JP2003514580A - ヒトの不妊症の処置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトの不妊症は、第一減数分裂前期のヒト卵母細胞を能動的に停止させ、そして次に、少なくとも１つの減数分裂刺激化合物の添加、又は卵母細胞−卵丘混合物中での減数分裂刺激分子の内因性の形成を導く培養条件のいずれかによって、この減数分裂の阻止を能動的に反転させるｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法によって処置され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は胚の実験手順並びにヒトの不妊症を処置するための医薬組成物及びそ
の使用に関する。更に具体的には、本発明は第一減数分裂前期にヒトの卵母細胞
を能動的に停止させ、そして次に、少なくとも１つの減数分裂刺激化合物を添加
するか、又は卵母細胞−卵丘細胞混合体における減数分裂刺激分子の内生的な形
成を導く培養条件によって、そのいずれかでこの減数分裂の阻止を能動的に反転
するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法によるヒトの不妊症の処置に関する。要約すると
、本発明はｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精（体外受精。本明細書ではＩＶＦと表す）
の改良方法に関する。

【０００２】 本発明の背景 減数分裂は、有性生殖を基にした生殖細胞の独特且つ最終的な事象である。減
数分裂は、２つの減数分裂的な分裂を含んで成る。第一分裂の間、母性と父性の
遺伝子の交換が起こり、その後染色体の対が２つの娘細胞に分かれる。これらは
わずかに半分の数（１ｎ）の染色体及び２ｃ ＤＮＡを含む。第二減数分裂は、
ＤＮＡ合成せずに進行する。この分裂は、結果としてわずかに１ｃのＤＮＡを有
する一倍体の生殖細胞の形成をもたらす。

【０００３】 この減数分裂の事象は雄性及び雌性の生殖細胞において類似しているが、卵子
及び精子を導くタイムスケジュール及び分化の過程は大いに異なる。全ての雌性
の生殖細胞が、幼いときに、しばしば生まれる前に第一減数分裂前期に進むが、
前期の終わりに（ディクティエート（ｄｉｃｔｙａｔｅ）状態）卵母細胞として
、思春期後の排卵まで全て停止する。この様に、幼少の頃から雌性は、蓄えが使
い尽くされるまで利用される卵母細胞の蓄えを有している。雌性における減数分
裂は受精が終わるまで完了せず、そして生殖細胞当たりわずかに１つの卵及び２
つの不稔性の極体が生じる。対照的に、雄性の生殖細胞のうち、わずかにいくつ
かが思春期から減数分裂に進み、そして一生の間生殖細胞の大部分はそのままで
ある。一度開始すると、雄性細胞における減数分裂はほとんど遅れることなく進
行し、そして４つの精子を産生する。

【０００４】 雄性及び雌性の減数分裂を制御する機構についてはほとんど知られていない。
卵母細胞の近年の研究は、卵胞のプリン、例えばヒポキサンチン、及びアデノシ
ンが、減数分裂の停止に重要であり得ることを示している（Dowms, S.M., et al
. (1985) in Dev. Biol. 82: 454-458; Eppig, J.J., et al. (1986) in Dev. B
iol. 119: 313-321; 及びDowns, S.M. et al. (1993) in Mol. Reprod. Dev. 35
: 82-94 ）。これらのプリン塩基は、卵胞液中でミリモーラーの濃度で見出され
た（Eppig, J.J., et al. (1985) in Biol. Reprod. 33: 1041-1049 ）。しかし
ながら、プリン塩基によって誘導される停止は可逆的であった。このことは、マ
ウス及びヒトの卵母細胞が、ヒポキサンチンを用いて、続いて阻害剤無しの培地
中で１６〜３０時間培養することによって２４時間減数分裂の停止を維持したと
いう実験によって示された（Downs, S.M., et al. (1986) in Gamet Res. 15: 3
05-316; 及びCha, K.Y., et al. (1992) in Reprod. Fertil. Dev. 4: 695-701
）。ほぼ１０％の停止したマウスの卵母細胞が成熟を再開し、そして更に成熟卵
母細胞は首尾よく受精し、そして完全な着床前及び後の形成を示した。これらの
データは共同で、プリン、例えばヒポキサンチン及びアデノシンが、ｉｎ ｖｉ
ｖｏでの減数分裂を制御する機構において生理学的に重要であるという考えを支
持している。

【０００５】 環状アデノシン５′−モノリン酸（以後ｃＡＭＰと表す）は、卵母細胞の減数
分裂の間、シグナル伝達系路における第二メッセンジャーとして重要な役割を果
たす。ｃＡＭＰはアデニル酸シクラーゼ（以後ＡＣと表す）の作用によって生じ
る。ｃＡＭＰは、不活性な第二メッセンジャー生成物を生成する、ホスホジエス
テラーゼ酵素（以後ＰＤＥと表す）のファミリーによって生成される。ヒポキサ
ンチン（以後Ｈｘと表す）はｃＡＭＰ ＰＤＥの阻害剤である（Eppig, J.J., e
t al. (1985) in Biol. Reprod. 33: 1041-1049 ）。従って、Ｈｘは卵母細胞の
ｃＡＭＰの加水分解を防ぎ、そしてそれによって卵母細胞におけるｃＡＭＰの上
昇したレベルを維持することができる。ヒポキサンチンに加えて、ｃＡＭＰの上
流及び下流に作用する物質は、ｃＡＭＰレベルを増大せしめることができる。こ
の様に、フォルスコリンによるＡＣの活性化、非選択的な３−イソブチル−１−
メチルキサンチン（以後ＩＢＭＸと表す）によるＰＤＥの阻害又は特異的ＰＤＥ
３阻害剤、例えばミルリノンによる卵母細胞特異的なイソ型ＰＤＥ３の阻害は、
卵母細胞内でのｃＡＭＰの上昇したレベルを維持することによって、減数分裂の
停止を導く（Downs, S.M., and Hunzicker-Dunn, M., (1995) in Dev Biol 172:
72-85; 及びTsafiri, A., et al. (1996) in Dev Biol 178: 393-402）。

【０００６】 ＰＤＥ３特異的阻害剤は、避妊薬として記載されている（ＷＯ ９８／１０７
６５）。

【０００７】 拡散可能な減数分裂制御物質の存在は、胎児マウスの性腺のものが最初に記載
された（Byskov, A.G., et al. (1976) in Dev. Biol. 52: 193-200 ）。減数分
裂活性化物質（ＭＡＳ）は、減数分裂が続いている胎児マウスの卵巣において分
泌されており、そして減数分裂防止物質（以後ＭＰＳと表す）は、休止している
非減数分裂細胞を有する、形態学的に分化した精巣から放出された。従って、相
対的な濃度のＭＡＳ及びＭＰＳは、雄性及び雌性の生殖細胞における減数分裂の
停止及び再開の開始を制御することが示唆された（Byskov, A.G., and Hoyer, P
.E., (1994) in The Physiology of Reproduction, Knobil, E., and Neil, J.D
., (Editors), Raven Press, New York, pp.487-540 ）。近年の論文（Byskov,
A.G., et al. (1995) in Nature 374: 559-562）は、あるステロールの単離を記
載しており、排卵前の卵巣の卵胞液由来のものはＦＦ−ＭＡＳ、そしてウシの睾
丸の精巣由来のものはＴ−ＭＡＳとして定義されており、これらは卵母細胞の減
数分裂を活性化する。このことは最近になって、ｄｅ ｎｏｖｏ合成したＦＦ−
ＭＡＳがマウスの卵母細胞における減数分裂の再開を中介し得ることから確認さ
れた（Grondahl et al. (1998) in Biol. Reprod. (1998); 58: 1297-1302 ）。

【０００８】 最初の体外受精による妊娠によって、１９７８年に子供が産まれてから、この
手順は何千もの妊娠をもたらし、そして不妊症のカップルの研究及び処置の大き
な新規領域を切り開いてきた。なおも、改良された不妊症処置の様相についての
重大な必要性が今日存在している。約１／７のカップルが軽度の不妊症又は不妊
症による問題を経験していると予想される。

【０００９】 ヒト卵母細胞の体外受精は、雌性及び雄性の軽度の不妊症の処置に普通に使用
される様になってきている。標準的な体外受精の処置は、雌性の患者の長期間の
ホルモン刺激を含み、これは例えば３０日間であり、患者自身の卵胞刺激ホルモ
ン（以後ＦＳＨと表す）及び黄体形成ホルモン（以後ＬＨと表す）を、ゴナドト
ロピン放出ホルモン（以後ＧｎＲＨと表す）によって抑制することによって開始
され、そしてこの後に、外因性のゴナドトロピン、例えばＦＳＨ及び／又はＬＨ
が、複数の排卵前の卵胞の形成及び排卵直前の、複数のｉｎ ｖｉｖｏで成熟し
た卵母細胞の吸引を保証するために注射される。吸引された卵母細胞は、続いて
ｉｎ ｖｉｔｒｏで受精され、そして４〜８個の細胞の段階で子宮に戻す前に、
典型的に３日間培養される。一連の努力が、この手順を最適化し、そして単純化
するために行われてきた。それにも関わらず、全体的な妊娠率は、現在の処置の
様相をもってしても約２０％以上には有意に増大され得ない。体外受精の患者の
、欧州における大規模な調査において、患者１人当たり、１１．５個の吸引され
た卵母細胞のうち７．２個の卵母細胞が受精直前に減数分裂を再開し、わずかに
４．３個の卵母細胞が受精し、そしてわずかに２．２個の卵母細胞が、受精及び
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養後に８個の細胞の胚の段階に達した（ESHRE, Edinbur
gh, 1997）。

【００１０】 今日の胚に関する技術水準の非常に予測不可能な質により、１つ以上の胚が、
道理に合った成功の機会を与えるためだけに移植されている。それ故に、２〜３
個の胚（いくつかの国においては最大５個の胚）を移植することが一般的である
が、これは患者及び子供の両方に対する大きな不安及び危険性と共に、多胎妊娠
という非常に大きな副作用を伴う。更に、多子出産（双子、三つ子等）による医
療費の増大は、体外受精の支出の合計を超過することが予想される。

【００１１】 従って、現在の処置についての複数の欠点が存在しており、４つの最も顕著な
ものとして、 １．入院を必要とする致死的な症状の可能性がある、ゴナドトロピンの注射によ
る卵巣過剰刺激症候群の危険性、 ２．多胎妊娠（正常な双子及び三つ子の頻度がそれぞれ５０〜１，０００倍）、
３．例えば、多嚢胞性卵巣症候群及び多くの糖尿病性の症候群のために現在の方
法に耐えられない、多くの患者のセグメントの存在、及び ４．潜在的な長期間のガンの危険性、 がある。

【００１２】 更に、体重の減少、鼓脹、吐き気、嘔吐、不安定な状態及び患者の他の不快感
が、自分自身に注射することの患者の不本意と共に欠点として報告されている。

【００１３】 現在、ヒトにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟は、多くの関心及び臨床的な試
みにも関わらず非常に成功しにくいことが証明されている。

【００１４】 本発明の要約 近年、我々は自然な成熟及びＭＡＳ誘導型成熟が、異なるシグナル伝達機構を
利用していることを発見した。自然な成熟は、ＭＡＳ誘導型シグナル伝達機構と
対照的に、コレラ毒素感受性シグナル伝達機構を利用していない。このことは、
異なる受容体、すなわちＧタンパク質共役受容体が２つのシグナル伝達機構を利
用していることを意味する。更に、我々は自然な、及びＦＦ−ＭＡＳ誘導型の卵
母細胞の成熟の動態が完全に異なることを観察した。裸のマウスの卵母細胞は４
時間以内に自然に成熟し、一方、減数分裂が停止されたマウスの卵母細胞（大量
の卵丘細胞の封入物又は種々のプリンのいずれかによる停止）は、１６〜２０時
間かけてＦＦ−ＭＡＳ又はＦＳＨによる活性化で成熟する。

【００１５】 我々は更に、ヒトの卵母細胞が封入されている卵丘のＦＦ−ＭＡＳが、核だけ
でなく細胞質の成熟も改良することを観察した（Grondahl et al., 1999 Alpha
abstract, Copenhagen）。

【００１６】 ＦＦ−ＭＡＳの使用は、現在利用されている方法と比較して妊娠の割合を改良
するが、より一層この割合を増大せしめることが望ましい。

【００１７】 本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで起こり、そして成熟の能動的な誘導を好む、自
然な成熟の回避によって不妊症の処置を改良することに関する。

【００１８】 このことは、卵母細胞の成熟が阻止される方法によって達成される。続いて、
減数分裂の阻止は能動的に反転される。

【００１９】 本発明の詳細な説明 本明細書で特許され、そして請求される方法の１つは、女性、例えば雌性の、
ヒトの患者又は雌性のヒトの供与者から摘出し、又は採取した卵母細胞で行われ
る。当該方法は、以下の段階： １）女性から摘出した卵母細胞を、卵母細胞を停止せしめる条件に適用し（以後
停止段階と表す）、 ２）当該卵母細胞を、停止状態が反転する条件に適用し（以後反転段階と表す）
、 ３）当該卵母細胞を受精させること（以後受精段階と表す）、 を含んで成り、但し、当該卵母細胞が患者又は供与者から摘出されたときから
、以後１６時間、好ましくは以後８時間、更に好ましくは以後４時間、より更に
好ましくは以後２時間、そしてより更に好ましくは以後１時間、自然な成熟が全
く又は実質的に全く起こらない。

【００２０】 あるいは、上記方法の但し書きは、次の様に「但し、当該卵母細胞が患者又は
供与者から摘出されたときから、以後１６時間、好ましくは以後８時間、最も好
ましくは以後４時間、卵核胞崩壊は、減数分裂の再開が能動的に誘導される前に
、全く又は実質的に全く現れない」と表される。

【００２１】 上記方法を実施する前に、少なくとも１つの卵母細胞が女性、例えば雌性の患
者又は供与者から摘出される。この摘出は既知の方法、例えばItskovitz-Eldor
及びThalerによって記述されたもの（Reproductive, Endocrinology, Surgery a
nd Technology Chapter 107 pp 1191-2030, Editors: Adashi, Rock and Rosenw
aks, 1995, Lippencott-Raven publishers）で実施され得る。通常５〜１５個の
卵母細胞が摘出される。全ての卵母細胞が摘出され、又はそれらのうちのわずか
にいくつかのものが本発明の方法に適用され得る。

【００２２】 本発明に使用する卵母細胞は、それらが減数分裂的な成熟を再開するための完
全な能力を獲得する増殖期を終えておくべきである。当該増殖期の完了は、卵胞
の変化の間に起こる。好ましくは、卵胞は少なくとも約５mmの直径を有しており
、そして好ましくは、卵胞は約１０mm以下の直径を有する。

【００２３】 雌性の患者は、体外受精を行うことが決定された女性である。あるいは、卵子
の供与者が使用され得る。

【００２４】停止段階 減数分裂を阻害する環境にある、患者又は供与者の卵胞からの卵母細胞の摘出
の後、当該卵母細胞は、卵母細胞に減数分裂の停止を維持せしめる条件に適用さ
れ、あるいは言い換えると、卵母細胞の自然な成熟が回避される条件、すなわち
停止段階に適用される。卵母細胞を停止せしめる条件は、任意な既知の方法で得
ることができる。例えば、この減数分裂を停止せしめる条件は、何らかの方法で
、例えば卵丘に封入された卵母細胞を単独で、あるいは卵丘細胞、莢膜細胞、顆
粒球細胞、体細胞との共培養液中で、又は上文で列記した細胞が培養液中で産生
し得る自己分泌及び傍分泌因子の濃度によって、若しくは任意な化学的減数分裂
阻害剤、例えばプリンを培地に加えることによって条件づけた培地中で一緒に培
養することによって得ることができる。

【００２５】 卵母細胞の減数分裂状態が観察され、そして核の成熟の進行によって、例えば
無傷の核膜の存在又は不存によってそのまま続けられことがある。未成熟（減数
分裂的に停止した）な卵母細胞は、Ｎｏｍａｒｓｋｉ又はＨｏｆｆａｍａｎｎの
光学レンズを有する倒立顕微鏡を用いる、生きている卵母細胞の光学顕微鏡的な
研究で認識され得る減数分裂の再開による膜崩壊（卵核胞崩壊（以後ＧＶＢと表
す））を経験し得る球状の卵核胞（以後ＧＶと表す）を証明する。

【００２６】 好ましくは、卵母細胞に減数分裂の停止を維持させる条件の期間は、約１時間
〜約４８時間、好ましくは約８時間〜約２２時間である。

【００２７】 卵母細胞が減数分裂を阻害せしめる条件に適用された場合（卵細胞の停止とも
表される）、一定期間卵母細胞を培養することが望ましいと思われる。都合良く
は、この培養期間は約１時間〜約４４時間、好ましくは約４時間〜約３６時間の
範囲内である。好ましくは、卵母細胞は培地、例えばＴＣＭ−１９９又は単純ア
ール平衡塩溶液中で培養される。Ｂａｖｉｓｔｅｒ又はＧａｒｄｎｅｒを参照の
こと。保存は、好ましくは約３６℃〜約３９℃、好ましくは約３７℃〜約３７．
５℃の範囲の温度で実施される。

【００２８】反転段階 卵母細胞が減数分裂を停止せしめる条件に適用された場合、卵母細胞は、停止
状態が反転する、又は換言すると減数分裂の阻止が反転する条件に適用される。
従って、停止段階が反転する段階において、これまでの段階で停止を招いていた
成分はなおも存在していると思われる。好ましくは、停止状態は１又は複数の減
数分裂活性化物質（以後ＭＡＳと表す）の添加によって、あるいは培養細胞に減
数分裂の再開を媒介する物質を産生し、又は分泌せしめる培地成分によって反転
する。

【００２９】 ＷＯ ９６／００２３５から、あるステロール誘導体が減数分裂の制御に使用
され得ることが知られている。その様なステロールの例は、４，４−ジメチル−
５α−コレスタ−８，１４，２４−トリエン−３β−オール（以後、ＦＦ−ＭＡ
Ｓと表す）である。

【００３０】 本明細書において、用語「ＭＡＳ」は、卵母細胞の減数分裂を媒介する化合物
を表す。更に具体的には、ＭＡＳは、以下の例１に記載した試験において、コン
トロールよりも有意に高い卵核胞崩壊（以後ＧＶＢと表す）のパーセンテージを
有する化合物である。好ましい化合物は、ＧＶＢのパーセンテージが少なくとも
５０％、好ましくは少なくとも８０％の化合物である。

【００３１】 ＭＡＳの例は、ＷＯ ９６／００２３５，９６／２７６５８，９７／００８８
４，９８／２８３２３，９８／５４９６５及び９８／５５４９８、更に具体的に
はそれらの請求項１で言及されている。

【００３２】 ＷＯ ９５／０００２６５において、複数の潜在的なＭＡＳが未成熟な雌性の
マウスで試験された。試験動物が頸椎脱臼によって殺される４８時間前に、それ
らは２０IUのＦＳＨ及び２０IUのＬＨを含むヒト閉経ゴナドトロピンの単回注射
を受けた。卵巣を摘出し、ヒポキサンチン培地に据え、そして無関係な組織を除
いた。次に、卵母細胞は、卵胞の外側で穿刺され、卵丘細胞が除かれ、そして減
数分裂制御誘導体を含む培地中で培養された。

【００３３】 好ましくは、卵母細胞が、停止状態が反転する条件に適用される期間は、約１
時間〜約４８時間、好ましくは約４時間〜約３６時間である。

【００３４】 好ましくは、卵母細胞が、それらを停止した減数分裂のまま維持せしめる条件
に適用されてから、卵母細胞が、停止状態が反転する条件に適用されるまでの期
間は、約０時間〜約２４時間、好ましくは約１時間〜約４時間である。

【００３５】受精 卵母細胞が、停止状態が反転される条件に適用された後、卵母細胞は受精され
る。受精は、本質的に標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精（ＩＶＦ）、又は細胞
質内精子注射（intra cytoplasmic sperm injection （ＩＣＳＩ））のいずれか
によって知られている、例えばDavis 及びRosenwaks による総括的な文献（Repr
oductive, Endocrinology, Surgey and Technology Chapter 124, pp.2319-2334
, Editors: Adashi, Rock and Rosenwaks, 1995, Lippencott-Raven publishers
）に記載されている方法で実施される。

【００３６】 卵母細胞が受精した後、接合体が培養液中で形成するまで２，３日放置され、
そして次に患者の子宮に移植されるか、又は低温保存される。好ましくは、これ
は本質的に知られている方法で行われる。

【００３７】 上記処置の段階の多くが既知の方法で実施され、そして残りの段階は本質的に
知られている方法で実施される。

【００３８】 本発明の好ましい態様において、前記方法は以下の段階： ａ）卵母細胞を雌性の患者又は供与者から摘出し、 ｂ）当該卵母細胞を、減数分裂を停止せしめる条件に適用し、 ｃ）当該卵母細胞を、停止状態が反転する条件に適用し、 ｄ）当該卵母細胞を受精させ、そして 移植又は低温保存の前に接合体を形成せしめること、 を含んで成る。

【００３９】 本発明は、以下の例によって更に例示されるが、これは保護の範囲を限定する
ものと見なされるべきではない。前述の記載及び後述の例で開示される特徴は、
任意なそれらの組み合わせで、それらの様々な形態を実現するためのものであっ
てもよい。

【００４０】 例１ ＭＡＳを選択するために使用する方法 卵母細胞は、制御された温度で（２０〜２２℃）、明るいところで（０．６０
０〜１８．００の点灯）、そして相対湿度で（５０〜７０％）維持された、１３
〜１６ｇの重量の未成熟の雌性のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×ＤＢＡ／２Ｊ Ｆ
１，Ｂｏｍｈｏｌｔｇａａｒｄ，Denmark ）から得られた。マウスは、２０IU
ＦＳＨを含む０．２mlのゴナドトロピン（Ｇｏｎａｌ−Ｆ，Ｓｅｒｏｎｏ）の腹
腔内注射を受け、そして４８時間後、頸椎脱臼によって殺された。卵巣を切り離
し、そして卵巣が、立体顕微鏡のもと、一組の２７ゲージの針を用いる手作業に
よる卵胞の破裂によってＨｘ培地（下文を参照のこと）中で単離された。無傷な
卵核胞（以後ＧＶと表す）を示す球状の卵母細胞は、卵丘に封入された卵母細胞
（以後ＣＥＯと表す）及び裸の卵母細胞（以後ＮＯと表す）に分割され、そして
３mg／mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−７０
３０）、５mg／mlのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ，Ｓｔａｔｅ Ｓｅｒｕｍ Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅ，Denmark ）、０．２３mMのピルビン酸塩（Ｓｉｇｍａ，Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．Ｓ−８６３６）、２mMのグルタミン（Ｆｌｏｗ Ｃａｔ．Ｎｏ．１６
−８０１）、１００IU／mlのペニシリン及び１００μｇ／mlのストレプトマイシ
ン（Ｆｌｏｗ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−７００）を添加したα−最小必須培地（リ
ボヌクレオシド無しのα−ＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２２５
６１）中に据えられた。この培地は３mMのヒポキサンチン（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ
．Ｎｏ．Ｈ−９３７７）が添加され、そしてＨｘ培地と表された。

【００４１】 卵母細胞をＨｘ培地中で３回すすぎ、そして均一なサイズの卵母細胞をＣＥＯ
及びＮＯの群に分けた。ＣＥＯ及びＮＯは、各穴が０．４mlのＨｘ培地及び１０
μＭの濃度の試験すべき化合物を含んだ４穴マルチディッシュ（Ｎｕｎｃｌｏｎ
，Denmark ）中で培養した。１つのコントロールの穴（すなわち、試験化合物が
添加されていない、同一の培地中で培養された３５〜４５個の卵母細胞）は、常
に３つの試験的な穴（試験化合物が添加された穴当たり３５〜４５個の卵母細胞
）と同時に培養された。

【００４２】 卵母細胞は、加湿された、大気中の５％ ＣＯ₂ の雰囲気で、２４時間３７℃
で培養された。培養期間の終わりに、ＧＶ，ＧＶＢ及び極体（以後ＰＢと表す）
を有する卵母細胞の数が、それぞれ立体顕微鏡（Ｗｉｌｄｔ，Ｌｅｉｃａ ＭＺ
１２）を用いて計数された。ＧＶＢのパーセンテージは、その穴における卵母
細胞の合計数当たりＧＶＢを経験している卵母細胞のパーセンテージとして定義
され、 ％ＧＶＢ＝（（ＧＶＢの数＋ＰＢの数）／卵母細胞の合計数）×１００、 として算出された。

【００４３】 例２ ヒト卵母細胞を単離し、そして培養するために使用する方法 雌性の患者は、ＩＶＦ又はＩＣＳＩを実施することが決定された女性である。
当該患者は、婦人科学的な検査の後、次のホルモン前処置：ゴナドトロピン放出
ホルモンによるダウンレギュレーション、外来性の組換え又は尿を基にしたヒト
ＦＳＨによる卵胞成長の刺激及びＬＨ活性を示すヒト絨毛性ゴナドトロピン（以
後ｈＣＧと表す）によって誘導される最終的な卵母細胞の成熟に適用される。卵
母細胞は、鎮静状態のもと、超音波によって誘導される、中程度のものから巨大
なサイズの卵胞（直径１２〜２０mmの卵胞）の経膣卵胞吸引を介して吸引される
。

【００４４】 減数分裂阻害環境にある患者の卵胞からの卵母細胞の摘出後、卵母細胞は、卵
母細胞に減数分裂の停止を維持せしめる、換言すると卵母細胞の自然な成熟を回
避する条件に適用される。この減数分裂停止条件は、卵丘に封入されている卵母
細胞を、卵丘細胞／顆粒膜細胞との共培養と共に培養して卵母細胞の成熟を阻止
することによって、又は生理学的ＰＤＥ阻害剤であるヒポキサンチンを、例えば
３mMの濃度で培地に加えることによって得られる。

【００４５】 減数分裂の停止を保証せしめる、顆粒膜細胞及びヒポキサンチンを含む培地Ｔ
ＣＭ−１９９中での１時間の期間の後、２０μＭのＦＦ−ＭＡＳを培地に加え、
次にこれを、減数分裂の停止に打ち勝つために約３７．４℃の温度で２４時間培
養した。

【００４６】 例３ 未成熟ヒト卵母細胞を単離し、そして培養するために使用する方法 雌性の患者は、ＩＶＦ又はＩＣＳＩを実施することが決定された女性である。
当該患者は、婦人科学的な検査の後、次のホルモン前処置に適用される：周期に
おける６日目に（０日目は月経の最初の日である）、小さい卵胞の短期間の刺激
が、２２５ＩＥの外来性の組換え又は尿を基にしたヒトＦＳＨの３日間の注射に
よって誘導される。未成熟卵母細胞は、鎮静状態のもと、超音波によって誘導さ
れる、小〜中程度のサイズの卵胞（直径６〜１２mmの卵胞）の経膣卵胞吸引を介
して吸引される。減数分裂阻害環境にある患者の卵胞からの卵母細胞の摘出後、
卵母細胞は、卵母細胞に減数分裂の停止を維持せしめる、換言すると卵母細胞の
自然な成熟を回避する条件に適用される。この減数分裂停止条件は、卵丘に封入
されている卵母細胞を、卵丘細胞／顆粒膜細胞との共培養と共に培養して卵母細
胞の成熟を阻止することによって、又は生理学的ＰＤＥ阻害剤であるヒポキサン
チンを、例えば３mMの濃度で培地に加えることによって得られる。

【００４７】 減数分裂の停止を保証せしめる、顆粒膜細胞及びヒポキサンチンを含む培地Ｔ
ＣＭ−１９９中での１時間の期間の後、２０μＭのＦＦ−ＭＡＳを培地に加え、
次にこれを、減数分裂の停止に打ち勝つために３６時間培養した。

【００４８】 例４ 目的：適切な濃度のＦＦ−ＭＡＳを添加することによって卵母細胞の成熟を開始
する前に、自然な成熟を４時間停止させることによって、哺乳類の卵母細胞のた
めの培養条件を最適化すること。 卵母細胞は、制御された光及び温度のもとで維持した、１３〜１６ｇの重量の
未発達な（２１〜２４日齢）雌性のマウス（Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ×ＤＢＡ／２Ｊ
Ｆ１−ｈｙｂｒｉｄｓ，Ｍ ＆ Ｂ，Denmark ）から得た。当該マウスは、２０
IUのＦＳＨを含む０．２mlのゴナドトロピン（Ｇｏｎａｌ−Ｆ，Ｓｅｒｏｎｏ）
の腹腔内注射を受け、そして４８時間後、当該動物は頸椎脱臼によって殺された
。卵巣を切除し、そして立体顕微鏡のもと、一組の２７ゲージの針を用いる手作
業による卵胞の破壊によってＨｘ培地（下文を参照のこと）中で単離された。無
傷な卵核胞（ＧＶ）を示す球状の卵母細胞を選択し、そして３mMのヒポキサンチ
ン（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ−９３７７）、８mg／mlのヒト血清アルブミ
ン（ＨＳＡ，Ｓｔａｔｅ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Denmark ）、０．
２３mMのピルビン酸塩（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ−８６３６）、２mMのグ
ルタミン（Ｆｌｏｗ Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−８０１）、１００IU／mlのペニシリ
ン及び１００μｇ／mlのストレプトマイシン（Ｆｌｏｗ Ｃａｔ．Ｎｏ．１６−
７００）を添加したα最小必須培地（リボヌクレオシド無しのα−ＭＥＭ，Ｇｉ
ｂｃｏ ＢＲＬ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２２５６１）中に据えた。この培地はＨｘ培地
を表した。Ｈｘを除いて全く同一な培地をＨｘを含まない培地と表した。

【００４９】 この様に、卵母細胞は、各穴が０．４mlのＨｘ培地又はＨｘを含まない培地（
自然な成熟をさせるため）及び３５〜４５個の卵母細胞を含んだ４穴マルチディ
ッシュ（Nunclon, Denmark）で培養した。

【００５０】 異なる処置群： １．コントロール：阻害無し、ＦＦ−ＭＡＳ無し ２．ＭＡＳ：阻害無し及び１０□Ｍ ＦＦ−ＭＡＳ ３．阻害及びその後に自然な成熟：Ｈｘ培地中で４時間、その後Ｈｘを含まない
培地への移し替え ４．阻害及びＦＦ−ＭＡＳの誘導：Ｈｘ培地中で４時間、そしてＨｘ培地へのＦ
Ｆ−ＭＡＳの添加 ５．阻害及び阻害の除去、及びその後のＦＦ−ＭＡＳ誘導：Ｈｘ培地中での４時
間、すすぎ、Ｈｘを含まない培地への移し替え、及びＦＦ−ＭＡＳの添加。 成熟から１６〜２０時間後の体外受精。 指標：受精率及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚の発生。

【表１】

【００５１】 ５つの処置のうち１つが、受精率及び胚の発生能として評価される卵母細胞の
観点において、他のものより優れていた。第４番目の処置の様相、すなわち阻害
及びＦＦ−ＭＡＳ誘導は、他の処置の選択肢よりも有意に優れていた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）女性から摘出した卵母細胞を、卵母細胞を停止せしめる
   条件に適用し（本明細書では停止段階と表す）、 ｂ）当該卵母細胞を、停止状態が反転する条件に適用し（本明細書では反転段階
   と表す）、そして ｃ）当該卵母細胞を受精させること（本明細書では受精段階と表す）、 を含んで成る方法であって、但し、当該卵母細胞が患者又は供与者から摘出され
   たときから、以後１６時間、好ましくは以後８時間、最も好ましくは以後４時間
   、より更に好ましくは以後２時間、そしてより更に好ましくは以後１時間、減数
   分裂の再開がＭＡＳによって能動的に誘導される前に、ＧＶＢの初期に見られる
   自然な成熟は、全く又は実質的に全く起こらない条件付きでの方法。
2. 【請求項２】 ａ）女性から摘出した卵母細胞を、卵母細胞を停止せしめる
   条件に適用し（本明細書では停止段階と表す）、 ｂ）当該卵母細胞を、停止状態が反転する条件に適用し（本明細書では反転段階
   と表す）、そして ｃ）当該卵母細胞を受精させること（本明細書では受精段階と表す）、 を含んで成る方法であって、但し、当該卵母細胞が患者又は供与者から摘出され
   たときから、以後１６時間、好ましくは以後８時間、最も好ましくは以後４時間
   、より更に好ましくは以後２時間、そしてより更に好ましくは以後１時間、減数
   分裂の再開が能動的に誘導される前に、卵核胞崩壊が全く又は実質的に全く現れ
   ない条件付きでの方法。
3. 【請求項３】 受精段階後に（すなわち段階ｃ後に）、卵母細胞を発生させ
   る段階を含んで成る、請求項１又は２に記載の方法。
4. 【請求項４】 停止状態が反転する条件が、ＭＡＳを用いてもたらされる、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 停止状態が反転する条件が、卵母細胞−卵丘混合物中での減
   数分裂刺激分子の内因性の形成を導く培養条件である、請求項１〜４のいずれか
   １項に記載の方法。
6. 【請求項６】 本明細書に記載の特徴のうちの任意な新規特徴又は組み合わ
   せ。