【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血管新生促進ならびに骨新生促進用の徐放製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多血小板血漿（ＰＲＰ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ）とも称される）とは、末梢血を低速で遠心分離して赤血球を除くことにより得られる濃厚血小板血漿である。ＰＲＰには、血小板中に含まれる血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）などの成長因子が多く含まれており、これらの相乗的作用により血管新生、創傷治癒の促進、皮膚潰瘍の治療、骨組織再生の促進などにおける効果が報告されている。また、ＰＲＰに含まれる成長因子によりその再生、修復が促進されるあらゆる組織や臓器、例えば、軟骨、筋肉、神経、脂肪組織などの創傷治癒および修復の促進が期待される。また、その治癒修復の状態がより正常に近くなることも期待される。さらに、ＰＲＰには成長因子以外にも、種々のサイトカイン、リンホカイン、モノカイン、生理活性物質などが含まれていることから、広く患者自身の免疫系を介した治療薬としての可能性も示唆されている。さらに、このような有効成分を含むＰＲＰを患者自身の血液から簡単に採取することができるため、治療上の倫理的問題も全くなく、血液製剤の使用に伴うウイルス感染や免疫不適合などのリスクを回避しうるという長所を有する。
【０００３】
しかしながら、ＰＲＰ中に含まれる各種の成長因子などの生理活性をもつ有効成分は、通常、投与部位から拡散により排泄、酵素分解により失活するために生体内半減期が短く、ＰＲＰを局所投与した場合には、これらの有効成分の生理活性効果をほとんど得ることができなった。これの解決法として、例えば、フィブリン糊、アルギン酸、β−ＴＣＰなどとＰＲＰとを混合して用いることによって、ＰＲＰの生物効果を増強させる試みが報告されている。しかしながら、これらの試みは、現在臨床で使用されている材料との単なる組み合わせであり、ＰＲＰ中に含まれる有効成分を徐放し、持続的な効果を実現させることを目的としたものではない。
【０００４】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【特許文献１】
ＷＯ９４／２７６３０
【非特許文献１】
ｔｈｅ Ｑｕｉｎｔｅｓｓｅｎｃｅ， Ｖｏｌ． ２０， Ｎｏ． １， ２００１， ９５−１０４
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、ＰＲＰに含まれる有効成分を病巣部位に効率的に輸送しうる徐放性製剤を形成することにより、血管新生および骨新生を促進させ、創傷、皮膚潰瘍、骨欠損を有効に治療しうる薬剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＰＲＰを含むハイドロゲルを用いて作製したＰＲＰの徐放性製剤が、モデル動物において血管新生および骨新生に顕著な効果を有することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、ＰＲＰおよびゼラチンからなるハイドロゲルを含む徐放製剤を提供する。本発明にしたがって、ＰＲＰをゼラチンハイドロゲルに含浸させた粒子を病巣に局所投与して徐放させることにより、血管新生および骨新生の有意な促進効果が得られる。
【０００７】
別の観点においては、本発明は、多血小板血漿およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤からなることを特徴とする、血管新生を促進するための医薬組成物、骨新生を促進するための医薬組成物、創傷を治療するための医薬組成物、ならびに皮膚潰瘍を治療するための医薬組成物を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明で使用されるゼラチンは、牛、豚、魚類などを始めとする各種の動物種の皮膚、骨、腱などの身体のあらゆる部位から採取できるコラーゲン、あるいはコラーゲンとして用いられている物質から、アルカリ加水分解、酸加水分解、および酵素分解等の種々の処理によって変性させて得ることができる。ゼラチンの性質は、用いる材料および処理方法により様々であるが、そのいずれの性質をもつゼラチンも本発明においてＰＲＰの徐放のためのハイドロゲル材料として利用することができる。
【０００９】
ゼラチンの性質を表す尺度としては、例えば、等電点、分子量、ジータ電位などがある。例えば、市販のゼラチンとしては、シグマ社製タイプＡゼラチン、和光社製ゼラチンがあり、水溶液中のジータ電位が以下のとおりである：
シグマ社製タイプＡゼラチン：約０〜約５ｍＶ
和光社製ゼラチン：約−５〜約−２ｍＶ
ジータ電位は、物質（ゼラチン）の静電的な荷電の程度を表す尺度である。
【００１０】
本発明において用いるのに特に好ましいゼラチンは、以下の物性：
コラーゲンからのアルカリ加水分解処理によって得られる、酸性ゼラチンであり、
分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの非還元条件下で約１０〜約２０万ダルトンであり、
水溶液中のジータ電位が、約−１５〜約−２０ｍＶである
を有するゼラチンである。また好ましくは、ウシの骨由来のＩ型コラーゲンをアルカリ処理して調製した酸性ゼラチンを用いることができ、新田ゼラチン社の試料等電点（ＩＥＰ）５．０として入手することもできる。なお、酸処理して調製した塩基性ゼラチンは同じく新田ゼラチン社の試料ＩＥＰ９．０として入手することができるが、ジータ電位は以下のように大きく相違する。
酸性ゼラチン （新田ゼラチン社試料ＩＥＰ５．０）：約−１５〜約−２０ｍＶ
塩基性ゼラチン （新田ゼラチン社試料ＩＥＰ９．０）：約＋１２〜約＋１５ｍＶ
【００１１】
本発明で使用されるゼラチンハイドロゲルとは、上記ゼラチンを用いて種々の化学的架橋剤とゼラチン分子間に化学架橋を形成させて得られるハイドロゲルのことである。化学的架橋剤としては、例えばグルタルアルデヒド、例えばＥＤＣ等の水溶性カルボジイミド、例えばプロピレンオキサイド、ジエポキシ化合物、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、イミダゾール基などの間に化学結合を作る縮合剤を用いることができる。好ましいものは、グルタルアルデヒドである。また、ゼラチンは、熱処理又は紫外線照射によっても化学架橋することができる。また、これらの架橋処理を組み合わせて用いることもできる。さらに、塩架橋、静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用などを利用した物理架橋によりハイドロゲルを作製することも可能である。
【００１２】
ゼラチンの架橋度は、所望の含水率、すなわちハイドロゲルの生体吸収性のレベルに応じて適宜選択することができる。ゼラチンハイドロゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度の好ましい範囲は、ゼラチン濃度１〜２０ｗ／ｗ％、架橋剤濃度０．０１〜１ｗ／ｗ％である。架橋反応条件は特に制限はないが、例えば、０〜４０℃、１〜４８時間で行うことができる。一般に、ゼラチンおよび架橋剤の濃度、架橋時間が増大するとともにハイドロゲルの架橋度は増加し、生体吸収性は低くなる。
【００１３】
ゼラチンハイドロゲルの形状は、特に制限はないが、例えば、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、粒子状などがある。円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のものは、通常埋込片として用いられることが多く、あるいは細かく砕いて粒子状にして用いることも可能である。また、球状、粒子状、ペースト状のものは注射投与も可能である。
【００１４】
円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のゼラチンハイドロゲルは、ゼラチン水溶液に架橋剤水溶液を添加するか、あるいは、架橋剤水溶液にゼラチンを添加し、所望の形状の鋳型に流し込んで、架橋反応させることにより調製することができる。また、成形したゼラチンゲルにそのまま、あるいは乾燥後に架橋剤水溶液を添加してもよい。架橋反応を停止させるには、エタノールアミン、グリシン等のアミノ基を有する低分子物質に接触させるか、あるいは、ｐＨ２．５以下の水溶液を添加する。反応に用いられた架橋剤および低分子物質を完全に除去する目的で、得られたゼラチンハイドロゲルは、蒸留水、エタノール、２−プロパノール、アセトン等により洗浄し、製剤調製に供される。
【００１５】
球状、粒子状のゼラチンハイドロゲルは、例えば、三口丸底フラスコに固定した攪拌用モーター（例えば、新東科学社製、スリーワンモーター、ＥＹＥＬＡ ｍｉｎｉＤ．Ｃ． スターラー等）とテフロン（登録商標）用プロペラを取り付け、フラスコと一緒に固定した装置にゼラチン溶液を入れ、ここにオリーブ油等の油を加えて２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンとし、これに架橋剤水溶液を添加するか、ゼラチン水溶液を予めオリーブ油中にて前乳化（例えば、ボルテックスミキサーＡｄｖａｎｔｅｃ ＴＭＥ−２１、ホモジナイザー、ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ１０−３５等を用いて）しておいたものをオリーブ油中に滴下し、微粒子化したＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これに架橋剤水溶液を添加して架橋反応させ、遠心分離によりゼラチンハイドロゲルを回収した後、アセトン、酢酸エチル等で洗浄し、さらに２−プロパノール、エタノール等に浸漬して架橋反応を停止させることにより、調製することができる。得られたゼラチンハイドロゲル粒子は、２−プロパノール、Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水、蒸留水等で順次洗浄し、製剤調製に供される。ゼラチンハイドロゲル粒子が凝集する場合には、例えば、界面活性剤などの添加あるいは超音波処理（冷却下、１分以内程度が好ましい）等を行ってもよい。
【００１６】
得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は、上述の粒子作製時におけるゼラチン濃度、ゼラチン水溶液とオリーブ油との体積比、および撹拌スピードなどにより変化する。一般には粒径は１〜１０００μｍであり、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けて使用すればよい。さらに、前乳化することによって、粒子サイズが２０μ以下の微粒子状のゼラチンハイドロゲルを得ることができる。
【００１７】
球状、粒子状のゼラチンハイドロゲルを調製する別法として以下の方法も挙げられる。上記の方法と同様の装置にオリーブ油を入れ、２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、ここにゼラチン水溶液を滴下してＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これを冷却後、アセトン、酢酸エチル等を加えて攪拌し、遠心分離により未架橋ゼラチン粒子を回収する。回収したゼラチン粒子を、さらにアセトン、酢酸エチル等、次いで２−プロパノール、エタノール等で洗浄後、乾燥させる。この乾燥ゼラチン粒子を０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む架橋剤水溶液に懸濁させ、緩やかに攪拌しながら架橋反応させ、使用した架橋剤に応じて０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１００ｍＭグリシン水溶液又は０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む０．００４Ｎ ＨＣ１等にて洗浄し、架橋反応を停止することによりゼラチンハイドロゲル粒子を調製することができる。本法で得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は上記の方法の場合と同様である。
【００１８】
本発明のゼラチンハイドロゲルは適宜、適当な大きさ及び形に切断後凍結乾燥し滅菌して使用することができる。凍結乾燥は、例えば、ゼラチンハイドロゲルを蒸留水に入れ、液体窒素中で３０分以上、又は−８０℃で１時間以上凍結させた後に、凍結乾燥機で１〜３日間乾燥させることにより行うことができる。
【００１９】
本発明で使用されるＰＲＰは、末梢血を低速で遠心分離して、赤血球成分を除去することにより容易に得ることができる。当業者は、用いる遠心分離器の種類に応じて、血球成分を効率的に除去する回転数および時間を適宜選択することができる。さらに、血球成分を除去した後、再度遠心分離することにより血小板を濃縮してもよい。あるいは、膜を用いる血液分離装置により調製することもできる。本発明のＰＲＰ含有徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤は、例えば、上記の凍結乾燥した酸性ゼラチンハイドロゲルにＰＲＰを滴下するか、あるいはゼラチンをＰＲＰ中に浸漬させ、ハイドロゲル内にＰＲＰを含浸させることにより得ることができる。この含浸操作は、通常、４−３７℃で１５分間−１時間、好ましくは４−２５℃で１５−３０分間で終了し、その間にハイドロゲルはＰＲＰで膨潤し、ＰＲＰ中に含まれるの有効成分がゼラチン分子と相互作用することによって、有効成分がゼラチン分子と複合体を形成し、ＰＲＰがゼラチンハイドロゲル内に物理的相互作用によって固定される。ＰＲＰとゼラチンとの間の複合体の形成には、両者の間の静電的相互作用だけでなく、疎水結合、水素結合等の他の相互作用も大きく寄与していると考えられる。
【００２０】
ゼラチン（乾燥重量）に対するＰＲＰの重量比は約１倍から約１００００倍の範囲内であることが好ましい。より好ましくは、ゼラチンに対してＰＲＰは約２倍から約５０００倍の重量比であり、さらに好ましくは約１０倍から約１０００倍の重量比である。
【００２１】
本発明のＰＲＰ徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤は、ＰＲＰの徐放性効果と安定化効果を持つため、ＰＲＰに含まれる各種成長因子等の有効成分の機能を少量で長時間にわたって発揮し得る。そのため、局所投与した部位において、これらの有効成分の血管新生促進機能および骨新生機能が効果的に発揮される。
【００２２】
この徐放のメカニズムは、ＰＲＰに含まれる各種成長因子等の有効成分が、ハイドロゲル内のゼラチンに物理的に固定化されていることに基づく。本発明者らは、これまで、成長因子、サイトカイン、モノカイン、リンホカイン、その他の生理活性物質などの生体吸収性高分子ハイドロゲルを用いた徐放化を試み、これにより他の材料では達成できない生理活性を有した有効成分の徐放化とその徐放期間のコントロールに成功してきた。本発明においては、ＰＲＰに含まれる有効成分が同様のメカニズムによってハイドロゲルから徐放されると考えられる。ゼラチンハイドロゲルに固定化された状態では、有効成分はハイドロゲルから放出されない。生体内でハイドロゲルが分解されるにつれて、ゼラチン分子が水可溶性となり、それに伴って、ゼラチン分子に固定化されている有効成分が放出されるようになる。すなわち、ハイドロゲルの分解によって、有効成分の徐放性を制御することができる。ハイドロゲルの分解性は、ハイドロゲル作製時における架橋程度を調節することにより変えることができる。また、ＰＲＰに含まれる各種成長因子等の有効成分がゼラチンと相互作用することによって、これらの生体内での安定性、例えば酵素分解抵抗性などが向上する。
【００２３】
本発明のゼラチンハイドロゲルの架橋度を評価する指標として含水率がある。これは膨潤ハイドロゲルの重量に対するハイドロベル中の水の重量パーセントである。含水率が大きければハイドロゲルの架橋度は低くなり、分解されやすくなる。つまり、この含水率の値がＰＲＰの徐放（徐々に放出）を左右する。ハイドロゲルの生体内での酵素分解性は、この含水率によって変化する。体内の場所、動物の種類によって多少の差はあるが、分解期間が５日間から３か月間で分解するハイドロゲルの含水率は９９−８５ｗｔ％である。ハイドロゲルの分解期間はＰＲＰの徐放期間と一致するため、この場合の徐放期間も５日間から３か月の間で変化する。好ましい徐放性効果を示す含水率としては約８０〜９９ｗ／ｗ％であり、さらに好ましいものとしては、約９５〜９８ｗ／ｗ％のものが挙げられる。
【００２４】
本発明のＰＲＰゼラチンハイドロゲル製剤は、薬学的に許容しうる水性注射溶液中に懸濁させることにより、注射用製剤として非経口的に使用することができる。例えば、皮下、筋肉内、静脈内、体腔内、結合組織内、骨内膜あるいは障害臓器等に投与することができる。
【００２５】
本発明のＰＲＰ徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤あるいはその複合体は、それぞれの用途に応じて適宜剤型を工夫することができる。例えば、シート状、スティック状、粒子状、ロッド状、ペースト状の剤型にして投与することができる。投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、体腔内投与、結合組織内投与、骨内膜投与などが考えられる。
【００２６】
本発明の徐放製剤中のＰＲＰの用量は、疾患の重篤度、患者の年齢、体重等により適宜調製することができるが、通常成人患者当たり約０．１〜約５００ｍｌの範囲、好ましくは、約１〜約５０ｍｌの範囲から投与量が選択され、これを患部またはその周辺部位に注入することができる。また１回の投与で効果が不十分であった場合は、該投与を複数回行うことも可能である。
【００２７】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２８】
実施例１．ＰＲＰ含有ゼラチンハイドロゲルの作製
酸性ゼラチン（等電点５．０）は、新田ゼラチン（大阪）から入手した。また、フィブリンはＴｉｓｓｅｅｌ（（登録商標））（Ｂａｘｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）を使用した。その他の試薬は特に精製せずに用いた。ゼラチン２．５ｇと蒸留水４７．５ｇをビーカーに入れ、３０分間室温で撹拌した。その後、４０℃に加温しながら、さらに３０分間撹拌し、５ｗｔ％ゼラチン水溶液を作製した。新しいビーカーにこのゼラチン水溶液を４０ｍｌ入れ、撹拌しながら７０μｌのグルタルアルデヒド水溶液を滴下した。すぐに反応溶液をポリエチレンディッシュ（８×８ｃｍ２）に流延して、アルミホイルで蓋をして、４℃、２４時間架橋反応させた。得られたゼラチンハイドロゲルを適当な大きさに切り、０．１Ｍグリシン水溶液に入れて、室温で１時間撹拌することにより未反応のアルデヒド基をブロックした。その後、蒸留水中で室温で１時間撹拌を２回行い、−８０℃の冷凍庫において２４時間凍結した。凍結後、凍結乾燥を行い、インビボ実験に用いる前にエチレンオキサイドガスによるガス滅菌を行った。得られたハイドロゲルの含水率は９８ｗｔ％であった。なお、含水率は膨潤時のハイドロゲル重量に対するハイドロゲル内の水の量のパーセンテージで表す。
【００２９】
実施例２．血管新生に及ぼす効果の評価
実験モデルとして体重２５０−３００ｇの雄性ウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットを用いた。０．２ｍｌペントバルビタール（ネンブタール（登録商標）、大日本製薬、大阪）の腹腔投与による全身麻酔を行った。麻酔奏効確認後、腹部皮下に５ｗｔ％ブドウ糖液５ｍｌを注射した。その後、大腿部にＮｏ．１０のメスで約１ｃｍの切開を行った。大腿動・静脈を露出し、同血管から２４ゲージ留置針と５ｍｌシリンジにて血液を４．５ｍｌ採血した。このとき、注射筒にはあらかじめ血液抗凝固液としてＡＣＤ液（２．２ｗｔ％クエン酸ナトリウム、０．８ｗｔ％クエン酸、２．２ｗｔ％ブドウ糖）を０．５ｍｌ入れておいた。採血した血液を１０ｍｌ遠沈管に入れ、遠心器にて２４００ｒｐｍで１０分間の遠心を行った。遠心終了後、血清成分と血球成分に分離するので、血清成分のみを１８ゲージ注射針と５ｍｌシリンジにて採取し、新しい１０ｍｌ遠沈管に入れ、３５００ｒｐｍで１５分間、再度遠心した。遠心終了後、遠沈管下方に溜まったＰＲＰを１８ゲージ注射針と１ｍｌシリンジにて採取した。
【００３０】
凍結乾燥ゼラチンハイドロゲル７ｍｇにＰＲＰ６００ｍｇを滴下し、室温で１５分間静置し、ＰＲＰを十分に含浸させることにより、ＰＲＰ含浸ゼラチンハイドロゲルを得た。フィブリン（Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標））の調製は製造元の指針にしたがって行い、凝固する直前にＰＲＰを混合した。このフィブリン糊とＰＲＰとの混合は従来より行われている方法であり、比較試験として行った。
【００３１】
ラット背部に７０％エタノールの噴霧にて消毒した後、同部をバリカンにて剃毛を行い、手術台に乗せて上肢、下肢を固定した。背部をイソジンにて消毒後、Ｎｏ．１０のメスで約２ｃｍの皮膚切開を行った。その後、皮膚と筋層を剥離剪刀にて約１．５ｃｍ×１．５ｃｍ剥離した。同様の剥離を合計４箇所行い、以下のものを留置した。
１．ＰＲＰ含浸ゼラチンハイドロゲル
２．フィブリンとＰＲＰの混合物（ＰＲＰ含有フィブリン糊）
留置後、皮膚を３−０絹糸にて縫合し、最後に創部をイソジンにて消毒した。
【００３２】
１週間後に創部を観察することにより血管新生の程度を評価した。結果を図１に示す。ＰＲＰ含浸ゼラチン埋入部位周辺には血管新生が見られている。これに対して、従来法であるＰＲＰフィブリン糊では、血管新生は見られるものの軽微であった。なお、同量のＰＲＰを投与した場合には、血管新生は全く認められなかった（図には示されていない）。また、顕微鏡下に単位面積あたりの新生血管の数を測定した。結果を図２に示す。これらの結果は、ゼラチンハイドロゲルによりＰＲＰが徐放化され、その生物活性が有効に発現されたことを示す。
【００３３】
実施例３．骨新生に及ぼす効果の評価
実験モデルとして、体重３−４ｋｇのニュージーランドホワイトラビットを用いた。ケタミン（ケタラール（登録商標）、三共、東京）３ｍｌ、キシラジン（セラクタール（登録商標）、バイエル、東京）１．５ｍｌの臀部筋肉注射により全身麻酔を行った。麻酔奏効確認後、背部皮下に５ｗｔ％ブドウ糖液１０ｍｌを注射した。その後、耳部の動脈より２２ゲージ留置針と１０ｍｌシリンジにて血液を９ｍｌ採血した。このとき、注射筒にはあらかじめ血液抗凝固液としてＡＣＤ液（２．２ｗｔ％クエン酸ナトリウム、０．８ｗｔ％クエン酸、２．２ｗｔ％ブドウ糖）を１．０ｍｌ入れておいた。採血した血液を１０ｍｌ遠沈管に入れ、遠心器にて２４００ｒｐｍで１０分間の遠心を行った。遠心終了後、血清成分と血球成分に分離するので、血清成分のみを１８ゲージ注射針と５ｍｌシリンジにて採取し、新しい１０ｍｌ遠沈管に入れ、３５００ｒｐｍで１５分間、再度遠心した。遠心終了後、遠沈管下方に溜まったＰＲＰを１８ゲージ注射針と１ｍｌシリンジにて採取した。
【００３４】
凍結乾燥ゼラチンハイドロゲル２０ｍｇにＰＲＰ１．５ｇを滴下し、室温で１５分間静置し、ＰＲＰを十分に含浸させることにより、ＰＲＰ含浸ゼラチンハイドロゲルを得た。フィブリン（Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標））の調製は製造元の指針にしたがって行い、凝固する直前にＰＲＰを混合した。
【００３５】
家兎両側前腕（前足）の第一関節から第二関節まで７０％エタノールの噴霧にて消毒した後、同部をバリカンにて剃毛を行い、手術台に乗せて右側上腕を固定した。手術部位をイソジンにて消毒後、Ｎｏ．１０のメスで肘関節から約４ｃｍの点を中心点とした約２ｃｍの皮膚切開を行った。その後、筋層を剥離子にて剥離し尺骨を露出させ、尺骨の骨膜をＮｏ．１５のメスにて切開し、骨膜剥離子にて骨膜を剥離し、筋組織および骨膜を開創器にて固定した。肘関節から約４ｃｍの点にエアータービンバーを用いて印を入れ、その点から遠位に１ｃｍの点の骨を生理食塩水注入下にてエアータービンバーを用いて削った。同様に、同点から近位に１ｃｍの点の骨を生理食塩水注入下にてエアータービンバーを用いて削り、２ｃｍの骨を尺骨から切り離した。無鈎鑷子にて切り取った骨を摘出し、骨欠損部を生理食塩水にて十分に洗浄し、同部に以下のものを留置した。
１．ＰＲＰ含浸ゼラチンハイドロゲル
２．フィブリンとＰＲＰの混合物（ＰＲＰ含有フィブリン糊）
留置後、尺骨周囲の筋組織を５−０プロリン糸にて縫合し、皮膚を３−０絹糸にて縫合し、最後に創部をイソジンにて消毒した。
【００３６】
４週間後に、軟Ｘ線観察を行うことにより、骨欠損部における骨新生の程度を評価した。結果を図３に示す。ＰＲＰ含有ゼラチンを用いた実験群においては、骨欠損部における骨新生が認められた。これに対して、ＰＲＰ含浸フィブリン糊実験群では骨再生がほとんど見られなかった。なお、骨欠損部に等量のＰＲＰを投与した場合には、骨再生は全く見られなかった（図には示していない）。これらの結果は、ゼラチンハイドロゲルによるＰＲＰの徐放化により、ＰＲＰの骨再生能の発現が増強されたことを示す。
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のＰＲＰ含浸ゼラチンハイドロゲルを投与したラットにおける血管新生を示す写真図面である。
【図２】図２は、本発明のＰＲＰ含浸ゼラチンハイドロゲルを投与したラットにおける血管新生を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のＰＲＰ含浸ゼラチンハイドロゲルを投与したウサギ尺骨骨欠損部における骨新生を示すＸ線写真図面である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a sustained-release preparation for promoting angiogenesis and osteogenesis.
[0002]
[Prior art]
Platelet rich plasma (also referred to as PRP (Platelet Rich Plasma)) is concentrated platelet plasma obtained by centrifuging peripheral blood at low speed to remove red blood cells. PRP has many growth factors such as platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor β (TGF-β), fibroblast growth factor (FGF), and insulin-like growth factor (IGF) contained in platelets. These synergistic effects have been reported to be effective in angiogenesis, promotion of wound healing, treatment of skin ulcers, promotion of bone tissue regeneration, and the like. In addition, it is expected to promote wound healing and repair of all tissues and organs whose regeneration and repair are promoted by growth factors contained in PRP, such as cartilage, muscle, nerve, and adipose tissue. It is also expected that the state of healing and repair will be closer to normal. In addition to growth factors, PRP contains various cytokines, lymphokines, monokines, physiologically active substances, etc., suggesting its potential as a therapeutic drug through the patient's own immune system. Yes. Furthermore, since PRP containing such active ingredients can be easily collected from the patient's own blood, there is no therapeutic ethical problem, and there is no risk of viral infection or immune incompatibility associated with the use of blood products. It has the advantage that it can be avoided.
[0003]
However, active ingredients having physiological activities such as various growth factors contained in PRP are usually excreted from the administration site by diffusion and deactivated by enzymatic degradation, so the in vivo half-life is short, and PRP was locally administered. In some cases, the bioactive effects of these active ingredients could hardly be obtained. As a solution to this problem, for example, an attempt to enhance the biological effect of PRP by using a mixture of PRP and fibrin glue, alginic acid, β-TCP and the like has been reported. However, these attempts are merely a combination with materials that are currently used in clinical practice, and are not intended to provide sustained release of the active ingredients contained in PRP to achieve a sustained effect.
[0004]
Prior art document information related to the present invention includes the following.
[Patent Document 1]
WO94 / 27630
[Non-Patent Document 1]
the Quintessence, Vol. 20, no. 1, 2001, 95-104
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, the present invention promotes angiogenesis and osteogenesis by forming a sustained-release preparation capable of efficiently transporting the active ingredient contained in PRP to the lesion site, thereby effectively treating wounds, skin ulcers, and bone defects. An object of the present invention is to provide a drug that can be treated.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found that a sustained-release preparation of PRP produced using a hydrogel containing PRP has a remarkable effect on angiogenesis and osteogenesis in a model animal, and completed the present invention. That is, this invention provides the sustained release formulation containing the hydrogel which consists of PRP and gelatin. According to the present invention, a significant promotion effect of angiogenesis and osteogenesis can be obtained by locally administering particles impregnated with PRP in gelatin hydrogel to the lesion and releasing the particles slowly.
[0007]
In another aspect, the present invention comprises a pharmaceutical composition for promoting angiogenesis, a pharmaceutical composition for promoting osteogenesis, comprising a sustained-release preparation comprising platelet-rich plasma and gelatin hydrogel Products, pharmaceutical compositions for treating wounds, and pharmaceutical compositions for treating skin ulcers are provided.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Gelatin used in the present invention is collagen that can be collected from any part of the body such as skin, bone, tendon of various animal species including cattle, pigs, fish, etc., or a substance used as collagen, It can be obtained by modification by various treatments such as alkaline hydrolysis, acid hydrolysis, and enzymatic decomposition. The properties of gelatin vary depending on the material and processing method used, and gelatin having any of these properties can be used as a hydrogel material for sustained release of PRP in the present invention.
[0009]
Examples of the scale representing the properties of gelatin include isoelectric point, molecular weight, and zeta potential. For example, commercially available gelatin includes Sigma type A gelatin and Wako gelatin, and the Zeta potential in an aqueous solution is as follows:
Sigma type A gelatin: about 0 to about 5 mV
Wako Gelatin: about -5 to -2 mV
Zeta potential is a measure representing the degree of electrostatic charge of a substance (gelatin).
[0010]
Particularly preferred gelatin for use in the present invention has the following physical properties:
It is acidic gelatin obtained by alkaline hydrolysis treatment from collagen,
The molecular weight is about 10 to about 200,000 daltons under non-reducing conditions of SDS-PAGE;
Gelatin having a Zeta potential in an aqueous solution of about -15 to about -20 mV. Preferably, acidic gelatin prepared by alkali treatment of type I collagen derived from bovine bone can be used, and can also be obtained as a sample isoelectric point (IEP) 5.0 of Nitta Gelatin. The basic gelatin prepared by acid treatment can also be obtained as Sample IEP 9.0 of Nitta Gelatin Co., but the Zeta potential is greatly different as follows.
Acid gelatin (Nitta Gelatin Sample IEP5.0): about -15 to about -20 mV
Basic gelatin (Nitta Gelatin Company sample IEP 9.0): about +12 to about +15 mV
[0011]
The gelatin hydrogel used in the present invention is a hydrogel obtained by forming chemical crosslinks between various chemical crosslinkers and gelatin molecules using the gelatin. Examples of the chemical crosslinking agent include a condensing agent that forms a chemical bond between water-soluble carbodiimides such as glutaraldehyde such as EDC, such as propylene oxide, diepoxy compounds, hydroxyl groups, carboxyl groups, amino groups, thiol groups, and imidazole groups. Can be used. Preference is given to glutaraldehyde. Gelatin can also be chemically crosslinked by heat treatment or ultraviolet irradiation. These crosslinking treatments can be used in combination. Furthermore, it is also possible to produce a hydrogel by physical crosslinking using salt crosslinking, electrostatic interaction, hydrogen bonding, hydrophobic interaction, and the like.
[0012]
The degree of crosslinking of gelatin can be appropriately selected according to the desired water content, that is, the level of bioabsorbability of the hydrogel. The preferred ranges of the concentration of gelatin and the crosslinking agent in preparing the gelatin hydrogel are a gelatin concentration of 1 to 20 w / w% and a crosslinking agent concentration of 0.01 to 1 w / w%. The crosslinking reaction conditions are not particularly limited, but can be performed, for example, at 0 to 40 ° C. for 1 to 48 hours. In general, as the concentration of gelatin and the crosslinking agent and the crosslinking time increase, the degree of crosslinking of the hydrogel increases and the bioabsorbability decreases.
[0013]
The shape of the gelatin hydrogel is not particularly limited, and examples thereof include a columnar shape, a prismatic shape, a sheet shape, a disk shape, a spherical shape, and a particle shape. Columnar, prismatic, sheet, and disk-shaped materials are often used as embedded pieces, or can be finely pulverized into particles. In addition, spherical, particulate, and paste-like materials can be administered by injection.
[0014]
Cylindrical, prismatic, sheet, and disk-shaped gelatin hydrogels can be cross-linked by adding an aqueous crosslinking agent solution to an aqueous gelatin solution, or adding gelatin to an aqueous crosslinking agent solution and pouring it into a mold of the desired shape. Can be prepared. Further, an aqueous crosslinking agent solution may be added to the formed gelatin gel as it is or after drying. In order to stop the crosslinking reaction, it is brought into contact with a low molecular substance having an amino group such as ethanolamine or glycine, or an aqueous solution having a pH of 2.5 or less is added. The obtained gelatin hydrogel is washed with distilled water, ethanol, 2-propanol, acetone or the like for the purpose of completely removing the cross-linking agent and low-molecular substances used in the reaction, and used for preparation of the preparation.
[0015]
Spherical and particulate gelatin hydrogels are, for example, a stirring motor (for example, manufactured by Shinto Kagaku Co., Ltd., Three One Motor, EYELA miniDC Stirrer, etc.) fixed to a three-necked round bottom flask and a propeller for Teflon (registered trademark). The gelatin solution is put into a device fixed together with the flask, and oil such as olive oil is added thereto and stirred at a speed of about 200 to 600 rpm to obtain a W / O type emulsion, and an aqueous crosslinking agent solution is added thereto. Alternatively, an aqueous gelatin solution pre-emulsified in olive oil (for example, using a vortex mixer Advantec TME-21, a homogenizer, polytron PT10-35, etc.) is dropped into olive oil to make finely divided W / Prepare an O-type emulsion and add aqueous crosslinking agent solution The gelatin hydrogel can be collected by centrifugation, washed with acetone, ethyl acetate or the like, and further immersed in 2-propanol, ethanol or the like to stop the crosslinking reaction. The obtained gelatin hydrogel particles are sequentially washed with distilled water containing 2-propanol, Tween 80, distilled water or the like, and are used for preparation of a preparation. When gelatin hydrogel particles agglomerate, for example, a surfactant or the like may be added or sonication (preferably within about 1 minute under cooling) may be performed.
[0016]
The average particle size of the obtained gelatin hydrogel particles varies depending on the gelatin concentration at the time of preparing the above-mentioned particles, the volume ratio of the gelatin aqueous solution and olive oil, the stirring speed, and the like. In general, the particle size is 1-1000 μm, and particles having a necessary size may be appropriately screened and used according to the purpose. Further, by pre-emulsifying, a gelatinous gelatin hydrogel having a particle size of 20 μm or less can be obtained.
[0017]
Another method for preparing spherical and particulate gelatin hydrogels is as follows. Olive oil is put in the same apparatus as the above method, and stirred at a speed of about 200 to 600 rpm. A gelatin aqueous solution is dropped into this to prepare a W / O type emulsion. After cooling this, acetone, ethyl acetate, etc. are added. In addition, the mixture is stirred and uncrosslinked gelatin particles are recovered by centrifugation. The collected gelatin particles are further washed with acetone, ethyl acetate, etc., then 2-propanol, ethanol, etc., and then dried. The dried gelatin particles are suspended in a cross-linking agent aqueous solution containing 0.1% Tween 80 and allowed to undergo a cross-linking reaction while gently stirring, and depending on the cross-linking agent used, a 100 mM glycine aqueous solution containing 0.1% Tween 80 or 0.1% Gelatin hydrogel particles can be prepared by washing with 0.004N HC1 or the like containing% Tween 80 and stopping the crosslinking reaction. The average particle size of the gelatin hydrogel particles obtained by this method is the same as in the above method.
[0018]
The gelatin hydrogel of the present invention can be appropriately used after being cut into an appropriate size and shape, lyophilized and sterilized. Freeze-drying is performed, for example, by putting gelatin hydrogel in distilled water and freezing it in liquid nitrogen for 30 minutes or more, or at -80 ° C for 1 hour or more, and then drying it in a freeze dryer for 1 to 3 days. Can do.
[0019]
The PRP used in the present invention can be easily obtained by centrifuging peripheral blood at low speed to remove erythrocyte components. A person skilled in the art can appropriately select the number of rotations and time for efficiently removing blood cell components according to the type of centrifuge used. Furthermore, after removing blood cell components, the platelets may be concentrated by centrifuging again. Alternatively, it can be prepared by a blood separation device using a membrane. The PRP-containing sustained-release gelatin hydrogel preparation of the present invention is prepared by, for example, dropping PRP into the freeze-dried acidic gelatin hydrogel described above, or immersing gelatin in PRP so that the hydrogel is impregnated with PRP. Can be obtained. This impregnation operation is usually completed at 4-37 ° C. for 15 minutes-1 hour, preferably at 4-25 ° C. for 15-30 minutes, during which time the hydrogel swells with PRP and is effectively contained in the PRP. When the component interacts with the gelatin molecule, the active component forms a complex with the gelatin molecule, and the PRP is immobilized in the gelatin hydrogel by physical interaction. It is considered that not only the electrostatic interaction between the two but also other interactions such as hydrophobic bond and hydrogen bond contribute greatly to the formation of the complex between PRP and gelatin.
[0020]
The weight ratio of PRP to gelatin (dry weight) is preferably in the range of about 1 to about 10,000 times. More preferably, the PRP is about 2 to about 5000 times the weight ratio of gelatin, and more preferably about 10 to about 1000 times the weight ratio.
[0021]
Since the PRP sustained-release gelatin hydrogel preparation of the present invention has a sustained-release effect and a stabilizing effect of PRP, the functions of active ingredients such as various growth factors contained in PRP can be exerted in a small amount for a long time. Therefore, the angiogenesis promoting function and the osteogenic function of these active ingredients are effectively exhibited at the site of local administration.
[0022]
This mechanism of sustained release is based on the fact that active ingredients such as various growth factors contained in PRP are physically immobilized on gelatin in the hydrogel. The present inventors have attempted sustained release using bioabsorbable polymer hydrogels such as growth factors, cytokines, monokines, lymphokines, and other physiologically active substances so far, and thus physiological properties that cannot be achieved by other materials. We have succeeded in sustained release of active ingredients with activity and control of the sustained release period. In the present invention, the active ingredient contained in PRP is considered to be released from the hydrogel by the same mechanism. In the state immobilized on the gelatin hydrogel, the active ingredient is not released from the hydrogel. As the hydrogel is degraded in the living body, the gelatin molecule becomes water-soluble, and accordingly, the active ingredient immobilized on the gelatin molecule is released. That is, the sustained release of the active ingredient can be controlled by the decomposition of the hydrogel. The degradability of the hydrogel can be changed by adjusting the degree of crosslinking during the preparation of the hydrogel. In addition, when active ingredients such as various growth factors contained in PRP interact with gelatin, their in vivo stability, such as resistance to enzymatic degradation, is improved.
[0023]
The water content is an index for evaluating the degree of crosslinking of the gelatin hydrogel of the present invention. This is the weight percent of water in the hydrobell relative to the weight of the swollen hydrogel. If the water content is large, the degree of crosslinking of the hydrogel is low and it is easily decomposed. That is, the value of the water content determines the sustained release (gradual release) of PRP. The in vivo enzymatic degradability of the hydrogel varies depending on the water content. Although there are some differences depending on the location in the body and the type of animal, the water content of hydrogel that degrades in 5 to 3 months is 99-85 wt%. Since the hydrogel degradation period coincides with the PRP sustained release period, the sustained release period in this case also varies from 5 days to 3 months. The water content showing a preferable sustained-release effect is about 80 to 99 w / w%, and more preferably about 95 to 98 w / w%.
[0024]
The PRP gelatin hydrogel preparation of the present invention can be used parenterally as an injectable preparation by suspending in a pharmaceutically acceptable aqueous injection solution. For example, it can be administered subcutaneously, intramuscularly, intravenously, into a body cavity, into connective tissue, endosteal, or damaged organ.
[0025]
The PRP sustained-release gelatin hydrogel preparation of the present invention or a complex thereof can be appropriately devised in accordance with each application. For example, it can be administered in the form of a sheet, stick, particle, rod, or paste. Examples of the administration method include intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intracavity administration, connective tissue administration, and endosteal administration.
[0026]
The dose of PRP in the sustained-release preparation of the present invention can be appropriately adjusted depending on the severity of the disease, the age of the patient, the body weight, etc., but is usually in the range of about 0.1 to about 500 ml per adult patient, preferably The dose is selected from the range of about 1 to about 50 ml, and can be injected into the affected area or the surrounding area. Moreover, when the effect is insufficient with a single administration, the administration can be performed a plurality of times.
[0027]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be described below in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0028]
Example 1. Preparation of PRP-containing gelatin hydrogel Acid gelatin (isoelectric point 5.0) was obtained from Nitta Gelatin (Osaka). As the fibrin, Tisseel ((registered trademark)) (Baxter, Austria) was used. Other reagents were used without any particular purification. 2.5 g of gelatin and 47.5 g of distilled water were placed in a beaker and stirred at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the mixture was further stirred for 30 minutes while heating to 40 ° C. to prepare a 5 wt% gelatin aqueous solution. 40 ml of this gelatin aqueous solution was placed in a new beaker, and 70 μl of glutaraldehyde aqueous solution was added dropwise with stirring. Immediately, the reaction solution was cast on a polyethylene dish (8 × 8 cm 2 ), covered with aluminum foil, and subjected to a crosslinking reaction at 4 ° C. for 24 hours. The obtained gelatin hydrogel was cut to an appropriate size, placed in a 0.1 M glycine aqueous solution, and stirred at room temperature for 1 hour to block unreacted aldehyde groups. Thereafter, the mixture was stirred twice in distilled water at room temperature for 1 hour and frozen in a freezer at −80 ° C. for 24 hours. After freezing, freeze-drying was performed, and gas sterilization with ethylene oxide gas was performed before use in in vivo experiments. The water content of the obtained hydrogel was 98 wt%. The water content is expressed as a percentage of the amount of water in the hydrogel with respect to the hydrogel weight at the time of swelling.
[0029]
Example 2 Evaluation of effects on angiogenesis Male Wistar rats weighing 250-300 g were used as an experimental model. General anesthesia was performed by intraperitoneal administration of 0.2 ml pentobarbital (Nembutal (registered trademark), Dainippon Pharmaceutical, Osaka). After confirming the effect of anesthesia, 5 ml of 5 wt% glucose solution was injected subcutaneously into the abdomen. Thereafter, no. An incision of about 1 cm was made with 10 scalpels. The femoral motion and vein were exposed, and 4.5 ml of blood was collected from the blood vessel using a 24-gauge indwelling needle and a 5 ml syringe. At this time, 0.5 ml of ACD solution (2.2 wt% sodium citrate, 0.8 wt% citric acid, 2.2 wt% glucose) was previously placed in the syringe as a blood anticoagulant. The collected blood was placed in a 10 ml centrifuge tube and centrifuged at 2400 rpm for 10 minutes using a centrifuge. Since the serum component and the blood cell component were separated after the centrifugation, only the serum component was collected with an 18-gauge injection needle and a 5 ml syringe, placed in a new 10 ml centrifuge tube, and centrifuged again at 3500 rpm for 15 minutes. After completion of the centrifugation, PRP accumulated under the centrifuge tube was collected with an 18 gauge needle and a 1 ml syringe.
[0030]
600 mg of PRP was added dropwise to 7 mg of freeze-dried gelatin hydrogel, allowed to stand at room temperature for 15 minutes, and sufficiently impregnated with PRP to obtain a PRP-impregnated gelatin hydrogel. Fibrin (Tisseel®) was prepared according to the manufacturer's guidelines and PRP was mixed just prior to solidification. This mixing of fibrin glue and PRP is a conventional method, and was performed as a comparative test.
[0031]
After the rat was sterilized by spraying with 70% ethanol, the same part was shaved with a clipper and placed on the operating table to fix the upper and lower limbs. After disinfecting the back with isodine, no. An approximately 2 cm skin incision was made with 10 scalpels. Thereafter, the skin and the muscle layer were peeled off by about 1.5 cm × 1.5 cm with a peeling scissors. The same peeling was performed at a total of four places, and the following were placed.
1. 1. PRP impregnated gelatin hydrogel Mixture of fibrin and PRP (PRP-containing fibrin glue)
After indwelling, the skin was sutured with 3-0 silk, and finally the wound was disinfected with isodine.
[0032]
One week later, the degree of angiogenesis was evaluated by observing the wound. The results are shown in FIG. Angiogenesis is seen around the PRP-impregnated gelatin embedding site. On the other hand, with the conventional PRP fibrin glue, angiogenesis was observed but slight. When the same amount of PRP was administered, no neovascularization was observed (not shown in the figure). In addition, the number of new blood vessels per unit area was measured under a microscope. The results are shown in FIG. These results indicate that PRP was sustained-released by gelatin hydrogel and its biological activity was effectively expressed.
[0033]
Example 3 Evaluation of effect on osteogenesis New Zealand White Rabbit weighing 3-4 kg was used as an experimental model. General anesthesia was carried out by intramuscular injection of 3 ml of ketamine (Ketalar (registered trademark), Sankyo, Tokyo) and 1.5 ml of xylazine (Seractal (registered trademark), Bayer, Tokyo). After confirming the effect of anesthesia, 10 ml of 5 wt% glucose solution was injected subcutaneously into the back. Thereafter, 9 ml of blood was collected from the ear artery using a 22 gauge indwelling needle and a 10 ml syringe. At this time, 1.0 ml of ACD solution (2.2 wt% sodium citrate, 0.8 wt% citric acid, 2.2 wt% glucose) was previously placed in the syringe as a blood anticoagulant. The collected blood was placed in a 10 ml centrifuge tube and centrifuged at 2400 rpm for 10 minutes using a centrifuge. Since the serum component and the blood cell component were separated after the centrifugation, only the serum component was collected with an 18-gauge injection needle and a 5 ml syringe, placed in a new 10 ml centrifuge tube, and centrifuged again at 3500 rpm for 15 minutes. After completion of the centrifugation, PRP accumulated under the centrifuge tube was collected with an 18 gauge needle and a 1 ml syringe.
[0034]
To 20 mg of freeze-dried gelatin hydrogel, 1.5 g of PRP was added dropwise and allowed to stand at room temperature for 15 minutes to fully impregnate PRP, thereby obtaining a PRP-impregnated gelatin hydrogel. Fibrin (Tisseel®) was prepared according to the manufacturer's guidelines and PRP was mixed just prior to solidification.
[0035]
After sterilizing 70% ethanol from the first joint to the second joint of the rabbit's both forearms (forefoot), the same part was shaved with a clipper and placed on an operating table to fix the right upper arm. After disinfection of the surgical site with isodine, A skin incision of about 2 cm with a point of about 4 cm from the elbow joint as a center point was performed with 10 scalpels. Thereafter, the muscular layer was peeled off with a peeler to expose the ulna. An incision was made with 15 scalpels, the periosteum was removed with a periosteum exfoliator, and the muscle tissue and periosteum were fixed with a retractor. A point of about 4 cm from the elbow joint was marked with an air turbine bar, and a bone at a point of 1 cm distal to the point was shaved using an air turbine bar under physiological saline injection. Similarly, a bone at a point of 1 cm proximally from the same point was shaved using an air turbine bar under physiological saline injection, and a 2 cm bone was cut off from the ulna. The bone cut out with an insulator was removed, the bone defect portion was thoroughly washed with physiological saline, and the following were placed in the same portion.
1. 1. PRP impregnated gelatin hydrogel Mixture of fibrin and PRP (PRP-containing fibrin glue)
After placement, the muscle tissue around the ulna was sutured with 5-0 proline thread, the skin was sutured with 3-0 silk thread, and finally the wound was disinfected with isodine.
[0036]
Four weeks later, the degree of osteogenesis at the bone defect was evaluated by performing soft X-ray observation. The results are shown in FIG. In the experimental group using PRP-containing gelatin, osteogenesis was observed at the bone defect site. In contrast, almost no bone regeneration was seen in the PRP-impregnated fibrin glue experimental group. When an equal amount of PRP was administered to the bone defect part, no bone regeneration was observed (not shown in the figure). These results indicate that the sustained release of PRP by gelatin hydrogel enhanced the expression of PRP bone regeneration ability.
[0037]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photographic diagram showing angiogenesis in rats administered with a PRP-impregnated gelatin hydrogel of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing angiogenesis in rats administered with a PRP-impregnated gelatin hydrogel of the present invention.
FIG. 3 is an X-ray photograph showing osteogenesis in a rabbit ulna bone defect site to which the PRP-impregnated gelatin hydrogel of the present invention is administered.
