JP2003530894A

JP2003530894A - 選択的にスプライシングされた遺伝子の発現をモニターするための方法

Info

Publication number: JP2003530894A
Application number: JP2001578702A
Authority: JP
Inventors: デイビッドバラバン，
Original assignee: アフィメトリックスインコーポレイテッド
Priority date: 2000-04-25
Filing date: 2001-04-24
Publication date: 2003-10-21
Also published as: US20070248975A1; US20060141506A1; EP1285089A1; US20050214824A1; AU2001257239A1; CA2406402A1; WO2001081632A1; EP1285089A4; WO2001081632A9

Abstract

(57)【要約】本発明は、選択的スプライシングの産物のような配列バリエーションを分析するための、方法、組成物、およびコンピューターソフトウェアを提供する。本発明のこれらの方法、組成物、およびコンピューターソフトウェア製品は、多数の選択的スプライシングされたｍＲＮＡを分析するために特に有用である。いくつかの実施形態において、ＥｘｏｎＣｈｉｐを作製および使用するための方法、組成物およびコンピューターソフトウェアが提供される。本発明のＥｘｏｎＣｈｉｐは、選択的スプライシング、選択的プロモーター、ＲＮＡ編集などによる遺伝子調節を分析するために特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本願は、米国仮出願番号６０／１９９，４８４（２０００年４月２５日出願）
および米国仮出願番号６０／２０８，７９４（２０００年６月１日出願）（これ
らの両方は、全ての目的のために本明細書中に参考として援用される）の利益を
主張する。

【０００２】（発明の背景）米国特許第５，４２４，１８６号および同第５，４４５，９３４は、先駆的な
技術、なかでも、分子（例えば、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ペプチド、多糖
、および他の材料）の高密度アレイを形成および使用するための技術を記載する
。これらの特許は、全ての目的のために本明細書中に参考として援用される。例
えば、オリゴヌクレオチドまたはペプチドのアレイは、表面から光で除去可能な
基を連続的に除去し、表面の曝露された領域にモノマーをカップリングし、そし
てこのプロセスを反復することによって表面上に形成される。これらの技術は、
オリゴヌクレオチド、ペプチド、および他の材料の極度に密集したアレイを形成
するために使用されている。このようなアレイは、例えば、薬物開発、遺伝子発
現のモニタリング、遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）、および種々の他の
適用において有用である。

【０００３】核酸プローブアレイ技術の開発は、多数の遺伝子の複雑な発現調節を研究する
ための手段を提供する。例えば、米国特許第６，０４０，１３８号は、多数の遺
伝子の発現をモニタリングするためのプロセスを記載する。遺伝子発現調節の１
つの重要な局面は、選択的スプライシング（これによって異なるｍＲＮＡが単一
遺伝子から生成されるプロセス）である。いくつかの場合、単一遺伝子の発現は
、多数の異なるｍＲＮＡを生じ得、故に、多数の異なる機能するタンパク質を生
じ得る。例えば、６４個の異なるｍＲＮＡ改変体が、単一遺伝子から生成され得
ることが示されている。選択的スプライシングは、非常に一般的な調節機構であ
る。１つの推定に基づいて、少なくとも３０％の遺伝子が、選択的スプライシン
グされる。従って、選択的スプライシングのモニタリングは、薬物発見、治療モ
ニタリング、および診断のための情報を提供する。従って、選択的スプライシン
グされたｍＲＮＡをより効率的に決定するための方法に関する多大なる必要性が
当該分野に存在する。

【０００４】（発明の要旨）従って、本発明は、選択的スプライシングの産物のような配列バリエーション
を分析するための、方法、組成物、およびコンピューターソフトウェアを提供す
る。本発明のこれらの方法、組成物、およびコンピューターソフトウェア製品は
、多数の選択的スプライシングされたｍＲＮＡを分析するために特に有用である
。いくつかの実施形態において、ＥｘｏｎＣｈｉｐを作製および使用するため
の方法、組成物およびコンピューターソフトウェアが提供される。本発明のＥｘ
ｏｎＣｈｉｐは、選択的スプライシング、選択的プロモーター、ＲＮＡ編集な
どによる遺伝子調節を分析するために特に有用である。しかし、ＥｘｏｎＣｈ
ｉｐの有用性は、遺伝子調節を分析することに限定されない。これらのチップは
、一般的に、配列エレメント（例えば、エキソン）の配置を分析するために使用
され得る。生物学的サンプル中で特定の配列の配置を同定し得ることに加えて、
本発明のエキソンチッププローブアレイはまた、特定の配列を定量するために有
用である。このようなプローブアレイは、遺伝子発現（特に、選択的スプライシ
ング、選択的プロモーター、ＲＮＡ編集などによって調節される遺伝子）のより
良い理解のために使用され得る。

【０００５】本発明の１つの局面において、第１配列エレメントと第２配列エレメントとの
間の結合配列を問い合わせる（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）ためのプローブセット
を含む核酸プローブアレイが、提供される。いくつかの実施形態において、プロ
ーブアレイ上のプローブは、オリゴヌクレオチドである。第１配列エレメントは
、第１エキソンであり得、そして第２配列エレメントは、第２エキソンであり得
る。結合配列は、第１配列と第２配列との間の連結部に隣接する配列の部分であ
る。これらの配列エレメントがエキソンの場合、結合配列は、一方のエキソンの
３’配列、かつ他方のエキソンの５’配列である。結合配列は、少なくとも２０
塩基長、好ましくは少なくとも３０塩基長、より好ましくは少なくとも４０塩基
長、さらにより好ましくは少なくとも５０塩基長、そして最も好ましくは１００
塩基長であるべきである。

【０００６】いくつかの好ましい実施形態において、プローブセットは、少なくとも１００
プローブ／ｃｍ^２、好ましくは少なくとも１０００プローブ／ｃｍ^２、より好ま
しくは少なくとも２０００プローブ／ｃｍ^２の密度で基材上に固定される。アレ
イは、配列エレメントを定量するために設計されたプローブを含み得る。例えば
、アレイは、エキソンの内部配列を標的化するプローブを含み得る。必要に応じ
て、種々の型のコントロールプローブは、本発明のアレイ上に含まれ得る。

【０００７】本発明の別の局面において、標的配列を決定するための方法が提供され、ここ
で、この標的配列は、第２配列エレメントに結合した第１配列エレメントを含む
。いくつかの実施形態において、この方法は、第１配列エレメントと第２配列エ
レメントとの間の結合配列を問い合わせるためのプローブセットを有する核酸プ
ローブアレイと標的配列とをハイブリダイズする工程、およびプローブセットと
標的配列とのハイブリダイゼーションに基づいて、結合配列に関する情報を得る
工程を包含する。第１配列エレメントおよび第２配列エレメントは、エキソンで
あり得る。核酸プローブのセットは、好ましくは少なくとも１００プローブ／ｃ
ｍ^２の密度で基材上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブであり得る。いく
つかの実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、遺伝子か
ら転写された少なくとも２つの選択的スプライシングされたｍＲＮＡのうちの１
つであり得る。この方法はまた、結合配列およびハイブリダイゼーションに関す
る情報を用いて第１配列エレメントおよび第２配列エレメントを定量する工程を
包含し得る。

【０００８】いくつかの実施形態において、本発明の核酸プローブアレイは、第１配列エレ
メントおよび第２配列エレメントに対する更なる配列プローブを有し得る。定量
は、標的配列と、第１配列エレメントおよび第２配列エレメントの内部配列に対
する配列プローブとのハイブリダイゼーションに基づき得る。問い合わせるため
のプローブは、少なくとも２０塩基長、好ましくは少なくとも３０塩基長、より
好ましくは少なくとも４０塩基長、そしてさらにより好ましくは少なくとも５０
塩基長、そして最も好ましくは１００塩基長であるべきである結合配列をタイリ
ングするためのプローブである。

【０００９】本発明のなお別の局面において、コンピューターソフトウェア製品が提供され
る。この製品は、以下を備え得る：複数のハイブリダイゼーションシグナルを受
けるコンピューターコード（ここで、複数のシグナルの各々は、標的配列の結合
配列を問い合わせるための複数のタイリングプローブのうちの１つのハイブリダ
イゼーションを反映し、ここで、標的配列は、少なくとも２つの配列エレメント
の群から選択される少なくとも１つの配列エレメントを有する）；ｂ）上記のハ
イブリダイゼーションシグナルに基づいて配列エレメントを同定するコンピュー
ターコード；ならびにｃ）上記のコードを保存するコンピューター読み取り可能
な媒体。このタイリングプローブは、基材に固定されたオリゴヌクレオチドであ
る。このタイリングプローブは、少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも３
０塩基、より好ましくは少なくとも４０塩基、さらにより好ましくは少なくとも
５０塩基、そして最も好ましくは少なくとも１００塩基を問い合わせる。このコ
ンピューターソフトウェアは、標的配列を定量するためのコンピューターコード
を備え得る。

【００１０】なお別の局面において、２つの配列エレメントの組み合わせを検出するために
プローブを設計するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、こ
の方法は、２つの配列エレメント間の結合領域の配列を入力する工程；ならびに
結合領域の配列に基づいて、上記結合領域をタイリングするためのプローブを選
択する工程を包含する。好ましい実施形態において、配列エレメントは、エキソ
ンである。いくつかの実施形態において、本発明の方法はまた、平板マスクを設
計する工程を包含し、ここで、平板マスクは、核酸プローブのアレイの製作に使
用される。いくつかの他の実施形態において、本発明の方法は、基材上に化合物
を沈着させるためのインクジェット印刷機構を制御するための出力信号の工程を
包含する。問い合わせられる結合領域の配列は、少なくとも２０塩基、好ましく
は少なくとも３０塩基、より好ましくは少なくとも４０塩基、さらにより好まし
くは少なくとも５０塩基、そして最も好ましくは１００塩基である。

【００１１】本発明のエキソンチップを設計するためのコンピューターソフトウェア製品が
また、提供される。いくつかの実施形態において、コンピューターソフトウェア
製品は、結合配列を構築するコンピュータープログラムコード；結合配列を問い
合わせるためのタイリングプローブを選択するコンピュータープログラムコード
；ならびにそのコードを保存するコンピューター読み取り可能な媒体を備える。
結合配列は、選択的スプライシングされたｍＲＮＡのうちの１つに関する結合配
列であり得る。いくつかの実施形態において、コンピューターソフトウェア製品
はまた、エキソン配列を入力するコンピューターコードを備える。この結合配列
は、エキソン配列に基づいて構築される。コンピューターソフトウェア製品は、
プローブ配列を出力するコードを備え得る。

【００１２】（好ましい実施形態の説明）ｍＲＮＡは、しばしば、配列エレメントの組み合わせの結果である。例えば、
成熟ｍＲＮＡは、ＲＮＡスプライシングの結果であり得、ここで、イントロンか
ら転写される配列は除かれている。配列エレメントの組み合わせは、選択的形式
で設定され得る。本発明のいくつかの実施形態において、核酸の設定（エキソン
などの配列エレメントの配置）を同定するための、方法、組成物、コンピュータ
ーソフトウェア製品およびシステムが、提供される。方法、組成物、コンピュー
ターソフトウェア製品およびシステムは、ｍＲＮＡの同時の定量および特徴づけ
のために特に有用である。

【００１３】（Ｉ．配列エレメントの検出）遺伝子の活性は、その産物（その遺伝子によってコードされるタンパク質また
は他の分子）の活性によって反映される。これらの産物分子は、生物学的機能を
発揮する。しかし、遺伝子産物の活性を直接的に測定することは、しばしば特定
の遺伝子について困難である。その代わり、最終産物の免疫学的活性もしくは量
またはそのペプチドプロセシング中間体が、遺伝子活性の測定として決定される
。より頻繁に、中間体（例えば、転写物、ＲＮＡプロセシング中間体、または成
熟ｍＲＮＡ）の量または活性が、遺伝子活性の測定として検出される。用語「ｍ
ＲＮＡ」は、遺伝子の転写物をいう。転写物は、ＲＮＡ（例えば、翻訳の用意が
整った成熟メッセンジャーＲＮＡを含む）、転写物プロセシングの種々の段階の
生成物である。転写物プロセシングは、スプライシング、編集および分解を含み
得る。

【００１４】多くの場合、遺伝子の最終産物の形態および機能は、未知である。これらの場
合、遺伝子の活性は、転写物、ＲＮＡプロセシング中間体、成熟ｍＲＮＡまたは
そのタンパク質産物の量または活性によって簡便に測定される。

【００１５】転写単位は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡの連続セグメントである。例えば、細
菌は、いくつかの連続する遺伝子を連続的に転写して、ポリシストロン性ｍＲＮ
Ａを作製し得る。連続する遺伝子は、同じ転写単位由来である。高等生物がまた
、単一転写単位から種々の異なる遺伝子産物を作製するためのいくつかの機構を
使用することは、当該分野で周知である。

【００１６】多くの遺伝子は、いくつかの選択的プロモーター（各プロモーターの使用は、
１つの特定の転写物をもたらす）を有することが公知である。一般的に、５’プ
ロモーターの使用は、相対的に３’プライマーから生じる産物が存在しない、さ
らなる配列エレメントを有する産物を生じる。選択的プロモーターの使用は、し
ばしば、組織特異的遺伝子発現を調節するために使用される。例えば、ヒトジス
トロフィン遺伝子は、少なくとも７個のプロモーターを有する。最も５’上流の
プロモーターは、脳特異的転写物を転写するために使用され；第１のプロモータ
ーから１００ｋｂ下流のプロモーターは、筋肉特異的転写物を転写するために使
用され、そして第２のプロモーターの１００ｋｂ下流のプロモーターは、プルキ
ニェ細胞特異的転写物を転写するために使用される。

【００１７】同様に、選択的スプライシングもまた、頻繁に、組織特異的様式で遺伝子活性
を調節するために重要な機構である。真核生物では、新生プレｍＲＮＡは一般に
、タンパク質に翻訳されない。むしろ、これらは、いくつかの方法でプロセシン
グされて、成熟ｍＲＮＡを生成する。ＲＮＡスプライシングは、最も普通のＲＮ
Ａプロセシング方法である。新生プレｍＲＮＡは、スプライソソームと呼ばれる
特化された装置によって切断され、そして貼り付けられる。イントロン領域から
転写されたいくつかの非コード領域は切り出される。エキソンは連結されて、翻
訳の用意ができた連続したコード領域を形成する。いくつかのスプライシング反
応では、１種類の新生プレｍＲＮＡを用いて、選択的スプライシングと呼ばれる
プロセスによって複数種類の成熟ＲＮＡが生成される。選択的スプライシングで
は、エキソン（配列エレメント）が選択的に用いられて異なる成熟ｍＲＮＡを形
成し、この成熟ｍＲＮＡは、異なるタンパク質をコードする。例えば、ヒトのカ
ルシトニン遺伝子（ＣＡＬＣ）は、甲状腺においてカルシトニン（循環するＣａ^２＋恒常性ホルモン）として；視床下部においてカルシトニン遺伝子関連ペプチ
ド（ＣＧＲＰ）（神経調節および栄養因子）としてスプライシングされる（Ｈｏ
ｄｇｅｓおよびＢｅｒｎｓｔｅｉｎ，１９９４，Ａｄｖ．Ｇｅｎｅｔ．，３１，
２０７−２８１を参照のこと）。

【００１８】選択的スプライシングは、高等真核生物における重要な調節機構である（Ｓｈ
ａｒｐ，Ｐ．Ａ．（１９９４）Ｃｅｌｌ．，７７，８０５−８１５２）。最近の
見積もりによれば、少なくとも３０％のヒト遺伝子は選択的にスプライシングさ
れる（Ｍｉｒｏｎｏｖ，Ａ．Ａ．およびＧｅｌｆａｎｄ，Ｍ．Ｓ．Ｐｒｏｃ．１
ｓｔＩｎｔ．Ｃｏｎｆ．ｏｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｏｆＧｅ
ｎｏｍｅＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ，１９９８．第２巻，２４９頁）。選択的スプ
ライシングは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの性決定において、ヒトの抗体応答におい
て、および他の組織または発生段階特異的なプロセスにおいて主な役割を果たす
（Ｓｔａｍｍ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｍ．Ｑ．，Ｍａｒｒ，Ｔ．Ｇ．およびＨｅｌ
ｆｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，１９９４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２２
，１５１５−１５２６；Ｃｈａｂｏｔ，Ｂ．，１９９６，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎ
ｅｔ．，１２，４７２−４７８；Ｂｒｅｉｔｂａｒｔ，Ｒ．Ｅ．，Ａｎｄｒｅａ
ｄｉｓ，Ａ．およびＮａｄａｌＧｉｎａｒｄ，Ｂ．，１９８７，Ａｎｎｕ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，４６７−４９５；Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｗ．，Ｐａ
ｔｔｏｎ，Ｊ．Ｇ．およびＮａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ，Ｂ．，１９８９，Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２３，５２７−５７）。選択的スプライシングは、
単一の転写産物から６４までの異なるｍＲＮＡ改変体を生成し得る（Ｂｒｅｉｔ
ｂａｒｔ，Ｒ．Ｅ．およびＮａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ，Ｎ．１９８７，Ｃｅｌｌ
，４６，７９３−８０３）。全ての引用文献は、全ての目的のために本明細書中
に参考として援用される。

【００１９】高密度アレイは、転写レベル、ＲＮＡプロセシングレベルおよび分解レベルで
発現制御をモニタリングするために特に有用である。高密度アレイの製造および
遺伝子発現モニタリングにおける高密度アレイの適用は、以前に、例えば、本明
細書中に全ての目的のために参考として援用されている米国特許第６，０４０，
１３８号に開示されている。高密度アレイを用いるいくつかの実施形態では、高
密度オリゴヌクレオチドアレイは、本全ての目的で明細書中に参考として援用さ
れる米国特許第５，４４５，９３４号に開示される超大規模固定化ポリマー合成
（ＶＬＳＩＰＳ）のような方法を用いて合成される。各オリゴヌクレオチドは、
基板上で既知の位置を占める。核酸標的サンプルは、オリゴヌクレオチドの高密
度アレイとハイブリダイズされ、次いでアレイ中の各プローブにハイブリダイズ
した標的核酸の量が定量される。１つの好ましい定量方法は、共焦点顕微鏡およ
び蛍光標識を使用することである。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）システム（Ａ
ｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）は、ハイブリダイゼーシ
ョンを定量するために特に適切である；しかし、当業者には、任意の同様のシス
テムまたは他の有効に等価な検出方法もまた用いられ得ることが明らかである。

【００２０】高密度アレイは、大集団の不均質核酸の存在下で、遺伝子の発現レベルにおけ
る小さなバリエーションを定量するために適切である。このような高密度アレイ
は、基板上でのデノボ合成または基板の特定の位置への天然の核酸配列のスポッ
ティングもしくは輸送のいずれかによって製造され得る。核酸は、生物学的材料
（例えば、目的の配列のクローニングセグメントを含む細菌プラスミド）から精
製および／または単離される。

【００２１】オリゴヌクレオチドアレイは、本発明のために特に好ましい。オリゴヌクレオ
チドアレイは、他の方法とは対照的に多数の利点（例えば、生成効率、アレイ内
およびアレイ間の変異性の減少、情報量の増加、ならびに高いシグナル対ノイズ
比）を有する。

【００２２】遺伝子機能同定および遺伝的ネットワークマッピングのための好ましい高密度
アレイは、約１００より大きい、好ましくは約１０００より大きい、より好まし
くは約１６，０００より大きい、そして最も好ましくは６５，０００もしくは２
５０，０００よりも大きいか、または約１，０００，０００よりもさらに大きい
、異なるオリゴヌクレオチドプローブを好ましくは１ｃｍ^２未満の表面積に含む
。オリゴヌクレオチドプローブは、約５ヌクレオチド長〜約５０ヌクレオチド長
または約５００ヌクレオチド長、より好ましくは約１０ヌクレオチド長〜約４０
ヌクレオチド長、そして最も好ましくは約１５ヌクレオチド長〜約４０ヌクレオ
チド長の範囲にわたる。

【００２３】エキソン配列を標的とするプローブを含むオリゴヌクレオチドプローブアレイ
は、種々の転写産物を検出および定量するように選択され得る。これらのエキソ
ンプローブを用いることによって、生物学的サンプル中の特定のエキソンの存在
が決定され得る。以下の節では、特定の配置（配列エレメントの配置）の標的核
酸を検出および定量するためのプローブアレイを設計するための方法が提供され
る。

【００２４】（ＩＩ．配列エレメントの組合せを検出するためのプローブ）本発明の１つの局面では、配列エレメントの配置を決定し、そして必要に応じ
て定量するための核酸プローブが提供される。これらのプローブは好ましくは、
プローブアレイとして基板上に固定される。

【００２５】本発明のいくつかの実施形態では、２つの配列エレメントを連結する領域の配
列を問い合わせるためのプローブセットが設計される（図２を参照のこと）。一
旦、２つの配列エレメントを連結する領域の配列が公知になると、配列エレメン
トの組合せが確認され得る。例えば、図２に示すように、２つの配列エレメント
１および２は、以下を形成するために選択的に用いられ得る：配置１：エレメント１−エレメント３配置２：エレメント２−エレメント３。

【００２６】エレメント１とエレメント３、およびエレメント２とエレメント３を連結する
領域を敷き合わせる（ｔｉｌｉｎｇ）ためのプローブセットは、配置１および配
置２の存在を決定するために設計され得る。ハイブリダイゼーションシグナルも
また配列のレベルを反映するので、生物学的サンプル中の配置１および配置２の
相対的レベルもまた決定され得る。多数のｍＲＮＡのレベルを定量的に決定する
ための方法は、例えば、全ての目的のために本明細書中に参考として援用される
、米国特許第６，０４０，１３８号に開示される。

【００２７】１つの実施形態（図３）では、プローブは、３つのエキソン（５’から３’に
、エキソン１、エキソン２およびエキソン３）を有する標的遺伝子の転写産物を
検出するために設計され得る。この実施形態では、第一のセットのプローブを、
エキソン１の３’領域とエキソン２の５’領域とを敷き合わせるために設計した
。第二のセットのプローブは、エキソン１の３’領域とエキソン３の５’領域と
を敷き合わせるために設計される。第三のセットのプローブは、エキソン２の３
’領域とエキソン３の５’領域とを敷き合わせるために設計される。プローブセ
ットの敷き合わせ領域は、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも２０塩基
、そしてより好ましくは少なくとも４０塩基であり得る。いくつかの例では、敷
き合わせ領域は、少なくとも１００塩基であり得る。

【００２８】図４は、４つのエキソンを有する遺伝子を示す。エキソン１は、スプライスさ
れてエキソン２、エキソン３またはエキソン４と連結され得る。エキソン２は、
スプライスされて、エキソン３またはエキソン４と連結され得る。エキソン３お
よびエキソン４は、連結され得る。敷き合わせプローブ（エキソンの下の小さな
バー）は、連結配列を問い合わせるように設計される。決定された配列に基づい
て、種々の配置が確認され得る。

【００２９】再配列目的で領域を敷き合わせるためのプローブを設計するための方法は、例
えば、米国特許第５，５７１，６３９号およびＣｈｅｅら、１９９６，Ａｃｃｅ
ｓｓｉｎｇＧｅｎｅｔｉｃＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｗｉｔｈＨｉｇｈ−
ＤｅｎｓｉｔｙＤＮＡＡｒｒａｙｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：６１０−６
１４（両方とも全ての目的で本明細書中に参考として援用される）に開示された
。

【００３０】本発明の方法は、広範な適用を有する。例えば、いくつかの実施形態では、本
発明の方法は、スプライス改変体の相対レベルを決定するために用いられ得る。
相対スプライス改変体を決定することによって、選択的スプライシングによる遺
伝子発現の調節が理解され得、この調節は次いで、疾患検出、薬物の発見および
医学的処置のモニタリングについての重要な情報を提供し得る。

【００３１】本発明の方法は、エキソンの境界が完全に既知である遺伝子の研究には限定さ
れない。対照的に、張り合わせプローブセットの使用のために、本発明の方法は
、エキソン境界についての知識のいくらかのあいまいさを可能にする。このプロ
ーブセットは、正確なスプライシング部位を理解するために有用であり得る。

【００３２】当業者は、本発明の方法が、スプライス改変体の研究に制限されないことを認
識する。その代わり、この方法は一般に、任意の核酸配列エレメントの配置の研
究に適用可能である。例えば、この方法はまた、体細胞組換えおよびＲＮＡ編集
を決定するために有用である。

【００３３】（ＩＩＩ．プローブを設計するための方法、システムおよびコンピュータソフ
トウェア）プローブセットを設計するための方法、システムおよびコンピュータソフトウ
ェアもまた提供される。いくつかの実施形態では、プローブを設計するための方
法は、少なくとも２つの配列エレメント（例えば、２つのエキソン）の配列情報
を得る工程を含む。２つの配列エレメントの間の可能な連結領域が同定される。
領域を敷き合わせるためのプローブが選択される。

【００３４】他のいくつかの実施形態では、遺伝子のゲノムＤＮＡ配列が得られる。イント
ロンエキソン構造が予想される。いくつかのスプライシング部位断定アルゴリズ
ムの制限のために、スプライス部位は、いくらかあいまいに決定され得る。予想
されたエキソンの間の連結領域を張り合わせるためのプローブが選択される。

【００３５】いくつかのさらなる実施形態では、エキソン／イントロン境界は、転写産物の
配列とゲノムの配列とを比較することによって決定され得る。２つのエキソンを
連結する領域を張り合わせるためのプローブが選択される。

【００３６】図５は、プローブのコンピューター支援選択のためのプロセスを示す。１つの
遺伝子のエキソン配列が入力される（５０１）。選択的にスプライシングされた
ｍＲＮＡのうちの１つについての連結配列がメモリに構築される（５０２）。配
列を問い合わせる敷き合わせプローブが選択される（５０３）。次いで、このプ
ロセスは、この遺伝子由来の全てのｍＲＮＡ改変体が処理されるまで、選択的に
スプライシングされた別のｍＲＮＡについて敷き合わせプローブを選択し続ける
（５０４）。次いで、このプロセスは、別の遺伝子のエキソン配列の入力に進む
（５０１）。

【００３７】いくつかの実施形態では、コンピュータ化システムは、生物学的材料（例えば
、ＲＮＡまたはＤＮＡ）のアレイを形成および分析するために用いられる。デジ
タルコンピュータは、生物学的ポリマー（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）のアレ
イを設計するために用いられる。このコンピュータは、例えば、適切なメモリ、
ＣＰＵおよび他の記録媒体（例えば、ハードドライブ、必要に応じてＣＤ−ＲＯ
ＭまたはＺｉｐドライブ）を含む、適切にプログラムされたＳｕｎＷｏｒｋｓ
ｔａｔｉｏｎまたはＩｎｔｅｌＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）に基づいたパーソ
ナルコンピュータまたはワークステーションであり得る。コンピュータは、ロー
カルエリアネットワークのようなネットワークに接続され得、そして必要に応じ
てプロキシサーバを介してワイドエリアネットワーク（例えば、インターネット
）に接続され得る。コンピュータの、インターネットに対するアクセス能力は、
配列データベースがインターネットを介してアクセスされ得る、いくつかの実施
形態において好適であり得る。

【００３８】コンピュータシステムは、目的の遺伝子の所望の特徴に関してユーザから入力
され、そしてアレイの所望の特徴に関する他の入力がされる。必要に応じて、こ
のコンピュータシステムは、目的の特定の遺伝子配列に関する情報を、外部また
は内部のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃ
ｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ、２０００年４月２５日に最後に訪れた））から
獲得し得る。コンピュータシステムの出力は、チップ設計コンピュータファイル
のセットである。

【００３９】チップ設計ファイルは、ＤＮＡのような分子のアレイの製造において用いられ
るリソグラフマスクを設計するシステムに提供される。このシステムまたはプロ
セスは、マスクを製造するために必要なハードウェア、そしてまた効率的な様式
でマスクにマスクパターンを配置するために必要な、必要なコンピュータハード
ウェアおよびソフトウェアを含み得る。このような装置は、同じ物理的位置に位
置していてもよく、位置していなくてもよい。このシステムは、ポリマーアレイ
の製造において使用するための、ガラス上のクロムマスクのようなマスクを生じ
る。

【００４０】このマスク、ならびにシステム由来のチップの設計に関する選択された情報を
、合成システムに用いる。合成システムは、基板またはチップ上のポリマーのア
レイを製造するために用いた必要なハードウエアおよびソフトウエアを含む。例
えば、合成機（シンセサイザー）は、光源および化学フローセル（この上に基板
またはチップが置かれる）を備える。マスクは、光源と基板／チップとの間に置
かれ得、そしてこの２つは、チップの選択された領域の脱保護のために適切な時
間、お互いに対して平行移動される。選択された化学試薬は、脱保護された領域
にカップリングするために、ならびに洗浄および他の操作のために、フローセル
を通じて方向付けられる。全ての操作は、好ましくは適切にプログラムされたデ
ジタルコンピューターによって指示される。このデジタルコンピューターは、マ
スク設計およびマスク作製において用いたコンピューターと同じコンピューター
であってもよいし、同じでなくてもよい。

【００４１】このチップ上で合成されるべき種々のプローブの配列を選択し、そしてこのチ
ップ上でのこのプローブの物理的整列を決定する。例えば、目的の標的核酸配列
の連結領域は、ｋマーであり、好ましくは、２０より大きく、より好ましくは４
０より大きく、そしてなおより好ましくは１００より大きい。一方、このチップ
上のプローブはｎマーであり、ここでｎはｋより小さい。従って、このチップを
用いて、特定の核酸サンプルが標的核酸の連結領域を含むか否かを決定し得るよ
うに、このチップ上で合成されるｎマーを選択し、そして配置するためのソフト
ウエアが必要である。

【００４２】一般に、配列のタイリングは、標的のｎ塩基ピースをとること、およびそのｎ
塩基ピースに対する相補体を決定することによって実施される。次いでこのシス
テムは、標的を１つの位置に下ろし、そして次のｎビットピースに対する相補体
を同定する。これらのｎ塩基ピースは、この配列がタイリングされる場合にのみ
、このチップ上に配置された配列である。

【００４３】単純な例として、推定標的核酸は、５’−ＡＣＧＴＴＧＣＡ−３’である。こ
のチップはその上に合成された４マーを有することが推定される。目的の核酸に
相補性である４マープローブは、３’−ＴＧＣＡ（最初の４位に相補的）、３’
−ＧＣＡＡ（２、３、４、および５位に相補的）、３’−ＣＡＡＣ（３、４、５
、および６位に相補的）、３’−ＡＡＣＧ（４、５、６、および７位に相補的）
、および３’−ＡＣＧＴ（最後の４位に相補的）である。従って、ユーザーが配
列タイリングを選択したと仮定すれば、このシステムは、合成されるべきこのプ
ローブの配列が３’−ＴＧＣＡ、３’−ＧＣＡＡ、３’−ＣＡＡＣ、３’ＡＡＣ
Ｇ、および３’ＡＣＧＴであることを決定する。特定のサンプルが標的配列を有
する場合、結合は、各々の４マープローブの部位で表される。特定のサンプルが
配列５’−ＡＣＧＴＴＧＣＡ−３’を有さない場合、この基板上のプローブの１
つ以上の部位で、結合はほとんど示されないかまたは全く示されない。

【００４４】次いでこのシステムは、さらなるタイリングが行われるべきであるか否かを決
定し、もしそうであれば繰り返す。

【００４５】プローブが選択された後、このシステムは、プローブのアレイを形成するのに
必要な合成サイクルの数を最小にすることができる。この工程を実施するため、
合成されるべきプローブを、専門のアルゴリズムに従って評価し、どの塩基がど
んな順序で付加されるべきかを決定する。

【００４６】１つのアルゴリズムは、合成「テンプレート」、好ましくは、プローブのアレ
イを形成するのに必要な合成サイクルの数の最小化を可能にするテンプレートを
使用する。１つの「テンプレート」は、ＡＣＧＴＡＣＧＴの付加を繰り返す。こ
のテンプレートの合成サイクルの十分に長い反復を用いて、全ての可能性のある
プローブを合成し得る。このテンプレート（および／または他のテンプレート）
に対するプローブを評価することによって、多くの工程を省略して種々のトライ
アル合成ストラテジーを生成し得る。トライアル合成ストラテジーは、このテン
プレート中の各塩基が「この塩基付加なしに合成されるプローブであり得るか？
」を質問することによって試験される。言い換えれば、あらゆるプローブにおけ
るあらゆる塩基が、このテンプレートのいくつかのサブセットを用いて適切な順
序で合成され得る場合、「トライアルストラテジー」を用いて、このプローブを
合成し得る。そうであれば、この塩基付加はテンプレートから欠失される。次い
で他の塩基が除去について試験される。

【００４７】以下に考察する特定の実施形態において、いくつかのアルゴリズムの１つまた
は組み合わせによって合成ストラテジーが、開発される。この方法論が設計され
ることによって、例えば、少数の合成サイクル、チップ上の隣接するプローブの
間の少数の差異が得られ得る。１つの特定の実施形態において、このシステムは
、タイリングされた配列の「カラム（列）」における隣接するプローブの間の配
列工程の差異の数を減らす。すなわち、このシステムは、モノマーが隣接する領
域に付加されない場合、モノマーが１つの合成領域に付加される回数を減じる。
これらは、両方とも合成ストラテジーの所望の特性である。

【００４８】（ＩＶ．配列エレメントの組み合わせを検出するための方法、システムおよび
コンピューターソフトウェア）配列エレメントの組み合わせを検出するための方法、システムおよびコンピュ
ーターソフトウェアが提供される。いくつかの実施形態において、プローブアレ
イを用いて、少なくとも２つの配列エレメントを含む標的配列を決定する。２つ
の配列エレメントのうち少なくとも１つが、少なくとも２つの異なる配列エレメ
ントの群から選択される。これらの実施形態において、このプローブアレイは、
２つの配列エレメントに接続する配列領域を問い合わせるプローブを含む。配列
エレメントの正確なアレンジメントは、接続する配列領域の問い合わせに基づい
て決定され得る。配列アレンジメントの異なる組み合わせを有する２つ以上のタ
イプの標的配列（例えば、１つの遺伝子由来の選択的スプライシング転写物）を
含むサンプルにおいて、異なるタイプの標的配列の相対的レベルが、問い合わせ
プローブのハイブリダイゼーション強度に基づいて決定され得る。用語「定量」
は、遺伝子の転写レベルを定量する文脈で用いる場合、絶対的定量または相対的
定量をいうことができる。絶対的定量は、１つ以上の既知濃度の標的核酸（例え
ば、コントロール核酸（例えば、ＢｉｏＢ）または既知量の標的核酸自体）を
封入すること、および既知の標的核酸と未知のハイブリダイゼーション強度とを
参照すること（例えば、標準曲線の作成による）によって達成され得る。あるい
は、相対的定量は、２つ以上の遺伝子の間のハイブリダイゼーションシグナルの
比較、またはハイブリダイゼーション強度、および（意味するのは）転写レベル
の変化を定量するための２つ以上の処置の間の比較によって達成され得る。基板
上の単一のプローブまたは複数のプローブを用いて標的配列を定量的に分析する
方法は、例えば、６，０４０，１３８（全ての目的のために本明細書において参
考として援用されている）に記載されている。

【００４９】（ＩＶ．遺伝子発現モニタリング方法）上記で考察したように、遺伝子の活性を測定する任意の方法が、本発明の少な
くともいくつかの実施形態に有用である。例えば、伝統的なノーザンブロットお
よびハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ＲＴ−ＰＣＲおよびディファ
レンシャルディスプレイが、遺伝子活性を検出するために用いられてきた。これ
らの方法は、本発明のいくつかの実施形態に有用である。しかし、本発明は、多
数の遺伝子の発現を検出する方法と組み合わせて最も有用である。

【００５０】転写的なＲＮＡプロセッシングおよび分解レベルで、発現制御（コントロール
）をモニタリングするために、高密度アレイが、特に有用である。遺伝子発現モ
ニタリングにおける高密度アレイの製造および適用は、例えば、米国特許第５，
８００，９９２号（１９８８年９月１日発行）、および米国特許出願第０８／７
７２，３７６号（１９９６年１２月２３日出願）（全てが、本明細書において全
ての目的のために参考として援用されている）において以前に開示されている。
高密度アレイを用いるいくつかの実施形態において、米国特許第５，４４５，９
３４号（本明細書において全ての目的のために参考として援用されている）に開
示されたＶｅｒｙＬａｒｇｅＳｃａｌｅＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＰｏｌ
ｙｍｅｒＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＶＬＳＩＰＳ）のような方法を用いて、高密度
オリゴヌクレオチドアレイを合成する。各オリゴヌクレオチドは、基板上で既知
の位置を占める。核酸標的サンプルを、オリゴヌクレオチドの高密度アレイでハ
イブリダイズし、次いでこのアレイにおいて各プローブにハイブリダイズした標
的核酸の量を定量する。１つの好ましい定量方法は、共焦点顕微鏡および蛍光標
識を使用することである。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＰｒｏｂｅＡｒｒａ
ｙｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）は
、ハイブリダイゼーションを定量するために特に適切である；しかし当業者には
、任意の類似のシステムまたは他の効率的に等価な検出方法がまた用いられ得る
ことが、理解される。

【００５１】高密度アレイは、異種核酸の大きい集団の存在において遺伝子の発現レベルの
小さいバリエーションを定量するのに適切である。このような高密度アレイは、
基板上の新規合成、または基板の特定の位置に天然の核酸配列をスポッティング
もしくは移動することのいずれかによって製造され得る。核酸は、目的の配列の
クローニングされたセグメントを含む細菌プラスミドのような生物学的材料から
精製、および／または単離される。適切な核酸がまたテンプレートの増幅によっ
て生成される。非限定的例示として、ポリメラーゼ連鎖反応、および／またはイ
ンビトロ転写が、適切な核酸増幅方法である。

【００５２】合成されたオリゴヌクレオチドアレイは、本発明に特に好ましい。オリゴヌク
レオチドアレイは、他の方法に対して、多くの利点（例えば、生成の効率、アレ
イ内およびアレイ間での可変性の減少、情報量の増大、高いシグナル対ノイズ比
）を有する。

【００５３】遺伝子機能同定および遺伝子ネットワークマッピングのための好ましい高密度
アレイは、好ましくは表面積１ｃｍ^２未満中に、約１００より多い、好ましくは
約１０００より多い、より好ましくは約１６，０００より多い、そして最も好ま
しくは６５，０００もしくは２５０，０００より多い、または約１，０００，０
００より多くさえ、異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。このオリゴヌク
レオチドプローブは、約５〜約５０または約５００ヌクレオチド、より好ましく
は約１０〜約４０ヌクレオチド、最も好ましくは約１５〜約４０ヌクレオチド長
にわたる。

【００５４】（Ａ．マッシブパラレル遺伝子発現モニタリング（ＭａｓｓｉｖｅＰａｒａ
ｌｌｅｌＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇ））マッシブパラレル遺伝子発現モニタリングのための１つの好ましい方法は、高
密度核酸アレイに基づく。

【００５５】一般に、遺伝子発現をモニタリングするこれらの方法は、以下（ａ）１つ以上
の標的遺伝子のＲＮＡ転写物を含む標的核酸、またはこのＲＮＡ転写物由来の核
酸のプールを提供する工程；（ｂ）プローブの高密度アレイに対して核酸サンプ
ルをハイブリダイズさせる工程；ならびに（ｃ）ハイブリダイズした核酸を検出
して、相対的発現および／または絶対的発現（転写物、ＲＮＡプロセシング、ま
たは分解）レベルを算出する工程、を包含する。

【００５６】（Ａ）核酸サンプルを提供する工程当業者は、目的の転写物を反映する標的核酸配列を含む核酸サンプルを有する
ことが所望され得ることを理解する。従って、適切な核酸サンプルは、目的の転
写物を含み得る。しかし、適切な核酸サンプルは、目的の転写物に由来する核酸
を含み得る。本明細書において用いる場合、転写物に由来する核酸とは、その合
成のために、最終的にｍＲＮＡ転写物またはそのサブ配列がテンプレートとして
働く核酸をいう。従って、転写物から逆転写されたｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写
されたＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、増幅したＤＮＡから転写された
ＲＮＡなどは全て転写物に由来し、そしてこのような誘導された産物の検出は、
サンプル中における元の転写物の存在および／または非存在の指標である。従っ
て、適切なサンプルとしては、遺伝子の転写産物、転写産物から逆転写されたｃ
ＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、遺伝子から増幅されたＤＮＡ、増幅
されたＤＮＡから転写されたＲＮＡ、など、が挙げられるがこれらに限定されな
い。本明細書において用いる場合、転写産物は、プレｍＲＮＡ新生転写物、転写
物プロセシング中間体、成熟ｍＲＮＡ、および分解産物が挙げられ得るがこれら
に限定されない。本発明を実施するために全てのタイプの転写物をモニタリング
することは必要ではない。例えば、当業者は、本発明の実施のために、成熟ｍＲ
ＮＡレベルのみを測定することを選択し得る。

【００５７】１つの実施形態において、このようなサンプルは細胞もしくは組織または他の
生物学的サンプルのホモジネートである。好ましくは、このようなサンプルは、
生物学的サンプルの総ＲＮＡ調製物である。いくつかの実施形態においてより好
ましくは、このような核酸サンプルは、生物学的サンプルから単離された総ｍＲ
ＮＡである。当業者は、ほとんどの方法で調製した総ｍＲＮＡは、成熟ｍＲＮＡ
だけでなく、ＲＮＡプロセシング中間体および新生プレｍＲＮＡ転写物をも含む
ことを理解する。例えば、ポリ（Ｔ）カラムで精製した総ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ
）テールを有するＲＮＡ分子を含む。これらのポリＡ＋ＲＮＡ分子は、成熟ｍＲ
ＮＡ、ＲＮＡプロセシング中間体、新生転写物または分解中間体であり得る。

【００５８】生物学的サンプルは、任意の生物学的組織、または液体もしくは細胞のサンプ
ルであり得る。頻繁に、このサンプルは、患者に由来するサンプルである「臨床
サンプル」である。臨床サンプルは、遺伝子ネットワークまたは遺伝子発現の種
々の状態に関する情報の豊富な供給源を提供する。本発明のいくつかの実施形態
は、変異体を検出するために、そして変異体の機能を同定するために使用される
。このような実施形態は、臨床診断および臨床研究において広い適用を有する。
代表的な臨床サンプルとしては、喀痰、血液、血球（例えば、白血球）、組織も
しくは微細注射針生検サンプル、尿、腹水、および胸膜液、またはそれらに由来
する細胞が挙げられるがこれらに限定されない。生物学的サンプルとしてはまた
、組織学的目的のために採取された凍結切片のような組織の切片が挙げられ得る
。

【００５９】生物学的サンプルの別の代表的な供給源は、遺伝子発現状態を操作して遺伝子
間の関係を調査し得る、細胞培養物である。本発明の１つの局面において、遺伝
ネットワークの広範な種々の状態を反映する生物学的サンプルを生成するための
方法が提供される。

【００６０】当業者は、ホモジネートがハイブリダイゼーションのために使用され得る前に
、ホモジネートに存在するＲＮａｓｅを阻害または破壊することが望ましいこと
を、理解する。ヌクレアーゼを阻害または破壊する方法は、当該分野において周
知である。いくつかの好ましい実施形態において、細胞または組織がカオトロピ
ック因子の存在下で均質化されて、ヌクレアーゼを阻害する。いくつかの他の実
施形態において、ＲＮａｓｅは、熱処理および引き続くプロテイナーゼ処理によ
って、阻害または破壊される。

【００６１】全ｍＲＮＡの単離の方法もまた、当業者に周知である。例えば、核酸を単離お
よび精製する方法は、ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙの第３
章：ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＷｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒ
ｏｂｅｓ，ＰａｒｔＩ．ＴｈｅｏｒｙａｎｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．
（１９９３）およびＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙの第３章
：ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＷｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏ
ｂｅｓ，ＰａｒｔＩ．ＴｈｅｏｒｙａｎｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（
１９９３）に詳細に記載されている。

【００６２】１つの好ましい実施形態において、全ＲＮＡは、所定のサンプルから、例えば
、酸グアニジニウム−フェノール−クロロホルム抽出法を使用して単離され、そ
してポリＡ^＋ｍＲＮＡは、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィーまたは（ｄＴ
）ｎ磁気ビーズの使用によって、単離される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ
（第２版），第１〜３巻，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，（１９８９）、またはＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ
ｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，
ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８７）を参照のこと）。

【００６３】頻繁に、核酸サンプルをハイブリダイゼーションの前に増幅することが望まし
い。当業者は、どの増幅方法が使用されるとしても、定量的な結果が望ましい場
合には、定量的な増幅を達成するために、増幅された核酸の相対的頻度を維持ま
たは制御する方法を使用する際に、注意を払わなければならないことを理解する
。

【００６４】「定量的な」増幅の方法は、当業者に周知である。例えば、定量的なＰＣＲは
、既知の量のコントロール配列を、同じプライマーを使用して同時に共同増幅（
ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｙ）する工程を包含する。これは、ＰＣＲ反応を較正するた
めに使用され得る内部標準を提供する。従って、高密度のアレイは、この増幅さ
れた核酸の定量のための内部標準に特異的なプローブを含み得る。

【００６５】他の適切な増幅方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓら，ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ
．ＡｇｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．
ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ＳａｎＤｉｅｇｏ，（１９９０））
、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
，４：５６０（１９８９），Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：
１０７７（１９８８）ならびにＢａｒｒｉｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅ，８９：１１７
（１９９０）を参照のこと）、転写増幅（Ｋｗｏｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１１７３（１９８９））および自己持続配列複
製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７
：１８７４（１９９０））。

【００６６】細胞溶解物または組織ホモジネートは、しばしば、ポリメラーゼ活性の多数の
インヒビターを含む。従って、ＲＴ−ＰＣＲは、代表的に、引き続いて増幅テン
プレートとして使用するための全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離する予備工程を包
含する。１チューブｍＲＮＡ捕捉法（ｏｎｅｔｕｂｅｍＲＮＡｃａｐｔｕ
ｒｅｍｅｔｈｏｄ）は、同じチューブ内での即時のＲＴ−ＰＣＲに適切なポリ
（Ａ）＋ＲＮＡサンプルを調製するために使用され得る（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒＭａｎｎｈｅｉｍ）。捕捉されたｍＲＮＡは、逆転写混合物、および引き続
いてＰＣＲ混合物を添加することによって、ＲＴ−ＰＣＲに直接供され得る。

【００６７】特に好ましい実施形態において、サンプルｍＲＮＡは、逆転写酵素ならびにオ
リゴｄＴおよびファージＴ７プロモーターをコードする配列からなるプライマー
によって逆転写されて、一本鎖ＤＮＡテンプレートを生成する。第２のＤＮＡ鎖
は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して重合される。二本鎖ｃＤＮＡの合成の後に、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが添加され、そしてＲＮＡがｃＤＮＡテンプレートか
ら転写される。各単一のｃＤＮＡテンプレートからの相次ぐ回の転写は、増幅さ
れたＲＮＡを生じる。インビトロ重合の方法は、当業者に周知であり（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照のこと）、そしてこの特定の方法は、ＶａｎＧ
ｅｌｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１６６
３−１６６７（１９９０）によって詳細に記載される。さらに、Ｅｂｅｒｗｉｎ
ｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３０１０−３０
１４は、インビトロ転写を介する２回の増幅を使用して、元の出発物質の１０^６倍より大きな増幅を達成し、これによって生物学的サンプルが限られている場合
でさえも、発現のモニタリングを可能にするプロトコルを提供する。

【００６８】１９９９年１２月１６日に出願された、米国仮出願番号６０／１７２，３４０
に開示される、ＣＲＮＡ増幅法。

【００６９】上記直接転写方法は、アンチセンス（ａＲＮＡ）プールを提供することが、当
業者によって理解される。アンチセンスＲＮＡが標的核酸として使用される場合
には、アレイに提供されるオリゴヌクレオチドプローブは、これらのアンチセン
ス核酸の部分配列と相補的であるように選択される。逆に、標的核酸プールがセ
ンス核酸のプールである場合には、オリゴヌクレオチドプローブは、これらのセ
ンス核酸の部分配列に相補的であるように選択される。最後に、核酸プールが二
本鎖である場合には、これらのプローブは、いずれのセンスであってもよい。な
ぜなら、この標的核酸は、センス鎖とアンチセンス鎖との両方を含むからである
。

【００７０】上に引用したプロトコルは、センス核酸またはアンチセンス核酸のいずれかの
プールを生成する方法を含む。実際に、１つのアプローチを使用して、必要に応
じてセンス核酸またはアンチセンス核酸のいずれかを生成し得る。例えば、ｃＤ
ＮＡは、ベクター（例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ
ＩＩＫＳ（＋）ファージミド）に指向的にクローニングされ得、その結果、こ
れはＴ３またはＴ７プロモーターに隣接し得る。Ｔ３ポリメラーゼを用いるイン
ビトロ転写は、１つのセンス（このインサートの配向に依存するセンス）のＲＮ
Ａを生成し、一方でＴ７ポリメラーゼを用いるインビトロ転写は、逆のセンスを
有するＲＮＡを生成する。他の適切なクローニング系としては、Ｃｒｅ−ｌｏｘ
Ｐプラスミドサブクローニングのために設計された、ファージλベクターが挙げ
られる（例えば、Ｐａｌａｚｚｏｌｏら，Ｇｅｎｅ，８８：２５−３６（１９９
０）を参照のこと）。

【００７１】（（Ｂ）高密度アレイへの核酸のハイブリダイゼーション）（１．プローブ設計）当業者は、多数のアレイ設計が、本発明の実施に適切であることを理解する。
高密度アレイは、代表的に、目的の配列に特異的にハイブリダイズする多数のプ
ローブを含む。さらに、好ましい実施形態において、このアレイは、１つ以上の
コントロールプローブを含む。

【００７２】高密度アレイチップは、「試験プローブ」を含む。試験プローブは、約５〜約
４５ヌクレオチド長、または５〜約５００ヌクレオチド長、より好ましくは約１
０〜約４０ヌクレオチド長、そして最も好ましくは約１５〜約４０ヌクレオチド
長の範囲のオリゴヌクレオチドである。他の特に好ましい実施形態において、プ
ローブは、２０ヌクレオチド長または２５ヌクレオチド長である。別の好ましい
実施形態において、試験プローブは、二本鎖または一本鎖のＤＮＡ配列である。
ＤＮＡ配列は、天然の供給源から単離されるか、またはクローニングされるか、
あるいは天然の核酸をテンプレートとして使用して天然の供給源から増幅される
。これらのプローブは、遺伝子（この遺伝子の発現を検出するように、これらの
プローブが設計される）の特定の部分配列に相補的な配列を有する。従って、試
験プローブは、これらが検出する標的核酸に特異的にハイブリダイズし得る。

【００７３】目的の標的核酸を結合する試験プローブに加えて、高密度アレイは、多数のコ
ントロールプローブを含み得る。これらのコントロールプローブは、本明細書中
において以下のように称される、３つのカテゴリーに入る：１）正規化コントロ
ール；２）発現レベルコントロール；および３）標的配列の塩基と異なる少なく
とも１つの塩基を含むよう設計された、ミスマッチコントロール。正規化コント
ロールは、核酸サンプルに添加された標識された参照オリゴヌクレオチドまたは
他の核酸配列に相補的な、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸プローブである。
ハイブリダイゼーション後に正規化コントロールから得られるシグナルは、ハイ
ブリダイゼーション条件、標識強度、「読み取り」効率、および完全なハイブリ
ダイゼーションのシグナルをアレイ間で変化させ得る他の因子における変動に対
する制御を提供する。好ましい実施形態において、そのアレイにおける他の全て
のプローブから読み取られるシグナル（例えば、蛍光強度）は、コントロールプ
ローブからのシグナル（例えば、蛍光強度）によって除算され、これによって、
これらの測定を正規化する。

【００７４】事実上任意のプローブが、正規化コントロールとして働き得る。しかし、ハイ
ブリダイゼーション効率は、塩基組成およびプローブの長さと共に変動すること
が、理解される。好ましい正規化プローブは、そのアレイに存在する他のプロー
ブの平均長さを反映するよう選択されるが、これらは、ある範囲の長さを網羅す
るよう選択され得る。正規化コントロールはまた、そのアレイにおける他のプロ
ーブの（平均）塩基組成を反映するよう選択され得るが、好ましい実施形態にお
いて、ほんの１つまたは数個の正規化プローブが使用され、そしてこれらは、こ
れらが良好にハイブリダイズし（すなわち、二次構造なし）、そしていかなる標
的特異的プローブにもマッチしないように、選択される。

【００７５】発現レベルコントロールは、生物学的サンプルにおいて構成的に発現される遺
伝子と特異的にハイブリダイズするプローブである。事実上任意の構成的に発現
された遺伝子が、発現レベルコントロールに適した標的を提供する。代表的に、
発現レベルコントロールプローブは、構成的に発現された「ハウスキーピング遺
伝子」（β−アクチン遺伝子、トランスフェリンレセプター遺伝子、ＧＡＰＤＨ
遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない）の部分配列に相補的な配列
を有する。ミスマッチコントロールもまた、標的遺伝子へのプローブに対して、
発現レベルコントロールに対して、または正規化コントロールに対して、提供さ
れ得る。ミスマッチコントロールは、１つ以上のミスマッチ塩基の存在を除いて
、それらの対応する試験プローブ、標的プローブまたはコントロールプローブと
同一であるように設計された、オリゴヌクレオチドプローブまたは他の核酸プロ
ーブである。ミスマッチ塩基は、その他の点ではこのプローブが特異的にハイブ
リダイズする標的配列において、対応する塩基に相補的ではないように選択され
た塩基である。適切なハイブリダイゼーション条件（例えば、ストリンジェント
な条件）下で、試験プローブまたはコントロールプローブがその標的配列とハイ
ブリダイズするが、ミスマッチプローブはハイブリダイズしない（または有意に
より低い程度にハイブリダイズする）ことが予測されるように、１つ以上のミス
マッチが選択される。好ましいミスマッチプローブは、中心ミスマッチを含む。
従って、例えば、プローブが２０マーである場合には、対応するミスマッチプロ
ーブは、６〜１４のいずれかにおける単一の塩基のミスマッチ（例えば、Ｇ、Ｃ
またはＴがＡの代わりに存在する）（中心ミスマッチ）を除いて、同一の配列を
有する。

【００７６】従って、ミスマッチプローブは、サンプル中の、そのプローブが指向されてい
る標的以外の核酸への非特異的結合または交差ハイブリダイゼーションに対する
制御を提供する。従って、ミスマッチプローブは、ハイブリダイゼーションが特
異的であるか否かを示す。例えば、標的が存在する場合には、完全なマッチプロ
ーブは、ミスマッチプローブより一貫して有望であるはずである。さらに、全て
の中心ミスマッチが存在する場合には、これらのミスマッチプローブが、変異を
検出するために使用され得る。完全なマッチプローブとミスマッチプローブとの
間の強度の差（Ｉ（ＰＭ）−Ｉ（ＭＭ））は、ハイブリダイズした物質の濃度の
良好な尺度を提供する。

【００７７】高密度アレイはまた、サンプル調製／増幅コントロールプローブを含み得る。
これらは、アッセイされる特定の生物学的サンプルの核酸には通常は存在しない
ので選択された、コントロール遺伝子の部分配列に相補的なプローブである。適
切なサンプル調製／増幅コントロールプローブとしては、例えば、細菌遺伝子（
例えば、ＢｉｏＢ）に対するプローブが挙げられ、ここで、問題のサンプルは
、真核生物由来の生物学的物質である。

【００７８】次いで、ＲＮＡサンプルは、既知量の核酸（この核酸に対して、サンプル調製
／増幅コントロールプローブが指向される）でスパイクされ、次いでプロセシン
グされる。次いで、サンプル調製／増幅コントロールプローブのハイブリダイゼ
ーションの定量は、プロセシングの工程（例えば、ＰＣＲ、逆転写、インビトロ
転写など）によって引き起こされた多数の核酸の変化の尺度を提供する。

【００７９】１つの好ましい実施形態において、高密度アレイにおけるオリゴヌクレオチド
プローブは、核酸標的（この標的に対して、これらのプローブが指向される）に
、利用される特定のハイブリダイゼーション条件下で、最小の非特異的結合また
は交差ハイブリダイゼーションを伴って、特異的に結合するよう選択される。本
発明の高密度アレイは、１，０００，０００を超える異なるプローブを含み得る
ので、特定の核酸配列に結合する特徴的な長さの各プローブを提供することが可
能である。従って、例えば、この高密度アレイは、ＩＬ−２ｍＲＮＡに相補的
な全ての可能な２０マー配列を含み得る。

【００８０】しかし、ＩＬ−２ｍＲＮＡに独特ではない２０マー部分配列が存在し得る。
これらの部分配列に指向されるプローブは、サンプルゲノムの他の領域における
これらの相補的配列の発生と共に交差ハイブリダイズすると予測される。同様に
、他のプローブは、単に、ハイブリダイゼーション条件下で効果的にハイブリダ
イズしないかもしれない（例えば、二次構造、または基質もしくは他のプローブ
との相互作用に起因して）。従って、好ましい実施形態において、このような乏
しい特異性またはハイブリダイゼーション効率を示すプローブが同定され、そし
て高密度アレイ自体（例えば、アレイの作製の間）とハイブリダイゼーション後
のデータ分析とのいずれにも含まれないかもしれない。

【００８１】さらに、好ましい実施形態において、発現モニタリングアレイは、数百塩基対
長である遺伝子の存在および発現レベル（転写レベル）を同定するために使用さ
れる。ほとんどの用途について、数千〜数十万の遺伝子の存在、非存在または発
現レベルを同定するのに有用である。好ましい実施形態において、１アレイあた
りのオリゴヌクレオチドの数は制限されるため、各遺伝子（この発現が検出され
る）に特異的なプローブの限定されたセットのみを含むことが望ましい。

【００８２】米国特許第出願番号０８／７７２，３７６に開示されるように、１５、２０ま
たは２５ヌクレオチドほどの短いプローブは、遺伝子のサブ配列にハイブリダイ
ズするのに十分であり、またほとんどの遺伝子について、広範囲の標的核酸の濃
縮にわたって十分に行うプローブのセットが存在する。好ましい実施形態におい
て、高密度アレイを合成する前に、各遺伝子に好ましいかまたは「最適な」サブ
セットのプローブを選択することが望ましい。

【００８３】（２．高密度アレイの形成）最小数の合成工程で、オリゴヌクレオチド、ペプチドおよび他のポリマー配列
の高密度アレイを形成する方法は、公知である。オリゴヌクレオチドアナログア
レイは、様々な方法（光誘導性化学カップリング、および力学的に誘導されるカ
ップリングが挙げられるが、これらに限定されない）によって固体基板上で合成
され得る。Ｐｉｒｒｕｎｇら、米国特許第５，１４３，８５４号（ＰＣＴ出願番
号ＷＯ９０／１５０７０もまた参照のこと）、およびＦｏｄｏｒら、ＰＣＴ公開
番号ＷＯ９２／１００９２、およびＷＯ９３／０９６６８、および米国特許出願
第０７／９８０，５２３（これらは、例えば、光誘導性合成技術を使用して、ペ
プチド、オリゴヌクレオチドおよび他の分子の巨大なアレイを形成する方法を開
示する）を参照のこと。Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，７６７−７７
（１９９１）もまた参照のこと。ポリマーアレイの合成のためのこれらの手順は
、ここで、ＶＬＳＩＰＳ^ＴＭ手順と称される。このＶＬＳＩＰＳ^ＴＭアプローチ
を使用して、ポリマーの１つの異種アレイを、多数の反応部位を同時にカップリ
ングすることによって、異なる異種アレイに変換する。米国特許出願番号第０．
７／７９６，２４３号および同第０７／９８０，５２３号を参照のこと。

【００８４】上記の米国特許第５，１４３，８５４号およびＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９０／
１５０７０および９２／１００９２に記載されるようなＶＬＳＩＰＳ^ＴＭ技術の
開発は、コンビナトリアル合成およびコンビナトリアルライブラリーのスクリー
ニングの分野において先駆的な技術と考えられる。より最近では、特許出願番号
０８／０８２，９３７（１９９３年６月２５日出願）は、標的核酸の部分配列ま
たは完全配列を試験または決定し、そして特定のオリゴヌクレオチド配列を含む
核酸の存在を検出するために使用され得るオリゴヌクレオチドプローブのアレイ
を作成するための方法を記載している。

【００８５】簡潔には、ガラス表面上におけるオリゴヌクレオチドアレイの光誘導性コンビ
ナトリアル合成は、自動化ホスホルアミダイト化学およびチップ作成技術を使用
して進行する。１つの特定の実施において、ガラス表面は、官能基（例えば、感
光性の保護基でブロックされたヒドロキシル基またはアミン基）を含むシラン試
薬で誘導体化される。写真平板マスクによる光分解は、官能基を暴露するために
選択的に使用され、これは次いで、次の５’−光保護されたヌクレオシドホスホ
ルアミダイトと反応するように準備される。ホスホルアミダイトは、照射された
（従って、感光性のブロック基の除去によって暴露される）部位とのみ反応する
。従って、ホスホルアミダイトは、前述の工程で選択的に暴露された領域にのみ
添加される。これらの工程は、配列の所望のアレイがこの固体表面上で合成され
るまで繰り返される。アレイ上の異なる位置における異なるオリゴヌクレオチド
アナログのコンビナトリアル合成は、合成中の照射パターンおよび追加のカップ
リング試薬の順序によって決定される。

【００８６】ポリアミド骨格を有するオリゴヌクレオチドアナログがＶＬＳＩＰＳ^ＴＭ手順
において使用される場合、ホスホルアミダイト化学を使用して合成工程を行うこ
とは一般的に不適切である。なぜなら、モノマーは、ホスフェート結合を介して
互いに結合しないからである。その代わり、ペプチド合成方法に置き換えられる
。例えば、Ｐｉｒｒｕｎｇら、米国特許第５，１４３，８５４号を参照のこと。

【００８７】ポリアミド骨格および天然に存在するヌクレオシドに見出される塩基を含むペ
プチド核酸は、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ
）から市販されている。ペプチド核酸は、高い特異性で核酸に結合し得、そして
本開示の目的のために、「オリゴヌクレオチドアナログ」とみなされる。

【００８８】上記に加えて、単一の基板上にオリゴヌクレオチドのアレイを生成するために
使用され得るさらなる方法は、同時係属出願０７／９８０，５２３（１９９２年
１１月２０日出願）、および０７／７９６，２４３（１９９１年１１月２２日出
願）、ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９３／０９６６８に記載される。これらの出願で
開示される方法において、試薬は以下の（１）〜（３）のいずれかによってこの
基板に送達される：（１）所定の領域上に規定されたチャネル内におけるフロー
イング、または（２）所定の領域上の「スポッティング」、または（３）フォト
レジストの使用によって。しかし、他のアプローチ、ならびにスポッティングと
フローイングとの組み合わせが用いられ得る。各場合において、基板の特定の活
性化された領域は、モノマー溶液が様々な反応部位に送達される場合、他の領域
から機械的に分離される。

【００８９】本発明の化合物およびライブラリーに適用される代表的な「フローチャネル」
方法は一般に、以下のように記載され得る。様々なポリマー配列は、適切な試薬
が流れるかまたは適切な試薬が配置される基板の表面上に、フローチャネルを形
成することによって、基板または固体支持体上の選択された領域で合成される。
例えば、モノマー「Ａ」が選択された領域の最初の群の基板に結合すると仮定す
る。必要ならば、選択された領域の全てまたは一部の基板の表面の全てまたは一
部は、例えば、適切な試薬をチャネルの全てまたは一部を通して流すことによっ
て、または基板全体を適切な試薬で洗浄することによって結合に対して活性化さ
れる。この基板の表面上にチャネルブロックを配置した後、モノマーＡを有する
試薬は、このチャネルの全てまたは一部を通って流れるか、またはこのチャネル
の全てまたはいくつかに配置される。これらのチャネルは、第１の選択した領域
と流体とを接触させ、これによりモノマーＡを、第１の選択した領域内で、基板
上に直接的にかまたは間接的に（スペーサーを介して）結合する。

【００９０】その後、モノマーＢは、第２の選択された領域（このいくつかは、第１の選択
した領域内に含まれ得る）にカップリングされる。この第２の選択した領域は、
この基板の表面上におけるチャネルブロックの並進、回転または置換によって；
選択したバルブの開閉によって；または化学試薬またはフォトレジストの層の沈
着によって、第２のフローチャネルと流体接触する。必要ならば、少なくとも第
２の領域を活性化するための工程が行われる。その後、モノマーＢを、第２のフ
ローチャネル（単数または複数）を通して流されるか、または第２のフローチャ
ネル（単数または複数）内に配置され、モノマーＢが第２の選択した位置に結合
される。この特定の例において、この処理段階で基板に結合した得られる配列は
、例えば、Ａ、ＢおよびＡＢである。このプロセスを繰り返して、基板上の既知
の位置において、所望の長さの配列の巨大なアレイを形成する。

【００９１】基板が活性化された後、モノマーＡは、これらのチャネルのいくつかを通して
流され得、モノマーＢは、他のチャネルを通して流され得、モノマーＣは、さら
に他のチャネルを通して流され得る（以下同様）。このように、反応領域の多く
または全ては、チャネルブロックが移動されなければならない前に、または基板
が洗浄および／または再活性化されなければならない前に、モノマーと反応され
る。利用可能な反応領域の多くまたは全てを同時に使用することによって、洗浄
および活性化工程の数が最小化され得る。

【００９２】当業者は、チャネルを形成するかまたはそうでなければ基板の表面の一部を保
護する代替の方法が存在することを認識する。例えば、いくつかの実施形態によ
れば、保護コーティング（例えば、親水性コーティングまたは疎水性コーティン
グ（溶媒の性質に依存する））は、他の領域における反応物溶液による湿潤を容
易にする材料と時折組み合わせて、保護されるべき基板の部分の上に用いられる
。このように、フローイング溶液は、それらの設計された流路の外側を通過する
ことをさらに防止される。

【００９３】高密度核酸アレイは、予備合成した核酸または天然の核酸を所定の位置に配置
することによって製造され得る。全ての目的のために以前に援用された米国出願
番号およびその親出願において開示されるように、合成核酸または天然の核酸は
、光誘導性標的化およびオリゴヌクレオチド誘導性標的化によって基板の特定の
位置に沈着される。核酸はまた、フローチャネル法とほとんど同じ様式で、特定
の位置に方向付けられ得る。例えば、核酸Ａは、適切に活性化された反応領域の
第１の群に送達されここに連結され得る。その後、核酸Ｂが、活性化された反応
領域の第２の群に送達されこの群と反応し得る。核酸は、選択された領域に沈着
される。別の実施形態は、領域から領域へと移動して、核酸と特定のスポットに
沈着させるディスペンサーを使用する。代表的なディスペンサーは、核酸を基板
へ送達するためのマイクロピペットまたはキャピラリーピン、およびこの基板に
対するマイクロピペットの位置を制御するためのロボットシステムを備える。他
の実施形態において、ディスペンサーは、一連のチューブ、マニホルド、ピペッ
トまたはキャピラリーピンのアレイなどを備え、その結果、様々な試薬が反応領
域に同時に送達され得る。

【００９４】（３．ハイブリダイゼーション）核酸のハイブリダイゼーションは、単に、プローブと標的核酸とを、このプロ
ーブおよびその相補標的が安定なハイブリッド二重鎖を相補塩基対形成によって
形成し得る条件下で接触させる工程を包含する。ハイブリッド二重鎖を形成しな
い核酸は、次いで、洗い流され、代表的には結合した検出可能な標識の検出によ
って検出されるハイブリダイズした核酸が残る。一般的に、核酸は、温度を上げ
ることによって、または核酸を含む緩衝液の塩濃度を下げることによって変性す
ることが認識される。低いストリンジェンシーな条件下（例えば、低温および／
または高塩）で、ハイブリッド二重鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮ
Ａ、またはＲＮＡ：ＤＮＡ）が、アニーリングした配列が完全には相補的ではな
い場合でさえ形成する。従って、ハイブリダイゼーションの特異性は、より低い
ストリンジェンシーにおいて減少する。逆に、より高いストリンジェンシー（例
えば、高温または低塩）において、首尾良いハイブリダイゼーションは、より少
ないミスマッチを必要とする。

【００９５】当業者は、ハイブリダイゼーション条件は、ある程度のストリンジェンシーを
提供するように選択され得ることを理解する。好ましい実施形態において、ハイ
ブリダイゼーションは、この場合、６×ＳＳＰＥ−Ｔ中３７℃（０．００５％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で、低いストリンジェンシーで行われてハイブリダ
イゼーションを保証し、次いで続く洗浄は、より高いストリンジェンシー（例え
ば、１×ＳＳＰＥ−Ｔ、３７℃）で行われて、ミスマッチしたハイブリッド二重
鎖を排除する。首尾良い洗浄は、所望のレベルのハイブリダイゼーションの特異
性が得られるまで、徐々にストリンジェンシーを高くして（例えば、３７℃〜５
０℃で、０．２５×ＳＳＰＥ−Ｔほど低く）、行われ得る。ストリンジェンシー
はまた、ホルムアミドのような試薬を添加することによって増大され得る。ハイ
ブリダイゼーションの特異性は、試験プローブに対するハイブリダイゼーション
と存在し得る様々なコントロール（例えば、発現レベルコントロール、正規化コ
ントロール、ミスマッチコントロールなど）に対するハイブリダイゼーションと
を比較することによって、評価され得る。

【００９６】一般的に、ハイブリダイゼーションの特異性（ストリンジェンシー）とシグナ
ル強度との間に関係が存在する。従って、好ましい実施形態において、洗浄は、
最高のストリンジェンシーで行われ、これは一貫した結果を生じ、そしてバック
グラウンド強度の約１０％より大きなシグナル強度を提供する。従って、好まし
い実施形態において、ハイブリダイズしたアレイは、より高いストリンジェンシ
ー溶液で連続的に洗浄され、各洗浄の間に解読され得る。このように生成された
データセットの分析は、それより上ではハイブリダイゼーションパターンが多く
は変更されない洗浄ストリンジェンシーを評価し、そしてこの分析は、目的の特
定のオリゴヌクレオチドプローブに適切なシグナルを提供する。

【００９７】好ましい実施形態において、バックグラウンドシグナルは、非特異的結合を減
少させるために、ハイブリダイゼーションの間の界面活性剤（例えば、Ｃ−ＴＡ
Ｂ）またはブロッキング剤（例えば、精子ＤＮＡ、ｃｏｔ−１ＤＮＡなど）の
使用によって減少される。特に好ましい実施形態において、このハイブリダイゼ
ーションは、約０．５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ（例えば、ニシン精子ＤＮＡ）の存在
下で実施される。ハイブリダイゼーション中のブロッキング剤の使用は、当業者
に周知である（例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，前出の第８章を参照のこと）。

【００９８】ＲＮＡ間またはＤＮＡ間に形成される二重鎖の安定性は、溶液中で、一般に、
ＲＮＡ：ＲＮＡ＞ＲＮＡ：ＤＮＡ＞ＤＮＡ：ＤＮＡの順序である。長いプローブ
は、標的との良好な二重鎖安定性を有するが、より短いプローブよりも、ミスマ
ッチの区別が乏しい（ミスマッチの区別とは、完全に一致したプローブと単一塩
基がミスマッチのプローブとの間の、測定されたハイブリダイゼーションシグナ
ル比をいう）。より短いプローブ（例えば、８マー）は、非常に良好にミスマッ
チを区別するが、全体的な二重鎖安定性は低い。

【００９９】例えば、公知のオリゴヌクレオチドアナログを使用してこの標的とプローブの
間に形成される二重鎖の熱安定性（Ｔ_ｍ）を変化させること、二重鎖安定性およ
びミスマッチの区別の最適化を可能にする。Ｔ_ｍを変化させることの１つの有用
な局面は、アデニン−チミン（Ａ−Ｔ）二重鎖が、グアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ
）二重鎖よりも低いＴｍを有するという事実から生じ、これは、Ａ−Ｔ二重鎖は
塩基対当り２つの水素結合を有するが、Ｇ−Ｃ二重鎖は塩基対当り３つの水素結
合を有しているという事実に一部起因している。塩基の不均一な分布が存在する
異質なオリゴヌクレオチドアレイにおいて、各オリゴヌクレオチドプローブにつ
いてハイブリダイゼーションを同時に最適化することは一般に可能ではない。従
って、いくつかの実施形態において、Ｇ−Ｃ二重鎖を選択的に不安定化し、そし
て／またはＡ−Ｔ二重鎖の安定性を増加することが望ましい。これは、例えば、
Ｇ−Ｃ二重鎖を形成するアレイのプローブにおけるグアニン残基をヒポキサンチ
ンで置換することによってか、またはＡ−Ｔ二重鎖を形成するプローブにおける
アデニン残基を２，６ジアミノプリンで置換することによってか、あるいはＮａ
Ｃｌの代わりにテトラメチルアンモニウムクロリド塩（ＴＭＡＣｌ）を使用する
ことによって、達成され得る。

【０１００】オリゴヌクレオチドアナログプローブを使用することによって与えられる変化
した二重鎖安定性は、例えば、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたオ
リゴヌクレオチドアナログのアレイの経時的な蛍光シグナル強度に従って、確認
され得る。このデータは、例えば、室温（将来の単純化された診断適用について
）での特定のハイブリダイゼーション条件の最適化を可能にする。

【０１０１】変化した二重鎖安定性を確認する別の方法は、ハイブリダイゼーションの際に
経時的に生成されるシグナル強度に従うことである。ＤＮＡ標的およびＤＮＡチ
ップを使用する以前の実験は、シグナル強度が時間と共に増加し、そしてより安
定な二重鎖が、安定でない二重鎖よりも速くより高いシグナル強度を生成するこ
とを示した。このシグナルは、全ての結合部位の占有に起因して、特定の期間後
にプラトーまたは「飽和」に達する。これらのデータは、ハイブリダイゼーショ
ンの最適化、および特定の温度での最良の条件の決定を可能にする。

【０１０２】ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は、当業者に周知である（例え
ば、ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４：Ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＷｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ，
Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９９３）を参照のこ
と）。

【０１０３】（（Ｃ）シグナルの検出）好ましい実施形態において、ハイブリダイズした核酸は、サンプル核酸に結合
した１つ以上の標識を検出することによって検出される。この標識は、当業者に
周知の多くの方法のいずれかによって組み込まれ得る。しかし、好ましい実施形
態において、この標識は、増幅工程の間に、このサンプル核酸の調製において同
時に組み込まれる。従って、例えば、標識されたプライマーまたは標識されたヌ
クレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標識された増幅産物を
与える。好ましい実施形態において、標識されたヌクレオチド（例えば、フルオ
レセイン標識されたＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を使用する上記のような転写
増幅は、転写された核酸に標識を組み込む。

【０１０４】あるいは、標識は、最初の核酸サンプル（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡｍＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡなど）または増幅が完了した後のこの増幅産物に、直接付加され得
る。核酸に標識を結合する手段は、当業者に周知であり、そしてこれらとしては
、例えば、核酸のキナーゼ処理（ｋｉｎａｓｉｎｇ）および引き続いて、このサ
ンプル核酸を標識（例えば、発蛍光団）に結合する核酸リンカーの結合（連結）
による、ニックトランスレーションまたは末端標識化（例えば、標識されたＲＮ
Ａを用いる）が挙げられる。

【０１０５】本発明における使用のために適切な検出可能標識としては、分光学的、光化学
的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手段によって検出
可能な任意の組成物が挙げられる。本発明において有用な標識としては、標識さ
れたストレプトアビジン結合体で染色するためのビオチン、磁気ビーズ（例えば
、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^ＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレ
ッド（ｔｅｘａｓｒｅｄ）、ローダミン、グリーン蛍光タンパク質など）、放
射性標識（例えば、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、または^３２Ｐ）、酵素（
例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳ
Ａにおいて一般に使用される他のもの）、ならびにコロイド状金または着色した
ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテック
スなど）ビーズのような比色標識が挙げられる。このような標識の使用を教示し
ている特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５
２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７
，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が挙
げられる。

【０１０６】このような標識を検出するための手段は、当業者に周知である。従って、例え
ば、放射性標識が、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して
検出され得、蛍光マーカーは、放出された光を検出するための光検出器を使用し
て検出され得る。酵素標識は、基質と共に酵素を提供し、そしてこの酵素の基質
への作用によって生成される反応産物を検出することによって代表的に検出され
、そして比色標識は、着色した標識を単に可視化することによって検出される。
１つの特に好ましい方法は、散乱光を測定することによって検出され得るコロイ
ド状金標識を使用する。

【０１０７】この標識は、ハイブリダイゼーションの前、または後に標的（サンプル）核酸
に付加され得る。いわゆる「直接標識」は、ハイブリダイゼーションの前に標的
（サンプル）核酸に直接結合されるか、または組み込まれる検出可能な標識であ
る。対照的に、いわゆる「間接標識」は、ハイブリダイゼーション後に、ハイブ
リッド二重鎖に結合される。しばしば、間接標識は、ハイブリダイゼーションの
前に標的核酸に結合される結合部分に結合する。従って、例えば、この標的核酸
は、ハイブリダイゼーションの前にビオチン化され得る。ハイブリダイゼーショ
ン後に、アビデン（ａｖｉｄｅｎ）と結合体化した発蛍光団は、ビオチン保有ハ
イブリッド二重鎖と結合して、容易に検出される標識を提供する。核酸の標識方
法およびハイブリダイズされた標識核酸の検出方法の詳細な総説については、Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４：Ｈｙｂｒｉｄ
ｉｚａｔｉｏｎＷｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ，Ｐ．Ｔ
ｉｊｓｓｅｎ，編．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９９３）を参照のこと）
。

【０１０８】蛍光標識は、好ましく、そしてインビトロの転写反応の間に容易に付加される
。好ましい実施形態において、フルオレセイン標識したＵＴＰおよびＣＴＰは、
上記のように、インビトロでの転写反応において生成されるＲＮＡに組み込まれ
る。

【０１０９】高密度アレイのプローブにハイブリダイズする標識された標的（サンプル）核
酸を検出する手段は、当業者に公知である。従って、例えば、比色標識が使用さ
れる場合、標識の単純な可視化で十分である。放射性標識されたプローブが使用
される場合、放射線の検出（例えば、写真フィルムまたは固体検出器を用いて）
で十分である。

【０１１０】しかし、好ましい実施形態において、この標的核酸は、蛍光標識で標識され、
そしてプローブアレイ上でのこの標識の局在化は、蛍光顕微鏡法を用いて達成さ
れる。ハイブリダイズしたアレイは、光源を用いて特定の蛍光標識の励起波長で
励起され、そしてその発光波長で得られる蛍光が検出される。特に好ましい実施
形態において、この励起光源は、この蛍光標識の励起に適切なレーザーである。

【０１１１】共焦点顕微鏡は、高密度アレイ全体を自動的に走査するコンピュータ制御ステ
ージで自動化され得る。同様に、この顕微鏡は、アレイ上の各オリゴヌクレオチ
ドプローブにハイブリダイゼーションすることによって生成される蛍光シグナル
を自動的に記録するための自動化データ取得システムに結合した光トランスデュ
ーサー（例えば、光電子増倍管、固体アレイ、ＣＣＤカメラなど）を備え得る。
このような自動化されたシステムは、米国特許第５，１４３，８５４号、ＰＣＴ
出願２０９２／１００９２、および同時系属の米国特許出願番号０８／１９５
，８８９（１９９４年２月１０日出願）において十分に記載される。シグナル検
出のための自動化された共焦点顕微鏡と関連してのレーザー照明の使用は、約１
００μｍより良好な分解能、より好ましくは約５０μｍより良好な分解能、そし
て最も好ましくは約２５μｍより良好な分解能での検出を可能にする。

【０１１２】当業者は、ハイブリダイゼーションの結果を評価する方法が、使用される特定
のプローブ核酸および提供されるコントロールの性質によって変化することを理
解する。最も単純な実施形態において、各プローブについての蛍光強度の単純な
定量化が決定される。これは、高密度アレイ上の各位置（異なるプローブを表す
）でのプローブシグナル強度を測定することによって単純に達成される（例えば
、この標識が蛍光標識の場合、このアレイの各位置に固定された励起照明によっ
て生成される蛍光の量（強度）の検出）。「試験」サンプル由来の核酸にハイブ
リダイズしたアレイの絶対強度と、「コントロール」サンプルによって生成され
る強度との比較は、このプローブの各々にハイブリダイズする核酸の相対的発現
の基準を提供する。

【０１１３】しかし、当業者は、ハイブリダイゼーションシグナルが、ハイブリダイゼーシ
ョンの効率、このサンプル核酸上の標識の量、およびこのサンプル中の特定の核
酸の量と共にその強度が変化することを理解する。代表的に、非常に低レベル（
例えば、１ｐＭ未満）で存在する核酸は、非常に弱いシグナルを示す。ある程度
低い濃度レベルで、このシグナルは、バックグラウンドから実質的に識別不能と
なる。ハイブリダイゼーションデータの評価において、強度閾値は、シグナルが
バックグラウンドから本質的に識別不能となる数値未満で選択され得る。

【０１１４】上記の記載は、例示的であり、そして限定的ではない。本開示を検討すること
で、本発明の多くの変化が当業者に明白となる。従って、本発明の範囲は、上記
の記載への参照で決定されるべきではなく、代わりに、添付の特許請求の範囲お
よび均等物の全範囲を参照して決定されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、選択的スプライシングを示す。

【図２】図２は、配列エレメントの組み合わせの検出を示す。

【図３】図３は、選択的スプライシングの検出を示す。

【図４】図４は、より複雑な選択的スプライシングの検出を示す。

【図５】図５は、エキソンチップを設計するためのプロセスを示す。

【図６】図６は、エキソンチップからのデータを分析するためのプロセスを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA09 CA12 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 FA15 4B063 QA01 QA13 QQ53 QR32 QR55 QR84 QS34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸プローブアレイであって、第１の配列エレメントと第２
の配列エレメントとの間の結合配列を問い合わせるための１セットのプローブを
含む、核酸プローブアレイ。
【請求項２】前記核酸がオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のプ
ローブアレイ。
【請求項３】前記第１の配列エレメントが第１エキソンであり、そして前
記第２の配列エレメントが第２のエキソンである、請求項１に記載のプローブア
レイ。
【請求項４】前記結合配列が、前記第１のエキソンの３’配列および前記
第２のエキソンの５’配列である、請求項３に記載のプローブアレイ。
【請求項５】前記結合配列が、少なくとも２０塩基である、請求項４に記
載のプローブアレイ。
【請求項６】前記結合配列が、少なくとも３０塩基である、請求項５に記
載のプローブアレイ。
【請求項７】前記結合配列が、少なくとも４０塩基である、請求項６に記
載のプローブアレイ。
【請求項８】前記結合配列が、少なくとも５０塩基である、請求項７に記
載のプローブアレイ。
【請求項９】前記結合配列が、少なくとも１００塩基である、請求項８に
記載のプローブアレイ。
【請求項１０】前記セットのプローブが、少なくとも１００プローブ／ｃ
ｍ^２の密度で基板上に固定される、請求項１に記載のプローブアレイ。
【請求項１１】標的配列を決定するための方法であって、ここで、該標的
配列が、第２の配列エレメントに結合している第１の配列エレメントを含み、以
下：ａ）該標的配列を核酸プローブアレイにハイブリダイズする工程であって、該
核酸プローブアレイが、該第１の配列エレメントと該第２の配列エレメントとの
間の結合配列を問い合わせるための１セットのプローブを含む、工程；およびｂ）該標的配列の該セットのプローブへのハイブリダイゼーションに基づいて
、該結合配列についての情報を得る工程、を包含する、方法。
【請求項１２】前記第１の配列エレメントおよび第２の配列エレメントが
、エキソンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】前記セットの核酸プローブが、オリゴヌクレオチドプロー
ブである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】前記セットの核酸プローブが、基板上に固定される、請求
項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記セットの核酸プローブが、少なくとも１００プローブ
／ｃｍ^２の密度で固定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】前記標的配列が、ｍＲＮＡである、請求項１２に記載の方
法。
【請求項１７】前記ｍＲＮＡが、遺伝子から転写された、少なくとも２つ
の選択的にスプライシングされたｍＲＮＡのうちの１つである、請求項１６に記
載の方法。
【請求項１８】請求項１１に記載の方法であって、前記結合配列および前
記ハイブリダイゼーションについての前記情報を使用して、前記第１の配列エレ
メントおよび前記第２の配列エレメントを定量化する工程をさらに包含する、方
法。
【請求項１９】前記核酸プローブアレイが、前記第１の配列エレメントお
よび前記第２の配列エレメントに対する配列プローブを含む、請求項１１に記載
の方法。
【請求項２０】請求項１９に記載の方法であって、前記標的配列および前
記配列プローブのハイブリダイゼーションに基づいて、前記第１の配列エレメン
トおよび前記第２の配列エレメントを定量化する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２１】前記問い合わせるためのプローブが、前記結合配列を被覆
するためのプローブである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】前記結合配列が、少なくとも２０塩基である、請求項２１
に記載の方法。
【請求項２３】前記結合配列が、少なくとも３０塩基である、請求項２２
に記載の方法。
【請求項２４】前記結合配列が、少なくとも４０塩基である、請求項２３
に記載の方法。
【請求項２５】前記結合配列が、少なくとも５０塩基である、請求項２４
に記載の方法。
【請求項２６】前記結合配列が、少なくとも１００塩基である、請求項２
５に記載の方法。
【請求項２７】前記プローブがオリゴヌクレオチドである、請求項１９に
記載の方法。
【請求項２８】コンピュータソフトウェアプロダクトであって、以下：ａ）複数のハイブリダイゼーションシグナルを受信するためのコンピュータコ
ードであって、ここで、該複数のシグナルのそれぞれが、標的配列の結合配列を
問い合わせるための複数の被覆プローブの１つのハイブリダイゼーションを反映
し、ここで、前記標的配列が、少なくとも２つの配列エレメントの群から選択さ
れる少なくとも１つの配列エレメントを有する、コンピュータコード；ｂ）該ハイブリダイゼーションシグナルに基づいて、該配列エレメントを同定
する、コンピュータコード；およびｃ）該コードを保存する、コンピュータ読み取り可能媒体、を含む、コンピュータソフトウェアプロダクト。
【請求項２９】前記被覆プローブが、基板上で固体されるオリゴヌクレオ
チドである、請求項２８に記載のコンピュータソフトウェア。
【請求項３０】前記被覆プローブが少なくとも２０塩基を問い合わせる、
請求項２９に記載のコンピュータソフトウェア。
【請求項３１】前記被覆プローブが少なくとも３０塩基を問い合わせる、
請求項２９に記載のコンピュータソフトウェア。
【請求項３２】前記被覆プローブが少なくとも４０塩基を問い合わせる、
請求項２９に記載のコンピュータソフトウェア。
【請求項３３】前記被覆プローブが少なくとも５０塩基を問い合わせる、
請求項２９に記載のコンピュータソフトウェア。
【請求項３４】前記被覆プローブが少なくとも１００塩基を問い合わせる
、請求項２９に記載のコンピュータソフトウェア。
【請求項３５】前記標的配列を定量化するコンピュータコードをさらに含
む、請求項２８に記載のコンピュータソフトウェア。
【請求項３６】２つの配列エレメントの組み合わせを検出するためのプロ
ーブを設計するための方法であって、以下：ａ）該２つの配列エレメント間の結合領域の配列を入力する工程；およびｂ）該配列に基づいて、該結合配列を被覆するためのプローブを選択する工程
、を包含する、方法。
【請求項３７】前記２つの配列エレメントがエキソンである、請求項３６
に記載の方法。
【請求項３８】請求項３７に記載の方法であって、リソグラフィーマスク
を設計する工程をさらに包含し、ここで、該リソグラフィーマスクが、核酸プロ
ーブのアレイの製造に使用される、方法。
【請求項３９】請求項３８に記載の方法であって、基板上に化合物を堆積
するためのインクジェット印刷機構を制御するための出力シグナルの工程をさら
に包含する、方法。
【請求項４０】前記配列が少なくとも２０塩基である、請求項３８に記載
の方法。
【請求項４１】前記配列が少なくとも３０塩基である、請求項４０に記載
の方法。
【請求項４２】前記配列が少なくとも４０塩基である、請求項４１に記載
の方法。
【請求項４３】前記配列が少なくとも５０塩基である、請求項４２に記載
の方法。
【請求項４４】前記配列が少なくとも１００塩基である、請求項４３に記
載の方法。
【請求項４５】コンピュータソフトウェアプロダクトであって、以下：ａ）結合配列を構築するコンピュータプログラムコード；ｂ）該結合配列を問い合わせるための被覆プローブを選択する、コンピュータ
プログラムコード；およびｃ）該コードを保存する、コンピュータ読み取り可能媒体、を含む、コンピュータソフトウェアプロダクト。
【請求項４６】前記結合配列が、選択的にスプライシングされたｍＲＮＡ
の１つに対する、請求項４５に記載のコンピュータソフトウェアプロダクト。
【請求項４７】１つの遺伝子のエキソン配列を入力するコンピュータコー
ドをさらに含む、請求項４６に記載のコンピュータソフトウェアプロダクト。
【請求項４８】前記結合配列が前記エキソン配列に基づいて構築される、
請求項４７に記載のコンピュータソフトウェアプロダクト。
【請求項４９】前記プローブの配列を出力するコードをさらに含む、請求
項４８に記載のコンピュータソフトウェアプロダクト。