JP2002544486A - 細胞分離装置およびその使用法 - Google Patents

細胞分離装置およびその使用法

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JP2002544486A JP2000616423A JP2000616423A JP2002544486A JP 2002544486 A JP2002544486 A JP 2002544486A JP 2000616423 A JP2000616423 A JP 2000616423A JP 2000616423 A JP2000616423 A JP 2000616423A JP 2002544486 A JP2002544486 A JP 2002544486A
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カール ウェイスマン
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Abstract

(57)【要約】 細胞、ウイルス、オルガネラなどの粒子の複雑な混合液からサブセットを分離するための装置および方法を提供するが、ここでこれらの粒子は、接近可能な、通常外側表面上に存在する結合部位を有する。この装置は、切断可能な結合および選択リガンドを含む捕獲システムを管腔表面に結合している毛管(1)または毛細管アレイを備える。捕獲システム(200)は、リガンドを介した粒子の結合、および切断可能なリンカーを介した粒子の放出の両方において、選択性を提供する。各毛管(1)は、ふたつのゾーン(101-104)に直線的に分割することができ、ここで各ゾーン中で、捕獲システムの組成は、特にリガンド特異性について異なる。本発明のひとつの態様において、各ゾーンは、所望の粒子上の様々なポジティブまたはネガティブ選択マーカーに特異的なリガンドを含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 細胞分離は、生物医学および臨床の発展において急激に成長しつつある分野で
ある。複雑な集団から望ましい細胞サブセットを分離する改善された方法は、比
較的均一かつ限定された特徴を有する細胞の研究および使用を可能にしている。
細胞分離は、例えば標的細胞集団に対する薬物または治療の作用を決定するため
の研究;生体経路の研究;形質転換またはそれ以外の修飾された細胞集団の単離
などにおいて広範に使用されている。現在の臨床用途は、特に切除を伴う(ablat
ive)化学療法および放射線療法と組合せた、血液細胞の再構成のための造血幹細
胞の単離を含む。
【0002】 細胞分離は、固相への標的細胞集団の選択的可逆的付着を実現するための、特
異的親和性リガンドによる細胞表面の分子の標的化により達成される。それに続
く段階において、非特異的に吸着された細胞が、洗浄により除去され、その後、
標的細胞が放出される。この特異的親和性リガンドは、抗体、レクチン、受容体
リガンド、またはタンパク質、ホルモン、糖質もしくは生体活性のある他の分子
に結合するその他のリガンドであることができる。
【0003】 臨床用途には、そこで生存力のある特異的細胞集団を大量に粗細胞懸濁液から
もしくは直接血液から迅速に得ることができるような、無菌の閉鎖された装置が
必要である。現在無菌選別のためのいくつかのシステムを使用することができる
。様々な様式のフローサイトメトリーが広く使用されており、かつ高度に精製さ
れた細胞集団を提供することができる。しかしこれには、経費がかかり、熟練し
た操作者を必要とし、かつ大規模化が困難であるという欠点がある。
【0004】 フローサイトメトリーの代用法は、カラムクロマトグラフィーの変種を含み、
ここでカラムは、鉄粒子;粒子上に固定された抗体;固定されたレクチンなどを
含むことができる。例えば磁気粒子に付着された抗体が造血前駆細胞の分離に使
用されており、ここでは抗体が出発細胞集団に結合され、その後、鉄ビーズカラ
ム上で分離されている。
【0005】 標的粒子を試料液から分離するためにカラムで使用する様々な基質が存在する
。一般に、分離を行うために選択された基質の種類により、標的粒子が試料液か
らいかにして分離されるかが決まる。基質は、望ましい粒子が、試料の残余成分
とは異なる基質への結合特性を有するように選択される。細胞分離用カラム型装
置の例は、1993年8月31日に公開された米国特許第5,240,856号に開示されており
、ここでは細胞はカラム内のマトリックスに結合する。ある型式において、カラ
ムは、結合した細胞の除去を促進するために柔軟であるように設計されている(
米国特許第5,695,989号、1997年12月9日公開)。1997年9月30日に公開された米国
特許第5,672,481号は、閉鎖された無菌野における分離用の装置を開示しており
、ここでは単独の容器が収集および濃縮および輸送に使用される。米国特許第5,
763,194号は、その内側表面にリガンドが付着された半透過性中空ファイバーの
アレイで構成された細胞分離装置を開示している。
【0006】 細胞分離の改善された方法は、精製された集団を必要とする多くの医学的およ
び生物学的分野において非常に有益である。バイオテクノロジー、微生物学、臨
床診断および治療、体外受精、血液学および病理学などで使用されるもののよう
な多くの生物学的技術は、例えば細胞サブセット、血小板、細菌、ウイルス粒子
などの標的細胞または粒子の同定、分離、培養、または操作の工程を必要として
いる。
【0007】 関連文献 超常磁性粒子を伴う放出可能なリンカーの使用は、国際公開公報第96/31776号
に開示されている。米国特許第5,849,878号は、化学的および空間的に限定され
た架橋剤(cross-linker)としての2本鎖DNAの使用を開示している。
【0008】 Priestの米国特許第5,391,723号は、オリゴヌクレオチドの複合体を開示して
いる。さらに興味深いのは、AmankwaおよびKuhrの論文、Analytical Chemistry
、64:1610-1613(1992)である。
【0009】 発明の概要 例えば細胞、ウイルス、オルガネラなどの粒子の複雑な混合物からサブセット
を分離するための装置および方法が提供されており、ここでこれらの粒子は、接
近可能な、通常外側表面上に存在する結合部位を有する。この装置は、下記式の
捕獲システムが管腔表面に結合しているような毛細管または毛細管アレイを備え
ている: S-Q-(X)n-CL-(Y)m-L (式中、Sは毛管束の管腔表面であり;Qは表面とXの間の化学結合であり;Xはリ
ンカーまたは親和性試薬であり;CLは切断可能な結合であり;Yはリンカーまた
は親和性試薬であり;並びに、Lは所望の粒子サブセット上に存在する部位に特
異的に結合することが可能である選択リガンドである。独立して、nおよびmは、
1または0であるように選択される)。好ましい切断可能なリンカーは、例えば核
酸配列のような、該粒子の接近可能な表面には普通は存在しない化合物である。
【0010】 各毛管は、ゾーンに直線的に分割することができ、これらの各ゾーンにおいて
、捕獲システムの組成、特にリガンド特異性が変動する。本発明のひとつの態様
において、各ゾーンは、所望の粒子の様々なポジティブまたはネガティブ選択マ
ーカーに特異的なリガンドを含んでいる。
【0011】 標的とされた粒子は、通常剪断応力を最小化するような低い流量で、管束の長
手方向に沿って流れることにより、管腔表面のリガンドと接触させられる。未結
合の粒子は、毛管を通って洗浄される。捕獲リガンドに結合した粒子は、切断試
薬による切断可能なリンカーの切断により、表面から結合が離される。好ましい
切断試薬は、標的粒子の切断反応に対する有害な作用を最小化するような、生理
的条件下で反応性がある酵素である。その後、未結合の粒子が、任意に攪拌また
は他の物理的手段と組合せた、増大した剪断応力を伴う流量により、毛管表面か
ら洗浄される。
【0012】 具体的態様の説明 改善された生物学的粒子の分離装置および分離法が提供される。この分離装置
は、下記式の捕獲システムが管腔表面に結合している毛細管または毛細管のアレ
イを備える: S-Q-(X)n-CL-(Y)m-L (式中、Sは毛管束の管腔表面であり;Qは表面とXの間の化学結合であり;Xは化
学結合したリンカーまたは親和性試薬であり;CLは切断可能な結合であり;Yは
化学結合したリンカーまたは親和性試薬であり;並びに、Lは所望の粒子サブセ
ット上に存在する部位に特異的に結合することが可能であるリガンドである)。
【0013】 複雑な混合物から標的とされた粒子サブセットを分離するために、この混合物
を毛管の管腔と接触させ、重力、毛管流れ、蠕動ポンプなどにより、通常は剪断
応力を最小化するような低い流量で流す。標的粒子は、リガンド部位に結合され
る。結合していない粒子は、毛管を通って流れる。結合した粒子は、切断可能な
リンカーの切断により表面から放出される。その後、標的粒子は、任意に攪拌ま
たは他の物理的手段と組合せた、増大した剪断応力を伴う流量で毛管表面から洗
い流される。選択ゾーンが存在する場合は、放出された細胞は、次に該装置の下
側のゾーンでの選択に利用可能となり、そこでの選択法は、異なる結合特異性に
ついて反復することができる。
【0014】 接近可能な表面上に存在する結合部位を含むいかなる生物学的粒子も、本発明
の方法により分離することができる。この結合部位は、標的粒子を複雑な混合物
中に存在する他の粒子から識別するために使用することができる。この複雑な混
合物は、例えば細胞集団のような類似した粒子;例えば細胞集団中に存在するウ
イルスのような類似していない粒子;例えばコロイド懸濁液のような懸濁液中の
粒子などを含むことができる。特に対象となる粒子は、細胞、オルガネラ、ウイ
ルスなどを含む。特に対象となるのは、神経冠幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞
、間充織幹細胞、中枢神経幹細胞などを含む、幹細胞または前駆細胞のような多
能性細胞を含む、様々なシステムおよび臓器由来の細胞である。
【0015】 定義 本発明は、特定の方法論、プロトコール、細胞株、動物種または属、および記
された試薬に限定されるものではなく、それ自体変更することができることは理
解されなければならない。さらに本明細書において使用される学術語は、単に特
定の態様を説明する目的であり、添付された「特許請求の範囲」によってのみ限
定されるであろう本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理
解されなければならない。
【0016】 本明細書において使用される単数形「1つの(a)」、「および(and)」、およ
び「その(the)」は、文脈が特に明確に指示しない限りは、複数の意味も含んで
いる。従って例えば「1つの細胞(a cell)」の意味は、複数のそのような細胞
を含み、かつ「そのタンパク質(the protein)」の意味は、1種以上のタンパク
質および当業者に公知のそれらの同等物などの意味を含む。本明細書において使
用される全ての技術用語および科学用語は、特に明確に記さない限りは、本発明
が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【0017】 捕獲システム:捕獲システムは、標的粒子の結合および放出の両方における選
択性を提供する結合構造である。捕獲システムは、毛細管の管腔表面に付着され
、一般に毛細管を被覆している。概して、管腔表面の単位面積当たりに捕獲され
る粒子の数は、捕獲されるべき粒子のサイズ、リガンドLのサイズ、Lとその粒子
表面の標的結合部位との親和性、および毛管中の粒子の流量によって決まる。最
適流れ条件、並びに標的受容体に十分な高親和性、一般に少なくとも約10-4M親
和性、通常少なくとも約10-5M、および好ましくは少なくとも約10-6Mの親和性を
有するリガンドを用いると、管腔表面の単位面積当たりに捕獲された粒子数は、
リガンドおよび粒子の相対的なサイズによって左右されるであろう。親和性が低
いリガンドは、近隣のリガンドと組合せて十分な親和力がある場合に、使用する
ことができる。
【0018】 本発明のほとんどの用途において、粒子サイズは、リガンドサイズよりもかな
り大きいと思われる。この一例は、粒子がヒト細胞(平均直径〜10-25μm)であり
、かつリガンドが抗体(平均直径〜100-200Å)である場合である。一般に立体的
干渉、管腔表面と粒子表面の間の複数のリガンド−受容体相互作用、および粒子
懸濁液中の夾雑種が管腔表面へ非特異的結合をするような作用は、管腔表面の単
位面積あたりに実際に捕獲され得る粒子数を、単純な面積計算によって予想され
る最大数の約1〜10%に減少するであろう。
【0019】 捕獲システムは下記の成分を含む: S-Q-(X)n-CL-(Y)m-L 先に定義したように、式中、nおよびmはそれぞれ独立して1または0である。個々
の成分については下記により詳細に定義する。捕獲システムは、接近可能な粒子
表面に存在する部位に特異的に結合するようなリガンドを通じて、および通常の
流れ条件下では安定しているが特異的切断試薬の存在中で切断されるような切断
可能なリンカーを通じての両方で、粒子分離の選択性を提供する。この方法にお
いて、標的粒子は、これら2種が接触させられた場合に、捕獲システムに結合し
、望ましくない粒子、細胞などの洗浄除去が可能になる。次に粒子は、この捕獲
システムを切断試薬と接触することにより、毛管表面から放出される。
【0020】 本発明のひとつの態様において、XもしくはYのいずれか、またはこれら両方が
、親和性試薬として存在し、その結果、選択試薬LおよびCLは「カセット」型で
導入することができる。例えば毛管束は、Qにより;かつ次に、ビオチン、ハプ
テンのような親和性試薬により、その長さに沿って機能化することができる。そ
の後、毛管は貯蔵され、かつ必要に応じて様々な切断可能なリンカーおよび選択
リガンドのために使用される。切断可能なリンカーの「カセット」は、単独でま
たは選択リガンドと組合せて、Xの結合パートナー、例えばアビジン、ストレプ
トアビジン、抗体などに付着される。その後、Xとの接触時に、CLまたはCL-L基
は、毛管壁に結合される。本方法の変法として、CL-L基は、標的粒子に予め結合
することができる。
【0021】 ポジティブ選択:これは、不均一群から特異的粒子集団の直接の選択および回
収を可能にする。これは、標的とされた細胞または他の生物学的粒子の選択的濃
縮および精製を可能にする。
【0022】 ネガティブ選択:これは、不均一集団からの特定の細胞型の除去に関する。ネ
ガティブ選択技術は、特定の成分型を除去することができるが、残りの成分は必
ずしも純粋な集団を提供するわけではない点で限界がある。
【0023】 毛管表面(S):本発明において使用した毛管束は、通常、当技術分野において
公知かつ使用されるものであることができ、長さは約10cm〜10m、直径は少なく
とも約50μmから約500μmを越えない範囲であることができる。毛管壁は、ガラ
ス、溶融シリカ、石英、ポリスチレン、ポリエチレン/ポリプロピレン、ポリカ
ーボネート、ポリメチルメタクリレートなどを含む、軟質または硬質の物質であ
ることができる。
【0024】 結合(Q):これは、管腔毛管表面と、存在する場合は種Xの間の;または、CLへ
の、分子結合である。Qは、分離法の標準の操作条件下で安定であるように選択
されたリンカーであり、これは一般には試料の生物学的完全性を維持するもので
ある。Qは、毛管表面へのおよびCLまたはXへの付着を提供すると思われる。
【0025】 Qを不要とするために、例えばタンパク質などのある種のXは、毛管の管腔表面
に、非共有的形で、受動的に吸着することが可能である。このような方法は当業
者に周知であり、かつX溶液を表面と十分長期間接触する段階、およびその後の
未結合のXを洗浄する段階からなる。この方法による簡略化は魅力的ではあるが
、概して表面コーティングは、長期間の使用で高純度の分離を確実にするには余
りにも不安定であり、かつXの選択は極めて限定的であると思われる。
【0026】 コーティングの安定性を改善し、かつより多数の選択肢を提供するために、管
腔表面は、XまたはCLの付着を促進するようにQで官能基化される。表面の官能基
化の方法は、3-アミノプロピルトリエトキシシラン、3-メルカプトプロピルトリ
メトキシシラン、3-イソチオシアノナトプロピルトリエトキシシラン、3-イソチ
オシアノナトプロピルトリエトキシシラン、2-(4-クロロスルホニルフェニル)エ
チルトリメトキシシラン、3-ブロモプロピルトリメトキシシラン、メタクリルオ
キシメチルトリメチルシランなどによるガラス様表面のシラン化を含む。ガラス
様表面およびプラスチック表面のポリマーコーティングは、ポリビニルアルコー
ル、ポリエチレンイミン、ポリアクロレイン、ポリアクリル酸などにより行うこ
とができる。プラスチック表面の直接の化学的改質は、グラフト重合;ハロメチ
ル化;アミン、アルコールおよびカルボン酸のプラズマ蒸着;ニトロ化とそれに
続く還元;および酸化を含む。
【0027】 カプラー1(X):これは、直接または間接のいずれかでの、切断可能な結合CLの
Qへの付着を可能にするような、任意の成分である。Xが間接的カップリングを提
供する場合、これは2種の結合パートナーを含む親和性試薬であることができる
。適当な結合パートナーの例は、ビオチン/アビジンまたはストレプトアビジン
;抗体/ハプテン;受容体/リガンドなどに加え、化学的親和性システムを含む
【0028】 Xが直接的カップリングを提供する場合、この結合は、一端にはQへの安定した
結合を形成することが可能な基、および反対端には切断可能なリンカーCLへの安
定した結合を形成することが可能な基を有するホモ-またはヘテロ-二官能性リン
カーであることができる。具体的な実体は以下を含む:アジドベンゾイルヒドラ
ジド、N-[4-(p-アジドサリチルアミノ)ブチル]-3'-[2'-ピリジルジチオ]プロピ
オンアミド)、スベリン酸ビス-スルホンスクシンイミジル、アジピン酸ジメチル
(dimethyladipimidate)、酒石酸ジスクシンイミジル、N-γ-マレイミドブチリル
オキシスクシンイミドエステル、N-ヒドロキシスルホスクシンイミジル-4-アジ
ド安息香酸塩、N-スクシンイミジル[4-アジドフェニル]-1,3'-ジチオプロピオン
酸塩、N-スクシンイミジル[4-イオドアセチル]アミノ安息香酸塩、グルタルアル
デヒド、NHS-PEG-MAL;スクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサ
ン-1-カルボン酸塩;3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシン
イミドエステル(SPDP)、または4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カル
ボン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(SMCC)。
【0029】 QのXへのカップリングとしての用途が分かっている化学基は、アミド(アミン
+カルボン酸)、エステル(アルコール+カルボン酸)、チオエーテル(ハロアルカ
ン+スルフヒドリル;マレイミド+スルフヒドリル)、シッフ塩基(アミン+アル
デヒド)、尿素(アミン+イソシアネート)、チオ尿素(アミン+イソチオシアネー
ト)、スルホンアミド(アミン+塩化スルホニル)など、当技術分野において公知
のものである。
【0030】 種Xは、CL のQへの安定した付着を提供する特性を有し、更には捕獲システム
の標的種への良好な提示を提供し、かつ切断処理時にCLの切断試薬への良好な接
近可能性を提供するように選択される。Xは、線状または分枝状であることがで
きるが、通常は線状であるようなアルキルスペーサーを含み、かつ1個以上の不
飽和結合を含むことができ;炭素原子を1〜約12個有する。さらにXは、ヘテロ原
子またはアミン、エーテル、ホスホジエステルなどを含む官能基の存在を有する
この種のスペーサーも含む。対象となる具体的な構造は以下を含む:(CH2CH2O)n 、式中、nは1〜約12である;(CH2CH2NH)n、式中、nは1〜約12である;[(CH2)n(C
=O)NH(CH2)m]z、式中、nおよびmは1〜約6であり、かつzは1〜約10である;[(CH2 )nOPO3(CH2)m]z、式中、nおよびmは1〜約6であり、かつzは1〜約10である。
【0031】 切断可能な結合(CL):この切断可能な結合は、通常、標的粒子に存在せず、か
つ生物学的(例えば酵素的)、化学的、または物理的(例えば温度、イオン強度
、光、pHなど)であることができるような作用因により切断されるような化学リ
ンカーである。1個以上の特異的認識部位が、CL中に存在することができ;好ま
しくは、同じ特異性を有する複数の部位が単独のリンカー中に存在する。任意に
、2個以上のゾーンが捕獲毛管に存在する場合、各ゾーンに異なる切断可能な結
合が存在することができ、ここで特異的認識配列は、他の切断試薬と交差反応を
しない。
【0032】 対象となる結合は、DNA-DNAオリゴヌクレオチドハイブリッド;DNA-RNAオリゴ
ヌクレオチドハイブリッド;RNA-RNAオリゴヌクレオチドハイブリッド;オリゴ
糖;ポリペプチド;DNA-PNAハイブリッド(ここでPNAはペプチド核酸である);DN
A-DNAハイブリッド+マイナー溝(minor groove)結合ポリアミド;DNA-DNAハイブ
リッド+メジャー溝(major groove)結合3本鎖形成オリゴヌクレオチドなどであ
る。
【0033】 特に関心があるのは、特異的ヌクレアーゼにより切断され易いオリゴヌクレオ
チドの使用であり、これは当技術分野において周知であるように制限エンドヌク
レアーゼの認識配列を含む。例えば制限酵素EcoRIは、六量体認識配列GAATTCを
切断し、HindIIIは六量体認識部位AAGCTTを切断する。例えばRNAse Hで切断され
得るDNA-RNAハイブリッド、S1またはミクロコッカスのヌクレアーゼで切断され
る1本鎖DNAまたはRNAなどである。前述のように、捕獲毛管中の異なるゾーンは
、特定の粒子集団の選択的放出を可能にする異なる認識配列を含む。
【0034】 別の対象となる切断可能なリンカーは、例えばα(1→6)グリコシド結合を有す
るデキストランのようなオリゴ糖;β(1→4)グリコシド結合を有するセルロース
;アミロース;ペクチン;キチンなどを含む。切断可能なリンカーとして対象と
なるポリペプチドは、該粒子の接近可能な表面上に頻出しない配列、または通常
存在しない配列を有するものを含む。例えば凝固因子に存在する配列に特異的な
プロテアーゼを使用することができ、これは第Xa因子およびトロンビンを含む。
【0035】 前述のように、下記結合システム: X'-CL-Y-L は、捕獲毛管の製造時に使用することができる結合/特異性カセットを構成する
ことができる。親和性システムを含むカプラーXは、2個の結合対メンバーX'およ
びX''に効果的に分割される。X'は結合対の一方のメンバーであり、かつX''はコ
グネイトの結合対メンバーである。これらのカセットは、下記毛管システムと個
別に合成することができ: S-Q-X'' 選択試薬、すなわちCLおよびLにおいてより大きい柔軟性およびコンビナトリア
ル多様性が提供される。
【0036】 選択リガンドに結合し、これにより毛管表面に切断可能なリガンドを介して結
合された粒子を放出するために、リンカーCLを特異的に切断する切断試薬が添加
されると同時に、標的粒子上に存在する結合部分は実質的に完全なまま残される
。好ましい切断試薬は、標的に対する作用が最小化されるような、生理的条件下
で反応性がある酵素である。粒子表面マーカーへの追加の親和性試薬を結合する
能力、粒子表面受容体を介した薬剤への反応などのように、放出反応後、細胞お
よび/または粒子の生存度が維持される。
【0037】 本発明のひとつの態様において、切断試薬は、毛管表面に結合したカプセル封
入された形状で存在し、かつ圧力または他の手段、好ましくは力学的手段により
放出される。
【0038】 カプラー2(Y):これは、切断可能な結合CLを選択的結合リガンドLに付着する
。一般に先にXについて説明された属性は、同等にYに適用でき、すなわち種Yは
、CLのLへの安定した付着を提供する特性を有し、加えて切断処理時の捕獲シス
テムの標的種への良好な提示を提供し、かつCLの切断試薬への良好な接近可能性
を提供するように選択される。必要な付着は、生体親和性システムを介して達成
することができ、これはビオチン/アビジンまたはストレプトアビジン;抗体/
ハプテン;受容体/リガンド;化学親和性を介して(小分子システム);または直
接の共有結合によるものを含む。YをCLおよびLに付着している粒子は、XのQおよ
びCLに付着するものと同じである。
【0039】 選択リガンド(L):本明細書において使用される「特異的結合メンバー」とい
う用語は、特異的結合対のメンバー、すなわち2個の分子、通常2個の異なる分子
であって、これらの分子の一方が化学的または物理的手段により、他方の分子に
特異的に結合しているものを意味する。特異的結合対の相補的メンバーは、リガ
ンドおよび受容体と称されることがある。汎用される抗原および抗体の特異的結
合対、ペプチド-MHC-抗原複合体およびT 細胞受容体対のほかに、対象となる別
の特異的結合対は、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン;糖質お
よびレクチン;相補的ヌクレオチド配列(DNAハイブリダイゼーションアッセイ法
においてプローブおよび捕獲物質として使用される核酸配列を含む);ペプチド
リガンドおよび受容体;エフェクターおよび受容体分子;ホルモンおよびホルモ
ン結合タンパク質;酵素補因子および酵素;酵素インヒビターおよび酵素などを
含む。これらの特異的結合対は、当初の特異的結合メンバーのアナログ、誘導体
および断片を含むことができる。例えば、タンパク質抗原に対する抗体は、エピ
トープが存在する限りは、ペプチド断片、化学的に合成されたペプチド模倣物、
標識されたタンパク質、誘導されたタンパク質なども認識することができる。
【0040】 免疫学的に特異的な結合対は、抗原および抗原特異性抗体;並びに、T細胞抗
原受容体、およびそれらのコグネイトMHC-ペプチド複合体を含む。抗原として適
しているのは、ハプテン、タンパク質、ペプチド、糖質などである。組換えDNA
法またはペプチド合成を使用し、結合対のいずれかのメンバーのキメラ、短縮型
、または1本鎖アナログを作成することもでき、キメラタンパク質は、それらの
混合物または断片、または抗体もしくは他の特異的結合メンバーの混合物を提供
することがある。抗体およびT細胞受容体は、モノクローナル性またはポリクロ
ーナル性であることができ、かつトランスジェニック動物、免疫感作された動物
、不死化されたヒトまたは動物のB-細胞、抗体またはT細胞受容体をコードして
いるDNAベクターでトランスフェクションされた細胞などであることができる。
抗体調製の詳細およびそれらの特異的結合メンバーとしての使用の適性は、当業
者には周知である。
【0041】 好ましい態様において、選択リガンドは、抗体またはそれに由来した結合断片
である。抗体は、直接的または間接的にYに結合される。抗体が結合/選択性カ
セット内に存在する場合、これは標的粒子にあらかじめ結合されるか、または毛
管表面にあらかじめ結合され得る。
【0042】 特に対象となる抗体は、幹細胞を認識するものである。例えば、ヒト造血幹細
胞は、CD34、thy-1、SCAH-1、およびSCAH-2に特異的抗体を用いてポジティブ選
択するか;または、グリコホリンA、CD3、CD24、CD16、CD14、CD38、CD45RA、CD
36、CD2、CD19、CD56、CD66a、およびCD66bを含む、系列特異マーカー;T細胞特
異マーカー、腫瘍特異マーカーなどを用いてネガティブに選択することができる
。中胚葉幹細胞の分離に有用なマーカーは、FcγRII、FcγRIII、Thy-1、CD44、
VLA-4α、LFA-1β、HSA、ICAM-1、CD45、Aa4.1、Sca-1などを含む。神経堤幹細
胞は、低親和性神経成長因子受容体(LNGFR)に特異的な抗体によりポジティブ選
択するか、またはスルファチド、グリア細胞繊維性酸性タンパク質(GFAP)、ミエ
リンタンパク質P0、ペリフェリンおよびニューロフィラメントのマーカーについ
てネガティブ選択することができる。ヒト間充織幹細胞は、マーカーSH2、SH3お
よびSH4を用いてポジティブに分離することができる。
【0043】 多くのその他の選択リガンドも興味深く、例としてウイルス、原生動物寄生体
、細菌、および他の病原体において認められたマーカー、並びに腫瘍特異抗原が
ある。例えば、特定の抗原-特異的T細胞サブセットは、LがT細胞受容体αβまた
はT細胞受容体γδ分子の特定の範囲のコグネイトMHC-ペプチドである場合に、
単離することができる。
【0044】 捕獲毛管:本明細書において使用される場合、これは、前述のような管腔表面
上に捕獲システムが被覆された毛管束を包含することが意図されている。毛管は
、明確に入口端、出口端、並びに入口端および出口端の中間に位置した管腔表面
、並びに管束の内部を意味している。操作の際には、試料液体が、毛管の入口端
から提供され、かつ重力流れ、圧力、または吸引によりカラムを通って移動する
。液体がカラムを通過する際に、該捕獲システムは、液体組成物から標的粒子を
分離する。典型的には、毛管は円形の断面外形を有するが、他の外形、例えば楕
円形なども使用することができる。捕獲システム10を伴う内側表面を有する基本
的捕獲毛管1を図1Bに示す。本発明のひとつの態様において、図1Bに示したよう
に、捕獲毛管1は、複数のゾーンに分割されている。
【0045】 これらのゾーンは、一体化した毛管を分割するか、または各ゾーンが個々の毛
管上に存在し、次にこれらが任意の常法において端と端で接合されている。各ゾ
ーンは、切断可能なリガンドの中、選択リガンドの中、またはこれら両方の中の
いずれかに異なるように、様々な選択試薬を含む。複数のゾーンが存在する場合
、これらのゾーンは、ポジティブまたはネガティブ選択のいずれかを提供する。
例えば、集団からの稀種の分離においては、ポジティブ選択マーカーの第一ゾー
ンおよびネガティブ選択マーカーの第二ゾーンを有することが望ましいと考えら
れる。あるいは、第一および第二のゾーンは、異なるポジティブ選択マーカーを
含むことができる。
【0046】 ゾーンがネガティブ選択マーカーを含む場合、標的粒子はネガティブ選択マー
カーとは結合されないことから、これは切断可能なマーカーを伴う捕獲システム
を含む必要はない。ネガティブ選択ゾーンは、下記式の種類の分離システムを含
むことができる: S-Q-(X)n-L (式中、これらの成分は先に説明されたものである)。
【0047】 捕獲装置:本明細書において使用される捕獲装置という用語は、前述のような
捕獲毛管アレイ、更には分離を実行するために必要とされるフィルター、バッフ
ル、収集容器などを備えるものを意味することが意図されている。典型的アレイ
100を図2Aに示す。アレイは、約10〜約105個の毛管、より一般的には約102〜約1
04個の毛管を備えることができる。この数は、主に処理されるべき粒子の数およ
び試料容量により決まるであろう。このアレイは、操作者にとって都合がよい断
面外形に配置することができる。典型的には毛管間の「デッドスペース」が最小
化されるであろう。いくつかの態様において、デッドスペースは、毛管への試料
の移動を促進するために、捕獲装置の入口でふさがれている。
【0048】 図2Bに示したように、装置の注入口および排出口で、このアレイは、毛管束を
通じての最適な均一な分布および流れを確実にする供給機構25に連結されている
。任意に、粒子の集塊が毛管に侵入することを防ぐためにフィルター20を備える
こともできる。分離されるべき試料15が、供給機構に供給される。該装置の排出
口には、供給機構30が、装置を望ましい粒子集団の収集容器35に連結するために
備えられている。
【0049】 粒子が培養または臨床用途のための細胞集団である場合、装置の構成のために
選択される材料は、滅菌手法との適合性もあると考えられる。試料15および収集
容器35は、無菌環境を提供する閉鎖された容器であってもよい。
【0050】 本発明のひとつの態様において、毛管アレイ100は、図3に示されるように、ラ
セン形に巻きつけられている。この形状は、比較的長い毛管束のセットにとって
より都合の良い形状を提供する。
【0051】 捕獲器具:本発明のひとつの態様において、前述のように、液体制御システム
が、捕獲装置と併用されるように備えられている。液体制御システムは、該装置
から収集容器への液体流れをモニタリングするカラムセンサーを含む。液体制御
システムはさらに、液体が該装置から出て収集容器に入ることを選択的に可能に
するために、バルブ制御シグナルに応答する装置バルブも備えている。液体制御
システムの操作を制御するためにデータ処理手段が備えられている。データ処理
装置は、装置シグナルに応答し、収集される標的粒子の濃度を最適化するための
バルブ制御シグナルを提供する。
【0052】 液体制御システムはさらに、装置内の液体の圧力を測定するために、該装置に
連結された圧力センサーを備えることができる。圧力センサーは、圧力シグナル
のデータ処理装置への連動(coupling)のためのコネクターを備えることができる
。液体管内の液体流れの速度および方向を制御するために、ポンプ制御シグナル
に応答するポンプが備えてもよい。このデータ処理装置は、圧力シグナルに応答
し、カラム内の液体の圧力を増減するようにポンプ制御シグナルを提供する。
【0053】 この捕獲器具はさらに、毛管内に滞留した粒子の放出を補助するための捕獲装
置の内容物を攪拌するための攪拌用アセンブリを備える。この攪拌用アセンブリ
は、標的細胞の放出速度を変動するために、装置の内容物の攪拌量を変動するよ
う起動シグナルに応答することができる。
【0054】 複雑な混合物からの粒子の分離 本発明の分離システムを用いて、任意の所望の標的物質を単離することができ
る。特に関心があるのは複雑な混合物からの特定の成分の分離である。本発明の
分離システムは、一度にほとんどあらゆる標的物質を分離し、特異的結合メンバ
ーが入手できるという大きい融通性を有する。標的物質または分析物は、特異的
結合対のメンバーのいずれかであるか、または特異的結合対のメンバーに会合し
た物質であることができる。実施例のように、細胞表面抗原−抗体結合対を使用
して、抗原それ自身、該抗原を発現している細胞、該抗原のプロセシングに関連
した特定のオルガネラなどを単離することができる。本発明の装置および方法は
、免疫アッセイ法などのような、受容体およびリガンドの結合に関連した診断技
術に有利に適用することもできる。
【0055】 簡略化のために、この分離システムは主に、末梢血、骨髄、臍帯もしくは胎盤
由来の血液、胎児血液、または白血球除去製品のような混合された細胞集団から
細胞の規定された集団(標的細胞)を特異的に選択および分離するその能力につい
て説明されるであろう。さらに組織を単細胞または単分散懸濁液へと破壊し、特
定の細胞サブセットを単離することを可能にする、例えば腫瘍塊からの腫瘍浸潤
リンパ球の分離、膵組織からの島細胞の分離などができることも理解されるであ
ろう。例えば様々な細胞種を、細胞パージおよび/または細胞濃縮を可能にする
ために、特異的抗体で標識することができる。標的細胞集団は一般に、前述のよ
うな、標的細胞に存在する細胞表面抗原に選択的に結合するような、特異的結合
メンバーにより同定される。しかし、対象となる装置および方法はこのような用
途に限定されないと理解されるべきである。
【0056】 標的粒子を得るための試料液体の成分部分の予備分離のための様々な方法およ
び装置が存在する。これらの方法は、フィルター、遠心分離、クロマトグラフィ
ー、および他の周知の液体分離法を含む。これらの方法は、カラム、遠心分離、
フィルターを用いるおおまかな分離、望ましくない細胞の殺傷による分離、蛍光
活性化したセルソーターによる分離、パンニング法のような物理的支持体上に固
定されたリガンドへ直接的または間接的に結合している細胞による分離、カラム
免疫吸着による分離、および磁気免疫ビーズを用いる分離を含む。
【0057】 予備選択法の後、この細胞試料を、X'-CL-Y-L型の1種以上のポジティブ選択性
カセットに予備結合することができる。このような試薬の細胞への結合法は当技
術分野において周知である。該試薬が結合反応における限定要因とならないよう
に、十分量の選択性カセットを添加する。結合に約5〜30分を要する。過剰な選
択性カセットは、細胞から洗い流される。集団がこの方法で予備結合されたなら
ば、この捕獲装置は、捕獲システムS-Q-X''を含み、ここでX'およびX''は結合対
のコグネイトメンバーである。
【0058】 あるいは、試料は、捕獲装置に予備結合されるが、これに直接は適用されず、
この場合の捕獲装置は、完全な捕獲システムS-Q-(X)n-CL-(Y)m-Lを含む。
【0059】 この細胞集団は、剪断力は最小化するが細胞の捕獲表面への接触を最大化する
ような流れ条件下、液体中で該捕獲装置に適用される。この液体はいずれか許容
できる緩衝液システムであってよい。標的粒子が細胞であるならば、この液体は
、細胞の生理的完全性を維持するように、好ましくは細胞の生存度を最大化する
ように選択される。
【0060】 一旦標的化された細胞が捕獲装置に結合されかつ望ましくない細胞が洗い流さ
れると、捕獲装置に切断試薬が添加される。この試薬は典型的には適当な媒質中
で該装置を通って流される。切断試薬の濃度は、切断リンカーの全て、一般には
少なくとも約90%、より一般には少なくとも約95%、および好ましくは少なくと
も約99%を切断するのに十分であろう。放出の条件は、温度、pH、金属補因子、
還元剤等の存在について、このような条件を変更しかつ細胞放出に対する量的作
用を決定することにより、経験的に最適化することができる。この放出は、一般
には少なくとも約15分、より一般には少なくとも約10分で完了し、かつ通常約30
分より長いことはない。
【0061】 切断工程が完了すると、細胞が毛管壁から放出される。細胞の通過は、ゾーン
を通じて制御される。例えば、細胞流れは第一ゾーンに進められ、その時点で流
れが停止され、選択リンカーへ結合され、切断などへと進められる。一旦選択工
程が完了すると、この流れは第二ゾーンへと進められ、そこでさらに選択が行わ
れる。
【0062】 前述の捕獲装置が複数のゾーンを有するならば、細胞は最初のゾーンから放出
された後に低いゾーンと接触されるであろう。接触、結合および洗浄の工程が、
第一のゾーンについて先に説明されたように行われる。好ましくは第二のポジテ
ィブ選択マーカーは、異なる切断特異性を有し、かつ結合した細胞は第二のリン
カーの切断後に放出されるであろう。第二またはそれ以降のゾーンがネガティブ
選択マーカーを有する場合には、標的細胞はそこを通って流れ、そこには切断試
薬は必要ではない。
【0063】 細胞が放出される媒質は、細胞の生存度を維持し、かつ放出試薬の活性をもた
らすような任意の媒質であると考えられる。適当な媒質は、0.1〜0.5%BSAを含
有するリン酸緩衝生理食塩水、ダルベッコの改良イーグル培地(dMEM)、ハンクス
基本塩溶液(HBSS)、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(dPBS)、RPMI、Iscove培
地、5mM EDTAを含むPBSなどであり、ウシ胎仔血清、BSA、HSAなどが補充される
ことが多い。
【0064】 複雑な混合物からの特異的細胞種の精製時に、この放出法が有用であり、ここ
でその手順は複数の分離工程を含む。この手順は、様々な濃縮工程および枯渇工
程の組合せを使用することができ、一般には濃縮から開始する。単独のマーカー
について高度の精製を実行するために、例えば2種の異なる抗CD34抗体のような
、マーカーの2種の異なるエピトープに特異的な抗体を使用する、ふたつの連続
する濃縮工程を行うことができる。ふたつの連続するポジティブ選択を、例えば
CD34、thy-1、CD71、トランスフェリン受容体、HB-F胎児細胞選択、造血系マー
カーの混合液(例えばCD4/CD8/CD19の組合せなど)、サイトカイン受容体、CD45
RA/ROなどの、2種以上の分離を組合せて異なるマーカーについて行うことができ
る。複雑な混合物から少量の細胞集団を選別する場合には、操作される細胞の数
を減少するために、濃縮を最初に行うことが望ましいことが多い。例えば造血前
駆細胞の選択時のCD34ポジティブ細胞の濃縮、または母体血液中の胎児細胞につ
いての選択時のCD71ポジティブ細胞の濃縮が、有用な第一工程である。その後、
この濃縮に、枯渇工程、および任意に別のポジティブ選択が続く。選択工程の数
は必要に応じて増やすことができる。
【0065】 多くの場合分析は、分離手順に従い当初のおよび分離された集団のアリコート
について行われる。例えばフィコエリトリン、FITC、ローダミン、テキサスレッ
ド、アロフィコシアニンなどのような蛍光色素で抗体を標識することが有用であ
ることがある。蛍光色素標識は、分離工程の後に細胞組成物を微視的またはフロ
ーサイトメトリーによりモニタリングするために使用することができる。蛍光標
識は、粒子と同様に間接的結合システムを都合よく使用することができる。
【0066】 研究および臨床検査における必要性に対処するために、本発明を実施するため
に必要な試薬および装置を備えるキットを提供することができる。このようなキ
ットは、任意に選択性カセットと組合せて、適当なコーティングを有する捕獲装
置を含むであろう。様々な切断可能なリンカーのための切断試薬も含むことがで
きる。提供される他の成分は、予備的分離試薬、器具構成部品、酵素消化のため
の緩衝液などであることができる。単独のアレイを利用する一方で、複数のアレ
イを同時に試行することができ、かつ自動または手動による手順のための装置が
このような目的のために任意に提供されることは予測される。
【0067】 下記実施例は、当業者に、いかにして本発明を作成しかつ使用するかについて
完全な公開および説明を提供するために記しているが、本発明とみなされる範囲
を限定することは意図してはいない。使用した数値(例えば、量、温度、濃度な
ど)に関して精度を確実にするために労作がなされているが、若干の実験誤差お
よび偏差は仕方がない。特に記さない限りは、部は質量部であり、分子量は平均
分子量であり、温度は摂氏であり;かつ圧力は大気圧またはその近傍である。
【0068】 本明細書に言及された全て出版物は、例えば本明細書に記した発明と結びつけ
て使用することができるような出版物に記された化合物および方法を説明および
開示の目的で本明細書に参照として組入れられている。前掲および本文を通じて
記載された出版物は、本明細書の出願日以前に明らかにされたもののみが提供さ
れている。本発明者らは先行する発明により明らかにされた日付に先立ち権利を
与えられていないような承認は記載していない。
【0069】 実施例実施例1 ヒト造血幹細胞および乳がん特異性T細胞の単離 ヒト造血幹細胞(HSC)および乳癌特異性T細胞を、単独の方法で患者試料から連
続して単離する。毛管ゾーンを含む分離装置の例を図4に示す。
【0070】 容易にHSCを単離するために、ドナーを収集前に可動化試薬で処理する。PBMC
を、Ficoll-Paque(Pharmacia社、ウプスラ、スウェーデン)上での遠心により、
白血球が豊富な白血球層(buffy coat)から得る。遠心後、間期細胞を収集し、緩
衝液中に再懸濁し、かつ300 x gで沈降し、その後再度緩衝液中に再懸濁し、か
つ200 x gで遠心し、血小板を除去する。
【0071】 予備-分離を、ネガティブ選択バッグ100中で行う。このバッグは、高性能のネ
ガティブ選択のための細かいメッシュを備えている。モノクローナル抗体をメッ
シュに結合する。選択に使用した抗体は、B 細胞、赤血球、マクロファージ、単
球、乳房上皮細胞、血小板、またはT細胞上には存在しない他の系列のマーカー
と特異的に反応する。これらの細胞は、少なくとも1時間はバッグ内でインキュ
ベーションする。
【0072】 その後、未結合の細胞を、制御された流れによりゾーン1(101)に移動させる。
ゾーン1は、切断可能なリンカーがEcoRIの認識配列の複数の反復(multiple repe
at)を含む2本鎖DNAオリゴマーであるような毛管アレイを備えている。選択リガ
ンドLは、ペプチド抗原her2/neuとのHLA-A型の主要組織適合性遺伝子複合体タン
パク質である。このゾーンは、her2/neu表面抗原を生じる乳癌細胞に特異性のあ
るT細胞と結合する。これらの細胞を、およそ30分間、ゾーン1区間でインキュベ
ーションする。
【0073】 その後、未結合の細胞は、制御された流れによりゾーン2(102)へと移動させる
。ゾーン2は、切断可能なリンカーがHpa IIの認識配列の複数の反復を含む2本鎖
DNAオリゴマーであるような毛管アレイを備えている。選択リガンドLは、CD34に
特異的なモノクローナル抗体である。このゾーンは、CD34表面抗原を生じる造血
前駆細胞と結合する。これらの細胞を、およそ30分間、ゾーン2区間でインキュ
ベーションする。
【0074】 インキュベーション後、細胞を完全に洗い流し、毛管アレイ全体の未結合の細
胞を放出する。その後系列ネガティブ、CD34ポジティブ細胞を放出するために、
ゾーン2の放出試薬を適用する。これらの細胞は、ゾーン2の細胞をHpa II制限酵
素と約1時間のインキュベーションすることにより放出される。
【0075】 放出された細胞は、ゾーン2から洗い出され、かつ制御された流れによりゾー
ン3(103)へと移動する。ゾーン3は、切断可能なリンカーがMsc Iの認識配列の複
数の反復を含む2本鎖DNAオリゴマーであるような毛管アレイを備えている。選択
リガンドLは、Thy-1に特異的なモノクローナル抗体である。このゾーンは、Thy-
1表面抗原を生じる造血前駆細胞と結合する。これらの細胞を、およそ30分間、
ゾーン3区間でインキュベーションする。
【0076】 インキュベーション後、細胞を完全に洗い流し、毛管アレイ全体の未結合の細
胞を放出する。その後、系列ネガティブ、CD34ポジティブ、Thy-1ポジティブ細
胞を放出するために、ゾーン3の放出試薬を適用する。これらの細胞は、ゾーン3
の細胞をMscI制限酵素と約1時間インキュベーションすることにより放出される
【0077】 放出された細胞は、ゾーン3から洗い出され、かつ制御された流れによりゾー
ン4(104)へと移動する。ゾーン4は、高性能ネガティブ選択バッグ中に存在する
ものと同じ系列マーカーパネルを有するネガティブ選択アレイである。細胞を、
ゾーン4区間において、およそ30分間インキュベーションする。未結合の細胞は
完全に洗い出され、かつ収集される。この画分は造血幹細胞を含み、これは、通
常、切除的な化学療法または放射線療法の後に、患者の造血機能の再構成に使用
する。
【0078】 HSCを収集した後、T細胞をEcoRIであるゾーン1の放出試薬と共にインキュベー
ションすることにより放出する。これらの細胞は、放出試薬中で約1時間インキ
ュベーションし、その後ゾーン4に流す。ゾーン4において、細胞は、約30分間イ
ンキュベーションされることにより、第二のネガティブ選択工程を受ける。未結
合の細胞は洗い出され、かつ収集される。この画分は、乳癌細胞を認識するT細
胞を示し、かつ免疫療法に使用される。
【0079】 更なる細胞の分析のために、純度を決定することを目的として、これらをフロ
ーサイトメトリーで評価する。ヨウ化プロピジウム1μl(1mg/ml)を試料に添加し
、かつ細胞を、FACScan フローサイトメーター(Becton Dickinson社)で分析した
。デブリおよび死滅細胞は通門(gating)により排除した。
【0080】実施例2 溶融シリカ毛管表面のアミノ化 10本の溶融シリカ毛管(内径250μm、外径350μm、長さ1m;Polymicro Technol
ogies社)を各々、16-ゲージ針を用いて、ゴム製隔壁(24/40標準先細ジョイント
サイズ;Aldrich Chemical社)に突き通す。毛管は、隔壁の底からおよそ3インチ
突き出るように調節する。次に毛管を伴う隔壁を、24/40直線状真空アダプター(
ChemGlass社)の上側ジョイントに嵌合する。次にこのアセンブリを、1Lの24/40
丸底フラスコに装着し、かつ真空アダプターに減圧装置を装着する。毛管の自由
端は、0.1M水酸化ナトリウム水溶液100mlが入った100ml目盛り付きシリンダー中
に入れる。この溶液を、減圧下で毛管を通して吸引する。その後、毛管を、同じ
手法を用いて、蒸留した脱イオン水100mlで洗浄する。最後に毛管を、減圧下30
分間乾燥窒素を吸引し乾燥する。
【0081】 試薬等級のアセトンを溶媒とする2.5%(v/v)2-アミノプロピルトリエトキシシ
ラン(Acros社)溶液100mlを、125mlの三角フラスコ中で調製する。このフラスコ
を、毛管−隔壁−アダプターアセンブリの上側約30cmに配置する。乾燥した毛管
の自由端を該溶液中に入れ、かつこのシステムを短時間減圧することで流れを開
始する。一旦毛管全体に流れが認められたならば、減圧を止め、溶液を重力流れ
下で毛管を通じて30分間還流させる。この間に、溶液およそ70mlが毛管を通じて
流れる。毛管の自由端をフラスコから取り外し、かつ乾燥空気を15分間それを通
して吸引する。毛管を隔壁から取り外し、かつ95℃の炉中に一晩置き、硬化させ
る。
【0082】実施例3 アミノ化した溶融シリカ毛管表面のビオチン化 実施例2の10本のアミノ化した溶融シリカ毛管を各々、16-ゲージ針を用いて、
ゴム製隔壁(24/40標準先細ジョイントサイズ)に突き通す。毛管は、隔壁の底か
らおよそ3インチ(7.6cm)突き出るように調節する。次に毛管を伴う隔壁を、24/4
0直線状真空アダプター(ChemGlass社)の上側ジョイントに嵌合する。次にこのア
センブリを、500mlの24/40丸底フラスコに装着し、かつ真空アダプターに減圧装
置を装着する。
【0083】 無水N-メチルピロリジノン:N,N-ジイソプロピルエチルアミン(Aldrich Chemi
cal社)9:1溶液10mlを溶媒とするビオチン-X-NHS(Molecular Probes社)100mgの溶
液を調製する。この溶液を、15mlのプラスチック製コニカル遠心チューブに入れ
、これを毛管−隔壁−アダプターアセンブリの上側約30cmに配置する。アミノ化
した毛管の自由端を該溶液中に入れ、かつこのシステムを短時間減圧することで
流れを開始する。一旦毛管全体に流れが認められたならば、減圧を止め、溶液を
重力流れ下で毛管を通じて全ての溶液が毛管を通って流れるまで還流させる。そ
の後毛管を、減圧下で、N-メチルピロリジノン10ml、変性エタノール10ml、水10
mlにより、順次洗浄する。毛管の自由端をチューブから取り外し、かつ乾燥空気
を15分間それを通して吸引する。ビオチン化した毛管を隔壁から取り外し、かつ
必要時まで4℃でプラスチックバック中に入れて保存する。
【0084】実施例4 ビオチン化した毛管表面へのストレプトアビジン結合試験 実施例3のビオチン化した毛管を、シリンジポンプ(KD Scientific社、モデル1
00)に保持された30mlのプラスチック製シリンジ(Becton Dickinson社)に装着す
る。毛管のシリンジのルーアー端への嵌合を、メス型ルーアーとオス型フィンガ
ータイト(Fingertight)管継手アダプター(Upchurch Scientific社)の取付け、
およびそれへのメス型フィンガータイト管継手とマイクロタイト(Microtight)
管継手アダプター(Upchurch Scientific社)の連結により行う。その後毛管をマ
イクロタイト管継手と接続する。
【0085】 この毛管を、10mlのPBS緩衝液(0.1Mリン酸ナトリウム、0.15M塩化ナトリウム
、pH7.2)で、シリンジポンプを用いて緩衝液を20ml/時で送り、洗浄する。30ml
シリンジを、PBS中にウシ血清アルブミン(BSA;Sigma社)の10 mg/ml溶液を1ml含
む1mlプラスチック製シリンジ(Becton Dickinson社)と交換する。毛管をこの溶
液で、シリンジポンプを用いて、2ml/時で溶液が送達されるように還流する。こ
のBSA処理を用いて、引き続きの操作における生物学的物質(例えば抗体、核酸、
細胞)の毛管表面への非特異的結合を最小化する。
【0086】 アルカリホスファターゼ基質溶液を、2 x DEA緩衝液(2Mジエタノールアミン、
2mM MgCl2、0.2mM ZnCl2)15mlおよびp-ニトロフェニルリン酸(PNPP)錠(Sigma社)
1個を溶解した水15mlを用いて作成する。
【0087】対照実験 : BSAでブロックした毛管を、シリンジポンプを用いて、PBS 10mlで洗浄し、緩
衝液を20ml/時で送達する。BSA 1mg/mlを含有するPBSの1.0mlを溶媒とするアル
カリホスファターゼ0.5mg溶液を調製し、かつ毛管を通して0.5ml/時で還流する
。毛管を、PBSのアリコート30mlで2回、30ml/時で洗浄する。最後に、前記PNPP
溶液0.5mlを、毛管を通して10ml/時でポンプ注入する。毛管の自由端に存在する
溶液は、非常に淡い黄色であり、このことはビオチン化された毛管表面への非特
異的アルカリホスファターゼ結合がほとんどないことを示している。
【0088】結合実験 : 対照実験に使用したものと同じ毛管を、PBS 60mlを用い、30ml/時で洗浄する
。PBS 1.0mlを溶媒とするストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ複合体(S
igma社)の1mg溶液を調製し、かつ毛管に0.5ml/時で還流する。毛管をPBSのアリ
コート30mlで2回、30ml/時で洗浄する。最後に、前記PNPP溶液0.5mlを、毛管を
通して10ml/時でポンプ注入する。毛管の自由端に存在する溶液は、明るい黄色
であり、このことは特異的ストレプトアビジン-ビオチン相互作用による、ビオ
チン化された毛管表面への顕著なアルカリホスファターゼの結合を示している。
【0089】実施例5 ストレプトアビジンで被覆した毛管の調製 実施例3のビオチン化した毛管を、シリンジポンプ(KD Scientific社、モデル1
00)に保持されたプラスチック製シリンジ30ml(Becton Dickinson社)に装着する
。毛管のシリンジのルーアー端への嵌合を、メス型ルーアーとオス型フィンガー
タイト管継手アダプター(Upchurch Scientific社)の取付け、およびそれへのメ
ス型フィンガータイト管継手とマイクロタイト管継手アダプター(Upchurch Scie
ntific社)の連結により行う。その後、毛管をマイクロタイト管継手と接続する
【0090】 この毛管を、10mlのPBS緩衝液(0.1Mリン酸ナトリウム、0.15M塩化ナトリウム
、pH7.2)で、シリンジポンプを用いて緩衝液を20ml/時で送り、洗浄する。30ml
シリンジを、PBS中にウシ血清アルブミン(BSA;Sigma社)の10 mg/ml溶液を1ml含
む1mlプラスチック製シリンジ(Becton Dickinson社)と交換する。毛管をこの溶
液で、シリンジポンプを用いて、2ml/時で溶液が送達されるように還流する。こ
のBSA処理を用いて、引き続きの操作における生物学的物質(例えば抗体、核酸、
細胞)の毛管表面への非特異的結合を最小化する。
【0091】 1mlシリンジを、30mlシリンジと交換し、かつBSAでブロックした毛管を、PBS
緩衝液30mlで、シリンジポンプを用いて緩衝液を30ml/時で送り、洗浄する。30m
lシリンジを、PBS中のストレプトアビジン2.5mg/ml(Sigma社)およびBSA 1mg/ml
の溶液を1ml含む1mlシリンジと交換する。毛管をこの溶液で、0.5ml/時の速度で
還流する。最後に1mlシリンジを、30mlシリンジと交換し、かつ毛管を、30mlのP
BSで、速度20ml/時で洗浄する。
【0092】 ストレプトアビジンで被覆した毛管は、少量の水が入ったプラスチックバッグ
中で4℃で保存する。
【0093】実施例6 オリゴヌクレオチドの調製 この実施例においては、単独のEcoRI制限酵素の切断部位(太字で示す)を有す
る下記の2種の相補的オリゴデオキシリボヌクレオチド配列を使用する: 4種の1μmoleのEcoRI合成を、標準的なDNA合成技術を用いて行う(PE Biosystems
社、モデル394自動DNAシンセサイザー、製造業者の合成サイクルで使用;試薬は
Glen Research社から入手)。これらの配列を、トリチル-オン(Trityl On)、手
動切断モードで調製する。その後、これらのオリゴヌクレオチドを、DNAシンセ
サイザー上で、市販のホスホロアミダイト試薬(Glen Research社)を用いて、最
初にヘキサエチレングリコールスペーサーで、次にビオチンで、5'末端標識する
。合成サイクルを変更し、これらの非ヌクレオチド性ホスホロアミダイトについ
て10分間のカップリング時間をもたらす。最終配列は、トリチル-オン、自動切
断モードで調製し、かつ一晩60℃で脱保護する。その後、粗トリチル化されたオ
リゴヌクレオチドを、Speed Vac(Savant Instruments社)において、冷却した脱
保護溶液を約0.5mlへ濃縮することにより得る。
【0094】 粗オリゴヌクレオチドを、Inertsil C4 5μm HPLCカラム、4.6mm x 150 mm (M
etaChem Technologies社)上における、FoxyII画分コレクター(Isco社)に連結さ
れた1050Ti HPLCシステム(Agilent/Hewlett Packard社)を用いる、逆相HPLCによ
り2回精製する。この精製は、0.1Mトリエチル酢酸アンモニウム中のアセトニト
リルの直線勾配を用いて行う(pH6.5)。流量は1.0ml/分である。溶離液を280nmで
モニタリングする。最初の精製は、粗生成物溶液の100μlアリコートについて行
う。最初のHPLC精製に続けて、精製されたトリチル化されたオリゴヌクレオチド
を含有する画分を、Speed Vacで蒸発乾固する。乾燥したペレットを、1mlの80:2
0(v/v)酢酸:水で、室温で60分間処理し、トリチル基を除去し、その後Speed Va
cにおいて蒸発乾固する。乾燥したオリゴヌクレオチドを、水0.5mlに溶解し、再
度250μlアリコートでHPLC精製する。最後に純粋なオリゴヌクレオチドを含有す
る画分を、Speed Vacで蒸発乾固し、水に溶解し総容量1mlとし、かつ凍結保存す
る。ストック用オリゴヌクレオチド溶液の濃度は、ストック液5μlを水1mlに希
釈し、この溶液の吸光度を260nmで測定し、かつBeer法を用いて濃度を計算する
ことにより決定する(A =εbc、ε=36 x 104M-1cm-1、b=1cm、および希釈因子200
)。
【0095】 4種の1μmoleのEcoRICの合成は、前段で記した標準的なDNA合成技術を使って
行う。オリゴヌクレオチドは、トリチル-オン、手動切断モードで調製する。そ
の後2種の1μmole合成は、DNAシンセサイザー上で、市販のホスホロアミダイト
試薬(Glen Research社)を用いて、最初にトリエチレングリコールスペーサーで
、次に5-アミノ-3-オキソ-1-ペンタノールで、5'末端を標識する。残りの2種の1
μmole合成は、市販のホスホロアミダイト試薬(Glen Research社)を用いて、フ
ルオレセインで、5'末端を標識する。蛍光標識したオリゴヌクレオチドはトリチ
ル基を有さないので、HPLC走行間に脱トリチル化を必要としないこと以外は、こ
れらのオリゴヌクレオチドを、前段のように脱保護しかつ精製する。精製オリゴ
ヌクレオチドを凍結保存する。ストック用オリゴヌクレオチド溶液の濃度は、ス
トック液5μlを水1mlに希釈し、この溶液の吸光度を260nmで測定し、かつBeer法
を用いて濃度を計算することにより決定する(A =εbc、ε=36 x 104M-1cm-1、b=
1cm、および希釈因子200)。
【0096】実施例7 ビオチン化したオリゴヌクレオチドとストレプトアビジンで被覆した毛管との結 合試験 実施例4のストレプトアビジンで被覆した毛管を、PBS(0.1Mリン酸ナトリウム
、0.15M塩化ナトリウム、pH7.2)30mlで、シリンジポンプを用い、緩衝液を30ml/
時で送達し、洗浄する。
【0097】 PBS 20ml中のストック用オリゴヌクレオチドビオチン−EcoRIの20μlの溶液(
〜5.8nmole)を調製する。この溶液10mlを、前述の毛管を通じて、2ml/時で還流
する。1ml画分を、微量遠心チューブ1.5ml中に収集する。これらの画分を、UV吸
光度を260nmで測定することによりアッセイする。毛管を通って通過する際に溶
液から取り除かれたビオチン化されたオリゴヌクレオチドの量を、Beer法を用い
て計算する(実施例6を参照のこと)。オリゴヌクレオチドのほとんどは画分1にお
いて除去される。結合したオリゴヌクレオチドの総量は、毛管1m当たり〜20pmol
eであると計算される。
【0098】実施例8 オリゴヌクレオチドで被覆した毛管への相補的オリゴヌクレオチドの結合試験 実施例7のビオチン化したオリグヌクレオチドで被覆した毛管を、PBS(0.1Mリ
ン酸ナトリウム、0.15M塩化ナトリウム、pH7.2)30mlで、シリンジポンプを用い
て、緩衝液を30ml/時で送達し、洗浄する。その後、毛管を、シリンジポンプか
ら取り外し、2個の同等の小片に切断する。一方の半分は、少量の水と共に4℃で
プラスチックバッグ中に保存する。他方の半分はシリンジポンプに再度結合する
【0099】 PBS 40ml中のストック用オリゴヌクレオチドフルオレセイン−EcoRICの1μlの
溶液(〜375pmole)を調製する。この溶液10mlを、前述の毛管を通して、4ml/時で
還流する。1ml画分を、微量遠心チューブ1.5ml中に収集する。これらの画分を、
UV吸光度を260nmで測定することによりアッセイする。毛管を通って通過する際
に溶液から取り除かれた相補的オリゴヌクレオチドの量を、Beer法を用いて計算
する(実施例6を参照のこと)。オリゴヌクレオチドのほとんどは画分1〜3におい
て除去される。ハイブリダイズされた相補的オリゴヌクレオチドの総量は、毛管
1m当たり〜50pmoleであると計算される。
【0100】実施例9 2本鎖オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンで被覆した毛管との結合試験 実施例4のストレプトアビジンで被覆した毛管を、PBS(0.1Mリン酸ナトリウム
、0.15M塩化ナトリウム、pH7.2)30mlを、シリンジポンプを用いて、緩衝液を30m
l/時で送達し、洗浄する。
【0101】 PBS 20ml中のストック用オリゴヌクレオチドビオチン−EcoRIの2.0μlの溶液(
〜580pmole)およびPBS 20ml中のストック用オリゴヌクレオチドフルオレセイン
−EcoRICの1.6μlの溶液(〜600pmole)を調製し、かつ室温に30分間放置する。こ
の溶液6mlを、ストレプトアビジンで被覆した毛管を通じて、4ml/時で還流する
。1ml画分を、微量遠心チューブ1.5ml中に収集する。これらの画分を、UV吸光度
を260nmで測定することによりアッセイする。毛管を通って通過する際に溶液か
ら取り除かれた2本鎖オリゴヌクレオチドの量を、Beer法を用いて計算する(実施
例5を参照のこと)。オリゴヌクレオチドのほとんどは画分1〜3において除去され
る。2本鎖オリゴヌクレオチドの総量は、毛管1m当たり〜60pmoleであると計算さ
れる。
【0102】実施例10 オリゴヌクレオチドと複合した抗体の調製 オリゴヌクレオチド修飾:アミノ−EcoRICのストック溶液400μl (〜380 nmol
es)を、1M MOPS(Na)、pH7.3、緩衝液400μlと混合する。無水メチルスルホキシ
ド(Aldrich社)200μl中のN-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネ
ート(SPDP;Pierce社)の2.0mg溶液(FW 312.4、〜6.4μmole、〜16.6倍過剰)を添
加する。この透明な液体を、室温で1時間振盪し、その後さらに4℃で2.5時間放
置する。この反応混合液を、NAP-25ゲル濾過カラム(Amersham Pharmacia社)上で
、PBSE(0.1Mリン酸ナトリウム、0.15M 塩化ナトリウム、1mM EDTA、pH7.4)で平
衡化し、かつ溶離し、精製する。8個の1ml画分を、1.5mlの微量遠心チューブ中
に収集し、UV分光計でDNAについてアッセイする。DNAを含有する画分3-6をプー
ルする。
【0103】 SPDPで修飾したオリゴヌクレオチドを、Inertsil C4 5μm、4.6mm x 150mmカ
ラム(MetaChem Technologies社)を用いる、0.1Mトリエチル酢酸アンモニウム中
のアセトニトリル直線勾配(pH6.5)を用い、逆相HPLCにより分析する。クロマト
グラムにおいて出現するこれら2種の相対ピーク面積から算出すると、アミノ-オ
リゴヌクレオチドからピリジルジチオプロピオニル-オリゴヌクレオチドへのお
よそ80%の転化が認められる。
【0104】 ストック用ピリジルジチオプロピオニル−オリゴヌクレオチドの濃度は、水1m
lへストック液5μlを希釈し、この溶液の吸光度を260nmで測定し、かつBeer法を
用いて濃度を計算することにより決定する(A =εbc、ε=36 x 104M-1cm-1、b=1c
m、および希釈因子200)。この調製について60.6μMの値が得られた。
【0105】 SPDP−修飾の程度は以下のように決定する。ストック用修飾オリゴヌクレオチ
ド溶液(〜6.1nmole)の100μlアリコートを、PBSE 900μlと一緒にし、かつこの
溶液をUV分光計のキュベットに入れる。水中の10mMのトリス-塩酸カルボキシエ
チルホスフィン(TCEP)溶液10μl(100nmole;Pierce社)を添加し、かつ反応混合
液の吸光度を343nmで15分間に渡って測定する。最初の数分間に吸光度は急激に
上昇し、これは発色基ピリジン-2チオンおよびチロール化されたオリゴヌクレオ
チドの同時生成を伴う、TCEPによるピリジルジスルフィドの還元を示し、その後
レベルは低下する。ピリジン-2チオンの濃度、およびその結果としてのSPDP修飾
オリゴヌクレオチドの濃度を、343nmの吸光度の最大値から、Beer法を用いて計
算し(ε343 =8.08x103)、この調製について52.0μMである。従ってオリゴヌクレ
オチドの修飾の割合は86%であり、クロマトグラフィーの結果と良く一致してい
る。
【0106】 抗体修飾:PBS中の0.5mg/mlの抗体M1/70の溶液(〜3.3nmole;Stanford Medica
l Schoolより提供)1mlを、1M MOPS(Na)緩衝液(pH7.3)100μlと混合する。無水メ
チルスルホキシド(Aldrich社)25μl中のスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミ
ドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート0.1mg(Sulfo-SMCC、〜228nmole、
〜69倍モル過剰)溶液を添加する。この透明な溶液を室温で2時間振盪する。この
反応混合液を、NAP-25ゲル濾過カラム(Amersham Pharmacia社)上で、PBSE(0.1M
リン酸ナトリウム、0.15M塩酸ナトリウム、1mM EDTA、pH7.4)で平衡としかつ溶
離し、精製する。8個の1ml画分を、1.5ml微量遠心チューブ中に収集し、かつUV
分光計でタンパク質についてアッセイする。IgGを含有する画分4および5をプー
ルする。この方法で本質的に全てのIgGが回収されると推定される。
【0107】 DNA-抗体複合体の調製:前記のSPDP修飾オリゴヌクレオチド溶液1ml(修飾した
オリゴヌクレオチド〜52nmole)を、石英キュベットに添加し、かつキュベットを
UV分光計に設置する。水10μl中のTCEP 20μg溶液を添加し、かつ343nmでの吸光
度を前述のようにモニタリングする。反応速度は、20分までにほぼゼロ近くまで
遅くなる。1時間後、チオル化されたオリゴヌクレオチドを含有する溶液をキュ
ベットから取り除き、かつ100μ1(〜5.2nmole)を、前記のSMCC修飾IgG溶液に添
加する。この反応を4℃で一晩進行させる。
【0108】 オリゴヌクレオチド−IgG複合体を、再生セルロースから製造され、かつ名目
上分子量30,000ダルトン以上を有する、Ultrafree-MO遠心フィルターユニット(M
illipore社)を用いて精製する。その結果、これらの限外濾過ユニットは、この
タンパク質-DNA複合体を保持する一方で、あらゆる未反応のオリゴヌクレオチド
は該膜を通過し破棄される。2個のユニットは、最初にBSAでブロックされ、膜へ
の非特異的結合を通じての該複合体の喪失を減少する。PBS中のBSA 10mg/mlの40
0μlを、各ユニットにピペットで注入する。これらのユニットを、4℃の冷凍遠
心分離機(モデルGS-15R;Beckman Instruments社)に配置し、かつ3000 x gで30
分間回転する。その後これらの試料カップを水ですすぎ、新たな遠心チューブに
移す。粗オリゴヌクレオチド-IgG複合体溶液400μlを各ユニットに追加する。こ
れらのユニットを、4℃の冷凍遠心分離機に配置し、かつ3000 x gで30分間回転
する。フロースルーを破棄し、かつ残りの複合反応液を2個のユニット間で等分
する。残りの複合体溶液を、PBSで400μ1に希釈し、かつこれらのユニットを再
度3000 x gで30分間4℃で回転する。フロースルーを再度破棄し、残った複合体
溶液をPBSで400μ1に希釈し、かつこれらのユニットを3000 x gで30分間4℃で回
転する。この方法をさらに4回繰り返す。最後に残った複合体溶液を、PBSで400
μ1に希釈し、1.5mlの微量遠心チューブ中で一緒にする。複合体濃度は、この溶
液の吸光度を260nmで測定し、Beer法を用いて濃度を計算することにより決定す
る(A =εbc、ε=36 x 104M-1cm-1、b=1cm)。この調製について濃度42.2μMであ
る。
【0109】実施例11 Mac-1ポジティブ細胞の濃縮 表面にMac-1を高度に発現している細胞を濃縮するために、調製物を前述の装
置上に流す。
【0110】 内径250μmの毛管1mを、循環ポンプに連結した。毛管束それ自身を、実施例3
に記したようにビオチンで被覆した。PBS + 0.5%BSA中のストレプトアビジン5m
g/mlの溶液を、毛管束を通して30分間循環した。その後、毛管を、PBS + BSA 3m
lで15分間洗浄した。
【0111】 実施例7に記したように、PBS + BSA 中のビオチン化したオリゴヌクレオチド(
配列番号:l)濃度3μMを、ストレプトアビジンで被覆した毛管を循環させた。こ
の毛管を、PBS+BSAで15分間洗浄した。
【0112】 Mac-1抗体を毛管に結合するために(実施例10を参照のこと)、オリゴヌクレオ
チドに複合した抗体(Oligo2 (配列番号:2)-Mac-1 抗体)を37℃で10分間加熱し
た。抗体溶液2μMを、毛管を通して30分間、37℃で流し、その後15分間洗浄した
【0113】 PBS + BSA 中の新たに単離した脾細胞の懸濁液濃度3x106を、毛管を通して循
環した。その後管を15分間洗浄した。ポンプ(細胞を伴う毛管ではない)を、あら
ゆる残留している未結合の細胞を排除するように大量に洗浄し、かつ毛管に20分
間流し、二次抗体をマーカー(ヤギ抗ラットIgG)として添加し、その後15分間洗
浄した。
【0114】 結合した細胞を溶離するために、1 x ReACT 3 緩衝液+BSA中のEcoRIエンドヌ
クレアーゼ200ユニットを、毛管を通して35分間37℃で再還流した。これらの細
胞を、追加のPBS + BSA 300μlで溶離し、かつFACS分析のために収集した。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明の毛管束、およびそのゾーンへの分割を示す。図1Bは、毛
管束の表面に結合している管腔を図示している。
【図2】 図2Aは、毛管アレイを示し、かつ図2Bは、毛管アレイ、バッフル
、およびフィルター;並びに、分配容器および収集容器を備える装置を示してい
る。
【図3】 毛管アレイのらせん形配置を示している。
【図4】 ゾーン化された毛管システムの例を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウェイスマン アービング エル. アメリカ合衆国 カリフォルニア州 レッ ドウッド シティー ジェファーソン ア ベニュー 4147 Fターム(参考) 2G045 AA24 BB03 CA01 CB01 FB01 FB03 HA06 HA14 JA07 2G052 AA33 AD09 AD29 BA02 BA21 CA03 DA01 ED05 ED09 JA09 4B029 AA07 BB11 CC01 FA04 FA05 4B063 QA01 QQ08 QR48 QR54 QR63 QR82 QS33

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 下記式を有する管腔表面上の捕獲システムを備える、複雑な
    混合物からの生物学的粒子の分離のための捕獲毛管: S-Q-(X)n-CL-(Y)m-L (式中、Sは毛管束の管腔表面であり;Qは表面とXの間の化学結合であり;Xは親
    和性試薬であり;nは1または0であり;CLは切断可能な結合であり;Yはリンカー
    または親和性試薬であり;mは1または0であり;並びに、Lは所望の粒子サブセッ
    ト上に存在する部位に特異的に結合することが可能であるリガンドである)。
  2. 【請求項2】 nが1であり;およびXがコグネイト結合対メンバーX'およびX
    ''を含む親和性試薬である、請求項1記載の捕獲毛管。
  3. 【請求項3】 毛管が、複数のゾーンに直線的に分割され、該ゾーンの各々
    が独自のLリガンドを含む、請求項1記載の捕獲毛管。
  4. 【請求項4】 切断可能なリガンドCLがオリゴヌクレオチドを含む、請求項
    1記載の捕獲毛管。
  5. 【請求項5】 オリゴヌクレオチドが、1個以上の制限酵素認識配列を含む2
    本鎖DNAである、請求項4記載の捕獲毛管。
  6. 【請求項6】 オリゴヌクレオチドが、2本鎖RNA:DNAハイブリッドである
    、請求項4記載の捕獲毛管。
  7. 【請求項7】 リガンドLが細胞表面抗原を認識する、請求項1記載の捕獲
    毛管。
  8. 【請求項8】 リガンドLが抗体である、請求項7記載の捕獲毛管。
  9. 【請求項9】 このような(本発明者らは捕獲システムの密集性に関するい
    くつかの請求項を含むこととする)、請求項1記載の捕獲毛管。
  10. 【請求項10】 下記を備える捕獲装置: 下記式を有する管腔表面上の捕獲システムを備える、10〜105個の捕獲毛管の
    アレイ: S-Q-(X)n-CL-(Y)m-L (式中、Sは毛管束の管腔表面であり;Qは表面とXの間の化学結合であり;Xは親
    和性試薬であり;nは1または0であり;CLは切断可能な結合であり;Yはリンカー
    または親和性試薬であり;mは1または0であり;並びに、Lは所望の粒子サブセッ
    ト上に存在する部位に特異的に結合することが可能であるリガンドである)。
  11. 【請求項11】 nが1であり;およびXがコグネイト結合対メンバーX'およびX
    ''を含む親和性試薬である、請求項10記載の捕獲装置。
  12. 【請求項12】 毛管が、複数のゾーンに直線的に分割され、これらのゾーン
    の各々が独自のLリガンドを有する、請求項10記載の捕獲装置。
  13. 【請求項13】 切断可能なリガンドCLがオリゴヌクレオチドを含む、請求項
    10記載の捕獲装置。
  14. 【請求項14】 リガンドLが細胞表面抗原を認識する、請求項10記載の捕獲
    装置。
  15. 【請求項15】 リガンドLが抗体である、請求項14記載の捕獲装置。
  16. 【請求項16】 装置が入口および出口供給機構をさらに備える、請求項10記
    載の捕獲装置。
  17. 【請求項17】 装置が収集容器をさらに備える、請求項16記載の捕獲装置。
  18. 【請求項18】 毛管アレイが、ラセン形に巻きつけられている、請求項10記
    載の装置。
  19. 【請求項19】 請求項10記載の捕獲装置、および液体制御システムを備える
    、捕獲器具。
  20. 【請求項20】 完全な器具に具備され得るものを一度決定すると精巧に作成
    することができ、さらに好ましい態様である場合に捕獲システムのための特定の
    化学物質も含むことができる、請求項1から19記載のもの。
  21. 【請求項21】 下記の段階を含む、生物学的粒子を分離する方法: 該粒子と、下記式を有する管腔表面上の捕獲システムを備える捕獲毛管とを接
    触させる段階 S-Q-(X)n-CL-(Y)m-L (式中、Sは毛管束の管腔表面であり;Qは表面とXの間の化学結合であり;Xは親
    和性試薬であり;nは1または0であり;CLは切断可能な結合であり;Yはリンカー
    または親和性試薬であり;mは1または0であり;並びに、Lは所望の粒子サブセッ
    ト上に存在する部位に特異的に結合することが可能であるリガンドである); 該所望の粒子サブセットを、該リガンドLと結合する段階; 該所望の粒子サブセットと、該切断可能なリンカーCLに特異的である切断試薬
    とを接触させることにより放出する段階; 該所望のサブセットを該捕獲毛管から収集する段階。
  22. 【請求項22】 前記粒子が細胞である、請求項21記載の方法。
  23. 【請求項23】 捕獲毛管が、所望の粒子サブセットは結合しないようなネガ
    ティブ選択捕獲システムを含むゾーンをさらに備える、請求項21記載の方法。
  24. 【請求項24】 切断可能なリガンドCLがオリゴヌクレオチドを含み、かつ該
    切断可能な試薬がヌクレアーゼを含む、請求項21記載の方法。
  25. 【請求項25】 リガンドLが細胞表面抗原を認識する、請求項21記載の方法
  26. 【請求項26】 リガンドLが抗体である、請求項21記載の方法。
  27. 【請求項27】 下記の段階を含む、生物学的粒子を分離する方法: 式 S-Q-X''を有する管腔表面上の捕獲システムを含む捕獲毛管に、該粒子を適
    用して、下記式の選択性カセットと該粒子とを接触させる段階 X'-CL-(Y)m-L (式中、X'およびX''は、特異的結合対のコグネイトメンバーであり;Sは毛管束
    の管腔表面であり;Qは表面とXの間の化学結合であり;CLは切断可能な結合であ
    り;Yはリンカーまたは親和性試薬であり;mは1または0であり;並びに、Lは所
    望の粒子サブセット上に存在する部位に特異的に結合することが可能であるリガ
    ンドである); 該所望の粒子サブセットを、該リガンドLと結合する段階; 該所望の粒子サブセットと、該切断可能なリンカーCLに特異的である切断試薬
    とを接触させることにより放出する段階; 該所望のサブセットを該捕獲毛管から収集する段階。
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