JP2004300328A - Functional polymer compound and biosensor using the same - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a biosensor obtained by immobilizing a molecule derived from an organism such as an enzyme on a substrate such as carbon by using a polymer compound having maleimide groups on the side chains. <P>SOLUTION: The surface of a carbon electrode having many reactive residues on the surface is modified with amino groups by using APTES (γ-aminopropyltriethoxysilane) and the surface of the carbon electrode is modified with polymaleimidestyrene (PMS) by reacting the amino groups with parts of maleimide groups which are side chains of PMS, and further, the enzyme is immobilized by using the residue of maleimide groups which are the side chains of PMS. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００９】
本発明のバイオセンサは、基材と、該基材に物理的または化学的に固定され、側鎖にマレイミド基を有する高分子化合物と、該高分子化合物の側鎖のマレイミド基の少なくとも一部に化学的に結合された１級アミノ基、２級アミノ基またはチオール基を有する生体由来分子とを具備することを特徴とするものである。
【００１０】
前記生体由来分子は例えば酵素及び／又は該酵素の電極反応を促進する電子移動メディエータである。
【００１１】
前記基材は、例えば端面に反応性残基を実質的に有する炭素電極である。
【００１２】
前記基材は、また例えば炭素多孔体である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、例えばポリマレイミドスチレン（ＰＭＳ）のマレイミド基がチオール基だけでなくリジンとも速やかに結合することができることを実証し、ＰＭＳが酵素の簡便迅速な固定化材料として極めて有用であることを見いだしたことに基づいている。酵素のチオール基およびリジン残基のアミンとポリマーの結合反応式を図１に示す。なお、図には１級アミンとの結合が示されているが、ＰＭＳは２級アミンとも結合する。
【００１４】
本発明によれば、ＰＭＳを被覆したカーボン電極やガス透過性膜を有するセンサを酵素溶液に浸すだけで極めて簡便迅速に酵素センサを作製することができる。さらにＰＭＳとカーボンなどの電極表面への被覆状態の安定性の向上を図るため、図２のようにカーボン電極表面にアミノ基を修飾してＰＭＳと結合させれば長期間ポリマーが脱離することなく使用できる。
【００１５】
この場合に、電極材料として、高分子樹脂に黒鉛を混合し、黒鉛の結晶を一方向に配向させつつ成形した後、焼成して得られるＰＦＣ（Ｐｌａｓｔｉｃ Ｆｏｒｍｅｄ Ｃａｒｂｏｎ）は、端面に多数の反応性残基が存在するので、アミノ基による修飾に適する。図３にＰＦＣ電極表面をＡＰＴＥＳ（γ−アミノプロピルトリエトキシシラン）を用いてアミノ基で修飾し、次いでＰＭＳで修飾し、さらに酵素で修飾する過程を示す。
【００１６】
ＰＭＳはクロロホルムなどの極性のある有機溶媒に溶けて均一溶液となる。そこでＰＭＳの均一溶液を用いてＰＭＳを被覆させた多孔性膜を作製すればこの膜をタンパク溶液に浸すだけで酵素や抗体が固定でき、各種電極やセンサデバイスに装着することによって酵素反応や抗原抗体反応に関与する反応物や生成物を検出する方式のセンサが作製できる。
【００１７】
【実施例】
１．前駆体ポリマーの合成
（実施例１）
前述の非特許文献１の記載に従い、Ｎ−（ｐ−ビニルフェニル）マレイミド（ＶＰＭＩ）＝２．５×１０^−２ ｍｏｌ／Ｌ、ＢＦ_３ ・Ｏ（Ｃ_２Ｈ_５）_２ ＝１．０×１０^−２ ｍｏｌ／Ｌの濃度で窒素下、フラスコにてジクロロメタン中、０℃で１２時間重合を行った。
【００１８】
重合はメタノールを加えて停止し、その後大量のメタノール中に投入して、沈澱したポリマーを回収した。その後ジクロロメタンに再度溶解、メタノールに再沈澱することによりポリマーを精製し、ろ過後減圧乾燥にてポリマーを単離した。
【００１９】
収率：５６％、
数平均分子量＝１．０×１０^５
数平均分子量はＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィ）にて単分散ポリスチレンを用いた検量線により測定した。
【００２０】
ＮＭＲにて構造を解析した。 ^１Ｈ ＮＭＲ：ＶＰＭＩに観測された、６．８ｐｐｍ のビニレン基の吸収（２Ｈ）は線幅が広がるものの化学シフトおよび吸収強度に変化なく、５．３，５．８、および６．７ｐｐｍ のビニル基の吸収は消失、新たに１．４−２．５ｐｐｍ にポリマー主鎖のメチン、メチレンの吸収（３Ｈ）が観測された。
【００２１】
以上からポリマレイミドスチレン（ＰＭＳ）が合成されたと確認した。
（実施例２）
下式（３）の構造を有するｐ−マレイミドスチレンオキシド（ＭＩＳＯ）を次のようにして合成した。
【００２２】
還流冷却器を付けた２００ｍｌ二口フラスコにクロロホルム２０ｍｌに溶解させた５．５ｍｍｏｌ（１．０２ｇ）のｐ−マレイミドスチレンを入れ、そこへクロロホルム３０ｍｌに溶解させた８．８ｍｍｏｌ（１．５１ｇ）のｍ−クロロ安息香酸を室温で２．５時間かけて滴下した。滴下終了後、加熱しクロロホルム還流下反応させた。反応はガスクロマトグラフィーで追跡し、原料のｐ−マレイミドスチレンが完全に反応しガスクロマトグラフィー上ピークが観測されなくなるまで反応を行った。その後２０％亜硫酸ナトリウム水溶液、１０％炭酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて後処理し、溶媒のクロロホルムを除去することにより、淡黄色の固体として生成物であるｐ−マレイミドスチレンオキシドを得た。収量２９６ｍｇ、収率２４．９％。
【００２３】
^１Ｈ ＮＭＲ：２．７，３．０ｐｐｍ （ｄ，１Ｈ，ｄ，１Ｈ、エポキシ環内のメチレン水素）、３．８ｐｐｍ （ｄ−ｄ，１Ｈ エポキシ環内のメチレン水素）、６．８ｐｐｍ （ｓ，２Ｈ イミド環内のビニレン水素）、７．２５〜７．３４ｐｐｍ （ｍ，４Ｈ，ｐ−ジ置換フェニル）。
【００２４】
【化３】

【００２５】
１０ｍｌのジクロロメタンにＭＩＳＯ ２１５ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、ＢＦ_３ ・Ｏ（Ｃ_２ Ｈ_５ ）_２ ５．６８ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）を入れ、−１０℃で２４時間反応させた。反応はメタノールにて停止し、大量のメタノール中に投入してポリマーを沈澱させ単離した。得られたポリマーは下図のような構造のｐｏｌｙ（ＭＩＳＯ）であった。
【００２６】
【化４】

【００２７】
収量１５０ｍｇ、収率６９．８％。
【００２８】
^１Ｈ ＮＭＲ：２．７，３．０ｐｐｍ （ｄ，１Ｈ，ｄ，１Ｈ、エポキシ環内のメチレン水素）及び、３．８ｐｐｍ （ｄ−ｄ，１Ｈ エポキシ環内のメチン水素）が消失。かわって、３．７〜４．２ｐｐｍ にポリマー主鎖のオキシエチレン（３Ｈ）に由来するピークを観察した。６．８ｐｐｍ （ｓ，２Ｈ イミド環内のビニレン水素）、７．２〜７．４ｐｐｍ （ｍ，４Ｈ，ｐ−ジ置換フェニル）の吸収は変化なく観測された。
２．機能性高分子合成とキャラクタリゼーション
（実施例３）
実施例１にて合成したポリマレイミドスチレン０．２ｇ（マレイミドユニット１．０×１０^−３ｍｏｌ ）を５０ｍｌのクロロホルムに溶解させたポリマー溶液と、Ｌ−システイン１．２ｇ（１．０×１０^−２ｍｏｌ ）を純水１００ｍｌに溶解させた溶液を分液ロートにて１０分間振盪した。水層と有機層の境界面に白色のレイヤーが出現し、それを回収、純水およびクロロホルムにて３回洗浄後乾燥し、目的物を単離した。
（実施例４）
実施例１にて合成したポリマレイミドスチレン０．２ｇ（マレイミドユニット１．０×１０^−３ｍｏｌ ）を５０ｍｌのクロロホルムに溶解させたポリマー溶液と、Ｌ−リジン１．５ｇ（１．０×１０^−２ｍｏｌ ）を純水１００ｍｌに溶解させた溶液を分液ロートにて１０分間振盪した。水層と有機層の境界面に白色のレイヤーが出現し、それを回収、純水およびクロロホルムにて３回洗浄後乾燥し、目的物を単離した。
（実施例５）
実施例１にて合成したポリマレイミドスチレン０．２ｇ（マレイミドユニット１．０×１０^−３ｍｏｌ ）を５０ｍｌのクロロホルムに溶解させたポリマー溶液にカーボンフェルトに浸し引き上げ乾燥させた。そのポリマー被覆カーボンフェルトを１ｇ／Ｌのウレアーゼ水溶液に１０分間浸漬後引き上げ、十分に純水にて洗浄した後、さらに純水中で超音波を照射、洗浄することにより物理的な吸着物を全て洗い流すことによりカーボンフェルト上に目的物を生成させた。
（実施例６）
実施例３にて合成した目的物をＮＭＲとＩＲにてキャラクタリゼーションした。
【００２９】
^１Ｈ ＮＭＲ：６．８ｐｐｍ に観測されたビニレン基の吸収は消失し、３．５−４．５ｐｐｍ に新たにスクシンイミド環内のメチレンおよび硫黄原子に隣接したメチン水素が観測され、システイン由来の吸収もそれぞれ観測された。また主鎖のメチン、メチレンの吸収もそれぞれ観測された。
【００３０】
ＩＲ：２７００〜３５００ｃｍ^−１および３４００ｃｍ^−１付近にそれぞれアミノ酸のカルボキシル基とアミノ基の吸収が観測された。前駆体ポリマーであるポリマレイミドスチレンに存在した１６７８ｃｍ^−１のビニレン基の二重結合由来の吸収はシステインのメルカプト基が二重結合に反応し、共有結合にて付加するため観測されなかった。
【００３１】
また、ニンヒドリン反応に対しても陽性であった。
【００３２】
従って、得られた物質は下式（５）の構造を有すると結論できる。
【００３３】
【化５】

【００３４】
（実施例７）
実施例４にて得られた高分子化合物も実施例３と同様な解析により、スクシンイミド環にリジンのアミノ基が付加共有結合を形成した下式（６）の構造を有する化合物であることが明かとなった。
【００３５】
【化６】

【００３６】
（実施例８）
実施例５にて得られた高分子化合物については、物理的吸着を排除した後の生成物がニンヒドリン反応に対して明白な陽性を示すことに加え、実施例６および実施例７でアミノ酸のメルカプト基またはアミノ基が前駆体ポリマー（ポリマレイミドスチレン）のマレイミド基の二重結合に付加しスクシンイミド環に共有結合することが明らかになっていることおよびウレアーゼはタンパク質すなわちポリアミノ酸であることを考慮すると、ウレアーゼの有するメルカプト基および／またはアミノ基がマレイミドの二重結合と反応し、スクシンイミド環にウレアーゼが共有結合して、下式（７）の構造をした高分子化合物が生成したことは明白である。
【００３７】
【化７】

【００３８】
（実施例９）
同様な方法にて、実施例２で合成したｐｏｌｙ（ＭＩＳＯ）のクロロホルム溶液とＬ−システインの水溶液または、ウレアーゼ水溶液を分液ロート中で振盪することにより機能性高分子化合物を合成した。生体由来分子がマレイミド環のビニレン基に付加反応し、スクシンイミド環の構造を有するポリマーが生成したことは、実施例６，７と同様な方法にて確かめた。
３．ＰＦＣ電極の作製
（実施例１０）
塩素化塩化ビニル樹脂（日本カーバイド社製Ｔ−７４１）３０部、フラン樹脂（日立化成社製ヒタフランＶＦ−３０２）４５部、の混合樹脂系を用い、これに黒鉛微粉末（日本黒鉛社製ＳＰ−３００Ｓ平均粒度２μｍ）２５部を複合した組成物１００部に対し、可塑剤としてジアリルフタレートモノマー２０部を添加して、ヘンシェル・ミキサーを用いて分散した後、表面温度を１２０℃に保ったミキシング用二本ロールを用いて十分に混練を繰り返してシート状組成物を得、ペレタイザーによってペレット化し成形用組成物を得た。このペレットをスクリュー型押出機で直径３．６ｍｍのダイスを用い脱気を行いつつ１３０℃で３ｍ／秒の速度で押し出し、これを枠に固定して、１８０℃に加熱されたエアー・オーブン中で１０時間処理してプリ・カーサー（炭素前駆体）線材とした。次に、これを窒素ガス中で５００℃までを１０℃／ｈ、５００℃から１０００℃迄を５０℃／ｈの昇温速度で昇温し、その後１５００℃迄を１００℃／時で昇温し、１５００℃で３時間保持した後自然冷却することで断面部直径３ｍｍの円柱状カーボン電極を得た。
【００３９】
得られたカーボン電極の細孔直径を、湯浅アイオニクス社製ポロシメーター（オートスキャン−６０）を用いて水銀圧入法により測定した結果、最大細孔直径は１２０オングストロームであった。電極特性としては、柳本製ポーラログラフィクアナライザー（ＹＡＮＡＣＯ Ｐ−１１００）を使用し、電極反応活性の目安として５×１０^−３Ｍ Ｆｅ（ＣＮ）_６ ^４− と１Ｍ ＫＣｌ系中でのフェロ／フェリシアンイオンのレドックス反応性を観察した結果、特別な前処理を施さなくてもブランク電流は小さく、シャープな酸化波、還元波のピークが得られ、ピーク電位の差ΔＥｐは理論値に近似した。又、電解液の侵入に伴なう電流値の増加は見られず、実質的にガラス状炭素並の電解液不浸透性を示した。
４．炭素多孔体の作製
（実施例１１）
フラン樹脂初期縮合物（日立化成社製 ヒタフランＶＦ−３０２）７５部に、乾留ピッチ（呉羽化学工業社製 ＫＨ−１Ｐ）５部、平均粒径１μｍの天然鱗状黒鉛微粉末（日本黒鉛社製 ＣＳＳＰ−Ｂ）２０部を加え、ミキサーで混合して液状組成物を調製した。次いで、三次元網目構造を有し気孔率６０％のポリウレタンフォームに上記液状組成物を含浸させた。余剰の液状組成物を取り除いた後１００℃乾燥機中で３時間かけ硬化反応させた。次に、１８０℃乾燥機中で１０時間かけ炭素前駆体化処理を行なった。この前駆体処理物を、窒素ガス中で５００℃迄を２０℃／ｈの昇温速度で昇温し、その後１０００℃迄を１００℃／ｈで昇温し、１０００℃で３時間保持した後自然冷却して炭素多孔体を得た。
５．ポリマレイミドスチレンを酵素固定化担体とするポテンショメトリックバイオセンサ
（実施例１２）
アンモニア検出型ウレアーゼ固定化尿素センサ
クロロホルムに溶解したポリマレイミドポリスチレン（ＰＭＳ）溶液をアンモニア電極のアンモニアガス透過性膜上に浸して乾燥させた後、ウレアーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ ｆｒｏｍ Ｊａｃｋｂｅａｎ）に３０分浸漬し、ウレアーゼを結合させた。そして０．０１Ｍジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）溶液に３０分浸して酵素を活性化させた。ウレアーゼは酵素活性の発現にＳＨ基が不可欠なＳＨ酵素として良く知られており、固定化段階で一部ＳＨ基が酸化されてジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成して失活している酵素分子があり、Ｓ−Ｓ結合切断試薬であるジチオスレイトールを加えて酵素活性を再生させた。この酵素修飾アンモニアガス透過性膜を装着したアンモニア電極の構造を図４に示す。このセンサをｐＨ８の０．１Ｍリン酸緩衝液に入れてバックグランド電位が安定した後尿素を加えたところ、尿素濃度に応じた電位変化が生じた。尿素が加水分解されてアンモニアと炭酸ガスを生じる反応は（８）式に示す通りである。
【００４０】
尿素 ＋ Ｈ_２ Ｏ → ２ＮＨ_３ ＋ ＣＯ_２ （８）
試料添加から２０分程度で電位応答が定常値となったが、この応答速度はＰＭＳの膜圧によって大きく変化する。センサ作製してから３日後に得られた検量線を図５に示す。検量線の傾きは５５ｍＶ／ｄｅｃａｄｅとほぼネルンスト応答を示した。また毎日検量線の作成実験を行ったところ１週間後に３０％の応答減少が生じた。これは主としてポリマーの隔膜からの離脱が関係しているものと考えられるので担体表面へのアミンの導入などを行ってポリマーの強固な担体への固定を行う必要がある。
【００４１】
またウレアーゼは表面にＳＨ基を有することが知られており、ウレアーゼのチオール基の炭素電極における酸化で活性が失われることを本願発明者の内山らは見いだしている（Ｓ． Ｕｃｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｕｒｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒ ｏｎ ｔｈｅ Ｃａｒｂｏｎ Ｆｅｌｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ”， Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ ２００２， １４ ｐｐ．１６４４−１６４７）。さらにウレアーゼを金網に吸着固定させたところ、活性を保持した状態で金に結合することがわかり、またシステインとほぼ同じ電極酸化波を有することから、ウレアーゼ自身のＳＨ基がマレイミドと反応して固定化されたものと考えられる。なぜならＳＨ基とマレイミドの反応速度の方がリジン残基とマレイミドのそれより極めて大きいことが知られているからである。さらに水晶振動子センサを用いて金表面にウレアーゼが直接結合あるいは強い吸着をすることを確認している。従って、ウレアーゼのように酵素表面にチオール基を有するタンパクは自身のチオール基で結合させることができるが、これまで天然のタンパク分子の表面のチオール基を用いて固定化したとの報告は見受けられない。
（実施例１３）
二酸化炭素検出型ウレアーゼ固定化尿素センサ
クロロホルムに溶解したポリマレイミドスチレン（ＰＭＳ）溶液にカーボンフェルトを浸して乾燥された後ウレアーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）に３０分浸漬し、ウレアーゼを結合させた。そして炭酸ガス電極のガス透過性膜上に装着し、二酸化炭素検出型尿素センサを作製した。このセンサも上述のアンモニア電極を検出電極とするセンサと同様に電位応答が得られた。検量線の傾きが４０ｍＶ／ｄｅｃａｄｅと小さかったが、応答時間が５〜１０分程度と迅速であった。なお、このセンサの応答は作成してから３０日後に約５０％の減少が見られたもののアンモニアガスの隔膜上に被覆させた時よりもより安定であった。これはポリマー鎖とカーボンフェルト表面の親和力の方がポリマー鎖とガス透過性膜のそれより強いことに起因していると考えられる。
（実施例１４）
アデノシンデイミナーゼ固定アデノシンセンサ
カーボンペーパーを１ｍｇ／ｍｌのポリマーのクロロホルム溶液１ｍｌに浸し、乾燥させ、ポリマー被覆カーボンペーパーを作製した。次にアデノシンデイミナーゼ溶液（ｐＨ７のリン酸緩衝液）に３０分浸けた後水洗し、アンモニアガス透過性膜上に装着した。この電極を緩衝液中に入れ、電位が安定した後、アデノシン溶液を段階的に加えて電位応答を記録した。検量線の傾きは約４０ｍＶ／ｄｅｃａｄｅ応答時間は２０分程度であった（図６）。アデノシンデイミナーゼも迅速にＰＭＳと結合するので表面に存在するＳＨ基とポリマーが結合したものと考えられる。アデノシンの酵素による加水分解反応は（９）式の通りである。なおセンサ応答は３週間ほとんど低下しなかった。
【００４２】
アデノシン ＋ Ｈ_２ Ｏ → イノシン ＋ ＮＨ_３ （９）
６．ポリマレイミドスチレンに電子移動メディエータを固定した機能性電極
（実施例１５）
ドーパミン結合ＰＭＳ修飾ＰＦＣ（Ｐｌａｓｔｉｃ ｆｏｒｍｅｄ ｃａｒｂｏｎ）電極によるアスコルビン酸の電極酸化触媒波の測定
１ｍｇ／ｍｌのＰＭＳクロロホルム溶液中にＰＦＣ電極を浸して乾燥させ、ＰＭＳを被覆した後、０．０１Ｍドーパミン溶液（ｐＨ９．０リン酸緩衝液）に３０分浸してドーパミンの側鎖のアミノ基をマレイミドに固定化させた。このドーパミン固定化電極を用いて０．１ｍＭアスコルビン酸溶液（ｐＨ７．０）のサイクリックボルタンメトリーを行ったところ、アスコルビン酸の電極酸化メディエータ電流が観察された。全くＰＭＳ処理をしていないＰＦＣ電極では溶液に浸されている電極面積が大きいので大きな容量性電流があらわれているのに対し、ＰＭＳ被覆電極では小さな容量性電流となった。しかし、アスコルビン酸の電解酸化電流が前置波として現れた。この前置波は固定化されたドーパミンが電解酸化されて生成するドーパミンキノンがアスコルビン酸に還元再生されることにより発生したものである。固定化反応を図７に示す。
７．ＰＦＣ電極に被覆したＰＭＳを酵素固定層とするアンペロメトリック酵素センサ
（実施例１６）
ＰＦＣ電極を研磨しエッジ面をろ出させた後、ＰＭＳ塩化メチレン溶液をディップコーティングした。その後チロシナーゼ（ポリフェノールオキシダーゼ）（０．２５ｍｇ／ｍｌ）溶液（ｐＨ６．５リン酸緩衝液）と反応させ、チロシナーゼを固定化した。これを作用極として銀塩化銀電極を参照極、白金線を対極として−０．０５Ｖで定電位アンペロメトリーを行った。電解液には０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．５ １０ｍｌを用い、撹拌子により溶液を一定測度で撹拌しながら、測定対象となるチロシナーゼ基質の標準液を所定量添加した。本センサではチロシナーゼ触媒反応によりカテコール化合物またはフェノール化合物から生じたｏ−キノン化合物をＰＦＣ電極で電解還元再生することにより図８に示すような循環反応が生じ、カテコールまたはフェノール化合物などのチロシナーゼ基質を高感度に測定することができる。この応答は迅速であり、５〜１０秒程度で定常値に達した。また図３を参照して説明したように、あらかじめＡＰＴＥＳ処理によりＰＦＣ電極にアミノ基を導入後ＭＰＳを被覆すると、測定感度が増大するとともに、連続測定に対する安定性が向上した。図９にＡＰＴＥＳ処理をしない場合とした場合のカテコールの検量線を示す。
【００４３】
測定可能なフェノール化合物の例としては、フェノール、クロロフェノール、アミノフェノール、クレゾールなどが挙げられ、測定可能なカテコール化合物の例としては、カテコール、ドーパミン、Ｌ−ドーパ、アドレナリン、カフェイン酸などが挙げられる。
【００４４】
また、上記チロシナーゼ基質を一定量添加し定常電流値が得られたところでＣＮ⁻ ，Ｎ３⁻ ，ＳＣＮ⁻ 、安息香酸、コウジ酸、アトラジンなどの酵素阻害剤を加えることで、その阻害電流から各種阻害剤の測定も可能であった。
【００４５】
ＰＦＣに酵素のチロシナーゼと同様にチオニンなどのチオール基、１級アミノ基、２級アミノ基を有する電子移動メディエータを同時に固定化することも可能であり、これにより、感度の向上を達成することができた。
（実施例１７）
実施例１６と同様にＰＦＣ電極にＰＭＳをコーティングした後、さらに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１ｍｇ／ｍｌ）とチオニン（０．１ｍＭ）の混合溶液に浸し酵素およびチオニンを固定化した。この応答は、電子メディエーターをＰＭＳに同時に固定することにより著しく向上した。
【００４６】
図１０に示すように、過酸化水素とペルオキシダーゼの反応（１）で生じた２種の酸化型ペルオキシダーゼ中間体は、電子メディエータ（フェノチアジン・フェノオキサジン系電子メディエータ）により順次還元され（２）酵素が再生される。−０．２Ｖ（ｖｓ．Ａｇ．ＡｇＣｌ）で、電子メディエータの還元電流（３）を検出した。
【００４７】
ペルオキシダーゼとチオニンまたはトルイジンブルーを同時にＰＭＳに固定化すると、上記反応スキームにより過酸化水素濃度に依存した定常電流応答を得ることができた。ＰＭＳの膜厚により若干応答速度は異なるが、過酸化水素に対する応答時間は１０秒以内と迅速である。
【００４８】
また、メルドラブルー、メチレンブルーはＰＦＣ電極に強く吸着するため、ＰＦＣにあらかじめこれらを吸着させた後、ＰＭＳを被覆し、ＨＲＰを固定しても同様にセンサを構築できた。電子メディエータを用いず、ＨＲＰのみを固定化しても酸素中間体と電極間の直接電子移動反応に基づく電流応答が得られたが、感度は、メディエーターを同時固定した場合の１／１００程度であった。
８．多孔性カーボン電極に被覆したＰＭＳを酵素固定層とするフロー型バイオセンサ
（実施例１８）
炭素多孔体や多孔性カーボンフェルト（ＣＦ）をフロー型検出器の作用極として用いることで実施例１６〜１７の反応はすべて、図１１に示すようなフロー型バイオセンサに応用可能である。この場合にも炭素多孔体および多孔性ＣＦをＰＭＳで被覆した。さらにチロシナーゼおよびＨＲＰを固定化し、それぞれカテコール（またはフェノール）センサ、過酸化水素センサを構築した。またアミノ基を有するチオニンをＰＭＳに酵素と同時に固定化することで感度の著しい増加が得られた。特にチロシナーゼ・チオニン系ではｐ−クロロフェノールに対して１０ｎＭまで計測可能であった（図１２、図１３）。ＡＰＴＥＳ処理による感度増幅および再現性の向上も認められた（図１４）。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＭＳとチオール基またはアミノ基を有する酵素との結合反応を示す図である。
【図２】炭素電極表面に修飾したアミノ基とＰＭＳとの結合を示す図である。
【図３】ＡＰＴＥＳを用いた炭素表面のアミノ基による修飾、そのＰＭＳによる修飾、さらにＰＭＳ−酵素による修飾の過程を示す図である。
【図４】酵素で修飾されたアンモニアガス透過膜を装着したアンモニア電極を示す図である。
【図５】図４のセンサにおける、透過膜に固定化されたウレアーゼによる尿素の検量線を示すグラフである。
【図６】図４のセンサにおける、透過膜に固定化されたアデノシンデイミナーゼによるアデノシンの検量線を示すグラフである。
【図７】電子移動メディエータとしてのドーパミンのＰＭＳへの固定化反応を示す図である。
【図８】ＰＭＳによりＰＦＣ電極に固定化されたチロシナーゼによる循環反応を示す図である。
【図９】ＰＦＣ電極をアミノ基で修飾した場合と修飾しない場合の測定感度を示すグラフである。
【図１０】ＨＲＰとチオニンの循環反応による過酸化水素の検出の反応を示す図である。
【図１１】フロー型バイオセンサの構成を示す図である。
【図１２】図１１のセンサにおけるｐ−クロロフェノールの測定結果を示すグラフである。
【図１３】図１２の結果に基づくｐ−クロロフェノールの検量線を示すグラフである。
【図１４】ＡＰＴＥＳ処理による感度増幅および再現性の向上を示すグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a functional polymer in which a biological molecule such as an enzyme or an electron transfer mediator is chemically bonded to a side chain, and a biosensor in which the functional polymer is immobilized on a base material or a carbon electrode.
[0002]
[Prior art]
Until now, many techniques for immobilizing proteins by chemical bonding utilizing the reactivity of functional groups such as lysine residues and carboxyl groups present on the protein surface have been developed. However, until now, functional groups that react with these functional groups must be modified in advance on the immobilization carrier. For example, introduction of aminoallyl groups on the surface of glass beads, diazotization thereof, and modification with glutaraldehyde are well known. However, all of them have considerable complications.
[0003]
It is known that a maleimide chemically bonds to a thiol group very quickly. Conventionally, a thiol group is introduced into a protein such as an enzyme or an antibody to bond the maleimide. However, maleimides used for protein immobilization are limited to monomers and low molecular weight compounds, and there is no report on protein immobilization using a polymer having a maleimide group densely on the surface.
[0004]
Hagiwara, one of the inventors of the present application, in 1991 polymerized the styrene group of N- (4-vinylphenyl) maleimide monomer by cationic polymerization to form a chemically reactive maleimide group densely pendant and insoluble in water. Polystyrene (polymaleimide styrene: PMS) was synthesized and its physical properties were reported (Non-Patent Document 1).
[0005]
[Non-patent document 1]
T. Hagiwara et al. , "Synthesis and Polymerization of N- (4-Vinyl phenyl) maleimide", Macromolecules,24  (1991), p6856-6858.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention focuses on a polymer compound having a maleimide group in a side chain, such as the PMS, a functional polymer using the same, and an enzyme sensor or a functional electrode using the functional polymer. And the like.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The functional polymer compound of the present invention is obtained by adding a biological molecule having a primary amino group, a secondary amino group or a thiol group to at least a part of the repeating unit represented by the following general formula (1). The repeating unit to which the molecule is added is characterized by being represented by the following general formula (2).
[0008]
Embedded image

[0009]
The biosensor of the present invention comprises a substrate, a polymer compound physically or chemically fixed to the substrate and having a maleimide group in a side chain, and at least a part of the maleimide group in the side chain of the polymer compound. And a biologically-derived molecule having a primary amino group, a secondary amino group, or a thiol group chemically bonded to a biological molecule.
[0010]
The biological molecule is, for example, an enzyme and / or an electron transfer mediator that promotes an electrode reaction of the enzyme.
[0011]
The base material is, for example, a carbon electrode substantially having a reactive residue on an end face.
[0012]
The substrate is, for example, a carbon porous body.
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention has demonstrated that, for example, the maleimide group of polymaleimide styrene (PMS) can quickly bind not only thiol groups but also lysine, and that PMS is extremely useful as a simple and quick immobilization material for enzymes. It is based on what you find. FIG. 1 shows the reaction formula for coupling the amine with the thiol group and lysine residue of the enzyme to the polymer. Although the figure shows a bond with a primary amine, PMS also bonds with a secondary amine.
[0014]
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, an enzyme sensor can be manufactured very simply and quickly only by immersing a sensor having a carbon electrode or a gas-permeable membrane coated with PMS in an enzyme solution. Furthermore, if the surface of the carbon electrode is modified with an amino group as shown in Fig. 2 and bonded to PMS, the polymer will be released for a long period of time in order to improve the stability of the coating state of the electrode surface such as PMS and carbon. Can be used without.
[0015]
In this case, PFC (Plastic Formed Carbon) obtained by mixing graphite with a polymer resin as an electrode material, forming the graphite crystal while orienting the graphite crystal in one direction, and firing the resultant, has many reactive surfaces on the end face. Since the residue is present, it is suitable for modification with an amino group. FIG. 3 shows the process of modifying the surface of the PFC electrode with an amino group using APTES (γ-aminopropyltriethoxysilane), then modifying it with PMS, and further modifying it with an enzyme.
[0016]
PMS is dissolved in a polar organic solvent such as chloroform to form a homogeneous solution. Therefore, if a porous membrane coated with PMS is prepared using a uniform solution of PMS, enzymes and antibodies can be immobilized simply by immersing the membrane in a protein solution. Enzyme reactions and antigens can be performed by attaching the membrane to various electrodes and sensor devices. A sensor of a type for detecting a reaction product or a product involved in an antibody reaction can be produced.
[0017]
【Example】
1. Synthesis of precursor polymer
(Example 1)
According to the description of the aforementioned Non-patent Document 1, N- (p-vinylphenyl) maleimide (VPMI) = 2.5 × 10^-2  mol / L, BF₃  ・ O (C₂H₅)₂  = 1.0 × 10^-2  Polymerization was performed at 0 ° C. for 12 hours in dichloromethane in a flask under a nitrogen atmosphere at a concentration of mol / L.
[0018]
The polymerization was stopped by adding methanol, and then poured into a large amount of methanol to recover the precipitated polymer. Thereafter, the polymer was purified by re-dissolving in dichloromethane and re-precipitating in methanol, followed by filtration and drying under reduced pressure to isolate the polymer.
[0019]
Yield: 56%,
Number average molecular weight = 1.0 × 10⁵
The number average molecular weight was measured by GPC (gel permeation chromatography) using a calibration curve using monodispersed polystyrene.
[0020]
The structure was analyzed by NMR.¹1 H NMR: The absorption (2H) of the vinylene group at 6.8 ppm observed by VPMI showed no change in the chemical shift and absorption intensity, although the line width was widened, and the 5.3, 5.8, and 6.7 ppm vinyl groups were absorbed. Disappeared, and the absorption (3H) of methine and methylene in the polymer main chain was newly observed at 1.4 to 2.5 ppm.
[0021]
From the above, it was confirmed that polymaleimide styrene (PMS) was synthesized.
(Example 2)
P-Maleimide styrene oxide (MISO) having the structure of the following formula (3) was synthesized as follows.
[0022]
5.5 mmol (1.02 g) of p-maleimidostyrene dissolved in 20 ml of chloroform was placed in a 200 ml two-necked flask equipped with a reflux condenser, and 8.8 mmol (1.51 g) of 8.8 mmol (1.51 g) dissolved in 30 ml of chloroform was added thereto. m-Chlorobenzoic acid was added dropwise at room temperature over 2.5 hours. After completion of the dropwise addition, the mixture was heated and reacted under reflux of chloroform. The reaction was followed by gas chromatography, and the reaction was continued until the starting material p-maleimidostyrene was completely reacted and no peak was observed on gas chromatography. Thereafter, the product was post-treated with a 20% aqueous sodium sulfite solution, a 10% aqueous sodium carbonate solution and saturated saline, and the solvent, chloroform, was removed to obtain p-maleimide styrene oxide as a pale yellow solid. Yield 296 mg, 24.9%.
[0023]
¹1 H NMR: 2.7, 3.0 ppm (d, 1H, d, 1H, methylene hydrogen in epoxy ring), 3.8 ppm (dd, 1H methylene hydrogen in epoxy ring), 6.8 ppm (s, 2H vinylene hydrogen in imide ring), 7.25 to 7.34 ppm (m, 4H, p-disubstituted phenyl).
[0024]
Embedded image

[0025]
215 mg (1 mmol) of MISO in 10 ml of dichloromethane, BF₃  ・ O (C₂  H₅  )₂  5.68 mg (0.04 mmol) was added and reacted at -10 ° C for 24 hours. The reaction was stopped with methanol and poured into a large amount of methanol to precipitate and isolate the polymer. The obtained polymer was poly (MISO) having a structure as shown below.
[0026]
Embedded image

[0027]
Yield 150 mg, 69.8%.
[0028]
¹1 H NMR: 2.7, 3.0 ppm (d, 1H, d, 1H, methylene hydrogen in the epoxy ring) and 3.8 ppm (dd, 1H methine hydrogen in the epoxy ring) disappeared. Instead, a peak derived from oxyethylene (3H) in the polymer main chain was observed at 3.7 to 4.2 ppm. Absorption of 6.8 ppm (vinylene hydrogen in the s, 2H imide ring) and 7.2 to 7.4 ppm (m, 4H, p-disubstituted phenyl) were observed without change.
2. Functional polymer synthesis and characterization
(Example 3)
0.2 g of the polymaleimide styrene synthesized in Example 1 (maleimide unit 1.0 × 10^-3mol) was dissolved in 50 ml of chloroform, and 1.2 g of L-cysteine (1.0 × 10^-2(mol) in 100 ml of pure water was shaken for 10 minutes in a separating funnel. A white layer appeared on the interface between the aqueous layer and the organic layer. The white layer was collected, washed three times with pure water and chloroform, and then dried to isolate the desired product.
(Example 4)
0.2 g of the polymaleimide styrene synthesized in Example 1 (maleimide unit 1.0 × 10^-3mol.) in 50 ml of chloroform and 1.5 g of L-lysine (1.0 × 10^-2(mol) in 100 ml of pure water was shaken for 10 minutes in a separating funnel. A white layer appeared on the interface between the aqueous layer and the organic layer. The white layer was collected, washed three times with pure water and chloroform, and then dried to isolate the desired product.
(Example 5)
0.2 g of the polymaleimide styrene synthesized in Example 1 (maleimide unit 1.0 × 10^-3mol) was dissolved in 50 ml of chloroform and immersed in carbon felt and pulled up and dried. The polymer-coated carbon felt is immersed in a 1 g / L urease aqueous solution for 10 minutes, pulled up, washed sufficiently with pure water, irradiated with ultrasonic waves in pure water, and washed to remove all physically adsorbed substances. The target object was formed on the carbon felt by washing away.
(Example 6)
The target compound synthesized in Example 3 was characterized by NMR and IR.
[0029]
¹1 H NMR: The absorption of vinylene groups observed at 6.8 ppm disappeared, and methine hydrogen adjacent to methylene and sulfur atoms in the succinimide ring was newly observed at 3.5 to 4.5 ppm. Each was observed. The absorption of methine and methylene in the main chain was also observed.
[0030]
IR: 2700-3500cm^-1And 3400cm^-1In the vicinity, absorption of a carboxyl group and an amino group of the amino acid was observed, respectively. 1678 cm present in the precursor polymer, polymaleimide styrene^-1No absorption due to the double bond of the vinylene group was observed because the mercapto group of cysteine reacted with the double bond and was added by a covalent bond.
[0031]
It was also positive for the ninhydrin reaction.
[0032]
Therefore, it can be concluded that the obtained substance has the structure of the following formula (5).
[0033]
Embedded image

[0034]
(Example 7)
The same analysis as in Example 3 revealed that the polymer compound obtained in Example 4 was also a compound having the structure of the following formula (6) in which the amino group of lysine formed an additional covalent bond on the succinimide ring. It was ok.
[0035]
Embedded image

[0036]
(Example 8)
Regarding the polymer compound obtained in Example 5, in addition to the fact that the product after the elimination of physical adsorption shows a clear positivity to the ninhydrin reaction, the mercapto amino acid in Examples 6 and 7 was used. Considering that it has been shown that a group or amino group is added to the double bond of the maleimide group of the precursor polymer (polymaleimidostyrene) and covalently bonds to the succinimide ring, and that urease is a protein, ie a polyamino acid, It is obvious that the mercapto group and / or amino group of urease reacted with the double bond of maleimide, and urease was covalently bonded to the succinimide ring to produce a polymer compound having the structure of the following formula (7). is there.
[0037]
Embedded image

[0038]
(Example 9)
In the same manner, a functional polymer compound was synthesized by shaking the chloroform solution of poly (MISO) and the aqueous solution of L-cysteine or the aqueous solution of urease synthesized in Example 2 in a separating funnel. It was confirmed in the same manner as in Examples 6 and 7 that an addition reaction of a bio-origin molecule to a vinylene group of a maleimide ring produced a polymer having a succinimide ring structure.
3. Fabrication of PFC electrode
(Example 10)
A mixed resin system of 30 parts of chlorinated vinyl chloride resin (T-741 manufactured by Nippon Carbide Co., Ltd.) and 45 parts of furan resin (Hitafuran VF-302 manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.) was used. After mixing 20 parts of diallyl phthalate monomer as a plasticizer with 100 parts of a composition obtained by combining 25 parts of -300S average particle size of 2 μm) and dispersing them using a Henschel mixer, mixing was performed while maintaining the surface temperature at 120 ° C. The mixture was sufficiently kneaded using a two-roll mill to obtain a sheet-like composition, which was pelletized by a pelletizer to obtain a molding composition. The pellets were extruded with a screw type extruder at a speed of 3 m / sec at 130 ° C. while degassing using a 3.6 mm diameter die, and the pellets were fixed to a frame and placed in an air oven heated to 180 ° C. For 10 hours to obtain a precursor (carbon precursor) wire. Next, this is heated in a nitrogen gas at a rate of 10 ° C./h up to 500 ° C. and at a rate of 50 ° C./h from 500 ° C. to 1000 ° C., and then up to 1500 ° C. at 100 ° C./hour. After maintaining at 1500 ° C. for 3 hours, the mixture was naturally cooled to obtain a columnar carbon electrode having a cross-sectional diameter of 3 mm.
[0039]
As a result of measuring the pore diameter of the obtained carbon electrode by a mercury intrusion method using a porosimeter (Autoscan-60) manufactured by Yuasa Ionics, the maximum pore diameter was 120 angstroms. As the electrode characteristics, a polarographic analyzer (YANACO P-1100 manufactured by Yanagimoto) was used.^-3M Fe (CN)₆ ^4-  As a result of observing the redox reactivity of ferro / ferricyan ion in 1M KCl system, the blank current was small, sharp oxidation wave and reduction wave peaks were obtained without special pretreatment, and peak potential was obtained. Was close to the theoretical value. In addition, no increase in the current value due to the intrusion of the electrolyte was observed, and the electrolyte showed substantially the same impermeability as the glassy carbon.
4. Production of porous carbon
(Example 11)
75 parts of furan resin initial condensate (Hitafuran VF-302 manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.), 5 parts of dry distillation pitch (KH-1P manufactured by Kureha Chemical Industry Co., Ltd.), natural scale-like graphite fine powder having an average particle diameter of 1 μm (CSSP manufactured by Nippon Graphite Co., Ltd.) -B) 20 parts were added and mixed with a mixer to prepare a liquid composition. Next, a polyurethane foam having a three-dimensional network structure and a porosity of 60% was impregnated with the liquid composition. After removing the excess liquid composition, a curing reaction was performed in a dryer at 100 ° C. for 3 hours. Next, a carbon precursor conversion treatment was performed in a dryer at 180 ° C. for 10 hours. The temperature of the precursor-treated product was increased in nitrogen gas up to 500 ° C. at a rate of 20 ° C./h, then up to 1000 ° C. at 100 ° C./h, and held at 1000 ° C. for 3 hours. The carbon porous body was obtained by natural cooling.
5. Potentiometric biosensor using polymaleimide styrene as enzyme-immobilized support
(Example 12)
Urease immobilized urea sensor with ammonia detection
A polymaleimide polystyrene (PMS) solution dissolved in chloroform was immersed on an ammonia gas permeable membrane of an ammonia electrode and dried, and then immersed in a urease solution (1 mg / ml from Jackbean) for 30 minutes to bind urease. Then, the enzyme was activated by immersion in a 0.01 M dithiothreitol solution for 30 minutes. Urease is well known as an SH enzyme in which an SH group is indispensable for the expression of enzymatic activity, and an enzyme in which a part of the SH group is oxidized in an immobilization step to form a disulfide (SS) bond and is inactivated. The molecule was present and the enzymatic activity was regenerated by the addition of dithiothreitol, an SS bond cleavage reagent. FIG. 4 shows the structure of the ammonia electrode equipped with the enzyme-modified ammonia gas permeable membrane. When this sensor was placed in a 0.1 M phosphate buffer of pH 8 and the background potential was stabilized, urea was added, and a potential change corresponding to the urea concentration occurred. The reaction in which urea is hydrolyzed to produce ammonia and carbon dioxide gas is as shown in equation (8).
[0040]
Urea + H₂  O → 2NH₃    + CO₂        (8)
The potential response became a steady value about 20 minutes after the sample was added, but this response speed greatly changes depending on the membrane pressure of the PMS. FIG. 5 shows a calibration curve obtained three days after the production of the sensor. The slope of the calibration curve was approximately 55 mV / decade, indicating a nearly Nernst response. Further, when an experiment for preparing a calibration curve was carried out every day, a response was reduced by 30% one week later. This is considered to be mainly related to the detachment of the polymer from the membrane, so it is necessary to fix the polymer to a strong carrier by introducing an amine onto the surface of the carrier.
[0041]
Urease is known to have an SH group on its surface, and Uchiyama et al. Of the present inventor have found that the activity of the thiol group of urease is lost by oxidation at a carbon electrode (S. Uchiyama et al., "Electrical Control of Urease Activity Immobilized to the Conducting Polymer on the Carbon Felt Electrode", Electroanalysis 2002,14  pp. 1644-1647). Furthermore, when urease was adsorbed and immobilized on a wire mesh, it was found that the urease was bound to gold while maintaining its activity, and because it had almost the same electrode oxidation wave as cysteine, the SH group of urease itself reacted with maleimide to fix it. It is considered to be This is because it is known that the reaction rate between the SH group and the maleimide is much higher than that between the lysine residue and the maleimide. Furthermore, it has been confirmed that urease directly binds or strongly adheres to the gold surface using a quartz oscillator sensor. Therefore, a protein having a thiol group on the enzyme surface, such as urease, can be bound with its own thiol group, but it has been reported that the protein was immobilized using a thiol group on the surface of a natural protein molecule. Absent.
(Example 13)
Urease immobilized urea sensor with carbon dioxide detection
The carbon felt was immersed in a polymaleimide styrene (PMS) solution dissolved in chloroform and dried, and then immersed in a urease solution (1 mg / ml) for 30 minutes to bind urease. Then, the urea sensor was mounted on a gas permeable membrane of a carbon dioxide gas electrode to produce a carbon dioxide detection type urea sensor. In this sensor, a potential response was obtained in the same manner as the above-described sensor using the ammonia electrode as a detection electrode. The slope of the calibration curve was as small as 40 mV / decade, but the response time was quick, about 5 to 10 minutes. The response of this sensor was reduced by about 50% 30 days after the preparation, but was more stable than when the ammonia gas was coated on the diaphragm. This is considered to be due to the fact that the affinity between the polymer chains and the carbon felt surface is stronger than that between the polymer chains and the gas permeable membrane.
(Example 14)
Adenosine deiminase immobilized adenosine sensor
The carbon paper was immersed in 1 ml of a 1 mg / ml polymer chloroform solution and dried to prepare a polymer-coated carbon paper. Next, it was immersed in an adenosine deiminase solution (phosphate buffer solution of pH 7) for 30 minutes, washed with water, and mounted on an ammonia gas permeable membrane. The electrode was placed in a buffer solution, and after the potential was stabilized, an adenosine solution was added stepwise to record the potential response. The slope of the calibration curve was about 40 mV / decade, and the response time was about 20 minutes (FIG. 6). Since adenosine deiminase also rapidly binds to PMS, it is considered that the SH group present on the surface is bound to the polymer. The hydrolysis reaction of adenosine by the enzyme is as shown in equation (9). The sensor response hardly decreased for 3 weeks.
[0042]
Adenosine + H₂  O → Inosine + NH₃      (9)
6. Functional electrode with electron transfer mediator immobilized on polymaleimide styrene
(Example 15)
Measurement of catalytic oxidation wave of ascorbic acid using dopamine-bound PMS-modified PFC (Plastic formed carbon) electrode
The PFC electrode was immersed in a 1 mg / ml PMS chloroform solution and dried, coated with PMS, and then immersed in a 0.01 M dopamine solution (pH 9.0 phosphate buffer) for 30 minutes to remove the amino groups on the side chain of dopamine. Immobilized on maleimide. When cyclic voltammetry of a 0.1 mM ascorbic acid solution (pH 7.0) was performed using the dopamine-immobilized electrode, an electrode oxidation mediator current of ascorbic acid was observed. In the case of the PFC electrode without any PMS treatment, a large capacitive current appeared because the electrode area immersed in the solution was large, whereas the PMS-coated electrode showed a small capacitive current. However, the ascorbic acid electro-oxidation current appeared as a pre-wave. This pre-wave is generated by the reduction and regeneration of dopamine quinone, which is produced by the electrolytic oxidation of immobilized dopamine, to ascorbic acid. The immobilization reaction is shown in FIG.
7. Amperometric enzyme sensor using PMS coated on PFC electrode as enzyme fixed layer
(Example 16)
After the PFC electrode was polished and the edge face was filtered off, a PMS methylene chloride solution was dip-coated. Then, it was reacted with a tyrosinase (polyphenol oxidase) (0.25 mg / ml) solution (pH 6.5 phosphate buffer) to immobilize tyrosinase. Using this as a working electrode, constant potential amperometry was performed at -0.05 V using a silver-silver chloride electrode as a reference electrode and a platinum wire as a counter electrode. As the electrolyte, 10 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 6.5 was used, and a predetermined amount of a standard solution of a tyrosinase substrate to be measured was added while stirring the solution with a stirrer at a constant rate. In this sensor, an o-quinone compound generated from a catechol compound or a phenol compound by a tyrosinase-catalyzed reaction is electrolytically reduced and regenerated with a PFC electrode, whereby a circulating reaction as shown in FIG. 8 occurs, and a tyrosinase substrate such as a catechol or a phenol compound is increased. Sensitivity can be measured. The response was rapid, reaching a steady state in about 5-10 seconds. Further, as described with reference to FIG. 3, when the PFC electrode was previously introduced with an amino group by APTES treatment and then covered with MPS, the measurement sensitivity was increased and the stability for continuous measurement was improved. FIG. 9 shows a calibration curve of catechol when the APTES treatment was not performed.
[0043]
Examples of measurable phenol compounds include phenol, chlorophenol, aminophenol, cresol, and the like.Examples of measurable catechol compounds include catechol, dopamine, L-dopa, adrenaline, caffeic acid, and the like. Can be
[0044]
When a constant current value was obtained by adding a certain amount of the tyrosinase substrate, CN⁻  , N3⁻  , SCN⁻  By adding enzyme inhibitors such as benzoic acid, kojic acid and atrazine, various inhibitors could be measured from their inhibition currents.
[0045]
It is also possible to simultaneously immobilize an electron transfer mediator having a thiol group such as thionin, a primary amino group and a secondary amino group on the PFC in the same manner as the enzyme tyrosinase, thereby achieving an improvement in sensitivity. did it.
(Example 17)
After coating the PFC electrode with PMS in the same manner as in Example 16, the enzyme and thionin were immobilized by further immersing in a mixed solution of horseradish peroxidase (HRP) (1 mg / ml) and thionin (0.1 mM). This response was significantly improved by co-immobilizing the electron mediator to the PMS.
[0046]
As shown in FIG. 10, two oxidized peroxidase intermediates generated in the reaction (1) between hydrogen peroxide and peroxidase are sequentially reduced by an electron mediator (phenothiazine / phenoxazine-based electron mediator), and (2) the enzyme is Will be played. At −0.2 V (vs. Ag. AgCl), the reduction current (3) of the electron mediator was detected.
[0047]
When peroxidase and thionine or toluidine blue were simultaneously immobilized on PMS, a steady-state current response depending on the concentration of hydrogen peroxide could be obtained by the above reaction scheme. Although the response speed slightly varies depending on the thickness of the PMS, the response time to hydrogen peroxide is as quick as 10 seconds or less.
[0048]
In addition, since Meldora Blue and methylene blue strongly adsorb to the PFC electrode, a sensor could be similarly constructed by adsorbing PFC in advance, coating PMS, and fixing HRP. Even if HRP alone was immobilized without using an electron mediator, a current response based on a direct electron transfer reaction between the oxygen intermediate and the electrode was obtained, but the sensitivity was about 1/100 of that when the mediator was simultaneously immobilized. Was.
8. Flow type biosensor using PMS coated on porous carbon electrode as enzyme immobilized layer
(Example 18)
By using a porous carbon material or porous carbon felt (CF) as the working electrode of the flow type detector, all the reactions of Examples 16 to 17 can be applied to a flow type biosensor as shown in FIG. Also in this case, the carbon porous body and the porous CF were covered with PMS. Further, tyrosinase and HRP were immobilized, and a catechol (or phenol) sensor and a hydrogen peroxide sensor were respectively constructed. In addition, a significant increase in sensitivity was obtained by immobilizing thionin having an amino group on the PMS simultaneously with the enzyme. In particular, the tyrosinase / thionine system was able to measure p-chlorophenol up to 10 nM (FIGS. 12 and 13). Improvements in sensitivity amplification and reproducibility due to the APTES treatment were also observed (FIG. 14).
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a binding reaction between PMS and an enzyme having a thiol group or an amino group.
FIG. 2 is a diagram showing a bond between an amino group modified on the surface of a carbon electrode and PMS.
FIG. 3 is a diagram showing a process of modification of a carbon surface with an amino group using APTES, modification with a PMS, and modification with a PMS-enzyme.
FIG. 4 is a view showing an ammonia electrode equipped with an ammonia gas permeable membrane modified with an enzyme.
FIG. 5 is a graph showing a calibration curve of urea by urease immobilized on a permeable membrane in the sensor of FIG. 4;
6 is a graph showing a calibration curve of adenosine by adenosine deiminase immobilized on a permeable membrane in the sensor of FIG.
FIG. 7 is a diagram showing a reaction of immobilizing dopamine as an electron transfer mediator on PMS.
FIG. 8 is a diagram showing a circulatory reaction by tyrosinase immobilized on a PFC electrode by PMS.
FIG. 9 is a graph showing measurement sensitivity when a PFC electrode is modified with an amino group and when the PFC electrode is not modified.
FIG. 10 is a diagram showing a reaction of detecting hydrogen peroxide by a circulating reaction between HRP and thionine.
FIG. 11 is a diagram showing a configuration of a flow-type biosensor.
FIG. 12 is a graph showing measurement results of p-chlorophenol in the sensor of FIG.
FIG. 13 is a graph showing a calibration curve of p-chlorophenol based on the results of FIG.
FIG. 14 is a graph showing sensitivity amplification and improvement in reproducibility by APTES processing.

Claims (6)

A biologically-derived molecule having a primary amino group, a secondary amino group or a thiol group is added to at least a part of the repeating unit represented by the following general formula (1). A functional polymer compound represented by the formula (2).

The functional polymer compound according to claim 1, wherein the biological molecule is an enzyme and / or an electron transfer mediator that promotes an electrode reaction of the enzyme. A substrate,
A polymer compound physically or chemically fixed to the base material and having a maleimide group in a side chain,
A biosensor comprising: a biological molecule having a primary amino group, a secondary amino group, or a thiol group chemically bonded to at least a part of a maleimide group in a side chain of the polymer compound. 4. The biosensor according to claim 3, wherein the biological molecule is an enzyme and / or an electron transfer mediator that promotes an electrode reaction of the enzyme. The biosensor according to claim 3, wherein the substrate is a carbon electrode having a reactive residue substantially on an end face. The biosensor according to claim 3, wherein the substrate is a carbon porous body.

Images