【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液、体液等の血球浮遊液から白血球を選択的に除去するための白血球選択吸着剤及びフィルターに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、種々の疾患治療に血液中の必要な成分のみを輸血する成分輸血が盛んに行なわれるようになった。成分輸血に用いられる血液製剤、すなわち赤血球製剤、血小板製剤、血漿製剤などは全血を遠心分離して調製される。しかし遠心分離操作で調製された血液製剤には多くの白血球が含まれており、この白血球が原因となって輸血後の副作用、たとえば、軽微なものでは頭痛、吐き気から重篤なものでは白血球中に存在するウイルスによる感染などが起こることが明らかにされている。通常、全血中には１ｍｌ当たり１０００万個の白血球が含まれており、頭痛などの軽微な副作用を防止するためには１回の輸血で患者に輸注される白血球の数を１億個程度より少なくする必要があるとされ、血液製剤における白血球の残存率（全血を基準にした）が１／１０〜１／１００以下にする必要がある。さらにこの残存率が１／１０，０００〜１／１，０００，０００とすることができれば、重篤な副作用を防止することができると期待される。このため、血液製剤に混入している白血球を除去してから血液製剤を輸血する、いわゆる白血球除去輸血が普及してきた。
【０００３】
血液製剤から白血球を除去する工業的手段としては、遠心分離法と、不織布などの繊維構造体や網目構造やスポンジ構造を有するフィルターによるろ過法があるが、白血球除去効率が高いこと、操作が簡便であること、コストが安いことなどの理由からフィルターによるろ過法が広く用いられている。以下、不織布などの繊維構造体や網目構造やスポンジ構造を有するフィルターを総称してフィルター材と呼ぶ。
白血球を効率的に除去するために、フィルター材の厚み、平均繊維径、充填密度といった、物理的構造の様々な工夫がなされている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
しかし、フィルター材表面が疎水性の場合、これらの方法では白血球のみならず他の血球成分、特に高い粘着性を持つ血小板の除去の効率まで上げてしまう。
このため、フィルター材表面の改質が行われる。表面改質には、親水性ポリマーなどの抗血栓性材料を、コートなどの方法によりフィルター材表面に保持させる手法が主に用いられる。しかし、このような手法により血小板の吸着を抑制した場合には白血球の吸着まで抑制され、本来の目的にかなわない（例えば、特許文献２参照。）。
【０００５】
また、フィルター材に適量の塩基性官能基と非イオン性親水基とを含むポリマーをコーティングするなどの方法により、白血球除去に優れ、かつ血小板の通過性が高まることが開示され、白血球除去フィルターを牛の血液処理に用いる実験が実施されている（例えば、特許文献３参照。）。
【０００６】
しかし、該公報に記載されるフィルターは、牛の血液処理や人の濃厚血小板製剤の処理に用いる場合には、高い血小板通過性を有し、白血球選択除去能にも優れているが、ヒトの全血液の処理に用いる場合には、血小板通過性が劣ってくる点で充分満足するものでない。
さらに、例えば、特許文献４には、塩基性含窒素官能基と非イオン性親水基とを含む白血球選択吸着剤を用いたフィルターの白血球除去能と血小板透過性は塩基性含窒素官能基の含有量に支配され、塩基性含窒素官能基の含有量には最適範囲が存在することが示されている。
【０００７】
しかしながら、本発明者らの実験によると、たとえ、白血球選択吸着剤を重合する際のモノマーの仕込み比を最適にし、設計どおりの平均組成を持つ白血球吸着剤を得たとしても、予定通りの白血球除去能及び血小板透過性が得られないことがあることが分かった。そこで、本発明者らは、白血球除去フィルターの性能が満足できない理由として、共重合ポリマーが均一物質ではなく、組成分布と分子量分布が交差した複雑な混合物であることが挙げられるのではないかと考えた。すなわち、共重合ポリマーの組成分布が広ければ目指す性能が得られないことがあるため、白血球選択吸着剤をはじめとする機能性高分子の設計においては、これまで設計の指標とされてきたポリマーの組成比、平均分子量、分子量分布の他に組成分布の均一性を考慮することが重要であると予測した。
【０００８】
【特許文献１】
特公平２−１３５８７号公報（第４−８頁）
【特許文献２】
特開昭５５−１２９７５５号
【特許文献３】
特公平６−５１０６０号公報（第５−７頁、第１−２表）
【特許文献４】
特公平６−５１０６０号公報（第１、５−７頁、第１−２表）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、血液に代表される血小板と白血球を含有する細胞浮遊液から血小板の損失を低く抑えながら白血球を除去する、血小板通過性及び白血球除去能に優れた白血球選択吸着剤及び白血球選択除去用フィルターを提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、従来技術の問題点を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、前記のように、これまで設計の指標とされてきたポリマーの平均組成比、平均分子量、分子量分布の他に組成分布の均一性を考慮することが重要であると予測し、フリーフロー等速電気泳動法などの荷電による成分分離法を用いて共重合ポリマーの成分分離を行うと、電荷量、たとえば塩基性含窒素官能基の含有率のみに依存する分離が可能であることを見出し、本発明に至った。
【００１１】
本発明は、非イオン性親水基と塩基性含窒素官能基を少なくとも有する共重合ポリマーからなり、荷電による成分分離を行って得た塩基性含窒素官能基の含有率Ｙが、該ポリマーにおいて均一であることを特徴とする白血球選択吸着剤及び白血球選択除去用フィルターに関する。
さらに詳細には、本発明は、非イオン性親水基と、全モノマーユニットに対して平均Ｘｍｏｌ％の塩基性含窒素官能基を含有する共重合ポリマーを試料として、フリーフロー等速電気泳動に代表される、荷電による成分分離を行い、各分離成分について塩基性含窒素官能基の含有率Ｙの測定をし、Ｙが（１／２）Ｘｍｏｌ％≦Ｙ≦（３／２）Ｘｍｏｌ％（ここで、Ｘは共重合ポリマーにおける塩基性含窒素官能基の平均含有率）の範囲内である成分を、全分離成分の７５重量％以上含有することを指標として選んだ、血小板通過性及び白血球除去能に優れた白血球選択吸着剤及び白血球選択除去用フィルターに関するものである。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）非イオン性親水基と塩基性含窒素官能基とを少なくとも有する共重合ポリマーからなり、荷電による成分分離によって得た各分離成分について測定した塩基性含窒素官能基の含有率Ｙが（１／２）Ｘｍｏｌ％≦Ｙ≦（３／２）Ｘｍｏｌ％（ここで、Ｘは塩基性含窒素官能基の平均含有率）の範囲内である成分を、全分離成分の７５重量％以上有することを特徴とする白血球選択吸着剤、
（２）共重合ポリマーにおける塩基性含窒素官能基の平均含有率Ｘが、０．１〜１０ｍｏｌ％である上記（１）に記載の白血球選択吸着剤、
（３）荷電による成分分離にフリーフロー等速電気泳動法を用いることを特徴とする上記（１）または（２）記載の白血球選択吸着剤、
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載された白血球選択吸着剤を、少なくともフィルター表面に保持させたことを特徴とする白血球選択除去用フィルター、および
（５）非イオン性親水基と塩基性含窒素官能基とを少なくとも有する共重合ポリマーにおいて、荷電による成分分離を行い、各分離成分について測定した塩基性含窒素官能基の含有率Ｙが（１／２）Ｘｍｏｌ％≦Ｙ≦（３／２）Ｘｍｏｌ％（ここで、Ｘは共重合ポリマーにおける塩基性含窒素官能基の平均含有率）の範囲内である成分を、全分離成分の７５重量％以上有することを指標として白血球選択吸着材を製造する方法、
を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明における荷電による成分分離とは、キャピラリー電気泳動やフリーフロー等速電気泳動法に代表される、電圧を分離の駆動力とした成分分離法を言う。成分分離の際には脱塩作業や吸着などによる試料のロスが避けられないが、試料の性質を示すデータを得るためには、成分分離のトータルの回収率が７０重量％以上でなければならない。ここで、成分分離のトータルの回収率とは、成分分離を行う試料中に含まれるポリマーの乾燥重量と成分分離後に回収されたポリマー成分の総乾燥重量の比を言う。
【００１４】
本発明における白血球選択吸着剤とは、血液から白血球を選択的に除去し、赤血球、血小板、血漿タンパクは通過させる機能を有するポリマーである。一般に吸着剤の白血球吸着性能を高くすると、血小板に対する吸着性も同時に高くなる傾向があり、白血球選択吸着性は下がる。本発明が提供する白血球選択吸着剤は血小板の非吸着性、すなわち血小板回収率が高い白血球吸着剤である。本発明の白血球選択吸着剤とは、数式（１）で定義される白血球吸着係数が大きく、数式（２）で定義される血小板回収率が高い吸着剤である。
白血球吸着係数＝−ｌｏｇ｛（ろ過後回収液中の白血球濃度）／（ろ過前血液中の白血球濃度）｝ （１）
血小板回収率（％）＝｛（ろ過後回収液中の血小板濃度）／（ろ過前血液中の血小板濃度）｝×１００ （２）
【００１５】
白血球選択吸着剤としての良好な性能とは、実施例に示す実験系において白血球吸着係数が４．０以上、かつ血小板回収率が５０％以上であることを指す。白血球残存率と血小板回収率は、測定に用いるフィルター材のサイズや容量、ろ過圧力や処理される血液量、また用いる血液の由来により必ずしも一定ではないため、別々の血液提供者から採取したヒト新鮮血から得られた値の平均値を採用した。
【００１６】
本発明における白血球選択除去用フィルターとは、全血に代表される白血球含有液中の白血球は捕捉するが、他の血液成分、即ち赤血球、血小板、血漿は捕捉しないフィルターである。該フィルターは、フィルター材の表面にコートや修飾などの方法で白血球選択吸着剤を固定化させたものでも、フィルター材そのものを白血球選択吸着剤で作製したものでもよい。
【００１７】
本発明における塩基性含窒素官能基の含有率とは、全モノマーユニットに対する塩基性含窒素官能基のモル分率であり、核磁気共鳴（以下、ＮＭＲと略す）の積分値から求めることができる。本発明の実施例では塩基性含窒素官能基の含有率を１Ｈ−ＮＭＲにより求めた。
【００１８】
本発明における、白血球選択吸着剤の塩基性含窒素官能基の平均含有率Ｘは、荷電による成分分離の前に、ＮＭＲにより求めた。分離前における白血球選択吸着剤の塩基性含窒素官能基の平均含有率Ｘは０．１ｍｏｌ％〜１０ｍｏｌ％の範囲であることが望ましく、より好ましいのは１ｍｏｌ％〜６ｍｏｌ％である。塩基性含窒素官能基の平均含有率が０．１ｍｏｌ％未満であると血小板と共に白血球も粘着しにくくなるため、白血球の選択除去が行えなくなる傾向にある。一方、塩基性含窒素官能基の平均含有率が１０ｍｏｌ％を超えると白血球と共に血小板も粘着しやすくなるため、この場合も白血球の選択除去が行えなくなる傾向にある。
【００１９】
本発明の白血球選択吸着剤では、荷電による成分分離によって得た各分離成分における塩基性含窒素官能基の含有率Ｙが、均一であること、すなわち、白血球選択吸着剤を構成している共重合ポリマーにおける塩基性含窒素官能基の分布幅が狭いことを特徴とするものである。具体的には、本発明の白血球選択吸着剤は、荷電による成分分離によって得た各分離成分ごとに塩基性含窒素官能基の含有率Ｙを測定し、Ｙが（１／２）Ｘｍｏｌ％≦Ｙ≦（３／２）Ｘｍｏｌ％の範囲内である成分を、全分離成分の７５重量％以上有する共重合ポリマーからなるものである。（１／２）Ｘｍｏｌ％≦Ｙ≦（３／２）Ｘｍｏｌ％の範囲内にある成分は、９０重量％以上であることがさらに好ましい。
荷電による成分分離後の塩基性含窒素官能基の含有率Ｙも、塩基性含窒素官能基の平均含有率Ｘと同様にＮＭＲによって求めた。
【００２０】
本発明における非イオン性親水基として、具体的にはヒドロキシル基、アミド基、エーテル基、ニトロ基、ニトロソ基、スルホキシド基、スルホニル基、スルホ基、シアノ基、カルボキサミド、スルホンアミド、チオ酸アミド、シアナート、チオシアナートイソチオシアナートなどが挙げられるが、これらに限ったものではない。この中でも化学的に安定でかつ親水性の高い、ヒドロキシル基、アミド基、エーテル基が特に好ましい。
【００２１】
本発明における塩基性とは、正の荷電を有することを言う。塩基性の官能基は正の荷電を有しているため、生理的条件下で負に帯電している白血球を静電的な相互作用により効率的に吸着する効果があり、白血球に対する親和性を向上させることができる。
本発明における塩基性含窒素官能基として、具体的には第二級アミノ基、第三級アミノ基、第四級アンモニウム基、及びピロール、ピラゾール、ピロリジン、ピペリジンなどの骨格を有する含窒素複素環基などが挙げられるが、これらに限ったものではない。この中でも化学的に安定でかつ医療器具として安全性が高いという点で第二級アミノ基、第三級アミノ基が好ましい。
【００２２】
本発明で言うポリマー構成成分の塩基性含窒素官能基の含有率は荷電による分離により求めることができる。本発明では分離成分の回収も行うため、公知の方法であるフリーフロー等速電気泳動法（ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ ８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ Ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， Ｒｏｍｅ， Ｏｃｔｏｂｅｒ ６−９， １９９２ １９９３ ＶＯＬ ６３８； ＮＵＭＢＥＲ ２ ，ｐａｇｅ（Ｓ） ２１５）を採用した。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳述する。
【実施例】
白血球選択吸着剤としてコポリマーＡ’を用いた。コポリマーＡ’は、非イオン性親水基を有する２−ヒドロキシエチルメタアクリレート（以下ＨＥＭＡと略称する）２５７ｇと塩基性含窒素官能基を有するジメチルアミノエチルメタアクリレート（以下ＤＭと略称する）９．６ｇを通常の溶液ラジカル重合により合成して得られるコポリマーＡを成分分離することで得た。成分分離法は下記のとおりである。
【００２４】
コポリマーＡの成分分離は、フリーフロー等速電気泳動を用いて行った。フリーフロー等速電気泳動装置はＤｒ．Ｗｅｂｅｒ社製のＯＣＴＯＰＵＳを用いた。フリーフロー等速電気泳動の移動相として、２０ｖｏｌ％のエタノールを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）を用いた。移動相の流速は５．２７ｍｌ／ｍｉｎであった。コポリマーＡを移動相と同じ組成の溶媒に溶解させてサンプルとした。サンプル中のコポリマーＡの濃度は０．８重量％とした。移動相が層流となったところでサンプルを送液した。送液速度は０．１２ｍｌ／ｍｉｎとした。移動相の流れ方向に垂直となるように、１５００Ｖの電圧を印加して、電荷による分離を行った。分離成分の回収は分離部の終点に設けた１００個の回収孔を用い、４０分間回収を行った。泳動距離が長い成分ほど大きな番号を付した回収孔から回収される。コポリマーＡの分離成分の検出には紫外検出器を用いた。得られたクロマトグラムからコポリマーＡの成分が存在する回収液の範囲を確認した上で、この範囲の回収液を回収孔番号の低い方から順に５つずつ統合して、コポリマーＡの成分が存在する回収液をａ〜ｆの６つのフラクションに分割した。
【００２５】
得られたフラクションにはリン酸とリン酸ナトリウムが多量に含まれているため、脱塩を行う必要がある。このため、以下の方法で脱塩を行った。各フラクションに含有するリン酸塩の量を体積とリン酸塩濃度から算出し、水酸化ナトリウム添加量がリン酸塩の１．５等量となるように０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えて、すべてのリン酸をリン酸ナトリウムとする。フラクションを減圧乾燥により乾燥させた後、ポリマー成分のみを溶媒抽出する。この溶液を液体クロマトグラフィー用の不溶物除去フィルター（クラボウ製クロマトフィルター：フィルター径２０ｍｍ、孔径０．４５μｍ）を用いてろ過し、浮遊するリン酸ナトリウムを除いた。得られた濾液を、エバポレーターを用いて減圧乾燥して大半の溶媒を除いた後、真空乾燥してわずかに残留する溶媒を除いた。分離成分のトータルの回収率は７６重量％であった。
【００２６】
フラクション毎に成分の１Ｈ−ＮＭＲ測定を行い、各分離成分のＤＭの含有率を求めたところ、フリーフロー等速電気泳動の分離はＤＭの含有率に依存していることが示された。ＮＭＲ測定には５００ＭＨｚのＮＭＲ（日本電子製ＡＬＰＨＡ５００）を用い、３ｍｍφのサンプル管を用いて測定を行った。
ＤＭの含有率を横軸、乾燥重量を縦軸として、コポリマーＡの分離挙動を示したものが図１である。フリーフロー等速電気泳動による分離を行う前におけるコポリマーＡのＤＭ含有率Ｘは２．４％であるので、（１／２）Ｘｍｏｌ％＝１．２％、（３／２）Ｘｍｏｌ％＝３．６％である。図１からコポリマーＡの分離成分のうち、塩基性含窒素官能基の含有率Ｙが（１／２）Ｘｍｏｌ％≦Ｙ≦（３／２）Ｘｍｏｌ％の範囲内である成分はフラクションｃ〜ｆであることがわかる。
【００２７】
コポリマーＡのフリーフロー等速電気泳動による成分分離を約４０時間行い、フラクションｃ〜ｆを統合し、脱塩を行った。この結果、コポリマーＡの分離成分であるコポリマーＡ’を約１．２ｇ得た。コポリマーＡ’のＤＭの平均含有率は２．６ｍｏｌ％であった。
このようにして得られたコポリマーＡ’の成分分離を、コポリマーＡと同様の条件で、フリーフロー等速電気泳動を用いて行った。コポリマーＡ’における分離成分のトータルの回収率は７６重量％であった。
【００２８】
ＤＭの含有率を横軸、乾燥重量を縦軸として、コポリマーＡ’の分離挙動を示したものが図２である。分離前のコポリマーＡ’のＤＭ含有率Ｘは２．６％であるので、（１／２）Ｘｍｏｌ％＝１．３％、（３／２）Ｘｍｏｌ％＝３．９％である。図２からコポリマーＡ’は、分離成分の塩基性含窒素官能基の含有率Ｙが（１／２）Ｘｍｏｌ％≦Ｙ≦（３／２）Ｘｍｏｌ％の範囲内である成分を、９１ｗｔ％有することが示された。
【００２９】
コポリマーＡ’を下記に示す方法でフィルター基材へコーティングした。コポリマーＡ’１ｇを５０重量％イソプロピルアルコール水溶液１９ｇに４０℃で溶解して、コポリマーＡ’の５重量％コート溶液を調製した。該コート溶液に平均繊維直径１．２μｍのポリエチレンテレフタレート繊維よりなる不織布（４０ｇ／ｍ２目付、厚さ０．２ｍｍ、幅１５０ｍｍ）を連続的に浸漬させた後、ニップロールに挟んで通過させることにより、余分なコート溶液を除去した。コーティングされた不織布は、排気ダクトを備えた乾燥室内で室温にて一昼夜乾燥させた後、回収した。
このようにして製造したコーティング不織布の任意の場所から直径２０ｍｍの円形フィルター３２枚を切り抜き、その３２枚をフィルターホルダーに重ねて充填（充填密度０．２ｇ／ｃｍ３）し、カラムとした。このカラムに後述する方法で調製したヒト新鮮全血を、シリンジポンプを用いて一定の流速０．７４ｍｌ／ｍｉｎで流し、その１３．３ｍｌを回収した。
ヒト新鮮全血は、採血した血液１００ｍｌに対し、抗凝固剤として濾過済みＣＰＤ溶液（クエン酸三ナトリウム二水和物２６．３ｇ、クエン酸一水和物３．２７ｇ、グルコース２３．２ｇ、およびリン酸二水素ナトリウム二水和物２．５１ｇを注射用蒸留水１０００ｍｌに溶解させ、孔径０．２μｍのフィルターで濾過した溶液）を１４ｍｌ加えて混和し、２０℃で３時間保存することにより調製した。
【００３０】
濾過前の血液、および血液を濾過した後の回収液について、その一定量の血液を採取し、白血球濃度は残存白血球測定用試薬システムＬｅｕｃｏＣＯＵＮＴＴＭｋｉｔ、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、および解析ソフトＣＥＬＬ Ｑｕｅｓｔ（以上、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を用いて測定した。また、血小板濃度は自動血球計数装置ＭＡＸ Ａ／Ｌ Ｒｅｔｉｃ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ、米国）を用いて測定した。その結果、コポリマーＡ’の白血球吸着係数は４．２、血小板回収率は５６．５％であり、白血球を選択的に除去する能力が良好であることが示された。
以上の結果から、本発明により、非イオン性親水基と、全モノマーユニットに対して平均Ｘｍｏｌ％の塩基性含窒素官能基を含有する共重合ポリマーである白血球選択吸着剤のフリーフロー等速電気泳動による成分分離を行い、回収した全分離成分のうち７５重量％以上がＸ±１／２Ｘｍｏｌ％の範囲内の塩基性含窒素官能基を含有することを指標とすることで、血液に代表される血小板と白血球を含有する細胞浮遊液から血小板の損失を低く抑えながら白血球を除去することが可能な、血小板通過性及び白血球除去能に優れた白血球選択吸着剤及び白血球選択除去用フィルターを提供することができた。
【００３１】
また、本発明の結果から、フリーフロー等速電気泳動を用いてより狭い範囲での成分回収を行ったり、精密重合を行ったりして、ＤＭの分布幅をさらに狭くすれば、コポリマーＡ’以上の性能を有する白血球選択吸着剤を得ることができると考えられる。
【００３２】
【比較例１】
コポリマーＡのフリーフロー等速電気泳動による分離挙動を示した図１から、分離成分のうち塩基性含窒素官能基の含有率Ｙが（１／２）Ｘｍｏｌ％≦Ｙ≦（３／２）Ｘｍｏｌ％の範囲内である成分をコポリマーＡは全分離成分の７１重量％有することが示される。
コポリマーＡの白血球吸着係数と血小板回収率を、コポリマーＡ’の場合と同様の方法で求めた。コポリマーＡの白血球吸着係数は３．８、血小板回収率は５４．２％であり、血小板は吸着しないが、白血球吸着係数が小さく、白血球選択吸着能が満足いく値でないことが示された。この結果、（１／２）Ｘｍｏｌ％≦Ｙ≦（３／２）Ｘｍｏｌ％の範囲内である成分を回収して得たコポリマーＡ’に比べ、組成分布の広いコポリマーＡでは白血球選択吸着剤としての能力である白血球吸着性能が低下することがわかった。
【００３３】
【比較例２】
白血球選択吸着剤として、非イオン性親水基を有するＨＥＭＡと塩基性含窒素官能基を有するコポリマーＢを用いた。コポリマーＢの重合条件は、モノマーの滴下条件のみをコポリマーＡの重合条件から変更している。コポリマーＢのモノマーの滴下条件は、ＨＥＭＡのみを反応容器中で重合した後、続けてＨＥＭＡ２５．７ｇとＤＭ９．６ｇであるモノマー混合物を滴下して、最終的なモノマー重量がＨＥＭＡ２５７ｇ、ＤＭ９．６ｇとなるようにした。コポリマーＢはＨＥＭＡを先に加えることで低ＤＭ含有率の成分を多く含むことが予想される。この低ＤＭ含有率の成分を多く含み、成分分布の広いと考えられるコポリマーＢについて、同様な検討を行った。フリーフロー等速電気泳動による分離を行う前におけるコポリマーＢのＤＭの平均含有率は２．４ｍｏｌ％であった。
この様にして得られたコポリマーＢの成分分離を、フリーフロー等速電気泳動を用いて行った。フリーフロー等速電気泳動の移動相として、２５ｖｏｌ％のエタノールを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）を用いた。コポリマーＢを移動相と同じ組成の溶媒に溶解させてサンプルとした。サンプル中のコポリマーＢの濃度は０．７５重量％とした。コポリマーＡの場合と同様にして分離を行いａ〜ｆの６つのフラクションに分割した。分離成分のトータルの回収率は７６重量％であり、ＤＭの含有率を横軸、乾燥重量を縦軸として、コポリマーＢの分離挙動を示したものが図３である。図３から、荷電量による分離を行い、回収した分離成分のうち、分離成分の塩基性含窒素官能基の含有率Ｙが（１／２）Ｘｍｏｌ％≦Ｙ≦（３／２）Ｘｍｏｌ％の範囲内である成分を、コポリマーＢは全分離成分の７１重量％有することが示された。また、コポリマーＢは、予想通り低ＤＭ含有率の成分を多く含んでいた。
コポリマーＢの白血球吸着係数と血小板回収率をコポリマーＡ’の場合と同様の方法で求めた。コポリマーＢの白血球吸着係数は３．６、血小板回収率は５４．２％であり、血小板は吸着しないが、白血球吸着係数が小さく、白血球選択吸着能が落ちることが示された。この結果、低ＤＭ含有率の成分を多く含み、組成分布の広いコポリマーＢでは白血球選択吸着剤としての能力である白血球吸着性能が低下することがわかった。
【００３４】
【比較例３】
白血球選択吸着剤として、非イオン性親水基を有するＨＥＭＡと塩基性含窒素官能基を有するＤＭを有するコポリマーＣを用いた。コポリマーＣの重合条件は、モノマーの滴下条件のみをコポリマーＡの重合条件から変更している。コポリマーＣのモノマーの滴下条件は、まずＨＥＭＡ２５．７ｇとＤＭ９．６ｇを重合し、続けてＨＥＭＡを滴下して、最終的なモノマー重量がＨＥＭＡ２５７ｇ、ＤＭ９．６ｇとなるようにした。コポリマーＣはＤＭを先に加えることで高ＤＭ含有率の成分を多く含むことが予想される。この高ＤＭ含有率の成分を多く含み、成分分布の広いと考えられるコポリマーＣについて、同様な検討を行った。コポリマーＡの場合と同様にしてＤＭの平均含有率を求めたところ、フリーフロー等速電気泳動による分離を行う前におけるコポリマーＣのＤＭの平均含有率は２．６ｍｏｌ％であった。
このようにして得られたコポリマーＣの成分分離を、フリーフロー等速電気泳動を用いて行った。フリーフロー等速電気泳動の移動相として、２５ｖｏｌ％のエタノールを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）を用いた。コポリマーＣを移動相と同じ組成の溶媒に溶解させてサンプルとした。サンプル中のコポリマーＣの濃度は０．７５重量％とした。コポリマーＡの場合と同様にして分離を行い、ａ〜ｆの６つのフラクションに分割した。分離成分のトータルの回収率は７６重量％であり、ＤＭの含有率を横軸、乾燥重量を縦軸として、コポリマーＣの分離挙動を示したものが図４である。図４から、荷電量による分離を行って得た分離成分のうち、分離成分の塩基性含窒素官能基の含有率Ｙが（１／２）Ｘｍｏｌ％≦Ｙ≦（３／２）Ｘｍｏｌ％の範囲内である成分を、コポリマーＣは全分離成分の６０重量％有することが示された。またコポリマーＣは、予想通り高ＤＭ含有率の成分を多く含んでいた。
コポリマーＣの白血球吸着係数と血小板回収率をコポリマーＡ’の場合と同様の方法で求めた。コポリマーＣの白血球吸着係数は３．７、血小板回収率は１６．８％であり、白血球と血小板を共に吸着させてしまうことが示された。この結果、高ＤＭ含有率の成分を多く含み、組成分布の広いコポリマーＣでは白血球選択吸着剤としての能力である血小板回収率が低下することがわかった。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、非イオン性親水基と、全モノマーユニットに対して平均Ｘｍｏｌ％の塩基性含窒素官能基を含有する共重合ポリマーである白血球選択吸着剤のフリーフロー等速電気泳動に代表される荷電による成分分離を行い、回収した全分離成分のうち７５重量％以上がＸ±１／２Ｘｍｏｌ％の範囲内の塩基性含窒素官能基を含有することを指標とすることで、血液に代表される血小板と白血球を含有する細胞浮遊液から血小板の損失を低く抑えながら白血球を除去できる、血小板通過性及び白血球除去能に優れた白血球選択吸着剤及び白血球選択除去用フィルターを提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例における、コポリマーＡの分離挙動である。
【図２】実施例における、コポリマーＡ’の分離挙動である。
【図３】比較例２における、コポリマーＢの分離挙動である。
【図４】比較例３における、コポリマーＣの分離挙動である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a leukocyte selective adsorbent and a filter for selectively removing leukocytes from a blood cell suspension such as blood or body fluid.
[0002]
[Prior art]
2. Description of the Related Art In recent years, component transfusion for transfusing only necessary components in blood for treatment of various diseases has been actively performed. Blood products used for component transfusion, that is, erythrocyte products, platelet products, plasma products, etc. are prepared by centrifuging whole blood. However, blood products prepared by centrifugation contain many white blood cells, which can cause side effects after blood transfusion, such as headache in minor cases and leukocyte in severe cases from nausea. It has been clarified that infections caused by viruses present in the virus occur. Normally, whole blood contains 10 million white blood cells per ml, and to prevent minor side effects such as headaches, the number of white blood cells to be infused to a patient in one blood transfusion is about 100 million. It is said that it is necessary to reduce the ratio, and the residual ratio of leukocytes in the blood product (based on whole blood) needs to be 1/10 to 1/100 or less. Furthermore, if this residual ratio can be set at 1 / 10,000 to 1 / 1,000,000, it is expected that serious side effects can be prevented. For this reason, so-called leukocyte-removed transfusion, in which a blood product is transfused after removing leukocytes mixed in the blood product, has become widespread.
[0003]
Industrial methods for removing leukocytes from blood products include centrifugal separation and filtration using a filter having a fibrous structure such as nonwoven fabric, a mesh structure, or a sponge structure. The filtration method using a filter is widely used because of its low cost and low cost. Hereinafter, a filter having a fibrous structure such as a nonwoven fabric, a mesh structure, or a sponge structure is generally referred to as a filter material.
In order to efficiently remove leukocytes, various measures have been taken for the physical structure such as the thickness of the filter material, the average fiber diameter, and the packing density (for example, see Patent Document 1).
[0004]
However, when the surface of the filter material is hydrophobic, these methods increase the efficiency of removing not only white blood cells but also other blood cell components, particularly platelets having high viscosity.
Therefore, the surface of the filter material is modified. For the surface modification, a method of holding an antithrombotic material such as a hydrophilic polymer on the surface of the filter material by a method such as coating is mainly used. However, when the adsorption of platelets is suppressed by such a method, the adsorption of leukocytes is also suppressed, which does not meet the original purpose (for example, see Patent Document 2).
[0005]
In addition, it is disclosed that, by a method such as coating a polymer containing an appropriate amount of a basic functional group and a nonionic hydrophilic group on a filter material, excellent leukocyte removal and increased platelet permeability are disclosed. An experiment for blood treatment of cattle has been conducted (for example, see Patent Document 3).
[0006]
However, when the filter described in this publication is used for the treatment of bovine blood or the treatment of human concentrated platelet preparations, it has high platelet permeability and is excellent in the ability to selectively remove leukocytes. When used for the treatment of whole blood, it is not satisfactory in that the platelet permeability is poor.
Further, for example, Patent Document 4 discloses that the leukocyte removal ability and platelet permeability of a filter using a leukocyte selective adsorbent containing a basic nitrogen-containing functional group and a nonionic hydrophilic group include the basic nitrogen-containing functional group. It is shown that there is an optimum range for the content of the basic nitrogen-containing functional group, governed by the amount.
[0007]
However, according to the experiments of the present inventors, even if the charge ratio of monomers when polymerizing the leukocyte selective adsorbent is optimized and a leukocyte adsorbent having an average composition as designed is obtained, the expected leukocyte adsorbent is obtained. It was found that removal ability and platelet permeability could not be obtained in some cases. Therefore, the present inventors think that the reason why the performance of the leukocyte removal filter cannot be satisfied may be that the copolymer is not a homogeneous substance but a complex mixture in which the composition distribution and the molecular weight distribution intersect. Was. That is, if the composition distribution of the copolymer is wide, the desired performance may not be obtained.Therefore, in the design of functional macromolecules such as leukocyte selective adsorbents, the design index of It was predicted that it was important to consider the uniformity of the composition distribution in addition to the composition ratio, average molecular weight, and molecular weight distribution.
[0008]
[Patent Document 1]
JP-B-2-13587 (pages 4-8)
[Patent Document 2]
JP-A-55-129755
[Patent Document 3]
Japanese Patent Publication No. Hei 6-51060 (Page 5-7, Table 1-2)
[Patent Document 4]
Japanese Patent Publication No. 6-51060 (Pages 1, 5-7, Table 1-2)
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to remove leukocytes from a cell suspension containing platelets and leukocytes typified by blood while suppressing the loss of platelets, and to provide a leukocyte selective adsorbent and leukocyte selection excellent in platelet permeability and leukocyte removal ability. It is to provide a filter for removal.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the problems of the prior art, and as a result, as described above, as well as the average composition ratio, average molecular weight, and molecular weight distribution of polymers that have been used as design indices so far. It is predicted that it is important to consider the uniformity of the composition distribution, and if the component separation of the copolymer is performed using a component separation method such as free flow isotachophoresis, the charge amount, for example, the base amount The present inventors have found that separation that depends only on the content of the functional nitrogen-containing functional group is possible, and have reached the present invention.
[0011]
The present invention comprises a copolymer having at least a nonionic hydrophilic group and a basic nitrogen-containing functional group, and the content Y of the basic nitrogen-containing functional group obtained by performing component separation by charging is uniform in the polymer. And a filter for selectively removing leukocytes.
More specifically, the present invention is directed to free-flow isotachophoresis using, as a sample, a copolymer containing a nonionic hydrophilic group and an average of X mol% of a basic nitrogen-containing functional group with respect to all monomer units. Is performed, and the content Y of the basic nitrogen-containing functional group is measured for each separated component, and Y is (1/2) Xmol% ≦ Y ≦ (3/2) Xmol% (here Wherein X is a component within the range of the basic nitrogen-containing functional group in the copolymer) and is selected as an index to contain at least 75% by weight of all the separated components. TECHNICAL FIELD The present invention relates to a leukocyte selective adsorbent and a leukocyte selective removal filter having excellent performance.
[0012]
That is, the present invention
(1) It consists of a copolymer having at least a nonionic hydrophilic group and a basic nitrogen-containing functional group, and the content Y of the basic nitrogen-containing functional group measured for each separated component obtained by component separation by charging is ( (1/2) X mol% ≦ Y ≦ (3/2) X mol% (where X is the average content of the basic nitrogen-containing functional group) has 75% by weight or more of all separated components. A selective leukocyte adsorbent,
(2) The selective leukocyte adsorbent according to the above (1), wherein the average content X of the basic nitrogen-containing functional groups in the copolymer is 0.1 to 10 mol%.
(3) The leukocyte selective adsorbent according to the above (1) or (2), wherein a free-flow isotachophoresis method is used for component separation by charging.
(4) a filter for selectively removing leukocytes, wherein the leukocyte selective adsorbent described in any of (1) to (3) above is retained on at least the filter surface;
(5) In a copolymer having at least a nonionic hydrophilic group and a basic nitrogen-containing functional group, component separation by charge is performed, and the content Y of the basic nitrogen-containing functional group measured for each separated component is (1). / 2) X mol% ≦ Y ≦ (3/2) X mol% (where X is the average content of basic nitrogen-containing functional groups in the copolymer), and 75% by weight of all separated components %, A method for producing a leukocyte selective adsorbent using the index as having
I will provide a.
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The component separation by charge in the present invention refers to a component separation method using voltage as a driving force for separation, as typified by capillary electrophoresis and free-flow isotachophoresis. In the case of component separation, loss of the sample due to desalting work and adsorption is inevitable, but in order to obtain data indicating the properties of the sample, the total recovery of the component separation must be 70% by weight or more. . Here, the total recovery of component separation refers to the ratio of the dry weight of the polymer contained in the sample to be subjected to component separation to the total dry weight of the polymer components recovered after component separation.
[0014]
The leukocyte selective adsorbent in the present invention is a polymer having a function of selectively removing leukocytes from blood and allowing red blood cells, platelets, and plasma proteins to pass therethrough. In general, when the leukocyte adsorption performance of the adsorbent is increased, the adsorbability to platelets tends to be increased at the same time, and the selective adsorption of leukocytes decreases. The leukocyte selective adsorbent provided by the present invention is a leukocyte adsorbent having high platelet non-adsorbent, that is, high platelet recovery. The leukocyte selective adsorbent of the present invention is an adsorbent having a large leukocyte adsorption coefficient defined by the formula (1) and a high platelet collection rate defined by the formula (2).
Leukocyte adsorption coefficient = -log {(white blood cell concentration in recovered liquid after filtration) / (white blood cell concentration in blood before filtration)} (1)
Platelet recovery rate (%) = {(platelet concentration in recovered liquid after filtration) / (platelet concentration in blood before filtration)} × 100 (2)
[0015]
Good performance as a leukocyte selective adsorbent means that the leukocyte adsorption coefficient is 4.0 or more and the platelet collection rate is 50% or more in the experimental system shown in Examples. The leukocyte retention rate and platelet recovery rate are not necessarily constant depending on the size and volume of the filter material used for measurement, the filtration pressure, the amount of blood to be processed, and the origin of the blood used. The average of the values obtained from blood was used.
[0016]
The filter for selectively removing leukocytes in the present invention is a filter that captures leukocytes in a leukocyte-containing liquid represented by whole blood, but does not capture other blood components, that is, red blood cells, platelets, and plasma. The filter may be one in which a leukocyte selective adsorbent is immobilized on the surface of the filter material by a method such as coating or modification, or one in which the filter material itself is made of a leukocyte selective adsorbent.
[0017]
The content of the basic nitrogen-containing functional group in the present invention is a mole fraction of the basic nitrogen-containing functional group with respect to all monomer units, and can be determined from an integral value of nuclear magnetic resonance (hereinafter abbreviated as NMR). . In the embodiment of the present invention, the content of the basic nitrogen-containing functional group 1 It was determined by 1 H-NMR.
[0018]
In the present invention, the average content X of the basic nitrogen-containing functional group of the leukocyte selective adsorbent was determined by NMR before component separation by charging. The average content X of the basic nitrogen-containing functional group of the leukocyte selective adsorbent before separation is preferably in the range of 0.1 mol% to 10 mol%, more preferably 1 mol% to 6 mol%. If the average content of the basic nitrogen-containing functional group is less than 0.1 mol%, the white blood cells are hardly adhered together with the platelets, so that the selective removal of the white blood cells tends to be impossible. On the other hand, if the average content of the basic nitrogen-containing functional groups exceeds 10 mol%, platelets are likely to adhere together with leukocytes, and in this case, there is a tendency that selective removal of leukocytes cannot be performed.
[0019]
In the selective leukocyte adsorbent of the present invention, the content Y of the basic nitrogen-containing functional group in each separated component obtained by component separation by charging is uniform, that is, the copolymer constituting the leukocyte selective adsorbent. It is characterized in that the distribution width of the basic nitrogen-containing functional group in the polymer is narrow. Specifically, the leukocyte selective adsorbent of the present invention measures the content Y of the basic nitrogen-containing functional group for each separated component obtained by component separation by charging, and Y is (Ｙ) Xmol% ≦ It is composed of a copolymer having a component in the range of Y ≦ (3/2) X mol% in an amount of 75% by weight or more of all separated components. The component within the range of (1/2) Xmol% ≦ Y ≦ (3/2) Xmol% is more preferably 90% by weight or more.
The content Y of the basic nitrogen-containing functional group after component separation by charging was also determined by NMR in the same manner as the average content X of the basic nitrogen-containing functional group.
[0020]
As the nonionic hydrophilic group in the present invention, specifically, hydroxyl group, amide group, ether group, nitro group, nitroso group, sulfoxide group, sulfonyl group, sulfo group, cyano group, carboxamide, sulfonamide, thioamide, Examples thereof include cyanate and thiocyanate isothiocyanate, but are not limited thereto. Among these, a hydroxyl group, an amide group, and an ether group, which are chemically stable and have high hydrophilicity, are particularly preferable.
[0021]
Basic in the present invention means having a positive charge. Since the basic functional group has a positive charge, it has the effect of efficiently adsorbing negatively charged leukocytes under physiological conditions through electrostatic interaction, and has an affinity for leukocytes. Can be improved.
As the basic nitrogen-containing functional group in the present invention, specifically, a secondary amino group, a tertiary amino group, a quaternary ammonium group, and a nitrogen-containing heterocycle having a skeleton such as pyrrole, pyrazole, pyrrolidine, or piperidine. Groups, but are not limited to these. Among these, a secondary amino group and a tertiary amino group are preferable in that they are chemically stable and have high safety as a medical device.
[0022]
The content of the basic nitrogen-containing functional group in the polymer component in the present invention can be determined by charge separation. In the present invention, in order to collect the separated components, a known method such as free flow isotachophoresis (JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY 8th International Symposium on Capillary Electrophoresis and Isochochoresis, Rome 19-92, 1993, 9-92, O. N. Oc. , Page (S) 215).
[0023]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.
【Example】
Copolymer A 'was used as a leukocyte selective adsorbent. The copolymer A ′ is composed of 257 g of 2-hydroxyethyl methacrylate having a nonionic hydrophilic group (hereinafter abbreviated as HEMA) and 9.6 g of dimethylaminoethyl methacrylate having a basic nitrogen-containing functional group (hereinafter abbreviated as DM). Was obtained by separating components of a copolymer A obtained by synthesizing by ordinary solution radical polymerization. The component separation method is as follows.
[0024]
The components of the copolymer A were separated by free flow isotachophoresis. The free flow isotachophoresis apparatus is available from Dr. OCTOPUS manufactured by Weber was used. As a mobile phase for free-flow isotachophoresis, a 5 mM phosphate buffer (pH 2.5) containing 20 vol% of ethanol was used. The mobile phase flow rate was 5.27 ml / min. A sample was prepared by dissolving the copolymer A in a solvent having the same composition as the mobile phase. The concentration of copolymer A in the sample was 0.8% by weight. The sample was sent when the mobile phase became laminar. The liquid sending speed was 0.12 ml / min. A voltage of 1500 V was applied so as to be perpendicular to the flow direction of the mobile phase, and separation by electric charge was performed. Separation components were collected for 40 minutes using 100 collection holes provided at the end of the separation section. A component having a longer migration distance is recovered from a recovery hole with a larger number. An ultraviolet detector was used to detect the separated components of the copolymer A. After confirming the range of the recovery solution in which the component of the copolymer A is present from the obtained chromatogram, the recovery solutions in this range are integrated five by five in ascending order of the recovery hole number, and the component of the copolymer A is present. The collected liquid to be recovered was divided into six fractions a to f.
[0025]
Since the obtained fraction contains a large amount of phosphoric acid and sodium phosphate, it is necessary to desalt. Therefore, desalting was performed by the following method. The amount of phosphate contained in each fraction was calculated from the volume and the phosphate concentration, and a 0.1 N sodium hydroxide aqueous solution was added so that the amount of sodium hydroxide added was 1.5 equivalents of phosphate. All phosphoric acid is sodium phosphate. After drying the fraction by drying under reduced pressure, only the polymer component is solvent-extracted. This solution was filtered using an insoluble matter removal filter for liquid chromatography (Chromatofilter manufactured by Kurabo Industries: filter diameter: 20 mm, pore diameter: 0.45 μm) to remove floating sodium phosphate. The obtained filtrate was dried under reduced pressure using an evaporator to remove most of the solvent, and then dried under vacuum to remove a small amount of the remaining solvent. The total recovery of the separated components was 76% by weight.
[0026]
For each fraction 1 H-NMR measurement was performed to determine the content of DM of each separated component, and it was shown that the separation by free-flow isotachophoresis was dependent on the content of DM. For the NMR measurement, 500 MHz NMR (ALPHA500 manufactured by JEOL Ltd.) was used, and the measurement was performed using a 3 mmφ sample tube.
FIG. 1 shows the separation behavior of the copolymer A with the DM content on the horizontal axis and the dry weight on the vertical axis. Before the separation by free-flow isotachophoresis, the DM content X of the copolymer A is 2.4%, so (1/2) Xmol% = 1.2% and (3/2) Xmol% = 3 0.6%. From FIG. 1, among the separated components of the copolymer A, the components having a basic nitrogen-containing functional group content Y in the range of (１ ／) Xmol% ≦ Y ≦ (3/2) Xmol% are fractions cf. It can be seen that it is.
[0027]
The components of the copolymer A were separated by free flow isotachophoresis for about 40 hours, and the fractions c to f were integrated and desalted. As a result, about 1.2 g of a copolymer A ′ which was a separating component of the copolymer A was obtained. The average DM content of the copolymer A ′ was 2.6 mol%.
The components of the copolymer A ′ thus obtained were separated under the same conditions as for the copolymer A, using free-flow isotachophoresis. The total recovery of the separated components in the copolymer A ′ was 76% by weight.
[0028]
FIG. 2 shows the separation behavior of the copolymer A ′ with the DM content on the horizontal axis and the dry weight on the vertical axis. Since the DM content X of the copolymer A ′ before separation is 2.6%, (1/2) Xmol% = 1.3% and (3/2) Xmol% = 3.9%. From FIG. 2, the copolymer A ′ has 91 wt% of a component in which the content Y of the basic nitrogen-containing functional group of the separated component is in the range of (１ ／) X mol% ≦ Y ≦ (3/2) X mol%. It was shown.
[0029]
Copolymer A 'was coated on a filter substrate by the method described below. 1 g of the copolymer A ′ was dissolved in 19 g of a 50% by weight aqueous isopropyl alcohol solution at 40 ° C. to prepare a 5% by weight coating solution of the copolymer A ′. A non-woven fabric made of polyethylene terephthalate fiber having an average fiber diameter of 1.2 μm (40 g / m 2 (A basis weight, a thickness of 0.2 mm, and a width of 150 mm) were continuously immersed, and then passed through a nip roll to remove excess coating solution. The coated nonwoven fabric was dried overnight at room temperature in a drying room equipped with an exhaust duct, and then collected.
32 circular filters having a diameter of 20 mm are cut out from an arbitrary place of the coated nonwoven fabric thus manufactured, and the 32 filters are stacked on a filter holder and filled (filling density: 0.2 g / cm). 3 ) And used as a column. Fresh whole human blood prepared by the method described later was passed through this column at a constant flow rate of 0.74 ml / min using a syringe pump, and 13.3 ml of the collected whole blood was collected.
Fresh human whole blood was obtained by filtering 100 ml of collected blood with a filtered CPD solution (trisodium citrate dihydrate 26.3 g, citric acid monohydrate 3.27 g, glucose 23.2 g, and anticoagulant). A solution prepared by dissolving 2.51 g of sodium dihydrogen phosphate dihydrate in 1000 ml of distilled water for injection, adding 14 ml of a solution filtered with a filter having a pore size of 0.2 μm), and storing the mixture at 20 ° C. for 3 hours. did.
[0030]
A certain amount of blood was collected from the blood before the filtration and the collected liquid after the blood was filtered, and the leukocyte concentration was measured by a residual leukocyte measurement reagent system LeucoCOUNT. TM kit, flow cytometer FACSCalibur, and analysis software CELL Quest (BD Bioscience, USA). The platelet concentration was measured using an automatic blood cell counter MAX A / L Retic (BECKMAN COULTER, USA). As a result, the copolymer A 'had a leukocyte adsorption coefficient of 4.2 and a platelet recovery of 56.5%, indicating that the ability to selectively remove leukocytes was good.
From the above results, according to the present invention, the free-flow constant velocity electricity of the leukocyte selective adsorbent which is a copolymer containing a nonionic hydrophilic group and an average of X mol% of a basic nitrogen-containing functional group with respect to all monomer units is obtained. The components are separated by electrophoresis, and as an index, 75% by weight or more of all the separated components collected contains a basic nitrogen-containing functional group in the range of X ± 1 / 2Xmol%, and is represented by blood. To provide a selective adsorbent for leukocytes and a filter for selectively removing leukocytes, which is capable of removing leukocytes while suppressing loss of platelets from a cell suspension containing platelets and leukocytes, and which is excellent in platelet permeability and leukocyte removal ability. I was able to.
[0031]
Further, from the results of the present invention, if the component recovery in a narrower range using free-flow isotachophoresis or precision polymerization is performed to further narrow the distribution width of DM, the copolymer A ′ or more It is considered that a leukocyte selective adsorbent having the following performance can be obtained.
[0032]
[Comparative Example 1]
From FIG. 1 showing the separation behavior of the copolymer A by free-flow isotachophoresis, the content Y of the basic nitrogen-containing functional group among the separated components was (1/2) Xmol% ≦ Y ≦ (3/2) Xmol % Is shown to have 71% by weight of the total separated components.
The leukocyte adsorption coefficient and platelet recovery of copolymer A were determined in the same manner as for copolymer A '. The copolymer A had a leukocyte adsorption coefficient of 3.8 and a platelet recovery rate of 54.2%. Although platelets were not adsorbed, the leukocyte adsorption coefficient was small, indicating that the leukocyte selective adsorption ability was not a satisfactory value. As a result, as compared with the copolymer A ′ obtained by recovering a component in the range of (１ ／) Xmol% ≦ Y ≦ (3/2) Xmol%, the copolymer A having a broader composition distribution is used as a leukocyte selective adsorbent. It was found that the leukocyte adsorption performance, which is the ability of the enzyme, decreased.
[0033]
[Comparative Example 2]
As the leukocyte selective adsorbent, HEMA having a nonionic hydrophilic group and copolymer B having a basic nitrogen-containing functional group were used. The polymerization conditions of the copolymer B are different from the polymerization conditions of the copolymer A only in the monomer dropping conditions. The conditions for dropping the monomer of the copolymer B were as follows: after polymerizing only HEMA in a reaction vessel, a monomer mixture of 25.7 g of HEMA and 9.6 g of DM was continuously dropped, and the final monomer weight was 257 g of HEMA and 9.6 g of DM. I made it. Copolymer B is expected to be rich in components with low DM content by adding HEMA first. A similar study was conducted for copolymer B, which contains many components having a low DM content and is considered to have a wide component distribution. The average DM content of Copolymer B before separation by free flow isotachophoresis was 2.4 mol%.
The components of the copolymer B thus obtained were separated using free flow isotachophoresis. As a mobile phase for free-flow isotachophoresis, a 5 mM phosphate buffer (pH 2.5) containing 25 vol% of ethanol was used. A sample was prepared by dissolving the copolymer B in a solvent having the same composition as the mobile phase. The concentration of copolymer B in the sample was 0.75% by weight. Separation was carried out in the same manner as in the case of copolymer A, and divided into six fractions a to f. The total recovery of the separated components is 76% by weight, and FIG. 3 shows the separation behavior of the copolymer B with the DM content on the horizontal axis and the dry weight on the vertical axis. From FIG. 3, the content Y of the basic nitrogen-containing functional group of the separated component is (１ ／) Xmol% ≦ Y ≦ (3/2) Xmol% among the separated components collected after the separation by the charge amount. With components falling within the range, copolymer B was shown to have 71% by weight of the total separated components. Copolymer B also had a high content of low DM content components as expected.
The leukocyte adsorption coefficient and platelet recovery of copolymer B were determined in the same manner as for copolymer A '. Copolymer B had a leukocyte adsorption coefficient of 3.6 and a platelet recovery of 54.2%, indicating that platelets were not adsorbed, but the leukocyte adsorption coefficient was small and the leukocyte selective adsorption ability was reduced. As a result, it was found that the copolymer B containing a large amount of components having a low DM content and having a wide composition distribution deteriorates the leukocyte adsorption performance which is the ability as a leukocyte selective adsorbent.
[0034]
[Comparative Example 3]
As a leukocyte selective adsorbent, a copolymer C having HEMA having a nonionic hydrophilic group and DM having a basic nitrogen-containing functional group was used. The polymerization conditions of the copolymer C are different from those of the copolymer A only in the conditions for dropping the monomer. As for the dropping conditions of the monomer of the copolymer C, first, 25.7 g of HEMA and 9.6 g of DM were polymerized, and then HEMA was dropped, so that the final monomer weight was 257 g of HEMA and 9.6 g of DM. Copolymer C is expected to be rich in components with high DM content by adding DM first. A similar study was conducted for Copolymer C, which contains many components with a high DM content and is considered to have a broad component distribution. When the average DM content was determined in the same manner as in the case of the copolymer A, the average DM content of the copolymer C before separation by free-flow isotachophoresis was 2.6 mol%.
The components of the copolymer C thus obtained were separated using free-flow isotachophoresis. As a mobile phase for free-flow isotachophoresis, a 5 mM phosphate buffer (pH 2.5) containing 25 vol% of ethanol was used. A sample was prepared by dissolving the copolymer C in a solvent having the same composition as the mobile phase. The concentration of copolymer C in the sample was 0.75% by weight. Separation was carried out in the same manner as for copolymer A and divided into six fractions a to f. The total recovery of the separated components was 76% by weight, and FIG. 4 shows the separation behavior of the copolymer C with the horizontal axis representing the DM content and the vertical axis representing the dry weight. From FIG. 4, the content Y of the basic nitrogen-containing functional group of the separation component among the separation components obtained by performing the separation by the charge amount is (１ ／) Xmol% ≦ Y ≦ (3/2) Xmol%. With components falling within the range, Copolymer C was shown to have 60% by weight of the total separated components. Copolymer C also had a high content of high DM content components as expected.
The leukocyte adsorption coefficient and platelet recovery of copolymer C were determined in the same manner as for copolymer A '. The leukocyte adsorption coefficient of copolymer C was 3.7, and the platelet recovery was 16.8%, indicating that both leukocytes and platelets were adsorbed. As a result, it was found that the copolymer C containing many components having a high DM content and having a wide composition distribution lowers the platelet recovery rate, which is the ability as a selective leukocyte adsorbent.
[0035]
【The invention's effect】
The present invention is represented by free-flow isotachophoresis of a leukocyte selective adsorbent, which is a copolymer containing a nonionic hydrophilic group and a basic nitrogen-containing functional group having an average of X mol% based on all monomer units. Separation of components by charge is performed, and as an index, 75% by weight or more of all collected separated components contains a basic nitrogen-containing functional group in the range of X ± 1 / 2Xmol%, and is represented by blood. A platelet-selective adsorbent and a filter for selectively removing leukocytes, which are capable of removing leukocytes from a cell suspension containing platelets and leukocytes while suppressing the loss of platelets at a low level, and having excellent platelet-passing and leukocyte-removing ability. .
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the separation behavior of Copolymer A in Examples.
FIG. 2 shows the separation behavior of copolymer A ′ in Examples.
FIG. 3 shows the separation behavior of Copolymer B in Comparative Example 2.
FIG. 4 shows the separation behavior of Copolymer C in Comparative Example 3.
