JP2002514892A - 遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用 - Google Patents

遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、核酸を凝縮し得る複数のペプチド、および凝縮された核酸を含む、合成ウイルス様粒子の発見に基づく。複数のペプチドは低い多分散指数を有し、そしてこの複数のペプチドのそれぞれのペプチドはヘテロペプチドである。核酸は治療的に利益のある配列をコードし得る。合成ウイルス様粒子は自己集合し、そして特定の細胞または組織の型を標的化し、そして核酸を送達して、標的細胞または組織の染色体または染色体外配列に組み込まれ得るように設計され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用 発明の分野 本発明は、遺伝子療法による疾病の治療に有用な薬学組成物に関し、特に、核 酸縮合剤に依存する組成物に関する。 発明の背景 遺伝子療法は、標的細胞へのDNAの効率的な送達、およびこのような細胞の核 における送達されたDNAの発現に依存する。異なるモードのDNA送達が提案されて おり、これらは、遺伝子配列のウイルスおよび非ウイルス送達の両方を含む。 DNAを哺乳類細胞にインビトロで導入する初期の実験では、低効率のトランス フェクションを有する沈降形態のDNAを用い、選択可能マーカー遺伝子を必要と していた（Wiglerら、（1977）細胞16、777〜85；GrahamおよびVan der Eb（197 9）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77、1373〜76、および（1973）Virology 52、4 56）。この頃から、分子生物学者は、エレクトロポレーション、アスベスト、ポ リブレン、DEAE、デキストラン、リポソーム類、リポポリアミン類、ポリオルニ チンを用いた複合化、粒子衝撃、および直接的なマイクロインジェクションなど の、DNAを細胞に導入するためのより効率的な他の多くの技術を開発してきた（K ucherlapatiおよびSkoultchi（1984）Crit．Rev．Biochem．16、349〜79；Keown ら、（1990）Methods Enzymol．185、527によって概説されている）。これらの 方法の多くは、非常に変動しやすく、比較的低レベルのトランスフェクションを 提供するので、臨床的に用いるには不適切である。現存するトランスフェクショ ンの広範囲な使用のもう１つの障害となっているは、インビボで不安定に残存す る複合体である。従来技術のトランスフェクション複合体と同様のサイズの粒子 が、細網上皮システムによって血液から迅速かつ効率的に除去されることが示さ れている（PosteおよびKirsch、Bio/Technology 1、869(1984)）。 LoyterおよびVolsky（Cell Sur．Rev．8、215〜266(1982)）ならびにKaneda ら（Exp．Cell Res．173、56〜69(1987)）は、ウイルスエンベロープをDNAのキ ャリアを含む生物学的キャリアとして再構築することを記載している。このアプ ローチでは、天然に存在するウイルスを単離し、洗浄剤を含有する溶媒に溶解し 、ウイルス核酸を除去し、残存するウイルス成分をプラスミドDNAの存在下で再 構築する。しかし、この技術を拡大するには、非常に費用がかかり、困難である 。さらに、抽出されたウイルスを薬学的に用いることに関する安全性の問題も深 刻である。 文献に記載されている他の非ウイルス遺伝子送達システムは、合成ポリマーを 用いて縮合されたDNAを用いるトランスフェクションに関する考察をさらに展開 したにすぎない。例えば、可溶性のDNA／ポリリジン複合体が生成され得る（Li ら、Biochem、J．12、1763(1973)）。アシアログリコプロテインで標識を付けら れたポリリジン複合体は、DNAを肝細胞にインビトロで標的づけるのに用いられ ている（WuおよびWu、J.Biol．Chem．262、4429(1987)；米国特許第5,166,320号 ）。ラクトシル化ポリリジン（Midouxら、（1993）Nuc．Acids Res．21、871〜8 78）およびガラクトシル化ヒストン類（Chenら、（1994）Human Gene Therapy5 、429〜435）は、プラスミドDNAをレクチンレセプターを有する細胞に、ポリリ ジンに結合したインシュリン（Rosenkrantzら、（1992）Exp．Cell Res．199、3 23〜329）をインシュリンレセプターを有する細胞に標的づけるのに用いられて いる。しかし、Wagnerら（上述）は、後者のアプローチは、トランスフェクショ ンの標準的な方法と比較してもまだ非効率であるので、薬学的な開発には不適切 であり得ることを示した。モノクローナル抗体は、DNAを特定の細胞型に標的づ けるのに用いられている（Machyら、（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85、 8027〜8031；Trubetskoyら、（1992）Bioconjugate Chem、3、323〜27およびWO 91/17773およびWO 92/19287）。 ウイルスエンベロープ蛋白質のアミノ酸配列から得られたペプチドは、ポリリ ジンDNA複合体と共に投与され、遺伝子転移において用いられている（Plankら、 （1994）J．Biol．Chem．269、12918〜24）。Trubetskoyら（上述）およびMack ら（(1994)Am．J．Med．Sci．307、138〜143）は、カチオン脂質とのポリリジン 結合体を共に縮合すると、遺伝子転写効率が向上し得ることを示唆している。WO 95/02698号は、カチオン脂質遺伝子転写の効率の増加を試みるためにウイルス成 分を用いることを開示している。 送達ビヒクルのペプチド成分を連結するためにジスルフィド結合が用いられて いる(cottonら、（1992）Meth．Enzymol．217、618〜644)；さらにTrubetskoyら （上述）も参照のこと。しかし、種々の成分の化学的な改変は、グループ特異的 であるが、部位特異的ではなく、結合生成物の大きな分子異種性をもたらす。ジ スルフィド結合はまた、生物学的流体において不安定であることがことが知られ ており、このため、このような化合物の効能は実際には限定される。 同様の異種性は、側鎖カルボキシル基を介したカルボジイミド結合などの他の 標準的な結合方法によってももたらされる（Wuら、（1991）J．Biol．Chem．266 、14338〜42）。しかし、上記の欠点に加えて、結果として得られる成分を結合 するアミド結合は、サイトゾル内では化学的に安定であり、成分は分離が困難に なる。 より特異的な結合化学方法は、Cottenら（上述）によって用いられている。こ の方法は、過ヨウ素酸塩を用いる炭水化物の部分の酸化、およびそれに次ぐポリ リジンとの反応を伴う。このように形成されたシッフ塩基を、シアノボロ水素化 ナトリウム（sodium cyanoborohydride）で還元し、安定なアミド結合を形成し た。しかし、得られるリジン残基は多数であるため、結果として得られるアミド 結合を、ポオリリジン成分にでたらめに結合した。 Trubstskoy（上述）は、モノクローナル抗体上のアミノ機能にN末端を介して 非特異的に結合した異種ポリリジン部分からなる結合体の効率が増加したのを観 察した。 多くの従来技術の方法は、結合化学方法によって結合した非常に異種性の高い 成分を用いるので、より異種性をもたらす。この異種性は、調製中の制御が良好 でなく、バッチ毎に大きな変動をもたらし、効能が低く、また溶液の安定性も悪 い。 文献に記載されている遺伝子送達ビヒクルの拡大および再生可能な製造は、シ ステムの生成物および成分の異種性が非常に高いため問題がある。質制御、プロ セス制御、および生成物同定などの主要なパラメータは、このように不正確とな っている。それ故、本発明の目的は、外因性DNAの標的細胞への高効率な送達を 容易にする薬学組成物の再生可能かつ拡大可能な生産プロセスの開発である。 本発明の他の目的は、細網上皮システムを回避でき、インビボにおける退化に 耐え得る改善された核酸の送達ビヒクルを提供することである。 本発明の他の目的は、規定された化学量の化学成分を有するため異種性が低減 された、改善された遺伝子送達複合体を提供することである。 本発明の他の目的は、改善された治療的メリットを有する薬学組成物として、 改善された特性を有する遺伝子療法生成物を提供することである。 本発明のさらに他の目的は、選択された細胞群を標的とするかまたは広範囲の 細胞型を標的とするように設計され得る核酸送達複合体を提供することである。 本発明のさらに他の目的は、非常に低レベルの非特異的細胞ターゲティングを 有する核酸送達複合体を提供することである。 本発明のさらに他の目的は、規定の化学量の成分を用いて自己結集ウイルス様 粒子を提供することである。 本発明のさらに他の目的は、増加したトランスフェクション効率を示す遺伝子 療法用薬学組成物を提供することである。 発明の要旨 本発明は、核酸を哺乳動物細胞にトランスフェクトするための合成ウイルス様 粒子（すなわち、トランスフェクション複合体または遺伝子送達ビヒクル）を包 含み、合成ウイルス様粒子は、組換え核酸、複数の核酸凝縮ペプチドを含み、ペ プチドは、核酸が凝された形態になるように組換え核酸と非共有結合し、ここで それぞれの核酸凝縮ペプチドはヘテロペプチドであり、そして複数の核酸凝縮ペ プチドは低い多分散を有する。 好ましい実施態様において、複数の核酸凝縮ペプチドは、第１の核酸凝縮ペプ チドおよび第２の核酸凝縮ペプチドを含み、ここで、第１の核酸凝縮ペプチドは 、それに共有結合した第１の機能基を含む。第１の核酸凝縮ペプチドは、ペプチ ドに直接結合し得るか、または第１の機能基に共有結合し得る、第２の機能基を さ らに含み得、ここで、第１の機能基はペプチドに結合している。あるいは、第２ の核酸凝縮ペプチドはまた、それに共有結合した第２の機能基を含み得、第２の 機能基は第１の機能基と異なる。第１および第２の核酸凝縮ペプチドは、同一の アミノ酸配列、または異なるアミノ酸配列を有し得る。 本発明に有用なペプチドに結合する機能基としては、抗原性ペプチドであるリ ガンド、または特定の細胞型を標的化するリガンド（例えば、モノクローナル抗 体、インシュリン、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、または糖）が挙 げられる。従って、リガンドは、非特異的な様式で、または細胞型について制限 される特異的な様式で細胞を標的化し得る。 機能基はまた、パルミトイル、オレイル、ステアロイル、またはコレステロー ルのような脂質を含み得る。 機能基はまた、ポリエチレングリコール(PEG)、またはポリビニルピロリジン( PVP)のような中性親水性ポリマーを含み得る。 機能基はまた、インフルエンザウイルスのHAペプチドのようなフソゲン(fusog enic)ペプチドを含み得る。 機能基はまた、リコンビナーゼまたはインテグラーゼのような酵素を含み得る 。 機能基はまた、核局在化配列(NLS)のような細胞内輸送タンパク質を含み得る 。 特に好ましい実施態様において、第１の機能基は、脂質またはPEGのような中 性親水性ポリマーの１つを含み得、そして第２の機能基は、細胞表面レセプター を標的化するリガンドを含み得、すなわち、ここで、第２の機能基は、ペプチド に直接結合した第１の機能基に共有結合する。例えば、第１の機能基が脂質を含 む場合、第２の機能基は細胞レセプターを標的化するリガンドを含み得る。第１ の機能基がPEGを含む場合、第２の機能基は細胞レセプターを標的化するリガン ドを含み得る。リガンドは、例えば、糖部分またはその細胞レセプターが細胞型 について制限されるリガンドの１つであり得、従って、標的細胞集団は細胞型に ついて制限されなくてもよいし、または制限されてもよい。あるいは、第１の機 能基が脂質を含む場合、第２の機能基はPEGを含み得る。 第１の核酸凝縮ペプチドは、８〜24の正に荷電したアミノ酸側鎖基を含み得、 より好ましくは、正に荷電したアミノ酸側鎖基の数は12〜18である。 好ましくは、特定の哺乳動物細胞型を標的化し得る合成ウイルス様粒子におけ る正/負の電荷の比は、核酸中のリン酸残基あたり0.5〜３の範囲内である；この 比は、より好ましくは0.8〜1.2の範囲内である。 好ましくは、標的化する細胞の型について制限されない合成ウイルス様粒子に おける正/負の電荷の比は、核酸中のリン酸残基あたり0.5〜５の範囲内であり、 そしてより好ましくは1.2〜２の範囲内である。 本発明はまた、本発明の合成ウイルス様粒子を処方するために使用される複数 の核酸凝縮ペプチドを含み、ここで、複数の核酸凝縮ペプチドのそれぞれの核酸 凝縮ペプチドは、ヘテロペプチドであり、そして複数の核酸凝縮ペプチドは低い 多分散を有し、ペプチドは、組換え核酸と接触される場合、ペプチドが核酸に非 共有結合して凝縮された組換え核酸を含む合成ウイルス様粒子を形成し得る点で さらに特徴づけられ、そして合成ウイルス様粒子は、哺乳動物細胞と接触される 場合、粒子が核酸を細胞にトランスフェクトし得る点で特徴づけられる。 複数の核酸凝縮ペプチドは、第１の核酸凝縮ペプチドおよび第２の核酸凝縮ペ プチドを含み得、ここで、第１の核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合した第１ の機能基を含み、そして第２の核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合した第２の 機能基を含み得、第２の機能基は第１の機能基と異なる。 好ましい核酸凝縮ペプチドは、以下の一般式： のアミノ酸配列を含み、 ここで、X1-8のそれぞれは、独立して、側鎖に正に荷電した基を有するアミノ 酸であり；ここで、Y1-4のそれぞれは、独立して、αヘリックス形成を促進する 天然に存在するアミノ酸であり；ここで、Z1-4のそれぞれは、独立して、安定化 された折り曲がり(turn)構造を形成する高度な性質を有する少なくとも３つのア ミノ酸を伴う、天然に存在するアミノ酸であり；ここで、Ａはアミノ末端のセリ ンまたはスレオニン残基であり；ここで、Ｂは任意のアミノ酸であり；そしてこ こで、ｎ＝２〜４およびｍ＝２である。 他の好ましいペプチドは、X1-8のそれぞれは、独立して、リジン、アルギニン 、2,4-ジアミノ-酪酸、またはオルニチンであり；Y1-4のそれぞれは、独立して 、グ ルタミン酸、アラニン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、トリプトファン、 またはヒスチジンであり；Z1-4のそれぞれは、独立して、アスパラギン、グリシ ン、プロリン、セリン、およびアスパラギン酸であり；Ｂはアラニン、グルタミ ン酸、またはシステインのいずれか１つである、ペプチドである。 本発明に有用なペプチドは、好ましくは、選択されたリガンドに対する接合の ために曝さる配列内の位置（従って、αヘリックスの正に荷電した（核酸に配向 される）面上ではない位置）に、１つ以上の内部セリン、スレオニン、またはシ ステイン残基を含み得ることもまた、本発明により意図される。ペプチド内にあ り、核酸と接触するペプチドの面と接触しないように配向される選択された反応 性アミノ酸残基のこの位置決定は、選択されそして定義された安定性の結合によ るペプチドと他の機能的ペプチドとの接合を可能にする。システインは、そのチ オール側鎖と他の反応性チオール基を含む化合物とを介する（ジスルフィドを介 する）、アルキル化基（チオエーテル結合を形成する）を介する、または他のチ オール反応性基（例えば、マレイミド誘導体）を介する特異的な接合を可能にす る。「定義された安定性」の結合は、本明細書中以下に記載され、そして酸不安 定結合(ヒドラゾン)またはサイトゾルの還元環境において安定ではない結合（ジ スルフィド）のような結合を含む。このような結合は、合成ウイルス様粒子上の 機能基を保持するのに有用である。 この一般式にある好ましいペプチドは、以下のものを含む： 従って、本発明による核酸凝縮ペプチドは：１）ヘリックス形成アミノ酸、２ ）核酸の主要な溝(groove)と接触する反復３次元構造、３）定量のための適切な 発色団、および４）アクセサリー機能ドメインを形成するリガンドの領域(regio )特異的接合のための多数の「ハンドル」（すなわち、反応部位）を含み得る。 本発明の核酸凝縮ペプチドはまた、核酸を凝縮する能力を有する配列として本 明細書中に同定されるH1の部分(以下の配列I、II、またはIII)を含み得る。従っ て、本発明の核酸凝縮ペプチドは、全体の配列の長さが＞17残基である、以下の ３つのコンセンサス配列の直線状の組合せを含み得る： 配列I： ここで、Kはリジンであり；Pはプロリンであり；Aはアラニンであり；Xはセリン 、スレオニン、またはプロリンであり；Yはアラニンまたはバリンであり；Zはア ラニン、スレオニン、またはプロリンであり；Bはリジン、アラニン、スレオニ ン、またはバリンであり；そしてJはアラニンまたはバリンである。 配列II ここで、Xはアラニンまたはバリンであり；Kはリジンであり；Sはセリンであり ；Pはプロリンであり；そしてAはアラニンである。 配列III ここで、Xはリジンまたはアルギニンであり；Yはアラニンまたはスレオニンであ り；Zはプロリン、アラニン、またはセリンであり；Bはリジン、スレオニン、ま たはバリンであり；Kはリジンであり；Pはプロリンであり；Aはアラニンである 。 好ましいペプチドはNBC1であり、これは以下の構造： ここで、-C-はシステインであり；ここで、SV40 NLSは配列Pro-Lys-Lys-Lys-Arg -Lys-Val-Glnを有し；および配列 を有する。 本発明の別の好ましい核酸凝縮ペプチドは、以下の一般配列： の範囲内にあるアミノ酸配列を有し、 ここで、Xは存在しないか、あるいはセリンまたはスレオニンであり；Yは上に定 義されるような配列Ｉ、IIまたはIIIであり；nは２〜６であり；そしてCはシス テインである。 本発明による特に好ましいペプチドは以下のものである： NBC2は構造：NH2-[SeqIII]-[SV40 NLSl]-[Seql]-C-COOHを有し、 ここで-C-はシステインである。 NBC8は構造：NH2-[SeqI]−[SeqI]-C-COOHを有し、 ここで-C-はシステインである。 NBC13は構造：NH2-[SeqI]-[SeqI]-[SeqI]-C-COOHを有し、 ここで-C-はシステインである。 NBC10は構造：NH2-[SeqI]-[SeqI]-[SeqI]-[SeqI]-C-COOHを有し、 ここで-C-はシステインである；これらのアミノ酸配列は以下のとうりである： 本発明はまた、核酸を哺乳動物細胞にトランスフェクトするための合成ウイル ス様粒子を特徴とし、合成ウイルス様粒子は、組換え核酸、第１の複数の第１の 核酸凝縮ペプチド、共有結合した第１の機能基を含むそれぞれのペプチド、第２ の複数の第２の核酸凝縮ペプチドを含み、ここで、それぞれの核酸凝縮ペプチド はヘテロペプチドであり、そしてそれぞれの複数の核酸凝縮ペプチドは低い多分 散を有し、ここで、それぞれの複数の核酸凝縮ペプチドは、核酸が凝縮された形 態になるように組換え核酸と非共有結合する。 合成ウイルス様粒子は、第３の複数の第３の核酸凝縮ペプチドをさらに含み得 、それぞれの第３のペプチドは、第１の機能基とは異なる共有結合した第２の機 能基を含む。 第１および第２の機能基は、予め選択された比において合成ウイルス様粒子に 存在し得る。 第１の核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合した第１の機能基を含み得、そし てそれに共有結合した第２の機能基をさらに含み得る。第２の機能基は、第１の 機能基に共有結合し得るか、またはペプチド自身に共有結合し得る。 第１および第２の核酸凝縮ペプチドは、同一のアミノ酸配列または異なるアミ ノ酸配列を有し得る。 本発明はまた、哺乳動物細胞を組換え核酸でトランスフェクトする方法を包含 し、この方法は、哺乳動物細胞を本明細書中に記載の合成ウイルス様粒子と接触 させる工程を包含する。 本発明はまた、哺乳動物細胞を組換え核酸でトランスフェクトする方法を包含 し、この方法は、ａ）本発明の合成ウイルス様粒子とエンドソーム破壊薬剤との 混合物を形成する工程、およびｂ）核酸での細胞のトランスフェクションを可能 にするのに十分な条件下で、工程ａ）の混合物と哺乳動物細胞とを接触させる工 程を包含する。 本発明はまた、患者への投与のための合成ウイルス様粒子を処方する方法を包 含し、この方法は、本発明の合成ウイルス様粒子とエンドソーム破壊薬剤とを混 合する工程を包含する。 好ましくは、エンドソーム破壊薬剤は、フソゲンペプチドである。 本発明はまた、組換え核酸での哺乳動物細胞のトランスフェクションを増強す る方法を包含し、この方法は、ａ）合成ウイルス様粒子と本明細書中に記載の中 性親水性ポリマーとの混合物を形成する工程、およびｂ）核酸での細胞のトラン スフェクションを可能にするのに十分な条件下で、工程ａ）の混合物と哺乳動物 細胞とを接触させる工程を包含する。 本発明はまた、患者への投与のための合成ウイルス様粒子を処方する方法を包 含し、１つの方法は、本発明の合成ウイルス様粒子と本明細書中に記載の中性親 水性ポリマーとを混合する工程を包含する。 本発明はまた、患者に組換え核酸を投与するための薬学的処方物を包含し、こ れは薬学的に受容可能なポリマーと混合した本発明の合成ウイルス様粒子を含む 。 薬学的処方物は、エンドソーム破壊薬剤、または中性親水性ポリマーをさらに 含み得る。 本発明はまた、患者に組換え核酸を導入する方法を包含し、この方法は、患者 に薬学的有効量の本発明の合成ウイルス様粒子、または本発明の薬学的処方物を 投与する工程を包含する。 本発明はまた、組換え核酸で哺乳動物細胞をトランスフェクトするための合成 ウイルス様粒子を作製する方法を包含し、この方法は、凝縮された核酸を含む合 成ウイルス様粒子の形成を可能にするのに十分な条件下で、組換え核酸と複数の 核酸凝縮ペプチドとを混合する工程を包含し、ここで核酸凝縮ペプチドはヘテロ ペプチドであり、そして複数の核酸凝縮ペプチドは低い多分散を有する。 好ましくは、混合する工程は、核酸と複数の核酸凝縮ペプチドとを混合する工 程を包含し、ここで複数の核酸凝縮ペプチドは、第１の核酸凝縮ペプチドおよび 第２の核酸凝縮ペプチドを含み、それぞれの核酸凝縮ペプチドはヘテロペプチド であり、そしてそれぞれの複数の核酸凝縮ペプチドは低い多分散を有し、ここで 、第１の核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合した第１の機能基を含む。 本発明はまた、組換え核酸で哺乳動物細胞をトランスフェクトするための合成 ウイルス様粒子を作製する方法を包含し、この方法は、凝縮された核酸を含む合 成ウイルス様粒子の形成を可能にするのに十分な条件下で、組換え核酸と第１の 複数の第１の核酸凝縮ペプチドおよび第２の複数の第２の核酸凝縮ペプチドとを 混合する工程を包含し、ここで、それぞれの第１および第２の核酸凝縮ペプチド はヘテロペプチドであり、そしてそれぞれの第１および第２の複数の核酸凝縮ペ プチドは低い多分散を有する。 方法はまた、合成ウイルス様粒子とエンドソーム破壊薬剤とを混合する工程を 包含し得る。 第１の核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合した第１の機能基を含み得、そし て第２の核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合した第２の機能基を含み得る。第 １および第２の核酸凝縮ペプチドは、同一のアミノ酸配列または異なるアミノ酸 配列を有し得る。第１および第２の機能基はまた、同一の基または異なる基であ り得る。 それぞれの核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合したさらなる機能基を有し得 、そしてこれらの機能基は、ペプチドに直接的に結合し得るか、または別の機能 基により間接的にペプチドに結合し得る。 本発明のこの方法の混合する工程は、第１および第２の機能基の比を選択する 工程を包含し得、その結果、組換え核酸と混合される、それぞれそれに共有結合 した第１および第２の機能基を有する第１および第２の核酸凝縮ペプチドの割合 がこの比に対応する。 本発明はまた、機能基に対する共有結合のための核酸凝縮ペプチド上の結合位 置が選択され得、そして核酸凝縮ペプチドのアミノ酸に対する結合のための機能 基上の位置もまた選択され得る点で、高精度な化学を包含する。核酸凝縮ペプチ ド上の結合位置の選択は、例えば、第１の機能基に対する共有結合のための第１ の核酸凝縮ペプチド上のアミノ酸位置を選択する工程、および第２の機能基に対 する共有結合のための第２の核酸凝縮ペプチド上のアミノ酸位置を選択する工程 を包含し得る。結合位置は、核酸凝縮ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末 端のアミノ酸位置であり得る。 本発明はまた、組換え核酸で哺乳動物細胞をトランスフェクトするための合成 ウイルス様粒子を作製する方法を包含し、この方法は、ａ）複数の核酸凝縮ペプ チドと核酸との非共有結合、および核酸の凝縮を可能にするのに十分な時間の間 、高塩濃度中で、複数の第１の核酸凝縮ペプチドと組換え核酸とを接触する工程 、ｂ）工程ａ）の塩濃度をより低い濃度に希釈する工程、ならびにこの溶液を安 定な粒子形成を可能にする中性親水性ポリマーの濃度にする工程を包含する。 好ましくは、方法はまた、工程ｂ）の後または同時に、複数の第２の核酸凝縮 ペプチドを添加するさらなる工程を包含し、それぞれの第２のペプチドは、それ に共有結合した脂質基を有し、ここで、それぞれの第１および第２の核酸凝縮ペ プチドはヘテロペプチドであり、そしてそれぞれの複数の核酸凝縮ペプチドは低 い多分散を有する。 好ましくは、工程ｂ）において、希釈は、複数の第２の核酸凝縮ペプチドの添 加と同時に行われる。あるいは、希釈は、複数の第２の核酸凝縮ペプチドの添加 の前に行われる。 本発明はまた、組換え核酸で哺乳動物細胞をトランスフェクトするための合成 ウイルス様粒子を作製する方法を包含し、この方法は、ａ）複数の第１の核酸凝 縮ペプチドと組換え核酸との混合物を高塩濃度中で形成する工程、ｂ）複数の核 酸凝縮ペプチドと核酸との非共有結合、および核酸の凝縮を可能にするのに十分 な時間の間、工程ａ）の混合物をインキュベートする工程、ならびにｃ）工程ｂ ）の混合物と第２のペプチドに共有結合した脂質基を含む複数の第２の核酸凝縮 ペプチドとを接触する工程を包含し、ここで、それぞれの第１および第２の核酸 凝縮ペプチドはヘテロペプチドであり、そしてそれぞれの複数の核酸凝縮ペプ チドは低い多分散を有する。 本発明のさらなる特性および利点は、実施態様およびその図面の以下の説明に おいて、ならびに請求の範囲からより十分に明らかになる。 図面の説明 本発明の好ましい実施態様を説明する前に、図面を説明する。 図1(a)は、複数のヘテロペプチド(20a)および縮合核酸(50)を含む、本発明に よる合成ウイルス様粒子(10)の模式図であり； 図1(b)は、第１アミノ酸配列を有する複数のヘテロペプチド(20a)、第２アミ ノ酸配列を有する複数のヘテロペプチド(20b)、官能基(30)が結合した複数のヘ テロペプチド(21)、および縮合核酸(50)を含む、本発明によるウイルス様粒子(1 1)の模式図であり； 図1(c)は、複数のヘテロペプチド(20)、第１官能基(30)が結合した複数のヘテ ロペプチド(21)、第２官能基(31)が結合した複数のヘテロペプチド(22)、および 縮合核酸(50)を含む、本発明によるウイルス様粒子(12)の模式図であり、第１お よび第２官能基は、選択された比で粒子内に存在し； 図1（d)は、複数のヘテロペプチド(20)、第１官能基(30)および第２官能基(31 )の両方が結合した複数のヘテロペプチド(23)、および縮合核酸(50)を含む、本 発明によるウイルス様粒子(13)の模式図であり； 図1(e)は、複数のヘテロペプチド(20)、第２官能基(31)が結合した第１官能基 (30)を有する複数のヘテロペプチド、および縮合核酸(50)を含む、本発明による ウイルス様粒子(14)の模式図であり；および 図1(f)は、複数のヘテロペプチド(20)、第１官能基(30)が結合した複数のヘテ ロペプチド(21)、第２官能基(31)が結合した複数のヘテロペプチド(22)、第３官 能基(32)が結合した複数のヘテロペプチド(25)、および縮合核酸(50)を含む、本 発明によるウイルス様粒子(f)の模式図であり、第１、第２および第３官能基は 、選択された比で粒子内に存在する。 図2(a)〜(h)は、本発明で用いたペプチドの質量分布に関する代表的なエレク トロスプレイデータである。各図は、脱回旋（deconvoluted）エレクトロスプレ イ質量スペクトルを示す。VG Instruments Quattro II lnstrumentで収集された データは、Quadropole分析器で得られたデータと一致していた。ペプチドをアセ トニトリル、メチルオキシエタノール、およびトリフルオロ酢酸に分散および希 釈し、インストルメント源に直接注入した。 図2(a)は、NBC1を示し、 図2(b)は、NBC2を示し、 図2(c)は、NBC4を示し、 図2(d)は、NBC7を示し、 図2(e)は、NBC8を示し、 図2(f)は、NBC9を示し、 図2(g)は、NBCを10示し、および 図2(h)は、NBC13を示す。 図３は、核酸縮合ペプチドのゲルリタデーションアッセイである。実施例4.1 に記載するように、複合体を結集し、電気泳働を実施した。 図4(a)は、本発明の合成ウイルス様粒子による非標的化トランスフェクション に対する過剰の核酸縮合ペプチドの効力を示すグラフである。 図4(b)は、トランスフェクション効率に対する過剰な核酸縮合ペプチドの効力 を示すグラフである。 図4(c)は、トランスフェクション効率に対する過剰な核酸縮合ペプチドの効力 を示す棒グラフである。 図５は、個々のNBCペプチドのみの相対的なトランスフェクション効能を示す 。アッセイを以下のように実施した。0.6Mの塩化ナトリウム、25mMのリン酸ナト リウム緩衝液(pH7.4)、およびpRSV LucプラスミドDNA１μg当たり２μgのペプチ ドを用いて実施例4.1に記載するように複合体を結集した。Jurkat細胞（ポイン ト当たり１×106個の細胞）およびポイント当たり2.5μgのDNAを用いて実施例4. 2.1に記載するようにアッセイを実施した。 図6(a)は、複合体において所定量のLip 13と組み合わせられた個々のNBCペプ チドの相対的なトランスフェクション効率を示す。各複合体をDNA１μg当たり0. 15μgのLip13の存在下で結集したこと以外は、実験の詳細は、図５に示す通りで ある。NBDペプチドの濃度は、DNA１μg当たり２μgのペプチドであった。 図6(b)は、Lip 13の比をDNA１μg当たり0.6μgのペプチドまで増加させたこと 以外は、図6(a)に示すのと同様の結果である。 図７は、抗CD7-NBC2のイオン交換クロマトグラフィー中に得られた溶出パター ンのUV吸収度のトレースである。 図８は、酸不安定結合およびジスルフィド結合を介して結合した抗CD33-NBC2 のイオン交換クロマトグラフィー中に得られた溶出パターンのUV吸収度トレース である。 図９は、抗CD33-NBC1で縮合したリポーター遺伝子を含むプラスミドで処理し たヒト骨髄細胞（K562細胞）中のリポーター遺伝子発現を示すヒストグラムであ る。実施例4.1および4.2.1に記載する方法によって実験を実施した。アッセイポ イント当たりの（複合体における）DNAの量（ポイント当たり１×106個の細胞） は、0.15〜5μgに変化した。 図10は、トランスフェクション効率に対する電荷比の効力を示すヒストグラム である。データポイントは、２つの複製物の平均である。 図11は、トランスフェクション効率に対する、核酸縮合における抗体結合体（ 抗CD7-NBC1）の濃度の効力を示すヒストグラムである。各データポイントは、３ つの複製物の平均である。 図12は、複合体において種々の割合のリガンド−NBC結合体を用いて結集した 標的化複合体（抗CD7/Jurkat細胞）の相対的なトランスフェクション効率を示す 。抗CD7-NBC1結合体および非結合NBC1ペプチドによるRSV Luc DNAの100%縮合の ポイントを、個別のゲルリタデーション分析によって決定した。次に、複合体を 種々の割合の抗CD7-NBC1を用いて実施例4.1に記載するように結集した。実施例 ６に詳細に記載するように、100%濃度の核酸を成し遂げるように、結合NBC1およ び非結合NBC1を相対的な割合で加えた。 図13は、0.6Mの塩化ナトリウム、2.5mMのHEPES緩衝液（pH7.4）の存在下で実 施例4.1に記載するように結集した抗CD7-NBC1複合体を用いてJurkat細胞をトラ ンスフェクトした後のルシフェラーゼリポーター遺伝子の発現のタイムコースを 示す。 図14は、インシュリンレセプターを介在した遺伝子転移を用いてルシフェラー ゼリポーター遺伝子DNAをHepG2細胞に標的つけることを示す。 図15は、インンシュリンレセプターで標的づけられた遺伝子転移のレベルが非 結合リガンドの存在下でトランスフェクションによって減少することを示す。こ の実験におけるコントロール送達システムは、DNA１μg当たり0.6μgのLip8と組 み合わせられたDNA１μg当たり２μgのNBC13で構成される非標的化遺伝子複合体 であった。 図16は、マンノシル化（mannosylated）NBC1/pRSV Luc DNA複合体を用いたHep G2のトランスフェクションを示す。細胞をトランスフェクションの24時間および 90時間後にインキュベートしたこと以外は、複合体を実施例4.1に記載するよう に結集し、実施例4.2.2に記載するようにアッセイした。 図17は、N−パルミチル−NBC1を複合体に導入した場合に得られるトランスフ ェクション効率が増加したことを示すヒストグラムである。抗CD7-NBC1結合体を 、実施例4.1および図12の説明に記載するようにLip2の割合を増加させて共に縮 合させ、Jurkat細胞を実施例4.2.1に記載するようにトランスフェクトするのに 用いた。 図18は、N−パルミチル−NBC1を複合体に導入した場合に得られるトランスフ ェクションの効率が増加したことを示すヒストグラムである。抗CD33-NBC1結合 体を、実施例4.1および図12の説明に記載するようにLip2の割合を増加させて共 に縮合させ、K562細胞を実施例4.2.1に記載するようにトランスフェクトするの に用いた。 図19は、合成ウイルス様粒子のトランスフェクション効率に対する、脂質化核 酸縮合ペプチドの存在の効力を示すグラフである。複合体をNBC2およびLip2を用 いて実施例4.1に記載するように結集し、実施例4.2.2に記載するようにHepG2細 胞を用いてアッセイした。 図20は、RSV Lucルシフェラーゼリポーター遺伝子DNAを用いたJurkat細胞の非 標的化トランスフェクションに対する、NBCペプチドNBC2、NBC7、NBC8およびNBC 13と組み合わせたLip 2、Lip 7、Lip 8およびLip 13の効力を示す。 図21は、RSVLucルシフェラーゼリポーター遺伝子DNAを用いたJurkat細胞のト ランスフェクションに対する、ポリリジンまたはNBC13と組み合わせたLip13およ びパルミチルポリーリジンの効力を示す。 図22は、合成ウイルス様粒子を用いたHepG2およびK562細胞のトランスフェク ションを示すグラフである。 図23は、脂質化ペプチドを含む合成ウイルス様粒子のプラズマ安定性を示すグ ラフである。 図24は、トランスフェクション効率に対する、合成ウイルス様粒子処方物にお けるPEGおよび塩の濃度を変化させた場合の効力を示すグラフである。 図25は、トランスフェクション効率に対する、2%のPEGを含む合成ウイルス様 粒子処方物におけるDNAおよび塩の濃度を変化させた場合の効力を示すグラフで ある。 図26(a)は、RSVLucリポーター遺伝子DNAの処方物の相対的なトランスフェクシ ョン効率を示す。複製物１は、0.8Mの塩化ナトリウムおよび25mMのHEPES（pH7.4 ）において処方されたNBC2/Lip2複合体の効力を示す。アッセイポイント当たり2 .5μgを、実施例4.2.1に記載するトランスフェクション手法中に、１×106Jurka t細胞に直接希釈した。複製物２は、複合体をまず0.15Mの塩化ナトリウムおよび 25mMのHEPESに希釈した場合のトランスフェクション効率を示す。複製物３は、1 0%のPEG10,000を含むこと以外は同一の緩衝液に希釈した後のトランスフェクシ ョン効力を示す。複製物５は、複合体を0.8Mの塩化ナトリウムおよび3.5%のPEG1 0,000の存在下で結集し、次に、複製物３について記載したように希釈した場合 に観察される効率を示す。 図26(b)は、0.6Mの塩化ナトリウムおよび25mMのリン酸ナトリウム中にNBC2複 合体を予め結集し、この溶液をDNA1μg当たり0.6μgのLip2を含むリン酸緩衝化 生理食塩水、10%のPEG10,000を含むリン酸緩衝化生理食塩水、および10%のPEG10 00およびDNA１μg当たり0.6μgのLip2を含むリン酸緩衝化生理食塩水に希釈した 場合の効力を示す。 図27は、４℃または-20℃に種々の処方物を維持した場合の効力を示す。処方 物S6〜S19を図13に要約する。 図28は、合成ウイルス様粒子の抹消血単分子細胞への送達を示すヒストグラム である。 図29は、合成ウイルス様粒子のJurkat細胞および抹消血単分子細胞への送達を 示すヒストグラムである。 図30は、合成ウイルス様粒子によってインビボでトランスフェクトされた腫瘍 組織の断面の一連の写真であり、LacZリポーター遺伝子によるトランスフェクシ ョンを青色で示す。実施例12.1.1に記載するように、高塩処方物において結集お よび処方したNBC2/Lip2複合体を用いて実験を実施した。 図31(a)〜(f)は、合成ウイルス様粒子によってインビボでトランスフェクトさ れた腫瘍組織の断面の一連の写真であり、LacZリポーター遺伝子によるトランス フェクションを青色で示す。実施例12.2.2に記載するように、等張処方物におい て結集および処方したNBC13/Lip2複合体を用いて実験を実施した。発明の詳細な説明 本発明は、哺乳類細胞と接触すると、核酸を細胞に転移する効率の高い合成ウ イルス様粒子の発見に基づく。合成ウイルス様粒子は、複数の核酸縮合ペプチド および縮合された核酸を含む。合成ウイルス様粒子のこれらの成分の特徴、およ び本発明の合成ウイルス様粒子を形成および使用する方法を以下に詳細に説明す る。 本発明による有用な核酸は、例えば、円形、線形、二本鎖、およびDNAまたはR NAなどの任意の形態の核酸であり得る。核酸は、例えば、10〜50塩基オリゴヌク レオチドまたはより長いベクターDNA、例えば、1〜20kbの任意の長さまたは配列 であり得る。 本発明による核酸縮合ペプチド 本発明において有用な核酸縮合ペプチドは、以下の特徴を有する。 １）本発明において有用な核酸縮合ペプチドは、ペプチドがヘテロペプチドで あることを特徴とする。 本願で使用する「ヘテロペプチド」は、選択されたアミノ酸配列を有するペプ チドを指す。用語「ヘテロペプチド」は、少なくとも２つの異なるアミノ酸を含 むアミノ酸組成物を有するペプチドを指す。これは、アミノ酸組成物が同一のア ミノ酸からなる「ホモペプチド」とは対照的である。従って、ホモペプチドは、 100%同一のアミノ酸からなるのに対して、ヘテロペプチドは、少なくとも１つの アミノ酸が鎖中の残りのアミノ酸とは異なる、または例えば鎖中の５%、10%、20 %、30%、50%、70%、80%、90%等のアミノ酸がこの鎖中の残りのアミノ酸とは異な るポリペプチド鎖（claim）からなる。従って、ヘテロペプチドは、選択された アミノ酸配列の観点から、種々（即ち、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少な くとも４つ等）のタイプのアミノ酸からなる線形ペプチドである。 本願で使用する「アミノ酸」は、20個の天然の一般的なアミノ酸のいずれかを 示し、また、天然の一般的でないアミノ酸またはアミノ酸誘導体もしくは類似体 も示し得る。本発明によるペプチドには、Ｄ型またはＬ型のアミノ酸が存在し得 る。 ２）本発明の核酸縮合粒子はまた、本発明において有用な複数の核酸縮合ペプ チド、または核酸縮合ペプチドの調製物が低い多分散指数（polydispersion ind ex）を有することを特徴とする。 例えばポリカチオンなどの従来技術の核酸縮合ペプチド調製物は、1.1よりも 高い多分散指数を有する。これは、従来技術のポリリジンペプチド調製物が「中 間Mr」を有する（Wuら、1987、J．Biol．Chem．262:4429；Wuら、1988、J．Biol ．Chem．263:14621；およびWuら、1988、Biochem 27:887）、または「平均鎖長 」を有する（Wagnerら、1991、Proc．Nat．Aca．Sci．88:4255；Wagnerら、1992 、Proc．Nat．Aca．Sci．89:7934）、または「平均重合度」を有する（Birnstei lら、EPO532525）という記載から証明される。中間Mrまたは平均鎖長を有するポ リリジン調製物は、従来技術において、DNAを縮合して遺伝子を送達するために 用いられる。このような調製物は、所定数のリジン基の平均重合度を有するが開 示されている。例えば、「ポリジン90」は、90個のリジン基の平均重合度を有し 、「ポリジン190」は、190個のリジン基の平均重合度を有する等（Birnsteilら 、上述）。ポリリジンの調製物は、Sigma Corporationから市販され、当業者に 公知であり、購入時に各サンプル内の実際のサイズ分布が添付され、サイズは、 サンプル毎に異なり、例えば、材料の30%〜150%の分布で変化し得る。従って、 こ のようなサンプル内の実際のペプチドの長さは、例えば、ペプチドの指定された 平均長さの80%を上回るかまたは80%を下回り得る。従って、ペプチドの長さは、 種々のサイズの平均として報告され、この平均は、化学的に合成されたペプチド の個々のロットを低角度光分散分析によって決定される。 本発明による有用な核酸縮合ペプチド調製物は、低い多分散指数（PDI）（多 分散性指数（index of polydispersity）とも呼ばれる）を有する。本願で使用 する「低」多分散指数は、1.01よりも小さいPDIを指す。本発明において有用な 核酸縮合ペプチドは、1.01よりも小さいPDIを有し、好ましくは1.001よりも小さ いPDIを有する。本発明の核酸縮合ペプチド調製物は、勿論、1.0のPDIを有し得 るので、「単分散」とも呼ばれる。本願で使用する「高い」多分散指数は、1.1 、1.2、1.3よりも大きいPDIを示し、一般に1.1〜2.0の範囲である。 多分散指数は、ポリマー化合物の分子量分布を特徴づけるために用いられる。 均一な分子量の分布を有するポリマー（即ち、ポリマー調製物が均一の分子量を 有する）のPDIは、1.0であり、異種性の高いポリマー調製物（即ち、ポリマー調 製物が広い分布の分子量を有する）に関しては、値は2.0に近づく。 ペプチド調製物の多分散指数は、以下に記載する２つの方法によって決定され 得る：１）ペプチド調製物の光分散および束一性を用いて調製物内のペプチドの 重量および数平均分子量を決定する；または２）エレクトロスプレイ質量分光法 を用いて、所定の調製物内のペプチドの分子量を決定する。２つの方法のうちの 最も正確な方、即ち、エレクトロスプレイ質量分光法に従ってPDIを計算するこ とが本発明には重要である。即ち、PDIを計算する前者の方法は、PDIのおおよそ の見積もりしか提供しない。この方法では、所定のペプチド調製物に関しては、 重量平均分子量／数平均分子量の比が、異種ポリマーに対してそれぞれ、ペプチ ド調製物の光分散および束一性から決定され得る（G．Odian in Principles of Polymerisation，John Wiley and Sons、1981）。このような束一性の１つは粘 性（上述）である。しかし重量および数平均分子量を測定するためのこれらのパ ラメータは、低い多分散性を有するペプチドのPDIの決定に用いるほど正確では ない。なぜなら、これらのパラメータは、PDIのおよその見積もり、即ち、調製 物の各ペプチド成分の質量のわずか１%以内にしか提供しないからである。 1.01より小さいPDIを有するペプチド調製物、即ち、本願に記載する方法によ って合成したペプチド調製物に関しては、精度が調製物の各ペプチド成分の質量 の0.01%および好ましくは0.001%以内となるように、ペプチド調製物におけるペ プチドの長さの非常に正確な測定が提供されなければならない。 本願に開示するポリマーペプチドのPDIは、エレクトロスプレイ質量分光法で ペプチドを分析することによって計算され得る。この方法によると、各成分の正 確な質量が0.001%以内で得られる。本発明で用いられるペプチドの代表的なエレ クトロスプレイ質量分光法データを図2(a)〜(h)に示す。本発明において有用な ペプチド調製物のPDI値は、1.0〜1.01の範囲である。エレクトロスプレイデータ からのPDIの計算を実施例３に示す。本発明において特に有用なペプチド調製物 は、1.01よりも小さいPDIを有し、1.001よりも小さいPDIを有する場合もある。 これとは対称的に、核酸縮合ペプチド調製物のPDI値は、従来技術では1.1よりも 大きいと報告された。 ３）本発明の核酸縮合ペプチドのアミノ酸の長さおよび組成。 本発明による適切な核酸縮合ペプチドは、塩基性ペプチド、即ち、ネット正電 荷を有するペプチド、例えば、2〜50、好ましくは12〜40、およびより好ましく は15〜38のDまたはLアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。 好ましくは、ポリペプチドは、少なくとも30%、より好ましくは50%、および80〜 90%程度のリジン、アルギニン、ヒシジン、オルニチンまたは第二または第三ア ミノ基を有する側鎖を含む非天然アミノ酸などの塩基性アミノ酸を有し得る。 本発明による核酸縮合ペプチドは、好ましくは、本願で定義するように、リガ ンドへの部位特異的結合に対して用いられるシステインおよび／またはスレオニ ンおよび／またはセリン残基を有する、例えば、長さが８〜10個の残基のペプチ ドである。システインおよびスレオニン残基は、リガンドの共有結合の手として 作用し得るように、それぞれＮ末端およびＣ末端に配置されるのが好ましい。 本発明は、全体としてネット正電荷を有するヘテロペプチドの使用を想定して いるが、本発明において有用な核酸縮合ペプチドもまた、ペプチドのアミノ酸組 成物の大部分（例えば、30%〜90%）が、リジンなどの単一の塩基性アミノ酸種で あるペプチドを有する。例えば、約８から約30のリジル残基からの配列を有する ヘテロペプチドは、本発明によると有用である。しかし、リジル残基のホモポリ ーであるペプチドは、本発明によると有用ではない。なぜなら、ホモポリマーポ リリジンは、細胞毒性で、ある条件下で非特異的に細胞表面に付着する傾向があ るからである。従って、本願で想定されるヘテロポリマー核酸縮合ペプチドは、 ポリリジンなどのホモポリマーよりも有利である。 ４）好ましい核酸縮合ペプチドは、αらせんコンフォメーション構造を有する ペプチドまたはポリペプチドである。 NBC7およびNBC11（本願で記載する）が特異的な例であるこのようなペプチド は、αらせんであるコンフォメーション構造を通して相互作用することによって DNAと相互作用するように設計されている。官能基がペプチドと共有結合する場 合、結合体の官能基は、ウイルス様粒子の外面に最適に露出するようにαらせん 構造のターンの周りに配置され得る。 我々は、DNA結合複合体（即ち、官能基に共有結合した本発明のペプチドを有 する結合体と非特異的に結合するDNA）のコンフォメーション構造に注目してき た。関連の分子間相互作用は、特異的にDNAをドッキングし、立体障害が発生し ないように官能部分の位置決めを可能にする硬直した足場を構築することによっ て洗練される。 DNAと特異的に相互作用する多数の蛋白質（例えば、P22 cro、レプレッサ、tr pリプレッサ、Cap等）は、DNAらせんの主要な溝にまたがって位置するαらせん 構造（10個の残基）を通して相互作用する。このαらせんの後には、通常、ポリ ペプチドにおいて逆ターンが続き、これらの蛋白質の特徴であるらせん−ターン −らせんモチーフを形成する。これらの配列がNDAとなす相互作用の大半は、リ ン酸塩および塩基への弱い水素結合である。これは、これらのドメインの機能が 特定の塩基配列を認識し、コンフォメーション変化を誘発することであるからで ある。我々は、このようならせんが、水素結合がイオン相互作用によって置換さ れるように設計されるならば、結合は、ドッキング／宿合ペプチドとして、さら に強力で、我々にとって有用となるであろうという仮説をたてた。 αらせん足場を有するペプチドは以下のように設計される。 10個の残基のαらせんの分子モデル、らせんホイール、およびB-DNAのモデルを 用いると、X1X2-BB-X1X2-BB-X1X2の繰り返し配列モチーフを用いて強力な相互作 用がなされ得ることは明白である。ここで、X1は、主要な溝の一端にあるリン酸 塩と相互作用する塩基性残基であり、X2は、主要な溝の直径方向に対向する他端 にあるリン酸塩と相互作用する塩基性残基である。X1およびX2のいずれかは、例 えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジンである。リジン、アルギニン、お よびヒスチジンは好ましい。なぜなら、両アミノ酸は、１）主要な溝のギャップ を架橋するのに十分なサイズであり、２）リン酸塩と強力に相互作用し、および ３）強力ならせんを形成するからである。残基BBも強力ならせん形成傾向を有す る残基であるならば、ペプチドは、安定したαラセンを溶液内に形成する。 本発明のこの局面による好ましい核酸縮合ペプチドは、以下の一般式で表され る。 ここで、Xは、リジン、アルギニン、2,4−ジアミノ−ブチル酸、ヒスチジン、 およびオルニチンなどの、正に帯電した基を側鎖に有する天然に存在するアミノ 酸もしくは合成アミノ酸、または第二または第三アミン基を有する側鎖を含む非 天然アミノ酸であり、 Yは、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、メチオニンまたはグルタミン、ト リプトファンまたはヒスチジンなどのWiltおよびThornton（1988）J．Mol．Biol 203．2221〜232によって定義されるαらせん形成を促進する傾向が高い天然に 存在するアミノ酸であり、 Z1 〜4は、アスパラギン、グリシン、プロリン、セリン、およびアスパラギン 酸などのWilt Thornton（loc．cit.）によって規定される安定したターン構造を 形成する傾向が高い配列の少なくとも３つのメンバーを有する天然に存在するア ミノ酸であり、 Aは、アルデヒド基の側鎖の過ヨウ素酸による特異的な酸化を可能にし、それ によって、反応性のヒドラジドまたはアミノオキシアセチル官能基を有する他の 分子へのペプチドの結合を可能にするＮ末端セリンまたはスレオニンであり、 Bは、任意のアミノ酸であるが、好ましくは、アラニン、グルタミン酸、また はシステイン、ならびにn=2〜4およびm=2である。 本発明によると、本発明において有用なペプチドは、１つまたはそれ以上の内 部セリン、スレオニン、またはシステイン残基を、好ましくは、露出して選択さ れたリガンドに結合するような配列内の位置に有し得るが、αらせんの正に帯電 した（DNA配向）面には有さない。この選択された反応性アミノ酸残基のペプチ ド内での位置は、これらの残基が、DNAに接触するペプチドの面には接触せずに 、選択され規定された安定性を有する結合によるペプチドと他の官能ペプチドと の結合を可能にするように方向づけられる。システインは、他の反応性チオール 基（ジスルフィドを介した）、アルキル化官能基（チオエーテル結合を形成する ）、またはマレイミド誘導体などの他のチオール反応性基を含む化合物へのチオ ール側鎖を介した特異的な結合を可能にする。「規定された安定性」を有する結 合を以下に説明する。これらの結合は、酸不安定結合（ヒドラジン）またはシト ゾール（ジスルフィド）の還元環境においてあまり安定しない結合などの結合を 含む。このような結合は、合成ウイルス様粒子上に官能基を担持するのに有用で ある。 本発明のこの局面において、ペプチドは、１）らせん形成アミノ酸、２）DNA の主要な溝に接触する繰り返し３次元構造、３）定量に適切な発色団、および４ ）補助官能ドメインを形成するリガンドの部位特異的結合のための多数の「手」 （即ち、反応部位）を含む。このようなペプチドの例としては、NBC7およびNBC1 1が挙げられる。これらのペプチドにおいて、ポジション１におけるスレオニン ンは、グリオキサールに対する酸化、およびオキシム結合を介した結合のために 用いられ、ポジション５および28におけるトリプトファンは、DNAの存在および 不在下において定量を可能にする発色団である。NBC7のポジション９におけるリ ジンおよびNBC-11のポジション９におけるグルタミン酸は、還元アミノ化、ペプ チド結合等を介した部位特異的結合のために用いられ、およびポジション16のシ ステインは、チオエーテルおよびジスルフィド結合を介した結合に用いられる。 NBC7のＣ末端グルタミン酸は、ヒドラジドの改変、およびオキサイウムまたはヒ ドラゾン結合を介した結合に用いられる。 ５）他の好ましい核酸縮合ペプチドは、ヒストンＨ１蛋白質および他のヒトヒ ストンの配列から得られる配列を有するペプチドである。 ヒストンH1は、すべての高等生物において見いだされるヒストンファミリーの 塩基性の高い蛋白質である。このファミリーの大半の他のメンバーとは違って、 シストンH1は、ヌクレオソームの一体的な部分として結集しない。ヒストンH1は 、主として、染色体DNAを結合するクロマチンのヌクレオソーム複合体の伸張部 と相互作用すると考えられる（Allenら、Nature 288（1980）675）。ヒストンH1 は、H1が消耗したクロマチンと同一の塩依存性で裸のDNAと結合する（Kumarおよ びWalker（1980）Nucleic Acids Research 8、3135）。 ヒストンH1蛋白質は、遺伝子療法送達ビヒクルの成分としては有用ではない。 なぜなら、ヒストンH1は、入手しにくく、それ自身の転写の生物学的レプレッサ であるからである。組換えヒストンH1は、組換え方法によって容易に製造され得 ず、蛋白質は、化学的に合成するには大きすぎる。ヒト細胞以外の哺乳類源から H1を精製することは安全性に問題が生じる。トランスフェクション用のプラスミ ドDNAの縮合を促進するためにヒストンH1を用いると、送達された遺伝子の発現 が減少する傾向がある。なぜなら、H1は、過剰なヒストンH1の存在が転写を減少 させる一般的なリプレッサ機構の一部であるからである（Weintraub、H［1985］ 細胞、705〜711、Crostonら［1991］Science 251、643）。 しかし、本発明の核酸縮合ペプチドは、核酸を縮合する能力を有する配列とし て本願で同定されるH1の部分（以下の配列I、IIまたはIII）を含み得る。従って 、本発明の核酸縮合ペプチドは、配列の全長が17個の残基よりも長い、以下の３ つのコンセンサス配列の線形組合せを含み得る。 配列I: ここで、Kはリジン；Pはプロリン；Aはアラニン；Xはセリン、スレオニンまたは プロリン；Yはアラニン、プロリン、またはバリン；Zは、アラニン、スレオニン 、リジン、またはプロリン；Bはリジン、アラニン、スレオニンまたはバリン； およびJはアラニンまたはバリンである。 配列II ここで、Xはアラニンまたはバリン；Kはリジン；Sはセリン；Pはプロリン；およ びAはアラニンである。 配列III ここで、Xはリジンまたはアルギニン；Yはアラニン、バリンまたはスレオニン； Zはプロリン、アラニンまたはセリン；Bはアラニン、リジン、スレオニンまたは バリン；Kはリジン；Pはプロリン；Aはアラニンである。 配列IVは、すべてのヒトヒストン配列からのコンセンサス配列である。 配列IV ここで、Aは、好ましくは、リジンまたはスレオニン；Bは、好ましくは、グリシ ンまたはグルタミン；Cは、好ましくは、グリシンであるが、アスパラギン酸塩 、グルタミン酸塩、またはセリンでもあり得；Dは、好ましくは、グリシンであ るが、リジン、バリン、グルタミン酸塩、またはスレオニンでもあり得；Eは、 好ましくは、リジンまたはアラニンであり；Fは、好ましくは、アラニンまたは リジンであり；Gは、好ましくは、アルギニンであるが、バリンまたはイソロイ シンでもあり得；Hは、好ましくは、アラニンであるが、スレオニン、ヒスチジ ン、またはプロリンでもあり得；Iは好ましくはリジン、アルギニン、またはグ ルタミン酸塩であり；Jは、アラニンまたはアルギニン（Anginine）であり；お よびKは、好ましくは、リジンまたはグルタミン酸塩である。好ましいコンセン サス配列は、 NBC1は、以下の構造を有する： ここで、-Cは、システインであり；ここで、SV40 NLSは、配列Pro-Lys-Lys-Lys- Arg-Lys-Val-Gln-を有する（DingwallおよびLaskey（1991）Trends Biochem．Sc i 16，478）。 従って、本発明の他の好ましい核酸縮合ペプチドは、以下の一般的な配列で表 されるアミノ酸配列を有する： ここで、Xは、不在であるか、セリンまたはスレオニンであり；Yは、上記で定義 した配列I、II、IIIまたはIVであり；nは、２〜６であり；およびCはシステイン である。 特に好ましいペプチドは以下の通りである： NBC2は、構造：NH2-[Seq III]-[SV40 NLS1]−[Seq I]-C-COOHを有し、ここで 、-C-はシステインである。 NBC8は、構造：NH2-[Con Seq I]-[Con Seq I]-C-COOHを有し、ここで、-C-は システインである。 NBC13は、構造：NH2-[Seq I]-[Seq I]-[Seq I]-C-COOHであり、ここで、-C-は 、システインである。 NBC10は、構造：NH2-[Seq I]-[Seq I]-[Seq I]-[Seq I]-C-COOHであり、ここ で、-C-は、システインである。 NBC1またはNBC2ペプチドを用いて調製した合成ウイルス様粒子は、１ml当たり 10μgより多くの塩が存在しないと不溶性である。この為、これらのペプチドは 、粒子処方中に塩が存在するのが好ましい。一般に、粒子がコンフォメーション の観点から純粋であり、ペプチド／DNAの相互作用が安定であるならば、この塩 の効力は、観察されない（電荷を帯びた粒子は互いに反発する傾向がある）。し かし、本発明によると、以下に詳細に記載するように、いくらかの塩が本発明の 合成ウイルス様粒子の処方中に存在しているのが好ましい。 配列NBC8〜10は、NBC2の一部から得られるが、核局在配列を欠失し、繰り返し モチーフ（上記の配列I、IIまたはIII）を有し、このモチーフによって、我々は 、機能に対するペプチドの長さの効力を見ることが可能となる。NBC8では、この 配列は２重に繰り返され、NBC13では、３重に繰り返され、NBC10では、配列は、 ４重に繰り返される。 NBC1〜10の配列は以下の通りである。 これらのペプチドの合成を実施例１および２に詳細に記載する。本願で具体的 に合成を説明していない他の核酸縮合ペプチドは、実質的に実施例に記載するよ うに合成される。 ６）本発明の核酸縮合ペプチドは、１つまたはそれ以上の共有結合した官能基 を含み得る。 本願で使用する「官能基」は、本願で定義するするようにDNA結合ペプチドに 共有結合し、生物学的流体における粒子安定性に対して生物学的な機能、即ち、 細胞への侵入、細胞核へのDNAの送達、または染色体への統合を有する蛋白質、 脂質、または化学基を指す。共有結合は、以下に定義するように、安定または不 安定結合であり得る。官能基がペプチドである場合、共有結合は、ペプチド結合 であるので、融合蛋白質を形成する。 本発明による有用な官能基の例としては、限定はされないが、以下のものが挙 げられる：ａ）ｉ）抗原性蛋白質もしくはペプチド、またはii)標的細胞の表面 に同族レセプターを有するターゲティング分子などのリガンド；ｂ）脂質；ｃ） 中 性親水性ポリマー；ｄ）エンドソーム崩壊剤；ｅ）酵素；およびｆ）核への分子 内走行（trafficking）を促進する因子。 ａ）リガンドである官能基 リガンドは、細胞によって異種（例えば、樹脂状細胞）として認識される抗原 性蛋白質またはペプチドを含むため、細胞による合成ウイルス様粒子の取り込み を促進する。リガンドはまた、標的細胞の表面上に同族レセプターを有するター ゲティング分子であり得る。例えば、リガンドの例としては、限定はされないが 、抗体；レクチン；単糖類またはオリゴ糖類、例えば、マンノース、ガラクトー ス、フコース、およびシアル酸などの糖類；トランスフェリン、およびアシアロ グリコプロテインが挙げられる。例えば、細胞を標的とする抗体としては、限定 はされないが、ケラチノサイトを標的とする抗インテグリン類、上皮細胞を標的 とする抗E-セレクチン、Ｔ細胞を標的とする抗CD2、CD4またはCD8、単核細胞／ マクロファージ／樹脂状細胞前駆体を標的とする抗CD33、マクロファージを標的 とする抗HLAクラスII（一定領域）、Ｂ細胞および活性化樹脂状細胞、Ｂ細胞を 標的とする抗CD80、CD19またはCD22が挙げられ、癌細胞を標的とする抗体として は、限定はされないが、大腸癌および乳癌に対する抗PEM（多形上皮mu in）、抗 CEA（胎児性癌抗原）結腸直腸腫瘍、メラノーマに対する抗MAGE、および肺癌お よび乳癌に対する抗EGFR-!（上皮成長因子レセプター−１）が挙げられる。 本発明による有用なターゲティングリガンドは、標的細胞型上の特異的なリガ ンドを認識し、高い特異的な親和性（即ち、Ka=<10nM）で、リガンドに結合する 。実際には、最も有用なターゲティングリガンドは、インシュリンまたは上皮成 長因子などのモノクローナル抗体またはレセプター分子であるか、あるいはE-セ レクチン結合ドメインなどのレセプター結合分子の結合ドメインである。 本発明による有用なターゲティングリガンドの１つのタイプは、インシュリン レセプターを発現する細胞に合成ウイルス様粒子を方向づける蛋白質ホルモンイ ンシュリンまたはインシュリンの誘導体を含み、インシュリンまたはインシュリ ン誘導体は、核酸縮合ペプチドに結合すると、レセプター結合特性を保持する。 インシュリンおよびインシュリン誘導体を結合したペプチドの合成を実施例１、 ６および７に記載し、標的化遺伝子をインシュリンレセプターを有する細胞に転 移するためのこのようなペプチドの使用を実施例６に記載する。 合成ウイルス様粒子から標的細胞への核酸の転移効率は、合成ウイルス様粒子 におけるリガンドの密度に依存し得る。エンドサイトーシスを誘発するレセプタ ー−リガンド相互作用は、通常、膜結合レセプターの初期オリゴマー化を伴う。 従って、本願に記載する合成ウイルス様粒子は、結合レセプターを細胞表面に密 集させるのに有効な量で用いられるのが好ましい。このような密集を成し遂げる １つ方法は、実施例６に記載するように、密集したモノクローナル抗体などの密 集したリガンドを含むペプチドを合成することである。 ターゲティングリガンドはまた、核酸縮合ペプチドのアミノ酸のアミノ基に直 接結合した糖残基、または、例えばPEG官能基を介してペプチドに間接的に結合 した糖残基であり得る。このような誘導体の合成および使用を実施例１、６およ び11に記載する。 ｂ）本発明の官能基はまた脂質を有するので、本発明のペプチドと結合すると 、脂質から誘導された核酸縮合ペプチドを形成する。 本願で使用する用語「脂質」は、水には不溶性で、アルコールには溶性の４〜 30個の炭素分子を指す。この用語は、脂肪、脂肪油、精油、ワックス類、ステロ ール類、コレステロール類、ホスホ脂質類、スルホ脂質類、アミノ脂質類、クロ モ脂質類、および脂肪酸を含む。核酸縮合ペプチドは、本発明により、例えば、 脂肪酸の活性化エステルなどの脂質で縮合することによって特異的に改変され得 る。脂肪酸は、理想的には、パルミチン酸、ジオレオイルホスファチジルエタノ ールアミンなどのオレイン酸、ミリスチン酸、またはコレステロールのいずれか であるが、ステアリン酸などの他の脂肪酸も用いられ得る。Ｎ−パルミトイル− NBC2（Lip 2）の合成例を実施例１および７に提供し、遺伝子転移におけるその 使用を実施例７に記載する。合成ウイルス様粒子のトランスフェクション効率に 対する脂質成分の存在の効力は、非常に大きく（図17〜図23に示す結果を参照） 、活性は40倍より大きく増加する。この現象は、カチオン性脂質を用いたDNAト ランスフェクション中に観察される効力とは無関係であり、ここで、活性は複合 体中のカチオン脂質のレベルに比例し、トランスフェクションに必要なリガンド 密度は、本発明による遺伝子転移に必要なリガンド密度よりも数オーダ（例えば 、 10x〜100ｘ）高い。 コレステロールは、実施例１に示す炭素環構造を有する脂質を指し、基を結合 した誘導体を有する。 粒子または粒子処方物に脂質化ペプチドが存在することによって与えられる１ つの利点は、退化に対する粒子の抵抗である。粒子処方物内に脂質化ペプチドが 存在すると、ヒトプラズマによる活性化に対してより高い抵抗が与えられる。実 施例７に示す実験は、粒子処方物内に脂質化ペプチドが存在することによって、 合成ウイルス様粒子がトランスフェクション培地内の種々のレベルのヒトプラズ マに曝された後トランスフェクションの相対的なレベルを増加させる（図23）。 c)中性親水性ポリマーである官能基 ポリカチオン−核酸錯体の溶媒和および安定化についてはほとんど知られてお らず、現在までの文献のほとんどは、静電相互作用の重要性ならびに対イオンの 性質および濃度に集中している（例えば、Garcia-Ramirezら(1994)、Biopolymer s、34、285-292；MistraおよびHonig(1995)、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.、 92、4691）。タンパク質の場合には、溶媒和および溶媒添加物がタンパク質構造 体の安定性にどのように影響を与えるかについての理論は進展している（上記の Arakawaら(1993)1-28；Timasheff(1992)、Stability of Protein Pharmaceutica ls Part B、265-285頁）。これら安定化添加物の作用の理論は、安定化はタンパ ク質と溶媒添加物との熱力学的に好ましくない相互作用によってもたらされると いうことである。タンパク質表面が安定化添加物をその表面に隣接する部分から 排除するこの傾向は、選択的水和または負の結合と呼ばれる減少である。すなわ ち、タンパク質表面近くでのこの添加物の濃度は、バルク溶媒中の濃度よりはる かに低い。従って、タンパタ質が変性または展開されると、溶媒と接触するポリ ペプチドの表面積は極めて大きくなる。タンパク質と接触する溶媒層からの溶媒 添加物の優先的な排除は明らかに表面積に比例する。従って、天然の状態から優 先的に排除する必要のある溶媒添加物の量は変性（拡張）状態の場合より少ない ので、天然の緻密な状態の方が変性状態より好ましい。この効果を有する化合物 は、タンパク質との強い極性またはイオン性相互作用を持たず、強い水素結合機 能性を持たず、また非極性分子を排除する傾向を有するものである。このよう な化合物は、糖のようなポリオール、グリセロール、ならびにポリエチレングリ コール、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ヒ ドロキシプロピルセルロース、プルラン、ポリオキサマ、ポリオキサミン、ポリ ソルベート、およびポリ(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドのような親水 性ポリマーである。 核酸の縮合についての文献の多くは、イオン強度の凝集およびサイズに及ぼす 影響に集中している(Garcia Ramierez、同書；Ferkol、WO 95/25809)。塩の存在 下でカチオンとDNAとを混合することによって得られる縮合の程度は、通常は、 天然のクロマチンにみられる縮合の程度に達しない。本発明者らは、DNAの縮合 の増大は、タンパク質構造体の安定化の理論をカチオン−DNA相互作用に適用す ることによって得られると仮定した。すなわち、多価カチオンがDNAの高い負電 荷密度を中性化させると、DNAらせんを確実に拡張させる静電反発力が消滅し、 複合らせんのセグメント間の疎水性相互作用が優勢となるに従ってDNA構造体が 崩壊する（縮合する）。DNAらせんの長さおよび剛直度が一定の場合、崩壊した 状態のDNAのパッキング密度を増大させる力が依然として存在し得る。 本発明者らは、疎水性ポリマー（ポリエチレングリコール[PEG]、プルロニッ クポリオール、ポリビリルアルコール、ポリビニルピロリジン）のような疎水性 表面の表面から除去される共溶媒を使用することにより、核酸コンパクションの レベルが高くなり、凝集が低減し、処方が安定し、従って粒子の全体的なサイズ が小さくなると仮定した。これは実験により観察された。 本明細書においては、用語「中性親水性ポリマー」は、本発明のペプチドとの 共溶媒として作用するポリマー分子を含み、これらには、糖のようなポリオール 、グリセロール、ならびにポリエチレングリコール、メチルセルロース、ポリビ ニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ヒドロキシプロピルセルロース、プル ラン、ポリオキサマ、ポリオキサミン、ポリソルベート、およびポリ(2-ヒドロ キシプロピル)メタクリルアミドのような親水性ポリマーが含まれる。このよう なポリマー分子は、分子量が1000〜100,000、好ましくは1000〜50,000、最も好 ましくは5000〜10,000の範囲のものである。 「中性親水性ポリマー」は本明細書では２つの形態で用いられる。すなわち、 中性親水性ポリマーは、本発明では、直接または間接に、本発明で有用なペプチ ドと共有結合する官能基として使用され得るか、または合成ウィルス様粒子（下 記参照）の処方中に共溶媒として使用され得る。いかなる理論にも拘束されない が、本発明の中性親水性ポリマーを上記のいずれかで使用すると、核酸コンパク ションが向上し、全体的なサイズが小さくなり、合成ウィルス様粒子の安定性が 高くなり、従ってターゲット細胞に対する粒子の形質移入の効率が向上すると考 えられている。 中性親水性ポリマーはペプチドに結合され得、従って、実施例で詳細に述べる ように、官能基として提供され得る。 d)エンドソームの破壊剤である官能基 本発明で有用な官能基は、細胞による合成ウィルス様粒子の取り込みを促進す るように働くリガンドを含む。例えば膜構造体を破壊することによって、分子の 細胞への取り込みを促進する能力を有する多くのペプチド分子が当該分野で知ら れている。このようなペプチドのなかで合成ウィルス様粒子にとって最も有用な ペプチドは、インフルエンザウィルスからのHAペプチドのような、pHに依存して 立体配座が変化するものである。このようなペプチドの構造および合成について は実施例８に示す。 本発明で有用なフソジェニックペプチドは以下の通りである。センダイウィル スからのフソジェニックペプチドは以下のアミノ酸配列を有する： H-Phe-Phe-Gly-AIa-Val-Ile-Gly-Thr-Ile-Ala-Leu-Gly-Val-Ala-Thr-Ser-Ala-Gl n-Ile-Thr-Ala-Gly-Ile-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Arg-Glu-Ala-Lys-Arg-OH（D．Rap aportおよびY．Shai、J．Biol．Chem.、1994、263、15124-15131）。HIV gp41タ ンパク質からのフソジェニックペプチド配列： H-AIa-Val-Gly-Ile-Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Th r-Met-Gly-Ala-Arg-Ser-OH（M．Rafalaski，J.D.およびW.F．DeGrado、Biochemi stry、1990、29、7917-7922）。 パラダキシンからのフソジェニックペプチド配列： H-Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Pro-Lys-Ile-Ile-Ser-Ser-Pro-Leu-Phe-Lys-Thr-Le u-Leu-Ser-Ala-Leu-Ser-Ser-Ser-Gly-Gly-Gln-Glu-OH（D．Rapaport、G.R．Hagu e、Y．PounryおよびY．Shai、Biochemistry、1993、32、3291-3297）。メリチン からのフソジェニックペプチド配列： H-Glｙ-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-S er-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2（C.R．Dawsonら、Biochem．Biophys ．Acta:1978、510、75）。 フソジェニックペプチドが細胞による合成ウィルス様粒子の取り込みを促進さ せると考えられるメカニズムは以下の通りである。中性のpHでは、ペプチドはラ ンダム構造を有し、細胞膜との相互作用はほとんどまたは全くない。ペプチドは 、拡散によって、または好ましくはウィルス様粒子の一部として運ばれることに よってエンドソームのコンパートメントに入る。エンドソームのpHが低下すると 、HAペプチドはαらせん構造またはその凝集体を形成し、これらはエンドソーム の膜に入りその完全性を破壊する。 e)本発明の官能基は酵素であり得る 本明細書では、酵素は、本発明の核酸縮合ペプチドに共有結合すると、共有結 合の破壊および再編成を伴う生物活性を顕し得る分子として定義される。このよ うな官能基の例としては、実施例９で述べるように、組み換えDNAの細胞DNAとの 組み換えを促進するリコンビナーゼまたはインテグラーゼ、もしくは細胞内輸送 酵素、またはセヨウワサビペロキシダーゼのようなリポーター酵素が含まれる。 f)本発明の官能機は核局在化配列であり得る 本発明で有用な核局在化配列としては、上述のSV40 T抗原の短い塩基性NLS； ヌクレオプラスミンの二裂NLS；リボ核タンパク質配列A1、核の小さいリボ核タ ンパク質配列U1A、およびヒトT-リンパ増殖性ウィルス-1Taxタンパク質；HIVマ トリックスタンパク質NLS；ならびに核転座成分importin/hSRP1およびRan/TC4が 含まれる。本発明で特に使用されるものは、ProまたはAlaを両側に持つ核局在化 コンセンサス配列KXX(K/R)（Roberts(1989)、Biochem．Biophys．Acta、1008、2 63、本明細書において参考として援用）、またはヌクレオプラスミンの核局在化 配列（DingwallおよびLaskey、Trends in Biotech.、16、478(1991)）、または アンテナペディアからのNLS（Derossiら、Jour．Biol．Chem.、269、10444(1994 )）である。 従って、本発明はまた、核タンパク質の輸送という天然の機能を有する非塩基 性の核局在化配列に結合される核酸縮合ペプチドを包含する。このような配列は 、ウィルス、例えばインフルエンザ核タンパク質（Daveyら、Cell、40、667(198 5)）、HIV MAタンパク質（Gallayら、Cell、80、379(1995)では知られている。 核タンパク質輸送配列はまた、リボ核タンパク質錯体、例えば、hnRNP A1タンパ ク質（SiomiおよびDreyfuss J.、Cell．Biol.、129、551(1995)）を輸送するタ ンパク質内にも生じる。hnRNP A1のM9核局在化配列に結合する核酸縮合ペプチド (NBC2)の合成については実施例10で述べる。 核局在化配列は、官能基として本発明の核酸縮合ペプチドに共有結合し得るか 、または融合タンパタ質としてペプチドボンド結合を介して核酸縮合タンパク質 の配列内に存在し得る。 本発明で特に有用な核酸縮合配列は、核酸縮合ドメインだけではなく、媒体の 輸送を核に向ける核局在化配列も含む。このような核酸縮合ペプチドの例として は、本明細書に示すNBC1およびNBC2があり、これらは、実施例１および２に示す ように、ペプチド配列内にSV40 T抗原の核局在化配列を含む。実施例10は、縮合 ペプチドとしてNBC2を使用すると、NBC5を使用する場合より形質移入活性が高い ことを示す。NBC5は、NLSが配列のこの部分のアミノ酸配列を反転させることに よって不活性化されたということを除いては、NBC2と同じ構造を有する。異なる 配列、例えばNBC2（核局在化配列を含む）とNBC9（核局在化配列を含まない）と を有するペプチドを組み合わせることは、本発明の範囲内である。 官能基の核酸縮合ペプチドへの結合 官能基と共役する本発明の核酸縮合ペプチドは、所望であれば、ペプチドと官 能基とが細胞表面および細胞内に会合し得るほどに安定しているボンドを介して 共役され得る。 本発明では、以下のタイプの結合が考えられる。 １．安定結合 ボンドの安定性が重要な変数ではないときは（例えば、塩基性ポリマー単位 の重合化）、安定結合が好適である。好適な安定ボンドはアミド、チオエーテル およびオキシムである。 P-C=N-0-NBC オキシム P-S-CH2-NBC チオエーテル Ｐは上記の官能基のいずれかであり、NBCは核酸縮合ペプチドである。チオエ ーテル結合成分の合成については実施例６に示す。アミド結合は、アルデヒドと アミノ化合物との反応によって形成されるシフ塩基ボンドの還元によって形成さ れ得る。この合成の例は実施例６に示す。 ２．酸非安定性結合 エンドサイトーシス後は、官能基もフソジェニックペプチドも合成ウィルス様 粒子に結合したままである必要はない。粒子が細胞内に入ると、新しく形成され たエンドサイトーシスのベシクルは急速に酸性化し、pH非安定性ボンドの構造体 内への取り込みを用いてこれらの成分を粒子から除去することができる。好適な pH非安定性結合は非還元ヒドラゾンボンドである。ヒドラゾンボンドは、アルデ ヒドの置換ヒドラジドとの反応によって容易に合成される。 P-CH=NNH-NBC ヒドラゾン このような構造体の合成については実施例６および８に示す。プロテアーゼで 切断可能な酸性非安定性結合の合成については実施例８で述べる。 ３．還元可能な結合 哺乳類の細胞のサイトゾルは、還元グルタチオンの合成によって純還元状態下 に保持される。従って、分子がサイトゾルに吸収されるとジスルフィドは切断さ れる。よって、この結合は、細胞内に入った後はその機能は必要とされない合成 ウィルス様粒子（例えば、ターゲティングタンパク質またはフソジェニックペプ チド）へのペプチドの結合にとっては有用である。ジスルフィド結合は、2-ピリ ジル基により活性化されたチオール残基を用いることによって容易に合成される （Carlssonら、Biochem．J.、173、723-737(1978)）。 P-S-S-NBC ジスルフィド結合 このような成分の合成の例については実施例６および８に示す。 線形または分枝鎖ポリマー 合成ウィルス粒子は、以下の式によって一般的に示される線形または分枝鎖ポ リマーのいずれかを含み得る。 ここで、Ｐはタンパク質、ペプチド、または他の化学物質、ｂは１〜20であり、 Ｐは以下の群のうちのいずれか１つに属する。 (1) ターゲット細胞の表面の構造体と特異的に相互作用するターゲティングタ ンパク質またはペプチド (2) 膜構造体（プラスマ、エンドソーム、または核）の浸透を促進するかまた は細胞成分と相互作用して核への輸送を向上させるタンパク質、ペプチド、また は他の化学物質と組み合わせた（すなわち共役した）上記(1)。 (3) 上記(2)に示した薬剤を用いてまたは用いないで脂質誘導体と組み合わせた （すなわち共役した）上記(1)。 (4) インテグラーゼまたはリコンビナーゼ酵素、もしくは錯体の核への輸送を 向上させるかまたはDNAの統合を補助する他の酵素機能のような送達された遺伝 子材料の発現を向上させるタンパク質、ペプチド、または他の化学物質と組み合 わせた上記(1)、(2)、または(3)。 Xaは、核酸に結合し得るモノマー単位を含有するアミノ酸配列または他の生物 配列を含み、好ましくは少なくとも１つの核局所化配列を含有する核酸結合成分 であり、ａは１〜５である。 Ｌはアミド、ヒドラゾン、還元ヒドラゾン、ジスルフィド、チオエーテル、ま たはジスルフィドボンドを含むリンカ配列である。リンカ配列は脂質またはポリ エチレングリコールであり得る。 Ｙは(-CH2)1であり、ｔは１〜６、好ましくは１〜５である。 R1は-OH、-NH2、またはO(CH2)nCH3であり、ｎ＝０、１〜３である。 ここで、分枝ポリマーでは、Ｐ基を含む第２鎖は第１鎖と同じであるかまたは 第１鎖とは異なる。 本発明の合成ウイルス様粒子の特性。 １）総電荷 本発明の合成ウイルス様粒子は、以下のような総（正味の）電荷を有する。特 定の細胞タイプを標的するように設計され、そのために標的リガンドを含む合成 ウイルス様粒子は、0.5〜3.0の範囲、より特定すると0.2〜2.0の範囲、そして最 適には0.8〜1.2の範囲の総電荷を有する。特定の細胞タイプを標的しないが、広 範囲の細胞タイプをトランスフェクトするように設計された粒子は、0.5〜5.0の 範囲、より特定すると1.0〜3.0の範囲、そして最適には1.3〜3.0の範囲の総電荷 を有する。 合成ウイルス様粒子の総電荷（すなわち、正および負の電荷種類のバランス） は、以下のように決定される。粒子の核酸成分内に存在するリン酸塩残基のモル 数は、縮合反応において用いられるＤＮＡの量に基づいて推定される。 縮合反応内のnMリン酸塩=(μg DNA/0.62)×2 （１塩基対の平均分子量=620とする。） 各ペプチドの正帯電基モル数は、縮合ペプチドとＤＮＡに添加された共役体の 質量に基づいて計算される。 nM正帯電基=(μgペプチド／分子量×10-3)×配列内の正電荷の数 帯電率は従って、 ＝Σ(nM正帯電基)n/nMリン酸塩 但し、ｎは縮合反応中の各構成ペプチドである。 異なる電荷を有するペプチドの核酸縮合活性および異なる帯電率を有する合成 ウイルス様粒子のトランスフェクション効率を実施例４に示す。様々な正／負帯 電残基割合の量を含む粒子のトランスフェクション効率を実施例７に提示する。 高効率トランスフェクションは、標的リガンドを含んでおらず従って特定の細胞 タイプに対して標的されない、本発明の粒子を用いて得られ得る。このような粒 子は、正／負電荷の割合が1.25を越えるトランスフェクションに対して高効率で ある。 ２）全体のサイズ 本発明によると、ウイルス様粒子のサイズが５nM〜500nMの範囲に入ることが 好適である。粒子サイズが500nMを越えると、細胞による粒子の取り込み効率が 急激に減少する。これは、与えられた細胞タイプ内のエンドソーム管孔のサイズ によると考えられる。粒子サイズは、レーザ光散乱または原子間力顕微鏡または 電子顕微鏡によって測定される。そのため、本発明の粒子のサイズは、細胞タイ プおよび与えられた細胞タイプのエンドソーム管孔のサイズに依存して変化する 。 ３）核酸縮合ペプチド／核酸分子の割合 本発明の合成ウイルス様粒子は、粒子内の核酸分子の数に対するペプチドの数 の割合が10/1〜1,000,000/1の範囲内である。この割合は、ペプチドと核酸分子 との相対的なサイズ、ペプチドの縮合活性度、および核酸が達成する縮合度に依 存する。より特定すると、範囲は、100/1〜10,000/1である。例えば、８kbベク ターと組み合わされたＮＢＣ２の場合、細胞へのベクターの標的されない送達の 使用率は、約5000:1（分子の相対的数）である。８kbべタターと組み合わされた インシュリンに結合されたＮＢＣ２の場合、細胞へのベクターの標的された送達 の使用率は、約1000:1である。核酸が例えば長さ10〜50ヌクレオチドのオリゴヌ クレオチドである場合、ペプチド／オリゴヌクレオチドの割合は、0.1〜10.0の 範囲であり、好適には0.5〜1.0である。 本発明の合成ウイルス様粒子の処方 １）粒子の調製 本発明の合成ウイルス様粒子は、核酸およびペプチド調製物が同量の同一の緩 衝液中で調製されるように、処方される。縮合ペプチド調製物が１分当たり0.1 ボリュームの速度で添加されている間に、核酸が攪拌される。複合体は、標的細 胞に添加される前に、室温で約30分間放置され、４℃で貯蔵され得る。粒子は、 凝集性物質を除去するために遠心分離され、その後遺伝子移送のためにアッセイ される。 薬学的試薬として用いるために、核酸／ペプチド複合体は、室温で30分間放置 された後、無菌0.2μフィルター、例えば親水性ナイロン膜フィルターを介して 濾過されることが好適である。本明細書に記載する合成ウイルス様粒子の濾過は 、歩留まりを大幅に減少させることはなく、実際しばしば粒子の100%回収という 結果になる。 標的細胞への効率的な核酸の移送のためには、本発明の粒子が高度に縮合され た核酸を含むことが重要である。本発明において有用な核酸縮合ペプチドの縮合 特性は、本明細書において詳細に開示される。核酸縮合が、効率的な遺伝子移送 を可能にするに十分な程度で起こったか否かを評価するために、粒子内に存在す るペプチドの、核酸を縮合させる能力を評価するゲルリタデーションアッセイが 行われ得る。ゲルリタデーションアッセイは以下のように行われる。 （ｉ）以下の方法を用いて、共役体またはペプチドが、ＤＮＡを縮合させる能 力に関してアッセイされる。 核酸の濃度が、例えば20、30または40μg/mlおよび可能性として50、60、70ま たは100μg/mlに選択され、低塩緩衝材、例えば150mM NaCl中で調製される。 １つの実施の形態において、ＤＮＡの必要量は、150mM NaCl、25mM HEPES、pH 7.4、または0.6M NaCl、25mM HEPES、pH7.4中において20μg/mlまでにされ、マ ルチウェルプレート上のウェル間でアリコートされる。0.1〜5.0の正帯電リン酸 塩の割合を与えるに必要な共役体またはペプチドの量が計算される。これは、15 0mM塩化ナトリウム、25mM HEPES、pH7.4または0.6M塩化ナトリウム、25mM HEPES 、pH7.4のいずれかにおいて、ＤＮＡアリコート(0.05〜0.5ml)と同量までにされ る。共役体またはペプチドが１分当たり0.1ボリュームの速度で添加されている 間に、ＤＮＡを含むプレートがプレート振とう器上に載置されて振と うされる。縮合ペプチドの添加が完了すると、溶液は室温で少なくとも30分間イ ンキュベートされる。各正帯電リン酸塩の割合のサンプルは、アガロースゲル上 で電気泳動にかけられる。ゲルは、臭素エチジウムで染色されて紫外光下で視覚 化される。縮合ＤＮＡは、ゲルのウェル内に残っており、電界内を移動すること はない。 遊離ＮＢＣ２およびモノクローナル抗体-ＮＢＣペプチド共役体の、核酸を縮 合させる能力を実施例４に記載する。 （ｉｉ）本発明の合成ウイルス様粒子のトランスフェクション効率 合成ウイルス様粒子は、末端血液細胞に遺伝子を移送する能力に関してアッセ イされる。トランスフェクション効率を決定することを目的とした研究の場合、 プラスミドＤＮＡは、ファイアーフライルシフェラーゼ用のマーカー遺伝子を含 む。薬学的適用のために、プラスミドは、その発現が好適な治療上の効果を有す る遺伝子を含む。粒子は血液細胞でインキュベートされ、混合物は、所望であれ ば、エレクトロポレーションに曝され得る。更なるインキュベートの後、細胞は 溶解されて、遺伝子発現のためにアッセイされる。ルシフェラーゼレポーターの 場合、溶解された細胞にルシフェリンおよびＡＴＰが添加され、発された光がル ミノメーターで測定される。 細胞は、アッセイの日に、室温で５分間1200rpmで遠心分離することにより収 集される。細胞ペレットは、リン酸緩衝食塩水中で再懸濁されて再び遠心分離さ れる。この動作は、２回行われる。細胞ペレットはその後、RPMI 1640(Gibco Lt d.)内で懸濁されて1ml当たり2.7×106細胞の懸濁液を生成する。その後細胞は管 にアリコートされて、0.75ml RPMI培地が添加され、次いで0.04〜0.08mlの１mM フソゲンペプチドまたは好適には100mMクロロキンが添加され、そして最後に0.2 5ml ＤＮＡ複合体溶液が添加される。トランスフェクションはその後、細胞を37 ℃で４時間インキュベートすることにより進行することが可能になる。その後、 細胞は、2000rpmでの遠心分離により収集される。細胞はその後、1ml RPMI中で 懸濁され、再び遠心分離される。最後に、細胞は、10%ウシ胎児血清を含む0.5ml RPMI中で懸濁される。この段階において、必要であれば、細胞は、従来のエレ クトロポレーションを用いて、300V、250μFでエレクトロポレートされ る。 トランスフェクトされた細胞懸濁液の各0.5mlは、1.5ml RPMI 10% FBSを含む １２ウェルプラスチック培地プレートのウェルにトランスフェクトされる。元の トランスフェクション管は、さらなる1ml培地で洗浄され、洗浄水は培地皿に移 送されて最後の３mlを生成する。その後、培地プレートは37℃で24〜72時間、5% CO2雰囲気中でインキュベートされる。培地皿内の各ウェルの内容物は、遠心分 離管に移送されて、細胞は13,000rpmの遠心分離により収集される。ペレットは0 .12ml Lysis緩衝液（100mMリン酸ナトリウム、pH7.8、８mM MgCl2、１mM EDTA、 1%トリトンX-100および15%グリセロール）中で再懸濁されて、ピペットで攪拌さ れる。溶解物は13,000rpmで１分間遠心分離されて、上澄みが収集される。80μl の上澄みがルミノメーター管に移送される。次いで、ルシフェラーゼ活性が、Be rthold Lumat L9501ルミノメーターを用いてアッセイされる。用いられるアッセ イ緩衝液は、10mMルシフェリンおよび100mM ATPを含むLysis緩衝液である。ルシ フェラーゼにより生成された光は、４秒に亘って積分され相対的光ユニット（Ｒ ＬＵ）と記載される。データは、溶解物のＲＬＵ/ｍｌ、ＲＬＵ/細胞またはＲＬ Ｕ/mgタンパク質（この場合、BioRAD Lowryアッセイにより、溶解物のタンパク 質濃度が決定されている）に変換される。 本発明の様々な合成ウイルス様粒子の、異なる細胞株へのトランスフェクショ ン効率を実施例５、６、７、９、10、13および15に記載する。 ２）粒子形成の化学量論：予め選択された割合の官能基を含む粒子の処方 合成ウイルス様粒子が、２つの異なる縮合ペプチド調製物、例えば、標的リガ ンドが結合された第１のペプチド調製物およびエンドソーム分裂ペプチドが結合 された第２のペプチドと組み合わされた核酸を含む場合、粒子は、３つのコンポ ーネントを共に、選択された割合で、室温で30分〜24時間インキューベートする ことにより処方される。コンポーネントの割合は、粒子内において所望される官 能基の割合（この場合は、標的リガンド／エンドソーム分裂ペプチドの割合）に よって選択される。従って、官能基の与えられた割合が与えられた細胞タイプの トランスフェクションにとって特に効果的であることが決定された場合、ウイル ス様粒子内に存在する基の割合は、官能基を含むペプチドの処方物に対する化学 量論的追加に基づいて予め選択され得る。 例えば、選択された官能基が脂質である場合、粒子内に存在する脂質の量は、 粒子処方物に対する、脂質が結合したペプチドの化学量論的追加によって変化し 得る。 本発明によると、粒子処方の化学量論が、１以上の官能基が単一のペプチド上 にある、または単一の官能基が単一のペプチド上にあるペプチド調製物を組み合 わせることにより変化し得る。従って、前者の場合、ペプチド調製物は、単一の ペプチド上に存在する２つの官能基を１/１の割合で送達する、または単一のペ プチド上に存在する３つの官能基を１/１/１または１/２/１（等）の割合で送達 する、粒子生成混合物に添加され得る。さらに、第２の調製物が、例えば第３／ 第４／第５の官能基を混合物に送達する粒子形成混合物に添加され得る。当業者 であれば、これらの官能基の相対的割合を予め選択する。 また、後者の場合は、各ペプチドが単一の官能基を含んでおり、粒子生成混合 物に添加される各ペプチドの量は、ペプチドに結合する官能基の添加の化学量論 を決定する。 また、ＤＮＡは、縮合ペプチドの予め選択された化学量論で縮合され、約30分 間インキュベートされ、次いで官能基を含む第２のペプチドが縮合された複合体 でインキュベートされ得る。 ３）本発明の合成ウイルス様粒子の、中性親水性ポリマーによる処方 本発明の合成ウイルス様粒子は、より安定し、より小さい粒子を形成し且つト ランスフェクション効率を高めるために、中性親水性ポリマーで処理され得る。 このようなポリマー分子は、1000〜100,000の分子量の範囲、好適には1000〜50, 000の分子量の範囲、そして最も好適には、5000〜10,000の分子量の範囲内であ る。本発明によると、このような分子は、与えられた処方物中の濃度が0.5%〜10 .0%の範囲、好適には0.5%〜5.5%の範囲、そして最も好適には1%〜2%の範囲にあ るときに最も有用である。 中性親水性ポリマーは、本発明のこの局面において、以下の合成ウイルス様粒 子を処方する手順で用いられる。 合成ウイルス様粒子は、予め選択された縮合ペプチドを選択された量の中性親 水性ポリマーと組み合わせることにより調製される。所望であれば、生理的（す なわち、等張性）レベル（例えば、0.15M）の塩が処方のこの段階で含まれる。 次いで、核酸が混合物に添加されて、化合物を室温で少なくとも１時間インキュ ベートすることが可能になる。ウイルス様粒子はこの間にアセンブルされる。し かし、所望であれば、混合物は、24〜48時間もの長期間インキュベートされ得る し、あるいは一晩低温（４℃）で貯蔵され得る。 粒子処方中に混合物に添加される中性親水性ポリマーおよび塩の量は、実施例 12で述べるように、そして実施例５、７、13および15に記載の指示を用いて、概 して以下のように決定され得る。 粒子は、１μg ＤＮＡ当たり２μgの縮合ペプチドを、ＤＮＡ濃度100μg/mlで 組み合わせることにより調製され得る。異なる濃度の中性親水性ポリマーが各々 、選択された塩濃度で、テスト用に選択される。例えば、テストすべき中性親水 性ポリマーの濃度は、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、4,0%、および5.0%のオーダーで あり得、選択された塩濃度は、0.2M、0.4M、0.6M，0.8Mおよび1.0Mであり得る。 まず、ペプチドが中性親水性ポリマーおよび100μl 25mM HEPES緩衝液、pH7.4と 化合される。10μgの核酸が少量（数μl）添加される。ペプチドは、一晩４℃で 貯蔵される前に室温で１時間生成されることが可能になり、翌日バイオアッセイ 用に用いられる。本発明による好適な中性親水性ポリマーは、PEGであり、好適 は濃度は１〜２％である。好適な塩は、塩化ナトリウムであり、好適な濃度は約 0.4Mである。 粒子処方物中に用いられる核酸および塩の量は、以下のように決定し得る。い くつかの異なる濃度の核酸（例えばDNA濃度（100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml 、750μg/mlおよび1000μg/ml）など）を、各々異なる塩濃度で（例えば0.4M、0 .6Mおよび0.8M Nacl）選択する。要するに、20μgのペプチドを中性親水性ポリ マー（例えば２%PEG 8000など）と混合し、そして選択された塩濃度を、25mM HE PES pH7.4中に混合する。ペプチドの濃度は、DNAおよびペプチドの添加の後に、 最終ペプチド濃度200、500、1000、1500または2000μg/mlが可能になるようにす る。次に、10μgのDNAを各混合物に加え、よく混合する。所望ならば、追加的な ペプチド（例えば脂質化(lipidated)形態の）を加え混合する。次に、混合物を 室温で１時間放置した後、４℃で一晩保存する。次に、翌日、粒子をトランスフ ェクション効率についてアッセイする。 塩濃度0.4Mにおいて、粒子の組み立て(particle acssembly)に好適な核酸濃度 は、100μg/ml以下である。より高い核酸濃度においては、0.6M NaClが最適であ る。本発明の粒子のトランスフェクション効率は、処方物中のDNAが500μg/mlを 越えると、減少する。 中性親水性ポリマー（例えばポリエチレングリコール(PEG、mw範囲2000〜15,0 00)）は、（１）合成ウィルス様粒子の形成中または（２）粒子の形成後および 粒子のトラスフェクション培地への希釈中のいずれかにおいて、１〜10％の濃度 範囲(w/v)で存在し得る。トランスフェクション効率は、中性親水性ポリマーの 存在によって有意に増加することが見いだされた。 実施例５、７、１２、１３および１５において、中性親水性ポリマーを含有す る合成ウィルス様粒子処方調製物を用いた、哺乳動物細胞のトランスフェクショ ン効率を表す実験結果を示している。 ４）エンドソーム分裂(endosomal disruption)を容易にする薬剤の存在下にお ける、本発明の合成ウィルス様粒子の処方 エンドソーム分裂剤、例えば遊離フソジェニック(fusogenic)ペプチドまたは クロロキンなどの存在下において合成ウィルス様粒子を処方した場合に、トラン スフェクション効率が増加することが、見いだされた。 本発明の合成ウィルス様粒子を用いたトランスフェクション効率は、エンドソ ーム機能を妨害(perturb)する薬剤の存在下でトランスフェクションが起こった 場合、劇的に高くなる。そのような能力を有する薬剤の１つは、抗マラリア薬ク ロロキンである。クロロキンの活性は、細胞の処理の前に合成ウィルス様粒子を クロロキンを含有する溶液中でプリインキュベーションすることによって、増幅 され得る（好ましくはこの親油性分子を合成ウィルス様粒子の疎水性表面に吸着 させることによる）。 脂質化ペプチドの存在下で調製された合成ウィルス様粒子を、標的細胞への曝 露前にクロロキンを用いてプリインキュベーションした際、トランスフェクショ ン効率の増大が観察される。合成ウィルス様粒子中の親油性置換基のレベルを高 めることによってクロロキンの結合を増加させることにより、トランスフェクシ ョン効率は更に増大し得る。本発明に基づく有用なプリインキュベーション濃度 の範囲は、一般に、10μMから7OmMである。より高い投与量(dosage)においては 、インビボで合成ウィルス様粒子とともに投与されるクロロキンの最大量は、3. 5mg/kg体重を越えるべきではない。エキソビボのアプリケーションにおいては、 処方物からの希釈後のクロロキンの最終濃度は、50〜200μMの範囲である。 また、標的細胞がクロロキンの存在下で合成ウィルス様粒子に曝露される時間 を延ばすことによって、トランスフェクション効率が増大することも見いだされ た。時間は２時間から24〜48時間になってもよく、インキュベーション時間が長 いほど、クロロキン存在下のトランスフェクション効率が増大する。 実施例１７において、クロロキンを用いて合成ウィルス様粒子をプリインキュ ベーションすることを含む新規な手順に従って調製された、合成ウィルス様粒子 を用いたトランスフェクション効率の増大を示した実験を述べる。 ５）本発明の合成ウィルス様粒子の高塩処方物 高塩処方物の使用を含む新規な手順に従って調製された合成ウィルス様粒子を 用いて、トランスフェクション効率が増大することを発見した。本願において「 高」塩とは、0.5〜1.0M塩の範囲内と定義し、「低」塩とは、0.1〜0.2M塩の範囲 内と定義する。この手順は以下の通りである。 核酸を、0.6〜1.0M塩化ナトリウムを含有する25mM HEPES緩衝液中で、90〜120 μg/mlまで作成する。核酸濃縮ペプチド(nucleic acid condensing peptide)を 塩化ナトリウムのモル当量(equivalent molarity)まで作成し、濃縮ペプチド溶 液を、0.1vol/min.の割合の急速撹拌で核酸溶液に加える。次に、混合物を少な くとも30分間20℃で放置してから、４℃において1〜16時間インキュベーション した後、RPMI培地（オプションとしてアルブミン1mg/ml、トランスフェリン50μ g/mlを含有する）そしてエンドソーム逃避剤(endosome escape agent)、フソジ ェニックペプチド（20〜100μM）またはクロロキン（100〜200μM）を含有する 中で、5μg/ml核酸の濃度まで希釈する。 安定（実施例１３に記載するように有効期間に対して）かつ、実施例１５に示 すように高トランスフェクション効率を有する分子を提供する粒子処方において 、上述のように高塩（高張）中で核酸を濃縮し、次にこの混合物を低塩（等張） 濃度（例えば0.15M）中で希釈し、PEGなどの中性親水性ポリマーを加えることに よって粒子を調製することが、特に有利である。 ６）脂質化ペプチドを含有する本発明の合成ウィルス様粒子の高塩処方 脂質化核酸濃縮ペプチドが存在する、合成ウィルス様粒子を用いた哺乳動物細 胞（この粒子は、高塩処方物の使用を包含する新規な手順に従って調製される） のトランスフェクションは以下の通りである。 本発明に有用な脂質化ペプチドは、DNA濃度が約250〜300μg/mlを越える場合 には、上述の初期高塩処方物に導入することができない。例えば、脂質化NBC2(L ip2)をDNA濃度400μg/mlで用いてこれを試みると、生成される合成ウィルス様粒 子の示す生物学活性は最小となる。従って、合成ウィルス様粒子中に脂質化ペプ チドを用いた場合、生物学的活性を維持するように粒子を処方しなければならな い。そのような粒子の高塩処方は、以下のように行われる。 脂質化ペプチドを、RPMI希釈培地に濃度０〜２μg/μgDNA（絶対濃度０〜10μ g/ml）で導入し、溶液を少なくとも30分間37℃でインキュベーションした後、ト ランスフェクションを行う。または、合成ウィルス様粒子を上述のように高塩中 で処方し、一晩４℃でインキュベートされた合成ウィルス様粒子を、脂質化ペプ チドの前に、0.15M塩化ナトリウムを含有する25mM Hepes緩衝液中の1mg/ml脂質 化ペプチドのストック溶液から、合成ウィルス様粒子に加える。脂質化ペプチド を含有する粒子（これらの粒子は高塩中で処方される）のトランスフェクション 効率を、実施例７に説明する。 実施例 本発明の核酸濃縮ペプチドは、ペプチド調製物中において、多分散指数(polyd ispersion index)および官能基の追加の両方の意味において高度の均一性(homog eneity)を達成するように、合成される。例えば、ペプチド調製物が選択された アミノ酸配列からなる場合は、成長中の(growing)ペプチド鎖に完全に結合させ るために、ヘテロペプチド配列の均一さを確実にするように、合成中に注意する 。調製物の均一さはまた、成長中のペプチド中の潜在的に反応性を有する(poten tially reactive)アミノ酸鎖を保護することによって、確実にされる。 実施例１ 用語 1.1 核酸結合(NBC)ペプチド 1.2 規定コンジュゲート これらは、全ての化学結合が領域特異性(regio-specific)結合によって規定さ れているコンジュゲートである。 1.2.1 脂質化誘導体 対応するNBCペプチドのN-パルミチル誘導体を、Lip1、Lip2などと呼ぶ。 例えば、Lip2の構造は以下の通りである。 コレステリル誘導体は、対応するNBCペプチドに準じて命名される。Chol1、Ch ol2などである。例えば、Chol2（Cholαβ-NBC121（上付添字は誘導の部位を表 す））は以下の通りである。 1.2.2 インシュリンコンジュゲート InslaB1-NBC141（上付添字はリガンドおよびペプチド上の連鎖部位を意味する） は、以下の構造を有する： InsllB1-NBC141は、以下の構造を有する： InsulinB1-Cholβ3-NBC141.18は、以下の構造を有する： 1.2.3.グリコシル化デンドリマー(dendrimer)コンジュゲート NBC12にコンジュゲートしたマンノシル化リジンデンドリマー（Man4Den2-NBC121 ）の構造は、以下の通りである： マンノシル化リジンデンドリマー−ウンデカンスペーサ−NBC12（Man4Den3-NB C121）の構造は、以下の通りである： PEGスペーサを有するマンノシル化リジンデンドリマー（Man4Den4-NBC12）の 構造は、以下の通りである： コンジュゲートMan4Den5-NBC12およびMan4Den6-NBC12はそれぞれ、Man4Den2お よびMan4Den3のアナログであり、リジンデンドリマー骨格へのマンノース残基の 連鎖によって、構造が異なる。これらの場合において、Man4Den5-NBC12の場合に おけるように、Ｎ末端のセリン残基の水酸化基を介して糖が連鎖している。また 、デンドリマーとNBCペプチドとの間には、cys-マレイミドフェニルブチレート リンカーが存在しない。 Man4Den5-NBC12の構造は以下の通りである。Man4Den6-NBC12の構造は以下の通りである。 実施例２ NBC ペプチドの調製 Fmoc-Cys(Acm)-O-PEG-PS-樹脂および溶媒としてのジメチルホルムアミドを用 いた拡張合成サイクルモードにおいて、Biosearch 9050 plus Pepsynthesizerを 用いて、ペプチドNBC1〜14を合成した。各結合前の、N末端のFmoc基の脱保護化( deprotection)を、ジメチルホルムアミド中20％ピペリジンの溶液を用いて（高 フローレートで１分間の後、３ml/minで10分間）、達成した。O-(1H-ベンゾトリ アゾ-l-yl)-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(O-(1H-benzotriaz o-l-yl)-tetramethyluronium tetrafluoroborate)(TBTU)／1-ヒドロキシベンゾ トリアゾール(1-hydroxybenzotriazole)およびN-エチルジイソプロピルアミンを 活性剤として用いて、アミノ酸を４倍剰余量で結合した。合成中、NBC1について は、結合時間は30分で開始し、毎15番目のアミノ酸後に15分ずつ、最後の15個の アミノ酸の1.25時間まで増加した。他の全てのNBCペプチドについては、結合時 間は、合成中を通じて１時間に設定した。以下のアミノ酸誘導体を、適宜NBCに 用いた：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(O'Bu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)- OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser('Bu)-OH、Fmoc-Thr('Bu)-OH、Fmoc-Tyr('Bu)-OH、F moc-Val-OH。各ペプチドの合成完了後に、Ｎ末端のFmoc基を上述のように除去す ることによって、樹脂に結合した遊離アミノ側鎖保護ペプチド(free amino，sid e chain protected，pepetide bount to the resin)を得た。次に各樹脂を、メ タノールを用いてガラスバイアル中で洗浄して、減圧中で(in vacuo)乾燥させた 。 樹脂から、TFA／水／フェノール／チオアニソール／1,2-エタンジチオール（8 2.5:５:５:５:2.5）混合物（樹脂の１グラム毎につき混合物10mlを切り出す）を 用いて、ペプチドを切り出した。次に、樹脂を濾過によって除去し、TFAを用い て３回洗浄した。 濾過物と洗浄物の組み合わせ物を、蒸発によって濃縮した後、ジエチルエーテ ルを用いて沈殿させ、遠心分離することにより、粗ペプチドを得た。 少量の１％酢酸水溶液中に、粗ペプチドを溶解し、適切なサイズのSephadex G 25（超微細）カラムに塗布し、同じ１％酢酸溶液を用いて溶出した。分析逆相hp lcを用いペプチドを含有すると決定された画分を、プールして凍結乾燥した。Dy namax 83-221-Cカラムおよび、水中(0.1％TFA)５〜30％のアセトニトリル(0.1％ TFA)勾配を用いた20分間の調製用(preparative)逆相hplcによって、さらなる精 製を行なった。ペプチドを含有する画分をプールし、アセトニトリルを減圧中で 蒸発させ、凍結乾燥した。 次に、NBC1を、１％酢酸水溶液0.75ml中に溶解することにより脱塩し、PD-10 カラムに塗布し、次に同じ緩衝液を用いて溶出した。0.75ml毎に画分をとり、画 分３〜８組み合わせて凍結乾燥することにより、最終ペプチドを得た。 NBC2〜NBC14を、調製用rp hplcにより精製し、１％酢酸水溶液を用いてSephad ex超微細G25カラム（1.6×30cm）上で、溶出した。得られた画分を逆相hplcで分 析し、上述のようにプールし凍結乾燥した。 必要であれば、アセタミドメチル(acetamidomethyl)(Acm)チオール保護基を、 酢酸水銀(II)を30％酢酸水溶液中で用いた後2-メルカプトエタノールを用いて沈 殿することにより、除去してもよい。得られた遊離チオールペプチドを、ゲル濾 過を用いて精製することにより、所望の生成物が得られる。 実施例３ 合成ペプチドの多分散性指数の計算 多分散指数は、ポリマー性化合物の分子量分布を特徴付けるために用いられる。 上式において、Mwは、重量平均分子量であり、Mnは数平均分子量である。 ポリリジンなどの不均一性ポリマー(heterogeneous polymer)の重量平均分子 量を求めるための常法は、光散乱を用いることであり、散乱光の量は、分子サイ ズならびに粒子数に依存する。これらの場合において、数平均分子量は、溶液中 のポリマーの、粘度などの束一的(colligative)特性から計算される。なぜなら 、この特性は単位体積あたりのポリマー分子数に依存するためである。 例えば、Poly-L-Lysine 25000;シグマプロダクトP7890、ロットNo.93H-5516は 、1.2のPDIを有する。この結果は、文献に報告されている多くの遺伝子組換え実 験(gene transer experiments)ポリリジンのバッチにおいて典型的である。 低多分散性調製物については、粘度測定および光散乱測定の両方とも比較的不 正確であるため、このアプローチを用いることはできない。これらの場合におい てはエレクトロスプレー質量分光測定を用い得る。 図２は、ペプチドNBC9（理論的質量4082.2）の逆重畳積分化(deconvoluted)エ レクトロスプレー質量分光測定を示している。1mg/mlペプチドの水溶液を調製し 、サンプルをアセトニトリル：メトキシエタノール：0.1％トリフルオロ酢酸の 混合物中に希釈した。実験は、四極子分析器(quadropole analyzer)を用いたVG Instruments Quatro II機器上で行われた。ミオグロビンで機器を校正し、10μl アリコートを直接機器源中に注入した。 -この技術により、正確な質量が得られ、各ピークの面積を積分することにより 、各成分の相対割合を推定することができる。これにより、Mw、Mnおよび多分散 指数を計算することが可能になる。 NBC9スペクトルにおけるピークの積分により、以下の相対面積が得られる： 質量 面積(n1) 4212 120 4084 4250 4064 420 4013 900 3838 150 このデータから上式を用いて、 Mw＝4070 Mn＝4067 PDI＝1.0008 実施例４ インビトロ力価(potency)の決定のための合成ウィルス様粒子の組立て 4.1 組立ておよびDNA濃縮 核酸は、緩衝液中20〜400μg/mlからなる（通常0.15M〜1.0M NaCl；25mM HEPE S、pH7.4）。必要なコンジュゲートまたはペプチド量が、同じ緩衝液中の核酸溶 液と同量まで作成される。濃縮剤を毎分0.1体積の割合で加えながら、DNAを穏や かに撹拌する。錯体を少なくとも30分間室温で放置してから、細胞に加えて４℃ で保存することができる。 本願に開示する核酸濃縮ペプチドの相対DNA濃縮活性およびトランスフェクシ ョン効率を決定するために、以下の実験を行った。本発明のペプチドの性質を有 する核酸濃縮ペプチドを、NBC1、8、9および10について下記のように、すなわち ゲル遅延およびトランスフェクション効率などの試験パラメータを用いて試験す る。 図３は、NBC1（31個の正帯電基）、NBC7（16個の正帯電基）、NBC8（13個の正 帯電基）、NBC9（19個の正帯電基）およびNBC10（25個の正帯電基）の比較ゲル 遅延挙動を示す。プラスミドRSVluc DNA（25mMH EPES、pH7.4中の150mM NaCl中2 0μg/ml）の１μgアリコートを、マルチウェルプレート（50μl体積）中に等分 した。正電荷対ホスフェート比：０、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 、2.0、2.5、3.0、3.5および4.0を得るために必要な各ペプチドの量を計算し、1 50mM塩化ナトリウム；25mM HEPES、pH7.4中50μlまで作成した。DNAを含有する プレートをプレートシェーカーに置き、ペプチド溶液をDNAに毎分５μlの割合で 加えながら震盪した。濃縮剤の添加の完了後、溶液を室温で少なくとも30分間イ ンキュベーションした。各正電荷：ホスフェート比のサンプルを、標準的な１％ TAEアガロースゲル上で電気泳動した。ゲルをエチジウムブロミドで染色し(stai n)、紫外光下で可視化した。濃縮されたDNAはゲルのウェル中に残存し、電界中 を泳動しない。 各ゲルは、様々な比の各ペプチド(DNAホスフェートの当量毎につき0、0.15、0 .6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5および4.0当量の正電 荷（リジン＋アルギニン＋α-アミノ）と等しい）と混合後、同量のプラスミドD NAの電気泳動移動度を示す。このデータは、４つのペプチドの全てが、少なくと もNB自と同程度のDNA濃縮能力を有する強力なDNA濃縮剤であり、関連シリーズNB C8〜10においては短い方のペプチドNBC8が長い方のペプチドNBC9およびNBC10よ りも有意に弱い濃縮活性を有することを示している。NBC7は他の配列よりも弱い （所与量のDNAの濃縮を起こすために必要なペプチドの相対質量において）核酸 濃縮ペプチドであるが、図１５は、ペプチドNBC7は高濃度においてエチジウムブ ロミド染色を無くす(abolition)ことを示している。一方、他のペプチドは優れ た濃縮ペプチドではあるが、この効果は有さない。このことは、NBC7を用いて濃 縮したDNAがより濃縮された形態であり、この染料をDNAとの相互作用から除外し ていることを示している。 4.2 遺伝子送達の相対強さ(relative potency)の決定 トランスフェクション効率を決定ことを目的とする研究において用いられる核 酸は、ホタルルシフェラーゼのマーカー遺伝子を含有するプラスミドDNAである （pRSVluc；de Wet J.R.、Wood K.V.、DeLuca M.、Helsinki D.R.、およびSubra mani S.（1987）Mol．Cell.Biol．vol.7、pp725-737）。インキュベーションの 後、細胞を溶解して、遺伝子発現についてアッセイする。ルシフェラーゼリポー ター遺伝子の場合、溶解した細胞にルシフェリンおよびATPを加えて、発光した 光を輝度計(luminometer)で測定する。 4.2.1.懸濁液培養物中で成長した細胞を用いた、導入遺伝子(transgene)発現の アッセイ JurkatおよびK562などの細胞株は懸濁液中で成長し、トランスフェクトして℃ 入遺伝子発現のレベル（ルシフェラーゼ活性）を以下の方法で決定することがで きる。細胞を、室温で1200rpmでなされる５分間の遠心分離により、アッセイの 日に回収する。細胞ペレットをホスフェート緩衝化生理食塩水に再懸濁し、再遠 心分離する。この操作を２回行う。次に、細胞ペレットをRPMI 1640(Gibco Ltd. )中に懸濁することにより、ml毎につき2.7×106個の細胞の懸濁液を作成する。 次に、細胞を試験管に等分し、RPMI培地の0.75mlを加えた後、100mMクロロキン0 .04〜0.08mlを加え、最後にDNA錯体溶液0.25mlを加える。次に、細胞を37℃で４ 時間インキュベーションすることにより、トランスフェクションを進行させる。 この時間経過後に、細胞を2000rpmの遠心分離により回収する。次に、細胞をRPM I培地1ml中に懸濁させ、再遠心分離する。最後に、細胞を、10％ウシ胎児血清を 含有する0.5mlのRPMI培地中に懸濁させる。トランスフェクトされた細胞懸濁液 の各0.5mlを、1.5mlのRPMI 10％FBSを含有する１２ウェルのプラスチック培養プ レートのウェルの１つに移す。元々のトランスフェクション試験管をさらに１ml の培地でリンスし、洗浄物を培養皿に移して最終体積を3mlとする。次に、５％C O2雰囲気下において、培養プレートを37℃で24〜90時間インキュベートする。培 養皿中の各ウェルの内容物を遠心分離管に移し、細胞を13000rpmの遠心分 離により回収する。ペレットをLysis Buffer（100mMナトリウムホスフェート、p H7.8、8mM塩化マグネシウム、１mM EDTA；１％ Triton X-100および15％グリセ ロール）0.12ml中に再懸濁させ、ピペットで撹拌する。溶解物を13000rpmで１分 間遠心分離し、上澄み液を回収する。上澄み液の80μlを輝度計管に移す。次に 、Berthold Lumat L9501輝度計を用いてルシフェラーゼ活性をアッセイする。用 いるアッセイ緩衝液は、10mMルシフェリンおよび100mM ATPを含有するLysis Buf ferである。ルシフェラーゼによって生成された光を４秒間にわたって積分して 、これを相対光ユニット(RLU)として記述する。データをRLU/溶解物ml、RLU/細 胞またはRLU/タンパク質mgに換算する（この場合において溶解物のタンパク質濃 度はBioRAD Lowryアッセイによって決定した）。 4.2.2 接着細胞(adherent cell)を用いた導入遺伝子発現のアッセイ 本方法を、肝臓癌腫細胞株HepG2などの接着細胞用に改変することが可能であ る。細胞を24時間プレートにとり、その後６ウェルの組織培養プレート中で、完 全培地中（MEM(ならびにEarle塩)＋１％不必須アミノ酸＋10％仔ウシ胎児血清） 、ウェル毎につき1〜2×105の密度でトランスフェクションを行う。培養培地を 吸引し、細胞をホスフェート緩衝化生理食塩水で洗浄することにより、トランス フェクションを行った。錯体（50μg/ml DNA）を細胞単層上に積層し、ヒアルブ ミン（1mg/ml）およびヒトトランスフェリン（50μg/ml）を補ったRPMI中2.5μg DNAおよび120μMクロロキンを含有する最終体積を１mlとした。次に、37℃で４ 時間インキュベーションすることによりトランスフェクションを進行させた後、 トランスフェクション錯体を除去し、細胞をPBSで洗浄して完全化培地を加え、 その後５％CO2の雰囲気下で37℃で24〜72時間インキュベーションした。 次に、細胞を剥離するためにトリプシンを用いて、細胞を回収した。トリプシ ンを不活性化するための血清を含有する培地を加えた後、13,000rpmの遠心分離 により細胞をペレット化した。次に、細胞を1mlのPBS中に懸濁させ、再遠心分離 した。ペレットを200μlのLysis Buffer（100mMナトリウムホスフェート、pH7.8 ；８mM MgCl2、１mM EDTA；１％ Triton X-100；15％グリセロール；0.5M PMSF および１mMジチオスレイトール）中に再懸濁し、ピペットで撹拌した。溶解物 を13,000rpmで１分間遠心分離し、上澄み液を回収する。上澄み液の80μlを輝度 計管に移す。次に、Berthold Lumat L9501輝度計を用いてルシフェラーゼ活性を アッセイする。用いるアッセイ緩衝液は、0.01mMルシフェリンおよび0.04375mM ATPを含有するLysis Bufferである。ルシフェラーゼによって生成された光を４ 秒間にわたって積分して、これを相対光ユニット(RLU)として記述する。データ をRLU/溶解物ml、RLU/細胞またはRLU/タンパク質mgに換算する（この場合におい て溶解物のタンパク質濃度はBioRAD Lowryアッセイによって決定した）。 処方物中の正帯電残基（DNA濃縮ポリマー上の）対負電荷（プラスミドDNAのホ スフェート基上の）の当量の比が1.25を越えるような遺伝送達錯体を組み立てる と、高効率のトランスフェクションが得られることが見いだされた。図４は、NB C1およびNBC2のプラスミドDNAに混合する量を増加することによって調製される 合成ウィルス様粒子による、非レセプタ仲介トランスフェクションを示す。図４ (a)〜(c)は、処方物中の核酸濃縮ペプチドの比率を増やすことにより高レベルの トランスフェクションが得られることを示している。実験は以下のように行わっ た。NBC1およびNBC2のストック溶液を、濃度2.5、５および7.5μg/120μlの25mM Hepes、0.85M塩化ナトリウム、pH7.4（塩化ナトリウム0.7M含有）で作成した。 各溶液を120μlの0.7M塩化ナトリウム25mM Hepes、pH7.4（RSVLUCプラスミドDNA 2.5μg含有）に混合し、混合物を室温にて30分間インキュベートした後、４℃で 一晩インキュベートした。次に、合成ウィルス様粒子をRPMI中に希釈し、室温で 30分間インキュベーションした後、120μMクロロキンを含有するRPMI中１×106 個のJurkat細胞と混合した。４時間後に細胞を遠心分離し、培地を除去し、細胞 を10％仔ウシ胎児血清を含有するRPMI培地2.5ml中に再懸濁した。24時間後に細 胞を回収し、25mM Hepes、0.85M塩化ナトリウム、pH7.4中で洗浄し、溶解して、 ルシフェラーゼ発現のレベルを上述のように決定した。 実施例５ 異なるNBCペプチドのトランスフェクション効率の比較 異なるNBC濃縮ペプチドあるいばポリ-L-リジンからなる錯体のトランスフェク ションの相対効率を比較するために、100μg/mlの濃度のpRSVLuc DNAを、以下の 点以外は実施例４に記載した通りに２μg/μgプラスミドDNAの比でペプチドを用 いて、濃縮した。すなわち、細胞[Jurkat細胞株]の添加以前に、10％PEG 10000 ：37mM塩化ナトリウム；25mMナトリウムホスフェート、pH7.4を用いて、錯体を2 0μg/mlに希釈した。細胞を、24時間後にルシフェラーゼに関してアッセイした 。 これらの結果を図５に示す。これらの条件下において、全ての低多分散性ペプ チド（NBC14(規定された構造の合成ポリ-L-リジン)を含む）が、多分散ポリ-L- リジンよりも有意に優れたトランスフェクション剤であった。 図６ａは、同様な実験の結果を示す。全条件は前記実施例と同様であったが、 ただしこの場合においては、希釈前にDNAを0.6μgLip13/μgDNAとともに共濃縮( co-condense)した。やはり、poly-L-リジンを含有するものを除く全ての組み合 わせにおいて、有意に高いトランスフェクションレートが観察された。図６ｂは 、濃縮ペプチドとしてNBC1、NBC8、NBC9およびNBC10を用いたデータの同様な比 較を示す。 実施例６ 標的遺伝子錯体を用いた遺伝子送達 6.1 モノクローナル抗体標的化遺伝子組換え 6.1.1 コンジュゲート合成 6.1.1.1 炭水化基を介したモノクローナル抗体のNBC1へのコンジュゲーション モノクローナル抗体などの細胞標的化成分を、本発明による核酸濃縮ペプチドに 対してコンジュゲートし得る。 モノクローナル抗体上に存在する炭水化基を、周期性酸(periodic acid)を用 いて酸化することにより、反応性アルデヒド基を生成する（JentoftおよびDearb orn J．Biol．Chemi．254、4359(1979)）。次に、酸化された抗体を、NBC2ペプ チド上に存在するアミノ基と反応させる。これにより、抗体とNBCポリマーとの 間にイミン（シッフ基）連鎖が形成される。イミン連鎖は水中で非常に変化しや すいため、安定なアミンを得るために、ナトリウムシアノボロヒドリドまたはナ トリウムボロヒドリドを用いて還元しなければならない。 25mM酢酸ナトリウム、pH5.0中の抗CD7抗体（５mg/mlにて50mg）を、ナトリウ ムペリオデートを加えて10mMとすることによって酸化した。溶液を、暗所にて氷 上に１時間放置した。酸化された抗体を脱塩し、Sephadex G25カラム(30cm×2.5 cm i.d.)緩衝液を25mM MES、pH6.0に交換した。カラムから回収された抗体の量 を、280nmにおける吸光度（280nmにおける抗体の1mg/ml溶液の吸光度は1.33であ る）を測定することにより決定した。５倍モル過剰量のNBC1を加えて、溶液を室 温で１時間放置した。ナトリウムシアノボロヒドリドを加えて10mMとし、溶液を 室温でさらに４時間放置した後、12k分子量カットオフ膜中、0.6M塩化ナトリウ ム；25mM HEPES、pH7.9；を用いて一晩透析した。コンジュゲートを透析から除 去して、0.6M塩化ナトリウム；25mM HEPES pH7.9中にて平衡化したSPセフェロー スカラム（5ml）上にロードした。同じ緩衝液の５カラム体積を用いてカラム上 に洗浄し、0.6M〜3.0M塩化ナトリウムの勾配を20カラム体積に用いて溶出した。 修飾されなかった抗体はカラムに結合せず、洗浄される。NBC1にコンジュゲー トした抗体はカラムに結合し、勾配の早い時点で溶出する（図７）。コンジュゲ ートは、約1M NaClにおいてピーク溶出を示した。 6.1.1.2 ヒドラゾンおよびジスルフィド連鎖を介したモノクローナル抗体のNBC 2へのコンジュゲーション 25mlの25mM酢酸ナトリウム、pH5.0中の20mgの抗CD33抗体に対し、ナトリウム ピリオデートを加えて最終濃度を10mmとした。室温で３時間後に、25mMナトリウ ムアセテート、0.5M NaCl、pH5.0を緩衝液流(running buffer)として用いたゲル 濾過によって抗体を脱塩した。プールされたタンパク質画分に、50μlのDMSOに 溶解した５mg（22μモル）の3-(2-ピリジルジチオ)プロピオニルヒドラジド（PD PH）を加えた。室温で１時間の後、抗体-PDPHを、25mM HEPES、0.5M NaCl、pH7. 9を緩衝液流として用いたSephadex G-25ゲル濾過によって精製した。タンパク質 画分をプールし、４℃で保存した。NBC-2-SH（5mg/ml）を、ジチオスレイトール （ジチオスレイトール）を用いて還元し、25mM HEPES、0.5M NaCl、pH7.9を緩衝 液流として用いたゲル濾過により精製した。合計250nmolのNBC2（Ellman試験を 用いて決定）を抗体-PDPHに加え、溶液を室温で16時間放置した。NaClの濃度を0 .15Mに調整した後、抗体-NBC2コンジュゲートを、0.15〜3MのNaCl勾配を用いたS P Sepharose上におけるカチオン交換により、精製した。得られた分離物を図４ に示す。粗コンジュゲートを、0.15M NaClを用いたカラム[S-Sepharose Fast Fl ow]に塗布し、NaClの0.15〜３Mの線形勾配によって溶出した。コンジュゲートは 、約１M NaClでピーク溶出を示した。タンパク質ピークをプールし、0.02M HEPE S緩衝液、0.15M塩化ナトリウム緩衝液、pH7.2を用いて透析した。 6.1.1.3 ヒドラゾンおよびチオエーテル結合を介したNBC2へのモノクローナル 抗体の接合 25mMの酢酸ナトリウム、pH5.0、2.5ml中の抗CD33抗体、20mgへと、過ヨウ素酸 ナトリウムが、最終濃度が10mMになるように添加された。暗所、室温で３時間放 置した後、この抗体は、25mMの酢酸ナトリウム、0.5MのNaCl、pH5.0を流れ緩衝 液として用いて、ゲル濾過により脱塩された。プールされたタンパク質留分へと 、DMSO、50μlに溶解された３−（２−ピリジルジチオ）ピロピオニルヒドラジ ド（PDPH）が5mg（22μmol）添加された。室温で１時間放置した後、還元された 抗体−PDPHが、25mMのHEPES、0.5MのNaCl、pH7.9を流れ緩衝液として用いたSeph adex G-25ゲル濾過により精製された。これらのタンパク質留分は、プールされ 、４℃で貯蔵された。 誘導体化された抗体は、システインを用いて還元され、25mMのHEPES、0.5MのN aCl、pH7.9を流れ緩衝液として用いたゲル濾過により精製された。これらの留分 はプールされ、チオール基の濃度は、エルマンの試験を用いて決定された。２モ ル過剰なマレイミド−β−アラニル−NBC2−（Ｓ−アセトアミドメチル−シス） −COOH（5mg/ml）が、抗体−PDPHへと添加され、その溶液は、室温で16時間放置 された。NaClの濃度は、抗体−NBC2接合体が、0.15〜3MのNaClグラジエントを用 いたSPセファローズ上でのカチオン交換により精製される前に、0.15Mに調整さ れた。タンパク質のピークはプールされ、滅菌プールは濾過され、接合 体は、4℃で貯蔵された。 6.1.1.4 クラスターされたモノクローナル抗体−NBC2接合体の合成 鋳型結合剤（２−ブロモアセチル）−GG（E（NHNH2）GG）4−NHNH2（CL）の合成 ペプチドは、Millipore 9050と、結合時間を制御するために強化された対イオ ン分布監視を備えたペプチド合成剤とを用いて合成された。Fmoc-Gly-O-Resinが 用いられた。20%のピペリジンをジメチルホルムアミド中で用いてFmoc基の保護 を解除した後、後続アミノ酸は、0.025%のキノリンイエローをジメチルホルムア ミド中に有する0.6MのＮ、Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミドと、１mMのジイ ソプロピルエチルアミンをジメチルホルムアミド中に活性剤として有する0.6Mの １−ヒドロキシベンゾトリアゾールとを用いて、４倍過剰に結合される。このペ プチドの合成が完了した後、Ｎ末端Fmoc基が上述したように除去され、ペプチド は、95:5のTFA／水混合物を用いて樹脂から開裂された。調製用逆相hplcが後続 するSephadex G25上でゲル濾過によりペプチドを精製したところ、所望の生成物 が得られた。 このペプチドは、その後、２−ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエ ステル水を用いて処理され得、それにより、Ｎ−（２−ブロモアセチル）−ペプ チドを得る。このペプチド溶液を、水中でEDC-Iの存在下に大量の過剰ヒドラジ ンと反応させた後、このペプチドのＮ−（２−ブロモアセチル）−ペンタ−グル タリル−ヒドラジン誘導体を生じた。 クラスターされたモノクローナル抗体配位子の合成およびNBC2へのその接合 25mMの酢酸ナトリウム、pH5.0、2.5ml中の抗CD33抗体、20mgへと、過ヨウ素酸 ナトリウムが、最終濃度が10mMになるように添加された。暗所、室温で３時間放 置した後、この抗体は、25mMの酢酸ナトリウム、0.5MのNaCl、pH5.0を流れ緩衝 液として用いて、ゲル濾過により脱塩された。プールされたタンパク質留分へと 、（直前の実施例）からペプチドが5mg添加された。室温で１時間放置した後、 この接合体は、ゲル濾過により精製され、ピークがプールされた。２モル過剰な チオール形態のNBC2がクラスターされた抗体誘導体へと添加され、その 溶液は、室温で16時間放置された。NaCl−の濃度は、クラスターされた抗体−NB C2接合体が、0.15〜3MのNaClグラジエントを用いたSPセファローズ上でのカチオ ン交換により精製される前に、0.15Mに調整された。タンパク質のピークはプー ルされ、滅菌プールは濾過され、接合体は、4℃で貯蔵された。 6.1.2 モノクローナル抗体配位子により方向付けられた遺伝子錯体を用いた標 的化された遺伝子転写 トランスフェクション効率の例は、図９〜図14に示されている。これらの図は 、RSVプロモータの制御の下にルシフェラーゼ遺伝子を含有するプラスミドDNAで トランスフェクトされた細胞から誘導された溶解物中のルシフェラーゼの相対活 性を示すヒストグラムである。用いられた細胞株あるいは一次細胞のいずれにお いても、内因性のルシフェラーゼ活性は存在しない。 図９は、マイロイド細胞への遺伝子転写は、DNAが抗CD33-NBC1接合体へと用量 依存的に縮合される抗CD33錯体を用いて標的化され得ることを示している。抗CD 33-NBC1接合体は、実施例6.1.1.1に記載されているように合成された。この実験 は、錯体の濃度が遺伝子転写に及ぼす影響を示している。接合されなかったNBC2 と錯体化された2.5μg/mlのDNAでは、遺伝子転写は観測されなかった。細胞に添 加される錯体の量が増加するにつれて、ルシフェラーゼ（トランスフェクション ）のレベルは増加し、１×106個の細胞につき１つのDNA錯体あたり最大１〜２μ gに達する。図10は、プラスミドへの接合体の全増量比は、活性に対して重要で あり、より低い活性は、過剰な接合体を用いて調製された錯体に関連づけられて いることを示す。抗CD33-NBC1錯体は、DNAに対する接合体の比が一定のままとな り、接合されないNBC2の量が変化させられることによって、全カチオンリン酸比 を0.5〜2.0とするように調製された。 細胞の標的化は特異的である。このことは、自由で競合する接合されていない 抗CD33抗体により処理された細胞が、標準的なアッセイシステム（図11）におい て抗CD33-NBC1（実施例6.1.1.1に記載されているように調製された）を用いて形 成された錯体に曝された時には、そのトランスフェクションレベルが低下したこ と、および細胞が、接合されていないNBC2（図4(a)）で縮合されたDNAに曝され る時には、転写が全く観察されないという事実により示されている。競合実験（ 図11）においては、合成ウイルス状粒子を添加する直前に、細胞が所与の濃度の 抗CD33抗体を用いて37℃で１時間インキュベーションされたことを別にして、上 述した標準的なアッセイが用いられた。この合成ウイルス状粒子は、その後、規 定どおり添加され、インキュベーションは、37℃でさらに３時間続けられた。自 由抗体の存在は、おそらくはCD33受容体と優先的に相互作用することによって、 トランスフェクションのレベルを低下させる。 図12は、錯体内の抗体の量は、トランスフェクション効率を増加させるように 最適化され得ることを示している。錯体は、実施例４で既に述べたように、さま ざまな割合の抗CD7-NBC1接合体（実施例6.1.1.1で述べたように調製された）お よび接合されていないNBC2を用いて調製された。最終量は、ゲル遅延アッセイに より決定されるDNA縮合が変化しないように、調整された。図12は、核酸と、抗C D7／ペプチド接合体と、自由NBC2による75%との間の相互作用により25%の縮合が 実現される時、最大のトランスフェクション効率が得られることを示している。 図13は、発現の時間経過を示している。細胞は、実施例6.1.1.1に記載されて いるように調製された抗CD7接合体を用いてトランスフェクトされ、ルシフェラ ーゼ発現の溶解および分析以前の時間を長くするように細胞を成長させた点を別 にして、実施例４に記載されているようにアッセイされた。 6.2 インシュリン標的化された遺伝子転写 6.2.1 インシュリンB1−NBC14'の合成 6.2.1.1 インシュリンの機能性化 インシュリンは、わずかな改変を施した上で、前述の方法（Offord、R.E．(19 80)、'Semisynthetic Proteins'、235頁、Wiley，Chichester and New York、第 43〜44頁）に従って、化学的に修正された。簡単にいうと、Znのないインシュリ ン100mgが、1Mの炭酸水素ナトリウムの1ml中に溶解され、ジメチルホルムアミド 4mLで希釈された後、（ペプチドアミノ基に対して）等しいモル量のメチルスル フォニルオキシ炭酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させられた。 室温で１時間インキュベートした後、この混合物は、酸性化され、流量4 mL/分で25分間65〜90%のグラジエント（Ａ：0.3Mの硫酸アンモニウム、pH2.7、 Ｂ：35%のアセトニトリルを含有する0.3Mの硫酸アンモニウム）を用いて、0.3M の硫酸アンモニウム、pH2.7中で平衡化されたC8カラム上で半調製用HPLCにかけ られた。この硫酸アンモニウム溶液は、conc.硫酸を用いてpH2.7（ガラス電極） に調整された3Mの株溶液を希釈することによって得られた。希釈された溶液のpH には、それ以上の調整はなされなかった。２価の置換されたインシュリンに対応 するピーク（後続する電子スプレー質量分析により判定される）は、0.1%のTFA 内で平衡化された二重クロマ結合上で収集され、脱塩された。このような反応で 得られた２価の誘導体は、はるかに重要で所望のAl、B29置換された分子である ことが知られている。この仮定は、以下のようにしてチェックされた。水中の50 mMのジチオスレイトルを一晩インキュベートした後の修正されたタンパク質を分 析することにより、B鎖が単一のメチルスルフォニルオキシカルボニル基（計算 値：m/z 3547.8;実測値：m/z 3549.6±0.4）のみを含有することの有効性を許容 した。その後、メチルスルフォニルオキシカルボニル２−インシュリン50mgが、 Ｎ−メチル−ピロリドン、１mL中に溶解され、等しいモル量のHOBTおよび十分な Ｎ−エチルモルフォリンの存在下に10倍過剰なモル量のBoc-AoA-OSu（Vilaseca ら、（1993）Bioconjugate Chem．4 515-520に従って合成された）と反応させる ことにより、湿ったpH紙を用いて指定されたpHである約８をもたらした。室温で １時間インキュベーションした後、反応培地は酸性化され、0.1%のTFAで希釈さ れた。そして、誘導体化されたインシュリンは、20分間の間、35〜45%のグラジ エント（上述したのと同じ溶離剤）を用いて、0.1%のTFA中で平衡化されたC8カ ラム上の半調製用HPLCにより単離された。その後、標準的な条件下に、メチルス ルフォニルオキシカルボニル基は開裂され、この物質は、20分間の間、35〜40% のグラジエントを用いて、C8カラム上で再び精製された。最終的な化合物である Boc-AoAインシュリンは、電子スプレー質量分析（計算値：m/z 5950.6;実測値： m/z 5948.1±0.1）により特性評価され、NBC14へと接合される直前に、TFA処理 （室温で30分間）により保護解除された。 6.2.1.2 インシュリンBl−NBC14'接合体の接合 シス保護されたペプチドは、以下のようにして酸化された。このペプチドは、 50mMのイミダゾール（CI）、pH6.9中に濃度10mg/mLで溶解され、水中の0.2Mのメ チオニンが、ペプチドに対して10倍のモル量だけ過剰に（脱酸化スカベンジャー として）添加された。その後、50mMの過ヨウ素酸ナトリウムが、ペプチドに対し て５倍のモル量だけ過剰に添加され、この溶液は、室温で５分間、暗所で静置さ れた。この混合物は、10%〜60%の溶媒Bを25分間用いて、C8カラム上の半調製用H PLCにより精製された。ここで、溶媒Aは、0.1%（w/v）の水性TFAであり、溶媒B は、TFA／アセトニトリル-TFA-水900:1:100（V/W/V）である。単離された酸化さ れたペプチドは、氷酢酸を用いてpH3.8（ガラス電極）に調整した後、アセトニ トリルが50μL添加された0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液0.5mL中に作られたAoA-イ ンシュリン誘導体、5mg（インシュリンに対してペプチドが約２倍のモル量だけ 過剰である）の溶液中に溶解された。 この接合体は、室温で15時間インキュベーションされた後、単離され、電子ス プレー質量分析（計算値：m/z 8426.1;実測値：m/z 8429.3±0.5）により特性評 価された。4mgの物質が、30〜45%のグラジエントを用いて、半調製用HPLCにより 反応混合物のバルクから単離された。ピーク留分は、Speed Vac真空遠心分離に より乾燥された。最終収量は、4mgの接合体であった。 6.2.2 インシュリンの非受容体結合相似体（desB23-31インシュリンB1−NBC14' ）を含有する接合体の合成 B23〜31配列［des〜インシュリン］を欠いたインシュリン誘導体が、以下のよ うにして調製された。 インシュリン70mgが、50mMのHepes緩衝液、pH8.0、7.0ml中に溶解され、TPCK- トリプシシン7mgを用いて37℃で３時間消化された。反応は、0.1Mのp-メチルス ルフォニルフルオリドを140μlだけエタノール中に添加し、pH3.0が得られるま で酢酸を添加することによって、停止させられた。des-インシュリンは、Waters Nova-Pak HR C18カラムおよび水性トリフロロ酢酸（0.1%）をアセトニトリル／ トリフロロ酢酸／水（900:1:100）グラジエント（40分間、20〜40%）に用いて、 調製用rp-hplcにより単離された。物質が38mg回収され、電子スプレー質 量分析（計算された質量：4865.5／観測された質量4867.7）により特性評価され た。 des-インシュリンのB鎖のＮ末端におけるアミノオキシアセチル基の導入は、O fford（Offord、R.E．[1980]、Semi-synthetic Proteins、第235頁、Wiley，Lon don and New York）により記載されているアプローチと同様のアプローチにより 達成された。7.7μMのdes−インシュリンが、1Mの炭酸水素ナトリウム0.5ml中に 溶解され、9.4μMのメチルスルフォニルオキシ炭酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ドエステルを含有するジメチルホルムアミド1.75mlで希釈された（Tesser［1975 ］、Peptides、第53〜56頁、John WiIey）。室温で１時間インキュベートした後 、この混合物は、トリフロロ酢酸を用いて酸性化され、その誘導体は、上述した 条件と同じ条件下に再びクロマトグラフィにかけられた。des-インシュリンのモ ノ置換された誘導体に対応するピーク（電子スプレー質量分析［計算された質量 ：5015、観測された質量：5018］により判定された）が、収集され、凍結乾燥さ れた（25mg回収された）。その後、この物質は、Ｎ−メチル−２−ピロリドン0. 4ml中に溶解され、等しいモル量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｎ−エ チルモルフォリンを用いてpHが8.0に調整された）の存在下にBoc−アミノオキシ 酢酸（Vilascaら、［1993］Bioconjugate Chem．4 515-520に従って合成された ）の５倍過剰なモル量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体と反応さ せられた。室温で１時間インキュベーションした後、反応は酸性化され、インシ ュリン誘導体は、上述したように精製された。その後、標準的な条件下に、メチ ルスルフォニルオキシカルボニル基は開裂され、ペプチドは、上述したようにhp lcにより再び精製された。アミノオキシアセチル−des−インシュリン8mgが回収 された（計算された質量：4939／電子スプレー質量分析により観測された質量： 4938）。 過ヨウ素酸塩により酸化されたNBC14が、実施例6.2.1.2に記載されているよう に調製された。この物質の4mgが、20%のアセトニトリル、pH3.6を含有する0.1M の酢酸ナトリウム緩衝液400μl中でdes-インシュリン誘導体4mgと混合された。 室温で15時間インキュベーションした後、この接合体は、直径1cmのC8カラムお よび30〜35%のアセトニトリル溶媒（上述した溶媒Aおよび溶媒Bを用いる）を用 いて、調製用hplcにより単離された。回収された物質（3.2mg）は、電子スプレ ー質量分析（計算された質量：7465／観測された質量：7462）により特性評価さ れた。 6.2.3 インシュリン−ポリ−Ｌ−リシンの調製 この接合体は、Birnstielら（Meth Enzymol、1993、217、618〜644）によりヒ トのトランスフェリン−ポリ−Ｌ−リシン接合体構成について記載されたプロト コルに従い、それにわずかな修正を施した上で調製された。 Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP） を、インシュリンおよび市販のポリ−Ｌ−リシンの両方と個別に反応させた。こ れら２つの誘導体は、２−ピリジルジスルフィド基を修正されたポリ−Ｌ−リシ ン中で還元した後、混合された。 Znのないインシュリン（3.5μmol）20mgが、1MのNaHCO3、200μL中に可溶化さ れた後、DMF、800μLを用いて希釈され、DMF、100μLに溶解されたSPDP、2.2mg （7.0μmol）と反応させられた。室温で１時間インキュベーションした後、この 混合物はpH3.0に酸性化され、流量4mL/分で15分間の間、35〜40%のグラジエント を用いて、0.1%のTFA中で平衡化されたC8カラム上の半調製用HPLCにかけられた 。単離された主要な誘導体（11mg）は、後続するESI-MS（計算値：m/z 6172.4、 実測値：m/z 6170.8±1.7）により判定される２価の置換されたビス（ジチオ− ピリジン−プロピオニル）−インシュリンである。 0.1MのHEPES緩衝液、pH7.9、1.9mLに溶解されたSigmaからポリ−Ｌ−リシン（ MW 52.500、0.38μmol）20mgを、３倍のモル量だけ過剰なSPDP（エタノールに溶 解された1.14μmol）と反応させた。30分間インキュベーションした後、この溶 液は、1Mの酢酸ナトリウム、pH4.6、200μLを用いて酸性化され、修正されたポ リマーは、20mMの酢酸ナトリウム、pH5.0中で平衡化されたPharmacia高速脱塩カ ラム上で精製された。置換の度合いは、50mMのDTTの存在下に、物質のアリコー トから放出されたピリジン２−チオンの量に従って、4.3μmolのジチオピリジン ／μmolポリ−リシンにおいて推定された。PMSF（5mM、最終濃度）が、プロテア ーゼによる汚染の予防策として添加され、溶液は、1.5Lに凝縮さ れた。DTT、25mgが、修正されたポリ−リシンに添加され、pHは、1MのHEPES緩衝 液、pH7.9を用いて7.0に調整された。30分後、この溶液は、1Mの酢酸ナトリウム 、pH4.6を用いて酸性化され、物質は、前述した条件と同じ条件の下に高速脱塩 カラム上で単離され、凝縮された。 0.18μmolのチオールプロピオネート（-SH）形式のポリ−Ｌ−リシンが、定量 的ニンヒドリン試験により最終的に回収され、５倍のモル量だけ過剰な３−（２ −ピリジルジチオ）−プロピオニルインシュリンと混合され、1MのHEPES、pH7.9 を用いて、pHは7.0に調整された。１時間インキュベーションした後、この接合 体は、20mMの酢酸ナトリウム、0.1MのNaCl、pH5.0中で平衡化されたSuperose12 カラム上でのゲル濾過により精製された。カラムから溶離した最初のピークに対 応するこの接合体は、収集され、1%の酢酸および水に対して透析され、最後に凍 結乾燥された（10mgが回収された）。この試料は、Ins．PolyK1という名前の物 質に対応していた。 6.2.4 インシュリン−NBC14接合体を用いた標的化された遺伝子転写 合成ウイルス状粒子を標的としたインシュリン受容体が、実施例４に記載され ているように、pRSVLucプラスミドDNAおよびインシュリン−NBC14接合体を用い て集められた。遺伝子転写効率は、肝炎癌細胞株HepG2を用いて測定された。こ れらの細胞は、接着性であり、標準的なアッセイは以下のように修正された。細 胞は、完全な培地（MEM（Earleの塩をもつ）＋1%の非真性アミノ酸+10%のfoetal 子ウシの血清）中の１ウェルにつき1.2×106の密度で、トランスフェクション以 前に、６ウェルの組織培養プレート内に配置された。トランスフェクションは、 培地を呼吸させ、リン酸緩衝化生理食塩水で細胞を洗浄することによりおこなわ れた。錯体（50μg/mlのDNA）は、ヒトのアルブミン（1mg/ml）およびヒトのト ランスフェリン（100μg/ml）を補充されたRPMl中にDNA、2.5μgと120μMのクロ ロキンを含有する最終容積lml中の細胞単層上へと層状に形成された。トランス フェクションは、その後、細胞を37℃で４時間インキュベートすることにより進 行させられ、その後、トランスフェクション錯体が除去され、細胞がPBSで洗浄 され、完成された培地は、5%のCO2雰囲気中で24〜72時間、37℃でおこなわれる インキュベーション以前に、添加された。 これらの細胞は、その後、細胞を脱離させるトリプシンを用いて、収穫された 。トリプシンを不活性化するために血清を含有する培地を添加した後、細胞は、 13,000rpmでの遠心分離によりペレットされた。これらの細胞は、その後、PBS、 1ml中に懸濁され、再び遠心分離された。このペレットは、溶解緩衝液（100mMの リン酸ナトリウム、pH7.8、8mMのMgCl2、1mMのEDTA、1%のトリトンX-100、15%の グリセロール、0.5mMのPMSFおよび1mMのジチオスレイトル）200μl中で再び懸濁 され、ピペットを用いて攪拌された。溶解物は、13,000rpmで１分間遠心分離さ れ、上清が収集された。上清80mlが発光計管へと移された。その後、Berthold L umat L9501発光計を用いて、ルシフェラーゼ活性がアッセイされた。用いられた アッセイ緩衝液は、0.01mMのルシフェリンおよび0.04375mMのATPを含有する溶解 緩衝液である。ルシフェラーゼにより生成された光は、４秒間のあいだ積分され 、相対光単位（RLU）として表現される。これらのデータは、溶解物のRLU/ml、R LU/細胞またはRLU/mgタンパク質（この場合はBioRAD Lowryアッセイにより決定 された溶解物のタンパク質濃度）に変換される。 図14は、規定されたインシュリン−NBC14接合体、非受容体結合インシュリン 相同体（desB23-31インシュリン−NBC14）の規定された接合体、および上で引用 したBirnstielらのアプローチにより調製されたポリ−Ｌ−リシンのインシュリ ン接合体の相対トランスフェクション潜在性を示している。これらの結果は、標 的化が特異的であり、受容体を認識し得るインシュリン接合体の存在に依存する ことを示している（インシュリン−NBC14は活性であり、一方、desB23-31インシ ュリン−NBC14は、完全に不活性である）。また、有意なトランスフェクション 効率は、精密に規定されたインシュリン−ポリカチオン接合体に依存する。なぜ なら、インシュリン−NBC14に基づく送達は、最良の相同体であるポリ−Ｌ−リ シンに基づく送達よりも少なくとも２桁高いからである。インシュリン−ポリ− Ｌ−リシンの活性が大幅に低下しているのは、主として、ポリ−Ｌ−リシンのト ランスフェクション特性が貧弱であることによる。インシュリンは、接合に利用 可能な３つのアミノ基を有している。規定されたNBC14接合体では、これらのア ミノ基のうちただ１つが用いられる。よって、もし他のアミノ基を介した接合の 結果、 受容体結合が減少するのなら、インシュリン−ポリ−Ｌ−リシン接合体は、規定 された接合体のうちの1/3までの活性を支持すると予想される（後者を調製する のに用いられる化学作用は、ランダムではあるが、アミノ基については基特異的 である）。これらのランダムな接合体の活性は、インシュリン−NBC14接合体よ りも２桁未満だけ低いので、活性がさらに失われるのは、トランスフェクション 剤として多分散ポリ−Ｌ−リシンポリマーの特性が劣っていることが原因である はずである。 送達は、図15に示されているように標的化される。図15において、標準的なア ッセイにおいてトランスフェクション処理中に自由インシュリンを添加すること により、遺伝子トランスフェクションの低下がもたらされた。自由な接合されて いないインシュリンの存在は、インシュリン受容体と競合し得るので、これらの 細胞により取り込まれるインシュリンにより標的化された送達粒子の量を減らす ことが、このデータから推論される。 6.3 グリコシル標的化された遺伝子転写 6.3.1 ４（α−Ｄ−マンノピラノシロキシ）フェニルイソチオシアネート（Man l-NBC1）を用いたNBC1の修正 ４（α−Ｄ−マンノピラノシロキシ）フェニルイソチオシアネート（MPIC）が 、MullerおよびSchuberの方法［Biochem．Biophys．Acta，986，97-105（1989） ］に従ってｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−マンノースから合成された。 NBC1、10mg（1.5μmol）が、25mMのHEPES、pH7.9、1.8ml中に溶解された。 この溶液に、DMSO、50μlの中に溶解されたMPIC、10mg（32μmol）が添加された 。その後、攪拌された溶液へとDMSOが滴下により添加され、残存する溶解してい ないMPICをすべて溶解させた。この混合物は、25mMのHepes、1.5MC7)NaCl、pH7. 9を流れ緩衝液として用いたゲル濾過による精製以前に、室温で１時間放置され た。析出した留分は、フェノール−硫酸方法［Robyt、JFおよびWhite、BJ（1987 ）、Biochemical Techniques:Theory and Practice，Brooks/Cole，California ］を用いて、カルボヒドレートについて定量的に分析され、ニンヒドリン試験を 用いて１次アミンの内容について定量的に分析された。マンノシル化され たNBC1留分がプールされ、25mMのHEPES、0.15MのNaCl、pH7.5に対して20時間、 透析された。この方法を用いることにより、NBC1のリシル残基中、30%がマンノ シル化されたと推定された。 6.3.2 標的化用配位子としてのクラスターされたグリコシル誘導体の使用 グリコシル化されたデンドリマー配位子設計の理論的根拠 グリコシル部分は、自然起源または合成起源の分岐されたカルボヒドレートの 使用によりクラスターされ得る。あるいは、これらの基は、分岐されたアミノ酸 バックボーン（デンドリマー）を修正することによってもクラスターされ得る。 このセクションで述べるグリコシル化されたデンドリマー部分は、NBCペプチ ドと接合された時には、ヘパトサイトアシアログリコプロテイン受容体（ASGPR ）またはマクロファージマンノース受容体（MMR）のいずれかへのペプチドの最 適な結合をもたらす配位子の生成設計に基づいている。配位子の合成で用いられ るこのタイプのモノサッカリドは、関心の対象である受容体に依存する。配位子 の設計は、ASGPRおよびMMRの結合要件の考慮に基づいている。なぜなら、遺伝子 標的化に使用するのに第１に関心のあることは、これらの受容体であるからであ る。 文献には、その非還元末端が露出されており、共にクラスターされたいくつか （すなわち、３つ以上）のモノサッカリド単位を示す配位子は、一般に、ASGPR およびMMRを含む膜レクチンへの最適な結合を実現することが述べられている（L eeおよびLee（1987）Glycoconjugate J.4，317-328;Monsignyら（1994）Adv．Dr ug Del．Rev.，14，1-24）。このような配位子は、１つまたは２つだけのモノサ ッカリド単位を示す対応する配位子に比べて、より大きな親和力で結合する。こ れが、いわゆる「クラスター効果」である。ASGPRについての研究により、（結 合親和力の点で）最も成功している配位子は、平均距離1.5nmで分離されている いくつかのモノサッカリド部分を所有する配位子であることが示されている。「 Hyperchem」モデル化ソフトウェアを用いた理論的計算により、Man4Den2（下記 を参照のこと）構造で例示されているもののようなモノサッカリド単位は、0.8n m〜2.5nmだけ離れていることが示されている。加えて、LeeおよびLee（198 7）は、ASGPR用の最適な配位子を、1.5、2.2、2.5nmの部位間距離を有する三角 形の形状を呈し、３つのガラクトース末端残基を有するものとして記載している 。例示されている配位子上に存在するモノサッカリドの可撓性および部位間距離 は、本願の配位子もこの基準に当てはまることができるようにするものであるこ とが示唆されている。 MMRの結合要件は、ASGPRについての結合要件ほど徹底的に調査されていないが 、MMRによく結合する自然トリサッカリドが、1.0〜3.0nmのあいだの部位間距離 をもつモノサッカリドを示すことは知られている。この場合も、例示されている これらの配位子は、このような基準に当てはまることが示唆されている。 6.3.2.1 マンノシル化されたリシンデンドリマーの調製 第２世代のリシンデンドリマー［Dcn(2Lys)3-Gly-Gly-Tyr-Cys］が、Millipor e 9050および拡張されたサイクルモード（１時間の結合）で作動するPepsynthes iserを用い、TBTU／N−エチルジイソプロピルアミンの活性化および保護解除を ジメチルホルムアルデヒド中の20%のピペリジンを用いておこなって、合成され た。Fmoc−シス（Trt）−O−PEG−PS樹脂から開始し、アミノ基を解放するのに ４倍過剰な活性化されたアミノ酸を用いて、ペプチドは、以下のアミノ酸誘導体 を用いて順次合成された。すなわち、Fmoc−O（tert−ブチル）−チロシン、Fmo c−グリシン、ジ−Fmoc−リシンおよびFmoc−Nt−tert−ブトキシカルボニルリ シンである。最終結合が完了した後、Ｎ末端Fmoc基は、ジメチルホルムアミド中 の20%のピペリジンを用いて除去された。 ペプチドは、試薬Ｋ（TFA、水、フェノール、チオアニソール、１、２−エタ ンジチオール：82.5:5:5:5:2.5）を用いて乾燥された樹脂から開裂され、イオン 交換（SP-セファローズ）および逆相hplcにより精製された。 １：１のアセトニトリル：水の混合物1ml中のデンドリマー15mg（20μmol）ヘ と、エタノール100μl中の２、２−ジピリジルジスルフィド、6mg（1.5モル等量 ）が添加された。この混合物を室温で５分間放置した後、ペプチドは、hplcによ り精製された。 凍結乾燥されたペプチド10mg（12μmol）が、１：１のアセトニトリル：0.1 Mの硼酸、pH9.0の1ml中に溶解された。pHは、NaOHを添加することによって、9.0 に調整された。その後、このペプチド溶液は、アセトニトリル／硼酸溶液1ml中 に溶解された４−（α−Ｄ−マンノピラノシロキシ）−フェニルイソチオシアネ ート、95mgへと添加された。マンノシル化は、37℃で16時間、放置して進行させ た。 マンノシル化されたペプチドのチオールは、固体ジチオスレイトル20mgを添加 することにより減少させた。その後、ペプチドは、高分解能ゲル濾過により精製 された。 適切な分光光度アッセイを用いて、マンノシル化されたペプチドは、１ペプチ ド分子につき平均で３つから４つのマンノース基を有すると判定された。 6.3.2.2 マンノシル化されたデンドリマー配位子Man4Den2のNBC12への接合（Ma n4DEN2-NBC12接合体の合成） 50mMのイミダゾール、pH6.9、1.0ml中のNBC12、41.2mg（10.2μmol）が、イミ ダゾール緩衝液内で調製された0.1Mの過ヨウ素酸ナトリウムを0.50ml添加するこ とにより酸化された。室温で５分間反応させた後、エチレングリコール（市販の 溶液）を0.50ml添加することにより、反応を停止させた。培地は、逆相HPLCによ る精製をおこなう以前に、酢酸を用いてpH3.0に酸性化された。凍結乾燥の後、 酸化されたNBC12が30mg得られた。 マレイミド機能が４（−４−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド4.3mg（12. 2μmol）、HCl、l/2ジオキサンを、20%のアセトニトリルを含有する0.1Mの酢酸 ナトリウム、pH4.6、2.0ml中の酸化されたNBC12、10mg（2.5μmol）へと添加す ることによって、NBC12へと導入された。室温で15時間インキュベーションをお こなった後、ヒドラゾンが、1%の酢酸、pH4.7中でのゲル濾過により精製された 。ペプチド溶液は、凍結乾燥された。 3.2μmolのペプチド（チオール分析により決定される）を含有する1.0mlの50% のアセトニトリル／水が、20%のアセトニトリルを含有する0.1MのHEPES、pH7.5 中のMAL-NBC12、5.0mg（1.1μmol）へと添加された。室温で２時間インキュベー ションをおこなった後、この物質は、逆相調製用HPLCにより精製され、その 後直ちに凍結乾燥された。このペプチド構成は、Man4Den2-NBC12'と命名された 。 6.3.3 マンノシル化されたリシンデンドリマー−NBC12接合体Man4DEN5-NBC12' の調製 Man4Den2-NBC12'は、Man4Den2-NBC12'と構造面で類似するNBC12のマンノシル 化されたデンドリマー誘導体である。しかし、この場合、マンノシル側鎖は、テ トラ−Ｏ−アセチル−マンノース−α−Fmoc−セリン誘導体を用いた固相ペプチ ド合成結合方法を用いて導入される。 ペプチドデンドリマーは、Fmoc−Ｎt−tert−ブトキシカルボニルリシンの代 わりにジ−Fmoc−リシンが用いられた点を別にして、上述したのと同様にMillip ore 9050およびPepsynthesiserを用いて合成された。 これらのペプチドを樹脂上にして、４つのFmoc保護されたアミン基が、ジメチ ルホルムアミド中の20%のピペリジンを用いて保護解除された。その後、これら の自由アミンは、TBTU／N−エチルジイソプロピルアミンを活性剤として用いて 、（16倍のモル量だけ過剰なペプチド中の）テトラ−Ｏ−Ac−マン−α−Fmoc− セリン残基と反応させられた。結合が完了した後、Ｎ末端Fmoc基は、2%のピペリ ジンを含有するジメチルホルムアミド中の2%のDBUを用いて除去された。 これらのグリコペプチドは、過剰な95%のTFAを室温で２時間添加することによ って、樹脂から開裂された。このグリコペプチドは、10倍の容積中のエーテルに 沈殿させられた。このエーテルは、遠心分離後に廃棄され、hplcにより精製され た。 カルボヒドレート部分に存在するＯ−アセチル保護基を除去するために、これ らのペプチドは、HPLCによる最終精製以前に、NaOMe/MeOHを用いて処理された。 グリコペプチドMan4Den5は、上述したように、マレイミド−ヒドラジド二重機 能架橋剤を介してNBC12に結合された。あるいは、このグリコペプチドは、「Man 4Den4の合成」に記載されているヒドロキシメチル安息香酸（HMBA）樹脂結合剤 および開裂方法を用いることによって、C末端ヒドラジド基と合成された。この ようなヒドラジド誘導体は、Man4Den4-NBC12の合成について述べたように、ヒト のペプチドを酸化されたNBC12へと直接、結合するのにも用いられ得る。 ６）マンノシル化されたNBC1の生物活性 Manl-NBC1の潜在性を評価するために、培養液中のHepG2細胞へのルシフェラー ゼ遺伝子の転写が測定された。このアッセイは、クロロキンの濃度を標準的な12 0μMから240μMへと増加させたこと、およびHepG2細胞が、酵素アッセイ以前に2 4時間および90時間のあいだ培養されたことを別にして、実施例４に記載されて いるようにおこなわれた。 このアッセイの結果は、図16に示されている。 実施例７ リポ-ペプチド複合体を含む遺伝子移入複合体 7.1 Ｎ-パルミチル誘導体 7.1.1 Ｎ−パルミチルＮＢＣ誘導体の合成 パルミチン酸Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル(樹脂１グラムにつき0.5 ｇ)を、Ｎ-末端アミド脱保護された、樹脂に結合したペプチド(側鎖保護された) -Ｏ-ＰＥＧ-ＰＳ樹脂含有メタノール/クロロホルム(1:4；実施例２に記載のよう に樹脂１グラムにつき５mlを合成)の懸濁液に添加した。反応物を48時間室温に て振とうし、樹脂を濾過して取り除き、クロロホルムで３度洗浄し、メタノール で洗浄し、真空中で乾燥した。 ＴＦＡ/水/フェノール/チオアニゾール/1,2-エタンジチオール(82.５：５：5 ：5：2.5)混合物を用いてペプチドを樹脂から開裂した(開裂する樹脂１グラムに つき10mlの混合物)。次いで、樹脂を濾過することにより取り除き、無水トリフ ルオロ酢酸で３度洗浄した。合わせた濾過液および洗浄液を、蒸発により濃縮し 、ジエチルエーテルを用いて沈殿させ、その後、遠心分離により粗ペプチドを得 た。 粗ペプチドを、少量の25mM ＨＥＰＥＳ(pH7.4)に溶解し、適切な大きさのＳＰ -Sepharose高速流体カラムに入れ、0-2M NaCl含有25mM ＨＥＰＥＳ(pH7.4)の勾 配を20カラム容量以上用いて溶離した。分析的逆相ｈｐｌｃが示すペプチドを含 有する画分をプールし、調製用の逆相ｈｐｌｃ(Dynamax 83-221-Cカラム)に直 接入れ、適切な勾配のアセトニトリル(0.1％ＴＦＡ)を含む水(0.1％ＴＦＡ)用い て溶離した(典型的に、30-50％アセトニトリルで20分)。所望のペプチドを含有 する画分をプールし、真空中でアセトニトリルを蒸発し、凍結乾燥した。LIP-ペ プチドを、１％酢酸含有水の入ったSephadex G25精密カラム(1.6×30ｃｍ)で溶 離することにより脱塩した。その結果得た画分を、逆相ｈｐｌｃにより分析し、 純ペプチドを含有する画分をプールし、凍結乾燥して、最終的なペプチドを得た 。 7.1.2 パルミチル-ポリリシンの合成 パルミチン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(25.7mg)を、ポリ-(ε-C bz)-リシン(分子量約2000)(97.3mg)を含む乾燥ジメチルホルムアミド(1.5ml)の 撹拌溶液に添加した。その結果得た溶液を、一晩室温にて撹拌させた。水(49ml) を添加し、その結果得た沈殿物をスピンダウンした。上清を、デカントして処分 し、ペレットを冷凍し、凍結乾燥した。 残った固体を、30％ ＨＢｒ含有酢酸(６ml)に溶解し、室温にて30分間撹拌し た。エーテル(44ml)を添加し、得られた沈殿物をスピンダウンした。エーテルの ２番目のアリコート(30ml)を、添加し、ペレットを再懸濁し、再度スピンダウン した。ペレットを、次いで、水(15ml)中で混ぜ、凍結乾燥した。 7.1.3 Ｎ-パルミチル結合体を含む遺伝子移入複合体のアセンブリ 脂質含有複合体を実施例４に記載のようにアセンブリし得る。リポペプチドを 、ペプチド混合物をDNA溶液に添加する前に、ＮＢＣで縮合したペプチド溶液と 混合し得る。または、リポペプチドを、ＮＢＣでの縮合の後に、細胞への添加前 の希釈工程の前後に、複合体に添加し得る。これらの場合、リポペプチドの添加 の前に、複合体を一晩インキュベートしなければならない。 7.1.4 トランスフェクション効率に対するＮ-パルミチルペプチドの効果 7.1.4.1 標的化した遺伝子送達 図17は、抗ＣＤ７-ＮＢＣ２結合体のトランスフェクション効率に対するＮ-パ ルミトイル-ＮＢＣ２の効果を示している。複合体を、実施例４に記載のように 作成した。DNAをまず、ゲルリタデーションアッセイを用いて定量し材料の50％ を縮合するように結合体で処置した。完全縮合が得られるように、非結合ＮＢＣ １およびＮ-パルミチル-ＮＢＣ１の種々の混合物を添加した。次いで、これらの 複合体を、100μMクロロキンを使用したことを除いては標準のアッセイシステム において採用した。図17からわかるように、12.5％Ｎ-パルミチル-ＮＢＣ１の存 在下で、非常に高いトランスフェクション効率を得た。この結合体に関しては、 効率に40倍の上昇が認められた。 図18は、抗ＣＤ３３-ＮＢＣ２結合体のトランスフェクション効率に対するＮ −パルミトイル-ＮＢＣ１の効果を示していることを除いては、図17と同様のデ ータを示す。 7.1.4.2 非標的化遺伝子送達 塩基性残基とリン酸との比率が1.0を上回ってアセンブリした複合体で細胞を 処置した場合に(実施例４に記載および図５に示すように)認められるトランスフ ェクション効率は、複合体にパルミチル化ペプチドを取り入れることによって有 意に上昇する。 図19は、Lip2とＮＢＣ２との最適な比率が、トランスフェクション活性を、＞ ２桁高めることができることを示す。図20は、この効果が、低多分散性の誘導体 化ペプチドの共通の特質であることを示す。これらのデータはまた、乏しい相対 トランスフェクション効率を有するペプチド(例えば、ＮＢＣ８)が、Ｎ-末端パ ルミチル基(例えば、Lip８)で誘導体化される場合には、他の低多分散性の規定 核酸縮合ペプチドと合わせると、効能のあるトランスフェクション作用物質を形 成できることを示す。しかし、これは、これらの誘導体化ペプチドを、ポリ-Ｌ- リシン(図21)と合わせて使用する場合には当てはまらない。この場合、低多分散 性の誘導体化ペプチド(Lip13)は、高多分散性のポリマー(ポリ-Ｌ-リシン)によ ってトランスフェクションを向上しなかった。この図はまた、上記したようにＮ -末端パルミチル基で誘導体化したポリ-Ｌ-リシンポリマーが、低多分散性のペ プチド(Lip13)よりも有意に低いレベル(＜２桁)の低多分散性のペプチドにより 縮合したDNAによるトランスフェクションを向上することを示す。このデータは また、高多分散性の誘導体化ポリマーが、非誘導体化ポリマーで縮合したDNAの トランスフェクションを向上しなかったことを示す。 トランスフェクションの最適な比率は、標的細胞組織によって変化する。図22 は、２つの異なる細胞株K562およびHepG2、ならびにＮＢＣ２中の同じ処方物Lip ２から得た異なるトランスフェクションレベルを示す。K562細胞の場合、活性化 におけるわずかなブーストを認め、HepG2の場合、処方物の最適比率は＞1.0μg/ μgDNAであった。ジャーカット細胞の最適比率は、0.13〜0.6μgペプチド/μgDN Aである。 複合体中のパルミチレート化ＮＢＣペプチドの存在はまた、血漿による不活性 化に対するより高い耐性を付与する。図23は、種々のヒト血漿量で合成ウイルス 様粒子を予備インキュベートした場合のトランスフェクション効率に対する効果 を示す。処方物中のLip2の存在は、この劣化に対するさらなる耐性を明らかに付 与する。1.5μg ＮＢＣ２のDNA処方物を用いて実質的に上述のようにＮＢＣ２合 成ウイルス様粒子を調製し、25mM Ｈｅｐｅｓ、0.85Ｍ塩化ナトリウム(pH7.4)中 で、10μgDNA/mlの濃度まで希釈した。1.5μgLip2/μgDNAを25mM Ｈｅｐｅｓ、0 .85Ｍ塩化ナトリウム(pH7.4)中で混合することによって、Lip2合成ウイルス様粒 子を調製した。合成ウイルス様粒子を50％、25％、10％、および０％の新たに調 製したヒト血漿を含有する同じ容量の希釈/トランスフェクション媒体、および1 00μMクロロキンで希釈した。溶液を、次いで、120μMクロロキンを含む１×106 ジャーカット細胞含有ＲＰＭＩと混合した。４時間後、細胞を遠心分離し、媒体 を除去し、10％子ウシ血清を含む2.5mlのＲＰＭＩ媒体中に細胞を再懸濁した。2 4時間後、細胞を回収し、25mM Ｈｅｐｅｓ、0.85M塩化ナトリウム(pH7.4)中で洗 浄し、溶解し、ルシフェラーゼ発現のレベルを上述したように定量した。 7.2 コレステリル誘導体 7.2.1 コレステリルＮＢＣ１２(Chol3 β-ＮＢＣ１２1)の合成 7.2.1.1. ＮＢＣ１２の酸化 41.2mg(10.2μmol)ＮＢＣ１２含有1.0ml 50mMイミダゾール(pH6.9)を、イミダ ゾール緩衝液中で調製した0.50ml 0.1M過ヨウ素酸ナトリウムの追加により酸化 した。５分の室温での反応の後、0.50mlエチレングリコール(市販溶液)を追加し て反応を停止した。逆相ＨＰＬＣによる精製の前に、酢酸を用いて媒体を酸性化 した(pH3.0)。凍結乾燥の後、30.0mg酸化ＮＢＣ１２を得た。 7.2.1.2 コレステリルクロロホルメートからのコレステリル３オキシカルボヒ ドラジドの合成 200mg(450μmol)コレステリルクロロホルメートを含む８ml 1：1クロロホルム ：メタノールの激しく撹拌した溶液に、1.5ml(20mmolヒドラジン水化物を添加し た。室温にて１時間後、ＴＬＣによる分析のためサンプルを取り出し、出発材料 (Rf=0.45を含む8：1ヘキサン：クロロホルム溶媒システム)が、完全に生成物(Rf =0.00)に変化したことがわかった。３×10ml水を用いて、有機相からヒドラジン を除去した。最後に、有機溶媒を蒸発させ、得られた白い固体をエタノールで洗 浄した。生成物を真空中で２時間乾燥した。110mgのコレステリル３オキシカル ボヒドラジドを得た。 エレクトロスプレー質量分析およびＩＲ分析によって正しい合成を確認した。 7.2.1.3 Chol3 β-ＮＢＣ１２1の合成 40mg(90μmol)コレステリル３オキシカルボヒドラジドを、0.8mlクロロホルム に溶解し、15.0mg(3.8μmol)酸化ＮＢＣ１２を含む0.8mlＭｅＯＨに添加した。 反応物を４時間室温にて放置した。0.1％ＴＦＡを含むアセトニトリル/水溶媒シ ステムを用いて、調製用の逆相ＨＰＬＣによって結合体を単離した。アセトニト リルの蒸発の後、ペプチド結合体を凍結乾燥した。6.7mgの結合体を得、-80℃で 保存した。 7.2.2 Chol-ＮＢＣ１２1の生物活性 コレステリルＮＢＣ１２のDNAを縮合する能力を、実施例４に記載のように確 認した。以下のペプチド比率で、ＲＳＶＬｕｃ血漿DNAをＮＢＣ９で共縮合する ことによって、このリポペプチドの遺伝子移入を促進する能力を測定した。 処方物は以下の様に調製した： 最終DNA濃度が100μg/mlとなるように、必要量の最終DNA1μgにつき２μg Ｎ ＢＣ９を、DNAの必須量と混合した。必要な濃度の脂質化(lipidated)ペプチドを 得るために必要となるChol3 β-ＮＢＣ１２1の量を、次いで、複合体に添加し、 複合体を室温にて１時間インキュベートする。全ての溶液の緩衝液は、0.6M NaC l、25mMリン酸緩衝液(pH7.4)であった。４℃での一晩のインキュベーションの後 、複合体を、10％ＰＥＧ10000、150μMクロロキンおよび37mM塩化ナトリウム、 ならびに25mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)の溶液で20μg/mlまで希釈した。 実施例４に記載のようにジャーカット細胞を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子移 入の効率について複合体をアッセイした。結果を図24に示す。 7.3 マンノシル-脂質-結合体 脂質および標的リガンドのコンビネーションもまた、核酸結合ペプチドに付着 し得る。 7.3.1 脂質スペーサを含むマンノシル化されたデンドリマー(dendrimer)-ＮＢ Ｃ１２結合体(Man4Den3-NBC12l)の調製 この結合体は、マンノシル化リシンデンドリマリガンドが、11炭素の炭化水素 スペーサによって、核酸結合ペプチドから分離されていることを除いては、Man4 Den2-ＮＢＣ１２1と同様の構造を有する。 ＴＭＳ-Ｃｌ(4.9ml、38.7mmol)を、アミノウンデカン酸(aminoundecanoic aci d)(3.9g、19.37mmol)含有ジクロロメタン(45.2ml)の撹拌懸濁液に添加し、反応 物を室温にて15分間撹拌した。Ｎ-エチルジイソプロピルアミン(5.81ml)を、反 応物に添加し、さらに室温にて15分間撹拌し、次いで加熱し、１時間環流した。 室温まで冷却した後、９-フルオレニルメトキシカルボニルクロライド(Ｆｍｏｃ -Ｃｌ；5.51g、21.3mmol)を撹拌溶液に添加し、反応物をさらに２時間撹拌した 。反応混合物を、次いで、水に注いで振とうし、層の間で沈殿したＦｍｏｃ-ア ミノ-ウンデカン酸を濾過し、真空中で乾燥し、生成物(4.21g、9.9mmol)を得る 。 延長サイクルモード(１時間結合)で流れるMillipore 9050、そしてPepsynthes iSerを用いて、リシンデンドリマDen3(Lys)3-Gly-Gly-Tyr-アミノウンデカン-Cy s-を合成し、ＴＢＴＵ/Ｎ-エチルジイソプロピルアミン活性化し、および20％ピ ペリジン含有ジメチルホルムアミドで脱保護樹脂した。Ｆｍｏｃ-Ｃｙｓ(Ｔｒｔ )-Ｏ-ＰＥＧ-ＰＳ樹脂から出発し、４倍過剰の活性化アミノ酸を用いてアミノ基 を遊離し、以下のアミノ酸誘導体を連続的に用いてペプチドを合成した；Ｆｍｏ ｃ-アミノ-ウンデカン酸；Ｆｍｏｃ-Ｏ(tert-ブチル)-チロシン、Ｆｍｏｃ-グリ シン、ジ-Ｆｍｏｃ-リシン、およびＦｍｏｃ-Ｎt-tert-ブトキシカルボニルリシ ン。最終結合が終了した後、20％ピペリジン含有ジメチルホルムアミドを用いて Ｎ-末端Ｆｍｏｃ基を除去した。 ペプチドを、試薬Ｋ(ＴＦＡ、水、フェノール、チオアニゾール、1,2-エタン ジチオール；82.5：5：5：5：2.5)を用いて乾燥樹脂から開裂し、イオン交換(SP -セファローズ)および逆相ｈｐｌｃにより精製した。 15mg(20μmol)のデンドリマを含有する１mlの1:1アセトニトリル:水混合液に 、６mg(1.5モル等量)の2,21-ジピリジルジ硫化物含有100μlエタノールを添加し た。混合物を室温にて５分間放置した後、ＨＰＬＣでペプチドを精製した。 10mg(13μmol)凍結乾燥したペプチドを、１mlの1:1アセトニトリル:0.1Mほう 酸塩(pH9.0)に溶解した。pHは、ＮａＯＨの添加によって9.0に調整した。ペプチ ド 溶液を、次いで、１mlのアセトニトリル/ほう酸溶液に溶解した95mg ４-(α-D- マンノピラノシルオキシ)-フェニルイソチオシアネートに添加した。16時間の37 ℃でのマンノシル化に進めた。 20mgの固体ジチオストレイオールを添加することによって、マンノシル化ペプ チドのチオールを還元した。ペプチドを、次いで、高分解能ゲル濾過によって精 製した。 適切な分光光度アッセイを用いて、マンノシル化ペプチドを定量し、１ペプチ ド分子につき平均で３から４のマンノシル基を得た。グリコシル化された脂質デ ンドリマを、6.3.2.1に記載の手法と似た手法でＮＢＣ１２と結合した。 7.3.2 インシュリン-ＮＢＣ141.20-コレステロール結合体 7.3.2.1 合成 チオコレステロール(0.5mg、1.24μmol)を含むクロロホルム(100μl)の溶液を 、インシュリン-ＮＢＣ１４1(2mg、0.24μmol)を含むメタノール(400μl)の撹拌 溶液に添加した。反応物を、室温にて１時間、次いで４℃にて17時間撹拌するた めに放置した。反応混合物を、次いで、乾燥するまで蒸発させ、水中で再溶解し 、遠心分離によって沈殿物を除去した。上清を、PD-10カラム(Pharmacia)にいれ 、水で溶離した。0.75ml画分を取り出し、真空遠心分離器中で画分3-7を合わせ 、容量1.5mlまで縮合した。275nmでのそのＵＶ吸収率(0.23)により、最終生成物 の濃度を0.39mg/ml(44.5μM)と定量した。 実施例８ フソゲンペプチド-ＮＢＣ結合体 8.1 インフルエンザＨＡペプチド結合体の合成 本発明のペプチドに、以下のように官能基を結合した。フソゲンペプチドは、 代表的な官能基の１つである。インフルエンザＨＡ由来のフソゲンペプチド(Ｆ Ｐ１３)は、以下の配列を有し得る： ＮＧ2-ＧＬＦＥＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＧＧＣ(Ａｃｍ)-ＣＯＯＨ 8.1.1 Ｈ2Ｎ-ＦＰ１３-(Ｓ-アセタミドメチル-Ｃｙｓ)-ＣＯＯＨの合成 延長サイクルモード(１時間結合)で、Millipore 9050、そしてペプチド合成 器を用いてペプチドを合成した。Ｆｍｏｃ-Ｃｙｓ(Ａｃｍ)-Ｏ-ＰＥＧ-ＰＳ樹脂 (Perseptive Biosystem Ltd.)を用いた。20％ピペリジン含有ジメチルホルムア ミドでのＦｍｏｃ基の脱保護の後、O-(１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-ｙｌ)-テト ラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(ＴＢＴＵ)/１-ヒドロキシベンゾト リアゾールおよびＮ-エチル-ジイソプロピルアミンを活性化剤として用いて、得 られたアミノ酸を４倍過剰で結合した。ペプチドの合成終了後、Ｎ-末端Ｆｍｏ ｃ基を上記のように除去し、樹脂に結合した遊離のＮ-末端アミノ側鎖保護され たペプチドを得た。これは、ＴＦＡ/水/フェノール/チオアニソール/1,3-エタン ジチオール(82.5:5:5:5:2.5)混合物を用いて樹脂から開裂した。所望の生成物を 得るために、エーテルおよび遠心分離による沈殿に続いて、ゲル濾過を用いてペ プチドを精製し得る。 ペプチド上のアセタミドメチル(Ａｃｍ)チオール保護基は、水/アセトニトリ ル(1:1；0.1％ＴＦＡ)を溶媒とし、水銀(II)アセテートを用いて取り除かれ、そ の後、２-メルカプトエタノールによる水銀の沈殿が続き得る。結果として得た 遊離のチオールペプチドは、所望の生成物を得るためにゲル濾過を用いて精製さ れ得る。 8.1.1.2 ＦＰ１３-ＮＢＣ２30の合成 ＮＢＣ２(チオール形態)を、標準固相法により合成し、実施例２に記載のよう にｈｐｌｃにより精製した。ペプチドを、50モル過剰の2,2-ジチオピリジルジス ルフィド、およびゲル濾過により精製したＳ-ピリジル誘導体で処置した。この 中間物の５％モル過剰分を、次いで、脱保護フソゲンペプチドの還元チオール、 およびイオン交換クロマトグラフィにより単離した結合体と反応させた。 8.1.1.3 ＦＰ１３-ＮＢＣ１２1 ＦＰ１を、Ｃ-末端チオールにヒドラジド残基を配置する、２モル過剰分のブ ロモアセチル-ヒドラジドと誘導体化した。ｈｐｌｃによる精製後、このＦＰ１ 中間物を、過ヨウ素酸酸化ＮＢＣ１２の５×モル過剰分と反応させた。ＮＢＣ１ ２を、実施例7.2.1.1.に記載の方法で酸化した。その結果得た結合体は、ＦＰと ＮＢＣ２との間のヒドラゾンリンケージを含む。理論的に、このリンケージは、 酸に対して不安定であり、エンドソーム中の酸性状態の下では破壊し、遊離ＦＰ １を縮合DNA-結合複合体から放出する。または、ヒドラゾン基を、ホウ化水素ナ トリウムで還元し、ヒドラジド結合を安定し得る。 8.1.1.4 Ｃ-末端プロテアーゼ開裂可能な配列FP13を含む フソゲンペプチドの合成 FP13の配列は以下の通りである： ＮＨ2-ＧＬＦＥＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＧＧＦ*ＬＧＥＧＧＳＣ-ＣＯ ＯＨ このペプチドを、実施例8.1.1に記載したように標準固相自動法で合成した。 FP13のエンドソームプロテアーゼ開裂の実証 ペプチドFP13アミノ酸配列に存在するプロテアーゼー開裂可能配列「ＧＦＬＧ」 [Gly-Phe-Leu-Gly](上記参照)を、アスパラギン酸プロテアーゼカテプシンＤを 用いて開裂した。カテプシンＤ活性は、エンドソームのコンパートメントにおい て認めた。結合FP13ペプチドを含む複合体は、結合FP13を含むものと比較してト ランスフェクション効率を上昇し得た。なぜなら、理論的には、FP13配列は、エ ンドソームにおいて開裂されるため、ペプチドがエンドソームの膜と融合するこ とが可能になる。遊離のペプチドは、高いフソゲン活性を有することが示されて きた[Wagnerら[1992]Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A．89，7934-38。 開裂したペプチドをゲル濾過分析で観察しながら、pH5.0において急速に、そ してpH7.0において非常に遅くペプチドを開裂した。「ＧＦＬＧ」配列のフェニルアラニンとロイシンとの間のペプチド結合(*)を、 カテプシンＤによって加水分解し、モル量2370と622の２つの画分を得た。280nm において、大きい方のＮ-末端画分は吸収を有し、小さい方の画分は有さない。 従って、開裂反応を、高分解能ゲル濾過から得た溶離物のＡ280を測定すること によって観察できる。 50mMクエン酸ナトリウム(pH5.0)；50mMクエン酸ナトリウム(pH6.0)；または50 mMＨＥＰＥＳ(pH7.0)のいずれかを用いて、450μlの1mg/mlペプチド溶液含有0.1 5M NaClを調製した。37℃での予備インキュベーションの後、50μlのカテプシン Ｄ(EC3.4.23.5)含有水(1mg/ml：5-15ユニット/ml)を添加し溶液を混合した。ヘ モグロビンを基質として用いたＴＣＡ-可溶生成物として、37℃にてpH3.0で測定 (１cm光路)すると、１ユニットでＡ280を毎分１mlにつき1.0上昇させる。37℃に て30および90分後、100μlサブサンプルを、すぐに分析するために、Superdex P eptide HR 10/30カラム(ランニング緩衝液、HBS；流量、0.75ml/分；280nmでの 検出)を用いて高分解能ゲル濾過により取り出した。 各サンプルのゲル濾過から得たＡ280溶離プロファイルを分析することにより 、開裂反応がpH5.0において速く、pH7.0では遅いことを認めた。 このペプチドは、実施例8.1.....、8.1.2、および8.1.3に記載した方法によりＮ ＢＣペプチドに結合し得る。実施例９ 細胞への酵素機能性の送達 9.1 西洋ワサビペルオキシダーゼのＮＢＣ２への結合 10mgの西洋ワサビペルオキシダーゼを、２mlのナトリウムアセテート(pH５)に 溶解した。10mMまでナトリウム過ヨウ素酸を加え、溶液を室温にて１時間放置し た。溶液を脱塩し、Pharmacia PD10カラムで、緩衝液を25mM MES(pH６)に交換し た。２mg ＮＢＣ２を加え、溶液を室温にて１時間放置した。ナトリウムシアノ ホウ化水素(sodium cyanoborohydride)を10mM加え、溶液を２時間放置した。こ の時間の終わりに、グリシンを10mM加え、溶液を、２Ｌ25mMリン酸(pH7.4)に対 して一晩透析する前にさらに２時間放置した。 結合体を、ＳＰ-セファロースカラムで精製した。カラムを、25mMリン酸(pH7. 4)中で平衝し、粗結合体をロードした。非結合西洋ワサビペルオキシダーゼを、 直接カラムに通して洗浄した。O-1.5Ｍの塩勾配で結合体を溶離した。勾配から 得た茶色の画分をプールし、25mMリン酸(pH7.4)；0.6M NaCl中で平衝したSephac ryl S-300カラムにロードした。再度、カラムから溶離した茶色の画分をプール した。精製した結合体は、カラムから直接使用するには希薄過ぎた。従って、３ 段階で変化した５Ｌの蒸留水に対して透析し、次いで凍結乾燥した。得られた粉 末を、約0.8mlの水に溶解し、不溶性材料を取り除くために濾過した。 9.2 酵素送達のトランスフェクションおよびアッセイ 一般的な方法から外れた以下の例外を有して、実施例４において記載した、ジ ャーカット細胞を用いたトランスフェクションアッセイを採用した。50μgDNAを 、2.5mgの結合体を含む、0.6M塩化ナトリウム、25mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)、２％ＰＥＧ10,000中で縮合した。４℃での一晩のインキュベーションの後 、複合体溶液を、37mM塩化ナトリウム、25mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)、 濃度0.15μg/μgDNAでLip13を含有する10％ＰＥＧ10,000の溶液で１＋４希釈し た。通常通り、１アッセイポイント(２×106細胞)ごとに2.5μgDNAを使用した。 24時間後、細胞を、0.5％グルタルアルデヒド(glutraldhyde)中で10分間室温 にて固定した。次いで、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。次いで、 細胞を、Vectar Labs AEC(Vectar Labs Inc．Burlingaeme，CA．U.S.A.)で10分 間染色した。染色した細胞を、倍率×20の光学顕微鏡の下で試験した。結合体で 処置したサンプル(damples)は、関係する細胞の完全な黒の染色が明示するよう に約20％の送達頻度を示した。コントロールサンプルにおいては、黒の染色は認 めなかった。実施例１０ 核トロピック遺伝子移入複合体を用いた遺伝子移入 タンパク質、および核酸-タンパク質複合体の取り入れを制御することで知ら れるペプチド配列を取り入れることによって、トランスフェクションのレベルを 上げることができる。これらの配列は、縮合ペプチド構造(ＮＢＣ１およびＮＢ Ｃ２)、または縮合ペプチドに結合し得るペプチドドメインのいずれかに取り入 れられ得る。 10.1 縮合ペプチドに取り入れられた核局在化配列の効果 ＮＢＣ２は、SV40Ｔ抗体核局在化シグナルを含む。この配列は、配列を含むタ ンパク質の核局在化を促進することで知られる(Roberts，B（1989）Biochem．Bi ophys．Acta 1008，263)。ペプチドＮＢＣ５は、核局在化配列の配列が反転する ことを除いて、ＮＢＣ２と同様の構造を有する。配列モチーフの反転によって、 核局在化特質が無効になることが知られている。 ＮＢＣ２とＮＢＣ５との相対的なトランスフェクション効力を、ジャーカット 細胞を用いて、標準非標的トランスフェクションアッセイにおいて比較した(実 施例４に記載のように)。複合体を、0.6Ｍ塩化ナトリウム中で、２μg ＮＢＣ２ またはＮＢＣ５/μg ｐＲＳＶＬｕｃプラスミドDNAの比率でアセンブリした。ト ランスフェクションを促進するために、希釈前に0.15μg Lip13を核複合体に添 加した。 結果 複合体 ルシフェラーゼ活性 複製１ 複製２ ＮＢＣ２＋Lip13 3,280,572 3,332,902 ＮＢＣ５＋Lip13 935,883 878,306 10.2 Ｍ９-ＮＢＣ２の合成 Ｍ９は、ｈｎＲＮＰ Ａｌの核局在化ドメインを含む。Ｍ９の配列は以下の通 りである： Ｍ９ ＮＨ2-ＴＧＮＹＮＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧ ＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹＣ-ＣＯＯＨ Ｎ-末端チレオニン残基、およびＣ-末端システイン残基を添加し、ＮＢＣ２への 化学的結合を行うことにより配列を改変した。ペプチドを、Millipore 9050、そ れにペプチド合成器を用いて、延長合成サイクルモード(１時間結合)で合成した 。Ｆｍｏｃ-Ｃｙｓ(Ａｃｍ)-Ｏ-ＰＥＧ-ＰＳ-を使用した。20％ピペリジン含有 ジメチルホルムアミドを用いたＦｍｏｃ基の脱保護の後、結果として得たアミノ 酸を、O-(１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-ｙｌ)-テトラメチルウロニウムテトラフ ルオロボレート(ＴＢＴＵ)/１-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびＮ-エチル- ジイソプロピルアミンを活性化剤として用いて４倍過剰で結合した。ペプチドの 合成の終了後、Ｎ-末端Ｆｍｏｃ基を上記のように取り除き、樹脂に結合した遊 離のＮ-末端アミノ側鎖保護ペプチドを得た。これは、ＴＦＡ/水/フェノール/チ オアニソール/1,2-エタンジチオール(82.5:5:5:5:2.5)混合物を用いて樹脂から 開裂した。所望の生成物を得るために、エーテルおよび遠心分離による沈殿に続 いて、ゲル濾過を用いてペプチドを精製し得る。 ペプチド上のアセタミドメチル(Ａｃｍ)チオール保護基は、水/アセトニトリ ル(1:1；0.1％ＴＦＡ)を溶媒とし、水銀(II)アセテートを用いて取り除かれ、そ の後、２-メルカプトエタノールによる水銀の沈殿が続く。結果として得た遊離 のチオールペプチドは、所望の生成物を得るためにゲル濾過を用いて精製され得 る。 ＮＢＣ２へのＭ９配列の結合は、過ヨウ素酸によるＭ９配列の酸化によって、 Ｎ-末端アルデヒド機能性を形成することにより最も良好に行われる。ＮＢＣ２ のチオールを、脱ブロックし、ブロモアセチルヒドラジドと反応させる。ＮＢＣ ２のヒドラジドを、次いで、酸化Ｍ９およびｈｐｌｃによって精製した結合体と 反応させる。 10.3 ＨＩＶマトリクスタンパク質およびＮＢＣ１２(ＭＡＴ１-ＮＢＣ１２)の 結合体の合成 ＨＩＶは、非分割細胞を感染することが可能なレトロウイルスである。ＨＩＶ マトリクスタンパク質は、この特質の原因となるタンパク質の一つであり、タン パク質は、２つの核局在化配列を有し、核膜孔を通るウイルスの輸送の要因であ ると考えられる(Gallayら、（1995）Cell 80，379;（1996）83，859)。この影響 の要因と考えられる配列モチーフは、以下の構造を有するＭＡＴ１と称される合 成ペプチド配列の設計において取り入れる。 Biosearch 9050、そしてPepsynthesizerを用いて、延長合成サイクルモードで 、ＤＭＦを含むＦｍｏｃ-Ｃｙｓ(Ａｃｍ)-Ｏ-ＰＥＧ-ＰＳ-樹脂を溶媒として用 いて、ペプチドを合成した。各結合前のＮ-末端Ｆｍｏｃ基の脱保護は、20％ピ ペリジン含有ＤＭＦの溶液を用いて行った(高流量において１分間、続けて３ml/ 分にて10分間)。O-(１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-ｙｌ)-テトラメチルウロニウ ムテトラフルオロボレート(ＴＢＴＵ)/１-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび Ｎ-エチル-ジイソプロピルアミンを活性化剤として用いて、アミノ酸を４倍過剰 で結合した。合成の間、結合時間を１時間に設定した。以下のアミノ酸誘導体を 使用した：Ｆｍｏｃ-Ａｌａ-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ａｓｎ(Ｔｒｔ)-ＯＨ、Ｆｍｏｃ- Ａｓｐ(ＯＢｕ)-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｇｌｎ(Ｔｒｔ)-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｇｌｙ-ＯＨ 、 Ｆｍｏｃ-Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｉｌｅ-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｌｅｕ-ＯＨ 、Ｆｍｏｃ-Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｓｅｒ(Ｂｕ)-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｔ ｈｒ(Ｂｕ)-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｔｙｒ(Ｂｕ)-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｖａｌ-ＯＨ。ペプ チドの合成の完了後、Ｎ-末端Ｆｍｏｃ基を、上記のように取り除き、樹脂に結 合した遊離のアミノ側鎖保護ペプチドを得た。次いで、樹脂を、メタノールの入 ったガラスバイアル中で洗浄し、真空中で乾燥した。 ＴＦＡ/水/フェノール/チオアニゾール/1,2-エタンジチオール(82.5：5：5：5 ：2.5)混合物を用いてペプチドを樹脂から開裂した(開裂する樹脂１グラムにつ き10mlの混合物)。次いで、樹脂を濾過することにより取り除き、ＴＦＡで３度 洗浄した。組合わせた濾過液および洗浄液を、蒸発により濃縮し、ジエチルエー テルを用いて沈殿させ、その後、遠心分離により粗ペプチドを得た。 粗ペプチドを、少量の１％酢酸含有水に溶解し、適切な大きさのSephadex G25 (精密)カラムに入れ、同じ１%酢酸溶液を用いて溶離した。分析的逆相ｈｐｌｃ によって示されるように、ペプチドを含有する画分をプールし、凍結乾燥した。 Dynamax 83-221-Cカラム、および適切な勾配のアセトニトリル(0.1%ＴＦＡ)含有 水(0.1%ＴＦＡ)を20分にわたり用いた調製用の逆相ｈｐｌｃにより追加の精製を 行った。ペプチドを含む画分をプールし、真空中でアセトニトリルを蒸発し、凍 結乾燥した。 ペプチドを、次いで、１％酢酸含有水の入ったsephadex G25精密カラム(1.6× 30cm)で遊離することにより脱塩した。結果として得た画分を、上記のように逆 相ｈｐｌｃによって分析し、プールし、そして凍結乾燥した。 システイン樹脂のアセタミドメチル保護基は、水銀アセテート含有30％酢酸水 で処置することによって取り除き得る。この反応による生成物は、次いで、上記 したようにG25でのゲル濾過によりさらに精製し得る。遊離のチオール基を、次 いで、リンカーを介してペプチドをＮＢＣに付着するためのハンドルとして使用 し得る。または、ＮＢＣ１２について記載したように、Ｎ-端末チレオニン部分 の過ヨウ素酸での酸化は、適切なペプチドヒドラジドと結合し得るＮ-末端グリ オキサル誘導体を生じる。 10.4 アンテナペディアホメオドメインおよびＮＢＣ１２(ＡＮＴＩ-ＮＢＣ１２ )の結合体の合成 アンテナペディア遺伝子生成物のホメオドメインは、核局在化特質を有すると 示されてきた(Derossiら[1994]J.biol.Chem.269、10444)。この特質の要因と考 えられるドメインの配列を同定し、以下のペプチドに取り入れた。 Biosearch 9050、そしてPepsynthesizerを用いて、延長合成サイクルモードで 、ＤＭＦを含むＦｍｏｃ-Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)-Ｏ-ＰＥＧ-ＰＳ-樹脂を溶媒として用 いて、ペプチドを合成した。各結合前のＮ-末端Ｆｍｏｃ基の脱保護は、20％ピ ペリジン含有ＤＭＦの溶液を用いて行った(高流量において１分間、続けて３ml/ 分にて10分間)。O-(１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-ｙｌ)-テトラメチルウロニウ ムテトラフルオロボレート(ＴＢＴＵ)/１-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび Ｎ-エチルジイソプロピルアミンを活性化剤として用いて、アミノ酸を４倍過剰 で結合した。合成の間、結合時間を１時間に設定した。以下のアミノ酸誘導体を 使用した：Ｆｍｏｃ-Ａｒｇ(Ｐｂｆ)-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｇｌｎ(Ｔｒｔ）-ＯＨ、 Ｆｍｏｃ-Ｇｌｕ(ＯＢｕ)-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｉｌｅ-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｌｙｓ(Ｂｏ ｃ)-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｍｅｔ-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｐｈｅ-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｔｈｒ(Ｂ ｕ)-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｔｒｐ(Ｂｏｃ)-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｖａｌ-ＯＨ。ペプチドの 合成の完了後、Ｎ-末端Ｆｍｏｃ基を、上記のように取り除き、樹脂に結合した 遊離のアミノ側鎖保護ペプチドを得た。次いで、樹脂を、メタノールの入ったガ ラスバイアル中で洗浄し、真空中で乾燥した。 ＴＦＡ/水/フェノール/チオアニゾール/1,2-エタンジチオール(82.5：5：5：5 ：2.5)混合物を用いて、ペプチドを樹脂から開裂した(開裂する樹脂１グラムに つき10mlの混合物)。次いで、樹脂を濾過することにより取り除き、ＴＦＡで３ 度洗浄した。合わせた濾過液および洗浄液を、蒸発により濃縮し、ジエチルエー テルを用いて沈殿させ、その後、遠心分離により粗ペプチドを得た。 粗ペプチドを、少量の25mM炭酸アンモニウム含有水に溶解し、適切な大きさの Sephadex G25(精密)カラムに入れ、同じ25mM炭酸アンモニウム含有水を用いて溶 離した。分析的逆相ｈｐｌｃによって示すようにペプチドを含有する画分をプー ルし、凍結乾燥した。 所望であればこの段階で、チオール基をジピリジルジ硫化物でブロック/活性 化し得る。 Dynamax 83-221-Cカラム、および適切な勾配のアセトニトリル(0.1%ＴＦＡ)含 有水(0.1%ＴＦＡ)を用いた調製用の逆相ｈｐｌｃにより追加の精製を行った。ペ プチドを含む画分をプールし、真空中でアセトニトリルを蒸発し、凍結乾燥した 。 ペプチドを、次いで、25mM炭酸アンモニウム含有水で、sephadex G25精密カラ ム(1.6×30cm)で遊離することにより脱塩した。結果として得た画分を、上記の ように、逆相ｈｐｌｃにより分析し、プールし、凍結乾燥した。 ＮＢＣ１２について記載したように、Ｎ-端末チレオニン部分の過ヨウ素酸で の酸化は、適切なペプチドヒドラジドと結合し得るＮ-末端グリオキサル誘導体 を生じる。 実施例１１ 中性親水性ポリマーでコートされた合成ウィルス様粒子の調製 ＰＥＧのような中性親水性ポリマーは、血流中の粒子およびタンパク質のイン ビポにおける安定性に影響を及ぼすことが知られている。従って、このようなポ リマーの利用は、非経口的な遺伝子送達システムの開発に有効である。 １１．１ 無作為に誘導体化されたＰＥＧ核酸縮合ペプチドの合成 １００ｍｇの高リジンＮＢＣペプチドあるいはε−アミノブロック誘導体を、 ｐＨ８．８の２５ｍＭホウ酸塩緩衝液１００ｍｌ中に溶解する。固体ＰＥＧ化試 薬であるモノメトキシ−ポリエチレングリコール−ｐ−ニトロフェニルカーボネ ートを、利用可能なα−あるいはε−アミノ基の５倍のモル過剰分を与えるよう に計り分け、１００ｍｌの水に溶解する。その後、この試薬溶液をペプチド溶液 に加え、混合液を３７℃で３時間インキュベートする。この時間の終わりに、１ ００ｍＭのエタノールアミンを１０ｍｌ加えることによって、反応をクエンチす る。このＰＥＧ化したペプチドを、実施例２に記載したようなカチオン交換クロ マトグラフィによって精製し、実施例４に記載したような合成ウィルス様粒子内 に組み込む。インビボトランスフェクションを増大させるのに必要なＰＥＧ化ペ プチドの量は、ターゲット細胞の細胞型によって変わる。 １１．２ 規定ＰＥＧ結合体ＰＥＧ5000−ＮＢＣ１２38の調製 モノメトキシ−ＰＥＧ5000のマレイミド誘導体（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）を、Shea twater Polymers Inc.，Huntsville．Al．U.S.A.から入手し、これを用いて、完 全に規定されたＰＥＧ−ＮＢＣ９結合体を調製した。ＮＢＣ１２の単一のシステ インチオールを脱保護し、次のようにＰＥＧ上のマレイミド基と反応させた。２ ５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、０．１５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）中で、 ｍＰＥＧ−ＭＡＬを、ＮＢＣ１２のチオール型１５ｍｇの５倍のモル過剰分で加 えた。この反応を２５℃で１６時間放置した。 次の精製手順に従った。ゲルパーミエーション（セファデックスＧ−５０）カ ラムを用いて、遊離(free)ＮＢＣ１２およびＰＥＧ5000をきれいに分離(clear s eparation)することができる。従って、ゲルパーミエーションを用いて、結合体 および未反応ｍＰＥＧ−ＭＡＬから全ての未反応ＮＢＣ９を分離した。ＳＰ−セ ファロースに対するカチオン交換を行って、ＮＢＣ１２−Ｓ−ＭＡＬ−ＰＥＧ結 合体から未反応ｍＰＥＧ−ＭＡＬを分離した。予備実験によって、未反応ｍＰＥ Ｇ−ＭＡＬがＳＰ−セファロースに結合しなかったことを確認した。純粋な結合 体を脱塩し、そして凍結乾燥した。 Superdex Peptide分析によると、結合体はＮＢＣ１２よりも「重た」かった。 この結合体が共有結合していることは、ランニング緩衝液(running buffer)とし て６Ｍのグアニジン、ＨＣｌを用いた、Superdex Peptideカラムでのゲル濾過に よる証拠によって裏付けられる。 １１．３ グリコシルレセプターへのターゲティングを行うことができる規定Ｐ ＥＧ−結合体の合成 送達複合体（共有結合）上のＰＥＧコーティングの存在は、非特異的な遺伝子 トランスフェクションを阻害する（データは示さない）。従って、インビボ用途 においては、ＰＥＧポリマー自体に対して何らかのターゲティングリガンドを用 いることが重要である。このようにすれば、リガンドは、縮合したＤＮＡによる 立体障害、およびＰＥＧ基自体からの遮断(shielding)を受けない。 マンノースレセプターリガンドを含む結合体は、実施例６．３．２に記載され ている。Ｍａｎ4Ｄｅｎ５−ＮＢＣ１２に類似するが、ＰＥＧスペーサー基を有 するリガンドを以下のように合成した。 Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ（３４００）−ＣＯＯＨの２倍過剰分を、ＤＣＣおよ びＤＭＡＰを用い、一晩再循環して、ＨＭＢ−ＰＳ樹脂に結合させる。残りのア ミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍ ｏｃ−Ｓｅｒ（Ｏ（Ａｃ4−ｍａｎｎ））−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（’Ｂ ｕ）−ＯＨ）を、ＴＢＴＵ／Ｎ、Ｎ’−エチルジイソプロピルアミン活性化およ び２％ピペリジン含有ジメチルホルムアミド中に２％ＤＢＵを用いた脱保護によ って、標準的な１時間の結合サイクルを用いて、４倍過剰分に結合させる。Ｎ末 端を除去した後、完成した樹脂結合ペプチド上のＦｍｏｃ基をＴＦＡ／水９５： ５の溶液で１時間処理する。その後、メタノール中の１０％ヒドラジン溶液を１ 時間撹拌することによって、樹脂からペプチドを切断する。その後、糖ペプチド を精製し、逆相ｈｐｌｃし、脱塩し、そして凍結乾燥した(The glycopeptide wa s then be purified be reverse phase hplc，desalted and lyophilised)。６ ．３．２．２に記載したように、糖保護アシル基を除去する。実施例１２ 遺伝子送達複合体の処方 実施例４に記載したインビトロアッセイにおいて使用される処方の方法は、薬 剤としての使用に理想的ではない。なぜなら、この方法は、（ａ）使用直前に遺 伝子送達複合体の慎重なアセンブリを含み、（ｂ）ＤＮＡ濃度を５μｇ／ｍｌに 制限するからである。 煩雑な調製手順を必要とせず且つ安定な別の２種類の処方物が開発されている 。これらの種類の処方物は、高塩処方物および等張処方物と呼ばれる。等張処方 物は、投与の直前に溶液「希釈液」を用いた希釈を必要とする。カチオンリポソ ームあるいは裸のＤＮＡの使用を含むもののような非ウィルス性遺伝子治療の他 の方法の大きな欠点の１つは、最終生成物が容易にフィルター滅菌されないこと である。これにより、非常に高価な処理である無菌処理を製造中に行う要件が生 じる。本明細書中に記載される発明は、一般的に用いられ、製薬業界で認められ ている方法を用いて簡単にフィルター滅菌を行うことを可能にする。 高塩処方は、遺伝子送達ビヒクルの高張溶液の直接的な注射を含むインビボ処 方である。従って、この処方は、腫瘍組織のような特異的組織あるいは静脈内へ の比較的少量＜５ｍｌの直接的な注射に限定される。 等張処方物は、大量の注射あるいはエキスビボ療法に有用である。 １２．１ 高塩処方物の調製 これらの処方物は、０．３〜０．６ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを含み、０．５〜１Ｍ 塩化ナトリウム含有緩衝液［２５ｍＭのリン酸あるいはＨＥＰＥＳのような生理 的に許容可能な緩衝液］（ｐＨ６．５〜８．０）の存在下での、必要不可欠な量 の単数あるいは複数の縮合ペプチド（０．３〜１．２ｍｇ／ｍｌ）のＤＮＡとの 初期混合を含む。ＨＨＳ高塩処方の場合、非誘導体化縮合ペプチドのみをＤＮＡ に加える。４℃で１６時間のインキュベーションの後、他のペプチド成分および ／またはクロロキンを濃縮物(concentrate)として同じ緩衝液中に加える。 ＴＨＳ高塩処方の場合、ＰＥＧ（３０００−１００００）を含有する緩衝液の 存在下で全てのペプチド成分を同時に加える。０．６Ｍの塩分濃度、２５０μｇ ／ｍｌのＤＮＡ濃度において、ＰＥＧ濃度は最適には２％である。ジャーカット 細胞についてのルシフェラーゼ既報告遺伝子アッセイを用いて(using the lucif erase reported gene assay on Jurkat cells)、ＰＥＧおよび塩分濃度を変化さ せて（図２４）、また、ＰＥＧの濃度を２％に固定してＤＮＡおよび塩分濃度を 変化させて（図２５）、これらのパラメータを規定した。 この処方は、濾過膜に付着する成分を含有する複合体の調製に特に有用である 。ＰＥＧ３０００−１００００の存在は、Ｌｉｐ１３の濾過膜への不可逆的な吸 着を防ぐことが分かっている。 １２．１．１ ｐＲＳＶＬｕｃの高塩処方物の調製：処方物ＨＨＳ 以下の溶液を調製した。 ａ）０．７Ｍの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中の８ ００μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡ ｂ）０．７Ｍの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中の１ ．６ｍｇ／ｍｌのＮＢＣ２ ｃ）０．７Ｍの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）中の１ｍｇ ／ｍｌのＬｉｐ２ ｄ）０．７Ｍの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）中の１０ｍ Ｍのクロロキン IKA-SchuttlerＭＴ４マシン［３００ｒｐｍ］を用いて、毎分０．１当量の速 度で、ＮＢＣ２溶液（１当量）をＤＮＡ溶液（１当量）に撹拌しながらゆっくり と加えた。この処理は、室温で行った。室温で１時間のインキュベーションの後 、複合体を４℃で一晩保存した。 次に、複合体１ｍｌ当たり０．１２ｍｌのＬｉｐ２溶液を、撹拌しながら複合 体に加え、その後、複合体溶液１ｍｌ当たり０．０１２ｍｌの１０ｍＭクロロキ ン溶液を加えた。その後、複合体を３７℃で３０分間インキュベートし、そして 、フィルター滅菌した。 １２．１．２ ｐＲＳＶＬｕｃの高塩処方物の調製：処方物ＴＨＳ 以下の溶液を調製した。 ａ）０．６Ｍの塩化ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４） および２％ＰＥＧ１００００中の５００μｇ／ｍｌのｐＲＳＶＬｕｃＤＮＡ ｂ）０．６Ｍの塩化ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４） および２％ＰＥＧ１００００中の１ｍｇ／ｍｌのＮＢＣ１３、０．１５ｍｇのＬ ｉｐ１３ ｃ）０．６Ｍの塩化ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４） および２％ＰＥＧ１００００中の１０ｍＭのクロロキン IKA-SchuttlerＭＴ４マシン［３００ｒｐｍ］を用いて、毎分０．１当量の速 度で、ＮＢＣ１３およびＬｉｐ１３溶液（１当量）を、ＤＮＡ溶液（１当量）に 撹拌しながらゆっくりと加えた。この処理は、室温で行った。室温で１時間おい た後、複合体をフィルター滅菌した。 １２．２ 等張処方物 これらの処方物の場合、遺伝子送達複合体は、高塩処方物として保存し、使用 直前に希釈する。 塩水中での希釈は、物理的不安定性を生じ、トランスフェクション効力を損な うことが分かっている。ＰＥＧ中での希釈は、活性を損なうことは全くなく、ト ランスフェクション効力を３〜１０倍に大幅に増大させることが分かっている（ 図２６ａおよび図２６ｂ）。 賦形剤としてＰＥＧを使用する作用により、遺伝子複合体の粒径(size)および 粒径分布に影響を及ぼすことがわかった。 ３．２５％のＰＥＧを用いて／用いないで調製したＮＢＣ９合成ウィルス様粒 子の光子相関分光法（ＰＣＳ）分析は以下の通りであった。ＤＮＡ１μｇ当たり ２μｇのペプチドを含有するＮＢＣ９合成ウィルス様粒子を、上記のように、３ ．２５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００を用いて／用いないで、 ０．８Ｍ塩化ナトリウム中において、１ｍｌ当たり１００μｇのＤＮＡの濃度で 調製した。１．０ｍｌの０．８ＭＮａＣｌ、０．２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７ ．４）中２００μｇのＮＢＣ９（１つの例では３．２５％のＰＥＧ８０００を含 有）を５００ｒｐｍで振盪した。少量（５４．６μｌ）に、１００μｇのプラス ミドＤＮＡを加えた。複合体を１時間室温に放置し、その後、４℃で一晩保存し た。翌朝、Malvern Instrumentsのレーザー光散乱マシン、Ｓ４７００ｖ１．２ ６のソフトウェア、およびサンプル容量０．５ｍｌに調節した細胞を用いて、Ｐ ＣＳ分析を行った。レーザー角度を９０°に設定し、１０回の走査から平均の粒 径を計算した。 表１ 粒径（ｎｍ） 走査Ｎｏ 0.8Ｍ NaCl 0.8M NaCl＋3.25％ＰＥＧ １ ８２．５ １０．８ ２ １７８ １１．１ ３ １３９．３ １０．５ ４ ９６．１ １０．６ ５ ８３．２ １０．６ ６ ７６．７ １０．８ ７ ８７．６ １０．２ ８ ８５．５ １１．４ ９ ２３１ １１．９ １０ ８２．５ １１．８ 平均粒径 114.2+/-52.2nm 11.0+/-0.6nm この実験は、高塩処方物中に３．３５％のＰＥＧが存在する場合、遺伝子送達粒 子が大幅にコンパクトに且つ規則的な形状になることを示している。 １２．２．１ 等張処方物ＰＥＧ１ 以下の溶液を調製した。 ａ）０．６Ｍの塩化ナトリウムおよび２％のＰＥＧ１００００を含有する、２ ５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中の０．２ｍｇ／ｍｌのｐＲＳ ＶＬｕｃＤＮＡ ｂ）０．６Ｍの塩化ナトリウムおよび２％のＰＥＧ１００００を含有する、２ ５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中の０．４ｍｇ／ｍｌのＮＢＣ １３および０．１２ｍｇ／ｍｌのＬｉｐ１３ ｃ）３７ｍＭの塩化ナトリウムおよび１５０μＭのクロロキンを含有する、２ ５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中の１０％ＰＥＧ１００００ 等量のＤＮＡを、穏やかに撹拌しながら０．１当量／分の速度でペプチド溶液 に加えた。その後、この複合体を室温で１時間インキュベートし、フィルター滅 菌し、そして、使用する必要が生じるまで４℃で保存した。 アッセイあるいは注射の前に、この濃縮物をＰＥＧ溶液で希釈した（遺伝子複 合体濃縮物１当量：ＰＥＧ希釈液４当量）。その後２４時間以内に、この希釈調 製物を使用した。 １２．２．２ 等張処方物ＰＥＧ２ ａ）０．６Ｍの塩化ナトリウムおよび２％のＰＥＧ１００００を含有する、２ ５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中の０．２ｍｇ／ｍｌのｐＲＳＶＬｕ ｃＤＮＡ ｂ）０．６Ｍの塩化ナトリウムおよび２％のＰＥＧ１００００を含有する、２ ５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中の０．４ｍｇ／ｍｌのＮＢＣ１３ ｃ）ＲＰＭＩ１６４０培養液中、１０％のＰＥＧ１００００、０．３μｇ／ｍ ｌのＬｉｐ１３／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン、５０μｇ／ｍｌの ヒトトランスフェリンおよび１２０μＭのクロロキン 等量のＤＮＡを、穏やかに撹拌しながら０．１当量／分の速度でペプチド溶液 に加えた。その後、この複合体を室温で１時間インキュベートし、フィルター滅 菌し、そして、使用する必要が生じるまで４℃で保存した。 アッセイあるいは注射の前に、この濃縮物をＰＥＧ溶液で希釈した（遺伝子複 合体濃縮物１当量：ＰＥＧ希釈液２０当量）。その後２４時間以内に、この希釈 調製物を使用した。実施例１３ 処方された合成ウィルス様遺伝子送達粒子の保存安定性(Shelf Stability) 一連のｐＲＳＶＬｕｃＤＮＡ処方物を調製し、これらを、バイアル中−２０℃ および４℃で保存した。様々な時間間隔において、実施例４に記載したジャーカ ット細胞を用いて、トランスフェクション効率について調製物をアッセイした。 試験した処方物は以下の通りである。安定性複合体 図２７は、２例を除いて全ての例において、処方物が安定であることを示す。実施例１４ 細胞へのオリゴヌクレオチドの送達 本発明は、プラスミドＤＮＡに類似の様式で、細胞へのオリゴヌクレオチドの 送達を包含する。２つの１７塩基オリゴヌクレオチドが合成された。 各オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオレートバックボーン上で合成され、５ ’位で、ビオチンで標識された。これらのオリゴヌクレオチドは、Ｒ＆Ｄ Syste ms Europeから入手され、ヒトＢＣ１２遺伝子の３５−５１塩基コーディング領 域に関連し（Clearyら、（1986）、Cell，47、19〜28）；ＢＣ１−２Ｓ−Ｂ１０ は、センス配列オリゴヌクレオチドで、ＢＣ１−ＡＳ−Ｂ１０は、アンチセンス オリゴヌクレオチドである。後者のオリゴヌクレオチドは、自然ヒトＢＣ１−２ 遺伝子と相互作用し、ＢＣ１−２遺伝子発現を抑制することにより、ジャーカッ ト等の、腫瘍細胞株におけるアポトーシスを誘発するということがわかる。 -オリゴヌクレオチドの送達は、本明細書中に教示されるように、ＢＣ１−２Ｓ −Ｂ１０およびＢＣ１−ＡＳ−Ｂ１０を合成ウイルス様粒子へと処方し、ジャー カット細胞への送達を可視化することにより示された。 オリゴヌクレオチドは、以下の改変を有して、実施例４に記載されるように、 ２μｇのＮＢＣ１３／１μｇオリゴヌクレオチド（１００μｇオリゴヌクレオチ ド／ｍｌ）を用いて凝縮された。緩衝液は、０．６Ｍの塩化ナトリウムに対して 、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）であった。４．０℃で１６時間後 、複合体は、１２０μｍのクロロキンおよび０．１５μｇＬｉｐ１３／μｇオリ ゴヌクレオチドＤＮＡを含有する、１０％ＰＥＧ１０、０００、３７．５ｍＭの 塩化ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中の２０μ ｇオリゴヌクレオチド／ｍｌに希釈された。１点当たり１×１０6のジャーカッ ト細胞は、２．５μｇオリゴヌクレオチドＤＮＡで形質移入された。細胞は、形 質 移入培地を緩衝液と取り換える前に、実施例４に記載されるように、４時間イン キュベートされた。２４時間後、細胞は、リン酸緩衝食塩水で洗浄され、室温で 、０．０５％のグルタルアルデヒド中で１０分間洗い流された。細胞は、再びリ ン酸緩衝食塩水で洗浄され、その後、４．０℃で２分間、０．１％トリトン×１ ００で透過された。リン酸緩衝食塩水で再び洗浄した後、細胞は、製造者（Vect or Laboratories、Burlington、C.A.）の指示に従ってベクタステインＡＢＣ（V ectorstain ABC）で処理された。このキットは、アビジン（ビオチンに強力に結 合する）、西洋わさびペルオキシダーゼ結合体を含む。室温で、６０分後、細胞 は、リン酸緩衝食塩水で洗浄され、ベクタステインＡＥＣを用いて保存された。 細胞における西洋わさびペルオキシダーゼは、黒色によって表示される。水でさ らに洗浄した後、細胞は、×２０の倍率で光学顕微鏡によって検査された。対照 の細胞は陰性であった。オリゴヌクレオチドを含有する合成ウイルス様粒子で処 理された細胞は、２０％の頻度で陽性（黒）であった。実施例１５ エクスビボおよびインビボでの形質移入効率 15.1 エクスビボ送達 本発明の粒子は、造血系のプライマリセル（primarycell）の高度形質移入も 行うことができる（図２８および２９）。どちらの場合も、１００μＭのクロロ キンが、形質移入培地に含有されたことを除く、標準アッセイ条件を用いて、細 胞がインキュベートされた。図２８は、抗ＣＤ３３−ＮＢＣ複合体が、細胞株に 類似の効率で、末梢血単核細胞への遺伝子転移をもたらし得ることを示す。この 比較は、ＣＤ３３＋細胞株Ｋ５６２および標準フィコール勾配遠心分離によって 末梢血から調製された末梢血単核細胞に対する、抗ＣＤ３３−ＮＢＣ１の形質移 入効率を示す。アッセイ間の誤差（％ＳＥＭ−３０％）を仮定すると、それらの 活動は、等価であると考えられ得る。 図２９は、抗ＣＤ７−ＮＢＣ１と複合したＤＮＡが、効率的に遺伝子を、新鮮 な末梢血単核細胞、ＩＬ−２刺激Ｔ細胞、および細胞株（ジャーカット）に転移 させ得ることを示す。この比較は、ＣＤ７＋細胞株ジャーカット（Ｔ細胞株由来 ）、新鮮な末梢血単球およびＩＬ−２の存在下で７日間、標準条件の下で培養す ることにより活性化された末梢血単球に対する、抗ＣＤ７−ＮＢＣ２結合体の活 動を示す。 15.2 インビボ送達 本発明の重要な目的の１つは、哺乳動物の細胞にインビボで外性核酸を転移す ることである。本実施例においては、本発明の合成ウイルス様粒子による腫瘍細 胞のインビボでの形質移入が、明解に示される。 マウスの癌モデルを用いて、インビボの合成ウイルス様粒子の効率が示された 。３匹のオスのＢＤＦ１マウス（ＤＢＡ２マウスとＣ５７Ｂ１６を交配すること により、Manchester U.K.のPaterson Institute of Cancer Researchによって開 発された株）は、癌株Ｔ５０／８０、すなわち、ＢＤＦ１マウスにおいて自然発 生的に生じたマウスの乳癌細胞株、の細胞を皮下的に移植された（Paterson Ins ti tute；Doddら、1989 British J．Cancer 60．164)。移植の８週間後には、各マ ウスは、右脇腹に直径６〜９ｍｍの腫瘍の塊を有していた。 ０．８５ｍＭの塩化ナトリウムを含有している２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中 で、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）リポーター遺伝子をコードするプラスミ ドＤＮＡの溶液（８００μｇ／ｍｌ）は、ボルテックス撹拌機（IKA-Schuttler MT4）を用いて、３００ｒｐｍで混合された。同じ緩衝液中の、同じ量の８００ μｇ／ｍｌのペプチドＮＢＣ２が、０．１ｖｏｌ／ｍｉｎ．の率で、ＤＮＡに滴 状に加えられた。複合体は、４℃で一晩インキュベートされた。最終濃度０．３ μｇ／μｇＤＮＡのＬｉｐ２は、次に、複合体混合物に添加され、３０分間３７ ℃でインキュベートされた。 Ｔ５０／８０腫瘍を持つ３びきのマウスは、エーテルで麻酔をかけられ、腫瘍 の塊に、２０μｌの以下の溶液を注入した。動物（ａ）７．１４μｇのプラスミ ドＤＮＡを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液；動物（ｂ）７．１４μｇを含有する送達 複合体、そして動物（ｃ）は、動物（ｂ）と同じ溶液であって、処方緩衝液に溶 解したクロロキンの１０ｍＭの溶液を０．２４μｌ追加して注入された。 マウスは、注入の４８時間後に、脳のディスロケーション（cerebral disloca tion）により屠殺された。腫瘍は、切開によって取り除かれ、液体窒素中で急速 凍結され、リン酸緩衝食塩水中の０．２５％のグルタルアルデヒドに固定される 前に、切断された（腫瘍の塊の中心を切り開く１４μｍの切片）。切片は、Ｘ− ＧＡＬ中で２４時間β−ガラクトシダーゼ活動に対して染色され（Sigma Ltd.、 Poole U.K.）、Boutら（Exp Lung Res 19．193〜202）によって記載されるよう に、核高速赤染色（Nuclear Fast Red stain）で対比染色された。このアッセイ において、β−ガラクトシダーゼ活動を発現する細胞は、青に着色する。 スライドは、顕微鏡的に検査されて、以下の結果を有した。動物Ａ（裸のＤＮ Ａを注入された）：全ての切片は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現に対して本 質的に陰性で、所々の切片において細胞細片の所々の青い染色を有するのみであ った。動物Ｂ（複合体を注入された）細胞の小さな断片は、所々の切片において 青に染色された。動物Ｃ（合成ウイルス様粒子を注入された）全ての切片が、腫 瘍の塊全体にわたって複合体が広く汎発することを確実にするβ−ガラクトシダ ーゼ陽性細胞の広い領域を示した。 これらの腫瘍の代表的な切片が、図２４に示され、図２４は、酵素β−ガラク トシダーゼの発現につながるリポーター遺伝子ｌａｃＺをコードするプラスミド ＤＮＡで形質移入された腫瘍組織を通る切片をとった写真を提示する。切片は、 本文に記載されるように調製され、β−ガラクトシダーゼを発現する細胞の位置 を示すように染色された。スライドは、明視野レンズを取り付けた標準顕微鏡に よって検査され、それを用いて記録された。スライド１は、裸のプラスミドＤＮ Ａを注入された動物Ａが有していた腫瘍から得られた結果を示す。スライド２は 、動物Ｂを用いて行われた実験結果を示す。この動物は、本文に記載されるよう に調製された複合体を注入された。スライド３は、動物Ｂと同じ複合体であるが 、１２０μＭのクロロキンの存在下で処方された複合体を腫瘍に注入された動物 Ｃが有していた腫瘍から得られた。矢印は、染色の部分を表す。 ＴＨＳおよびＰＥＧ１処方を用いた乳癌Ｔ５０／８０への遺伝子転移 ４匹のオスのＢＤＦ１マウスは、Ｔ５０／８０癌株細胞を皮下的に移植された (Moore、Jpn．J．Cancer Res．79、236〜243(1988)。移植の８週間後、各マウス は、右の横腹に直径６〜９ｍｍの腫瘍の塊を有していた。 デリケートなリポーター遺伝子および潜在的治療遺伝子の、同じ腫瘍組織への 遺伝子転移を評価するために、２つのリポータープラスミド、すなわち、ｌａｃ Ｚリポーターをコードするものと、プロドラッグ転換酵素のニトロ還元酵素をコ ードするものとを、真核生物転写性調節エレメントの制御の下で同時投与した。 ０．８５ｍＭのＮａＣｌを含有するｐＨ７４の２５ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液中 の、ｌａｃＺリポーター遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ溶液（ｐＴＫ７． ２、２００μｇ／ｍｌ）は、ボルテックス撹拌機（IKA-Schuttler MT4）を用い て、３００ｒｐｍで撹拌された。同じ緩衝液中の４００μｇ／ｍ１での同量のペ プチドＮＢＣ１３が、０．１ｖｏｌ．／ｍｉｎの率でＤＮＡに滴状に添加された 。 ２５ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４、０．８５ｍＭのＮａＣｌを含有） 中の発現可能な大腸菌ニトロ還元酵素遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡの第 ２の溶液（ｐＢＰＶ−ＥＣＯ．ＮＴＲ、２００μｇ／ｍｌ）は、ボルテックス撹 拌機（IKA-Schuttler MT4）を用いて、３００ｒｐｍで撹拌された。同じ緩衝液 中の４００μｇ／ｍｌでの同量のペプチドＮＢＣ１３が、０．１ｖｏｌ．／ｍｉ ｎの率でＤＮＡに滴状に添加された。 複合体は、４℃で一晩インキュベートされ、その後、同量の各複合体が一緒に 混合された。５０：５０の混合物が、その後、５０μｇ／ｍｌのヒトトランスフ ェリンおよび１ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＲＡＴ培地）を含有するＲＰ Ｍ１ベースの培地へと、１０％のＰＥＧ８０００を用いてまたは用いずに、５μ ｇＤＮＡ／ｍｌに希釈された。オプションで、ＬＩＰ１３が、次に、複合体混合 物に添加されて、１μｇＤＮＡ当たり、０．６μｇのＬＩＰ１３の最終濃度とな り、最後に、クロロキンが１２０μＭに添加された。これらの二重ベクター処方 は、次に、２０μｌの複合体を注入することによって動物に投与され、る、すな わち、１腫瘍当たり総投薬量０．１μｇのプラスミドＤＮＡが与えられる。 腫瘍１．ＲＡＴに希釈されたＤＮＡ−ＮＢＣ１３複合体 腫瘍２．ＲＡＴ＋１０％ＰＥＧ８０００に希釈されたＤＮＡ−ＮＢＣ１３複合体 腫瘍３．ＲＡＴ＋１０％ＰＥＧ８０００＋０．６μｇＬＩＰ１３／μｇＤＮＡに 希釈されたＤＮＡ−ＮＢＣ１３複合体 腫瘍４．ＲＡＴ＋０．６μｇ／μｇＬＩＰ１３／μｇＤＮＡに希釈されたＤＮＡ −ＮＢＣ１３複合体 複合体投与の６日後、動物は、脳のディスロケーションにより屠殺され、腫瘍 は、切開され、液体窒素中で急速冷凍され、クリオスタットミクロトームを用い て、腫瘍全体にわたって１００μｍの間隔で、１４μｍの切片を取った。切片は 、顕微鏡のスライド上に取り付けられ、室温で空気乾燥された。上記４つの処方 を用いて得られた形質移入効率を測定するために、切片は、０．２５％のグルタ ルアルデヒド／ＰＢＳに固定され、その後、Boutら（Exp．Lung Res．19、193〜 202）によって記載されるように、Ｘｇａｌ溶液中で、３７℃でインキュベート することによって、β−ガラクトシダーゼ発現に対して染色された。このアッセ イ において、β−ガラクトシダーゼ活動を発現する細胞は、青に染色した。加湿チ ャンバの中で、３７℃で一晩染色した後、切片は、エタノール系を通して脱水さ れ、キシレン中で一掃され、ＤＰＸマウンタント流体中に取り付けられた。結果 図３１（ａ）は、腫瘍１において、ＲＡＴに希釈されたＤＮＡ−ＮＢＣ１３複 合体の注入により、採取された全ての切片のうちのほんの少数の切片において、 所々の細胞(occasional cell)または細胞の小さなグループのみが青く染色され ている、低形質移入効率が結果として生じたことを示す。 図３１（ｂ）では、［ＲＡＴ＋１０％ＰＥＧ８０００］に希釈されたＤＮＡ− ＮＢＣ１３複合体の腫瘍２への注入により、腫瘍の塊中に、少数の、細胞の小さ な集団または単細胞の形質移入が結果として生じたことがわかる。 しかし、図３１（ｃ）は、［ＲＡＴ＋１０％ＰＥＧ８０００＋０．６μｇＬＩ Ｐ１３／μｇＤＮＡ］に希釈されたＤＮＡ−ＮＢＣ１３複合体を注入することに より、細胞の大きなグループの効率的な形質移入が結果として生じたことを示し 、これらの集団は、腫瘍の塊全体にわたって見られ、このことは、複合体が注入 の際に腫瘍全体に十分分散していたことを示す。多くの分離した単細胞および細 胞の集団は、腫瘍全体にわたって多くの異なる位置で採取された切片において可 視でき、このことは再び、注入の際の複合体の効率的な分散および送達系によっ て仲介される効率的な遺伝子転移を示す。 図３１（ｄ）は、［ＲＡＴ＋０．６μｇＬＩＰ１３／μｇＤＮＡ］に希釈され たＤＮＡ−ＮＢＣ１３複合体を注入することにより、細胞の小さなグループの形 質移入が結果として生じ、この処方が１０％のＰＥＧ８０００を補充されたとき よりも、比較的高率が悪いことを示す。図３１（ｅ）は、腫瘍の表面に近い細胞 層への非常に効率的な送達が、［ＲＡＴ＋０．６μｇＬＩＰ１３／μｇＤＮＡ］ に希釈されたＤＮＡ−ＮＢＣ１３複合体とともに観測された、図４と同じ腫瘍の 切片を示す。この腫瘍において、このような領域が１つだけ観測されたが、この 領域における発現レベルは高いものであった。 図３１（ｆ）は、ｌａｃＺ発現に対して陰性に染色された、注入を受けていな いＴ５０／８０腫瘍の切片を示す。結論 １０％のＰＥＧ８０００中で処方されたＮＢＣ１３ペプチドの両方を含有する 、 遺伝子送達複合体のインビボ注入により、腫瘍の塊全体にわたる複合体の広範囲 の分散および腫瘍細胞のインビボでの効率的な形質移入が結果として生じる。図面の詳細な説明 図３１（ａ）： ｌａｃＺ+青染色細胞が見られなかった、Ｔ５０／８０乳房腫瘍組織の切片。 図３１（ｂ）： ｌａｃＺ+青染色細胞の小さな集団が、視界の中心に、全視界の〜１％の面積 を占領して見られた、Ｔ５０／８０乳房腫瘍組織の切片。 図３１（ｃ）： ｌａｃＺ+青染色細胞の一群が、写真の上部左手の角から下部右手の角にわた る視界に見られ得る、Ｔ５０／８０乳房腫瘍組織の切片。青色細胞は、無染色細 胞と混じり合うが、視界の〜２０％の面積を包含する。約３０の青染色材料の病 巣であって、細胞の小さな集団または単細胞を表す各病巣がこの図に見られ得る 。淡い青の染色部分が、図の上端部の中央にも見られ得る。淡い青の染色部分が 、図の上端部の中央にも見られ得、形質移入された細胞のさらなる断片を示す。 （ｄ）ｌａｃＺ+青染色細胞の楕円形の環が視界に見られ得る（環の直径−水 平寸法の〜４０％）Ｔ５０／８０乳房腫瘍組織の切片。最も強く染色されたｌａ ｃＺ+細胞は、視界の中心に位置される、細胞の環の底部にあった。 図３１（ｅ）： ｌａｃＺ+青染色細胞の小さな集団が、視界の中心に、全視界の〜１％の面積 を占領して見られた、Ｔ５０／８０乳房腫瘍組織の切片。 図３１（ｆ）： ｌａｃＺ+青染色細胞の層が、腫瘍の表面近くに、視界の〜１０％の面積を占 領し、視界の中心の右に黒い垂直線として現れて見られ得る、Ｔ５０／８０乳房 腫瘍組織の切片。実施例１６ 投薬量および製薬処方 核酸凝縮ペプチドおよび細胞に送達される核酸は、非経口投与のため、または 合成ウイルス様粒子として別々に処方され得る。後者の場合、合成ウイルス様粒 子は、使用の直前にアセンブルされ得る。製薬組成の場合には、核酸は、受け手 の細胞に対してある有益な治療効果を有するであろう発現を持つ遺伝子を含有す る。標的細胞への治療遺伝子送達の最適な効率のためには、凝縮された形態の治 療的核酸が、約１００ｎｍより小さい、すなわち、約１〜１００ｎｍの範囲の大 きさ、または、長さ約５０ｋｂより短いことが好ましい。核酸は、直線または円 形のプラスミドＤＮＡの形態、または、ＤＮＡフラグメントの形態であり得る。 治療遺伝子の例は、当該分野において公知で、それらに限定されることはない が、β−グルコセレブロシダーゼ（β−glucocerebrosidase）遺伝子、Brutonの チミジンキナーゼ遺伝子、ＴＮＦ等のサイトカインをコードする遺伝子、インタ ーロイキン１−１２、インターフェロン（α、β、γ）、Ｆ2レセプター、およ びＴ細胞レセプターを含む。ＤＮＡは、薬剤抵抗性遺伝子、β−ガラクトシダー ゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、およびクロラムフェニコールアセ チルトランスフェラーゼ遺伝子などの標識遺伝子も含有し得る。 ペプチドおよびＤＮＡは、等張性無リン酸緩衝液に移され、０．４５または０ ．２２μのフィルタを通して無菌濾過された。処方された溶液または合成ウイル ス様粒子（選択された官能基に結合されたペプチド、ＤＮＡ、および遊離凝縮ペ プチドの混合物）は、適切なバイアルに無菌状態で入れて等分される。バイアル は、４℃、２０℃、または８０℃で保存され得、あるいは、ＤＮＡ、ペプチド、 または合成ウイルス様粒子は、適切なキャリアおよびバルキング剤を含有する緩 衝液からフリーズドライされ得る。これらの場合、投薬形態は、投与の前に、無 菌溶液で再構成される。 インビボまたはエクスビボで、欠陥遺伝子の交換、または潜在的に有益な、追 加的遺伝子機能などの生理学的重要性を有する遺伝子を含有する核酸と共にこの 種の製薬組成を使用することにより、細胞の長期的な遺伝子改変が与えられ、病 気の治療に効果的となることが予期される。 例えば、ウイルス性または遺伝病にかかっている患者は、本発明に従って、イ ンビボ またはエクスビボの方法を用いて治療され得る。例えば、インビボでの治 療においては、本発明の送達ビヒクルは、好ましくは、摂取、注入、吸入、また は、いかなる数の他の方法によって、生物学的に適合性のある溶液または製薬的 に受容可能なキャリアで患者に投与され得る。投与される投薬量は、患者によっ て異なり、「治療的に効果的な投薬量」は、いかなる危険性または有害な副作用 に対して均衡をとった、転移された遺伝子材料の機能の拡張レベルによって決定 される。遺伝子導入、遺伝子発現および／またはコードされた抗ウイルスタンパ ク質の存在またはレベルのモニタリングレベルは、投与される投薬量を選択し、 調整する助けとなる。一般的に、合成ウイルス様粒子を含む組成は、１０ｎｇ〜 １００μｇ／ｋｇ体重の範囲内、好ましくは、１００ｎｇ〜１０μｇ／ｋｇ体重 の範囲内の単一服用量で、治療遺伝子の少なくとも１つのコピーが各標的細胞に 送達されるように投与される。もちろん、治療遺伝子は、標的細胞における遺伝 子発現のための適切な制御配列に関連する。 エクスビボの治療もまた、本発明の範囲内に考えられる。細胞集団は、患者か ら取り除かれ得、もしそうでない場合は、本発明に従って治療遺伝子で形質導入 され、その後、患者に再導入され得る。一般的には、エクスビボ細胞投薬量は、 いかなる有害な副作用に対して均衡をとった所望の治療効果に従って決定される 。このような投薬量は、通常、患者１人につき、毎日、週一回、または断続的に 、１０6〜１０細胞の範囲内にあり、好ましくは、患者一人当たり１０6〜１０7 細胞の範囲内にある。 本発明に従った、合成ウイルス様粒子は、Ｘ連鎖されたγ−グロブリネミア（ γ−globulinemia）の治療に用いられ得る。ウイルス様粒子における凝縮された 核酸は、Brutonのチロシンキナーゼ遺伝子（Vetrieら、1993、Nature、361．226 〜233）を含有し、この遺伝子は、（＋３３）位でのＰｖｕＩ部位および（＋２ １２６）位でのＨｉｎｄＩＩＩ部位によって表される２．１ｋｂフラグメント上 で輸送され、所望であれば、プラスミドは、ＰＣＴ／ＧＢ８８／００６５５で教 示されるように、位置非依存性組織特異的遺伝子発現を与える配列も含有し得 る。治療遺伝子は、スプライス部位およびポリＡテイルもまたコードし得、ポリ Ａテイルは、ヒトβグロビン遺伝子座スプライスおよびポリＡシグナルの部分、 すなわち、エキソン２ ＩＶＳＩＩ−エキソン３−−ポリＡ配列を含有するＢａ ｍＨＩ Ｘｂａｌ２．８ｋｂ ３スプライス／ポリＡフランキング配列を含有し 得る。 Brutonのチロシンキナーゼ遺伝子を含有する合成ウイルス様粒子は、本明細書 中に記載されるようにアセンブルされ、Martenssonら、Eur．Jour．Immunol．19 87、17：1499；Okabeら、Eur．Jour．Immunol．1992、22:37；およびBanerjiら 、Cell 33:729、1983に記載されるように、インビボ遺伝子治療のために患者に 直接構成物を導入する、またはエクスビボ治療のためにプレＢ細胞に直接構成物 を導入し、形質移入されたプレＢ細胞を、Ｘ連鎖されたγ−グロブリネミアに冒 された患者に投与することによりＸ連鎖されたγ−グロブリネミアの治療に用い られる。Ｘ連鎖されたγ−グロブリネミアの治療のための合成ウイルス様粒子は 、プレＢ細胞の標的のリガンドを含有する。このようなリガンドは、当該分野に おいて公知であり、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１９、Ｃ Ｄ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ７２およびＣＤ７４の うちの１つまたは複数に対して特異的で、そのマーカーを標的にし得る。 本明細書中に記載される合成ウイルス様粒子は、ゴーシェ病の治療にも用いら れ得る。ゴーシェ病は、異なる２つの遺伝子変異の１つから生じる。ゴーシェの タイプＩはＣＧＧ→ＣＡＧ変異（この変異はＡｒｇを生じさせる）→：β−グル コセレブロシダーゼポリペプチドの１１９位でのＧｌｎ置換である（Graves、DN A 7:521、1988）。ゴーシェタイプ２は、ＣＴＧ→Ｌｅｕを生じさせるＣＣＧ変 異→Ｚ−グルコセレブロシダーゼポリペプチドの４４４位でのプロ置換である（ Tsuji、NEJM 316:570、1987）。野生型ポリペプチドをコードする：β−グルコ セレブロシダーゼ遺伝子の存在は、ゴーシェ病を実質的に直すと考えられている 。従って、本発明による有用な治療核酸は、Horowitzら、1989、Genomics 4:87 〜96に記載されるようなβ−グルコセレブロシダーゼ遺伝子を含有し、この遺伝 子は、Horowitzらに開示されるように、エキソン１におけるＢａｍＨＩ部位から ＥｃｏＲＶ部位３１とポリアデニル化部位へと延びる９７２２塩基対フラグメ ント上に有される。このフラグメントは、１１のエキソンおよび全ての介在配列 を含有し、エキソン２で翻訳を開始する。位置非依存性および組織特異的遺伝子 発現を与える配列は、構成物中に含有され得、Boniferら、1990、Euro．Mol．Bi ol．Org Jour 9:2843に記載されるように、ＰＩＩＩ．ｌｙｘ構成物からの１１ ．８ｋｂ Ｘｈｏｌ−ＳａｃＩフラグメント上に有される。 β−グルコセレブロシダーゼ遺伝子を含有する合成ウイルス様粒子は、本明細 書中に記載されるようにアセンブルされ、Immunology and Cell Biology．1993 、Vol．71 75〜78頁に記載されるように、インビボ治療のためにはホスト、また は、エクスビボ治療のためには単離されたマクロファージにウイルス様粒子を直 接導入し、形質移入されたマクロファージをゴーシェ病に冒された患者に導入す ることによりゴーシェ病の治療に用いられる。ゴーシェ病に冒された患者におけ る野生型導入遺伝子の発現により、病気状態の修正が生じるべきである。合成ウ イルス様粒子は、マクロファージ上の細胞表面抗原を特異的に標的とするリガン ドを含有する。このようなリガンドは、当該分野において公知で、例えば、以下 の細胞表面マーカー：ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２６、ＣＤ３１、ＣＤｗ３２、 ＣＤ３６、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ６３、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ ２３、ＣＤ２５およびＣＤ６９の内の１つ、または複数に対して特異性を有し、 かつ、そのマーカーを標的とできるモノクローナル抗体である。 本発明による、インビボまたはエクスビボの遺伝子転移を標的とした細胞は、 治療遺伝子が送達されることが望ましいいかなる細胞を含有する。このような細 胞は、細胞表面マーカーを生じさせ、このマーカーに対して、対応する特定のリ ガンドが利用可能である、または本発明による細胞特異的ターゲティングを可能 とするように調製され得る。例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージな どの免疫系の細胞、造血細胞、および樹状細胞の各細胞は、本発明のウイルス様 粒子において、選択された細胞に応じて、ターゲティングリガンドとして使用す るために選択され得る、対応リガンドを有する、１つ以上の公知の細胞表面レセ プターを生じさせる。確立された技術を用いて、幹細胞は、濃縮手順の後、遺伝 子転移に用いられ得る（例えば、造血細胞の集団から幹細胞を分離する方法を開 示する、欧州特許出願第0 455 482号および第0 451 611号を参照）。あるいは、 分離されていない造血細胞および幹細胞集団が、本明細書中に記載されるような ＤＮＡ転移のための標的集団として使用され得る。 実施例１７ 以下に示す実施例では、脂質化(lipidated)核酸縮合ペプチドが存在する合成 ウィルス様粒子を用いた、哺乳類細胞のトランスフェクションを記載する。この 粒子は、クロロキンを用いた合成ウィルス様粒子の予備インキュベーションを含 む新規な手順に従って調製したものである。 合成ウィルス様粒子を用いたインビトロトランスフェクションは、エンドソー ム機能を乱す薬剤の有無に絶対的に依存する。このような有力な薬剤の１つは、 抗マラリア薬クロロキンである。細胞を処理する前にクロロキン含有溶液中で合 成ウィルス様粒子の予備インキュベーションを行うことによって、クロロキンの 作用を増幅し得る（おそらく、この親油性分子が合成ウィルス様粒子疎水性表面 に吸着することによる）。図２２は、Ｌｉｐ２の存在下で調製した合成ウィルス 様粒子を、ジャーカット細胞への暴露前に、１２０μＭのクロロキンの存在下あ るいは非存在下において予備インキュベートした場合に見られる増加したトラン スフェクション効率を示す。合成ウィルス様粒子中の親油性置換基のレベルを高 めてクロロキンの結合を増大させることによって、合成ウィルス様粒子は、核酸 送達をさらに最適化する。本発明に有用な予備インキュベーション濃度の範囲は 、概ね１０μＭから７０ｍＭである。比較的高い用量の場合、インビボにおいて 合成ウィルス様粒子とともに投与されるクロロキンの最大量が、３．５ｍｇ／体 重１ｋｇを越えてはならない。エキスビボ用途の場合は、処方物からの希釈後の クロロキン最終濃度が２００μＭを越えてはならない。 クロロキンの存在下でターゲット細胞を合成ウィルス様粒子に暴露する時間を 延長することによって、インビトロにおけるトランスフェクション効率を高める ことも可能である。図２３は、インキュベーション時間の増加が、１２０μＭの クロロキンの存在下におけるＬｉｐ２合成ウィルス様粒子によるジャーカット細 胞のトランスフェクションに及ぼす影響を示す。 図２３において、ＮＢＣ１の溶液は、０．７Ｍの塩化ナトリウムを含有する、 ２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．８５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）中において ２００μｇ／ｍｌの濃度でできているか、あるいは、５％のＰＥＧを含有する同 じ緩衝液（Sigma Ltd.，Poole，Dorset）中にできていた。各溶液を、適切な量 の３．５ｍｇ／ｍｌのＲＳＶＬＵＣプラスミドＤＮＡと混合して、最終濃度を１ ００μｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡとし、この混合液を室温で６０分間インキュベ ートし、その後、４℃で一晩さらにインキュベートした。その後、合成ウィルス 様粒子を、１×１０6のジャーカット細胞および１２０μＭのクロロキンを含有 するＲＰＭＩ培地中に直接（２５μｌのＤＮＡ合成ウィルス様粒子を１ｍｌの細 胞培養液中へ）、あるいは、１０％のＰＥＧを含有する２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、 ０．８５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）中に希釈して、最終濃度を２５μｇ ＤＮＡ／ｍｌとした。室温で３０分間おいた後、ＨＥＰＥＳ緩衝液中の溶液をそ れぞれ、１×１０6のジャーカット細胞および１２０μＭのクロロキンを含有す るＲＰＭＩ中に（１００μｌのＤＮＡ合成ウィルス様粒子を１ｍｌの細胞培養液 中へ）希釈した。４時間後に、細胞を遠心分離し、培地を除去し、そして、１０ ％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ培地２．５ｍｌ中で細胞を再懸濁した。２ ４時間後に、細胞の回収、洗浄および溶解を行い、そして、上記のようにして、 ルシフェラーゼ発現レベルを求めた。 他の実施形態 当業者には他の実施形態が明らかになる。上記の詳細な説明は、明瞭さのため のものに過ぎず且つ例示的でしかないことを理解されたい。本発明の主旨および 範囲は上記実施例に限定されるのではなく、以下に示す請求の範囲によって包含 される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９５１９３０４．１ (32)優先日 平成７年９月21日(1995．9．21) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ６０／００４，２８５ (32)優先日 平成７年９月25日(1995．9．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ９５２５９５５．２ (32)優先日 平成７年12月19日(1995．12．19) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ６０／００８，９５２ (32)優先日 平成７年12月19日(1995．12．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０１１，５３１ (32)優先日 平成８年２月12日(1996．2．12) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／６６０，２３１ (32)優先日 平成８年６月７日(1996．6．7) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 クレイグ，ロジャー キングダン イギリス国 シーダブリュー11 ０エック スエイ チェシャー，サンドバック，スモ ールウッド，スペン グリーン，ジュビリ ー ハウス ファーム（番地なし) (72)発明者 ウィルクス，ポーラ エリザベス イギリス国 エスティー７ ２ジェイケイ ストーク オン トレント，アルサガ ー，アロースミス ドライブ ５ (72)発明者 カンリッフェ，ビンセント トレバー イギリス国 ダブリューエイ16 ６エイチ ゼット ナッツフォード，クイーン スト リート 21 (72)発明者 ウェルシュ，ジョン ハミルトン イギリス国 エスティー５ ４エイチジェ イ ニューキャッスル アンダー レイ ム，クレイトン，メルビル コート ４

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．核酸を哺乳動物細胞にトランスフェクトするための合成ウイルス様粒子であ って、該合成ウイルス様粒子は、 組換え核酸、 複数の核酸凝縮ペプチド、 を含み、該ペプチドは、該核酸が凝縮された形態になるように該組換え核酸と非 共有結合し、ここで、それぞれの該核酸凝縮ペプチドはヘテロペプチドであり、 そして該複数の核酸凝縮ペプチドは低い多分散を有する、合成ウイルス様粒子。 ２．前記複数の核酸凝縮ペプチドは、第１の核酸凝縮ペプチドおよび第２の核酸 凝縮ペプチドを含み、該第１の核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合した第１の 機能基を含む、請求項１に記載の合成ウイルス様粒子。 ３．前記第２の核酸凝縮ペプチドはそれに共有結合した第２の機能基を含み、該 第２の機能基は前記第１の機能基とは異なる、請求項２に記載の合成ウイルス様 粒子。 ４．前記第１および前記第２の核酸凝縮ペプチドが異なるアミノ酸配列を有する 、請求項２に記載の合成ウイルス様粒子。 ５．前記第１および前記第２の核酸凝縮ペプチドが同一のアミノ酸配列を有する 、請求項２に記載の合成ウイルス様粒子。 ６．前記第１の核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合した第１の機能基を含み、 そしてそれに共有結合した第２の機能基をさらに含む、請求項２に記載の合成ウ イルス様粒子。 ７．前記第２の機能基が前記第１の機能基に共有結合している、請求項２に記載 の合成ウイルス様粒子。 ８．前記機能基が抗原性ペプチドであるリガンドを含む、請求項２に記載の合成 ウイルス様粒子。 ９．前記機能基が特定の細胞型を標的化するリガンドを含む、請求項２に記載の 合成ウイルス様粒子。 １０．前記リガンドがモノクローナル抗体、インシュリン、トランスフェリン、 およびアシアロ糖タンパク質からなる群より選択される、請求項９に記載の合成 ウイルス様粒子。 １１．前記機能基が非特異的な様式で細胞を標的化するリガンドを含む、請求項 ９に記載の合成ウイルス様粒子。 １２．前記リガンドが糖を含む、請求項１１に記載の合成ウイルス様粒子。 １３．前記機能基が脂質を含む、請求項１２に記載の合成ウイルス様粒子。 １４．前記脂質がパルミトイル、オレオイル、ステアロイル、およびコレステロ ールからなる群より選択される、請求項１３に記載の合成ウイルス様粒子。 １５．前記機能基が中性親水性ポリマーを含む、請求項２に記載の合成ウイルス 様粒子。 １６．前記中性親水性ポリマーがPEGおよびPVPからなる群より選択される、請求 項１５に記載の合成ウイルス様粒子。 １７．前記機能基がフソゲンペプチドである、請求項２に記載の合成ウイルス様 粒子。 １８．前記フソゲンペプチドがHAペプチドを含む、請求項１７に記載の合成ウイ ルス様粒子。 １９．前記機能基が酵素を含む、請求項２に記載の合成ウイルス様粒子。 ２０．前記酵素がリコンビナーゼおよびインテグラーゼからなる群より選択され る、請求項１９に記載の合成ウイルス様粒子。 ２１．前記機能基が細胞内輸送タンパク質を含む、請求項２に記載の合成ウイル ス様粒子。 ２２．前記細胞内輸送タンパク質が核局在化配列からなる群より選択される、請 求項２１に記載の合成ウイルス様粒子。 ２３．前記第１の機能基が脂質または中性親水性ポリマーの１つを含み、そして 前記第２の機能基は細胞を標的化するリガンドである、請求項７に記載の合成ウ イルス様粒子。 ２４．前記第１の機能基が脂質を含む場合、前記第２の機能基は細胞レセプター を標的化するリガンドを含む、請求項２３に記載の合成ウイルス様粒子。 ２５．前記第１の機能基がPEGを含む場合、前記第２の機能基は細胞レセプター を標的化するリガンドを含む、請求項２４に記載の合成ウイルス様粒子。 ２６．前記リガンドが、糖部分、またはその細胞レセプターが細胞型に制限され るリガンドの１つを含む、請求項２５に記載の合成ウイルス様粒子。 ２７．前記第１の機能基が脂質を含む場合、前記第２の機能基はPEGを含む、請 求項２３に記載の合成ウイルス様粒子。 ２８．請求項１に記載の合成ウイルス様粒子であって、ここで前記核酸凝縮ペプ チドは、以下の一般式： のアミノ酸配列を含み、 ここで、X1-8のそれぞれは、独立して、側鎖に正に荷電した基を有するアミノ 酸であり； ここで、Y1-4のそれぞれは、独立して、αヘリックス形成を促進する天然に存 在するアミノ酸であり； ここで、Z1-4のそれぞれは、独立して、安定化された折り曲がり構造を形成す る高度な性質を有する少なくとも３つのアミノ酸を伴う、天然に存在するアミノ 酸であり； ここで、Ａはアミノ末端のセリンまたはスレオニン残基であり； ここで、Ｂは任意のアミノ酸であり；そして ここで、ｎ＝２〜４およびｍ＝２である、 合成ウイルス様粒子。 ２９．X1-8のそれぞれは、独立して、リジン、アルギニン、2,4-ジアミノ-酪酸 、またはオルニチンである、請求項２８に記載の合成ウイルス様粒子。 ３０．Y1-4のそれぞれは、独立して、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、メチ オニン、グルタミン、トリプトファン、またはヒスチジンである、請求項２８に 記載の合成ウイルス様粒子。 ３１．Z1-4のそれぞれは、独立して、アスパラギン、グリシン、プロリン、セリ ン、およびアスパラギン酸である、請求項２８に記載の合成ウイルス様粒子。 ３２．Ｂはアラニン、グルタミン酸、またはシステインのいずれか１つである、 請求項２８に記載の合成ウイルス様粒子。 ３３．前記ペプチドは少なくとも１つの内部セリン、スレオニン、またはシステ イン残基を含む、請求項２８に記載の合成ウイルス様粒子。 ３４．前記内部残基は機能基への接合のために利用可能である、請求項３３に記 載の合成ウイルス様粒子。 ３５．前記ペプチドが以下のアミノ酸配列： の１つを含む、請求項２８に記載の合成ウイルス様粒子。 ３６．請求項１に記載の合成ウイルス様粒子であって、ここで、前記核酸凝縮ペ プチドは、全体の配列の長さが＞17残基である、以下の３つのコンセンサス配列 ： 配列I： ここで、Kはリジンであり；Pはプロリンであり；Aはアラニンであり；Xはセリン 、スレオニン、またはプロリンであり；Yはアラニンまたはバリンであり；Zはア ラニン、スレオニン、またはプロリンであり；Bはリジン、アラニン、スレオニ ン、またはバリンであり；そしてJはアラニンまたはバリンであり； 配列II ここで、Xはアラニンまたはバリンであり；Kはリジンであり；Sはセリンであり ；Pはプロリンであり；そしてAはアラニンであり； 配列III ここで、Xはリジンまたはアルギニンであり；Yはアラニンまたはスレオニンであ り；Zはプロリン、アラニン、またはセリンであり；Bはリジン、スレオニン、ま たはバリンであり；Kはリジンであり；Pはプロリンであり；Aはアラニンである 、の直線状の組合せを含む、合成ウイルス様粒子。 ３７．前記ペプチドが以下のアミノ酸配列： を含み、ここで、-C-はシステインであり；ここで、SV40 NLSは配列Pro-Lys-Lys -Lys-Arg-Lys-Val-Glnを有する、請求項３６に記載の合成ウイルス様粒子。 ３８．前記ペプチドが以下のアミノ酸配列： を含む、請求項３７に記載の合成ウイルス様粒子。 ３９．請求項３６に記載の合成ウイルス様粒子であって、前記ペプチドが以下の 一般式： のアミノ酸配列を含み、 ここでXは存在しないか、あるいはセリンまたはスレオニンの１つであり； Yは配列I、IIまたはIIIの１つであり； nは２〜６であり；そして Cはシステインである、合成ウイルス様粒子。 ４０．前記ペプチドが以下のもの： ここで-C-はシステインであり； ここで-C-はシステインであり； ここで-C−はシステインであり；およびここで-C-はシステインである、 の群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の合成ウイルス様粒 子。 ４１．前記ペプチドが以下の配列： の群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の合成ウイルス様粒 子。 ４２．複数の核酸凝縮ペプチドであって、 ここで、該複数の核酸凝縮ペプチドのそれぞれの核酸凝縮ペプチドはヘテロペ プチドであり、そして該複数の核酸凝縮ペプチドは低い多分散を有し、 該ペプチドは、組換え核酸と接触される場合、該ペプチドが該核酸に非共有結 合して、凝縮された組換え核酸を含む合成ウイルス様粒子を形成し得る点でさら に特徴づけられ、そして 該合成ウイルス様粒子は、哺乳動物細胞と接触される場合、該粒子が該核酸を 該細胞にトランスフェクトし得る点で特徴づけられる、 複数の核酸凝縮ペプチド。 ４３．第１の核酸凝縮ペプチドおよび第２の核酸凝縮ペプチドを含む、請求項４ ２に記載の複数の核酸凝縮ペプチドであって、ここで、該第１の核酸凝縮ペプチ ドは、それに共有結合した第１の機能基を含む、複数の核酸凝縮ペプチド。 ４４．前記第２の核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合した第２の機能基を含み 、該第２の機能基は前記第１の機能基と異なる、請求項４３に記載の複数の核酸 凝縮ペプチド。 ４５．前記第１および前記第２の核酸凝縮ペプチドが異なるアミノ酸配列を有す る、請求項３８に記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ４６．前記第１および前記第２の核酸凝縮ペプチドが同一のアミノ酸配列を有す る、請求項４３に記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ４７．前記第１の核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合した第１の機能基を含み 、そしてそれに共有結合した第２の機能基をさらに含む、請求項４３に記載の複 数の核酸凝縮ペプチド。 ４８．前記第２の機能基が前記第１の機能基に共有結合している、請求項４３に 記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ４９．前記機能基が抗原性ペプチドであるリガンドを含む、請求項４３に記載の 複数の核酸凝縮ペプチド。 ５０．前記機能基が特定の細胞型を標的化するリガンドを含む、請求項４３に記 載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ５１．前記リガンドがモノクローナル抗体、インシュリン、トランスフェリン、 およびアシアロ糖タンパク質からなる群より選択される、請求項５０に記載の複 数の核酸凝縮ペプチド。 ５２．前記機能基が非特異的な様式で細胞を標的化するリガンドを含む、請求項 ５０に記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ５３．前記リガンドが糖を含む、請求項５２に記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ５４．前記機能基が脂質を含む、請求項５３に記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ５５．前記脂質がパルミトイル、オレオイル、ステアロイル、およびコレステロ ールからなる群より選択される、請求項５４に記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ５６．前記機能基が中性親水性ポリマーを含む、請求項４３に記載の複数の核酸 凝縮ペプチド。 ５７．前記中性親水性ポリマーがPEGおよびPVPを含む、請求項５６に記載の複数 の核酸凝縮ペプチド。 ５８．前記機能基がフソゲンペプチドである、請求項４３に記載の複数の核酸凝 縮ペプチド。 ５９．前記フソゲンペプチドがHAペプチドを含む、請求項５８に記載の複数の核 酸凝縮ペプチド。 ６０．前記機能基が酵素を含む、請求項４３に記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ６１．前記酵素がリコンビナーゼおよびインテグラーゼからなる群より選択され る、請求項６０に記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ６２．前記機能基が細胞内輸送タンパク質を含む、請求項４３に記載の複数の核 酸凝縮ペプチド。 ６３．前記細胞内輸送タンパク質が核局在化配列からなる群より選択される、請 求項６２に記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ６４．前記第１の機能基が脂質またはPEGの１つを含み、そして前記第２の機能 基は細胞を標的化するリガンドである、請求項４８に記載の合成ウイルス様粒子 。 ６５．前記第１の機能基が脂質を含む場合、前記第２の機能基は細胞レセプター を標的化するリガンドを含む、請求項６４に記載の合成ウイルス様粒子。 ６６．前記第１の機能基がPEGを含む場合、前記第２の機能基は細胞レセプター を標的化するリガンドを含む、請求項６５に記載の合成ウイルス様粒子。 ６７．前記リガンドが、糖部分、またはその細胞レセプターが細胞型に制限され るリガンドの１つを含む、請求項６６に記載の合成ウイルス様粒子。 ６８．前記第１の機能基が脂質を含む場合、前記第２の機能基はPEGを含む、請 求項６４に記載の合成ウイルス様粒子。 ６９．請求項４２に記載の複数の核酸凝縮ペプチドであって、ここで前記核酸凝 縮ペプチドは、以下の一般式： のアミノ酸配列を含み、 ここで、X1-8のそれぞれは、独立して、側鎖に正に荷電した基を有するアミノ 酸であり； ここで、Y1-4のそれぞれは、独立して、αヘリックス形成を促進する天然に存 在するアミノ酸であり； ここで、Z1-4のそれぞれは、独立して、安定化された折り曲がり構造を形成す る高度な性質を有する少なくとも３つのアミノ酸を伴う、天然に存在するアミノ 酸であり； ここで、Ａはアミノ末端のセリンまたはスレオニン残基であり； ここで、Ｂは任意のアミノ酸であり；そして ここで、ｎ＝２〜４およびｍ＝２である、 複数の核酸凝縮ペプチド。 ７０．X1-8のそれぞれは、独立して、リジン、アルギニン、2,4-ジアミノ-酪酸 、またはオルニチンである、請求項６９に記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ７１．Y1-4のそれぞれは、独立して、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、メチ オニン、グルタミン、トリプトファン、またはヒスチジンである、請求項６９に 記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ７２．Z1-4のそれぞれは、独立して、アスパラギン、グリシン、プロリン、セリ ン、およびアスパラギン酸である、請求項６９に記載の複数の核酸凝縮ペプチド 。 ７３．Ｂはアラニン、グルタミン酸、またはシステインのいずれか１つである、 請求項６９に記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ７４．前記ペプチドは少なくとも１つの内部セリン、スレオニン、またはシステ イン残基を含む、請求項６９に記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ７５．前記内部残基は機能基への接合のために利用可能である、請求項７４に記 載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ７６．前記ペプチドが以下のアミノ酸配列： の１つを含む、請求項６９に記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ７７．請求項４２に記載の複数の核酸凝縮ペプチドであって、ここで、前記核酸 凝縮ペプチドは、全体の配列の長さが＞17残基である、以下の３つのコンセンサ ス配列： 配列I： ここで、Kはリジンであり；Pはプロリンであり；Aはアラニンであり；Xはセリン 、スレオニン、またはプロリンであり；Yはアラニンまたはバリンであり；Zはア ラニン、スレオニン、またはプロリンであり；Bはリジン、アラニン、スレオニ ン、またはバリンであり；そしてJはアラニンまたはバリンであり； 配列II ここで、Xはアラニンまたはバリンであり；Kはリジンであり；Sはセリンであり ；Pはプロリンであり；そしてAはアラニンであり； 配列III ここで、Xはリジンまたはアルギニンであり；Yはアラニンまたはスレオニンであ り；Zはプロリン、アラニン、またはセリンであり；Bはリジン、スレオニン、ま たはバリンであり；Kはリジンであり；Pはプロリンであり；Aはアラニンである 、の直線状の組合せを含む、複数の核酸凝縮ペプチド。 ７８．前記ペプチドが以下のアミノ酸配列： を含み、ここで、-C-はシステインであり；ここで、SV40 NLSは配列Pro-Lys-Lys -Lys-Arg-Lys-Val-Glnを有する、請求項７７に記載の複数の核酸凝縮ペプチド。 ７９．前記ペプチドが以下のアミノ酸配列： を含む、請求項７８に記載の複数の核酸凝縮ペプチド ８０．請求項７７に記載の複数の核酸凝縮ペプチドであって、ここで、前記ペプ チドが以下の一般式：のアミノ酸配列を含み、 ここで、Xは存在しないか、あるいはセリンまたはスレオニンの１つであり； Ｙは配列I、IIまたはIIIの１つであり； nは２〜６であり；そして Cはシステインである、複数の核酸凝縮ペプチド。 ８１．前記ペプチドが以下のもの： ここで-C-はシステインであり； ここで-C-はシステインであり； ここで-C-はシステインであり；および ここで-C-はシステインである、 の群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載の複数の核酸凝縮ペ プチド。 ８２．前記ペプチドが以下の配列： の群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８１に記載の複数の核酸凝縮ペ プチド。 ８３．核酸を哺乳動物細胞にトランスフェクトするための合成ウイルス様粒子で あって、該合成ウイルス様粒子は、 組換え核酸、 第１の複数の第１の核酸凝縮ペプチドであって、それぞれの該ペプチドは共有 結合した第１の機能基を含み、 第２の複数の第２の核酸凝縮ペプチド、 を含み、 ここで、それぞれの該核酸凝縮ペプチドはヘテロペプチドであり、そしてそれ ぞれの該複数の核酸凝縮ペプチドは低い多分散を有し、 ここで、それぞれの該複数の核酸凝縮ペプチドは、該核酸が凝縮された形態に なるように該組換え核酸と非共有結合する、合成ウイルス様粒子。 ８４．第３の複数の第３の核酸凝縮ペプチドをさらに含み、それぞれの該第３の ペプチドは、前記第１の機能基とは異なる共有結合した第２の機能基を含む、請 求項８３に記載の合成ウイルス様粒子。 ８５．前記第１および第２の機能基は、予め選択された比において前記合成ウイ ルス様粒子に存在する、請求項８４に記載の合成ウイルス様粒子。 ８６．前記第１および前記第２の核酸凝縮ペプチドは、異なるアミノ酸配列を有 する、請求項８３に記載の合成ウイルス様粒子。 ８７．前記第１および前記第２の核酸凝縮ペプチドは、同一のアミノ酸配列を有 する、請求項８３に記載の合成ウイルス様粒子。 ８８．前記第１の核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合した第１の機能基を含み 、そしてそれに共有結合した第２の機能基をさらに含む、請求項８３に記載の合 成 ウイルス様粒子。 ８９．前記第２の機能基が前記第１の機能基に共有結合している、請求項８８に 記載の合成ウイルス様粒子。 ９０．前記機能基が抗原性ペプチドであるリガンドを含む、請求項８３に記載の 合成ウイルス様粒子。 ９１．前記機能基が特定の細胞型を標的化するリガンドを含む、請求項８３に記 載の合成ウイルス様粒子。 ９２．前記リガンドがモノクローナル抗体、インシュリン、トランスフェリン、 およびアシアロ糖タンパク質からなる群より選択される、請求項９１に記載の合 成ウイルス様粒子。 ９３．前記機能基が非特異的な様式で細胞を標的化するリガンドを含む、請求項 ９１に記載の合成ウイルス様粒子。 ９４．前記リガンドが糖を含む、請求項９３に記載の合成ウイルス様粒子。 ９５．前記機能基が脂質を含む、請求項９４に記載の合成ウイルス様粒子。 ９６．前記脂質がパルミトイル、オレオイル、ステアロイル、およびコレステロ ールからなる群より選択される、請求項９５に記載の合成ウイルス様粒子。 ９７．前記機能基が中性親水性ポリマーを含む、請求項９３に記載の合成ウイル ス様粒子。 ９８．前記中性親水性ポリマーがPEGまたはPVPを含む、請求項９７に記載の合成 ウイルス様粒子。 ９９．前記機能基がフソゲンペプチドである、請求項８３に記載の合成ウイルス 様粒子。 １００．前記フソゲンペプチドがHAペプチドを含む、請求項９９に記載の合成ウ イルス様粒子。 １０１．前記機能基が酵素を含む、請求項８３に記載の合成ウイルス様粒子。 １０２．前記酵素がリコンビナーゼおよびインテグラーゼからなる群より選択さ れる、請求項１０１に記載の合成ウイルス様粒子。 １０３．前記機能基が細胞内輸送タンパク質を含む、請求項８３に記載の合成ウ イルス様粒子。 １０４．前記細胞内輸送タンパク質が核局在化配列からなる群より選択される、 請求項１０３に記載の合成ウイルス様粒子。 １０５．前記第１の機能基が脂質またはPEGの１つを含み、そして前記第２の機 能基は細胞を標的化するリガンドである、請求項８９に記載の合成ウイルス様粒 子。 １０６．前記第１の機能基が脂質を含む場合、前記第２の機能基は細胞レセプタ ーを標的化するリガンドを含む、請求項１０５に記載の合成ウイルス様粒子。 １０７．前記第１の機能基がPEGを含む場合、前記第２の機能基は細胞レセプタ ーを標的化するリガンドを含み得む、請求項１０６に記載の合成ウイルス様粒子 。 １０８．前記リガンドが、糖部分、またはその細胞レセプターが細胞型に制限さ れるリガンドの１つを含む、請求項１０７に記載の合成ウイルス様粒子。 １０９．前記第１の機能基が脂質を含む場合、前記第２の機能基はPEGを含む、 請求項１０５に記載の合成ウイルス様粒子。 １１０．請求項８３に記載の合成ウイルス様粒子であって、ここで前記核酸凝縮 ペプチドは、以下の一般式： のアミノ酸配列を含み、 ここで、X1-8のそれぞれは、独立して、側鎖に正に荷電した基を有するアミノ 酸であり； ここで、Y1-4のそれぞれは、独立して、αヘリックス形成を促進する天然に存 在するアミノ酸であり； ここで、Z1-4のそれぞれは、独立して、安定化された折り曲がり構造を形成す る高度な性質を有する少なくとも３つのアミノ酸を伴う、天然に存在するアミノ 酸であり； ここで、Ａはアミノ末端のセリンまたはスレオニン残基であり； ここで、Ｂは任意のアミノ酸であり；そして ここで、ｎ＝２〜４およびｍ＝２である、 合成ウイルス様粒子。 １１１．X1-8のそれぞれは、独立して、リジン、アルギニン、2,4-ジアミノ-酪 酸、またはオルニチンである、請求項１１０に記載の合成ウイルス様粒子。 １１２．Y1-4のそれぞれは、独立して、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、メ チオニン、グルタミン、トリプトファン、またはヒスチジンである、請求項１１ ０に記載の合成ウイルス様粒子。 １１３．Z1-4のそれぞれは、独立して、アスパラギン、グリシン、プロリン、セ リン、およびアスパラギン酸である、請求項１１０に記載の合成ウイルス様粒子 。 １１４．Ｂはアラニン、グルタミン酸、またはシステインのいずれか１つである 、請求項１１０に記載の合成ウイルス様粒子。 １１５．前記ペプチドは少なくとも１つの内部セリン、スレオニン、またはシス テイン残基を含む、請求項１１０に記載の合成ウイルス様粒子。 １１６．前記内部残基は機能基への接合のために利用可能である、請求項１１５ に記載の合成ウイルス様粒子。 １１７．前記ペプチドが以下のアミノ酸配列： の１つを含む、請求項１１０に記載の合成ウイルス様粒子。 １１８．請求項８３に記載の合成ウイルス様粒子であって、ここで、前記核酸凝 縮ペプチドは、全体の配列の長さが＞17残基である、以下の３つのコンセンサス 配列： 配列I： ここで、Kはリジンであり；Pはプロリンであり；Aはアラニンであり；Xはセリン 、スレオニン、またはプロリンであり；Yはアラニンまたはバリンであり；Zはア ラニン、スレオニン、またはプロリンであり；Bはリジン、アラニン、スレオニ ン、またはバリンであり；そしてJはアラニンまたはバリンであり； 配列II ここで、Xはアラニンまたはバリンであり；Kはリジンであり；Sはセリンであり ；Pはプロリンであり；そしてAはアラニンであり； 配列III ここで、Xはリジンまたはアルギニンであり；Yはアラニンまたはスレオニンであ り；Zはプロリン、アラニン、またはセリンであり；Bはリジン、スレオニン、ま たはバリンであり；Ｋはリジンであり；Pはプロリンであり；Aはアラニンである 、の直線状の組合せを含む、合成ウイルス様粒子。 １１９．前記ペプチドが以下のアミノ酸配列： を含み、ここで、-C-はシステインであり；ここで、SV40NLSは配列Pro-Lys-Lys- Lys-Arg-Lys-Val-Glnを有する、請求項１１８に記載の合成ウイルス様粒子。 １２０．前記ペプチドが以下のアミノ酸配列： を含む、請求項１１９に記載の合成ウイルス様粒子。 １２１．請求項１１８に記載の合成ウイルス様粒子であって、前記ペプチドが以 下の一般式： のアミノ酸配列を含み、 ここでXは存在しないか、あるいはセリンまたはスレオニンの１つであり； Yは配列I、IIまたはIIIの１つであり； nは２〜６であり；そして Cはシステインである、合成ウイルス様粒子。 １２２．前記ペプチドが以下のもの： ここで-C-はシステインであり； ここで-C-はシステインであり； ここで-C-はシステインであり；および ここで-C-はシステインである、 の群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２１に記載の合成ウイルス様 粒子。 １２３．前記ペプチドが以下の配列： の群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２２に記載の合成ウイルス様 粒子。 １２４．哺乳動物細胞を組換え核酸でトランスフェクトする方法であって、該方 法は、該哺乳動物細胞と請求項１に記載の合成ウイルス様粒子とを接触させる工 程を包含する、方法。 １２５．哺乳動物細胞を組換え核酸でトランスフェクトする方法であって、該方 法は、以下の工程： ａ）請求項１に記載の合成ウイルス様粒子とエンドソーム破壊薬剤との混合物 を形成する工程、および ｂ）該核酸での該細胞のトランスフェクションを可能にするのに十分な条件下 で、工程ａ）の該混合物と哺乳動物細胞とを接触させる工程、 を包含する、方法。 １２６．患者への投与のための合成ウイルス様粒子を処方する方法であって、該 方法は、請求項１に記載の合成ウイルス様粒子とエンドソーム破壊薬剤とを混合 する工程を包含する、方法。 １２７．前記エンドソーム破壊薬剤がフソゲンペプチドである、請求項１２５ま たは請求項１２６に記載の方法。 １２８．哺乳動物細胞を組換え核酸でトランスフェクトする方法であって、該方 法は、以下の工程： ａ）請求項１に記載の合成ウイルス様粒子と中性親水性ポリマーとの混合物を 形成する工程、および ｂ）該核酸での該細胞のトランスフェクションを可能にするのに十分な条件下 で、工程ａ）の該混合物と哺乳動物細胞とを接触させる工程、 を包含する、方法。 １２９．患者への投与のための合成ウイルス様粒子を処方する方法であって、該 方法は、請求項１に記載の合成ウイルス様粒子と中性親水性ポリマーとを混合す る工程を包含する、方法。 １３０．前記中性親水性ポリマーがポリエチレングリコールを含む、請求項１２ ８または請求項１２９に記載の方法。 １３１．薬学的に受容可能なポリマーと組み合わせた請求項１に記載のいずれか １つの合成ウイルス様粒子を含む、患者に組換え核酸を投与するための薬学的処 方物。 １３２．エンドソーム破壊薬剤をさらに含む、請求項１３１に記載の薬学的処方 物。 １３３．中性親水性ポリマーをさらに含む、請求項１３１に記載の薬学的処方物 。 １３４．患者に組換え核酸を導入する方法であって、該方法は、治療的有効量の 請求項１に記載の合成ウイルス様粒子、または請求項１３１に記載の薬学的処方 物を該患者に投与する工程を包含する、方法。 １３５．組換え核酸で哺乳動物細胞をトランスフェクトするための合成ウイルス 様粒子を作製する方法であって、該方法は、凝縮された核酸を含む合成ウイルス 様粒子の形成を可能にするのに十分な条件下で、組換え核酸と複数の核酸凝縮ペ プチドとを混合する工程を包含し、ここで、該核酸凝縮ペプチドはヘテロペプチ ドであり、そして該複数の核酸凝縮ペプチドは低い多分散を有する、方法。 １３６．前記混合する工程は、前記核酸と前記複数の核酸凝縮ペプチドとを混合 する工程を包含し、ここで、該複数の核酸凝縮ペプチドは第１の核酸凝縮ペプチ ドおよび第２の核酸凝縮ペプチドを含み、それぞれの該核酸凝縮ペプチドはヘテ ロペプチドであり、そしてそれぞれの該複数の核酸凝縮ペプチドは低い多分散を 有し、ここで、該第１の核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合した第１の機能基 を含む、請求項１３５に記載の方法。 １３７．組換え核酸で哺乳動物細胞をトランスフェクトするための合成ウイルス 様粒子を作製する方法であって、該方法は、凝縮された核酸を含む合成ウイルス 様粒子の形成を可能にするのに十分な条件下で、組換え核酸と第１の複数の第１ の核酸凝縮ペプチドおよび第２の複数の第２の核酸凝縮ペプチドとを混合する工 程を包含し、ここで、それぞれの該第１および第２の核酸凝縮ペプチドはヘテロ ペプチドであり、そしてそれぞれの該第１および第２の複数の核酸凝縮ペプチド は低い多分散を有する、方法。 １３８．前記第１の核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合した第１の機能基を含 む、請求項１３７に記載の方法。 １３９．前記第１および前記第２の核酸凝縮ペプチドは異なるアミノ酸配列を有 する、請求項１３６または請求項１３７に記載の方法。 １４０．前記第１および前記第２の核酸凝縮ペプチドは同一のアミノ酸配列を有 する、請求項１３６または請求項１３７に記載の方法。 １４１．前記混合する工程は、前記核酸と前記複数の核酸凝縮ペプチドとを混合 する工程を包含し、ここで、前記第２の核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合し た第２の機能基を含み、該第２の機能基は前記第１の機能基とは異なる、請求項 １３６または請求項１３７に記載の方法。 １４２．前記第１の核酸凝縮ペプチドは、それに共有結合した第２の機能基をさ らに含む、１３６または請求項１３７に記載の方法。 １４３．前記第２の機能基は、前記第１の機能基に共有結合している、請求項１ ４２に記載の方法。 １４４．前記混合する工程が以下の工程： 第１および第２の機能基の比を選択する工程を包含し、その結果、前記組換え 核酸と混合される、第１および第２の核酸凝縮ペプチドの割合が該比に対応する 、請求項１４１に記載の方法。 １４５．前記混合する工程が以下の工程： 前記機能基に対する共有結合のための前記核酸凝縮ペプチド上の結合位置を選 択する工程を包含する、請求項１４１に記載の方法。 １４６．前記選択する工程は、前記第１の機能基に対する共有結合のための前記 第１の核酸凝縮ペプチド上のアミノ酸位置を選択する工程、および前記第２の機 能基に対する共有結合のための前記第２の核酸凝縮ペプチド上のアミノ酸位置を 選択する工程を包含する、請求項１４５に記載の方法。 １４７．前記選択する工程が前記核酸凝縮ペプチドのアミノ末端またはカルボキ シ末端の位置を選択する工程を包含する、請求項１４５に記載の方法。 １４８．前記混合する工程は、以下の工程：前記核酸凝縮ペプチドに対する共有 結合のための前記機能基上の位置を選択する工程を包含する、請求項１４１に記 載の方法。 １４９．前記機能基は標的化タンパク質を含む、請求項１４８に記載の方法。 １５０．前記混合する工程後に、前記合成ウイルス様粒子とエンドソーム破壊薬 剤とを混合する工程をさらに包含する、請求項１３５または請求項１３７に記載 の方法。 １５１．組換え核酸で哺乳動物細胞をトランスフェクトするための合成ウイルス 様粒子を作製する方法であって、該方法は、 ａ）複数の第１の核酸凝縮ペプチドと組換え核酸とを、該複数の核酸凝縮ペプ チドと該核酸との非共有結合を可能にし、そして該核酸の凝縮を可能にするのに 十分な時間の間、高塩濃度中で、接触する工程、 ｂ）工程ａ）の該塩濃度をより低い塩濃度に希釈する工程、および中性親水性 ポリマーを添加する工程、 を包含する、方法。 １５２．前記工程ｂ）において、前記希釈および添加は、複数の第２の核酸凝縮 ペプチドの添加と同時に行われ、それぞれの該第２のペプチドは、それに共有結 合した脂質基を含み、 ここで、それぞれの該第１および第２の核酸凝縮ペプチドはヘテロペプチドで あり、そしてそれぞれの該複数の核酸凝縮ペプチドは低い多分散を有する、請求 項１５１に記載の方法。 １５３．前記工程ｂ）において、前記希釈および添加は、複数の第２の核酸凝縮 ペプチドの添加の前に行われ、それぞれの該第２のペプチドは、それに共有結合 した脂質基を含み、 ここで、それぞれの該第１および第２の核酸凝縮ペプチドはヘテロペプチドで あり、そしてそれぞれの該複数の核酸凝縮ペプチドは低い多分散を有する、請求 項１５１に記載の方法。 １５４．前記中性親水性ポリマーはポリエチレングリコールを含む、請求項１５ １に記載の方法。 １５５．組換え核酸で哺乳動物細胞をトランスフェクトするための合成ウイルス 様粒子を作製する方法であって、該方法は、 ａ）複数の第１の核酸凝縮ペプチドと組換え核酸との混合物を高塩濃度中で形 成する工程、 ｂ）該複数の核酸凝縮ペプチドと該核酸との非共有結合、および該核酸の凝縮 を可能にするのに十分な時間の間、工程ａ）の該混合物をインキュベートする工 程、ならびに ｃ）工程ｂ）の該混合物と第２のペプチドに共有結合した脂質基を含む複数の 第２の核酸凝縮ペプチドとを接触する工程を包含し、 ここで、それぞれの該第１および第２の核酸凝縮ペプチドはヘテロペプチドで あり、そしてそれぞれの該複数の核酸凝縮ペプチドは低い多分散を有する、 方法。
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