【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子工学分野において有用な標識化プローブの調製方法並びに該プローブを用いた高感度検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハイブリダイゼーション法は、細胞や組織において発現するｍＲＮＡの種類を同定するために、あるいは各ｍＲＮＡ分子量を定量するために通常よく利用される方法である。それゆえ、ｍＲＮＡの同定、定量のためのハイブリダイゼーション技術は、生物学ならびに医学の分野において非常に重要である。
上記ハイブリダイゼーション法として例えば、全ＲＮＡまたは精製されたＲＮＡをナイロン膜のような多孔性の担体上に固定化し、蛍光物質あるいは放射性同位元素（ＲＩ）等で標識した、検出しようとする遺伝子（ＲＮＡ）に相補的なプローブと混合してハイブリダイズさせる方法がある。このカテゴリーに属する技術としてノーザン・ハイブリダイゼーション法が挙げられる。
また、別法としては、検出しようとする遺伝子（ＲＮＡ）を含む混合物、若しくは該混合物から精製したＲＮＡを蛍光物質あるいは放射性同位元素等で標識し、これを膜上に固定されたプローブとハイブリダイズさせる方法がある。このカテゴリーの属する技術としては、逆ドットブロット法が挙げられる。これら２法は、遺伝子工学分野の研究の様々な実験で使用されている。
【０００３】
従来のハイブリダイゼーション法では通常、膜上に固定化された核酸が使用されてきたが、最近、上記のハイブリダイゼーション技術について、ガラスのような非多孔性の硬質の担体上に、主として既知のＤＮＡ断片を固定化して使用するハイブリダイゼーション技術が開発されている。この技術においては、担体表面上のあらかじめ定められた領域に数多くの種類のＤＮＡ断片を極めて高密度に固定することができる。このような高密度にＤＮＡ断片が固定化された担体は、一般にＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）と呼ばれている。当該ＤＮＡマイクロアレイを使用することにより、少量の試料中の多種類のｍＲＮＡの同定、定量を一度に実施することが可能になった。
【０００４】
上記ＤＮＡマイクロアレイを使用する場合には、試料中の核酸を、例えば蛍光物質を用いて標識し、担体上に固定化されたＤＮＡ断片とハイブリダイズさせて検出するのが一般的である。すなわち、試料中のｍＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイで検出する場合には、例えば、以下のような方法で試料を標識することができる。
１．試料中のｍＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成の際に蛍光標識ヌクレオチドを添加して蛍光標識ｃＤＮＡを作成する方法、あるいは
２．試料中のｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、蛍光標識ヌクレオチド存在下に該ｃＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼで転写反応を行い、蛍光標識ＲＮＡプローブを作成する方法。
上記方法によって作製された標識ＤＮＡあるいはＲＮＡは、試料中のｍＲＮＡ由来の塩基配列、若しくはこれに相補的な塩基配列を有しており、適切なＤＮＡ断片が固定されたマイクロアレイ上で検出することができる。
【０００５】
しかしながら、上記のような方法で試料中のｍＲＮＡ由来の塩基配列を有する標識核酸を作製する場合には、該標識核酸に取り込まれる標識化合物の数が当該核酸の鎖長に比例するため、短い鎖長の標識核酸は長鎖長のものに比較して１分子当りに取り込まれる標識ヌクレオチドの数が少なくなるという欠点がある。従って、同一分子数の標識核酸が担体、例えばマイクロアレイ上に固定化されたＤＮＡ断片とハイブリダイズしている場合、各アレイについて得られる標識化合物由来の標識シグナルの強度はハイブリダイズする核酸の鎖長に大きく影響されることになる。このことは、定量性を求められる実験においては、非常に重要な問題となる。
【０００６】
一方、標識する核酸の鎖長に影響されない核酸標識方法として、米国特許第６００４７５５号公報記載の末端標識方法が挙げられる。しかしながら、該方法は、末端標識したオリゴｄＴプライマーを使用してｃＤＮＡを合成する方法であり、プライマーに付加される標識化合物の数は限られている。従って、検出しようとする遺伝子由来のｍＲＮＡが微量であった場合、シグナル強度が弱く検出できない可能性がある。
【０００７】
細胞内では非常に多くの種類の遺伝子が発現されており、各遺伝子にコードされているポリペプチドはその構造、機能がそれぞれ異なるため、これらのポリペプチドに対応するｍＲＮＡの鎖長も広い範囲に分布している。従って、これらのｍＲＮＡをできるだけ正確に、また高い再現性で検出、定量するための定量性に優れたシグナルを与えるようなｍＲＮＡ、若しくはｍＲＮＡ由来の塩基配列を有する核酸の検出方法が求められていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、検出しようとする核酸の鎖長に影響されない標識核酸を調製し、該標識核酸を用いた高感度検出方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはハイブリダイゼーション法による核酸の検出、定量法について鋭意研究を行い、固定されたプローブとハイブリダイズするｍＲＮＡを、該ｍＲＮＡの３’末端に存在しているポリＡ配列を利用して検出することによって定量性及び検出感度に優れたｍＲＮＡの検出が可能な方法を見出した。また、人工的にポリヌクレオチドを付加したＤＮＡにおいても上記と同様の方法で標的ＤＮＡの検出が可能な方法も見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、ポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズすることを特徴とする標識ポリヌクレオチドプローブに関する。本発明の第１の発明において、標識ポリヌクレオチドプローブのポリアデニンヌクレオチド部分がｍＲＮＡのポリリボアデニンヌクレオチドテールであってもよい。また、本発明において標識ポリヌクレオチドプローブは、該プローブの鎖長は５０ヌクレオチド以上であるものが好適に使用できる。また、該プローブはデオキシウラシルヌクレオチド及び／又はデオキシチミンヌクレオチドからなるポリヌクレオチドが好適であり、標識デオキシウラシルヌクレオチド及び／又は標識デオキシチミンヌクレオチドを含有していることが好ましい。さらに、該標識ヌクレオチドは、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、リガンドあるいはレセプターのいずれかから選択される物質で標識されているものが好適に使用できる。特に限定はされないが、例えば、フルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される物質で標識されている標識ポリヌクレオチドプローブが好適に使用でき、特に好ましくは、上記標識を有するｄＵＴＰあるいはｄＴＴＰが例示される。
【００１１】
本発明の第２の発明は、ポリリボアデニンヌクレオチドあるいはポリデオキシアデニンヌクレオチドを鋳型とし、オリゴｄＴをプライマーとしたヌクレオチド伸長反応により調製することを特徴とする本発明の第１の発明の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法に関する。本発明の第２の発明において、ヌクレオチド伸長反応はポリリボアデニンヌクレオチドを鋳型とした逆転写反応であってもよい。また、本発明において鋳型となるポリリボアデニンヌクレオチドあるいはポリデオキシアデニンヌクレオチドの鎖長は、５０ヌクレオチド以上であるものが好適に使用できる。また、本発明においてヌクレオチド伸長反応は、デオキシヌクレオチド重合反応であってもよい。さらに、本発明においては、標識ポリヌクレオチドプローブの鎖長は、５０ヌクレオチド以上であることが好ましく、上記ヌクレオチド伸長反応あるいはデオキシヌクレオチド重合反応が少なくとも標識デオキシウラシルヌクレオチド及び／又は標識デオキシチミンヌクレオチドを用いて行われる反応であってもよい。この場合、デオキシウラシルヌクレオチドとデオキシチミンヌクレオチドの含有モル比が１：１〜１：３であるプローブ調製用反応液中で実施されることが好ましく、また使用される標識物質は、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、リガンドあるいはレセプターのいずれかから選択される物質が好適に使用できる。特に限定はされないが、例えばフルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される物質で標識されていることが好ましい。
【００１２】
本発明の第３の発明は、ポリアデニンヌクレオチド部分に標識ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせることを特徴とする標的核酸の検出方法に関する。本発明の第３の発明において、ポリアデニンヌクレオチド部分は、ｍＲＮＡのポリリボアデニンヌクレオチド部分（テール）であってもよく、人工的に後からポリアデニンヌクレオチド部分を付加させたもののいずれもが好適に使用できる。すなわち、本発明の第１の発明の標識ポリヌクレオチドプローブが効率良く、特異的にハイブリダイズするものであれば、特に限定はされない。本発明の第３の発明において、標識ポリヌクレオチドプローブは、少なくとも標識デオキシウラシルヌクレオチド及び／又は標識デオキシチミンヌクレオチドを含むものが好適に使用できる。該標識ヌクレオチドは、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、リガンドあるいはレセプターのいずれかから選択される物質で標識されているものが好ましく、特に限定はされないが例えば、フルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される物質で標識されている標識ポリヌクレオチドプローブが挙げられる。
【００１３】
本発明の第４の発明は、ポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズするプローブであって、異なる標識を有する少なくとも２種類の標識ポリヌクレオチドプローブを用い、異なる２種類の試料中の多種類の遺伝子の発現を比較することを特徴とする発現遺伝子の解析方法に関する。本発明の第４の発明において、特に限定はされないが例えば、フルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される物質で標識されている標識ポリヌクレオチドプローブが好適に使用できる。
【００１４】
本発明の第５の発明は、ポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズすることを特徴とする標識ポリヌクレオチドプローブと発現遺伝子のポリアデニンヌクレオチド以外の部分にハイブリダイズすることを特徴とする標識ポリヌクレオチドプローブを組み合わせることを特徴とする発現遺伝子の解析方法に関する。本発明の第５の発明において、特に限定はされないが例えば、フルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される物質で標識されている標識ポリヌクレオチドプローブが好適に使用できる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書においてヌクレオチドとは、デオキシリボヌクレオチドあるいはリボヌクレオチドのことをいい、例えばデオキシリボヌクレオチドの場合、糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミン，ウラシルを有するものが挙げられる。また、リボヌクレオチドの場合、糖部分がＤ−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが挙げられる。さらに、当該ヌクレオチドには修飾デオキシリボヌクレオチドあるいは修飾リボヌクレオチドのいずれもが包含され、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド［（α−Ｓ）リボヌクレオチド、（α−Ｓ）Ｎとも記載する］やこの他の誘導体等も含まれる。
【００１６】
本明細書において、ポリアデニンヌクレオチドとは、リボアデニンヌクレオチドあるいはデオキシアデニンヌクレオチドの重合体のことをいう。該ポリマーは、人工的に調製したものあるいは天然に存在するもののいずれもが含まれる。特に限定はされないが、例えば真核生物由来のｍＲＮＡのポリＡテール（ポリリボアデニンヌクレオチドテール）が挙げられる。
【００１７】
本明細書において標識ヌクレオチドとは、標識物質で標識されたヌクレオチドのことをいう。該標識物質は、上記デオキシヌクレオチドあるいはリボヌクレオチドに直接、又はリンカー等を介して結合しているもののいずれもが含まれる。
本明細書において標識ポリヌクレオチドとは、上記ヌクレオチドのポリマーのことをいい、該ポリマーは、標識ヌクレオチド及び／又は非標識ヌクレオチドで構成される重合体が好ましい。
【００１８】
本明細書においてヌクレオチド伸長反応とは、上記ヌクレオチドを伸長させる反応であれば特に限定はなく、逆転写反応、ＤＮＡポリメラーゼ反応あるいは、末端デオキシヌクレオチド転移反応のいずれもが好適に使用できる。
【００１９】
本明細書において標的核酸とは、検出しようとする核酸配列、例えば任意の遺伝子の核酸配列のことをいう。該核酸配列は、ＤＮＡあるいはＲＮＡのいずれであってもよい。
【００２０】
（１）本発明の標識ポリヌクレオチドプローブ
本発明の標識ポリヌクレオチドプローブは、ポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプローブであればよく、特に限定はされないが、デオキシウリジンヌクレオチド（ｄＵＴＰ）のポリマー、デオキシチミンヌクレオチド（ｄＴＴＰ）のポリマー、あるいはｄＵＴＰとｄＴＴＰの混合ポリマーのいずれもが好適に使用できる。本発明の標識ポリヌクレオチドプローブの鎖長は、特に限定はされないが、好ましくは５０ヌクレオチド以上、さらに好ましくは１００ヌクレオチド以上であるものが好適に使用できる。本発明の標識ヌクレオチドプローブは、プローブ１分子当りにほぼ一定量の標識化合物を含むものであれば、特に限定はされないが例えば、標識化合物が付加されたヌクレオチド（標識ヌクレオチド）を含有するものであることができる。該標識ヌクレオチドは、特に限定されるものではないが例えば、標識デオキシウラシルヌクレオチド又は標識デオキシチミンヌクレオチドが好適であり、これらを混合して使用してもよい。さらに、該標識ヌクレオチドは、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、リガンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチドのいずれもが好適に使用できる。特に限定はされないが、例えば３２Ｐ、３３Ｐのような放射性同位元素、ＡＭＰＰＤのような化学発光物質、フルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のような蛍光物質、ビオチン、アビジン、ディゴキシゲニン等のリガンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチドのいずれもが好適に使用できる。本発明においては、好ましくは蛍光物質、特に好ましくはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、Ｃｙ３あるいはＣｙ５で標識されたｄＵＴＰが好適に使用できる。
【００２１】
また、別の態様として、アミノ基やチオール基等の官能基を有する修飾ヌクレオチドを用いて該修飾ヌクレオチドのポリマーを調製した後に、当該官能基を利用して上記標識物質を付加させた標識ポリヌクレオチドも本発明の標識ポリヌクレオチドプローブに含まれる。
【００２２】
本発明の標識ポリヌクレオチドプローブは、特に限定はされないがストリンジェントな条件においてポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズするものが好ましい。該ストリンジェントな条件としては、例えば、モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、第２版（１９８９）記載の条件が好適に使用できる。
【００２３】
本発明の標識ポリヌクレオチドプローブを使用するｍＲＮＡの検出において得られるシグナル強度は、ｍＲＮＡの大きさに関係なく、唯一各々のｍＲＮＡのコピー数に依存する。また、検出しようとするｍＲＮＡごとにプローブを作製する必要がなく、プローブは異なる試料にも共通して使うことができる。
さらに、本発明のプローブは、そのヌクレオチド中に複数箇所ラベルされており、エンドラベルされたポリヌクレオチドやｃＤＮＡプローブよりも強いシグナルを与える。従って、標識されたｄＵＴＰの連続した結合がヌクレオチド伸長反応に影響しない、あるいは伸長産物において立体障害を生じないとするならば、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブは、１種類のヌクレオチド標識により同じ長さのｃＤＮＡプローブよりも約４倍強いシグナルを得ることができる。
【００２４】
（２）本発明の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法
本発明の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法は、特に限定はされないが例えば、ポリリボアデニンヌクレオチドあるいはポリデオキシアデニンヌクレオチドを鋳型とし、オリゴｄＴをプライマーとしたヌクレオチド伸長反応により調製することができる。該ヌクレオチド伸長反応において、使用する酵素は、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブを効率良く調製できるものであれば特に限定はなく、常温性、好熱性、超耐熱性の酵素のいずれであってもよい。また、該ヌクレオチド伸長反応は、ポリリボアデニンヌクレオチドを鋳型とした逆転写反応が好適に使用できる。この場合、特に限定はないが例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（Ｍ−ＭＬＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２由来逆転写酵素（ＲＡＶ―２）、バチルス カルドテナックス（Ｂｃａ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｒｄｏｔｅｎａｘ）由来ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス サーモフィラス（Ｔｔｈ：Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。さらに、該ヌクレオチド伸長反応は、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成反応であってもよい。この場合、特に限定はされないが、例えばクレノウ断片、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス ステアロサーモフィラス（Ｂｓｔ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス アクアティカス（Ｔａｑ：Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス フリオサス（Ｐｆｕ：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス コダカラエンシス（ＫＯＤ：Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。さらに、ＤＮＡ合成機を用いて化学合成したものも好適に使用できる。また、短鎖ヌクレオチドをライゲーション反応によりポリヌクレオチドにしたものも好適に使用できる。
【００２５】
上記鋳型となるポリリボアデニンヌクレオチドの鎖長は、好ましくは５０ヌクレオチド以上、さらに好ましくは１００ヌクレオチド以上である。該鋳型を使用した場合、調製される標識ポリヌクレオチドの範囲は、５０ヌクレオチド以上である。さらに、上記ヌクレオチド伸長反応のべつの態様としては、デオキシヌクレオチド重合反応であってもよい。この場合、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ：Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）等の市販の修飾酵素が好適に使用できる。この場合において、該プローブの鎖長が５０ヌクレオチド以上になるように反応条件を設定することが好ましい。
【００２６】
上記ヌクレオチド伸長反応のいずれの場合において、少なくとも標識デオキシウラシルヌクレオチド及び／又は標識デオキシチミンヌクレオチドの存在下に反応を実施することにより容易に標識ポリヌクレオチドを調製することができる。上記のヌクレオチド伸長反応において、反応液中での標識（デオキシウラシル）ヌクレオチド３リン酸と非標識（デオキシチミン）ヌクレオチド３リン酸の含有モル比は、好ましくは１：１〜１：３の範囲、特に好ましくは１：２である。また、本発明の調製方法で使用する標識ヌクレオチドは、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、リガンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチドから選択することができ、上記ヌクレオチド伸長反応を阻害しない標識ヌクレオチドあるいは該標識ヌクレオチドのアナログであってもよい。
【００２７】
さらに、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法としては、上記標識化合物が付加された標識ヌクレオチドをヌクレオチド伸長反応の際に取り込ませる方法が例示されるが、別の態様として非標識のヌクレオチドをヌクレオチド伸長反応に使用し、反応終了後にさらに、酵素化学的あるいは化学的に標識化合物を導入する方法であってもよく、最終的に本発明の標識化されたポリヌクレオチドプローブを調製することができる標識導入方法のいずれもが好適に使用できる。
【００２８】
本発明において、鋳型そしてプライマーとして示されたポリリボアデニンヌクレオチド及びオリゴデオキシチミンヌクレオチドの存在下において逆転写反応によって蛍光標識されたポリデオキシウラシルヌクレオチドを調製することができる。本発明の方法によって調製された、標識デオキシウラシルヌクレオチド及び非標識デオキシチミンヌクレオチドを含有する本発明の標識ポリヌクレオチドプローブは、膜またはガラス表面（ＤＮＡチップ）上にスポットされたＤＮＡ配列とハイブリするｍＲＮＡを検出するために使用することができる。
【００２９】
（３）本発明の標的核酸の検出方法及び発現遺伝子の解析方法
本発明の標的核酸の検出方法において標的核酸のポリアデニンヌクレオチド部分に標識ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせることにより検出することができる。標的核酸のポリアデニンヌクレオチド部分は、人工的に後からポリリボアデニンヌクレオチドあるいはポリデオキシアデニンヌクレオチドを付加させたものでもよく、天然のｍＲＮＡのポリリボアデニンヌクレオチドテールであってもよい。すなわち、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブが効率良く、特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定はなく、該標識ヌクレオチドは、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、リガンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチドのいずれかから選択されるものが好ましく、例えば、標識がフルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される標識ヌクレオチドが挙げられる。
【００３０】
本発明の検出方法の別の態様としては、発現遺伝子の解析方法が挙げられる。該方法においては、異なる標識を有する少なくとも２種類の標識ポリヌクレオチドプローブを用いることにより、異なる２種類の試料中の多種類の遺伝子の発現を比較することができる。標識ポリヌクレオチドプローブは特に限定はされないが、例えば、それぞれＣｙ３及びＣｙ５で標識されたポリヌクレオチドプローブが好適に使用できる。
【００３１】
さらに発現遺伝子の解析方法の別の態様としては、ポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズする標識ポリヌクレオチドプローブと発現遺伝子のポリアデニンヌクレオチド以外の部分にハイブリダイズする標識ポリヌクレオチドプローブ（ｃＤＮＡ標識ポリヌクレオチドプローブ）を組み合わせることができる。この場合において、標識は異なるものを用いることができる。上記発現遺伝子のポリアデニンヌクレオチド以外の部分にハイブリダイズするプローブは、公知の方法、例えば試料中のｍＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成反応により調製することができる。本発明の方法は、特に限定はされないが、例えば、３’末端のポリアデニル化又は脱アデニル化によって制御されている特定遺伝子の発現において使用することができ、前述の制御を検出することができる。
【００３２】
また、本発明の検出方法において標識ポリヌクレオチドプローブは、共通で使用することができるので、従来の標的核酸に合わせてｃＤＮＡプローブを調製する必要がなく、低コストで短時間で検出を行うことができる。
【００３３】
【実施例】
本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
（１）標識ポリヌクレオチドプローブの調製
逆転写／標識反応を用いて標識ポリヌクレオチドプローブを調製した。該反応は、以下の反応液組成で行った。すなわち、１００ｐｍｏｌの合成テンプレート−プライマーのＰｏｌｙ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）１２−１８（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を鋳型とし、各０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４０μＭのｄＴＴＰ及び２０μＭのＡｌｅｘａ−ｄＵＴＰ（モレキュラープローブ社製）、１０ｍＭ ＤＴＴ、２５Ｕ リボヌクレオチドインヒビター（ギブコＢＲＬ社製）、１．５Ｕのスーパースクリプト逆転写酵素（ギブコＢＲＬ社製）を加え、反応液容量を５０μｌにした。該反応混合溶液を３０℃で６０分間保持し、次に９４℃で３分間加熱して酵素を失活させ、氷浴上で冷却した。該反応溶液をマイクロスピンＳ−３００ＨＲカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて精製した。次に精製物を３７℃、２０分間、０．３ＮのＮａＯＨで処理し、鋳型ポリ（ｒＡ）を分解後、塩酸及び１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で中和した。この溶液を蛍光標識ポリｄＵプローブ溶液として使用した。
【００３５】
（２）細胞培養、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡプローブの調製
ヒト ＨｅＬａ細胞とＷＩ３８細胞は、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（Ｈｕｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ：ＨＳＲＲＢ）から入手し、１０％ ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ 血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍで培養した。全ＲＮＡは、上記培養細胞からグアニジウム−フェノール・クロロホルム法で抽出した。混入した可能性のあるゲノムＤＮＡは、ＲＮａｓｅフリー ＤＮａｓｅ（ＲＱ１ ＤＮａｓｅ，プロメガ社製）を用いて取り除いた。ｍＲＮＡは、必要に応じて、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （アマシャム・ファルマシア バイオテク社製）を用いて精製した。ｃＤＮＡプローブは、上記の６００ｎｇの精製したＲＮＡを鋳型としてＣｙ３―ｄＵＴＰ（アマシャム・ファルマシア バイオテク社製）を用いた逆転写反応によって調製した。反応条件は、３７℃、６０分間インキュベートした後、１０μｌの１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を加えて１０分間、３７℃でインキュベートし、鋳型ＲＮＡを分解した。反応物に２５μｌの１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて中和した後、エタノールで沈殿させた。沈殿物は、１０μｌのハイブリバッファーで再度溶解した。
【００３６】
（３）ＤＮＡ固定化メンブレン及びＤＮＡマイクロアレイの調製
ヒトＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）、ｐ５３、Ｒｂ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）、Ｒａｓオンコジーン、ｐ１３０、ｐ１４、ｐ１６、ｐ１８、ｐ１９、ｐ２１、ｐ２７の遺伝子をターゲットとして、配列表の配列番号１〜４０記載のプライマー及びＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（宝酒造社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ｐ５３、ＲＢ、ｐ１３０、ｐ１６、ｐ１９、ｐ２７、ｐ１８、ｐ１４の遺伝子については、逆転写反応後、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。鋳型は、上記実施例１（２）で得られたＲＮＡを使用した。得られた増幅断片は、精製後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ クローニングベクター（ノバジェン社製）にサブクローニングし、ＤＮＡ配列解析を確認した。挿入塩基配列を確認後、前述の挿入断片をＢｉｏ−Ｄｏｔ（バイオラッド社製）を用いてハイボンドＮ＋（アマシャム・ファルマシア バイオテク社製）上に固定した。また、ＤＮＡマイクロアレイは、市販のＴｅｓｔ ａｒｒａｙ（宝酒造社製）を使用した。
【００３７】
（４）ハイブリダイゼーション及び検出
上記ターゲット遺伝子を保持するメンブレンフィルターは、メンブレン１ｃｍ２あたり１ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、０．５％ ＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、０．１％ ＳＤＳ）を使用して、３７℃、１時間、プレハイブリダイゼーションを行った。初めに上記実施例１（２）で得られた全ＲＮＡもしくは精製ＲＮＡのいずれか１０μｌに上記実施例１（１）で調製した標識ポリｄＵプローブ溶液 １０μｌを添加し、最終容量が２００μｌになるようにハイブリダイゼーション緩衝液を加え、７０℃、１０分間加熱後、上記メンブレンフィルターと６〜１０時間、３０℃でハイブリダイズした。メンブレンフィルターは、室温で１５分間、洗浄緩衝液Ｉ（１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）に入れて穏やかに振とうし、次に１０分間、洗浄緩衝液ＩＩ（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）に入れて振とうし、洗浄した。洗浄後、メンブレンフィルターは、蛍光イメージアナライザーＦＭＢＩＯ ＩＩ（宝酒造社製）で検出した。一方、ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションは添付の取り扱い説明書の指示通りにおこなった。すなわち、プレハイブリダイゼーションは、１４μｌのプレハイブリダイゼーション液（６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．１μｇ／μｌ サケ精子ＤＮＡ）を用いて１時間、６５℃で行った。ポリｄＵプローブとのハイブリダイゼーションについては、上記実施例１（２）で得られた６００ｎｇのｍＲＮＡに１μｌのポリｄＵを加え、容量を１４μｌとした。該溶液を７０℃、１０分間加熱した。また、同量のｍＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡプローブの調製を行った。前述の反応液をマイクロアレイに添加し、次いでアレイを６５℃、１８〜２０時間インキュベートし、さらに３０℃、３時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、該マイクロアレイを６０℃、１５分間、２×ＳＳＣ溶液で、さらに６０℃、１５分間、洗浄液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で洗浄し、最後に室温で２回、２×ＳＳＣで洗浄した。マイクロアレイ上のシグナルは、アレイスキャナー４１８（アフィメトリックス社製）を用いて検出した。
【００３８】
メンブレンフィルターにおける本発明の標識ポリヌクレオチドプローブの一例として、Ａｌｅｘａ−ｄＵＴＰで標識された標識ポリヌクレオチドプローブのハイブリ特異性について図１−Ａに示す。図１−Ｂは、各ポリヌクレオチドのスポットした位置を示す。図１−Ａに示したように該標識ポリヌクレオチドプローブは、ポリリボアデニンヌクレオチド（ｐｏｌｙＡ）に特異的にハイブリダイズし、他のヌクレオチドにはハイブリダイズしないことが確認できた。
【００３９】
さらに、ポリリボアデニンヌクレオチドを１ｎｇ（３ｆｍｏｌ）〜１μｇ（３ｐｍｏｌ）の濃度範囲でスポットしたメンブレンを用いて検出感度を検討した。その結果を図２に示す。図２に示したように１ｎｇ（３ｆｍｏｌ）を１２ｍｍ２に固定化した場合においても明瞭な蛍光シグナルが得られることが確認できた。
【００４０】
また、１μｇのＧＡＰＤＨ ＤＮＡ断片及びｐＵＣ１８ プラスミドＤＮＡを同一メンブレン上にスポットしたフィルターを用いて、ＨｅＬａ細胞由来の１０〜４０μｇの全ＲＮＡに上記実施例１（１）で調製された標識ポリｄＵプローブ溶液 １０μｌをアニーリングさせたものをハイブリダイズさせた。その結果を図３に示す。図３に示したようにｐＵＣ１８ＤＮＡではなく、ＧＡＰＤＨ ＤＮＡをスポットしたもののみシグナルが検出された。
【００４１】
次に、上記（４）で調製したＤＮＡ断片をスポットしたメンブレンを使用し、ＨｅＬａ細胞とＷＩ１３８細胞由来の２０μｇの全ＲＮＡと上記実施例１（１）で調製したポリｄＵプローブ溶液 １０μｌをアニーリングしたものをハイブリダイズした。その結果を図４に示す。図４―１は、ＨｅＬａ細胞由来、図４―２はＷＩ１３８由来の試料を用いた結果を示す。図４―３は、スポットした各遺伝子の位置を示す。図４―１及び図４―２より、発現する遺伝子に応じてシグナルが検出されることが確認できた。さらに、従来法のノーザンブロットの結果と比較したところ同じ発現パターンで検出されることが確認できた。
【００４２】
ＤＮＡマイクロアレイ及びＷＩ３８細胞由来のｍＲＮＡを用いて検討した。その結果を図５に示す。図５Ａに示したようにＷＩ３８細胞由来のｍＲＮＡに本発明の標識ポリヌクレオチドプローブがアニーリングしたものは、哺乳類細胞由来の特異的なターゲットにハイブリダイズすることが示された。一方、シアノバクテリア遺伝子のものは全く検出しなかった。この事から、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブは、ＤＮＡマイクロアレイにおいても使用できることを確認した。また同じチップを、同じｍＲＮＡ調製品から従来の方法で調製されたｃＤＮＡプローブによって検討した結果を図５Ｂに示す。図５のＡ及びＢの比較から本発明の検出方法が、従来法と基本的に同様の結果を示すことが確認できた。
【００４３】
実施例２
（１）標識ポリヌクレオチドプローブの調製
実施例１（１）のＡｌｅｘａ−ｄＵＴＰをＣｙ３−ｄＵＴＰ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（アマシャム・ファルマシア バイオテク社製）にかえて、実施例１の方法で標識ポリヌクレオチドプローブを調製し、それぞれＣｙ３標識ポリｄＵプローブ、Ｃｙ５標識ポリｄＵプローブとした。
【００４４】
（２）細胞培養、ＲＮＡ抽出
マウスＲＡＷ２４７細胞はヒューマンサイエンス研究資源バンク（ＨｕｍａｎＳｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ：ＨＳＲＲＢ）から入手した。実施例１−（２）と同様の方法で細胞の培養、ｍＲＮＡの抽出を行なった。ＲＡＷ２４７細胞の破骨細胞への分化は、Ｈｓｕ Ｈ．らの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：ｐ３５４０−３５４５，１９９９年）に従い、Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＯＤＦ）を用いた。
【００４５】
（３）ハイブリダイゼーション及び検出
未分化のＲＡＷ２４７細胞から抽出したｍＲＮＡとＣｙ３標識ポリｄＵプローブをアニーリングさせた。すなわち、６００ｎｇのｍＲＮＡと１０μｌのＣｙ３標識ポリｄＵプローブを混合し、７０℃で１０分処理した。また、破骨細胞に誘導したＲＡＷ２４７細胞から抽出したｍＲＮＡとＣｙ５標識ポリｄＵプローブを上記と同様にアニーリングさせた。
【００４６】
ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ Ｍｏｕｓｅ ＣＨＩＰ Ｓｅｔ Ｉ ｖｅｒ．１．０（宝酒造社製）を用い、添付の取り扱い説明書の指示通りにハイブリダイゼーションを行なった。すなわち、プレハイブリダイゼーションは、１４μｌのプレハイブリダイゼーション液（６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．１μｇ／μｌ サケ精子ＤＮＡ）を用いて１時間、６５℃で行った。プローブとして上記Ｃｙ３、Ｃｙ５標識ポリｄＵプローブとｍＲＮＡをアニーリングさせた溶液を混合して１４μｌとし、マイクロアレイに添加して、次いでアレイを６５℃、１８〜２０時間インキュベートし、さらに３０℃、３時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、該マイクロアレイを６０℃、１５分間、２×ＳＳＣ溶液で、さらに６０℃、１５分間、洗浄液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で洗浄し、最後に室温で２回、０．２×ＳＳＣで洗浄した。マイクロアレイ上のシグナルは、４１８アレイスキャナー（アフィメトリックス社製）を用いて検出した。その結果を図６に示す。
【００４７】
図６に示したように、異なる蛍光物質で標識された２種類の標識ポリヌクレオチドプローブを組み合わせた場合においても、遺伝子の発現解析を行なうことができることを確認した。
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、ハイブリダイゼーションにおいて有用な標識核酸プローブ、該プローブの調製方法及び該プローブを用いた標的核酸の高感度検出方法が提供される。
【００４９】
【００５０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションにおける特異性を示す図である。
【図２】図２は、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブの検出感度を示す図である。
【図３】図３は、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブを用いた発現遺伝子の検出を示す図である。
【図４】図４は、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションにおける特異性を示す図である。
【図５】図５は、ＤＮＡチップにおける本発明の標識ポリヌクレオチドプローブを用いた検出を示す図である。
【図６】図６は、ＤＮＡチップにおける本発明の異なる標識を有する２種類の標識ポリヌクレオチドプローブを用いた遺伝子の発現解析を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for preparing a labeled probe useful in the field of genetic engineering, and a highly sensitive detection method using the probe.
[0002]
[Prior art]
The hybridization method is a method often used for identifying the type of mRNA expressed in cells or tissues or for quantifying the molecular weight of each mRNA. Therefore, hybridization techniques for identifying and quantifying mRNA are very important in the fields of biology and medicine.
As the above-mentioned hybridization method, for example, a gene (RNA) to be detected which is obtained by immobilizing total RNA or purified RNA on a porous carrier such as a nylon membrane and labeling with a fluorescent substance or a radioisotope (RI) or the like. ) Is a method of mixing and hybridizing with a complementary probe. Techniques belonging to this category include the Northern hybridization method.
Alternatively, a mixture containing the gene (RNA) to be detected or RNA purified from the mixture is labeled with a fluorescent substance or a radioisotope, and the mixture is hybridized with a probe immobilized on a membrane. There is a way to make it happen. Techniques belonging to this category include the reverse dot blot method. These two methods are used in various experiments in the field of genetic engineering.
[0003]
Conventional hybridization methods have generally used nucleic acids immobilized on a membrane. Recently, however, the above-mentioned hybridization techniques have been carried out mainly on known non-porous hard carriers such as glass, using known DNA. Hybridization techniques using immobilized fragments have been developed. In this technique, many types of DNA fragments can be immobilized at a very high density on a predetermined area on the surface of the carrier. Such a carrier on which DNA fragments are immobilized at high density is generally called a DNA microarray (DNA chip). By using the DNA microarray, identification and quantification of many types of mRNA in a small amount of sample can be performed at once.
[0004]
When the above DNA microarray is used, it is general that a nucleic acid in a sample is labeled with, for example, a fluorescent substance, and detected by hybridizing with a DNA fragment immobilized on a carrier. That is, when detecting mRNA in a sample with a DNA microarray, the sample can be labeled, for example, by the following method.
1. 1. A method of preparing a fluorescence-labeled cDNA by adding a fluorescence-labeled nucleotide at the time of cDNA synthesis using mRNA in a sample as a template, or A method of synthesizing cDNA from mRNA in a sample, and then performing a transcription reaction with RNA polymerase in the presence of a fluorescently labeled nucleotide using the cDNA as a template to prepare a fluorescently labeled RNA probe.
The labeled DNA or RNA prepared by the above method has a base sequence derived from mRNA in the sample or a base sequence complementary thereto, and can be detected on a microarray on which an appropriate DNA fragment is immobilized. it can.
[0005]
However, when a labeled nucleic acid having a base sequence derived from mRNA in a sample is prepared by the above-described method, the number of labeled compounds incorporated into the labeled nucleic acid is proportional to the length of the nucleic acid. Long labeled nucleic acids have the disadvantage that the number of labeled nucleotides incorporated per molecule is smaller than that of long labeled nucleic acids. Therefore, when labeled nucleic acids having the same number of molecules are hybridized with a carrier, for example, a DNA fragment immobilized on a microarray, the intensity of the labeled signal derived from the labeled compound obtained for each array is determined by the chain length of the hybridizing nucleic acid. Will be greatly affected by This is a very important issue in experiments that require quantification.
[0006]
On the other hand, as a nucleic acid labeling method which is not affected by the chain length of a nucleic acid to be labeled, there is a terminal labeling method described in US Pat. However, this method is a method of synthesizing cDNA using an end-labeled oligo dT primer, and the number of labeled compounds added to the primer is limited. Therefore, when the amount of mRNA derived from the gene to be detected is very small, there is a possibility that the signal intensity is weak and cannot be detected.
[0007]
Numerous types of genes are expressed in cells, and the polypeptides encoded by each gene have different structures and functions, so the mRNA chain lengths corresponding to these polypeptides also vary widely. Are distributed. Therefore, there has been a need for a method for detecting mRNA or a nucleic acid having a nucleotide sequence derived from mRNA that gives a signal with excellent quantitativeness for detecting and quantifying these mRNAs as accurately as possible and with high reproducibility. .
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to prepare a labeled nucleic acid that is not affected by the length of a nucleic acid to be detected, and to provide a highly sensitive detection method using the labeled nucleic acid.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies on the detection and quantification of nucleic acids by the hybridization method, and have determined that an mRNA that hybridizes with an immobilized probe can be obtained by using a poly A sequence present at the 3 ′ end of the mRNA. We have found a method that can detect mRNA that is excellent in quantification and detection sensitivity by detection. In addition, the present inventors have also found a method capable of detecting a target DNA in the same manner as described above for DNA to which a polynucleotide has been artificially added, thereby completing the present invention.
[0010]
In general, the present invention relates to a labeled polynucleotide probe that hybridizes to a polyadenine nucleotide portion. In the first invention of the present invention, the polyadenine nucleotide portion of the labeled polynucleotide probe may be a polyriboadenine nucleotide tail of mRNA. In the present invention, a labeled polynucleotide probe having a probe chain length of 50 nucleotides or more can be suitably used. The probe is preferably a polynucleotide comprising a deoxyuracil nucleotide and / or a deoxythymine nucleotide, and preferably contains a labeled deoxyuracil nucleotide and / or a labeled deoxythymine nucleotide. Further, as the labeled nucleotide, those labeled with a substance selected from a radioisotope, a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, a ligand and a receptor can be suitably used. Although not particularly limited, for example, a labeled polynucleotide probe labeled with a substance selected from fluorescein, Cascade Blue, Oregon Green, BODIPY, Rhodamine Green, Alexa Fluor, Texas Red, Cy3 or Cy5 is preferable. It can be used, and particularly preferably, dUTP or dTTP having the above label is exemplified.
[0011]
A second invention of the present invention is the labeled polynucleotide of the first invention, characterized in that the labeled polynucleotide is prepared by a nucleotide extension reaction using polyriboadenine nucleotide or polydeoxyadenine nucleotide as a template and oligo dT as a primer. The present invention relates to a method for preparing a probe. In the second invention of the present invention, the nucleotide extension reaction may be a reverse transcription reaction using polyriboadenine nucleotide as a template. In the present invention, a polyriboadenine nucleotide or a polydeoxyadenine nucleotide serving as a template having a chain length of 50 nucleotides or more can be suitably used. In the present invention, the nucleotide extension reaction may be a deoxynucleotide polymerization reaction. Further, in the present invention, the chain length of the labeled polynucleotide probe is preferably 50 nucleotides or more, and the nucleotide extension reaction or the deoxynucleotide polymerization reaction is performed using at least a labeled deoxyuracil nucleotide and / or a labeled deoxythymine nucleotide. The reaction may be performed. In this case, the reaction is preferably performed in a probe preparation reaction solution in which the molar ratio of deoxyuracil nucleotide to deoxythymine nucleotide is 1: 1 to 1: 3, and the labeling substance used is a radioisotope, A substance selected from a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, a ligand and a receptor can be suitably used. Although not particularly limited, it is preferably labeled with a substance selected from fluorescein, Cascade Blue, Oregon Green, BODIPY, Rhodamine Green, Alexa Fluor, Texas Red, Cy3 or Cy5.
[0012]
A third invention of the present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid, which comprises hybridizing a labeled polynucleotide probe to a polyadenine nucleotide portion. In the third invention of the present invention, the polyadenine nucleotide portion may be a polyriboadenine nucleotide portion (tail) of mRNA, and any of those obtained by artificially adding a polyadenine nucleotide portion later is suitable. Can be used. That is, there is no particular limitation as long as the labeled polynucleotide probe of the first invention of the present invention efficiently and specifically hybridizes. In the third invention of the present invention, a labeled polynucleotide probe containing at least a labeled deoxyuracil nucleotide and / or a labeled deoxythymine nucleotide can be suitably used. The labeled nucleotide is preferably labeled with a substance selected from any of a radioisotope, a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, a ligand and a receptor, and is not particularly limited. For example, fluorescein, Cascade Blue, Oregon Green , BODIPY, Rhodamine Green, Alexa Fluor, Texas Red, a labeled polynucleotide probe labeled with a substance selected from Cy3 and Cy5.
[0013]
A fourth invention of the present invention relates to a probe that hybridizes to a polyadenine nucleotide portion, wherein at least two types of labeled polynucleotide probes having different labels are used, and expression of various genes in two different types of samples is performed. And a method for analyzing an expressed gene, characterized by comparing In the fourth invention of the present invention, for example, but not limited to, labeled with a substance selected from fluorescein, cascade blue, Oregon green, BODIPY, rhodamine green, Alexa Fluor, Texas red, Cy3 or Cy5 Any labeled polynucleotide probe can be suitably used.
[0014]
A fifth invention of the present invention provides a labeled polynucleotide probe characterized by hybridizing to a polyadenine nucleotide portion and a labeled polynucleotide probe characterized by hybridizing to a portion other than polyadenine nucleotide of an expressed gene. The present invention relates to a method for analyzing an expressed gene, which is characterized by being combined. In the fifth invention of the present invention, for example, but not limited to, labeled with a substance selected from fluorescein, cascade blue, Oregon green, BODIPY, rhodamine green, Alexa Fluor, Texas red, Cy3 or Cy5 Any labeled polynucleotide probe can be suitably used.
[0015]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present specification, a nucleotide refers to a deoxyribonucleotide or a ribonucleotide.For example, in the case of a deoxyribonucleotide, it refers to a nucleotide in which the sugar moiety is composed of D-2-deoxyribose. Those having cytosine, guanine, thymine and uracil are mentioned. In the case of ribonucleotides, it refers to nucleotides in which the sugar moiety is composed of D-ribose, and includes those having adenine, cytosine, guanine, and uracil in the base moiety. Furthermore, the nucleotide includes both modified deoxyribonucleotides and modified ribonucleotides. For example, modified ribonucleotide [(α-S) ribonucleotide, (α-S) ribonucleotide in which the oxygen atom of the α-phosphate group is replaced with a sulfur atom -S) N] and other derivatives.
[0016]
In the present specification, a polyadenine nucleotide refers to a polymer of a riboadenine nucleotide or a deoxyadenine nucleotide. The polymer includes both artificially prepared and naturally occurring polymers. Although not particularly limited, for example, a polyA tail (polyriboadenine nucleotide tail) of eukaryotic mRNA is exemplified.
[0017]
In the present specification, a labeled nucleotide refers to a nucleotide labeled with a labeling substance. The labeling substance includes any of those linked directly to the deoxynucleotide or ribonucleotide or via a linker or the like.
In the present specification, the labeled polynucleotide refers to a polymer of the above nucleotide, and the polymer is preferably a polymer composed of a labeled nucleotide and / or an unlabeled nucleotide.
[0018]
In the present specification, the nucleotide extension reaction is not particularly limited as long as it is a reaction for extending the above nucleotide, and any of a reverse transcription reaction, a DNA polymerase reaction, and a terminal deoxynucleotide transfer reaction can be suitably used.
[0019]
As used herein, a target nucleic acid refers to a nucleic acid sequence to be detected, for example, a nucleic acid sequence of any gene. The nucleic acid sequence may be either DNA or RNA.
[0020]
(1) Labeled Polynucleotide Probe of the Present Invention The labeled polynucleotide probe of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide probe that can hybridize to a polyadenine nucleotide portion, and is not particularly limited, but deoxyuridine nucleotide (dUTP) , A polymer of deoxythymine nucleotide (dTTP), or a mixed polymer of dUTP and dTTP can be suitably used. The chain length of the labeled polynucleotide probe of the present invention is not particularly limited, but those having preferably 50 nucleotides or more, more preferably 100 nucleotides or more can be suitably used. The labeled nucleotide probe of the present invention is not particularly limited as long as it contains a substantially constant amount of a labeling compound per probe molecule, but includes, for example, a nucleotide to which a labeling compound is added (labeled nucleotide). be able to. The labeled nucleotide is not particularly limited, but is preferably, for example, a labeled deoxyuracil nucleotide or a labeled deoxythymine nucleotide, and these may be used as a mixture. Further, as the labeled nucleotide, any of nucleotides labeled with a radioisotope, a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, a ligand or a receptor can be suitably used. Although not particularly limited, for example, radioisotopes such as 32 P and 33 P, chemiluminescent substances such as AMPPD, fluorescein, cascade blue, Oregon green, BODIPY, rhodamine green, Alexa Fluor, Texas Red, Cy3 or Cy5 Any of such fluorescent substances, ligands such as biotin, avidin, and digoxigenin or nucleotides labeled with a receptor can be suitably used. In the present invention, dUTP labeled with a fluorescent substance, particularly preferably Alexa Fluor, Cy3 or Cy5 can be suitably used.
[0021]
Further, as another embodiment, a labeled polynucleotide obtained by preparing a polymer of a modified nucleotide using a modified nucleotide having a functional group such as an amino group or a thiol group, and then adding the labeling substance using the functional group. Are also included in the labeled polynucleotide probe of the present invention.
[0022]
The labeled polynucleotide probe of the present invention is not particularly limited, but is preferably one that hybridizes to a polyadenine nucleotide portion under stringent conditions. As the stringent conditions, for example, the conditions described in Molecular Cloning, Laboratory Manual (Molecular Cloning, Laboratory Manual), 2nd edition (1989) can be suitably used.
[0023]
The signal intensity obtained in the detection of mRNA using the labeled polynucleotide probe of the present invention depends solely on the copy number of each mRNA, regardless of the size of the mRNA. Further, it is not necessary to prepare a probe for each mRNA to be detected, and the probe can be used in common for different samples.
Furthermore, the probe of the present invention is labeled at a plurality of positions in its nucleotide, and gives a stronger signal than an end-labeled polynucleotide or cDNA probe. Therefore, provided that successive binding of labeled dUTPs does not affect the nucleotide extension reaction or does not cause steric hindrance in the extension product, the labeled polynucleotide probe of the present invention can have the same length by one nucleotide label. About 4 times stronger than that of the cDNA probe.
[0024]
(2) Method for Preparing Labeled Polynucleotide Probe of the Present Invention The method for preparing the labeled polynucleotide probe of the present invention is not particularly limited. For example, a polyriboadenine nucleotide or a polydeoxyadenine nucleotide is used as a template, and oligo dT is used as a primer. Can be prepared by the nucleotide extension reaction described above. In the nucleotide extension reaction, the enzyme to be used is not particularly limited as long as the labeled polynucleotide probe of the present invention can be efficiently prepared, and may be any of room temperature, thermophilic, and hyperthermostable enzymes. . In addition, for the nucleotide extension reaction, a reverse transcription reaction using a polyriboadenine nucleotide as a template can be suitably used. In this case, although not particularly limited, for example, avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase (AMV RTase), Moloney murine leukemia virus-derived reverse transcriptase (M-MLV RTase), and Rouss-associated virus 2 derived reverse transcriptase (RAV) -2), a DNA polymerase derived from Bacillus cardotenax (Bca), and a DNA polymerase derived from Thermoth thermophilus (Tth). Further, the nucleotide extension reaction may be a complementary strand synthesis reaction by a DNA polymerase. In this case, although not particularly limited, for example, Klenow fragment, Bca DNA polymerase, Bacillus stearothermophilus (Bst) -derived DNA polymerase, Thermus aquaticus (Taq: Thermus aquaticus) -derived DNA polymerase, Pyrococcus fryosas Pfu: Pyrococcus furiosus-derived DNA polymerase, Thermococcus kodakaraensis (KOD) -derived DNA polymerase, and the like. Furthermore, those chemically synthesized using a DNA synthesizer can also be suitably used. Further, those obtained by converting a short-chain nucleotide into a polynucleotide by a ligation reaction can also be suitably used.
[0025]
The chain length of the polyriboadenine nucleotide used as the template is preferably 50 nucleotides or more, more preferably 100 nucleotides or more. When the template is used, the range of the prepared labeled polynucleotide is 50 nucleotides or more. Further, another embodiment of the nucleotide extension reaction may be a deoxynucleotide polymerization reaction. In this case, a commercially available modified enzyme such as terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) can be suitably used. In this case, it is preferable to set the reaction conditions so that the chain length of the probe is 50 nucleotides or more.
[0026]
In any of the above nucleotide extension reactions, a labeled polynucleotide can be easily prepared by performing the reaction in the presence of at least a labeled deoxyuracil nucleotide and / or a labeled deoxythymine nucleotide. In the above-mentioned nucleotide extension reaction, the content molar ratio of labeled (deoxyuracil) nucleotide triphosphate to unlabeled (deoxythymine) nucleotide triphosphate in the reaction solution is preferably in the range of 1: 1 to 1: 3, Particularly preferred is 1: 2. The labeled nucleotide used in the preparation method of the present invention can be selected from nucleotides labeled with a radioisotope, a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, a ligand or a receptor. It may be an analog of the labeled nucleotide.
[0027]
Further, as a method for preparing a labeled polynucleotide probe of the present invention, a method of incorporating a labeled nucleotide to which the above-mentioned labeled compound is added at the time of a nucleotide extension reaction is exemplified. A method used for elongation reaction, and after completion of the reaction, may be a method of introducing a labeled compound enzymatically or chemically, and a label capable of finally preparing the labeled polynucleotide probe of the present invention. Any of the introduction methods can be suitably used.
[0028]
In the present invention, a fluorescently labeled polydeoxyuracil nucleotide can be prepared by a reverse transcription reaction in the presence of a polyriboadenine nucleotide and an oligodeoxythymine nucleotide shown as a template and a primer. The labeled polynucleotide probe of the present invention, containing labeled deoxyuracil nucleotides and unlabeled deoxythymine nucleotides, prepared by the method of the present invention can be used as an mRNA that hybridizes with a DNA sequence spotted on a membrane or glass surface (DNA chip). Can be used to detect
[0029]
(3) The method for detecting a target nucleic acid and the method for analyzing an expressed gene according to the present invention In the method for detecting a target nucleic acid according to the present invention, detection can be performed by hybridizing a labeled polynucleotide probe to a polyadenine nucleotide portion of a target nucleic acid. The polyadenine nucleotide portion of the target nucleic acid may be one to which polyriboadenine nucleotide or polydeoxyadenine nucleotide is artificially added later, or may be the polyriboadenine nucleotide tail of natural mRNA. That is, there is no particular limitation as long as the labeled polynucleotide probe of the present invention efficiently and specifically hybridizes, and the labeled nucleotide is labeled with a radioisotope, a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, a ligand or a receptor. Preferred are those selected from any of the following nucleotides, for example, labeled nucleotides selected from fluorescein, Cascade Blue, Oregon Green, BODIPY, Rhodamine Green, Alexa Fluor, Texas Red, Cy3 or Cy5. Can be
[0030]
Another embodiment of the detection method of the present invention includes a method for analyzing an expressed gene. In this method, by using at least two types of labeled polynucleotide probes having different labels, the expression of various types of genes in two different types of samples can be compared. The labeled polynucleotide probe is not particularly limited, but for example, a polynucleotide probe labeled with Cy3 and Cy5, respectively, can be suitably used.
[0031]
Further, as another embodiment of the method of analyzing an expressed gene, a labeled polynucleotide probe that hybridizes to a polyadenine nucleotide portion and a labeled polynucleotide probe that hybridizes to a portion other than the polyadenine nucleotide of an expressed gene (cDNA-labeled polynucleotide probe) Can be combined. In this case, different labels can be used. A probe that hybridizes to a portion other than the polyadenine nucleotide of the expressed gene can be prepared by a known method, for example, a cDNA synthesis reaction using mRNA in a sample as a template. Although not particularly limited, the method of the present invention can be used, for example, in the expression of a specific gene that is controlled by polyadenylation or deadenylation at the 3 ′ end, and the above-described control can be detected.
[0032]
Further, in the detection method of the present invention, since the labeled polynucleotide probe can be used in common, there is no need to prepare a cDNA probe in accordance with a conventional target nucleic acid, and detection can be performed at low cost and in a short time. it can.
[0033]
【Example】
The present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0034]
Example 1
(1) Preparation of labeled polynucleotide probe A labeled polynucleotide probe was prepared using a reverse transcription / labeling reaction. The reaction was performed with the following reaction solution composition. That is, using 100 pmol of synthetic template-primer Poly (rA) · p (dT) 12-18 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) as a template, 0.5 mM each of dATP, dCTP, dGTP, 40 μM dTTP and 20 μM Alexa-dUTP (manufactured by Molecular Probes), 10 mM DTT, 25 U ribonucleotide inhibitor (manufactured by Gibco BRL), and 1.5 U of superscript reverse transcriptase (manufactured by Gibco BRL) were added to make the reaction solution volume to 50 μl. . The reaction mixture was kept at 30 ° C. for 60 minutes, then heated at 94 ° C. for 3 minutes to inactivate the enzyme and cooled on an ice bath. The reaction solution was purified using a Microspin S-300HR column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). Next, the purified product was treated with 0.3N NaOH at 37 ° C. for 20 minutes to decompose the template poly (rA), and then neutralized with hydrochloric acid and a 1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0). This solution was used as a fluorescence-labeled poly dU probe solution.
[0035]
(2) Cell culture, RNA extraction, and preparation of cDNA probe Human HeLa cells and WI38 cells were obtained from Human Science Research Resources Bank (HSRRB), and Dulbecco's modified containing 10% fetal calf serum. The cells were cultured in Eagle medium. Total RNA was extracted from the above cultured cells by the guanidium-phenol-chloroform method. Genomic DNA that may have been contaminated was removed using RNase-free DNase (RQ1 DNase, manufactured by Promega). The mRNA was purified using the mRNA Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech) as necessary. A cDNA probe was prepared by a reverse transcription reaction using Cy3-dUTP (Amersham Pharmacia Biotech) with 600 ng of the purified RNA as a template. The reaction conditions were as follows: after incubation at 37 ° C. for 60 minutes, 10 μl of 1N sodium hydroxide solution was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 10 minutes to decompose the template RNA. The reaction was neutralized by adding 25 μl of 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), and then precipitated with ethanol. The precipitate was redissolved in 10 μl of the hybridization buffer.
[0036]
(3) Preparation of DNA Immobilized Membrane and DNA Microarray Human GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), PCNA (proliferating cell nuclear antigen), p53, Rb (retinoplast, p18, Rp, p18, Rp, p18, Rp) p21 and p27 genes as targets and primers described in SEQ ID NOs: 1 to 40 in the Sequence Listing and TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. RT-PCR was performed using 2.1 (Takara Shuzo). Nested PCR was performed for the p53, RB, p130, p16, p19, p27, p18, and p14 genes after the reverse transcription reaction. As the template, the RNA obtained in Example 1 (2) was used. The obtained amplified fragment was purified and then subcloned into a pT7Blue-T cloning vector (Novagen), and DNA sequence analysis was confirmed. After confirming the inserted nucleotide sequence, the above-mentioned inserted fragment was immobilized on Hybond N + (Amersham Pharmacia Biotech) using Bio-Dot (BioRad). A commercially available Test array (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was used as the DNA microarray.
[0037]
(4) Hybridization and detection The membrane filter holding the target gene was prepared using 1 ml of a hybridization buffer (5 × SSC, 0.5% BSA, 0.1 mg / ml salmon sperm DNA, 0.1 ml / cm 2 of the membrane). % SDS) at 37 ° C. for 1 hour. First, 10 μl of the labeled poly-dU probe solution prepared in Example 1 (1) is added to 10 μl of either the total RNA or the purified RNA obtained in Example 1 (2) so that the final volume becomes 200 μl. Was heated at 70 ° C. for 10 minutes, and then hybridized with the membrane filter at 30 ° C. for 6 to 10 hours. The membrane filter was gently shaken in Wash Buffer I (1 × SSC, 0.1% SDS) for 15 minutes at room temperature, and then washed for 10 minutes with Wash Buffer II (0.1 × SSC, 0% SDS). (1% SDS) and shaken. After washing, the membrane filter was detected with a fluorescence image analyzer FMBIO II (Takara Shuzo). On the other hand, hybridization of the DNA microarray was performed as instructed in the attached instruction manual. That is, prehybridization is performed at 65 ° C. for 1 hour using 14 μl of prehybridization solution (6 × SSC, 0.1% SDS, 5 × Denhardt's solution, 0.1 μg / μl salmon sperm DNA). Was. For hybridization with the poly-dU probe, 1 μl of poly-dU was added to 600 ng of the mRNA obtained in Example 1 (2) to make the volume 14 μl. The solution was heated at 70 ° C. for 10 minutes. A cDNA probe was prepared using the same amount of mRNA. The above reaction was added to the microarray, and the array was then incubated at 65 ° C for 18-20 hours, then at 30 ° C for 3 hours. After hybridization, the microarray was washed with a 2 × SSC solution at 60 ° C. for 15 minutes, and further with a washing solution (2 × SSC, 0.1% SDS) at 60 ° C. for 15 minutes. X Washed with SSC. The signal on the microarray was detected using an array scanner 418 (Affymetrix).
[0038]
As an example of the labeled polynucleotide probe of the present invention in a membrane filter, FIG. 1A shows the hybridization specificity of a labeled polynucleotide probe labeled with Alexa-dUTP. FIG. 1-B shows the spotted position of each polynucleotide. As shown in FIG. 1-A, it was confirmed that the labeled polynucleotide probe specifically hybridized to polyriboadenine nucleotide (polyA) and did not hybridize to other nucleotides.
[0039]
Furthermore, the detection sensitivity was examined using a membrane in which polyriboadenine nucleotides were spotted in a concentration range of 1 ng (3 fmol) to 1 μg (3 pmol). The result is shown in FIG. As shown in FIG. 2, it was confirmed that a clear fluorescent signal was obtained even when 1 ng (3 fmol) was immobilized to 12 mm 2 .
[0040]
Using a filter in which 1 μg of GAPDH DNA fragment and pUC18 plasmid DNA were spotted on the same membrane, 10-40 μg of total RNA derived from HeLa cells was added to the labeled poly dU probe solution prepared in Example 1 (1). Annealed 10 μl was hybridized. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 3, a signal was detected only on the spot of GAPDH DNA, not on pUC18 DNA.
[0041]
Next, using the membrane on which the DNA fragment prepared in (4) above was spotted, 20 μg of total RNA derived from HeLa cells and WI138 cells and 10 μl of the poly dU probe solution prepared in Example 1 (1) were annealed. The things were hybridized. The result is shown in FIG. FIG. 4-1 shows the results obtained using HeLa cell-derived samples, and FIG. 4-2 shows the results obtained using WI138-derived samples. FIG. 4-3 shows the position of each spotted gene. From FIGS. 4-1 and 4-2, it was confirmed that a signal was detected depending on the gene to be expressed. Furthermore, when compared with the results of the conventional Northern blot, it was confirmed that the same expression pattern was detected.
[0042]
The examination was performed using a DNA microarray and mRNA derived from WI38 cells. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 5A, it was shown that the mRNA derived from WI38 cells annealed with the labeled polynucleotide probe of the present invention hybridized to a specific target derived from mammalian cells. On the other hand, the cyanobacterial gene was not detected at all. From this, it was confirmed that the labeled polynucleotide probe of the present invention can be used in a DNA microarray. FIG. 5B shows the result of examining the same chip using a cDNA probe prepared from the same mRNA preparation by a conventional method. From the comparison between A and B in FIG. 5, it was confirmed that the detection method of the present invention showed basically the same results as the conventional method.
[0043]
Example 2
(1) Preparation of Labeled Polynucleotide Probe The Alexa-dUTP of Example 1 (1) was changed to Cy3-dUTP or Cy5-dUTP (manufactured by Amersham-Pharmacia Biotech), and the labeled polynucleotide probe was replaced by the method of Example 1. Prepared and used as Cy3-labeled poly dU probe and Cy5-labeled poly dU probe, respectively.
[0044]
(2) Cell culture and RNA extraction Mouse RAW247 cells were obtained from Human Science Research Resources Bank (HSRRB). Cell culture and mRNA extraction were performed in the same manner as in Example 1- (2). The differentiation of RAW247 cells into osteoclasts is described in Hsu H. et al. Osteoblast Differentiation Factor (ODF) was used according to the method of Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 3540-3545 (1999).
[0045]
(3) Hybridization and detection mRNA extracted from undifferentiated RAW247 cells was annealed with Cy3-labeled poly dU probe. That is, 600 ng of mRNA and 10 μl of Cy3-labeled poly-dU probe were mixed and treated at 70 ° C. for 10 minutes. In addition, mRNA extracted from RAW247 cells induced into osteoclasts and Cy5-labeled poly dU probe were annealed in the same manner as described above.
[0046]
IntelliGene Mouse CHIP Set I ver. Using 1.0 (manufactured by Takara Shuzo), hybridization was carried out as instructed in the attached instruction manual. That is, prehybridization is performed at 65 ° C. for 1 hour using 14 μl of prehybridization solution (6 × SSC, 0.1% SDS, 5 × Denhardt's solution, 0.1 μg / μl salmon sperm DNA). Was. A solution obtained by annealing the above-mentioned Cy3 or Cy5-labeled poly dU probe and mRNA as a probe was mixed to 14 μl, added to the microarray, and then the array was incubated at 65 ° C. for 18 to 20 hours, and further incubated at 30 ° C. for 3 hours. did. After hybridization, the microarray was washed with a 2 × SSC solution at 60 ° C. for 15 minutes, and further with a washing solution (2 × SSC, 0.1% SDS) at 60 ° C. for 15 minutes. Washed with 2 × SSC. Signals on the microarray were detected using a 418 array scanner (Affymetrix). FIG. 6 shows the result.
[0047]
As shown in FIG. 6, it was confirmed that gene expression analysis could be performed even when two types of labeled polynucleotide probes labeled with different fluorescent substances were combined.
[0048]
【The invention's effect】
The present invention provides a labeled nucleic acid probe useful in hybridization, a method for preparing the probe, and a method for highly sensitive detection of a target nucleic acid using the probe.
[0049]
[0050]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the specificity in hybridization of a labeled polynucleotide probe of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing the detection sensitivity of the labeled polynucleotide probe of the present invention.
FIG. 3 is a diagram showing detection of an expressed gene using the labeled polynucleotide probe of the present invention.
FIG. 4 is a diagram showing the specificity in hybridization of the labeled polynucleotide probe of the present invention.
FIG. 5 is a diagram showing detection using a labeled polynucleotide probe of the present invention on a DNA chip.
FIG. 6 is a diagram showing gene expression analysis on a DNA chip using two types of labeled polynucleotide probes having different labels of the present invention.
