JP2004075569A

JP2004075569A - Il20 receptor and new use of il20

Info

Publication number: JP2004075569A
Application number: JP2002234880A
Authority: JP
Inventors: Makoto Kobayashi; 小林　真; Akira Fujii; 藤井　亮; Yuko Noguchi; 野口　優子; Kuniji Hinuma; 日沼　州司
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2002-08-12
Filing date: 2002-08-12
Publication date: 2004-03-11

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for screening a prophylactic and a therapeutic agent for large intestinal tumor. <P>SOLUTION: The method for screening the prophylactic and the therapeutic agent for large intestinal tumor comprises using G protein conjugated receptor protein (IL20 receptor) containing the same or substantially the same amino acid sequence as that represented by sequence number 1 or it salt and IL20. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＩＬ２０、ＩＬ２０受容体およびそれらをコードするポリヌクレオチドの用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＬ２０はＩＬ１０のファミリーに属するサイトカインとして発見され（Ｃｅｌｌ，　１０４，　９−１９，　２００１）、乾癬で発現が亢進すること（Ｃｅｌｌ，　１０４，　９−１９，　２００１）、トランスジェニュックマウスで皮膚に異常が起こること（Ｃｅｌｌ，　１０４，　９−１９，　２００１）が知られている。
また、ＩＬ２０受容体をコードするＤＮＡが単離されているおり（Ｃｅｌｌ，　１０４，９−１９，　２００１）、ＩＬ２０受容体には、ＩＬ２０以外にＩＬ１９やＩＬ２４も結合することが報告されている（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　１６７（７）：３５４５−９，　２００１，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２７７，　ｐｐ７３４１−７３４７，　２００２）。ＩＬ２４に関しては、ｒａｓの情報を受けて細胞の増殖に働くことを示唆する報告がなされている（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２７７，　ｐｐ７３４１−７３４７，　２００２）。さらに、ＩＬ２４が大腸癌で発現が亢進していることも報告されている（Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　６２，　８５１−８９１）が、そのシグナルを送る受容体に関しての記述はない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＩＬ２０受容体の機能を解明し、ＩＬ２０およびＩＬ２０受容体の新たな用途を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体α鎖もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる大腸癌の予防および／または治療剤、
（２）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体α鎖もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる大腸癌の診断薬、
（３）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体α鎖もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる大腸癌の予防および／または治療剤、
（４）ＩＬ２０と配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体α鎖もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる大腸癌の予防および／または治療剤、
（５）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体α鎖またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる大腸癌の予防及び／又は治療剤、
（６）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体α鎖またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる大腸癌の予防及び／又は治療剤、
（７）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体α鎖またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる大腸癌の診断薬、
（８）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体α鎖またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる大腸癌の予防及び／又は治療剤、
（９）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体α鎖またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる大腸癌の診断薬、
（１０）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体β鎖もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる大腸癌の予防および／または治療剤、
（１１）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体β鎖もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる大腸癌の診断薬、
（１２）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体β鎖もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる大腸癌の予防および／または治療剤、
（１３）ＩＬ２０と配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体β鎖もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる大腸癌の予防および／または治療剤、
（１４）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体β鎖またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる大腸癌の予防及び／又は治療剤、
（１５）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体β鎖またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる大腸癌の予防及び／又は治療剤、
（１６）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体β鎖またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる大腸癌の診断薬、
（１７）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体β鎖またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる大腸癌の予防及び／又は治療剤、
（１８）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体β鎖またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる大腸癌の診断薬、
（１９）ＩＬ２０またはその塩を含有してなる大腸癌の予防および／または治療剤、
（２０）ＩＬ２０またはその塩に対する抗体を含有してなる大腸癌の診断薬、
（２１）ＩＬ２０またはその塩に対する抗体を含有してなる大腸癌の予防および／または治療剤、
（２２）ＩＬ２０の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる大腸癌の予防及び／又は治療剤、
（２３）ＩＬ２０をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる大腸癌の予防及び／又は治療剤、
（２４）ＩＬ２０をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる大腸癌の診断薬、
（２５）ＩＬ２０をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる大腸癌の予防及び／又は治療剤、
（２６）ＩＬ２０をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる大腸癌の診断薬、
（２７）（ｉ）ＩＬ２０またはその塩、（ｉｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体α鎖、その部分ペプチドまたはその塩および（ｉｉｉ）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体β鎖、その部分ペプチドまたはその塩を用いて、ＩＬ２０またはその塩と、該ＩＬ２０受容体α鎖またはその塩および（または）該ＩＬ２０受容体β鎖またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を選択することを特徴とする大腸癌の予防・治療薬のスクリーニング方法、
（２８）（ｉ）ＩＬ２０またはその塩、（ｉｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体α鎖、その部分ペプチドまたはその塩および（ｉｉｉ）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＩＬ２０受容体β鎖、その部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする大腸癌の予防・治療薬のスクリーニング用キット等を提供する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
（タンパク質）
本発明で用いられるＩＬ２０受容体α鎖は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質である。
本発明で用いられるＩＬ２０受容体β鎖は、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質である。
これらＩＬ２０受容体α鎖およびＩＬ２０受容体β鎖は（Ｃｅｌｌ，　１０４，　９−１９，　２００１）に記載されている公知のタンパク質である。以下、ＩＬ２０受容体α鎖およびＩＬ２０受容体β鎖を単にＩＬ２０受容体と略記する場合がある。
本発明で用いられるＩＬ２０は、配列番号：９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である。
配列番号：９で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＩＬ２０は（Ｃｅｌｌ，　１０４，
９−１９，　２００１）に記載されている公知のタンパク質である。
ＩＬ２０およびＩＬ２０受容体は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞〔例えば、網膜細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、白血球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞（例、乳癌細胞株（ＧＩ−１０１）、結腸癌細胞株（ＣＸ−１、ＧＩ−１１２）、肺癌細胞株（ＬＸ−１、ＧＩ−１１７）、卵巣癌細胞株（ＧＩ−１０２）、前立腺癌細胞株など）など〕、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
【０００６】
本明細書において、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、比較するアミノ酸配列に対して、例えば、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
配列番号：９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：９で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、レセプター結合活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、レセプター結合活性などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性、レセプター結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
【０００７】
ＩＬ２０受容体としては、（１）配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（４）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられる。
ＩＬ２０としては、（１）配列番号：９で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号：９で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号：９で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（４）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられる。
【０００８】
本明細書におけるＩＬ２０受容体またはＩＬ２０は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明でいうＩＬ２０受容体またはＩＬ２０に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０には、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
ＩＬ２０受容体α鎖の具体例としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＩＬ２０受容体α鎖などが挙げられる。
ＩＬ２０受容体β鎖の具体例としては、例えば、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＩＬ２０受容体β鎖などが挙げられる。
ＩＬ２０の具体例としては、例えば、配列番号：９で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＩＬ２０などが挙げられる。
ＩＬ２０受容体、ＩＬ２０またはその塩は、上記したヒトや哺乳動物の細胞または組織から公知のレセプタータンパク質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載するＩＬ２０受容体またはＩＬ２０をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【０００９】
ＩＬ２０受容体の部分ペプチド（以下、単に「部分ペプチド」と略記する場合がある）としては、上記したＩＬ２０受容体の部分アミノ酸配列を有するペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、ＩＬ２０受容体の分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、ＩＬ２０受容体と実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するＩＬ２０受容体α鎖または配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するＩＬ２０受容体β鎖の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記したＩＬ２０受容体の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、「実質的に同質のレセプター結合活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質のレセプター結合活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
【００１０】
また、部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
さらに、部分ペプチドには、上記したＩＬ２０受容体と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
ＩＬ２０受容体またはその部分ペプチド、またはＩＬ２０の塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
ＩＬ２０受容体の部分ペプチドまたはその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＩＬ２０受容体を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、ＩＬ２０受容体を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下のａ）〜ｅ）に記載された方法が挙げられる。
ａ）Ｍ．　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ　および　Ｍ．Ａ．　Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド　シンセシス　（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６６年）
ｂ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ　ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ），　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６５年）
ｃ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、　丸善（株）　（１９７５年）
ｄ）矢島治明　および榊原俊平、生化学実験講座　１、　タンパク質の化学ＩＶ、　２０５、（１９７７年）
ｅ）矢島治明監修、続医薬品の開発　第１４巻　ペプチド合成　広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００１１】
（ポリヌクレオチド）
ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０をコードするポリヌクレオチドとしては、上記したＩＬ２０受容体またはＩＬ２０をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９９７記載の公知の方法またはそれに準じた方法により、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０のｍＲＮＡを定量することができる。
ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞または組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、ＩＬ２０受容体α鎖をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるＩＬ２０受容体α鎖と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
具体的には、ＩＬ２０受容体β鎖をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるＩＬ２０受容体β鎖と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ＩＬ２０をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：９で表わされるアミノ酸配列からなるＩＬ２０と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
配列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００１２】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
「該ハイストリンジェントな条件」とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
本発明の「ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチド」とは、下記のＩＬ２０受容体の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、ＩＬ２０受容体遺伝子またはＩＬ２０遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたＩＬ２０受容体またはＩＬ２０をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、ＩＬ２０受容体遺伝子またはＩＬ２０遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいはＩＬ２０受容体関連ＲＮＡまたはＩＬ２０関連ＲＮＡとの相互作用を介してＩＬ２０受容体遺伝子またはＩＬ２０遺伝子の発現を調節・制御することができる。ＩＬ２０受容体関連ＲＮＡまたはＩＬ２０関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、およびＩＬ２０受容体関連ＲＮＡまたはＩＬ２０関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外でＩＬ２０受容体遺伝子またはＩＬ２０遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（タンパク質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（タンパク質）のアミノ酸を通常指している。レセプタータンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、レセプタータンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
ＩＬ２０受容体またはその部分ペプチド、またはＩＬ２０（以下、包括的に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００１３】
（アンチセンス・ポリヌクレオチド）
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質、核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００１４】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば　Ｊ．　Ｋａｗａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ　Ｔｅｃｈ　Ｊａｐａｎ，　Ｖｏｌ．　８，　ｐｐ．２４７，　１９９２；　Ｖｏｌ．　８，　ｐｐ．３９５，　１９９２；　Ｓ．　Ｔ．　Ｃｒｏｏｋｅ　ｅｔ　ａｌ．　ｅｄ．，　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９３　などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはレセプタータンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、生体内における本発明のタンパク質または本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の機能を抑制することができるので、例えば、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。さらに、本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできるので、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不全に関連する疾患の診断に用いることができる。
【００１５】
（部分ペプチドをコードするＤＮＡ）
ＩＬ２０受容体の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記したＩＬ２０受容体の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞または組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、ＩＬ２０受容体α鎖の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、
（１）配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、
（２）配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
具体的には、ＩＬ２０受容体β鎖の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、
（１）配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、
（２）配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００１６】
（抗体）
ＩＬ２０受容体もしくはその部分ペプチドまたはその塩、またはＩＬ２０またはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質、あるいは本発明のタンパク質を含有する細胞を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のタンパク質に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００１７】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプタータンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００１８】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、レセプタータンパク質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したレセプタータンパク質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００１９】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００２０】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（本発明のタンパク質等の抗原）とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物からＩＬ２０受容体等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００２１】
［レセプタータンパク質、ＤＮＡなどの用途］
ＩＬ２０受容体やＩＬ２０、それらをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、ＩＬ２０受容体やＩＬ２０に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、本発明のＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ（以下、本発明のアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）などは、以下の用途を有している。
【００２２】
（１）ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤
ＩＬ２０受容体α鎖は大腸癌細胞で高発現していることから、ａ）ＩＬ２０受容体（α鎖またはβ鎖）もしくはＩＬ２０、またはｂ）ＩＬ２０受容体もしくはＩＬ２０をコードするＤＮＡを、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不全、特に大腸癌の予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。例えば、生体内においてＩＬ２０受容体またはＩＬ２０が減少しているために、ＩＬ２０の生理作用が期待できない（ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の欠乏症）患者がいる場合に、ａ）ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０を該患者に投与し、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の量を補充したり、ｂ）（イ）ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）対象となる細胞にＩＬ２０受容体をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるＩＬ２０受容体の量を増加させ、ＩＬ２０受容体、あたはＩＬ２０の作用を充分に発揮させることができる。
すなわち、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０をコードするＤＮＡは、安全で低毒性な該ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不全、特に大腸癌の予防および／または治療剤として有用である。
ＩＬ２０受容体またはＩｌ２０を上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、本発明のＤＮＡを上記予防・治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、ａ）ＩＬ２０受容体もしくはＩＬ２０、またはｂ）本発明のＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、ａ）ＩＬ２０受容体もしくはＩＬ２０、またはｂ）本発明のＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００２３】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００２４】
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
本発明のＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、糖尿病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、大腸癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、大腸癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、糖尿病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００２５】
（２）本発明のＤＮＡを用いる診断剤及び診断方法
本発明のＤＮＡおよびアンチセンスＤＮＡは、プローブとして使用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
例えば、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０をコードするＤＮＡは、大腸癌の診断剤として使用することができる。
（３）本発明のアンチセンスＤＮＡを含有してなる医薬
ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０をコードするＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡは、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の過剰発現などに起因する疾患（例えば、大腸癌）などの疾患の予防及び／又は治療薬として用いることができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
本発明のＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによりＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の発現低下または発現過多が検出された場合は、例えば、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不全または過剰発現に起因する疾患、特に大腸癌等に罹患している可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【００２６】
（４）ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡは、プローブとして用いることにより、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用いることができる。すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物の（１）血液、（２）特定の臓器、（３）臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ｉｉ）形質転換体等に含まれるＩＬ２０受容体またはＩＬ２０のｍＲＮＡ量を測定することによる、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００２７】
ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０のｍＲＮＡ量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗癌剤など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肺、大腸、前立腺など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれる本発明のタンパク質のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、公知の手段によりノザンブロットを行うことにより解析することもできる。
（ｉｉ）ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれるＩＬ２０受容体またはＩＬ２０のｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。
【００２８】
ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の発現量を変化させる化合物のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞に含まれるＩＬ２０受容体またはＩＬ２０のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができ、
（ｉｉ）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれるＩＬ２０受容体またはＩＬ２０のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができる。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の発現量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の発現量を増加させることにより、ＩＬ２０受容体を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を増強させる化合物、（ロ）ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の発現量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
上記スクリーニング方法で得られるＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の発現量を変化させる化合物は、大腸癌などの予防および／または治療剤として用いることができる。
【００３０】
（５）ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の発現量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤
ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の発現量を変化させる化合物は、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。
該化合物を前記したＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不全に関連する疾患、例えば大腸癌の予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
【００３１】
（６）ＩＬ２０受容体（α鎖およびβ鎖）とＩＬ２０との結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング方法及びスクリーニングキット
ＩＬ２０受容体等を用いるか、または組換え型レセプタータンパク質等の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、リガンドとＩＬ２０受容体等との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
ＩＬ２０受容体に対するリガンドとしては、ＩＬ２０が用いられる。具体的には、配列番号：９で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＩＬ２０などが用いられる。さらに、リガンドとしては、ＩＬ２０とＩＬ２０受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることもできる。このＩＬ２０とＩＬ２０受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩は、例えば、リガンドとしてＩＬ２０を用いて、後述する本発明のスクーニング方法を実施することによって得ることができる。また、ＩＬ２４、ＩＬ１９などもリガンドとして使用することができる。以下、これらのリガンドをまとめて単にリガンドと記載する。
リガンドとＩＬ２０受容体との結合性を変化させる化合物には、（イ）レセプターを介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を有する化合物（いわゆる、ＩＬ２０受容体に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、ＩＬ２０受容体に対するアンタゴニスト）、（ハ）リガンドと本発明のレセプタータンパク質との結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）リガンドとＩＬ２０受容体との結合力を減少させる化合物などが含まれる（なお、上記（イ）の化合物は、上記したリガンド決定方法によってスクリーニングすることが好ましい）。
すなわち、本発明は、（ｉ）ＩＬ２０受容体もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、リガンドとを接触させた場合と（ｉｉ）ＩＬ２０受容体もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドとＩＬ２０受容体もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ｉｉ）の場合における、例えば、該レセプタータンパク質等に対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。
【００３２】
より具体的には、本発明は、
（ｉ）標識したリガンドを、ＩＬ２０受容体等に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物をＩＬ２０受容体等に接触させた場合における、標識したリガンドの該レセプタータンパク質等に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＩＬ２０受容体等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ｉｉ）標識したリガンドを、ＩＬ２０受容体等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物をＩＬ２０受容体等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＩＬ２０受容体等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ｉｉｉ）標識したリガンドを、本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプタータンパク質等に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＩＬ２０受容体等に接触させた場合における、標識したリガンドの該レセプタータンパク質等に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＩＬ２０受容体等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
【００３３】
（ｉｖ）ＩＬ２０受容体等を活性化する化合物（例えば、リガンドなど）をＩＬ２０受容体等を含有する細胞に接触させた場合と、ＩＬ２０受容体等を活性化する化合物および試験化合物をＩＬ２０受容体等を含有する細胞に接触させた場合における、レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＩＬ２０受容体等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（ｖ）ＩＬ２０受容体等を活性化する化合物（例えば、リガンドなど）を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＩＬ２０受容体等に接触させた場合と、ＩＬ２０受容体等を活性化する化合物および試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＩＬ２０受容体等に接触させた場合における、レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＩＬ２０受容体等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるＩＬ２０受容体等としては、上記したＩＬ２０受容体等を含有するものであれば何れのものであってもよいが、ＩＬ２０受容体等を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のレセプタータンパク質等などが適している。
本発明のレセプタータンパク質を製造するには、上記の方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とするタンパク質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。ＩＬ２０受容体をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Ｎａｍｂｉ，Ｐ．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．），２６７巻，１９５５５〜１９５５９頁，１９９２年〕に記載の方法に従って行なうことができる。
なお、本発明のスクリーニング方法において、ＩＬ２０受容体等を含有するものとしては、公知の方法に従って精製したレセプタータンパク質等であってもよいし、該レセプタータンパク質等を含有する細胞を用いてもよく、また該レセプタータンパク質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法において、ＩＬ２０受容体等を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。
ＩＬ２０受容体等を含有する細胞としては、該レセプタータンパク質等を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータンパク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプタータンパク質等を含有する細胞や膜画分中のレセプタータンパク質の量は、１細胞当たり１０^３〜１０^８分子であるのが好ましく、１０^５〜１０^７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００３５】
リガンドとＩＬ２０受容体等との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記の（１）〜（３）を実施するためには、例えば、適当なＩＬ２０受容体画分と、標識したリガンドが必要である。
ＩＬ２０受容体画分としては、天然型のＩＬ２０受容体画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ＩＬ２０受容体画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識したリガンドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用いられる。例えば〔^３Ｈ〕、〔^１２５Ｉ〕、〔^１４Ｃ〕、〔^３５Ｓ〕などで標識されたリガンドなどが用いられる。
具体的には、リガンドとＩＬ２０受容体等との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうには、まずＩＬ２０受容体等を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプタータンパク質標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプタータンパク質との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識したリガンドを添加し、同時に１０^−４Ｍ〜１０^−１０Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は約０℃から５０℃、望ましくは約４℃から３７℃で、約２０分から２４時間、望ましくは約３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ_０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ_０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００３６】
リガンドとＩＬ２０受容体等との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記の（４）〜（５）の方法を実施するためには、例えば、レセプタータンパク質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、ＩＬ２０受容体等を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＩＬ２０受容体を発現した細胞が必要である。ＩＬ２０受容体等を発現した細胞としては、天然型のＩＬ２０受容体等を有する細胞株、上記の組換え型レセプタータンパク質等を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
また、試験化合物としては、ＩＬ２０受容体の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物が好ましく用いられる。ＩＬ２０受容体の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置の測定は、公知の方法あるいはそれに準じる方法を用いて行うことができる。
【００３７】
リガンドとＩＬ２０受容体等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、ＩＬ２０受容体等、ＩＬ２０受容体等を含有する細胞、またはＩＬ２０受容体等を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
（１）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
（２）ＩＬ２０受容体標品
ＩＬ２０受容体を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０^５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ_２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
（３）標識リガンド
市販の〔^３Ｈ〕、〔^１２５Ｉ〕、〔^１４Ｃ〕、〔^３５Ｓ〕などで標識したリガンド
水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
（４）リガンド標準液
リガンドを０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００３８】
２．測定法
（１）１２穴組織培養用プレートにて培養したＩＬ２０受容体発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（２）１０^−３〜１０^−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０^−３Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。
（３）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンドを０．２Ｎ　ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（４）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Ｐｅｒｃｅｎｔ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）を次の式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ_０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Ｐｅｒｃｅｎｔ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｂ　　：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｂｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ_０　　：最大結合量
【００３９】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、リガンドとＩＬ２０受容体等との結合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（１）レセプターを介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を有する化合物（いわゆる、ＩＬ２０受容体に対するアゴニスト）、（２）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、ＩＬ２０受容体に対するアンタゴニスト）、（３）リガンドとＩＬ２０受容体との結合力を増強する化合物、あるいは（４）リガンドとＩＬ２０受容体との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
ＩＬ２０受容体等に対するアゴニストは、ＩＬ２０受容体等に対する上記リガンドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、該生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
ＩＬ２０受容体等に対するアンタゴニストは、ＩＬ２０受容体等に対する上記リガンドが有する生理活性を抑制することができるので、該生理活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドとＩＬ２０受容体との結合力を増強する化合物は、ＩＬ２０受容体等に対する上記リガンドが有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドとＩＬ２０受容体との結合力を減少させる化合物は、ＩＬ２０受容体等に対する上記リガンドが有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる、リガンドとＩＬ２０受容体との結合性を変化させる作用を有する化合物またはその塩は、例えば、大腸癌に対する予防及び／又は治療薬として有用である。
（７）ＩＬ２０受容体とリガンドとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニストなど）を含有する各種疾病の予防および／または治療剤）
ＩＬ２０受容体とＩＬ２０との結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）やＩＬ２０は、ＩＬ２０受容体の機能不全に関連する疾患、例えば、大腸癌に対する予防および／または治療剤として用いることができる。
該化合物やリガンドをＩＬ２０受容体の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として使用する場合は、上述したような常套手段に従って製剤化することができる。
【００４１】
（８）本発明の抗体を用いるタンパク質などの定量、本発明の抗体を含有する診断薬およびそれを用いる診断方法
本発明の抗体は、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０を特異的に認識することができるので、被検液中のＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の定量、特にサンドイッチ免疫測定法、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどによる定量などに使用することができる。
【００４２】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＩＬ２０受容体、ＩＬ２０またはそれらの塩の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江　寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江　寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン・エンジモノジー」（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）Ｖｏｌ．　７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ａ））、　同書　Ｖｏｌ．　７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｂ））、　同書　Ｖｏｌ．　７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｃ））、　同書　Ｖｏｌ．　８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、　同書　Ｖｏｌ．　９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ））、　同書　Ｖｏｌ．　１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）、ＷＯ　００／１４２２７号公報第３９頁第２５行〜第４２頁第８行、ＥＰ１１１１０４７Ａ２号公報段落［０１１５］第１９頁第３５行〜第２０頁第４７行などを参照することができる。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、ＩＬ２０受容体、ＩＬ２０またはそれらの塩を感度良く定量することができる。
さらに、本発明の抗体を用いて、生体内でのＩＬ２０受容体、ＩＬ２０またそれらの塩を定量することによって、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。
例えば、ＩＬ２０受容体に対する抗体を用いてＩＬ２０受容体の濃度を定量することによって、ＩＬ２０受容体の濃度の増加または減少が検出された場合、例えば、ＩＬ２０受容体の機能不全または過剰発現に起因する疾患、特に大腸癌に罹患している可能性が高い、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在するＩＬ２０受容体またはＩＬ２０を特異的に検出するために使用することができる。また、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中のＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の検出、被検細胞内におけるＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の挙動の分析などのために使用することができる。
【００４３】
（９）細胞膜におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法
本発明の抗体は、ＩＬ２０受容体もしくはその部分ペプチドまたはその塩を特異的に認識することができるので、細胞膜におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち本発明は、例えば、
（ｉ）非ヒト哺乳動物の（ａ）血液、（ｂ）特定の臓器、（ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドを定量することによる、細胞膜におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｉ）ＩＬ２０受容体もしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドを定量することによる、細胞膜におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｉｉ）非ヒト哺乳動物の（ａ）血液、（ｂ）特定の臓器、（ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該レセプタータンパク質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該タンパク質を確認することによる、細胞膜におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
（ｉｖ）ＩＬ２０受容体もしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該レセプタータンパク質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該タンパク質を確認することによる、細胞膜におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００４４】
細胞膜画分に含まれるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの定量は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗癌剤など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肺、大腸、前立腺など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）等に懸濁し、臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤（例えば、トリトンＸ１００^ＴＭ、ツイーン２０^ＴＭなど）などを用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
【００４５】
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータンパク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
【００４６】
細胞膜画分に含まれるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドは、例えば、本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブロット解析などにより定量することができる。
かかるサンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことができ、ウエスタンブロットは公知の手段により行なうことができる。
【００４７】
（ｉｉ）ＩＬ２０受容体もしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、細胞膜画分に含まれるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドを定量することができる。
【００４８】
細胞膜におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞膜におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの量を定量することにより行なうことができ、
（ｉｉ）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、細胞膜におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの量を定量することにより行なうことができる。
【００４９】
細胞膜画分に含まれるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの確認は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉｉｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肺、大腸など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、常法に従い組織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。細胞表層での該レセプタータンパク質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該タンパク質を確認することにより、定量的または定性的に、細胞膜におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの量を確認することができる。
（ｉｖ）ＩＬ２０受容体もしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、細胞膜におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）細胞膜におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの量を増加させることにより、レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を増強させる化合物、（ロ）細胞膜におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、ＩＬ２０受容体等の生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、ＩＬ２０受容体等の生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
【００５１】
（１０）細胞膜におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物、及びその化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤
ＩＬ２０受容体は上記のとおり、例えば、生体内で重要な役割を果たしていると考えられる。したがって、細胞膜におけるＩＬ２０受容体またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物は、ＩＬ２０受容体の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。
例えば、細胞膜におけるＩＬ２０受容体の量を変化させる化合物は、該ＩＬ２０受容体の機能不全または過剰発現などに起因する疾患（例えば、大腸癌）の予防及び／又は治療薬として用いることができる。
該化合物をＩＬ２０受容体の機能不全または過剰発現に関連する疾患の予防および／または治療剤として使用する場合は、上述した常套手段に従って製剤化することができる。
【００５２】
（１１）ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０に対する抗体を含有する医薬
ＩＬ２０受容体もしくはその部分ペプチド、ＩＬ２０またはその塩に対する中和抗体は、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の関与する活性、例えばシグナル伝達機能を不活性化する活性を有している。従って、該抗体が中和活性を有する場合は、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の関与するシグナル伝達、例えば、ＩＬ２０受容体を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を不活性化することができる。したがって、このような抗体は、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の過剰発現などに起因する疾患の予防および／または治療に用いることができる。
例えば、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０に対する中和抗体は、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の過剰発現などに起因する疾患（例えば、大腸癌）の予防及び／又は治療薬として用いることができる。
本発明の予防・治療剤の製剤化は、前述のＩＬ２０受容体を含有する製剤と同様に製剤化することができる。
【００５３】
（１２）本発明のＤＮＡ導入動物の作製
本発明は、外来性の本発明のＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
〔２〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕記載の動物、
〔３〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔２〕記載の動物、および
〔４〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ導入動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを導入することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ導入動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ_１系統，ＢＤＦ_１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ_１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００５４】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常なＩＬ２０受容体を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常なＩＬ２０受容体の機能を抑制するレセプタータンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に導入させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを導入させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ導入哺乳動物を作出することができる。
【００５５】
ＩＬ２０受容体の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（ａ）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ｂ）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ導入哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【００５６】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流　に連結することも目的により可能である。
正常なＩＬ２０受容体の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なＩＬ２０受容体の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は導入動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを導入させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００５７】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的にＩＬ２０受容体の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ導入動物を用いて、ＩＬ２０受容体の機能亢進症や、ＩＬ２０受容体が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを導入させた哺乳動物は、遊離したＩＬ２０受容体の増加症状を有することから、ＩＬ２０受容体に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００５８】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的にＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ導入動物を用いて、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不活性型不応症における本発明の異常レセプタータンパク質による正常レセプタータンパク質の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを導入させた哺乳動物は、遊離したＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の増加症状を有することから、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ導入動物のその他の利用可能性として、例えば、
（ａ）組織培養のための細胞源としての使用、
（ｂ）本発明のＤＮＡ導入動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたＩＬ２０受容体またはＩＬ２０を分析することによる、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０により特異的に発現あるいは活性化するＩＬ２０受容体またはＩＬ２０との関連性についての解析、
（ｃ）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（ｄ）上記（ｃ）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（ｅ）本発明の変異レセプタータンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不活性型不応症などを含む、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ導入動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ導入細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、ＩＬ２０受容体産生細胞またはＩＬ２０産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不活性型不応症を含む、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ導入動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００５９】
（１３）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔２〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔３〕ネオマイシン耐性である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔４〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔５〕ゲッ歯動物がマウスである第〔４〕項記載の胚幹細胞、
〔６〕本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
〔７〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔８〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔９〕ゲッ歯動物がマウスである第〔８〕項記載の非ヒト哺乳動物、および
〔１０〕第〔７〕項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしているＩＬ２０受容体の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的にＩＬ２０受容体の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【００６０】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知　ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ_１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ_１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ_１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【００６１】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０^６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１−０．５％トリプシン／０．１−５ｍＭ　ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ　ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．　Ｊ．　Ｅｖａｎｓ及びＭ．　Ｈ．　Ｋａｕｆｍａｎ，　ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．　Ｒ．　Ｍａｒｔｉｎ　プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．　Ｃ．　Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ　ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおけるＩＬ２０受容体またはＩＬ２０受容体の細胞生物学的検討において有用である。
【００６２】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、ＩＬ２０受容体のヘテロ発現不全個体であり、ＩＬ２０受容体のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔からＩＬ２０受容体のホモ発現不全個体を得ることができる。
【００６３】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、ＩＬ２０受容体により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、ＩＬ２０受容体の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００６４】
（１４ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００６５】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の癌組織が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上縮小した場合、該試験化合物を癌に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、ＩＬ２０受容体の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患（例えば、大腸癌）に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したＩＬ２０受容体とリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に例えば、大腸癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、大腸癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６６】
（１４ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、ＩＬ２０受容体をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、ＩＬ２０受容体の発現する組織で、ＩＬ２０受容体の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便にＩＬ２０受容体の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、ＩＬ２０受容体欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００６７】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の発現を促進し、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能を促進することができるので、例えば、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の機能不全に関連する疾患などの予防及び／又は治療薬などの医薬として有用である。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の発現を阻害し、該レセプタータンパク質の機能を阻害することができるので、例えば、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０の発現過多に関連する疾患などの予防及び／又は治療薬などの医薬として有用である。
具体的には、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０をコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物は、例えば、大腸癌などの予防及び／又は治療薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００６８】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したＩＬ２０受容体またはその塩とリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に例えば、大腸癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、前立腺癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防及び／又は治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのレセプタータンパク質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポータ遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、ＩＬ２０受容体またはＩＬ２０そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【００６９】
（略号の表示）
本明細書において、塩基、アミノ酸、化合物等を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づき表示を行い、その例を以下に記載する。またアミノ酸が光学異性体を取りうる場合、特に明示しなければＬ体を表す。
ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ　　　　：相補的デオキシリボ核酸
ａまたはＡ　　　：アデニン
ｔまたはＴ　　　：チミン
ｇまたはＧ　　　：グアニン
ｃまたはＣ　　　：シトシン
ｕまたはＵ　　　：ウラシル
ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
Ｇｌｙ　　　　　：グリシン
Ａｌａ　　　　　：アラニン
Ｖａｌ　　　　　：バリン
Ｌｅｕ　　　　　：ロイシン
Ｉｌｅ　　　　　：イソロイシン
Ｓｅｒ　　　　　：セリン
Ｔｈｒ　　　　　：スレオニン
Ｃｙｓ　　　　　：システイン
Ｍｅｔ　　　　　：メチオニン
Ｇｌｕ　　　　　：グルタミン酸
Ａｓｐ　　　　　：アスパラギン酸
Ｌｙｓ　　　　　：リジン
Ａｒｇ　　　　　：アルギニン
Ｈｉｓ　　　　　：ヒスチジン
Ｐｈｅ　　　　　：フェニルアラニン
Ｔｙｒ　　　　　：チロシン
Ｔｒｐ　　　　　：トリプトファン
Ｐｒｏ　　　　　：プロリン
Ａｓｎ　　　　　：アスパラギン
Ｇｌｎ　　　　　：グルタミン
ｐＧｌｕ　　　　：ピログルタミン酸
【００７０】
本明細書の配列表記載の配列は以下のとおりである。
配列番号：１
ヒト型ＩＬ２０レセプタータンパク質のα鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２
ヒト型ＩＬ２０レセプタータンパク質のα鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を表す。
配列番号：３
ヒト型ＩＬ２０レセプタータンパク質のβ鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号：４
ヒト型ＩＬ２０レセプタータンパク質のβ鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を表す。
配列番号：５
実施例１で用いたプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：６
実施例１で用いたプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：７
実施例１で用いたプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：８
実施例１で用いたプローブの塩基配列を表す。
配列番号：９
ヒト型ＩＬ２０のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１０
ヒト型ＩＬ２０をコードするＤＮＡの塩基配列を表す。
【００７１】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
【００７２】
実施例１　大腸癌株におけるＩＬ２０受容体α鎖（ＩＬ２０ＲＡ）の発現解析
（１）細胞からのＲＮＡ　の抽出および　ｃＤＮＡ　合成
大腸癌細胞株は大日本製薬社において培養したものを購入して用いた。用いた大腸癌株は表１に示した。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　は　ＩｓｏＧｅｎ　を用いてメーカーの手順書に従って抽出精製した。抽出した　ＲＮＡ　は　ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　社）　のマニュアルに従って　ｆｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　を合成した。正常大腸　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　はＣｌｏｎｔｅｃｈ　社から購入した。ヒト臓器　ｐｏｌｙＡ　ＲＮＡ　はＣｌｏｎｔｅｃｈ　社から購入した。
【表１】

（２）ＴａｑＭａｎ　を用いた定量
合成したｃＤＮＡ　は　ＴＥ　に溶解し、５０　μｇ／ｍｌ　の　ｙｅａｓｔ　ｔＲＮＡ　を含む　ＴＥ　に６．６７　ｎｇ／μｌになるように希釈した。希釈したｃＤＮＡ溶液３．７５　μｌ（２５　ｎｇ　ＲＮＡ　相当）に対し、増幅反応試薬は、ＴａｑＭａｎ（商標）　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）、ＴａｑＭａｎ（商標）　Ｐｒｏｂｅ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を用い、１５　μｌの合計反応液量に調製した。各プライマー、プローブはＩＬ−２０　ＲＡ　の塩基配列（配列番号：２）を元に設計した配列番号：５〜配列番号：７のものを用い、最終濃度はマニュアルに従った。ＴａｑＭａｎ（商標）　ＰＣＲは、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（商標）７９００ＨＴ配列検出システム（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）で行い、使用した温度周期はＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）のマニュアルに従った。
増幅生成物の定量的ＴａｑＭａｎ解析は、７９００ＨＴ　ＳＤＳソフトウェア（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を用いて行った。コピー数は配列番号：８の　ｃＤＮＡ　を　ｓｔａｎｄａｒｄ　として求めた。
図１にそれぞれの細胞株におけるＩＬ−２０ＲＡ　の発現を示した。また、図２にヒト正常臓器における該分子の発現量を示した。
【００７３】
【発明の効果】
ＩＬ２０受容体、その部分ペプチドまたはその塩、またはＩＬ２０受容体もしくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、大腸癌などの予防及び／又は治療薬として有用である。
また、ＩＬ２０受容体、その部分ペプチドまたはその塩とＩＬ２０とを用いることによって、ＩＬ２０とＩＬ２０受容体またはその塩との結合性を変化させる化合物を効率良くスクリーニングでき、該化合物を大腸癌の予防・治療剤として使用することができる。
【００７４】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】各種細胞株におけるＩＬ２０受容体α鎖（ＩＬ２０ＲＡ）の発現を示す。
【図２】ヒト正常臓器でのＩＬ２０ＲＡの発現分布を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to the use of IL20, IL20 receptor and polynucleotides encoding them.
[0002]
[Prior art]
IL20 was discovered as a cytokine belonging to the IL10 family (Cell, 104, 9-19, 2001), and its expression was enhanced in psoriasis (Cell, 104, 9-19, 2001). It is known that abnormalities occur (Cell, 104, 9-19, 2001).
Further, DNA encoding the IL20 receptor has been isolated (Cell, 104, 9-19, 2001), and it has been reported that IL19 and IL24 bind to IL20 receptor in addition to IL20 ( The Journal of Immunology, 167 (7): 3545-9, 2001, Journal of Biological Chemistry, 277, pp 7341-7347, 2002). It has been reported that IL24 acts on cell proliferation in response to ras information (Journal of Biological Chemistry, 277, pp 7341-7347, 2002). Furthermore, it has also been reported that the expression of IL24 is enhanced in colorectal cancer (Annu. Rev. Biochem. 62, 851-891), but there is no description of the receptor that sends that signal.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to elucidate the function of the IL20 receptor and provide a new use of IL20 and the IL20 receptor.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention
(1) Prevention and / or prevention of colorectal cancer comprising an IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Therapeutic agents,
(2) A diagnostic agent for colorectal cancer comprising an antibody against the IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 ,
(3) prevention and treatment of colorectal cancer comprising an antibody against the IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; / Or therapeutic agent,
(4) a compound or a salt thereof that changes the binding property to an IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof or a salt thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with IL20 A prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer comprising:
(5) A compound or a salt thereof that changes the expression level of the IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer,
(6) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer,
(7) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Diagnostic agent for colorectal cancer,
(8) a base complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding an IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer comprising a polynucleotide comprising the sequence or a part thereof,
(9) a base complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding an IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Diagnostic agent for colon cancer comprising a polynucleotide comprising the sequence or a part thereof,
(10) Prevention and / or prevention of colorectal cancer comprising an IL20 receptor β-chain or a partial peptide thereof or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Therapeutic agents,
(11) A diagnostic agent for colorectal cancer comprising an antibody against the IL20 receptor β-chain or a partial peptide thereof or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 ,
(12) Prevention and treatment of colorectal cancer comprising an antibody against the IL20 receptor β chain or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 / Or therapeutic agent,
(13) A compound or a salt thereof that changes the binding property to an IL20 receptor β-chain or a partial peptide thereof or a salt thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as that of IL20 represented by SEQ ID NO: 3 A prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer comprising:
(14) a compound or a salt thereof that changes the expression level of the IL20 receptor β chain or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer,
(15) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a IL20 receptor β-chain or a partial peptide thereof having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer,
(16) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the IL20 receptor β-chain or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Diagnostic agent for colorectal cancer,
(17) a base complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the IL20 receptor β-chain or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 A prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer comprising a polynucleotide comprising the sequence or a part thereof,
(18) a base complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding an IL20 receptor β-chain or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Diagnostic agent for colon cancer comprising a polynucleotide comprising the sequence or a part thereof,
(19) a prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer comprising IL20 or a salt thereof,
(20) a diagnostic agent for colon cancer comprising an antibody against IL20 or a salt thereof,
(21) a prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer comprising an antibody against IL20 or a salt thereof,
(22) a prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer, comprising a compound that changes the expression level of IL20 or a salt thereof,
(23) a prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer comprising a polynucleotide containing a polynucleotide encoding IL20;
(24) a diagnostic agent for colorectal cancer comprising a polynucleotide containing a polynucleotide encoding IL20;
(25) a prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer comprising a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding IL20 or a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide comprising a part thereof;
(26) a diagnostic drug for colorectal cancer comprising a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding IL20 or a polynucleotide comprising a part thereof,
(27) (i) IL20 or a salt thereof, (ii) an IL20 receptor α-chain containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (Iii) IL20 or a salt thereof, using an IL20 receptor β-chain containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, its partial peptide or its salt, A method for screening for a prophylactic / therapeutic agent for colorectal cancer, comprising selecting a receptor α-chain or a salt thereof and / or a compound or a salt thereof that alters the binding to the IL20 receptor β-chain or a salt thereof;
(28) (i) IL20 or its salt, (ii) IL20 receptor α-chain containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide or its salt, and (Iii) Prevention of colorectal cancer comprising an IL20 receptor β-chain having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, a partial peptide thereof or a salt thereof・ Provide screening kits for therapeutic agents.
[0005]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
(protein)
The IL20 receptor α-chain used in the present invention is a receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
The IL20 receptor β chain used in the present invention is a receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
These IL20 receptor α-chain and IL20 receptor β-chain are known proteins described in (Cell, 104, 9-19, 2001). Hereinafter, the IL20 receptor α-chain and the IL20 receptor β-chain may be simply abbreviated as IL20 receptor.
IL20 used in the present invention is a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
Human IL20 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 (Cell, 104,
9-19, 2001).
IL20 and IL20 receptor can be, for example, any cells of humans and other mammals (eg, guinea pig, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) [eg, retinal cells, splenocytes, nerve cells, Glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells) , Natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, leukocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, Hepatocytes or stromal cells, or precursor cells, stem cells or cancer cells of these cells (eg, breast cancer cell line (GI-101), colon cancer cell line (CX-1, GI-112), lung) Cell line (LX-1, GI-117), ovarian cancer cell line (GI-102), prostate cancer cell line, etc.), or any tissue in which those cells exist, for example, brain, various parts of the brain ( Example, olfactory bulb, squamous nucleus, basal cerebral sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, hypothalamus nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital lobe, frontal lobe, temporal lobe, putamen, caudate nucleus, brain stain, black Quality), spinal cord, pituitary, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, Submandibular gland, peripheral blood, peripheral blood cells, prostate, testis, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc., or cells of the blood cell system or cultured cells thereof (for example, MEL, M1, CTLL-2, HT-2, WEHI-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, M OLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP- 1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG-01) or a synthetic protein.
[0006]
As used herein, “substantially identical amino acid sequence” refers to, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably the amino acid sequence to be compared. An amino acid sequence having about 95% or more homology.
Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; A protein having substantially the same activity as the protein consisting of the amino acid sequence represented by 1 is preferred.
Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 include, for example, a protein containing the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; A protein having substantially the same activity as the protein consisting of the amino acid sequence represented by 3 is preferred.
Examples of substantially the same activity include a ligand binding activity and a signal transduction effect. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, the activities such as ligand binding activity and signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). However, quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 include, for example, a protein containing the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9; A protein having substantially the same activity as the protein consisting of the amino acid sequence represented by 9 is preferred.
Examples of substantially equivalent activities include receptor binding activity and the like. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, it is preferable that the activities such as receptor binding activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the degree of activity of the protein and the molecular weight of the protein may be different.
The activities such as ligand binding activity, receptor binding activity and signal signal transduction can be measured according to known methods, for example, according to the screening method described later.
[0007]
As the IL20 receptor, (1) one or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more than 1 to 30 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3) Preferably, an amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids are deleted, and (2) one or more (preferably 1 to 30) amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 Amino acid sequence to which about 1, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5) amino acids have been added; (3) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 An amino acid sequence in which one or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5)) amino acids have been substituted with another amino acid; Also (4) a protein comprising the amino acid sequence comprising a combination thereof may be used.
As IL20, (1) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acid sequence, and (2) one or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, More preferably, an amino acid sequence to which several (1 to 5) amino acids have been added; (3) one or more (preferably about 1 to 30) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9; A protein comprising an amino acid sequence in which preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids have been substituted with another amino acid, or (4) an amino acid sequence combining them Domo used.
[0008]
In the present specification, the IL20 receptor or IL20 has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end in accordance with the convention of peptide labeling. IL-20 receptor or IL20 has a carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO) at the C-terminus. ⁻ ), Amide (-CONH ₂ )) Or an ester (—COOR).
Here, R in the ester is, for example, C, such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl. _1-6 Alkyl groups such as C, cyclopentyl, cyclohexyl, etc. _3-8 Cycloalkyl groups such as phenyl, α-naphthyl and the like; _6-12 Aryl groups, for example phenyl-C such as benzyl, phenethyl, etc. _1-2 An alkyl group or α-naphthyl-C such as α-naphthylmethyl _1-2 C such as an alkyl group _7-14 In addition to aralkyl groups, pivaloyloxymethyl groups commonly used as oral esters are used.
When the IL20 receptor or IL20 has a carboxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
Furthermore, in the IL20 receptor or IL20, the amino group of the N-terminal methionine residue in the protein described above is protected by a protecting group (for example, formyl group, acetyl or the like). _2-6 C such as alkanoyl group _1-6 Acyl group), a glutamyl group formed by cleavage of the N-terminal side in vivo and pyroglutamine oxidation, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, -OH, -SH, An amino group, an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc. are suitable protecting groups (for example, formyl group, C _2-6 C such as alkanoyl group _1-6 (Eg, an acyl group), or a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
Specific examples of the IL20 receptor α chain include, for example, a human IL20 receptor α chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
Specific examples of the IL20 receptor β chain include, for example, a human IL20 receptor β chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
Specific examples of IL20 include, for example, human IL20 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
The IL20 receptor, IL20 or a salt thereof can be produced from the above-mentioned method for purifying a receptor protein from human or mammalian cells or tissues, or contains a DNA encoding the IL20 receptor or IL20 described later. Can also be produced by culturing a transformant to be prepared. Further, the protein can also be produced according to the protein synthesis method described later or according thereto.
When producing from human or mammalian tissues or cells, the homogenized human or mammalian tissues or cells are extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.
[0009]
The partial peptide of the IL20 receptor (hereinafter, may be simply abbreviated as “partial peptide”) may be any peptide as long as it has a partial amino acid sequence of the IL20 receptor described above. Of the IL20 receptor molecules, those that are exposed outside the cell membrane and have substantially the same receptor binding activity as the IL20 receptor are used.
Specifically, as a partial peptide of the IL20 receptor α-chain having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the partial peptide of the IL20 receptor β-chain having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a cell obtained by hydrophobic plot analysis is used. It is a peptide containing a portion analyzed to be an outer region (hydrophilic site). Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
The number of amino acids in the partial peptide is preferably a peptide having an amino acid sequence of at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the above-mentioned constituent amino acid sequences of the IL20 receptor.
A substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology with these amino acid sequences. .
Here, “substantially the same receptor binding activity” has the same meaning as described above. "Substantially the same receptor binding activity" can be measured in the same manner as described above.
[0010]
In addition, the partial peptide has one or two or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the above amino acid sequence deleted, or the amino acid sequence thereof. Is added with one or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5)) amino acids, or One or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and still more preferably about 1 to 5) amino acids may be substituted with another amino acid.
The partial peptide has a carboxyl group (—COOH) and a carboxylate (—COO) ⁻ ), Amide (-CONH ₂ ) Or an ester (—COOR).
Further, similar to the above-mentioned IL20 receptor, the partial peptide has the amino group of the N-terminal methionine residue protected by a protecting group, and the Gln formed by cleavage of the N-terminal side in vivo is pyroglutamine oxidation. And those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide to which a sugar chain is bound.
Examples of the IL20 receptor or a partial peptide thereof, or a salt of IL20 include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
A partial peptide of the IL20 receptor or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method, or by cleaving the IL20 receptor with an appropriate peptidase. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the IL20 receptor with the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group. Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following a) to e).
a) M. Bodanszky and M.A. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
b) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
c) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
d) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory of Biochemistry 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
e) Supervision of Haruaki Yajima, Development of Continuing Drugs Volume 14 Peptide Synthesis Hirokawa Shoten
After the reaction, the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. When the partial peptide obtained by the above method is in a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and when it is obtained in a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be.
[0011]
(Polynucleotide)
The IL20 receptor or the polynucleotide encoding IL20 may be any as long as it contains the above-described base sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the IL20 receptor or IL20. The polynucleotide is an RNA such as a DNA or mRNA encoding the IL20 receptor or IL20, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
Using the IL20 receptor or a polynucleotide encoding IL20, the IL20 receptor or IL20 can be isolated by a known method described in, for example, “New PCR and Its Applications”, 15 (7), 1997, or a method analogous thereto. mRNA can be quantified.
The DNA encoding the IL20 receptor or IL20 may be any of a genomic DNA, a genomic DNA library, the above-described cell or tissue-derived cDNA, the above-described cell or tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, amplification can be directly carried out by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells or tissues described above.
Specifically, as the DNA encoding the IL20 receptor α-chain, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a high string Having a DNA that hybridizes under gentle conditions and having substantially the same activity (eg, ligand binding activity, signal transduction activity, etc.) as the IL20 receptor α-chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. DNA encoding a receptor protein having the same.
Specifically, as the DNA encoding the IL20 receptor β chain, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 and a high string Having a DNA that hybridizes under gentle conditions and having substantially the same activity as the IL20 receptor β chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (eg, ligand binding activity, signal transduction action, etc.) DNA encoding a receptor protein having the same.
Examples of the DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 under high stringency conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. DNA containing a base sequence having a homology of 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more is used.
Examples of the DNA encoding IL20 include a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 or a DNA that hybridizes under high stringent conditions to a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 And a DNA encoding a protein having substantially the same activity as IL20 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 (eg, ligand binding activity, signal information transduction action, etc.).
Examples of the DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 under high stringency conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 More preferably, a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more, more preferably about 95% or more is used.
[0012]
Hybridization can be performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
The “high stringent conditions” refer to, for example, conditions at a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C., preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
The term "polynucleotide comprising a part of the base sequence of DNA encoding IL20 receptor or IL20 or a part of a base sequence complementary to the DNA" of the present invention means the following part of IL20 receptor It is used to include not only DNA encoding a peptide but also RNA.
According to the present invention, an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the IL20 receptor gene or the IL20 gene is cloned or determined, and the DNA encoding the IL20 receptor or IL20 is determined. Can be designed and synthesized based on the nucleotide sequence information of Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize to the IL20 receptor gene or RNA of the IL20 gene, inhibit the synthesis or function of the RNA, or bind to the IL20 receptor-related RNA or IL20-related RNA. Can regulate and control the expression of the IL20 receptor gene or IL20 gene through the interaction of. Polynucleotides that are complementary to a selected sequence of an IL20 receptor-related RNA or IL20-related RNA, and that can specifically hybridize to an IL20 receptor-related RNA or an IL20-related RNA, are in vivo and in vitro. Are useful for regulating and controlling the expression of the IL20 receptor gene or the IL20 gene, and are also useful for treating or diagnosing diseases and the like. The term “corresponding” means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. "Corresponding" between a nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) as directed by the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. . 5 'end hairpin loop of the receptor protein gene, 5' end 6-base pair repeat, 5 'end untranslated region, polypeptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation termination codon, 3' end untranslated region, 3 The 'end palindrome region and the 3' end hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the receptor protein gene may be selected as a target.
As a means for cloning a DNA that completely encodes the IL20 receptor or a partial peptide thereof, or IL20 (hereinafter, sometimes abbreviated as the protein of the present invention), a DNA having a partial base sequence of the protein of the present invention is used. Amplification by PCR using synthetic DNA primers, or hybridization with DNA incorporated into an appropriate vector and labeled with a DNA fragment encoding a partial or entire region of the protein of the present invention or a synthetic DNA Can be sorted out. Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
[0013]
(Antisense polynucleotide)
The relationship between the target nucleic acid and a polynucleotide complementary to at least a part of the target region can be said to be "antisense" if the relationship between the target nucleic acid and a polynucleotide capable of hybridizing with the target is. Antisense polynucleotides include polynucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polynucleotides containing D-ribose, other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases, Alternatively, other polymers having a non-nucleotide backbone (eg, commercially available proteins, nucleic acids, and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing specialized linkages, such as those found in DNA or RNA Base pairing and nucleotides having a configuration that allows base attachment). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can also be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), or even known. Such as labeled, capped, methylated, one or more naturally-occurring nucleotides replaced by analogs, intramolecular nucleotides Modified, such as those having uncharged bonds (eg, methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.), charged or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.) ), Such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, Those having side chain groups such as syn, antibody, signal peptide, poly-L-lysine, etc. and sugars (eg, monosaccharide), those having intercalating compounds (eg, acridine, psoralen) Containing chelating compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), those containing alkylating agents, those having modified bonds (eg, α-anomeric nucleic acids) Etc.). Here, "nucleoside", "nucleotide", and "nucleic acid" may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or by functional groups such as ethers, amines, etc. It may have been converted.
[0014]
The antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of the modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives and thiophosphate derivatives of nucleic acids, and those that are resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides. The antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to make the antisense nucleic acid more cell permeable, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
A number of such modifications are known in the art, and Kawakami et al. , Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; T. Crooke et al. ed. , Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993.
The antisense nucleic acid of the present invention may contain altered or modified sugars, bases or bonds, may be provided in a special form such as liposomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be provided in an added form. Thus, in the form of addition, polycations such as polylysine which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, lipids which enhance the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids ( For example, hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol can be mentioned. Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond. Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. Such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
The inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the receptor protein. The nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
Since the antisense polynucleotide of the present invention can suppress the function of the protein of the present invention or the polynucleotide of the present invention (eg, DNA) in a living body, it is associated with, for example, IL20 receptor or IL20 dysfunction. It can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for the following diseases. Furthermore, the antisense polynucleotide of the present invention can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or expression of the DNA of the present invention in tissues or cells. It can be used for diagnosis of diseases associated with insufficiency.
[0015]
(DNA encoding partial peptide)
The DNA encoding the partial peptide of the IL20 receptor may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the IL20 receptor. In addition, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above cells or tissues, cDNA library derived from the above cells or tissues, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR) using an mRNA fraction prepared from the cells or tissues described above.
Specifically, the DNA encoding the partial peptide of the IL20 receptor α chain includes, for example,
(1) a DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(2) having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having substantially the same quality as the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA encoding a receptor protein having an activity (eg, ligand binding activity, signal transduction action, etc.) is used.
Specifically, examples of the DNA encoding the partial peptide of the IL20 receptor β chain include, for example,
(1) a DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4,
(2) having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and having substantially the same quality as the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; A DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA encoding a receptor protein having an activity (eg, ligand binding activity, signal transduction action, etc.) is used.
Examples of the DNA that hybridizes with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 under high stringency conditions include, for example, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. DNA containing a base sequence having a homology of 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more is used.
[0016]
(antibody)
An antibody against the IL20 receptor or its partial peptide or its salt, or IL20 or its salt (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention) recognizes the protein of the present invention or a cell containing the protein of the present invention. Any antibody that can be used may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
An antibody against the protein of the present invention can be produced according to a known antibody or antiserum production method using the protein of the present invention as an antigen.
[0017]
[Preparation of monoclonal antibody]
(A) Preparation of monoclonal antibody-producing cells
The protein of the present invention may be administered to a mammal at a site capable of producing an antibody upon administration, itself or together with a carrier or diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep and goats, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, a warm-blooded animal immunized with the antigen, for example, an individual having an antibody titer was selected from a mouse, and the spleen or lymph node was collected 2 to 5 days after the final immunization. By fusing the contained antibody-producing cells with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled receptor protein or the like described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0 and the like, and P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. Incubation at about 20 to 40 ° C., preferably about 30 to 37 ° C. for about 1 to 10 minutes allows efficient cell fusion.
[0018]
Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which an antigen such as a receptor protein is directly or adsorbed together with a carrier, and then added. A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like (an anti-mouse immunoglobulin antibody is used when the cells used for cell fusion are mice) or protein A A method of adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, adding a receptor protein or the like labeled with a radioactive substance or an enzyme, and detecting a monoclonal antibody bound to the solid phase. No.
The selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a known method or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in an animal cell culture medium to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as a hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1 to 10% fetal bovine serum, or serum-free for hybridoma culture A medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used. The culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. The culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
[0019]
(B) Purification of monoclonal antibody
Monoclonal antibodies can be separated and purified by immunoglobulin separation and purification methods [eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, specific purification method in which an antibody alone is collected using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to obtain the antibody. Can be performed according to
[0020]
(Preparation of polyclonal antibody)
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (antigen such as the protein of the present invention) and a carrier protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting the contents and separating and purifying the antibody.
Regarding a complex of an immunizing antigen and a carrier protein used to immunize a mammal, the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten should be such that the antibody can be efficiently produced against the hapten immunized by crosslinking the carrier. Any kind may be cross-linked at any ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of about 0.1 to 20 with respect to 1 hapten. Preferably, a method of coupling at a ratio of about 1 to 5 is used.
Various coupling agents can be used for coupling the hapten and the carrier, and glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times. The polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of the mammal immunized by the above method.
The measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. The separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
[0021]
[Uses for receptor proteins, DNA, etc.]
IL20 receptor and IL20, DNAs encoding them (hereinafter sometimes abbreviated as DNA of the present invention), antibodies to IL20 receptor and IL20 (hereinafter sometimes abbreviated as antibody of the present invention), the present invention (Hereinafter sometimes abbreviated as the antisense DNA of the present invention) and the like have the following uses.
[0022]
(1) An agent for preventing and / or treating a disease associated with IL20 receptor or IL20 dysfunction
Since the IL20 receptor α-chain is highly expressed in colorectal cancer cells, a) the IL20 receptor (α-chain or β-chain) or IL20, or b) the IL20 receptor or the DNA encoding IL20 was replaced with the IL20 receptor. Alternatively, it can be used as a medicament such as a preventive and / or therapeutic agent for dysfunction of IL20, particularly for colorectal cancer. For example, when there is a patient in whom the physiological action of IL20 cannot be expected (deficiency of IL20 receptor or IL20) due to a decrease in IL20 receptor or IL20 in a living body, To supplement the amount of the IL20 receptor or IL20, or b) (a) administering and expressing DNA encoding the IL20 receptor or IL20 to the patient; After inserting and expressing the DNA encoding the IL20 receptor, the amount of the IL20 receptor in the patient's body is increased by, for example, transplanting the cells into the patient, and the action of the IL20 receptor or IL20 is increased. Can be fully exhibited.
That is, the IL20 receptor or the DNA encoding IL20 is useful as a safe and low toxic dysfunction of the IL20 receptor or IL20, particularly as a preventive and / or therapeutic agent for colorectal cancer.
When the IL20 receptor or Il20 is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to conventional means.
On the other hand, when the DNA of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the DNA of the present invention is used alone or after insertion into an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, and the like. It can be implemented according to the means. The DNA of the present invention can be administered as it is or together with an auxiliary agent for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
For example, a) IL20 receptor or IL20, or b) DNA of the present invention can be administered orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules and the like, optionally coated with sugar or water or other water. It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions with pharmaceutically acceptable solutions, or suspensions. For example, a) the IL20 receptor or IL20, or b) the DNA of the invention is commonly found with known physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like. It can be manufactured by mixing in the unit dosage form required for formulation. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
[0023]
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) ^TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
[0024]
The prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like may be added. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
The dose of the IL20 receptor or IL20 of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. In the case of oral administration, for example, in a diabetic patient (as 60 kg), one dose is generally used. About 0.1 mg to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of an injection, for example, in a colon cancer patient (as 60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of 60 kg.
The dose of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, for example, in a colon cancer patient (60 kg), for example, about 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like. For example, usually in the form of an injection, for example, in a diabetic patient (as 60 kg), It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of 60 kg.
[0025]
(2) Diagnostic agent and diagnostic method using DNA of the present invention
The DNA and antisense DNA of the present invention can be used as a probe to produce an IL20 receptor or a portion thereof in a human or mammal (eg, rat, mouse, rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog, monkey, etc.). Abnormality (gene abnormality) of DNA or mRNA encoding a peptide can be detected, and thus, for example, gene diagnosis such as damage, mutation, or decreased expression of the DNA or mRNA, and increased or excessive expression of the DNA or mRNA Useful as an agent.
For example, the IL20 receptor or DNA encoding IL20 can be used as a diagnostic agent for colorectal cancer.
(3) A medicine comprising the antisense DNA of the present invention
The antisense DNA against the IL20 receptor or the DNA encoding IL20 can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases such as diseases caused by overexpression of the IL20 receptor or IL20 (eg, colorectal cancer).
For example, when using the antisense DNA, the antisense DNA can be used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, followed by a conventional method. The antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and can be administered using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
Furthermore, the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of expression thereof.
The above-described genetic diagnosis using the DNA or the antisense DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Processings). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, 2766-2770 (1989), etc. Can be.
For example, when the expression of IL20 receptor or IL20 is decreased or overexpressed by Northern hybridization, the disease is caused by dysfunction or overexpression of IL20 receptor or IL20, particularly colon cancer and the like. Can be diagnosed as likely to be present or likely to be affected in the future.
[0026]
(4) A method for screening a compound that changes the expression level of IL20 receptor or IL20
The DNA of the present invention can be used for screening for a compound that changes the expression level of IL20 receptor or IL20 by using it as a probe. That is, the present invention includes, for example, (i) (1) blood, (2) a specific organ, (3) a tissue or cell isolated from an organ, or (ii) a transformant of a non-human mammal. Provided is a method for screening a compound that changes the expression level of the IL20 receptor or IL20 by measuring the amount of the IL20 receptor or IL20 mRNA.
[0027]
The measurement of the amount of the IL20 receptor or IL20 mRNA is specifically performed as follows.
(I) For a normal or disease model non-human mammal (eg, mouse, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog, monkey, etc., more specifically, a cancer-bearing mouse, etc.), Blood, or specific organs (eg, brain, lung, large intestine, prostate, etc.) after a certain period of time after applying a physical stress (eg, immersion stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.) Or a tissue or cell isolated from an organ.
The mRNA of the protein of the present invention contained in the obtained cells can be quantified by, for example, extracting mRNA from cells or the like by a usual method and using, for example, a technique such as TaqMan PCR, and Northern blotting by known means. The analysis can also be performed by performing.
(Ii) A transformant expressing the IL20 receptor or IL20 is prepared according to the above-described method, and the IL20 receptor or IL20 mRNA contained in the transformant can be quantified and analyzed in the same manner.
[0028]
Screening for a compound that alters the expression level of the IL20 receptor or IL20 comprises:
(I) A given time (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 1 hour) before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal Before to 6 hours before) or after a certain time (after 30 minutes to 3 days, preferably after 1 hour to 2 days, more preferably after 1 hour to 24 hours), or at the same time as the drug or physical stress. After a certain period of time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours) after administration, the IL20 receptor or IL20 mRNA contained in the cells It can be done by quantifying and analyzing the amount,
(Ii) When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium, and after culturing for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days) Days after), the amount of IL20 receptor or IL20 mRNA contained in the transformant can be quantified and analyzed.
[0029]
The compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an action of changing the expression level of IL20 receptor or IL20, and specifically, (a) the expression level of IL20 receptor or IL20 To increase cell-stimulating activity via IL20 receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca ²⁺ Activity or inhibition that promotes release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP inhibition, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. (B) a compound that attenuates the cell stimulating activity by decreasing the expression level of the IL20 receptor or IL20.
Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be novel compounds or known compounds.
The compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for enhancing the biological activity of IL20 receptor or IL20.
The compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for decreasing the IL20 receptor or the physiological activity of IL20.
The compound that changes the expression level of the IL20 receptor or IL20 obtained by the above screening method can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for colon cancer and the like.
[0030]
(5) An agent for preventing and / or treating various diseases containing a compound that changes the expression level of IL20 receptor or IL20
The compound that alters the expression level of the IL20 receptor or IL20 can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with IL20 receptor or IL20 dysfunction.
When the compound is used as an agent for preventing and / or treating a disease associated with the above-mentioned IL20 receptor or IL20 dysfunction, for example, colorectal cancer, it can be formulated according to a conventional method.
[0031]
(6) Screening method and screening kit for compounds (agonists, antagonists, etc.) that alter the binding between IL20 receptor (α-chain and β-chain) and IL20
By using an IL20 receptor or the like or constructing an expression system for a recombinant receptor protein or the like and using a receptor binding assay system using the expression system, the binding between the ligand and the IL20 receptor or the like is changed. Compounds (eg, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof can be efficiently screened.
IL20 is used as a ligand for the IL20 receptor. Specifically, human IL20 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and the like are used. Further, as the ligand, a compound or a salt thereof that changes the binding between IL20 and the IL20 receptor can also be used. The compound or a salt thereof that alters the binding between IL20 and the IL20 receptor can be obtained, for example, by using IL20 as a ligand and performing the scouring method of the present invention described below. Further, IL24, IL19 and the like can also be used as ligands. Hereinafter, these ligands are collectively referred to simply as ligands.
Compounds that alter the binding between the ligand and the IL20 receptor include (a) cell stimulating activities (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca ²⁺ Activity or inhibition that promotes release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP inhibition, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. (B) a compound having no cell stimulating activity (a so-called antagonist to IL20 receptor), (c) a compound having a ligand and a receptor protein of the present invention. Includes compounds that enhance the binding force, or (d) compounds that decrease the binding force between the ligand and the IL20 receptor (the compound (a) is preferably screened by the ligand determination method described above). ).
That is, the present invention relates to (i) the case where an IL20 receptor or its partial peptide or a salt thereof is brought into contact with a ligand, and (ii) the case where the IL20 receptor or its partial peptide or a salt thereof is brought into contact with a ligand and a test compound. Provided is a method for screening a compound or a salt thereof, which changes the binding property between a ligand and an IL20 receptor or a partial peptide thereof or a salt thereof, wherein the compound is compared with the case of contact.
The screening method of the present invention is characterized in that, in the cases (i) and (ii), for example, the amount of binding of the ligand to the receptor protein or the like, the cell stimulating activity and the like are measured and compared.
[0032]
More specifically, the present invention provides
(I) The amount of binding of the labeled ligand to the receptor protein or the like is measured when the labeled ligand is brought into contact with the IL20 receptor or the like and when the labeled ligand and a test compound are brought into contact with the IL20 receptor or the like. A method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property between a ligand and an IL20 receptor or the like,
(Ii) When the labeled ligand is brought into contact with a cell containing the IL20 receptor or the like or a membrane fraction of the cell, and when the labeled ligand and the test compound are brought into contact with the cell containing the IL20 receptor or the like or the membrane of the cell. Measuring the amount of the labeled ligand bound to the cell or the membrane fraction when contacted with the fraction, and comparing the ligand with the IL-20 receptor or the like. Salt screening method,
(Iii) When the labeled ligand is brought into contact with a receptor protein or the like expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention, When the transformed transformant is contacted with an IL20 receptor or the like expressed on a cell membrane by culturing the transformant, the amount of the labeled ligand bound to the receptor protein or the like is measured, and the ligand is characterized by being compared. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property to an IL20 receptor or the like,
[0033]
(Iv) When a compound (eg, a ligand) that activates an IL20 receptor or the like is brought into contact with a cell containing the IL20 receptor or the like, a compound that activates the IL20 receptor or the like and a test compound are compared with the IL20 receptor. And the like, when they are brought into contact with cells containing, for example, receptor-mediated cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca ²⁺ Activity or inhibition that promotes release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP inhibition, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. And a method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property between a ligand and an IL20 receptor or the like, characterized by measuring and comparing
(V) when a compound (eg, a ligand) that activates an IL20 receptor or the like is brought into contact with an IL20 receptor or the like expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention; Receptor-mediated cell stimulating activity when a compound activating IL20 receptor or the like and a test compound are brought into contact with an IL20 receptor or the like expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention. (For example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca ²⁺ Activity or inhibition that promotes release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP inhibition, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. And a method for screening for a compound or a salt thereof that alters the binding property between a ligand and an IL20 receptor or the like, characterized in that the activity of the compound is measured and compared.
The specific description of the screening method of the present invention is as follows.
First, the IL20 receptor or the like used in the screening method of the present invention may be any as long as it contains the above-mentioned IL20 receptor or the like, but the mammalian organ containing the IL20 receptor or the like may be used. Are preferred. However, since human organs are particularly difficult to obtain, human receptor proteins and the like that are expressed in large amounts using recombinants are suitable for screening.
The above-mentioned method is used for producing the receptor protein of the present invention, but it is preferably carried out by expressing the DNA of the present invention in mammalian cells or insect cells. A complementary DNA is used as the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited thereto. For example, a gene fragment or a synthetic DNA may be used. In order to introduce a DNA fragment encoding the IL20 receptor into host animal cells and express them efficiently, the DNA fragment is required to be expressed by a nuclear polyhedrosis virus (NPV) belonging to a baculovirus using an insect as a host. ), It is preferable to incorporate the promoter into the downstream of the polyhedrin promoter, SV40-derived promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, SRα promoter and the like. The quantity and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the literature [Nambi, P .; Et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992].
In the screening method of the present invention, the one containing the IL20 receptor or the like may be a receptor protein or the like purified according to a known method, or a cell containing the receptor protein or the like may be used. Alternatively, a membrane fraction of a cell containing the receptor protein or the like may be used.
[0034]
In the case of using a cell containing an IL20 receptor or the like in the screening method of the present invention, the cell may be immobilized with glutaraldehyde, formalin, or the like. The immobilization method can be performed according to a known method.
The cell containing the IL20 receptor or the like refers to a host cell that has expressed the receptor protein or the like, and the host cell is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, or the like.
The cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by crushing cells and then obtained by a known method. As a method for crushing the cells, a method of crushing the cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, crushing with a Waring blender or a polytron (manufactured by Kinematica), crushing with an ultrasonic wave, ejection of the cells from a thin nozzle while applying pressure by a French press or the like. Crushing and the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (generally about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. The precipitate is the membrane fraction. The membrane fraction contains a large amount of expressed receptor proteins and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
The amount of the receptor protein in cells or membrane fractions containing the receptor protein etc. is 10 per cell. ³ -10 ⁸ Preferably a molecule ⁵ -10 ⁷ Preferably it is a molecule. The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which makes it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples in the same lot. .
[0035]
In order to carry out the above (1) to (3) for screening for a compound that changes the binding property between a ligand and an IL20 receptor, for example, an appropriate IL20 receptor fraction and a labeled ligand are required. is there.
The IL20 receptor fraction is preferably a natural IL20 receptor fraction or a recombinant IL20 receptor fraction having an activity equivalent thereto. Here, “equivalent activity” refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
As the labeled ligand, a labeled ligand, a labeled ligand analog compound, or the like is used. For example, [ ³ H], [ ¹²⁵ I], [ ¹⁴ C], [ ³⁵ S] or the like.
Specifically, to screen for a compound that alters the binding between a ligand and an IL20 receptor or the like, cells containing the IL20 receptor or the like or a membrane fraction thereof are suspended in a buffer suitable for screening. Prepare a receptor protein standard by turbidity. The buffer may be any buffer such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer such as Tris-HCl buffer that does not inhibit the binding between the ligand and the receptor protein. Further, in order to reduce non-specific binding, CHAPS, Tween-80 are used. ^TM Surfactants such as (Kao-Atlas), digitonin and deoxycholate can also be added to the buffer. Furthermore, a protease inhibitor such as PMSF, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), pepstatin and the like can be added for the purpose of suppressing the degradation of the receptor or ligand by the protease. A fixed amount (5000 cpm to 500,000 cpm) of the labeled ligand is added to 0.01 ml to 10 ml of the receptor solution, and 10 ^-4 M-10 ^-10 M test compounds are allowed to coexist. A reaction tube containing a large excess of unlabeled ligand is also prepared to determine the amount of non-specific binding (NSB). The reaction is carried out at about 0 ° C. to 50 ° C., preferably about 4 ° C. to 37 ° C., for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the mixture is filtered with a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. Count when there is no antagonist (B ₀ ) Minus the amount of non-specific binding (NSB) (B ₀ -NSB) as 100%, a test compound having a specific binding amount (B-NSB) of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance having competitive inhibitory ability.
[0036]
In order to carry out the above-mentioned methods (4) to (5) for screening a compound that alters the binding property between a ligand and an IL20 receptor or the like, for example, a cell stimulating activity via a receptor protein (for example, arachidonic acid release) , Acetylcholine release, intracellular Ca ²⁺ Activity or inhibition that promotes release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP inhibition, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. Activity) can be measured using a known method or a commercially available measurement kit.
Specifically, first, cells containing the IL20 receptor or the like are cultured in a multiwell plate or the like. Before performing screening, the cells were exchanged with a fresh medium or an appropriate buffer that was not toxic to cells, and a test compound was added and incubated for a certain period of time. The product is quantified according to the respective method. When the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of cell stimulating activity is difficult due to a degrading enzyme contained in a cell, an assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. In addition, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
In order to perform screening by measuring cell stimulating activity, cells expressing an appropriate IL20 receptor are required. As a cell expressing the IL20 receptor or the like, a cell line having a natural IL20 receptor or the like, a cell line expressing the above-mentioned recombinant receptor protein or the like is desirable.
As the test compound, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts and the like are used. Or a known compound.
As the test compound, a compound designed to bind to the ligand binding pocket based on the atomic coordinates of the active site of the IL20 receptor and the position of the ligand binding pocket is preferably used. The measurement of the atomic coordinates of the active site of the IL20 receptor and the position of the ligand binding pocket can be performed using a known method or a method analogous thereto.
[0037]
A screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding property between a ligand and an IL20 receptor or the like includes a membrane fraction of cells containing the IL20 receptor or the like, or cells containing the IL20 receptor or the like. And the like.
Examples of the screening kit of the present invention include the following.
1. Screening reagent
(1) Measurement buffer and washing buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco) plus 0.05% bovine serum albumin (manufactured by Sigma).
The solution may be sterilized by filtration through a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C., or may be prepared at use.
(2) IL20 receptor preparation
CHO cells expressing the IL20 receptor were placed in a 12-well plate at 5 × 10 5 ⁵ Passage at 37 ° C, 5% CO ₂ , Cultured at 95% air for 2 days.
(3) Labeled ligand
Commercially available [ ³ H], [ ¹²⁵ I], [ ¹⁴ C], [ ³⁵ S]
The aqueous solution is stored at 4 ° C. or −20 ° C., and diluted to 1 μM with a measuring buffer before use.
(4) Ligand standard solution
The ligand is dissolved in PBS containing 0.1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma) to a concentration of 1 mM and stored at -20 ° C.
[0038]
2. Measurement method
(1) The CHO cells expressing IL20 receptor cultured on a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of the measurement buffer, and then 490 μl of the measurement buffer is added to each well.
(2) 10 ^-3 -10 ^-10 After adding 5 μl of the M test compound solution, 5 μl of the labeled ligand is added, and reacted at room temperature for 1 hour. To determine the amount of non-specific binding, 10 ^-3 Add 5 μl of M ligand.
(3) Remove the reaction solution and wash three times with 1 ml of washing buffer. The labeled ligand bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS, and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
(4) Radioactivity is measured using a liquid scintillation counter (manufactured by Beckman), and Percent Maximum Binding (PMB) is determined by the following equation.
PMB = [(B-NSB) / (B ₀ −NSB)] × 100
PMB: Percent Maximum Binding
B: Value when the sample was added
NSB: Non-specific Binding (Non-specific binding amount)
B ₀ : Maximum binding amount
[0039]
The compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound having an action of changing the binding property between a ligand and an IL20 receptor or the like. Cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca ²⁺ Activity or inhibition that promotes release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP inhibition, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. (2) a compound having no cell-stimulating activity (a so-called antagonist against IL20 receptor), (3) a binding force between a ligand and the IL20 receptor. Or (4) a compound that decreases the binding force between the ligand and the IL20 receptor.
Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be novel compounds or known compounds.
An agonist for the IL20 receptor or the like has an action similar to the physiological activity of the above-mentioned ligand for the IL20 receptor or the like, and is useful as a safe and low-toxic drug according to the physiological activity.
An antagonist to the IL20 receptor or the like can suppress the physiological activity of the ligand for the IL20 receptor or the like, and is therefore useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the physiological activity.
A compound that enhances the binding force between the ligand and the IL20 receptor is useful as a safe and low-toxicity drug for enhancing the physiological activity of the ligand for the IL20 receptor and the like.
A compound that decreases the binding force between the ligand and the IL20 receptor is useful as a safe and low-toxicity drug for reducing the physiological activity of the ligand for the IL20 receptor and the like.
[0040]
The compound having a function of altering the binding property between a ligand and an IL20 receptor or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is useful, for example, as a prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer. is there.
(7) A preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound that changes the binding property between an IL20 receptor and a ligand (agonist, antagonist, etc.)
Compounds (agonists and antagonists) that alter the binding between IL20 receptor and IL20 and IL20 can be used as prophylactic and / or therapeutic agents for diseases associated with IL20 receptor dysfunction, such as colon cancer.
When the compound or ligand is used as a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with IL20 receptor dysfunction, it can be formulated according to conventional methods as described above.
[0041]
(8) Quantification of proteins and the like using the antibodies of the present invention, diagnostic agents containing the antibodies of the present invention, and diagnostic methods using the same
Since the antibody of the present invention can specifically recognize the IL20 receptor or IL20, the quantification of the IL20 receptor or IL20 in the test solution, in particular, the sandwich immunoassay, the competition method, the immunometric method, or the nephrometry It can be used for quantification and the like.
[0042]
In applying these individual immunological measurement methods to the measurement method of the present invention, no special conditions, operations, and the like need to be set. What is necessary is just to construct the measuring system of IL20 receptor, IL20, or those salts by adding the usual technical considerations of those skilled in the art to the usual conditions and procedures in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, and the like. For example, Hiroe Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (Medical Shoin, Showa Ed. Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (2nd edition) (Issue Shoin, 1982), Eiji Ishikawa et al. “Enzyme Immunoassay” (3rd Edition), Ishikawa, Showa 1962, “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), ibid., Vol. 73 (Immunochemical Technologies (Part B)), ibid., Vol. 74 (Immunochemical Technologies (Part C)), ibid., Vol. 84 (Immunochemical Technologies (Part D: Selected Immunoassays)), ibid., Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid., Vol. 121 (Academic Press), WO 00/14227, p. 39, No. 8, EP-A, No. 121, p. Page 19, line 35 to page 20, line 47 can be referred to.
As described above, by using the antibody of the present invention, IL20 receptor, IL20 or a salt thereof can be quantified with high sensitivity.
Furthermore, by quantifying IL20 receptor, IL20 and salts thereof in a living body using the antibody of the present invention, it is possible to diagnose various diseases related to IL20 receptor or IL20 dysfunction.
For example, if an increase or decrease in the concentration of the IL20 receptor is detected by quantifying the concentration of the IL20 receptor using an antibody against the IL20 receptor, for example, due to dysfunction or overexpression of the IL20 receptor It can be diagnosed that the patient is likely to suffer from a disease, particularly colorectal cancer, or is likely to suffer in the future.
Further, the antibody of the present invention can be used for specifically detecting an IL20 receptor or IL20 present in a subject such as a body fluid or a tissue. In addition, preparation of an antibody column used for purifying IL20 receptor or IL20, detection of IL20 receptor or IL20 in each fraction at the time of purification, analysis of behavior of IL20 receptor or IL20 in test cells, etc. Can be used for
[0043]
(9) A method for screening a compound that changes the amount of IL20 receptor or its partial peptide in a cell membrane
Since the antibody of the present invention can specifically recognize the IL20 receptor or its partial peptide or its salt, it can be used for screening for a compound that changes the amount of the IL20 receptor or its partial peptide in the cell membrane.
That is, the present invention, for example,
(I) After disrupting (a) blood, (b) a specific organ, and (c) tissue or cells isolated from an organ of a non-human mammal, a cell membrane fraction is isolated and contained in the cell membrane fraction. A method for screening a compound that changes the amount of the IL20 receptor or its partial peptide in the cell membrane by quantifying the IL20 receptor or its partial peptide,
(Ii) After disrupting a transformant or the like expressing the IL20 receptor or its partial peptide, isolating the cell membrane fraction and quantifying the IL20 receptor or its partial peptide contained in the cell membrane fraction, A method for screening a compound that alters the amount of the IL20 receptor or a partial peptide thereof,
(Iii) A section of (a) blood, (b) a specific organ, (c) a tissue or a cell isolated from an organ of a non-human mammal, and then using immunostaining, the section on the cell surface is obtained. Provided is a method for screening a compound that changes the amount of the IL20 receptor or a partial peptide thereof in a cell membrane by confirming the protein on the cell membrane by quantifying the degree of staining of the receptor protein.
(Iv) Transformants or the like expressing the IL20 receptor or its partial peptide are sectioned, and the degree of staining of the receptor protein on the cell surface is quantified by using an immunostaining method. And a method of screening for a compound that alters the amount of the IL20 receptor or its partial peptide in the cell membrane by confirming said protein.
[0044]
The quantification of the IL20 receptor or its partial peptide contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
(I) For a normal or disease model non-human mammal (eg, mouse, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog, monkey, etc., more specifically, a cancer-bearing mouse, etc.), Blood, or specific organs (eg, brain, lung, large intestine, prostate, etc.) after a certain period of time after applying a physical stress (eg, immersion stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.) Or a tissue or cell isolated from an organ. The obtained organ, tissue or cell is suspended in, for example, an appropriate buffer (eg, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hepes buffer, etc.), and the organ, tissue or cell is destroyed. Activator (eg, Triton X100 ^TM , Tween 20 ^TM And the like, and further using a method such as centrifugation, filtration, or column fractionation to obtain a cell membrane fraction.
[0045]
The cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by crushing cells and then obtained by a known method. As a method for crushing the cells, a method of crushing the cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, crushing with a Waring blender or a polytron (manufactured by Kinematica), crushing with an ultrasonic wave, ejection of the cells from a thin nozzle while applying pressure by a French press or the like. Crushing and the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (generally about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. The precipitate is the membrane fraction. The membrane fraction contains a large amount of expressed receptor proteins and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
[0046]
The IL20 receptor or its partial peptide contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western blot can be performed by known means.
[0047]
(Ii) A transformant expressing the IL20 receptor or its partial peptide is prepared according to the method described above, and the IL20 receptor or its partial peptide contained in the cell membrane fraction can be quantified.
[0048]
Screening for a compound that alters the amount of the IL20 receptor or its partial peptide in the cell membrane is performed by:
(I) A given time (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 1 hour) before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal Before to 6 hours before) or after a certain time (after 30 minutes to 3 days, preferably after 1 hour to 2 days, more preferably after 1 hour to 24 hours), or at the same time as the drug or physical stress. After a certain period of time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours) after administration, the amount of IL20 receptor or its partial peptide in the cell membrane By quantifying
(Ii) When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium, and after culturing for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days) Days later) by quantifying the amount of IL20 receptor or its partial peptide in the cell membrane.
[0049]
The confirmation of the IL20 receptor or its partial peptide contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
(Iii) Normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits, cancer-bearing A drug (eg, an anti-dementia drug, a blood pressure lowering drug, an anti-cancer drug, an anti-obesity drug, etc.) or a physical stress (eg, waterlogging stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), etc. After a lapse of time, blood or a specific organ (eg, brain, lung, large intestine, etc.), or tissue or cells isolated from the organ is obtained. The obtained organ, tissue or cell is cut into a tissue section according to a conventional method, and immunostaining is performed using the antibody of the present invention. Confirming the protein on the cell membrane by quantifying the degree of staining of the receptor protein on the cell surface, and quantitatively or qualitatively confirming the amount of the IL20 receptor or its partial peptide in the cell membrane Can be.
(Iv) It can also be confirmed by using a similar method using a transformant or the like that expresses the IL20 receptor or a partial peptide thereof.
[0050]
The compound or its salt obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an action of changing the amount of IL20 receptor or its partial peptide in the cell membrane, and specifically, (a) IL20 receptor in the cell membrane Alternatively, by increasing the amount of the partial peptide, cell stimulating activity via the receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca ²⁺ Activity or inhibition that promotes release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP inhibition, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. (B) a compound that attenuates the cell stimulating activity by decreasing the amount of the IL20 receptor or its partial peptide in the cell membrane.
Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be novel compounds or known compounds.
The compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for enhancing the physiological activity of the IL20 receptor and the like.
The compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for decreasing the physiological activity of IL20 receptor and the like.
[0051]
(10) Compound that changes the amount of IL20 receptor or its partial peptide in cell membrane, and agent for preventing and / or treating various diseases containing the compound
As described above, the IL20 receptor is considered to play an important role in vivo, for example. Therefore, a compound that alters the amount of the IL20 receptor or its partial peptide in the cell membrane can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the IL20 receptor.
For example, a compound that alters the amount of IL20 receptor in the cell membrane can be used as a preventive and / or therapeutic agent for a disease (eg, colorectal cancer) caused by dysfunction or overexpression of the IL20 receptor.
When the compound is used as a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction or overexpression of IL20 receptor, it can be formulated according to the above-mentioned conventional means.
[0052]
(11) A medicine containing an IL20 receptor or an antibody against IL20
A neutralizing antibody against the IL20 receptor or its partial peptide, IL20 or a salt thereof has an activity associated with the IL20 receptor or IL20, for example, an activity of inactivating a signal transduction function. Therefore, when the antibody has a neutralizing activity, the IL20 receptor or signaling involved in IL20, for example, a cell stimulating activity via the IL20 receptor (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca ²⁺ Activity or inhibition that promotes release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP inhibition, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. Activity, etc.) can be inactivated. Therefore, such an antibody can be used for prevention and / or treatment of a disease caused by overexpression of the IL20 receptor or IL20.
For example, the IL20 receptor or a neutralizing antibody against IL20 can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases caused by overexpression of the IL20 receptor or IL20 (eg, colorectal cancer).
The preparation of the prophylactic / therapeutic agent of the present invention can be prepared in the same manner as the preparation containing the IL20 receptor described above.
[0053]
(12) Production of the DNA-introduced animal of the present invention
The present invention relates to a non-human mammal having a foreign DNA of the present invention (hereinafter abbreviated as the foreign DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the foreign mutant DNA of the present invention). provide.
That is, the present invention
[1] a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
[2] the animal of [1], wherein the non-human mammal is a rodent;
[3] the animal of [2], wherein the rodent is a mouse or a rat, and
[4] It is to provide a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or its mutant DNA and capable of being expressed in mammals.
Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as the DNA-transferred animal of the present invention) can be used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like. And preferably at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the stage of single cells or fertilized eggs and generally before the 8-cell stage), the calcium phosphate method, the electric pulse method, the lipofection method, the agglutination method, It can be produced by introducing a target DNA by a microinjection method, a particle gun method, a DEAE-dextran method, or the like. Further, by the DNA introduction method, the exogenous DNA of the present invention can be introduced into somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like. The DNA-transfected animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned germ cells with a cell fusion method known per se.
As the non-human mammal, for example, cow, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat and the like are used. Among them, rodents, which are relatively short in ontogeny and biological cycle in terms of preparation of disease animal model systems, and are easy to breed, especially mice (for example, hybrids such as C57BL / 6 strain and DBA2 strain as pure strains) B6C3F as a system ₁ System, BDF ₁ System, B6D2F ₁ Strain, BALB / c strain, ICR strain, etc.) or rat (eg, Wistar, SD etc.) is preferred.
"Mammals" in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
[0054]
The exogenous DNA of the present invention refers to the DNA of the present invention once isolated and extracted from a mammal, not the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal.
As the mutant DNA of the present invention, those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution with another base, etc. The resulting DNA or the like is used, and also includes abnormal DNA.
The abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal IL20 receptor, and for example, a DNA that expresses a receptor protein that suppresses the function of a normal IL20 receptor is used.
The exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest. When introducing the DNA of the present invention into a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells. For example, when the human DNA of the present invention is introduced, DNAs derived from various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology thereto are expressed. Highly expressing the DNA of the present invention by microinjecting a DNA construct (eg, vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters that can be made into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. DNA-introduced mammals can be created.
[0055]
Examples of IL20 receptor expression vectors include Escherichia coli-derived plasmids, Bacillus subtilis-derived plasmids, yeast-derived plasmids, bacteriophages such as λ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, and animal viruses such as vaccinia virus or baculovirus. Is used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast is preferably used.
Examples of the promoter for controlling the DNA expression include, for example, (a) a promoter of a DNA derived from a virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.); ) Promoters derived from various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acid Protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor β, keratins K1, K10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, dystrophy Fin, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (commonly abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, metallothionein I and IIA, metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), peptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β actin , Α and β myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α A Chin, pre-pro-enkephalin A, such as a promoter, such as vasopressin is used. Among them, a cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the body, a human peptide chain elongation factor 1α (EF-1α) promoter, a human and chicken β-actin promoter, and the like are preferable.
The vector preferably has a sequence that terminates transcription of a target messenger RNA in a DNA-transfected mammal (generally called a terminator). For example, a sequence of each DNA derived from a virus and various mammals can be used. A simian virus SV40 terminator or the like is preferably used.
[0056]
In addition, a splicing signal of each DNA, an enhancer region, a part of an intron of a eukaryotic DNA, and the like are placed 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or between the translation region for the purpose of further expressing the desired foreign DNA. It is also possible to connect 3 ′ downstream of the above depending on the purpose.
The translated region of the normal IL20 receptor is derived from liver, kidney, thyroid cells, fibroblast-derived DNA from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) and commercially available DNAs. All or a part of genomic DNA can be obtained from various genomic DNA libraries, or complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cell, or fibroblast-derived RNA can be used as a raw material. The foreign abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating a normal IL20 receptor translation region obtained from the above-described cells or tissues by a point mutagenesis method.
The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in an introduced animal by a usual DNA engineering technique in which the translation region is ligated downstream of the promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
Introduction of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the introduction of the DNA means that all progeny of the produced animal will retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells. means. The offspring of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells.
The non-human mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been introduced can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. .
Introduction of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA introduction means that all the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. Means Progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all offspring can be bred to have the DNA in excess.
[0057]
The non-human mammal having the normal DNA of the present invention, in which the normal DNA of the present invention is highly expressed, eventually develops hyperactivity of the IL20 receptor by promoting the function of endogenous normal DNA. Can be used as a disease model animal. For example, using the normal DNA-introduced animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of IL20 receptor hyperfunction and IL20 receptor-related diseases and to examine methods for treating these diseases. is there.
In addition, since the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been introduced has an increased symptom of the released IL20 receptor, it can be used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with the IL20 receptor.
On the other hand, a non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in an ordinary breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. Furthermore, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-described plasmid and used as a source material. The DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. Introduction of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA introduction means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. A homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed the cells so that all offspring have the DNA.
[0058]
The non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention expresses the abnormal DNA of the present invention at a high level, and finally inhibits the function of endogenous normal DNA to thereby inactivate the function of IL20 receptor or IL20. It may cause type refractory disease and can be used as a disease state model animal. For example, using the abnormal DNA-introduced animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of IL20 receptor or IL20 function-inactive refractory disease and to examine a method for treating this disease.
Also, as a specific possibility, the abnormal DNA-highly expressing animal of the present invention is characterized in that the abnormal receptor protein of the present invention inhibits the function of a normal receptor protein in the IL20 receptor or IL20 inactive refractory disease (dominant negative). Action).
Further, since the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been introduced has an increased symptom of the released IL20 receptor or IL20, the mammal is also subjected to a therapeutic drug screening test for IL20 receptor or IL20 functional inactive refractory disease. Available.
In addition, other possible uses of the two kinds of the DNA-introduced animals of the present invention include, for example,
(A) use as a cell source for tissue culture;
(B) by specifically analyzing the DNA or RNA in the tissue of the DNA-transfected animal of the present invention, or by specifically analyzing the IL20 receptor or IL20 expressed by the DNA, to specifically express or express the IL20 receptor or IL20; Analysis for activating IL20 receptor or association with IL20,
(C) culturing cells of DNA-bearing tissue by standard tissue culture techniques and using them to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture;
(D) screening for an agent that enhances the function of the cell by using the cell described in (c) above, and
(E) Isolation and purification of the mutant receptor protein of the present invention and production of its antibody may be considered.
Furthermore, using the DNA-introduced animal of the present invention, it is possible to examine clinical symptoms of IL20 receptor or IL20-related diseases, including IL20 receptor or IL20 dysfunction-type refractory disease. More detailed pathological findings in the body or in each organ of the IL20-related disease model can be obtained, which can contribute to the development of new treatment methods, and further to the study and treatment of secondary diseases caused by the disease.
In addition, it is possible to take out each organ from the DNA-introduced animal of the present invention, cut it into small pieces, and then use a proteolytic enzyme such as trypsin to obtain the released DNA-introduced cells, culture them, or systematize the cultured cells. . Furthermore, the specificity of IL20 receptor-producing cells or IL20-producing cells, the relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism therein can be examined, and their abnormalities can be examined. It is an effective research material for elucidating its action.
Furthermore, in order to develop a therapeutic agent for a disease associated with IL20 receptor or IL20, including IL20 receptor or IL20 dysfunction type refractory disease, using the DNA-transfected animal of the present invention, the above-described test method is used. It is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease by using the method and the quantitative method. Further, using the DNA-introduced animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a DNA treatment method for a disease associated with IL20 receptor or IL20.
[0059]
(13) Knockout animal
The present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
That is, the present invention
[1] a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated,
[2] the embryonic stem cell according to [1], wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli);
[3] the embryonic stem cell according to [1], which is neomycin-resistant;
[4] the embryonic stem cell according to [1], wherein the non-human mammal is a rodent;
[5] the embryonic stem cell of [4], wherein the rodent is a mouse;
[6] a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, wherein the DNA is inactivated;
[7] The DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention [6]. The non-human mammal according to the item,
[8] the non-human mammal according to [6], wherein the non-human mammal is a rodent;
[9] the non-human mammal of [8], wherein the rodent is a mouse, and
[10] A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to the animal according to [7] and detecting the expression of a reporter gene. I will provide a.
A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is a DNA which is artificially mutated to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, thereby suppressing the expression ability of the DNA, or By substantially losing the activity of the IL20 receptor encoded by the DNA, the DNA substantially lacks the ability to express the IL20 receptor (hereinafter, may be referred to as the knockout DNA of the present invention). Refers to embryonic stem cells of human mammals (hereinafter abbreviated as ES cells).
As the non-human mammal, the same one as described above is used.
The method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique. With these mutations, the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
[0060]
Specific examples of the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA-inactivated ES cells of the present invention or the knockout ES cells of the present invention) include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene or a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl). A reporter gene or the like typified by a transferase gene) to disrupt the exon function, or insert a DNA sequence that terminates gene transcription into an intron between exons (for example, a polyA addition signal); Inability to synthesize complete messenger RNA Thus, a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to eventually destroy the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the resulting ES cells PCR using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and using the DNA sequence on the targeting vector and the DNA sequence in the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector as primers And selecting the knockout ES cells of the present invention.
As the ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like, for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufma method. It may be a newly established one. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129-line ES cells are generally used. For example, for the purpose of obtaining ES cells in which BDF is clearly known, for example, BDF in which the number of eggs collected by C57BL / 6 mice or C57BL / 6 has been improved by hybridization with DBA / 2 ₁ Mouse (F of C57BL / 6 and DBA / 2) ₁ ) Can also be used favorably. BDF ₁ In addition to the advantage that the number of eggs collected and the eggs are robust, the mice have C57BL / 6 mice as a background, and thus, the ES cells obtained using the C57BL / 6 mice were used to produce C57BL / 6 mice. / 6 mice can be advantageously used in that the genetic background can be replaced by C57BL / 6 mice by backcrossing.
In addition, when ES cells are established, blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. In addition, a large number of blastocysts can be efficiently obtained by collecting embryos at the 8-cell stage and culturing them until blastocysts are used. Early embryos can be obtained.
Either male or female ES cells may be used, but generally male ES cells are more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor.
[0061]
As a method for determining the sex of ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in a sex-determining region on the Y chromosome by a PCR method can be mentioned. If this method is used, it is conventionally necessary to perform about 10 karyotype analyses. ⁶ Since the number of ES cells is required, the number of ES cells of about 1 colony (approximately 50) is sufficient, so that primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by discriminating between male and female. In addition, by enabling selection of male cells at an early stage, labor in the initial stage of culture can be significantly reduced.
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes in the obtained ES cells is desirably 100% of the normal number. However, when it is difficult due to physical operations at the time of establishment, after knocking out the gene of the ES cells, the normal cells (for example, chromosomes in mice) are knocked out. It is desirable to clone again into cells (number 2n = 40).
The embryonic stem cell line obtained in this way usually has very good growth properties, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ontogenic ability. For example, on a suitable feeder cell such as STO fibroblast, in the presence of LIF (1-10000 U / ml) in a carbon dioxide incubator (preferably, 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% The cells are cultured by a method such as culturing at about 37 ° C. in carbon dioxide gas and 90% air. At the time of subculture, for example, a trypsin / EDTA solution (usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5 mM EDTA, Preferably, a method is used in which cells are converted into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA and seeded on newly prepared feeder cells. Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal muscle, visceral muscle, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. [M. J. Evans and M.E. H. Kaufman, Nature, 292, 154, 1981; R. Martin Proc. Of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; C. Doetschman, et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, Vol. 87, p. 27, 1985], that the DNA-deficient cell of the present invention obtained by differentiating the ES cell of the present invention is characterized by in vitro It is useful in IL20 receptor or cell biology of IL20 receptor.
[0062]
The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
As the non-human mammal, those similar to the aforementioned can be used.
The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is, for example, a DNA in which the targeting vector prepared as described above is introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the targeting vector is inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by homologous recombination.
Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used as a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and the DNA of the present invention derived from the mouse used for the targeting vector. It can be determined by analysis by PCR using a DNA sequence of a nearby region other than DNA as a primer. When non-human mammalian embryonic stem cells are used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of non-human mammalian cells. The chimeric embryo is injected into an animal embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal. The produced animal is a chimeric animal comprising both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention. When a part of the germ cells of the chimeric animal has a mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by judging coat color or the like. The individual thus obtained is usually an individual having a heterozygous expression of the IL20 receptor, and mating individuals with a heterozygous expression of the IL20 receptor. Obtainable.
[0063]
In the case of using an egg cell, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg by a microinjection method, and these transgenic non-human mammals can be obtained. Compared to mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
In this manner, the individual in which the DNA of the present invention is knocked out can be bred in an ordinary breeding environment after confirming that the DNA of the animal obtained by the breeding is also knocked out.
Further, the acquisition and maintenance of the germ line may be performed according to a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that there are one normal animal and one homozygote. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
The non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention.
In addition, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the IL20 receptor, and thus can be a model for a disease caused by inactivation of the biological activity of the IL20 receptor. Therefore, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
[0064]
(14a) A method for screening a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention
The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention.
That is, the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and observing and measuring a change in the animal. Provided is a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / prophylactic effect against a disease.
Examples of the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention used in the screening method include the same as described above.
Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like. These compounds are novel compounds. Or a known compound.
Specifically, a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with an untreated control animal, and tested using changes in each organ, tissue, disease symptoms, etc. of the animal as an index. The therapeutic / preventive effects of the compounds can be tested.
As a method of treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. The dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
[0065]
In the screening method, when a test compound is administered to a test animal, when the cancer tissue of the test animal is reduced by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more, the test compound is treated as a cancer. Can be selected as compounds having a therapeutic / preventive effect on
The compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a safe and low-toxic treatment / prevention for diseases (eg, colorectal cancer) caused by deficiency or damage of IL20 receptor. It can be used as a medicine such as an agent. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). ) Is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
A medicament containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned medicament containing a compound that alters the binding property between an IL20 receptor and a ligand.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, when the compound is orally administered, generally, for example, in a colon cancer patient (as 60 kg), About 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of an injection, for example, in a colon cancer patient (as 60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of 60 kg.
[0066]
(14b) A method for screening a compound that promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention
The present invention provides a compound which promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and detecting the expression of a reporter gene, or a compound thereof. A method for screening a salt is provided.
In the above-mentioned screening method, the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene, A reporter gene that can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
Examples of the test compound include the same compounds as described above.
As the reporter gene, the same one as described above is used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
In a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is replaced with a reporter gene, since the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention, the expression of the substance encoded by the reporter gene is traced. By doing so, the activity of the promoter can be detected.
For example, when a part of the DNA region encoding the IL20 receptor is replaced with a β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli, the β-galactosidase gene originally expressed in a tissue expressing the IL20 receptor instead of the β-galactosidase gene instead of the IL-20 receptor. Galactosidase is expressed. Therefore, for example, by staining with a reagent serving as a β-galactosidase substrate such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal), IL20 receptor can be easily obtained. The expression state of the body in the animal body can be observed. Specifically, an IL20 receptor-deficient mouse or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with a phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or around 37 ° C. After reacting for about 30 minutes to 1 hour, the β-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with a 1 mM EDTA / PBS solution, and the color may be observed. Further, mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.
The compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). ) Is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
[0067]
Since the compound of the present invention or a salt thereof that promotes the promoter activity for DNA can promote the expression of IL20 receptor or IL20 and promote the function of IL20 receptor or IL20, for example, IL20 receptor or IL20 can be promoted. It is useful as a medicament such as a preventive and / or therapeutic drug for diseases associated with dysfunction.
Since the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits promoter activity against DNA inhibits the expression of IL20 receptor or IL20 and can inhibit the function of the receptor protein, for example, overexpression of IL20 receptor or IL20 It is useful as a medicament such as a prophylactic and / or therapeutic drug for diseases related to the disease.
Specifically, a compound that promotes or inhibits the promoter activity of the IL20 receptor or the DNA encoding IL20 is useful, for example, as a prophylactic and / or therapeutic agent for colon cancer and the like.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
[0068]
A drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing a compound that alters the binding between the IL20 receptor or a salt thereof and a ligand.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject to be administered, the administration route, and the like.For example, when a compound that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention is orally administered, generally, for example, For a colon cancer patient (as 60 kg), the dose is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of injection, for example, in prostate cancer patients (60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of 60 kg.
As described above, the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention, It can greatly contribute to investigating the cause of various diseases caused or developing preventive and / or therapeutic drugs.
Also, using a DNA containing the IL20 receptor or the promoter region of IL20, genes encoding various proteins are ligated downstream of the DNA and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (transgenic animal). By preparing, it is possible to specifically synthesize the receptor protein and examine its action in a living body. Furthermore, by binding an appropriate reporter gene to the above promoter portion and establishing a cell line that expresses the reporter gene, a low molecule having an action of specifically promoting or suppressing the ability of the IL20 receptor or IL20 itself to be produced in the body. It can be used as a compound search system.
[0069]
(Display of abbreviation)
In the present specification, when bases, amino acids, compounds, and the like are indicated by abbreviations, indications are made based on the abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or abbreviations commonly used in the art, and examples thereof are described below. In addition, when an amino acid can take an optical isomer, it represents an L-form unless otherwise specified.
DNA: deoxyribonucleic acid
cDNA: complementary deoxyribonucleic acid
a or A: adenine
t or T: thymine
g or G: guanine
c or C: cytosine
u or U: uracil
RNA: ribonucleic acid
mRNA: messenger ribonucleic acid
dATP: deoxyadenosine triphosphate
dTTP: deoxythymidine triphosphate
dGTP: deoxyguanosine triphosphate
dCTP: deoxycytidine triphosphate
ATP: Adenosine triphosphate
Gly: glycine
Ala: Alanine
Val: Valine
Leu: Leucine
Ile: Isoleucine
Ser: Serine
Thr: Threonine
Cys: cysteine
Met: methionine
Glu: glutamic acid
Asp: Aspartic acid
Lys: lysine
Arg: Arginine
His: histidine
Phe: phenylalanine
Tyr: Tyrosine
Trp: Tryptophan
Pro: Proline
Asn: Asparagine
Gln: Glutamine
pGlu: pyroglutamic acid
[0070]
The sequences described in the sequence listing in the present specification are as follows.
SEQ ID NO: 1
2 shows the amino acid sequence of the α-chain of the human IL20 receptor protein.
SEQ ID NO: 2
1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the α chain of human IL20 receptor protein.
SEQ ID NO: 3
2 shows the amino acid sequence of the β chain of the human IL20 receptor protein.
SEQ ID NO: 4
2 shows the base sequence of DNA encoding the β chain of human IL20 receptor protein.
SEQ ID NO: 5
1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
SEQ ID NO: 6
1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
SEQ ID NO: 7
1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
SEQ ID NO: 8
2 shows the nucleotide sequence of a probe used in Example 1.
SEQ ID NO: 9
2 shows the amino acid sequence of human IL20.
SEQ ID NO: 10
1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding human IL20.
[0071]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but this does not limit the scope of the present invention.
[0072]
Example 1 Expression analysis of IL20 receptor α-chain (IL20RA) in colon cancer cell lines
(1) Extraction of RNA from cells and cDNA synthesis
The colon cancer cell line was purchased from Dainippon Pharmaceutical Co. and used. The colon cancer strains used are shown in Table 1. Total RNA was extracted and purified using IsoGen according to the manufacturer's protocol. The extracted RNA was used to synthesize first strand cDNA according to the manual of SuperScript II (Invitrogen). Normal colon total RNA was purchased from Clontech. Human organ polyA RNA was purchased from Clontech.
[Table 1]

(2) Quantification using TaqMan
The synthesized cDNA was dissolved in TE and diluted to 6.67 ng / μl in TE containing 50 μg / ml yeast tRNA. For 3.75 μl of the diluted cDNA solution (corresponding to 25 ng RNA), the amplification reaction reagent was TaqMan ™ Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.), TaqMan ™ Probe Kit (Applied Biosystems Japan) The total reaction volume was adjusted to 15 μl using the following method. The primers and probes used were those of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 7 designed based on the base sequence of IL-20 RA (SEQ ID NO: 2), and the final concentrations were in accordance with the manual. TaqMan ™ PCR was performed on an ABI PRISM ™ 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems Japan KK), and the temperature cycle used was TaqMan ™ Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems Japan KK) manual. Followed.
Quantitative TaqMan analysis of the amplification products was performed using 7900HT SDS software (Applied Biosystems Japan). The copy number was determined using the cDNA of SEQ ID NO: 8 as a standard.
FIG. 1 shows the expression of IL-20RA in each cell line. FIG. 2 shows the expression level of the molecule in normal human organs.
[0073]
【The invention's effect】
The IL20 receptor, its partial peptide or its salt, or the DNA encoding the IL20 receptor or its partial peptide is useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for colon cancer and the like.
Further, by using IL20 and its partial peptide or its salt and IL20, a compound that changes the binding property between IL20 and IL20 receptor or its salt can be efficiently screened, and the compound can be used for the prevention and treatment of colorectal cancer. It can be used as a therapeutic.
[0074]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the expression of the IL20 receptor α-chain (IL20RA) in various cell lines.
FIG. 2 shows the expression distribution of IL20RA in normal human organs.

Claims

A prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer, comprising an IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.

A diagnostic agent for colorectal cancer comprising an antibody against the IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof or a salt thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.

Prevention and / or treatment of colorectal cancer comprising an antibody against the IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Agent.

A compound or a salt thereof that changes the binding property to an IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof or a salt thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as that of IL20 represented by SEQ ID NO: 1. An agent for preventing and / or treating colorectal cancer.

A colorectal cancer comprising a compound that changes the expression level of the IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof; Prophylactic and / or therapeutic agents.

A colorectal cancer comprising a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Prophylactic and / or therapeutic agents.

A colorectal cancer comprising a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Diagnostics.

A nucleotide sequence complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding an IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or A prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer comprising a polynucleotide comprising a part thereof.

A nucleotide sequence complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding an IL20 receptor α-chain or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or A diagnostic agent for colorectal cancer comprising a polynucleotide comprising a part thereof.

A prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer comprising an IL20 receptor β-chain or a partial peptide thereof or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.

A diagnostic agent for colorectal cancer, comprising an antibody against the IL20 receptor β-chain or a partial peptide thereof or a salt thereof, having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.

Prevention and / or treatment of colorectal cancer comprising an antibody against IL20 receptor β-chain or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Agent.

It contains a compound or a salt thereof that changes the binding property to IL20 receptor β chain or a partial peptide thereof or a salt thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as that of IL20 represented by SEQ ID NO: 3. An agent for preventing and / or treating colorectal cancer.

Colorectal cancer comprising a compound or a salt thereof that changes the expression level of the IL20 receptor β-chain or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Prophylactic and / or therapeutic agents.

Colorectal cancer comprising a polynucleotide containing a polynucleotide encoding an IL20 receptor β-chain or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Prophylactic and / or therapeutic agents.

Colorectal cancer comprising a polynucleotide containing a polynucleotide encoding an IL20 receptor β-chain or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Diagnostics.

A nucleotide sequence complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the IL20 receptor β chain or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or A prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer comprising a polynucleotide comprising a part thereof.

A nucleotide sequence complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the IL20 receptor β chain or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or A diagnostic agent for colorectal cancer comprising a polynucleotide comprising a part thereof.

An agent for preventing and / or treating colorectal cancer, comprising IL20 or a salt thereof.

A diagnostic agent for colorectal cancer, comprising an antibody against IL20 or a salt thereof.

An agent for preventing and / or treating colorectal cancer, comprising an antibody against IL20 or a salt thereof.

An agent for preventing and / or treating colorectal cancer, comprising a compound that changes the expression level of IL20 or a salt thereof.

A prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer comprising a polynucleotide containing a polynucleotide encoding IL20.

A diagnostic agent for colorectal cancer comprising a polynucleotide containing a polynucleotide encoding IL20.

A prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer comprising a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding IL20 or a part thereof.

A diagnostic agent for colorectal cancer, comprising a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding IL20 or a part thereof.

(I) IL20 or a salt thereof, (ii) an IL20 receptor α-chain containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (iii) Using an IL20 receptor β-chain containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, its partial peptide or its salt, IL20 or its salt, and its IL20 receptor α A method for screening a prophylactic / therapeutic agent for colorectal cancer, which comprises selecting a chain or a salt thereof and / or a compound or a salt thereof that alters the binding to the IL20 receptor β chain or a salt thereof.

(I) IL20 or a salt thereof, (ii) an IL20 receptor α-chain containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (iii) A prophylactic / therapeutic agent for colorectal cancer, comprising an IL20 receptor β-chain containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, a partial peptide thereof or a salt thereof. Screening kit.