JP2004043446A

JP2004043446A - Histone deacetylase inhibitor and use thereof

Info

Publication number: JP2004043446A
Application number: JP2003134665A
Authority: JP
Inventors: Osamu Nakanishi; 中西　理; Takayuki Tatamiya; 畳家　貴之
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2002-05-15
Filing date: 2003-05-13
Publication date: 2004-02-12

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new apoptosis inducer and to provide a method for screening an apoptosis inducer. <P>SOLUTION: This invention relates to the apoptosis inducer to inhibit HDAC6 such as an antisense oligonucleotide to the gene of histone deacetylase 6 (HDAC6), an anticancer agent containing the apoptosis inducer and a method for the screening of an apoptosis inducing substance to suppress HDAC6, more particularly, a method for screening an apoptosis inducing substance. The method comprises the step of (1) determining whether or not a test substance inhibits histone deacetylase 6 (HDAC6) by using deaectylation of an acetylated substance that can be a substrate for histone deacetylase 6 (HDAC6) or decrease in the expression of histone deacetylase 6 (HDAC6) as an index and (2) confirming, when inhibition is present, whether it induces apoptosis of the cell in vitro and/or in vivo. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アポトーシス誘導剤及びそのスクリーニング方法に関する。このアポトーシス誘導剤は抗癌剤として有望である。
【０００２】
【従来の技術】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、遺伝子の発現制御に重要な働きをしていることが明らかになっている（Ｋｈｏｃｈｂｉｎ　Ｓ，　Ｖｅｒｄｅｌ　Ａ，　Ｌｅｍｅｒｃｉｅｒ　Ｃ，　Ｓｅｉｇｎｅｕｒｉｎ−Ｂｅｒｎｙ　Ｄ．　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｈｉｓｔｏｎｅ　ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．　Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｇｅｎｅｔ　Ｄｅｖ．　２００１　Ａｐｒ；　１１（２）：　１６２−６）。ヒトのヒストンデアセチラ−ゼには多数のアイソザイムが存在し、クラスＩ（ＨＤＡＣアイソザイム１、２、３及び８）、クラスＩＩ（ＨＤＡＣアイソザイム４、５、６及び７）、並びにクラスＩＩＩ　（ＳＩＲＴアイソザイム１、２、３、４、５、６及び７）に分類される。この内、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）は、他のアイソザイムが核に存在するのと異なり細胞質内に存在する。したがってヒストンを本来の基質としえない、トリコスタチンＡにより阻害される、構造がユニークである、などの点で他のアイソザイムと異なる性質を有する。
【０００３】
細胞分裂に重要な役割を果たす微小管は、その構成たんぱく質の一つとしてα−チューブリンを含んでおり、このタンパク質は、タキソールなどにより微小管が安定化されると、アセチル化を受けることが知られている（Ｐｉｐｅｒｎｏ，　Ｇ．，　ＬｅＤｉｚｅｔ，　Ｍ．　＆　Ｃｈａｎｇ，　Ｘ．−ｊ．　（１９８７）　Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ　α−ｔｕｂｕｌｉｎ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１０４，　２８９−３０２）。したがって、細胞質内にはα−チューブリンにアセチル基を付加する酵素（α−チューブリンアセチル化酵素）（α−チューブリンアセチラーゼ）とα−チューブリンに付加したアセチル基を除去する酵素（α−チューブリン脱アセチル化酵素）（α−チューブリンデアセチラーゼ）が存在すると考えられる。
【０００４】
α−チューブリンのアセチル化が微小管の安定化に寄与することが知られている（Ｐｉｐｅｒｎｏ，　Ｇ．，　ＬｅＤｉｚｅｔ，　Ｍ．　＆　Ｃｈａｎｇ，　Ｘ．−ｊ．　（１９８７）　Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ　α−ｔｕｂｕｌｉｎ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１０４，　２８９−３０２）。しかしながら、ヒストンデアセチラ−ゼ６（ＨＤＡＣ６）は、α−チューブリンに対する脱アセチル化酵素であるが、ＨＤＡＣ６を阻害することにより、細胞にアポトーシスが惹起されることは知られていない。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　Ｄｅｖ．　２００１　Ａｐｒ；　１１（２）　：　１６２０１６６　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　１０４，　２８９−３０２
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アポトーシスを惹起させることにより抗癌効果を生ずるアポトーシス誘導剤及び当該アポトーシス誘導剤を有効成分とする抗癌剤、並びにアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法を提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒストンデアセチラ−ゼ（ＨＤＡＣ）の多数のアイソザイムの内、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）のみが細胞質に存在し、その生来の基質がヒストンではありえないこと等に注目し、種々検討の結果、ＨＤＡＣ６がα−チューブリンのデアセチラーゼ酵素であることを確認した。更にＨＤＡＣ６を抑制してα−チューブリンのアセチル化を亢進させて微小管を安定化することにより、細胞にアポトーシスを惹起させることが出来ることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
したがって本発明は、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）を抑制する物質を含んでなる、アポトーシス誘導剤を提供する。このヒストンアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）を抑制する物質としては、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）自体を阻害する物質であってもよく、またヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）の生成（合成）を抑制する物質であってもよい。ヒストンデアセチラーゼ６の合成を抑制する物質の一例としては、核酸またはペプチドが挙げられ、この核酸としては、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムが挙げられる。
【０００９】
本発明はまた、ＨＤＡＣ６を抑制するアポトーシス誘導物質のスクリーニング方法であって、
（１）　被験物質がヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）を抑制するか否かを、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）の基質となり得るアセチル化物質の脱アセチル化又はヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）の発現の減少を指標として決定し、
（２）　抑制する場合には更に、インビトロ及び／又はインビボで細胞にアポトーシスを引き起こすか否かを確認する、
ことを含んでなる方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明においては先ず、ＨＤＡＣ６がα−チューブリンの脱アセチル化酵素であることを確認した。このため、ＨＤＡＣ６をコードするｃＤＮＡを哺乳動物細胞用発現ベクターにクローニングし（実施例１）、この発現ベクターを宿主細胞に導入し、この細胞内でＨＤＡＣ６を過剰発現させ、α−チューブリンのアセチル化の程度を観察した。ＨＤＡＣ６がα−チューブリンの脱アセチル化酵素であれば、過剰発現したＨＤＡＣ６によってα−チューブリンのアセチル基が除去されるため細胞内のアセチル化されたα−チューブリンの量が減少するはずである。なお、ＨＤＡＣ６をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に示し、そしてそれによりコードされるアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００１１】
この結果、ＨＤＡＣ６を過剰発現させた場合アセチル化の程度が５０％程度減少したが、ＨＤＡＣ６を発現しないベクター（Ｈｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＡＳ）及びベクターのみを細胞に導入した場合にはα−チューブリンのアセチル化の程度は減少しなかった。この結果、ＨＤＡＣ６がα−チューブリンの脱アセチル化酵素である事が証明された。
【００１２】
次に、ＨＤＡＣ６の細胞内での発現を低下させる方法を検討した。その一例として、ＨＤＡＣ６の遺伝子の発現を抑制する方法として、ＨＤＡＣ６のｍＲＮＡに対して相補的なホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）による発現抑制を試みた。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、ＨＤＡＣ６の翻訳開始コドンＡＴＧを含む配列に相補的な３種類のオリゴヌクレオチド、すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチド１：ＣＡＴＡＧＴＴＧＡＧ　ＧＡＧＧＣＴＴＧＧＣ（配列番号：３）、アンチセンスオリゴヌクレオチド２：ＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧ　ＴＴＧＡＧＧＴＣＡＴ（配列番号：４）及びアンチセンスオリゴヌクレオチド３：ＧＧＴＴＧＡＧＧＴＣ　ＡＴＡＧＴＴＧＡＧＧ（配列番号：５）、並びにＡＴＧの上流の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド４：ＣＣＣＴＧＣＣＧＣＧ　ＧＴＴＣＴＴＣＣＡＣ（配列番号：６）及びＡＴＧの下流の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド５：ＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴ　ＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡ（配列番号：７）を用いた。
【００１３】
更に、ポリＡ付加シグナル配列（配列番号：１における塩基４０８２−４０８７）を含む上流側の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド６：ＴＴＴＡＴＴＡＣＡＴ　ＡＴＧＣＡＡＣＣＴＴ（配列番号：８）及びポリＡ付加シグナル配列を含む下流側の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド７：ＡＡＣＡＧＣＴＴＧＴ　ＡＣＴＴＴＡＴＴＡＣ（配列番号：９）、第一触媒領域（配列番号：１中における塩基３５２−１３０５）中の保存されたアスパラギン酸とヒスチジン残基（ＤＨ）に対応する配列を含む下流側の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド８：ＣＣＴＴＧＡＣＣＧＴ　ＧＧＴＧＣＡＣＡＴＣ（配列番号：１０）及び前記ＤＨに対応する配列を含む上流側の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド９：ＧＴＧＧＴＧＣＡＣＡ　ＴＣＣＣＡＡＴＣＴＡ（配列番号：１１）、並びに第二触媒領域（配列番号：１における塩基１５３７−２４７５）中の保存されたＤＨに対応する配列を含む下流側の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１０：ＣＣＡＴＴＡＣＣＧＴ　ＧＧＴＧＧＡＣＡＴＣ（配列番号：１２）及び前記ＤＨに対応する配列を含む上流側の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１１：ＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡ　ＴＣＣＣＡＡＴＣＣＡ（配列番号：１３）を用いた。
【００１４】
更に、ＨＤＡＣ６のｍＲＮＡの全領域を網羅するため、配列番号：１の塩基１−２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１２：ＣＧＣＴＣＣＴＣＡＧ　ＧＧＧＡＣＴＧＣＣＣ（配列番号：１４）、塩基５０１−５２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１３：ＡＣＡＴＣＡＧＣＴＣ　ＴＴＣＣＴＴＴＴＣＡ（配列番号：１５）、塩基１００１−１０２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１４：ＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡ　ＴＴＧＡＴＧＧＴＡＴ（配列番号：１６）、塩基１５０１−１５２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１５：ＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧ　ＴＣＡＧＧＡＴＴＧＧ（配列番号：１７）、
【００１５】
塩基２００１−２０２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１６：ＴＣＣＧＴＡＧＧＧＣ　ＡＴＧＣＣＣＡＣＴＧ（配列番号：１８）、塩基２５０１−２５２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１７：ＴＧＧＣＡＧＧＧＴＣ　ＡＧＣＡＧＧＧＧＴＧ（配列番号：１９）、塩基３００１−３０２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１８：ＡＧＣＧＴＧＧＣＴＣ　ＣＣＣＣＡＡＣＡＧＣ（配列番号：２０）、塩基３５０１−３５２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド１９：ＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧ　ＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡ（配列番号：２１）及び塩基４００１−４０２０の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド２０：ＴＡＴＣＡＧＣＴＣＣ　ＣＴＣＴＴＧＧＧＧＣ（配列番号：２２）を用いた。
【００１６】
その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチド１〜５、アンチセンスオリゴヌクレオチド８〜１１、並びにアンチセンスオリゴヌクレオチド１６に遺伝子の発現を抑制する効果、すなわちＨＤＡＣ６の産生の低下が認められた。また、ＨＤＡＣ６の産生の低下と共にα−チューブリンのアセチル化が亢進する事が確認された。
そこで、α−チューブリンのアセチル化を亢進する効果を有する事が確認されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを癌細胞に導入すると、細胞質中で微小管が安定化し、またアポトーシスが生じていることが観察された。ＨＤＡＣ阻害剤として知られているトリコスタチンＡも同様の結果をもたらすことが確認された。
【００１７】
以上の実験結果から、ＨＤＡＣ６を抑制する物質はアポトーシスを誘導し、抗癌剤として有用である事が合理的に推定される。従ってまた、ＨＤＡＣ６の活性を抑制する物質を、α−チューブリンの脱アセチル化及び／又はアセチル化を指標として選択することにより、アポトーシス誘導物質及び抗癌剤の検索を行う事が可能である。
ＨＤＡＣ６を抑制する物質には、酵素であるＨＤＡＣ６を阻害する酵素阻害剤と、ＨＤＡＣ６の生成（合成）を抑制する物質が考えられるので、それらを検索する方法としては、酵素としてのＨＤＡＣ６を阻害する酵素阻害剤を検索する方法と、ＨＤＡＣ６の発現、即ち生成（合成）を抑制する物質を検索する方法とがある。
【００１８】
ＨＤＡＣ６に対する酵素阻害剤の検索のためには、酵素であるＨＤＡＣ６と、その基質となり得るアセチル化物質と被験物質を反応せしめ、基質の脱アセチル化を指標とすれば良い。そして、被験物質が脱アセチル化を阻害する場合、その被験物質はアポトーシス誘導剤と推定される。ＨＤＡＣ６の基質となり得るアセチル化物質は、例えば、アセチル化α−チューブリン、アセチル化ヒストンまたはリジン残基をアセチル化した合成ペプチドなどを挙げる事ができる。脱アセチル化を検出する方法は検出が可能であれば特に限定されないが、アセチル化α−チューブリンを基質として用いる場合は、アセチル化α−チューブリンの減少及び／又は遊離される酢酸又は脱アセチル化α−チューブリンの増加等を測定すればよい。また、酵素阻害剤の検索の為に、ＨＤＡＣ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ、ＡＫ−５００（ＢＩＯＭＯＬ社）や、ＨＤＡＣ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＣｙｃＬｅｘ社）を使用する事もできる。
【００１９】
また、ＨＤＡＣ６の発現を抑制する物質を検索するには、ＨＤＡＣ６を発現している細胞、例えば動物細胞を、被検物質の存在下及び非存在下で培養し、被検物質の存在下で培養した細胞中のＨＤＡＣ６のタンパク量及び／またはｍＲＮＡ量が、被検物質の非存在下で培養した細胞中のＨＤＡＣ６のタンパク量及び／またはｍＲＮＡ量よりも減少している場合は、その被検物質はＨＤＡＣ６の発現抑制物質であり、従ってアポトーシス誘導剤であると推定すれば良い。
【００２０】
ＨＤＡＣ６のタンパク量はウエスタンブロット法等により、ｍＲＮＡの量はノーザンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲ法等によって検出する事が出来る。また、細胞を被検物質の存在下及び非存在下で培養し、被検物質の存在下で培養した細胞中のアセチル化α−チューブリンとα−チューブリンとの比率とを比較し、被検物質の非存在下で培養した細胞中のアセチル化α−チューブリンの比率に比べて、被検物質の存在下で培養した細胞中のアセチル化α−チューブリンの比率が高い場合に、その被検物質はＨＤＡＣ６の発現抑制物質であり、従ってアポトーシス誘導剤であると推定することもできる。
【００２１】
上記の細胞としては、ＨＤＡＣ６を発現している細胞であれば特に限定されないが、動物細胞、特にヒトの培養細胞が好ましく、特に癌細胞が好ましく、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＬ−６０細胞、Ａ５４９細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬｏＶｏ細胞、ＳＷ４８０細胞、Ｃａｌｕ−１細胞などが挙げられ、特にＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬｏＶｏ細胞、ＳＷ４８０細胞、Ｃａｌｕ−１細胞が好ましい。また、クローニングしたＨＤＡＣ６をコードするＤＮＡを人為的に導入してＨＤＡＣ６を過剰発現するように遺伝子操作した細胞を用いてもよい。
【００２２】
【実施例】
次に、実施例により、本発明を更に具体的に説明する。
実施例１．
全ＲＮＡの単離
ＨＤＡＣ６をコードするｃＤＮＡを、ＨＤＡＣ６のコード領域を３分割する事によりクローニングした。ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０で培養し、５００Ｘｇ　５分間の遠心分離で回収した。回収した１　Ｘ　１０^６個の細胞を１ｍｌのＴＲＩｚｏｌｅ　ｒｅｇｅｎｔ　（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）に溶解し、そこに２００μｌのクロロホルムを加え懸濁し、水層を回収した。回収した水層に５００μｌのイソプロピルアルコールを加えて混和し、１２０００Ｘｇにて１０分間遠心分離し、全ＲＮＡを沈殿させた。沈殿させた全ＲＮＡを７５％エタノールでリンスし、軽く風乾後５０μｌの水に溶解させた。２６０ｎｍの波長でＲＮＡ濃度を測定し、使用時まで−８０℃で保存した。
【００２３】
ＨＤＡＣ６をコードするｃＤＮＡのクローニング
単離したＨＬ−６０細胞の全ＲＮＡを用い、逆転写反応を行なった。反応には、ＧｉｂｃｏＢＲＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩを使用し、ＴａＫａＲａ　ＲＮＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１に含まれているＲａｎｄｏｍ　９　ｍｅｒｓをプライマーとして０．５μｇ用い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩに添付されているマニュアル通りに操作を行い、全ｃＤＮＡを得てＰＣＲの鋳型とした。
【００２４】

【００２５】
ＰＣＲは、上記の全ｃＤＮＡを鋳型として、上記のプライマー対を用い、ポリメラーゼとしてＬＡ　Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、９４℃にて１分間、５５℃にて３０秒間、および７２℃にて２分間の温度にて３０サイクルを行った。こうして増幅された各ｃＤＮＡをクローニングベクターｐＴ７ｂｌｕｅ　Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングして、それぞれ、ＨＤＡＣ６　ＨＥＡＤ／ｐＴ７ｂｌｕｅ、ＨＤＡＣ６　ＭＩＤ／ｐＴ７ｂｌｕｅ、及びＨＤＡＣ６　ＴＡＩＬ／ｐＴ７ｂｌｕｅを得、配列決定した。
【００２６】
前記ＨＤＡＣ６　ＨＥＡＤ／ｐＴ７ｂｌｕｅのＸｂａＩ／ＮｄｅＩ部位に、Ｈｉｓ６リンカー：ＣＴＡＧＡＴＧＣＣＧ　ＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣ　ＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡ　ＴＣＡＴＣＡ（配列番号：２９）及びＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧ　ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡ　ＧＡＡＣＣＣＣＧＣＧ　ＧＣＡＴ（配列番号：３０）を、それぞれＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化後アニールして挿入し、構築したベクターをＸｂａＩ及びＤｒａＩＩＩ　により消化してＨｉｓ６付きＨＥＡＤ（Ｘｂａ／ＤｒａＩＩＩ）断片を得た。このＨｉｓ６付きＨＥＡＤ（Ｘｂａ／ＤｒａＩＩＩ）断片及び前記ＨＤＡＣ６ＭＩＤ／ｐＴ７ｂｌｕｅをＤｒａＩＩＩ　及びＢｐｕ１１０２Ｉで消化して得られたＭＩＤ（ＤｒａＩＩＩ／Ｂｐｕ１１０２Ｉ）断片を前記ＨＤＡＣ６　ＴＡＩＬ／ｐＴ７ｂｌｕｅをＸｂａＩ及びＤｒａＩＩＩ　で消化したものに挿入し、全長ＨＤＡＣ６（Ｎ−末端Ｈｉｓ６融合）／ｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｈｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐＴ７ｂｌｕｅと称する）を構築した。
【００２７】
前記Ｈｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐＴ７ｂｌｕｅをＳａｃＩで消化してＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化後ＸｂａＩで消化し、この断片をベクターｐＶＬ１３９２のＸｂａＩ／ＳｍａＩ部位と連結し、トランスファーベクターＨｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐＶＬ１３９２を作成した。以上の工程を図１２及び１３に記載する。
次に、このトランスファーベクターを、常法に従って、ＴＮＭ−ＦＨ培地で培養したＳｆ−９細胞にトランスフェクトした。即ち、４μｇの前記トランスファーベクターＨｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐＶＬ１３９２、０．５μｇのＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ線状化ＡｃＭＮＰＶ　ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２０μＬのＩｎｓｅｃｔｉｎＰｌｕｓリポゾ−ムを、１ｍＬのＧｒａｃｅ昆虫培地中で、２×１０^６個のＳｆ−９細胞と共にキットのマニュアル通りにインキュベートした。７日間の培養の後、培養上清を取り、プラーク精製を行い、単一プラークからウイルスを増幅して、高タイターウイルスストックとした。
【００２８】
実施例２．　組換えＨＤＡＣ６タンパク質の生成
実施例１で増幅したウイルス約１０^８ｐｆｕ／ｍＬを１／１００希釈し、１０^６細胞／ｍＬのＳｆ−９細胞３００ｍＬにＭＯＩ＝１で感染させ、２７℃にて７２時間、７０ｒｐｍで撹拌培養した。培養後、５００Ｘｇにて５分間の遠心分離により細胞を回収し、−８０℃で保存した。この細胞をプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭ　ＰＭＳＦ，２μＭ　ロイペプチン，２μＭ　ぺプスタチン，２００ｎＭ　アプロチニン）を含む６ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５），３００ｍＭ　ＮａＣｌ，２０ｍＭ　イミダゾール）に懸濁し、テフロンホモジナイザーにより２０ストロークで破砕し、破砕物を２００００Ｘｇ、４℃にて３０分間遠心分離して透明な細胞破砕液を得た。この得られた細胞破砕液に、緩衝液Ａで平衡化した１ｍＬの吸着樹脂Ｎｉ−ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ）を加え、４℃にて１〜２時間吸着させた。
【００２９】
前記吸着樹脂含有液を２０００Ｘｇで５分間、４℃にて遠心分離して上清を除去し、回収した吸着樹脂を１０ｍＬの緩衝液Ａに再懸濁し、２０００Ｘｇで５分間、４℃にて遠心分離し、上清を除去した。この操作を３回反復した。この洗浄した樹脂を緩衝液Ａに懸濁し、カラム（Ｅｃｏｎｏ　ｃｏｌｕｍｎ，　ＢＩＯ−ＲＡＤ）に詰め、２０ｍＬの緩衝液Ａで洗浄した。このカラムを緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５），３００ｍＭ　ＮａＣｌ，３００ｍＭ　イミダゾール）により溶出処理し、溶出液画分を１ｍＬづつ集め、透析緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ）に対して透析した。透析液のタンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）により定量した後、−８０℃にて保存した。
【００３０】
上記のようにして精製したＨＤＡＣ６タンパク質の脱アセチル化活性を、ＨＤＡＣ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ａｓｓａｙ／Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｋｉｔ（ＢＩＯＭＯＬ）により測定した。また、ＨＤＡＣ６の阻害剤であるトリコスタチンＡを１μＭ測定系に加えた場合についても測定を行い、図１に示す結果を得た。即ち、測定試料の脱アセチル化活性はトリコスタチンＡにより完全に阻害され、遺伝子組換えにより調製したＨＤＡＣ６が本来の脱アセチル化活性を有することが確認された。
【００３１】
実施例３．　ＨＤＡＣ６強制発現用ベクターの構築及びＨＤＡＣ６の強制発現によるα−チューブリンの脱アセチル化の促進
実施例１で構築したＨｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐＴ７ｂｌｕｅをＳａｃＩで消化してＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端後、ＸｂａＩで消化し、この断片をＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、Ｈｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＡＳを得た。構築したベクターは、発現用のプロモーターに対してＨＤＡＣ６ｃＤＮＡが逆向きに挿入されている為、該ベクターを、ＰｍｅＩで消化後、ＰｍｅＩを不活性化してそのままｐｃＤＮＡ３．１（＋）とＨＤＡＣ６断片を結合し、発現用のプロモーターに対してＨＤＡＣ６ｃＤＮＡが正方向に挿入された、ＨＤＡＣ６の強制発現用ベクター、Ｈｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＥを得た。以上の工程を図１４に記載する。
【００３２】
１０ｃｍのディッシュ中１０％ＦＣＳ，１×非必須アミノ酸を含むＭＥＭ培地にＨｅＬａ細胞を播種し、ＨＤＡＣ６をヒスチジン融合タンパク質として発現する様に構築された５μｇのＨｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＥと、５μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クローンテック）とを、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて同時形質転換した。又、Ｈｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＡＳ及びｐｃＤＮＡ３．１（＋）を用い、同様の操作を行なった。４８時間後、トリプシンにより細胞を剥離して回収し、ＦＡＣＳ　ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）陽性細胞のみを分別回収した。
【００３３】
回収した細胞を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（ブロムフェノールブルー不含）により細胞溶解し、タンパク質を定量した後、２．５μｇ／レーンのタンパク質の量で細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗−アセチル化α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　６−１１Ｂ−１，Ｓｉｇｍａ）、抗−α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　ＤＭ１Ａ，Ｓｉｇｍａ）又は抗−ＲＧＳ　Ｈｉｓ抗体（ＱＩＡＧＥＮ）によりイムノブロットした。
図２に示す通り、ＨＤＡＣ６を発現しないベクター（Ｈｉｓ６−ＨＤＡＣ６（ｆｕｌｌ）／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＡＳ及びｐｃＤＮＡ３．１（＋）を導入した細胞ではα−チューブリンのアセチル化の度合いに変化がないのに対して、ＨＤＡＣ６を強制発現させた細胞ではα−チューブリンのアセチル化の度合いが減少しており、ＨＤＡＣ６がα−チューブリンの脱アセチル化を担っていることが示唆された。
【００３４】
実施例４．　　ホスホロチオエート・アンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を用いたＨＤＡＣ６タンパク質の発現抑制とそれによるα−チューブリンアセチル化の亢進
ＨＤＡＣ６遺伝子のｍＲＮＡ配列（ｇｅｎｅ　ｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ　００６０４４）を基に、２０種類のアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：３〜２２）及び対照オリゴヌクレオチド：ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴ　ＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴ（配列番号：３１）（ヘモグロビン異常症サラセミアにおける赤血球βグロビンｐｒｅ−ｍＲＮＡ中の７０５番目の部位のスプライシング異常により生じた配列に由来し、健常細胞ではこのオリゴヌクレオチドは特異的標的部位や生物学的活性を有しない）をデザインし、ホスホロチオエート・アンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を合成した（サワディーテクノロジー）。
【００３５】
合成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを滅菌水に溶解し、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、添付のプロトコールを用いてＨｅＬａ細胞に導入した。１．５×１０^５のＨｅＬａ細胞は６ウエルプレートに播種し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度は２００ｎＭとし、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＮＩＮＥは３μＬ／ウエルで使用した。
導入して４８時間後、細胞をトリプシンで剥離して回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（ＢＰＢ不含）で細胞溶解し、タンパク質を定量した後、２５μｇ／レーンの細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗−アセチル化α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　６−１１Ｂ−１，Ｓｉｇｍａ）、抗−α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　ＤＭ１Ａ，Ｓｉｇｍａ）又は抗−ＨＤＡＣ６抗体（Ｈ−３００、サンタクルーズ）によりイムノブロットした。
【００３６】
図３に示す通り、試験した２０種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドの内、約半数がＨＤＡＣ６の発現量の低下をもたらし、ある種のアンチセンスオリゴヌクレオチドがＨＤＡＣ６の発現を抑制することが確認された。対照オリゴは、予想通り、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現低下を惹起する活性を有しなかった。
また、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現量の低下に応じて、α−チューブリンのアセチル化が亢進していた。このことから、ＨＤＡＣ６タンパク質によりα−チューブリンの脱アセチル化が行われることが示唆された。
【００３７】
上記のアンチセンス活性を生じさせたアンチセンスオリゴヌクレオチドの内、本訳開始コドンＡＴＧ近傍のアンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４（配列番号：６）、Ｎｏ．５（配列番号：７）及びネガティブコントロールとしてＮｏ．６（配列番号：８）、並びにコード領域の中間に位置し、最も強いアンチセンス活性を惹起するアンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６（配列番号：１８）につき、トランスフェクション後の細胞回収までの培養時間を変えて（２４時間後、３０時間後、３６時間後及び４８時間後）上記と同様の実験を行った。
図４に示す通り、アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４、５及び１６は、何れの時間においてもα−チューブリンのアセチル化が亢進していることが確認された。このため、今後の実験においては、これら３種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した。
【００３８】
実施例５．　ＨＤＡＣ６タンパク質の発現低下による微小管構造の変化
ＨｅＬａ細胞を、Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩ　Ｃｈａｍｂｅｒｅｄ　Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ（Ｎｕｎｃ）上に播種し、
（１）微小管重合剤である１μＭ　Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ｓｉｇｍａ）による１６時間の処理、
（２）ＨＤＡＣ阻害剤である１μＭ　トリコスタチンＡ（和光）による１６時間の処理、又は
（３）ＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４を最終濃度２００ｎＭで、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥにより導入して２４時間培養を行った。
【００３９】
その後、Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩ　Ｃｈａｍｂｅｒｅｄ　Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓを０．１Ｍ　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．９）洗浄し、０．５％グルタルアルデヒド／０．１　Ｍ　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．９）で１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＰＢＳで５分間づつ３回透過性付与（ｐｅｒｍｅａｌｉｚｅ）し、ＰＢＳで３回洗浄し、２．５ｍｇ／ｍＬ　硼水素化ナトリウム／５０％エタノールで１０分間づつ３回処理し、ＰＢＳで３回洗浄し、１０％　正常ヤギ血清／ＰＢＳでブロッキングし、１次抗体である（ａ）抗−アセチル化α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　６−１１Ｂ−１，Ｓｉｇｍａ）又は（ｂ）抗−α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　ＤＭ　１Ａ，Ｓｉｇｍａ）／ＰＢＳと１時間反応させ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０／ＰＢＳで３回洗浄し、２次抗体であるＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８接合抗−マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ）／ＰＢＳと３０分間反応せしめ、そして０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）で観察した。
【００４０】
その結果を図５に示す。未処理対象細胞と比較して、微小管重合促進剤であるＰａｃｌｉｔａｘｅｌで処理した細胞では、抗−α−チューブリン抗体で染色した場合、核周辺に強く重合した微小管が観察された。抗−アセチル化α−チューブリン抗体で染色した場合、中心体から強く重合した微小管が観察された。
ＨＤＡＣ６の活性を阻害するトリコスタチンＡ又はＨＤＡＣ６の生成を抑制するＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドにより処理した細胞では、微小管重合促進剤であるＰａｃｌｉｔａｘｅｌ処理とは異なり、細胞質全体に重合した微小管像が観察された。これらの、α−チューブリンの脱アセチル化を阻害した細胞では、微小管重合促進剤であるＰａｃｌｉｔａｘｅｌで処理した場合とは異なる作用機序により、細胞質全体で微小管の安定性が上昇したと考えられる。
【００４１】
実施例６．　ＨＤＡＣ６タンパク質に発現低下によるアポトーシスの誘導
１０％ＦＣＳ，１×非必須アミノ酸を含むＭＥＭ培地を入れた６ウエルプレートにＨｅＬａ細胞（１．５×１０^５／ｗｅｌｌ）を播種し、最終濃度２００ｎＭのＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４、５、６及び１６、並びに対照オリゴヌクレオチドを、３μＬ／ウエルのＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥにより導入し、２４時間、３０時間、３６時間又は４８時間処理し、細胞をトリプシン処理により剥離して回収し、アポトーシスを検出できるＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖ−ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により、添付のプロトコールに従って染色し、ＦＡＣＳ　ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。
【００４２】
即ち、回収した細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬの結合緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に懸濁させ、この細胞懸濁液に５μＬのＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖ−ＰＥを加え、１５分間インキュベートし、結合緩衝液を加えて合計５００μＬにした。これを、ＦＡＣＳ解析にかけた。結果を図６に示す。Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ陽性の細胞の割合は、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現量の減少に応じて増加している。Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖはアポトーシスの初期段階で細胞膜のホスファチジルセリンが細胞外に露出する際に結合するとされている。従って、ＨＤＡＣ６の機能を阻害することにより、細胞にアポトーシスを生じさせたと考えられる。
【００４３】
実施例７．　ＨＤＡＣ６タンパク質に発現低下によるミトコンドリア膜電位の脱分極の誘導
１０％ＦＣＳ，１×非必須アミノ酸を含むＭＥＭ培地を入れた６ウエルプレートにＨｅＬａ細胞（１．５×１０^５／ｗｅｌｌ）を播種し、最終濃度２００ｎＭのＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４、５、及び１６、並びに対照オリゴヌクレオチドを、３μＬ／ウエルのＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥにより導入し、２４時間、３６時間又は４８時間処理し、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｓｅｎｓｏｒ　ＪＣ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を最終濃度１０μｇ／ｍＬと成るように加え、３７℃にて１０分間更に培養した。１０分後、細胞をトリプシン処理により剥離して回収し、ＦＡＣＳ　ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。
【００４４】
Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｓｅｎｓｏｒ　ＪＣ−１を培地に添加すると、正常な細胞では速やかにミトコンドリア内に取り込まれ、赤色蛍光（〜５９０ｎｍ；ＦＬ−２）を示すが、ミトコンドリアの膜電位が脱分極している細胞では、ミトコンドリアに取り込まれずに細胞質に存在し、緑色蛍光（〜５２５ｎｍ；ＦＬ−１）を示す。従って、ミトコンドリアの膜電位が脱分極した細胞を検出するために、緑色蛍光陽性の細胞の割合をグラフ化し、アポトーシスの指標とした。
【００４５】
結果を図７に示す。図３の結果から、ＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドはＮｏ．１６、４及び５の順で、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現量を低下させる活性が高いと推測できる。図６の結果から、ミトコンドリア膜電位が脱分極を起こしている細胞の割合は、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現量の低下に比例して起こっており、ＨＤＡＣ６の機能を阻害すれば、細胞内のα−チューブリンのアセチル化が亢進し、更にミトコンドリアの膜電位の脱分極を引き起こすことからアポトーシスを引き起こしていると考えられる。
【００４６】
実施例８．　アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＮｏ．１６（配列番号：１８）を用いたＨＤＡＣ６タンパク質の発現抑制とそれによるα−チューブリンアセチル化の亢進
オリゴヌクレオチドＮｏ．１６（配列番号：１８）（この実施例においてＨＤＡＣ６　ＡＳＯと称する）と対照オリゴヌクレオチドＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴ　ＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴ（配列番号：３１）（実施例４を参照のこと）を用いて、ＨｅｐＧ２細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＳＷ４８０細胞（Ｃｏｌｏｎ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＬｏＶｏ細胞（Ｃｏｌｏｎ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）又はＣａｌｕ−１（Ｌｕｎｇ　ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）における、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現抑制とそれによるα−チューブリンアセチル化の亢進を試験した。
【００４７】
合成された前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを、を滅菌水に溶解し、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、添付のプロトコールを用いて上記の細胞に導入した。細胞は、ＨｅｐＧ２細胞　５×１０^５細胞／ウエル、ＳＷ４８０細胞　４×１０^５細胞／ウエル、ＬｏＶｏ細胞　４×１０^５細胞／ウエル、又はＣａｌｕ−１細胞　２×１０^５細胞／ウエルの濃度で６ウエルプレートに播種し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度は２００ｎＭとし、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＮＩＮＥは３μＬ／ウエルで使用した。全ての細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）＋１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）中で培養した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入して４８時間後、細胞をトリプシンで剥離して回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（ＢＰＢ不含）で細胞溶解し、タンパク質を定量した後、２０μｇ／レーンの細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗−アセチル化α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　６−ＩＩＢ−１，Ｓｉｇｍａ）、抗−α−チューブリン抗体（ｃｌｏｎｅ　ＤＭ１Ａ，Ｓｉｇｍａ）又は抗−ＨＤＡＣ６抗体（Ｈ−３００、サンタクルーズ）によりイムノブロットした。
【００４８】
図８に示す通り、試験したアンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６（ＨＤＡＣ６　ＡＳＯ）は、実験に用いた全ての細胞においてＨＤＡＣ６の発現量の低下をもたらすことが確認された。対照アンチセンスオリゴヌクレオチドは、予想通り、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現低下を惹起する活性を有しなかった。このことから、ＨＤＡＣ６タンパク質によりα−チューブリンの脱アセチル化が行われることが確認された。
【００４９】
実施例９．　アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６によるＨＤＡＣ６タンパク質の発現低下に起因するミトコンドリア膜電位の脱分極の誘導
ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）＋１０％ＦＣＳを入れた６ウエルプレートに、ＨｅｐＧ２細胞　５×１０^５細胞／ウエル、ＳＷ４８０細胞　４×１０^５細胞／ウエル、ＬｏＶｏ細胞　４×１０^５細胞／ウエル、又はＣａｌｕ−１細胞　２×１０^５細胞／ウエルを播種し、最終濃度２００ｎＭのＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６、又は対照オリゴヌクレオチドを、３μＬ／ウエルのＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥにより導入し、４８時間インキュベートした。パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）処理対照については、細胞を１μＭのパクリタキセルと共に２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓｅｎｓｏｒ　ＪＣ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を最終濃度１０μｇ／ｍＬと成るように加え、３７℃にて１０分間更にインキュベートした。１０分後、細胞をトリプシン処理により剥離して回収し、ＦＡＣＳ　ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。
【００５０】
結果を図９に示す。図８の結果から、ＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６は、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現量を低下させる活性を有すると推測できる。図９の結果から、ＨＤＡＣ６の機能を阻害すれば、細胞内のα−チューブリンのアセチル化が亢進し、更にミトコンドリアの膜電位の脱分極を引き起こすことからアポトーシスを引き起こしていると考えられる。
【００５１】
実施例１０．　アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６により誘導されるアポトーシスによる細胞数の減少
ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）＋１０％ＦＣＳを入れた６ウエルプレートに、ＨｅｐＧ２細胞　５×１０^５細胞／ウエル、ＳＷ４８０細胞　４×１０^５細胞／ウエル、ＬｏＶｏ細胞　４×１０^５細胞／ウエル、又はＣａｌｕ−１細胞　２×１０^５細胞／ウエルを播種し、最終濃度２００ｎＭのＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６、又は対照オリゴヌクレオチドを、３μＬ／ウエルのＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥにより導入し、４８時間インキュベートした。パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）処理対照については、細胞を１μＭのパクリタキセルと共に２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を回収し、血球計算板により細胞数を測定した。
【００５２】
結果を図１０に示す。図１０の結果から、ＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６は、ＨＤＡＣ６タンパク質の発現量を低下させる活性を有し、細胞死を誘導することが推測できる。
実施例８〜１０の結果から、ＨｅＬａ細胞以外の癌細胞においても、ＨＤＡＣ６の生成を抑制することにより、ＪＣ−１染色で緑色蛍光陽性細胞が検出されること、及び細胞数の減少が観察されることから、ミトコンドリアを介するアポトーシスによる細胞死が誘導されることが示唆された。
【００５３】
実施例１１．　アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６によるＨＤＡＣ６タンパク質の発現低下に起因する微小管構造の変化
ＨｅＬａ細胞を、Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩ　Ｃｈａｍｂｅｒｅｄ　Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ（Ｎｕｎｃ）上に播種し、
（１）微小管重合剤である１μＭ　Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ｓｉｇｍａ）により１６時間の処理し、
（２）ＨＤＡＣ阻害剤である１μＭ　トリコスタチンＡ（和光）により１６時間の処理し、又は
（３）ＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６を最終濃度２００ｎＭで、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥにより導入して２４時間培養を行った。
コルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ；コルヒチンの誘導体）を、エタノールに溶解して培地に添加し、最終濃度１μＭとし、１５分間（前処理無しでは微小管がほぼ消失する時間）処理した。
【００５４】
その後、Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩ　Ｃｈａｍｂｅｒｅｄ　Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓを０．１Ｍ　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．９）で洗浄し、０．５％グルタルアルデヒド／０．１Ｍ　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．９）で１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＰＢＳで５分間づつ３回透過性付与（ｐｅｒｍｅａｌｉｚｅ）し、ＰＢＳで３回洗浄し、２．５ｍｇ／ｍＬ　硼水素化ナトリウム／５０％エタノールで１０分間づつ３回処理し、ＰＢＳで３回洗浄し、１０％　正常ヤギ血清／ＰＢＳでブロッキングし、１次抗体であるラット抗−α−チューブリンモノクローナル抗体（ＭＡＢ１８６４；ＣＨＥＭＩＣＯＮ）／ＰＢＳと１時間反応させ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０／ＰＢＳで３回洗浄し、２次抗体であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ　４８８接合抗−ラットＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ）／ＰＢＳと３０分間反応せしめ、そして０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０　／ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）で観察した。
【００５５】
その結果を図１１に示す。前処理をしないでコルセミド処理をした細胞では微小管が消失したのに対し、微小管重合促進剤であるパクリタキセル、ＨＤＡＣ６を阻害するトリコスタチンＡ、又はＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞では、重合した微小管が残っている像が観察された。これは、ＨＤＡＣ６の阻害又は抑制によりα−チューブリンのアセチル化が亢進し、微小管が安定化されたことによると考えられる。
【００５６】
【産業上の利用可能性】
本発明により、ヒストンデアセチラーゼ６（ＨＤＡＣ６）の抑制によってα−チューブリンのアセチル化が亢進し、その結果アポトーシスが誘導される事が見出され、ＨＤＡＣ６を抑制する物質は抗癌剤として有望である事が示された。従って本発明は、抗癌剤として有望なアポトーシス誘導剤を提供する。本発明は更に、抗癌剤として有望なアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法を提供する。
【００５７】
【配列表】

【００５８】

【００５９】

【００６０】

【００６１】

【００６２】

【００６３】

【００６４】

【００６５】

【００６６】

【００６７】

【００６８】

【００６９】

【００７０】

【００７１】

【００７２】

【００７３】

【００７４】

【００７５】

【００７６】

【００７７】

【００７８】

【００７９】

【００８０】

【００８１】

【００８２】

【００８３】

【００８４】

【００８５】

【００８６】

【００８７】

【００８８】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明において製造された組換えＨＤＡＣ６が脱アセチル化活性を有し、その活性がトリコスタチンＡにより阻害されることを示すグラフである。
【図２】図２は、ＨＤＡＣ６がアセチル化α−チューブリンを脱アセチル化することを示すウエスタンブロットの図であり、図面代用写真である。
【図３】図３は、試験したＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドの内、幾つかがＨＤＡＣ６の発現を抑制し、α−チューブリンのアセチル化を亢進させることを示すウエスタンブロットの図であり、図面代用写真である。
【図４】図４は、ＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４、５、６及び１６並びに陰性対照オリゴヌクレオチドにつき、処理時間を変えて、ＨＤＡＣ６の生成抑制及びα−チューブリンのアセチル化を亢進させる事を示すウエスタンブロットの図であり、図面代用写真である。
【図５】図５は、本発明のＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４での処理により、ＨｅＬａ細胞の細胞質中に微小管が重合したことを示す顕微鏡写真であり、図面代用写真である。
【図６】図６は、本発明のＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４、５及び１６が、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ陽性により判定した場合、ＨｅＬａ細胞においてアポトーシスを誘導することを示すグラフである。
【図７】図７は、本発明のＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．４、５及び１６が、ＪＣ−１染色により判定した場合、ＨｅＬａ細胞においてミトコンドリアにおける脱分極を誘導することを示すグラフである。
【図８】図８は、本発明のＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６での処理により、各種ヒト癌細胞中でＨＤＡＣ６の生成が抑制され、α−チューブリンのアセチル化が亢進することを示すウエスタンブロット図である。
【図９】図９は、ＪＣ−１染色により判定した場合、本発明のＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６が、各種ヒト癌細胞において、ミトコンドリアにおける脱分極を誘導することを示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明のＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドが、各種ヒト癌細胞において細胞死を誘導することを示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明のＨＤＡＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドＮｏ．１６は、微小管を安定化させ、コルセミドによる微小管の消失を阻害することを示す写真である。
【図１２】図１２は、ＨＤＡＣ６全長ｃＤＮＡのクローニング及びバキュロウイルス用Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒの構築を示す。
【図１３】図１３は図１２の続きである。
【図１４】図１４は、ＨＡＤＣ６の動物細胞発現用ベクターの構築を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an apoptosis inducer and a screening method thereof. This apoptosis inducer is promising as an anticancer agent.
[0002]
[Prior art]
Histone deacetylase (HDAC) has been shown to play an important role in controlling gene expression (Khochbin S, Verdel A, Lemercier C, Seigneurin-Berny D. Function significance difice. Curr Opin Genet Dev. 2001 Apr; 11 (2): 162-6). Numerous isozymes exist in human histone deacetylase, including class I (

HDAC isozymes

1, 2, 3 and 8), class II (

HDAC isozymes

4, 5, 6 and 7), and class III (

SIRT Isozymes

1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7). Of these, histone deacetylase 6 (HDAC6) is present in the cytoplasm, unlike other isozymes in the nucleus. Therefore, it has properties different from other isozymes in that histone cannot be used as an original substrate, it is inhibited by trichostatin A, and its structure is unique.
[0003]
Microtubules that play an important role in cell division contain α-tubulin as one of their constituent proteins, and this protein is subject to acetylation when the microtubules are stabilized by taxol or the like. Known (Piperno, G., ＤLeDiset, M.ｊ & Chang, X.-j. (1987) Microtubules contained ｅｔα-tubulin in mammalian cell.in Col. Therefore, in the cytoplasm, an enzyme that adds an acetyl group to α-tubulin (α-tubulin acetylase) (α-tubulin acetylase) and an enzyme that removes the acetyl group added to α-tubulin (α -Tubulin deacetylase) (α-tubulin deacetylase).
[0004]
It is known that acetylation of α-tubulin contributes to the stabilization of microtubules (Piperno, G., ＤLeDiset, M. & Chang, X.-j. (1987) Microtubules containing acetylated α-tubulin in). mammalian cells cells in culture, J. Cell Biol. 104, 289-302). However, histone deacetylase 6 (HDAC6) is a deacetylase for α-tubulin, but it is not known that inhibition of HDAC6 causes apoptosis in cells.
[0005]
[Non-patent document 1]
Curr. {Opin. {Genet. {Dev. {2001} Apr; {11 (2)}: {162166} J. {Cell} Biol. , $ 104, $ 289-302
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an apoptosis-inducing agent that produces an anti-cancer effect by inducing apoptosis, an anti-cancer agent containing the apoptosis-inducing agent as an active ingredient, and a method for screening an apoptosis-inducing agent.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have noticed that, among the many isozymes of histone deacetylase (HDAC), only histone deacetylase 6 (HDAC6) is present in the cytoplasm, and his native substrate cannot be histone. As a result of various studies, it was confirmed that HDAC6 was a deacetylase enzyme of α-tubulin. Furthermore, they have found that apoptosis can be induced in cells by suppressing HDAC6 and enhancing α-tubulin acetylation to stabilize microtubules, thus completing the present invention.
[0008]
Therefore, the present invention provides an apoptosis inducer comprising a substance that inhibits histone deacetylase 6 (HDAC6). The substance that inhibits histone acetylase 6 (HDAC6) may be a substance that inhibits histone deacetylase 6 (HDAC6) itself, or inhibits the production (synthesis) of histone deacetylase 6 (HDAC6). May be used. An example of a substance that suppresses the synthesis of histone deacetylase 6 includes a nucleic acid or a peptide, and the nucleic acid includes an antisense oligonucleotide or ribozyme of histone deacetylase 6 (HDAC6).
[0009]
The present invention also relates to a method for screening an apoptosis-inducing substance that suppresses HDAC6,
(1) Whether or not the test substance inhibits histone deacetylase 6 (HDAC6) is determined by deacetylation of an acetylated substance that can be a substrate of histone deacetylase 6 (HDAC6) or histone deacetylase 6 (HDAC6). Decreased expression is determined as an index,
(2) In the case of inhibition, it is further confirmed whether the cell causes apoptosis in vitro and / or in vivo,
Providing a method comprising:
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, it was first confirmed that HDAC6 was an α-tubulin deacetylase. For this purpose, the cDNA encoding HDAC6 is cloned into an expression vector for mammalian cells (Example 1), this expression vector is introduced into host cells, HDAC6 is overexpressed in the cells, and the acetyl of α-tubulin is expressed. The degree of conversion was observed. If HDAC6 is an α-tubulin deacetylase, the amount of acetylated α-tubulin in the cell should decrease because the acetyl group of α-tubulin is removed by overexpressed HDAC6. is there. The nucleotide sequence of cDNA encoding HDAC6 is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 2.
[0011]
As a result, when HDAC6 was overexpressed, the degree of acetylation was reduced by about 50%, but only a vector that did not express HDAC6 (His6-HDAC6 (full) /pcDNA3.1 (+) AS) and the vector were introduced into the cells. Did not decrease the degree of α-tubulin acetylation. As a result, HDAC6 was proved to be an α-tubulin deacetylase.
[0012]
Next, a method for reducing the expression of HDAC6 in cells was examined. As an example, as a method for suppressing the expression of the HDAC6 gene, an attempt was made to suppress the expression by a phosphorothioate oligonucleotide (antisense oligonucleotide) complementary to the HDAC6 mRNA. As antisense oligonucleotides, three kinds of oligonucleotides complementary to the sequence containing the translation initiation codon ATG of HDAC6, namely, antisense oligonucleotide 1: CATAGTTGAG @ GAGGCTTGGC (SEQ ID NO: 3), antisense oligonucleotide 2: TCCTGGCCGG @ TTGAGGTCAT (SEQ ID NO: 4) and antisense oligonucleotide 3: GGTTGAGGTC @ ATAGTTGAGGG (SEQ ID NO: 5), and antisense oligonucleotide 4: CCCTGCCGCG @ GTTCTTCCAC (SEQ ID NO: 6) and ATG complementary to the sequence upstream of ATG Antisense oligonucleotide 5: GCTGCCTGTGＧTGTGGTGGAA (SEQ ID NO: : 7) was used.
[0013]
Furthermore, an antisense oligonucleotide 6: TTTATTACAT @ ATGCAACCTT (SEQ ID NO: 8) and a polyA addition signal sequence that are complementary to an upstream sequence containing a polyA addition signal sequence (bases 4082 to 4087 in SEQ ID NO: 1) Antisense oligonucleotide 7: AACAGCTTTGT ACTTTATTAC (SEQ ID NO: 9), conserved aspartic acid in the first catalytic region (bases 352-1305 in SEQ ID NO: 1), which is complementary to the downstream sequence containing And an antisense oligonucleotide 8: CCTTGACCGT @ GGTGCACATC (SEQ ID NO: 10) complementary to a downstream sequence containing a sequence corresponding to histidine residue (DH) and an upstream sequence containing a sequence corresponding to the DH Is complementary to, Antisense oligonucleotide 9: complementary to the downstream sequence including the sequence corresponding to the conserved DH in the second catalytic region (bases 1537-2475 in SEQ ID NO: 1), as well as GTGGTGCACAΔTCCCAATCTA (SEQ ID NO: 11). Antisense oligonucleotide 10: CCATTACCCGT @ GGTGGACATC (SEQ ID NO: 12) and complementary to the upstream sequence containing the sequence corresponding to DH, antisense oligonucleotide 11: GTGGTGGACA @ TCCACAATCCA (SEQ ID NO: 13) Was used.
[0014]
Furthermore, in order to cover the entire region of the mRNA of HDAC6, the antisense oligonucleotide 12: CGCTCCTCAG @ GGGACTGCCC (SEQ ID NO: 14), which is complementary to the sequence of bases 1 to 20 of SEQ ID NO: 1, and bases 501 to 520 Antisense oligonucleotide 13: ACATCAGCTC @ TTCCTTTTCA (SEQ ID NO: 15) complementary to the sequence, antisense oligonucleotide 14: CCAAGGCCA @ TTGATGGTAT (SEQ ID NO: 16), base complementary to the sequence of bases 1001-1020 An antisense oligonucleotide 15: ACTGGCCATG @ TCAGGATTGG (SEQ ID NO: 17), which is complementary to the sequence of 1501-1520;
[0015]
Antisense oligonucleotide 16: TCCGTAGGGC @ ATGCCCACTG (SEQ ID NO: 18), complementary to the sequence of bases 2001-2020, antisense oligonucleotide 17: TGGCAGGGCTCAGCAGGGGTG (SEQ ID NO: 18), complementary to the sequence of bases 2501-2520 : 19), antisense oligonucleotide 18: AGCGTGGCTC @ CCCCAACAGC (SEQ ID NO: 20), complementary to the sequence of bases 3001-3020, antisense oligonucleotide 19: AATTCTCTTG, complementary to the sequence of bases 3501-3520 GATTGTTCCA (SEQ ID NO: 21) and antisense oligonucleotide 20: TATCGCTCT, complementary to the sequence of bases 4001-4020 C CTCTTGGGGC (SEQ ID NO: 22) was used.
[0016]
As a result, antisense oligonucleotides 1 to 5, antisense oligonucleotides 8 to 11, and antisense oligonucleotide 16 exhibited an effect of suppressing gene expression, that is, a decrease in HDAC6 production. In addition, it was confirmed that acetylation of α-tubulin was increased with a decrease in HDAC6 production.
Thus, when antisense oligonucleotides confirmed to have the effect of enhancing α-tubulin acetylation were introduced into cancer cells, it was observed that microtubules were stabilized in the cytoplasm and apoptosis was occurring. Was. Trichostatin A, which is known as an HDAC inhibitor, was confirmed to give similar results.
[0017]
From the above experimental results, it is reasonably estimated that the substance that suppresses HDAC6 induces apoptosis and is useful as an anticancer agent. Therefore, it is possible to search for an apoptosis-inducing substance and an anticancer agent by selecting a substance that suppresses the activity of HDAC6 using α-tubulin deacetylation and / or acetylation as an index.
Substances that inhibit HDAC6 include an enzyme inhibitor that inhibits the enzyme HDAC6 and a substance that inhibits the generation (synthesis) of HDAC6. Methods for searching for these include inhibiting HDAC6 as an enzyme. There are a method of searching for an enzyme inhibitor and a method of searching for a substance that suppresses HDAC6 expression, that is, production (synthesis).
[0018]
In order to search for an enzyme inhibitor of HDAC6, HDAC6 as an enzyme, an acetylated substance that can be a substrate thereof, and a test substance may be reacted, and deacetylation of the substrate may be used as an index. When the test substance inhibits deacetylation, the test substance is assumed to be an apoptosis inducer. Examples of the acetylated substance that can be a substrate of HDAC6 include acetylated α-tubulin, acetylated histone, and a synthetic peptide obtained by acetylating a lysine residue. The method for detecting deacetylation is not particularly limited as long as it can be detected, but when acetylated α-tubulin is used as a substrate, acetylated α-tubulin is reduced and / or liberated acetic acid or deacetylated. What is necessary is just to measure an increase in α-tubulin and the like. For searching for an enzyme inhibitor, HDAC Fluorescent Activity Assay Kit, AK-500 (BIOMOL) or HDAC Assay Kit (CyClex) can also be used.
[0019]
To search for a substance that suppresses HDAC6 expression, cells expressing HDAC6, for example, animal cells, are cultured in the presence or absence of a test substance, and cultured in the presence of the test substance. If the amount of HDAC6 protein and / or mRNA in the isolated cells is smaller than the amount of HDAC6 protein and / or mRNA in cells cultured in the absence of the test substance, the test substance Is a substance that suppresses the expression of HDAC6, and thus may be presumed to be an apoptosis inducer.
[0020]
The amount of HDAC6 protein can be detected by Western blotting or the like, and the amount of mRNA can be detected by Northern blotting or RT-PCR. The cells were cultured in the presence and absence of the test substance, and the ratio of acetylated α-tubulin to α-tubulin in the cells cultured in the presence of the test substance was compared. When the ratio of acetylated α-tubulin in the cells cultured in the presence of the test substance is higher than the ratio of acetylated α-tubulin in the cells cultured in the absence of the test substance, The test substance is a substance that suppresses the expression of HDAC6, and thus can be estimated to be an apoptosis inducer.
[0021]
The above-mentioned cells are not particularly limited as long as they express HDAC6, but animal cells, particularly human cultured cells, are preferable, and cancer cells are particularly preferable. For example, HeLa cells, HL-60 cells, A549 cells , HepG2 cells, LoVo cells, SW480 cells, Calu-1 cells, and the like, and HeLa cells, HepG2 cells, LoVo cells, SW480 cells, and Calu-1 cells are particularly preferable. Alternatively, cells genetically engineered to overexpress HDAC6 by artificially introducing cloned DNA encoding HDAC6 may be used.
[0022]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
Embodiment 1 FIG.
all RNA Isolation
The cDNA encoding HDAC6 was cloned by dividing the coding region of HDAC6 into three. HL-60 cells (ATCC) were cultured in RPMI1640 containing 10% FCS, and collected by centrifugation at 500 × g for 5 minutes. 1 X 10 collected⁶The cells were dissolved in 1 ml of TRIzole reagent (Gibco BRL), and 200 μl of chloroform was added thereto, suspended, and the aqueous layer was recovered. 500 μl of isopropyl alcohol was added to the collected aqueous layer, mixed, and centrifuged at 12,000 × g for 10 minutes to precipitate total RNA. The precipitated total RNA was rinsed with 75% ethanol, lightly air-dried, and dissolved in 50 μl of water. RNA concentration was measured at a wavelength of 260 nm and stored at -80 ° C until use.
[0023]
HDAC6 Code cDNA Cloning
A reverse transcription reaction was performed using the total RNA of the isolated HL-60 cells. For the reaction, GibcoBRL SuperScript II was used, and TaKaRa RNA RNA PCR Kit (AMV) Ver. Using 0.5 μg of Random 9ｅｒmers contained in 2.1 as a primer, the operation was carried out as per the manual attached to SuperScript II to obtain all cDNAs and use them as PCR templates.
[0024]

[0025]
PCR was performed using the above cDNA pair as a template, the above primer pair, and LA @ Taq (Takara) as a polymerase for 1 minute at 94 ° C., 30 seconds at 55 ° C., and 2 minutes at 72 ° C. 30 cycles were performed at a temperature of. Each of the cDNAs thus amplified was subcloned into a cloning vector pT7blue @ T-Vector (Novagen), and HDAC6 @ HEAD / pT7blue, HDAC6 @ MID / pT7blue, and HDAC6 @ TAIL / pT7blue, respectively, were sequenced.
[0026]
At the XbaI / NdeI site of the HDAC6 @ HEAD / pT7blue, a His6 linker: CTAGATGCCG @ CGGGGTTCTC @ ATCATCATCA @ TCATCA (SEQ ID NO: 29) and TATGATGATG @ ATGATGATGA @ ATGATGATGA @ GAACCCCCG @ GCAT4 (SEQ ID NO: 30) were phosphatized with nucleotides, and kinased with polynucleotide (SEQ ID NO: 30). The inserted and constructed vector was digested with XbaI and DraIII to obtain a HEAD-attached His6 (Xba / DraIII) fragment. The HEAD (Xba / DraIII) fragment with His6 and the MID (DraIII / Bpu1102I) fragment obtained by digesting the HDAC6MID / pT7blue with DraIII and Bpu1102I were inserted into the HDAC6 TAIL / pT7blue digested with XbaI and DraIII. Full-length HDAC6 (N-terminal His6 fusion) / pT7blue (referred to as His6-HDAC6 (full) / pT7blue).
[0027]
The His6-HDAC6 (full) / pT7blue was digested with SacI, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and then digested with XbaI. This fragment was ligated to the XbaI / Smal site of the vector pVL1392, and the transfer vector His6-HDAC6 (full) / pVL1392 was created. The above steps are described in FIGS.
Next, this transfer vector was transfected into Sf-9 cells cultured in a TNM-FH medium according to a conventional method. That is, 4 μg of the transfer vector His6-HDAC6 (full) / pVL1392, 0.5 μg of Bac-N-Blue linearized AcMNPV DNA (Invitrogen) and 20 μL of InsectinPlus liposome were added in 1 mL of Grace insect medium. 2 × 10⁶And incubated with the Sf-9 cells as per the kit manual. After culturing for 7 days, the culture supernatant was taken, plaque purified, and the virus was amplified from a single plaque to obtain a high titer virus stock.
[0028]
Example 2 . Recombinant HDAC6 Protein production
About 10 viruses amplified in Example 1⁸pfu / mL was diluted 1/100 and 10⁶300 ml of cells / mL of Sf-9 cells were infected at MOI = 1, and cultured with stirring at 27 rpm at 27 ° C. for 72 hours. After the culture, the cells were collected by centrifugation at 500 × g for 5 minutes and stored at −80 ° C. The cells were suspended in 6 mL of buffer A (50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5), 300 mM NaCl, 20 mM imidazole) containing a protease inhibitor (1 mM PMSF, 2 μM leupeptin, 2 μM pepsin, 200 nM aprotinin), The cells were crushed with a Teflon homogenizer for 20 strokes, and the crushed material was centrifuged at 20,000 × g at 4 ° C. for 30 minutes to obtain a clear cell lysate. To the obtained cell lysate, 1 mL of an adsorption resin Ni-NTA @ Superflow (Qiagen) equilibrated with the buffer solution A was added and adsorbed at 4 ° C. for 1 to 2 hours.
[0029]
The adsorbent resin-containing liquid was centrifuged at 2000 × g for 5 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant, and the collected adsorbent resin was resuspended in 10 mL of buffer A and centrifuged at 2000 × g for 5 minutes at 4 ° C. Separated and the supernatant was removed. This operation was repeated three times. The washed resin was suspended in buffer A, packed in a column (Econo column, BIO-RAD), and washed with 20 mL of buffer A. The column was eluted with buffer B (50 mM sodium phosphate (pH 7.5), 300 mM NaCl, 300 mM imidazole), and the eluate fractions were collected in 1 mL portions, and dialyzed with a dialysis buffer (50 mM @ Tris-Cl (pH 7.5)). , 150 mM NaCl, 2 mM EDTA). The protein in the dialysate was quantified by Protein Assay Kit (BIO-RAD) and stored at -80 ° C.
[0030]
The deacetylation activity of the HDAC6 protein purified as described above was measured by using HDAC Fluorescent Activity Activity / Drug Discovery Kit (BIOMOL). The measurement was also performed when trichostatin A, which is an HDAC6 inhibitor, was added to a 1 μM measurement system, and the results shown in FIG. 1 were obtained. That is, the deacetylation activity of the measurement sample was completely inhibited by trichostatin A, and it was confirmed that HDAC6 prepared by genetic recombination had the original deacetylation activity.
[0031]
Example 3 . HDAC6 Construction of vector for forced expression and HDAC6 Of α-tubulin deacetylation by forced expression of
His6-HDAC6 (full) / pT7blue constructed in Example 1 was digested with SacI, blunt-ended with T4 DNA polymerase, digested with XbaI, and this fragment was digested with EcoRV and XbaI. PcDNA3.1 (+) (Invitrogen) To obtain His6-HDAC6 (full) /pcDNA3.1 (+) AS. Since the constructed vector has HDAC6 cDNA inserted in the reverse direction to the promoter for expression, the vector is digested with PmeI, PmeI is inactivated, and pcDNA3.1 (+) and the HDAC6 fragment are directly ligated. Then, a vector for forced expression of HDAC6, His6-HDAC6 (full) /pcDNA3.1 (+) SE, in which HDAC6 cDNA was inserted in the forward direction with respect to the promoter for expression, was obtained. The above steps are described in FIG.
[0032]
HeLa cells were seeded on a MEM medium containing 10% FCS, 1 × non-essential amino acids in a 10 cm dish and 5 μg of His6-HDAC6 (full) /pcDNA3.1 (constructed to express HDAC6 as a histidine fusion protein). +) SE and 5 μg of pEGFP-C1 (Clontech) were co-transformed with FuGENE6 transfection reagent (Roche). The same operation was performed using His6-HDAC6 (full) /pcDNA3.1 (+) AS and pcDNA3.1 (+). After 48 hours, the cells were detached and collected with trypsin, and only EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) positive cells were separately collected using FACS calibrators (Becton Dickinson).
[0033]
The collected cells were lysed with an SDS-PAGE sample buffer (containing no bromophenol blue), the protein was quantified, and the cell lysate was subjected to SDS-PAGE separation at a protein amount of 2.5 μg / lane. Transfer to membrane and immunoblot with anti-acetylated α-tubulin antibody (clone @ 6-11B-1, Sigma), anti-α-tubulin antibody (clone @ DM1A, Sigma) or anti-RGS @ His antibody (QIAGEN) did.
As shown in FIG. 2, the degree of α-tubulin acetylation was changed in the cells into which HDAC6-expressing vectors (His6-HDAC6 (full) /pcDNA3.1 (+) AS and pcDNA3.1 (+) were introduced). In contrast, in the cells in which HDAC6 was forcibly expressed, the degree of α-tubulin acetylation was reduced, suggesting that HDAC6 is responsible for α-tubulin deacetylation.
[0034]
Example 4 . 　 Using phosphorothioate antisense oligonucleotide (antisense oligonucleotide) HDAC6 Suppression of protein expression and thereby enhancement of α-tubulin acetylation
MRNA sequence of HDAC6 gene (gene @ bank @ accession # No. @ NM　006044), 20 kinds of antisense oligonucleotides (SEQ ID NOs: 3 to 22) and control oligonucleotides: CCTCTTACCT @ CAGTTACAAT (SEQ ID NO: 31) (No. 705 in erythrocyte β-globin pre-mRNA in thalassemia hemoglobin disorder) Is derived from the sequence generated by the splicing abnormality at the site, and in healthy cells, this oligonucleotide has no specific target site or biological activity), and the phosphorothioate antisense oligonucleotide (antisense oligonucleotide) is designed. Synthesized (Sawaddy technology).
[0035]
The synthesized antisense oligonucleotide was dissolved in sterilized water, and introduced into HeLa cells using OligofectAMINE (Invitrogen) using the attached protocol. 1.5 × 10⁵HeLa cells were seeded on a 6-well plate, the final concentration of the antisense oligonucleotide was 200 nM, and OligofectANINE was used at 3 μL / well.
Forty-eight hours after the introduction, the cells were detached with trypsin, collected, lysed with SDS-PAGE sample buffer (without BPB), quantified for proteins, and 25 μg / lane cell lysate was subjected to SDS-PAGE. And transferred to a PVDF membrane, and anti-acetylated α-tubulin antibody (clone @ 6-11B-1, Sigma), anti-α-tubulin antibody (clone @ DM1A, Sigma) or anti-HDAC6 antibody (H -300, Santa Cruz).
[0036]
As shown in FIG. 3, about half of the 20 antisense oligonucleotides tested reduced HDAC6 expression levels, confirming that certain antisense oligonucleotides suppressed HDAC6 expression. The control oligo, as expected, did not have the activity to cause reduced expression of HDAC6 protein.
In addition, acetylation of α-tubulin was enhanced in response to a decrease in the expression level of HDAC6 protein. This suggested that α-tubulin was deacetylated by the HDAC6 protein.
[0037]
Among the antisense oligonucleotides that have produced the above antisense activity, the antisense oligonucleotide No. 1 near the translation start codon ATG is used. 4 (SEQ ID NO: 6); 5 (SEQ ID NO: 7) and No. 5 as a negative control. No. 6 (SEQ ID NO: 8), as well as antisense oligonucleotide No. 6 which is located in the middle of the coding region and elicits the strongest antisense activity. For 16 (SEQ ID NO: 18), the same experiment as described above was performed by changing the culture time until cell recovery after transfection (24 hours, 30 hours, 36 hours, and 48 hours).
As shown in FIG. 4, 5, and 16 confirmed that the acetylation of α-tubulin was enhanced at any time. Therefore, these three types of antisense oligonucleotides were used in future experiments.
[0038]
Example 5 . HDAC6 Changes in microtubule structure due to decreased protein expression
HeLa cells were seeded on Lab-TekII Chambered （Coverglass (Nunc),
(1) treatment for 16 hours with 1 μM Paclitaxel (Sigma), which is a microtubule polymerization agent,
(2) treatment with 1 μM @trichostatin A (Wako), which is an HDAC inhibitor, for 16 hours, or
(3) HDAC6 antisense oligonucleotide No. 4 was introduced at a final concentration of 200 nM by OligofectAMINE and cultured for 24 hours.
[0039]
Then, Lab-TekII Chambered Coverglass was washed with 0.1 M PIPES (pH 6.9), fixed with 0.5% glutaraldehyde / 0.1 M M PIPES (pH 6.9) for 10 minutes, and washed three times with PBS. Permealize three times with 0.5% Triton-X100 / PBS for 5 minutes, wash three times with PBS, and treat three times with 2.5 mg / mL sodium borohydride / 50% ethanol for 10 minutes each. After washing three times with PBS and blocking with 10% normal goat serum / PBS, the primary antibody (a) anti-acetylated α-tubulin antibody (clone 6-11B-1, Sigma) or (b) ) Reaction with anti-α-tubulin antibody (clone @ DM @ 1A, Sigma) / PBS for 1 hour, Wash three times with 0.1% Tween 20 / PBS, react with secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugated anti-mouse IgG (Molecular Probe) / PBS for 30 minutes, and react with 0.1% Tween 20 / PBS for 3 minutes. After washing twice, observation was performed with a confocal laser microscope (Carl Zeiss).
[0040]
The result is shown in FIG. Compared with untreated control cells, cells treated with Paclitaxel, a microtubule polymerization promoter, showed strongly polymerized microtubules around the nucleus when stained with an anti-α-tubulin antibody. When stained with an anti-acetylated α-tubulin antibody, strongly polymerized microtubules were observed from the centrosome.
In cells treated with trichostatin A, which inhibits the activity of HDAC6, or with HDAC6 antisense oligonucleotide, which suppresses the production of HDAC6, microtubule images polymerized throughout the cytoplasm are observed, unlike the treatment with Paclitaxel, which is a microtubule polymerization promoter. Was done. In these cells in which α-tubulin deacetylation was inhibited, it was thought that the stability of microtubules was increased in the entire cytoplasm due to a different mechanism of action from treatment with Paclitaxel, a microtubule polymerization promoter. Can be
[0041]
Example 6 . HDAC6 Induction of apoptosis by reduced expression of protein
HeLa cells (1.5 × 10 5) were placed in a 6-well plate containing MEM medium containing 10% FCS and 1 × non-essential amino acids.⁵/ Well) and a final concentration of 200 nM of HDAC6 antisense oligonucleotide No. 4, 5, 6 and 16 and control oligonucleotides were introduced with 3 μL / well of OligofectAMINE, treated for 24, 30, 36 or 48 hours, cells were detached by trypsinization and harvested, and apoptosis was determined. The cells were stained with detectable Annexin @ V-PE (Becton @ Dickinson) according to the attached protocol and analyzed using FACS @ caliber (Becton @ Dickinson).
[0042]
That is, the collected cells were washed with PBS, suspended in 100 μL of binding buffer (Becton @ Dickinson), 5 μL of Annexin @ V-PE was added to the cell suspension, incubated for 15 minutes, and the binding buffer was added. To a total of 500 μL. This was subjected to FACS analysis. FIG. 6 shows the results. The proportion of Annexin V-positive cells increases with a decrease in the expression level of HDAC6 protein. AnnexinΔV is said to bind when cell membrane phosphatidylserine is exposed extracellularly during the early stages of apoptosis. Therefore, it is considered that inhibition of the function of HDAC6 caused apoptosis in cells.
[0043]
Example 7 . HDAC6 Induction of mitochondrial membrane potential depolarization by reduced expression of proteins
HeLa cells (1.5 × 10 5) were placed in a 6-well plate containing MEM medium containing 10% FCS and 1 × non-essential amino acids.⁵/ Well) and a final concentration of 200 nM of HDAC6 antisense oligonucleotide No. 4, 5, and 16 as well as control oligonucleotides were introduced with 3 μL / well of OligofectAMINE, treated for 24, 36 or 48 hours, and Mitochondrial \ potential \ sensor \ JC-1 (Molecular Probes) was brought to a final concentration of 10 μg / mL. The mixture was further cultured at 37 ° C. for 10 minutes. After 10 minutes, the cells were detached by trypsin treatment, collected, and analyzed using FACS®caliber (Becton @ Dickinson).
[0044]
When Mitochondrial \ potential \ sensor \ JC-1 is added to the medium, normal cells are rapidly taken up into mitochondria and show red fluorescence (~ 590 nm; FL-2), while cells with mitochondrial membrane potential depolarized , Present in the cytoplasm without being taken up by mitochondria and exhibiting green fluorescence (（525 nm; FL-1). Therefore, in order to detect cells in which the mitochondrial membrane potential was depolarized, the ratio of green fluorescence-positive cells was graphed and used as an index of apoptosis.
[0045]
FIG. 7 shows the results. From the results shown in FIG. In the order of 16, 4, and 5, it can be assumed that the activity of reducing the expression level of the HDAC6 protein is high. From the results in FIG. 6, it can be seen that the proportion of cells in which the mitochondrial membrane potential is depolarized occurs in proportion to the decrease in the expression level of HDAC6 protein. Phosphorus acetylation is promoted, and the mitochondrial membrane potential is depolarized, which is considered to be causing apoptosis.
[0046]
Example 8 . Antisense phosphorothioate oligonucleotide No. 16 (SEQ ID NO: 18) Using HDAC6 Suppression of protein expression and thereby enhancement of α-tubulin acetylation
Oligonucleotide No. HepG2 cells (Hepatocellular @ carcinoma), SW480 using 16 (SEQ ID NO: 18) (referred to as HDAC6 @ ASO in this example) and the control oligonucleotide CCCTCTTACCT @ CAGTTACAAT (SEQ ID NO: 31) (see Example 4). The suppression of HDAC6 protein expression and the enhancement of α-tubulin acetylation by antisense oligonucleotides in cells (Colon @ adenocarcinoma), LoVo cells (Colon @ adenocarcinoma) or Calu-1 (Lung @ epidermoid @ carcinoma) were tested.
[0047]
The synthesized antisense oligonucleotide was dissolved in sterilized water, and introduced into the cells using OligofectAMINE (Invitrogen) using the attached protocol. Cells were HepG2 cells 5 × 10⁵Cells / well, SW480 cells 4 × 10⁵Cells / well, LoVo cells 4 × 10⁵Cells / well, or Calu-1 cells 2 × 10⁵Cells were seeded at a cell / well concentration in a 6-well plate, the final concentration of antisense oligonucleotide was 200 nM, and OligofectANINE was used at 3 μL / well. All cells were cultured in RPMI 1640 medium (GIBCO) + 10% FCS (fetal calf serum).
Forty-eight hours after the introduction of the antisense oligonucleotide, the cells were detached with trypsin, collected, lysed with SDS-PAGE sample buffer (without BPB), quantified for proteins, and lysed at 20 μg / lane. The product was separated by SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane, and subjected to anti-acetylated α-tubulin antibody (clone @ 6-IIB-1, Sigma), anti-α-tubulin antibody (clone @ DM1A, Sigma) or anti-α-tubulin antibody (clone @ DM1A, Sigma). -Immunoblot with HDAC6 antibody (H-300, Santa Cruz).
[0048]
As shown in FIG. 16 (HDAC6ΔASO) was confirmed to reduce the expression level of HDAC6 in all cells used in the experiment. The control antisense oligonucleotide, as expected, did not have the activity to cause reduced expression of HDAC6 protein. This confirmed that α-tubulin was deacetylated by the HDAC6 protein.
[0049]
Example 9 . Antisense oligonucleotide No. 16 by HDAC6 Induction of mitochondrial membrane potential depolarization due to decreased protein expression
In a 6-well plate containing RPMI1640 medium (GIBCO) + 10% FCS, HepG2 cells 5 × 10⁵Cells / well, SW480 cells 4 × 10⁵Cells / well, LoVo cells 4 × 10⁵Cells / well, or Calu-1 cells 2 × 10⁵Cells / well were seeded and HDAC6 antisense oligonucleotide No. no. 16, or control oligonucleotides were introduced by 3 μL / well of OligofectAMINE and incubated for 48 hours. For Paclitaxel-treated controls, cells were incubated with 1 μM paclitaxel for 24 hours. After the incubation, Mitochondrial @ potentialsensor @ JC-1 (Molecular @ Probes) was added to a final concentration of 10 .mu.g / mL, and further incubated at 37.degree. C. for 10 minutes. After 10 minutes, the cells were detached by trypsin treatment, collected, and analyzed using FACS®caliber (Becton @ Dickinson).
[0050]
FIG. 9 shows the results. From the results in FIG. No. 16 can be presumed to have an activity of reducing the expression level of HDAC6 protein. From the results shown in FIG. 9, it is considered that inhibition of the function of HDAC6 promotes acetylation of α-tubulin in cells and further causes depolarization of mitochondrial membrane potential, thereby causing apoptosis.
[0051]
Example 10 . Antisense oligonucleotide No. 16 -Induced apoptosis reduces cell number
In a 6-well plate containing RPMI1640 medium (GIBCO) + 10% FCS, HepG2 cells 5 × 10⁵Cells / well, SW480 cells 4 × 10⁵Cells / well, LoVo cells 4 × 10⁵Cells / well, or Calu-1 cells 2 × 10⁵Cells / well were seeded and HDAC6 antisense oligonucleotide No. no. 16, or control oligonucleotides were introduced by 3 μL / well of OligofectAMINE and incubated for 48 hours. For Paclitaxel-treated controls, cells were incubated with 1 μM paclitaxel for 24 hours. After the incubation, the cells were collected, and the number of cells was measured using a hemocytometer.
[0052]
The results are shown in FIG. From the results in FIG. No. 16 has an activity of reducing the expression level of HDAC6 protein, and can be presumed to induce cell death.
From the results of Examples 8 to 10, even in cancer cells other than HeLa cells, by suppressing the generation of HDAC6, green fluorescence-positive cells were detected by JC-1 staining, and a decrease in the number of cells was observed. This suggests that cell death by apoptosis via mitochondria is induced.
[0053]
Example 11 . Antisense oligonucleotide No. 16 by HDAC6 Changes in microtubule structure due to decreased protein expression
HeLa cells were seeded on Lab-TekII Chambered （Coverglass (Nunc),
(1) Treatment with microtubule polymerization agent, 1 μM @ Pacaritaxel (Sigma) for 16 hours,
(2) treatment with 1 μM trichostatin A (Wako), which is an HDAC inhibitor, for 16 hours, or
(3) HDAC6 antisense oligonucleotide No. 16 was introduced at a final concentration of 200 nM by OligofectAMINE and cultured for 24 hours.
Colcemid (Colcemid; a derivative of colchicine) was dissolved in ethanol and added to the medium to a final concentration of 1 μM, and treated for 15 minutes (the time when microtubules almost disappeared without pretreatment).
[0054]
Then, Lab-TekII Chambered Coverglass was washed with 0.1 M PIPES (pH 6.9), fixed with 0.5% glutaraldehyde / 0.1 M PIPES (pH 6.9) for 10 minutes, and washed three times with PBS. Permealize three times with 0.5% Triton-X100 / PBS for 5 minutes, wash three times with PBS, and treat three times with 2.5 mg / mL sodium borohydride / 50% ethanol for 10 minutes each. Then, the plate was washed three times with PBS, blocked with 10% normal goat serum / PBS, reacted with a primary antibody, rat anti-α-tubulin monoclonal antibody (MAB1864; CHEMICON) / PBS, for 1 hour, % Tween 20 / PBS three times, and Alexa, a secondary antibody Luor 488 conjugated anti - rat IgG (Molecular Probe) / PBS and the reaction allowed for 30 minutes and washed 3 times with 0.1% Tween 20 / PBS, and observed with a confocal laser microscope (Carl Zeiss).
[0055]
The result is shown in FIG. In cells treated with colcemide without pretreatment, microtubules disappeared, whereas in cells treated with paclitaxel, a microtubule polymerization promoter, trichostatin A that inhibits HDAC6, or HDAC6 antisense oligonucleotide, An image of the remaining microtubules was observed. This is presumably because inhibition or suppression of HDAC6 promoted α-tubulin acetylation and stabilized microtubules.
[0056]
[Industrial applicability]
According to the present invention, it has been found that inhibition of histone deacetylase 6 (HDAC6) enhances acetylation of α-tubulin, thereby inducing apoptosis, and a substance inhibiting HDAC6 is promising as an anticancer agent. The thing was shown. Therefore, the present invention provides apoptosis inducers that are promising as anticancer agents. The present invention further provides a method for screening an apoptosis-inducing agent that is promising as an anticancer agent.
[0057]
[Sequence list]

[0058]

[0059]

[0060]

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[0070]

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[0075]

[0076]

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[0080]

[0081]

[0082]

[0083]

[0084]

[0085]

[0086]

[0087]

[0088]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing that the recombinant HDAC6 produced in the present invention has deacetylation activity, and the activity is inhibited by trichostatin A.
FIG. 2 is a Western blot diagram showing that HDAC6 deacetylates acetylated α-tubulin, and is a photograph substituted for a drawing.
FIG. 3 is a Western blot showing that some of the tested HDAC6 antisense oligonucleotides suppress HDAC6 expression and enhance α-tubulin acetylation. It is a photograph.
FIG. 4 shows HDAC6 antisense oligonucleotide No. FIG. 4 is a Western blot drawing showing that HDAC6 production suppression and α-tubulin acetylation are enhanced by changing the treatment time for 4, 5, 6, and 16 and the negative control oligonucleotide. .
FIG. 5 shows the HDAC6 antisense oligonucleotide No. 1 of the present invention. 4 is a micrograph showing that microtubules were polymerized in the cytoplasm of HeLa cells by the treatment in Example 4, and is a photograph substituted for a drawing.
FIG. 6 shows the HDAC6 antisense oligonucleotide No. 1 of the present invention. It is a graph which shows that 4, 5, and 16 induce apoptosis in HeLa cells when judged by AnnexinΔV positive.
FIG. 7 shows the HDAC6 antisense oligonucleotide No. 1 of the present invention. 4 is a graph showing that mitochondrial depolarization is induced in HeLa cells as determined by JC-1 staining.
FIG. 8 shows the HDAC6 antisense oligonucleotide No. 1 of the present invention. FIG. 13 is a Western blot showing that HDAC6 production is suppressed in various human cancer cells and α-tubulin acetylation is enhanced by treatment with No. 16.
FIG. 9 shows that HDAC6 antisense oligonucleotide No. 1 of the present invention, as determined by JC-1 staining. 16 is a graph showing that various human cancer cells induce mitochondrial depolarization.
FIG. 10 is a graph showing that the HDAC6 antisense oligonucleotide of the present invention induces cell death in various human cancer cells.
FIG. 11 shows the HDAC6 antisense oligonucleotide No. 1 of the present invention. FIG. 16 is a photograph showing that microtubules are stabilized and inhibit the disappearance of microtubules by colcemide.
FIG. 12 shows cloning of HDAC6 full-length cDNA and construction of Transfer @ Vector for baculovirus.
FIG. 13 is a continuation of FIG. 12;
FIG. 14 shows construction of a vector for expressing HADC6 in animal cells.

Claims

An apoptosis inducer comprising a substance that inhibits histone deacetylase 6 (HDAC6).

The apoptosis-inducing agent according to claim 1, wherein the substance that inhibits histone acetylase 6 (HDAC6) is a nucleic acid or a peptide.

The apoptosis-inducing agent according to claim 2, wherein the nucleic acid is an antisense oligonucleotide or ribozyme of histone deacetylase 6 (HDAC6).

The apoptosis-inducing agent according to claim 2, wherein the nucleic acid is an antisense oligonucleotide of histone deacetylase 6 (HDAC6).

The method according to claim 4, wherein the antisense oligonucleotide has a nucleotide sequence complementary to a sequence containing the translation initiation codon ATG of the gene for histone deacetylase 6 (HDAC6), or complementary to a sequence around the initiation codon. An apoptosis-inducing agent as described above.

The antisense oligonucleotides are CATAGTTGAG @ GAGGCTTGGC (SEQ ID NO: 3), TCCTGGCCGG @ TTGAGGGTCAT (SEQ ID NO: 4), GGTTGAGGGTCATAGTTGAGG (SEQ ID NO: 5), CCCTGCCGCG @ GTCTGTCGCT or GTCTGCTGCTC (SEQ ID NO. The apoptosis-inducing agent according to claim 5, which has the nucleotide sequence of (1).

The antisense nucleotide is CCTGTCACCGTGGTGCACATC (SEQ ID NO: 10), GTGGTGCACA @ TCCCAATCTA (SEQ ID NO: 11), CCATTACCCGT @ GGTGGACATC (SEQ ID NO: 12), GTGGTGGACA @ TCCCAATCCA (SEQ ID NO: GATGCATGCATGCATGCATGCGTGCATGCGTGCATGCGTGCATGCGTGCATGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTGCGTCGATGCGTCC Or an apoptosis-inducing agent according to claim 4, which has a nucleotide sequence of TCCGTAGGGCATGCCCACTG (SEQ ID NO: 18).

An anticancer agent comprising the apoptosis-inducing agent according to any one of claims 1 to 7 as an active ingredient.

A method for screening for an apoptosis-inducing substance that inhibits histone deacetylase 6 (HDAC6).

The method of screening for an apoptosis-inducing substance,
(1) Whether a test substance inhibits histone deacetylase 6 (HDAC6) is determined by deacetylation of an acetylated substance that can be a substrate of histone deacetylase 6 (HDAC6) or histone deacetylase 6 (HDAC6). Decreased expression is determined as an index,
(2) In the case of inhibition, it is further confirmed whether the cell causes apoptosis in vitro and / or in vivo,
The screening method according to claim 9, comprising: