【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、血液中の白血球等を吸着する際に用いられる細胞吸着材および細胞吸着器の滅菌方法ならびに細胞吸着器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、多発性硬化症、重症筋無力症、ギランバレー症候群等の神経免疫疾患の治療法として血液中の特異的な細胞を吸着除去する技術開発が行われており、上記疾患の治療器として細胞吸着器が開発されている。この細胞吸着器には、特定の細胞に対する細胞親和性リガンドを表面に固定した担体（以下、「細胞吸着材」という）が充填されている。血液をこの細胞吸着器に通液することで、特定の細胞を吸着することができる。細胞親和性リガンドとして、ペプチド、タンパク質および合成物等が研究されている。
【０００３】
これらの細胞親和性リガンドは、その化学構造の違いまたは特徴によって目的細胞の表面分子を認識して結合するものである。しかしながら、これら細胞親和性リガンドの細胞認識は極めて特異的または選択的であるので、該リガンドに僅かな構造変化が生じることによってもリガンド機能は損なわれてしまう。従って、細胞親和性リガンドは化学的に決して安定なものではない。一方、医療用具として細胞吸着器を用いる以上は、細胞吸着器は滅菌される必要がある。しかしながら、細胞吸着器を滅菌する際、熱や放射線の作用によってリガンドは分解または変性される。このように細胞吸着器滅菌の際の細胞親和性リガンドの滅菌安定性については以前から問題があった。
【０００４】
一方、リガンドおよびバルク材料を含めた医療材料の滅菌安定性を改善する試みはこれまで数多くなされている。例えば、有機化合物もしくは無機化合物からなる酸化防止剤、単糖類、オリゴ糖またはグリコールなどのラジカルスカベンジャーあるいは親水性合成ポリマー、多糖類またはアルブミンなどの高次構造安定化剤と上記医療材料とを共存させる方法等が知られている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、高分子材料からなる人工臓器に１０〜５，０００ｐｐｍのアミノ酸緩衝剤を接触させて照射滅菌による材料劣化を抑制する試みが開示されている。該公報では、アミノ酸緩衝剤に含まれるアミノ酸として、グリシン、アラニンまたはヒスチジン等が挙げられている。しかし、この方法は、中空糸膜等の人工臓器の滅菌保護に好適な方法であって、細胞親和性リガンドを保護するといった効果を奏する方法ではない。
【０００６】
また、特許文献２には、塩基性アミノ酸で処理することにより線維素溶解活性酵素を固定した担体の照射滅菌が可能であると開示されている。該公報では、塩基性アミノ酸として、アルギニン、リジンまたはヒスチジンが挙げられている。該公報で開示されている技術を基にして、本発明者らは、上記塩基性アミノ酸とともに細胞親和性リガンドを滅菌することを検討した。その結果、細胞親和性リガンドの酸化劣化が起き、細胞親和性リガンドの滅菌保護効果としては決して満足できるものではなかった。
【０００７】
さらに、特許文献３には、陽性荷電を有する三糖以上の多糖類とともに生物学的作用物質（リガンド）を滅菌する方法が開示されている。該公報では、上記多糖類による抗体またはペプチドからなるリガンドの滅菌保護効果が記載されている。この方法では、滅菌保護材である多糖類の分子量がある程度高いほど優れた滅菌保護効果が得られる。しかしながら、滅菌保護材の分子量が高くなると水溶性が低下して調整が困難となり、滅菌保護効果にばらつきが生じる等の問題がある。
【０００８】
以上のように、医療材料の滅菌保護方法として数多くの技術が知られている。しかしながら、滅菌後においても細胞親和性リガンド機能を維持することができる細胞吸着器の滅菌方法として、満足できる方法はなかった。
【０００９】
【特許文献１】
特開昭５９−１９８６３号公報
【特許文献２】
特開昭６１−１２４３８３号公報
【特許文献３】
国際公開第９７／２７８７８号公報
【特許文献４】
特表２０００−５１４７７８号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、例えば滅菌後においても細胞親和性リガンド機能を維持することができる細胞吸着材および細胞吸着器の滅菌方法、ならびに該滅菌方法によって滅菌された細胞吸着材を備える細胞吸着器および該滅菌方法によって滅菌された細胞吸着器を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、細胞親和性リガンドに対してアミノ酸の中でも特に芳香族環を有する非極性側鎖アミノ酸が優れた滅菌保護効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、少なくとも細胞親和性リガンドを表面に固定した細胞吸着材の滅菌方法において、該リガンドの近傍に、少なくとも芳香族環を有する非極性側鎖アミノ酸を存在させて滅菌することを特徴とする細胞吸着材の滅菌方法である。前記アミノ酸としては、フェニルアラニンおよび／またはトリプトファンが挙げられる。
【００１３】
さらに、本発明は、滅菌前に、濃度０．０１ｗｔ／ｖ％以上２ｗｔ／ｖ％未満の前記アミノ酸を含む水溶液を前記細胞吸着材に含浸する工程を含むことを特徴とする前記細胞吸着材の滅菌方法である。
【００１４】
さらに、本発明は、前記細胞吸着材が、前記アミノ酸をさらに表面に固定したものであることを特徴とする前記細胞吸着材の滅菌方法である。
さらに、本発明は、細胞親和性リガンドが抗体および／またはペプチドであることを特徴とする前記細胞吸着材の滅菌方法である。
【００１５】
さらに、本発明は、電磁波照射滅菌により滅菌することを特徴とする前記細胞吸着材の滅菌方法である。
さらに、本発明は、上記リガンドを介して吸着する細胞が白血球または造血幹細胞であることを特徴とする前記細胞吸着材の滅菌方法である。
【００１６】
さらに、本発明は、内部に通液可能な容器と、該容器内に配設され、少なくとも細胞親和性リガンドを表面に固定した細胞吸着材とを有する細胞吸着器の滅菌方法において、該リガンドの近傍に、少なくとも芳香族環を有する非極性側鎖アミノ酸を存在させて滅菌することを特徴とする細胞吸着器の滅菌方法である。前記アミノ酸としては、フェニルアラニンおよび／またはトリプトファンが挙げられる。
【００１７】
さらに、本発明は、滅菌前に、濃度０．０１ｗｔ／ｖ％以上２ｗｔ／ｖ％未満の前記アミノ酸を含む水溶液を前記容器内に通液する工程を含むことを特徴とする前記細胞吸着器の滅菌方法である。
【００１８】
さらに、本発明は、前記細胞吸着材が、前記アミノ酸をさらに表面に固定したものであることを特徴とする前記細胞吸着器の滅菌方法である。
さらに、本発明は、細胞親和性リガンドが抗体および／またはペプチドであることを特徴とする前記細胞吸着器の滅菌方法である。
【００１９】
さらに、本発明は、電磁波照射滅菌により滅菌することを特徴とする前記細胞吸着器の滅菌方法である。
さらに、本発明は、上記リガンドを介して吸着する細胞が白血球または造血幹細胞であることを特徴とする前記細胞吸着器の滅菌方法である。
【００２０】
さらに、本発明は、内部に通液可能な容器と、前記細胞吸着材の滅菌方法によって滅菌された細胞吸着材とを備える細胞吸着器である。
さらに、本発明は、前記細胞吸着器の滅菌方法によって滅菌されたことを特徴とする細胞吸着器である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る滅菌方法の対象は、内部に通液可能な容器と、該容器内に配設され、少なくとも細胞親和性リガンドを表面に固定した細胞吸着材とを有する細胞吸着器である。さらに、上記細胞吸着材自体も本発明に係る滅菌方法の対象である。
【００２２】
ここで「容器」とは、内部に通液可能な筐体構造を有するものを意味し、例えば液体の入口と出口とを有する容器が挙げられる。
【００２３】
「細胞親和性リガンドを表面に固定した細胞吸着材」とは、担体と細胞親和性リガンドから成り、目的細胞を特異的または選択的に吸着することができる吸着材である。ここで「表面」とは、担体とその周囲の液相との界面を意味し、特に、担体と液相中の細胞が接触可能な領域を意味する。例えば、担体が繊維の場合は、該表面は繊維の外周面を意味する。また担体が多孔質体の場合は、該表面は多孔部を含む全表面のことを意味する。
【００２４】
上記担体は、少なくとも所定量の細胞親和性リガンドを安定して固定できる担体である。該担体の素材としては、特に限定されないが、様々な形状に加工でき、細胞親和性リガンドを直接または間接的に化学結合でき、かつ医療材料として安全に用いることができるものが好ましい。担体としては、例えば、ガラス、カオリナイトまたはベントナイトなどの無機材料、セルロース、デキストラン、キチン、キトサン、デンプン、アガロース、タンパク質（コラーゲンなど）または天然ゴムなどの天然ポリマー、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリメタクリル酸エステル、ポリ塩化ビニルまたはポリアミノ酸などの合成ポリマーあるいは活性炭等が挙げられる。
【００２５】
上記担体の形状としては、特に限定されないが、液相中の目的細胞との接触頻度を高めるために表面積が大きいものであることが好ましい。担体の形状としては、例えば、繊維状、綿状、布状、糸状、束状、織布状または不織布状などの繊維構造体、スポンジなどの高分子多孔質体、ビーズ状、ゲル状あるいは中空糸等が挙げられる。特に、血液中の細胞を分離または吸着する場合、担体の形状としては、吸着効率の点から織布状または不織布状が好ましく、さらには、担体の構造制御が容易であるという点から不織布状が最も好ましい。
【００２６】
不織布状担体において、強度、加工性または安全性の点から、不織布状担体を構成する繊維は、セルロース、ポリエステルまたはポリプロピレンであることが好ましい。また、該担体構成繊維の平均繊維直径を適宜選択することで、不織布担体の構造を制御することができる。該担体構成繊維の平均繊維直径は２．５μｍ以上５０μｍ未満であることが好ましい。なぜなら、平均繊維直径が２．５μｍ未満であると、不織布状とした際に目が細かくなる傾向があり、目的細胞以外の細胞を物理的に捕捉する非特異的細胞吸着が起こるため好ましくない。一方、５０μｍ以上の場合、不織布状とした際に目が粗くなる傾向があり、目的細胞との接触頻度が著しく低下し、従って除去効率が下がるので好ましくない。
【００２７】
一方、「細胞親和性リガンド」とは、目的細胞と親和性を有する、すなわち、目的細胞と特異的または選択的に結合する物質である。細胞親和性リガンドは、一般に、目的細胞の表面抗原を認識して目的細胞と結合する。例えば細胞親和性リガンドとしては、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはこれらの抗体断片、あるいはアミノ酸残基数が約３〜５０である抗体の抗原認識部位を含むペプチドが挙げられる。細胞親和性が優れている点で、細胞親和性リガンドとして上記抗体またはこれらの抗体断片は好ましい。一方、体外循環の際に体内に混入することが万一生じても免疫原性が低い点で、細胞親和性リガンドとして上記ペプチドは好ましい。
【００２８】
細胞親和性リガンドとして用いる抗体としては、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ５、ＣＤ３Ｒ、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ７２、ＣＤ７７、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤｗ６５、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ８９、ＣＤｗ９０、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ９４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ４６、ＣＤ３１、ＣＤｗ３６、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ１０３、ＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ２５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２２、ＣＤｗ１２４、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＩＬ−２Ｒ、ＣＤ６９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５２、ＣＤ１７８、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１９５、ＣＤｗ１９７またはＣＤ２２６に対する抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
担体への細胞親和性リガンドの固定においては、担体表面に細胞親和性リガンドを直接結合していてもよいし、または活性基を介して結合していてもよい。基本的に担体から細胞親和性リガンドまたは活性基が剥離しない結合状態であれば、いずれの結合状態であってもよい。結合状態としては、共有結合、イオン結合または疎水結合が挙げられる。細胞親和性リガンドの流出を抑制する点から、共有結合、疎水結合がより好ましく、最も好ましくは共有結合である。結合反応は、細胞親和性リガンドの活性を維持できる反応であれば公知のいずれの反応も用いることができ、例えば、置換反応、縮合反応または開環反応等が挙げられる。
【００３０】
担体表面に活性基を介して細胞親和性リガンドを結合する場合、細胞親和性リガンドと担体とを共有結合できる構造であれば、該活性基は公知のいずれの官能基であってもよい。活性基としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシメチルハロアセトアミドもしくはＮ−ヒドロキシメチルジハロアセトアミド等を用いて担体表面を活性化することによって得られるα−アセトアミノハロゲン基、Ｎ−ヒドロキシメチルジハロプロピオンアミド等を用いて担体表面を活性化することによって得られるα，β−プロピオンアミノハロゲン基、Ｎ−ヒドロキシメチルジハロアセトアミド等を用いて担体表面を活性化することによって得られるα，α−アセトアミノジハロゲン基、またはＮ−ヒドロキシメチルトリハロアセトアミド等を用いて担体表面を活性化することによって得られるα，α，α−アセトアミノトリハロゲン基等のハロアセトアミノアルカン化剤を用いて担体表面を活性化することによって得られる活性基、あるいはエピクロロヒドリン等を用いて担体表面を活性化することによって得られるエポキシ基等が挙げられる。また活性基としては、例えば、イソシアネート基、イソチオシアネート基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、ビニル基、またはブロモシアンによる活性基等も挙げられるがこれらに限定されない。細胞親和性リガンドの機能を維持したまま穏和な条件で反応できる点から、ハロアセトアミノアルカン化剤を用いて担体表面を活性化することによって得られる活性基が好ましい。
【００３１】
さらに、一度に分離または除去したい細胞の種類が複数である場合には、その細胞の種類に応じて、複数種の細胞親和性リガンドを担体に固定することができる。
【００３２】
以上のように構成された細胞吸着材及び細胞吸着器に対して、本発明に係る滅菌方法を適用することができる。細胞吸着材を備える細胞吸着器を組み立てた後、以下に説明する滅菌方法を適用してもよいし、該滅菌方法により細胞吸着材を滅菌した後に、細胞吸着器を組み立ててもよい。
【００３３】
本発明に係る滅菌方法に従えば、細胞吸着器または細胞吸着材を滅菌する際に、芳香族環を有する非極性側鎖アミノ酸によって該細胞吸着材に固定された細胞親和性リガンドが保護され、滅菌による該リガンドの分解または変性が抑制される。すなわち、芳香族環を有する非極性側鎖アミノ酸が滅菌保護材として機能する。
【００３４】
ここで「芳香族環を有する非極性側鎖アミノ酸」とは、芳香族環を有する疎水性アミノ酸を意味する。上記アミノ酸としては、具体的には必須アミノ酸であるフェニルアラニンまたはトリプトファンが挙げられ、芳香族環と芳香族複素環を併せ持つトリプトファンが最も好ましい。本発明に係る滅菌方法においては、上記アミノ酸は単独で、または任意に混合して用いてもよい。また上記アミノ酸には光学異性体が存在するが、本発明に係る滅菌方法に用いる場合には、Ｌ体またはＤ体のいずれであってもよく、あるいはその混合物であってもよい。さらに、「芳香族環を有する非極性側鎖」という特徴を維持する限り、上記アミノ酸において側鎖の一部に別の置換基が導入されていたり、あるいはアミノ基またはカルボキシル基が修飾されていてもよい。さらには、上記アミノ酸をオリゴマーとして用いることもできる。
【００３５】
「細胞親和性リガンドの近傍に少なくとも芳香族環を有する非極性側鎖アミノ酸が存在する」とは、上記アミノ酸が細胞親和性リガンドに吸着した状態および／または上記アミノ酸を含む水溶液が該リガンドに接液した状態を意味する。「吸着した状態」とは、例えば、上記アミノ酸を含む水溶液を細胞吸着器に通液し、一定期間放置することで、上記アミノ酸が細胞親和性リガンドの疎水部付近を中心に吸着し、液相中のアミノ酸濃度が極端に減少した状態を意味する。なお上記アミノ酸を含む水溶液の通液工程の後は、該水溶液をそのまま封入してもよく、あるいは細胞吸着器の入口もしくは出口から液が垂れない程度までエアー等でフラッシュした湿潤状態またはハーフウェット状態としても良い。「接液した状態」とは、例えば、充填液として上記アミノ酸を含む水溶液を細胞吸着器内の空間に満たした浸漬状態を意味する。細胞親和性リガンドの機能維持効果の点から、上記アミノ酸を細胞親和性リガンドに吸着させ、かつ上記アミノ酸を含む水溶液が細胞親和性リガンドに接液している状態が好ましい。
【００３６】
本発明に係る滅菌方法によって細胞吸着材自体を滅菌する場合、例えば、細胞吸着材を上記アミノ酸を含む水溶液に浸漬し、一定期間放置することで、上記アミノ酸を細胞親和性リガンドに吸着させ、その後に細胞吸着材を滅菌する。滅菌する際には、上記アミノ酸を含む水溶液に細胞吸着材を浸漬したままでもよく、または細胞吸着材が上記アミノ酸を含む水溶液を含浸した状態であってもよい。
【００３７】
ここで「アミノ酸を含む水溶液」とは、細胞およびリガンド機能に影響を及ぼさない溶媒に上記アミノ酸を溶解した水溶液を意味する。また、細胞吸着器を使用する前に実施される生理食塩水等を用いたプライミング工程で、生理食塩水で置換され易い水溶液であることが望ましい。溶媒としては、例えば、蒸留水、生理食塩水やリン酸緩衝液等の水溶液が挙げられるが、細胞への影響が少ないという観点から、好ましくは生理食塩水またはリン酸緩衝液であり、最も好ましくはリン酸緩衝液である。該緩衝液のｐＨは中性付近であればよい。
【００３８】
前記水溶液中のアミノ酸濃度は、０．０１ｗｔ／ｖ％以上２ｗｔ／ｖ％未満であることが好ましい。フェニルアラニンの場合は、温度に依らず前記濃度範囲でよい。しかしながら、トリプトファンの場合は、溶解度の点から、溶解時の温度が２５℃以下の場合、濃度は０．０１ｗｔ／ｖ％以上１．１４ｗｔ／ｖ％未満、７５℃以下の場合、濃度は０．０１ｗｔ／ｖ％以上２ｗｔ／ｖ％未満であることが望ましい。上記濃度範囲未満の場合は、滅菌保護効果が低下するか、あるいは、所望の滅菌保護効果を得るのに非常に大量の通液を必要とする。反対に、前記濃度範囲以上にすると上記アミノ酸の溶解性が悪くなって分散状態となり、滅菌保護効果にバラツキが生じ得る。さらに溶解のために１００℃程度の加熱が必要となり、化学的に不安定な細胞親和性リガンドを処理するうえで好ましくない。以上の理由から、前記水溶液中のアミノ酸濃度は、０．１０ｗｔ／ｖ％以上１ｗｔ／ｖ％未満であることがより好ましい。
【００３９】
あるいはまた、細胞親和性リガンドとともに上記アミノ酸を担体表面に直接結合していもよいし、または活性基を介して結合していてもよい。上記アミノ酸の担体表面への直接の結合方法または活性基を介した結合方法は、上記で説明した担体表面への細胞親和性リガンドの結合と同様であってよい。
【００４０】
本発明に係る滅菌方法で用いる滅菌とは、電磁波照射滅菌、電子線照射滅菌、または高圧蒸気滅菌を意味する。電磁波照射滅菌とは、例えばコバルト６０等を線源とした１０〜１００ｋＧｙのγ線照射処理またはＸ線照射処理を意味する。また、電子線照射滅菌とは、例えば加速電圧２００ｋｅＶ〜１ＭｅＶで、照射線量が１０ｋＧｙ〜１００ｋＧｙである電子線照射処理を意味する。さらに、高圧蒸気滅菌においては、例えば１１０℃〜１３０℃にて１．２〜１．５気圧程度で２０分以上の処理を行う。医療用具の滅菌としてはいずれでもよいが、設備導入後のランニングコストまたは連続処理性の製造上の理由、ならびに細胞親和性リガンドの安定性の理由から、電磁波照射滅菌または電子線照射滅菌が好ましく、γ線による電磁波照射滅菌が最も好ましい。
【００４１】
一方、本発明に係る滅菌方法によって細胞吸着器を滅菌した後、細胞吸着器の入口から被処理液を前記吸着器内に通液し、細胞吸着材に被処理液を接触させた後、出口から処理液を回収することによって、目的細胞が吸着除去された処理液、すなわち、浄化された処理液が得られる。あるいは、被処理液を上記吸着器内に通液し、細胞吸着材に被処理液を接触させた後、細胞吸着材に吸着された目的細胞を分離した後、回収することもできる。
【００４２】
ここで「被処理液」とは、吸着除去または回収の対象である目的細胞を含んだ血液または骨髄液を意味する。血液には、全血（末梢血）、臍帯血、あるいはリンパ球浮遊液、単核球浮遊液もしくはバフィーコート等の細胞分離処理を施した細胞浮遊液が含まれる。目的細胞としては、リンパ球、顆粒球または単球等の白血球または造血幹細胞が挙げられるが限定されるものではない。特に、免疫疾患治療用の細胞吸着器においては、目的細胞は、ヘルパーＴ細胞もしくはサプレッサーＴ細胞等のＴ細胞またはＢ細胞などのリンパ球あるいは造血幹細胞である。
【００４３】
また、必要に応じて抗凝固剤または血液保存液等を加えた血液も、被処理液として本発明に係る細胞吸着器に適用することができる。
【００４４】
以上のように本発明に係る滅菌方法によって処理された細胞吸着器は、滅菌によって細胞親和性リガンドの機能が損なわれていない。従って、例えば、体外循環治療に、あるいは白血病治療のための骨髄液、末梢血（Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）等の造血因子を投与した被験者由来）または臍帯血からの造血幹細胞の回収率の低下を防止できる。
【００４５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
実施例１ ． 細胞吸着器の作製
活性化不織布状担体の作製
ガラス製のフラスコにＮ−ヒドロキシメチルヨードアセトアミド０．６ｇ、濃硫酸５．７ｍｌ及びニトロベンゼン７．２ｍｌを加えて常温にて撹拌溶解した。次に２５℃で該溶液にパラホルムアルデヒド０．０３６ｇを加えてさらに撹拌した。その後、得られた溶液にポリプロピレンからなる不織布状担体（平均繊維直径３．５μｍ）０．３ｇを入れ常温にて２４時間遮光反応した。２４時間の反応後、不織布状担体を取り出し、エタノール及び純水にて洗浄し、真空乾燥することで活性化不織布状担体を得た。
【００４６】
細胞吸着器の作製
上記活性化不織布状担体を直径０．６８ｃｍの円形に切断した（以下「円形不織布状担体」という）。次に、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩液（以下「ＰＢＳ（−）」という）に溶解した抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体溶液４００μｌ（１６μｇ／４００μｌ）に、得られた円形不織布状担体４枚を常温で２．５時間浸し、該モノクローナル抗体を円形不織布状担体に固定した。その後、該円形不織布をＰＢＳ（−）２ｍｌで洗浄した。次に、０．２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート／ＰＢＳ（−）溶液（以下「Ｔｗｅｅｎ２０溶液」という）に該円形不織布状担体を常温で２．５時間浸し、ブロッキングを行った。その後、該円形不織布状担体をＰＢＳ（−）２ｍｌで洗浄することで、該円形不織布状担体を以下で用いるフィルターとした。
【００４７】
次に入口と出口を有する容量１ｍｌの容器に、上記フィルター４枚と充填液として１．０ｗｔ／ｖ％トリプトファンＰＢＳ（−）溶液（分子量２０４）とを充填し、細胞吸着器を作成した。
【００４８】
実施例２ ． 滅菌後の細胞吸着器の細胞吸着性
上記細胞吸着器に対してγ線２５ｋＧｙを照射し滅菌した。次に滅菌後の細胞吸着器の入口から、ＡＣＤ−Ａ添加ヒト新鮮血液５ｍｌ（血液：ＡＣＤ−Ａ＝８：１）をシリンジポンプにて流速１ｍｌ／分で送液した。その後、細胞吸着器の出口から細胞吸着後の溶液を回収した。
【００４９】
次に、フローサイトメーター（ＣＯＵＬＴＥＲ ＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ ＥＳＰ）を用いたフローサイトメトリー法によって、細胞吸着前のＡＣＤ−Ａ添加ヒト新鮮血液および細胞吸着後の溶液中のＣＤ４（＋）細胞数を測定し、細胞吸着器への細胞の吸着率を計算した。その結果、ＣＤ４（＋）細胞の吸着率は９０％であった。また、ＣＤ８（＋）細胞の吸着率は９％、Ｂリンパ球の吸着率は２７％、血小板の吸着率は８％であった。
【００５０】
一方、フェニルアラニンは、トリプトファンと同様に芳香族環を有する非極性側鎖アミノ酸である。そこで、充填液として１．０ｗｔ／ｖ％フェニルアラニンＰＢＳ（−）溶液（分子量１６５）溶液を用いて、上記と同様の実験を行った。その結果、ＣＤ４（＋）細胞の吸着率は７５％であった。またＣＤ８（＋）細胞の吸着率は１１％、Ｂリンパ球の吸着率は２７％、血小板の吸着率は８％であった。
【００５１】
さらに、充填液としてＰＢＳ（−）溶液または１．０ｗｔ／ｖ％アルギニンＰＢＳ（−）溶液（分子量１７４）溶液を用いて、上記と同様の実験を行った。その結果、ＰＢＳ（−）溶液の場合、ＣＤ４（＋）細胞の吸着率は１７％であった。またＣＤ８（＋）細胞の吸着率は３０％、Ｂリンパ球の吸着率は４３％、血小板の吸着率は８％であった。
【００５２】
１．０ｗｔ／ｖ％アルギニンＰＢＳ（−）溶液（分子量１７４）溶液の場合、ＣＤ４（＋）細胞の吸着率は２９．４％であった。またＣＤ８（＋）細胞の吸着率は１７．２％、Ｂリンパ球の吸着率は２２．３％、血小板の吸着率は８％であった。
【００５３】
以上から、滅菌保護材として芳香族環を有する非極性側鎖アミノ酸、トリプトファンまたはフェニルアラニンを用いることで、滅菌した後においても抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体を損なうことなく、ＣＤ４（＋）細胞を特異的に吸着することができた。
【００５４】
実施例３ ． 滅菌保護材として有効なトリプトファン濃度の検討
滅菌保護材として有効なトリプトファンの濃度を検討した。充填液として０．００８ｗｔ／ｖ％、０．０１２５ ｗｔ／ｖ％または０．１ｗｔ／ｖ％のトリプトファンＰＢＳ（−）溶液（分子量２０４）を用いて、上記と同様の実験を行った。
【００５５】
０．００８ｗｔ／ｖ％トリプトファンＰＢＳ（−）溶液の場合、ＣＤ４（＋）細胞の吸着率は３２％であった。また、ＣＤ８（＋）細胞の吸着率は２０％、Ｂリンパ球の吸着率は４０％、血小板の吸着率は２％であった。
【００５６】
０．０１２５ｗｔ／ｖ％トリプトファンＰＢＳ（−）溶液の場合、ＣＤ４（＋）細胞の吸着率は７４％であった。また、ＣＤ８（＋）細胞の吸着率は２０％、Ｂリンパ球の吸着率は４８％、血小板の吸着率は０％であった。
【００５７】
０．１ｗｔ／ｖ％トリプトファンＰＢＳ（−）溶液の場合、ＣＤ４（＋）細胞の吸着率は８８％であった。また、ＣＤ８（＋）細胞の吸着率は２８％、Ｂリンパ球の吸着率は４２％、血小板の吸着率は０％であった。
【００５８】
以上から、トリプトファン濃度が０．０１ｗｔ／ｖ％以上である場合に、ＣＤ４（＋）細胞の吸着率が優れていた。従って、滅菌保護材として有効なトリプトファン濃度は、０．０１ｗｔ／ｖ％以上であることが判明した。
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、滅菌後においてもリガンド機能を維持することができる細胞吸着材および細胞吸着器の滅菌方法、ならびに該滅菌方法によって得られる細胞吸着器が提供される。従って、本発明により、細胞吸着材および細胞吸着器を用いた細胞の特異的吸着または回収において、優れた吸着率および回収率を達成することができる。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a cell adsorbent used for adsorbing leukocytes and the like in blood, a method for sterilizing a cell adsorber, and a cell adsorber.
[0002]
[Prior art]
In recent years, technology development for adsorbing and removing specific cells in blood has been carried out as a treatment method for neuroimmune diseases such as multiple sclerosis, myasthenia gravis, Guillain-Barre syndrome, and the like. Adsorbers are being developed. The cell adsorber is filled with a carrier having a cell affinity ligand for a specific cell immobilized on its surface (hereinafter, referred to as “cell adsorbent”). By passing blood through the cell adsorber, specific cells can be adsorbed. Peptides, proteins, synthetic products, and the like have been studied as cell-affinity ligands.
[0003]
These cell-affinity ligands recognize and bind to the surface molecule of the target cell based on the difference or characteristic of the chemical structure. However, since cell recognition of these cell-affinity ligands is extremely specific or selective, even a slight structural change in the ligand impairs the function of the ligand. Therefore, cytophilic ligands are never chemically stable. On the other hand, as long as a cell adsorber is used as a medical device, the cell adsorber needs to be sterilized. However, when sterilizing the cell adsorber, the ligand is decomposed or denatured by the action of heat or radiation. As described above, there has been a problem in the sterilization stability of the cell affinity ligand during the sterilization of the cell adsorber.
[0004]
On the other hand, there have been many attempts to improve the sterilization stability of medical materials, including ligands and bulk materials. For example, an antioxidant composed of an organic compound or an inorganic compound, a radical scavenger such as a monosaccharide, an oligosaccharide or a glycol, or a higher-order structural stabilizer such as a hydrophilic synthetic polymer, a polysaccharide or an albumin, and the medical material coexist. Methods and the like are known.
[0005]
For example, Patent Literature 1 discloses an attempt to suppress material deterioration due to irradiation sterilization by bringing an artificial organ made of a polymer material into contact with an amino acid buffer of 10 to 5,000 ppm. In this publication, glycine, alanine, histidine and the like are mentioned as amino acids contained in the amino acid buffer. However, this method is a method suitable for sterilization protection of an artificial organ such as a hollow fiber membrane, and is not a method having an effect of protecting a cell affinity ligand.
[0006]
Patent Document 2 discloses that irradiation with a carrier on which a fibrinolytic active enzyme is immobilized can be performed by treatment with a basic amino acid. In this publication, arginine, lysine or histidine is mentioned as a basic amino acid. Based on the technology disclosed in the publication, the present inventors have studied sterilization of the cell affinity ligand together with the above basic amino acids. As a result, the oxidative deterioration of the cell affinity ligand occurs, and the effect of protecting the cell affinity ligand against sterilization has never been satisfactory.
[0007]
Further, Patent Document 3 discloses a method for sterilizing a biologically active substance (ligand) together with a positively charged trisaccharide or higher polysaccharide. This publication describes the effect of the above polysaccharide on the sterilization protection of a ligand comprising an antibody or a peptide. In this method, the higher the molecular weight of the polysaccharide, which is a sterilizing protective material, is higher, the better the sterilizing protective effect is obtained. However, when the molecular weight of the sterilization protective material is high, the water solubility is reduced and adjustment is difficult, and there is a problem that the sterilization protection effect varies.
[0008]
As described above, a number of techniques are known as sterilization protection methods for medical materials. However, there has been no satisfactory method for sterilizing a cell adsorber capable of maintaining the cell affinity ligand function even after sterilization.
[0009]
[Patent Document 1]
JP-A-59-198163
[Patent Document 2]
JP-A-61-124383
[Patent Document 3]
WO 97/27878 A
[Patent Document 4]
JP 2000-514778 A
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention relates to a cell adsorbent capable of maintaining a cell affinity ligand function even after sterilization, a method for sterilizing a cell adsorber, a cell adsorber including a cell adsorbent sterilized by the sterilization method, and the sterilization. It is an object to provide a cell adsorber sterilized by the method.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, it has been found that, among the amino acids, a nonpolar side chain amino acid having an aromatic ring among the amino acids exhibits an excellent sterilization protective effect for the cell affinity ligand, and the present invention It was completed.
[0012]
That is, the present invention provides a method for sterilizing a cell-adsorbing material having at least a cell-affinity ligand immobilized on a surface thereof, wherein at least a nonpolar side-chain amino acid having an aromatic ring is present near the ligand for sterilization. This is a method for sterilizing a cell adsorbent. The amino acids include phenylalanine and / or tryptophan.
[0013]
Further, the present invention includes a step of impregnating the cell adsorbent with an aqueous solution containing the amino acid having a concentration of 0.01 wt / v% or more and less than 2 wt / v% before sterilization. It is a sterilization method.
[0014]
Further, the present invention is the method for sterilizing the cell adsorbent, wherein the cell adsorbent further comprises the amino acid immobilized on the surface.
Further, the present invention is the method for sterilizing the cell adsorbent, wherein the cell affinity ligand is an antibody and / or a peptide.
[0015]
Further, the present invention is the method for sterilizing the cell adsorbent, which is sterilized by electromagnetic wave irradiation sterilization.
Further, the present invention is the method for sterilizing a cell adsorbent, wherein the cells adsorbed via the ligand are leukocytes or hematopoietic stem cells.
[0016]
Further, the present invention provides a method for sterilizing a cell adsorber having a container through which liquid can be passed, and a cell adsorbent provided in the container and having at least a cell affinity ligand immobilized on the surface thereof. A method for sterilizing a cell adsorber, which comprises sterilizing in the vicinity of a nonpolar side chain amino acid having at least an aromatic ring. The amino acids include phenylalanine and / or tryptophan.
[0017]
Further, the present invention comprises a step of passing an aqueous solution containing the amino acid having a concentration of 0.01 wt / v% or more and less than 2 wt / v% into the container before sterilization. It is a sterilization method.
[0018]
Further, the present invention is the method for sterilizing the cell adsorber, wherein the cell adsorbent further comprises the amino acid fixed on the surface.
Further, the present invention is the method for sterilizing the cell adsorber, wherein the cell affinity ligand is an antibody and / or a peptide.
[0019]
Further, the present invention is the method for sterilizing the cell adsorber, wherein the method is performed by sterilization by electromagnetic wave irradiation.
Further, the present invention is the method for sterilizing a cell adsorber, wherein the cells adsorbed via the ligand are leukocytes or hematopoietic stem cells.
[0020]
Furthermore, the present invention is a cell adsorber including a container through which liquid can be passed, and a cell adsorbent sterilized by the cell adsorbent sterilization method.
Further, the present invention is a cell adsorber, which is sterilized by the method for sterilizing a cell adsorber.
[0021]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
An object of the sterilization method according to the present invention is a cell adsorber having a container through which liquid can pass, and a cell adsorbent provided in the container and having at least a cell affinity ligand immobilized on the surface. Furthermore, the cell adsorbent itself is also a subject of the sterilization method according to the present invention.
[0022]
Here, the “container” means a container having a housing structure through which liquid can pass, and examples thereof include a container having an inlet and an outlet for liquid.
[0023]
The “cell adsorbent having a cell-affinity ligand immobilized on its surface” is an adsorbent composed of a carrier and a cell-affinity ligand and capable of adsorbing target cells specifically or selectively. Here, the “surface” means an interface between the carrier and the surrounding liquid phase, and particularly means a region where the carrier and the cells in the liquid phase can contact. For example, when the carrier is a fiber, the surface means the outer peripheral surface of the fiber. When the carrier is a porous body, the surface means the entire surface including the porous portion.
[0024]
The carrier is a carrier that can stably immobilize at least a predetermined amount of a cell affinity ligand. The material of the carrier is not particularly limited, but is preferably a material that can be processed into various shapes, can directly or indirectly chemically bind a cell affinity ligand, and can be safely used as a medical material. As the carrier, for example, glass, inorganic materials such as kaolinite or bentonite, cellulose, dextran, chitin, chitosan, starch, agarose, natural polymers such as protein (such as collagen) or natural rubber, polystyrene, polyamide, polyester, polyethylene, Examples thereof include synthetic polymers such as polyurethane, polyvinyl alcohol, ethylene vinyl alcohol copolymer, polymethacrylate, polyvinyl chloride and polyamino acid, and activated carbon.
[0025]
The shape of the carrier is not particularly limited, but preferably has a large surface area in order to increase the frequency of contact with target cells in the liquid phase. Examples of the shape of the carrier include a fibrous structure such as a fibrous, cottony, cloth-like, thread-like, bundle-like, woven or non-woven fabric, a polymer porous body such as a sponge, a bead-like, gel-like, or hollow. Yarn and the like. In particular, when cells in blood are separated or adsorbed, the shape of the carrier is preferably a woven or nonwoven fabric in terms of adsorption efficiency, and further, a nonwoven fabric is preferred in that the structure of the carrier is easily controlled. Most preferred.
[0026]
In the nonwoven carrier, the fibers constituting the nonwoven carrier are preferably cellulose, polyester or polypropylene from the viewpoints of strength, processability and safety. The structure of the nonwoven fabric carrier can be controlled by appropriately selecting the average fiber diameter of the carrier constituent fibers. The average fiber diameter of the carrier constituent fibers is preferably 2.5 μm or more and less than 50 μm. This is because if the average fiber diameter is less than 2.5 μm, the nonwoven fabric tends to have fine eyes and nonspecific cell adsorption that physically captures cells other than the target cells occurs, which is not preferable. On the other hand, when the thickness is 50 μm or more, the nonwoven fabric tends to have coarse eyes, and the frequency of contact with target cells is significantly reduced, and thus the removal efficiency is undesirably reduced.
[0027]
On the other hand, the “cell affinity ligand” is a substance having an affinity for a target cell, that is, a substance that specifically or selectively binds to a target cell. The cell affinity ligand generally recognizes a surface antigen of a target cell and binds to the target cell. For example, the cell affinity ligand includes a monoclonal antibody or a polyclonal antibody or a fragment thereof, or a peptide containing an antigen recognition site of an antibody having about 3 to 50 amino acid residues. The above-mentioned antibodies or antibody fragments thereof are preferred as cell-affinity ligands in that they have excellent cell affinity. On the other hand, the peptide is preferred as a cell-affinity ligand because it has low immunogenicity even if it is mixed into the body during extracorporeal circulation.
[0028]
Examples of the antibody used as the cell affinity ligand include CD4, CD8, CD3, CD2, CD1a, CD1b, CD5, CD3R, CD6, CD7, CD9, CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD28, CD37, CD40, CD72, CD77, CD16, CD32, CD33, CD34, CD35, CD45RO, CD64, CD65, CDw65, CD66b, CD66e, CD89, CDw90, CD56, CD57, CD94, CD105, CD106, CD46, CD31, CDw36, CD41, CD42a, CD42b, CD63, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD29, CD44, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD 9e, CD49f, CD50, CD51, CD54, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD103, CD26, CD30, CD70, CD71, CD95, CD96, CD25, CD117, CD122, CDw124, CD126, CD127, IL-2R, Examples include, but are not limited to, antibodies to CD69, CD40L, CD152, CD178, CD183, CD184, CD195, CDw197 or CD226.
[0029]
In the fixation of the cell affinity ligand to the carrier, the cell affinity ligand may be directly bound to the surface of the carrier, or may be bound via an active group. Basically, any binding state may be used as long as the cell affinity ligand or active group is not separated from the carrier. The bonding state includes a covalent bond, an ionic bond or a hydrophobic bond. From the viewpoint of suppressing the outflow of the cell affinity ligand, a covalent bond and a hydrophobic bond are more preferred, and a covalent bond is most preferred. Any known reaction can be used for the binding reaction as long as it can maintain the activity of the cell affinity ligand, and examples thereof include a substitution reaction, a condensation reaction, and a ring opening reaction.
[0030]
When the cell affinity ligand is bound to the carrier surface via an active group, the active group may be any known functional group as long as the cell affinity ligand and the carrier can be covalently bonded. Examples of the active group include an α-acetoaminohalogen group obtained by activating the carrier surface using N-hydroxymethylhaloacetamide or N-hydroxymethyldihaloacetamide, and N-hydroxymethyldihalopropionamide Α, β-propionaminohalogen group obtained by activating the surface of the carrier by using the above, α, α-acetamino obtained by activating the surface of the carrier using N-hydroxymethyldihaloacetamide, etc. Activating the carrier surface using a haloacetoaminoalkane agent such as an α, α, α-acetoaminotrihalogen group obtained by activating the carrier surface with a dihalogen group or N-hydroxymethyltrihaloacetamide or the like Activated group or epichrom Epoxy groups and the like obtained by activating the surface of the carrier with rohydrin or the like can be mentioned. Examples of the active group include, but are not limited to, an isocyanate group, an isothiocyanate group, an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a vinyl group, and an active group based on bromocyanide. An active group obtained by activating the surface of a carrier with a haloacetaminoalkane agent is preferred because the reaction can be performed under mild conditions while maintaining the function of the cell affinity ligand.
[0031]
Furthermore, when there are a plurality of types of cells to be separated or removed at one time, a plurality of types of cell-affinity ligands can be immobilized on a carrier according to the types of cells.
[0032]
The sterilization method according to the present invention can be applied to the cell adsorbent and the cell adsorber configured as described above. After assembling the cell adsorber including the cell adsorbent, the sterilization method described below may be applied, or the cell adsorber may be assembled after the cell adsorbent is sterilized by the sterilization method.
[0033]
According to the sterilization method of the present invention, when sterilizing a cell adsorber or a cell adsorbent, the cell affinity ligand immobilized on the cell adsorbent is protected by a nonpolar side chain amino acid having an aromatic ring, Degradation or denaturation of the ligand due to sterilization is suppressed. That is, the nonpolar side chain amino acid having an aromatic ring functions as a sterilization protective material.
[0034]
Here, “non-polar side chain amino acid having an aromatic ring” means a hydrophobic amino acid having an aromatic ring. Specific examples of the amino acid include phenylalanine and tryptophan which are essential amino acids, and tryptophan having both an aromatic ring and an aromatic heterocycle is most preferable. In the sterilization method according to the present invention, the above amino acids may be used alone or in any combination. The amino acids have optical isomers, and when used in the sterilization method of the present invention, the amino acids may be either the L-form or the D-form, or may be a mixture thereof. Furthermore, as long as the feature of "non-polar side chain having an aromatic ring" is maintained, another substituent may be introduced into a part of the side chain or the amino group or the carboxyl group may be modified in the amino acid. Is also good. Further, the above amino acids can be used as oligomers.
[0035]
"A non-polar side-chain amino acid having at least an aromatic ring is present in the vicinity of the cell-affinity ligand" means that the amino acid is adsorbed on the cell-affinity ligand and / or an aqueous solution containing the amino acid contacts the ligand. It means a liquid state. The "adsorbed state" means, for example, that an aqueous solution containing the amino acid is passed through a cell adsorber and left for a certain period of time, whereby the amino acid is adsorbed mainly around the hydrophobic portion of the cell affinity ligand, and the liquid phase It means a state in which the concentration of amino acids in the medium is extremely reduced. After the step of passing the aqueous solution containing the amino acid, the aqueous solution may be sealed as it is, or may be in a wet state or a half-wet state in which the liquid is flushed with air or the like until the liquid does not drip from the inlet or outlet of the cell adsorber. It is good. The “contacted state” means, for example, an immersion state in which the space in the cell adsorber is filled with an aqueous solution containing the amino acid as a filling liquid. From the viewpoint of the effect of maintaining the function of the cell affinity ligand, it is preferable that the amino acid is adsorbed to the cell affinity ligand and that the aqueous solution containing the amino acid is in contact with the cell affinity ligand.
[0036]
When the cell adsorbent itself is sterilized by the sterilization method according to the present invention, for example, the cell adsorbent is immersed in an aqueous solution containing the amino acid, and left for a certain period of time to adsorb the amino acid to the cell affinity ligand, and then Sterilize the cell adsorbent. When sterilizing, the cell adsorbent may be immersed in the aqueous solution containing the amino acid, or may be impregnated with the aqueous solution containing the amino acid.
[0037]
Here, the “aqueous solution containing an amino acid” means an aqueous solution in which the amino acid is dissolved in a solvent that does not affect the function of cells and ligands. In addition, it is desirable that the aqueous solution be easily replaced with physiological saline in a priming step using physiological saline or the like that is performed before using the cell adsorber. Examples of the solvent include distilled water, an aqueous solution such as a physiological saline or a phosphate buffer, and from the viewpoint of little effect on cells, preferably a physiological saline or a phosphate buffer, and most preferably. Is a phosphate buffer. The pH of the buffer may be around neutral.
[0038]
The amino acid concentration in the aqueous solution is preferably 0.01 wt / v% or more and less than 2 wt / v%. In the case of phenylalanine, the above concentration range may be used regardless of the temperature. However, in the case of tryptophan, from the viewpoint of solubility, the concentration is 0.01 wt / v% or more and less than 1.14 wt / v% when the temperature at the time of dissolution is 25 ° C or less, and the concentration is 0. Desirably, it is not less than 01 wt / v% and less than 2 wt / v%. When the concentration is less than the above range, the sterilization protection effect is reduced or a very large amount of liquid is required to obtain the desired sterilization protection effect. Conversely, if the concentration is higher than the above range, the solubility of the amino acid is deteriorated and the amino acid is in a dispersed state, which may cause a variation in the sterilization protection effect. Further, heating at about 100 ° C. is required for lysis, which is not preferable for treating a chemically unstable cell affinity ligand. For the above reasons, the amino acid concentration in the aqueous solution is more preferably 0.10 wt / v% or more and less than 1 wt / v%.
[0039]
Alternatively, the amino acid may be directly bound to the carrier surface together with the cell affinity ligand, or may be bound via an active group. The method for directly binding the amino acid to the carrier surface or via an active group may be the same as the method for binding the cell affinity ligand to the carrier surface described above.
[0040]
Sterilization used in the sterilization method according to the present invention means electromagnetic wave irradiation sterilization, electron beam irradiation sterilization, or high-pressure steam sterilization. Electromagnetic radiation sterilization means, for example, a 10 to 100 kGy γ-ray irradiation treatment or an X-ray irradiation treatment using cobalt 60 or the like as a radiation source. The electron beam irradiation sterilization means, for example, an electron beam irradiation process at an acceleration voltage of 200 keV to 1 MeV and an irradiation dose of 10 kGy to 100 kGy. Furthermore, in high-pressure steam sterilization, for example, a treatment is performed at 110 ° C. to 130 ° C. at about 1.2 to 1.5 atm for 20 minutes or more. Sterilization of the medical device may be any, but for reasons of manufacturing cost or continuous processability after equipment introduction, and stability of the cell affinity ligand, electromagnetic irradiation sterilization or electron beam irradiation sterilization is preferable, Electromagnetic radiation sterilization with gamma rays is most preferred.
[0041]
On the other hand, after the cell adsorber is sterilized by the sterilization method according to the present invention, the liquid to be treated is passed through the cell adsorber from the inlet of the cell adsorber, and the liquid to be treated is brought into contact with the cell adsorbent, and then the outlet. By recovering the processing solution from the above, a processing solution from which the target cells are adsorbed and removed, that is, a purified processing solution is obtained. Alternatively, after the liquid to be treated is passed through the adsorber, the liquid to be treated is brought into contact with the cell adsorbent, the target cells adsorbed on the cell adsorbent are separated and then collected.
[0042]
Here, the “liquid to be treated” means a blood or bone marrow fluid containing target cells to be adsorbed and removed or collected. The blood includes whole blood (peripheral blood), umbilical cord blood, or cell suspension subjected to cell separation treatment such as lymphocyte suspension, mononuclear cell suspension, or buffy coat. Target cells include, but are not limited to, leukocytes such as lymphocytes, granulocytes or monocytes or hematopoietic stem cells. In particular, in a cell adsorber for treating an immune disease, the target cells are lymphocytes such as T cells such as helper T cells or suppressor T cells or B cells or hematopoietic stem cells.
[0043]
In addition, blood to which an anticoagulant or a blood preservation solution is added as necessary can be applied to the cell adsorber according to the present invention as a liquid to be treated.
[0044]
As described above, in the cell adsorber treated by the sterilization method according to the present invention, the function of the cell affinity ligand is not impaired by the sterilization. Thus, for example, recovery of hematopoietic stem cells from bone marrow fluid, peripheral blood (derived from a subject who has been administered a hematopoietic factor such as G-CSF (granulocyte colony stimulating factor)) for extracorporeal circulation treatment or leukemia treatment, or cord blood The rate can be prevented from lowering.
[0045]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
Example 1 . Fabrication of cell adsorber
Preparation of activated non-woven carrier
0.6 g of N-hydroxymethyliodoacetamide, 5.7 ml of concentrated sulfuric acid and 7.2 ml of nitrobenzene were added to a glass flask and dissolved by stirring at room temperature. Next, 0.036 g of paraformaldehyde was added to the solution at 25 ° C., and the mixture was further stirred. Thereafter, 0.3 g of a nonwoven fabric carrier (average fiber diameter: 3.5 μm) made of polypropylene was added to the obtained solution, and a light-shielding reaction was performed at room temperature for 24 hours. After the reaction for 24 hours, the non-woven carrier was taken out, washed with ethanol and pure water, and dried under vacuum to obtain an activated non-woven carrier.
[0046]
Fabrication of cell adsorber
The activated non-woven carrier was cut into a circular shape having a diameter of 0.68 cm (hereinafter referred to as "circular non-woven carrier"). Next, 400 μl (16 μg / 400 μl) of an anti-human CD4 monoclonal antibody solution dissolved in a phosphate buffered saline solution (hereinafter referred to as “PBS (−)”) containing no calcium and magnesium was added to the obtained circular non-woven carrier 4. The plate was immersed at room temperature for 2.5 hours, and the monoclonal antibody was fixed on a circular nonwoven carrier. Thereafter, the circular nonwoven fabric was washed with 2 ml of PBS (-). Next, the carrier was immersed in a 0.2% polyoxyethylene sorbitan monolaurate / PBS (-) solution (hereinafter referred to as "Tween 20 solution") at room temperature for 2.5 hours to perform blocking. Thereafter, the circular non-woven carrier was washed with 2 ml of PBS (-) to obtain a filter using the circular non-woven carrier below.
[0047]
Next, a 1 ml container having an inlet and an outlet was filled with the above four filters and a 1.0 wt / v% tryptophan PBS (−) solution (molecular weight: 204) as a filling solution to prepare a cell adsorber.
[0048]
Example 2 . Cell adsorbability of cell adsorber after sterilization
The cell adsorber was irradiated with 25 kGy of γ-ray and sterilized. Next, 5 ml of ACD-A-added human fresh blood (blood: ACD-A = 8: 1) was sent from the inlet of the cell adsorber after sterilization at a flow rate of 1 ml / min using a syringe pump. Thereafter, the solution after cell adsorption was recovered from the outlet of the cell adsorber.
[0049]
Next, the number of CD4 (+) cells in the ACD-A-added human fresh blood before cell adsorption and the solution after cell adsorption was measured by a flow cytometry method using a flow cytometer (COULTER EPICS ELITE ESP), The rate of cell adsorption to the cell adsorber was calculated. As a result, the adsorption rate of CD4 (+) cells was 90%. The adsorption rate of CD8 (+) cells was 9%, the adsorption rate of B lymphocytes was 27%, and the adsorption rate of platelets was 8%.
[0050]
On the other hand, phenylalanine is a non-polar side chain amino acid having an aromatic ring like tryptophan. Therefore, the same experiment as described above was performed using a 1.0 wt / v% phenylalanine PBS (-) solution (molecular weight: 165) solution as the filling liquid. As a result, the adsorption rate of CD4 (+) cells was 75%. The adsorption rate of CD8 (+) cells was 11%, the adsorption rate of B lymphocytes was 27%, and the adsorption rate of platelets was 8%.
[0051]
Further, the same experiment as described above was performed using a PBS (-) solution or a 1.0 wt / v% arginine PBS (-) solution (molecular weight: 174) solution as a filling solution. As a result, in the case of the PBS (-) solution, the adsorption rate of CD4 (+) cells was 17%. The adsorption rate of CD8 (+) cells was 30%, the adsorption rate of B lymphocytes was 43%, and the adsorption rate of platelets was 8%.
[0052]
In the case of a 1.0 wt / v% arginine PBS (-) solution (molecular weight: 174) solution, the adsorption rate of CD4 (+) cells was 29.4%. The adsorption rate of CD8 (+) cells was 17.2%, the adsorption rate of B lymphocytes was 22.3%, and the adsorption rate of platelets was 8%.
[0053]
As described above, by using a nonpolar side chain amino acid having an aromatic ring, tryptophan or phenylalanine as a sterilizing protective material, CD4 (+) cells can be specifically isolated without impairing the anti-human CD4 monoclonal antibody even after sterilization. It could be adsorbed.
[0054]
Example 3 . Examination of tryptophan concentration effective as a sterilization protective material
The concentration of tryptophan effective as a sterilizing protective material was examined. The same experiment as described above was performed using a tryptophan PBS (-) solution (molecular weight 204) of 0.008 wt / v%, 0.0125 wt / v%, or 0.1 wt / v% as a filling liquid.
[0055]
In the case of the 0.008 wt / v% tryptophan PBS (-) solution, the adsorption rate of CD4 (+) cells was 32%. The adsorption rate of CD8 (+) cells was 20%, the adsorption rate of B lymphocytes was 40%, and the adsorption rate of platelets was 2%.
[0056]
In the case of 0.0125 wt / v% tryptophan PBS (-) solution, the adsorption rate of CD4 (+) cells was 74%. The adsorption rate of CD8 (+) cells was 20%, the adsorption rate of B lymphocytes was 48%, and the adsorption rate of platelets was 0%.
[0057]
In the case of 0.1 wt / v% tryptophan PBS (-) solution, the adsorption rate of CD4 (+) cells was 88%. The adsorption rate of CD8 (+) cells was 28%, the adsorption rate of B lymphocytes was 42%, and the adsorption rate of platelets was 0%.
[0058]
From the above, when the tryptophan concentration was 0.01 wt / v% or more, the adsorption rate of CD4 (+) cells was excellent. Therefore, it was found that the tryptophan concentration effective as a sterilization protective material was 0.01 wt / v% or more.
[0059]
【The invention's effect】
According to the present invention, there are provided a cell adsorbent capable of maintaining a ligand function even after sterilization, a method for sterilizing a cell adsorber, and a cell adsorber obtained by the sterilization method. Therefore, according to the present invention, in the specific adsorption or recovery of cells using a cell adsorbent and a cell adsorber, excellent adsorption and recovery rates can be achieved.