JP2001526650A - 光画像造影剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、光学顕微鏡を用いるインビボ光画像処理において、造影剤としての材料を用いることに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 光画像造影剤 本発明は造影剤、さらに詳しくは、光に基づく多様な診断画像化技術における 粒子状造影剤、さらに特定すれば、粒子状光造影剤に関する。 造影剤は診断画像の各種分野において画像を増強させるために用いられ、これ らの中で最も重要な分野はＸ線、磁気共鳴映像法(MRI)、超音波画像および核医 学の分野である。開発中または現在臨床的に使用されている他の医学的画像様式 には磁性起源の画像化および応用の可能性のある断層撮影がある。Ｘ線造影剤の 歴史はほぼ100年になる。 現在臨床的に用いられているＸ線造影剤としては分子あたり３〜６個のヨウ素 原子からなる各種の水溶性ヨード化芳香族化合物が包含される。これらの化合物 は荷電できる（生理学的に許容される塩の形態で）かまたは非イオン性である。 今日最も一般的な造影剤は、広範な研究で非イオン性物質がイオン性化合物より 安全なことが証明されたことから非イオン性物質である。これは患者を浸透圧負 荷で処置しなければならない。水溶性ヨード化造影剤に加え、硫酸バリウムもな お頻繁に胃腸系のＸ線検査に使用されている。数種の水不溶性または粒子状造影 剤が、主として肝臓およびリンパ系の画像処理に非経口投与用Ｘ線造影剤として 示唆されてきた。代表的な非経口投与用の粒子状Ｘ線造影剤には、たとえば固体 ヨード化粒子の懸濁液、水溶性ヨード化造影剤を含有するリポソームの懸濁液ま たはヨード化油状物のエマルジョンが包含される。 最近のＭＲＩ造影剤は、一般的に常磁性物質、または強磁性、フェリ磁性もし くは超常磁性挙動を示す粒子（以下磁性粒子という）を含有する物質からなる。 常磁性ＭＲＩ造影剤には、たとえば、Mn EDTAおよびGd DTPAのような遷移金属キ レートおよびランタニドキレートがある。現在、数種のガドリニウムベースの造 影剤が臨床的に使用されている。これらには、たとえばGd DTPA（Magnevist−登 録商標）、Gd DTPA−BMA（Omniscan−登録商標）、 Gd DOTA（Dotarem−登録商標）およびGd HPDO3A（Prohance−登録商標）が包含 される。数種の粒子状常磁性造影剤が肝臓のＭＲＩ診断用に示唆されている。た とえば、常磁性キレートを含有するリポソームの懸濁液および常磁性固体粒子た とえばガドリニウムデンプンマイクロスフェアの懸濁液である。ＭＲ造影剤とし ての使用が提案されている磁性粒子は、所望によりコーティングもしくは担体マ トリックスで提供されるFe₃O₄またはδ−Fe₂O₃のような水不溶性物質である。こ のような物質は、きわめて活性なＭＲ造影剤であり、生理学的に許容される懸濁 液の形態で投与される。 超音波造影媒体（コントラストメジウム）のための造影剤は一般に遊離のまた は封入された気泡の懸濁液からなる。気体は任意の許容される気体たとえば空気 、窒素またはペルフルオロカーボンとすることができる。代表的な封入材料は炭 水化物マトリックス（たとえば、Echovist−登録商標およびLevovist−登録商標 ）、タンパク質（たとえば、Albunex−登録商標）、リン脂質のような脂質材料 （気体含有リポソーム）および合成ポリマーである。 シンチグラフィーのような診断核医学のためのマーカーは一般的に、たとえば キレート複合体の型で提供されるテクネチウム（99ｍ）およびインジウム（III ）のような放射性元素であるが、リンホシンチグラフィー（lymphoscintigraphy ）は放射標識テクネチウム硫黄コロイドおよび酸化テクネチウムコロイドにより 行われる。 本明細書で用いられる「光画像」の語は、広い領域の適用を包含し、それらは すべて、電磁性スペクトルのＵＶ、可視またはＩＲ領域の照射源として利用され る。光画像では、生体を通過、生体により散乱または反射（また蛍光の場合には 再発光）した光が検知され、画像が、直接的または間接的に作られる。光は、物 質と相互作用し、そのエネルギーを有意に変えることなく、その伝播の方向を変 える。この過程は弾性散乱と呼ばれる。軟部組織による光の弾性散乱は組織の誘 電率における顕微鏡的変化と関係づけられる。 与えられた波長（λ）の光が組織内を進行する単位距離あたりで散乱する確率は （線状）拡散係数μ_sと呼ばれる。約600〜1300nの光学窓における軟部組織の拡 散係数は10¹〜10³cm^-1の範囲であって、１／λとして低下する。この範囲ではμ_s >>μ_a（吸収係数）であり、μ_s（および総減衰）はきわめて大きく、前進拡散 は光の組織中への実質的透過を生じる。弾動光（ballistic light）とは、拡散 することなく組織領域を通過した光である。準弾動光(quasi-ballistic light) （「蛇」光）とはほぼ同じ進行方向を維持している散乱光である。有効浸透深度 は630nm以上への波長の増大とともに徐々に上昇するかほとんど一定である（975 nmにおける水吸収のピークではわずかな伏角が観察されるが）。拡散係数は、波 長の上昇とともに緩徐な低下を示すのみである。 散乱する光は散乱部位から遠ざかると無作為に分散されるか（等方性）または 最小の分散で特定の方向に散乱される（非等方性）ことができる。便宜上また数 学的モデル化の目的で、組織における散乱は不連続で独立した散乱中心（「粒子 」）で起こると仮定する。このような「粒子」からの散乱では、散乱係数および 散乱の平均コサイン（相関数）は、粒子とその周囲の媒体の間の反射係数の差お よび粒子サイズ対波長の比に依存する。入射光の波長より小さい粒子による光の 散乱はレイリー（Rayleigh）散乱と呼ばれる。この散乱は１／λ⁴として変動し 、散乱はほぼ等方性である。光の波長に匹敵するかまたはそれより大きい粒子に よる光の散乱はMie散乱と呼ばれる。この散乱は１／λとして変動し、散乱はほ ぼ非等方性（前方ピーク）である。大部分の測定が行われている可視／近−ＩＲ では、組織に観察される散乱はミクロン規模の粒子：たとえば、細胞および主要 なオルガネラによるミー（Mie）様散乱と一致する。 散乱係数は光学窓（600〜1300nm）における光の波長に対してきわめて大きい ので、散乱現象が起こる前に光量子によって運ばれる平均距離はわずか10〜100 μmにすぎない。これから、組織に有意な距離浸透する光量子は多重 散乱現象に遭遇することが示唆される。組織を通って数cm運ばれた光の弾動性成 分は、著しく小さい。組織における多重散乱とは真の光学的行路が光の入力およ び出力部位の間の物理的な距離よりはるかに大きいことを意味する。したがって 、散乱は光を組織内に拡散するように作用する（拡散−透過および拡散−反射） 。多重散乱が画像に与える難点は３重である。すなわち、(ｉ)多重散乱により無 作為化された光はシグナル情報を失い、画像に対するノイズに寄与する（散乱は ノイズを増大させる）；(ii)散乱は光を組織内に長期間保持して、吸収の確率を 増加させ、したがって検出のために組織を通過する光は減少する（散乱がシグナ ルを低下させる）；および(iii)ベール−ランバートの法則から得ることができ る濃度のような組織（または造影媒体）の物理的性質の決定は、散乱により真の 光学行路の測定が困難なので複雑化される（散乱は組織における光の相互作用を 複雑にする）。しかしながら、光は散乱せずに組織内には10分の数ミクロン以上 浸透することはできないが、散乱の平均コサインの大きな値は、入射光中の光量 子の有意な分画が最初の光軸から大きく変異することなく、多数の散乱を受け、 そのまま画像の形成に寄与できることを示している。結果としてノイズ成分を拒 絶することが可能で光の準弾動成分が検出できれば、散乱が優勢であっても組織 に関して画像化を実施することが可能である。 光画像技術のために最も興味がある波長はほぼ600〜1300nmの範囲である。こ れらの波長は、天然の物質による吸収がされずに生体組織に比較的深く浸透する ことが可能であり、しかも人体に無害である。しかしながら、表面構造の光学的 分析あるいは生体表面または生体窩洞表面もしくは管腔にきわめて接近した疾患 の診断には、ＵＶおよび600nm未満の可視光も使用できる。 光は治療にも使用できる。すなわち、光力学療法（PDT）では、たとえば光量 子は吸収され、そのエネルギーが癌療法に使用できる熱および／または光化学反 応に変換される。 今日の光画像の主たる方法には、単純な透照法、各種断層撮影技術、蛍光画像 および放射線を含むハイブリッド方法、または他の形態の放射線もしくは放射線 と接合したエネルギーまたは光の検出（たとえば、光音響もしくは音響光学）が 包含される。これらの方法は、透過、散乱もしくは発光（蛍光）光量子、または これらの作用の組み合わせのいずれかに有利である。本発明は任意の形態の光を ベースとしたこれらのおよびその他の画像化方法のための造影剤に関する。 現在、光をベースとした画像のための新たな装置の開発には、大きな興味がも たれている。興味のある方法は、とくに各種タイプの開発中の断層技術である。 診断医学およびＰＤＴにおける光の使用に関する科学参照文献には、たとえば、 光画像技術および光線画像における各種染料の使用に関連する幾つかの特許が 公告されている。すなわち、ヒドロキシアルミニウム2,3−ピリドシアニドから なる標識蛍光染料：JP 4,320,456（Hitachi Chem）、蛍光標識フタロシアニン色 素を含有する腫瘍用の治療および診断剤：JP 4288 022（Hitachi Chem）、各種 の可視部のネイティブなルミネセンスを使用する癌組織の検出：US 4,930,516(A lfano，R．ら)、ネイティブな蛍光を用いる癌組織の検出のための方法および装 置：US 5,131,398(Alfano，R．ら)、組織からの蛍光発光による診断の改良：WO 90／10219（Andersson-Engels，S．ら）、蛍光プローブとしての蛍光ポルフィリ ンおよび蛍光フタロシアニン−ポリエチレングリコール、ポリオールおよび糖誘 導体：WO 91／18006(Diatron Corp)、ランダムメジウムを造影する方法：US 5,1 37,355（State Univ of New York）、テトラピロール治療剤：US 5,066,274（Ni ppon Petrochemicals）、治療剤中におけるテトラピロールポリアミノモノカル ボン酸：US 4,977,177（Nippon Petrochemicals）、テトラピロールアミノカル ボン酸：US 5,004,811（Nippon Petrochemicals）、ポルフィリンならびに癌治 療：US 5,162,519（Efamol Holdings）、ジヒドロポルフィリンおよび壊死しや すい腫瘍の処置方法：US 4,837,221（Efamol）、非経口的に投与される合成リン 脂質を包含するリポソーム中分散形態の亜鉛フタロシアニド化合物：EP 451 103 （CIBA Geigy）、腫瘍を検出するための装置および方法：US 4,515,165（Energy Conversion Device）、低酸素症を決定するため の時間および頻度ドメインスペクトロスコピー：WO 92／13598(NIM Inc)、蛍光 ジゴキシン試薬としてのフタノシアナートポリエチレングリコールおよびフタロ シアナート糖：WO 91／18007（Diatron）、フルオロメーター：US 4,877,965（D iatron）、ファイバーオプティック蛍光スペクトロメーター：WO 90／00035（Ya le Univ）、組織酸素測定システム：EP 502,270（Hamamatsu Photonics）、皮膚 反射からビリルビン濃度を定量する方法：US 4,029,084（Purdue Research Foun dation）、バクテリオクロロフィル−光力学的治療に有用な誘導体：US 5,173,5 04（Health Research Inc）、光力学的治療に有用な精製ヘマトポルフィリンダ イマーおよびトリマー：US 5,190,966（Health Research Inc）、ポルフィリン から構成される薬剤：US 5,028,621（Health Research Inc）、ヘモポルフィリ ン誘導体および製造方法：US 4,866,168（Health Research Inc）、標的細胞を 破壊または傷害する方法：US 5,145,863（Health Research Inc）、腫瘍の存否 を診断する方法：US 5,015,463（Health Research Inc）、光力学的治療法：US 4,957,481（U.S.Bioscience）、生体組織を検査するための装置：US 2,437,916 （Philip Morris and Company）、胸部の電子画像の正常化による乳癌および他 の胸部損傷の診断のためのトランスイルミネーション法の装置：US 5,079,698（ Advanced Light Imaging Technologies）、トリカルボシアニン赤外吸収染料：U S 2,048,955（Eastman Kodak）、神経外科学のための光学画像システム：CA 2,0 48,697（Univ Techn Int）、癌の診断および／または処置におけるＰＤＴのため の光増感剤としての新規ポルフィリン誘導体およびそれらの金属複合体：JP 323 ,597（Hogyo，T）、ヘテロダイン検出の光受容体システムおよび光伝達画像のた めの画像形成装置：EP 445,293（Research Dvelopment Corp．of Japan）、ヘテ ロダイン検出の光受容体システムおよび光受容体システムを用いる光伝達画像の ための画像形成装置：WO 91／05239（Research Dvelopment Corp．of Japan）、 保存に安定なポルフィリン組成物とそれらの製造方法：US 4,882,234（Healux） 、 化学被検物質を光学的に測定するための方法：WO 92／19957(Univ of Marylanda t Baltimore)、波長特異的な細胞毒性物質：US 4,883.790（Univ of BritishCol ombia）、ヒドロ−モノベンゾ−ポルフィリンの波長に特異的な毒性物質：US 4, 920,143（Univ of British Colombia）、ヒト組織の定量的検査および高分解能 画像のための装置および方法：EP 447,708（Haidien Longxing Med Co）、神経 外科における光画像システム：US Appl.7,565,454（University TechnologiesIn t．Inc.）、蛍光リガンドによる特異的薬物受容体の特性解析：WO 93／03382（P harmaceutical Discovey Corp）、分子プローブとしての4,7−ジクロロフルオレ セイン染料：US 5,188,934（Applied Biosystems）、狭いスペクトルバンド幅の 非イオン化照射を用いる高分解能胸部画像装置：US 4,649,275（Nelson，R．ら ）、メソ−テトラフェニル−ポルフィリン−複合化合物、それらの製造方法およ びそれらを含有する医薬：EP 336,879（Schering）、13,17−プロピオン酸及び プロピオン酸誘導体置換ポルフィリン−複合化合物、およびその製造方法および それを含む薬剤：EP 355,041（Schering）、感光性薬剤：US 5,039,349(Health Research)、光学的治療におけるピロフェオフォルバイド（pyropheophorbides） とその使用：US 5,198,460(Health Research)、ラマンスペクトルを使用する光 学的組織化学的分析、インビボ検出および異常組織切除のためのリアルタイムガ イダンス：WO 93／03672(Redd，D.)、テトラベンツトリアザポルフィリン試薬お よびそれを含むキット：US 5,135,717（British Technology Group）、ヒト脳に おける機能的活性の局所限定のためのシステムおよび方法：US 5,198,977（Salb ，J.）、サファリンの光力学的活性：US 5,120,411(Board of Regents，Univers ity of Texas)、拡張ポルフィリンの製造法：US 5,152,509(Board of Regents， University of Texas)、拡張ポルフイリン：(Board of Regents，University of Texas)、赤外照射画像システムと方法：WO 88／01485（Singer Imaging）、散 乱および拡散照射線を用いる画像作成方法：WO 91／07655（Singer Imaging）、 悪性腫瘍の真性 蛍光のための診断装置：US 4,957,114、インダセン化合物ならびにその使用方法 ：US 5,189,029（Bo-Dekk Ventures）、肺における癌を検出するために５,10,15 ,20−テトラキス（カルボキシフェニル）ポルフィリンを使用する方法：US 5,16 2,231(Cole，D．A．ら)、組織領域の画像表示：DE 4327 798（Siemens）、クロ ロフィルおよびバクテリオクロロフィル誘導体、それらの製造、ならびにそれら を含有する医薬組成物：EPO 584 552（Yeda Research and Development Company ）、波長特異的な感光性ポルファシアニンおよび拡張ポルフィリン様化合物なら びにそれらの製造および使用方法：WO 94／10172（Qudra Logic Technologies） 、半透明ランダムメジウム中または後方に隠された対象物の形成画像のシグナル 対ノイズ比改良のための方法および装置：US 5,140,463（Yoo，K．M．ら）、光 力学的療法のためのベンゾポルフィリン誘導体：US 5,214,036（University of British Columbia）、デルターアミノレブリン酸を用いる癌の蛍光診断：WO 93 ／13403（Svanbergら）、蛍光発生物質の増強によるとくに腫瘍領域の診断方法 ：DE 4136 769（Humboldt Uuiversitat）、テルピリジン誘導体：WO 90／00550 （Wallac）等である。 現在の技術水準に記載のすべての光画像化染料および造影剤は様々な性質を有 するが、すべて入力光に作用し、吸収および／または蛍光のいずれか導く作用を 有する。しかしながら、これらの造影剤は、いずれも粒子状造影剤としては使用 されていない。 本発明者らは、今回、散乱造影剤として粒子状物質を導入することによって光 画像でとくに効率的に造影の増強が達成されることを発見した。明瞭にするため に「粒子」の語は任意の生理学的に許容される粒子状の材料を意味して使用され る。このような粒子は固体（たとえば被覆されたまたはされていない結晶物質） または液体（たとえば乳化液中の液体粒子）でもよく、また凝集していてもよい （たとえば、液体含有リポソーム）。入力光の波長より小さいまたは類似のサイ ズの粒子材料が好ましい。 したがって、本発明の一態様からみると、インビボで診断光学顕微鏡に使用す るためのコントラストメジウムを含有する造影剤、とくに造影媒体含有粒子状造 影剤のための生理学的に耐容性のある材料、好ましくは生理学的に耐容性のある 粒子状の材料の使用を提供する。 本発明の他の態様からみると、また、ヒトまたは非ヒト（好ましくは、哺乳動 物、鳥類または爬虫類）動物生体の画像を光学顕微鏡によって発生させる方法に おいて、生理学的に耐容性のある造影剤好ましくは生理学的に耐容性のある粒子 状造影剤のコントラスト有効量を上記生体に投与し、上記生体の少なくとも一部 の画像を発生させる方法を提供する。このような方法では、造影剤とくに粒子状 造影剤のコントラスト有効量が、たとえば非経口的にまたは外部に空間がある生 体臓器または管に投与され、生体により発光、透過または散乱された光が検出さ れ、造影剤が存在する生体の少なくとも一部の画像が発生される。光が単独また は他の形の照射線と接合して生体に投与され、光または何らかの他の形の照射線 が検出されるハイブリッド方法も包含される。とくに、他の形の照射線は超音波 とすることができる。 本発明により使用される粒子は、好ましくは水不溶性であるかまたは検討下に ある生体に投与後少なくとも２時間はそれらの所望の粒子サイズ（たとえば15〜 1500nm）を保持するのに十分に貧弱な溶解性を示す。 発生した画像は、空間的または一時的および一次元または多次元である。 本発明のさらに他の態様では、画像技術は試験下にある生体または生体の部分 に特徴的なパラメーターの値たとえば血液の流速を決定するために用いられる。 この場合、しかしながら、パラメーターの決定は、皮膚または内視鏡によりもし くは外科的に暴露された表面から検討された粒子より検出される光に基づくもの である。 とくに好ましくは、使用される光画像操作は共焦点走査レーザー顕微鏡（CSLM ）、光学的干渉断層撮影（OCT）、レーザードップラー、レーザースペックル、 および多重光量子顕微鏡技術(後者についての説明は、たとえば Denk，W．Photonics Spectra，125-130，July，(1997);Denk，W．ら，Science 2 48:73-76，April，(1990);Denk，W．ら，J ．Neurosci．Meth．54:2:151-162，(1 994);Denk，W．ら，Neuron 18:351-357，January，(1997);Maiti，S．ら，Scien ce 275:530-532，January，(1997);Denk，W．ら，Proc ．Natl．Acad．92:18:827 9-8282，(1995)および下記参照)。 本明細書で用いられる「顕微鏡」の語は１mm〜0.1ミクロンの分解能を有する 光学的方法として定義される。 多重光量子顕微鏡は光学分画のための放射強度に依存する画像化方法である。 分子に到達する赤外領域付近の光の２個の光量子はほぼ同時に紫外部における光 の光量子を通常要求する電子遷移を誘導することができる。２個の赤外光量子の エネルギーの和は１個の紫外線光量子の場合に近似しなければならない。２個の 光量子が分子とほぼ同時に相互作用する要求は光の強度が高くなければならない ことを意味する。２個の光量子過程によって産生される電子遷移の数は瞬間強度 の二乗に比例する。３個以上の光量子による多重光量子励起では、光の強度に対 するさらに厳しい制限さえ要求される。 ２個の光量子励起後に、単一光量子励起後の場合と同じ波長に蛍光が生じる。 すなわち、単一光量子の蛍光による励起後にその光学領域内で通常蛍光を発する 染料も、赤外または可視光線での２個の光量子励起後に可視領域内に蛍光を発す る。生体サンプルに対する２光量子画像による利点は、励起した光が単一光量子 による画像よりもはるかに大きな浸透を示すことである。赤外光では、紫外光の 場合よりも生体の光傷害ははるかに小さい。 多重光量子顕微鏡の背後にある原理は、レーザー光線の回折限界焦点が２光量 子遷移を焦点の領域内の狭い平面に限定することである。焦点領域の外部では、 ２光量子遷移を生じるには強度が不十分である。100 fsecパルス内の必要な強度 の一時的な濃縮は皮膚に対する熱および光傷害を最小にする。 多重光量子顕微鏡に適当な造影剤は、最大吸収の波長が300〜650nmの範囲 の蛍光物質である。これらは波長範囲600〜1300nmの光による２光量子顕微鏡に 適当である。さらに好ましくは造影剤は650〜1000nmの範囲の励起で325〜500nm の範囲で吸収することになる。 共焦点走査レーザー顕微鏡（CSLM）は試験対象内の単一の点をピンホール源か らその点に光を集めることにより選択的に検出する画像様式である。その点を通 って透過するまたはその点から反射する光は、第二のピンホールに再び集まるか 、またはその焦点を除く対象における他の部位から来る光をろ過する同一のピン ホールに戻る。サンプルを通過する面を通る焦点のラスター走査は点のその面の 完全な画像を発生させる。ピンホールおよび焦点を合わせる装置をサンプルの前 後に移動することにより、異なるサンプル平面が選択される。実際上、ＣＳＬＭ は試験サンプルを「光学的」に分画する手段である。それはサンプルの個々の分 画の画像を引き出すが、それらの分画はサンプルの残余から物理的に分離される 必要はない。 光学的干渉断層撮影（OCT）は、類似のしかしながら若干異なる様式で光学的 分画を達成する。平行な光線はサンプルから反射し、ついで正確に既知の距離を 進行した対照光線と比較される。光源から検出器まで対照光線が進行した距離と 正確に同じ距離をサンプルへの往復に進行した光のみが、対照光線と構成的に干 渉し検出される。したがって、サンプル内の単一な平面からの光が再び選択され る。対照光線がサンプリング光線と比較される前に進行した距離を変動させると 異なるサンプル平面が選択される。 ＣＳＬＭ、ＯＣＴ、レーザードップラーおよびレーザースペックルは、たとえ ばRajadhyakshaら，Laser Focus World，119-127，Feburary，(1997);Sabelら， Nature Medicine 3(2):244-247，(1997);Tearneyら，SPIE 2389:29-34，(1995); Bonnerら，“Scattering techniques applied to supramolecular and non-equi librium systems"，685-701，Chenら編，Plenum;Ruth，J．Microcirc．Clin．Ex p．9：21-45，(1990);Pierard，Dermatology 186:4-5，(1993)およびBonnerら， “Laser-doppler blood flowmetry"，17-46，Shepherdら編，Kluwer，(1990)によって論じられている。 ＣＳＬＭ、ＯＣＴまたは他の形態のインビボ顕微鏡は、研究下の生体の皮膚に またはアクセスできる表面の約１mm以内に存在する構造ならびに現象、たとえば 外科手術時に暴露されたもしくは内視鏡により暴露された表面の研究にとくに有 効に使用できる。 ＣＳＬＭ、ＯＣＴまたは他の形態のインビボ顕微鏡は、光学的に導かれる腫瘍 切除に有用である。たとえば、大腸内視鏡に付属のいずれの装置も癌性の結腸の ポリープの除去後に悪性の組織が残っていないことの決定を容易にする。その他 の適用には、それらに限定されるものではないが、その他の消化管の疾患の診断 および処置、潰瘍性大腸炎の外科的処置ならびに子宮内膜症の診断および処置が 包含される。 ＣＳＬＭ、ＯＣＴまたは他の形態のインビボ顕微鏡は、暴露された表面の約１ mm以内にある皮膚および他の血管新生組織の毛細血管を通じた血液細胞の移動を 追跡するために動力学的に使用することができる。それらは血流の測定のために 、レーザードップラーまたはスペックル干渉法と接合して使用できる可能性があ る。 レーザードップラーおよびスペックル干渉法はそれぞれ、移動する粒子の収集 と相互作用するレーザー光線が時間とともに変化したのちに光の強度が検出され るという事実に依存する点で類似する。変化の数学的な分析により粒子が移動す る速度を計算するためのベースが与えられる。 手術によって暴露された組織の潅流はその組織の健康の一つの重要なインディ ケーターである。胸部の皮膚内の血流は内科疾患のインディケーターである可能 性がある。皮膚の血流はレーザードップラー血流測定またはレーザースペックル 干渉法の単独、またはＣＳＬＭ、ＯＣＴもしくは他の形態のインビボ顕微鏡と接 合して検出することができる。 本発明によれば、画像形成操作に用いられる波長の光を散乱できる合成粒子が インビボ光画像形成操作における造影剤として投与される。このような散乱粒子 は通常、生理学的に耐容性のある液体（たとえば、注射用水、生理的食塩水、リ ンゲル溶液等）に懸濁して関心ある血管もしくは筋肉または組織もしくは臓器に 投与される。 手術時のＣＳＬＭ、ＯＣＴまたは他の形態のインビボ顕微鏡のための好ましい 造影剤は以下の性質を有する。すなわち、それは水性または緩衝液体メジウム中 安定化された粒子から構成される。粒子サイズは、好ましくは約５〜10000nm、 好ましくは600〜1300nm、さらに好ましくは700〜1100nm（すなわち、光源の波長 にほぼ等しい）である。粒子の屈折率は、好ましくは体液たとえば血液およびリ ンパ液とは少なくとも0.01だけ異なることが好ましい。粒子は所望によりそれら の表面に付着した蛍光染料を有するか、または蛍光染料をそれらの内部に含有す るか、それらの粒子自体が蛍光染料から構成される。所望により、粒子は生体内 でマクロファージによる取り込みを遅延させ、それらの血液循環中の寿命を延長 するために、ポリ（エチレングリコール）のような適当な表面修飾剤を有するこ ともできる。 粒子は、光源の波長の光に透明もしくは半透明またはさらに好ましくは不透明 な材料から作成される。 とくに好ましくは、粒子は実質的に単分散系のポリマー粒子である（Coulter LS 130粒子サイズアナライザーで測定した粒子サイズの変動係数（すなわち、10 0×標準偏差÷検出可能な粒子の主要モードの容量による平均粒子サイズ）は10 ％未満、好ましくは５％未満）。このような粒子はUS-A-4336173ならびにUS-A-4 459378に開示されたSINTEF技術によって調製できる。このような粒子は単純な散 乱体であるか、また好ましくは300〜1300nmの範囲に特性吸収および／または発 光最大を有する発色団（または蛍光団）をもつように修飾されていてもよい。さ らにそれらは、標的ベクターたとえば粒子が所望の標的部位に蓄積を生じる役目 をする種、たとえば外部磁場の 適用により粒子の標的部位への蓄積を可能にする超常磁性結晶、また標的域たと えば細胞表面の受容体内の部位に結合親和性を有する薬剤、抗体、抗体フラグメ ントもしくはペプチド（たとえば、オリゴペプチドまたはポリペプチド）を包含 もしくは担うように修飾されてもよい。 粒子状造影剤は単純な局所適用または他の医薬的に許容される経路により適用 することができる。皮膚科学的適用では、造影剤は経皮的なパッチまたはイオン 泳動により送達されるように修飾することができる。送達される薬剤の量をコン トロールできるので、イオン泳動による送達が好ましい。 手術中の使用には、造影剤は手術前または手術時に血管または除去すべき病変 に注射することができる。リンパ節の検出には、それはリンパ管または外科領域 に排液する組織の粘膜内に注射することができる。また、それは手術時に局所用 軟膏、リキッドとして適用するか、またスプレーしてもよい。血流の測定には、 造影剤は測定前に静脈内に注射できる。 上に指示したように、本発明で用いられる粒子状造影剤は発色団または蛍光団 からなり、すなわち画像操作で検出される波長範囲の光を吸収してもまた発光し てもよく、あるいは主に光散乱効果に依存してもよい。後者の場合は、単に生理 学的に耐容性のある非光標識粒子、たとえば有機または無機材料たとえば肉眼で は白色または無色のように見える不溶性のトリヨードフェニル化合物または二酸 化チタンを使用すればよい。粒子が発色団または蛍光団からなる場合、すなわち 光標識されているときは、これは粒子状のキャリアー（たとえば、固体粒子また はリポソーム）によって担持された（たとえば、結合、コーティング、含有また は内部に沈着された）材料とすることができる。別法として、キャリアー自体が 発色団または蛍光団をもっていてもよい。光標識は黒色の光標識（すなわち、可 視スペクトルを吸収し、したがって肉眼には黒色に見える）でもよいが、非黒色 光標識が好ましい。 散乱造影剤（およびそれについての吸収造影剤）は光画像作成への適用に際し 画像増強の幾つかの機構を有することができる。第一の機構はＸ線画像 メジウムがＸ線画像発生に有するのと類似の直接画像増強作用である。直接的画 像増強においては、造影媒体を含有する組織から放出されるシグナルの強度に影 響することによって画像コントラストの改良にコントラストメジウムが直接寄与 する。光画像化においては、組織に局在する散乱剤（吸収剤）が周囲の組織とは 異なって光を減衰させ、コントラストの増強を導く。 共焦点顕微鏡および光学的干渉断層撮影のような近表面法では、主に散乱剤が 入力光を検出器に選択的に導く反射中心として働くことによりコントラストを発 生させる。散乱部位が移動する液体たとえば血液に捕らえられると、散乱部位の 移動の程度を液体の流速の指標として使用することができる。 「スペックル」現象は干渉照射（たとえばレーザーからのような）の散乱部位 との相互作用から生じる。散乱部位が移動すると、スペックルパターンが時間と ともに変化し、スペックルパターンの変化速度を、散乱部位の移動速度の決定に 使用することができる。散乱部位の移動が非(ノン)ランダムであると、たとえば それらが移動する液体に伴出されるとき、液体の流速はスペックルパターンの経 時的変化によって決定される。 散乱剤（吸収剤）が使用できると思われる第二の機構はノイズ拒絶剤としてで ある。この場合の造影剤は、上述のように直接画像を作成するのではなく、画像 シグナルからノイズシグナルを置換する機能を有するので所望のシグナルがより 容易に検出される。光画像形成の適用におけるノイズは多重散乱から生じ、画像 の質を低下させる。このノイズの原因は次の通りである。 前述のように、組織のようなランダムメジウムを伝播する光は多重散乱を受け る。この散乱は入射光を３つの成分、弾動性、半弾動性および非干渉性（高度に 散乱した）成分がある。弾動および半弾動シグナルは組織中を前方方向に伝播し て、対象情報をもっている。非干渉成分は、光がすべての方向にランダム散乱を 受け、対象についての情報は失われるのでノイズを構成する。弾動および半弾動 シグナルの強度が多重散乱ノイズの強度以下に低下すると対象は見えなくなる。 この多重散乱ノイズは入力光の共線方向から外れ る散乱光を拒絶する空間フィルターによって一部除去できる。しかしながら、ノ イズの実質的な部分は、最初の弾動シグナルの再合同による多重散乱現象後に対 象から出現する。この多重散乱光は望ましい弾動シグナルとのその共線経路によ り、空間フィルタリングでは除去できない。 散乱剤（および吸収剤）は、望ましい弾動および半弾動シグナルから望ましく ないノイズ成分の除去を補助できる。これは、多重散乱光は、組織内でランダム ウォーク（乱歩）を受け、したがって弾動シグナルより長い経路距離を進行する 。弾動および半弾動シグナルが通過する距離は本質的に、画像が作成される組織 （または生体部分）の厚さである。長い距離を進行する散乱光は減衰される確率 がより大きくなる。最近の技術は、弾動および半弾動成分から散乱シグナル（長 い進行距離＝長い組織内滞留時間）を拒絶するために、タイムゲート（一時的フ ィルター）を使用する。 等方性の小さい散乱剤の導入は高度に散乱したシグナル成分の滞留時間を著し く増大させるが、一方、弾動および半弾動成分はレーザー効果を有する。これは 、弾動および半弾動シグナルと高度に散乱された成分との間の長期分離を効果的 に提供し、散乱（ノイズ）成分の拒絶の改良およびよりよい画像品質を提供する 。 先行技術には粒子散乱に基づく造影剤に関してはほとんど開示されていない。 本発明者の知る限りでは、粒子散乱に基づく造影剤に関しての唯一の先行技術は 半透明メジウム内にまたはその後方に隠れた対象の形成された画像のシグナル対 ノイズ比を改良するための方法および装置を開示したUS 5,140,463（Yoo，K．M ．ら）である。一般的用語でその特許には、ランダムメジウムのランダム性を低 くすること（散乱光の少ないこと）が示唆され、また弾動および半弾動光と高度 に散乱した光の間の時間分離を上昇させることも示唆されている。この特許によ れば、これを得る多くの方法の一つは、ランダムメジウム中に小さな散乱体を導 入することになる。これらの小さな散乱体については、更なる示唆はなく、その インビトロ使用の示唆もな い。 リポソームの形での粒子材料は示唆されている。すなわちリ、ポソームまたは ＬＤＬ−投与されるZn(II)−フタロシアニンがReddi E．ら，Lasers in Medical Science 5，330，(1990)により腫瘍の光力学的薬剤として、合成リン脂質を含 有するリポソーム分散液の形態の非経口的に投与される亜鉛フタロシアニン組成 物がEP 451 103（Ciba Geigy）に、光力学的癌療法もしくは抗ウイルス剤に使用 されるベンゾポルフィリン誘導体を含有するリポソーム組成物がCA 2,047,969（ Liposome Company）に示唆されている。これらの粒子材料は治療剤として示唆さ れ、散乱光画像コントラスト剤としては何ら示唆されていない。 本発明の一実施態様においては、光に基づく画像様式のための造影媒体は、粒 子を含有する生理学的に耐容性のある気体からなる。好ましくは、たとえば、生 物分解性気体を含有するポリマー粒子、気体を含有するリポソーム粒子またはエ アゾル粒子である。 本発明のこの実施態様には、たとえば光画像化における、気体充填空隙を有す る粒子(US 4,442,843)、気体を有するガラクトース粒子(US 4,681,119)、微小気 泡の発生のための微小粒子(US 4,657,756およびDE 3313947)、タンパク微小気泡 (EP 224934)、気体を含有するクレー粒子(US 5,179,955)、固体界面活性剤微粒 子と気泡（DE 3313946）、アミロースまたはポリマーの気体含有微小粒子（EP 3 27490）、気体含有ポリマー粒子（EP 458079）、エアゲル粒子（US 5,086,085） 、生物分解性ポリアルデヒド微小粒子（EP 441468）、リポソーム会合気体（EO 9115244）、気体含有リポソーム（WO 9222247）および他の気体含有リポソーム （WO 9317718，EP 0398935，EP 0458745，WO 9218164，EP 0554213，WO 9503835 ，DE 3834705，WO 9313809，WO 9112823，EP 586875，WO 9406477，DE 4219723 ，EP 554213，WO 9313808，WO 9313802，DE 4219724，WO 9217212，WO 9217213 ，WO 9300930，US 5,196,183，WO 9300933，WO 9409703，WO 9409829，EP 53538 7， WO 9302712，WO 9401140）の使用を包含する。表面もしくは粒子のコーティング は任意の生理学的に許容される材料とすることが可能であり、気体は任意の気体 または気体混合物とすることができる。とくに好ましい気体は超音波造影剤に使 用される気体、たとえば空気、窒素、低級アルカン類および低級フルオロまたは ペルフルオロアルカン類（たとえば、７個まで、とくに４、５または６個の炭素 を含有する）が用いられる。 気体微小気泡（リポソームの封入膜のあるまたはない）が本発明により使用さ れる場合は、このような微小気泡を破壊する超音波の比較的高い強度のバースト の既知の能力の利点が得られる。すなわち、超音波暴露の前後に検出される光シ グナル（または画像）を比較することにより、造影剤の分布のマッピングが容易 になる。 本発明の他の実施態様においては、光に基づく画像様式のための造影媒体は、 脂質材料の生理学的に耐容性のある粒子、たとえばエマルジョン、とくに水性エ マルジョンである。好ましくは脂質材料からなるハロゲンである。本発明のこの 実施態様には、たとえば、光画像における以下の使用、油脂エマルジョン(JP 51 86372)、フルオロカーボンのエマルジョン（JP 2196730，JP 59067229，JP 9003 5727，JP 92042370，WO 930798，WO 910010，EP 415263，WO 8910118，US 5,077 ,036，EP 307087，DE 4127442，US 5,114,703）、ブロム化したペルフルオロカ ーボンのエマルジョン（JP 60166626，JP 92061854，JP 5904630，JP 93001245 ，EP 231070）、ペルフルオロクロロエマルジョン（WO 9311868）または他のエ マルジョン（EP 321429）の使用が包含される。 本発明のさらに他の実施態様においては、光に基づく画像様式のためのコント ラストメジウムは生理学的に耐容性のあるリポソームからなる。リポソームの好 ましい群はリン脂質リポソームおよび多重薄層リポソームである。 本発明のこの実施態様には、たとえばコレステロール誘導体を含有するリン脂 質リポソーム（US-A-4544545）；アルデヒド含有化合物と会合したリポ ソーム（US-A-4590060）；脂質マトリックスキャリアー（US-4610868）；肝臓お よび脾臓のＸ線検査にも適当なタイプのトリヨード安息香酸誘導体を含有するリ ポソーム（DE-2935195）；リンパ造影にも適したタイプのＸ線コントラストリポ ソーム（US-4192859）；受容体標的化リポソーム(WO-8707150)；免疫活性リポソ ーム（EP-307175）；抗腫瘍抗体特異的抗体を含有するリポソーム（US-4865853 ）；還元されたＭＲＩ造影剤（スピン標識）を修復できる酸化剤を含むリポソー ム（US-4863717）；ＭＲＩにも適当なタイプのマクロ分子結合常磁性イオンを含 有するリポソーム（GB-2193095）；気体前駆体として重炭酸ナトリウムまたはア ミノマロン酸を含有する超音波画像にも適当なタイプのリン脂質リポソーム（US -4900540）；安定な多薄層小胞（US-4522803）；脂質として非イオン界面活性剤 を含有する油充填多薄層リポソーム（US-4911928）；酸素との可逆的結合のため のリガンドを含有するリポソームリン脂質ポリマー（US-4675310）；非イオン界 面活性剤を含有する大きな単一薄層小胞リポソーム（US-4853228）；リポソーム 含有エアゾル処方（US-4938947およびUS-5017359）；両親媒性化合物を含有する リポソーム(EP-361894)；有機脂質溶液に水相を加え、次に溶媒を蒸発させ、濃 縮物に水性脂質相を加えて製造したリポソーム（FR-2561101）；高濃度での生物 活性剤の封入にも有用なタイプの安定な単相脂質小胞（WO 8500751）；均質のリ ポソームプレパレーション（US-4873035）、液化可能なゲル中の懸濁液からなる 安定化リポソーム化合物（US-5008109）；活性化合物の制御された拡大放出にも 適当なタイプのリポスフェア（リン脂質でコートされた固体親水性核：WO 91071 71）；ゲル中に封鎖されたリポソーム（US-4708861）；ＭＲ造影剤としての使用 にも適したリポソーム結合金属キレート（WO-9114178）；Ｘ線造影剤の脂質複合 体（WO 8911272）；高い溶質対脂質比を捕獲できるリポソーム（WO-9110422）； 血清半減期を改良するために外部表面上に共有結合したＰＥＧ残基を含有するリ ポソーム（WO-9004348）；常磁性および／または超常磁性物質が封入された特殊 な直径のリポソームからなる造影剤 （WO-9004943）；純粋なリン脂質から調製された小リポソームからなる、腫瘍に 送達する画像化物質としても適当なタイプのリポソーム(EP-179444)；封入Ｘ線 造影剤たとえばリポソーム中イオプロミド（US-5110475）；非リン脂質リポソー ム組成物（US-5043165およびUS-5049389）；肝細胞に向けられた小胞送達システ ム（US-4603044）；臓器の画像処理用の超音波造影剤としても適当なタイプの気 体充填リポソーム（US-5088499）；リポソームによって安定化された注射可能な 微小気泡懸濁液（WO-9115244）；リポソームに結合した常磁性キレート（US-513 5737）；固体の腫瘍に局在する化合物にも適当なタイプのリポソーム組成物（WO -9105546）；注射可能なＸ線不透明化リポソーム組成物（WO-8809165）；リポソ ーム中に封入された鉄キレート（EP-494616）；ジスルフィド結合によって標的 分子に連結されたリポソーム（WO-9007924）ならびに非放射性結晶Ｘ線造影剤お よび粒子サイズの小さいポリマー表面修飾剤からなる組成物（EP-498482）の光 画像における使用が包含される。 単なる水溶液では明らかに重要な光散乱剤または吸収剤ではない水溶性化合物 がリポソームに導入すると効果的な散乱剤になることがある。すなわち、ヨーデ ィキサノール（および市販品の入手が可能な他の可溶性ヨード化Ｘ線造影剤）は 水に溶解すると澄明な溶液を与える。しかしながら、ヨーディキサノールはリポ ソームに封入した場合、得られた粒子状生成物は灰色であり、有意な光散乱能力 が指示される。 リポソームは光画像造影剤の担体としての使用のほかに、界面活性分子たとえ ばドデシル硫酸ナトリウム、セチルトリメチルアンモニウムハライド、プルロニ ックス、テトロニックス等から、中程度または実質的に水に不溶性であるが両媒 性ミセル形成剤によって可溶化される光標識たとえばインドシアニングリーンの ような光標識のための担体として形成される単なるミセルを使用することが可能 である。同様に、自然にポリマーミセルに凝集するＰＥＧ修飾ポリアスパラギン 酸（Kwonら，Pharm．Res．10:970，1993参照） はこのような光標識を運ぶために使用することができる。同様に、光標識担体凝 集粒子は多環式芳香族炭化水素の陰イオン性界面活性剤（たとえば、ドデシル硫 酸ナトリウムまたは硫酸化プルロニックスＦ108）による処理、ついで重金属イ オン（たとえば、トリウムまたは銀）の添加により製造できる。このような重金 属処理はリン光性の挙動を示すミセルを生じ、これらは、光標識を導入すること なく本発明に使用することが可能で、とくにパルス光源と、時間的遅延リン光の ゲート検出を使用することができる。 本発明のさらに他の実施態様においては、光に基づく画像様式のコントラスト メジウムはヨウ素を含む生理学的に耐容性のある粒子からなる。これらの粒子は たとえば実質的に水不溶性固体または液体ヨウ素含有化合物、たとえば無機また は有機化合物、後者の場合好ましくはトリヨードフェニル基含有化合物であり、 またはそれらは、少なくとも１種の成分がヨード化化合物ある凝集粒子（たとえ ば、リポソーム）である。この場合、ヨード化化合物は膜形成化合物であるか、 もしくは膜によって封入されていてもよい。たとえば、乳化されたヨード化油脂 （US 4,404,182）粒子状Ｘ線造影剤（JP 67025412，SU 227529，DE 1283439，US 3,368,944，AU 9210145，EP 498482，DE 4111939，US 5,318,767）、ヨード化 エステル（WO 9007491，EP 300828，EP 543454，BE 8161143）、およびヨード化 脂質（EP 294534）が本発明のこの実施態様に包含される。 本発明のさらに他の実施態様では光に基づく画像様式のコントラストメジウム は生理学的に耐容性のある磁性粒子からなる。本明細書において用いられる「磁 性粒子」の語は、強磁性、フェリ磁性または超常磁性を示す任意の粒子であり、 好ましくは、磁性粒子および生理学的に耐容性のあるポリマーマトリックスまた はコート物質、たとえば炭水化物および／またはUS-A-5160725およびUS-A-49044 79においてたとえばPilgrimmまたはIllumにより記載されたポリアルキレンオキ シド（たとえばPEG）のような血液滞留延長ポリマーたとえば、磁性粒子を含有 する生物分解性マトリックス／ポリ マー粒子である。 本発明のこの実施態様には、たとえば、磁性液体（SU 1187221）、陰性に荷電 したコロイドで被覆されたフェライト粒子（DE 2065532）、フェライト粒子（US 3832457）、磁性応答性物質を含む液体マイクロスフェア（EP 42249）、シラン で被覆された金属酸化物核を有する磁性粒子(EP 125995)、タンパク質マトリッ クスに基づく磁性粒子（DE 3444939）、磁性小胞（JP 60255728）、磁性粒子（S U 106121）、不活性担体に包埋された磁性粒子（JP 62167730）、特異的抗体を 負荷された強磁性粒子（DE 3744518）、生物学的に許容される炭水化物ポリマー で被覆された超常磁性粒子(WO 8903675)、磁性材料を含む重合脂質小胞体（US 4 ,652,257）、生物分解性マトリックス中における超常磁性粒子（US 4,849,210） 、常磁性または強磁性材料を含有する生物分解性マトリックス粒子（US 4,675,1 73）、組織に対して結合親和性の物質を有する強磁性粒子(WO 8601112)、フェラ イト粒子（JP 47016625，JP 4701664）、強磁性の粒子（NL 6805260）、磁性ポ リマーの粒子（WO 7800005，JP 62204501，JP 94016444，WO 870263）、バリウ ムフェライト粒子（WO 8805337）、磁性酸化鉄粒子（US 4,452,773）、磁性粒子 含有アミノ酸ポリマー（US 4,247,406）、複合二重金属酸化物粒子（EP 186616 ）、磁性粒子（GB 2237198）、封入された超常磁性粒子（WO 8911154）、生物分 解性磁性粒子（WO 8911873）、タンパク質に共有結合した磁性粒子（EP 332022 ）、炭水化物マトリックスを有する磁性粒子（WO 8301768）、シリコーンマトリ ックスを有する磁性粒子（EP 321322）、ポリマーで被覆された磁性粒子(WO 901 5666)、ポリマー保護コロイド性金属分散物(EP 252254)、生物分解性の超常磁性 粒子（WO 8800060）、被覆された磁性粒子(WO 9102811)、第一鉄液体（DE 41302 68）、有機金属被覆磁性粒子（WO 9326019）および他の磁性粒子（EP 125995，E P 284549，US 5,160,726，EP 516252，WO 9212735，WO 9105807，WO 9112025，W O 922586，US 5,262,176，WO 9001295，WO 8504330，WO 9403501，WO 9101147， EP 409351，WO 9001899， EP 600529，WO 9404197）の光画像化における使用が包含される。 本発明で用いられる粒子状造影剤は、上述のように、非光標識または光標識さ れている。後者の場合には、これは粒子は入射光の波長において有効な光吸収剤 （すなわち発色団を有する）または入力波長の光を吸収して異なる波長で発光す る蛍光材料（すなわち蛍光団を有する）のいずれかであることを意味する。適当 な蛍光団の例にはフルオレセインならびにフルオレセイン誘導体および類縁体、 インドシアニングリーン、ローダミン、トリフェニルメチン、ポリメチン、シア ニン、ファロシアニン、ナフトシアニン、メロシアニン、ランタニド複合体（た とえば、US-A-4859777）またはクリプテート等、とくに発光最大を波長600nm以 上に有する蛍光団（たとえば、WO-A-92／08722に記載されたような蛍光団）が包 含される。他の標識には、フラーレン、オキサテルラゾール（たとえばUS-A-459 9410に記載されたような）、ラホイヤブルー、ポルフィリンおよびポルフィリン 類縁体（たとえば、ベルジン、プルプリン、ロージン、ペルフィセン、テキサフ ィリン、サフィリン、ルビリン、ベンゾポルフィリン、フォトフィリン、メタロ ポルフィリン等）および天然の発色団／蛍光団たとえばクロロフィル、カロテノ イド、フラボノイド、ビリン、フィトクローム、フィコビリン、フィコエリスリ ン、フィコシアニン、レチノイン酸ならびに類縁体たとえばレチノインおよびレ チネートが包含される。 一般的に発色団を含有する光標識は大きなモル吸収率例えば＞10⁵cm^-1M^-1およ び光学窓600〜1300nmにおける吸収最大を示さなければならない。多重光量子励 起には、吸収最大の適当な整数の積は光学窓600〜1300に落ちなければならない 。それらの吸収性によってノイズ拒絶剤として用いられる粒子は同様に、好まし くは10⁵cm_-1M^-1越えるモル吸収率および600〜1300nmの範囲に吸収最大をもつ必 要がある。蛍光粒子では、蛍光の量子収率が最も重要な特性の一つである。これ は可能な限り高くなければならない。しかしながら、蛍光団についてもモル吸収 率は望ましくは10⁵cm^-1M^-1より大きく、吸収 最大は望ましくは拡散反射試験では600〜1300nmまたは表面もしくは近表面試験 においては300〜1300nmでなければならない。 これらの光標識材料は、実質的に水不溶性および生理学的に耐容性であれば、 そのまま、たとえば固体もしくは液体粒子として使用され、また粒子状担体（た とえば無機もしくは有機粒子またはリポソーム）内に接合もしくは捕獲されても よい。この点でとくに好ましいものは、式Ｉ Ｉ₃Ｐｈ−Ｌ−Ｃ^* （Ｉ） ［式中、I₃Phはトリヨードフェニル残基であり、Ｌはリンカー残基であり、Ｃ^* は（たとえば、上述のような）発色団または蛍光団である］である。このような 化合物は本発明の他の態様を形成する。 I₃Ph残基は好ましくは、３および５位置におけるカルボキシルまたはアミン残 基を有する2,4,6−トリヨード残基［または置換されたこのような基、たとえば アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アルコ キシカルボニルアルコキシカルボニル、またはアルキルカルボニルアミノ基であ る（この場合、アルキルまたはアルキレン基は所望によりヒドロキシ置換され、 好ましくは20まで、とくに１〜６、ことに１〜３個の炭素を有する］である。リ ンカー基Ｌは、基Ｃ^*をI₃Ph残基に連結することができる任意の基であり、たと えばアミド、アミン、NHSO₂もしくはカルボキシル基またはそのチオ類縁体；ま たはこのような基で終結するC_1-20アルキレン鎖、およびチア、オキサ、および チア、オキサ、ヒドロキシもしくはアルキル残基で所望により置換された所望に より１個もしくは２個以上のメチレン基である。基Ｌの例には-NHSO₂−および-C O₂(CH₂)₂O-CS-NH-が包含される。 このような化合物は、Ｘ線造影剤としてNycomed，Sterling WinthropまたはBr accoにより彼らの多くの特許（例としては、たとえばUS-A-5264610，US-A-53284 04，US-A-5318767およびUS-A-5145684）に提案されたタイプの発色団または蛍光 団分子をトリヨードフェニル化合物に接合することにより 調製される。 本発明の一つの特定の実施態様では、非光標識粒子、たとえばポリマーまたは ヨード化Ｘ線造影剤の固体粒子が、光標識をその粒子に化学的または生理化学的 に結合することにより（たとえば、反対に荷電した光標識および粒子を用いるこ とにより）光標識のコーティングもしくは殻として提供される。好ましくはナノ 粒子サイズ（たとえば５〜10000nm、とくに10〜1000nm、さらに好ましくは10〜5 00nm）の得られた被覆粒子は、蛍光団で標識されると、粒子の核により捕獲され た光エネルギーが発光表面に移動し、蛍光団による発光が増強される。このよう な粒子を含有する組成物は、本発明の更なる態様を形成する。 別法として、光標識を、たとえばポリマーと光標識との共沈殿によりまたは多 孔性無機もしくは有機マトリックスのプローブ内での光標識の沈殿による固体ポ リマーマトリックスの内部に行うこともできる。 光標識の担体または核としての使用に適当な有機ポリマーマトリックスは実質 的に水に不溶性の生理学的に耐容性のあるポリマー、たとえばポリスチレンラテ ックス、ポリラクチドコグリコリド、ポリヒドロキシブチレートコバレレート等 である。 他の生理的に許容される粒子は、本発明による光に基づく画像化方法のための 造影媒体中に使用される。好ましい材料の群にはたとえば生物分解性ポリマー粒 子、ポリマーもしくはコポリマー粒子および常磁性材料を含有する粒子がある。 粒子はたとえば架橋ゼラチン粒子(JP 60222046)、親水性物質で被覆された粒子( JP 48019720)、ブロム化ペルフルオロカーボンエマルジョン(JP 58110522)、ペ ルフルオロカーボンエマルジョン(JP 63060943)、経口使用のための粒子および エマルジョン(DE 3246386)、ポリマー粒子（WO 8601524，DE 3448010）、脂質小 胞体（EP 28917）、金属酸化物粒子（JP 1274798）、金属トランスフェリンデキ ストラン粒子（US 4735796）、単分散磁性ポリマー粒子（WO 8303920）、ポリマ ー粒子（DE 2751867）、常 磁性金属化合物含有微小粒子（US 4,165,879）、常磁性材料含有多孔性粒子（WO 8911874）、親水性ポリマー粒子（CA 1109792）、水膨潤性ポリマー粒子（DE 2 510221）、ポリマー粒子（WO 8502772）、金属負荷されたモルキュラーシーブ（ WO 9308846）、硫酸バリウム粒子（SU 227529）、金属粒子（DE 2142442）、架 橋された多糖粒子（NL 7506757）、生物分解性ポリマー粒子（BE 869107）、ニ オビウム粒子（SU 574205）、生物分解性粒子（EP 245620）、両媒性ブロックコ ポリマー（EP 166596）、均一サイズの粒子（PT 80494）、着色粒子（WO 910877 6）、ポリマー粒子(US 5,041,310，WO 9403269、WO 9318070，EP 520888，DE 42 32755)、多孔性ポリマー粒子（WO 9104732）、多糖粒子（EP 184899）、脂質エ マルジョン(SU 164180)、炭水化物粒子（WO 8400294）、ポリシアノアクリレー ト粒子（EP 64967）、常磁性粒子（EP 275215）、ポリマーナノ粒子（EP 240424 ）、ナノ粒子（EP 27596，EP 499299）、ナノカプセル（EP 274961）、無機粒子 （EP 500023，US 5,147,631，WO 9116079）、ポリマー粒子（EP 514790）、アパ タイト粒子（WO 9307905）、粒子状マイクロクラスター（EP 546939）、ゲル粒 子（WO 9310440）、親水性コロイド（DE 2515426）、粒子状のポリ電解質複合体 （EP 454044）、コポリマー粒子（EP 552802）、常磁性ポリマー粒子（WO 92222 01）、親水性ポリ−グルタメートマイクロカプセル（WO 9402106）および他の粒 子（WO 9402122，US 4,997,454，WO 9407417，EP 28552，WO 8603676，WO 88078 70，DE 373809，US 5,107,842，EP 502814）がある。 一般に、粒子状試剤の非経口（たとえば脈管内）投与が意図される場合は、こ れらにたとえばPilgrimmによりUS-A-5160725またはIllumによりUS-A-4904479に 記載されているような血液内滞留時間延長ポリマーを付着することによって粒子 の血液内滞留時間を延長することが望ましい。この方法による血管系の画像化は 、細網内皮系による取り込みを遅延させることにより容易になる。リポソーム粒 子の場合は、血液内滞留時間延長ポリマーは、予 め形成されたリポソームに結合させるか、またはリポソーム膜形成分子に接合さ せて、得られたリポソームをそれらの表面に親水性血液滞留ポリマー成分を有す る両親媒性膜形成成分として使用することができる。別法としてまたはさらに、 粒子は、生物標的残基に接合させて（たとえばUS-A-94／21240に記載のように） 、所望の組織または臓器、たとえば腫瘍組織に粒子の優先的な分布を生じるよう にすることができる。 本発明により使用される粒子サイズは、粒子の投与が非経口的にもしくは生体 の窩腔の外部空隙に行われるか、または粒子が光標識されるか否かに依存する。 一般的に粒子サイズは５〜10000nm、ことに15〜1500nm、とくに50〜400nmの範囲 であり、それらの散乱効果のために使用される粒子では、粒子サイズは好ましく は１／15λ〜２λ、より好ましくは１／10λ〜λ、とくにλ／４π〜λ／πの範 囲、さらに特定すれば約λ／２πである（この場合、λは画像技術における入力 光の波長である）。血液の吸収最大以上の波長、たとえば600〜1000nmの範囲で 効果的に散乱する粒子サイズの選択およびその範囲内の波長での照射により、非 光標識粒子のコントラスト効果が増強される。 ヒトまたは動物対象に対する投与には、粒子は、慣用の医薬または動物医薬の 担体または賦形剤とともに処方するのが便利である。本発明に用いられるコント ラストメジウムは、医薬または動物医薬の処方補助剤たとえば安定化剤、抗酸化 剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、着色剤、フレーバー、粘度調整剤等を 含有させるのが便利である。それらは、非経口もしくは腸内投与、たとえば注射 もしくは輸液、または外部空隙排管を有する生体窩腔たとえば胃腸管、膀胱また は子宮への直接的な投与に適当な形態とすることができる。すなわち、本発明の メジウムは慣用の医薬的投与剤形、たとえば錠剤、コート錠、カプセル、散剤、 溶液剤、懸濁剤、分散剤、シロップ、坐剤、エマルジョン、リポソーム等である が、生理的に許容される担体メジウム好ましくは、たとえば注射用水中における 溶液、懸濁液および分散液が、しか しながら一般的に好ましい。メジウムが非経口的投与用に処方される場合は、粒 子を導入する担体メジウムは、等張性または若干高張性であることが好ましい。 造影剤は、インビボにおけるとくに臓器もしくは外部空隙を有する管（たとえ ば、ＧＩ管、子宮、膀胱等）、脈管、貪食作用臓器（たとえば、肝臓、脾臓、リ ンパ節等）または腫瘍の光画像化に使用できる。画像技術には、内視鏡操作たと えば光発光器および検出器の腹部空隙、ＧＩ管等への挿入、およびたとえば臓器 または排管表面からの透過、散乱または反射光の検出を包含する。単色入力光を 適宜使用し、一時的に遅延した発光（たとえば、パルス光ゲート検出）または入 力光とは異なる波長の光（たとえば、造影剤における蛍光団の発光最大での）を 検出する。同様に、画像は選択された標的の一時的画像であり、標的部位におけ る造影剤の蓄積または通過を示す。使用される光は、単色または多色、連続また はパルスでもよいが、一般には単色光、たとえばレーザー光が好ましい。光は紫 外または近赤外、たとえば波長100〜1300nmであるが、300nm以上の波長、とくに 600〜1300nmが好ましい。 本発明のコントラストメジウムは一般的に粒子濃度１・10^-6ｇ／ml〜50・10^-3 ｇ／ml、好ましくは５・10^-6ｇ／ml〜10・10^-3ｇ／mlをもたねばならない。投与量 は１・10^-7ｇ／kg〜５・10^-1ｇ／kg、好ましくは１・10^-6ｇ／kg〜５・10^-2ｇ／kgが 一般的に適当なコントラストを与えるが、通常１・10^-4ｇ／kg〜１・10^-2ｇ／kgが 好ましい。 本明細書に引用した様々な刊行物は引用により本明細書に導入される。 本発明をさらに以下の非限定的な実施例により例示する。他に指示がなければ 百分率および比率は重量による。実施例１ ヨーディキサノール含有リポソーム 平均直径300〜600nmのリポソームをA.D.BanghamらMethods in Membrane Biology(E.D.Korn編)，Plenum Press，NY，pp1-68，1974に記載の「薄層フィル ム水和法」の改変によって調製する。この方法によって製造された最大バッチサ イズは2.0Ｌである。水素化ホスファチジルコリン（10g H-PC）および水素化ホ スファチジルセリン（１ｇ H-PS）を水浴中70℃で振盪しながらクロロホルム／ メタノール／水（４：１：0.05，体積比）に溶解する。溶媒をロータリーエバポ レーターでＰＬ（リン脂質）の乾燥混合物が出現するまで除去する。リン脂質混 合物をヨーディキサノールの水性、等張性溶液および張度調整剤を60〜70℃の温 度で加えて、この混合物をホモミキサーでホモジナイズ（65〜70℃の温度で10分 間6000rpm）する。生成したリポソームを３枚のポリカーボネートフィルターか ら１回押し出す。リポソーム懸濁液5.0mlを20mlのガラス瓶に入れ、灰色のゴム 栓によって閉じ、アルミニウムカプセルでシールする。リポソームはオートクレ ーブ（121℃で20分間）で滅菌する。実施例２ 脂肪エマルジョン 水中油型エマルジョンを以下の成分から調製する。 大豆油 １０ｇ ベニバナ油 １０ｇ 卵ホスファチド １.２ｇ グリセリン ２.５ｇ 水 浸透圧258mOsm／L，pH8.3〜9.0 （このようなエマルジョンはLyposyn II の商品名でAbbott Laboratories， Chicago，I11，USAから市販されている）。これを生理的食塩水で所望の濃度に 希釈できる。実施例３ Ａ．固体微小粒子 粒子サイズ１〜12μmの気体充填（たとえば、空気充填）微小気泡懸濁液 は、微小気泡外殻材料としてオレイン酸およびヒト血清アルブミンを用い調製す る。 オレイン酸ナトリウムの0.5％水溶液のサンプル216mlを0.1Ｎ HClによって滴 定し、最終pHを3.9〜4.0の範囲にした。溶液はオレイン酸懸濁液の生成により著 しく白濁した。光学顕微鏡で測定した粒子サイズは0.1ミクロンの範囲であった 。 懸濁液を加圧してオレイン酸懸濁液中への気体の溶解度を上昇させた。懸濁液 を６ブレードのタービン型インペラー（Dispersimaxから）を付した500mlの撹拌 オートクレーブ（Autoclave Engineers，Inc．製造のZipperclave）中に取った 。容器を密閉し、1000psigの空気（通常の圧力範囲は900〜1100psigであった） を装填した。懸濁液を、１時間室温（23〜25℃）、1000rpmで撹拌した（撹拌範 囲750〜1500rpm）。通常、温度は試行中に２〜３℃上昇した。撹拌を停止し、容 器を通気し、懸濁液は使用まで30分保持した。光学顕微鏡で測定した粒子サイズ は0.1ミクロンの範囲であった。 ヒト血清アルブミン（HSA）の25％水溶液２ｇを28ｇの水および上述のエマル ジョン20ｇに加えた。白濁した溶液を65℃に加熱し、この間酸素ガスを通じた。 ついで溶液をOmni-Stirrer（ホモジナイザー）を用い５分間中間範囲のセッティ ングで撹拌した。泡状の混合物を分液漏斗に注ぎ、30分間放置した。底部から液 体を除去し、10mlの新鮮な１％ＨＳＡ溶液を泡状物に加えた。30分後に、液体を 除去し、10mlの新鮮な５％ＨＳＡ溶液を加え、泡状物を溶液に再懸濁した。液体 を速やかに底部から集めた。粒子（微小気泡）は直径範囲１〜12ミクロン、壁厚 １〜２ミクロンであった。 Ｂ．気体充填ミクロ粒子 気体が封入されたミクロスフェアをWO-A-95／01187に従い、ヒト血清アルブミ ンの水溶液を水不溶性気体たとえばペルフルオロアルカン（たとえばドデカフル オロペンタン）と混合して調製する。実施例４ ポリマー粒子 ポリマー粒子懸濁物は、生物分解性ポリマー、ポリヒドロキシブチレート−コ バレレートを適当な有機溶媒たとえばアセトン、メチレンクロリド等に溶解し、 水で沈殿させ、真空蒸留または透析ろ過によって有機溶媒を除去して製造する。 粒子サイズは、本技術分野で周知のように、界面活性剤安定化剤、溶媒蒸発、撹 拌の選択により0.05μm〜10μmの範囲内で選択できる。実施例５ 任意に光標識されたナノ粒子懸濁物 WIN 70177（以下の実施例24に従って調製されたヨード化造影剤）および所望 によりフルオレセイン、モル比100：１、至適には50：１、最も至適には25：１ のＤＭＳＯ（またはDMF）溶液を水中で沈殿させる。得られた沈殿を界面活性剤 安定化剤（たとえばプルロニックＦ108またはテトロニックＴ-908もしくは1508 ）とともにUS-A-5145684の記載のように粒子径0.2μmに粉砕し、水性メジウム中 、造影剤濃度0.5〜25重量％および界面活性剤濃度0.1〜30重量％に分散させる。 US-A-5352459に開示されたように、曇り点修飾剤たとえばポリエチレングリコー ル400（PEG 400）またはプロピレングリコールを、オートクレーブ安定化の安定 性を保証するために包含させることもできる。実施例６ 光標識ナノ粒子懸濁物 ドデシル硫酸ナトリウムの水溶液（pH＞10）にフィトクロームを添加する。得 られた溶液を界面活性剤（PVP、プルロニックおよびテトロトニックから選択） を含む酢酸の撹拌溶液に加え、混合物を透析ろ過して可溶性の塩、過剰の酸等を 懸濁物から除去すると10〜100nmの粒子の分散液が得られる。実施例７ 光標識ミセル インドシアニングリーン（ICG）(0.1〜10％)を、水溶液中３％プルロニックＦ 108と混合し、ミセル組成物を生成させ、滅菌ろ過する。 用いたＩＣＧ含量は、混合ミセルの製造には高く（＞0.5％）、ＩＣＧのミセ ル溶液の製造には低く（＜0.5％）する。0.2〜0.5％のＩＣＧ濃度が好ましい。実施例８ 光標識リポソーム リポソーム懸濁物は、インドシアニングリーンの0.01Ｍ溶液およびリン脂質５ 〜10％を用いた（レシチン対ジパルミトイルホスファチジルセリンの比は10：１ ）。調製は、慣用技術（たとえば、超音波）によって行われ、ついで制御された 孔径のフィルターを用いて排出し、さらに透析ろ過または微小流動体化を行なう 。得られたリポソームは、蒸気滅菌が可能であり、又、滅菌ろ過が可能であり、 窒素下に６カ月以上の物理的安定性を示す。実施例９ 光標識エマルジョン 水中油型エマルジョンを、10ｇのベニバナ油、10ｇのゴマ油、1.2ｇの卵ホス ファチド、2.5ｇのグリセリン、0.5〜10ｇの光標識（たとえばフルオレスセイン もしくはインドシアニングリーン）から調製し、水で全量100ｇとする。乳化は 慣用の方法により行われ、得られたエマルジョンは0.2μmの滅菌フィルターを通 して滅菌するかまたは慣用方法を用いて蒸気滅菌する。実施例１０ 粒子状ヨード化化合物 WIN 70146（以下の実施例23に従って調製されたヨード化Ｘ線造影剤）を約12m lのジルコニウムシリケート、最終懸濁液の15％（重量/容量％）に十分な量の1. 1mm直径のビーズを含む３×1.5ozの褐色のガラス瓶それぞれに添加した。ボトル Ａにはまた３％（重量／容量％）のプルロニックＦ−68、ボトルＢには３％（重 量／容量％）のプルロニックＦ−108、ボトルＣには３ ％（重量／容量％）のテトロニックＴ-908とした。得られた懸濁物を約150rpmで 計９日間粉砕し、粒子サイズを以下に詳細を記述するような様々の間隔で評価し た。 ^*ナトリウムジオクチルスルフォスクシネート（DOSS）を粉砕の1補助にこの 時点で0.2％（重量/容量％）加えた。 DOSSは曇り点修飾剤としてオートクレーブのためＦ-108およびＴ-908に添 加した（0.2重量/容量％）。 これらのデータは、Ｆ108およびＴ908中両者におけるこの試剤（すなわち、WI N 70146）による小粒子調製が予想を超えて容易であること、また、熱（オート クレーブ）および保存期間に対して優れた安定性を有することを示している。実施例１１ プルロニックＦ108中WIN 70146のナノ粒子懸濁物の調製および急性安全性試験 WIN 70146は実施例10におけるように調製し、マウスの尾静脈に３ml／kg、15m l／kgおよび30ml／kgの用量で注射した(すなわち、0.45gm／kg、2.25ml／kgおよ び4.5gm／kg)。動物を屠殺するまでの７日間、いずれの用量でもどのマウスにも 有害な作用は認められなかった。これらの動物の肉眼的観察でも、明らかな損傷 または形態異常は見られなかった。 さらにラットでの徹底した安全性試験においては、WIN 70146/F108の30ml／kg （4.5gm／kg）を含めそれまでのレベルの単回投与による重要な安全性の問題は 認められなかった。これらの試験には、詳細な組織病理学、臨床化学、および生 活観察を包含した。実施例１２ プルロニックＦ108中WIN 70146の調製（Ｉ-404） WIN 70146を直径1.1mmのジルコニウムシリケートビーズとともに無菌条件で３ 日間粉砕した。この試剤の濃度は、４％プルロニックＦ108の存在下に15％WIN 7 0146とした。その他の塩または界面活性剤は加えなかった。得られたナノ粒子懸 濁物の平均粒子サイズは光散乱により測定して162nmであった。実施例１３ プルロニックＦ108およびＰＥＧ400を用いたWIN 70146のオートクレーブ処理可 能な処方の調製 WIN 70146を直径1.1mmのジルコニウムシリケートビーズとともに、プルロニッ クＦ108の存在下に３日間粉砕した。最終粒子サイズは235nmと測定された。この 時点でこの懸濁物に滅菌ＰＥＧ400を完了時の処方が15％（重量／容量％）WIN 7 0146、３％（重量／容量％）プルロニックＦ−106および10％ＰＥＧ400となるよ うに加えた。この処方を次で標準条件下（すなわち、121℃、20分間）でオート クレーブ処理し、最終粒子サイズ248nmを得た。実施例１４ WIN 70146 のナノ粒子懸濁物による入射波長600nm以上の光散乱の測定 WIN 70146のナノ粒子懸濁物は、実施例10のように4.25％Ｆ−108／10％ＰＥＧ 400を用いて調製し、オートクレーブ処理後の粒子の平均直径は228nmとなった。 この懸濁物をついで以下に掲げる様々なレベルに水で希釈した。透過した入射光 の百分率を、ついで各懸濁液について数種の波長（下記参照）で測定した。懸濁 液をついでメタノールを加えて溶解し、相当の溶媒ブラン クに対する光の透過百分率を調べた。結果は以下に示す。 ナノ粒子WIN 70146および溶解したWIN 70146両者の632nm、700nmおよび820nmに おける透過百分率 ^*これらのサンプルは完全には溶解していないで、肉眼で白濁を示した。 これらの結果は、懸濁液がこれらの波長領域では入射光の有意な量が吸収され ない効率的な光散乱剤であることを示している（すなわち、溶解したWIN 70146 は600nm以上の光は吸収しない）。溶解した試剤についての吸収対波長の付加的 検査では、600〜800nmの光吸収の証拠は示さなかったが、ナノ粒子試剤では入射 光の散乱による古典的な吸収の減少を示す。実施例１５ WIN 70177 のナノ粒子懸濁液の調製 WIN 70177の組成物（実施例24に従い製造したヨード化Ｘ線造影剤）は15gmのW IN 70177／100mlの懸濁液および4.25gmのプルロニックＦ108／100mlの懸濁液お よび10gmのＰＥＧ400／100mlの懸濁液として調製した。懸濁液を５日間粉砕し、 平均粒子サイズは散乱光によって約235nmと測定された。新鮮なラット血漿およ びシミュレートした胃液中での安定性試験では全く凝集を示さなかった。実施例１６ ナノ粒子WIN 70177による入射波長600nm以上の光散乱の証明 WIN 70177のナノ粒子懸濁液を、実施例15のようにして調製し、オートク レーブ処理後の平均直径236nmの粒子を生じた。この懸濁液をっいで以下に掲げ る様々なレベルに水で希釈した。透過した入射光の百分率をついで各懸濁液につ いて数種の波長で測定した（下記参照）。ついで懸濁液をメタノールの添加によ り溶解し、相当の溶媒ブランクに対する光の透過百分率を調べた。結果は、以下 に示す。 ナノ粒子WIN 70177および溶解WIN 70177両者の632nmおよび700nmにおける透過百 分率 ^*これらは完全には溶解していない；粒子がまだ存在する。 これらのデータは、WIN 70177の粒子形態の散乱能力と、一方溶解した物質は 試験した波長の光にわたって何らエネルギーを吸収しないことを証明する。さら に粒子WIN 70177および溶解したWIN 70177による吸収の検査では、粒子WIN 7017 7は、懸濁した粒子による散乱に期待されるように波長とともに指数的低下を提 供するが、一方溶解物質は実際に５倍の濃度でも全く吸収を示さなかった。実施例１７ WIN 67722 のナノ粒子懸濁液の調製 WIN 67722の組成物（US-A-5322679に記載のヨード化Ｘ線造影剤）は３％プル ロニックＦ-108および15％ＰＥＧ1450を用い実施例１のようにして調製した。こ の懸濁液を３日間粉砕して、Coulter N4MD粒子サイザーで光散乱により測定して 粒子サイズ213nmが達成された（537nmにおける小分 画）。実施例１８ ナノ粒子WIN 67722によりる入射波長600nm以上 の光散乱の証明 WIN 67722のナノ粒子懸濁液を、３％プルロニックＦ-108および15％ＰＥＧ145 0を用いて実施例17のようにして調製し、オートクレーブ処理後の平均直径214nm の粒子を生じた。この懸濁液をついで以下に掲げる様々なレベルに水で希釈した 。透過した入射光の百分率をついで各懸濁液について数種の波長で測定した（下 記参照）。ついで懸濁液をメタノールの添加により溶解し、相当の溶媒ブランク に対する光の透過百分率を調べた。結果は以下に示す。 ナノ粒WIN 67722および溶解WIN 67227両者の632nmおよび700nmにおける透過百分 率 ^*完全には溶解していない；粒子がまだ存在する。 これらのデータは、WIN 67722の粒子形態の散乱能力と、一方、溶解した物質 は、試験した波長の光にわたって何らエネルギーを吸収しないことを証明する。 さらに粒子WIN 67722および溶解したWIN 67722による吸収の検査では、懸濁した 粒子による散乱に期待されるように波長とともに指数的低下を示すが、一方溶解 物質は実際に５倍の濃度でも全く吸収を示さなかった。実施例１９ WIN 72115 のナノ粒子の懸濁液の調製 ナノ粒子WIN 72115（以下の実施例21に記載の蛍光ヨード化造影剤）は、ガラ スジャー中、WIN 72115およびプルロニックＦ108（BASF，Parsippeny，NJ）を濃 度15gm／100ml懸濁液および３gm／100ml懸濁液で混合して調製した。ついでジャ ーの半分を直径1.0mmのジルコニウムシリケートビーズを充填し、上に記載の試 剤／界面活性剤の要求される濃度を達成するために十分な水を加えた。別法とし て界面活性剤はジャーに添加する前に水に溶解することもできる（0.2ミクロン のフィルターを通して滅菌ろ過してまたはしないで）。 ジャーはついで横にして、24時間未満または14時間以上、ジャー内のビーズが ジャーが回転するたびに、その壁に流れ落ちるのに十分な回転速度にて回転した （US-A-5145684）。粉砕サイクルの終了後、物質をジャーから取り出し、粉砕ビ ーズを分離した。 この方法で調製されたWIN 72115の粒子は光散乱により平均粒子サイズ225nmを 有した。WIN 72115はアルゴンイオンレーザー（緑、514nm付近）で入射励起し、 その値よりも高い波長の光を発光するように設計された。したがって、注射後、 患者の緑の光による照射は、診断の目的で使用できるわずかに異なる波長の光の 発光を刺激することになる。この試剤の鍵となる特徴はそれがナノ粒子として調 製され、脈管内に15分間以上保持され、光画像のために散乱および蛍光像を提供 することである。 WIN 72115の代わりに以下の実施例22の光標識剤を使用することができる。実施例２０ ポリマー粒子からの光散乱−粒子サイズおよび濃度に対する依存性 ポリスチレンラテックスポリマーの３種のサンプルを様々な程度に希釈し、数 種の異なる波長での透過に対するそれらの効果を検査した。結果は大きい粒子お よび高い濃度が入射光のより良好な散乱を生じることを確認するもの である。 実施例２１ ３−(Ｎ−アセチル−Ｎ−エチルアミノ)−５−[(５−ジメチルアミノ−１−ナフ チルスルホニル)アミノ]−2,4,6−トリヨード安息香酸エチルエステル（WIN 721 15） ピリジン（75ml）中、３−[(Ｎ−アセチル−Ｎ−エチルアミノ)−５−アミノ] −2,4,6−トリヨード安息香酸エチルエステル（11.6ｇ，18.５ミリモル）の撹拌 溶液を氷浴中で冷却し、これに60％NaH／油分散液（1.8ｇ，46.3ミリモル）を加 える。NaHのアミノ基との反応が終了したのち、ダンシルクロリド（５ｇ，18.8 ミリモル）を加える。得られた反応混合物を、氷浴中で４時間および室温で20時 間撹拌した。酢酸（10ml）で反応を停止させたのちに、褐色の溶液をロータリー エバポレーター上で濃縮した。褐色の残留物を最初にヘキサンで洗浄し、次に水 （200ml）中にスラリーとした。得られた汚い黄色ゴム状の固体を集め、水で洗 浄し、乾燥し、エタノールから再結晶すると明るい黄色の結晶5.3ｇ（33％）が 得られる。融点：238〜240℃，ms（FAB）862（90％，MH）であった。 元素分析：計算値（C₂₅H₂₆I₃N₃O₅Sとして）Ｃ 34.86；Ｈ 3.05；Ｎ 4.88； Ｉ 44.20、分析値Ｃ 34.91；Ｈ 3.02；Ｎ 4.74；Ｉ 44.53、¹NMRおよび¹³C-NMR スペクトルは以下の構造に一致する。 実施例２２ ２−(3,5−ビアセチルアミノ−2,4,6−トリヨードベンゾイルオキシ)エチルＮ− フルオレッセンチオカルバメート 3,5−(ビアセチルアミノ)−2,4,6−トリヨード安息香酸２−ヒドロキシエチル エステル(0.658ｇ，１ミリモル)、フルオレッセンイソチオシアナート（0.389ｇ ，１ミリモル）、60％NaH／油分散液（0.24ｇ，６ミリモル）およびＤＭＦ（25m l）を26時間室温で撹拌し、ついで６Ｎ HCl（2.5ml）により反応を停止させる。 得られた混合物をロータリーエバポレーターで減圧下に濃縮する。黄色の固体残 留物を水で洗浄し、ＤＭＦから再結晶すると生成物の黄色の結晶が65％の収率で 生成する。元素分析およびスペクトルデータは以下の構造に一致する。 実施例２３ 安息香酸3,5−ビス(アセチルアミノ)−2,4,6−トリヨード−１−(エトキシカル ボニル)ペンチルエステル（WIN 70146） 乾燥ＤＭＦ（1200ml）中ナトリウムジアトリゾエート（150ｇ，235.2ミリモ ル）の溶液を室温で撹拌しながら、これに２−ブロモヘキサン酸エチルエステル （63.8ｇ，285.8ミリモル，1.09当量）を加えた。この溶液を一夜90℃で加熱し 、ついで60℃に冷却した。反応混合物をついで撹拌しながら20リットルの水中に 注いだ。得られた白色の沈殿をろ過して集め、90℃、高真空下に乾燥した。粗生 成物をＤＭＦ／水から再結晶すると、乾燥後分析的に純粋な生成物が得られた。 融点：263〜265℃。ＭＳおよび¹H-NMR（300MHz）スペクトルデータは所望の構造 と一致した。 C₁₉H₂₃I₃N₂O₆として： 計算値：Ｃ 30.15，Ｈ 3.04，Ｎ 3.70，Ｉ 50.35 分析値：Ｃ 30.22，Ｈ 3.00，Ｎ 3.66，Ｉ 50.19実施例２４ プロパンジオン酸［[3,5−ビス(アセチルアミノ)−2,4,6−トリヨードベンゾイ ル]オキシ］メチル−ビス（１−メチルエチル）エステル（WIN 70177） 500mlのＤＭＳＯ中ナトリウムジアトリゾエート（393ｇ，616ミリモル）の混 合物を室温で撹拌しながら、これに２−ブロモ−２−メチルマロン酸ジイソプロ ピルエステル173ｇ（616ミリモル）を加え、この溶液をアルゴン雰囲気下、90〜 100℃で56時間加熱した。冷却したのち、この溶液を10リットルの水に機械的に 上から撹拌して加えた。沈殿した固体を６時間沈降させ、ついでろ過して集めた 。粗生成物を水（４リットル）で十分に洗浄し、室温で一夜乾燥させた。固体を 重炭酸カリウム（15mlのイソプロパノールを含有する水700ml中３ｇ）の溶液、 水で処理して、12時間風乾した。ＤＭＦから再結晶し、ついで水で洗浄し、高真 空下に乾燥すると分析的に純粋な生成物255ｇ（51％）が得られた。融点：258〜 260℃。ＭＳおよび¹H-NMR（300MHz）スペクトルデータは所望構造と一致した。 C₂₁H₂₅I₃N₂O₈として 計算値：Ｃ 30.98，Ｈ 3.10，Ｎ 3.44，Ｉ 46.76 分析値：Ｃ 30.96，Ｈ 3.00，Ｎ 3.44，Ｉ 46.77実施例２５ インビボ光画像試験 Ａ．粒子状散乱剤 40％（重量／容量％）ヨードディキサノール溶液中において形成させた薄層状 リポソームの懸濁液を、予めヘパトーマ９Ｌ腫瘍をその後側部に移植した白色ラ ットに注射した。注射は780nmでタイムゲートダイオードレーザー入射光を用い 、光ファイバーケーブルとペンシルヴェニア大学のBritton Chance博士の実験 室の相感受性検出装置を用いて入射光に対して180度の散乱成分を検出して画像 処理した。リポソーム粒子は投与用量（すなわち、３ml／kg）で、腫瘍における 散乱をバックグランドシグナルの４×以上まで増強した。至適化はしなかったが 、これらのデータは光画像処理のために散乱剤による造影化が可能であることを 示す。 Ｂ．光画像処理のための蛍光粒子 リポソームの懸濁液を0.7μg／mlのインドシアニングリーン（ICG）の存在下 に調製し、蒸気および圧力を用いて滅菌した。得られた粒子はHoriba 910粒子サ イジング装置を用いて光散乱により測定して約120nmの平均直径を有した。ラッ ト後側部の腫瘍モデルへの注射では、これらのリポソームは、ＩＣＧ単独の均一 な溶液で観察されたよりも有意に長い腫瘍への蛍光剤（すなわち、そのICG）の 滞留時間を与えた。これはシグナル平均化技術が画像の増強および漏れやすい血 管の部位をマークするために適用できる場合の画像処理に有用である。これらの 試験は、ペンシルバニア大学のBritton Chance博士の実験室でも実施された。実施例２６ 皮膚における血流のレーザードップラー測定の増強のためのコントラストメジウ ムの使用 測定を行う約0.5〜１時間前に、５〜20mgの染料（たとえば、3,3'−ジエチル チアトリカルボシアニンヨージド）の懸濁粒子を含有する、吸収最大600〜1300n mの滅菌水性懸濁液を静脈注射により投与する。平均粒子サイズは好ましくは約8 00nmであり、懸濁メジウムとしては生理的食塩水が好ましい。 血流の測定は血液中の造影剤粒子の濃度が安定したのちに行う。測定は標準レ ーザードップラー装置、たとえばLisca Development AB，Kinkoping，Swedenの 装置を用いて行なう。所望により830〜780nmで操作するレーザー光源を導入して 変更して行なうこともできる（Abottら，J.Invest.Dermatol.107:882-886，1996 参照）。実施例２７ 皮膚を通る血流の共焦点顕微鏡による測定の増強のためのコントラストメジウム の使用 測定を行う約0.5〜１時間前に、５〜20mgの染料（たとえば、3,3'-ジエチルチ アトリカルボシアニンヨージド）を含有する滅菌水性懸濁液、吸収最大600〜130 0nmを静脈注射により投与する。平均粒子サイズは約800nmであることが好ましく 、懸濁メジウムとしては生理食塩水が好ましい。 血流の測定は粒子が共焦点顕微鏡で毛細管を通じて移動したのちに行った。実施例２８ ＣＴＰ−10注射の調製 溶液Ａは、注射用水（WFI）12リットルにソルビトール216ｇおよびヨーディキ サノール5084.4ｇを約90℃で連続的に撹拌しながら溶解して調製した。冷却した 溶液を0.2μmの滅菌フィルターを通してろ過した。 溶液Ｂは、約200mlのＷＦＩにＴＲＩＳ 121ｇおよびエデト酸ナトリウムカル シウム（89％）を40℃で溶解して調製した。pHを５Ｍ塩酸で7.2〜7.4に調整し、 水を加えて500mlにした。冷却した溶液を0.2μmの滅菌フィルター を通してろ過した。 水素化卵ホスファチジルコリンおよび水素化ホスファチジルセリンナトリウム を比10：１で含有するリン脂質混合物604.8ｇを８リットルの溶液Ａに80℃で加 え、ついでこの分散液を20分間撹拌し、ついでホモジネーターでホモジネートし た。分散液をポリカーボネートフィルター（７×１μm）を通して押し出し（80 ℃で）、リポソームの濃縮懸濁液を製造した。 リポソーム濃縮物を集め、溶液Ａと４：１の比率で混合した。溶液Ｂをついで ＴＲＩＳの最終濃度が１mg／mlになるように加えた。 400mg／mlのヨーディキサノール、17mg／mlのソルビトール、56.3mg／mlのリ ン脂質混合物(PC:PS＝10:１)、１mg／mlのＴＲＩＳ、0.1mg／mlのエデト酸ナト リウムカルシウム、ｐＨ調整用塩酸およびＷＦＩを含有した。 リポソームの粒子サイズの分布は259〜1900nmの範囲であり、最大は736±216n mであった。１mlあたりヨウ素約80mgが封入された。ＣＴＰ−10で増強された共焦点顕微鏡によるラット耳の血流の画像処理 画像処理装置は光医学のWellman実験室におけるインビボ共焦点顕微鏡であり 、麻酔した400ｇのアルビノラットの耳に貼付した0.9口径を通して、波長1064nm で操作した。口径は角層からの散乱を低下させるために水で覆った。造影剤の注 射前に、単一毛細管からの血流を画像領域を横切る走査および視野の深さを変動 させて検出した。 造影剤（0.175ml）は皮膚の切開により暴露された大腿静脈から低出力顕微鏡 下に注射した。画像処理は５分以内に再び開始した。前に検出したと同じ血管を 再び検出したが、それに加えてさらに多くの血管が可視化され、一部は150μmの 深さまで可視化された。25分後も、血管は依然として明瞭であった。45分後には 、血管はまだ見えたが、強度は低下した。 静的写真上では、血管は組織の他の特徴と類似する。動画では、血管は毛細管 内の血漿および細胞の明らかな動きによって、周囲の組織からは識別される。 図１は、大腿静脈に、上述のようなＣＴＰ-10処方0.175mlを注射したのち、ア ルビノラットの耳から共焦点顕微鏡で記録した４つの画像を示す。動的な共焦点 画像では、血流は矢印で指示した経路に注射後45分まで可視化された。造影剤な しでは、血流は数個の単離された経路で可視化されたのみであった（示していな い）。Intralipid で増強された共焦点顕微鏡によるラット耳における血流の画像処理 Intralipidは卵ホスファチジルコリンおよびグリセリンの市販のエマルジョン である。用いた製品中の平均粒子サイズは310nmであった。 Intralipidの注射後の画像処理は、アルビノラットがＣＴＰ−10を注射された のち、２時間および45分に行った。共焦点画像における毛細管はこの場合も希薄 で発見が困難であった。0.45mlの内部脂質の注射は、45分後に行い、画像処理は ３分以内に開始した。この場合にも毛細管は血液中における造影剤の存在の結果 として容易に明らかになった。 大きなきわめて顕著な血管が181μmの深さに見いだされた。これをそれが薄れ る10分間の間モニターした。注射後18分には、他の静的なバックグランド画像で 流れている物質のぼんやりとした領域のようにバックグランド上にほとんど見分 けることができなかった。実施例２９ 共焦点顕微鏡の造影剤として気体充填気泡の使用 画像装置はインビボ共焦点顕微鏡であり、麻酔したアルビノラットの耳に貼付 した0.9口径を通して、波長1064nmで操作した。 造影剤は超音波画像の造影剤として使用するために市販されているのと類似の 気体充填気泡の懸濁液である。粒子サイズは２〜４ミクロンである。気泡は滅菌 水に10mg／mlの濃度で再懸濁して、使用前に３時間300回転／分の速度で撹拌し た。溶液は皮膚切開によって暴露した大腿静脈に、画像処理の前に50μl／kg体 重の用量で注射した。毛細管を通る血流は、注射後は液体 の明るい流れとして見える。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９７２７１２４．１ (32)優先日 平成９年12月22日(1997．12．22) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０９／０３５，２８５ (32)優先日 平成10年３月５日(1998．3．5) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヘンリクス，ポール・マーク アメリカ合衆国ペンシルベニア州 19087 ―8630．ウェイン．デヴォンパークドライ ブ466．ニュコメド・アマーシャム・イメ ージング・エイ・エス (72)発明者 ベイコン，エドワード アメリカ合衆国ペンシルベニア州 19087 ―8630．ウェイン．デヴォンパークドライ ブ466．ニュコメド・アマーシャム・イメ ージング (72)発明者 デサーイ，ヴィナイ・チャンドラカント アメリカ合衆国ペンシルベニア州 19087 ―8630．ウェイン．デヴォンパークドライ ブ466．ニュコメド・アマーシャム・イメ ージング (72)発明者 マッキンタイアー・グレゴリー・リン アメリカ合衆国ペンシルベニア州 19087 ―8630．ウェイン．デヴォンパークドライ ブ466．ニュコメド・アマーシャム・イメ ージング

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトまたは非ヒト動物生体の画像を光画像処理によって発生させる方法にお いて、生理学的に耐容性のある造影剤を生体に投与して上記生体の少なくとも一 部の画像を発生させ、上記画像は光学顕微鏡技術によって得られることを特徴と する方法。 ２．上記造影剤は生理学的に耐容性のある粒子状造影剤である請求項１記載の方 法。 ３．上記粒子状造影剤の粒子は、平均粒子サイズ範囲５〜10000nmを有する請求 項２記載の方法。 ４．上記粒子状造影剤の粒子は、平均粒子サイズ範囲10〜1000nmを有する請求項 ２記載の方法。 ５．上記粒子状造影剤の粒子は平均粒子サイズ範囲10〜500nmを有する請求項２ 記載の方法。 ６．上記粒子の粒子サイズの変動係数は、10％未満である請求項３記載の方法。 ７．画像はサブ表面顕微鏡技術によって提供されるサブ表面領域のものである請 求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ８．上記画像は共焦点走査レーザー顕微鏡、光学的干渉断層撮影技術、多重光量 子顕微鏡およびレーザードップラーおよびスペックル技術から選択される光画像 技術により発生させる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ９．上記生体は波長範囲300〜1300nmの光で照射し、上記画像は波長範囲300〜13 00nmの検出散乱光を用いて発生させる請求項８記載の方法。 10．上記画像は、暴露されたまたは内視鏡でアクセスされた表面の下部１mm未満 の上記生体の一部の画像である請求項８記載の方法。 11．上記画像は皮膚の一部の画像である請求項１０記載の方法。 12．上記画像は外科的に暴露された表面の下部１mm未満の上記生体の一部の画像 である請求項１０記載の方法。 13．上記粒子はポリマー粒子、染料粒子、およびヨード化有機化合物粒子から選 択される請求項３記載の方法。 14．上記画像は空間的画像である請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。 15．上記画像は一時的画像である請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。 16．上記画像は上記生体の少なくとも一部を通って透過した光から発生される請 求項１〜１５のいずれかに記載の方法。 17．上記画像は上記生体の少なくとも一部から反射した光から発生される請求項 １〜１６のいずれかに記載の方法。 18．上記画像は上記試剤により発光する蛍光から発生される請求項１〜１７のい ずれかに記載の方法。 19．上記画像は上記試剤により発光するリン光から発生される請求項１〜１８の いずれかに記載の方法。 20．上記画像は上記生体中の脈管の画像である請求項１〜１９のいずれかに記載 の方法。 21．上記画像は上記生体中の脈管内の血流の画像である請求項１〜２０のいずれ かに記載の方法。 22．上記画像は上記生体内の貪食性臓器の画像である請求項１〜２１のいずれか に記載の方法。 23．光は内視鏡により発光され、検出される請求項１〜２２のいずれかに記載の 方法。 24．上記生体は単色性の光によって照射される請求項１〜２３のいずれかに記載 の方法。 25．上記粒子状試剤は光標識されていない請求項１〜１７および請求項２０〜２ ５のいずれかに記載の方法。 26．上記試剤は気体微小気泡からなる請求項２５記載の方法。 27．上記試剤は固体または液体の粒子からなる請求項２５記載の方法。 28．上記試剤はリポソームからなる請求項２５記載の方法。 29．上記粒子状試剤は、少なくとも10⁵cm^-1M^-1のモル吸収率および300〜1300nm の範囲の吸収最大を有する光標識からなる請求項１〜２４のいずれかに記載の方 法。 30．上記粒子状試剤はリポソームからなる請求項２９記載の方法。 31．上記粒子状試剤は固体または液体の粒子からなる請求項２９記載の方法。 32．上記粒子状試剤は上記光標識で被覆された固体粒子からなる請求項２９記載 の方法。 33．上記粒子状試剤はミセルからなる請求項２９記載の方法。 34．インビボ診断光学顕微鏡に使用するためのコントラストメジウムを含有する 造影剤の製造における生理学的に耐容性のある物質の使用。 35．インビボ診断光学顕微鏡に使用するためのコントラストメジウムを含有する 粒子状造影剤の製造における生理学的に耐容性のある粒子状物質の使用。 36．請求項１〜３３のいずれかに記載の方法からなる画像処理操作におけるコン トラストメジウムの製造のための請求項３４および３５のいずれかに記載の使用 。 37．疾患状態の診断のためのインビボ光顕微鏡における請求項１〜３３のいずれ かに定義された試剤の使用。