＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）（ヒドララジン投与群，５ｍｇ／ｋｇ）に対するＳｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０５
^ｄＷＫＹ（賦形剤投与群）に対するＷｉｌｃｏｘｏｎ’ｓｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０１
【００６２】
［実施例６］酸化的蛋白修飾とＡＧＥに対する免疫組織染色
酸化的蛋白修飾物で、脂質の過酸化の過程で生成する４−ヒドロキシノネナール−タンパク付加物は、ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）の賦形剤投与群で蓄積が認められたが（図２Ａ）、高用量オルメサルタン投与群においては検出されなかった（図２Ｂ）。低用量のオルメサルタンまたはヒドララジンの投与により、４−ヒドロキシノネナール−タンパク付加物の生成抑制作用は認められなかった。対照のＷＫＹあるいはＳＨＲラットでは、４−ヒドロキシノネナール−タンパク付加物は認められなかった。ペントシジンは、ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）賦形剤投与群の尿細管で検出された（図２Ｃ）。またペントシジンは全ての群の糸球体で認められなかった。さらにペントシジンはＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）賦形剤投与群（図２Ｄ）の動脈壁で検出され、高用量オルメサルタンの投与により生成が抑制された（図２Ｅ）。ＷＫＹまたはＳＨＲラットの動脈壁では検出されなかった。
【００６３】
［実施例７］腎臓のペントシジン濃度
免疫組織染色では、検出限界以上のＡＧＥによるタンパク修飾を検出可能であるが、感度が低く、正確な定量は困難である。そこで、腎臓中のペントシジン濃度をＨＰＬＣにより化学的に測定した（表５）。腎臓のペントシジン（ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白）は、賦形剤投与したＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）群では、ＳＨＲ群およびＷＫＹ群よりも高値を示した（Ｐ＜０．０１）。腎臓のペントシジンはＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）の賦形剤投与群と比較して、オルメサルタン、ヒドララジン投与群において減少した。高用量のオルメサルタン投与群（Ｐ＜０．０１）およびヒドララジン投与群（Ｐ＜０．０５）では統計学的に有意であった。
ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）ラットでは、腎臓のペントシジン濃度は、尿中蛋白と有意な相関が認められた（ｙ＝０．２２ｘ＋３４．１１、ｎ＝３８、ｒ２＝０．４６２、Ｐ＜０．００１）（図３Ａ）。収縮期の血圧と尿中蛋白との相関はｙ＝１．２８ｘ＋２０．７７、ｎ＝３８、ｒ２＝０．１２６、Ｐ＜０．０５（図３Ｂ）、収縮期の血圧と腎臓のペントシジン濃度の相関はｙ＝０．５１ｘ＋６．２５、ｎ＝３８、ｒ２＝０．１７３、Ｐ＜０．０５（図３Ｃ）であり、いずれも有意な相関が認められた。
【００６４】
【表５】

データは平均±ＳＥで示した。
^ａＳＨＲ（賦形剤投与群）に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０１
^ｂＷＫＹに対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０１
^ｃＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）（賦形剤投与群）に対するＴｕｋｅｙ’ｓｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０５
^ｄＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）（賦形剤投与群）に対するＴｕｋｅｙ’ｓｔｅｓｔによる検定値がＰ＜０．０１
【００６５】
［実施例８］ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＡＧＥ抑制作用
本発明者らが以前にオルメサルタン等のｉｎｖｉｔｒｏの作用機序を検討したように（ＭｉｙａｔａＴ，ｅｔａｌ．，ＪＡｍＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ，ｉｎｐｒｅｓｓ．）、ヒドララジンの作用機序をｉｎｖｉｔｒｏで検討した。非糖尿病の透析患者血漿におけるｉｎｖｉｔｒｏでのペントシジン生成（図４Ａ）とＮε−カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）（図４Ｂ）は、ヒドララジンにより濃度依存的に阻害された（ペントシジンとＣＭＬのＩＣ５０は、０．５２ｍＭおよび０．７７ｍＭ）。非腎不全の糖尿病患者血漿や糖尿病の透析患者血漿、あるいは、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中１０ｍＭアラビノース存在下、ウシ血清アルブミンをインキュベートした時においても、同様のＡＧＥ生成に対する阻害効果が認められた（データは示していない）。
【００６６】
さらに、ヒドララジンのＡＧＥ生成抑制効果の作用機序を検討した。ヒドララジンはアミノグアニジンと同様、グリオキサールやメチルグリオキサールなどのＡＧＥの前駆体となるＲＣＯ（図４Ｃ）やピリドキサール５’−リン酸（図４Ｄ）を効果的に捕捉したが、この現象は、オルメサルタン（ＭｉｙａｔａＴ，ｅｔａｌ．，ＪＡｍＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ，ｉｎｐｒｅｓｓ．）の場合とは対照的であった。ヒドララジンは、酸化に対しても軽減化作用を有する。オルメサルタンと同様、ヒドララジンはカーボンセンターラジカル消去作用が認められたが、このことはアミノグアニジンとは対照的であった（図４Ｅ）。さらに、ヒドララジンには、ヒドロキシルラジカルの消去作用が認められたが（図４Ｆ）、アミノグアニジンの場合、消去作用はわずかであった。また、ヒドララジンは、銅イオンに対してキレート作用があり、フェントン反応を抑えることにより、アスコルビン酸の自動酸化を抑制した（ＩＣ５０＝１．３ｍＭ）。
【００６７】
［実施例９］オルメサルタンの小胞体ストレスに対する効果：小胞体ストレスの測定方法（小胞体ストレスタンパクの染色）
ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラット、対照としてＷＫＹラットおよびＳＨＲラットにおいて、アンジオテンシン受容体拮抗薬（ＡＲＢ）のオルメサルタン（ＣＳ−８６６；三共）を２０週間（１３〜３３週齢）各被験物質をゾンデにより強制経口投与し、腎保護効果を検討した。日本エスエルシーよりＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラット（雄、１１週齢）、ＷＫＹ（雄１１週齢）および、ＳＨＲ（雄、１１週齢）を入荷し、１週間馴化した。コントロールも含め、計４群で検討を行った（各群１０匹）。投与期間中は体重測定、採血、採尿および血圧測定する。形態学的解析のため、腎組織切片による糸球体の形態学的観察評価（糸球体肥大、糸球体硬化、尿細管障害等）を行った。被験物質投与２０週後に解剖（採血後、腎臓の摘出・重量測定）を行い、腎臓は生化学用および病理用にそれぞれ用いた。
【００６８】
ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットから摘出した腎組織を１０％ホルマリンを用い固定し、パラフィンにて包埋し腎組織のパラフィンブロックを作製した。ミクロトームによりパラフィンブロックを薄切し、組織染色サンプルとした。脱パラフィン後、一次抗体としてａｎｔｉ−ＧＲＰ７８（ポリクローナル抗体：ＳＡＮＴＡＣＲＵＺ）もしくは、ａｎｔｉ−ＯＲＰ１５０（ポリクローナル抗体：金沢大学小川教授より寄贈）を用いた。４℃、Ｏ／Ｎ後、ＰＢＳで５ｍｉｎ、１回洗浄後、二次抗体と反応させた。一次抗体がＧＲＰ７８の時、ａｎｔｉ−ｇｏａｔｂｉｏｔｉｎ抗体（ＤＡＫＯ）、ＯＲＰ１５０の場合、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔｂｉｏｔｉｎ抗体（ＺＹＭＥＤ）を使用した。室温で１ｈｒ反応させた後、ＰＢＳで５ｍｉｎ、１回洗浄後、ａｖｉｄｉｎ−ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ（ＶＥＣＴＯＲ）で発色させた（３０ｍｉｎ）。発色には０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．６、５ｍｉｎで洗浄した後、ＤＡＢ（０．１ｍｇ／ｍＬ）、過酸化水素水（０．０３％）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ液で、３７℃、１０ｍｉｎで処理した。水で発色反応を止めた。さらに、メチルグリーン（Ｖｅｃｔｏｒ）により核染色を行った。
【００６９】
ＧＲＰ７８抗体、ＯＲＰ１５０抗体を用いて免疫染色を行った結果を図５、図６および表６に示す。コントロールであるＷＫＹおよびＳＨＲの糸球体には、小胞体ストレスマーカーであるＧＲＰ７８を全く確認することができなかった。しかし、ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットにオルメサルタン投与によりＧＲＰ７８はほとんど消失した。ＯＲＰ１５０も同様の結果を示した。
以上より、小胞体ストレスマーカーであるＧＲＰ７８およびＯＲＰ１５０シャペロンタンパクの増減は、タンパク尿や糸球体硬化度と相関があり、糖尿病性腎症と小胞体ストレスとの関連を裏付けられた。
また、本発明のＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットにおいて、腎保護作用を有するオルメサルタンの投与で小胞体ストレスが消失したことから、ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットが小胞体ストレス改善作用、とりわけ腎保護作用を期待する化合物の治療薬としてのスクリーニングに有用であることが明らかとなった。
【００７０】
【表６】

【発明の効果】
本発明によって、ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットにおける小胞体ストレスの生成抑制作用の評価方法が提供された。ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットは、小胞体ストレスの亢進を呈する。そしてＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットに腎保護作用を有する化合物を投与することによって、実際に小胞体ストレスが軽減されることが本発明者らによって確認された。このことは、ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットが、腎障害が小胞体ストレスに由来するものであることを示すものであると共に、小胞体ストレスの生成が病因の一つとなっている疾患の治療に有用な化合物の作用を評価するためのツールとして有用であることを裏付けている。ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットの使用によって、生体内において起きている疾患メカニズムに対して、より効果的に作用する化合物の評価が可能となる。
たとえば、単に生体外で高血糖状態を再現することは容易である。しかし実際には、化合物が生体に投与され、生体内で治療効果を発現するまでには、考慮すべきさまざまな条件が存在する。したがって、生体内における治療効果を評価しうる方法は、小胞体ストレスによってもたらされる疾患の治療方法の開発において有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】典型的な糸球体障害の写真を示す。Ａ；ＳＨＲラットにおける少数の糸球体に観察された糸球体の硬化を示す。矢印は、代表的な硬化を示す。Ｂ；対照のＷＫＹラットの糸球体を示す。Ｃ；ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）ラットにおけるより高度な糸球体硬化を示す。Ｄ；ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）ラットの高用量オルメサルタン投与群における糸球体障害の軽減化を示す。
【図２】脂質の過酸化で生成する４−ヒドロキシノネナール蛋白付加物（Ａ，Ｂ）と、ＡＧＥであるペントシジン（Ｃ〜Ｅ）の免疫染色の写真（２００倍）を示す。Ａ；ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）ラットの賦形剤投与群の糸球体における、４−ヒドロキシノネナール蛋白付加物の蓄積を示す。Ｂ；ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）ラットの高用量オルメサルタン投与群において４−ヒドロキシノネナール蛋白付加物は認められなかったことを示す写真。Ｃ；ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）ラットの賦形剤投与群の尿細管におけるペントシジンの蓄積を示す。Ｄ；ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）ラットの動脈壁にペントシジンの蓄積を示す写真。Ｅ；ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）ラットの高用量オルメサルタン投与群においてペントシジンは認められなかったことを示す写真。
【図３】ＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐ（ｆａｔ／ｆａｔ）ラットの賦形剤投与群及び降圧薬投与群における、Ａ；尿中タンパクと腎臓中のペントシジン濃度の相関、Ｂ；収縮期の血圧と蛋白尿との相関、Ｃ；収縮期の血圧と腎臓中のペントシジン濃度の相関を示すグラフ。
【図４】ヒドララジンがｉｎｖｉｔｒｏにおいてＡＧＥｓの生成を抑制することを示すグラフ。薬剤がない対照を１００％とした。結果を平均±ＳＥで示した。
Ａ；非糖尿透析患者血漿をインキュベートした場合のヒドララジンによるペントシジンの生成抑制作用を示す。Ｂ；非糖尿透析患者血漿をインキュベートした場合のヒドララジンによるＣＭＬの生成抑制作用を示す。Ｃ；ヒドララジンによるジカルボニル化合物の捕捉を示す。Ｄ；ヒドララジンによるピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）の捕捉を示す。Ｅ；ヒドララジンによるリボース由来カーボンセンタードラジカルの消去作用を示す。縦軸は、キレックス（金属イオンに対するキレート剤）存在下、種々の薬剤の濃度におけるＮ−ｔ−ｂｕｔｙｌ−ａ−ｐｈｅｎｙｌｎｉｔｒｏｎｅ（ＰＢＮ）とリボース由来カーボンセンタードラジカルの付加物の相対的ＥＳＲ強度を示す。Ｆ；ヒドララジンによるヒドロキシルラジカルの消去作用を示す。縦軸は、５，５’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ（ＤＭＰＯ）ＯＨの相対的ＥＳＲのシグナルの高さを示す。
【図５】抗ＧＲＰ７８抗体を用いたＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットと対照ラットの腎組織の免疫染色（ｘ２００）
【図６】抗ＯＲＰ１５０抗体を用いたＳＨＲ／ＮＤｍｃ−ｃｐラットと対照ラットの腎組織の免疫染色（ｘ２００）[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for evaluating an endoplasmic reticulum stress improving agent.
[0002]
[Prior art]
The endoplasmic reticulum, a complex mesh-like membrane structure, is present in all eukaryotic cells. The endoplasmic reticulum is responsible for functions such as synthesis of secretory proteins, membrane proteins, lipids, and storage of calcium ions. In the lumen of the endoplasmic reticulum, a series of proteins called molecular chaperones, such as 78 kDa glucose-regulated protein (GRP78), 94 kDa glucose-regulated protein (GRP94), and 150 kDa oxygen-regulated protein (ORP150), are located. Molecular chaperones are involved in the folding of secretory proteins and membrane proteins in the endoplasmic reticulum. Here, the secretory protein and the membrane protein undergo modification such as glycosylation and disulfide (S—S) bond, and at the same time, are folded to have a correct tertiary structure.
[0003]
The correctly folded protein in the endoplasmic reticulum is transported to the next destination, the Golgi. However, proteins that fail to fold remain in the endoplasmic reticulum until they have the correct conformation. This is similar to a mechanism that does not bring defective products to the market in factories, and is called “protein quality control in the endoplasmic reticulum”, and is considered to be a very important function for cells to maintain normal functions. Thus, the endoplasmic reticulum plays an important role in protein folding, and it has been revealed that many molecular chaperones and folding enzymes work in cooperation to help that. .
[0004]
When cells receive various stresses from the outside world (such as glucose starvation, viral infection, decreased calcium concentration in the endoplasmic reticulum lumen, heavy metal intake, and hypoxia), protein folding in the endoplasmic reticulum becomes defective and higher order Unusually structured proteins accumulate in the endoplasmic reticulum. This condition is called ER stress. This condition is very harmful to cells and even living organisms. Since cells escape from this state, they are induced at the transcription level of endoplasmic reticulum chaperones and folding enzymes to increase the folding capacity in the endoplasmic reticulum (unfolded protein response; UPR), and suppress protein synthesis to reduce the load on the endoplasmic reticulum. And decomposes structurally abnormal proteins, and attempts to eliminate the accumulation of abnormal proteins in the endoplasmic reticulum. However, when they break down, the cells die by apoptosis (Non-Patent Document 1).
[0005]
The relationship between endoplasmic reticulum stress and diseases has become clear: neurodegenerative diseases represented by Alzheimer's disease, Parkinson's disease, polyglutamine disease, prion disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), insulin Dependent diabetes (juvenile diabetes), inflammatory bowel disease and the like. In these diseases, proteins are often aggregated in cells.
[0006]
Thus, ER stress involves accumulation and aggregation of abnormal structural proteins. Pathological model animals are useful for developing therapeutic agents for diseases caused by accumulation or aggregation of abnormal structural proteins and elucidating the behavior of abnormal proteins. Model animals are useful in elucidating the behavior of accumulation and aggregation of abnormal structural proteins, and in developing therapeutic agents caused by accumulation and aggregation of abnormal structural proteins. Several model animals are known to date.
[0007]
“Akita mouse” of type 2 diabetes is known as a model animal of endoplasmic reticulum stress (Non-Patent Document 2). However, the "Akita mouse" has a gender difference and has a disadvantage of a low incidence rate.
[0008]
The present inventors have clarified that compounds containing a biphenyltetrazole group, such as olmesartan, suppress generation of an end product of saccharification called AGEs and are useful for prevention / treatment of diseases caused by accumulation of AGEs. Have clarified that the radical scavenging action of the compound is involved in suppressing the generation of AGEs (Patent Document 1). Many biphenyltetrazole group-containing compounds such as olmesartan are known as anti-hypertensives having angiotensin II type 1 receptor antagonism. It is also expected as a renal protective agent for improving sickness.
[0009]
As the diseases involving AGEs, for example, the following diseases have been reported.
1) Nephropathy which is a diabetic complication (Horie, K. et al .; J. Clin. Invest., 100 (12), 2995-3004, 1997), neuropathy (Sugimoto, K. et al .; Diabetologia, 40 (12), 1380-1387, 1997), retinopathy (Lu, M. et al .; J. Clin. Invest., 101 (6), 1219-1224), and cataracts,
2) Arteriosclerosis (Park, L. et al .; Nat. Med., 4 (9), 1025-11031, 1998),
3) Dialysis amyloidosis (Miyata, T. et al .; J. Clin. Invest., 92, 1243-1252, 1993), which is a dialysis complication, and peritoneal sclerosis in peritoneal dialysis patients.
4) Central nervous disease Alzheimer's disease (Smith, MA et al .; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (12), 5710-5714, 1994), Pick's disease and Parkinson's disease,
5) Rheumatoid arthritis (Miyata, T. et al .; Biochem. Biophys. Res. Commun., 244, 45-49, 1999),
6) sunlight elastic fibrosis,
7) aging,
8) Renal failure (Makita, Z. et al .; N. Engl. J. Med., 325, 826-842, 1991) and the like
[0010]
[Patent Document 1] WO 02/083127
[Non-Patent Document 1] Mori, K .; : Cell, 101, 451-454, 2000
[Non-Patent Document 2] Wang, J .; et al. : J. Clin. Invest. , 103, 27-37, 1999.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for evaluating an endoplasmic reticulum stress improving effect. More specifically, an object of the present invention is to provide a method which has an effect of suppressing the production of endoplasmic reticulum stress in a living body, for example, and which can evaluate a protective effect of renal function. Another object of the present invention is to provide a method for screening a compound that can be used for treatment and / or prevention of a disease caused by production of ER stress based on the evaluation method.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
As described above, the present inventors have found that compounds containing a biphenyltetrazole group, such as olmesartan, suppress the generation of AGEs and are useful for the prevention / treatment of diseases such as renal diseases derived from the accumulation of AGEs. It was revealed that. Further, in the process of further pursuing the mechanism of the renal protective effect of the antihypertensive agent, by using an experimental system using a specific spontaneously hypertensive rat, the onset of renal damage is independent of blood pressure, The present inventors have found that a compound that suppresses the production of AGEs depends on the degree of AGEs production and can be a therapeutic agent for renal disease.
[0013]
The present inventors used SHR rats and SHR / NDmc-cp rats as spontaneously hypertensive rats. SHR / NDmc-cp rats exhibit obesity, hyperlipidemia, hypertension, hyperglycemia, and hyperinsulinemia, and show stronger proteinuria and renal impairment than SHR rats and normotensive rats. However, blood pressure is higher in SHR rats. This indicates that the onset of renal damage was caused by something other than blood pressure. Furthermore, the SHR / NDmc-cp rats showed extremely high AGEs content, although the renal AGEs content of SHR rats and normotensive rats was almost equal.
From these, it became clear that the AGEs content in the living body could be a powerful indicator of renal impairment. Then, they found that it is possible to screen for a compound that can be used for treatment or prevention of a disease caused by AGEs production, using the inhibitory effect of the test substance on AGEs production in SHR / NDmc-cp rats as an index.
[0014]
When the endoplasmic reticulum stress of SHR / NDmc-cp rats was examined, it was found that ORP150 and GRP78, which are anti-ER stress proteins, were remarkably expressed in renal epithelial cells. On the other hand, no anti-ER stress protein was observed in SHR rats that only develop hypertension or WKY rats as negative controls. This indicates that ER stress is deeply involved in proteinuria and renal function decline. The effects of endoplasmic reticulum stress on the kidneys have not been known at all.
[0015]
Further, when a compound having a confirmed renal protective action was administered to SHR / NDmc-cp rats, these anti-ER stress proteins disappeared.
[0016]
That is, the present invention relates to the following method for evaluating the endoplasmic reticulum stress-ameliorating effect, and a method for screening a compound that can be used for treatment and / or prevention of a disease caused by the production of endoplasmic reticulum stress using the evaluation method.
[1] A method for evaluating an endoplasmic reticulum stress improving agent, comprising the following steps:
(1) a step of administering a test substance to SHR / NDmc-cp rats before and / or after exhibiting type 2 diabetes-like symptoms;
(2) measuring the level of ER stress production in SHR / NDmc-cp rats; and
(3) a step of evaluating that the test substance has an endoplasmic reticulum stress improving action when the test substance has an action of suppressing the production level of endoplasmic reticulum stress
[2] A method for screening a compound that can be used for treatment and / or prevention of a disease caused by the production of ER stress, comprising the following steps.
(A) evaluating the ER stress-ameliorating effect of the test substance by the method according to [1], and
(B) selecting a test substance having a greater ER stress-ameliorating effect than the control
[3] The method of [2], wherein the disease caused by the production of endoplasmic reticulum stress is a renal disease.
[4] A pharmaceutical composition for treating and / or preventing a disease caused by the production of endoplasmic reticulum stress, comprising a compound that can be selected by the method according to [2] as an active ingredient.
[0017]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention relates to a method for evaluating an endoplasmic reticulum stress improving agent, comprising the following steps.
(1) a step of administering a test substance to SHR / NDmc-cp rats before and / or after exhibiting type 2 diabetes-like symptoms;
(2) measuring the level of ER stress production in SHR / NDmc-cp rats; and
(3) a step of evaluating that the test substance has an endoplasmic reticulum stress improving action when the test substance has an action of suppressing the production level of endoplasmic reticulum stress
[0018]
The SHR / NDmc-cp rat used in the present invention is an experimental animal widely used as a model animal for obesity and essential hypertension. In Japan, it is maintained at the "SHR and Other Disease Model Joint Study Group" (Kyoto) and can be obtained through Japan SLC Corporation (Shizuoka). Furthermore, by continuously feeding a high carbohydrate diet, SHR / NDmc-cp rats exhibit type 2 diabetes-like symptoms. Type 2 diabetes-like symptoms in SHR / NDmc-cp rats appear as symptoms such as hyperinsulinemia, hyperlipidemia, impaired glucose tolerance, proteinuria, and diabetes.
[0019]
In the evaluation method of the present invention, (1) a test substance is administered to SHR / NDmc-cp rats before and / or after exhibiting type 2 diabetes-like symptoms. The route of administration of the test substance is not limited. For example, the test substance can be administered orally or parenterally. The fact that SHR / NDmc-cp rats exhibit type 2 diabetes-like symptoms can be known by observing symptoms such as hyperinsulinemia, hyperlipidemia, decreased glucose tolerance, proteinuria, and diabetes. it can.
[0020]
For example, observing any of the symptoms of hyperinsulinemia, hyperlipidemia, impaired glucose tolerance, proteinuria, and diabetes as an index, and exhibiting type 2 diabetes when the symptoms are observed I understand. For urinary protein or urinary sugar testing, sampling is easy. In addition, any index can be easily measured using a commercially available measuring reagent or urine test paper, and is therefore a preferable index for type 2 diabetes. Methods for measuring these indices are known.
[0021]
In the present invention, the test substance can be administered before and / or after SHR / NDmc-cp rats exhibit type 2 diabetes-like symptoms. When administered before the onset of type 2 diabetes-like symptoms, the prophylactic action of the test substance can be evaluated. On the other hand, the therapeutic effect can be evaluated by administration after the onset.
[0022]
The evaluation method of the present invention includes (2) a step of measuring the level of ER stress production in SHR / NDmc-cp rats. The method of measuring the level of ER stress production in SHR / NDmc-cp rats is arbitrary. For example, a biological sample of a SHR / NDmc-cp rat can be collected to measure the level of ER stress generation. As the biological sample, blood, urine, or any tissue can be used.
[0023]
Markers for measuring levels of ER stress are known. In general, endoplasmic reticulum stress can be known by detecting an anti-ER stress protein as a marker. For example, examples of the anti-ER stress protein include ORP150, which is an ORP having a molecular weight of 150 kDa, and GRP78, which is a GRP having a molecular weight of 78 kDa.
[0024]
When cells are exposed to hypoxia, a series of stress proteins collectively referred to as Oxygen Regulated Proteins (ORPs) are induced (Heacock, CS et al .: Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. Phys. , 12, 1287-1290, 1986). Under glucose starvation conditions, a stress protein called Glucose Regulated Proteins (GRPs) is expressed (Lee, AS, Curr. Opin. Cell. Biol., 4, 267-273, 1992). It is known that these stress proteins function as factors that suppress apoptosis caused by endoplasmic reticulum stress. Therefore, the expression of these stress proteins is increased under the endoplasmic reticulum stress condition. Therefore, by observing the stress protein, the degree of ER stress can be known. Antibodies to ORP150 and GRP78 are known and can be detected by conventional methods such as tissue immunostaining.
[0025]
SHR / NDmc-cp rats have enhanced endoplasmic reticulum stress. A disease model animal having such characteristics is useful as a model animal for a disease caused by endoplasmic reticulum stress.
[0026]
SHR / NDmc-cp rats exhibit ER stress. Regardless of the cause of the ER stress condition, animals with ER stress are useful as models of ER stress condition. Specifically, various disorders caused to the living body by ER stress can be observed. In addition, a therapeutic method for alleviating a disorder caused by endoplasmic reticulum stress can be studied using a model animal.
[0027]
The SHR / NDmc-cp rat of the present invention can reproduce the endoplasmic reticulum stress state in a short period of time and frequently, and thus contributes to research on the mechanism of the occurrence of endoplasmic reticulum stress and prevention or treatment of endoplasmic reticulum stress. Specifically, the model animal of the present invention can elucidate the mechanism of ER stress generation and realize large-scale drug screening for developing therapeutics for diseases caused by ER stress.
[0028]
Using the SHR / NDmc-cp rat of the present invention, the therapeutic effect of a test substance on ER stress can be evaluated. The evaluation method according to the present invention relates to a method for evaluating the effect of suppressing endoplasmic reticulum stress, comprising the following steps.
(1) a step of administering a test substance to SHR / NDmc-cp rats before and / or after exhibiting type 2 diabetes-like symptoms;
(2) a step of detecting the action of reducing the production level of endoplasmic reticulum stress in SHR / NDmc-cp rats to which the test substance has been administered
[0029]
In addition, the SHR / NDmc-cp rat of the present invention can be used to screen a therapeutic compound for a disease caused by endoplasmic reticulum stress. The screening method of the present invention comprises measuring the activity of the test substance for repairing a disease caused by endoplasmic reticulum stress by the above-described evaluation method, and selecting a compound having a large activity as compared with a control not administered with the test substance. Can be implemented.
[0030]
In the evaluation method or screening method of the present invention, the degree of ER stress recovery can be evaluated using a stress protein as an index. For example, the following stress proteins are known. Methods for measuring these stress proteins are also known.
ORP150
GRP78
GRP95
GRP170
[0031]
In the evaluation method or the screening method of the present invention, the therapeutic effect of a disease caused by endoplasmic reticulum stress can be evaluated using various markers corresponding to each disease as an index. More specifically, in the case of diabetes, the therapeutic effect on diabetes can be known by using blood sugar level, urine sugar level, and the like as indexes. Diseases caused by endoplasmic reticulum stress include, besides diabetes, neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and polyglutamine disease (Huntington's disease, Macado-Joseph's disease).
[0032]
On the other hand, with the aging of the population, an increase in neurodegenerative diseases has become a major social problem. Such diseases are defined as being characterized by onset in adults, chronic history, a distinct clinical phenotype, specific cellular abnormalities involving a subset of neurons, and ultimately fatal consequences . Examples of neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's chorea and the like. No complete cure can be expected in such neurodegenerative diseases, and treatment must be limited exclusively to disease management. Disease model animals are indispensable for elucidation of pathological conditions and development of therapeutic agents.
[0033]
The SHR / NDmc-cp rat of the present invention causes endoplasmic reticulum stress in renal epithelial cells and exhibits renal impairment due to endoplasmic reticulum stress. The endoplasmic reticulum stress is eliminated by administration of a compound having a renal protective action. It has been pointed out that renal epithelial cells play a very important role in proteinuria and renal function decline, and are an important target for research and drug discovery. However, until now, only a model of renal epithelial cell damage caused by administration of an antibody or a drug (puromycin) has been known. Therefore, the disease model animal of the present invention is extremely useful for developing a therapeutic drug for renal disease.
[0034]
In the evaluation method of the present invention, it can be said that the lower the level of ER stress generation, the greater the effect of the test substance on suppressing ER stress generation. Therefore, by using, as a control, a comparative compound that has been confirmed to have a certain endoplasmic reticulum stress production inhibitory action, the production inhibitory action of the comparative compound can be compared with that of the comparative compound.
[0035]
The evaluation method of the present invention can be used for screening. That is, the present invention relates to a method for screening a compound that can be used for treatment and / or prevention of a disease caused by production of ER stress, which comprises the following steps.
(A) a step of evaluating the endoplasmic reticulum stress-ameliorating effect of the test substance by the evaluation method, and
(B) selecting a test substance having a greater ER stress-ameliorating effect than the control
[0036]
As described above, endoplasmic reticulum stress generated in vivo may cause various diseases. Therefore, a compound selected based on the inhibitory action of ER stress production as an index is useful as a therapeutic agent for various diseases caused by ER stress.
[0037]
It has already been shown that suppressing the production of ER stress is useful for treating diseases caused by ER stress. However, by using as a tool a model animal that actually accumulates endoplasmic reticulum stress, such as an SHR / NDmc-cp rat, a test substance can be evaluated in a state closer to the actual disease. For example, SHR / NDmc-cp rats exhibit type 2 diabetes-like symptoms, such as albuminuria or diabetes. In other words, by using SHR / NDmc-cp rats, it is possible to evaluate the therapeutic effect or preventive effect on the pathological condition occurring in the body of an actual diabetic patient.
[0038]
The test substance used in the screening of the present invention includes, for example, natural or synthetic compounds, various organic compounds, natural or synthetic saccharides, proteins, peptides, expression products of gene libraries, cell extracts, and bacterial cell components. Can be mentioned. In addition, a compound group having a tetrazole group can be used as a test substance. The present inventors have clarified that a compound having a tetrazole group or a pharmacologically acceptable salt thereof is useful as a composition for inhibiting the production of protein modification (WO 02/083127). By using the evaluation method of the present invention, it is also possible to evaluate the in vivo ER stress ameliorating effect of these groups of compounds. As a result, compounds with higher therapeutic effects can be screened
[0039]
The test substance can be administered to SHR / NDmc-cp rats before and / or after the onset of type 2 diabetes-like symptoms. However, in order to find a compound that acts more specifically on endoplasmic reticulum stress caused by diabetic symptoms, it is preferable to administer a test substance after exhibiting diabetic symptoms. By changing the timing of administration of the test substance and comparing the effects on the endoplasmic reticulum stress production level, a more effective administration time can also be clarified.
[0040]
The test substance selected by the screening method of the present invention is further tested for safety and stability, etc., and then an active ingredient of a pharmaceutical composition for treating and / or preventing a disease caused by the production of ER stress. It can be. The pharmaceutical composition of the present invention can be formulated and administered by a known pharmaceutical manufacturing method. The compound itself as an active ingredient can also be directly administered. When it is formulated, it can be administered, for example, in appropriate combination with a vehicle or carrier commonly used as a drug.
[0041]
If the compound can be encoded by DNA, the DNA may be incorporated into a gene therapy vector to perform gene therapy. Administration can be performed by, for example, intraarterial injection, intravenous injection, intranasal administration, intrabronchial administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, oral administration, direct administration to the affected area, and the like. The dose varies depending on conditions such as the patient's body weight, age, health degree, and administration method, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
[0042]
That is, for example, in SHR / NDmc-cp rats, the effective concentration is determined by comparing the therapeutic effect on type 2 diabetes-like symptoms between various doses. Then, the dose at which the concentration of the administered compound in the kidney reaches the effective concentration is empirically determined by each administration route as described above. In a typical dosage form, the dosage per kg of body weight is determined assuming that the active ingredient is distributed systemically. If the compound is considered to have high renal translocation based on the results of pharmacokinetic analysis in experimental animals, the dose can be set lower.
[0043]
The pharmaceutical composition of the present invention is mixed with a vehicle or carrier in consideration of the determined dosage and administration form. The skilled artisan will normally formulate the active ingredients so that the required dosage can be achieved. The dose of the pharmaceutical composition according to the present invention can be usually 1 μg to 20 g, more usually 10 μg to 500 mg per kg of body weight. In the case of an injection, the dose can be about 1/10 to 1/100 of the oral dose. Further, the dosage can be adjusted by applying a special formulation design. For example, the pharmaceutical composition of the present invention can be made into a sustained-release preparation by holding it in a suitable carrier, but in such a preparation, a high blood concentration can be maintained. Can be set low.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
[0044]
【Example】
[Example 1] Experimental materials and methods
Antihypertensive
Olmesartan (Sankyo) and hydralazine (Sigma) were used as antihypertensive drugs.
animal
Spontaneously hypertensive obese rat (SHR / NDmc-cp (fat / fat)), which is a subline of spontaneously hypertensive / NIH-obese rats (maintained at the Joint Study Group on Disease Modeling for SHR, etc. (Kyoto)), spontaneously hypertensive rat (SHR) ) And Wistar-Kyoto rats (WKY) were purchased from SLC Japan (Shizuoka). Thirteen-week-old SHR / NDmc-cp (fat / fat) were randomly divided into four groups as follows.
Vehicle administration group (Group 1): 10 animals,
Low-dose olmesartan administration group (1 mg / kg / day) (Group 2): 9 animals,
High-dose olmesartan administration group (5 mg / kg / day) (Group 3): 10
Hydralazine administration group (mg / kg / day) (Group 4): 9 animals
13-week-old SHRs (hypertension, non-diabetes) were divided into the following three groups.
Vehicle administration group (Group 5): 10 animals,
High-dose olmesartan administration group (5 mg / kg / day) (Group 6): 10
Control vehicle-administered WKY group (Group 7): 10
The drug administration period was 20 weeks. The protocol followed the guidelines for laboratory animals in the Tokai University School of Medicine.
[0045]
Blood pressure measurement, urine collection and blood collection
Systolic blood pressure was measured by the tail cuff method at the beginning of the study, two weeks later, and at four-week intervals. At the end of the study, the rats were weighed and kept in metabolic cages for 24 hours of urine collection. Blood was collected before sacrifice.
[0046]
Biochemical measurement of blood and urine
For the measurement of glucose, total cholesterol, triglyceride, phospholipid, creatinine and urea nitrogen (BUN) in plasma, and the concentration of protein and creatinine in urine, use an automatic analyzer (Synchron CX-7, manufactured by Beckman Coulter Inc). Measured. The insulin concentration in the plasma was measured using a commercially available kit (manufactured by Morinaga Biochemical Laboratory).
[0047]
Morphological analysis
Sections (3-4 μm) of kidney tissues were stained with periodate Schiff (PAS) and observed using an optical microscope. The glomerular hardening was evaluated semi-quantitatively by the method of Uehara et al. (Uehara, Y. et al .: Hypertension 24, 770-778, 1994). That is, 50 glomeruli from each animal were randomly selected for morphological analysis. The degree of glomerular sclerosis was indicated by% of the glomerular lesion site with respect to the total area, and was classified into the following five stages.
0; No obstacle
1+; 1% -25%
2+; 5% -50%
3+; 50% -75%
4+; 75% -100%
Regarding the glomerular sclerosis of animals, the degree of glomerular sclerosis (0 to 4+) multiplied by the ratio (%) indicating the degree was summed.
[0048]
Immunohistochemical staining
Oxidative protein adducts such as pentosidine, which is the structure of AGE, and 4-hydroxynonenal-protein adduct formed by peroxidation of lipids were analyzed using frozen sections fixed with ethanol: acetone. Background staining was reduced using an avidin / biotin kit (from Vector Laboratories). Prior to addition of the first antibody, the cells were incubated in a 3% hydrogen peroxide solution in PBS at room temperature for 15 minutes to remove endogenous peroxidase activity.
[0049]
Immunostaining of the sections was performed using the following rabbit anti-pentosidine antibody or mouse anti-4-hydroxynonenal monoclonal antibody NA59 using a 3,3′-diaminobenzidine (DAB) detection system. Unimmunized rabbit IgG was used as a control.
Rabbit anti-pentosidine antibody (Horie, K. et al .: Biochem. Biophys. Res. Commun., 236, 327-332, 1997).
Mouse anti-4-hydroxynonenal monoclonal antibody NA59 (Miyata, T. et al .: FEBS Lett, 445, 202-206, 1999) (provided by Dr. Witztum JL)
[0050]
AGE measurement
Pentosidine concentration in the kidney was measured. Kidney tissue (100 mg) was minced, washed with 10% trichloroacetic acid, dried under reduced pressure and then hydrolyzed in 500 μl of 6N HCl under nitrogen at 110 ° C. for 16 hours. Pentosidine was measured by reversed-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) according to the method described previously (Miyata, T. et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 2353-2358, 1996). . That is, 20 μl of the acid hydrolyzate diluted with PBS was injected into the HPLC system, and separated using a C18 reverse phase column (Waters). The mobile phase was measured at an excitation-absorption wavelength (335/385 nm) using a fluorescence detector (RF-10A, Shimadzu). Synthetic pentosidine was used as a standard.
[0051]
AGE inhibitory effect in vitro
The AGE production inhibitory effect of hydralazine was measured in vitro. After informed consent, 100 μl of 8, 20, or 50 mM hydralazine (DMSO solution) was added to fresh pooled plasma (900 μl) obtained by heparin pre-dialysis blood sampling of a non-diabetic renal failure patient, followed by incubation. The production of pentosidine by incubation was measured by the HPLC method according to our previous method (Miyata, T. et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 2353-2358, 1996).
[0052]
The mechanism of action for inhibiting AGE formation, i.e., capture of dicarbonyl (glyoxal and methylglyoxal), capture of pyridoxal 5'-phosphate, elimination of sugar-derived radicals and hydroxy radicals, and chelation of transition metal ions) Examination was performed by a method previously reported (Miyata, T. et al .: J. Am. Soc. Nephrol., In press.).
[0053]
Statistical analysis
All data are shown as mean ± SE. The comparison between the vehicle administration group of the other three groups of SHR / NDmc-cp (fat / fat) and the other group of SHR / NDmc-cp (fat / fat) was performed by Dunnett's test. The test between the SHR group and the SHR group administered with olmesartan, the test between the SHR / NDmc-cp (fat / fat) group and the SHR group, and the test between the SHR group and the WKY group were performed by the Student's t test. For histological analysis, see Steel's test or Wilcoxon's test. Tested by All calculations were performed using SAS software (SAS Institute). P <0.05 was considered statistically significant.
[0054]
[Example 2] Body weight, blood glucose and lipid concentration
At the end of administration, in contrast to SHR (Table 1), all SHR / NDmc-cp (fat / fat) became obese, hyperglycemic, hyperinsulin plasma, and hyperlipidemic. Olmesartan (type I angiotensin II receptor antagonist (ARB)) involved in the renin-angiotensin system and hydralazine considered not to be involved in the renin-angiotensin system were used as two types of antihypertensive drugs. The high dose olmesartan group reduced plasma levels of total cholesterol and phospholipids (P <0.05) compared to vehicle-treated control SHR / NDmc-cp (fat / fat) group. However, there was no change in glucose, insulin, total cholesterol, phospholipids, body weight, or plasma levels in the other groups that received antihypertensive drugs in the SHR / NDmc-cp (fat / fat) group.
[0055]
[Table 1]

Data are shown as mean ± SE.
^a The test value of Student's t-test for SHR (vehicle administration group) was P <0.01.
^b The test value of SHR / NDmc-cp (fat / fat) (Olmesartan administration group, 1 mg / kg) by Tukey's test was P <0.05.
^c The test value by Tukey's test for SHR / NDmc-cp (fat / fat) (vehicle administration group) was P <0.05.
^d Test value by Student's t-test for WKY (vehicle administration group) is P <0.01.
[0056]
[Example 3] systolic blood pressure
At the beginning of the test, all SHR (P <0.01) and SHR / NDmc-cp (fat / fat) rats (P <0.01) were hypertensive compared to control WKY rats, and the former was the latter. Blood pressure was higher (P <0.01). Olmesartan and hydralazine significantly reduced systolic blood pressure during the course of the experiment (Table 2). In SHR / NDmc-cp (fat / fat), the antihypertensive effect was dependent on the concentration of olmesartan. The systolic blood pressure of the hydralazine-administered group was almost similar to that of the low-dose olmesartan-administered group. Except for the last four weeks, the blood pressure was almost the same as that of the high-dose olmesartan administration group. The antihypertensive effect of high dose olmesartan was similar in SHR and SHR / NDmc-cp (fat / fat).
[0057]
[Table 2]

Data are shown as mean ± SE.
^a The test value by Student's t-test for SHR (vehicle administration group) was P <0.01.
^b The test value by Student's t-test for WKY (vehicle administration group) was P <0.01.
^c The test value by Tukey's test for SHR / NDmc-cp (fat / fat) (vehicle administration group) was P <0.05.
^d The test value of SHR / NDmc-cp (fat / fat) (vehicle administration group) by Tukey's test was P <0.01.
^e The test value by Student's t-test for SHR (olmesartan administration group, 5 mg / kg) was P <0.01.
^f The test value by Tukey's test for SHR / NDmc-cp (fat / fat) (olmesartan administration group, 1 mg / kg) was P <0.05.
[0058]
[Example 4] Proteinuria and renal function
At the end of the test, SHR / NDmc-cp (fat / fat) showed a high degree of proteinuria (Table 3). In the low-dose olmesartan and hydralazine groups, urinary protein excretion was lower than in the vehicle group, but was not statistically significant. In contrast, the reduction in proteinuria was more marked and statistically significant in the high dose olmesartan group (P <0.01). Proteinuria was mild in the control SHR group. And it was significantly reduced by administration of high dose olmesartan (P <0.01). WKY was normal without proteinuria. Kidney function was normal in all groups.
[0059]
[Table 3]

Data are shown as mean ± SE.
^a The test value by Student's t-test for SHR (vehicle administration group) was P <0.05.
^b The test value by Student's t-test for SHR (vehicle administration group) was P <0.01.
^c The test value of SHR / NDmc-cp (fat / fat) (vehicle administration group) by Tukey's test was P <0.01.
^d The test value by Student's t-test for WKY (vehicle administration group) was P <0.01.
[0060]
Example 5 Kidney Histology
Glomerular damage was observed in SHR / NDmc-cp (fat / fat) rats (Table 4). At the end of the administration period, focal glomerulosclerosis was significantly increased (P <0.01) in the vehicle-administered group in SHR / NDmc-cp (fat / fat) (FIG. 1C). The lower values were observed in the olmesartan low dose group and the hydralazine group, but were not statistically significant. In contrast, significantly lower (P <0.01) in the high dose olmesartan group (FIG. 1D). Focal glomerulosclerosis was present in only a small number of glomeruli in the SHR group (FIG. 1A) and not in the WKY group (FIG. 1B).
[0061]
[Table 4]

Data are shown as mean ± SE.
^a The test value by Wilcoxon's test for SHR (vehicle administration group) was P <0.01.
^b The test value of SHR / NDmc-cp (fat / fat) (vehicle administration group) by Tukey's test was P <0.01.
^c The test value of SHR / NDmc-cp (fat / fat) (hydralazine administration group, 5 mg / kg) by the Steel-Dass test was P <0.05.
^d The test value of WKY (vehicle administration group) by Wilcoxon's test was P <0.01.
[0062]
[Example 6] Oxidative protein modification and immunohistochemical staining for AGE
In the modified oxidative protein, the 4-hydroxynonenal-protein adduct generated during the process of lipid peroxidation accumulated in the SHR / NDmc-cp (fat / fat) vehicle-administered group. 2A), but not detected in the high-dose olmesartan administration group (FIG. 2B). The administration of a low dose of olmesartan or hydralazine did not inhibit the production of the 4-hydroxynonenal-protein adduct. In control WKY or SHR rats, no 4-hydroxynonenal-protein adduct was observed. Pentosidine was detected in the tubule of the SHR / NDmc-cp (fat / fat) vehicle administration group (FIG. 2C). Pentosidine was not found in any group of glomeruli. Furthermore, pentosidine was detected in the arterial wall of the SHR / NDmc-cp (fat / fat) vehicle-administered group (FIG. 2D), and its production was suppressed by administration of high-dose olmesartan (FIG. 2E). It was not detected in the arterial wall of WKY or SHR rats.
[0063]
[Example 7] Pentosidine concentration in kidney
In immunohistochemical staining, protein modification by AGE exceeding the detection limit can be detected, but sensitivity is low and accurate quantification is difficult. Therefore, the concentration of pentosidine in the kidney was chemically measured by HPLC (Table 5). Rentopentosidine (pmol / mg protein) showed a higher value in the SHR / NDmc-cp (fat / fat) group administered with vehicle than in the SHR group and WKY group (P <0.01). Pentosidine in the kidney decreased in the olmesartan and hydralazine administration groups as compared to the SHR / NDmc-cp (fat / fat) vehicle administration group. The high dose olmesartan administration group (P <0.01) and the hydralazine administration group (P <0.05) were statistically significant.
In SHR / NDmc-cp (fat / fat) rats, renal pentosidine concentration was significantly correlated with urinary protein (y = 0.22x + 34.11, n = 38, r2 = 0.462). , P <0.001) (FIG. 3A). The correlation between systolic blood pressure and urinary protein was y = 1.28x + 20.77, n = 38, r2 = 0.126, P <0.05 (FIG. 3B), systolic blood pressure and renal pentosidine. The correlation of the concentrations was y = 0.51x + 6.25, n = 38, r2 = 0.173, and P <0.05 (FIG. 3C), all of which showed significant correlations.
[0064]
[Table 5]

Data are shown as mean ± SE.
^a The test value of Student's t-test for SHR (vehicle administration group) was P <0.01.
^b Test value by Student's t-test for WKY is P <0.01
^c The test value of SHR / NDmc-cp (fat / fat) (vehicle administration group) by Tukey's test was P <0.05.
^d The test value of SHR / NDmc-cp (fat / fat) (vehicle administration group) by Tukey's test was P <0.01.
[0065]
[Example 8] AGE inhibitory action in vitro
As the present inventors previously studied the mechanism of action of in vitro such as olmesartan (Miyata T, et al., J Am Soc Nephrol, in press.), The mechanism of action of hydralazine was examined in vitro. . In vitro pentosidine production (FIG. 4A) and Nε-carboxymethyl lysine (CML) (FIG. 4B) in non-diabetic dialysis patient plasma were inhibited by hydralazine in a concentration-dependent manner (IC50 of pentosidine and CML was 0%). .52 mM and 0.77 mM). The same AGE was observed when bovine serum albumin was incubated in the presence of 10 mM arabinose in non-renal failure diabetic plasma, diabetic dialysis patient plasma, or 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.4). An inhibitory effect on production was observed (data not shown).
[0066]
Furthermore, the mechanism of action of hydralazine on the inhibitory effect on AGE formation was examined. Hydralazine, like aminoguanidine, effectively captured RCO (FIG. 4C) and pyridoxal 5′-phosphate (FIG. 4D), which are precursors of AGEs such as glyoxal and methylglyoxal. This phenomenon was caused by Olmesartan (Miyatatan). T, et al., J Am Soc Nephrol, in press.). Hydralazine also has a reducing effect on oxidation. Like olmesartan, hydralazine exhibited a carbon center radical scavenging effect, which was in contrast to aminoguanidine (FIG. 4E). Furthermore, hydralazine was found to have a hydroxyl radical scavenging effect (FIG. 4F), whereas aminoguanidine had a slight scavenging effect. In addition, hydralazine has a chelating effect on copper ions, and suppressed autoxidation of ascorbic acid by suppressing the Fenton reaction (IC50 = 1.3 mM).
[0067]
Example 9 Effect of Olmesartan on ER Stress: Method for Measuring ER Stress (Staining of ER Stress Protein)
In SHR / NDmc-cp rats, WKY rats and SHR rats as controls, olmesartan (CS-866; Sankyo), an angiotensin receptor antagonist (ARB), was forcibly administered with each test substance by sonde for 20 weeks (13 to 33 weeks). Oral administration was conducted to examine the renal protective effect. SHR / NDmc-cp rats (male, 11 weeks old), WKY (male 11 weeks old) and SHR (male, 11 weeks old) were received from Japan SLC and acclimated for 1 week. A total of four groups including the control were examined (10 animals per group). During the administration period, body weight measurement, blood collection, urine collection and blood pressure measurement are performed. For morphological analysis, morphological observation and evaluation of glomeruli (glomerular hypertrophy, glomerular sclerosis, tubular injury, etc.) were performed using kidney tissue sections. Twenty weeks after the administration of the test substance, dissection (after blood collection, excision and weight measurement of the kidney) was performed, and the kidney was used for biochemistry and pathology, respectively.
[0068]
Kidney tissues extracted from SHR / NDmc-cp rats were fixed using 10% formalin, and embedded in paraffin to prepare paraffin blocks of kidney tissues. The paraffin block was sliced with a microtome to obtain a tissue-stained sample. After deparaffinization, anti-GRP78 (polyclonal antibody: SANTA CRUZ) or anti-ORP150 (polyclonal antibody: donated by Professor Kagawa Ogawa) was used as the primary antibody. After O / N at 4 ° C., the plate was washed once with PBS for 5 min and reacted with a secondary antibody. When the primary antibody was GRP78, an anti-goat biotin antibody (DAKO) was used, and when the primary antibody was ORP150, an anti-rabbit biotin antibody (ZYMED) was used. After reacting at room temperature for 1 hr, the plate was washed once with PBS for 5 min and then developed with avidin-peroxidase (VECTOR) (30 min). For color development, the plate was washed with 0.05 M Tris-HCl pH 7.6 for 5 min, and then washed with a Tris-HCl solution containing DAB (0.1 mg / mL) and aqueous hydrogen peroxide (0.03%) at 37 ° C For 10 min. The color reaction was stopped with water. Further, nuclear staining was performed with methyl green (Vector).
[0069]
The results of immunostaining using the GRP78 antibody and the ORP150 antibody are shown in FIGS. GRP78, an endoplasmic reticulum stress marker, could not be confirmed at all in glomeruli of WKY and SHR as controls. However, administration of olmesartan almost completely abolished GRP78 to SHR / NDmc-cp rats. ORP150 also showed similar results.
As described above, the increase and decrease of GRP78 and ORP150 chaperone proteins, which are ER stress markers, correlated with proteinuria and the degree of glomerular sclerosis, supporting the relationship between diabetic nephropathy and ER stress.
In addition, in the SHR / NDmc-cp rat of the present invention, the endoplasmic reticulum stress disappeared by administration of olmesartan having a renal protective effect, and thus the SHR / NDmc-cp rat is expected to have an effect of improving the endoplasmic reticulum stress, particularly a renal protective effect. It was found that the compound is useful for screening as a therapeutic agent.
[0070]
[Table 6]

【The invention's effect】
The present invention provides a method for evaluating the action of inhibiting the production of endoplasmic reticulum stress in SHR / NDmc-cp rats. SHR / NDmc-cp rats exhibit enhanced ER stress. The present inventors have confirmed that administration of a compound having a renal protective effect to SHR / NDmc-cp rats actually reduces endoplasmic reticulum stress. This indicates that the SHR / NDmc-cp rat has renal damage derived from endoplasmic reticulum stress and is useful for treating a disease in which the production of endoplasmic reticulum stress is one of the causes. It is useful as a tool for evaluating the effects of various compounds. The use of SHR / NDmc-cp rats allows for the evaluation of compounds that act more effectively on disease mechanisms occurring in vivo.
For example, it is easy to simply reproduce a hyperglycemic state in vitro. However, in practice, there are various conditions to be considered before a compound is administered to a living body and exerts a therapeutic effect in the living body. Therefore, a method capable of evaluating a therapeutic effect in a living body is useful in developing a method for treating a disease caused by endoplasmic reticulum stress.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a photograph of a typical glomerular disorder. A; shows glomerular sclerosis observed in a small number of glomeruli in SHR rats. Arrows indicate typical cures. B: shows glomeruli of control WKY rats. C; shows higher glomerular sclerosis in SHR / NDmc-cp (fat / fat) rats. D: Reduction of glomerular damage in the high dose olmesartan administration group of SHR / NDmc-cp (fat / fat) rats.
FIG. 2 shows photographs (200 ×) of immunostaining of 4-hydroxynonenal protein adducts (A, B) generated by lipid peroxidation and pentosidine (CE), which is an AGE. A: Accumulation of 4-hydroxynonenal protein adducts in glomeruli of the vehicle-administered group of SHR / NDmc-cp (fat / fat) rats. B: Photograph showing that no 4-hydroxynonenal protein adduct was observed in the high dose olmesartan administration group of SHR / NDmc-cp (fat / fat) rats. C: Accumulation of pentosidine in the tubules of the vehicle-administered group of SHR / NDmc-cp (fat / fat) rats. D: Photograph showing the accumulation of pentosidine in the arterial wall of SHR / NDmc-cp (fat / fat) rats. E: Photograph showing that pentosidine was not observed in the high dose olmesartan administration group of SHR / NDmc-cp (fat / fat) rats.
FIG. 3: Correlation between urinary protein and renal pentosidine concentration, B: systolic blood pressure and protein in SHR / NDmc-cp (fat / fat) rats in the vehicle administration group and the antihypertensive drug administration group Graph showing correlation between urine and C; systolic blood pressure and renal pentosidine concentration.
FIG. 4 is a graph showing that hydralazine suppresses the generation of AGEs in vitro. The control without drug was taken as 100%. The results are shown as mean ± SE.
A: shows the effect of inhibiting the production of pentosidine by hydralazine when nondiabetic dialysis patient plasma is incubated. B: Inhibition of CML generation by hydralazine when nondiabetic dialysis patient plasma is incubated. C: shows capture of a dicarbonyl compound by hydralazine. D shows capture of pyridoxal 5'-phosphate (PLP) by hydralazine. E: Shows the elimination action of ribose-derived carbon centered radical by hydralazine. The vertical axis shows relative ESR intensities of Nt-butyl-a-phenylnitrone (PBN) and an adduct of ribose-derived carbon centered radical at various drug concentrations in the presence of Chelex (a chelating agent for metal ions). . F: shows the elimination action of hydroxyl radical by hydralazine. The vertical axis indicates the relative ESR signal height of 5,5′-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide (DMPO) OH.
FIG. 5: Immunostaining of kidney tissues of SHR / NDmc-cp rats and control rats using anti-GRP78 antibody (x200)
FIG. 6: Immunostaining of kidney tissues of SHR / NDmc-cp rats and control rats using anti-ORP150 antibody (x200)

Claims

A method for evaluating an endoplasmic reticulum stress improving agent, comprising the following steps.
(1) a step of administering a test substance to SHR / NDmc-cp rats before and / or after exhibiting type 2 diabetes-like symptoms;
(2) measuring the level of ER stress production in SHR / NDmc-cp rats; and (3) improving the ER stress when the test substance has an action of suppressing the level of ER stress generation Step of evaluating to have an effect

A method for screening a compound that can be used for treatment and / or prevention of a disease caused by the production of endoplasmic reticulum stress, comprising the following steps.
(A) a step of evaluating the endoplasmic reticulum stress-ameliorating effect of the test substance by the method according to claim 1, and (b) a step of selecting a test substance having a greater endoplasmic reticulum stress-imparting effect as compared with a control.

3. The method according to claim 2, wherein the disease caused by the production of ER stress is a renal disease.

A pharmaceutical composition for treating and / or preventing a disease caused by the production of endoplasmic reticulum stress, comprising a compound that can be selected by the method according to claim 2 as an active ingredient.