【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は水酸化フラーレンを有効成分として含む神経細胞保護剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バックミンスターフラーレンＣ６０は、交互に並ぶ５員環および６員環を有する球状炭素であり、３０個の炭素二重結合は、酸素ラジカルと容易に反応するためフリーラジカル捕捉剤として作用しうる。
しかし、Ｃ６０は、トルエンまたはベンゼンのような芳香族炭化水素系や芳香族ハロゲン化炭化水素系の溶媒にしか溶解性を示さず水やアルコールには全く不溶のため、水溶性のカルボキシフラーレンや水酸化フラーレンの合成およびその用途に関する研究開発が行われている。医薬用途として、例えばＣ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）ｎやＣ６０（ＯＨ） ｎ（ｎ＝１８〜２０）について、グルタミン酸レセプター介在性神経毒性損傷治療剤として検討が行われている（例えば、特許文献１、非特許文献１、非特許文献２参照）。
【０００３】
Ｃ６０（ＯＨ）ｎの別な医薬用途としては、抗ＨＩＶウイルス作用（非特許文献３参照）、細胞分裂抑制作用（非特許文献４参照）などの検討がおこなわれている。それゆえ、更に合成が容易で有効性が優れるフラーレン類が求められている。一方、水酸化フラーレンの製造方法としては、濃いアルカリ性水溶液を用いる方法（例えば、特許文献２参照）と、二酸化窒素を用いる方法（非特許文献５参照）、発煙硫酸を使用する方法（例えば、非特許文献６及び特許文献３参照）などが知られている。
前者の濃いアルカリ性水溶液を用いる方法は、非常に多い数の水酸基の導入が可能な方法として記載されているが、製品が水溶性のため、使用したアルカリ性無機物を中和した後の無機塩と製品の分離が容易に行えないという問題があった。
【０００４】
後者の発煙硫酸を使用する方法は、水酸基の数が１２個前後と前者の方法のものより少ないが、得られた製品は中性で、水に溶けないために製品を分離することが可能という利点がある。この方法では、硫酸の除去が必要となり、具体的には硫酸は水に溶けるので水での洗浄、例えば、製品と水を容器に入れて撹拌し、濾過やデカンテーションで水を除く懸濁洗浄方法や吸引濾過器などに濾紙などを置きその上に製品を敷き、上から水を掛けて洗浄し濾過するふりかけ洗浄方法によって除去することが知られている。
【０００５】
また、この方法が記載されている文献では、硫酸を除去して分離した製品を減圧中、４０℃で加熱乾燥して最終製品を得る旨の記載がなされている。しかしながら、このような方法では、最終生成品中に、３〜５％の水分が含まれていること、また、生成品は親水性の水酸基を有していて、水を非常に吸いやすい性質を有するために、放置すると８〜１０％の水分を吸収してしまうという問題があった。
【０００６】
【特許文献１】
特表２０００−５１４４１２号公報
【非特許文献１】
Ｈ． Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ Ｃ６０， Ｆｕｌｌｅｒｅｎｏｌｓ， ａｓ Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ＲｅｃｅｐｔｏｒＡｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６２： ６００−６０７ （２０００）
【非特許文献２】
Ｌ． Ｌ． Ｄｕｇａｎ ｅｔ ａｌ， Ｂｕｃｋｍｉｎｓｔｅｒｆｕｌｌｅｒｅｎｏｌ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ Ｒｅｄｕｃｅ Ｅｘｃｉｔｏｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｏｐｏｔｏｔｉｃ Ｄｅａｔｈ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｏｒｔｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ， Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ３： １２９−１３５ （１９９６）
【非特許文献３】
Ｒ．Ｆ． Ｓｃｉｎａｚｉ ｅｔ ａｌ， Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ Ｆｕｌｌｅｒｅｎｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｋ．Ｍ． Ｋａｄｉｓｈ ａｎｄ Ｒ．Ｓ． Ｒｕｏｆｆ， Ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ｖｏｌ． ４， ｐｐ３５７−３６０ （１９９７）
【非特許文献４】
Ｌ−Ｈ． Ｌｕ ｅｔ ａｌ， Ｔｈｅ Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｆ Ｆｕｌｌｅｒｅｎｏｌ， Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ Ｃ６０， ｏｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １２３： １０９７−１１０２ （１９９８））
【非特許文献５】
Ｌ． Ｙ． Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｏｎｅ−ｆｌａｓｋ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ ［６０］ Ｆｕｌｌｅｒｅｎｏｌｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５２： ４９６３−７２ （１９９６）
【特許文献２】
特開平７−４８３０２号公報
【非特許文献６】
Ｌ． Ｙ． Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｎｉｔｒｏｎｉｕｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｃ６０ ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １１４： １０１５７−１０１５７ （１９９２）
【特許文献３】
特開２００２−８０４１４号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記の通り、医薬として実用化しうる合成方法が容易で品質が安定な水酸化フラーレンの製造法やそれを有効成分とするより効果が優れる神経細胞保護剤が求められていた。
本願の出願人は、フラーレンと発煙硫酸とを反応させ、その後加水分解により得られる生成物を、アルカリ性水溶液で洗浄し、次いで加熱乾燥することを特徴とする特定数の水酸基が導入された高品質の水酸化フラーレンの製造方法を先に提案した（特願２００２−３２０１９６号明細書）。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、更に優れた神経細胞保護剤を開発すべく鋭意検討した結果、本願の出願人が先に提案した方法により製造された水酸化フラーレンは、優れた神経細胞保護作用を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
即ち、本発明により、下記式（１）
【０００９】
【化２】
Ｃ６０（ＯＨ）ｎ （１）
（式中、Ｃ６０はバックミンスターフラーレンを示し、ｎは２〜１２の正数を示す）
で表される水酸化フラーレン又はそのプロドラッグを含む神経細胞保護剤が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で、有効成分として用いられる化合物は、上記式（１）で示される水酸化フラーレン（以下これを「Ｆｕｌｌｅｒｏｌ」と称することがある）である。該化合物におけるバックミンスターフラーレンＣ６０への水酸基（ＯＨ）の導入数ｎは２〜１２の範囲内であり、好ましくは８、１０又は１２であり、更に好ましくは１０である。また当該水酸化フラーレンは、導入された水酸基数が異なるものの混合物であっても良い。この場合、ｎの数は平均値を示し、ｎの平均値としては、８〜１０の範囲内が好ましく、約１０程度がより好ましい。
【００１１】
ここで、本発明において「プロドラッグ」とは、投与後、生体内で分解されて上記式（１）の化合物が放出（生成）され得る式（１）の化合物の誘導体を意味する。具体的には、上記式（１）で表される化合物の低級アルキルエステル、および水溶性置換基（水酸基、アミノ基、カルボン酸基、四級アミノ基など）を有する低級アルキルエステル等が挙げられる。導入されるエステル基の数は、１ｎである。
【００１２】
上記式（１）の化合物は、如何なる方法で製造されたものであっても良い。具体的には、例えば、バックミンスターフラーレンＣ６０と発煙硫酸とを反応させ、その後加水分解して得られる生成物を、アルカリ性水溶液で洗浄し、次いで加熱乾燥することにより製造できる。この方法の詳細は、特願２００２−３２０１９６号明細書に記載されている。
ここで原料となるバックミンスターフラーレンＣ６０は市販されており容易に入手できる。
【００１３】
発煙硫酸は、特に限定されず、市販品されている三酸化硫黄含有量が１０％、３０％及び６０％のものを用いることができるが、３０％及び６０％のものが好ましい。三酸化硫黄含有量が１０％では反応が遅く、また６０％を越えると発煙が激しくなり取り扱いが困難となる。
フラーレンと発煙硫酸との反応は、従来公知の方法が採用でき、具体的には、５０〜６０℃で、５〜７時間、窒素気流下で反応させる。発煙硫酸の容量は、フラーレンの重量の３倍以上で十分だが、反応懸濁液の粘度が高いため十分な撹拌が出来ないので５倍以上が好ましい。１０倍以上あっても反応はこれ以上には進行せず意味をなさないので５倍〜１０倍の範囲が好ましい。
【００１４】
フラーレンと発煙硫酸との反応により硫酸化フラーレンの懸濁液が得られる。この硫酸化フラーレンを加水分解して水酸化フラーレンを合成する。
加水分解の方法は、従来公知の方法が採用できるが、フラーレンと発煙硫酸との反応により得られた懸濁液を、冷却した大量の水に移して希釈する方法が好ましい。懸濁液は、硫酸の濃度が高いため非常に危険であり、また濃度が高いため液の粘度が高く濾別が困難であったり、また分離するのに一般的に使用される濾紙や濾布を化学的に痛めてしまうからであり、例えば、懸濁液の中に水を加えると発熱が激しく、製品上余計な熱を与えてしまうため好ましくない。
【００１５】
この方法により、発煙硫酸に含まれている三酸化硫黄を水と反応させて硫酸にすると同時に、硫酸を希釈して取り扱いやすくできる。
水に移しただけでは硫酸化フラーレンのままであるので、８５〜９０℃で、５〜７時間加熱して硫酸部分を加水分解反応させる。加水分解により得られた生成物は、その後、濾過又は遠心分離により単離して水酸化フラーレンを得る。
【００１６】
得られた生成物が水酸化フラーレンであることは、赤外吸収により水酸基の存在、炭素−水素結合がないこと、及び元素分析で水素と酸素の元素数の値が近いことにより確認することができる。例えば、Ｃ６０を原料とした場合は、マススペクトルで８９０がメインピークであり、これは水酸基が１０個導入された水酸化体の分子量に一致することで判断できる。
【００１７】
濾過又は遠心分離により単離した生成物は、その後、アルカリ性水溶液で洗浄する。洗浄とは、加水分解により得られた生成物を濾過又は遠心分離したものに、アルカリ性水溶液を流す、又はアルカリ性水溶液中に入れて攪拌する方法等が採用できる。この内、濾過又は遠心分離したものにアルカリ性水溶液を流す方法が簡便で好ましい。この際、洗浄後の濾液が、ｐＨ７．０以上まで行うのが好ましい。
【００１８】
また、中和に使用されるアルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム及び水酸化アンモニア化合物の水溶液、アンモニア水やアミン水溶液等が挙げられる。
水酸化アンモニア化合物の具体例としては、水酸化テトラメチルアンモニウム及び水酸化テトラブチルアンモニウム等が挙げられる。また、アミン水溶液の具体例としてはメチルアミン水溶液及びジメチルアミン水溶液を挙げられる。これらの中で、アンモニア水及びアミン水溶液が好ましい。
【００１９】
アルカリ性水溶液で洗浄した後、加熱乾燥する。加熱乾燥は、製品として不要な水を除去するために、乾燥不活性気体の気流下又は真空下で行われる。加熱温度は、５０℃以上、好ましくは５５℃以上で、１００℃以下が好ましい。真空度は３ＫＰａ以下が好ましく、２ＫＰａ以下が更に好ましい。乾燥時間は３０分以上、１２時間以下が好ましく、２時間以上、１０時間以下が更に好ましい。
【００２０】
かくして本発明で有効成分として用いられる水酸化フラーレン、例えばＣ６０（ＯＨ）ｎ（ｎ＝１０又は１２）を得ることができる。本発明で用いるプロドラッグは、例えば該化合物を原料として、それ自体既知の通常用いられる方法、例えば脱水縮合剤によるエステル化法などにより合成することができる。
上記式（１）で表される化合物又はそのプロドラッグは、優れた神経細胞保護作用を有しているので、各種の急性又は慢性の神経損傷に起因する疾患の予防及び／又は治療剤、即ち神経細胞保護剤として用いることができる。ここで、神経損傷に起因する疾患としては、低酸素や虚血による神経損傷、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病等が挙げられる。
【００２１】
上記式（１）で表される化合物又はそのプロドラッグは、それ自体を医薬として患者に投与してもよいが、一般には、これらの有効成分の１種または２種以上を含む医薬組成物を製造して患者に投与することが好適である。このような医薬組成物として、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、丸剤、トローチ、舌下剤、又は液剤などの経口投与の製剤、あるいは注射剤、座剤、軟膏、貼付剤などの非経口投与用の製剤を例示することができる。
また式（１）の化合物又はそのプロドラッグが、生理学的に許容される塩又は溶媒和物となりうる場合、これら有効成分は、それらの形態であっても良い。
【００２２】
経口投与用の錠剤又はカプセル剤は、通常は単位投与物として提供され、結合剤、充填剤、希釈剤、打錠剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、香味剤及び湿潤剤のような通常の製剤用担体を添加して製造することができる。錠剤は、この当業界で周知の方法に従って、例えば、腸溶性コーティング剤を用いてコーティングすることができ、例えばセルロース、マンニトール、又はラクトース等の充填剤；澱粉、ポリビニルポリピロリドン、澱粉誘導体、又はナトリウム澱粉グリコラート等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤を用いて製造してもよい。
【００２３】
経口投与用の液剤は、例えば水性又は油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ剤又はエリキシル剤等の他、使用前に水又は適当な媒体により再溶解されうる乾燥製剤として提供される。このような液剤には、通常の添加剤、例えばメチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル又は水素化食用脂肪のような沈殿防止剤、レシチン、ソルビタンモノオレート、アラビアゴムのような乳化剤、アーモンド油、精製ココナッツ油、油状エステル（例えばグリセリンのエステル）、プロピレングリコール、エチルアルコールのような（食用油も包含しうる）非水性媒体、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル、エチルエステル、もしくはプロピルエステル、又はソルビン酸のような保存剤及び必要に応じて通常の香味剤又は着色剤を配合することができる。
【００２４】
経口投与剤の製剤は、混合、充填、又は打錠などの当業界で周知の方法により製造することができる。また、反復配合操作を用いて多量の充填剤等を使用した製剤中に有効成分を分布させてもよい。非経口投与用の製剤は、一般には有効成分である化合物と滅菌媒体とを含有する液体担体投与量製剤として提供される。非経口投与用の溶剤は、通常、化合物を媒体に溶解させて滅菌濾過し、次に適当なバイアル又はアンプルに充填して密封することにより製造される。安定性を高めるために組成物を凍結させた後にバイアル中に充填し、水を真空下で除去してもよい。非経口懸濁液は実質的に非経口溶液の場合と同じ方法で製造されるが、有効成分を媒体に懸濁させてエチレンオキシド等により滅菌することにより好適に製造できる。また、有効成分が均一分布となるように必要に応じて界面活性剤、湿潤剤等を添加してもよい。
【００２５】
有効成分である上記式（１）の化合物又はそのプロドラッグの投与量は、治療や予防の目的、患者の症状、体重、年齢や性別等を考慮して適宜決定すればよいが、通常の場合、成人一日あたり経口投与により０．０５〜３０ｍｇ／ｋｇ程度を投与することができる。このような投与量を１日あたり１〜数回に分けて投与するのが望ましい。
【００２６】
【実施例】
本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
製造例１ 水酸化フラーレンの合成
３０％発煙硫酸（和光純薬製）５ｍＬを、ガラス製５０ｍＬ２口フラスコに入れ乾燥窒素を吹き込みながらＣ６０（フロンティアカーボン（株）社製）１ｇを加え、５時間加熱撹拌した。これを氷冷した脱イオン水２０ｍＬにゆっくり滴下し、濾紙を使って生成物を濾過した。
【００２７】
ガラス製２００ｍＬ４つ口フラスコに、濾紙に残った赤色固体を脱イオン水３０ｍＬを使って移し、５時間加熱攪拌した。室温まで冷却した後濾紙を使って濾過し、さらに脱イオン水３０ｍＬで洗浄し、その後、２．５％アンモニア水で濾液のｐＨが７以上になるまで洗浄した。濾別された固体を真空中（圧力１．５ＫＰａ）４０℃で４時間乾燥し、赤褐色固体（水酸化フラーレン）１．２ｇを得た。
【００２８】
得られた生成物は、赤外吸収スペクトルで３４００ｃｍ−１、１４００ｃｍ−１及び１０４０ｃｍ−１に吸収があることより水酸基の存在が認められた。また、１６３０ｃｍ−１に吸収があることより、炭素炭素二重結合の存在が認められた。更には、３０５０〜２９００ｃｍ−１は、炭素水素結合の吸収が現れる領域であるがこの領域には吸収がなかったことから水素は炭素ではなく酸素と結合していると言え、水酸化フラーレン（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ）が生成していることが判明した。
【００２９】
また、元素分析では、Ｃ：７６．６％、Ｈ：１．３％、Ｏ：２４．８％、Ｎ：０．７６％、Ｓ：０．４４％、であり、炭素を６０とするとＣ：６０、Ｈ１０．７、Ｏ：１５．３、Ｓ：０．１（Ｈ／Ｃ＝１０．７／６０）と算出される。マススペクトルでは、８９０ピークがもっとも強く、これは分子量が水酸化数１０の水酸化フラーレンに相当し、元素分析とマススペクトルの結果が一致しないが、概ね水酸化数（ｎ）は１０と１２の混合物であると考えられる。含水率は、カールフィッシャー試薬測定したところ５．６％であった。
【００３０】
その後、この固体を真空中（圧力１．５ＫＰａ）１００℃で４時間乾燥処理した水酸化フラーレンの含水率は、０．５％で、元素分析のＨ／Ｃは１２．７／６０であり、加熱乾燥後、水素の減量は認められず、水酸化フラーレンが変質していないことが分かった。
また、真空中１００℃で４時間処理した水酸化フラーレンは、１重量％の水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬに対して２００ｍｇ程度の溶解性を有するものであった。
【００３１】
実施例１ 水酸化フラーレンによる細胞毒性試験
１）使用した試液
細胞培養用培地として液体低グルコースＤｕｌｂｅｃｃｏｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に非働化ウシ胎児血清とウマ血清をそれぞれ培地の容量の５％分添加し、さらに硫酸カナマイシンを１００ｍｇ／Ｌとなるように添加したものを使用した。
【００３２】
細胞継代時使用溶液として０．０２％ＥＤＴＡ−ＰＢＳ溶液（ＰＢＳにＥＤＴＡを０．０２％となるように加えて調製）および０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０２％ＥＤＴＡ−ＰＢＳ溶液に粉末トリプシンを０．２５％となるように添加）を用いた。
【００３３】
１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ（ＭＰＰ＋）はＤＭＳＯに溶解し、１００ｍＭストックを調製した。ストックは暗所に−２０℃で保存した。
水酸化フラーレン（Ｆｕｌｌｅｒｏｌ）は、製造例１と同様の方法で合成したものをＤＭＳＯに溶解し、５ｍＭストックを調製した。ストックは暗所に−２０℃で保存した。
【００３４】
ＸＴＴ試液は２，３−Ｂｉｓ［２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏ−５−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ−５−ｃａｒｂｏｘａｎｉｌｉｄｅ ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ（ＸＴＴ）１ｍｇ、０．５ｍＭ ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ（ＰＭＳ）（溶媒はＰＢＳを使用）２０μｌに無血清の液体低グルコースＤＭＥＭ培地を１ｍｌ加えて用時調製した。
【００３５】
２）細胞の培養
培養細胞としてラット副腎由来褐色種細胞（神経細胞）であるＰＣ１２細胞を使用した。
通常、細胞は培養フラスコ（培養面積２５ｃｍ２）で培養し、実験に使用する際はポリスチレン製９６穴マイクロプレート（平底、低蒸発タイプ）で培養した。細胞培養は３７℃、飽湿下、５％ＣＯ２に設定したＣＯ２インキュベーターで行った。
細胞の継代は０．０２％ＥＤＴＡ−ＰＢＳ溶液で洗ったのち、０．２５％トリプシン−ＰＢＳ溶液を用いて細胞を剥離させ、ピペッティングで細胞を分散させた後、培地で適当な濃度に希釈した。
【００３６】
３）細胞毒性試験
水酸化フラーレンのＰＣ１２細胞に対する生存率への影響を、ＸＴＴ法を用いて調べた。このＸＴＴ法は以下の原理に基づいている。ミトコンドリアは、酸化的リン酸化反応によるエネルギー産生の場として重要な役割を担っている。活発に増殖する細胞ではエネルギー産生量が多いが、細胞が破壊されると極端にミトコンドリアの機能が低下することが知られている。一方、ラット肝組織抽出液を用いた電子伝達系の解析からＸＴＴなどのテトラゾリウム塩がミトコンドリア脱水素酵素のよい基質になることが報告された。ＸＴＴは還元されると水溶性ホルマザン色素に変わるため、吸光度を測定することにより生存細胞数を定量することが可能である。よって無処理細胞との比較により、化合物による生細胞の減少、すなわち細胞死の増加が定量できる。この原理を模式的に図１に示す。
【００３７】
水酸化フラーレンの処理濃度は２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭとし、薬物処理時間は４８時間および７２時間とした。
対数増殖期にあるＰＣ１２細胞を４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で５０μｌずつ９６穴マイクロプレートに添加し、ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養した。水酸化フラーレン溶液を各目的濃度の２倍となるように培地に加え、９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ添加した（５０→１００μｌとなるために２倍に希釈され、目的の濃度となる）。ＣＯ２インキュベーターにて４８時間または７２時間培養後、培地交換を行い、さらに２４時間ＣＯ２インキュベーターにて培養した。ＸＴＴ試液を５０μｌずつ加え、ＣＯ２インキュベーターで４時間培養後、直ちにプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度から細胞生存率を以下の式から算出した。
【００３８】
細胞生存率＝（Ｓ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）×１００％
Ｓ＝検体での吸光度
Ｂ＝培地のみでの吸光度
Ｃ＝ｃｏｎｔｒｏｌでの吸光度
その結果を表１に示す。表１から明らかなとおり、４８時間、７２時間ともに水酸化フラーレンの細胞毒性は確認されなかった。この結果は、水酸化フラーレンが神経細胞に対して毒性がないことを示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
実施例２ 水酸化フラーレンによるＭＰＰ ＋ 毒性軽減作用
水酸化フラーレンによるＭＰＰ＋毒性への影響を、ＸＴＴ法を用いて調べた。水酸化フラーレン、ＸＴＴ試液およびＰＣ１２細胞は、実施例１と同様に調製したものを用いた。
ＭＰＰ＋の処理濃度は１２５μＭで、これに水酸化フラーレンを加えないもの、５μＭ、２０μＭを添加したものについて細胞生存率を調べた。なお、ＭＰＰ＋と水酸化フラーレンは同時に添加した。
【００４１】
対数増殖期にあるＰＣ１２細胞を４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で５０μｌずつ９６穴マイクロプレートに添加し、ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養した。水酸化フラーレン溶液を培地に加え、９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ添加した。ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養後、培地交換を行い、さらに２４時間ＣＯ２インキュベーターにて培養した。ＸＴＴ試液を５０μｌずつ加え、ＣＯ２インキュベーターで４時間培養後、直ちにプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度から細胞生存率を以下の式から算出した。
【００４２】
（細胞生存率）＝（Ｓ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）×１００
Ｓ＝検体での吸光度
Ｂ＝培地のみでの吸光度
Ｃ＝ｃｏｎｔｒｏｌでの吸光度
その結果を表２に示す。この結果は、Ｃ６０（ＯＨ）ｎが、ＭＰＰ＋が引き起こす神経細胞の毒性を減弱することを示す。
【００４３】
【表２】
Ｃｏｎｔｒｏｌ １００
ＭＰＰ＋ １２５μＭ １３．３
ＭＰＰ＋ １２５μＭ ＋ Ｆｕｌｌｅｒｏｌ ５μＭ ２６．７
ＭＰＰ＋ １２５μＭ ＋ Ｆｕｌｌｅｒｏｌ ２０μＭ ２９．３
【００４４】
【発明の効果】
本発明の神経細胞保護剤は、優れた神経細胞死の抑制作用を有しており、各種の急性又は慢性の神経損傷に起因する疾患の予防及び／又は治療剤となりうると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＸＴＴ法の原理を模式的に示した図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a neuroprotective agent containing hydroxylated fullerene as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Buckminsterfullerene C 60 is a spherical carbon having a 5-membered ring and 6-membered rings of alternating, 30 carbon second bonds may act as a free radical scavenger to readily react with oxygen radicals.
However, C60 is only soluble in aromatic hydrocarbon-based and aromatic halogenated hydrocarbon-based solvents such as toluene or benzene, and is completely insoluble in water or alcohol. Research and development on the synthesis of hydroxylated fullerenes and their uses have been carried out. For pharmaceutical use, for example, C 60 (C (COOH) 2 ) n and C 60 (OH) n (n = 18 to 20) are being studied as therapeutic agents for glutamate receptor-mediated neurotoxic damage (for example, See Patent Document 1, Non-patent Document 1, and Non-patent Document 2).
[0003]
As other medicinal uses of C 60 (OH) n , studies have been conducted on anti-HIV virus activity (see Non-Patent Document 3), cytostatic activity (see Non-Patent Document 4), and the like. Therefore, there is a need for fullerenes that can be easily synthesized and have excellent effectiveness. On the other hand, as a method for producing fullerene hydroxide, a method using a concentrated alkaline aqueous solution (for example, see Patent Document 2), a method using nitrogen dioxide (see Non-Patent Document 5), and a method using fuming sulfuric acid (for example, Patent Literatures 6 and 3) are known.
The former method using a concentrated alkaline aqueous solution is described as a method capable of introducing a very large number of hydroxyl groups.However, since the product is water-soluble, the inorganic salt and product after neutralizing the alkaline inorganic substance used are described. However, there is a problem that separation cannot be easily performed.
[0004]
In the latter method using fuming sulfuric acid, the number of hydroxyl groups is around 12 and less than that of the former method, but the obtained product is neutral, and it is possible to separate the product because it is insoluble in water. There are advantages. In this method, sulfuric acid must be removed.Specifically, since sulfuric acid is soluble in water, washing with water, for example, suspending the product and water in a container, stirring, and removing water by filtration or decantation It is known that a method or a filter paper is placed on a suction filter or the like, a product is laid on the filter paper, the product is spread on the filter paper, washed with water from above, and removed by a sprinkling cleaning method of filtering.
[0005]
Further, in the literature describing this method, it is described that a product separated by removing sulfuric acid is heated and dried at 40 ° C. under reduced pressure to obtain a final product. However, in such a method, the final product contains 3 to 5% of water, and the product has a hydrophilic hydroxyl group and has a property of absorbing water very easily. Therefore, there is a problem that 8 to 10% of water is absorbed when left unattended.
[0006]
[Patent Document 1]
JP-T-2000-514412 [Non-Patent Document 1]
H. Jin et al, Polyhydroxylated C 60, Fullerenols, as Glutamate ReceptorAntagonists and Neuroprotective Agents. Journal of Neuroscience Research 62: 600-607 (2000)
[Non-patent document 2]
L. L. Dugan et al, Buckminsterfullerenol Free Radical Scavengers Reduce Excitotic and Apopotic Death of Cultural Neurology, New York, 1991.
[Non-Patent Document 3]
R. F. Scinazi et al, Anti-human Immunodeficiency Virus Activity of Polyhydroxide Fullerenes in vitro, Recent Advances in Radiochemistry in the Chemistry Registry. M. Kadish and R.S. S. Ruoff, Editors, Published by Electrochemical Society, vol. 4, pp357-360 (1997)
[Non-patent document 4]
LH. Lu et al, The Possible mechanisms of the Antiproliferative Effectof Fullerenol, Polyhydroxylated C 60, on Vascular Smooth Muscle Cells, British Journal of Pharmacology, 123: 1097-1102 (1998))
[Non-Patent Document 5]
L. Y. Chiang et al, Efficient One-flash synthesis of Water-soluble [60] Fullerenols, Tetrahedron 52: 4963-72 (1996)
[Patent Document 2]
JP-A-7-48302 [Non-Patent Document 6]
L. Y. Chiang et al, Versatile Nitronium Chemistry for C60 fullerene functionalization, Journal of the American Chemical Society, 114: 10157-10157.
[Patent Document 3]
JP-A-2002-80414
[Problems to be solved by the invention]
As described above, there has been a demand for a method for producing fullerene hydroxide, which is easy to synthesize and can be put into practical use as a medicament and has a stable quality, and a neuroprotective agent which is more effective than using it as an active ingredient.
The applicant of the present application is to react a fullerene with fuming sulfuric acid, and then to obtain a high-quality product having a specific number of hydroxyl groups introduced therein, wherein the product obtained by hydrolysis is washed with an alkaline aqueous solution, and then dried by heating. (Japanese Patent Application No. 2002-320196) was previously proposed.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to develop a more excellent nerve cell protective agent, and as a result, have found that the fullerene hydroxide produced by the method previously proposed by the present applicant has an excellent nerve cell protective action. I found it. The present invention has been accomplished based on these findings.
That is, according to the present invention, the following formula (1)
[0009]
Embedded image
C 60 (OH) n (1)
(Wherein, C 60 represents buckminsterfullerene, and n represents a positive number of 2 to 12)
A neuroprotective agent comprising the hydroxylated fullerene represented by or a prodrug thereof is provided.
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present invention, the compound used as an active ingredient is a fullerene hydroxide represented by the above formula (1) (hereinafter sometimes referred to as “Fullerol”). Introduction number n of hydroxyl groups (OH) of the buckminsterfullerene C 60 in the compound is in the range of 2 to 12, preferably 8, 10 or 12, more preferably 10. Further, the fullerene hydroxide may be a mixture of those having different numbers of introduced hydroxyl groups. In this case, the number n indicates an average value, and the average value of n is preferably in the range of 8 to 10, and more preferably about 10.
[0011]
Here, in the present invention, the “prodrug” means a derivative of the compound of the formula (1) that can be decomposed in vivo to release (generate) the compound of the formula (1) after administration. Specific examples include a lower alkyl ester of the compound represented by the above formula (1) and a lower alkyl ester having a water-soluble substituent (such as a hydroxyl group, an amino group, a carboxylic acid group, or a quaternary amino group). . The number of ester groups introduced is 1n.
[0012]
The compound of the above formula (1) may be produced by any method. Specifically, for example, by reacting with buckminsterfullerene C 60 and fuming sulfuric acid, then the product obtained by hydrolyzing, washed with an alkaline solution and then can be produced by heating and drying. The details of this method are described in Japanese Patent Application No. 2002-320196.
Here buckminsterfullerene C 60 as a raw material is readily available and are commercially available.
[0013]
The fuming sulfuric acid is not particularly limited, and commercially available products having a sulfur trioxide content of 10%, 30% and 60% can be used, but those having a sulfur trioxide content of 30% and 60% are preferable. If the content of sulfur trioxide is 10%, the reaction is slow, and if it exceeds 60%, smoking becomes intense and handling becomes difficult.
For the reaction between fullerene and fuming sulfuric acid, a conventionally known method can be adopted. Specifically, the reaction is carried out at 50 to 60 ° C. for 5 to 7 hours under a nitrogen stream. The volume of fuming sulfuric acid is sufficient to be at least three times the weight of fullerene, but is preferably at least five times because the viscosity of the reaction suspension is high and sufficient stirring cannot be performed. Even if it is 10 times or more, the reaction does not proceed any more and it does not make sense, so the range of 5 to 10 times is preferable.
[0014]
The reaction of fullerene with fuming sulfuric acid gives a suspension of sulfated fullerene. The sulfated fullerene is hydrolyzed to synthesize hydroxylated fullerene.
As a hydrolysis method, a conventionally known method can be adopted, but a method of diluting a suspension obtained by a reaction between fullerene and fuming sulfuric acid into a large amount of cooled water is preferable. Suspensions are very dangerous because of the high concentration of sulfuric acid, and the high concentration of the solution makes the solution too viscous to filter by filtration, or filter paper or filter cloth commonly used for separation. For example, when water is added to the suspension, heat is generated intensely, and it is not preferable because excessive heat is given to the product.
[0015]
According to this method, sulfur trioxide contained in fuming sulfuric acid is reacted with water to form sulfuric acid, and at the same time, sulfuric acid is diluted to facilitate handling.
Since the sulfated fullerene remains as it is simply transferred to water, it is heated at 85 to 90 ° C. for 5 to 7 hours to cause a hydrolysis reaction of the sulfuric acid portion. The product obtained by hydrolysis is then isolated by filtration or centrifugation to obtain fullerene hydroxide.
[0016]
The fact that the obtained product is fullerene hydroxide can be confirmed by the presence of a hydroxyl group by infrared absorption, the absence of carbon-hydrogen bond, and the closeness of the number of elements of hydrogen and oxygen by elemental analysis. it can. For example, when C 60 is used as a raw material, 890 is the main peak in the mass spectrum, which can be determined by matching with the molecular weight of the hydroxide having 10 hydroxyl groups introduced.
[0017]
The product isolated by filtration or centrifugation is then washed with an aqueous alkaline solution. Washing may be performed by, for example, flowing an alkaline aqueous solution through a product obtained by filtration or centrifuging the product obtained by hydrolysis, or placing the product in an alkaline aqueous solution and stirring. Of these, a method of flowing an alkaline aqueous solution through a filter or a centrifugal separator is simple and preferable. At this time, it is preferable that the filtrate after washing is performed up to pH 7.0 or more.
[0018]
Examples of the alkaline aqueous solution used for neutralization include aqueous solutions of sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide and an ammonium hydroxide compound, aqueous ammonia and aqueous amine solutions.
Specific examples of the ammonium hydroxide compound include tetramethylammonium hydroxide and tetrabutylammonium hydroxide. Specific examples of the amine aqueous solution include a methylamine aqueous solution and a dimethylamine aqueous solution. Of these, aqueous ammonia and aqueous amine solutions are preferred.
[0019]
After washing with an alkaline aqueous solution, it is dried by heating. The heat drying is performed under a stream of a dry inert gas or under a vacuum in order to remove unnecessary water as a product. The heating temperature is 50 ° C. or higher, preferably 55 ° C. or higher, and is preferably 100 ° C. or lower. The degree of vacuum is preferably 3 KPa or less, more preferably 2 KPa or less. The drying time is preferably 30 minutes or more and 12 hours or less, more preferably 2 hours or more and 10 hours or less.
[0020]
Thus, a fullerene hydroxide used as an active ingredient in the present invention, for example, C 60 (OH) n (n = 10 or 12) can be obtained. The prodrug used in the present invention can be synthesized, for example, by using the compound as a raw material, by a commonly used method known per se, for example, an esterification method using a dehydrating condensing agent.
Since the compound represented by the above formula (1) or a prodrug thereof has an excellent neuroprotective action, it is a preventive and / or therapeutic agent for various diseases caused by acute or chronic nerve damage, that is, It can be used as a nerve cell protective agent. Here, the diseases caused by nerve damage include nerve damage due to hypoxia and ischemia, Parkinson's disease, Huntington's disease, Alzheimer's disease and the like.
[0021]
The compound represented by the above formula (1) or a prodrug thereof may be itself administered to a patient as a medicament, but generally, a pharmaceutical composition containing one or more of these active ingredients is used. It is preferred that it be manufactured and administered to a patient. Examples of such a pharmaceutical composition include preparations for oral administration such as tablets, capsules, fine granules, powders, pills, troches, sublinguals, and liquids, and non-administration preparations such as injections, suppositories, ointments, and patches. Preparations for oral administration can be exemplified.
When the compound of the formula (1) or a prodrug thereof can be a physiologically acceptable salt or solvate, these active ingredients may be in their forms.
[0022]
Tablets or capsules for oral administration are usually presented as unit doses and are usually prepared with binders, fillers, diluents, tablet tablets, lubricants, disintegrants, coloring agents, flavoring agents and wetting agents. Can be produced by adding a pharmaceutical carrier. Tablets may be coated according to methods well known in the art, for example, with an enteric coating, for example, a filler such as cellulose, mannitol, or lactose; starch, polyvinyl polypyrrolidone, a starch derivative, or sodium. It may be manufactured using a disintegrant such as starch glycolate; a lubricant such as magnesium stearate; a wetting agent such as sodium lauryl sulfate.
[0023]
Solutions for oral administration are provided as, for example, aqueous or oily suspensions, solutions, emulsions, syrups or elixirs, as well as dry preparations which can be redissolved in water or a suitable vehicle before use. Such liquid preparations may contain usual additives such as methylcellulose, gelatin, hydroxyethylcellulose, carboxymethylcellulose, suspending agents such as aluminum stearate gel or hydrogenated edible fat, lecithin, sorbitan monooleate and gum arabic. Emulsifiers, almond oil, refined coconut oil, oily esters (eg, esters of glycerin), non-aqueous media such as propylene glycol, ethyl alcohol (which may also include edible oils), methyl esters of p-hydroxybenzoic acid, ethyl esters, Alternatively, a preservative such as propyl ester or sorbic acid, and if necessary, a usual flavoring or coloring agent can be added.
[0024]
Preparations for oral administration can be produced by methods known in the art, such as mixing, filling, or tableting. Further, the active ingredient may be distributed in a preparation using a large amount of a filler or the like by using a repeated blending operation. Formulations for parenteral administration are generally provided as liquid carrier dosage formulations containing the compound, the active ingredient, and a sterile vehicle. Solvents for parenteral administration are usually prepared by dissolving the compound in a vehicle, sterile-filtrating and then filling and sealing a suitable vial or ampoule. After freezing the composition to enhance stability, it may be filled into vials and the water removed under vacuum. Parenteral suspensions are prepared substantially in the same manner as for parenteral solutions, but can be suitably prepared by suspending the active ingredient in a vehicle and sterilizing the suspension with ethylene oxide or the like. Further, a surfactant, a wetting agent, and the like may be added as necessary so that the active ingredient has a uniform distribution.
[0025]
The dose of the compound of formula (1) or a prodrug thereof as an active ingredient may be appropriately determined in consideration of the purpose of treatment or prevention, the patient's symptoms, body weight, age, sex, and the like. Adults can be administered orally at a dose of about 0.05 to 30 mg / kg per day. It is desirable to administer such a dosage in one to several portions per day.
[0026]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
Production Example 1 Synthesis of Fullerene Hydroxide 5 mL of 30% fuming sulfuric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was placed in a 50 mL two-neck flask made of glass, and 1 g of C 60 (manufactured by Frontier Carbon Co., Ltd.) was added thereto while blowing dry nitrogen, followed by 5 hours The mixture was heated and stirred. This was slowly dropped into 20 mL of ice-cooled deionized water, and the product was filtered using filter paper.
[0027]
The red solid remaining on the filter paper was transferred to a glass 200 mL four-necked flask using 30 mL of deionized water, and heated and stirred for 5 hours. After cooling to room temperature, the mixture was filtered using filter paper, washed with 30 mL of deionized water, and then washed with 2.5% aqueous ammonia until the pH of the filtrate became 7 or more. The solid separated by filtration was dried in a vacuum (pressure 1.5 KPa) at 40 ° C. for 4 hours to obtain 1.2 g of a reddish brown solid (fullerene hydroxide).
[0028]
The resulting product, in the infrared absorption spectrum 3400 cm -1, the presence of hydroxyl groups than that absorption in the 1400 cm -1 and 1040 cm -1 were observed. In addition, the presence of a carbon-carbon double bond was confirmed by absorption at 1630 cm −1 . Further, the region of 3050 to 2900 cm −1 is a region where the absorption of a carbon-hydrogen bond appears, but since there is no absorption in this region, it can be said that hydrogen is bonded not to carbon but to oxygen. 60 (OH) n ) was found to have formed.
[0029]
In elemental analysis, C was 76.6%, H was 1.3%, O was 24.8%, N was 0.76%, and S was 0.44%. : 60, H10.7, O: 15.3, S: 0.1 (H / C = 10.7 / 60). In the mass spectrum, the 890 peak is the strongest, which corresponds to the hydroxylated fullerene having a molecular weight of 10 and the results of the elemental analysis and the mass spectrum do not agree with each other. It is considered a mixture. The water content was 5.6% as measured by Karl Fischer reagent.
[0030]
Thereafter, the solid was dried at 100 ° C. for 4 hours in vacuum (pressure 1.5 KPa) for 4 hours. The water content of the fullerene hydroxide was 0.5%, and the H / C of the elemental analysis was 12.7 / 60. After heating and drying, no decrease in the amount of hydrogen was recognized, and it was found that the fullerene hydroxide was not altered.
The fullerene hydroxide treated in vacuum at 100 ° C. for 4 hours had a solubility of about 200 mg in 1 mL of a 1% by weight aqueous sodium hydroxide solution.
[0031]
Example 1 Cytotoxicity test with fullerene hydroxide
1) Test solution used As a cell culture medium, immobilized fetal bovine serum and horse serum were added to liquid low glucose Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) for 5% of the medium volume, and kanamycin sulfate was further added at 100 mg. / L was used.
[0032]
0.02% EDTA-PBS solution (prepared by adding EDTA to 0.02% in PBS) and 0.25% trypsin-EDTA solution (0.02% EDTA-PBS solution) Powdery trypsin was added to be 0.25%).
[0033]
1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP + ) was dissolved in DMSO to prepare a 100 mM stock. Stocks were stored at -20 ° C in the dark.
Fullerol hydroxide was synthesized in the same manner as in Production Example 1 and dissolved in DMSO to prepare a 5 mM stock. Stocks were stored at -20 ° C in the dark.
[0034]
The XTT reagent solution was 1 mg of 2,3-Bis [2-methyoxy-4-nitro-5-sulfophenyl] -2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt (XTT), 0.5 mM phenazine methosulfate (PMS was used as a solvent and PBS was used as a solvent). 1) Serum-free liquid low glucose DMEM medium (1 ml) was added to 20 μl to prepare at the time of use.
[0035]
2) Cell culture PC12 cells, which are rat adrenal brown cells (neural cells), were used as cultured cells.
Usually, cells were cultured in a culture flask (culture area 25 cm 2 ), and when used for experiments, in a 96-well polystyrene microplate (flat bottom, low evaporation type). The cell culture was performed in a CO 2 incubator set at 37 ° C. and 5% CO 2 under humid conditions.
After passage of cells, the cells were washed with a 0.02% EDTA-PBS solution, detached using a 0.25% trypsin-PBS solution, dispersed by pipetting, and then adjusted to an appropriate concentration in a medium. Diluted.
[0036]
3) Cytotoxicity test The effect of hydroxylated fullerene on the survival rate of PC12 cells was examined using the XTT method. This XTT method is based on the following principle. Mitochondria play an important role as a site for energy production by oxidative phosphorylation. Actively proliferating cells produce a large amount of energy, but it is known that mitochondrial function is extremely reduced when cells are destroyed. On the other hand, analysis of the electron transport system using rat liver tissue extract has reported that tetrazolium salts such as XTT are good substrates for mitochondrial dehydrogenase. Since XTT changes to a water-soluble formazan dye when reduced, it is possible to quantify the number of viable cells by measuring the absorbance. Thus, by comparing with untreated cells, the decrease in living cells, that is, the increase in cell death, due to the compound can be quantified. This principle is schematically shown in FIG.
[0037]
The treatment concentrations of fullerene hydroxide were 2.5 μM, 5 μM, 10 μM, and 20 μM, and the drug treatment times were 48 hours and 72 hours.
PC12 cells in the logarithmic growth phase were added to a 96-well microplate at a concentration of 4.0 × 10 5 cells / ml in a volume of 50 μl and cultured in a CO 2 incubator for 24 hours. The fullerene hydroxide solution was added to the medium at twice the respective target concentrations, and 50 μl of each solution was added to a 96-well microplate (diluted twice to obtain 50 → 100 μl to obtain the target concentration). After culturing for 48 hours or 72 hours in a CO 2 incubator, the medium was changed, and the cells were further cultured for 24 hours in a CO 2 incubator. The XTT test solution was added in an amount of 50 μl each, and after culturing in a CO 2 incubator for 4 hours, the cell viability was immediately calculated from the absorbance at 450 nm using a plate reader according to the following formula.
[0038]
Cell viability = (S−B) / (C−B) × 100%
S = absorbance of specimen B = absorbance of medium only C = absorbance of control The results are shown in Table 1. As is clear from Table 1, the cytotoxicity of the fullerene hydroxide was not confirmed for 48 hours and 72 hours. This result indicates that hydroxylated fullerene is not toxic to nerve cells.
[0039]
[Table 1]
[0040]
Example 2 Effect of reducing fullerene hydroxide on MPP + toxicity The effect of fullerene hydroxide on MPP + toxicity was examined using the XTT method. As the fullerene hydroxide, the XTT reagent and the PC12 cells, those prepared in the same manner as in Example 1 were used.
The treatment concentration of MPP + was 125 μM, and the cell viability was examined for those without addition of fullerene hydroxide, 5 μM, and 20 μM. Here, MPP + and fullerene hydroxide were added at the same time.
[0041]
PC12 cells in the logarithmic growth phase were added to a 96-well microplate at a concentration of 4.0 × 10 5 cells / ml in a volume of 50 μl and cultured in a CO 2 incubator for 24 hours. The fullerene hydroxide solution was added to the medium, and 50 μl each was added to a 96-well microplate. After culturing for 24 hours in a CO 2 incubator, the medium was changed, and the cells were further cultured for 24 hours in a CO 2 incubator. The XTT test solution was added in an amount of 50 μl each, and the cells were cultured in a CO 2 incubator for 4 hours. Immediately thereafter, the cell viability was calculated from the absorbance at 450 nm using a plate reader according to the following formula.
[0042]
(Cell viability) = (SB) / (CB) × 100
S = absorbance of specimen B = absorbance of medium only C = absorbance of control The results are shown in Table 2. This result indicates that C 60 (OH) n attenuates MPP + -induced neuronal toxicity.
[0043]
[Table 2]
Control 100
MPP + 125 μM 13.3
MPP + 125 μM + Fullerol 5 μM 26.7
MPP + 125 μM + Fullerol 20 μM 29.3
[0044]
【The invention's effect】
The nerve cell protective agent of the present invention has an excellent inhibitory effect on nerve cell death, and is considered to be an agent for preventing and / or treating various diseases caused by acute or chronic nerve damage.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram schematically showing the principle of the XTT method.
