JP2001525176A - Ｃｄ７＋ｃｄ３４−ｌｉｎ−造血細胞を単離し、使用する方法 - Google Patents

Ｃｄ７＋ｃｄ３４−ｌｉｎ−造血細胞を単離し、使用する方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 【解決手段】本発明は、造血幹細胞、並びに、該細胞を用いて遺伝的疾病及び疾患、感染性疾病を含む疾病及び疾患を治療する方法に関する。さらに、本発明は、幹細胞の増殖、移植、又は分化を同定する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、造血幹細胞、並びに、該細胞を用いて、遺伝病及び遺伝疾患、感染
性疾病を含む疾病（ｄｉｓｅａｓｅ）及び疾患（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を治療する
方法に関する。本発明は、さらに、幹細胞の増殖、移植（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎ
ｔ）、又は分化を促進する因子（ａｇｅｎｔ)を同定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子治療及び移植の目的で、造血幹細胞（ＨＳＣ；ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔ
ｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を単離し、これを取り扱えることは、近年、大きな
興味を引いている（Ｅｍｅｒｓｏｎ， Ｂｌｏｏｄ８７：３０８２（１９９６）
；Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｂｌｏｏｄ７８：２４８１（１９９１））。機能的には
、最も始源的な造血幹細胞は、自己新生（ｓｅｌｆ ｒｅｎｅｗａｌ）に対する
広範な可能性を有しており、全ての血液細胞系統（ｌｉｎｅａｇｅ）を作り出す
ことができる。しかしながら、現在では、最も始源的(ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ)なヒ
トの造血幹細胞の表現型は、未だ明らかではない。自己新生に対する広範な可能
性を秘め、多系統成長(ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ)を
する始源的なヒトの造血始源細胞は、インビトロアッセイとキメラ動物モデルの
両者を用いて、多くのグループによって特性決定されてきた。これらの研究は、
最も始源的なヒトのＨＳＣの多くは、ＣＤ３４表面マーカー（ＣＤ３４＋）を発
現し、明白な系統分化決定（ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）マーカー
（Ｌｉｎ−）を欠き、低乃至は検出不能なレベルの、ＣＤ３８、ＣＤ７１、ＣＤ
４５ＲＡ、及びＴｈｙ−１を含む他の細胞表面マーカーを発現する（Ｔｅｒｓｔ
ａｙｐｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ７７：１２１８（１９９１）；Ｌａｎｄｓ
ｄｏｒｐ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７８：７８７（１９９３）；
Ｃｉｃｕｔｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １０：１２
７（１９９４）；Ｄｅ Ｂｒｕｙｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １
３：２８１（１９９５）；Ｄｉ Ｇｉｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ８４
：４２１（１９９４）；Ｈａｏ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ８６：３７４（１９
９５）；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ８３：１５１５（１９９４）；Ｍ
ｕｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ８３：３１７０（１９９４）；Ｒｕｓｔ
ｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ８４：１４７３（１９９４））。この証拠にか
かわらず、現在まで、最も始源的なヒトの造血幹細胞の表現型を正式に決定する
ためのヒトの移植研究は、全くなかった。
【０００３】 最近、、低乃至は検出不能な量のＣＤ３４（ＣＤ３４ｌｏ−細胞）を発現し、
それらの移植後に、リンパ球及び骨髄球系統（ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ
）を持続的に産生し得る始源的なＨＳＣの集団があることが、長期のマウス骨髄
移植モデルを用いた三つの研究によって示された。Ｏｓａｗａら（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２７３：２４２（１９９６））は、単一のＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔ＋ Ｌｙ６Ａ
／Ｓｃａ−１＋ＣＤ３４ｌｏ／−細胞は、レシピエントのマウスに長期の造血再
構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）をもたらし得ることを実証した。Ｊｏｎ
ｅｓら（Ｂｌｏｏｄ ８８：４８７（１９９６））は、移植後に、リンパ球及び
骨髄球系統を持続的に産生し得るアルデヒド脱水素酵素を高レベルで発現した小
さなＬｉｎ−ＣＤ３４ｌｏ／−ＡＡ４．１−細胞の集団を同定した。Ｍｏｒｅｌ
ら（Ｂｌｏｏｄ ８８：６２９ａ（１９９６））は、Ｌｉｎ−ｔｈｙ−１ｌｏ
Ｌｙ６Ａ／Ｓｃａ−１＋ ＣＤ３４ｌｏ／−細胞は、長期間再集合する（ｒｅｐ
ｏｐｕｌａｔｉｎｇ）ＨＳＣを高い割合で含有することを実証した（Ｂｌｏｏｄ
８８：６２９ａ（１９９６））。
【０００４】 本発明は、少なくとも部分的には、ヒトＣＤ３４−ＨＳＣが存在しており、Ｃ
Ｄ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞とデザインされた、これらの細胞は、始源的多能
性細胞と一致する特性を保持しているという知見に基づいている。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞と表記される造血幹細胞に関する
。本発明は、さらに、このような細胞を用いて、疾病及び疾患を治療する方法に
関する。本発明の細胞を用いて治療され得る疾病の例には、遺伝性疾病と感染性
疾病の両者が含まれる。本発明は、幹細胞の増殖及び移植並びにこのような細胞
の分化を促進するために、使用され得る因子を同定する方法にも関する。
【０００６】 本発明の目的及び利点は、以下の記載から明らかになるであろう。
【０００７】 本発明は、造血幹細胞、及び該細胞を単離する方法に関する。ＣＤ７＋ＣＤ３
４−Ｌｉｎ−幹細胞と表記される、これらの細胞は、それらのＣＤ７発現、ＣＤ
３４発現の欠如によって定義される。ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞は、始源
的多能性細胞の特性を有する。このような細胞は、有利には、ヒトの細胞である
。
【０００８】 本発明には、例えば、標準的なフローサイトメトリー手法によって決定したと
きに、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞が、約８０％、好ましくは約９０％（又
は９５％）よりも多い細胞集団が含まれる。均質なＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ− 細胞集団がより好ましい。臍帯血からのＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞の単離
をここで具体的に例示する。骨髄、抹消血、及び胎児の肝臓を含む他の採取源か
らのこのような細胞の単離も想定される。ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞は、
以下の例に示されているものを含む様々な手法を用いてこのような採取源から単
離できる。例えば、三段階の単離操作を使用することができる。第一の工程では
、例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されているキ
ットを用いて、例えば、特異的な系統分化決定に付随する９つの異なる表面抗原
の何れかを発現する成熟単核細胞を除去することができる。Ｌｉｎ−と表記され
る得られた調製物は、以下の表面抗原：グリコフォリンＡ（ｇｌｙＡ）、ＣＤ３
、ＣＤ２、ＣＤ５６、ＣＤ２４、ＣＤ１９、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１４、及びＣＤ１
６の何れかを発現する細胞を実質的に欠いている。第二の工程では、Ｌｉｎ−細
胞のサブセットは、例えば、ヘキスト３３３４２色素を用いた染色後のフローサ
イトメトリーによって単離され得る。ソーティングされた細胞は、Ｌｉｎ−細胞
の調製物の約１％を占め、Ｌｉｎ−ＳＰと称される。この調製物は、相互に排他
的な二つの細胞集団：一つは、ＣＤ７＋ＣＤ３４−、もう一つはＣＤ７＋ＣＤ３
４＋からなる。第三の工程では、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞を得るために
、ＣＤ３４＋細胞は、例えば、フローサイトメトリーを用いてＬｉｎ−ＳＰ画分
から除去できる。
【０００９】 別の単離操作には、単一のネガティブ除去ステップの使用も含む。操作に従え
ば、ＣＤ３４及びＬｉｎ系統マーカーを発現する細胞は、適切な抗体（すなわち
、上記ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓキット中に存在するもの、
及びＣＤ３４特異的な抗体）を用いて単一ステップで除去される。あるいは、例
えば、ＦＡＣＳ又は免疫吸収剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂａｎｔ）を用いた後
、上述したように、ＣＤ３４＋及びＬｉｎ＋細胞のサブ集団を除去することによ
って、まず、ＣＤ７＋細胞をポジティブに選択してもよい。
【００１０】 用いた単離操作に関わらず，得られたＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞は、始
源的な造血幹細胞の特性を有する。第一に、それらは、未成熟及び成熟リンパ球
、赤血球、又は骨髄球細胞に対する細胞表面マーカーを含む系統分化決定マーカ
ーを欠如する。より具体的には、それらには、蛍光をコンジュゲートした抗体（
例４参照）を用いて検出できる骨髄球細胞（ＣＤ３３）、Ｂリンパ球（ＣＤ１９
、ＨＬＡ−ＤＲ）、Ｔリンパ球（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）、ＮＫ細胞（ＣＤ１
６、ＣＤ５６）、又は赤血球細胞（ＣＤ７１）の表面マーカーの発現が全く検出
されない。ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞には、初期リンパ球マーカーＣＤ１
０、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、又はＣＤ５の発現も検出されない。有利には、本発明の
ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞には、以下の抗原：ＣＤ３４、ＣＤ７１、ＣＤ
３８、ＣＤ３３、ＣＤ１４、ＣＤ１３、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ５、
ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ２５、ＣＤ１０、ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ、ＣＤ４１、ｇｌｙＡ、ＣＤ１３０、又はＣＤ１２４の何れの発現も検出され
ない（本発明の細胞では、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ１１ｂの発現が検出できる）。
第二に、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞は、マウスに長期の造血を持続させ得
る細胞と同じように（Ｇｏｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８
３：１７９７（１９９６））、ヘキスト３３３４２色素で染色される。第三に、
ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞は、始源造血細胞の特性であると考えられてい
る細胞周期の状態である（Ｓｐａｎｇｒｕｄe ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：７４３３（１９９０））、Ｇ０にある。第
四に、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞の免疫表現型は、Ｋｕｒｔｚｂｅｒｇら
によって記載された多能性白血病のそれと類似している（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．
１６２：１５６１（１９８５）；Ｂｌｏｏｄ７３：３８１（１９８９））。具体
的には、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞は、ＣＤ７１−、Ｔｈｙ−１−、及び
ＨＬＡ−ＤＲ−であり、それらが、赤血球（ＣＤ７１）、Ｔ細胞（Ｔｈｙ−１）
、又はＢ細胞（ＨＬＡ−ＤＲ）系統に分化決定されていないことを示している（
例５参照）。第五に、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞は、分化決定された骨髄
球、赤血球、及びＴリンパ球始源細胞の増殖を容易に支えるインビトロ培養アッ
セイにおいて、短期又は長期何れの増殖もなし得ない（例６参照）。しかしなが
ら、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞は、何ヶ月も培養状態を持続し、それらの
増殖を支えるシステムが確定され、例８に記載されている。
【００１１】 本発明のＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞は、様々な治療及び診断療法に適用
される。細胞は、始源的造血幹細胞なので、それらは、移植と遺伝子治療目的の
両者に適している。例えば、癌患者の骨髄又は抹消血からのＣＤ７＋ＣＤ３４− Ｌｉｎ−細胞の単離は、癌細胞からの幹細胞の分離に備えることができる。自己
移植を行っている患者では、このような分離は、癌細胞が患者に戻される可能性
を減らすために、使用することができる。精製された自己ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌ
ｉｎ−細胞は、自己移植後の好中球、赤血球、及び血小板移植を早めるために、
エクソビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）に拡張し得る。エクソビボ拡張（ｅｘｐａｎｓｉ
ｏｎ）は、所定のサイトカイン中で、ストロマ層上で、及び／又はバイオリアク
ター中での増殖によって実施され得る（Ｅｍｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏ
ｄ８７：３０８２（１９９６））。さらに、移植の失敗の発生を減らすこともで
きる。これは、自己移植を行っている癌患者、自己免疫疾患に罹患している患者
、及び遺伝子治療を行っている患者にとって有益である。
【００１２】 本発明の細胞を伴う遺伝子治療アプローチは、ある態様では、自己ＣＤ７＋Ｃ
Ｄ３４−Ｌｉｎ−細胞の単離、単離された細胞の遺伝子搬送ベクターへの暴露、
及び被修飾細胞の患者への再注入を含む（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅ
ｒ．１：１５５（１９９２））。このアプローチは、、エクソビボでの培養、又
は分裂していない細胞へ遺伝子を導入できるベクターの使用を含み、それによっ
て、エクソビボ培養が不必要になる。遺伝子治療は、例えば、鎌形赤血球貧血症
のような先天性疾病を治療するのに有用であり得、この場合には、変異βグロビ
ン遺伝子が、野生型グロビン遺伝子、又は抗鎌形グロビン遺伝子の何れかで置換
又は補充されている。癌の治療では、薬物耐性遺伝子は、細胞毒性のある薬物に
対する耐性を与えるために、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞に導入され得る。
これは、骨髄抑制の発生及び重度を軽減し得る。ＨＩＶを含む感染性疾病の治療
の場合、ウイルスに対して抵抗性を示すように、抗ウイルス遺伝子がＣＤ７＋Ｃ
Ｄ３４−Ｌｉｎ−細胞に導入され得る（Ｇｉｌｂｏａ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔ
ｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０：１３９（１９９４））。
【００１３】 ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞の単離は、ＧｖＨＤを引き起こすＴ細胞の除
去をもたらす。この除去は、同種異系移植のレシピエントにおけるＧｖＨＤの発
生及び重度を軽減すると予測できる。
【００１４】 同種異系移植後の好中球、赤血球、及び血小板移植を早めるために、精製され
たＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞は、エクソビボ拡張することができる。さら
に、移植の失敗の発生を減らすことができる。これは、特に、少ない細胞用量が
、移植の成功を制限する臍帯血移植のレシピエントにとって特に重要と思われる
。
【００１５】 ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞による移植が成功すれば、寛容を誘導するこ
とも予測できる。このようなことは、明らかに、確実な臓器移植を増大させるで
あろう。
【００１６】 本発明の細胞は、増殖及び発育において重要な遺伝子を含む、新規遺伝子（例
えば、サイトカイン及びサイトカイン受容体の）の採取源として使用できること
が理解できよう。
【００１７】 治療及び診断戦略におけるそれらの応用に加えて、本発明のＣＤ７＋ＣＤ３４ − Ｌｉｎ−細胞は、例えば、造血細胞の分化、又は増殖、及び／又は移植を促進
するために使用され得る因子を同定するためのスクリーニングプロトコールにお
いてしようされ得る。このようなプロトコールの一つでは、ＣＤ７＋ＣＤ３４− Ｌｉｎ−細胞は、分化を誘導すると思われる試験化合物と接触され、該試験化合
物が、（例えば、顕微鏡、及びフローメトリー検査を用いて）分化を起こす能力
を決定する。別のスクリーニングプロトコールでは、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ − 細胞は、増殖及び／又は移植を誘導すると思われる試験化合物と接触され、イ
ンビトロ長期コロニーアッセイ、又はインビボ免疫不全マウスモデル（例えば、
ＳＣＩＤ ＮＯＤマウス）を用いて、前記試験化合物が、増殖及び／又は移植を
起こす能力を決定する（Ｐｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ７：ｓ
９８−１０１（１９９３）参照）。
【００１８】 本発明は、本発明のＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞を調製するために使用さ
れ得るキットにも関する。該キットは、細胞を直接単離するために使用され得る
抗体を備え得る。好ましい態様では、キットは、一以上の容器手段の内部に配置
された、少なくとも、以下の抗原：ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ
３４、ＣＤ３８、及びＣＤ２５に対して特異的な抗体を含む。これらの抗体は、
例えば、約８０％の精製又はそれを上回る精製を達成するために、ＳｔｅｍＣｅ
ｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのキットに存在するものと共に使用することが
できる。有利には、キットは、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ７１に対して特異的な抗体
も含む。ＣＤ１４、ＣＤ１３、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ８
、ＣＤ３、ＣＤ１０、ｇｌｙＡ、ＣＤ１３０、及びＣＤ１２４に特異的な抗体で
あって、少なくとも一つの容器手段の内部に配置された抗体の何れか、又は全て
も含まれ得る。キットは、容器手段の内部に配置された抗ＣＤ７抗体も含み得る
。
【００１９】 キットの抗体は、容器手段の内部に配置され、キットは、さらに、単離プロト
コールを実施するのに適切な補助試薬（例えば、緩衝液など）を含み得る。
【００２０】 本発明のある種の側面は、以下の非限定的な例において、さらに詳しく記載さ
れている。
【００２１】 例 以下の実験の詳細は、その後の実施例のいくつかにおいて参照される。 抗体試薬：全ての細胞表面抗原の分析で、直接コンジュゲートされた蛍光抗体を
利用した。使用した抗体には、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＤＩＳ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）からの、ＣＤ２（Ｌｅｕ５；ＦＩＴＣ）、ＣＤ３（Ｌｅｕ４；
ＰｅｒＣＰ）、ＣＤ５（Ｌｅｕ１；ＰＥ）、ＣＤ７（Ｌｅｕ９；ＦＩＴＣ）、Ｃ
Ｄ１０（ＣＡＬＬＡ；ＦＩＴＣ）、ＣＤ１１ｂ（Ｌｅｕｌ５；ＰＥ）、ＣＤ１９
（Ｌｅｕｌ２；ＦＩＴＣ）、ＣＤ３３（ＬｅｕＭ９；ＰＥ）、ＣＤ３４（ＨＰＣ
Ａ２；ＦＩＴＣ及びＰＥ）、ＣＤ３８（Ｌｅｕｌ７；ＰＥ）、ＣＤ５６（Ｌｅｕ
ｌ９；ＰＥ）、及びＨＬＡ−ＤＲ（ＦＩＴＣ）に対して誘導された抗体が含まれ
た。抗ＣＤ−７（３Ａ１；ＰＥ）、及び抗ＣＤ４５（ＫＣ５６；ＰＥ）は、Ｃｏ
ｕｌｔｅｒ社（Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）から購入した；抗ＣＤ１６（３Ｇ８；Ｐ
Ｅ）とプールされた抗ＣＤ３４抗体（ＱＢＥｎｄ１０、Ｉｍｍｕ−１３３、Ｉｍ
ｍｕ−１３４；ＰＥ）は、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ
）から；抗ＣＤ３（ＢＢｌｌ；ＦＩＴＣ）とＣＤ３８（Ｂ−Ａ６；ＦＩＴＣ）は
、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、Ｃ
Ａ）；抗ＣＤ４５ＲＡ（Ｆ８−１１−１３；ＰＥ）は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａ
Ｌ）から；抗ＣＤｗ９０（５Ｅ１０；ＰＥ）は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社（Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。 マウス骨髄の単離 Ｃ５７Ｂ１／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）の大腿骨から骨髄を抽出し、
１８ゲージの注射針に骨髄を通すことによって、ダルベッコの改変イーグル培地
（ＤＭＥＭ）の中に、単一細胞の懸濁液を調製した。該細胞懸濁液をナローゲー
ジのワイヤーメッシュに通してろ過することにより、破片を除去した。続いて、
細胞を洗浄し、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７．４を補充したＤＭＥＭ中に１０６細胞／ｍＬで洗浄し、再懸濁した。９０分
、３７℃で、マウスの細胞を５ｍｇ／ｍＬのヘキスト３３３４２（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で標識した。いくつかの実験で
は、ヘキストでの染色中に、５０ｍＭの最終濃度で、ベラパミル（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）を
添加した。 細胞の単離及び系統除去 デューク大学医療センターの分娩及び出産病棟のスタ
ッフによって、抗凝固剤であるクエン酸緩衝液を含有する滅菌した瓶の中に、処
分が予定されていたヒトの臍帯血（ＵＣＢ）を集めた。これらの研究で使用した
ＵＣＢは、採集されている１８時間のうちに、処理された。ＵＣＢは、ダルベッ
コのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１：２に希釈し、赤血球は、最終濃度
１％になるように、Ｈｅｓｐａｎ（ＤｕＰｏｎｔ Ｐｈａｒｍａ，Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ，ＤＥ）を用いて、室温で凝集された。凝集しなかった白血球を採取し
、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、及び２００ｍＭ ＥＤＴＡを含有
する０．１７Ｍ ＮＨ４Ｃｌ中、３７℃で、残存した赤血球を溶血させた。系統
分化決定された細胞を除去するために、ＵＣＢの白血球分画を、ＰＢＳ／２％
ＦＣＳ中６−８×１０７細胞／ｍＬにして、キットの説明書に従って、ＣＤ３４ ＋ ＳｔｅｍＳｅｐ濃縮カクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を用いて除去した。回収された細胞は
、Ｌｉｎ−細胞と名付けられた。Ｌｉｎ−ＵＣＢ細胞は、１０％ＦＣＳ入りのＤ
ＭＥＭで洗浄し、蛍光活性化セルソーターに使用するまで、ＤＥＭ／１０％ＦＣ
Ｓ中において氷上に保存した。一晩保存するときには、細胞は、４℃低温室中で
、氷上に放置した。 ヘキストを用いた細胞の染色及び蛍光活性化セルソーティング ＤＭＥＭ／２％
ＦＣＳ／１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４（染色培地）中、１０６細胞／ｍＬ
で、除去されていない細胞又はＬｉｎ−ＵＣＢ細胞を再懸濁し、３７℃で３０分
間プレインキュベートした。次に、同じ培地の中で９０分間、２．５ｍｇ／ｍＬ
のヘキストを用いて細胞を標識した。使用するときには、ベラパミルは、５０ｍ
Ｍの濃度で含有せしめた。染色後、氷冷した染色培地を用いて、細胞を３回洗浄
し、再懸濁し、分析及びソーティングするまで氷上に保持した。ヘキスト染色さ
れた細胞の二色分析では、続いて、１ｍｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ；
ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含
む染色培地中に、細胞を再懸濁した。四色分析を可能とする抗体染色では、染色
培地（１００ｍＬ）中に細胞を再懸濁し、抗体を直接細胞懸濁物に加えた。該細
胞を２０〜３０分間、氷上でインキュベートした後、氷冷した染色培地中でさら
に３回洗浄し、１ｍｇ／ｍＬのＰＩを含有する染色培地に再懸濁した。次に、二
重ＣｏｈｅｒｅｎｔＩ−９０レーザーを取り付けたＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌｕｓセ
ルソーター上で、分析又はソーティングを行った。ヘキストは、３５１ｎｍで励
起され、４５ＯＤＦ２０（青）とＬＰ６７５（遠赤）フィルター（Ｏｍｅｇａ
Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．， Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）を用いて、発光
を検出した。これらの発光波長を分離するために、６１０ｎｍの短光路二色鏡を
使用した（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．）。ヘキスト色素からの発光
は、リニアスケールで得られた。死亡した細胞及び死にかけた細胞は、それらに
よるＰＩの摂取に起因する遠赤波長の強い発光に基づいて、除外した。
【００２２】 ヘキスト染色に基づいて予めソーティングされた細胞上の細胞表面抗原の分析
では、細胞は、２％ＦＣＳを含む１００ｍＬのＰＢＳ中に沈降させ、再懸濁し、
氷上に置いた。蛍光をコンジュゲートした抗体は、細胞懸濁物に直接添加された
。２０〜３０分間インキュベートした後、ＰＢＳ／２％ＦＣＳで細胞を３度洗浄
した。必要な場合には、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中の１％のホルムアルデヒド中に、
細胞を固定した。全ての表面マーカー分析において、ヘキストと抗体で同時に染
色される細胞を用いた四色分析と、引き続き抗体で染色されるＦＡＣＳ（登録商
標）ソーティングされたＳＰ細胞上で行ったそれらの分析との間には、顕著な差
はなかった。
【００２３】 細胞内染色の場合には、ＦＡＣＳ（登録商標）単離された細胞は、製造者（Ｃ
ａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓ
ｃｏ、ＣＡ）の説明書に従って、Ｆｉｘ ａｎｄ Ｐｅｒｍ細胞透過キット及び
抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰコンジュゲート（Ｌｅｕ４；ＢＤＩＳ）を用いて染色した
。
【００２４】 ライトギムザ染色 識別染色の調製においては、ＰＢＳ中の細胞は、１０００
ｒｐｍで、３分間のＣｙｔｏｓｐｉｎ３（Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｔｔ
ｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）による遠心を用いて、コートされたスライド上に直接沈降
された。細胞は、デューク大学医療センターの小児骨髄移植研究室の自動細胞装
置の中で、ライトギムザ染色により染色された。 造血始源細胞コロニー（ＨＰＣ）アッセイ及び長期培養（ＬＴＣ）アッセイ 短
期及び長期培養のＬｉｎ−ＣＤ３４＋ＳＰ及びＬｉｎ−ＣＤ３４−ＳＰ細胞を評
価するために、複数の連続ソーティングを利用して、Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＳＰ及
びＬｉｎ−ＣＤ３４−ＳＰ細胞の最大限の純度を保証した。まず、１〜２％のヘ
キスト染色されたＬｉｎ−ＵＣＢとしてＳＰ細胞を最初にソーティングした。こ
れには、ＳＰプロフィールの最も薄い辺縁に位置する細胞のみが含まれていた（
代表的なプロフィールについては図３Ｂを参照）。次に、単離されたＬｉｎ−Ｓ
Ｐ細胞は、それらのＣＤ３４及びＣＤ３８発現に基づいて再ソーティングされた
。ＣＤ３４−とＣＤ３４＋サブ集団の間の最適な識別を達成するために、ＦＩＴ
Ｃコンジュゲートより感度がよいので、抗ＣＤ３４のフィコエリトリン・コンジ
ュゲートで細胞を染色した。このため、ＣＤ３８ｌｏ／−細胞の選別は、ＦＩＴ
Ｃがコンジュゲートされた試薬に基づいてなされた。この試薬は、始源的ＨＳＣ
上でのＣＤ３８の発現を確定するために典型的に使用されるＰＥがコンジュゲー
トされた抗ＣＤ３８よりもかなり薄い（Ｈａｏ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ８６
：３７４５（１９９５）；Ｔｈｏｍａ ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ ８３：２１
０３（１９９４））。このために、最も明るいＣＤ３８＋細胞だけをこれらの培
養アッセイから除外した。この戦略を用いると、それらのＣＤ３８の発現に基づ
いて、平均７％のＣＤ３４−ＳＰ細胞及び２８％のＣＤ３４＋ＳＰ細胞が除外さ
れた。これらの単離の目的で、ＣＤ３８−は、ＦＩＴＣアイソタイプ対照と同等
又はそれ未満のシグナル強度を有する細胞として定義された。幾つかの実験では
、ＣＤ３４＋及びＣＤ３４−ＳＰ細胞は、ヘキストと抗ＣＤ３４−フィコエリト
リンで同時に染色された未分画のＵＣＢから直接単離された。
【００２５】 造血始源細胞コロニーアッセイは、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｈ４４３１（Ｓｔｅ
ｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中に１００〜２００の細胞
を播種することによって行った。３７℃で、５％ＣＯ２とともに、湿気のあるチ
ャンバー中で該細胞をインキュベートした。続いて、造血コロニー（＞１００細
胞）、培養開始から１４〜１８日目に、記録した。長期培養は、放射線照射した
異系同質骨髄ストロマか、マウスＭＳ−５細胞（Ｄｒ． Ｔａｄａｓｈｉ Ｓｕ
ｄｏ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｉｒｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｕｎｍａ，Ｊａｐａｎ；（Ｉｓｓａａｄ ｅ
ｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ８１：２９１６（１９９３）から譲り受けた）ストロマ
層の何れかの上で継続された。ＭＳ−５ストロマ層は、２４ウェル（Ｃｏｒｎｉ
ｇ Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）のプレートの中央
ウェルに、１０％のＦＣＳを補充した０．５ｍＬＤＭＥＭ中の６〜７×１０４Ｍ
Ｓ−５細胞／ウェルを播種することによって、確立した。これらの細胞は、培養
が約８０％の密集に近づくまで、湿気のあるインキュベーターの中にて、３７℃
で培養した。次に、セシウム源からの３０Ｇｙｇの照射によって、単層を照射し
た。照射後、単層からの培地をＭｙｅｌｏｃｕｌｔＨ５１００（ＳｔｅｍＣｅｌ
ｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で完全に置き換えて、５％ＣＯ２の湿気のある
チャンバー中に、３３℃で細胞を保持した。長期培養は、典型的には、放射線照
射されたＭＳ−５細胞上で、５００〜２０００の造血始源細胞（細胞／ウェル）
から開始した。７〜１０日の間隔で、培地が補給できるように、各ウェルから培
地の半分を除去した。５週間後に、付着及び非付着細胞を採取し、上述のように
ＨＰＣアッセイ中に播種した。 例１ ヒト臍帯血中のヘキスト３３３４２側方集団の同定 ヒトＵＣＢ中にＳＰ細胞を同定するために、初期研究を行い、最適なヘキスト
濃度と染色期間を確立した。幾つかの条件は、類似のパターンを作り出したが、
ＵＣＢを２．５ｍｇ／ｍＬのヘキストと９０分間インキュベートすると、マウス
の骨髄ＳＰのものと同様の染色及び蛍光発光パターンを有する細胞集団が常に同
定された（図１Ａ及び図１Ｂ）。Ｇｏｏｄｅｌｌら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８
３：１７９７（１９９６））は、以前、マウスの骨髄のヘキストＳＰプロフィー
ルが、ベラパミルの添加によってブロックされことを示し（図１Ｄ）、ＳＰ細胞
の薄い染色は、少なくとも部分的には、多剤耐性（ＭＤＲ；ｍｕｌｔｉ ｄｒｕ
ｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）様タンパクによるヘキストの流出に起因することを
示唆した。ＵＣＢ ＳＰサブ集団もベラパミル感受性であり（図１Ｃ）、ＵＣＢ
の総白血球含量の０．３５ ０．１５％を占めた。しかしながら、この集団は、
ベラパミル処理の非存在下では、主たる細胞集団とは容易に区別できない染色及
び発光プロフィールの「肩（ｓｈｏｕｌｄｅｒ）」を含む細胞を含有していた。
従って、ＵＣＢ ＳＰは、典型的には、全白血球細胞含量の０．１〜０．２％を
占めるベラパミル感受性ＵＣＢ細胞の最も薄い辺縁として定義された（図１Ａ及
び１ＣのＲ１）。これは、典型的には、総白血球細胞の約０．１％を占めるマウ
ス骨髄のＳＰと同様である（図１Ｂ及び１ＤのＲ２）（Ｇｏｏｄｅｌｌら（Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１７９７（１９９６））。 例２ 未分画ＵＣＢ中のＳＰの特性決定 ＵＣＢ ＳＰを確定したので、ヘキストと共に特異的な表面マーカーに対して
誘導された抗体を用いてＵＣＢを染色することによって、この集団を含む細胞の
特性決定を行った。数多くのインビトロ及びキメラ動物アッセイによって、始源
的ヒトＨＳＣが、高レベルのＣＤ３４を発現し、低乃至は検出不能なレベルのＣ
Ｄ３８を発現していることが見出されているので（Ｈａｏ ｅｔ ａｌ， Ｂｌ
ｏｏｄ ８６：３７４５（１９９５）；Ｍｕｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏ
ｄ ８３：３１７０（１９９４）；Ｒｕｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ
８４：１４７３））、ＵＣＢ ＳＰ細胞上のこれらのマーカーの発現を評価した
（図２）。ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏ／−細胞は、総ＵＣＢ集団の０．２％（±０
．１％）を占めたが、ＵＣＢ ＳＰの３．８％（±２．７％）を占めた。このよ
うに、ＵＣＢ ＳＰは、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏ／−細胞が１９倍豊富であった
；しかしながら、この始源的免疫表現型を有する全細胞の５〜１０％が、ＳＰの
中に存在するにすぎなかった。このようにＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏ／−細胞が豊
富であるにもかかわらず、ＵＣＢ ＳＰ細胞の多くは、ＣＤ３４−であった（図
２Ｂ）。全てのＣＤ３４−ＳＰ細胞は、全白血球のマーカーであるＣＤ４５を発
現しており（図２Ｄ）、これらが、造血細胞であって、間葉細胞でないことが確
認された。
【００２６】 どの細胞が、ＣＤ３４−ＳＰ画分を含んでいるかを、より注意深く確定するた
めに、様々な系統分化決定マーカーに対して誘導された抗体とヘキスト染色を組
み合わせて、ＵＣＢを染色した。ＣＤ３３又はＣＤ１９を発現する細胞は、ＣＤ
３４−ＳＰには存在せず（図２Ｆ）、成熟骨髄球細胞又はＢ細胞が存在しないこ
とが示された。対照的に、多数のＣＤ３４−ＳＰ細胞は、通常ＮＫ細胞上に見出
されるマーカーを発現していた（すなわち、ＣＤ１６及びＣＤ５６、図２Ｈ）。
ＵＣＢ ＳＰ細胞の小さな画分は、成熟Ｔリンパ球に付随するマーカーも発現し
ていた（すなわち、ＣＤ４、図２Ｊ及びＣＤ８）。最後に、これらの細胞のより
多くの画分は、Ｔ細胞への分化決定を示唆し得る、ＣＤ２、ＣＤ３、及びＣＤ５
を含む、さらなるリンパ球マーカーを発現していた。これらのデータは、ＣＤ３
４＋ＣＤ３８ｌｏ／−細胞に加えて、ＵＣＢ ＳＰは、ＮＫ及びＴ細胞系統に分
化決定された細胞に付随する表面マーカーを発現している非常に多くのＣＤ３４ − 細胞を含有することを示している。 例３ Ｌｉｎ−ＵＣＢ中のＳＰ細胞の特性決定 未分画ＵＣＢ中に存在するＣＤ３４−ＳＰ細胞の多くが、Ｔ細胞及びＮＫ細胞
であると思われるという事実にかかわらず、ＣＤ３４−ＳＰ細胞のサブ集団は、
Ｔ細胞又はＮＫ細胞マーカーに対しては染まらなかった。この集団の性質をより
明確に確定するために、得られたＬｉｎ−ＵＣＢをヘキストで染色する前に、系
統分化決定された細胞をＵＣＢから除去した。系統除去では、ＣＤ２、ＣＤ３、
ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、及びグリコ
ホリンＡを発現している細胞を特異的に除去するために、高密度磁気分離を利用
した（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ
１５４：２４５ （１９９２））。典型的には、この操作によって、臍帯血由
来の白血球のうち９９．５％が除去された。ＵＣＢ細胞が、ヘキスト３３３４２
で染色された２２のソーティングにおいて、Ｌｉｎ−ＵＣＢは、未分画ＵＣＢと
比較して、ＳＰ細胞が４．７倍豊富であった（図３Ａ−３Ｃ）。未分画ＵＣＢ
ＳＰ細胞と同様に、Ｌｉｎ−ＳＰ細胞には、ベラパミルに対する感受性が残存し
ていた。
【００２７】 Ｌｉｎ−ＳＰ細胞画分の濃縮によって、ＦＡＣＳ（登録商標）分析において低
い前方及び側方光散乱特性を有する細胞の集団が精製された。Ｌｉｎ−ＳＰは、
２つの異なるサブ細胞集団：一つは、ＣＤ３４＋（４７．５±１９．９％）、一
つは、ＣＤ３４−（５２．５±１９．９％）をほぼ等しい割合で含有していた。
Ｌｉｎ−ＳＰ細胞中のＣＤ３４−細胞は、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−ＳＰ細胞に比べて
、より低い前方光散乱細胞を示した。両サブ細胞集団は、ＣＤ４５を発現してお
り（図３Ｄ−３Ｆ）、それらが、間葉細胞というより、むしろ造血細胞であるこ
とを示唆していた。ＣＤ３４＋とＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＳＰ細胞は、それらの光散
乱特性によって示唆されたように、何れも最小の内部複雑性（ｃｏｍｐｌｅｘｉ
ｔｙ）と細胞質を有する小さな芽球（ｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ）であった（図４）
。しかしながら、ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞は、ＣＤ３４＋細胞よりも明らかに小
さかった。
【００２８】 Ｌｉｎ−ＳＰは、Ｌｉｎ−ＵＣＢ母集団で観察されたように、ほぼ等しい割合
のＣＤ３４＋及びＣＤ３４−細胞を有していた。しかしながら、Ｌｉｎ−ＳＰか
らは、特異的にＣＤ３４ｄｉｍ細胞が除かれており、Ｌｉｎ−ＵＣＢ母集団と比
較したときに、ＣＤ３８陽性を一般的に喪失していた（図５Ａ及び５Ｂ）。Ｌｉ
ｎ−ＳＰは、未処置のＬｉｎ−ＵＣＢと比べて（それぞれ、８．６±６．３％と
９．５±４．９％）、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−（１６．５±８％）とＣＤ３４−Ｃ
Ｄ３８−（３９．７±２１．５％）細胞が共に濃縮されていた。Ｌｉｎ−ＳＰ内
のＣＤ３４−細胞が、単にＣＤ３４の交差イソフォーム（ａｌｔｅｒｎａｔｅ
ｉｓｏｆｏｒｍ）を発現しているのではないことを確かめるために、三つのモノ
クローナル試薬（ＱＢＥｎｄ１０、Ｉｍｍｕ１３３、及びＩｍｍｕ４０９）を含
む抗ＣＤ３４抗体のプールで、Ｌｉｎ−ＳＰ細胞を染色した。この試薬を用いて
も、ＣＤ３４−とＣＤ３４＋の異なるサブ集団は、Ｌｉｎ−ＳＰの中に観察され
た。 例４ 系統分化決定マーカーの発現のためのＬｉｎ−ＣＤ３４−ＳＰ細胞の特性決定 系統分化決定された細胞が、Ｌｉｎ−ＳＰを維持しているかどうかを決めるた
めに、最初に、成熟骨髄球、リンパ球、又はＮＫ細胞上に一般的に見出される細
胞表面マーカーの発現について、これらの細胞を評価した。Ｌｉｎ−ＳＰは、Ｃ
Ｄ３４−ＣＤ３８＋細胞をほとんど欠いていた。Ｌｉｎ−ＳＰ細胞は、顕著なレ
ベルのＣＤ３３（図５Ｄ）又はＣＤ１９を発現していなかった。このように、Ｕ
ＣＢ ＳＰでも明らかであったように、Ｌｉｎ−ＳＰ細胞は、成熟骨髄球又はＢ
リンパ球細胞を含有していなかった。さらに、ほとんどのＬｉｎ−ＳＰ細胞は、
ＣＤ１６、又はＣＤ５６（図５Ｆ）、ＣＤ４（図５Ｈ）、又は成熟ＮＫ又はＴ細
胞と一致し得る他の表面マーカー（例えば、ＣＤ３又はＣＤ８）を発現していた
。このように、未処置のＵＣＢ ＳＰとは対照的に、Ｔリンパ球とＮＫ表面マー
カーを発現している細胞の多くは、Ｌｉｎ−ＳＰに存在していなかった。Ｌｉｎ − ＳＰが、より多くの始源的リンパ球分化決定細胞を含有しているかどうかを決
定するために、初期Ｂ細胞マーカーＣＤ１０、又は初期Ｔ細胞マーカーＣＤ７に
対して特異的な抗体とヘキストで、Ｌｉｎ−ＵＣＢを染色した。Ｌｉｎ−ＳＰ細
胞は、ＣＤ１０を発現しておらず（図６Ｂ）、これらの細胞が、明らかには初期
Ｂリンパ球でないことを示した。興味深いことに、大部分のＣＤ３４−Ｌｉｎ− ＳＰ細胞は、極めて明るいＣＤ７の発現を示したのに対して、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ − ＳＰ細胞は、ＣＤ７の発現を欠如していた（図６Ｄ）。このようにＣＤ７とＣ
Ｄ３４は、Ｌｉｎ−ＳＰ集団を識別するためのマーカーとして使用することがで
きた。ＣＤ７は、胸腺内Ｔ細胞始源細胞上に発現されているので（Ｈａｙｎｅｓ
ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１０６１（１９８８）；Ｋｕｒ
ｔｚｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：７５７５（１９８９）；Ｓｐｉｔｚ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．６：２１３（１９９４））、さらに、胸腺内リンパ球始源細胞上に一般的に
発現される他の系統分化決定マーカーの発現について、Ｌｉｎ−ＳＰ細胞の特性
決定を行った。Ｌｉｎ−ＳＰは、ＣＤ３の表面発現が全くなかった（ｓｕｒＣＤ
３；図６Ｆ）。ＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＳＰ細胞の約１０〜３０％は、細胞質内ＣＤ
３（ｃｙｔＣＤ３；図６Ｈ）を発現していたが、ＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＳＰ細胞の
大部分は、このマーカーがなかった。Ｌｉｎ−ＳＰ細胞は、ＣＤｌａ（図６Ｊ）
、ＣＤ２（図６Ｌ）、ＣＤ４（図５Ｈ参照）、ＣＤ５、又はＣＤ８も発現してい
なかった。これに対して、胎児肝臓内リンパ球始源細胞について記載されている
ように（Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ ８０：１２７０（１９９２））
、ほぼ全てのＣＤ７＋細胞は、ＣＤ１１ｂ（図６Ｎ）とＣＤ４５ＲＡ（図６Ｐ）
を同時発現していた。要約すれば、Ｌｉｎ−ＣＤ３４−ＳＰ細胞は、ＣＤ７＋Ｃ
Ｄ３８−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５ＲＡ＋の免疫表現型を有し、サブセットは、細胞
質内ＣＤ３＋である。これらのマーカーの幾つかは、これらの細胞が、Ｔリンパ
球又はＮＫ細胞分化の何れかに分化決定したことを示唆するのに対して、ＣＤｌ
ａ、ＣＤ２、ＣＤ４、ｓｕｒＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、及びＣＤ５６
の発現の不存在のために、これらの細胞を以前に確定されたＴ細胞又はＮＫ細胞
発達段階（Ｓｐｉｔｚ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２１２（１
９９４））の何れかに割り当てることはできない。 例５ 始源的幹細胞マーカーの存在に関するＬｉｎ−ＳＰ細胞の免疫表現型の特性決定 Ｌｉｎ−ＳＰ細胞中に存在するＣＤ３４＋細胞は、最も明るいＣＤ３４の発現
を有し、低乃至は検出不能なレベルのＣＤ３８を発現する細胞である（図５Ｂ参
照）。この表現型は、多くのグループによって、以前に、始源的ＨＳＣに分類さ
れた（Ｈａｏ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ８６：３７４５（１９９５）；Ｍｕｅ
ｎｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ８３：３１７０（１９９４）；Ｒｕｓｔｅｎ
ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ８４：１４７３））。それ故、始源的ヒトＨＳＣ上
への以前に記載された他の表面マーカーの発現について、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−Ｓ
Ｐ細胞を評価した。ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−ＳＰ細胞は、低乃至は検出不能なレベル
でＴｈｙ−１（ＣＤｗ９０）を発現していた（図７Ｂ）。これは、ＤｉＧｉｕｓ
ｔｏらによって以前同定された、ＳＣＩＤ−ｈｕマウス及び長期インビトロ培養
で多系統の子孫を持続的に生じる細胞が高度に増加したＬｉｎ−ＣＤ３４ｈｉＴ
ｈｙ−１ｌｏＵＣＢ細胞集団と類似している（ＤｉＧｉｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ，
Ｂｌｏｏｄ ８４：４２１（１９９４））。ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−ＳＰ細胞は、以
前に記載されたＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡｌｏＣＤ７１ｌｏ多能性ヒト幹細胞と同
様に（Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ、Ｂｌｏｏｄ７７：１２１８（１９９１）；Ｌａｎ
ｄｓｏｒｐ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｄ．１７８：７８７（１９９３）；Ｔ
ｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５４：２４
５（１９９２））、殆ど完全にＣＤ４５ＲＡ−とＣＤ７１−であった（図７Ｄ及
び７Ｆ）。さらに、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−ＳＰ細胞は、均質に、中レベルのＨＬＡ
−ＤＲを発現しており（図７Ｈ）、ＵＣＢ由来のＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＨＬＡ−
ＤＲ＋細胞が、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＨＬＡ−ＤＲ−細胞に比べて、長期培養開
始細胞（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌ
ｌ）がより増加しているという観察（Ｃｉｃｕｔｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｇｒｏ
ｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １０：１２７（１９９４）；ＤｅＢｒｕｙｎ、Ｓｔｅ
ｍ Ｃｅｌｌｓ １３：２８１（１９９５））と一致していた。これらの観察を
総合すれば、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−ＳＰ細胞は、キメラ動物モデル及び長期インビ
トロ培養を用いて多くの他の群によって確定されたところによれば、初期造血始
源細胞の表現型プロフィールを有することを示している。
【００２９】 これに対して、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＳＰ細胞は、ＣＤ７１−Ｔｈｙ−
１−、及びＨＬＡ−ＤＲ−（それぞれ図７Ｆ、７Ｂ、及び７Ｈ）である。これら
の表面マーカーの不存在は、これらの細胞が、明らかには、赤血球（ＣＤ７１）
、Ｔ細胞（Ｔｈｙ−１）、又はＢ細胞（ＨＬＡ−ＤＲ）系統に分化決定されてい
ないことをさらに示している。 例６ ＣＤ３４＋及びＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＵＣＢ ＳＰ中の造血始源細胞の機能特性の
決定 始源ＨＳＣが、Ｌｉｎ−ＳＰのＣＤ３４＋又はＣＤ３４−画分の何れかに、存
在しているかどうかをさらに決定するために、ＦＡＣＳ（登録商標）単離された
細胞を造血始源細胞コロニーアッセイ（ＨＰＣＡ）及び長期培養アッセイ（ＬＴ
ＣＡ）中に播種した。両アッセイは、骨髄球及び赤血球始源細胞の存在を定量す
る。ＨＰＣＡは、限られた系統と自己新生可能性を有する比較的成熟した始源細
胞を同定すると考えられているのに対して、ＬＴＣＡは、より高い自己新生可能
性を有するより始源的な細胞を定量する。ＨＰＣＡ及びＬＴＣＡを確立するため
の細胞を最も正確に単離できるようにするために、複数の連続的なソーティング
戦略を利用した。まず、１〜２％のヘキスト染色されたＬＩＮ−ＵＣＢとしてＳ
Ｐソーティングした。Ｌｉｎ−細胞は、典型的には、多くとも、除去されていな
いＵＣＢの僅かに０．５％を占めるにすぎないので、このゲートは、ＵＣＢの最
初の白血球含量の約０．００５〜０．０１％に対応していた。続いて、それらの
ＣＤ３４及びＣＤ３８発現に基づいてソーティングするために、ソーティングさ
れたＬｉｎ−ＳＰ細胞を再染色した。ＣＤ３４＋及びＣＤ３４−細胞を選択し、
最も明るいＣＤ３８発現を有する細胞を除外した。
【００３０】 Ｌｉｎ−ＵＣＢは、最初の未分画ＵＣＢに対して、ＨＰＣＡでは、８０倍を超
えて濃縮されていた（図８Ａ）。ヘキストをベースとするソーティングの後に、
Ｌｉｎ−ＳＰ集団は、Ｌｉｎ−細胞に比べて、クローン原性前駆体を有する頻度
が低かった。Ｌｉｎ−ＵＣＢは、ＨＰＣＡにおいてコロニーを作り出すことがで
き、且つＬｉｎ−ＳＰ細胞の単離中に除去されるＣＤ３８＋細胞とＣＤ３４ｄｉ ｍ 細胞を高い割合で含有しているので、これは予想できなかった。ＣＤ３４＋Ｃ
Ｄ３８ｌｏ／−Ｌｉｎ−ＳＰ細胞は、Ｌｉｎ−細胞のそれと類似するクローン原
性頻度を有していたのに対して、ＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＳＰ細胞は、実質的に、Ｈ
ＰＣＡアッセイで検出できる始源細胞を欠如していた。
【００３１】 ＣＤ３４−ＣＤ３８ｌｏ／−Ｌｉｎ−ＳＰ細胞が、ＨＰＣＡアッセイにおいて
増殖できなかったことに対して与え得る説明の一つは、それらが、始源的すぎて
、ＨＰＣＡで使用される培地とサイトカインによっては支えられなかったという
ことであろう。ＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＳＰ細胞が、より始源的な造血始源細胞を含
有しているかどうかを決定するために、マウスのストロマ細胞株ＭＳ−５上で、
それらが５週間にわたって支えられる長期培養の中に、これらの細胞を置いた。
ＭＳ−５細胞は、ヒト多能性細胞とＢＦＵ−Ｅの増殖をより長い間支え、標準的
な同種異系のストロマと同様に、又はそれ以上に初期幹細胞を支え得る（Ｉｓｓ
ａａｄ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ８１：２９１６（１９９３））。これらの５
週にわたる長期培養からのデータによって、ＨＰＣＡアッセイの知見が再確認さ
れる（図８Ｂ）。実質的に、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＳＰ細胞からは、全く
コロニーが得られなかったのに対して、Ｌｉｎ−ＵＣＢとＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌ ｏ／− Ｌｉｎ−ＳＰ細胞が、５週間の長期培養後にコロニーを生じ得る細胞が高
度に増加されていた。系統除去操作又は複数の連続的ソーティングプロセスが、
長期培養においてクローン原性子孫を生じ得るＣＤ３４−細胞を除去したかどう
かを決定するために、未分画ＵＣＢは、ヘキストと抗ＣＤ３４で染色され、とＣ
Ｄ３４＋ＳＰとＣＤ３４−ＳＰ細胞を回収し、５週間の長期培養アッセイのため
にＭＳ−５細胞上に播種した。ここでも、ＣＤ３４−ＳＰ細胞からは、実質的に
コロニーは全く作られなかったのに対して、ＣＤ３４＋ＳＰは、長期培養細胞が
高度に増加していた（図９）。さらに、二つの予備的な実験では、同種異系骨髄
ストロマも、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＳＰ細胞がクローン原性子孫に増殖、
分化するのを支えることができなかった。これは、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ− ＳＰ細胞が増殖できないのは、長期培養細胞を支えるためにＭＳ−５ストロマを
使用したことによるものではないことを示している。 例７ 細胞表面抗原に対して特異的な抗体の組み合わせ 細胞表面抗原に対して特異的な抗体の組み合わせは、色素流出アッセイを用い
て予め確定されたＣＤ７＋Ｌｉｎ−細胞集団を濃縮するために使用できることが
確定されてきた。この手法は、陰性の選択に基づいており、ここでは、不必要な
細胞が、幹細胞源から除去されるのに対して、目的の細胞は、影響を受けない。
【００３２】 このカクテルは、以下の細胞表面抗原： グリコホリンＡ ＣＤ５６ ＣＤ６６ｂ ＣＤ３ ＣＤ２４ ＣＤ１４ ＣＤ２ ＣＤ１９ ＣＤ１６ を発現している細胞が予め除去されたヒトの臍帯血源に対して使用された。
【００３３】 この最初の系統除去は、ＳｔｅｍＳｅｐキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）を用いて達成される。生じた細
胞調製物は、Ｌｉｎ−ＵＣＢである。
【００３４】 該Ｌｉｎ−ＵＣＢ集団をさらに除去するために、以下の抗原： ＣＤ３８ ＣＤ３４ ＣＤ４ ＣＤ７１ ＨＬＡ−ＤＲ ＣＤ２５ ＣＤ３３ ＣＤ５ を発現する細胞が除去される。
【００３５】 除去は、フローサイトメトリーを用いて実施される。
【００３６】 これらの抗原が除去された細胞は、Ｌｉｎ−Ｌｉｎ−ＵＣＢと表記される。
【００３７】 この除去を用いて単離された細胞で、色素流出に基づいて確定された細胞が増
加していることを確認するために、ＳｔｅｍＳｅｐキットを用いてＬｉｎ−ＵＣ
Ｂを調製した。これらの細胞は、上述のようにヘキスト３３３４２で染色された
。続いて、さらなる系統分化決定抗原に対して誘導された抗体の組み合わせで、
この細胞を染色した。系統分化決定抗原は、マウスの免疫グロブリンＧに対して
誘導されたＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体を用いることにより、群れをなして
（ｅｎ ｍａｓｓｅ）可視化された。該細胞は、ＣＤ７に対して誘導されたＰＥ
コンジュゲート抗体でも染色された。
【００３８】 この複雑な混合物を分析するために、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｆ
ＡＣＳｔａｒ Ｐｌｕｓ装置上で、６つの細胞パラメーターに対してデータを取
得した。総Ｌｉｎ−ＵＣＢのヘキストプロフィールは、高いヘキスト流出活性を
示した（図１０Ａ）。Ｌｉｎ−Ｌｉｎ−ＵＣＢを分析するために、前記のさらな
る系統分化決定抗原の発現が欠如していることのみに基づいて、総Ｌｉｎ−ＵＣ
Ｂ調製物のサブ集団を選択した（すなわち、ＦＩＴＣ陰性細胞；図１０ＢではＲ
１として示されている）。他のパラメータについて分析したときには、このゲー
ト中の細胞は、ＣＤ７＋であり（図１０Ｂ）、ＣＤ７＋Ｌｉｎ−Ｌｉｎ−ＵＣＢ
細胞は、主としてヘキストプロフィールの最高の流出部分中にあって（図１０Ｃ
）、小芽球であった（図１０Ｄ）。これらの観察は、色素流出アッセイを用いて
予め確定された細胞と一致していた。
【００３９】 抗ＣＤ７−ＰＥが、抗ＣＤ５９−ＰＥと置きかえられた同様のアッセイが実施
された。調査者の中には、造血幹細胞は、表面抗原ＣＤ５９を発現しているかも
しれないと信じている者もいる。 例８ ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＳＰ細胞の増殖を支えるシステム 予備的な結果は、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞の２つの異なる細胞型への
増殖を支えるシステムが確定されていることを示している。該システムは、予め
ＳＣＩＤ（Ｓｅｖｅｒｅ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎ
ｃｙ）マウス中に移植されたヒトの胸腺の小片中に直接（ヒトの臍帯血に由来す
る）該細胞を注入することを含む。移植片における全増殖が、注入されたＣＤ７ ＋ ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞から生じるように、移植に先立って、胸腺の移植片に
放射線照射した。合計、約８０００個の高度に精製されたＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌ
ｉｎ−ＳＰ細胞を４匹のマウスの胸腺移植片に移植した。９週間後に、ＣＤ７＋ ＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＳＰ細胞調製物を与えられた動物のうちの一匹を屠殺し、ヒ
ト組織移植片を取り出した。この胸腺移植片は、前記臍帯血由来の細胞に由来す
る未成熟なヒトＴ細胞によって占められていた。これらの予備的な結果は、ＣＤ
７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＳＰ細胞調製物が、Ｔ細胞になり得る細胞を含有するこ
とを示している。移植された細胞は、最初の２０００個の細胞から１０，０００
倍を超えて増大していた。さらに、最初に投与された細胞用量は、この種の実験
において、精製されたＣＤ３４＋細胞で典型的に使用される用量の２５〜１００
倍少なかった。これらの予備的な観察は、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＳＰ細胞
調製物は、胸腺を再集合する潜在能力を有する始源細胞が極めて濃縮されている
ことを示す。 例９ 系統除去カクテル中に抗ＣＤ１３抗体を含むことの利点 例７に記載されているように、ＳｔｅｍＳｅｐ幹細胞濃縮カラムを用いて予め
精製されたＬｉｎ−細胞に適用したときに、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞の
精製を実施するために、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ
３８、ＣＤ７１、及びＨＬＡ−ＤＲに特異的な抗体を用いることができる。これ
らの細胞調製物の純度は、多くの場合、６０％ＣＤ７＋〜８０％ＣＤ７＋を超え
る範囲にあった。さらなる細胞表面マーカーに対して特異的な抗体を注入すると
、最終調製物中のＣＤ７＋細胞の百分率に基づいて、９０％を超えなくても、８
０％を超える純度を有する細胞調製物を供給できるカクテルが得られる。このマ
ーカーは、ＣＤ１３（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）である。Ｌｉｎ−Ｕ
ＣＢから、上記及び例７に記載された抗体の混合物によって細胞を除去すると、
生じた集団が、約８０％の純度のＣＤ７＋細胞であった。残ったＣＤ７−細胞の
うち、約１５％が、ＣＤ１３＋であった。
【００４０】 これと同じ研究によって、Ｌｉｎ−Ｌｉｎ−ＵＣＢ細胞調製物中に残った ＣＤ７−ＣＤ１３−細胞の多くが、血小板マーカーである細胞表面抗原ＣＤ４１
でマークされることが示された。しかしながら、血小板自身が、しばしば非特異
的に細胞を結合するので、血小板抗原に対して誘導された抗体を混合物に添加す
ることは、有利ではないかもしれない。それ故、血小板の除去は、目的の細胞を
うっかり除去するかもしれない。
【００４１】 抗ＣＤ１３抗体を系統除去カクテルに加えた後の（「拡張された（ｅｘｔｅｎ
ｄｅｄ）系統除去カクテル」をもたらす）Ｌｉｎ−Ｌｉｎ−ＵＣＢ中に存在する
ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞の正体を確かめるために、ヘキスト３３３４２
色素流出アッセイを実施した。この研究では、まず、上述のように、ヘキスト３
３３４２で、Ｌｉｎ−ＵＣＢ細胞をラベルした。続いて、精製抗体とＦＩＴＣが
コンジュゲートされた二次ヤギ抗（マウスＩｇＧ）を用いて、拡張された系統除
去カクテルを用いて、これらの細胞をラベルした。最後に、ＰＥがコンジュゲー
トされた抗ＣＤ７抗体を用いて、該細胞をラベルした。該Ｌｉｎ−ＵＣＢは、典
型的なヘキストプロフィールを有していた。ＣＤ７＋Ｌｉｎ−Ｌｉｎ−ＵＣＢ細
胞を別々にゲーティングすると、約５０％のＣＤ７＋Ｌｉｎ−Ｌｉｎ−ＵＣＢ細
胞が、前記プロフィールの「ＳＰ」部分に局在した。これは、抗体除去で精製さ
れた細胞の多くが、ヘキストを用いて最初に精製された細胞であることを意味し
ている。
【００４２】 抗ＣＤ１３抗体を系統除去カクテルに加えた後のＬｉｎ−Ｌｉｎ−ＵＣＢ中に
存在するＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞の正体をさらに確かめるために、Ｌｉ
ｎ−Ｌｉｎ−ＵＣＢ中の細胞の免疫表現型を実施した。、ＡＰＣがコンジュゲー
トされた二次ヤギ抗（マウスＩｇＧ）を用いて、拡張された系統除去カクテルで
Ｌｉｎ−ＵＣＢをラベルした。続いて、ＣＤ７とＣＤ１１ｂに対して特異的な試
薬又はＣＤ７とＤ４５ＲＡに対して特異的な試薬を用いて細胞をラベルした。Ｌ
ｉｎ−Ｌｉｎ−ＵＣＢ細胞は、主に、ＣＤ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋とＣＤ７＋ＣＤ１
１ｂ＋であった。これらの表現型は、抗体除去によって精製された細胞の多くが
、最初にヘキストを用いて精製された細胞であったことを確証している。 例１０ 多剤耐性流出ポンプの活性をモニタリングする手法 それによって、Ｌｉｎ−Ｌｉｎ−ＵＣＢ中の多剤耐性流出ポンプ（ＭＤＲ）の
活性をモニターし得る手法を開発した。高ＭＤＲ活性は、造血幹細胞と同じ表現
型である。この活性は、ミトコンドリアによる色素３，３‘−ジエチルオキサカ
ルバシアニンヨウ化物（ＤｉＯＣ２；３，３’−ｊｉｅｔｈｙｏｌｘａｃａｒｂ
ａｃｙａｎｉｎｅ ｉｏｄｉｄｅ）の流出を通じてモニタリングされた。これら
の研究では、まず、ＤｉＯＣ２（５０ｎｇ／ｍＬ）で、３０分間Ｌｉｎ−ＵＣＢ
をラベルした後、洗浄し、９０分間色素を流出させた。続いて、ＡＰＣがコンジ
ュゲートされたヤギ抗（マウスＩｇＧ）を用いて、例９に記載した拡張された系
統除去カクテルを用いて該細胞をラベルした。続いて、ＣＤ７に対して誘導され
たＰＥコンジュゲート抗体を用いて該細胞をラベルした。ＣＤ７＋Ｌｉｎ−Ｌｉ
ｎ−ＵＣＢ中のＤｉＯＣ２染色の平均値は、全Ｌｉｎ−ＵＣＢ集団のそれよりも
１００ポイント以上低かった。これは、ＣＤ７＋Ｌｉｎ−Ｌｉｎ−ＵＣＢが、高
いＭＤＲ流出能を有していることを示している。このアッセイは、ヘキスト３３
３４２を用いた最初の観察が、ＭＤＲ流出ポンプの活性によるものであることを
確認するために使用された。ヘキストは、ＤＮＡ色素なので、この知見は、最初
に記載された低ヘキスト染色表現型が、高度に凝縮されたクロマチンを有する細
胞又はアポトーシスを行っている細胞で観察され得るという点で重要である。 例１１ ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞は、インビトロで、ＮＫマーカーを有する
細胞中に、及び骨髄球マーカーを有する細胞中に増殖する ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞は、様々なサイトカインの組み合わせを
補充したＡＤＴ２０４細胞株上で増殖することが示された。インビトロで生成さ
れる集団をさらに確定するために、より大規模なマルチパラメーターＦＡＣＳ分
析を行った。図１１は、ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋、ＣＤ５６＋ＣＤ１６−、及びＣ
Ｄ５６−ＣＤ１６＋細胞を含む、成熟ＮＫ表現型を有する細胞が、様々なサイト
カインを補充したＡＦＴ２０４上で培養されたＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／− 細胞から生じたことを実証している。これらの培養中に生じた細胞は、Ｋ５６２
細胞を溶解することができるＮＫ細胞の機能的な能力を保有していると予想され
る。成熟ＮＫ細胞に加えて、ＣＤ７＋ＣＤ５６細胞を含む、より始源的なＮＫ表
現型を有する他の集団は、ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞から容易に作成
することができるであろう。これらの観察を総合すれば、ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌ
ｉｎ−／−細胞集団は、ＮＫ細胞に対する前駆体を含有することを示している。
【００４３】 ＮＫマーカーを有する細胞の生成に加えて、ある種のインビトロ培養条件では
、ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞集団は、他のリンパ球マーカーの不存在
下で、骨髄球ＣＤ３３を保有する子孫細胞を生じた（図１２参照）。 例１２ ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞集団は、ＳＣＩＤ／ＮＯＤマウスに移植で
きる 移植されているヒトの細胞を厳正に同定し、移植レベルを増大せしめてＦＡＣ
Ｓの結果がより信頼できるものとなるようにデザインされた実験を行った。最初
の実験では、未培養のＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞が、ＳＣＩＤ／ＮＯ
Ｄマウスに移植できることが観察された。これらの実験では、ヒトのマーカーＣ
Ｄ４５に染まり、マウスのマーカーＬｙ５．２には染まらない事象だけをヒトの
細胞として数える（図１３参照）。ＣＤ３４＋細胞が、移植に寄与しなかったこ
とを保証するために、複数の精製工程によって、ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／ − から全てのＣＤ３４＋細胞を厳正に除去した。これらの厳格な細胞単離及び分
析基準を用いることにより、ＳＣＩＤ／ＮＯＤマウスに移植されているヒトの細
胞の殆どが、主としてＣＤ７−であることが分かり、それらが、単に接種された
細胞が維持されたものではないことを示している（図１３参照）。一つのマウス
は、脾臓に十分なヒトの細胞を有しており、それらは、主としてＣＤ１９＋Ｂ−
細胞であることが決定された（図１４参照）。これまでに行ったＳＣＩＤ／ＮＯ
Ｄ再集合（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）研究は、図１５に示されている。驚くべ
きことに、これらの実験で、未分画ＵＣＢのレシピエントは、１０７個の細胞を
受容し、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−ＵＣＢのレシピエントは、５０万個以上の細胞を受
容した。これに対して、ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞のレシピエントを
接種されたマウスは、４０００以下の細胞を受容した。 例１３ ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞は、ＳＣＩＤ／ｈｕ Ｔｈｙレシピエント
中でＴ細胞の子孫を作ることができる 始源的ヒトＨＳＣのＳＣＩＤ／ＮＯＤモデルに加えて、ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌ
ｉｎ−／−集団が、Ｔ細胞に対する前駆体を含有しているかどうかを決定するた
めに、ＳＣＩＤ／ｈｕ−ｔｈｙモデルを使用した。図１６は、ＣＤ３４−ＣＦ７ ＋ Ｌｉｎ−／−細胞を用いた一連のＳＣＩＤ／ｈｕ−ｔｈｙマウスの移植を示し
ている。これらの実験では、ドナー細胞は、ＨＬＡ−Ａ２＋ドナー細胞をＨＬＡ
−Ａ２−レシピエントに移植することによって、任意の残存する宿主胸腺細胞と
区別される。これらの実験では、ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞は、一重
陽性のＨＬＡ−Ａ２＋ドナーヒト胸腺細胞と二重陽性のＨＬＡ−Ａ２＋ドナーヒ
ト胸腺細胞の両者を生じ、この集団が、Ｔ細胞前駆体を含有していることを示し
ている。 例１４ 陰性除去 図１７及び１８に示されたデータは、無関係な細胞をネガティブに除去するた
めに２つのカラムを連続的に使用し（図１７）、又は細胞をネガティブに除去す
るために単一のカラムを使用して（図１８）、カラムをベースとする装置を用い
ることにより、本発明の幹細胞集団を単離することができることを実証している
。 引用した上記文献は、参照文献としてその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４４】 当業者であれば、この開示を読むことにより、本発明の真の範囲から離れずに
、形式および細部を様々に変化させ得ることが理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヘキスト染色と発光プロフィールを示す図（２．５μｇ／ｍＬのヘキスト（図
１Ａ）でラベルされたヒトＵＣＢの染色及び発光プロフィールを５μｇ／ｍＬの
ヘキストでラベルされたマウスの骨髄のそれと比較した（図１Ｂ）。側方集団（
ＳＰ；ｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）細胞は、線で描かれたゲートによって
示されており（ＵＣＢではＲ１、マウスの骨髄ではＲ２）、５０μＭのベラパミ
ルの存在下では、ヘキストによりラベルされた類似の細胞集団は存在しない（図
１ＣはＵＣＢ；マウス骨髄は図１Ｄ）。）。
【図２】 ＵＣＢ ＳＰ中での系統分化決定マーカーの発現を示す図（未分画のＵＣＢ中
でのＣＤ３４の発現（図２Ａ、２Ｃ、２Ｅ）をＵＣＢ ＳＰ中に見出されたそれ
（図２Ｂ、２Ｄ、２Ｆ）と比較するために、四色のＦＡＣＳ（登録商標）分析を
使用した。これらの分析において、ＳＰは、ヘキスト染色された細胞のうち最も
薄い０．１％に属する細胞として定義された。該発現は、ＣＤ３８（図２Ａ及び
２Ｂ）、ＣＤ４５（図２Ｃ及び２Ｄ）、ＣＤ３３（図２Ｅ及び２Ｆ）の発現と関
連して表されている）。
【図３】 ＵＣＢ ＳＰ中での系統分化決定マーカーの発現を示す図（未分画のＵＣＢ中
でのＣＤ３４の発現（図２Ｇ及び２Ｉ）をＵＣＢ ＳＰ中に見出されたそれ（図
２Ｈ、２Ｊ）と比較するために、四色のＦＡＣＳ（登録商標）分析を使用した。
これらの分析におけるＳＰは、ヘキスト染色された細胞のうち最も薄い０．１％
に属する細胞として定義された。該発現は、ＣＤ５６（図２Ｇ及び２Ｈ）、ＣＤ
４（図２Ｉ及び２Ｊ）の発現と関連して表されている）。
【図４】 Ｌｉｎ− ＳＰ中の造血細胞の集団を示す図（典型的なＵＣＢ、Ｌｉｎ−ＵＣ
Ｂ、及びＬｉｎ−ＳＰ細胞のヘキスト発光プロフィールが、それぞれ図３Ａ、３
Ｂ、及び３Ｃに表されている。ＵＣＢ、Ｌｉｎ−ＵＣＢ、及びＬｉｎ−ＳＰ細胞
の典型的なＣＤ３４及びＣＤ４５の発現が、図３Ｄ、３Ｅ、及び３Ｆに表されて
いる。これらのデータは、四色のＦＡＣＳ（登録商標）分析によって、得られた
）。
【図５】 精製されたＣＤ３４＋及びＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＳＰ細胞の形態を示す図（形態
を比較するために、Ｌｉｎ−ＵＣＢ（図４Ａ）、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−ＳＰ（図４
Ｂ）、及びＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＳＰ（図４Ｃ）細胞の細胞調製物をライト−ギム
ザ染色で染色した）。
【図６】 Ｌｉｎ−ＳＰ中に系統分化決定マーカーが発現していないことを示す図（Ｌｉ
ｎ−ＵＣＢ（図５Ａ、５Ｃ）をＬｉｎ−ＳＰ（図５Ｂ、５Ｄ）と比較するために
、四色のＦＡＣＳ（登録商標）分析を使用した。これらの分析では、Ｌｉｎ−Ｓ
Ｐは、ヘキスト染色された細胞の中で最も薄い０．５％に属する細胞として定義
された。ＣＤ３４の発現は、ＣＤ３８（図５Ａ及び５Ｂ）、ＣＤ３３（図５Ｃ及
び５Ｄ）の発現）と関連して調べられた。
【図７】 Ｌｉｎ−ＳＰ中に系統分化決定マーカーの発現が欠如していることを示す図（
Ｌｉｎ−ＵＣＢ（図５Ｅ、５Ｇ）をＬｉｎ−ＳＰ（図５Ｆ、５Ｈ）と比較するた
めに、四色のＦＡＣＳ（登録商標）分析を使用した。これらの分析では、Ｌｉｎ − ＳＰは、ヘキスト染色された細胞の中で最も薄い０．５％に属する細胞として
定義された。ＣＤ３４の発現は、ＣＤ１６、及びＣＤ５６（図５Ｅ及び５Ｆ）、
ＣＤ４（図５Ｇ及び５Ｈ）の発現）と関連して調べれられた。
【図８】 Ｌｉｎ−ＳＰ内の初期リンパ球マーカーの発現を示す図（Ｌｉｎ−ＳＰ中に見
出されたＣＤ１０及びＣＤ７の発現と（図６Ｂ及び６Ｄ）、Ｌｉｎ−ＵＣＢ中（
図６Ａ及び６Ｃ）のＣＤ１０（図６Ａ及び６Ｂ）及びＣＤ７（図６Ｃ及び６Ｄ）
の発現を比較するために、四色のＦＡＣＳ（登録商標）分析を使用した。これら
は、ＣＤ３４の発現と関連して表されている。）
【図９】 Ｌｉｎ−ＳＰ内の初期リンパ球マーカーの発現を示す図（細胞表面上（図６Ｅ
及び６Ｆ、及び細胞質中（図６Ｇ及び６Ｈ）におけるＣＤ３の発現を、ヘキスト
染色された細胞をＦＡＣＳ（登録商標）ソーティングすることによって、単離さ
れたＬｉｎ−ＵＣＢ（図６Ｅ及び６Ｇ）及びＬｉｎ−ＳＰ細胞（図６Ｆ及び６Ｈ
）で比較した。これらは、ＣＤ３４の表面発現に関連して表されている。）。
【図１０】 Ｌｉｎ−ＳＰ内の初期リンパ球マーカーの発現を示す図（Ｌｉｎ−ＵＣＢ（図
６Ｉ、６Ｋ）及びＬｉｎ−ＳＰ細胞（図６Ｊ、６Ｌ）上におけるＣＤｌａ（図６
Ｉ及び６Ｊ）、ＣＤ２（図６Ｋ及び６Ｌ）、の発現を比較するために、四色のＦ
ＡＣＳ（登録商標）分析を使用した。これらは、ＣＤ７の発現と関連して表され
ている。ＣＤ７の発現は、使用した蛍光色素にかかわらず、縦軸に描かれている
）。
【図１１】 Ｌｉｎ−ＳＰ内の初期リンパ球マーカーの発現を示す図（Ｌｉｎ−ＵＣＢ（図
６Ｍ及び６Ｏ）及びＬｉｎ−ＳＰ細胞（図６Ｎ及び６Ｐ）上におけるＣＤ１１ｂ
（図６Ｍ及び６Ｎ）、ＣＤ４５ＲＡ（図６Ｏ及び６Ｐ）の発現を比較するために
、四色のＦＡＣＳ（登録商標）分析を使用した。これらは、ＣＤ７の発現と関連
して表されている。ＣＤ７の発現は、使用した蛍光色素にかかわらず、縦軸に描
かれている）。
【図１２】 Ｌｉｎ−ＳＰ中の造血始源細胞に対するマーカーの発現を示す図（Ｌｉｎ-Ｕ ＣＢ（図７Ａ、７Ｃ）におけるＣＤｗ９０（Ｔｈｙ−１；図７Ａ及び７Ｂ）、Ｃ
Ｄ４５ＲＡ（図７Ｃ及び７Ｄ）とＬｉｎ−ＳＰ（図７Ｂ及び７Ｄ）におけるＣＤ
ｗ９０（Ｔｈｙ−１；図７Ａ及び７Ｂ）、ＣＤ４５ＲＡ（図７Ｃ及び７Ｄ）の発
現を比較するために、四色のＦＡＣＳ（登録商標）分析を使用した。これらの分
析では、Ｌｉｎ−ＳＰは、ヘキストで染色された細胞のうち最も薄い０．５％に
属する細胞として定義された。これらは、ＣＤ３４の発現に関連して表されてい
る。ＣＤ３４発現のレベルは、使用した蛍光色素にかかわらず、横軸に書かれて
いる。）。
【図１３】 Ｌｉｎ−ＳＰ中の造血始源細胞に対するマーカーの発現を示す図（Ｌｉｎ-Ｕ ＣＢ（図７Ｅ及び７Ｇ）におけるＣＤ７１（図７Ｅ及び７Ｆ）及びＨＬＡ−ＤＲ
（図７Ｇ及び７Ｈ）とＬｉｎ−ＳＰ（図７Ｆ及び７Ｈ）におけるＣＤ７１（図７
Ｅ及び７Ｇ）、及びＨＬＡ−ＤＲ（図７Ｇ及び７Ｈ）の発現を比較するために、
四色のＦＡＣＳ（登録商標分析）を使用した。これらの分析では、Ｌｉｎ−ＳＰ
は、ヘキストで染色された細胞のうち最も薄い０．５％の細胞として定義された
。これらは、ＣＤ３４の発現に関連して表されている。ＣＤ３４発現のレベルは
、使用した蛍光色素にかかわらず、横軸に書かれている。）。
【図１４】 骨髄赤血球（ｍｙｅｌｏ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ）条件下でのＬｉｎ−ＳＰの増
殖を示す図（ＵＣＢは、系統除去(ｌｉｎｅａｇｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ)によっ
て、及びＦＡＣＳ（登録商標）ソーティングによって分画された。ＵＣＢ、Ｌｉ
ｎ−ＵＣＢ、Ｌｉｎ−ＳＰ、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−ＳＰ、及びＣＤ３４−Ｌｉｎ− ＳＰ画分からの造血始源細胞をＨＰＣＡによって、及びＭＳ−５ストロマ上での
長期培養によって計数した。）
【図１５】 骨髄赤血球条件下でのＵＣＢ ＳＰの増殖を示す図（ＵＣＢ ＳＰ細胞は、三
色の免疫細胞学を使用して、未画分のＵＣＢ調製物からソーティングした。ソー
ティングされた細胞からの造血始源細胞は、同質異系の骨髄ストロマ上の長期培
養によって計数した。ＣＤ３４＋ＵＣＢ ＳＰ細胞は、フィコエリトリンをコン
ジュゲートした抗ＣＤ３４を用いたソーティングの間に、ＳＰから除外された。
実施可能なときには、ＣＤ３４＋ＵＣＢ ＳＰ細胞は、個別に採集され、培養さ
れた。対照細胞には、ＳＰゲート中には存在しないＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞も含ま
れていた。 ＊ＣＤ３４＋ＵＣＢ ＳＰ細胞からのデータは、二つの臍帯の各々からの単一
のＬＴＣ培養ウェルに由来する。 ＊＊ＣＤ３４−ＵＣＢ ＳＰ細胞に対して示された増殖は、全て（三つの臍帯
から開始された八つの培養ウェルうちの）単一のＬＴＣウェルに由来した。）。
【図１６】 Ｌｉｎ−ＵＣＢ及びＬｉｎ−Ｌｉｎ−ＵＣＢ調製物の分析を示す図。
【図１７】 ＣＤ３４−ＣＤ７＋Ｌｉｎ−／−細胞から、ＮＫ細胞マーカーを有する子孫が
生じることを示す図（ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞を、ＫＬ，Ｆｌｔ−
３Ｌ，Ｇ−ＣＳＦ，ＴＰＯ，ＩＬ−３，ＩＬ−７，ＩＬ−１１，及びＩＬ−１５
を補充したＡＦＴ２０４（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ８９：４３３
７（１９９７）上で，１４週間培養した。生きたヒトの細胞は、散乱特性（図１
１Ａ中のＲ１）、及び低７−ＡＡＤ染色と連結されたＣＤ４５の発現（図１１Ｂ
中のＲ２）に基づいて定義された。続いて、骨髄細胞（図１１Ｃ）、ＮＫ細胞（
図１１Ｄ−Ｆ）のマーカーに対して、これらの細胞を染色した。）。
【図１８】 ＣＤ３４−ＣＤ７＋Ｌｉｎ−／−細胞から、ＮＫ細胞マーカーを有する子孫が
生じたことを示す図（ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞を、ＫＬ，Ｆｌｔ−
３Ｌ，Ｇ−ＣＳＦ，ＴＰＯ，ＩＬ−３，ＩＬ−７，ＩＬ−１１，及びＩＬ−１５
を補充したＡＦＴ２０４（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ８９：４３３
７（１９９７）上で，１４週間培養した。生きたヒトの細胞は、散乱特性（図１
１Ａ中のＲ１）、及び低７−ＡＡＤ染色と連結されたＣＤ４５の発現（図１１Ｂ
中のＲ２）に基づいて定義された。続いて、ＮＫ細胞（図１１Ｆ）、Ｔ細胞（図
１１Ｇ−Ｈ）、ＤＣ（図１１Ｉ）、及びＢ細胞（図１１Ｊ）のマーカーに対して
、これらの細胞を染色した。）。
【図１９】 ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞から、骨髄球の免疫表現型を有する細胞
が生じることを示す図（ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞を、ＫＬ、ＦＬ、
ＴＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−１１、及びＩＬ−１５を補充
したＡＦＴ２０４ストロマ上で２８日間培養した。培養全部を採取し、散乱特性
（図１２Ａ）、及び低７−ＡＡＤ染色（図１２Ｂ）に基づいて定義された生きた
ヒトの細胞の集団中に、ＣＤ３３＋細胞を同定した。続いて、ＣＤ５６とＣＤ７
の同時発現について、ＣＤ３３＋細胞を分析した（図１２Ｃ）。成熟ＣＤ３３＋ ＣＤ７−ＣＤ５６−骨髄球細胞の候補が、図１２Ｃに赤で描かれている。）。
【図２０】 ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞は、ＳＣＩＤ／ＮＯＤマウスに移植する
ことができることを示す図（非致死量の放射線をＳＣＩＤ／ＮＯＤマウスに照射
し、４０００個以下のＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞を接種した。８週目
に、マウスを屠殺し、抗ＣＤ４５染色に基づいてヒトの細胞の存在を分析した（
図１３Ａ及び１３Ｂ）。抗ＣＤ４５で非特異的に染色し得るマウスの細胞を除外
するために、細胞を抗Ly-2で染色した（図１３Ａ及び１３Ｂ中の右側上部四分の
一）。続いて、ＣＤ４５＋Ｌｙ−２細胞（図１３Ａ及び１３Ｂでは緑）のＣＤ７
の発現を分析した（図１３Ｃ及び１３Ｄ）。データは、胸腺から回収された細胞
を用いて、二匹のマウス（ｍ９及びｍ１０）について表されている。
【図２１】 ＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞が、ＳＣＩＤ／ＮＯＤマウス中で、ＣＤ
１９＋細胞を作り出せることを示す図（対照未分画ＵＣＢ（図１４Ａ）、及びＣ
Ｄ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞（図１４Ｂ）を移植されたＳＣＩＤ／ＮＯＤ
マウスのＢ細胞マーカーＣＤ１９の発現について分析した（対照−図１４Ｃ、Ｃ
Ｄ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞−１４Ｄ）。データは、脾臓から回収した細
胞を使用して、一匹のマウスから得ている。）。
【図２２】 ＳＣＩＤ／ＮＯＤ実験の概要を示す図（示されたデータは、分画されていない
１０７個のＵＣＢ細胞を移植した２２匹のマウス、約５×１０５個のＣＤ３４＋ Ｌｉｎ−ＵＣＢを移植した１２匹のマウス、及び＜４×１０３個のＣＤ３４−Ｃ
Ｆ７＋Ｌｉｎ−／−細胞を移植した１０匹のマウスの平均及び標準偏差である。
移植の下の括弧内の数字は、各群に対する移植率をまとめたものである。移植レ
ベルは、図１３及び１４に上述されている基準を用いて移植後７〜８週目に決定
された。）。
【図２３】 ＳＣＩＤ／ｈｕ ｔｈｙマウス中でのＣＤ３４−ＣＦ７＋Ｌｉｎ−／−細胞の
移植を示す図（ＨＬＡ−ＡＴ−胸腺移植で確立された（Ｇａｌｙ ｅｔ ａｌ．
Ｂｌｏｏｄ ８５：２７７０（１９９５））ＳＣＩＤ／ｈｕ ｔｈｙマウスに、
１２００のＣＤ３４−ＣＦ７＋ＨＬＡ−Ａ２−Ｌｉｎ−／−細胞を接種した。９
週間後に、胸腺を採取し、ＨＬＡ−Ａ２を発現している生きた（７−ＡＡＤ−）
細胞（抗ＨＬＡ−Ａ２抗体ＢＢ７−ＦＩＴＣを用いて検出した）(図１６Ａ及び １６Ｄ中のＦＩＴＣ＋細胞)上でゲーティング（ｇａｔｅｄ）した。生きたＨＬ Ａ−Ａ２＋細胞のＣＤ３及びＣＤ５６（図１６Ｂ及び１６Ｅ）並びにＣＤ４及び
ＣＤ８（図１６Ｃ及び１６Ｆ）を分析した。カーソルは、事象の１％未満が陽性
となるアイソタイプ対照に基づいてセットされた。マウス３６−１８からの総細
胞収量（図１６Ａ−Ｃ）は、３．８×１０６細胞であり、マウス３６−１９から
は（図１６Ｄ−Ｆ）は、６．８×１０６細胞であった。
【図２４】 二つの連続した除去を示す図（まず、ＳｔｅｍＳｅｐ分離を介して、ＵＣＢか
らの単核細胞からＬｉｎ−細胞を濃縮した。続いて、Ｌｉｎ−／−ＵＣＢ細胞に
対するカクテルを用いて、Ｌｉｎ−ＵＣＢ細胞をさらに精製した。）。
【図２５】 二つの連続した除去を示す図（まず、ＳｔｅｍＳｅｐ分離を介して、ＵＣＢか
らの単核細胞からＬｉｎ−細胞を濃縮した。続いて、Ｌｉｎ−／−ＵＣＢ細胞に
対するカクテルを用いて、Ｌｉｎ−ＵＣＢ細胞をさらに精製精製した。）。
【図２６】 単一の除去を示す図（ＳｔｅｍＳｅｐ分離を介して、ＵＣＢからの単核細胞か
らＬｉｎ−細胞を濃縮するか、又はＬｉｎ−／−ＵＣＢ細胞に対するカクテルと
ＳｔｅｍＳｅｐカクテルを用いて、Ｌｉｎ−／−ＵＣＢを濃縮した。）。
【図２７】 単一の除去を示す図（ＳｔｅｍＳｅｐ分離を介して、ＵＣＢからの単核細胞か
らＬｉｎ−細胞を濃縮するか、又はＬｉｎ−／−ＵＣＢ細胞に対するカクテルと
ＳｔｅｍＳｅｐカクテルを用いて、Ｌｉｎ−／−ＵＣＢを濃縮した。）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ 15/09 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 15/00 Ａ (72)発明者 ストームス、ロバート・ダブリュ アメリカ合衆国、ノース・カロライナ州 27713 ダーハム、ダンゼイ・サークル 30 (72)発明者 ギルボア、エリ アメリカ合衆国、ノース・カロライナ州 27705 ダーハム、ストーン・ゲート・ド ライブ 3604 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA44 BA63 CA04 DA03 EA04 GA03 GA11 HA01 HA15 4B065 AA93X AC20 CA24 CA25 CA44 4C084 AA13 MA65 ZB022 ZB312 4C087 AA01 AA02 BB34 BB44 CA13 MA65 ZB02 ZB31

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも６０％のＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞を含む
    細胞の集団。
  2. 【請求項２】 前記細胞が、ヒトの細胞である請求項１に記載の集団。
  3. 【請求項３】 前記集団が、少なくとも８０％ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ− 細胞である請求項１に記載の集団。
  4. 【請求項４】 前記集団が、少なくとも９０％ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ− 細胞である請求項３に記載の集団。
  5. 【請求項５】 前記集団が、少なくとも９５％ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ− 細胞である請求項４に記載の集団。
  6. 【請求項６】 前記集団が、培地中に存在する請求項１に記載の集団。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の集団と生理学的許容される担体とを含む組
    成物。
  8. 【請求項８】 幹細胞源の細胞から造血幹細胞を単離する方法であって、 １） 系統分化決定表面抗原及びＣＤ３４表面抗原に特異的な抗体が前記 幹細胞源の前記細胞上に存在する前記表面抗原と結合できる条件下で、 前記幹細胞源の前記細胞を前記抗体と接触させる工程と； ２） 前記抗体に結合した前幹細胞源の細胞を前記幹細胞源の無抗体細胞 から分離する工程と； ３） 抗ＣＤ７表面抗原抗体が、工程２で得られた前記無抗体細胞上に存 在するＣＤ７表面抗原を結合できる条件下で、工程２で得られた前記 無抗体細胞を前記抗ＣＤ７表面抗原抗体と接触させる工程と； ４） 無抗ＣＤ７抗体細胞から工程３で得られた抗ＣＤ７抗体が結合した 細胞を分離する工程と； を備え、前記抗ＣＤ−７抗体が結合した細胞が、前記造血幹細胞である方法。
  9. 【請求項９】 工程１において、前記幹細胞源の細胞が、以下の抗原：ｇｌ
    ｙＡ、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ５６、ＣＤ２４、ＣＤ１９、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１４
    、ＣＤ１６、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、及び
    ＣＤ２５に対して特異的な抗体と接触される請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 工程１において、前記幹細胞源の細胞が、以下の抗原：ｇ
    ｌｙＡ、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ５６、ＣＤ２４、ＣＤ１９、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１
    ４、ＣＤ１６、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、Ｃ
    Ｄ２５、ＣＤ７１、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１３０、及びＣＤ１
    ２４に対して特異的な抗体と接触される請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記分離が、フローサイトメトリーを用いて実施される請
    求項８に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 幹細胞源の細胞から造血幹細胞を単離する方法であって、 １） 抗ＣＤ７抗体が、前記幹細胞源の前記細胞上に存在するＣＤ７表面 抗原と結合できる条件下で、前記幹細胞源の前記細胞を抗ＣＤ７表面 抗原抗体と接触させる工程と； ２） 前記抗ＣＤ７抗体を結合する前記幹細胞源の細胞を、結合しない細 胞から分離する工程と； ３） 系統分化決定表面抗原及びＣＤ３４表面抗原に特異的な前記抗体が、 工程２で得られた前記抗ＣＤ７が結合した細胞上に存在する系統分化 決定表面抗原及びＣＤ３４表面抗原に結合できる条件下で、工程２で 得られた前記抗ＣＤ７抗体を結合する前記細胞を、系統分化決定表面 抗原及びＣＤ３４表面抗原に特異的な抗体と接触させる工程と； ４） 工程３で得られた、系統分化決定表面抗原及びＣＤ３４表面抗原に 特異的な抗体がない細胞を、系統分化決定表面抗原及びＣＤ３４表面 抗原に特異的な抗体に結合した細胞から分離する工程と； を備え、前者が前記造血幹細胞である方法。
  13. 【請求項１３】 工程３において、前記幹細胞源の細胞が、以下の抗原：ｇ
    ｌｙＡ、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ５６、ＣＤ２４、ＣＤ１９、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１
    ４、ＣＤ１６、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、及
    びＣＤ２５に対して特異的な抗体と接触される請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 工程３において、前記幹細胞源の細胞が、以下の抗原：ｇ
    ｌｙＡ、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ５６、ＣＤ２４、ＣＤ１９、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１
    ４、ＣＤ１６、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、Ｃ
    Ｄ２５、ＣＤ７１、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１３０、及びＣＤ１
    ２４に対して特異的な抗体と接触される請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記分離が、フローサイトメトリーを用いて実施される請
    求項１２に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 骨髄移植を必要とする患者に骨髄移植を実施する方法であ
    って、幹細胞源からＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞を単離することと、導入さ
    れる細胞が移植される条件下で、前記患者に前記単離された細胞を導入すること
    とを備えた方法。
  17. 【請求項１７】 前記幹細胞源が、前記患者の骨髄又は抹消血である請求項
    １６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記患者が、癌患者である請求項１６に記載の方法。、
  19. 【請求項１９】 患者に遺伝子治療を実施する方法であって、幹源からＣＤ
    ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞を単離することと、治療的に有効なタンパク質をコ
    ードする核酸で前記単離された細胞を形質転換することと、前記核酸が発現され
    ることにより、前記タンパク質が産生され、それにより前記治療が実施される条
    件下で、前記患者に前記形質転換された細胞を導入することとを備えた方法。
  20. 【請求項２０】 前記幹細胞源が、前記患者の骨髄又は抹消血である請求項
    １９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 テスト化合物が、造血細胞の分化、増殖、又は移植を促進
    する能力をスクリーニングする方法であって、前記造血細胞の分化、増殖、又は
    移植が促進され得る条件下で、ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−を前記テスト化合物
    と接触させることと、前記接触が、前記ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−細胞の分化
    、増殖、又は移植の促進をもたらすかどうかを決定することとを備えた方法。
  22. 【請求項２２】 一以上の容器手段とともに配置された、ＣＤ４、ＣＤ５、
    ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、及びＣＤ２５に対して特異的な抗体
    を備えたキット。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008500558A (ja) * 2004-05-21 2008-01-10 ベックマン コールター，インコーポレイティド 完全自動化したモノクローナル抗体による広範な識別法
JP2016119910A (ja) * 2009-12-04 2016-07-07 ステム セル アンド リジェネレイティブ メディスン インターナショナル， インコーポレイテッド ヒト胚性幹細胞由来血管芽細胞からナチュラルキラー細胞および樹状細胞を生成する方法

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100697400B1 (ko) * 1999-10-05 2007-03-20 유니버시떼 드 몬트리얼 광역학적 진단 및 치료용 로다민 유도체
EP1514945A1 (en) * 2003-09-09 2005-03-16 Warner-Lambert Company LLC CD38 as a molecular marker on macrophages for COPD, and as a target molecule for treatment of COPD
WO2005047491A2 (en) * 2003-11-10 2005-05-26 Amgen Inc. Methods of using g-csf mobilized c-kit+cells in the production of embryoid body-like cell clusters for tissue repair and in the treatment of cardiac myopathy
WO2005113749A2 (en) 2004-05-14 2005-12-01 Becton, Dickinson And Company Stem cell populations and methods of use
US20080194474A1 (en) * 2004-05-14 2008-08-14 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods for the Treatment of Autoimmune Diseases
EP1874922A4 (en) * 2005-04-19 2009-10-28 Univ Johns Hopkins METHOD USING STROMA CELLS FROM UMBILICAL CORD BLOOD TO DEVELOP AND GRAFT NUCLEAR CELLS DERIVED FROM UMBILICAL CORD BLOOD
MX347303B (es) 2006-03-07 2017-04-21 Shroff Geeta Composiciones que comprenden celulas madre embrionarias humanas y sus derivados, metodos de uso y metodos de preparacion.
WO2012048298A2 (en) 2010-10-08 2012-04-12 Caridianbct, Inc. Methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system with control conditions
CN103193841A (zh) 2012-01-06 2013-07-10 维瑞斯特姆有限公司 治疗性化合物及相关使用方法
CN105793411B (zh) 2013-11-16 2018-04-17 泰尔茂比司特公司 生物反应器中的细胞扩增
WO2015148704A1 (en) 2014-03-25 2015-10-01 Terumo Bct, Inc. Passive replacement of media
WO2016049421A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Terumo Bct, Inc. Scheduled feed
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
EP3464565A4 (en) 2016-05-25 2020-01-01 Terumo BCT, Inc. CELL EXPANSION
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
HUE060548T2 (hu) 2017-02-13 2023-03-28 Hopitaux Paris Assist Publique Módszer a T-sejtek progenitorainak elõéllítására
EP3595683A1 (en) 2017-03-15 2020-01-22 Orca Biosystems, Inc. Compositions and methods for hematopoietic stem cell transplants
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
EP3656841A1 (en) 2017-03-31 2020-05-27 Terumo BCT, Inc. Cell expansion
US20200308540A1 (en) * 2017-09-29 2020-10-01 Regents Of The University Of Minnesota Methods of making, expanding, and using a human progenitor t cell

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5061620A (en) * 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
WO1996039489A1 (en) * 1995-06-06 1996-12-12 Whitehead Institute For Biomedical Research Isolation of mammalian hematopoietic stem cells

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008500558A (ja) * 2004-05-21 2008-01-10 ベックマン コールター，インコーポレイティド 完全自動化したモノクローナル抗体による広範な識別法
JP2012215593A (ja) * 2004-05-21 2012-11-08 Beckman Coulter Inc 完全自動化したモノクローナル抗体による広範な識別法
JP2016119910A (ja) * 2009-12-04 2016-07-07 ステム セル アンド リジェネレイティブ メディスン インターナショナル， インコーポレイテッド ヒト胚性幹細胞由来血管芽細胞からナチュラルキラー細胞および樹状細胞を生成する方法

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AU1625199A (en) 1999-06-16
EP1034288A1 (en) 2000-09-13
EP1034288A4 (en) 2002-11-27
WO1999028486A1 (en) 1999-06-10
US6537807B1 (en) 2003-03-25
CA2313250A1 (en) 1999-06-10
AU753975B2 (en) 2002-10-31

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