JP2003277398A - Antibody against transferrin-including immune complex, method of producing the same, hybridoma and immunity measuring method - Google Patents

Antibody against transferrin-including immune complex, method of producing the same, hybridoma and immunity measuring method

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JP2003277398A
JP2003277398A JP2002083212A JP2002083212A JP2003277398A JP 2003277398 A JP2003277398 A JP 2003277398A JP 2002083212 A JP2002083212 A JP 2002083212A JP 2002083212 A JP2002083212 A JP 2002083212A JP 2003277398 A JP2003277398 A JP 2003277398A
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    • G01N2333/435Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/79Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an antibody that can identify a patient with alcoholism and a patient with hepatitis, a method of producing the antibody, a hybridoma for producing the antibody and a simple immunoassay using the antibody. <P>SOLUTION: The antibody to be provided selectively reacts with an immune complex and the immune complex is composed of transferrin and immunoglobulin. The content of the immune complex in the body fluid is high in a patient with alcoholism but low in a patient with non-alcoholism and the difference can be measured with the antibody. Since the immune complex in the body fluid is determined with the antibody against the immune complex composed of transferring and immunoglobulin, the patients with alcoholism or hepatitis can be simply identified with high exactness. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【0001】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、アルコール中毒患
者及び/又は肝疾患患者を同定することができる抗体、
該抗体の製造方法、該抗体を産生するハイブリドーマ、
該抗体を用いた免疫測定方法に関する。
TECHNICAL FIELD The present invention relates to an antibody capable of identifying an alcoholic patient and / or a liver disease patient,
A method for producing the antibody, a hybridoma producing the antibody,
The present invention relates to an immunoassay method using the antibody.

【0002】[0002]

【従来の技術】アルコール中毒は、アルコール中毒患者
とかれらの関係者に多大の損害もたらすばかりか、アル
コール中毒に関連する生産性の損失及び莫大な年間健康
管理費用をもたらす。従って、アルコール中毒への早期
認識と治療とが個人及び社会にとって最善且つ費用効果
的である。このような状況下において、様々な集団にお
ける飲酒の併発症の危険にある個人を確認するために、
高感度で特異的、しかも迅速で費用のかからない方法が
必要である。重度の飲酒者を検出するために、多くの検
査法がこの30年間に開発されている。
BACKGROUND OF THE INVENTION Alcohol poisoning not only causes great damage to alcoholics and their individuals, but also results in lost productivity and enormous annual health care costs associated with alcohol poisoning. Therefore, early recognition and treatment of alcoholism is the best and cost effective for individuals and society. To identify individuals at risk of comorbid drinking in various populations under these circumstances,
What is needed is a method that is sensitive, specific, yet rapid and inexpensive. Many tests have been developed in the last 30 years to detect severe drinkers.

【0003】例えば、γ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼ(γ−GTP)、平均血球容積(mean corpuscular
volume) (MCV)、アスパラギン酸アミノトランスア
ミナーゼ(AST)又はアラニンアミノトランスアミナ
ーゼ(ALT)、α−リポタンパク質及びフェリチンの
ような臨床検査項目が、アルコール乱用の生化学的マー
カーとして多年にわたって用いられてきたが、これらの
検査の診断的感度及び特異性は満足のいくものではなか
った。また、アルコール摂取のレベル評価が、治療中に
おけるその効果を知る上で非常に重要でありながら、ア
ルコール中毒患者自身からのアルコール消費量の報告
は、信頼性の低いものであった。このような状況を鑑み
て、長期間の過度のアルコール消費と相関性のある簡易
な臨床検査法が望まれていた。
For example, γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTP), mean corpuscular
volume) (MCV), aspartate aminotransaminase (AST) or alanine aminotransaminase (ALT), α-lipoprotein and ferritin have been used as biochemical markers for alcohol abuse for many years, , The diagnostic sensitivity and specificity of these tests was unsatisfactory. Also, while the assessment of the level of alcohol intake is very important for knowing its effect during treatment, the reports of alcohol consumption by alcoholics themselves were unreliable. In view of such a situation, a simple clinical test method that is correlated with long-term excessive alcohol consumption has been desired.

【0004】Stibler らは、Acta Med Scan, 206, 275-
281,(1979)で、トランスフェリンの高い等電点を持つ
イソ型(isoform )が1週間以上にわたって毎日60g
以上のエタノールを摂取した者の81%で増加が認めら
れ、10日以上にわたって禁酒する場合に高い等電点を
持つイソ型が正常レベルに戻ることを報告している。
Stibler et al., Acta Med Scan, 206 , 275-
281, (1979), 60 g of transferrin isoform with high isoelectric point daily for over 1 week.
An increase was observed in 81% of those who took the above ethanol, and it was reported that the isoform having a high isoelectric point returns to a normal level when alcohol is absent for 10 days or more.

【0005】血清トランスフェリンは、79.5kDの
分子量を有し、二つのN−連結の多糖鎖を有する一本の
ポリペプチド鎖から成る糖タンパクである。これらの多
糖鎖は、分岐状であり、かつ末端シアル酸残基を有し、
シアル化の異なるレベルに応じて、6つのトランスフェ
リンイソ型が存在する。Wongおよび Regoeczi は、Int.
J.Peptide Res.9, 241-248, (1977)において、ヒトトラ
ンスフェリンは天然では不均一であり、シアル化の異な
るレベルに伴って種々のイソ型が存在すると述べてい
る。事実、6 種のこのようなイソ型、ペンタシアロ、テ
トラシアロ、トリシアロ、ジシアロ、モノシアロおよび
アシアロトランスフェリンが存在する。
Serum transferrin is a glycoprotein having a molecular weight of 79.5 kD and consisting of a single polypeptide chain having two N-linked polysaccharide chains. These polysaccharide chains are branched and have a terminal sialic acid residue,
There are six transferrin isoforms, depending on different levels of sialylation. Wong and Regoeczi are Int.
In J. Peptide Res. 9, 241-248, (1977), human transferrin is heterogeneous in nature and states that different isoforms exist with different levels of sialylation. In fact, there are six such isoforms, pentacialo, tetrasialo, trisialo, disialo, monosialo and asialotransferrin.

【0006】正常な健康個体においては、テトラシアロ
が支配するのに対して、アルコール中毒患者の血液中に
は、アシアロ、モノシアロ、ジシアロ、およびある程度
まではトリシアロが上昇したレベルで存在することが見
出されている (van Eijk etal, Clin Chim Acta 132 ,
167-171, (1983)、Stibler, Clin Chim, 37, 2029-203
7,(1991)および Stibler et al, ”Carbohydrate-def
icient transferrin (CDT) in serum as a marker of h
igh alcohol consumption", Advances in theBioscienc
es, (Ed Nordmann et al), Pergamon, 1988,Vol.71, p
ages 353-357参照) 。
In normal healthy individuals, tetrasialo is predominant, whereas in the blood of alcoholics, asialo, monosialo, disialo and to some extent elevated levels of trisialo are found. (Van Eijk et al, Clin Chim Acta 132 ,
167-171, (1983), Stibler, Clin Chim, 37 , 2029-203
7, (1991) and Stibler et al, “Carbohydrate-def.
icient transferrin (CDT) in serum as a marker of h
igh alcohol consumption ", Advances in the Bioscienc
es, (Ed Nordmann et al), Pergamon, 1988, Vol.71, p
ages 353-357).

【0007】アシアロ、モノシアロ、ジシアロおよびト
リシアロイソ型は、糖鎖欠損トランスフェリン(略語:
CDT)と呼ばれている。CDTは、アルコール消費、
特に慢性アルコール消費を検出およびモニターするため
の有効なマーカーであることが見出されている。CDT
は、従来の試験(例えばγ−GTPまたはMCV)とは
異なり、肝臓病を伴う患者における高アルコール摂取の
スクリーニングのために使用できるので、CDTのため
の検査法がWO−96/26444および Heil et al
、Anaesthetist, 43, 447-453,(1994)等に記載されて
いる。彼らの手法では、希釈血清サンプルをアニオン性
イオン交換樹脂に通し、正常なトランスフェリンイソ型
を樹脂に保持させる一方、CDT分画の通過を可能にし
ている。この溶出液のCDT含量は、免疫比濁法 (immu
noturbidimetric assay)等によって測定される。その
他、高速液体クロマト法によりCDTを定量する方法
(WO95/04932)も知られている。
The asialo, monosialo, disialo and trisialo isoforms are sugar chain-deficient transferrin (abbreviation:
It is called CDT). CDT is alcohol consumption,
In particular, it has been found to be an effective marker for detecting and monitoring chronic alcohol consumption. CDT
, Unlike conventional tests (eg γ-GTP or MCV), can be used for screening for high alcohol intake in patients with liver disease, so the test method for CDT is WO-96 / 26444 and Heil et al. al
, Anaesthetist, 43 , 447-453, (1994) and the like. In their approach, a diluted serum sample is passed through an anion ion exchange resin, allowing the normal transferrin isoform to be retained on the resin while allowing the CDT fraction to pass through. The CDT content of this eluate was determined by the immunoturbidimetric method (immu
noturbidimetric assay). In addition, a method for quantifying CDT by high performance liquid chromatography (WO95 / 04932) is also known.

【0008】[0008]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記従
来の検査手法の全ては、臨床検査の現場で普通に用いら
れる多くの臨床検査用自動分析装置に直接適用できず、
また、その検査手法も、イオン交換樹脂或いは高速液体
クロマト法を適用する等比較的複雑な手順に基づくもの
であった。
However, all of the above-mentioned conventional examination methods cannot be directly applied to many automatic analyzers for clinical examination commonly used in clinical examination sites,
The inspection method is also based on a relatively complicated procedure such as application of an ion exchange resin or high performance liquid chromatography.

【0009】一方、Makhloufらは、CDTのみを直接測
定するために、CDTに対するモノクローナル抗体の作
製を試みた。CDTを特異的に認識するモノクローナル
抗体を取得する目的で,糖鎖の結合している413番目
と611番目のアスパラギンを中心として前後6個のア
ミノ酸の合成ペプチドを免疫原として抗体を作製し、そ
の抗体をCDT測定のための免疫測定法に応用すること
を考えた(WO93/06133)。これに対して、E
R.Trimbleらは(Biochem Soc Trans, 26(1), S48(1998)
に、Makhloufらの手法による、合成ペプチドを免疫原
として作製したモノクローナル抗体はCDTには反応し
なかったことからそのエピトープはトランスフェリン分
子内に隠匿されており検出に応用できないと述べてい
る。
On the other hand, Makhlouf et al. Attempted to produce a monoclonal antibody against CDT in order to directly measure only CDT. For the purpose of obtaining a monoclonal antibody that specifically recognizes CDT, a synthetic peptide of 6 amino acids before and after the 413th and 611st asparagine to which a sugar chain is bound is used as an immunogen to prepare an antibody. It was considered to apply the antibody to an immunoassay for CDT measurement (WO93 / 06133). On the other hand, E
R. Trimble et al. (Biochem Soc Trans, 26 (1), S48 (1998)
In addition, since the monoclonal antibody prepared by the method of Makhlouf et al. Using a synthetic peptide as an immunogen did not react with CDT, its epitope is hidden in the transferrin molecule and cannot be applied to detection.

【0010】本発明者らは係る状況を鑑みて、まったく
新たなる発想の下に、アルコール中毒患者或いは肝疾患
患者を同定するための抗体、該抗体の製造方法、ハイブ
リドーマ及び該抗体を用いた簡便な免疫測定法を提供す
ることを目的とする。
In view of the above situation, the present inventors, under a completely new idea, an antibody for identifying an alcoholic patient or a liver disease patient, a method for producing the antibody, a hybridoma, and a simple method using the antibody. It is intended to provide a simple immunoassay method.

【0011】[0011]

【課題を解決するための手段】アルコール性肝疾患患者
或いはアルコール中毒者に、トランスフェリンと免疫グ
ロブリンから成る免疫複合体が多いことを本発明者らは
初めて見いだした。このような報告は従来見当たらな
い。本発明者らはこの点に着目し、本発明を完成した。
本発明者らは、トランスフェリンと免疫グロブリンから
成る免疫複合体量を測定することでアルコール中毒患者
を同定できないかと考え、固相化抗トランスフェリン抗
体と、酵素標識化抗免疫グロブリンG(IgG)抗体に
よるサンドイッチイムノアッセイで免疫複合体量を測定
した。その結果は、正しく期待した通り、アルコール性
疾患患者から健康固体とは有意な差異を持って多くの量
のトランスフェリンと免疫グロブリンから成る免疫複合
体が測定されたのみならず、肝炎ウイルス、例えば、B
型、C型などによる肝疾患患者にも、トランスフェリン
と免疫グロブリンから成る免疫複合体が健康固体とは有
意な差異を持って多くの量測定されることを本発明者ら
は確認した。
The present inventors have for the first time found that there are many immune complexes consisting of transferrin and immunoglobulin in patients with alcoholic liver disease or alcoholics. No such report has been found before. The present inventors have paid attention to this point and completed the present invention.
The present inventors thought that an alcoholic patient could be identified by measuring the amount of an immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin. Therefore, the inventors used immobilized anti-transferrin antibody and enzyme-labeled anti-immunoglobulin G (IgG) antibody. The amount of immune complex was measured by sandwich immunoassay. The results, as expected, were that not only were hepatitis virus, e.g. B
The present inventors have confirmed that even in patients with liver disease due to type C and type C, a large amount of the immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin is measured with a significant difference from that of a healthy individual.

【0012】即ち、本発明の抗体は、(1)免疫複合体
に選択的に反応する抗体であって、(2)該免疫複合体
はトランスフェリンと免疫グロブリンから成る免疫複合
体であり、(3)該免疫複合体の体液中の量は、アルコ
ール中毒患者に多く、非アルコール中毒患者に少ないこ
とが有意な差異で測定されることを特徴とする抗体であ
る。本明細書で、「有意な差異」とは、危険率(P)が
0.05(5%)以下、好ましくは、0.01(1%)
以下の確率で差異があることを示す。
That is, the antibody of the present invention is (1) an antibody that selectively reacts with an immune complex, and (2) the immune complex is an immune complex composed of transferrin and immunoglobulin, and (3) ) An antibody characterized in that the amount of the immune complex in a body fluid is measured by a significant difference that it is high in alcoholics and low in non-alcoholics. In the present specification, the "significant difference" means that the risk rate (P) is 0.05 (5%) or less, preferably 0.01 (1%).
It indicates that there is a difference with the following probability.

【0013】トランスフェリンと免疫グロブリンから成
る免疫複合体は、前記アルコール中毒患者のみならず、
アルコール性肝疾患患者、肝炎ウイルス等による肝疾患
患者等の体液中に健康固体とは有意な差異を持って多く
産生される。本発明の抗体は、アルコール性肝疾患患
者、肝炎ウイルス等による肝疾患患者等の体液中に産生
されるトランスフェリンと免疫グロブリンから成る免疫
複合体に対しても選択的に反応する抗体である。したが
って、本発明の抗体を用いて該免疫複合体を測定すれ
ば、アルコール性疾患患者、アルコール中毒者、肝炎ウ
ィルス等による肝疾患患者の同定が可能である。
The immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin is not limited to the above alcoholics,
A large amount is produced in body fluids of patients with alcoholic liver disease, liver disease due to hepatitis virus, etc. with a significant difference from healthy solids. The antibody of the present invention is an antibody that selectively reacts also with an immune complex composed of transferrin and immunoglobulin produced in a body fluid of a patient with alcoholic liver disease, a patient with liver disease due to hepatitis virus or the like. Therefore, by measuring the immune complex using the antibody of the present invention, it is possible to identify patients with alcoholic diseases, alcoholics, and patients with liver diseases due to hepatitis virus and the like.

【0014】本発明の抗体は、モノクローナル抗体であ
ってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。
The antibody of the present invention may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.

【0015】本発明の抗体産生方法は、(1)トランス
フェリンと免疫グロブリンから成る免疫複合体であっ
て、該免疫複合体の体液中の量がアルコール中毒患者に
多く、非アルコール中毒患者に少ないことが有意な差異
で測定される免疫複合体を、動物に免疫することにより
動物の体内に該免疫複合体に対して選択的に反応する抗
体を産生させ、(2)該該動物から該抗体を採取するこ
とを特徴とする。
The method for producing an antibody of the present invention is (1) an immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin, wherein the amount of the immune complex in body fluid is high in alcoholic patients and low in non-alcoholic patients. Is immunized into the animal by immunizing the immune complex, which is measured with a significant difference, to produce an antibody that selectively reacts with the immune complex in the body of the animal, and (2) the antibody is produced from the animal. Characterized by collecting.

【0016】本発明のハイブリドーマは、前記した特徴
を有する抗体がモノクローナル抗体であって、該モノク
ローナル抗体を産生する能力を有するハイブリドーマで
ある。
The hybridoma of the present invention is a hybridoma in which the antibody having the above-mentioned characteristics is a monoclonal antibody and has the ability to produce the monoclonal antibody.

【0017】本発明の1番目の免疫測定方法は、前記し
た本発明の抗体を、体液に接触させ、該抗体に選択的に
反応する免疫複合体を検出または、定量化することを特
徴とする。即ち、前記した本発明の免疫測定方法に用い
られる抗体には次の1)−4)の態様が挙げられる。 1)免疫複合体に選択的に反応する抗体であって、該免
疫複合体はトランスフェリンと免疫グロブリンから成る
免疫複合体であり、該免疫複合体の体液中の量は、アル
コール中毒患者に多く、非アルコール中毒患者に少ない
ことが有意な差異で測定されることを特徴とする抗体。 2)前記1)の抗体がモノクローナル抗体である抗体; 3)前記1)の抗体がポリクローナル抗体である抗体; 4)トランスフェリンと免疫グロブリンから成る免疫複
合体を免疫原として動物に免疫することにより得られた
抗体。
The first immunoassay method of the present invention is characterized in that the above-mentioned antibody of the present invention is brought into contact with a body fluid, and an immune complex selectively reacting with the antibody is detected or quantified. . That is, the antibody used in the above-described immunoassay method of the present invention includes the following aspects 1) to 4). 1) An antibody that selectively reacts with an immune complex, wherein the immune complex is an immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin, and the amount of the immune complex in body fluid is high in alcoholics. An antibody characterized by being significantly less measured in non-alcoholic patients. 2) An antibody in which the antibody in 1) is a monoclonal antibody; 3) An antibody in which the antibody in 1) is a polyclonal antibody; 4) Obtained by immunizing an animal with an immune complex composed of transferrin and immunoglobulin as an immunogen. Antibodies.

【0018】前記1番目の免疫測定方法において、免疫
複合体に対する抗体は、トランスフェリンと免疫グロブ
リンから成る免疫複合体のみに反応することから、該免
疫複合体を高精度に測定することができる。
In the first immunoassay, the antibody against the immune complex reacts only with the immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin, so that the immune complex can be measured with high accuracy.

【0019】本発明の2番目の免疫測定方法は、体液
に、抗トランスフェリン抗体と抗免疫グロブリン抗体を
接触させ、トランスフェリンと免疫グロブリンから成る
免疫複合体を検出、または定量化することを特徴とす
る。
The second immunoassay method of the present invention is characterized in that a body fluid is contacted with an anti-transferrin antibody and an anti-immunoglobulin antibody to detect or quantify an immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin. .

【0020】また、前記2番目の免疫測定方法において
は、固相用担体を用いる免疫測定方法を使用し、且つ固
相化させる抗体としてトランスフェリン抗体を選択でき
るが、この場合には、トランスフェリンと免疫グロブリ
ンとの複合体だけではなく、トランスフェリンも固相化
抗体に捕捉されてしまうため、前記1番目の免疫測定方
法に比べ、測定感度が低下する場合がある。
In the second immunoassay method, an immunoassay method using a solid phase carrier is used, and transferrin antibody can be selected as an antibody to be immobilized. In this case, transferrin and immunization are used. Since not only the complex with globulin but also transferrin is captured by the immobilized antibody, the measurement sensitivity may be lower than that of the first immunoassay method.

【0021】本発明の免疫測定方法は、アルコール中毒
者及び/又はアルコール性肝疾患患者の同定を可能に
し、アルコール消費の監視を可能にする。本発明の免疫
測定方法は、アルコール中毒者及び/又はアルコール性
肝疾患患者の同定或いはアルコール消費の監視に関し
て、従来技術の測定法より迅速かつ操作が簡易な免疫測
定法である。また、本発明の免疫測定方法は、肝炎ウイ
ルス等による肝疾患患者等の体液中に産生されるトラン
スフェリンと免疫グロブリンから成る免疫複合体に対し
ても測定が可能である。
The immunoassay method of the present invention enables identification of alcoholics and / or patients with alcoholic liver disease, and enables monitoring of alcohol consumption. The immunoassay method of the present invention is an immunoassay method that is quicker and easier to operate than the prior art assay methods for identifying alcoholics and / or patients with alcoholic liver disease or monitoring alcohol consumption. In addition, the immunoassay method of the present invention can also measure an immune complex composed of transferrin and immunoglobulin produced in a body fluid of a patient with liver disease caused by hepatitis virus or the like.

【0022】本発明において、免疫複合体を構成するト
ランスフェリンには、肝疾患患者及び/又はアルコール
中毒者に産生される種々のトランスフェリンが含まれ
る。
In the present invention, the transferrin constituting the immune complex includes various transferrins produced by patients with liver diseases and / or alcoholics.

【0023】[0023]

【発明の実施の形態】免疫測定方法 本発明の1番目及び2番目の免疫測定方法に適用可能な
方法には、不均一系測定方法としては、放射性同位体元
素標識免疫測定法、酵素標識免疫測定法、蛍光標識免疫
測定法、免疫比濁法、ラテックススライド凝集法、ラテ
ックス免疫比濁法、サンドイッチ法等が挙げられる。均
一系としては蛍光消光法、蛍光増強法、エネルギートラ
ンスファー法、凝集法、比濁法等が挙げられる。本発明
の免疫測定方法は如何なる反応形式で行われてもよく、
均一系でも不均一系でも何れであってもよい。これらの
免疫測定法は用手法あるいは自動化されてもよい。
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Immunoassay Method The methods applicable to the first and second immunoassay methods of the present invention include, as heterogeneous assay methods, radioisotope-labeled immunoassay, enzyme-labeled immunoassay. The measurement method, the fluorescence-labeled immunoassay method, the immunoturbidimetric method, the latex slide agglutination method, the latex immunoturbidimetric method, the sandwich method and the like can be mentioned. Examples of the homogeneous system include a fluorescence quenching method, a fluorescence enhancement method, an energy transfer method, an agglutination method and a nephelometry method. The immunoassay method of the present invention may be performed in any reaction format,
It may be either homogeneous or heterogeneous. These immunoassays may be manual or automated.

【0024】前記免疫比濁法、ラテックススライド凝集
法、ラテックス免疫比濁法に用いられる試薬において、
体液中のトランスフェリンと免疫グロブリンから成る免
疫複合体の検出または定量化を可能にするために、抗原
抗体反応に依存して形成される凝集に基づく濁度を肉眼
あるいは、例えば免疫比濁法の場合340nm、ラテッ
クス免疫比濁法では540nm付近の波長を利用して分
光学的に測定されるものが望ましい。
In the reagents used in the immunoturbidimetric method, the latex slide agglutination method, and the latex immunoturbidimetric method,
To enable the detection or quantification of immune complexes consisting of transferrin and immunoglobulins in body fluids, the turbidity based on aggregation formed depending on the antigen-antibody reaction is visually or, for example, in the case of immunoturbidimetry. 340 nm, in the latex immunoturbidimetric method, it is desirable to measure spectroscopically using a wavelength near 540 nm.

【0025】標識物質 前記免疫測定方法において、放射性同位体元素標識免疫
測定法、酵素標識免疫測定法、蛍光標識免疫測定法に用
いられる試薬の一つは、体液中のトランスフェリンと免
疫グロブリンから成る免疫複合体の検出または定量化を
可能にするために、標識される必要があるが、それらの
標識物質については公知のものを使用してもよく、例え
ば、以下のものが挙げられる。
Labeling substance One of the reagents used in the above-mentioned immunoassay method is a radioisotope-labeled immunoassay method, an enzyme-labeled immunoassay method, and a fluorescence-labeled immunoassay method. In order to enable detection or quantification of the complex, it is necessary to label, but known labeling substances may be used, and examples thereof include the following.

【0026】1)酵素:アルカリフォスファターゼ、ペ
ルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラク
トシダーゼ、グルコース−6−フォスフェートデヒドロ
ゲナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等 2)蛍光体:フルオレセインイソシアネート、ローダミ
ン、テキサスレッド等3)放射性同位体元素:I125
131 等 4)生物発光体:ルシフェリン、エクオリン等 5)化学発光体:イソルミノール、アクリジニウムエス
テル、オキサレートエステル等 所望の試薬へのこれらの標識体の結合は、公知の技術を
用いて行うことができる。
1) Enzyme: alkaline phosphatase, peroxidase, glucose oxidase, β-galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, acetylcholinesterase, etc. 2) Fluorophore: fluorescein isocyanate, rhodamine, Texas red, etc. 3) Radioisotope element: I 125 ,
I 131, etc. 4) Bioluminescent substance: luciferin, aequorin, etc. 5) Chemiluminescent substance: Isoluminin, acridinium ester, oxalate ester, etc. It can be carried out.

【0027】固相用担体 抗体の固相化に用いる担体の材質及び形状は、測定用途
によって公知のものから選択できる。例えば、ポリスチ
レン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルア
ミド、ガラス、アガロース、ニトロセルロース等が挙げ
られる。形状としては、マイクロタイタープレート、バ
イアル、ラテックスビーズ、ディップストリップ等が挙
げられる。
Solid phase carrier The material and shape of the carrier used for immobilizing the antibody can be selected from known ones depending on the measurement application. Examples thereof include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyacrylamide, glass, agarose and nitrocellulose. Examples of the shape include microtiter plates, vials, latex beads, dip strips and the like.

【0028】体液 本発明の免疫測定方法の対象となる体液は、血清、血
漿、唾液またはその他の体液であってもよいが、血清で
あることが好ましい。
Body fluid The body fluid which is the target of the immunoassay method of the present invention may be serum, plasma, saliva or other body fluid, but serum is preferred.

【0029】1番目の免疫測定方法 1)免疫原及び抗体の取得 アルコール性肝疾患患者及び/又はアルコール中毒者の
体液から精製あるいは部分的に精製された少なくとも一
種のイソ型トランスフェリンと免疫グロブリンから成る
免疫複合体を免疫原として用い、動物に免疫して、該動
物からトランスフェリンと免疫グロブリンから成る免疫
複合体に選択的に反応する抗体を取得することができ
る。
First immunoassay method 1) Acquisition of immunogen and antibody Consists of at least one isoform transferrin and immunoglobulin purified or partially purified from body fluids of patients with alcoholic liver disease and / or alcoholics The immune complex can be used as an immunogen to immunize an animal to obtain an antibody that selectively reacts with the immune complex composed of transferrin and immunoglobulin.

【0030】例えば、免疫原はすべてのトランスフェリ
ンイソ型と反応する抗トランスフェリン抗体を使用する
アフィニティークロマトグラフィーにより、アルコール
性肝疾患患者及び/又はアルコール中毒者の血清から精
製又は部分的に精製されたものでもよく、更に好ましく
は、ゲルクロマトグラフィーにより、トランスフェリン
単独分画より分子量の大きい分画、即ちトランスフェリ
ンと免疫グロブリンから成る免疫複合体分画を免疫原と
してもよい。
For example, the immunogen has been purified or partially purified from the sera of patients with alcoholic liver disease and / or alcoholics by affinity chromatography using anti-transferrin antibodies that react with all transferrin isoforms. However, more preferably, by gel chromatography, a fraction having a molecular weight higher than that of transferrin alone, that is, an immunocomplex fraction composed of transferrin and immunoglobulin may be used as an immunogen.

【0031】2)ポリクローナル抗体、ハイブリドー
マ、及びモノクローナル抗体 ポリクローナル抗体は上記免疫原を動物に免疫し、該動
物から採取される。動物を免疫する方法は公知の手法が
適用でき、それに必要な免疫プロトコールは当業者にと
って容易に決定し得る。例えば、本発明の抗体は、アジ
ュバントと混合した免疫原を適当な宿主動物(ウサギ、
ヤギ、ウマまたはその他の哺乳類)に注射することによ
り、作製し得る。免疫原の注射は、適当な力価の抗血清
が得られるまで続けられる。抗血清は回収後、必要に応
じてアフィニティークロマトやイオン交換クロマト法等
の既知技術を用いて更に精製されることが好ましい。
2) Polyclonal antibody, hybridoma, and monoclonal antibody Polyclonal antibody is obtained by immunizing an animal with the above immunogen. A known method can be applied to a method for immunizing an animal, and an immunization protocol required for the method can be easily determined by those skilled in the art. For example, the antibody of the present invention is prepared by combining an immunogen mixed with an adjuvant with a suitable host animal (rabbit,
Goats, horses or other mammals). Injection of immunogen is continued until a suitable titer of antiserum is obtained. After collecting the antiserum, it is preferable that the antiserum is further purified, if necessary, using a known technique such as affinity chromatography or ion exchange chromatography.

【0032】また、本発明の抗体は、免疫された動物
(例えば、ラット、ハムスター、マウスまたはその他の
哺乳類)から得た細胞と不死化細胞とを融合することに
よって得られる融合細胞(ハイブリドーマ)から得るこ
とができる。例えばマウスを使用することが可能であ
る。この場合、免疫原を既知技術により免疫した後、免
疫したマウスから回収した脾臓細胞とマウスミエローマ
細胞を用いてケーラーとミルシュタインの方法(ネイチ
ャー256巻495頁1975年)により目的のハイブ
リドーマを得ることが可能である。目的とする抗体を産
生するハイブリドーマの選択は、免疫原として用いたト
ランスフェリンと免疫グロブリンから成る免疫複合体、
トランスフェリン、免疫グロブリンをそれぞれ固相化し
た酵素免疫測定法でなされ,トランスフェリンと免疫グ
ロブリンには反応せず、免疫複合体のみに強く反応する
ものを選択する。最終的には限界希釈法にてクローンニ
ングを施し、目的とするハイブリドーマを得る。モノク
ローナル抗体は、得られたハイブリドーマから既知技術
である培養系またはマウス腹腔内で作製し、前記ポリク
ローナル抗体の場合と同様に、アフィニティークロマト
やイオン交換クロマト法等の既知技術により精製するこ
とができる。
Further, the antibody of the present invention is obtained from a fused cell (hybridoma) obtained by fusing a cell obtained from an immunized animal (eg, rat, hamster, mouse or other mammal) with an immortalized cell. Obtainable. For example, a mouse can be used. In this case, after immunizing the immunogen by a known technique, the target hybridoma is obtained by the method of Köhler and Milstein (Nature 256, 495, 1975) using spleen cells and mouse myeloma cells collected from the immunized mouse. Is possible. The selection of hybridomas producing the desired antibody is carried out by using an immunocomplex composed of transferrin and immunoglobulin used as an immunogen,
An enzyme-linked immunosorbent assay in which transferrin and immunoglobulin are immobilized is used. Select one that does not react with transferrin and immunoglobulin but strongly reacts only with the immune complex. Finally, cloning is performed by the limiting dilution method to obtain the target hybridoma. The monoclonal antibody can be prepared from the obtained hybridoma in a culture system or mouse abdominal cavity which is a known technique, and can be purified by a known technique such as affinity chromatography or ion exchange chromatography as in the case of the polyclonal antibody.

【0033】本発明の免疫測定法に用いるのに適した抗
体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体で
あってもよく、抗血清またはその精製分画、あるいは既
知のイソタイプまたはサブクラスでもよい。更には、必
要に応じて抗原と結合できる抗体フラグメントであって
もよい。即ち、抗体に関する唯一の条件は、それが少な
くともアルコール中毒患者に多く、非アルコール中毒患
者に少ないことが有意な差異で測定される免疫複合体、
即ち、トランスフェリンと免疫グロブリンから成る免疫
複合体に対して選択的に反応し得ることである。
Antibodies suitable for use in the immunoassay of the present invention may be polyclonal or monoclonal antibodies, antisera or purified fractions thereof, or known isotypes or subclasses. Further, it may be an antibody fragment capable of binding to an antigen if necessary. That is, the only condition for the antibody is the immune complex, which is measured by the significant difference that it is predominant in at least alcoholics and less in non-alcoholics,
That is, it can selectively react with an immune complex composed of transferrin and immunoglobulin.

【0034】3)免疫複合体の検出方法 好ましい検出方法としては、サンドイッチ法が推奨され
る。この測定法において、例えば、トランスフェリンと
免疫グロブリンから成る免疫複合体と選択的に反応する
抗体が固相化される。体液を該固相化抗体と反応せしめ
ることにより、体液中に含まれる免疫複合体が固相化抗
体に結合する。次いで未反応物を洗浄後、標識抗体が添
加され、これが固定化抗体に既に結合した免疫複合体に
結合する。この標識抗体は、抗トランスフェリン抗体の
ように全ての免疫複合体と反応する抗体であることが好
ましい。結合した標識成分の量は体液中のトランスフェ
リンと免疫グロブリンから成る免疫複合体量に比例す
る。
3) Detection Method of Immune Complex As a preferable detection method, the sandwich method is recommended. In this assay method, for example, an antibody that selectively reacts with an immune complex composed of transferrin and immunoglobulin is immobilized. By reacting the body fluid with the immobilized antibody, the immune complex contained in the body fluid binds to the immobilized antibody. After washing the unreacted material, labeled antibody is added, which binds to the immune complex already bound to the immobilized antibody. This labeled antibody is preferably an antibody that reacts with all immune complexes, such as an anti-transferrin antibody. The amount of bound labeling component is proportional to the amount of immune complex of transferrin and immunoglobulin in the body fluid.

【0035】本発明の免疫測定方法において、トランス
フェリンと免疫グロブリンから成る免疫複合体に選択的
に反応するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を
捕捉抗体、即ち、固相に固定化するための固相化抗体と
して用いことが望ましい。
In the immunoassay method of the present invention, a polyclonal or monoclonal antibody that selectively reacts with an immune complex composed of transferrin and immunoglobulin is used as a capture antibody, that is, a solid-phase antibody for immobilizing on a solid phase. Is desirable.

【0036】2番目の免疫測定方法 具体的には、固相化抗トランスフェリン抗体と、酵素標
識化抗免疫グロブリンG(IgG)抗体、A(IgA)
抗体またはM(IgM)抗体の組み合わせによるサンド
イッチイムノアッセイ;或いは、固相化抗免疫グロブリ
ンG(IgG)抗体、A(IgA)抗体又はM(Ig
M)抗体と、酵素標識化抗トランスフェリン抗体の組み
合わせによるサンドイッチイムノアッセイにより、体液
中に含まれるトランスフェリンと免疫グロブリンから成
る免疫複合体を検出、または定量化することが可能であ
る。
Second Immunoassay Method Specifically, a solid-phased anti-transferrin antibody, an enzyme-labeled anti-immunoglobulin G (IgG) antibody, and A (IgA)
Sandwich immunoassay with a combination of antibodies or M (IgM) antibodies; or immobilized anti-immunoglobulin G (IgG) antibodies, A (IgA) antibodies or M (Ig)
M) A sandwich immunoassay using a combination of an antibody and an enzyme-labeled anti-transferrin antibody can detect or quantify an immune complex composed of transferrin and immunoglobulin contained in a body fluid.

【0037】本発明の2番目の免疫測定方法は、トラン
スフェリン或いは免疫グロブリンも固相化抗体に捕捉さ
れてしまうために前記1番目の免疫測定方法に比べて、
測定精度はやや落ちる。
In the second immunoassay method of the present invention, transferrin or immunoglobulin is also captured by the immobilized antibody, so that the second immunoassay method is
The measurement accuracy drops slightly.

【0038】[0038]

【実施例】以下に、本発明を実施例及び添付した図を参
照して詳述する。
DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described in detail below with reference to embodiments and the accompanying drawings.

【0039】〔実施例1〕 健常者とアルコール性肝疾患患者の血清中におけるトラ
ンスフェリンと免疫グロブリンから成る免疫複合体量の
比較 健常者96検体及びアルコール性肝疾患患者92検体の
パネル血清中に存在する免疫複合体量を2種類の抗体を
用いたサンドイッチ酵素免疫測定法(ELISA)によ
り測定した。すなわち、96ウェルのマイクロプレート
に10mMリン酸緩衝液pH7.2(略語:PBS)で
10μg/mlに調製した抗ヒトトランスフェリンポリ
クローナル抗体を1ウェル当たりそれぞれ100μl 加
え,4℃で一昼夜反応させた。その後PBSで1回洗浄
し、0.5 %牛血清アルブミン(BSA)を含むPBS
(B−PBS)でブロッキングを行い、スクリーニング
用のプレートとした。各血清をPBSで50倍に希釈し
た溶液100μl をウェルに加え、室温で1時間反応さ
せた。PBSで洗浄した後、アルカリフォスファターゼ
標識抗ヒトIgG抗体(シグマ社製)溶液100μl を
加えて室温で1時間反応させた。洗浄後、アルカリフォ
スファターゼ活性をKind−King法にて発色さ
せ、マイクロプレートリーダーで490nmの吸光度
(OD)を測定することにより、免疫複合体を検出し
た。
Example 1 Comparison of Amount of Immune Complex Containing Transferrin and Immunoglobulin in Serum of Healthy Subjects and Patients with Alcoholic Liver Disease Present in panel serum of 96 healthy subjects and 92 subjects with alcoholic liver disease The amount of immune complex to be measured was measured by sandwich enzyme immunoassay (ELISA) using two kinds of antibodies. That is, 100 μl of each anti-human transferrin polyclonal antibody prepared at 10 μg / ml with 10 mM phosphate buffer (pH 7.2) (abbreviation: PBS) was added to a 96-well microplate, and the mixture was reacted at 4 ° C. overnight. After that, it was washed once with PBS and PBS containing 0.5% bovine serum albumin (BSA).
Blocking was performed with (B-PBS) to obtain a screening plate. 100 μl of a 50-fold diluted solution of each serum with PBS was added to the wells and reacted at room temperature for 1 hour. After washing with PBS, 100 μl of an alkaline phosphatase-labeled anti-human IgG antibody (manufactured by Sigma) was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing, the alkaline phosphatase activity was developed by the Kind-King method, and the absorbance (OD) at 490 nm was measured with a microplate reader to detect the immune complex.

【0040】その結果を図1のグラフに示す。図1に示
すように、アルコール性肝疾患患者においてトランスフ
ェリンと免疫グロブリンから成る免疫複合体の量が有意
に多いことが明かとなった。
The results are shown in the graph of FIG. As shown in FIG. 1, it was revealed that the amount of the immune complex composed of transferrin and immunoglobulin was significantly high in the patients with alcoholic liver disease.

【0041】〔実施例2〕 免疫原の調製 アルコール依存症患者由来のプール血清20mlを、抗
トランスフェリンポリクローナル抗体を結合させた10
mlのSepharose4B(ファルマシア社製)カ
ラムに通し、トランスフェリンと免疫グロブリンから成
る免疫複合体を含むと推定される血清中の全トランスフ
ェリン分画を捕獲した。カラム体積の10倍量のPBS
でカラムを洗浄後、酸(0.1Mグリシン−塩酸緩衝液
pH2.3)で溶出した。PBSで一晩透析し、酸で解
離した免疫複合体を再構築させ、さらに分子量の差を利
用したゲルろ過カラム(ULTROGEL AcA34 :商品名、BIOS
EPRA社製)クロマトグラフィーにより、トランスフェリ
ンと免疫グロブリンから成る免疫複合体の分画と、トラ
ンスフェリンの分画を分離精製した。回収したトランス
フェリンと免疫グロブリンから成る免疫複合体の分画は
限外ろ過により濃縮して免疫原とした。
[Example 2] Preparation of immunogen 20 ml of pooled serum derived from an alcoholic patient was bound with an anti-transferrin polyclonal antibody.
The fraction was passed through a Sepharose 4B (Pharmacia) column to capture the total transferrin fraction in serum presumably containing an immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin. 10 column volumes of PBS
After washing the column with, the column was eluted with an acid (0.1 M glycine-hydrochloric acid buffer pH 2.3). After dialysis against PBS overnight, the acid-dissociated immune complex was reconstituted and the gel filtration column (ULTROGEL AcA34: trade name, BIOS
The fraction of the immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin and the fraction of transferrin were separated and purified by chromatography (EPRA). The collected fraction of the immunocomplex composed of transferrin and immunoglobulin was concentrated by ultrafiltration to obtain an immunogen.

【0042】図2に、血清中の全トランスフェリン分画
をゲルろ過カラムにかけたときの溶出プロファイル(実
線OD280nm)、及びトランスフェリンと免疫グロ
ブリンから成る免疫複合体の溶出分画(破線OD490
nm)を示す。免疫複合体の検出は、固相化抗体に抗ヒ
トトランスフェリンポリクローナル抗体、標識抗体に抗
ヒト免疫グロブリンG抗体を用いたサンドイッチELI
SAで行っているため、該免疫複合体の溶出分画は確か
にトランスフェリンと免疫グロブリンから成る免疫複合
体である。図2は、免疫複合体の分画が主要なトランス
フェリンのピークよりも高分子領域に検出されることを
示す。この結果は、該分画がトランスフェリンと免疫グ
ロブリンから成る免疫複合体であることを示す。
FIG. 2 shows the elution profile when the total transferrin fraction in serum was applied to a gel filtration column (solid line OD280 nm), and the elution fraction of the immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin (broken line OD490).
nm) is shown. The detection of the immune complex was carried out by sandwich ELI using an anti-human transferrin polyclonal antibody as the immobilized antibody and an anti-human immunoglobulin G antibody as the labeled antibody.
Since it is performed on SA, the elution fraction of the immune complex is indeed an immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin. FIG. 2 shows that a fraction of the immune complex is detected in the higher molecular region than the major transferrin peak. This result indicates that the fraction is an immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin.

【0043】図2における矢印で示す範囲は以下の実施
例において使用した精製された抗原(トランスフェリン
と免疫グロブリンから成る免疫複合体)の分画範囲を示
す。
The range indicated by the arrow in FIG. 2 represents the range of fractionation of the purified antigen (immunocomplex composed of transferrin and immunoglobulin) used in the following examples.

【0044】〔実施例3〕 ハイブリドーマの調製 前記実施例2で得られた精製された抗原を用いて、抗原
溶液(0.5mg/ml)を調製した。該抗原溶液50
0μlにフロインドの完全アジュバンド500μlを混
和して乳化させ、5週令のBALB/cマウスの皮下に
免疫した。追加免疫としてフロインドの完全アジュバン
ドをフロインドの不完全アジュバンドに変えたもので同
様に調製したものを2週おきに3回繰り返した。その間
免疫時に採血をして抗原に対する血中の抗体活性を測定
した。最終免疫から14日後に500μlの抗原溶液を
腹腔内に投与し、3日後、脾臓を摘出した。脾細胞はマ
ウスミエローマ細胞(P3−NS1−Ag4−1(NS
−1)とポリエチレングリコール4000(メルク社
製)の存在下で2分間反応させることにより融合させ
た。融合後選択培地に縣濁して96ウェルの培養プレー
トに分注し,37℃のCO2 インキュウベーターで培養
した。その後1週間に1度培養液の半量を交換すること
により、ハイブリドーマを調製した。
Example 3 Preparation of Hybridoma An antigen solution (0.5 mg / ml) was prepared using the purified antigen obtained in Example 2 above. The antigen solution 50
500 μl of Freund's complete adjuvant was mixed with 0 μl to emulsify, and 5-week-old BALB / c mice were subcutaneously immunized. As a booster, Freund's complete adjuvant was replaced with Freund's incomplete adjuvant, and the same preparation was repeated every two weeks for three times. During that time, blood was collected at the time of immunization to measure the antibody activity in the blood against the antigen. Fourteen days after the final immunization, 500 μl of the antigen solution was intraperitoneally administered, and three days later, the spleen was extracted. Splenocytes are mouse myeloma cells (P3-NS1-Ag4-1 (NS
-1) and polyethylene glycol 4000 (manufactured by Merck) were reacted for 2 minutes to fuse the two. After fusion, the cells were suspended in a selective medium, dispensed into a 96-well culture plate, and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. Then, the hybridoma was prepared by replacing half of the culture medium once a week.

【0045】〔実施例4〕 免疫原に対する抗体産生ハイブリドーマの選抜(1次ス
クリーニング) 抗体産生ハイブリドーマの確認は、免疫原に用いた免疫
複合体を固相化したELISAにより行った。すなわち
96ウェルのマイクロプレートにPBSで10μg/m
lに調製した抗原を1ウェル当たりそれぞれ100μl
加え,4℃で一昼夜反応させた。その後PBSで1回洗
浄し、B−PBSでブロッキングを行いスクリーニング
用のプレートとした。増殖の認められたウェルの培養上
清をPBSで10倍に希釈した溶液100μlをウェル
に加え,室温で1時間反応させた。引き続きPBSで洗
浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウス免疫グロ
ブリン(BIOSOURCE INTERNATIONAL )溶液100μlを
加え、室温で1時間反応させた。再び洗浄後、アルカリ
フォスファターゼ活性をKind−King法にて発色
させ、マイクロプレートリーダーで490nmのODを
測定し、該免疫複合体に対する抗体活性を持つモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを選抜した。
Example 4 Selection of Antibody-Producing Hybridomas Against Immunogen (Primary Screening) Confirmation of antibody-producing hybridomas was performed by ELISA in which the immune complex used as the immunogen was immobilized. That is, 10 μg / m 2 with PBS in a 96-well microplate
100 μl of antigen prepared in each well
In addition, the reaction was performed overnight at 4 ° C. Thereafter, the plate was washed once with PBS, blocked with B-PBS, and used as a plate for screening. 100 μl of a solution obtained by diluting the culture supernatant of the well in which the growth was observed with PBS by 10 times was added to the well and reacted at room temperature for 1 hour. Subsequently, after washing with PBS, 100 μl of an alkaline phosphatase-labeled anti-mouse immunoglobulin (BIOSOURCE INTERNATIONAL) solution was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. After washing again, alkaline phosphatase activity was developed by the Kind-King method, OD at 490 nm was measured by a microplate reader, and a monoclonal antibody-producing hybridoma having an antibody activity against the immune complex was selected.

【0046】〔実施例5〕 トランスフェリンと免疫グロブリンから成る免疫複合体
に選択的に反応する抗体の選抜(2次スクリーニング) 免疫原に対する抗体活性を持つモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマは、モノクローナル抗体の大量産生のた
めマウス腹腔内にて増殖させた。こうして得られたマウ
ス腹水中のモノクローナル抗体は、プロテインAアガロ
ース(Bio−Rad社製)を用いたカラムクロマトグ
ラフィーにより精製した。トランスフェリン及び免疫グ
ロブリンに反応せず、トランスフェリンと免疫グロブリ
ンから成る免疫複合体に選択的に反応する抗体の選抜
は、ELISAにより行った。即ち96ウェルのマイク
ロプレートにPBSで10μg/mlに調製したトラン
スフェリン、免疫グロブリン、またはトランスフェリン
と免疫グロブリンから成る免疫複合体溶液を1ウェル当
たりそれぞれ100μl加え、4℃で一昼夜反応させ
た。その後、PBSで1回洗浄し、B−PBSでブロッ
キングを施したものをスクリーニング用プレートとし
た。これらのウェルに10μg/mlに調製したモノク
ローナル抗体溶液を100μl加え、室温で1時間反応
させた。PBSで洗浄した後、アルカリフォスファター
ゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体溶液100μlを加
え、室温で1時間反応させた。引き続き洗浄後、アルカ
リホスファターゼ活性をKind−King法にて発色
させ、マイクロプレートリーダーで490nmのODを
測定した。その結果を縦軸にODを採ったグラフとして
図3に示す。
Example 5 Selection of Antibodies Reactively Reacting with Immune Complex Consisting of Transferrin and Immunoglobulin (Secondary Screening) A monoclonal antibody-producing hybridoma having an antibody activity against an immunogen is a large-scale production of monoclonal antibody. Therefore, it was proliferated in the abdominal cavity of the mouse. The thus obtained mouse ascites monoclonal antibody was purified by column chromatography using protein A agarose (manufactured by Bio-Rad). An antibody that does not react with transferrin and immunoglobulin but selectively reacts with an immune complex composed of transferrin and immunoglobulin was selected by ELISA. That is, 100 μl each of transferrin, immunoglobulin, or an immune complex solution consisting of transferrin and immunoglobulin prepared in PBS at 10 μg / ml was added to a 96-well microplate, and reacted at 4 ° C. overnight. Then, the plate was washed once with PBS and blocked with B-PBS to obtain a screening plate. 100 μl of a monoclonal antibody solution adjusted to 10 μg / ml was added to these wells and reacted at room temperature for 1 hour. After washing with PBS, 100 μl of alkaline phosphatase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody solution was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. After subsequent washing, alkaline phosphatase activity was developed by the Kind-King method, and OD at 490 nm was measured by a microplate reader. The results are shown in FIG. 3 as a graph in which the vertical axis represents OD.

【0047】トランスフェリンと免疫グロブリンから成
る免疫複合体に対して高い反応を示したモノクローナル
抗体産生株(CT861)をトランスフェリンと免疫グ
ロブリンから成る免疫複合体に対する特異抗体(CT8
61抗体)産生ハイブリドーマとして選抜した。該モノ
クローナル抗体産生株(CT861)は、独立行政法人
産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM
P−18762として寄託されている。
A monoclonal antibody-producing strain (CT861) which showed a high reaction against an immune complex composed of transferrin and immunoglobulin was used as a specific antibody (CT8) against the immune complex composed of transferrin and immunoglobulin.
61 antibody) hybridomas were selected. The monoclonal antibody producing strain (CT861) was transferred to FERM at the Patent Biological Depositary Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
Deposited as P-18762.

【0048】〔実施例6〕 CT861抗体が血清中のトランスフェリンと免疫グロ
ブリンから成る免疫複合体を認識していることの確認 前記実施例5で選抜したモノクローナル抗体産生株(C
T861)の産生するCT861抗体が血中のトランス
フェリンと免疫グロブリンから成る免疫複合体を認識し
ていることを確かめるため、アルコール性肝疾患患者由
来のプール血清をゲルろ過カラム(ULTROGEL AcA34 :商
品名:BIOSEPRA社製) クロマトグラフィーにより分画
し、CT861抗体を固相化したサンドイッチELIS
Aで測定を行った。すなわち96ウェルのマイクロプレ
ートにPBSで10μg/mlに調製したCT861抗
体を1ウェル当たりそれぞれ100μl加え、4℃で一
昼夜反応させた。その後PBSで1回洗浄し、B−PB
Sでブロッキングを行い測定用のプレートとした。これ
らのウェルに各分画を100μl加え、室温で1時間反
応させた。PBSで洗浄した後、アルカリフォスファタ
ーゼ標識抗ヒトトランスフェリン抗体溶液100μlを
加え、室温で1時間反応させた。引き続き洗浄した後、
アルカリフォスファターゼ活性をKind−King法
にて発色させ、マイクロプレートリーダーで490nm
のODを測定した。その結果を縦軸にODを採ったグラ
フとして図4に示す。
[Example 6] Confirmation that CT861 antibody recognizes immune complex composed of transferrin and immunoglobulin in serum Monoclonal antibody producing strain (C
To confirm that the CT861 antibody produced by T861) recognizes an immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin in blood, pooled serum from a patient with alcoholic liver disease was subjected to gel filtration column (ULTROGEL AcA34: trade name: BIOSEPRA) Sandwich ELISA with CT861 antibody immobilized by chromatography
The measurement was performed at A. That is, 100 μl of each CT861 antibody prepared in PBS at 10 μg / ml was added to a 96-well microplate and reacted at 4 ° C. overnight. After that, wash once with PBS, B-PB
A plate for measurement was obtained by blocking with S. 100 μl of each fraction was added to these wells and reacted at room temperature for 1 hour. After washing with PBS, 100 μl of an alkaline phosphatase-labeled anti-human transferrin antibody solution was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. After continuous washing,
Alkaline phosphatase activity is developed by the Kind-King method, and 490 nm is read by a microplate reader.
Was measured. The result is shown in FIG. 4 as a graph in which OD is plotted on the vertical axis.

【0049】図4は、血清をゲルろ過カラムにかけたと
きの溶出プロファイル(実線OD280nm)及びCT
861の反応する分画(破線OD490nm)を示した
図である。白抜き矢印はトランスフェリンの分子量域
を、黒色矢印は免疫グロブリンの分子量域を、灰色矢印
はトランスフェリンと免疫グロブリンから成る免疫複合
体の分子量域を示している。図4に示すようにCT86
1抗体はトランスフェリン及び免疫グロブリンの分子量
域には反応せず、トランスフェリンと免疫グロブリンか
ら成る免疫複合体の分子量域にのみ反応することが示さ
れた。CT861抗体は免疫複合体にのみ反応し、トラ
ンスフェリン及び免疫グロブリンには反応しないことが
確認できる。
FIG. 4 shows the elution profile (solid line OD280 nm) and CT when serum was applied to a gel filtration column.
It is the figure which showed the fraction (broken line OD490nm) which 861 reacts. The white arrow indicates the molecular weight range of transferrin, the black arrow indicates the molecular weight range of immunoglobulin, and the gray arrow indicates the molecular weight range of the immune complex composed of transferrin and immunoglobulin. As shown in Figure 4, CT86
It was shown that 1 antibody did not react in the molecular weight range of transferrin and immunoglobulin, but only in the molecular weight range of the immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin. It can be confirmed that the CT861 antibody reacts only with the immune complex and not with transferrin and immunoglobulin.

【0050】〔実施例7〕 CT861抗体を用いた肝疾患患者の同定のための臨床
試験 肝疾患患者の同定の根拠となる免疫複合体を検出するた
めに、各種の肝疾患患者(アルコール性肝疾患患者50
検体、B型肝炎ウィルス患者20検体、及びC型肝炎ウ
ィルス患者20検体)の各パネル血清92検体及び健常
者血清96検体を用いてCT861抗体を固相化したサ
ンドイッチELISAで次のように測定を行った。
Example 7 Clinical Test for Identification of Liver Disease Patients Using CT861 Antibody In order to detect an immune complex which is the basis for identification of liver disease patients, various liver disease patients (alcoholic liver Disease patient 50
Samples, 20 hepatitis B virus patients, and 20 hepatitis C virus patients) were used in a sandwich ELISA in which CT861 antibody was immobilized using 92 panel sera of each sample and 96 sera of healthy subjects. went.

【0051】すなわち96ウェルのマイクロプレートに
PBSで10μg/mlに調製したCT861抗体を1
ウェル当たりそれぞれ100μl加え,4℃で一昼夜反
応させた。その後PBSで1回洗浄し、B−PBSでブ
ロッキングを行い測定用のプレートとした。これらのウ
ェルにPBSで20倍希釈した血清を100μl加え、
室温で1時間反応させた。PBSで洗浄した後、アルカ
リフォスファターゼ標識抗ヒトトランスフェリン抗体溶
液100μlを加え、室温で1時間反応させた。引き続
き洗浄した後、アルカリホスファターゼ活性をKind
−King法にて発色させ、マイクロプレートリーダー
で490nmのODを測定した。
That is, a CT861 antibody prepared at 10 μg / ml with PBS was added to a 96-well microplate.
100 μl was added to each well and reacted at 4 ° C. overnight. After that, the plate was washed once with PBS and blocked with B-PBS to prepare a plate for measurement. 100 μl of serum diluted 20-fold with PBS was added to these wells,
The reaction was carried out at room temperature for 1 hour. After washing with PBS, 100 μl of an alkaline phosphatase-labeled anti-human transferrin antibody solution was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. After subsequent washing, the alkaline phosphatase activity was
-King method was used for color development, and OD at 490 nm was measured with a microplate reader.

【0052】これらの測定値を用いて解析を行った結果
を図5に示す。図5−1はアルコール性肝疾患患者と健
常者の比較、図5−2はB型肝炎ウィルス患者と健常者
との比較、図5−3はC型肝炎ウィルス患者と健常者と
の比較である。図5に示すようにCT861抗体は健常
者に比べ肝疾患患者血清に対して有意に高い反応性を示
すことが示され、本測定系が肝疾患患者と健常者を明確
に区別することが可能な測定系であることが分かる。
The results of the analysis using these measured values are shown in FIG. Fig. 5-1 is a comparison between alcoholic liver disease patients and healthy subjects, Fig. 5-2 is a comparison between hepatitis B virus patients and healthy subjects, and Fig. 5-3 is a comparison between hepatitis C virus patients and healthy subjects. is there. As shown in Fig. 5, it was shown that CT861 antibody shows significantly higher reactivity to serum of liver disease patients than healthy people, and this measurement system can clearly distinguish liver disease patients and healthy people. It turns out that it is a different measurement system.

【0053】〔実施例8〕 抗ヒトトランスフェリン抗体と抗ヒト免疫グロブリン抗
体を用いた肝疾患患者の同定のための臨床試験 肝疾患患者の同定の根拠となる免疫複合体を検出するた
めに、各種の肝疾患患者(アルコール性肝疾患患者50
検体、B型肝炎ウィルス患者20検体、C型肝炎ウィル
ス患者20検体)の各パネル血清及び健常者血清96検
体を用いて免疫複合体を検出するサンドイッチELIS
Aで次のように測定を行った。
Example 8 Clinical Test for Identification of Liver Disease Patients Using Anti-Human Transferrin Antibody and Anti-Human Immunoglobulin Antibody In order to detect an immune complex which is the basis for identification of a liver disease patient, various tests were conducted. Liver disease patients (alcoholic liver disease patients 50
Sandwich ELIS for detection of immune complex using each panel serum of 96 samples, 20 samples of hepatitis B virus patient, 20 samples of hepatitis C virus patient) and 96 samples of healthy person serum
The measurement was performed in A as follows.

【0054】すなわち、96ウェルのマイクロプレート
に10mMリン酸緩衝液pH7.2(PBS)で10μ
g/mlに調製した抗ヒトトランスフェリンポリクロー
ナル抗体溶液を1ウェル当たりそれぞれ100μl加
え,4℃で一昼夜反応させた。その後PBSで1回洗浄
し、0.5%牛血清アルブミン(BSA)を含むPBS
(B−PBS)でブロッキングを行い、スクリーニング
用のプレートとした。各血清をPBSで50倍に希釈し
た溶液100μlをウェルに加え,室温で1時間反応さ
せた。PBSで洗浄した後、アルカリフォスファターゼ
標識抗ヒトIgG抗体(シグマ社製)溶液100μlを
加えて室温で1時間反応させた。洗浄後、アルカリフォ
スファターゼ活性をKind−King法にて発色さ
せ、マイクロプレートリーダーで490nmの吸光度
(OD)を測定することにより、免疫複合体を検出し
た。これらの測定値を用いて解析を行った結果を図6に
示す。図6−1はアルコール性肝疾患患者と健常者の比
較、図6−2はB型肝炎ウィルス患者と健常者との比
較、図6−3はC型肝炎ウィルス患者と健常者との比較
である。図6によれば、本測定系が肝疾患患者と健常者
を明確に区別することが可能な測定系であることが分か
る。
That is, 10 μM of 10 mM phosphate buffer pH 7.2 (PBS) was added to a 96-well microplate.
An anti-human transferrin polyclonal antibody solution prepared at g / ml was added to each well in an amount of 100 μl and reacted at 4 ° C. overnight. After that, it was washed once with PBS and PBS containing 0.5% bovine serum albumin (BSA)
Blocking was performed with (B-PBS) to obtain a screening plate. 100 μl of a 50-fold diluted solution of each serum with PBS was added to the wells and reacted at room temperature for 1 hour. After washing with PBS, 100 μl of an alkaline phosphatase-labeled anti-human IgG antibody (manufactured by Sigma) was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing, the alkaline phosphatase activity was developed by the Kind-King method, and the absorbance (OD) at 490 nm was measured with a microplate reader to detect the immune complex. The result of analysis using these measured values is shown in FIG. FIG. 6-1 is a comparison between an alcoholic liver disease patient and a healthy person, FIG. 6-2 is a comparison between a hepatitis B virus patient and a healthy person, and FIG. 6-3 is a comparison between a hepatitis C virus patient and a healthy person. is there. According to FIG. 6, it can be seen that this measurement system is a measurement system capable of clearly distinguishing between a liver disease patient and a healthy person.

【0055】〔実施例9〕 CT861抗体のアルコール中毒マーカーとしての有用
性 公知のアルコール中毒のマーカーとしてのγ−GTP及
び糖鎖欠損トランスフェリン(CDT)の測定値と、C
T861抗体を用いたサンドイッチELISAの測定値
を、アルコール中毒患者血清55検体及び健常者血清1
4検体を用いて次のようにして比較した。
Example 9 Usefulness of CT861 Antibody as a Marker for Alcohol Poisoning Measured values of γ-GTP and sugar chain deficient transferrin (CDT) as known markers for alcohol poisoning, and C
The sandwich ELISA measurement values using the T861 antibody were used to determine 55 alcohol-intoxicated patient sera and 1 healthy individual serum.
The four samples were compared as follows.

【0056】γ−GTPの測定は、γ−GTP測定用試
薬(GTP HAテストワコ−, 和光純薬社製)により
プロトコールに準じて血清中のγ−GTP活性を測定す
ることで行った。CDTの測定は、CDT測定試薬(%C
DT TIA Standard Version :商品名、Bio−Rad社
製)によりプロトコールに準じて血清中の全トランスフ
ェリンに占めるCDTの割合 (%CDT) を測定することで
行った。表1に、CT861抗体を用いたサンドイッチ
ELISAの測定値と、γ−GTPの測定値を陽性及び
陰性の一致率で示した。表1に示すように、γ−GTP
が陽性の34検体についてはCT861抗体を用いたサ
ンドイッチELISAは必ず陽性を示すことが分かる。
The measurement of γ-GTP was carried out by measuring the γ-GTP activity in serum using a γ-GTP measuring reagent (GTP HA test Wako, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the protocol. CDT measurement is performed using a CDT measurement reagent (% C
DT TIA Standard Version: trade name, manufactured by Bio-Rad) was used to measure the ratio of CDT to total transferrin in serum (% CDT) according to the protocol. In Table 1, the measured values of sandwich ELISA using CT861 antibody and the measured values of γ-GTP are shown as positive and negative concordance rates. As shown in Table 1, γ-GTP
It can be understood that the sandwich ELISA using the CT861 antibody is always positive for the 34 specimens that are positive.

【0057】[0057]

【表1】 [Table 1]

【0058】表1の中で、γ−GTPが陰性で且つCT
861抗体を用いたサンドイッチELISAが陽性を示
す21検体について%CDTを測定した結果を、表2に
陽性及び陰性の一致率で示す。表2に示すように、前記
表1におけるγ−GTP陰性で且つCT861抗体陽性
の21検体については、全て%CDT陽性を示すアルコ
ール中毒患者検体であった。
In Table 1, γ-GTP was negative and CT
Table 2 shows the results of measuring% CDT of 21 specimens showing positive results in the sandwich ELISA using the 861 antibody, in terms of positive and negative concordance rates. As shown in Table 2, all the 21 specimens of γ-GTP negative and CT861 antibody positive in Table 1 above were alcohol poisoning patient specimens showing% CDT positive.

【0059】[0059]

【表2】 [Table 2]

【0060】CT861抗体を用いたサンドイッチEL
ISAの測定値と、%CDTの測定値を、表3に陽性及
び陰性の一致率で示す。表3に示すように、%CDTが
陽性の37検体についてはCT861抗体を用いたサン
ドイッチELISAは必ず陽性を示すことが分かる。
Sandwich EL using CT861 antibody
The measured value of ISA and the measured value of% CDT are shown in Table 3 by the concordance rate of positive and negative. As shown in Table 3, it can be seen that the sandwich ELISA using the CT861 antibody always shows positive for the 37 samples with positive% CDT.

【0061】[0061]

【表3】 [Table 3]

【0062】表3の中で、%CDTの測定値をが陰性で
且つCT861抗体を用いたサンドイッチELISAが
陽性を示す18検体についてγ−GTPを測定した結果
を、表4に陽性及び陰性の一致率で示す。表4に示すよ
うに、CT861抗体陽性の18検体についても全て、
γ−GTP陽性のアルコール中毒患者検体であることが
分かる。
In Table 3, γ-GTP was measured for 18 specimens showing a negative% CDT measurement value and a positive sandwich ELISA using the CT861 antibody. Shown as a rate. As shown in Table 4, all 18 specimens positive for CT861 antibody
It can be seen that the sample is a γ-GTP-positive alcoholic patient.

【0063】[0063]

【表4】 [Table 4]

【0064】このように、γ−GTPと%CDTの両方
或いはどちらか一方が陽性の場合、CT861抗体を用
いたサンドイッチELISAは陽性を示し、γ−GTP
と%CDTの両方が陰性の場合、CT861抗体を用い
たサンドイッチELISAは陰性を示す結果が得られた
ことから、CT861抗体がアルコール中毒患者の診断
に有用であることが示された。
Thus, when both or either of γ-GTP and% CDT is positive, the sandwich ELISA using the CT861 antibody shows positive, and γ-GTP
When both CT and% CDT were negative, the sandwich ELISA using the CT861 antibody gave a negative result, indicating that the CT861 antibody is useful for diagnosing alcoholics.

【0065】上記69検体を用いて各測定系についてR
OC曲線を描いた。図7−1は、γ−GTP測定系のR
OC曲線を示す。図7−2は、%CDTの測定系のRO
C曲線を示す。図7−3は、CT861抗体を用いたサ
ンドイッチELISAのROC曲線を示す。γ−GTP
では図7−1の曲線下の面積が0.791、%CDTで
は図7−2の曲線下の面積が0.901であるのに対
し、CT861抗体を用いたサンドイッチELISAで
は図7−3の曲線下の面積が0.998となり、CT8
61抗体を用いたサンドイッチELISAはアルコール
中毒患者の診断に優れた測定系であることが分かる。
Using the above 69 samples, R
An OC curve was drawn. FIG. 7-1 shows R of the γ-GTP measurement system.
The OC curve is shown. Fig. 7-2 shows RO of% CDT measurement system.
The C curve is shown. FIG. 7-3 shows a ROC curve of sandwich ELISA using CT861 antibody. γ-GTP
The area under the curve in FIG. 7-1 is 0.791, and the area under the curve in FIG. 7-2 is 0.901 for% CDT, whereas the sandwich ELISA using the CT861 antibody is shown in FIG. 7-3. The area under the curve is 0.998, CT8
It can be seen that the sandwich ELISA using the 61 antibody is an excellent measurement system for diagnosing alcoholics.

【0066】[0066]

【発明の効果】本発明によれば、トランスフェリンと免
疫グロブリンから成る免疫複合体に対する抗体を提供で
きるので、アルコール中毒患者或いは肝疾患患者を簡単
な手法で、精度よく同定することが可能となる。
EFFECTS OF THE INVENTION According to the present invention, since an antibody against an immune complex composed of transferrin and immunoglobulin can be provided, it is possible to accurately identify an alcoholic patient or a liver disease patient by a simple method.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図1】実施例1で示したサンドイッチELISA法に
より、血清中に存在するトランスフェリンと免疫グロブ
リンから成る免疫複合体の量を、健常者とアルコール性
肝疾患患者の間で比較した結果を示す図である。
FIG. 1 is a diagram showing the results of comparing the amount of an immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin present in serum between a healthy subject and an alcoholic liver disease patient by the sandwich ELISA method shown in Example 1. Is.

【図2】血清中の全トランスフェリン分画をゲルろ過カ
ラムにかけたときの溶出プロファイル(実線OD280
nm)、及びトランスフェリンと免疫グロブリンから成
る免疫複合体の溶出分画(破線OD490nm)を示
す。
FIG. 2: Elution profile when the total transferrin fraction in serum was applied to a gel filtration column (solid line OD280
nm) and the elution fraction of the immune complex consisting of transferrin and immunoglobulin (dashed line OD490 nm).

【図3】実施例5で示したELISA法により、CT8
61がトランスフェリンと免疫グロブリンから成る免疫
複合体に特異性が高いことを示す図である。
FIG. 3 shows CT8 by the ELISA method shown in Example 5.
It is a figure which shows that 61 is highly specific to the immune complex which consists of transferrin and an immunoglobulin.

【図4】実施例6で示した血清をゲルろ過カラムにかけ
たときの溶出プロファイル(実線OD280nm)及び
CT861の反応する分画(破線OD490nm)を示
した図である。
FIG. 4 is a diagram showing an elution profile (solid line OD280 nm) when the serum shown in Example 6 is applied to a gel filtration column and a fraction (represented by broken line OD490 nm) in which CT861 reacts.

【図5】実施例7で示すCT861を用いたサンドイッ
チELISA法が健常者と肝疾患患者を明確に区別する
測定系であることを示した図である。
FIG. 5 is a diagram showing that the sandwich ELISA method using CT861 shown in Example 7 is a measurement system that clearly distinguishes healthy subjects from patients with liver disease.

【図6】実施例8で示す抗ヒトトランスフェリン抗体を
固相化し標識抗体として抗ヒト免疫グロブリンG抗体を
用いたサンドイッチELISAが健常者と肝疾患患者を
明確に区別できる測定系であることを示した図である。
FIG. 6 shows that the sandwich ELISA in which the anti-human transferrin antibody shown in Example 8 is immobilized and the anti-human immunoglobulin G antibody is used as a labeled antibody is a measurement system that can clearly distinguish healthy subjects and liver disease patients. It is a figure.

【図7】図7は、γ−GTP測定系(図7−1)、%C
DTの測定系(図7−2)、CT861抗体を用いたサ
ンドイッチELISA(図7−3)の各ROC曲線を示
す図であり、CT861を用いたサンドイッチELIS
Aがアルコール中毒患者の診断に優れた測定系であるこ
とを示す。
FIG. 7 shows a γ-GTP measurement system (FIG. 7-1),% C.
It is a figure which shows each ROC curve of the DT measurement system (FIG. 7-2) and the sandwich ELISA using CT861 antibody (FIG. 7-3), and the sandwich ELIS using CT861.
It shows that A is an excellent measurement system for diagnosis of alcoholics.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 33/577 C12R 1:91 //(C12N 5/10 C12N 5/00 B C12R 1:91) (C12P 21/08 C12R 1:91) Fターム(参考) 4B064 AG26 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA92X AB05 AC14 BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 CA42 CA43 DA75 DA76 EA50 FA72 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) G01N 33/577 C12R 1:91 // (C12N 5/10 C12N 5/00 B C12R 1:91) (C12P 21/08 C12R 1:91) F term (reference) 4B064 AG26 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA92X AB05 AC14 BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 CA42 CA43 DA75 DA76 EA50 FA72

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 (1)免疫複合体に選択的に反応する抗
体であって、 (2)該免疫複合体はトランスフェリンと免疫グロブリ
ンから成る免疫複合体であり、 (3)該免疫複合体の体液中の量は、アルコール中毒患
者に多く、非アルコール中毒患者に少ないことが有意な
差異で測定されることを特徴とする抗体。
1. An antibody that selectively reacts with an immune complex, (2) the immune complex is an immune complex composed of transferrin and immunoglobulin, and (3) the immune complex. An antibody characterized in that the amount in body fluid is high in alcoholics and low in non-alcoholics with a significant difference.
【請求項2】 前記抗体がモノクローナル抗体である請
求項1記載の抗体。
2. The antibody according to claim 1, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
【請求項3】 前記抗体がポリクローナル抗体である請
求項1記載の抗体。
3. The antibody according to claim 1, wherein the antibody is a polyclonal antibody.
【請求項4】 前記免疫複合体を免疫原として動物に免
疫することにより得られた請求項1乃至3の何れか1項
記載の抗体。
4. The antibody according to any one of claims 1 to 3, which is obtained by immunizing an animal with the immune complex as an immunogen.
【請求項5】 (1)トランスフェリンと免疫グロブリ
ンから成る免疫複合体であって、該免疫複合体の体液中
の量がアルコール中毒患者に多く、非アルコール中毒患
者に少ないことが有意な差異で測定される免疫複合体
を、動物に免疫することにより動物の体内に該免疫複合
体に対して選択的に反応する抗体を産生させ、 (2)該該動物から該抗体を採取することを特徴とする
抗体の製造方法。
5. An immunocomplex composed of (1) transferrin and immunoglobulin, wherein the amount of the immunocomplex in the body fluid is large in alcoholic patients and small in non-alcoholic patients, which is a significant difference. Immunizing an animal with the immune complex to produce an antibody that selectively reacts with the immune complex in the body of the animal, and (2) collecting the antibody from the animal. A method for producing an antibody.
【請求項6】 前記抗体がモノクローナル抗体である請
求項5記載の抗体の製造方法。
6. The method for producing an antibody according to claim 5, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
【請求項7】 前記抗体がポリクローナル抗体である請
求項5記載の抗体の製造方法。
7. The method for producing an antibody according to claim 5, wherein the antibody is a polyclonal antibody.
【請求項8】 請求項2記載のモノクローナル抗体を産
生する能力を有するハイブリドーマ。
8. A hybridoma having the ability to produce the monoclonal antibody of claim 2.
【請求項9】 体液に、請求項1乃至4の何れか1項記
載の抗体を接触させ、該抗体に選択的に反応する免疫複
合体を検出、又は定量化することを特徴とする免疫測定
方法。
9. An immunoassay characterized by contacting a body fluid with the antibody according to any one of claims 1 to 4 and detecting or quantifying an immune complex that selectively reacts with the antibody. Method.
【請求項10】 体液に、トランスフェリン抗体と抗免
疫グロブリン抗体を接触させ、トランスフェリンと免疫
グロブリンから成る免疫複合体を検出、または定量化す
ることを特徴とする免疫測定方法。
10. An immunoassay method comprising contacting a transferrin antibody and an anti-immunoglobulin antibody with a body fluid to detect or quantify an immune complex composed of transferrin and immunoglobulin.
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