JP2001520509A

JP2001520509A - Autoimmune cell therapy: cell compositions, methods and applications in the treatment of human diseases

Info

Publication number: JP2001520509A
Application number: JP50770697A
Authority: JP
Inventors: グルーエンバーグ，マイケル・エル
Original assignee: セルセラピー・インコーポレイテツド
Priority date: 1995-07-25
Filing date: 1996-07-24
Publication date: 2001-10-30
Also published as: EP0852618A1; AU6649996A; WO1997005239A1; CA2227327A1

Abstract

(57)【要約】患者から単離され、生体外での増殖および／または分化を行った機能的もしくは表現型的に特定された免疫細胞の実質的に均質な群を含む組成物。ドナーにそのような細胞を再注入することで、疾患の治療もしくは予防その他の形で該患者の免疫状態を変える方法も提供される。そのような細胞を生体外で増殖および／または分化させる方法も提供される。 (57) [Summary] A composition comprising a substantially homogeneous population of functionally or phenotypically identified immune cells that have been isolated from a patient and have undergone in vitro expansion and / or differentiation. Also provided is a method of altering the immune status of a patient by re-injecting such cells into a donor, such as treating or preventing disease or otherwise. Methods for growing and / or differentiating such cells in vitro are also provided.

Description

【発明の詳細な説明】自己免疫細胞療法：細胞組成物、方法およびヒト疾患の治療への応用本願は、１９９５年７月２５日出願の米国特許出願０８／５０６６６８号（Mi cheal Gruenberg,"PROCESS FOR PRODUCING EFFECTOR IMMUNE CELLS FOR USE IN ADOPTIVE CELLULAR IMMUNOTHERAPY"）の一部継続出願である。本願では、該出願に対する優先権の恩恵を主張するものである。本願は、１９９５年７月２５日出願の米国特許出願０８／５０６１７３号（Mi cheal Gruenberg,"CELL GROWING DEVICE FOR IN VITRO CELL POPULATION EXPANSION"）に関係するものでもある。米国の国内段階において、米国特許出願０８／５０６６６８号および０８／５０６１７３号のそれそれの主題は、引用によって本願にその全体が組み入れられるものとする。発明の属する技術分野本発明は、養子免疫療法に関するものである。詳細には、自己細胞療法が提供される。患者からの単離、分化および／または生体外（ex vivo）での増殖を行った機能的または表現型的に一定の免疫細胞の実質的に均質な群を含む組成物が提供される。そのような細胞を再注入することで、疾患の治療または予防あるいは患者の免疫状態をその他の形で変えるそのような組成物の使用も提供される。発明の背景Ｔリンパ球は、主として細胞内病原体からの保護およびある種の腫瘍の抑制もしくは除去を行う免疫細胞である。成熟Ｔリンパ球は、いずれもＣＤ３細胞表面抗原を発現し、ＣＤ４またはＣＤ８表面抗原のいずれかの発現に基づいて、２つのサブタイプに分けられる。ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、クラス１１主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に関連して生じる抗原を認識する。ＣＤ４⁺細胞は、それが産生するサイトカインによって、免疫応答の調節機能に関与する。ＩＬ−２などのこれらサイトカインは、病原体に対する免疫細胞の攻撃をまたは侵襲微生物に対する抗体の攻撃を媒介する。ＣＤ８⁺Ｔ細胞は、クラスＩのＭＨＣ分子との関連で生じる抗原を認識する。ＣＤ８⁺細胞は、異種抗原を有する細胞の細胞毒的破壊などの免疫応答におけるエフェクタ機能に関与する。これらの応答に介在する細胞は、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と称される。一般にはＣＤ８⁺細胞である（ただし、ＣＤ４⁺である場合もある）これらの細胞は、ウィルス感染および腫瘍に対する抵抗性の機序を演じる。ＣＴＬのエフェクタ機能は、ＣＤ４⁺調節細胞からのサイトカイン産生に依存している。養子免疫療法養子免疫療法は、ウィルスまたは腫瘍に対する患者の免疫応答を強化するための実験的治療方法である。その方法では、対象者からの免疫細胞の取り出し、エフェクタ細胞の生体外形成、臨床的に有効な数までの細胞の増殖および患者へのその細胞の再注入を含む。細胞とともにインターロイキン−２（ＩＬ−２）を注入することで極めて高い毒性が生じることから、養子免疫療法プロトコールは市販されておらす、また広く使用されてはいない。ＩＬ−２はこれらのプロトコールで使用されて、エフェクタ免疫細胞の分化および／または増殖を起こすものである。しかしながら、ＩＬ−２中で培養された免疫細胞が継続的生存およびエフェクタ機能はサイトカイン依存性となるために、エフェクタ細胞とともにＩＬ− ２を注入する必要がある。分化エフェクタ細胞が関与するいずれも養子免疫療法プロトコールも、ＩＬ−２が使用される。ＩＬ−２の使用に伴う重大な毒性のために、末期癌患者の治療やＡＩＤＳ患者におけるウィルス感染治療への養子免疫療法適用は制限されてきた。養子免疫療法とそれの癌治療への使用ヒトにおける養子免疫療法についての最初の試みでは、新鮮な腫瘍を溶解する能力によって機能的に定義されている免疫エフェクタ細胞であるリンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞が用いられた。ＬＡＫ細胞は、末梢血単核球が生体外で高濃度のＩＬ−２に曝露された時に産生される（例：Grimm etal.(1982)J.E xp Med.155 :1832）。癌患者治療に使用するＬＡＫ細胞を得るには（米国特許４６９０９１５号参照）、癌患者から白血球を取り出し、それを３〜６日間にわたって高濃度のＩＬ−２に曝露することで、細胞の一部が分化しＬＡＫ細胞となる。得られた不均質細胞群を、高全身用量のＩＬ−２との併用でドナーに再注入する。前述のように、高全身用量のＩＬ−２は非常に毒性が高く、それに充分耐性でない。ＬＡＫ細胞の効力を高める方法が開発されている。生体外での分化段階時にＩＬ−２とともにＬ−アミノ酸を加えると得られる細胞のＬＡＫ活性が４〜５倍高くなることが認められている（例えば米国特許４８４９３２９号参照）。ＩＬ−２およびオルニチン・デカルボキシラーゼ阻害薬とともにＬＡＫ細胞を投与すると、治療の有効性が高まる（米国特許５００２８７９号参照）。その方法のＬＡＫ分化段階時にリンパ球を抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に曝露することで、抗腫瘍活性の高いエフェクタ細胞が得られ(米国特許５３２６７６３号)、ＬＡＫ分化段階で、ＩＬ− ２を用いた場合と用いない場合のいずれにおいてもＩＬ−７を使用することによって、より強力なＬＡＫエフェクタ細胞を得ることもできる（米国特許５２２９１１５号参照）。ＩＬ−２とともにＧＭ−ＣＳＦを投与することによっても、ＬＡＫ活性が高くなることが報告されている（TakahaShi，et al.(1995)Jap.J.Can cer Res .86:861参照）。しかしながら、いずれのプロトコールにおいても、ＩＬ −２の投与が必要である。末期癌患者、特には悪性黒色腫患者におけるＬＡＫ細胞を用いる養子免疫療法の初期の臨床結果では、２１〜４４％という応答率が報告されている（例えばRo senburg et al.(1985)N.Engl.J.Med．313:1485およびRosenburg et al（1987）N .Engl.J.Med .316：889参照）。より最近のII相治験の結果は、０〜３３％という広い範囲の応答率を示しているが、これもまだ有望な結果である（例えばDilman et al.(1991)J.Clin.Oncol.9:1233;Thompson，J.A.et al .(1992)J.Clin.Oncol.10:961;Foon et al.(1992)J.Immunother.11：1984;Koretzet al.(1991)Arch.Surg.126:898参照）。応答率における差は、部分的には、投与されたＬＡＫ細胞およびＩＬ−２の用量変動、ならびに患者が異なることにより生じたＬＡＫ細胞の不均質群の殺腫瘍活性の差によるものである。養子免疫療法のためのＬＡＫ細胞の比較的均一な群を得る方法が開発されている（米国特許５０５７４２３号参照）。米国特許５０５７４２３号に記載の方法では、最初に末梢血単核球からのＬＡＫ原種細胞（ＬＧＬ）群の精製を行う。次に、そのＬＧＬ細胞をＩＬ−２に曝露して、大部分のＬＧＬをＬＡＫ細胞に分化させる。得られたエフェクタ細胞はＡ−ＬＡＫとして知られ、ヌードマウスにおけるヒト癌を殺す上で有効であることが明らかになっている（Sacchi(1991)et a l ．Int.J.Cancer 47:784;Boiardi et al．(1994)Cancer Immunol.Immunoth.39:1 93参照）。しかしながら、十分な数のＡ−ＬＡＫをヒトから得ることは極めて困難である。支持細胞を用いることで生体外増殖を向上させたとしても、約６０％の癌患者からのＡ−ＬＡＫ培養において、増殖は不十分であることが示されている（Sedlmayr，et al.(1991)J.Immunother .10:336参照）。別の養子免疫療法プロトコールは、癌患者への自己腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の投与を含む。ＴＩＬ細胞は、動物実験においてＬＡＫ細胞より殺腫瘍力が強いが、患者治療ができるだけ形成するのは困難で、経費を要する。ＴＩＬ細胞は、固形腫瘍においてインビボで分化した自己エフェクタ細胞である（癌の養子免疫療法のためのＴＩＬ細胞形成方法について報告している米国特許５１２６１３２号参照）。ＴＩＬ細胞は、患者から腫瘍細胞を採取し、腫瘍検体に浸潤するリンパ球を単離し、そのＴＩＬ細胞をＩＬ−２の存在下に生体外で成長させ、その細胞をＩＬ−２とともに患者に再注入することで得られる。このプロトコールを用いて評価可能な癌患者における応答率が６０％であることが報告されている（Rosenburg et al.(1988)N.Engl.J.Med.319:1676参照）。別の研究では、２３％という応答率が報告されている（Dillman et al.(1991)Cancer 68:1参照）。しかしながら、養子免疫療法プロトコールで使用するのに十分な数のＴＩＬ細胞を常に増殖させることは困難であった。さらに、ＴＩＬ培養由来の免疫細胞種は、極めて変動が大きい。腫瘍検体から回収される細胞には、活性および効力が異なる純粋もしくは混合の細胞群が含まれている。一部の細胞はＭＨＣ制限抗腫瘍細胞溶解活性を有して得られ、一部はＭＨＣ非制限抗腫瘍細胞溶解活性を有して得られ、一部は抗腫瘍細胞溶解活性を持たずに得られる。さらに、黒色腫由来の培養以外では、ＴＩＬ細胞の培養によって、固形腫瘍患者から腫瘍特異的細胞が得られるのは希であり、転移黒色腫患者で腫瘍特異的細胞が得られるのは約５０〜７５％からに過ぎない。ＴＩＬ細胞療法はＩＬ−２注入に伴う極度の毒性に関連することから、治療の効力を高めるための努力が行われてきた。例えば、ＩＬ−２とともにＩＬ−１０を加えることで、マウスにおけるＴＩＬ細胞の抗腫瘍機能が高くなることが明らかになっている（Yang et al(1995)J.Immunol.155:3897参照）。腫瘍部位でのＩＬ−６濃度の上昇によっても、マウスからのＴＩＬ細胞の抗腫瘍活性が高くなることが明らかになっている（Marcus et al.(1994)J.Immunoth.Emphasis Tumor I mmunol .15:105参照）。ＴＩＬ細胞の抗腫瘍活性は、ＩＬ−１の存在下に抗ＣＤ３ｍＡｂによって腫瘍排出性リンパ節細胞を活性化することによっても向上する（Hammel et al．(1994)J ．Immunoth.Emphasis Tumor Immunol.16:1 参照）。腫瘍浸潤物または腫瘍排出性リンパ節由来の細胞のエフェクタ機能には変動があるため、癌の養子免疫療法で使用するための腫瘍反応性免疫細胞の生体外感作を促進する方法を開発すべく努力が行われている。乳癌患者の細胞浸潤物に存在する前駆細胞からの腫瘍抗原特異的なＭＨＣ制限ＣＴＬが、組換えアビポックスＭＡＧＥ−１（ある種の腫瘍に存在するマーカー）とともに前駆細胞をインキュベーションすることで生成され、それによって、ＭＡＧＥ−１特異的ＣＴＬが形成される（ＭＡＧＥ−１および他のＭＡＧＥ抗原は、腫瘍細胞で発現される抗原である；Toso et al.(1996)Cancer Research 56:16参照；米国特許５５１２４４４号も参照）。強力なＭＨＣ制限ＣＴＬを得るための生体外での別の感作法では、黒色腫患者からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、黒色腫関連抗原であるｇｐ１００の合成ペプチドを適用した照射自己ＰＢＭＣとともにインキュベーションする（Salgaller et al.(1995)Cancer Research 55:4972参照）。癌の養子免疫療法においてＴＩＬ細胞に代わるものとして「ＡＬＴ」細胞がある。この細胞は、ＣＴＬ活性を有する生体外で活性化された末梢血リンパ球である。その細胞は、予め調製しておいた一方向混合リンパ球培養液由来のＩＬ−２を含む上清中で、あるいは抗ＣＤ−３ｍＡｂで刺激した前記リンパ球培養液から回収したサイトカイン豊富な自己上清を用いることで、活性化される。１日１回のシメチジンの経口投与（腫瘍関連サプレッサ活性を低下させるため）との併用で月１回のＡＬＴ細胞注入を行うことで、腎細胞癌および黒色腫患者において生存期間が大幅に延長し、永続的な腫瘍応答が誘発される（Graham et al（1993）Semin.Urol ．11:27およびGold eta1.(1996)J.Surg.Res.59:279）。癌の養子免疫療法に、他のエフェクタ免疫細胞が使用または提言されている。例えば、ＰＷＭ−ＡＫ細胞が癌の養子免疫療法の候補細胞として提言されている。これらのエフェクタ細胞は、ＬＡＫ細胞と同様の活性を有するアメリカヤマゴボウ分裂促進物質活性化ＰＢＭＣである（Ohno et al.(1994)Int.J.Immunopharm .16:761参照）。ヒト活性化マクファージ（ＭＡＫ）も、癌の養子免疫療法におけるエフェクタ細胞として提案されている。インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）による活性化によって、ＭＡＫ細胞が末梢血から分化され、動物における実験的腫瘍の退行を起こすことが明らかになっているが、ヒトにおける明瞭な治療応答は示されていない（Barthole yns et al.(1994)Anticancer Research 14:2673参照）。悪性腫瘍の養子免疫療法の使用のために、活性化ナチュラルキラー細胞（ＡＮＫ）も提案されている。ＡＮＫ細胞は、ＣＤ５／ＣＤ８をコーティングしたフラスコで末梢血幹細胞を選択して、単球またはＮＫ前記細胞豊富な群を得て、その細胞を高濃度のＩＬ−２で処理することで得られる。ヒト由来のＭＨＣ非制限ＣＴＬクローン（ＴＡＬＬ −１０４）も、ＩＬ−１２と併用した場合に、癌治療のための養子免疫療法プロトコールでの使用が有望であることが明らかになっている（Cesano et al(1994)J.Clin.Invest.94 :1076参照）。癌治療のための養子免疫療法プロトコールにおけるＭＡＫ、ＡＮＫおよび他の単核食細胞の使用に対する関心が高くなって、向流遠心懸濁分離法によって、大量の機能性ヒト循環血単球を再現性良く回収する改良法が開発されている（Faradiji et al(1994)J.Immunol.Methods174:297）。癌治療のための新たな養子免疫療法戦略は、患者血液から樹枝状細胞などの抗原提供細胞を単離および／または発生させ、その細胞に腫瘍断片もしくは抗原性ペプチドを適用し、次に細胞を患者に戻すものである（Grabbe et al．(1995)Immunol ．Today 16:117参照）。成人の血液中の前駆細胞から多数の樹枝状細胞を得る方法も報告されている（Romani et al.(1994)J.Exp.Med.1 80 :83およびBernhard et al.(1995)Cancer Res.55:1099）。養子免疫療法およびウィルス疾患治療へのその使用免疫細胞養子免疫療法の別の利用分野は、ウィルス疾患の治療である。ウィルス特異的なＣＤ８⁺およびＣＤ４⁺エフェクタ細胞を用いる養子免疫療法プロトコールが、ＣＭＶ、ＥＢＶおよびＨＩＶ感染の治療に向けて開発されている（Ridd ell et al.(1995)Ann.Rev.Immunol.13:545;van Lunzen et al.(1995)Adv.Exp.Me d.Biol .374:57;K1imas et al.(1994)AIDS 8:1073参照）。これらのプロトコールでは、ＡＩＤＳ患者の末梢血からのＣＤ⁺８Ｔ細胞の精製、フィトヘマグルチニンおよびＩＬ−２を加えてのその細胞の増殖、ならびにＩＬ−２注入との併用での患者への細胞の再注入が行われる（Whiteside et al.(1993)Blood 81:2085;Kl imas et al.(1994)AIDS 8:1073; Riddell et al.(1993)Curr.Opin.Immunol.5.:484;Torpey et al.(1993)Clin.Imm unol.Immunopath .68:263;Ho et al.(1993)Blood 81:2093;Riddell et al.(1992)Science 257:238参照）。インビトロでの免疫細胞成長方法大多数の養子免疫療法プロトコールにおいて、臨床的に有効な（すなわち、治療上十分な）注入のための量の細胞を成長させることができないことが妨げとなっている。別の問題としては、インビボでのＬＡＫ活性およびＣＴＬ活性を維持するのに必要な高用量ＩＬ−２を投与することで重大な毒性が生じるという問題がある。養子免疫療法向けの細胞成長を改善し、ＩＬ−の全身投与に必要な用量を低減する方法がいくつか報告されている。それらの活性を向上させようとする努力で、プロトコールからＩＬ−２をなくす手段を提供するものはなかった。抗ＣＤ−３ｍＡｂで活性化され、中等度の量のＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ）とともに増殖させたＴＩＬ細胞を、比較的毒性の低い全身用量のＩＬ−２を用いる養子免疫療法プロトコールで使用して奏功している（Goedegebuure et al.(19 95)J.Clin.Oncol.13:1939参照。Hatsumura et al.(1994)Cancer Research 54:27 44も参照）。低用量のＩＬ−２とともに抗ＣＤ−３ｍＡｂをインビボで投与することも、全身ＩＬ−２の必要量を低減する別途の養子免疫療法戦略として提案されている（Nakajima et al.(1994)Proc.Natl .Acad.Sci.U.S.A ．91:7889参照）。回転式の組織培養バッグ中で、固定化抗ＣＤ３ｍＡｂおよびＩＬ−２を用いて、ヘルパー機能および細胞溶解機能を有するＣＤ４⁺細胞を増殖する方法も報告されている(Nakamura et al.(1993)Br.J.Cancer 67:865参照)。リポ多糖類（ＬＰＳ）活性化Ｂ細胞と抗ＣＤ３ｍＡｂで活性化した抗腫瘍エフェクタ細胞を共培養することも、養子免疫療法のための細胞を成長させる別法として提案されている（Okamoto et al.(1995)Cancer Immunol.Immun oth .40:173参照）。これらの細胞はいずれも、その後に低用量のＩＬ−２とともに増殖される。比較的低用量のＩＬ−２存在下にＣＤ３に対するｍＡｂおよびＣＤ２８に対するｍＡｂを組み合わせることで、ＴＩＬ細胞の効果的増殖が誘発される（Mulder et al.(1995)Cancer Immunol Immunoth.41:293参照）。合成ペプチドによるインビトロ刺激によって生じる抗腫瘍ＣＴＬを、低用量ＩＬ−２（３０ｕ／ｍＬ）を含む培地で４ヶ月という長期間にわたって成長させることができる（Salgalle r et al.(1995)Cancer Research 55:4972参照）。ＩＬ−７は、反復刺激を行わなくとも長期間にわたってＣＴＬ成長を支持することが明らかになっている（Lynch et al.(1994)J.Exp. Med .179:31参照）。低濃度のＩＬ−２を用いての、人工的キャピラリ培養系でのＴＩＬ細胞の成長も行われている（Freedman et al.(1994)J.Immunoth.Emphasis Tumor Immunol .16(3):198参照）。免疫細胞増殖における外因性ＩＬ−２の必要性は、細胞を遺伝的に変えることによってのみなくすことができている（例：米国特許５４７０７３０号）。しかしながら、遺伝子的に未修飾の細胞を成長させるいずれの方法でも、養子免疫療法プロトコールで使用する細胞の分化および／または成長を促進するのに外因性ＩＬ−２が必要である。いずれの方法においても、そのような細胞の活性を維持するには、ＩＬ−２の全身投与が必要である。末期患者における養子免疫療法の効力が示されたとしても、養子免疫療法プロトコールで必要なＩＬ−２の全身用量の重大な毒性、個々の患者由来の細胞組成物のエフェクタ機能における変動性、ならびに臨床的に有効な数のエフェクタ細胞を増殖する上での問題のために、養子免疫療法の使用が制限されている。詳細には、外因性ＩＬ−２が必要であるために、養子免疫療法で使用される細胞は、限られた期間にわたって機能を発揮し得るエフェクタ細胞に限定される。この治療法の可能性を利用するためには、全身ＩＬ−２投与の必要性ならびに大量の細胞を得る上での問題を克服する必要がある。そこで、改良された養子免疫療法が必要とされる。従って本発明の目的は、そのような改良された方法を提供することにある。詳細には、本発明の目的は、外因性ＩＬ−２を使用しない養子免疫療法プロトコールで使用する免疫細胞を増殖する方法を提供することにある。本発明のさらに別の目的は、養子免疫療法プロトコールで使用する、調節細胞を含む組成物などの細胞組成物の大きいアレイ（array）を与える方法を提供することにある。本発明のさらに別の目的は、臨床的に有効な数のそのような細胞を含む組成物を製造する手段を提供することにある。細胞組成物アレイが利用できるようになれば、非常に多様な疾患および免疫機能変化に対する養子免疫療法プロトコールを作ることができる。従って、本発明の別の目的は、各種障害を治療する方法および免疫機能を変える方法を提供することにある。発明の概要臨床的に有効な数の免疫細胞を含む組成物が提供される。その組成物は、調節免疫細胞、エフェクタ免疫細胞またはそれらの組み合わせたものを含有する。詳細には、養子免疫療法（本明細書においては、自己細胞療法（ＡＣＴ）と称する）で使用される臨床的に有効な数の調節免疫細胞（特に、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞）を含む組成物が提供される。養子免疫療法で使用される臨床的に有効な数の免疫細胞を含む組成物を与える方法が提供される。その方法では、ＩＬ−２を使用する必要がない。結果的に、増殖免疫細胞では、活性を保持したり、生存性を維持するのにＩＬ−２が必要ない。さらに、感染性疾患および自己免疫疾患などの障害の治療方法も提供される。さらに、臓器もしくは組織の移植を可能とする免疫抑制の治療方法ならびにワクチンプロトコールの強化方法が提供される。治療方法においては、この組成物を使用する。調節細胞の上記組成物は、支配的な調節細胞群を変えることで、局所的または全身的に、患者の免疫調節均衡を変える手段を提供するものである。多くの疾患状態が、通常は調節免疫細胞によって維持される免疫系の調節された均衡の喪失を伴って起こることから、臨床的に有効な数の調節免疫細胞が利用できることで、その不均衡状態を改善する手段が提供される。それが可能となることで、各種疾患の治療が行える可能性が出てくる。臨床的に有効な数のエフェクタ免疫細胞および調節免疫細胞を得る方法が提供される。詳細には、臨床的に有効な数のＴｈ１およびＴｈ２などの調節免疫細胞の実質的に均質な群、ならびにＴｈ１様およびＴｈ２様の単核細胞群を得る方法が提供される。外因性ＩＬ−２を必要としないＣＴＬ、ＬＡＫおよびＴＩＬなどの臨床的に有効な数のエフェクタ細胞を含む組成物を得る方法が提供される。さらに、Ｔ細胞種の相対的欠乏が認められる疾患状態の治療に対する臨床的に有効な量の（すなわち、治療上有効な数、代表的には１０⁹超、好ましくは１０¹ ⁰ 超）自己特異的Ｔ細胞種を得る方法も提供される。詳細には、感染疾患およびアレルギー疾患などの（これらに限定されるものではないが）Ｔｈ２サイトカインプロファイルが支配的である疾患状態の患者からの自己生体外由来Ｔｈ１Ｔ細胞、ならびに慢性炎症および自己免疫疾患などの（これらに限定されるものではないが）Ｔｈ１支配的疾患での自己生体外由来Ｔｈ２Ｔ細胞を、ＡＣＴプロトコールで使用する上で臨床的に有効な数で得る方法が提供される。得られた細胞組成物が提供され、その組成物のＡＣＴプロトコールでの使用が提供される。さらに、移植術のための特異的免疫抑制を行うよう計画されたＡＣＴプロトコールで使用するための、ドナー臓器に対して感作した臨床的に有効な数の生体外由来抗原特異的Ｔｈ２細胞が提供される。ウィルス感染からの保護を提供することでウィルス予防接種戦略として役立つよう計画されたＡＣＴプロトコール向けの、臨床的に有効な数の生体外由来ウィルス特異的Ｔｈ１細胞も提供される。ヒト疾患を治療および予防するための自己細胞療法（ＡＣＴ）プロトコールでの調節免疫細胞の使用方法が提供される。患者における免疫調節の均衡を変えることで、調節細胞における不均衡が存在する疾患を治療するよう計画されたＡＣＴプロトコールが提供される。詳細には、患者における免疫調節の均衡を変えることで、調節細胞における不均衡が存在する疾患を治療するよう計画されたＡＣＴプロトコールが提供される。その方法では、患者から末梢血単核球を採取し、次に、適切な活性化とそれに続く、臨床的に有効な数の増殖細胞種が産生される（代表的には１０⁹、好ましくは１０¹⁰、より好ましくは１０¹¹以上であって、細胞の種類および最終的用途によって決まる）条件下で細胞表面特異的蛋白または蛋白による分裂促進刺激による細胞の増殖を行う。回収細胞がインビホで分化しないか、またはさらに分化させる必要がある場合は、回収後であって増殖前において、その方法では、少なくとも一部の細胞が調節細胞もしくはエフェクタ細胞あるいは他の細胞種に分化する条件下で、細胞を活性化し、生体外での分化を起こす。次に、得られた細胞をドナーに再注入して治療を行う。所望の細胞を自己移植に先だって精製して、より均質な群を提供することができる。必要な場合には、適切な量のサイトカインの存在下に、分裂促進物質によって細胞を活性化することで、単核細胞の分化を行う。この活性化は、特定の表現型の形成につながる環境条件下で、サイトカインもしくは分裂促進物質あるいは他の成長促進剤などの作用物質を使用することで行うことができる。例えば、細胞をＩＦＮ−γの存在下に活性化すると、Ｔｈ１細胞の分化が起こる。細胞をＩＬ −４の存在下に活性化すると、Ｔｈ２細胞の分化が生じる。そのような活性化物質には、ポリクローナル活性化のためのモノクローナル抗体、ならびにＭＨＣ分子の関連で提示される特異的活性化のための天然もしくは合成抗原などがある。増殖は高い細胞密度を得ることができる条件下で行なわれる。それによって内因性サイトカインが、成長する細胞群付近に保持され、およびＩＬ−２または同時注入を必要とするような他のサイトカイン以外の１以上の分裂促進性モノクローナル抗体その他の細胞表面特異的蛋白の存在下に保持される。そのような条件は、好ましくは、細胞を中空繊維（ＨＦ）バイオリアクタで成長させることで得られる。得られた細胞を用いる各種障害の治療方法も提供される。これらの方法を行う上で、欠乏しているか相対的に量の少ない種類の細胞を患者に注入する。例えば、患者から末梢血単核球を採取し；治療上有効な数の細胞を含む組成物が得られる条件下に細胞を増殖させ；得られた細胞組成物を患者に注入することで、感染性疾患または腫瘍を治療することができる。好ましい実施態様においては、その細胞は、効果が望まれる部位付近にある固有の抗原に対して特異的であるか、あるいは病原体もしくは治療対象の腫瘍に特異的である。他の好ましい実施態様では、病原体もしくは腫瘍に対して特異的である細胞毒性CD８⁺Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などのエフェクタ細胞を注入するか、あるいは調節細胞と同時注入する。さらに、移植術向けの特異的免疫抑制法が提供される。その方法では、ドナー臓器に対して感作した臨床的に有効な数の生体外由来の抗原特異的Ｔｈ２細胞の投与を行う。好ましい実施態様において、細胞は、移植される組織もしくは臓器に固有の同種抗原または抗原に対して特異的である。さらに、予防接種法およびワクチンとして使用される組成物が提供される。詳細には、注入することでウィルス感染からの保護を提供して、ウィルス予防接種戦略として役立つ、臨床的に有効な数の生体外由来ウィルス特異的Ｔｈ１細胞もしくはＴｈ２細胞（またはＴｈ１様またはＴｈ２様の細胞群）から、ワクチンの製剤を行う。自己の生体外由来増殖調節免疫細胞を注入することで、患者の免疫調節均衡を変える方法が提供される。この方法には、患者から末梢血単核球を採取する段階 ;細胞の少なくとも一部(１個であっても)を所望の調節細胞に分化させる条件下に、細胞を生体外で活性化させる段階；調節細胞を増殖させる段階；ならびに増殖した調節細胞をドナーに注入して、免疫調節均衡に影響を与える段階が含まれる。詳細には、注入において、ＩＬ−２などのサイトカインの同時注入は行わない。上記の方法は、調節免疫細胞における不均衡が特徴である障害の治療に有用である。具体的には、本明細書で提供される方法を用いて、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、クローン病、自己免疫甲状腺疾患および炎症性腸疾患など（これらに限定されるものではないが）の障害；ヒト免疫不全ウィルス、単純庖疹ウィルス、サイトメガロウィルスおよび肝炎ウィルスによる感染などの慢性感染疾患；喘息などのアレルギー性および他の過敏性の障害における慢性的炎症の治療を提供することができ、臓器および組織の移植術における特異的免疫抑制法ならびに予防接種における免疫保護を提供する方法が得られる。好ましい実施態様においては、調節免疫細胞は、ＣＤ４⁺もしくはＣＤ８⁺表現型を持つＴｈ１、Ｔｈ２もしくはＴｈ３細胞である。その細胞は好ましは、「記憶」表現型（すなわち、ＣＤ４５ＲＯ⁺、Ｌ−セレクチン^-）を持ち、それによって細胞が炎症部位に到達できるようにするものである。好ましくは、細胞の調節効果が望まれる部位に存在する固有の抗原に特異的な細胞を選択的に増殖することで、その細胞が身体の限局された領域で調節機能を行うようにする。例えば、慢性関節リウマチの治療においては、関節組織にのみ存在するＩＩ型コラーゲンに特異的な調節細胞が好ましい。糖尿病治療においては、移植された島細胞の拒絶を防止するために、インシュリンに特異的な調節細胞が好ましい。他の実施態様においてその細胞は、増殖を促進するためのＩＬ−２を用いずに、臨床的に有効な（すなわち、治療上有効な）数まで増殖させておいたエフェクタ細胞である。さらに、外因性ＩＬ−２を用いずに、免疫細胞の増殖を行う方法も提供される。免疫細胞の増殖は好ましくは、培地に１以上の分裂促進性ｍＡｂを加えることで起こす。免疫細胞は好ましくは、それが高密度で成長するような条件下に増殖させる。そのような高密度は、内因的に産生されるサイトカインを保持する繊維の分子量カットオフを持つ中空繊維バイオリアクタ中で細胞を成長させることで得ることができる。そのような分子量カットオフは好ましくは１４０００ダルトン未満、より好ましくは６０００ダルトン未満である。さらに、HIV⁺患者から得られたウィルス除去したＣＤ４⁺細胞の臨床的に有効な群を得る方法が提供される。得られるウィルス除去ＣＤ４⁺細胞をドナー患者に再注入することで、ＨＩＶの治療を行う。その細胞は、抗ＨＩＶエフェクタ細胞と同時注入することもできる。好ましい実施態様の詳細な説明Ａ．定義別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術的・科学的用語はいずれも、本発明が属する技術分野における当業者が一般に理解するものと同一の意味を有するものである。別段の断りがない限り、本明細書で引用の特許および刊行物はいずれも、その全内容が引用によって本明細書に組み込まれるものとする。本明細書で使用される場合、養子免疫療法または細胞養子免疫療法という用語は、免疫学的に活性な細胞の投与が関与する治療方法を指す。その治療で使用される細胞は通常、治療対象者（自己投与）または別の個人（同種異系）から静脈穿刺または白血球分離によって得られる。本明細書において、自己治療とは、自己細胞療法（ＡＣＴ）を指す。本明細書で使用される場合、自己細胞療法（ＡＣＴ）とは、免疫系の細胞を対象者から採取し、生体外またはインビトロで培養および／または操作し、治療の一環として同一対象者に注入する治療方法である。本明細書で使用する場合、活性化蛋白とは、Ｔ細胞群と接触した場合に細胞の増殖を起こす分子である。Ｔ細胞が増殖するには通常、２つの信号が必要である。そこで、活性化蛋白には、第１の抗原刺激信号および第２の共刺激（co-stimu latory）信号を含む必要信号を提供する蛋白の組み合わせを含むものである。第１の信号には、抗ＣＤ３ｍＡｂ、抗ＣＤ２ｍＡｂ、抗ＴＣＲｍＡｂ、ＰＨＡ、ＰＭＡおよび他のそのような信号などの信号剤が必要である。第２の信号には、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４０Ｌ、サイトカインおよび他のそのような信号などの１以上の信号物質が必要である。そこで、活性化蛋白には、細胞表面蛋白特異的モノクローナル抗体、細胞表面蛋白に対するリガンドを含む融合蛋白、そのような細胞表面蛋白のリガンド、あるいは単核細胞上の細胞表面受容体と特異的に相互作用して間接的もしくは直接的にその細胞の増殖を引き起こす分子など（これらに限定されるものではない）の分子の組み合わせたものが含まれる。本明細書において、エフェクタ細胞を増殖させる場合、活性化蛋白は、増殖後の細胞の生存性および機能を実質的に維持する必要のないものから選択される。そこで例えば、エフェクタ細胞増殖に関しては、ＩＬ−２は本明細書における活性化蛋白ではない。前述のように、本発明の方法は、ＩＬ−２を必要としない細胞、特にはエフェクタを得る手段を提供するものであり、従って好ましい実施態様においては、活性化剤としてＩＬ−２を使用しない。本明細書で使用される場合、分裂促進性モノクローナル抗体は、直接または間接に細胞と接触した時にＴ細胞分裂促進のための２つの必要な信号のうちの一つを提供する抗体である活性化蛋白である。一般に、そのような抗体は、細胞表面受容体に特異的に結合することで、信号伝達を誘発して、それが細胞増殖につながるものである。好適な分裂促進抗体は、単独であるいは特異的エフェクタ細胞数を多くできるようにするために組み合わせて選択された抗体を調べることで、経験的に確認することができる。好適な分裂促進抗体またはそれの組み合わせたものにより、所定の時間、代表的には１〜１０日間で、その抗体不在下での細胞数と比較して、細胞数が約５０％以上、好ましくは約１００％以上、より好ましくは１５０〜２００％以上増加する。本明細書で使用される場合、成長促進物質とは、何らかの形で細胞の分化、活性化、成長および／または分裂に関与するかもしくはそれを誘発する可溶性もしくは不溶性の物質である。成長促進物質には、分裂促進物質およびサイトカインなどがある。成長促進物質の例としては、線維芽細胞成長因子、脱無機イオン骨から精製されたオステオゲニン（例：Luyten et al.(1989)J.Biol.Chem.264:133 77）、上皮成長因子、腫瘍遺伝子の産生物、インターロイキン、コロニー刺激因子、ならびに当業者には公知の他のそのような因子などがある。組換えインターロイキンなどの組換え成長促進物質が、本発明の方法での使用に好適である。そのような蛋白をコードするＤＮＡをクローニングする手段およびそのようなクローニングＤＮＡから生理活性蛋白を製造する手段は、当業界の技術の範囲内である。例えば、インターロイキン１ないし６およびそれらの組み合わせたものを用いて、所望のリンパ球系細胞の小群を増殖させることができる。本明細書で使用する場合、分裂促進物質とは、細胞の分裂を誘発する物質であり、詳細には、本明細書で使用される場合、抗原依存的な形でリンパ球群を刺激して、増殖ならびにエフェクタ細胞または調節細胞への分化を行う物質である。そのような物質の例としては、レクチンおよびリポ多糖類などがある。本明細書で使用される場合、サイトカインとは、同じ細胞または他の細胞に影響を与える細胞によって産生されるリンフォカインまたはモノカインなどの因子である。本発明で使用される場合、リンホカインとは、活性化Ｔリンパ球によって産生・分泌され、同じ種類の細胞または他の種類の細胞に影響を与える物質である。腫瘍壊死因子、インターロイキンおよびインターフェロンは、リンホカインの例である。モノカインは、単球またはマクロファージによって分泌されて、同じ細胞または他の細胞に影響を与える物質である。本明細書で使用される場合、調節免疫細胞とは、一定のサイトカイン産生プロファイルを持ち、そのようなサイトカインプロファイルがエフェクタ機能に直接介在しない単核細胞である。調節免疫細胞は、免疫応答を制御もしくは指示する能力を有するが、応答においてエフェクタ細胞としては働かない単核細胞である。調節免疫細胞は、それが産生するサイトカインによって調節機能を行い、そのサイトカイン産生プロファイルによって分類することができる。例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生するが、ＩＬ−４を産生しない調節免疫細胞は、「Ｔｈ１」細胞と称される。ＩＬ−４およびＩＬ−１０を産生するが、ＩＦＮ−γを産生しない調節免疫細胞は、「Ｔｈ２」細胞と称される。ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γを産生するが、ＩＬ−２やＩＬ−４を産生しない調節免疫細胞は、「Ｔｈ３」細胞と称される。Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ３サイトカインプロファイルを生じる細胞は、ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺細胞群にある。ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γを産生する細胞は、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞の前駆細胞であると考えられ、「Ｔｈ０」細胞と称される。大半のＴｈ１サイトカインを産生する細胞群は「Ｔｈ１様」と称され、大半のＴｈ２サイトカインを産生する細胞群は「Ｔｈ２様」と称され、大半のＴｈ３サイトカインを産生する細胞群は「Ｔｈ３様」と称される。そこで、各組成物は、不均質な細胞群を含んでいるが、サイトカインに関しては、特定のＴｈサブセットと実質的に類似する性質を有する。このＴ細胞リストは単に例示であるに過ぎず、本発明の方法によって臨床的に有効な数まで増殖可能なＴ細胞の他の定義可能な群、アレイまたはサブタイプは本発明に含まれるものとする。本明細書で使用される場合、臨床的に有効な数の免疫細胞群を含む組成物とは、少くとも１０⁹個、好ましくは１０⁹個超、より好ましくは少くとも１０¹⁰個、最も好ましくは１０¹⁰個超の細胞を含み、その細胞の大部分は、ＬＡＫ、ＴＩＬおよびＣＴＬ細胞などのＴｈ１細胞もしくはＴｈ２細胞またはエフェクタ細胞のような所定の調節機能もしくはエフェクタ機能を有する組成物である。好ましい細胞数は、細胞の種類と同様、組成物の最終用途によって決まるものである。例えば、特定の抗原に対して特異的なＴｈ１細胞が望まれる場合、その群は、５０％超、好ましくは７０％超、より好ましくは８０％超、最も好ましくは９０〜９５％超のそのような細胞を含む。細胞群がポリクローナル増殖から得られたものである場合、その均質細胞は、特定の種類またはサブタイプの細胞である。本発明で提供される用途では、細胞の容量は、好ましくは１リットル以下、より好ましくは５００ｍＬ以下、さらに好ましくは２５０ｍＬ以下、最も好ましくは約１００ｍＬ以下とする。本明細書で使用される場合、支配的とは、約５０％超を意味する。本明細書で使用される場合、組み合わせ（物）とは、一緒にあるいは連続的に使用される組成物または混合物などの２個の成分要素を指す。組み合わせ物は、成分の混合物として、あるいはキットの形などでパッケージ化されたまたは一緒に提供される別個の成分として提供され得る。本明細書で使用される場合、エフェクタ細胞とは、病原体または腫瘍細胞を直接排除する能力を持つ単核細胞である。そのような細胞には、ＬＡＫ細胞、ＭＡＫ細胞および他の単核食細胞、ＴＩＬ、ＣＴＬおよび抗体産生性Ｂ細胞ならびに他のそのような細胞などがあるが、それらに限定されるものではない。本明細書で使用される場合、免疫均衡とは、疾患のない状態にある各種免疫細胞の正常な比率および絶対数を指す。免疫均衡の回復とは、疾患または障害の治療を行うことで、調節免疫細胞種の比率とその数が正常な範囲内となるかもしくはそれに近い状態となって、治療対象の疾患もしくは障害の症状が緩解される状態への回復を指す。投与される細胞の量は、経験的に決めることができるか、あるいは好ましくは、疾患または障害の症状が軽減もしくは消失するまで患者に少量ずつの細胞を投与することで決定することができる。一般に初回用量は、１０⁹〜１０¹⁰個以上の細胞である。さらに用量は、所望の治療に応じて変わるものである。本明細書で使用される場合、治療上有効とは、疾患に関連する症状を緩解または何らかの形で軽減できるだけの量の細胞を指す。方法に関して使用される場合、その方法は、疾患に関連する症状を緩解または何らかの形で軽減するだけの効果を持つものである。本明細書で使用される場合、単核細胞またはリンパ様細胞(これらの用語は同義的に使用される)には、リンパ球、マクロファージおよびそのような細胞が存在する組織由来の単球などがある。一般に、リンパ様細胞は、治療対象者から採取する。リンパ様細胞は、腫瘍、末梢血またはリンパ様細胞を含有もしくは形成するリンパ節および脾臓などの他の組織から取ることができる。本明細書で使用される場合、インビトロまたは生体外で増殖した単核細胞またはリンパ様細胞の治療上有用な小群とは、リンパ様細胞を生体外で培養した時にリンホカインなどの成長促進物質に細胞を曝露することで増殖する細胞である。治療上有用な小群は調節細胞またはエフェクタ細胞であり、臨床的に有効な数の細胞、代表的には約１０⁹ 個以上の細胞を含むものであって、好ましくは１リットル以下の臨床的に有用な容量である（すなわち、注入用）。本明細書で使用される場合、治療上有効な数または臨床的に有効な数の生体外増殖細胞とは、そのような細胞を特定のＡＣＴ法で使用した場合に、少なくとも所望の治療効果を達成できるだけの細胞数である。代表的にはそのような数は、１０⁹個以上、より好ましくは１０¹⁰個以上である。正確な数は、細胞の種類によって決まり、さらには所期の標的もしくは結果によっても決まる。本明細書で使用される場合、中空繊維バイオリアクタまたは中空繊維バイオリアクタカートリッジには、哺乳動物細胞の成長に好適な外殻ケーシング、接触しているかまたは付近にある哺乳動物細胞の成長に好適な外殻内に入っている複数の半透過性中空繊維、ならびにその細胞とＥＣＳ細胞上清とを含むＥＣＳとを有するものである。中空繊維の内側は管腔と称され、キャピラリの外側と外部内面との間の領域は、キャピラリ外空間（ＥＣＳ）と称する。組織培養培地は繊維管腔を通って灌流し、その繊維を囲む外殻内にも入る。組織培養培地は、これら２つの区画において異なっている場合があって、それには免疫細胞の増殖を維持および開始することができる拡散性成分が含まれる。培地は貯液槽に入れて提供されて、そこから繊維を通ってポンプ送液される。流量は、加える圧力を変えることで変動させて制御することができる。ＥＣＳまたは灌流培地にはさらに、ＴＩＬ細胞もしくは調節細胞などの免疫細胞の１以上の小群の増殖または抑制を特異的に促進する有効量の１以上の成長促進もしくは抑制物質を含むこともでき、その場合、有効量とは、前記の特異的増殖を行えるだけの量を指す。本明細書で使用される場合、中空細胞繊維培養系には、中空繊維バイオリアクタだけでなく、そのシステムに媒体を灌流させるためのポンプ送液手段、培地を供給・回収する貯液手段、ならびに電子的な制御、記録または感知を行う装置などの他の構成要素などがある。中空繊維バイオリアクタは、中空外殻内に入っている複数の半透過性の管形状繊維が入ったカートリッジである。中空繊維リアクタおよび中空繊維バイオリアクタという用語は同義的に使用される。その方法に好ましい装置は、同時係属中で認められた米国特許出願０８／５０６１７３号に記載のものである。本明細書で使用される場合、ＥＣＳとは、キャピラリ外空間細胞上清を指す。ＥＣＳは、ＥＣＳ中にて細胞が成長している培地である。それには、培養免疫細胞によって産生された、あるいはＥＣＳもしくは組織培養培地に加えられた、細胞の分泌産生物、拡散性養分ならびにリンフォカインおよびサイトカインなどの成長促進もしくは抑制物質が含まれる。ＥＣＳに含まれる特定の成分は、そこに接種されるものだけでなく、選択される中空繊維の特性によって決まる。本明細書で使用される場合、組織培養培地には、哺乳動物細胞の生体外成長に好適な培地が含まれる。そのような培地の例としては、ＡＩＭ−Ｖ、ＲＰＭＩ１６４０およびイスコーブ（Iscove's）培地（GIBCO，Grand Island，N.Y.）などがあるが、これらに限定されるものではない。培地には、血清、血清蛋白、分裂促進性モノクローナル抗体などの成長抑制および成長促進物質、ならびに遺伝子操作または遺伝的修飾を受けた細胞を選択するための選択物質などの追加成分を補給することができる。本明細書で使用される場合、治療とは、状態、障害または疾患の症状を緩解その他の有益な形で変える方法を意味する。治療には、本発明の組成物の医薬的使用も含まれるものである。本明細書で使用される場合、ワクチンとは、ウィルス感染、癌その他の障害に対する予防、あるいはウィルス感染、癌その他の障害の治療を提供する組成物である。ウィルス感染、癌その他の障害に対する予防は、感染または腫瘍その他の病気を完全に予防するか、あるいは結果的に病気に感染したり冒された場合に、感染または腫瘍その他の病気の重度もしくは期間を軽減／短縮するものである。治療によって、１以上の症状の緩解または重度もしくは期間の軽減／短縮がある。本明細書で使用される場合、特定組成物の投与による特定の障害の症状の緩和とは、永久的か一時的かとは無関係に、組成物投与によるかまたはその投与に関連する可能性がある持続的もしくは一時的な軽減を指す。本明細書で使用される場合、実質的に純粋とは、実質的に均質であって、そのような純度を評価する上で当業者が使用するフローサイトメトリーなどの標準的な分析方法によって測定して、容易に検出できる不純物がないように思われるか、あるいはそれ以上精製を行っても、生理活性などその物質の物理的および化学的性質が検出可能な程度には変わらないと考えられるほど純粋であるように思われるだけ均質であることを意味する。免疫細胞を精製して実質的に純粋な群を得る方法は、当業者には公知である。しかしながら、実質的に純粋な細胞群は、サブタイプの混合物であることができ、純度とは、その群の活性プロファイルを指す。そのような場合、さらに精製を行うことで、細胞群の特異的活性が高まる可能性がある。本明細書で使用される場合、生理活性とは、細胞、組成物その他の混合物をインビボで投与することで生じる免疫細胞のインビボ活性または生理的応答を指す。そこで、生理活性には、そのような細胞、組成物および混合物の治療効果および医薬活性を含むものである。本発明で提供される方法および細胞の使用および／または試験において類似または等価な方法および材料を使用することができるが、好ましい実施態様について以下に説明する。Ｂ．エフェクタ細胞および調節免疫細胞宿主が抗原に遭遇すると、細胞媒介性または体液性の免疫応答をもたらすことができる。調節免疫細胞は、病原体に対する免疫応答の性質を制御するものである（Mosmann et al.(1986)J.Immunol.136:2348;Cherwinski et al .(1987)J.Exp.Med.166:1229; Del Prete et al.(1991)J.Clin.Invest.88:346 参照）。応答の種類が異なるのは、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の不均質性によるものである。ＣＤ４⁺細胞は、そのサイトカイン発現プロファイルに応じて細分することができる。これらの細胞は、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ３サイトカインを産生し得る共通の前駆細胞であるＴｈ０に由来する（Firestein et al.(1989)J.Immunol ．143:518参照）。前述のように、Ｔｈ１クローンは、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γ、リンフォトキシンその他の細胞媒介免疫に特徴的な遅発型過敏反応を促進する因子を産生する。これらの細胞はＩＬ−４やＩＬ−５を発現しない。Ｔｈ１細胞は、細胞媒介炎症反応を促進し、マクロファージの活性化、ＩｇＧ２ａへの免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプ切り替えを支持し、細胞毒性機能を活性化する。Ｔｈ２クローンは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ− １３などのサイトカインを産生することで、体液性免疫応答を起こし、さらにはアレルギー型応答をも促進する。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γは発現しない。Ｔｈ２細胞は、Ｂ細胞活性化、ＩｇＧ１およびＩｇＥアイソタイプへの切り替え、抗体産生を助ける（例えばMosmann et al.(1989)Annu.Rev.Immunol.7:145参照）。Ｔｈ３細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを産生する。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞によって産生されるサイトカインは、互いに阻害的である。Ｔｈ１サイトカインは、Ｔｈ２細胞の増殖を阻害し、Ｔｈ２サイトカインはＴｈ１サイトカイン合成を阻害する（例えばFiorentino et al.(1989)Med.170 :2081(1989)参照）。この交差調節により、病原体に対するＴｈ１またはＴｈ２免疫応答への偏りが生じ、その結果、感染に対する宿主の抵抗性または感受性が生じる。ある種の病原体は、主としてＴｈ１またはＴｈ２型の免疫応答によって最も効果的に制御されることから、感染時の適切な調節免疫細胞応答の形成は重要である（例えばSher et al.（1989）Ann.Rev.Immunol.46:111;Scott et al.(1991)Im munol.Today 12:346;Sher et al.(1992)Immunol.Rev.127:183;Urban et al.(199 2)Immunol.Rev.127:205参照）。例えば、ハンセン病（例えばYamamura et al.(1 991)Science 254:277参照）、ＡＩＤＳ（例えばClerici et al.(1993)Immunol.T oday 14.:107 参照）、トキソプラズマ（Sher et al.(1989)Ann.Rev.Immunol.46:111参照）、橋本甲状腺炎（例えばDel Prete et al.(1989)Autoimmunity 4:267参照）、バセドウ病（例えばTurner et al.(1987)Eur.J.Immunol. 17:1807参照）、移植（例えばBenvenuto et al.(1991)Transplantation 51:887参照）、Ｉ型糖尿病（例えばFoulig et al.（1991）J.Pathol.165:97参照）、多発性硬化症（例えばBenven uto et al.(1991)Clin.Exp.Immunol.84:97参照）、ならびに慢性関節リウマチ（例えばQuayle et al.(1993)Scand.J.Immumol.38:75参照）において、支配的な調節免疫応答と疾患感受性の間に相関が認められている。マウスにおける原生動物、ウィルスおよび真菌の感染に対するＴｈ１応答は抵抗性に関連し、Ｔｈ２応答は疾患に関連する。Ｔｈ２応答は、マウスにおけるある種の嬬虫感染を治癒し、ウィルス感染を増悪させる。Ｔｈ２応答は、ヒトにおけるＡＤＩＳおよび自己免疫疾患と相関し、アレルギー性障害および移植拒絶と関係していた。Ｔｈ３と称される別の調節細胞は、多量のＴＧＦ−βを産生し、多発性硬化症に類似の疾患からマウスを保護することができる（例えばChen et al .(1994)Science 265 :1237参照）。これらの応答の分類は経験的に決定することができ、報告されている（要約について、例えばMosmann et. al.(1996)Immunology Today 17:138 -146参照）。ＣＤ８⁺Ｔ細胞のサブセットは、Ｔｈ１またはＴｈ２サイトカインパターンを分泌することも知られている。ＣＤ８⁺細胞をＩＦＮ−γおよびＩＬ−２に曝露することで、Ｔｈ１細胞への分化が生じるが、ＩＬ−４は、Ｔｈ２細胞への分化を誘発する。Ｔｈ１ＣＤ８⁺細胞はウィルスに対する免疫応答における重要なエフェクタであると考えられるが、Ｔｈ２ＣＤ８⁺細胞は免疫抑制機能を有する。他の調節細胞は、上記の細胞の特性決定を行うのに使用されたものと同様の方法によって特性決定することができる。本明細書に記載のように、交差調節および疾患状態で認められる免疫不均衡により、調節細胞は、各種疾患の治療に対して治療効果を持つはずである。そのような使用は、動物モデルである程度示されているが、ヒトにおいての実現の可能性はなかった。例えば、ネィティブＴ細胞およびActinobacillus actinomycetem comitansについてのＴｈ２抗原特異的クローンとを併用で投与することで、ヌードラットにおける歯周病が改善されている（Eastcott et al.(1994)Oral Microbiol.Immunol.9:284(1994)参照）。抗原特異的Ｔｈ１細胞クローンは、原生動物Leishmania majorによる感染、トラコーマ病原体による性器感染およびマウスカンジダ症に対する保護を行うことが明らかになっている（Powrie et al.(1994)J.Exp.Med.179:589;Igietseme et al.(1993)Regional Immunity 5.:317;Romani(1991)Inf.Immun.59:4647参照）。さらに、Ｔｈ２細胞クローンが自己免疫ブドウ膜強膜炎を予防することが明らかになっている（Saoudi et al.(1993)Eur.J.Immunol.23:3096参照）。抗原特異的Ｔｈ２細胞クローンは、多発性硬化症の動物モデルを抑制することが明らかになっている（Chen et al.(1994)Science 265:1237参照）。ドナー特異的Ｔｈ２細胞は、移植における致死性の移植片対宿主疾患を軽減することができる（Fo wler et al.(1994)Adv.Bone Marrow Prug.Process.,Fourth Int.Sympos.，Wiley -Liss，Inc.，p.533参照）。Ｔｈ２活性が強化された精製Ｔ細胞も、動物におけるインシュリン依存性糖尿病様疾患を予防することが明らかになっている（Fowe ll et al.(1993)J.Exp.Med.177:627参照）。Ｔｈ２クローンは動物における養子免疫細胞移入試験で使用されているが、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞などの調節細胞は、ヒトにおけるＡＣＴプロトコールでは使用されていない。そのようなプロトコールは、そのような調節細胞を治療上有効な量で分化・生成できないために限界がある。しかしながら本発明の方法は、そのような臨床的に有効な量の細胞を生成する手段を提供し、それによって、障害を改善し、ワクチンを提供し、組織もしくは臓器の拒絶を抑制する手段を提供する。本発明の方法はさらに、ＩＬ−２不在下に、臨床的に有効な量の調節細胞およびエフェクタ細胞を生成する手段を提供するものでもある。さらに本発明では、免疫系を強化または回復させることで、ＡＩＤＳ治療などのＨＩＶ感染の治療に対して治療上有用な細胞を成長させる方法をも提供するものである（例えば実施例３および４参照）。Ｃ．調節細胞の生成方法ＡＣＴプロトコールで使用する調節細胞を得る方法が本発明によって提供される。ＩＬ−２などのエフェクタ細胞の生存性を維持する外因性作用物質を必要とせずに、ＡＣＴプロトコールで使用するエフェクタ細胞を得る方法も提供される。その方法には、次のいくつかの段階の一部または全てが含まれる。すなわち（１）患者から単核細胞を採取する段階、（２）細胞の一部または全てを所望のＴ細胞サブタイプに分化させる作用物質で生体外にて細胞を処理する段階、（３）得られた細胞を精製する段階、（４）細胞表面受容体と特異的に相互作用する分裂促進物質とその細胞とを接触させることでその細胞を増殖させる段階である。本発明におけるそのような作用物質は好ましくは、分裂促進性モノクローナル抗体である。増殖細胞をさらに精製して、所望のサブタイプを選択することができる。１．単核細胞の回収単核細胞（すなわち、リンパ球および単球）は、末梢血、リンパ系組織、生検組織などの（これらに限定されるものではない）各種入手源、あるいは体腔洗浄法から得ることができる。好ましくは、簡単な静脈穿刺によって細胞を得る（５０〜５００ｍＬ）。さらに多くの細胞が必要な場合は、リンパ球分離法によって得ることができる。フィコール-ハイパック密度勾配遠心法または他の好適な方法を用いて、血液から単核細胞を精製することができる。ａ．生体外分化多くの研究から、各種抗原によって異なる免疫調節細胞サブセットの選択的誘発を起こして、体液性または細胞媒介性の免疫応答を起こすことができることが示されている。さらに、多くの疾患状態が、ある種の細胞が支配的になることで生じるものである。Ｔ細胞サブセットの分化を調節する機序についての理解が最近進んだことで、特定のサブセットを生体外で形成することが可能となっている。抗原の用量、抗原を提供する細胞の種類および対象者のＭＨＣハプロタイプなどのいくつかの因子が、特定の種類の調節免疫細胞の分化に影響を与え得る。各種サイトカインも、ヒトにおいて進行する種類の調節応答に影響を与え得るものである。例えば、初期Ｔ細胞活性化時にＩＬ−４が存在すると、Ｔｈ２様細胞が生じることが知られている（Hsieh et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89: 6065およびPaliard et al.(1992)J.mmunol.141:849参照）。逆に、ＩＬ−１２またはインターフェロン−γ存在下での細胞の活性化によって、Ｔｈ１様細胞が形成される（Sedar et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:10188参照）。従って、好ましい実施態様においては、次に、この方法の第１段階で回収される単核細胞をＩＬ−１２、インターフェロン −γまたはＩＬ−４の存在下に活性化して、それぞれＴｈ１またはＴｈ２細胞を形成させる。調節細胞の分化を促進するため、ＩＬ−１２および／またはインターフェロン−γに対する抗体を用いて、Ｔｈ２応答を促進することができ、ＩＬ −４に対する抗体を用いて、Ｔｈ１細胞の分化を促進することができる。抗体やＴ細胞上のＩＬ−１２、インターフェロン−γまたはＩＬ−４受容体に特異的な蛋白を用いて、リンホカインに代わる信号を提供することもできると考えられる。その細胞は、ＰＨＡおよびＰＭＡなどの化学試薬あるいは抗ＣＤ３もしくは抗ＣＤ２などのモノクローナル抗体によって非特異的に活性化することができる。好ましくはその細胞は、培地に加え、処理し、Ｔ細胞に対するＡＰＣによって提供される天然もしくは人工の蛋白抗原によって特異的に活性化される。場合によっては、採血に先だって患者に予防接種を行って、抗原特異的細胞の開始数を増加させることが必要な場合がある。別の戦略は、採血に先だって患者に対して経口での耐性付与を行うというものである。形成される細胞が既知の抗原に対して特異的である場合、細胞の再注入後に、その抗原を追加免疫原として用いて、インビボで所望の調節細胞を増加させることもできる。Ｔｈ１細胞分化を行う別の戦略は、αＢ７．２ｍＡｂまたはＴＧＦ−βの存在下に細胞を活性化するというものである。Ｔｈ２分化はさらに、αＢ７．１ｍＡｂ、低抗原用量およびＣＴＬＡ４／Ｉｇ融合蛋白（ＣＴＬＡ４はＣＤ２８のリガンドである）などの１以上の作用物質の存在下に細胞を活性化することによっても促進することができる。ＣＤ２８は、Ｔ細胞および抗原提示細胞で発現される。生じる調節細胞の種類は、疾患の動物モデルから決定しなければならない。一つの分類内の全ての調節細胞が類似しているとは限らないことがわかっている。例えば、一部のＴｈ２細胞は、高レベルのＩＬ−４および低レベルのＩＬ−１０を分泌するが、他のものは高レベルのＩＬ−５を有していた。他の調節細胞は、ＩＬ−１０およびインターフェロン−γを産生する。「Ｔｈ３」細胞と称される調節細胞はＴＧＦ−βを分泌し、多発性硬化症の治療には優先されるものであると思われる。ｂ．調節細胞の単離免疫細胞サブセットの単離法のほとんどは、Ｔ細胞表面抗原に対するｍＡｂの反応性に基づくものである。蛍光活性化細胞選択によって、陽性の選択を行うことができる（Reinherz et al .(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:4061参照）。特異的ｍＡｂをプラスチックプレートに結合させて、所望のＴ細胞サブセットを捕捉する各種選択法を用いることができる（Lumet al.(1982)Cell Immunol.72:122参照）。負の選択にも選択法を用いて、特異的ｍＡｂを有する望ましくないサブセットを排除することができる(例えばEngleman et al.(1981)J.Immunol.127:2124参照）。ｍＡｂをコーティングした磁性ポリマービーズの使用は、陽性選択および陰性選択によって、非常に純度の高い機能的に障害されていないリンパ系細胞群を単離する上で好ましい方法である（例えばLea et al.(1985)Scand.J.Immunol.22 :207;Lea et al.(1986)Scand.J.Immunol.23:509;Gaudernack et al.(1986)J.Imm unol .Methods 90:179参照）。調節免疫細胞サブセットを識別できる抗体はまだ報告されていないことから、ある種の細胞表面蛋白に基づいた精製を行うことで、所望の群を強化するよう努力する必要がある。例えば、ＣＤ３０陽性細胞群（Manetti et al.(1994)J.Exp. Med .180:2407参照）、ＣＤ２７陰性細胞群（Elson et al.(1994)Int.Immunol.6. :1003参照）およびＣＤ７陰性細胞群（Autran et al.(1995)J.Immunol.154:1408参照）が、大半のＴｈ２細胞を有することが明らかになっている。さらに、細胞の抗ＣＤ２８ｍＡｂとの反復接触は、Ｔｈ２細胞を増加させる別法である。調節細胞精製の別の戦略は、望ましくない細胞サブセットの成長を阻害することが知られている作用物質の存在下に、細胞を増殖するというものである。そのような作用物質には、Ｔｈ２細胞の成長を阻害するデキサメタゾン、コルヒチン、ＣＴＬＡ４／Ｉｇ融合蛋白およびプロゲステロンなどがある。ＴＧＦ−βは、Ｔｈ１細胞の成長を阻害する。ｃ．調節細胞増殖外因性ＩＬ−２を使用せずに生体外で臨床的に有効な数まで精製Ｔ細胞を増殖させる方法が、本発明において提供される。本発明の方法ではＩＬ−２を用いることは可能であると考えられるが、そのサイトカインを加えすに細胞を成長させることが好ましい。生体外でＩＬ−２に対して曝露される細胞は、その生存性および機能の維持に関してＩＬ−２の存在に依存するようになり、患者に対してその細胞とともにＩＬ−２の全身注入が必要となる。ＩＬ−２の全身注入は患者に対して極めて有毒であることが知られていることから、そのサイトカインの必要性を回避するのが最良である。Ｔ細胞を増殖させるには、２つの別個の信号が必要である。第１の信号は、細胞表面にあるＣＤ３／ＴＣＲ抗原複合体から出されるのが一般的である。第２の信号は、ＩＬ−２受容体から提供される。ＩＬ−２信号を使用せずに済ますには、ｍＡｂの組み合わせ物を使用する。好ましくは、可溶相に含めるか、あるいはプラスチックもしくは磁性のビーズに固定化して、細胞回収法を簡単にする。（ｉ）第１の信号第１の信号を提供するには、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体に対するｍＡｂによって細胞を活性化するのが好ましいが、抗原、スーパー（super）抗原、ポリクローナル活性化物質、抗ＣＤ２および抗ＴＣＲ抗体などの（これらに限定されるものではない）他の好適な信号を使用することができる。他の好適な作用物質は、経験的に確認することができる。ＯＫＴ３または６４．１などの固定化もしくは架橋した抗ＣＤ３ｍＡｂは、ポリクローナル的な形でＴ細胞を活性化することができる（Tax et al.(1983)Nature 304:445参照）。しかしながら、酢酸ミリスチン酸ホルボールなどの他のポリクローナル活性化物質も使用することができる（Hansen et al.(1981)Immunogenetics 10:247参照）。可溶相での１価抗ＣＤ３ｍＡｂを使用して、Ｔ細胞を活性化させることもできる（Tamura et al.(1992)J.Immunol.148:2370参照）。可溶形の１価抗ＣＤ３ｍＡｂによるＣＤ４⁺細胞の刺激は、Ｔｈ２細胞の増殖には好ましいが、Ｔｈ１細胞の増殖には好ましくない（deJong et al.(1992)J.Immunol.149:2795参照）。抗ＣＤ３および抗Ｔ細胞表面抗原ｍＡｂの可溶性ヘテロ接合体は、特定のＴ細胞サブセットを優先的に活性化することができる（Ledbetter et al.(1988)Eur.S. Immunol .18:525参照）。抗ＣＤ２ｍＡｂもＴ細胞を活性化することができる（Hu et et al.(1986)J.Immunol.137:1420参照）。抗ＭＨＣクラスＩＩｍＡｂは、Ｔ細胞増殖の誘発において抗ＣＤ３との相乗効果を持ち得る（Spertini et al.(19 92)J.Immunol.149:65参照）。抗ＣＤ４４ｍＡｂは、抗ＣＤ３ｍＡｂと同様の形でＴ細胞を活性化することができる（Galandrini et al.(1993)J.Immunol.150:4 225参照）。本発明においては、抗ＣＤ３に対するモノクローナル抗体が好ましい。ＣＤ３はＴ細胞受容体に隣接していることから、抗ＣＤ３を使用する。モノクローナル抗体相互作用による等のＣＤ３誘発により、同時にＴ細胞活性化が生じる。（ｉｉ）第２の信号次に、そのような活性化Ｔ細胞の増殖を起こすには、第２の信号が必要である。各種ｍＡｂが単独または併用で、Ｔ細胞増殖のための第２の信号を提供することができる。抗ＩＬ−４ＲｍＡｂ（インターロイキン−４受容体分子に対して特異的）は、Ｔｈ２細胞の増殖を促進することができる（Lindquist et al.(1993)J.Immunol .150:394参照）。ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ４９（ＶＬＡ）、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４４およびＣＤ２８に対する固定化リガンドまたはｍＡｂを使用しても、Ｔ細胞増殖を促進することができる（Manger et al .(1985)J.Immunol.135:3669;Hara et al.(1985)J.Exp.Med.161:1513; Shimizu et al.(1990)J.Immunol.145:59;Springer,（1990）Nature 346:425参照）。Ｂ細胞に対するリガンドである細胞表面蛋白は、Ｔｈ２細胞増殖に好ましい標的であるが、Ｔｈ１細胞増殖には、マクロファージリガンドが好ましい。抗ＣＤ３または抗ＣＤ２と併用した抗ＣＤ２８によって、長時間持続性のＴ細胞増殖応答が誘発される（Pierres et al.(1988)Eur.J.Immuno l .18:685参照）。抗ＣＤ５ｍＡｂと併用した抗ＣＤ２８ｍＡｂによって、数週間持続し得る増殖応答の強化が生じる（Ledbetter et al.(1985)J.Immunol.135:23 31参照）。抗ＣＤ５ｍＡｂ単独によっても、Ｔ細胞増殖の第２の信号を得ることができる（Vandenberghe et al.(1991)Eur.J.Immunol.21: 251参照）。Ｔ細胞増殖を支持することがわかっている他のｍＡｂには、抗ＣＤ４５およびＣＤ２７などがある（Ledbetter et al.(1985)J.Immunol.135:1819およびVan Lier et al.( 1987)J.Immunol.139:1589参照）。持続的な調節細胞増殖を至適に誘発するｍＡｂまたは蛋白の組み合わせを決定するには、これらｍＡｂまたは蛋白の組み合わせを用いるスクリーニング法を用いる。これら物質の各種組み合わせとともに細胞をインキュベーションし、³Ｈ −チミジン取り込みの分析もしくはそれに相当する方法によって成長についてのスクリーニングを行う。最も良好な成長特性を示す群を選択して、培地でそれを使用する。（ｉｉｉ）増殖精製Ｔ細胞を１０００億（１０¹¹）までの臨床的に有効な数まで増殖させるには、細胞を高密度まで成長させなければならない。それは、攪拌槽発酵槽、エアリフト発酵槽、ローラーボトル、培養バッグおよび他のバイオリアクタ装置など（これらに限定されるものではない）の好適な手段を用いて行うことができる。現在のところ、中空繊維バイオリアクタが好ましい。中空繊維バイオリアクタにより、わずかな容量で、細胞を必要な高密度まで培養することができる。これにより、生産工程で必要なモノクローナル抗体、血清および培地の量が減る。さらに、６０００ダルトンという分子量カットオフを有する繊維を選択することで、培養空間に細胞由来サイトカインを保持しながら、連続的な原料供給および廃棄生成物除去を行うことができる。ＩＬ−２およびＩＬ−４などのこれらサイトカインは、細胞の生存性および増殖を促進および維持するものである。ほとんどの哺乳動物細胞のようにＴ細胞は、組織培養で１×１０⁶個／ｍＬの最大密度まで成長する。従って、１０００億の細胞を支持するには、計１００リットルの培地が必要であると考えられる。さらに、細胞を生存状態に維持する上で必要な適切な養分／廃棄生成物の均衡を維持するには、培地１００リットルを定期的に補給する必要があると考えられる。１００リットルの培地の酸素飽和を維持する方法が必要であると考えられる。細胞培養に対する中空繊維法は公知であり（例：米国特許４２２０７２５号、４２０６０１５号、４２００６８９号、３８８３３９３号および３８２１０８７号；さらには、米国特許４３９１９１２号；米国特許４５４６０８３号；米国特許４３０１２４９号；米国特許４９７３５５８号、米国特許４９９９２９８号；ならびに米国４６２９６８６号も参照）、それを用いて、培地において組織のような細胞密度が得られる（すなわち、約１０⁸個／ｍＬより高い密度）。元の中空繊維バイオリアクタ容器には、複数の人工キャピラリ中空繊維膜を有するハウジングがある。キャピラリは装置の一端にある流入口および他端にある流出口の間で伸びている。キャピラリには、溶解した培地成分が拡散することができる選択的透過性壁がある。管腔およびＥＣＳは、流入口と流出口にある埋込材料によって隔てられている。ハウジングには、ＥＣＳに至る開口もあって、細胞をＥＣＳに接種することができるようになっている（例：米国特許３８２１０８７号、３８８３３９３号および４２２０７２５号、４２０６０１５号、４２００６８９号、３８８３３９３号および３８２１０８７号；さらには、Knazek et al.(1972)Sci ence 178:65も参照）。中空繊維法により、従来の細胞培養で認められる細胞密度(１×１０⁸個／ｍＬ以上)の１００倍の密度まで細胞を成長させることができる。そこで、１０００億の細胞を得るのに、わずか１リットルの培地容量が必要なだけである。細胞容量を減らすことによっても、増殖工程で必要なヒト血清および可溶性ｍＡｂの量が減るものと考えられる。さらに、細胞密度が高いことで、インビボ条件に比較的近い環境か提供される。中空繊維バイオリアクタは、中空繊維細胞培養システムの構成要素である。ＣＥＬＬＭＡＸ（登録商標）１００中空繊維細胞培養システム（Ce1lco Advanced Bioreactors，Inc.，MD）などの代表的な中空繊維培養システムは、貯液槽となる標準的なガラス製培地瓶、ステンレススチール／ライトン（Ryton）ギアポンプ、その中で細胞を培養する繊維および外殻ケーシングを有するオートクレーブ処理可能な中空繊維バイオリアクタ、ならびに医療用シリコーンゴム管あるいは培地のｐＨおよびｐＯ₂を適切に維持するためのガス交換体となる他の接続手段を有する。いずれの構成要素も、そのようなシステム４個を標準的な組織培養インキュベータ室内に入るだけの小さい寸法のステンレススチールトレーに固定されている。ポンプ速度および流動方向の自動逆転は、インキュベータ外部に設置され、インキュベータの扉のガスケットを通る平坦なリボンケーブルを介してポンプモーターに接続された電子制御ユニットによって決定される。ポンプモータは磁気的にポンプに組み付けられており、システムからはずされてから蒸気オートクレーブ処理を行う。本発明での使用に好適なＨＦバイオリアクタシステムについては、同時係属中の許可された米国特許出願０８／５０６１７３号に記載されている。２．大量Ｔ細胞培養において好ましい中空繊維システムインビボ条件に非常に近いことで、Ｔ細胞を１×１０⁷個／ｍＬ超、好ましくは１×１０⁸個／ｍＬ超の密度まで成長させることができ、低分子量カットオフを有する繊維を使用して分裂促進性ｍＡｂおよび血清成分を保持し、勾配形成の問題を持たないＨＦシステムが、同時係属中の許可された米国特許出願０８／５０６１７３号に記載されている。このＨＦ装置により、管腔液流の流出を完全に遮断することができる。それにより、中空繊維キャピラリ全長にわたって養分が均等に灌流される。それには、バイオリアクタのＥＣＳに酸素供給装置もあり、所望の酸素導入特性を与える。長さ１４インチ、ＥＣＳ容量１２０ｍＬ、分子量カットオフ（ＭＷＣ）６０００ダルトンの人工腎臓カートリッジ（CD Medical of Hialeah，FL）を、中空繊維処理装置で使用する中空繊維バイオリアクタとして選択した。その低ＭＷＣカートリッジの全長にわたる養分の均等分配を確保するため、自動オン／オフ電磁弁を、バイオリアクタの流出流開口に設置した。電磁弁を「オフ」の位置にすると、培地がバイオリアクタから出るのが防止される。代わりに培地は、バイオリアクタの全ての箇所において同じようにＥＣＳにおいて、細胞に対して限外濾過される。次に、培地は流出口を通ってバイオリアクタから流れ出る。養分の限外濾過は、比較的生理的であることから、細胞の高密度培養を維持する上で比較的望ましいものである（Swaab et al.(1974)Cancer Res.34:2814;Davis et al.(19 74)Chem.Eng.J.7:213参照）。ＥＣＳで細胞からの代謝廃棄物を除去するには、電磁弁を「オン」位置に切り換えて、圧力制御しながら培地を出口からＥＣＳに戻す。次に、培地を径方向に管腔中に移動する。最後に、培地を流出開口から出す。中空繊維システムによって、管腔からＥＣＳに限外濾過される（サイクル１）培地に、酸素を自動的に補充して、グルコース、乳酸および二酸化炭素の濃度を調節することができる。電磁弁をサイクル２において開くと、再コンディショニング培地がＥＣＳに戻る。同じ調節をバイオリアクタの管腔側にある培地について実施する。このようにして、酸素がバイオリアクタの管腔およびＥＣＳに供給され、酸素移動の唯一の手段としての中空繊維キャピラリを横切る拡散が防止されることから、酸素拡散の制限を克服することができる。調節免疫細胞の大量培養を行うには、流体力学を改善して勾配形成を低減した中空繊維バイオリアクタが現在は好ましい（例えば米国特許４８０４６２８号。特に、同時係属中の許可された米国特許出願０８／５０６１７３号を参照）。そのような流体力学が改善された中空繊維バイオリアクタは、調節免疫細胞の大量培養には最も適している。好ましい実施態様では、分裂促進性モノクローナル抗体を中空繊維表面上にコーティングして、免疫細胞の分裂を起こすのに必要な適切な信号を送る。Ｄ．エフェクタ細胞増殖エフェクタ細胞は、病原体または腫瘍細胞を直接排除する能力を有する単核細胞である。そのような細胞には、ＬＡＫ細胞、ＴＩＬ、ＣＴＬおよび抗体産生性Ｂ細胞および他のそのような細胞などがある。これらの細胞は、最初に患者から採取した細胞を公知の方法で処理してそのような細胞の分化を起こすことで得られる。例えば、ＴＩＬ細胞は、ＩＬ−２および／または他のＴＩＬ産生をもたらす物質とともに、生体切片によって得られた固形腫瘍組織を培養することで得られる。次に、その細胞を、調節細胞について前述のような細胞表面受容体に特異的なモノクローナル抗体その他の作用物質などの分裂促進物質の存在下に活性化およひ増殖させる。本発明の方法によれば、細胞を外因性ＩＬ−２（または、インビボ活性または生存について細胞か依存性となる他の作用物質）にさらされず、再注入においてＩＬ−２の同時注入を伴わない。Ｅ．免疫細胞表現型の選択融合細胞の調節効果が要求される（またはエフェクタ細胞が要求される）作用部位に依って、異なる細胞表現型が必要になり得る。リンパ球は身体全体を広範囲に循環して、組織およびリンパ器官に局在する。これは、リンパ球上の付着分子のアレイならびに脈管内皮、細胞外マトリクスおよび外皮上のカウンター受容体によって行われる。最近の研究から、リンパ球の移動に介在する特異的な受容体／リガンド相互作用かいくつか確認されている。循環から移動する（例：炎症部位へ）必要がある注入細胞は、各種組成の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を通過して移動する能力を持っていなければならない。例えば、内皮下基底膜は、ＩＶ型コラーゲン、ラミニンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカンリッチな障壁を提供する。間質のＥＣＭには、コラーゲンＩおよびＩＩＩ、ならびにヒアルロン酸などの各種グリコサミノグリカンが含まれている。フィブロネクチンおよびビトロネクチンも、基底膜および間質にある。免疫細胞をこれら材料を含むカラムに負荷することで、間質を通って移動することができる細胞のスクリーニングを行うことができる。さらに、「記憶」表現型を有する細胞（すなわち、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ１１ａ＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ５８＋、Ｌ −セレクチン−）が慢性炎症部位で非特異的に蓄積することも知られている。Ｌ−セレクチンを発現する細胞は移動する可能性が非常に低く、リンパ器官において所望の調節効果が必要な場合に使用すべきものである。特定の抗原特異性を有する細胞を培養することは、非特異的免疫調節を防止する上で望ましいであろう。調節効果が望まれる部位または病因性抗原に対して固有の抗原を選択しなければならない。Ｆ．治療法の実施本発明の治療法は、治療用の自己注入に関して臨床的に有効な（１０⁹以上、好ましくは１０¹⁰以上の細胞）調節免疫細胞群および／またはエフェクタ免疫細胞群を含む組成物を製造するようにデザインされたものである。本発明の方法は、細胞の生存性または活性を維持するために増殖後に存在させなければならない増殖用の作用物質に依存せず、それを使用しないものである。詳細には、増殖において、ＩＬ−２を必要とせず、それを使用しない。結果的に、細胞の再注入でＩＬ−２を必要とせず、それを使用しないことから、ＩＬ−２注入に関連する毒性その他の問題が回避される。組成物は、好ましくは、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１様細胞などの実質的に均質な群を含むものであり、そこでは、サイトカインプロファイルが優勢に１種類の細胞である（すなわち、約５０％を超える）。組成物は、調節免疫細胞、エフェクタ細胞またはその両方を含むことができる。いずれの場合も組成物には、臨床的に有効な、すなわち治療上有効な数の細胞が含まれている。そのような組成物を治療に使用して、免疫細胞の不均衡を元に戻すことができる。免疫細胞の不均衡は多くの疾患状態で一般的である。例えば、慢性関節リウマチ(Simon et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:8562参照)、Ｉ型糖尿病 (Foulis et al.(1991)J.Pathol.165:97参照)、全身性炎症(Brod et al.(1991)J. Immunol .147:810参照)、炎症性陽症候群(Niessner et al.(1995)Clin.Exp.Immun ol .101:428参照)、バセドウ病（de Carli et al.(1993)J.Clin.Endocr.Metab.77 :1120参照）、シェーグレン症候群（Oxholm et al.(1992)Autoimmunity 12:185 参照）、原発性全身性脈管炎（Grau(1990)Eur.Ctokine Netw.1:203参照）、自家移植拒絶（Benvenuto et al.(1991)Transplantation 51:887参照）などの自己免疫疾患において、Ｔｈ１調節免疫細胞の支配性が報告されている。ＡＩＤＳ（Romagnani et al.(1 994)Res.Immunol.145:611参照）、カンジダ症（Puccetti et al.(1995)Trends i n Microbiology 3:237参照）、結核（Zhang et al.(1995)Infect.Immun.63:3231 参照）、アレルギー(Romagnani et al.(1994)Curr.0pin.Immunol.6:838参照)では、Ｔｈ２調節免疫細胞の支配性が報告されている。さらに、各種抗原に対するヒトでのＴｈ１およびＴｈ２応答の偏りが保護においてある役割を果たすが、免疫病理的状態となることも知られている。本発明の方法を用いて、短時間供給でサブセットの自己調節細胞を注入することによって比率と絶対数を調節することで、病的なＴｈ１およびＴｈ２応答を改善することができる。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞は交差調節性を有することから、短時間供給の多量のサブセット注入を行うことで、不均衡状態の応答の病理的効果を防止することができる。これらの方法を用いていくつかの疾患を治療する例をいくつか以下に示す。以下のものは例示であることは明らかであり、特定サブセットのＴ細胞の比率または量が正常な範囲外である病的なＴ細胞応答が認められる状態を、比較的短時間供給でＴ細胞サブセットを注入することで治療することができる。１．投与静脈投与、非経口投与または局所投与などの（これらに限定されるものではない）好適な手段によって、細胞組成物を投与することができる。選択される特定の形態は、特定の治療および細胞の運搬によって決まるものである。現在は、静脈投与が好ましい。代表的には、約１０¹⁰〜１０¹¹個の細胞を、容量５０ｍＬ〜１リットル、好ましくは約５０ｍＬ〜２５０ｍＬ、より好ましくは約５０ｍＬ〜１５０ｍＬ、最も好ましくは約１００ｍＬで投与することができる。容量は、治療対象の障害および投与経路によって決まる。細胞の投与は、特に免疫系均衡の回復が目標である場合、単回投与または所定の時間間隔を設けて数回の投与により行い、用量決定を行うことができる。２．自己免疫症の治療本発明で提供される方法および調節細胞組成物を用いて、基礎的に自己免疫または成分を有する障害を治療することができる。ａ．慢性関節リウマチ（ＲＡ）の治療ＲＡは、滑膜炎症および自己抗体を特徴とする免疫媒介性の慢性炎症疾患である。ＲＡの基になっている原因は未知であるが、免疫調節の障害がその疾患の病因に寄与する主要な因子であることが広く認められている。正常な免疫応答の調節制御はかなりの部分が、マクロファージ、Ｔ細胞およびＢ細胞間の相互作用、ならびにそれらのサイトカイン産生によるものである。ＲＡ患者における疾患活動は、活性化マクロファージのサイトカイン産生との間に正の相関がある。炎症を起こしている関節ではマクロファージが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８，ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含む多量の催炎性サイトカインを産生している。これらサイトカインは、Ｔｈ１記憶細胞を関節に補充して、リウマチ因子（ＲＦ）産生を刺激するよう働いて、パンヌス形成および関節破壊を起こす。ＲＡにおける催炎性Ｔｈ１サイトカインのレベルを低下させる治療プロトコールによって、臨床的に改善があることが明らかになっている。サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１０は、マクロファージ活性を低下制御し、そのＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−α産生を阻害することが知られている。ＩＬ−４はさらに、ＲＡの主要な病理的特徴である滑膜細胞の無制限な増殖を抑制することもできる。ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、ＲＡ関節には実質的に存在しないＴｈ２細胞によって産生される。むしろ、ＲＡ関節はＴｈ１細胞を豊富に持っている。従って、本発明の方法によってＲＡ患者からの自己の生体外由来Ｔｈ２細胞を多量に生成することで、ＲＡを治療することができる。好ましくは１０⁹以上、より好ましくは１０¹⁰以上の量で得られた細胞を、患者に再注入することで、慢性炎症病変を抑制する。記憶細胞は炎症部位に移動する可能性が最も高いことから、記憶表現型のＴｈ２細胞が好ましい。さらに、細胞を活性化状態で注入することができる。ＲＡにおけるＴ細胞の浸潤によって、ＨＬＡ−ＤＲ発現に５〜６倍の上昇があり、ＶＬＡ−１発現で２〜５倍の上昇があることが明らかになっており、これらはいずれも活性化のマーカーである。さらに、好ましくは、注入したＴｈ２細胞は、関節のみにおいてその調節作用を行うようにして、全身性の免疫抑制効果を予防する。誘発抗原はＲＡでは未知であることから、使用されるＴｈ２細胞は、固有の関節抗原に特異的でなければならない（例：ＩＩ型コラーゲンまたはプロテオグリカン）。ｂ．多発性硬化症（ＭＳ）の治療ＭＳは、中枢神経系の炎症および脱髄を特徴とする自己免疫疾患である。ＭＳでのサイトカインのスペクトルおよび産生の調節が、疾患の結果に決定的な影響を持つと考えられる。データを総合すると、ＴＮＦ−α、リンフォトキシン、インターロイキン−１２およびインターフェロン−γなどのＴｈ１関連のサイトカインは疾患を亢進するが、ＩＬ−１０などのＴｈ２細胞からのサイトカインは、疾患を抑制することが明らかになっている。さらに、ＴＧＦ−βが疾患の抑制剤であることが明らかになっている。ＭＳの動物モデルでの研究（実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ））によって、「Ｔｈ３」と称されるＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを産生する調節細胞が、疾患の進行を抑制し、疾患からの回復を誘発する上で最も効果があることが明らかになっている。従って、本発明の方法は、自己細胞療法で使用するためのＭＳ患者からの治療効果のある量のＴｈ３細胞を生成することに使用することができる。疾患からの回復は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを産生する細胞の浸潤に関連することから、生体外由来のＴｈ３細胞が好ましくは記憶表現型を持つようにして、炎症病変への移動を促進しなければならない。さらに、細胞の免疫抑制効果を炎症病変に特異的なものとするため、ミエリンまたはミエリン抗原の脳炎誘発性エピトープ（例：ミエリン塩基性蛋白またはプロテオリピド蛋白）に特異的な細胞を使用しなければならない。ｃ．炎症性腸疾患（ＩＢＤ）ＩＢＤは、消化管の慢性的炎症状態である。ＩＢＤの病因および発病論については未知である。クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大胸炎（ＵＣ）には、１以上の一般的な脳成分に対する異常または無制限のＴ細胞反応が媒介していると考えられている。活動性ＣＤおよびＵＣは、Ｔｈ１様サイトカインの増加と、わすかに検出可能もしくは検出できないほどのＴｈ２様サイトカインを特徴とする。従って本発明の方法は、ＩＤＢ患者における注入用の自己Ｔｈ２細胞を形成することに使用することができる。好ましくは、注入細胞はインテグリンα４，β ７を発現する。このインテグリンは、消化管で起こるパイエル板高内皮細静脈で認められる粘膜アドレシン（addressin）細胞付着分子−１についてのリガンドであることが明らかになっている。α４，β７を発現するリンパ球は、粘膜器官に運搬され、そこに保持される。腸粘膜は、ＩＢＤの慢性炎症部位である。ｄ．インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の治療ＩＤＤＭは、宿主免疫系による膵島β細胞の自己免疫破壊によって生じるものである。膵島細胞の破壊には、Ｔ細胞が媒介していることが知られている。ＮＯＤマウスは、ヒトＩＤＤＭの自然発生モデルである。そのマウスにおける同系移植片としての膵島移植により、血糖正常状態となり、糖尿病の初期合併症か予防および回復される。しかしながら結局は、宿主の炎症応答によって、膵島移植片の破壊と疾患の再発が生じる。これらの炎症応答を分析することで、移植片特異的Ｔｈ１細胞は拒絶に介在するが、Ｔｈ２細胞は保護作用を持つことが明らかになっている。同系移植片および同種移植片の拒絶にＴｈ１細胞が媒介し、それはＴｈ２細胞によって抑制できることを示す証拠が得られている。Ｔｈ１細胞は、ＮＯＤマウスにおける糖尿病を活発に促進することが明らかになっている。Ｔｈ１サイトカインの阻害により、ＮＯＤマウスでの膵島同系移植片が保護される。最近、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４およびＩＬ−１０）の全身投与と膵島特異的Ｔｈ３クローンの養子移入が、この動物における同質遺伝子系統膵島移植片拒絶を阻害し得ることが明らかになっている。さらに、Ｔｈ２様応答が、同種異系臓器および組織の移植のモデルで保護効果を持つことが明らかになっている。従って、本発明の方法は、移植される同種異系膵島細胞の拒絶に対する保護を提供するＩＤＤＭ患者での注入のための臨床的に有効な数のＴｈ２細胞を形成することに使用することができる。好ましくはＴｈ２細胞は、移植された膵島にある同種異系抗原に対して特異的である。別法として、インシュリンに特異的なＴｈ２細胞を用いることができる。インシュリン特異的Ｔｈ２細胞を使用して、早期診断されたＩＤＤＭ患者の治療を行って膵島破壊を防止したり、高リスク患者でワクチンとして使用して、糖尿病を予防するか少なくとも進行を遅延させることも可能であると考えられる。e ．他の自己免疫疾患の治療自己免疫甲状腺疾患、抗尿細管基底膜疾患（腎臓）、シェーグレン症候群、強直性脊椎症、尿素性網膜炎などの（これらに限定されるものではないが）Ｔｈ１媒介性自己免疫疾患は、臨床的に有効な数の（代表的には１０⁹〜１０¹¹）Ｔｈ２細胞またはＴｈ２様組成物を含む組成物を投与することで治療することができる。３．移植Ｔｈ２細胞ＡＣＴを免疫抑制戦略として用いて、臓器および組織の移植を行うことができる。例えば、Ｔｈ２サイトカインは無拒絶の心臓同種移植片と関係しているが、Ｔｈ１サイトカインは拒絶と関係している。同様の所見が、腎臓同種移植片ならびにマウスの同所肝臓同種移植片および皮膚同種移植片について認められている。養子移入したＴｈ２細胞は、皮膚同種移植片拒絶を抑制し、亜致死的に放射線照射したマウスにおける牌臓細胞の同種異系移植が可能となり、致死性ＧＶＨＤ（移植片対宿主疾患）を抑制する。Ｔ細胞媒介性の同種異系反応性は、ＧＶＨＤおよび移植片拒絶の病因において中心的役割を果たすことが明らかになっている。従って、本発明の方法は、臓器または組織移植を予定している患者での注入用の自己Ｔｈ２細胞を形成することに使用することができる。好ましくは、そのＴｈ２細胞は、同種抗原または移植される臓器もしくは組織に固有の抗原に特異的である。４．アレルギー障害Ｔｈ２細胞は、アトピー性皮膚炎患者における湿疹性反応、ならびにアレルギー性喘息における気道反応亢進および肺好酸球増多症を起こす好酸球浸潤開始において非常に重要な役割を果たすように思われる。さらに、アトピー患者（花粉症患者、粉塵アレルキー患者および食物アレルギー患者）では、Ｔｈ２細胞が優先的に活性化されている。最近の証拠から、インビボでＴｈ２形成を抑制する治療が、アレルゲン誘発の気道変化および他のアトピー性応答に対して強い阻害効果を有することが明らかになっている。従って、Ｔｈ１サイトカインはＴｈ２応答を阻害することが知られていることから、本発明の方法は、アトピー患者への注入用に多数の自己Ｔｈ１細胞を形成することに使用することができる。好ましくはその細胞は、アレルゲンに対して特異的である。５．感染性疾患および癌Ｔｈ２細胞の過剰は、ウィルス感染、真菌感染、酵母感染、寄生虫感染およびマイコバクテリア感染などの最も感染性の高い疾患と関係している。その患者にＴｈ１細胞を注入することで、細胞媒介免疫方向に調節均衡を変えることができると考えられる。先行技術のＡＣＴプロトコールでは、ＴＩＬおよびＬＡＫエフェクタ細胞と病原性細胞もしくは腫瘍細胞特異的なＣＴＬを用いる方法が用いられている。これらのエフェクタ細胞は、免疫無防備状態宿主内で適切に作用するとは考えられない。Ｔｈ１調節細胞の同時注入は、エフェクタ細胞がその機能を発揮して、その治療を改善する上で必要な「支援」を提供するはずである。Ｔｈ１細胞単独の注入で、内因性ＣＤ８＋エフェクタ細胞の活動がインビボで十分支援されるものと考えられる。従って、本発明の方法は、感染性疾患もしくは癌の患者に注入するための多数の自己Ｔｈ１細胞を形成することに使用することができると考えられる。好ましくはその細胞は、病原体または腫瘍に固有の抗原に対して特異的である。Ｔｈ１細胞の注入は、病原体または腫瘍に特異的な細胞溶解性細胞とともに行うこともできる。本発明において特に興味深いものとしては、ＨＩＶ感染の治療方法である。ウィルス除去したＣＤ４⁺細胞を得る方法が提供される。好ましい実施態様においては、Ｔｈ１細胞分化が促進される条件下で細胞を増殖させる。得られた細胞は、ドナーＨＩＶ患者に再注入することで、免疫を回復させる。他の実施態様では、これらの細胞を増殖エフェクタ細胞、特にはＨＩＶに感染した細胞を特異的に標的とするエフェクタ細胞とともに再注入する。Ｔｈ１細胞組成物で治療できる他の感染性疾患には、インフルエンザウィルス、ポリオウィルス、白血病ウイルス、肝炎ウィルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヘルペスウィルス、レトロウィルス、エプスタイン−バールウィルス、梅毒（梅毒トレポネーマ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉腫）、ロドコッカス-エクイ（細胞内呼吸器病原体）、過敏性肺炎、糸状虫性角膜炎（河川盲目症）、火傷被害者、トラコーマ病原体、トリ結核菌、カンジダ・アルビカンス、コクサキーウイルス、リーシュマニアの主要感染、クリプトコックス感染および百日咳菌呼吸器感染などがあるが、これらに限定されるものではない。Ｔｈ細胞組成物によって治療できる感染性疾患には、フィラリア線虫（寄生虫）感染、Plasmodium chaboudi chaboudi(マラリア)感染、およびBorrelia burgd ofi(スピロヘータ)感染などがあるが、これらに限定されるものではない。本発明において興味深いものとしては、癌の治療方法もある。好ましい実施態様においては、腎細胞癌の治療方法が提供される。形質転換腎細胞は、熱ショック蛋白ｈｓｐ７０を発現する。結果的に、ｈｓｐ７０特異的Ｔｈ１細胞が、サイトカイン搬送媒体として役立って、腫瘍におけるＩＬ−２およびＩＦＮ−γの局所濃度を上昇させることで、抗腫瘍エフェクタ細胞の機能、活性および／または増殖を促進すると考えられる。Ｔｈ１細胞を用いて、黒色腫、乳癌、頭部および頸部の癌、前立腺癌および肺癌などの癌の腫瘍退行を媒介させることもできる。ある種の腫瘍で、Ｔｈ２応答が退行を媒介し得ることを示す証拠が得られている。６．予防接種細菌、ウィルスおよび寄生虫などの（これらに限定されるものではないが）細胞内病原に対する有効なワクチン戦略の開発が、医学研究の主要な最前線の一つとなっている。研究の主眼は、患者においてＴｈ１様応答を誘発できる病原性微生物からの抗原および抗原増強剤に置かれている。Ｔｈ１応答が感染性病原体に対して保護的であることが知られている。Ｔｈ１応答は、ほとんどのワクチンプロトコールでは、一部の患者において弱いか全く認められない。他の研究の主眼は、粘膜を介して体内に侵入する微生物に対して保護効果があると考えられるＩｇＡ抗体応答の誘発に置かれている。ＩｇＡ応答には、Ｔｈ２細胞が介在する。本発明の方法は、生体外予防接種方法を提供して（すなわち、患者の単核細胞に生体外でワクチン抗原を加えることで、所望の調節細胞分化を促進する条件下でその細胞を活性化する）、患者がワクチンに対して誘発する種類の免疫応答をより良好に制御するものである。本発明の方法を用いて、患者から採血を行い、単離した単核細胞をＩＬ−１２および／またはＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−４の存在下にワクチン抗原に曝露し、Ｔｈ１またはＴｈ２細胞を増殖して再注入を行うことができる。好ましくは使用される細胞は記憶表現型を持つことで、長期保護を提供するものとする。ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺のＴｈ１またはＴｈ２細胞を単独もしくは組み合わせて形成することができると考えられる。以下の実施例は、例示のみを目的とするものであり、本発明の範囲を制限するものではない。実施例１分裂誘発性モノクローナル抗体のスクリーニング本実施例は、Ｔ細胞サブセットを単独もしくはそれの組み合わせで増殖するのに好適な抗体を確認する方法を示すものである。Ｔ細胞サブセットの増殖に必要な共刺激信号を決定するため、細胞を各種モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とともにインキュベーションし、³Ｈ−チミジン取り込みアッセイでその増殖を測定する。その手順の例を示すため、以下の実験を行った。ＣＤ３に対するモノクローナルＡｂ（６４．１、ＩｇＧ２ａ）および抗ＣＤ５（１０．２、ＩｇＧ２ａ）は、レドベター氏（J.Ledbetter，Bristol Meyers，S eattle）から提供され、ＣＤ２８に対するｍＡｂ(Kolt-2、ＩｇＧ１)はサガワ氏 (K.Sagawa、久留米大学)から提供されたものである。これらのｍＡｂを、蛋白Ａセファロースカラムで、腹水から精製した。他のｍＡｂはいずれも購入したものである（PharMingen，San Diego，CA）。いずれのｍＡｂも、リン酸緩衝生理食塩水に対して透析し、無菌の０．４５μｍフィルターで濾過した。ヤギ抗マウスアフィニティ精製抗体（Tago，Burlingame，CA）をプラスチック製９６ウェル培養プレートに固定化した。抗体を、濃度１０μｇ／ｍＬでホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８.６）に溶かし、各ウェルに１００μＬずつ接種した。プレートを、１０％健常ヒト血清を含むＲＰＭＩ−１６４０で３回洗浄した。細胞を氷上で１５分間にわたって抗ＣＤ３ｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ）で標識してから、平板培養に供した。各ウェルで５００００個の細胞を平板培養した。１μｇ／ｍＬの可溶相にて共刺激ｍＡｂを加えた。細胞を５％ＣＯ₂ 雰囲気下に３７℃で培養した。８８時間培養した後、細胞に１μＣｉの［³Ｈ］ −チミジン（比活性２Ｃｉ／ｍｏｌ、New England Nuclear）を適用した。８時間後、細胞をＰＨＤ細胞ハーベスタ（Cambridge Technology，Cambridge，MA）で回収し、液体シンチレーションカウンター（LS1701，Beckman）で濾紙上の放射能をカウントした。健常対象者からの精製ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞にｍＡｂを加えて得られた結果を以下に示してある。結果は、４連での１分間当たり平均カウント数（ｃｐｍ）として示してある。標準誤差は常に１０％未満であった。これらのデータは、細胞を抗ＣＤ３で活性化させた場合に、抗ＣＤ５およびＣＤ２８がＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットにおけるＴ細胞増殖の共刺激信号を提供できることを示している。抗ＣＤ５およびＣＤ２８を組み合わせた場合の結果を以下に示してある。これらの結果は、ＣＤ３活性化精製Ｔ細胞で共刺激信号として抗ＣＤ５および抗ＣＤ２８を組み合わせることで、いずれかのｍＡｂ単独の場合より大きい増殖応答が誘発されることを示している。さらに、これらｍＡｂの併用によって、ＩＬ−２を加えずに増殖応答が得られた。抗ＣＤ３または抗ＣＤ２（第１の信号）とともに使用される健常ドナーからの精製ＣＤ８＋細胞に対する各種ｍＡｂ（第２の信号）の効果についても調べた。これらの結果を以下に示してある。これらの結果は、第１の信号としての抗ＣＤ３が抗ＣＤ２より強力な増殖刺激を与えることを示している。抗ＣＤ４５ＲＯおよび抗ＣＤ２８のｍＡｂは、抗ＣＤ３と併用した場合に、最も強い第２信号すなわち共刺激信号を提供するように思われる。これらの抗体の組み合わせを、黒色腫細胞のＭＡＧＥ−３抗原に特異的な抗ＣＤ３活性化した生体外形成ＣＤ８＋細胞溶解性細胞について調べた。その結果を以下に示してある。抗ＣＤ１１ａを含む組み合わせにより、これらの細胞について最強の増殖信号が得られた。これらの組み合わせで、非常に例外的な成長を行うものはなかった。それは、十分な内因性サイトカインを産生することができないＣＤ８＋ＣＴＬで生じる場合がある。しかしながら、自己ＣＤ４＋によるこれら細胞の共培養によって、ｍＡｂ刺激によるこれら細胞の増殖が促進された。これは恐らく、ＩＬ −２、ならびにＩＦＮ−γおよびＩＬ−７の内因性産生の増加によるものであった。実施例２健康ドナーからのＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞本実施例は、ポリクローナル的に活性化されたＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺調節Ｔ細胞サブセットを、開示された方法を用いて、ＩＬ−２を使用せずに、約１×１０⁶ 個という開始時数から臨床的に有効な数まで増殖させることができることを示すものである。Ａ．単核細胞の採取健常ドナーからの単核細胞を、白血球パック（Interstate Blood Bank，Inc. ）ソースから入手した。白血球パックの細胞を、カルシウム（Ｃａ²⁺）やマグネシウム（Ｍｇ²⁺）を含まないハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）で１：１希釈し、希釈した細胞３０〜３５ｍＬをフィコール-ハイパーク１２ｍＬに加え、その管を室温で１５００ＲＰＭにて遠心した。リンパ球および単球を含む白血球層を毛細管ピペットによって清浄な５０ｍＬ遠心管に移し入れ、ＨＢＳＳで３回洗浄した。次に、１０％ヒト血清、２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、２．０ｍＭグルタミン、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、２×１０^-5 Ｍ２−メルカプトエタノール、１０ＩＵのペニシリンＧおよび１００ｍｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｃＲＰＭＩ）に細胞を懸濁させた。５％ＣＯ₂および湿度１００％の雰囲気下に３７℃で終夜インキュベーションしたプラスチック製Ｔ細胞フラスコに付着させることで、単球をなくさせた。Ｂ．前駆細胞の精製免疫磁性ビーズ法を用いて、Ｔ細胞サブセットを精製した。ＧＡＭ被覆したビーズ（Dynal，Inc.）をＨＢＳＳで２回洗浄し、１％健常ヒト血清を含むＨＢＳＳ中４℃で回転ホイール上にて終夜インキュベーションして、非特異的結合を遮断した。氷上で予め力価決定した濃度の抗ＣＤ４または抗ＣＤ８のｍＡｂとともに、非付着細胞を３０分間インキュベーションした。標識した細胞を２回洗浄し、細胞１０個／ｍＬでｃＲＰＭＩ中に再懸濁させた。ビーズ／細胞比２：１で細胞にビーズを加え、十分混和した。この混合物を４℃にて５００ＲＰＭで１分間温和に遠心した。遠心管を慎重に上下反転させることで、ビーズ／細胞混合物を再懸濁させた。次に、遠心管を４℃で３０分間、回転ホイールに乗せた。次に、ビーズ／細胞混合物をｃＲＰＭＩで５倍に希釈し、コバルトサラリウム磁石上に乗せた。上清を吸引・ロゼット形成し、その手順を繰り返した。５％ＣＯ₂雰囲気下に３７℃ でｃＲＰＭＩ中、ロゼットを２４時間インキュベーションした。２４時間後、大半の細胞をビーズから脱着させ、溶液を磁石上に戻すことでビーズを除去した。得られた細胞は、フローサイトメトリーによって評価したところ、９８％を超える純度のＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺Ｔ細胞であった。Ｃ．生体外での分化精製ＣＤ４＋細胞を、それぞれ１００万個ずつの２つの異なる群に分けた。第１群は、４００Ｕ／ｍＬのＩＬ−４および１０μｇ／ｍＬの抗ＩＦＮ−γｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂの存在下に固定化抗ＣＤ３ｍＡｂによって活性化した。この第１群（Ｔｈ２）を、その条件下に、さらに１０日間増殖させた。第２群は、２５Ｕ／ｍＬのＩＬ−１２および１５０Ｕ／ｍＬの抗ＩＦＮ−γ、および抗ＣＤ２８ｍＡｂの存在下に固定化抗ＣＤ３によって活性化した。この細胞は、６日間の培養後に回収・洗浄した。Ｄ．調節細胞の増殖各精製Ｔ細胞小群１００万個を、氷上で抗ＣＤ３ｍＡｂ（６４．１、ＩｇＧ２ａ）によって３０分間標識した。精製ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺細胞２．５×１０⁵個をｃＲＰＭＩ１ｍＬに懸濁させ、ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）ポリクローナル抗体で被覆した２４ウェルプレートの４つの異なるウェルに入れた。精製抗ＣＤ５（１０．２、ＩｇＧ２ａ）および抗ＣＤ２８（ＫＯＬＴ−２、ＩｇＧ１）ｍＡｂを、最終濃度２００ｎｇ／ｍＬでウェルに加えた。次に、５％ＣＯ₂雰囲気下に３７℃でインキュベーションした。３日後、２００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ５および抗ＣＤ２８を含むｃＲＰＭＩ１ｍＬをウェルに加えた。６日後、ウェルを回収し、蓄積し、ｃＲＰＭＩで２回洗浄した。生存細胞をカウントし、１×１０⁶個／ｍＬでｃＲＰＭＩに懸濁させ、Ｔ型培養瓶中３７℃で４８時間インキュベーションした。次に、細胞を回収し、２回洗浄し、氷上で３０分間にわたり抗ＣＤ３ｍＡｂで標識し、２００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８および抗ＣＤ５ｍＡｂとともに、ＧＡＭ被覆した小型中空繊維バイオリアクタのキャピラリ外空間に接種した。１４日後に、細胞を回収し、洗浄し、計数した。１．小型中空繊維バイオリアクタ小型中空繊維装置を作製して、免疫エフェクタ細胞の増殖を行った。その装置には、４個の小型中空繊維ユニットを並列で設けた。中空繊維（CD Medical，Hialeah，FL）のキャピラリ外容量は９ｍＬであり、繊維の分子量カットオフ値は１００００ダルトンであった。中空繊維をＧＡＭポリクローナル抗体で被覆した。被覆は、ＧＡＭポリクローナル抗体を濃度１０ｍｇ／ｍＬでホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）に溶かし、その無菌溶液を中空繊維バイオリアクタのキャピラリ外空間(ＥＣＳ)に接種することで行った。管腔およびＥＣＳの口を封止し、バイオリアクタを回転板に乗せ、４℃で２４時間インキュベーションした。使用に先だって、バイオリアクタを１％健常ヒト血清を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。流路には、収納容器、ポンプおよび酸素化カートリッジなどがあった。管腔流量は１００〜４００ｍＬ／分の範囲であり、バイオリアクタでの細胞の成長に比例して手動で上昇させた。ｐＨおよび温度は連続的にモニタリングして、マイクロプロセッサで制御した。収納容器に供給する新鮮な培地の速度および酸素化カートリッジ中のＣＯ₂パーセントを変えることで、ｐＨを７．２に調節し、それに維持した。収納容器周囲に巻き付けた加熱コイルにかけるワット量を調節することで、温度を３７℃に制御した。２．１台の大型中空繊維バイオリアクタ小型中空繊維装置から回収された細胞を、Ｔ−フラスコ中、ｍＡｂ刺激を行わすに、ｃＲＰＭＩ中細胞１×１０⁷個／ｍＬで４８時間インキュベーションした。次に、抗ＣＤ３ｍＡｂで細胞を標識し、ＧＡＭ被覆した大型中空繊維バイオリアクタに、２００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ５および抗ＣＤ２８ｍＡｂとともに接種した（同時係属中の認可された上記米国特許出願０８／５０６１７３号参照）。１４日後、細胞を回収、洗浄および計数した。３．８カートリッジ中空繊維バイオリアクタ１台の大型中空繊維バイオリアクタから回収した細胞（同時係属中の認可された上記米国特許出願08／506173号参照）を、ｍＡｂ刺激を行わずに、ｃＲＰＭＩ中細胞１０⁷個／ｍＬで１０リットルのスピンナフラスコ中にて４８時間インキュベーションした。次に、抗ＣＤ３ｍＡｂで細胞を標識し、８台のＧＡＭ被覆した中空繊維バイオリアクタそれぞれに、２００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ５および抗ＣＤ２８ｍＡｂとともに接種した。１４日後、細胞を回収、洗浄および計数した。Ｅ．結果臨床的に有効な数の細胞を以下のように得た。従って、臨床的に有効な数のＴ細胞サブセットを含む組成物を得ることができる。実施例３ＨＩＶ⁺患者からのウィルス除去ＣＤ４⁺Ｔｈ１細胞本実施例は、本発明の方法によって、ＡＩＤＳについてのＡＣＴとして使用するための臨床的に有効な数のウィルス除去ＣＤ４⁺Ｔｈ１細胞を生成することができることを示すものである。ＣＤ４抗原を選択することで、細胞から活動性ウィルスを除去し、ポリクローナル的に活性化し、再度ＣＤ４抗原についての選択を行って、潜在ウィルスを除去した。Ａ．単核細胞の取得通常の血液スクリーニング法によって確認されウェスタンブロッティング分析によって確認されたＷＨＯＩＶ期のＨＩＶ⁺患者を、本試験のドナーとした。患者について、白血球除去法を行って、末梢血単核球採取を行った。Ｂ．調節細胞の精製前述の免疫磁性ビーズでの陽性選択によって、ＣＤ４⁺細胞を単離した。ＣＤ４⁺細胞を、４０Ｕ／ｍＬのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の存在下に、固定化抗ＣＤ３ｍＡｂとともに２４ウェルプレートで活性化した。２４時間培養後、細胞を回収し、洗浄し、免疫磁性ビーズで再度ＣＤ４についての選択を行った。陽性選択された細胞を抗ＣＤ３ｍＡｂで標識し、ＧＡＭ被覆した９６ウェルプレートで、細胞２５０００個／ウェルにて、ｃＲＰＭＩ中で平板培養した。抗ＣＤ２８ｍＡｂおよびＩＦＮ−γをそれぞれ濃度１μｇ／ｍＬおよび４０Ｕ／ｍＬで、ウェルに加えた。７日後、各ウェルからの上清について、市販のＥＬＩＳＡアッセイキット（DuPont）を用いてｐ２４抗原を調べた。陰性のウェルを全て集め、再度抗ＣＤ３ｍＡｂによって標識し、ＧＡＭ被覆した９６ウェルプレートで、細胞２５０００個／ウェルにて、ｃＲＰＭＩ中抗ＣＤ２８ｍＡｂとともに平板培養した。Ｃ．調節細胞増殖抗ＣＤ２８ｍＡｂのみを共刺激剤として用いた以外は、上記の実施例２に記載の方法に従って細胞の増殖を行った。Ｄ．結果６．３×１０¹⁰個の細胞を７２日間成長させた。細胞はｐ２４抗原について陰性であり、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生することができたが、ＩＬ−４はほとんど産生できなかった。その細胞はさらに、用量依存的な形でＮＫ機能を助けることができることが明らかになった。その細胞を患者に再注入した。細胞をＨＩＶ⁺患者に再注入することで、ＡＩＤＳの治療が行えるはずである。実施例４ＨＩＶ⁺ドナーからのＨＩＶ特異的ＣＤ８⁺細胞本実施例は、抗原特異的ＣＴＬをウィルス感染者から精製・増殖できることを示すものである。Ａ．エフェクタ細胞の取得ＩＶ期ＡＩＤＳ患者からの白血球除去によって、３×１０⁸個の単核球を得た。免疫磁性ビーズでの選択を２回行って、ＣＤ８⁺、ＣＤ２５⁺細胞を精製した。Ｂ．エフェクタ細胞の増殖約２×１０⁶個の細胞を回収し、抗ＣＤ３ｍＡｂおよび可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂで被覆した２４ウェルプレートで増殖させた。６日後、細胞を洗浄し（２回）、小型中空繊維バイオリアクタに接種した。小型中空繊維ユニットで１８日間経過させた後、細胞を洗浄し、計数し、２日間静置してから、上記の実施例２に記載の条件と同じ条件下に大型中空繊維バイオリアクタのカートリッジに接種した。１６日後、細胞を回収し、洗浄し、２日間静置した。次に、８カートリッジ中空繊維バイオリアクタシステムに生存細胞を接種し、上記の実施例２に記載のものと同じ条件下に培養を行った。Ｃ．結果２０日後に、６×１０¹⁰個の生存細胞を回収した。その細胞は、感染自己細胞に対してかなりのＡｇ特異的ＣＴＬ活性を示した。その細胞は、ＡＩＤＳ治療として患者に再注入することができる。さらにその細胞は、実施例３に記載の方法に従って得られたウィルス除去ＣＤ４⁺と同時注入することができる。実施例５健常ドナーからの抗原特異的Ｔｈ２様細胞本実施例は、健常者から抗原特異的Ｔｈ２様ＣＤ４⁺細胞を誘導して、臨床的に有効な数まで増殖できることを示すものである。Ａ．調節細胞の取得ＨＩＶ^-志願者から、血液５０ｍＬを、ヘパリンを加えた注射器に無菌的に採血した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、フィコール-ハイパック密度勾配遠心法によって分離した。ＰＢＭＣを１０ｍＬのＴ−フラスコ中２×１０⁶個／ｍＬで培養し、１．０μｇ／ｍＬの抗ＩＦＮ−γｍＡｂおよび２０Ｕ／ｍＬのＩＬ−４を含むｃＲＰＭＩ中のｇｐ１２０抗原を適用した。２日後、免疫磁性ビーズでのＣＤ２５の選択によって芽細胞を回収した。芽細胞を７２時間静置し、gp120を適用した自己単球で再度刺激し、直ちに軟寒天中でクローニングした。生存してコロニーとして成長したわずかな数の細胞（1／150000）はＡｇ特異的細胞が増加されていて、その細胞は刺激によってＩＬ−４およびＩＬ−１０を産生し、ＩＦＮ−γをほとんど産生しないことからサイトカインプロファイルにおいてＴｈ２様であった。Ｂ．エフェクタ細胞の増殖実施例２に記載の方法に従って細胞を増殖し、６２日間で９×１０¹⁰個まで成長させた。実施例６慢性関節リウマチ末梢血中の前駆細胞からのＴｈ２細胞の分化慢性関節リウマチ（ＲＡ）においてはＴ細胞サイトカイン発現は非常に低く、Ｔｈ２因子（例：ＩＬ−４およびＩＬ−１３）の不在が特に顕著である。Ｔｈ２サイトカインは催炎性サイトカイン、メタロプロテイナーゼおよびリウマチ因子の産生を抑制することから、ＲＡにおいてそれが相対的に少ないことが、疾患の永久化の原因であると考えられる。滑液におけるＴｈ２細胞の不足は、その分化経路がＲＡにおいては障害されている可能性があることを示唆している。ＲＡにおいてＴｈ２前駆細胞が存在するか否かを求めるため、末梢血ＲＡＣＤ４＋Ｔ細胞がインビトロでＴｈ０（ＩＬ−４＋ＩＦＮ−λ）、Ｔｈ１（ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４はなし）およびＴｈ２細胞（ＩＬ−４、ＩＦＮ−λはなし）に分化する能力について調べた。固定化αＣＤ３抗体、αＩＬ−１２およびＩＬ−４の存在下に、３日間にわたって精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養した。次に、細胞を洗浄し、モネンシンの存在下にＰＭＡおよびイオノマイシンによって６時間刺激した。αＩＬ−４およびβＩＦＮ−λモノクローナル抗体で透過性とした細胞での２色フローサイトメトリーを用いて、サイトカイン表現型を明らかにした。結果を、細胞パーセント±標準誤差(ｓｅ)として示してある。「ｎ」値を括弧内に示してある。これらのデータは、健常者とＲＡ患者の末梢血中には、同様の数のＴｈ２細胞前駆細胞が存在することを示している。さらに、ＩＬ−４抗体およびα−ＩＬ− １２抗体によって、成熟Ｔｈ２細胞群を有意に増加させることができる（ｐ＜０．０５）。従って、特異的Ｔｈ２前駆細胞の不足は関節におけるサイトカインプロファイルを説明するものではない。このことは、生体外で分化・増殖したＴｈ２細胞の投与が関与する新規な治療法が開発される可能性を生じさせる。実施例７ＨＩＶ＋リンパ球の増殖ＨＩＶ＋ドナーからのＰＢＬがポリクローナル活性化物質ＰＨＡ−Ｐおよび固定化抗ＣＤ３ｍＡｂに反応して増殖する能力を、健常ドナーからのＰＢＬと比較した（表１）。ＨＩＶ＋ドナーからのＰＢＬは、健常ドナーからのＰＢＬと比較した場合、いずれの分裂促進信号に応じる能力においても、顕著な抑制を示した。表１：健常者ドナーＰＢＬとＨＩＶ＋ドナーＰＢＬの分裂促進因子に対する増殖応答の比較^* *フィコール-ハイパック法で単離した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、９６ウェル平底培養プレートで細胞５００００個／ウェルにて平板培養した。培地のみ、ＰＨＡ−Ｐまたは固定化抗ＣＤ３ｍＡｂによる刺激を８８時間行った後、細胞に８時間にわたって［³Ｈ］−チミジンを適用し、健常者６名およびＨＩＶ＋被験者６名についての４連サンプルの平均および標準誤差をｃｐｍに示してある。ＨＩＶ＋ドナーからの精製Ｔ細胞サブセットが、活性化物質不在下に分裂促進刺激に応じることができるか否かを明らかにするため、以下の試験を実施した。健常者６名およびＨＩＶ＋被験者６名（表１に示した実験での参加者と同一）からのＰＢＬを、５％ＣＯ₂を含む空気の雰囲気下に、３７℃で２４時間にわたり、プラスチック製組織培養皿でインキュベーションした。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを、前述の免疫磁性ビーズでの陽性選択によって精製した。結果を表２に示してある。表２：健常者およびＨＩＶ＋被験者のＴ細胞サブセットの分裂促進物質に対する増殖応答 ^*健常ドナー６名およびＨＩＶ＋ドナー６名から、免疫磁性ビーズでの陽性選択によって単離したＴ細胞サブセット。平均純度を括弧内に示してある。９６ウェル平底組織培養プレートで、ＣＲＰＭＩおよび１０％ＮＨＳ中、細胞５００００個／ウェルにて細胞を平板培養し、培地のみ、固定化抗ＣＤ３＋ＩＬ−２（１０ｕ／ｍＬ）またはＰＭＡ（０．５ｎｇ／ｍＬ）のいずれかによる刺激を８８時間行った後、１μＣｉ［³Ｈ］−チミジンを８時間適用した。結果は、平均ｃｐｍおよび標準誤差として示してある。各群とも３連で行った。得られた結果は、ＨＩＶ＋ドナーについてかなりのＴ細胞増殖応答が可能であることを示している。ＨＩＶ＋ドナー細胞の抗ＣＤ３＋ＩＬ−２に対するＣＤ４＋細胞応答は健常ドナーでは約３０％未満であったが、それでもなお、培地のみ対照の場合より有意に高い値であった。ＨＩＶ＋ドナーのＣＤ８＋細胞の抗ＣＤ３＋ＩＬ−２に対する応答は、健常者細胞の場合とほぼ同等であった。健常ドナー細胞およびＨＩＶ＋ドナー細胞のＣＤ８＋応答は、ＣＤ４＋細胞で認められたものよりかなり低かった。これらの結果は、ＨＩＶ＋ドナーからの精製Ｔ細胞サブセットが分裂促進信号に応答できることを示している。分裂促進性ｍＡｂが、ＨＩＶ＋ドナーからの抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞で、Ｔ細胞増殖の第２の信号を提供できるか否かを明らかにするため、以下の実験を行った。ＨＩＶ＋ドナーのＰＢＬから精製したＴ細胞を、ＡＥＴ処理したＳＲＢＣを用いて単離した。抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞を、可溶性抗ＣＤ８のみ、抗ＣＤ５のみ、ならびに抗ＣＤ２８と抗ＣＤ５の組み合わせに対して曝露した。結果を表３に示してある。表３：ＨＩＶ＋ドナーからのＴ細胞の分裂促進性ｍＡｂに対する増殖応答^* ^*ＡＥＴ処理ＳＲＢＣＥ−ロゼット形成法によって精製したＴ細胞（９９．６％ＣＤ３＋）を、ＨＩＶ＋ドナーのＰＢＬから単離した。９６ウェル平底組織培養プレートで、ｃＲＰＭＩおよび１０％ＮＨＳ中、細胞５００００個／ウェルにて細胞を平板培養した。細胞を固定化抗ＣＤ３ｍＡｂで活性化し、ＩＬ−２（１０ｕ／ｍＬ）、可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ（２００ｎｇ／ｍＬ）、可溶性抗ＣＤ５（２００ｎｇ／ｍＬ）または可溶性の抗ＣＤ８と抗ＣＤ５の組み合わせのいずれかで刺激した。８８時間の刺激後、細胞に１μＣｉ［³Ｈ］−チミジンを８時間適用した。結果は、１名のドナーからのｃｐｍおよび標準誤差として示してある。各処理群とも４連で行った。抗ＣＤ２８は、ＨＩＶ＋ドナーからの精製Ｔ細胞に対する第２の信号提供において、ＩＬ−２と同様の効果を示した。抗ＣＤ５は単独および抗ＣＤ２８との併用では効果を示さなかったが、健常ドナーからのＴ細胞では増殖応答を高めた。増殖応答に必要な最低細胞密度固定化抗ＣＤ３／可溶性抗ＣＤ２８系においてＨＩＶ＋ドナーからの７種類の細胞を増殖させる上で必要な最低細胞密度を求めるため、以下の試験を実施した。ＨＩＶ＋ドナーおよび健常ドナーからのＴ細胞を、前述のＡＥＴ処理ＳＲＢＣＥ−ロゼット法を用いて精製した。Ｔ細胞の純度はＨＩＶ＋ドナーで９９.４％、健常ドナーで９９.２％であった。Ｔ細胞を、初期濃度１×１０⁶個／ｍＬから連続希釈し、９６ウェルプレートで平板培養した。最終細胞数／ウェルは、１０００００〜１０００の範囲であった。いずれの実験群も４連で試験を行った。結果を表４に示してある。表４：抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８系でのＴ細胞増殖応答に必要な最低細胞密度 ^*健常ドナーおよびＨＩＶ＋ドナーからのＡＥＴ処理ＳＲＢＣを用いたＥ−ロゼット形成法によって精製したＴ細胞について、固定化抗ＣＤ３ｍＡｂおよび２００ｎｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂに対する応答能力を調べた。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８または培地のみと８８時間培養してから、さらに８時間にわたって、［³Ｈ］−チミジンを適用した。結果はｃｐｍ±標準誤差として示してある。いずれの処理群とも試験は２連で行った。各処理群で１名のドナーを用いた。ＨＩＶ＋ドナーからのＴ細胞は、２．５×１０⁵個／ｍＬ（ウェル当たり２５０００個）を超える細胞密度で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８系においてかなりの増殖応答を示した。健常ドナーからのＴ細胞は、密度５×１０⁴個／ｍＬ（５０００個／ウェル）まで下げても応答することができた。ＨＩＶ＋ドナーからのＴ細胞の増殖応答は、健常ドナーからのＴ細胞より約５０％低いものであった。ＨＩＶ除去法Ｈ９連続細胞系ＡＩＤＳ患者の免疫系を再構築するには、多数のＣＤ４＋細胞が必要である。その細胞は潜在性および活動性のＨＩＶ−１を有することから、ウィルスを含まないＣＤ４＋細胞の開始群を単離する方法が必要である。除去法が１００％有効でなければ、宿主細胞の活性化によって複製の刺激を受けることで、ウィルスは急速に培地を占有する。ＨＩＶ−１のＡＩＤＳ患者からＣＤ４＋細胞を除去することができるか否かを明らかにするため、ＨＩＶ感染連続細胞系を用いた。細胞系Ｈ９（ＮＴＨのGall o博士から提供を受けたもの；ＡＣＴＴ寄託番号ＣＲＬ８５４３）は、クローニングしたＣＤ４＋ヒトリンパ球系である。それを培地で連続的に成長させて、ＨＩＶ−１を連続的に増殖させることもできる。２４ＥＬＩＳＡ市販のキット（DuPont）を用いて、細胞培養液中のウィルス量のアッセイを行い、除去実験の効率をモニタリングした。そのキットは、５０００個の細胞中の１個のウィルス粒子を検出できるものである。試験では、ＨＩＶｐ２４核抗原に対して非常に特異性の高いウサギポリクローナル抗体を用いる。その抗体を９６ウェルプレートに固定する。抗体は、５％Triton−Ｘで処理して細胞を溶解させた後に、細胞培養液の上清中に放出されるｐ２４抗原を捕捉する。捕捉されたｐ２４核抗原は、抗ｐ２４ビオチン処理ポリクローナル抗体と複合体を形成する。得られた複合体をストレプトアビジン−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）接合体で調べる。捕捉されたＨＩＶｐ２４抗原の量に比例して黄色様色を生じるオルトフェニルジアミン−ＨＣｌ（ＯＲＤ）とともにインキュベーションすることで、複合体は検出される。各ウェルの吸光度をマイクロプレート読取装置（Dy natech，Minireader 11）で測定し、既知値のｐ２４抗原の吸光度に対して較正を行った。試験の感度を高めるため、被験細胞をＰＨＡ活性化正常リンパ球と共培養した。結果除去プロトコールで用いる理論は、感染細胞の公知の表現型挙動に基づいたものである。活動性ウィルスを有するＨＩＶ細胞は、その細胞表面にｅｎｖ遺伝子産生物ｇｐ１２０およびｇｐ４１を発現する。活動性ウィルスを有するＨＩＶ＋細胞はそのＣＤ４受容体を取り込むことが報告されていることから、ＣＤ４の陽性選択について調べた。フローサイトメトリーによって測定したところ、ＨＩＶ−１感染していないＨ９細胞（Ｈ９−）は８５％ＣＤ４＋であるのに対して、感染Ｈ９細胞（Ｈ９＋）は４％ＣＤ４＋であった。１０００万個のＨ９細胞を以下の比率で混合する実験を計画した。（１）１０％Ｈ９＋と９０％Ｈ９− （２）３０％Ｈ９＋と７０％Ｈ９− （３）６０％Ｈ９＋と３０％Ｈ９− （４）８０％Ｈ９＋と２０％Ｈ９− 各群からの細胞について、免疫磁性ビーズを用いたＣＤ４の陽性選択を行った。陽性選択された細胞のサンプルについて、市販のＥＬＩＳＡ試験を用いてｐ２４を調べた（共培養なし）。結果を表５に示してある。表５：ＨＩＶ−１感染Ｈ９細胞の除去 ^*陰性対象と同じＨＩＶ−１に感染した連続細胞系Ｈ９（Ｈ９＋）および非感染Ｈ９（Ｈ９−）を各種比率で混合した。ＣＤ４表面抗原を発現する細胞を、特異的ｍＡｂおよび免疫磁性ビーズを用いて混合物から除去した。培地中のｐ２４抗原の量を、除去プロセスの前後で測定した。１００％Ｈ９＋群を除く全ての群で、このアッセイでの検出限界以下までウィルスを除去することに成功した。陰性分画がそのままウィルスを含まない状態を維持するか否かを明らかにするため、ｃＲＰＭＩ中の３×１０⁶個の指標細胞（ＰＨＡで７２時間活性化した正常リンパ球）および１０⁹個のＮＨＳとともに、２４ウェルプレートで、細胞を２０日間インキュベーションした。第７日に、新鮮な指標細胞を再度加えた。第７日、第１４日および第２０日に、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘによって各群からの１ ×１０⁸個の細胞を溶解し、ｐ２４についてのアッセイを行った。結果を表６に示してある。表６：指標細胞とウィルス除去Ｈ９細胞との共培養各種比率でＨ９−細胞と混合したＨ９＋細胞について、免疫磁性ビーズを用いてＣＤ４＋細胞の除去を行った。Ｈ９−分画をＰＨＡ刺激リンパ球と共培養した。その分画について、第０日、第７日、第１４日および第２０日に、ｐ２４ウィルス抗原の有無を調べた。これらの結果は、最初のウィルス除去が１００％有効ではなく、アッセイの感度レベル以下でウィルスがなお存在し得ることを示している。ウィルスを含まない培養液を得る試みをさらに行うべく、各群からの細胞１×１０⁶個を連続希釈し、２４ウェルプレートの２０００個のウェルで、ウェル当たり細胞５００個での平板培養を行った。細胞を１４日間増殖させ、次に指標細胞とともにに、以前と同様にして２０日間共培養した。前述の方法に従って、２０日後に、細胞サンプルについてｐ２４抗原の分析を行った。結果を表７に示してある。表７：５００個／ウェルでの平板培養後のウィルス除去Ｈ９細胞と指標細胞との共培養 ^*いずれの値も陰性対照より高い。各種比率でＨ９−細胞と混合し、ＣＤ４＋細胞を除去し、ＰＨＡ刺激指標リンパ球とともに２０日間共培養したＨ９＋細胞を連続希釈して、２４ウェルプレートのウェル当たり細胞５００個とした。細胞を１４日間増殖させ、ｐ２４ウィルス抗原についてのアッセイを行った。Ｈ９＋細胞／Ｈ９−細胞の各比率からのウェルで陽性であったもののパーセントを示してある。これらの結果は、連続希釈による陽性選択によって、ウィルス感染した細胞を除去できることを示していた。この方法についてさらに妥当性評価を行うため、陰性ウェルを蓄積し、さらに２０日間にわたって指標細胞とともに培養した。いずれの群も、ｐ２４抗原について陰性のままであった（データは示していない）。そこで、ＣＤ４＋細胞の陽性選択とそれに続く連続希釈との併用は、ウィルス除去法として有用なはずである。アッセイシステムの感度をさらに調べるため、Ｈ９＋細胞から、５００個／ウェルから１個未満／ウェル（１個／ウエルを超える２倍希釈と定義）までの２倍連続希釈液を行った。結果を表８に示してある。表８：Ｈ９＋細胞の連続希釈によるｐ２４抗原アッセイの感度試験市販のＥＬＩＳＡ（DuPont）での既知濃度のｐ２４抗原の吸光度を、ＨＩＶ− １感染連続細胞系（Ｈ９）からの細胞溶解物の吸光度と比較した。これらの結果は、このアッセイが極めて感度が高いことを示しており、０．０１５７ｎｇ／ｍＬという低濃度まで、＜１個／ウェルでｐ２４を検出することができる。ＨＩＶ＋ドナーからのウィルス除去Ｈ９試験から、連続希釈とＣＤ４＋細胞の陽性選択を併用することで、ウィルスを含まない細胞小群を単離できることが示された。その方法は、市販のｐ２４アッセイによって高感度でモニタリングすることができる。しかしながらこの方法は、細胞からの潜在ウィルス除去を行うものではない。潜在ウィルスを増殖させるには、宿主細胞を活性化しなければならない。固定化抗ＣＤ３系がその細胞の有効な活性化物質であることが明らかになっている。活性化後、ウィルスを含まない細胞を保護しなければならず、そうしなければ、その細胞はｐ２４アッセイでの指標細胞の場合同様、間もなく感染するようになる。抗ＣＤ４ｍＡｂを用いて、未感染ＣＤ４＋細胞を保護した。材料および方法上記の白血球分離法に従って、ＡＩＤＳ患者からリンパ球を単離した。未分画細胞のサンプルについて、２０日間の共培養試験でｐ２４を調べた。マクロファージ付着、ＣＤ４陽性選択およびＣＤＢ陽性選択後に、同様のサンプルを調べた。２４ウェルプレートでＣＤ４＋細胞を、固定化ＣＤ３ｍＡｂ上で活性化した。可溶性抗ＣＤ２８を培地に加え、７日後に細胞を回収した。ＣＤ４＋細胞を再度抗ＣＤ４で標識し、ＧＡＭ被覆した免疫磁性ビーズによる陽性選択を行った。陽性選択した細胞を抗ＣＤ３で再度標識し、細胞２５０００個／ウェルでＧＡＭ被覆した９６ウェルプレートに加えた。抗ＣＤ２８を成長培地に加えた。７日後、各ウェルからの上清についてｐ２４抗原を調べた。陰性のウェルを全て蓄積し、再度免疫磁性ビーズによるＣＤ４陽性選択を行った。陽性選択された細胞を抗ＣＤ３ｍＡｂで再度標識し、再度２５０００個／ウェルで平板培養した。抗ＣＤ２８を培地に加え、７日後にウェルについてｐ２４を調べた。陰性ウェルを再度蓄積し、抗ＣＤ２８のみを用い残留ウィルスから細胞を保護するために抗ＣＤ４(leu 3a、Becton Dickinson)を加えた以外は、上記の方法に従って増殖させた。細胞を１０００万個以上まで増殖させ、１００万個の小分け部分を回収して、指標細胞による共培養に供し、２０日後に細胞溶解物のｐ２４測定値を得た。結果結果を表９に示してある。表９：ＨＩＶ＋ドナーからのリンパ球のウィルス除去プラスチック製Ｔ−フラスコへの付着によるマクロファージ除去前、マクロファージ除去後、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の陽性選択後にＨＩＶ＋細胞の１００万個細胞溶解物から回収したｐ２４抗原の量ＣＤ４＋細胞を９６ウェルプレートのウェル当たり２５０００個で平板培養し、固定化抗ＣＤ３ｍＡｂおよび可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ上で７日間増殖させた。次に、各ウェルについてｐ２４抗原のアッセイを行った。結果を表１０に示してある。表１０：ＨＩＶ＋ドナーから精製した増殖ＣＤ４＋細胞のウェル中のＨＩＶ−１の検出ＡＩＤＳ患者の末梢血から精製し、固定化抗ＣＤ３ｍＡｂおよび可溶性ＣＤ２８ｍＡｂ上で７日間増殖した２５０００個のＣＤ４＋細胞が入った９６ウェルプレートのウェルから回収したｐ２４抗原の量。各群は、同一患者からの別個の精製の結果を示すものである。陰性ウェルのパーセントは非常に安定していた。陰性ウェルからの細胞を蓄積し、固定化抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８とともに増殖させ、抗ＣＤ４を加えて未感染細胞を保護した。全ての細胞を、２４ウェルプレートで２．５×１０⁵個／ウェルにて平板培養した。培養液中で６日後に回収したＣＤ４＋細胞の数を表１１に示してある。表１１：６日間増殖後の活動型および潜在ウィルスを除去した蓄積ＣＤ４＋細胞活動型および潜在ウィルスを除去したＣＤ４＋細胞を２４ウェルプレートで増殖させた。固定化抗ＣＤ３ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂとともに培養液中で６日間経過させた後、細胞を回収・計数した。２４ウェルプレートからの細胞を蓄積し、スピンナフラスコ中で３日間インキュベーションした。次に、それを抗ＣＤ４で再度標識し、ＧＡＭ被覆免疫磁性ビーズでロゼット形成した。陽性選択細胞１×１０⁶個を、２０日間にわたって指標細胞と共培養した。３群全てについての細胞溶解物がｐ２４について陰性であった（データは示していない）。この結果は、この方法が、ＡＩＤＳ患者の末梢血からのウィルスを含まないＣＤ４＋細胞分画を与え得ることを示している。この３群からの細胞を蓄積し、抗ＣＤ３ｍＡｂで再標識し、２００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８ｍＡｂとともに小型中空繊維装置の２個のＧＡＭ被覆したカートリッジに接種した。培養２１日後、１．７×１０⁸個の細胞を回収した。回収から３日後、細胞を抗ＣＤ３ｍＡｂで再度標識し、２００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８ｍＡｂとともに大量装置の１個のＧＡＭ被覆したカートリッジに接種した。培養２１日後、１．１×１０¹⁰個の細胞を回収した。回収から３日後、細胞を抗ＣＤ３ｍＡｂで再標識し、２００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８ｍＡｂとともに大量装置の８個のＧＡＭ被覆カートリッジに接種した。１８日間培養した後、６．４×１０¹⁰ 個のＣＤ４＋細胞を回収した。細胞はｐ２４について陰性であった。ＣＤ４＋機能試験この方法で単離・増殖したＣＤ４＋細胞がまだ正常な機能を行い得るか否かを示すため、それのＮＫ活性強化能力を評価した。ＡＩＤＳ患者は、ＮＫ機能が低下していることが知られている。いくつかの報告から、外因性ＩＬ−２がインビトロでＡＩＤＳ患者のＮＫ機能を大幅に高め得ることが明らかになっている。本試験から、増殖ウィルス除去ＣＤ４＋細胞が有効であることが明らかになった。材料および方法ＮＫ感受性細胞系Ｋ５６２を標的細胞として用いた。その細胞は、３７℃で６０分間にわたり100μＣｉ／ｍＬの［⁵¹Cr］クロム酸ナトリウム（New England N uclear，Boston，MA）を含むｃＲＰＭＩ中に１×１０⁷個／ｍＬの濃度で懸濁することでクロム標識した。次に、細胞を２回洗浄し、１００μＬずつ細胞５×１０⁴個／ｍＬの濃度にて丸底９６ウェルプレートのウェルに再葱濁させた。５×１０⁶個／ｍＬで懸濁させたＡＩＤＳ患者からの単核球不足リンパ球を、標的細胞を含むウェルに５０μＬずつ加えた。ＣＤ４＋を除いてエフェクタ：標的比が５０：１となるように、各ウェルに追加の培地またはＣＤ４＋細胞５０μ Ｌを加えた。湿度１００％で５％ＣＯ₂中、３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートを８００×ｇで１２分間遠心し、各ウェル１００μＬずつを回収し、液体シンチレーションカウンターでカウントした。各標的細胞の溶媒パーセントを、下記式によって求めた。溶解％＝ｃｐｍ_test−ｃｐｍ_control／ｃｐｍ_max−ｃｐｍ_control×１００式中、ｃｐｍ_testはリンパ球存在下に放出されるクロムの１分当たりカウントを示し、ｃｐｍ_controlは培地のみの存在下の放出を示し、ｃｐｍ_maxはＢＲＩＳ −３５洗剤（Sigma，St.Louis，MO）の存在下での放出を示す。各試験とも４連で行った。平均cpm_testと平均cpm_controlをスチュデントのｔ検定によって比較することで、溶解パーセントの有意差を求めた。結果を表１２に示してある。表１２：自己ウィルス除去CD４＋細胞を補給したAIDS患者からのリンパ球のＮＫ活性自己ウィルス除去ＣＤ４＋細胞による再構築後の１名のＡＡＩＤＳ患者のＮＫ活性。加えた細胞数を括弧内に示してある。結果は４連サンプルの平均±ＳＥとして表してある。２６．２±６．５％というＡＩＤＳ患者のＮＫ活性は、健常対照者の60．2±6 ．4％よりかなり低かった。ＩＬ−２を加えることで、健常被験者およびＡＩＤＳ患者においてＮＫ活性に大幅な上昇があったが、ＡＩＤＳ患者での効果の方がはるかに大きかった。1000個の自己CD4＋細胞を加えても、ＮＫ活性にほとんど上昇はなかった。５０００個および１００００個のＣＤ４＋細胞を加えたところ、活性は大幅に上昇して正常レベルとなった。５００００個のＣＤ４＋を加えた場合、１００００個を加えた場合と効果は同じであった。これらの結果から、このプロトコールによって単離・増殖したＣＤ４＋細胞がＩＬ−２を産生できることが明らかである。その結果はさらに、患者に対して多数のこれらＣＤ４＋細胞を再注入することで、免疫機能が回復されるはずであることを示す証拠を裏付けるものである。ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の精製ＨＩＶ特異的なクラスＩ制限Ｔ細胞が、ＡＩＤＳ患者の血液中に存在することが知られている。それは、CD8＋、CD28＋、ＣＤ１１、ＣＤ２５＋リンパ球のサブセットであると推定される。これらは、インビボで活性化した（ＩＬ２Ｒ＋と同じＣＤ２５＋）Ｔｃ（９．３と同じＣＤ２８＋）である。これらの細胞を単離するため、ＣＤ８（leu 2a，Becton Dickinson）、ＣＤ２８（K.Sagawaから提供されたKOLT-2）、ならびにＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ、Coulter）ｍＡｂおよびＧＡＭ被覆した免疫磁性ビーズを用いて、一連の陽性選択段階を行った。ＣＤ８、ＣＤ２８および最後にＣＤ２５の順に陽性選択が起こった。この単離細胞の一つのサブセットがＨＩＶ特異的であるはずである。この群の他のインビボＴ細胞も治療上重要である可能性がある。それは、患者に害を与える他の偶発的作用物質に対して特異的である可能性がある。ＡＩＤＳ患者では、ＣＤ２５＋細胞のパーセントが高いのが普通であった。調べた患者６名において、平均ＣＤ２５＋細胞は１４±８％であったのに対して、健常対照者６名では３±２．５％であった。ＣＤ８＋機能試験ＡＩＤＳ患者から単離し、５．３×１０¹⁰個まで増殖させたＣＤ８＋ＣＤ２８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞について、ＨＩＶ感染自己ＣＤ４＋リンパ球を溶解させる能力を調べた。標的リンパ球は、エフェクタ細胞を単離したのと同じ患者からのウィルスを含まない増殖ＣＤ４＋細胞であった。そのＣＤ４＋細胞を、２４ウェルプレートでｃＲＰＭＩ１ｍＬ中５×１０⁵個／ｍＬで、固定化抗ＣＤ３上で活性化した。１０⁹Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含むＨ９＋上清１ｍＬを各ウェルに加えた。湿度１００％で５％ＣＯ₂中、３７℃にて４日間インキュベーションした後、ＣＤ４＋細胞をウェルから回収した。Ｋ５６２標的細胞について説明したものと同じ方法によって、細胞を⁵¹Ｃｒで標識した。全ての細胞を、エフェクタ：標的比１００：１、５０：１および２５：１にて丸底９６ウェルプレートで平板培養した。溶解パーセントを前述の方法に従って求めた。各試験は３連で行った。結果を表１３に示してある。表１３：ＨＩＶ＋患者から単離したＣＤ８＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ２５＋キラーＴ細胞；自己ＨＩＶ感染細胞を溶解する能力ＡＩＤＳ患者から単離したＣＤ８＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ２５＋Ｔｃについて、ＨＩＶ−１に感染した自己ＣＤ４＋細胞を溶解する能力を調べた。溶解パーセントは、⁵¹Ｃｒ放出アッセイから計算した。これらの結果はかなりのエフェクタ機能があることを示している。溶解パーセントが低いのは恐らく、ＨＩＶ感染標的のパーセントが低く（７４％がＣＤ４＋のままであった）、しかもバックグラウンドが高いという両方の理由によるものである。以上、好ましい実施態様を参照しながら本発明について説明したが、当業者であれば、本発明の精神および範囲を逸脱しない限りにおいて形式および詳細において変更を加え得ることは明らかである。変更は当業者には明らかであることから、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されるべきものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTIONAutoimmune cell therapy: cell compositions, methods and applications in the treatment of human diseases This application is related to U.S. patent application Ser. No. 08 / 506,668 filed Jul. 25, 1995 cheal Gruenberg, "PROCESS FOR PRODUCING EFFECTOR IMMUNE CELLS FOR USE IN ADOPTIVE CELLULAR IMMUNOTHERAPY "). Claims the benefit of priority over the application. No. 08 / 506,173, filed Jul. 25, 1995, which is hereby incorporated by reference. cheal Gruenberg, "CELL GROWING DEVICE FOR IN VITRO CELL POPULATION EXPANSION "). In the United States national phase, U.S. patent applications 08/506668 and 08/5 No. 06173, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Shall be.Technical field to which the invention belongs The present invention relates to adoptive immunotherapy. In particular, self-cell therapy provided Is done. For isolation, differentiation and / or ex vivo growth from patients Functional or phenotypic Provided is a composition comprising a substantially homogeneous population of certain immune cells. Such fine Reinfuse the cells to treat or prevent disease or to improve the patient's immune status. Also provided is the use of such a composition which varies in the form ofBackground of the Invention T lymphocytes also protect primarily from intracellular pathogens and also suppress certain tumors. Or immune cells to be removed. Mature T lymphocytes are all CD3 cell surfaces Expressing the antigen, based on the expression of either the CD4 or CD8 surface antigen, two Subtypes. CD4⁺T cells are class 11 major histocompatibility complexes (MHC) recognizes antigens that occur in connection with the molecule. CD4⁺The cell it produces Are involved in the regulatory function of the immune response. Saw such as IL-2 These cytokines attack immune cells against pathogens or against invading microorganisms Mediates antibody attack. CD8⁺T cells recognize antigens that arise in the context of class I MHC molecules. CD8⁺Cells are involved in immune responses such as cytotoxic destruction of cells with heterologous antigens. Involved in effector functions. Cells that mediate these responses are cytotoxic T phosphorus Ball (CT L). Generally CD8⁺Cells (but CD4⁺May be These cells play a mechanism of resistance to viral infection and tumors. The effector function of CTL is CD4⁺Depends on cytokine production from regulatory cells ing.Adoptive immunotherapy Adoptive immunotherapy increases the patient's immune response to a virus or tumor Is an experimental treatment method. The method involves removing immune cells from the subject and In vitro formation of effector cells, proliferation of cells to clinically effective numbers and delivery to patients Including re-infusion of the cells. Inject interleukin-2 (IL-2) with cells Adoptive immunotherapy protocols are not commercially available because It is sold and is not widely used. IL-2 uses these protocols Used to cause differentiation and / or proliferation of effector immune cells is there. However, immune cells cultured in IL-2 show continued viability and F Since the effector function becomes cytokine-dependent, IL- 2 need to be injected. Any adoptive immunotherapy involving differentiated effector cells The protocol also uses IL-2. Due to the significant toxicity associated with the use of IL-2, treatment of terminal cancer patients and AIDS patients Adoptive immunotherapy for the treatment of viral infections in children has been limited.Adoptive immunotherapy and its use in cancer treatment First attempt at adoptive immunotherapy in humans lyses fresh tumors Lymphokines are immune effector cells functionally defined by their ability Activated killer (LAK) cells were used. LAK cells are derived from peripheral blood mononuclear cells. Produced when exposed to high concentrations of IL-2 outside (eg Grimmetal.(1982)JE xp Med.155 : 1832). To obtain LAK cells for use in treating cancer patients (US Pat. No. 690915), removing leukocytes from cancer patients and treating them for 3-6 days. Exposure to high concentrations of IL-2 causes some of the cells to differentiate and become LAK cells . The resulting heterogeneous cell population is re-injected into a donor in combination with a high systemic dose of IL-2 You. As mentioned above, high systemic doses of IL-2 are very toxic and well tolerated Not. Methods have been developed to increase the efficacy of LAK cells. During the differentiation stage in vitro, I LAK activity of cells obtained by adding L-amino acid together with L-2 is 4 to 5 times higher Is recognized to be (See, for example, US Pat. No. 4,849,329). IL-2 and Ornithine Deca Administration of LAK cells with ruboxylase inhibitors increases treatment efficacy (See US Patent No. 50027879). Lymphocytes during the LAK differentiation phase of the method Exposure to an anti-CD3 monoclonal antibody (mAb) results in an antibody with high antitumor activity. Effector cells were obtained (U.S. Pat. No. 5,326,763) and, at the stage of LAK differentiation, IL- In both cases where IL-2 was used and when it was not used, IL-7 was used. Thus, stronger LAK effector cells can be obtained (US Pat. No. 115). Administration of GM-CSF together with IL-2 also results in L It has been reported that AK activity is increased (TakahaShi,et al. (1995)Jap.J.Can cer Res .86: 861). However, in both protocols, IL -2 is required. Adoptive immunotherapy using LAK cells in terminal cancer patients, especially in melanoma patients Have reported response rates of 21-44% (e.g., Ro senburget al. (1985)N.Engl.J.Med.313: 1485 and Rosenburget al(1987)N .Engl.J.Med .316: 889). More recent Phase II results Indicates a wide range of response rates from 0 to 33%, but this is still a promising result (Eg Dilmanet al. (1991)J.Clin.Oncol.9: 1233; Thompson, J.A.et al . (1992)J.Clin.Oncol.Ten: 961; Foonet al. (1992)J.Immunother.11: 1984; Koretzet al. (1991)Arch.Surg.126: 898). Differences in response rates are partially Fluctuating doses of given LAK cells and IL-2 and different patients This is due to the difference in the tumoricidal activity of the resulting heterogeneous group of LAK cells. Methods have been developed to obtain relatively uniform populations of LAK cells for adoptive immunotherapy. (See US Pat. No. 5,054,423). Method described in U.S. Pat. No. 5,054,423 First, LAK progenitor cells (LGL) are purified from peripheral blood mononuclear cells. Next Then, the LGL cells are exposed to IL-2 to differentiate most of the LGLs into LAK cells. Let it. The resulting effector cells are known as A-LAK and are Has been shown to be effective in killing human cancer (Sacchi (1991)et a l .Int.J.Cancer 47: 784; Boiardi et al. (1994) Cancer Immunol.Immunoth. 39: 1 93). However, obtaining a sufficient number of A-LAKs from humans is extremely difficult. It is difficult. In vitro by using supporting cells Even with improved growth, in A-LAK cultures from about 60% of cancer patients, Proliferation has been shown to be inadequate (Sedlmayr, et al. (1991) J. Immunoother .10: 336). Another adoptive immunotherapy protocol is for autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TI L). TIL cells have more tumoricidal activity than LAK cells in animal experiments Strong, but difficult and expensive to shape patient care. TIL cells Are autologous effector cells differentiated in vivo in solid tumors (adopted cancer U.S. Pat. No. 51261 reporting on a method of forming TIL cells for immunotherapy No. 32). TIL cells harvest tumor cells from patients and invade tumor specimens Lymphocytes are isolated and the TIL cells are grown in vitro in the presence of IL-2 and Are obtained by re-injecting the cells with IL-2 into the patient. This protocol The response rate in cancer patients that can be evaluated using is reported to be 60%. (Rosenburget al. (1988)N.Engl.J.Med.319: 1676). In another study, 23 % Response rate (Dillmanet al. (1991)Cancer 68: 1). However, a sufficient number of TIL cells to be used in the adoptive immunotherapy protocol It is difficult to always grow Was. Furthermore, immune cell types derived from TIL cultures vary greatly. From a tumor specimen Recovered cells include pure or mixed cell populations with different activities and potencies Have been. Some cells are obtained with MHC-restricted anti-tumor cytolytic activity and some are MHC non-restricted anti-tumor cytolytic activity, some of which have anti-tumor cytolytic activity Obtained without having. Furthermore, except for those derived from melanoma, culture of TIL cells Therefore, tumor-specific cells are rarely obtained from patients with solid tumors, Only about 50-75% can obtain tumor-specific cells in an individual. Since TIL cell therapy is associated with the extreme toxicity associated with IL-2 infusion, Efforts have been made to increase potency. For example, IL-10 together with IL-2 It was found that the addition of increases the antitumor function of TIL cells in mice. (Yanget al(1995)J.Immunol.155: 3897). I at the tumor site Increased L-6 concentration also increases antitumor activity of TIL cells from mice (Marcuset al. (1994)J.Immunoth.Emphasis Tumor I mmunol .Fifteen: 105). The antitumor activity of TIL cells is determined by the presence of IL-1 By activating tumor-draining lymph node cells with anti-CD3 mAb (Hammelet al. (1994)J . Immunoth.Emphasis Tumor Immunol.16: 1 reference). Effector functions of cells from tumor infiltrates or draining lymph nodes fluctuate In vitro sensitization of tumor-reactive immune cells for use in adoptive immunotherapy of cancer Efforts are being made to develop ways to promote this. Present in cell infiltrates of breast cancer patients Tumor antigen-specific MHC-restricted CTLs from progenitor cells Incubate progenitor cells with MAGE-1 (a marker present in certain tumors) Generated, thereby forming MAGE-1-specific CTLs. (MAGE-1 and other MAGE antigens are antigens expressed on tumor cells. Is; Tosoet al. (1996)Cancer Research 56: 16; U.S. Pat. No. 44). Another in vitro sensitization method to obtain strong MHC restricted CTL Converts peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from melanoma patients to gp, a melanoma-associated antigen. Incubation with irradiated autologous PBMCs applying 100 synthetic peptides (Salgalleret al. (1995)Cancer Research 55: 4972). “ALT” cells are an alternative to TIL cells in adoptive immunotherapy of cancer. You. These cells are ex vivo activated peripheral blood lymphocytes with CTL activity. You. The cells were prepared from IL-2 derived from a previously prepared one-way mixed lymphocyte culture. Or from the lymphocyte culture stimulated with anti-CD-3 mAb It is activated by using the collected cytokine-rich auto-supernatant. Once a day With oral cimetidine (to reduce tumor-related suppressor activity) Monthly injection of ALT cells in patients with renal cell carcinoma and melanoma Dramatically prolong life and elicit a durable tumor response (Grahamet al(1993)Semin.Urol .11: 27 and Goldeta1. (1996)J.Surg.Res.59: 279). Other effector immune cells have been used or suggested for adoptive immunotherapy of cancer. For example, PWM-AK cells have been proposed as candidate cells for adoptive immunotherapy of cancer. . These effector cells have the same activity as LAK cells. Bow mitogen activated PBMC (Ohnoet al. (1994)Int.J.Immunopharm .16: 761). Human Activated Macphage (MAK) is also being used in adoptive immunotherapy of cancer. As an effector cell Have been. Activation by interferon-γ (IFN-γ) causes MA K cells are differentiated from peripheral blood, causing experimental tumor regression in animals Apparently, but no clear therapeutic response in humans (Barthole ynset al. (1994)Anticancer Research 14: 2673). Adoptive immunotherapy for malignant tumors Activated natural killer cells (ANK) have also been proposed for use in the method. ANK cells were selected from peripheral blood stem cells in CD5 / CD8 coated flasks. Alternatively, monocytes or NK are obtained to obtain the cell-rich group, and the cells are treated with high concentrations of IL-2. It is obtained by processing. MHC-unrestricted CTL clone derived from human (TALL -104) is also an adoptive immunotherapy for cancer treatment when used in combination with IL-12. Promising for use in tocols (Cesanoet al(1994)J.Clin.Invest.94 : 1076). Adoptive immunotherapy protocols for cancer treatment Interest in the use of MAK, ANK and other mononuclear phagocytes in Large-scale collection of functional human circulating blood monocytes with good reproducibility by flow centrifugal suspension Improved methods are being developed (Faradijiet al(1994)J.Immunol.Methods174: 297). New adoptive immunotherapy strategies for the treatment of cancer Isolate and / or develop antigen-presenting cells, such as dendritic cells, A strip or antigenic peptide is applied and the cells are then returned to the patient (Grabbe et al. (1995)Immunol . Today 16: 117). High levels of progenitor cells in adult blood Methods for obtaining high numbers of dendritic cells have also been reported (Romaniet al. (1994)J.Exp.Med.1 80 : 83 and Bernhardet al. (1995)Cancer Res.55: 1099).Adoptive immunotherapy and its use in treating viral diseases Another area of application of immune cell adoptive immunotherapy is the treatment of viral diseases. Will Specific CD8⁺And CD4⁺Adoptive immunotherapy protocol using effector cells Are being developed for the treatment of CMV, EBV and HIV infections (Ridd ellet al. (1995)Ann.Rev.Immunol.13: 545; van Lunzenet al. (1995)Adv.Exp.Me d.Biol .374: 57; K1imaset al. (1994)AIDS 8: 1073). These protocols Now, CD from peripheral blood of AIDS patients⁺Purification of 8T cells, phytohemagglutini Growth of the cells in addition to IL-2 and IL-2, and in combination with IL-2 injection Cells are reinjected into a patient (Whitesideet al. (1993)Blood 81: 2085; Kl imaset al. (1994)AIDS 8: 1073; Riddellet al. (1993)Curr.Opin.Immunol.Five.: 484; Torpeyet al. (1993)Clin.Imm unol.Immunopath .68: 263; Hoet al. (1993)Blood 81: 2093; Riddellet al. (1992)Science 257: 238).In vitro immune cell growth method In most adoptive immunotherapy protocols, clinically effective (ie, The inability to grow enough cells for injection (therapeutically sufficient) ing. Another problem is maintaining LAK and CTL activity in vivo. Of administering a high dose of IL-2 necessary to do There is. Improve cell growth for adoptive immunotherapy and dose required for systemic administration of IL- Some methods have been reported to reduce the odor. Try to improve their activity No effort has provided a means to eliminate IL-2 from the protocol. Activated with anti-CD-3 mAb, moderate amount of IL-2 (100 U / mL) Cells were grown with a relatively less toxic systemic dose of IL-2 Have been successfully used in adoptive immunotherapy protocols (Goedegebuureet al. (19 95)J.Clin.Oncol.131939. Hatsumuraet al. (1994)Cancer Research 54: 27 See also 44). Anti-C with low dose of IL-2 Administering D-3 mAb in vivo also reduces the need for systemic IL-2. As a new adoptive immunotherapy strategy (Nakajimaet al. (1994)Proc.Natl .Acad.Sci.USA .91: 7889). Immobilized anti-CD in a rotating tissue culture bag Using 3 mAb and IL-2, C having helper function and cytolytic function D4⁺Methods for growing cells have also been reported (Nakamuraet al. (1993)Br.J.Cancer 67: 865). Activated by lipopolysaccharide (LPS) activated B cells and anti-CD3 mAb Co-culture anti-tumor effector cells to grow cells for adoptive immunotherapy Has been proposed as an alternative toet al. (1995)Cancer Immunol.Immun oth .40: 173). All of these cells were subsequently treated with low doses of IL-2. Proliferated to MAbs to CD3 and CD28 in the presence of relatively low doses of IL-2 Combining different mAbs induces effective proliferation of TIL cells (Mulder et al. (1995)Cancer Immunol Immunoth.41: 293). B. Anti-tumor CTL caused by in vitro stimulation was reduced to low dose IL-2 (30 u / mL) (Salgalle) can be grown for as long as 4 months in a medium containing ret al. (1995)Cancer Research 55: 4972). IL-7 can be used for long periods without repeated stimulation. Have been shown to support CTL growth (Lynchet al. (1994)J.Exp. Med .179: 31). In an artificial capillary culture system using a low concentration of IL-2 TIL cells are also growing (Freedmanet al. (1994)J.Immunoth.Emphasis Tumor Immunol .16(3): 198). The need for exogenous IL-2 in immune cell proliferation is to genetically alter cells (Eg, US Pat. No. 5,470,730). Only However, either method of growing genetically unmodified cells requires adoptive immunotherapy. Exogenous to promote the differentiation and / or growth of cells used in the protocol IL-2 is required. In all cases, maintain the activity of such cells Requires systemic administration of IL-2. Even if the efficacy of adoptive immunotherapy has been demonstrated in end-stage patients, Significant toxicity of systemic dose of IL-2 required in the protocol, cell composition from individual patients Variability in the effector function of a product, as well as a clinically effective number of effector Problems with growing vesicles have limited the use of adoptive immunotherapy. You. In particular, it is used in adoptive immunotherapy due to the need for exogenous IL-2 Cells are limited to effector cells that can function for a limited period of time . To take advantage of this therapeutic potential, the need for systemic IL-2 administration and There is a need to overcome the problems of obtaining large numbers of cells. So, an improved adoption license Epidemiological therapy is needed. It is therefore an object of the present invention to provide such an improved method. Details Specifically, an object of the present invention is to provide an adoptive immunotherapy protocol that does not use exogenous IL-2. It is an object of the present invention to provide a method for expanding an immune cell used in a device. Still another of the present invention Is intended for use in protocols for adoptive immunotherapy, such as compositions containing regulatory cells. It is to provide a method for providing a large array of cell compositions. Departure Yet another object of the present invention is to produce a composition comprising a clinically effective number of such cells. It is to provide a means to do. Once a cell composition array becomes available, Create adoptive immunotherapy protocols for a wide variety of diseases and changes in immune function be able to. Accordingly, another object of the present invention is to provide a method and immune system for treating various disorders. It is to provide a way to change the epidemiological function.Summary of the Invention Compositions comprising a clinically effective number of immune cells are provided. The composition is regulated Contains immune cells, effector immune cells, or a combination thereof. Details Specifically, adoptive immunotherapy (referred to as autologous cell therapy (ACT) herein) ) Used in clinically effective numbers of regulatory immune cells (particularly Th1 cells and Th1 2 cells). Clinically effective used in adoptive immunotherapy A method is provided for providing a composition comprising a number of immune cells. In that method, IL-2 No need to use. As a result, proliferating immune cells retain activity or survive No IL-2 is needed to maintain sex. Also provided are methods of treating disorders such as infectious diseases and autoimmune diseases. Furthermore, a method for treating immunosuppression that enables transplantation of an organ or tissue and a vaccine Methods for enhancing the chin protocol are provided. In a method of treatment, the composition use. The above composition of regulatory cells may be used to alter the dominant regulatory cell population, either locally or It provides a means to alter the patient's immune regulatory balance systemically. Many diseases Loss of a regulated balance of the immune system whose condition is normally maintained by regulatory immune cells With As a result, the availability of a clinically effective number of regulatory immune cells Means are provided for improving the balance. Being able to do so will cure various diseases. There is a possibility that treatment can be performed. Methods for obtaining clinically effective numbers of effector and regulatory immune cells are provided Is done. In particular, a clinically effective number of regulatory immune cells such as Th1 and Th2 For obtaining substantially homogeneous populations of Th1 and Th2-like mononuclear cells Is provided. CTLs, LAKs and TILs that do not require exogenous IL-2 A method is provided for obtaining a composition comprising a clinically effective number of effector cells. In addition, clinically for the treatment of disease states where there is a relative deficiency of T cell types An effective amount (ie, a therapeutically effective number, typically 10⁹Super, preferably 10¹ ⁰ Also provided is a method for obtaining a super) self-specific T cell type. Specifically, infectious diseases and Th2 cytochemistry, including (but not limited to) allergic diseases Ex vivo Th1 T from a patient with a disease state in which the profile is dominant Cells, and (including but not limited to, chronic inflammatory and autoimmune diseases) Th1) Autologous ex vivo Th2 T cells in dominant disease are used in the ACT protocol A method is provided for obtaining a clinically effective number of cells. The resulting cell composition is provided And the use of the composition in an ACT protocol is provided. Further, an ACT protocol designed to provide specific immunosuppression for transplantation Clinically effective number of ex vivo sensitized donor organs for use in Derived antigen-specific Th2 cells are provided. Provide protection from virus infection For ACT protocol designed to serve as a virus vaccination strategy with Also provided is a clinically effective number of ex vivo-derived virus-specific Th1 cells. Autologous Cell Therapy (ACT) Protocol for Treating and Preventing Human Disease Methods of using regulatory immune cells are provided. Changing the balance of immune regulation in patients ACs designed to treat diseases in which there is an imbalance in regulatory cells A T protocol is provided. In particular, alter the balance of immune regulation in patients ACs designed to treat diseases in which there is an imbalance in regulatory cells A T protocol is provided. In that method, peripheral blood mononuclear cells are collected from the patient and then Activation followed by a clinically effective number of proliferating cell types (typically Is 10⁹, Preferably 10^Ten, More preferably 10¹¹This is the type of cell Cell surface-specific proteins or proteins under conditions) Proliferate cells by mitogenic stimulation. If the harvested cells do not differentiate in vivo Or, if further differentiation is required, after collection and before expansion, In the method, at least some of the cells are regulatory cells or effector cells or Under conditions that differentiate into other cell types, the cells are activated and undergo in vitro differentiation. Next Then, the obtained cells are re-injected into a donor for treatment. Prior to autologous transplantation of desired cells Because it can be purified to provide a more homogeneous population. If necessary, mitogens in the presence of appropriate amounts of cytokines By activating the cells, mononuclear cells are differentiated. This activation has a specific phenotype Cytokines or mitogens or other It can be carried out by using an active substance such as a growth promoter. For example, cells Is activated in the presence of IFN-γ, causing Th1 cell differentiation. Cells to IL When activated in the presence of -4, Th Two cell differentiation occurs. Such activators include polyclonal activation Antibodies, and specific activation presented in the context of MHC molecules For natural or synthetic antigens. Propagation is performed under conditions that allow high cell densities to be obtained. Thereby inside Intrinsic cytokines are retained near the growing population of cells and One or more mitogenic monochromes other than other cytokines that require time injection It is maintained in the presence of an internal antibody or other cell surface specific protein. Such conditions Is preferably obtained by growing cells in a hollow fiber (HF) bioreactor. Can be Methods for treating various disorders using the obtained cells are also provided. Do these methods Above, the patient is infused with a deficient or relatively small amount of cells. For example Obtaining peripheral blood mononuclear cells from the patient; obtaining a composition comprising a therapeutically effective number of cells. Cells can be grown under certain conditions; by injecting the resulting cell composition into a patient, Sexual diseases or tumors can be treated. In a preferred embodiment, the Are the cells specific or unique to a unique antigen near the site where the effect is desired? Or pathogen if Or specific to the tumor being treated. In other preferred embodiments, the pathogen or Is cytotoxic CD8 specific for tumors⁺Effects such as T lymphocytes (CTL) Injector cells or co-inject with regulatory cells. Further, specific immunosuppression methods for transplantation are provided. In that way, the donor Of a clinically effective number of in vitro derived antigen-specific Th2 cells sensitized to an organ Administration is performed. In a preferred embodiment, the cell is a tissue or organ to be transplanted Specific to the alloantigen or antigen specific to Further provided are compositions for use as vaccination methods and vaccines. Details In particular, injections provide protection from viral infections, A clinically effective number of ex vivo virus-specific Th1 cells also serve as a strategy Or Th2 cells (or a group of Th1-like or Th2-like cells) Do the formulation. Injecting autologous exogenous growth-regulating immune cells to improve patient's immune regulation A way to change is provided. The method involves collecting peripheral blood mononuclear cells from the patient. A condition under which at least a part (even one) of cells is differentiated into a desired regulatory cell And cells Activating the cells in vitro; growing the regulatory cells; and growing the cells. Injecting the node cells into the donor to affect the immune regulatory balance. Details Do not co-inject cytokines such as IL-2. The above method is useful for treating disorders characterized by an imbalance in regulatory immune cells. is there. Specifically, using the methods provided herein, multiple sclerosis, chronic Rheumatoid arthritis, Crohn's disease, autoimmune thyroid disease and inflammatory bowel disease But not limited to); human immunodeficiency virus, herpes simplex will Chronic infectious diseases, such as infections with virus, cytomegalovirus and hepatitis virus; Offer treatment for chronic inflammation in allergic and other hypersensitivity disorders such as asthma Specific immunosuppression method in organ and tissue transplantation, and A method is provided for providing immunoprotection in vaccination. In a preferred embodiment, the regulatory immune cells are CD4⁺Or CD8⁺Expression Th1 Th2, Th2 or Th3 cells that have a type. The cells are preferably Phenotype (ie, CD45RO)⁺, L-selectin^-) Cells to reach the site of inflammation. Preferably, Selective cells specific to unique antigens present at sites where cell regulatory effects are desired Proliferate so that cells perform regulatory functions in localized areas of the body . For example, in the treatment of rheumatoid arthritis, type II is present only in joint tissues. Regulatory cells specific for collagen are preferred. In the treatment of diabetes, transplanted To prevent islet cell rejection, regulatory cells specific for insulin are preferred. In another embodiment, the cells are not using IL-2 to promote proliferation. Effectors that have been grown to a clinically effective (ie, therapeutically effective) number Cell. Furthermore, a method for expanding immune cells without using exogenous IL-2 is provided. . Growth of immune cells is preferably achieved by adding one or more mitogenic mAbs to the medium. Wake up. The immune cells preferably proliferate under conditions such that they grow at high density Let it. Such high density is a fiber that retains endogenously produced cytokines By growing cells in a hollow fiber bioreactor with a molecular weight cutoff of Obtainable. Such a molecular weight cutoff is preferably 14,000 daltons Less than 6,000 daltons. Furthermore, HIV⁺Virus-free CD4 obtained from a patient⁺Clinically effective for cells A method for obtaining a large group is provided. Virus removal CD4 obtained⁺Cells to donor patient To treat HIV. The cells are anti-HIV effector cells It can be co-injected with the cells.Detailed Description of the Preferred Embodiment A. Definition Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein are Have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Have Unless otherwise noted, patents and publications cited herein. Are hereby incorporated by reference in their entirety. As used herein, the term adoptive or cellular adoptive immunotherapy Refers to therapeutic methods involving the administration of immunologically active cells. Used in its treatment Cells from the subject (self-administered) or another individual (allogeneic) Obtained by puncture or leukocyte separation. As used herein, self-treatment refers to self-treatment. Refers to self cell therapy (ACT). Autologous cell therapy (ACT), as used herein, refers to cells of the immune system. Collected from an elephant, cultured and / or manipulated in vitro or in vitro, and This is a treatment method in which the same subject is injected as a part. As used herein, an activating protein refers to the activation of a cell when contacted with a population of T cells. It is a molecule that causes proliferation. T cells typically require two signals to proliferate . Thus, the activated protein contains a first antigen stimulus signal and a second co-stimulatory signal. latory), including combinations of proteins that provide the required signal. No. 1 signal includes anti-CD3 mAb, anti-CD2 mAb, anti-TCR mAb, PHA, P Signal agents such as MA and other such signals are required. The second signal has an anti- One or more such as CD28, anti-CD40L, cytokines and other such signals Signal substance is required. Therefore, the activation proteins include cell surface protein-specific monoclonal antibodies. Lonal antibodies, fusion proteins containing ligands for cell surface proteins, such cells Interacts specifically with surface protein ligands or cell surface receptors on mononuclear cells Molecules that indirectly or directly cause the cell to proliferate (such as Is not specified) included. As used herein, when effector cells are grown, the activating protein is Choose from those that do not need to substantially maintain cell viability and function after growth Is done. Thus, for example, with respect to effector cell proliferation, IL-2 is described herein. Is not an activating protein. As described above, the method of the present invention requires IL-2. Provide a means to obtain cells, especially effectors, that do not In a preferred embodiment, IL-2 is not used as an activator. As used herein, a mitogenic monoclonal antibody can be directly or One of the two necessary signals for promoting T cell division when in close contact with cells An activating protein that is an antibody that provides Generally, such antibodies are Specific binding to the receptor triggers signal transduction, which leads to cell proliferation. It is a thing. Suitable mitogenic antibodies can be used alone or in specific effector cells. By examining the antibodies selected in combination to allow for a larger number, It can be confirmed empirically. A suitable mitogenic antibody or a combination thereof Depending on the cell in the absence of the antibody for a predetermined time, typically 1-10 days About 50% or more of the cells Or more preferably about 100% or more, more preferably 150 to 200% or more. As used herein, a growth promoting substance is any form of cell differentiation, activity. Soluble if involved in or inducing sex, growth and / or division Or an insoluble substance. Growth promoters include mitogens and cytokines and so on. Examples of growth promoting substances are fibroblast growth factor, demineralized ion bone Osteogenin purified from (eg Luytenet al. (1989)J. Biol. Chem.264: 133 77), epidermal growth factor, oncogene products, interleukins, colony stimulators And other such factors known to those skilled in the art. Recombinant interchange Recombinant growth-promoting substances such as leukins are suitable for use in the method of the invention. So For cloning DNA encoding a protein such as Means for producing bioactive proteins from chromosome DNA are within the skill of the art. You. For example, use interleukins 1 to 6 and their combinations Thus, a small group of desired lymphoid cells can be proliferated. As used herein, a mitogen refers to the division of a cell. A substance that induces, in particular, as used herein, in an antigen-dependent manner Stimulate lymphoid populations to proliferate and differentiate into effector or regulatory cells The substance to do. Examples of such substances include lectins and lipopolysaccharides There is. As used herein, cytokine refers to the same cell or other cells. Factors such as lymphokines or monokines produced by cells that affect It is. As used in the present invention, lymphokines are produced by activated T lymphocytes. -A substance that is secreted and affects cells of the same type or other types. Tumor necrosis factor, interleukins and interferons are examples of lymphokines It is. Monokine is secreted by monocytes or macrophages and A substance that affects vesicles or other cells. As used herein, regulatory immune cells refer to certain cytokine-producing processes. Files, and such cytokine profiles are directly linked to the effector function Non-intervening mononuclear cells. Regulatory immune cells control or direct the immune response A mononuclear cell that has the capacity but does not act as an effector cell in response . Regulatory immune cells depend on the cytokines they produce. Perform a regulatory function and classify it by its cytokine production profile. it can. For example, it produces IL-2 and IFN-γ but not IL-4. Regulatory immune cells are referred to as "Th1" cells. Produces IL-4 and IL-10 Regulatory immune cells that grow but do not produce IFN-γ are referred to as “Th2” cells. . Produces TGF-β, IL-10 and IFN-γ, but IL-2 and IL-4 Regulatory immune cells that do not produce are referred to as "Th3" cells. Th1, Th2 and Cells that give rise to Th3 and Th3 cytokine profiles are CD4⁺And CD8⁺cell In the group. Cells that produce IL-2, IL-4 and IFN-γ are Th1 and And progenitor cells of Th2 cells and are referred to as "Th0" cells. Most The group of cells that produce Th1 cytokines is called "Th1-like" and most Th2 The group of cells that produce itokines is called "Th2-like" and most Th3 cytokines The group of cells producing the protein is referred to as "Th3-like". So, each composition is heterogeneous Includes cell populations, but with respect to cytokines, It has similar properties. This list of T cells is merely exemplary and the method of the invention Other definable groups of T cells, arrays or The subtypes are included in the present invention. As used herein, a composition comprising a clinically effective number of immune cell populations , At least 10⁹Pcs, preferably 10⁹More than one, more preferably at least 10^TenPieces, Most preferably 10^TenContaining more than one cell, most of which are LAK, TIL And Th1 or Th2 cells such as CTL cells or effector cells. It is a composition having such a predetermined regulation function or effector function. preferable Cell number, as well as cell type, will depend on the end use of the composition. An example For example, if Th1 cells specific for a particular antigen are desired, the group would be 50 %, Preferably more than 70%, more preferably more than 80%, most preferably 90-9% Contains more than 5% of such cells. Cells obtained from polyclonal expansion , The homogenous cell is of a particular type or subtype. Departure For applications provided in the literature, the volume of cells is preferably less than 1 liter, more preferably 500 mL or less, more preferably 250 mL or less, and most preferably about 1 mL. Not more than 00 mL. As used herein, dominant means greater than about 50%. As used herein, a combination refers to together or sequentially Refers to two component elements, such as the composition or mixture used. The combination is Packaged or together as a mixture of ingredients or in kit form May be provided as a separate component. As used herein, effector cells refer to pathogens or tumor cells. It is a mononuclear cell with the ability to eliminate. Such cells include LAK cells, MA K cells and other mononuclear phagocytes, TIL, CTL and antibody producing B cells and Other such cells include, but are not limited to. As used herein, immune balance refers to various immune cells in a disease-free state. Refers to the normal proportion and absolute number of vesicles. Restoring immune balance is the cure of a disease or disorder. Treatment may bring the proportion and number of regulatory immune cell types within the normal range. Indicates that the symptoms of the disease or disorder to be treated are alleviated. Refers to the recovery to the state. Can the amount of cells administered be determined empirically? Or preferably a disease or disorder Determined by administering small doses of cells to the patient until symptoms of the disease are reduced or eliminated can do. Generally, the initial dose is 10⁹-10^TenMore than one cell. Sa In addition, the dose depends on the desired treatment. As used herein, therapeutically effective means ameliorating or ameliorating the symptoms associated with the disease. Refers to an amount of cells that can be alleviated in some way. When used for methods The method is only effective in relieving or somehow reducing the symptoms associated with the disease. It has fruit. As used herein, mononuclear cells or lymphoid cells (the terms are used interchangeably) (Uniquely used) include lymphocytes, macrophages and such cells. Monocytes derived from existing tissues. Generally, lymphoid cells are obtained from the subject being treated. Take. Lymphoid cells contain or form tumors, peripheral blood or lymphoid cells Can be taken from other tissues such as lymph nodes and spleen. As used herein, mononuclear cells grown in vitro or in vitro or Is a therapeutically useful subgroup of lymphoid cells when they are cultured in vitro. Promotion of growth such as lymphokines A cell that proliferates by exposing the cell to an enhancer. The therapeutically useful subgroup is regulatory Vesicles or effector cells, a clinically effective number of cells, typically about 10⁹ Containing more than one cell, preferably less than 1 liter of clinically useful Volume (ie, for injection). As used herein, a therapeutically or clinically effective number of ex vivo Proliferating cells are defined as at least when such cells are used in a particular ACT method. The number of cells is sufficient to achieve the desired therapeutic effect. Typically such numbers are 10⁹Or more, more preferably 10^TenNumber or more. The exact number depends on the cell type Depends on the intended target or outcome. As used herein, hollow fiber bioreactors or hollow fiber bioreactors The actor cartridge has an outer shell casing suitable for mammalian cell growth, In the outer shell suitable for growing or nearby mammalian cells Semi-permeable hollow fibers, and ECS containing the cells and ECS cell supernatant. Is what you do. The inside of the hollow fiber is called the lumen, the outside of the capillary and the outside inside The area between and the space outside the capillary (ECS). Tissue culture medium is perfused through the fiber lumen and also enters the shell surrounding the fiber. set The woven culture medium may be different in these two compartments, including Includes diffusible components that can maintain and initiate the growth of immune cells. Culture medium Is provided in a reservoir from which it is pumped through the fibers. The flow rate is It can be varied and controlled by changing the applied pressure. ECS or irrigation The flow media may further comprise one or more subgroups of immune cells such as TIL cells or regulatory cells. An effective amount of one or more growth promoting or inhibiting substances that specifically promotes the growth or inhibition of In which case an effective amount is sufficient to effect the specific growth described above. Refers to the quantity. As used herein, hollow cell fiber culture systems include hollow fiber bioreactors. As well as pumping means for perfusing the medium into the system, Supply / recovery liquid storage means and devices for electronic control, recording or sensing There are other components and so on. Hollow fiber bioreactor enters the hollow shell Cartridge containing a plurality of semipermeable tubular fibers. Hollow fiber reactor And hollow fiber bioreactors The term is used interchangeably. Appropriate equipment for the method is recognized during co-pending No. 08 / 506,173, filed Sep. 14, 1988. As used herein, ECS refers to extracapillary space cell supernatant. ECS is a medium in which cells are growing in ECS. To do this, you need to Cells produced by cells or added to ECS or tissue culture media Vesicle secretion products, diffusible nutrients and lymphokines and cytokines Includes growth promoting or inhibiting substances. The specific components contained in ECS are It depends not only on what is inoculated, but also on the properties of the hollow fiber chosen. As used herein, tissue culture media includes the in vitro growth of mammalian cells. A suitable medium is included. Examples of such media include AIM-V, RPMI 1640 and Iscove's medium (GIBCO, Grand Island, NY) However, the present invention is not limited to these. The medium contains serum, serum protein, Growth-suppressing and growth-promoting substances, such as cleft-promoting monoclonal antibodies, and genetics Additional components, such as selection agents for selecting cells that have undergone child manipulation or genetic modification Can be replenished it can. As used herein, treatment refers to ameliorating the symptoms of a condition, disorder or disease. Means to change it in other beneficial ways. For treatment, the pharmaceutical use of the composition of the invention Is also included. As used herein, a vaccine refers to a viral infection, cancer or other disorder. A composition that provides protection against, or treatment of, viral infections, cancer and other disorders. is there. Prevention against viral infections, cancer or other disorders is If you completely prevent the disease or consequently become infected or affected, It reduces or reduces the severity or duration of an infection or tumor or other illness. Treatment results in remission of one or more symptoms or reduction / reduction of severity or duration . As used herein, administration of certain compositions alleviates the symptoms of certain disorders. Is related to or related to the administration of the composition, whether permanent or temporary. Refers to continuous or temporary relief that may be linked. As used herein, substantially pure refers to substantially homogeneous, Standards such as flow cytometry used by those skilled in the art to evaluate such purity Measurement by various analytical methods Do not seem to have any readily detectable impurities or require further purification. Even if it is performed, the physical and chemical properties of the substance, such as physiological activity, can be detected Must be as homogeneous as it seems to be means. Methods of purifying immune cells to obtain substantially pure populations are known to those of skill in the art. It is. However, a substantially pure population of cells is a mixture of subtypes. Purity refers to the activity profile of the group. In such a case, By performing the purification, the specific activity of the cell group may be increased. As used herein, bioactivity refers to a cell, composition, or other mixture. Refers to the in vivo activity or physiological response of immune cells resulting from in vivo administration . Thus, the biological activity depends on the therapeutic effect of such cells, compositions and mixtures. And pharmaceutical activity. Similarity in the use and / or testing of the methods and cells provided herein. Or equivalent methods and materials can be used, but are not limited to the preferred embodiment. This will be described below.B. Effector cells and regulatory immune cells When the host encounters the antigen, it responds to cell-mediated or humoral immune responses. Can provide the answer. Regulatory immune cells determine the nature of the immune response to a pathogen. Control (Mosmannet al. (1986)J.Immunol.136: 2348; Cherwinskiet al . (1987)J.Exp.Med.166: 1229; Del Preteet al. (1991)J.Clin.Invest.88: 346 reference). The type of response is different for CD4⁺Due to T cell heterogeneity . CD4⁺Cells can be subdivided according to their cytokine expression profile it can. These cells can produce Th1, Th2 and Th3 cytokines. Derived from a common progenitor cell Th0 (Firesteinet al. (1989)J.Immunol .143: 518). As described above, the Th1 clone is composed of IL-2, INF-γ, Factors promoting the late-onset hypersensitivity response characteristic of lymphotoxin and other cell-mediated immunity Produces offspring. These cells do not express IL-4 or IL-5. Th1 cells Promotes cell-mediated inflammatory response, activates macrophages, immunizes IgG2a Supports roblin (Ig) isotype switching and activates cytotoxic functions. Th2 clones are IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 and IL- Producing cytokines such as 13 provokes a humoral immune response, It also promotes allergic responses. Th2 cells express IL-2 and IFN-γ. Does not appear. Th2 cells activate B cells, switch to IgG1 and IgE isotypes Aids antibody production (eg Mosmannet al. (1989)Annu.Rev.Immunol.7: 145 ). Th3 cells produce IL-4, IL-10 and TGF-β. Cytokines produced by Th1 and Th2 cells are mutually inhibitory is there. Th1 cytokines inhibit the growth of Th2 cells, and Th2 cytokines Inhibits Th1 cytokine synthesis (eg, Fiorentinoet al. (1989)Med.170 : 2081 (1989)). This cross regulation results in Th1 or Th2 against pathogens. A bias in the immune response results in the host's resistance or susceptibility to infection. Occurs. Certain pathogens are most effective primarily through Th1 or Th2-type immune responses. Therefore, the formation of an appropriate regulatory immune cell response during infection is important. (Eg Sheret al. (1989)Ann.Rev.Immunol.46: 111; Scottet al. (1991)Im munol.Today 12: 346; Sheret al. (1992)Immunol.Rev.127: 183; Urbanet al. (199 2)Immunol.Rev.127: 205). For example, leprosy (eg, Yamamuraet al. (1 991)Science 254: 277), AIDS (for example, Clericiet al. (1993)Immunol.T oday 14.: 107 See Toxoplasma (Sher)et al. (1989)Ann.Rev.Immunol.46: 111), Hashimoto's thyroiditis (eg, Del Preteet al. (1989)Autoimmunity Four: 267) Downy disease (eg Turneret al. (1987)Eur.J.Immunol.17: See 1807), transplant (example For example, Benvenutoet al. (1991)Transplantation 51: 887), type I diabetes (e.g. Fouliget al. (1991)J.Pathol.165: 97), multiple sclerosis (eg Benven utoet al. (1991)Clin.Exp.Immunol.84: 97), and rheumatoid arthritis ( For example, Quayleet al. (1993)Scand.J.Immumol.38: 75) A correlation has been observed between the nodal immune response and disease susceptibility. Th1 responses to protozoan, viral and fungal infections in mice are Th2 responses are associated with disease and Th2 responses are associated with disease. Th2 response was observed in mice Cures some types of Tsumagushi infections and exacerbates viral infections. Th2 response is human And allergic disorders and transplant rejection Was involved. Another regulatory cell, termed Th3, produces large amounts of TGF-β, Mice can be protected from diseases similar to multiple sclerosis (eg, Chenet al . (1994)Science 265 : 1237). The classification of these responses can be determined empirically and is reported (For a summary, see, for example, Mosmann et.al. (1996)Immunology Today 17: 138 -146). CD8⁺A subset of T cells has a Th1 or Th2 cytokine pattern. It is also known to secrete. CD8⁺Expose cells to IFN-γ and IL-2 This leads to differentiation into Th1 cells, whereas IL-4 differentiates into Th2 cells. Trigger. Th1 CD8⁺Cells play a critical role in the immune response to the virus. Th2CD8, thought to be a effector⁺Cells have an immunosuppressive function. Other regulatory cells are similar to those used to characterize the cells described above. Can be characterized. As described herein, cross-regulation and the immune imbalance observed in disease states Thus, regulatory cells should have a therapeutic effect on the treatment of various diseases. That's it Such uses have been demonstrated to some extent in animal models, but are feasible in humans. There was no sex. For example, native T cells and Actinobacillus actinomycetem By co-administering a Th2 antigen-specific clone for C. comitans, Periodontal disease in drats improved Being good (Eastcottet al. (1994)Oral Microbiol.Immunol.9: 284 (1994) See). Antigen-specific Th1 cell clones were infected by the protozoan Leishmania major Protects against genital infection and mouse candidiasis by trachomatic pathogens (Powrieet al. (1994)J.Exp.Med.179: 589; Igietseme et al. (1993)Regional Immunity Five.: 317; Romani (1991)Inf.Immun.59: See 4647 ). In addition, Th2 cell clones have been shown to prevent autoimmune uveoscleritis. (Saoudiet al. (1993)Eur.J.Immunol.twenty three3096). Antigen characteristics Apparent Th2 cell clones suppress animal models of multiple sclerosis (Chenet al.(1994)Science 265: 1237). Donor specific Th Two cells can reduce lethal graft-versus-host disease in transplantation (Fo wleret al. (1994)Adv.Bone Marrow Prug.Process., Fourth Int.Sympos. 、 Wiley -Liss, Inc., p.533). Purified T cells with enhanced Th2 activity have also been used in animals. Have been shown to prevent insulin-dependent diabetes-like illness (Fowe llet al. (1993)J.Exp.Med.177: 627). Th2 clones used for adoptive immune cell transfer studies in animals Regulatory cells, such as Th1 and Th2 cells, have been Not used in protocol. Such a protocol is There is a limit because node cells cannot be differentiated and generated in therapeutically effective amounts. However The method of the invention provides a means for producing such a clinically effective amount of cells, It will improve disability, provide vaccines and reduce tissue or organ rejection. Provide a means to control. The method of the present invention may further be clinically useful in the absence of IL-2. It also provides a means to generate effective amounts of regulatory and effector cells . Further, in the present invention, by strengthening or restoring the immune system, AIDS treatment and the like Also provides a method for growing therapeutically useful cells for the treatment of HIV infection (For example, see Examples 3 and 4).C. How to generate regulatory cells A method for obtaining regulatory cells for use in an ACT protocol is provided by the present invention. You. Requires exogenous agents to maintain effector cell viability, such as IL-2 Without obtaining an effector cell for use in an ACT protocol. . The method includes some or all of the following several steps. You That is, (1) the step of collecting mononuclear cells from the patient, (2) some or all of the cells Treating cells in vitro with an agent that differentiates into the desired T cell subtype (3) purifying the obtained cells, (4) interacting specifically with cell surface receptors Growing the cell by contacting the cell with the mitogen used It is. Such agents in the present invention are preferably mitogenic monochrome Is an internal antibody. Proliferating cells can be further purified to select for the desired subtype. Can be.1. Mononuclear cell recovery Mononuclear cells (ie, lymphocytes and monocytes) are collected from peripheral blood, lymphoid tissue, biopsies. Various sources, including but not limited to tissues, or body cavity irrigation Can be obtained from the law. Preferably, cells are obtained by simple venipuncture (5 0-500 mL). If more cells are needed, lymphocyte isolation Obtainable. Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation or other suitable method The method can be used to purify mononuclear cells from blood.a. In vitro differentiation Many studies have shown that different types of immunoregulatory cells Cause a selective induction of a set to elicit a humoral or cell-mediated immune response. It is shown that can be. In addition, many disease states are supported by certain cells. This is caused by the arrangement. Mechanisms regulating T cell subset differentiation Recent advances in understanding the ability of certain subsets to form in vitro It is possible. The dose of the antigen, the type of cells providing the antigen and the MHC haplotype of the subject. Any of several factors can affect the differentiation of certain types of regulatory immune cells. each Seed cytokines can also influence the types of regulatory responses that develop in humans It is. For example, if IL-4 is present during early T cell activation, Th2-like cells Is known to occur (Hsiehet al. (1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89: 6065 and Paliardet al. (1992)J.mmunol.141: 849). Conversely, IL-12 Alternatively, activation of cells in the presence of interferon-γ results in the formation of Th1-like cells. (Sedaret al. (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90: 10188). Thus, in a preferred embodiment, it is then recovered in the first stage of the method. Mononuclear cells with IL-12, interferon Activated in the presence of -γ or IL-4 to transform Th1 or Th2 cells, respectively. Let it form. To promote the differentiation of regulatory cells, IL-12 and / or Th2 response can be promoted using an antibody against -4 can be used to promote Th1 cell differentiation. Antibodies and Specific for IL-12, interferon-γ or IL-4 receptor on T cells Proteins could be used to provide alternative signals to lymphokines . The cells may contain chemical reagents such as PHA and PMA or anti-CD3 or anti-CD3. It can be non-specifically activated by a monoclonal antibody such as CD2. Preferably, the cells are added to the medium, treated, and submitted by APC to T cells. It is specifically activated by the provided natural or artificial protein antigen. Depending on the case Vaccinating patients prior to blood collection to increase the number of antigen-specific cells May need to be added. Another strategy is to treat patients prior to drawing blood. This is to provide oral resistance. Cells formed against known antigens If specific, after reinfusion of the cells, the antigen may be used as a booster Desired regulatory cells can also be expanded ex vivo. Th1 cells Another strategy for differentiation is to activate cells in the presence of αB7.2 mAb or TGF-β. It is to become sex. Th2 differentiation is further enhanced by αB7.1 mAb, Amount and CTLA4 / Ig fusion protein (CTLA4 is a ligand for CD28) Also by activating the cells in the presence of one or more agents, such as Can be. CD28 is expressed on T cells and antigen presenting cells. The type of regulatory cell that results must be determined from animal models of the disease. one It has been found that not all regulatory cells in one class are similar. For example, some Th2 cells have high levels of IL-4 and low levels of IL-10. , But others had high levels of IL-5. Other regulatory cells Produces IL-10 and interferon-γ. Called "Th3" cells Regulatory cells secrete TGF-β and are preferred for treatment of multiple sclerosis I think that the.b. Isolation of regulatory cells Most methods of isolating immune cell subsets rely on mAbs directed against T cell surface antigens. It is based on reactivity. Positive selection can be performed by fluorescence-activated cell selection. (Reinherzet al . (1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.76: 4061). Plasti specific mAb Using a variety of selection methods to capture the desired T cell subset (Lumet al. (1982)Cell Immunol.72: 122). Undesired subsets with specific mAbs using selection method also for negative selection (For example, Englemanet al. (1981)J.Immunol.127: 2124 ). The use of mAb-coated magnetic polymer beads provides positive selection and negative Sex selection allows for the production of highly pure, functionally impaired lymphoid cells. It is a preferred method for isolation (eg, Leaet al. (1985)Scand.J.Immunol.twenty two : 207; Leaet al. (1986)Scand.J.Immunol.twenty three: 509; Gaudernacket al. (1986)J.Imm unol .Methods 90: 179). Antibodies that can identify regulatory immune cell subsets have not yet been reported, Strive to enhance desired groups by purifying based on certain cell surface proteins I need to help. For example, a CD30-positive cell group (Manettiet al. (1994)J.Exp. Med .180: 2407), CD27 negative cell group (Elsonet al. (1994)Int.Immunol.6. : 1003) and CD7-negative cells Herd (Autranet al. (1995)J.Immunol.154: 1408), but possesses most Th2 cells. It is clear that In addition, repeated contact of cells with anti-CD28 mAb Is an alternative way to increase Th2 cells. Another strategy for regulatory cell purification is to inhibit the growth of unwanted cell subsets. And to proliferate cells in the presence of known agents. That Such agents include dexamethasone, which inhibits the growth of Th2 cells, colchicine , CTLA4 / Ig fusion proteins and progesterone. TGF-β is Inhibits the growth of Th1 cells.c. Regulatory cell proliferation Expand purified T cells to clinically effective numbers in vitro without exogenous IL-2 A method of causing this is provided in the present invention. The method of the present invention uses IL-2 It is thought possible to grow the cells by adding that cytokine. Preferably. Cells that are exposed to IL-2 in vitro will not And the maintenance of function is dependent on the presence of IL-2, Requires a systemic infusion of IL-2 with these cells. Systemic infusion of IL-2 to patients Extremely toxic to Is known to avoid the need for that cytokine. Is the best. Propagating T cells requires two separate signals. The first signal is generated from the CD3 / TCR antigen complex on the cell surface. General. The second signal is provided from the IL-2 receptor. Using IL-2 signal Use a combination of mAbs to avoid this. Preferably in the soluble phase Include or immobilize on plastic or magnetic beads to recover cells Simplify the law.(I) First signal To provide the first signal, the mAb against the CD3 / TCR complex provides Preferably activate cells, antigen, superantigen, polyclonal Activators, anti-CD2 and anti-TCR antibodies (including but not limited to Other suitable signals can be used. Other suitable agents are experienced Can be confirmed. Immobilization or crosslinking such as OKT3 or 64.1 Anti-CD3 mAb can activate T cells in a polyclonal manner (Taxet al. (1983)Nature 304: 445). However, mm Other polyclonal activators such as phorbol stinate can also be used (Hansenet al. (1981)Immunogenetics Ten: 247). T cells can also be activated using a monovalent anti-CD3 mAb in the soluble phase (Tamuraet al. (1992)J.Immunol.148: 2370). Soluble monovalent anti-CD3m CD4 by Ab⁺Stimulation of cells is preferred for Th2 cell growth, but Th1 cells are preferred. Not recommended for vesicle growth (deJonget al. (1992)J.Immunol.149: 2795). Soluble heterozygotes of anti-CD3 and anti-T cell surface antigen mAbs are specific T cell A subset can be activated preferentially (Ledbetteret al. (1988)Eur.S. Immunol .18: 525). Anti-CD2 mAbs can also activate T cells (Hu etet al. (1986)J.Immunol.137: 1420). Anti-MHC Class II mAbs May have a synergistic effect with anti-CD3 in inducing cell proliferation (Spertiniet al. (19 92)J.Immunol.149: 65). Anti-CD44 mAb has a similar form to anti-CD3 mAb. Can activate T cells (Galandriniet al. (1993)J.Immunol.150:Four 225). In the present invention, a monoclonal antibody against anti-CD3 is preferable. Use anti-CD3 because CD3 is adjacent to the T cell receptor . Simultaneous T cell activation by CD3 induction, such as by monoclonal antibody interaction Transformation occurs.(Ii) Second signal Second, a second signal is required to cause such activated T cell proliferation . Various mAbs, alone or in combination, provide a second signal for T cell expansion. Can be. Anti-IL-4R mAb (specific for interleukin-4 receptor molecule) Can promote the proliferation of Th2 cells (Lindquistet al. (1993)J.Immunol .150: 394). CD4, CD8, CD11a (LFA-1), CD 49 (VLA), immobilized ligand against CD45RO, CD44 and CD28 Can also promote T cell proliferation (Mangeret al . (1985)J.Immunol.135: 3669; Haraet al. (1985)J.Exp.Med.161: 1513; Shimizu et al. (1990)J.Immunol.145: 59; Springer, (1990)Nature 346: 425). B Cell surface proteins that are ligands for cells are preferred targets for Th2 cell proliferation. However, macrophage ligands are preferred for Th1 cell proliferation. Anti-CD28 in combination with anti-CD3 or anti-CD2 A time-sustaining T cell proliferative response is elicited (Pierreset al. (1988)Eur.J.Immuno l .18: 685). Several weeks with anti-CD28 mAb in combination with anti-CD5 mAb An enhanced sustained proliferative response results (Ledbetter et al. (1985) J. Immunol. 135: 23 31). Obtaining a second signal of T cell proliferation even with anti-CD5 mAb alone Can be (Vandenbergheet al. (1991)Eur.J.Immunol.twenty one: 251). T cell expansion Other mAbs known to support growth include anti-CD45 and CD27. (Ledbetteret al. (1985)J.Immunol.135: 1819 and Van Lieret al. ( 1987)J.Immunol.139: 1589). Determine mAbs or protein combinations that optimally induce sustained regulatory cell growth Screening method using a combination of these mAbs or proteins. I have. Incubate cells with various combinations of these substances,^ThreeH Analysis of thymidine incorporation or equivalent method Perform screening. Select the group that shows the best growth characteristics and use.(Iii) Proliferation Purify the purified T cells for 100 billion (10¹¹Up to clinically effective To grow to a number, the cells must be grown to high density. that is, Agitation fermenters, airlift fermenters, roller bottles, culture bags and other Using suitable means, such as, but not limited to, an reactor device It can be carried out. At present, hollow fiber bioreactors are preferred. Hollow fiber The fiber bioreactor allows cells to be grown to the required high density in small volumes. Can be. As a result, monoclonal antibodies, serum, The amount of land decreases. Further, a fiber having a molecular weight cutoff of 6000 daltons By keeping the cell-derived cytokine in the culture space, Raw material supply and waste product removal can be performed. IL-2 and IL-4 Which of these cytokines promote and maintain cell viability and proliferation It is. T cells, like most mammalian cells, are 1 × 10 5 in tissue culture.⁶Pcs / mL Grow to maximum density. Therefore, to support 100 billion cells, a total of 100 Turtle's medium may be required. In addition, to keep cells alive 100 liters of medium to maintain the proper nutrient / waste product balance required for It is considered necessary to replenish regularly. 100 Li It is believed that a method is needed to maintain oxygen saturation in the medium of the turtle. Hollow fiber methods for cell culture are known (eg, US Pat. No. 4,220,725, 4206015, 4200689, 3883393 and 3821087 No. 4,391,912; U.S. Pat. No. 4,454,083; U.S. Pat. No. 4,301,249; U.S. Pat. No. 4,973,558, U.S. Pat. No. 4,999,298; And also U.S. Pat. No. 4,629,686), which is used to remove tissue from the medium. Cell density is obtained (ie, about 10⁸Density per piece / mL). Inside the original An empty fiber bioreactor vessel contains a housing having a plurality of artificial capillary hollow fiber membranes. There is jing. Capillaries are located at the inlet at one end of the device and the outlet at the other end. Stretches between. The capillary has a selection that allows the dissolved medium components to diffuse. There are selectively permeable walls. The lumen and ECS are defined by the implant material at the inlet and outlet. Are separated. The housing also has an opening to the ECS, allowing cells to S can be inoculated (eg, US Pat. No. 3,821,087, Nos. 3883393 and 4220725, 4206015, 4200689 issue, 3883393 and 38210087; furthermore, Knazeket al. (1972)Sci ence 178: 65). By the hollow fiber method, the cell density (1 × 10⁸Pieces / mL The cells can be grown to a density 100 times higher than the above. So 1000 Only one liter of medium volume is needed to get a billion cells. Cell volume By reducing the amount, the amount of human serum and soluble mAb required in the growth step Is thought to decrease. In addition, high cell density compared to in vivo conditions A close environment or provided. Hollow fiber bioreactors are used in hollow fiber cell culture systems. It is a component of the system. CELLMAX® 100 hollow fiber cell culture cis Typical hollow fiber cultivation such as Tem (Ce1lco Advanced Bioreactors, Inc., MD) The system consists of a standard glass medium bottle serving as a reservoir, stainless steel / Ryton gear pump, fiber and shell casing in which cells are cultured Autoclavable hollow fiber bioreactor having PH and pO of silicone rubber tube or medium_TwoGas exchange to properly maintain It has another connecting means as a replacement. Both components are in such a system 4 Standard culture Into small stainless steel trays that are small enough to enter the incubator room. Is defined. Automatic reversal of pump speed and flow direction is external to the incubator Once installed, through a flat ribbon cable that passes through the incubator door gasket Determined by an electronic control unit connected to the pump motor. Pump model The motor is magnetically assembled to the pump and removed from the system before the steam Perform autoclave treatment. HF bioreactor systems suitable for use in the present invention are co-pending. No. 08 / 506,173, issued to the assignee of the present invention.2. Preferred hollow fiber system for large-scale T cell culture Very close to the in vivo conditions, T cells were 1 × 10⁷Pcs / mL, preferably Is 1 × 10⁸Low molecular weight cut-off that can be grown to a density of more than pcs / mL Mitotic mAb and serum components using fibers with A problem-free HF system is disclosed in co-pending US patent application Ser. No. 06173. With this HF device, the outflow of the lumen fluid flow is completely Can be shut off. This allows nutrients to be distributed over the entire length of the hollow fiber capillary. Perfused evenly. For that purpose, the ECS of the bioreactor also has an oxygen supply device, and the desired oxygen introduction characteristics give. 14 inches long, ECS capacity 120 mL, molecular weight cut off (MWC) 600 Insert a 0 Dalton artificial kidney cartridge (CD Medical of Hialeah, FL) It was selected as a hollow fiber bioreactor for use in fiber treatment equipment. Its low MWC Automatic on / off electromagnetic to ensure even distribution of nutrients over the entire length of the cartridge A valve was installed at the effluent opening of the bioreactor. Set solenoid valve to "off" position This prevents the medium from exiting the bioreactor. Instead, the medium is Ultrafiltration against cells in the ECS in the same way at all parts of the actor Is done. The medium then flows out of the bioreactor through the outlet. Nutrient limits Filtration is relatively physiological in maintaining high density cell cultures. Is desirable (Swaabet al. (1974)Cancer Res.34: 2814; Daviset al. (19 74)Chem.Eng.J.7: 213). To remove metabolic waste from cells with ECS, switch the solenoid valve to the “on” position Then, the medium is returned to the ECS from the outlet while controlling the pressure. Next, pipe the medium radially. Move into the cavity. Finally, Remove the medium from the outlet opening. Ultrafiltration from lumen to ECS by hollow fiber system (cycle 1) The medium is automatically replenished with oxygen to reduce glucose, lactate and carbon dioxide levels. Can be adjusted. When the solenoid valve is opened in cycle 2, reconditioning Medium returns to ECS. Make the same adjustments for the medium on the luminal side of the bioreactor. To implement. In this way, oxygen is supplied to the bioreactor lumen and ECS And prevents diffusion across the hollow fiber capillary as the only means of oxygen transfer. Thus, the limitation of oxygen diffusion can be overcome. Improving hydrodynamics and reducing gradient formation for large-scale cultures of regulatory immune cells Hollow fiber bioreactors are presently preferred (eg, US Pat. No. 4,804,628). In particular, see co-pending granted US patent application Ser. No. 08 / 506,173). So Hollow fiber bioreactors with improved fluid dynamics, such as Most suitable for culture. In a preferred embodiment, a mitogenic monoclonal antibody is coated on a hollow fiber surface. And send the appropriate signals needed to cause immune cell division.D. Effector cell proliferation Effector cells are mononuclear cells that have the ability to directly eliminate pathogens or tumor cells. Vesicles. Such cells include LAK cells, TILs, CTLs and antibody producing There are B cells and other such cells. These cells are first obtained from the patient It is obtained by treating the harvested cells by known methods to cause differentiation of such cells. It is. For example, TIL cells provide for IL-2 and / or other TIL production. Of solid tumor tissue obtained from biological sections with It is. Next, the cells are made specific for cell surface receptors as described above for regulatory cells. Activated in the presence of mitogens such as classical monoclonal antibodies and other agents And multiply. According to the method of the present invention, cells are treated with exogenous IL-2 (or in vivo activity or Cells, or other agents that are dependent on survival) No co-infusion of IL-2.E. FIG. Selection of immune cell phenotype Actions that require a fusion cell regulatory effect (or require effector cells) Different cell phenotypes are required depending on the site. Can get. Lymphocytes circulate extensively throughout the body and are localized in tissues and lymphoid organs I do. This is an array of adhesion molecules on lymphocytes as well as vascular endothelium, extracellular matrix. It is carried out by the counter receptor on the box and the hull. Recent studies show that phosphorus Several specific receptor / ligand interactions that mediate papocyte migration have been identified I have. Injected cells that need to move out of the circulation (eg, to the site of inflammation) Must have the ability to move through the outer matrix (ECM). For example, the subendothelial basement membrane contains collagen IV, laminin and heparan sulfate Provides a theoglycan-rich barrier. Interstitial ECM includes collagen I and Contains various glycosaminoglycans such as III and hyaluronic acid . Fibronectin and vitronectin are also found in basement membranes and stroma. Immunity By loading cells into a column containing these materials, they can move through the stroma. Screening of cells that can be performed. Furthermore, cells with a “memory” phenotype (ie, CD45RA−, CD45 RO +, CD29 +, CD11a +, CD44 +, CD54 +, CD58 +, L -Selectin-) is chronic It is also known to accumulate non-specifically at sites of inflammation. Expresses L-selectin Cells are very unlikely to migrate and require the desired regulatory effect in lymphoid organs Should be used in such cases. Culturing cells with specific antigen specificity prevents non-specific immunomodulation Would be desirable. Specific to the site where a regulatory effect is desired or to a pathogenic antigen You must choose a proprietary antigen.F. Implementation of treatment The treatment method of the present invention is clinically effective (10⁹that's all, Preferably 10^TenAbove cells) regulatory immune cells and / or effector immune cells It is designed to produce a composition containing vesicles. The method of the present invention Must be present after proliferation to maintain cell viability or activity It does not rely on and does not use growth agents. In particular, for proliferation In addition, IL-2 is not required and is not used. As a result, with cell reinfusion Because it does not require and does not use IL-2, the toxicities associated with IL-2 infusion Sex and other problems are avoided. The composition is preferably substantially homogeneous, such as Th1 cells or Th1-like cells. Group, where the cytokine profile is predominantly one type of subpopulation. Vesicles (ie, greater than about 50%). The composition comprises regulatory immune cells, effect Cells or both. In each case, the composition has a clinical Effective, ie, a therapeutically effective number of cells. Such compositions can be used in therapy to reverse immune cell imbalances You. Immune cell imbalance is common in many disease states. For example, rheumatoid arthritis Machi (Simonet al. (1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91: 8562), type I diabetes (Fouliset al. (1991)J.Pathol.165: 97), systemic inflammation (Brodet al. (1991)J. Immunol .147: 810), inflammatory yang syndrome (Niessneret al. (1995)Clin.Exp.Immun ol .101: 428), Graves' disease (de Carliet al. (1993)J.Clin.Endocr.Metab.77 1120), Sjogren's syndrome (Oxholmet al. (1992)Autoimmunity 12: 185 ), Primary systemic vasculitis (Grau (1990)Eur.Ctokine Netw.1: 203), own Transplant rejection (Benvenutoet al. (1991)Transplantation 51: 887) In epidemic disease, The dominance of Th1 regulatory immune cells has been reported. AIDS (Romagnaniet al. (1 994)Res.Immunol.145: 611), candidiasis (Puccettiet al. (1995)Trends i n Microbiology Three: 237), tuberculosis (Zhanget al. (1995)Infect.Immun.63: 3231 See allergy), allergies (Romagnaniet al. (1994)Curr.0pin.Immunol.6: 838) Reported the dominance of Th2-regulated immune cells. Furthermore, the bias of Th1 and Th2 responses in humans to various antigens is And play a role, but are also known to be immunopathological. Of the present invention By injecting a subset of autoregulated cells in a short supply using the method Improving pathological Th1 and Th2 responses by adjusting ratios and absolute numbers Can be. Th1 and Th2 cells have a cross-regulatory nature and therefore are High-volume subset injections to prevent the pathological effects of an imbalanced response Can be Some examples of treating some diseases using these methods It is shown below. It is clear that the following are illustrative and that a particular subset of T A condition in which a pathological T cell response in which the ratio or amount of cells is out of the normal range is recognized. Can be treated by injecting T cell subsets in a relatively short supply .1. Administration Such as, but not limited to, intravenous, parenteral or topical administration I) The cell composition can be administered by any suitable means. Specific to be selected Morphology depends on the particular treatment and cell delivery. Currently, quiet Pulse administration is preferred. Typically, about 10^Ten-10¹¹Individual cells, with a volume of 50 mL 1 liter, preferably about 50 mL to 250 mL, more preferably about 50 mL to It can be administered in 150 mL, most preferably about 100 mL. The capacity is It depends on the disorder to be treated and the route of administration. Cell administration is particularly important for immune system balance. If recovery is the goal, a single dose or several doses at predetermined time intervals To determine the dose.2. Treatment of autoimmune disease The methods and regulatory cell compositions provided by the present invention are used to fundamentally enhance autoimmunity. Or a disorder having a component.a. Treatment of rheumatoid arthritis (RA) RA is an immune-mediated chronic inflammatory disease characterized by synovial inflammation and autoantibodies. You. The cause underlying RA is unknown Is widely recognized that impaired immune regulation is a major factor contributing to the pathogenesis of the disease. Is being used. To a large extent, the regulatory control of normal immune responses is largely dependent on macrophages, Interactions between T cells and B cells and their cytokine production It is. Disease activity in RA patients is associated with cytokine production by activated macrophages. There is a positive correlation between them. In inflamed joints, macrophages have IL-1 Large amounts of proinflammatory cytokines, including IL-6, IL-6, IL-8, TNF-α and GM-CSF It produces tocaine. These cytokines recruit Th1 memory cells to joints Act to stimulate rheumatoid factor (RF) production, Causes joint destruction. Decreases proinflammatory Th1 cytokine levels in RA Treatment protocols have shown clinical improvement. The cytokines IL-4 and IL-10 down regulate macrophage activity Inhibits its production of IL-1, IL-6, IL-8 and TNF-α. Have been. IL-4 also inhibits synovial cell apoptosis, a key pathological feature of RA. Limited proliferation can also be suppressed. IL-4 and IL-10 are in RA joints Produced by Th2 cells that are substantially absent. Rather, RA joints are rich in Th1 cells. Thus, the method of the present invention allows autologous ex vivo Th2 cells from RA patients to be Producing it in large quantities can treat RA. Preferably 10⁹that's all, More preferably 10^TenBy reinjecting the cells obtained in the above amount into the patient, Suppresses inflammatory lesions. Are memory cells most likely to migrate to sites of inflammation? Thus, memory phenotype Th2 cells are preferred. In addition, inject cells in an activated state be able to. TLA infiltration in RA causes 5-6 It is clear that there is a 2-fold increase and there is a 2- to 5-fold increase in VLA-1 expression. And these are all markers of activation. Furthermore, preferably, the injected Th2 cells have their regulatory effect only in joints. To prevent systemic immunosuppressive effects. Induced antigen unknown in RA Therefore, the Th2 cells used must be specific for a unique joint antigen. (Eg, type II collagen or proteoglycan).b. Treatment of multiple sclerosis (MS) MS is an autoimmune disease characterized by inflammation and demyelination of the central nervous system. MS Of cytokine spectrum and production in Modulation is thought to have a decisive effect on disease outcome. Combining the data, TNF-α, lymphotoxin, interleukin-12 and interfero Th1-related cytokines such as IL-γ enhance disease, Cytokines from Th2 cells have been shown to suppress disease. Furthermore, it has been revealed that TGF-β is a disease suppressant. MS behavior In a product model study (experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)), "Th3 Regulatory cells that produce IL-10 and TGF-β, referred to as It has been shown to be the most effective in controlling and inducing recovery from the disease You. Thus, the method of the present invention is useful for treating patients from MS for use in autologous cell therapy. It can be used to produce an effective amount of Th3 cells. From the disease Recovery is related to infiltration of cells producing IL-10 and TGF-β The inflammatory lesion such that the ex vivo Th3 cells preferably have a memory phenotype Must facilitate the move to. In addition, the immunosuppressive effect of cells on inflammatory lesions Encephalitis-inducing epitope of myelin or myelin antigen to be specific (Example: myelin salt Cells that are specific to the basic protein or proteolipid protein) must be used .c. Inflammatory bowel disease (IBD) IBD is a chronic inflammatory condition of the gastrointestinal tract. About the etiology and pathogenesis of IBD Is unknown. 1 or more for Crohn's disease (CD) and ulcerative pneumonitis (UC) Are thought to be mediated by abnormal or unrestricted T cell responses to common brain components Have been. Active CD and UC are associated with increased Th1-like cytokines Characterized by a detectable or undetectable Th2-like cytokine. Thus, the method of the present invention forms autologous Th2 cells for injection in IDB patients. Can be used for Preferably, the injected cells are integrin α4, β 7 is expressed. This integrin is found in Peyer's patch high endothelial venules that occur in the digestive tract. Recognized ligand for mucosal addressin cell adhesion molecule-1 It is clear that Lymphocytes that express α4 and β7 are Transported to and held there. The intestinal mucosa is the site of chronic inflammation of IBD.d. Treatment of insulin dependent diabetes mellitus (IDDM) IDDM results from autoimmune destruction of islet β cells by the host immune system It is. It is known that the destruction of pancreatic islet cells is mediated by T cells. NO D mice are a naturally occurring model of human IDDM. Syngeneic transfer in the mouse Transplantation of pancreatic islets as transplants restores normal glycemia and prevents early complications of diabetes And recovered. However, eventually, the inflammatory response of the host causes islet graft Destruction and relapse of the disease. By analyzing these inflammatory responses, the Th1 cells mediate rejection, whereas Th2 cells have a protective effect Has become. Th1 cells mediate rejection of allografts and allografts, Has been shown to be controlled by Th1 cells are NOD mau It has been shown to actively promote diabetes in cancer. Th1 Siteka Inhibition protects islet syngeneic grafts in NOD mice. Recently, Th 2 Systemic administration of cytokines (IL-4 and IL-10) and islet specific Th3 Loan adoption prevents isogenic lineage islet graft rejection in this animal Clear to get It has become. In addition, Th2-like responses are modeled for allogeneic organ and tissue transplantation. Has a protective effect. Thus, the method of the present invention provides protection against rejection of transplanted allogeneic islet cells. Providing Clinically Effective Number of Th2 Cells for Infusion in Providing IDDM Patients Can be used for Preferably, the Th2 cells are located in the transplanted islets. Specific for allogeneic antigens. Alternatively, insulin specific T h2 cells can be used. Using insulin-specific Th2 cells, Treatment of stage-diagnosed IDDM patients to prevent islet destruction or high-risk patients Can be used as a vaccine to prevent or at least slow the progression of diabetes. It is considered possible.e . Treatment of other autoimmune diseases Autoimmune thyroid disease, antitubule basement membrane disease (kidney), Sjogren's syndrome, strong Th1 such as (but not limited to) ankylosing spondylosis, urea retinitis A mediated autoimmune disease has a clinically effective number (typically 10⁹-10¹¹) Th Treating by administering a composition comprising two cells or a Th2-like composition. Can be.3. Transplant Transplant organs and tissues using Th2 cell ACT as an immunosuppressive strategy be able to. For example, Th2 cytokines are associated with non-rejecting cardiac allografts. However, Th1 cytokines have been associated with rejection. Similar findings, kidney allogeneic Grafts and orthotopic liver and skin allografts in mice Have been. Adopted Th2 cells suppress skin allograft rejection and are sublethal Allograft of spleen cells is possible in mice that have been irradiated Inhibits GVHD (graft versus host disease). T cell-mediated allogeneic reactivity Reveals central role in the pathogenesis of GVHD and graft rejection Has become. Therefore, the method of the present invention is suitable for infusion in patients who are planning organ or tissue transplantation. Can be used to form autologous Th2 cells. Preferably, the T h2 cells are specific for alloantigens or antigens specific to the organ or tissue to be transplanted It is.4. Allergic disorders Th2 cells are eczema reactions in patients with atopic dermatitis, Causes airway hyperreactivity and pulmonary eosinophilia in and allergic asthma It appears to play a very important role in the initiation of eosinophil infiltration. In addition, In topy patients (hay fever patients, dust allergic patients and food allergy patients) , Th2 cells are preferentially activated. Recent evidence indicates that Th2 in vivo Treatment that suppresses formation may lead to allergen-induced airway changes and other atopic responses It has been shown to have a strong inhibitory effect. Therefore, Th1 site Since Cain is known to inhibit the Th2 response, the method of the invention Use to form large numbers of autologous Th1 cells for injection into atopic patients Can be. Preferably, the cells are specific for an allergen.5. Infectious diseases and cancer Th2 cell overload can be caused by viral, fungal, yeast, parasite and It is associated with the most infectious diseases, such as mycobacterial infections. To the patient Injecting Th1 cells can alter the regulatory balance in the direction of cell-mediated immunity It is thought that. Prior art ACT protocols include TIL and LAK Vector and pathogenic or tumor cell specific A method using CTL is used. These effector cells are immune compromised It does not appear to work properly in the state host. The co-injection of Th1 regulatory cells is a function of effector cells It should provide the "support" needed to improve care. Injection of Th1 cells alone It is considered that the activity of endogenous CD8 + effector cells is sufficiently supported in vivo. available. Accordingly, the method of the present invention is useful for injecting into patients with infectious diseases or cancer. Could be used to form autologous Th1 cells. Preferred Alternatively, the cells are specific for antigens specific to the pathogen or tumor. Th1 Cells can be injected with cytolytic cells specific for the pathogen or tumor. it can. Of particular interest in the present invention are methods of treating HIV infection. C CD4 with virus removed⁺A method for obtaining a cell is provided. In a preferred embodiment Thus, the cells are grown under conditions that promote Th1 cell differentiation. The resulting cells Restore immunity by reinfusion into donor HIV patients. In other embodiments, Effector cells, especially HIV, Cells are re-injected with the effector cells specifically targeted. Other infectious diseases that can be treated with the Th1 cell composition include influenza virus , Poliovirus, leukemia virus, hepatitis virus, respiratory syncytial virus, Lupes virus, retrovirus, Epstein-Barr virus, syphilis (syphilis) Treponema), cutaneous T-cell lymphoma (mycosis fungoides), Rhodococcus-equi ( Intracellular respiratory pathogens), irritable pneumonia, filamentous keratitis (river blindness), burn damage Person, trachomatic pathogen, Mycobacterium avium, Candida albicans, Kokusa kiwi Rus, Leishmania major infection, Cryptocox infection and B. pertussis respiratory tract Infections and the like, but are not limited to these. Infectious diseases that can be treated by the Th cell composition include filarial nematodes (parasites). ) Infection, Plasmodium chaboudi chaboudi (malaria) infection, and Borrelia burgd ofi (spirochetes) infections, but are not limited thereto. Also of interest in the present invention are methods of treating cancer. Preferred embodiment In another aspect, a method for treating renal cell carcinoma is provided. Transformed kidney cells are Expresses the protein hsp70. Consequently, hsp70-specific Th1 cells serve as cytokine delivery vehicles By increasing the local concentration of IL-2 and IFN-γ in tumors, It is believed to promote the function, activity and / or proliferation of tumor effector cells. Using Th1 cells, melanoma, breast cancer, head and neck cancer, prostate cancer and lung It can also mediate tumor regression of cancer, such as cancer. Th2 response in certain tumors Evidence has been obtained that can mediate regression.6. vaccination Details such as, but not limited to, bacteria, viruses and parasites Developing effective vaccine strategies against endoplasmic reticulum is one of the major frontiers in medical research It has become. The focus of the study is on pathogenic microbes that can elicit Th1-like responses in patients. Located on antigens and antigen enhancers from organisms. Th1 response becomes an infectious agent It is known to be protective. The Th1 response is the The protocol is weak or non-existent in some patients. Other research focus Is thought to have a protective effect on microorganisms that enter the body through mucous membranes. has been placed on eliciting a gA antibody response. Th for the IgA response Two cells intervene. The method of the present invention provides an in vitro vaccination method (ie, Addition of vaccine antigens to patient mononuclear cells in vitro to achieve the desired regulatory cell differentiation Activates the cells under conditions that promote It better controls the type of immune response. Blood is collected from a patient using the method of the present invention, and the isolated mononuclear cells are isolated from IL-12. And / or exposure to vaccine antigens in the presence of IFN-γ and / or IL-4 When exposed, Th1 or Th2 cells can be expanded and reinjected. Preferably The cells used have a memory phenotype to provide long-term protection. CD4⁺And CD8⁺Th1 or Th2 cells alone or in combination It is thought that it can be achieved. The following examples are for illustrative purposes only and limit the scope of the invention Not something.Example 1 Screening for mitogenic monoclonal antibodies This example demonstrates that T cell subsets can be expanded alone or in combination. 1 shows a method for confirming an antibody suitable for the method described above. To determine the costimulatory signals required for T cell subset expansion, cells were Incubate with clonal antibody (mAb)^ThreeH-thymidine removal The proliferation is measured in a plug-in assay. The following experiment was performed to show an example of the procedure. Was. Monoclonal Ab against CD3 (64.1, IgG2a) and anti-CD5 (10.2, IgG2a) by Mr. Redbetter (J. Ledbetter, Bristol Meyers, S. The CD mAb (Kolt-2, IgG1) provided by Sagawa (K.Sagawa, Kurume University). These mAbs were converted to protein A Purified from ascites on a Sepharose column. All other mAbs purchased (PharMingen, San Diego, CA). Both mAbs are phosphate-buffered physiological diets It was dialyzed against saline and filtered through a sterile 0.45 μm filter. Goat anti-mouse affinity purified antibody (Tago, Burlingame, CA) in plastic Was immobilized on a 96-well culture plate manufactured by Eisai. Antibodies with boric acid at a concentration of 10 μg / mL Dissolved in sodium buffer (pH 8.6) and inoculated 100 μL in each well . Plates were washed three times with RPMI-1640 containing 10% healthy human serum. Cells were incubated with anti-CD3 mAb (1 μg / m After labeling with L), the plate was subjected to plate culture. Plate 50,000 cells in each well Cultured. Co-stimulatory mAbs were added at a soluble phase of 1 μg / mL. 5% CO_Two The cells were cultured at 37 ° C. in an atmosphere. After culturing for 88 hours, 1 μCi of [^ThreeH] -Thymidine (specific activity 2 Ci / mol, New England Nuclear) was applied. 8 o'clock After a while, the cells are harvested using a PHD cell harvester (Cambridge Technology, Cambridge, Mass.). With a liquid scintillation counter (LS1701, Beckman). The shooting power was counted. Obtained by adding mAb to purified CD4 + and CD8 + cells from healthy subjects The results are shown below. The results are the average counts per minute (cp) in quadruplicates. m). Standard error was always less than 10%. These data indicate that when cells were activated with anti-CD3, anti-CD5 and C D28 provides a costimulatory signal of T cell proliferation in CD4 + and CD8 + subsets Indicates that it can be provided. Conclusion when combining anti-CD5 and CD28 The results are shown below. These results indicate that anti-CD5 and co-stimulatory signals in CD3-activated purified T cells Combination of anti-CD28 results in greater proliferation than either mAb alone Indicates that a response is elicited. Furthermore, the combined use of these mAbs allows A proliferative response was obtained without the addition of L-2. From a healthy donor used with anti-CD3 or anti-CD2 (first signal) The effect of various mAbs (second signal) on purified CD8 + cells was also examined. The results are shown below. These results indicate that anti-CD3 as the first signal is a stronger growth stimulator than anti-CD2. To give. The anti-CD45RO and anti-CD28 mAbs were To provide the strongest second signal, co-stimulation signal, when used with D3 Seem. Combinations of these antibodies are used to elicit anti-C specific for the MAGE-3 antigen on melanoma cells. D3 activated in vitro formed CD8 + cytolytic cells were examined. The result Shown below. The combination containing anti-CD11a gives the strongest growth signal for these cells was gotten. None of these combinations produced very exceptional growth . It is a CD8 + CTL that cannot produce enough endogenous cytokines May occur in. However, co-culture of these cells with autologous CD4 + Thus, the proliferation of these cells was stimulated by mAb stimulation. This is probably IL -2, and increased endogenous production of IFN-γ and IL-7. Was.Example 2 CD4 ⁺ and CD8 ⁺ T cells from healthy donors This example demonstrates that polyclonally activated CD4⁺And CD8⁺Adjustable T Cell subsets were obtained using the disclosed method without the use of IL-2 at approximately 1 × 10⁶ Demonstrates the ability to grow from a starting number of It is something.A. Collection of mononuclear cells Mononuclear cells from a healthy donor were transferred to a leukocyte pack (Interstate Blood Bank, Inc. ) Obtained from source. The cells of the leukocyte pack are converted to calcium (Ca)²⁺) And magne Cium (Mg²⁺) Without Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) Add 30-35 mL of diluted cells to 12 mL of Ficoll-Hypaque and add the tubes Was centrifuged at 1500 RPM at room temperature. Hairy leukocyte layer containing lymphocytes and monocytes Transfer to a clean 50 mL centrifuge tube with a capillary pipette and wash 3 times with HBSS. Was. Next, 10% human serum, 25 mM HEPES buffer, 2.0 mM glutamate 1.0 mM sodium pyruvate, 0.1 mM non-essential amino acids, 2 × 10^-Five M 2-mercaptoethanol, 10 IU Supplemented with Penicillin G and 100 mg / mL streptomycin sulfate The cells were suspended in PMI-1640 medium (cRPMI). 5% CO_TwoAnd wet Plastic T incubated overnight at 37 ° C under 100% atmosphere Monocytes were eliminated by attachment to cell flasks.B. Purification of progenitor cells T cell subsets were purified using the immunomagnetic bead method. GAM-coated beads (Dynal, Inc.) was washed twice with HBSS and washed with HBS containing 1% healthy human serum. Incubate overnight at 4 ° C on a rotating wheel in S to block nonspecific binding. Refused. With anti-CD4 or anti-CD8 mAbs at concentrations pre-titered on ice Next, the non-adherent cells were incubated for 30 minutes. Wash the labeled cells twice Was resuspended in cRPMI at 10 cells / mL. 2: 1 beads / cell ratio The beads were added to the cells and mixed well. This mixture is heated at 500 RPM for 1 minute at 4 ° C. Centrifuge gently. Carefully invert the centrifuge tube to remove the bead / cell mixture. Resuspended. Next, the centrifuge tube was placed on a rotating wheel at 4 ° C. for 30 minutes. next, The bead / cell mixture was diluted 5-fold with cRPMI and placed on a cobalt salarium magnet. I put it. Supernatant Was suctioned and rosette-formed, and the procedure was repeated. 5% CO_Two37 ° C under atmosphere For 24 hours in cRPMI. 24 hours later, large Half the cells were detached from the beads and the beads were removed by returning the solution onto a magnet. The obtained cells exceeded 98% as assessed by flow cytometry. Pure CD4⁺Or CD8⁺T cells.C. In vitro differentiation Purified CD4 + cells were divided into two different groups, one million each. No. One group contained 400 U / mL IL-4 and 10 μg / mL anti-IFN-γ mAb. And activated by immobilized anti-CD3 mAb in the presence of anti-CD28 mAb. This first group (Th2) was grown under these conditions for an additional 10 days. The second group consisted of 25 U / mL IL-12 and 150 U / mL anti-IFN-γ, And activated by immobilized anti-CD3 in the presence of anti-CD28 mAb. This cell Was collected and washed after 6 days of culture.D. Regulatory cell proliferation One million subgroups of each purified T cell were cultured on ice with anti-CD3 mAb (64.1, IgG2 Labeled according to a) for 30 minutes. Purification CD4⁺And CD8⁺2.5 × 10 cells^FiveAnd suspended in 1 mL of cRPMI. 4 anti-mouse (GAM) 24-well plates coated with polyclonal antibody Into different wells. Purified anti-CD5 (10.2, IgG2a) and anti-CD 28 (KOLT-2, IgG1) mAb at a final concentration of 200 ng / mL Added to Next, 5% CO_TwoIncubate at 37 ° C. under atmosphere. After 3 days, cRPMI 1 containing 200 ng / mL anti-CD5 and anti-CD28 mL was added to the wells. Six days later, the wells are collected, accumulated, and washed twice with cRPMI. Was cleaned. Viable cells were counted and 1 × 10⁶Cells / mL in cRPMI, Incubation was performed at 37 ° C. for 48 hours in a T-type culture bottle. Next, collect the cells, Washed twice, labeled with anti-CD3 mAb on ice for 30 minutes, 200 ng / m GAM coated small hollow fiber bath with anti-CD28 and anti-CD5 mAbs The space outside the capillary of the ioreactor was inoculated. After 14 days, cells are collected and washed And counted.1. Small hollow fiber bioreactor Producing a small hollow fiber device to expand immune effector cells went. The device was provided with four small hollow fiber units in parallel. Hollow fiber (CD Medical, Hialeah, FL) has an extra-capillary volume of 9 mL and fiber molecules The quantity cutoff value was 10,000 daltons. GAM polyclonal hollow fiber Antibody. Coating was performed using GAM polyclonal antibody at a concentration of 10 mg / mL. Dissolve in sodium borate buffer (pH 8.6) and transfer the sterile solution to the hollow fiber vial. This was done by inoculating the extra-capillary space (ECS) of the reactor. Lumen and E Close the CS port, place the bioreactor on a rotating plate, and incubate at 4 ° C for 24 hours. Was an option. Prior to use, the bioreactor was washed with phosphoric acid containing 1% healthy human serum. Washed with acid buffered saline. The flow path included a storage container, a pump, an oxygenated cartridge, and the like. Luminal flow Volumes range from 100-400 mL / min, which is relative to cell growth in the bioreactor. As an example, it was raised manually. Monitor pH and temperature continuously and use microphone Controlled by a microprocessor. The speed and oxygenation rate of fresh medium supplied to the container CO in cartridge_TwoBy changing the percent, the pH is adjusted to 7.2, Maintained. Adjust the wattage applied to the heating coil wrapped around the storage container The temperature The temperature was controlled at 37 ° C.2. One large hollow fiber bioreactor Cells recovered from the small hollow fiber device were subjected to mAb stimulation in T-flasks. In particular, 1 × 10 cells in cRPMI⁷Incubated at 48 cells / mL for 48 hours . Next, cells were labeled with anti-CD3 mAb, and GAM-coated large hollow fiber biore Actors were inoculated with 200 ng / mL anti-CD5 and anti-CD28 mAb (See co-pending and granted US patent application Ser. No. 08 / 506,173). 1 After 4 days, cells were harvested, washed and counted.3.8 Cartridge hollow fiber bioreactor Cells recovered from one large hollow fiber bioreactor (co-pending, licensed US patent application Ser. No. 08 / 506,173, which was described in US Pat. Medium cell 10⁷Ink for 48 hours in a 10 liter spinner flask at 10 pieces / mL Has been recorded. Next, cells were labeled with anti-CD3 mAb and coated with 8 GAMs. 200 ng / mL anti-CD5 and anti-C Inoculated with D28 mAb. After 14 days, cells were harvested, washed and counted.E. FIG. result A clinically effective number of cells was obtained as follows. Thus, a composition comprising a clinically effective number of T cell subsets can be obtained. You.Example 3 Virus-depleted CD4 ⁺ Th1 cells from HIV ⁺ patients This embodiment is used as an ACT for AIDS by the method of the present invention. -Effective number of virus-removed CD4s for⁺Generating Th1 cells It shows what you can do You. By selecting the CD4 antigen, active virus can be removed from cells and polyclonal Activation and then again select for the CD4 antigen to remove potential virus Removed.A. Obtaining mononuclear cells Western blot analysis confirmed by routine blood screening Stage IV HIV confirmed by⁺Patients were donors for this study. Suffering For the individual, the peripheral blood mononuclear cell was collected by performing the leukocyte removal method.B. Purification of regulatory cells By positive selection on immunomagnetic beads as described above, CD4⁺Cells were isolated. CD 4⁺Cells were grown in the presence of 40 U / mL interferon-γ (IFN-γ) Activated in 24-well plates with immobilized anti-CD3 mAb. 24 hours culture Thereafter, the cells are collected, washed, and again selected for CD4 using immunomagnetic beads. Was. 96 wells labeled positively selected cells with anti-CD3 mAb and GAM coated Plates were plated at 25000 cells / well in cRPMI. Anti CD28 mAb and IFN-γ at concentrations of 1 μg / mL and 40 U / m, respectively At L, was added to the wells. Seven days later, the supernatant from each well was The p24 antigen was examined using a commercially available ELISA assay kit (DuPont). All negative wells were collected, again labeled with anti-CD3 mAb and GAM coated Anti-CD2 in cRPMI at 25000 cells / well in 96-well plate Plated with 8 mAb.C. Regulatory cell proliferation Described in Example 2 above, except that only anti-CD28 mAb was used as a costimulator. The cells were grown according to the method described above.D. result 6.3 × 10^TenIndividual cells were grown for 72 days. Cells are negative for p24 antigen Were able to produce IL-2 and IFN-γ, whereas IL-4 Most could not be produced. The cells also help NK function in a dose-dependent manner It became clear that we could do that. The cells were re-infused into the patient. H IV⁺Reinfusion into the patient should provide treatment for AIDS.Example 4 HIV-specific CD8 ⁺ cells from HIV ⁺ donor In this example, antigen-specific CTL was purified from a virus infected person. It indicates that it can proliferate.A. Obtaining effector cells By leukocyte depletion from AIDS stage IV patients, 3 × 10⁸Obtained monocytes . Selection with immunomagnetic beads was performed twice to obtain CD8⁺, CD25⁺The cells were purified.B. Effector cell proliferation About 2 × 10⁶Cells were harvested and the anti-CD3 mAb and soluble anti-CD28 mAb were collected. Growth was performed on 24-well plates coated with b. After 6 days, cells are washed (twice) , A small hollow fiber bioreactor. 18 days in small hollow fiber unit After passing, the cells were washed, counted, and allowed to stand for 2 days before being described in Example 2 above. Inoculated into a cartridge of a large hollow fiber bioreactor under the same conditions as listed . Sixteen days later, the cells were collected, washed, and left for 2 days. Next, out of 8 cartridges The empty fiber bioreactor system was inoculated with live cells and treated as described in Example 2 above. Culture was performed under the same conditions as described above.C. result After 20 days, 6 × 10^TenViable cells were collected. The details The vesicles showed significant Ag-specific CTL activity against infected autologous cells. The cells can be re-infused into the patient for AIDS treatment. Moreover Cells were obtained from the virus-free CD4 obtained according to the method described in Example 3.⁺And simultaneous note You can enter.Example 5 Antigen-specific Th2-like cells from healthy donors This example demonstrates that antigen-specific Th2-like CD4⁺Inducing cells, clinical This indicates that the cells can grow to an effective number.A. Acquisition of regulatory cells HIV^-50 mL of blood is aseptically collected from a volunteer into a syringe containing heparin. I was bloody. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were subjected to Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation. Separated. PBMC was placed in a 10 mL T-flask at 2 × 10⁶Pcs / mL Incubate 1.0 μg / mL anti-IFN-γ mAb and 20 U / mL IL-4 The gp120 antigen in cRPMI containing was applied. Two days later, with immunomagnetic beads The blast cells were recovered by selection of CD25. Allow the blasts to stand for 72 hours and remove gp120 Self applied Restimulated with monocytes and immediately cloned in soft agar. Surviving as a colony Only a small number of cells (1 / 150,000) that have grown have increased Ag-specific cells The cells produce IL-4 and IL-10 upon stimulation and produce IFN-γ. Th2-like in cytokine profile due to little production .B. Effector cell proliferation Cells were grown according to the method described in Example 2 and 9 × 10^TenUp to Lengthened.Example 6 Differentiation of Th2 cells from progenitor cells in peripheral blood of rheumatoid arthritis T cell cytokine expression is very low in rheumatoid arthritis (RA) The absence of Th2 factors (eg, IL-4 and IL-13) is particularly pronounced. Th2 Cytokines are proinflammatory cytokines, metalloproteinases and rheumatoid factors Is relatively low in RA because it suppresses the production of It is thought to be the cause of perpetuation. Deficiency of Th2 cells in synovial fluid indicates its differentiation This suggests that the path may be impaired in RA. RA Th2 precursor fine Peripheral blood RACD4 + T cells were tested in vitro to determine if vesicles were present. h0 (IL-4 + IFN-λ), Th1 (IFN-λ, no IL-4) and The ability to differentiate into Th2 cells (without IL-4, IFN-λ) was examined. 3 days in the presence of immobilized αCD3 antibody, αIL-12 and IL-4 Purified CD4 + T cells were cultured. Next, the cells are washed and in the presence of monensin. Were stimulated with PMA and ionomycin for 6 hours. αIL-4 and βI Two-color flow cytometry on cells permeabilized with FN-λ monoclonal antibody Was used to reveal the cytokine phenotype. Results are expressed as cell percent ± standard It is shown as an error (se). The “n” value is shown in parentheses. These data show that similar numbers of Th2 cells were found in the peripheral blood of healthy subjects and RA patients. This indicates that precursor cells are present. Furthermore, IL-4 antibody and α-IL- The 12 antibodies can significantly increase the population of mature Th2 cells (p <0 . 05). Therefore, the lack of specific Th2 progenitor cells is a factor It does not explain the profile. This means that Th differentiated and proliferated in vitro This raises the possibility of developing new therapies involving the administration of two cells.Example 7 HIV + lymphocyte proliferation PBLs from HIV + donors are combined with polyclonal activator PHA-P and solid The ability to proliferate in response to immobilized anti-CD3 mAb compared to PBL from healthy donors (Table 1). PBL from HIV + donor compared to PBL from healthy donor Showed significant suppression in the ability to respond to any mitogenic signal . Table 1: Proliferation of healthy donor PBL and HIV + donor PBL against mitogen Compare responses^* * Peripheral blood lymphocytes (PBL) isolated by Ficoll-Hypaque method were The plate was cultured at 50,000 cells / well on a flat bottom culture plate. Medium only, After stimulation with PHA-P or immobilized anti-CD3 mAb for 88 hours, cells For eight hours [^ThreeH] -thymidine applied, 6 healthy subjects and HIV + test The mean and standard error of quadruplicate samples for 6 subjects are shown in cpm. Purified T cell subsets from HIV + donors are mitogenic in the absence of activators The following tests were performed to determine if the stimulus could be met. 6 healthy subjects and 6 HIV + subjects (same as participants in the experiment shown in Table 1) 5% CO_Two24 hours at 37 ° C in an air atmosphere containing And incubated in plastic tissue culture dishes. CD4 + and And CD8 + T cell subsets were purified by positive selection with immunomagnetic beads as described above. Made. The results are shown in Table 2. Table 2: T cell subsets of normal and HIV + subjects against mitogens Proliferative response ^*Positive selection with immunomagnetic beads from 6 healthy donors and 6 HIV + donors T cell subsets isolated by selection. Average purity is shown in parentheses. 96 u 5000 cells in CRPMI and 10% NHS in a flat bottom tissue culture plate. Cells were plated at 0 cells / well, medium alone, immobilized anti-CD3 + IL-2 (1 0u / mL) or PMA (0.5ng / mL) After 88 hours of stimulation by either, 1 μCi [^ThreeH] -thymidine for 8 hours Applied. Results are shown as mean cpm and standard error. Triple for each group I went in. The results obtained indicate that a significant T cell proliferative response is possible for HIV + donors. Which indicates that. CD4 against anti-CD3 + IL-2 of HIV + donor cells + Cell response was less than about 30% in healthy donors, but nevertheless only medium The value was significantly higher than that of the control. Anti-CD of HIV + donor CD8 + cells The response to 3 + IL-2 was almost equal to that of healthy cells. Healthy donna CD8 + response of-cells and HIV + donor cells was observed in CD4 + cells It was much lower than the ones. These results indicate that purified T cell sources from HIV + donors Buset can respond to mitogenic signals. The mitogenic mAb is an anti-CD3 activated T cell from an HIV + donor, The following experiments were performed to determine whether a second signal of proliferation could be provided. . T cells purified from HIV + donor PBLs were purified using AET-treated SRBCs. And isolated. Anti-CD3 activated T cells were isolated from soluble anti-CD8 only, 5 alone, as well as the combination of anti-CD28 and anti-CD5. The result It is shown in Table 3. Table 3: Proliferative response of T cells from HIV + donors to mitogenic mAbs^* ^*T cells purified by AET-treated SRBC E-rosette formation method (99.6 % CD3 +) was isolated from HIV + donor PBL. 96-well flat bottom tissue culture 50,000 cells / well in cRPMI and 10% NHS in culture plate The cells were plated. Cells were activated with immobilized anti-CD3 mAb and IL-2 (1 0 u / mL), soluble anti-CD28 mAb (200 ng / mL), soluble anti-CD5 (200 ng / mL) or a combination of soluble anti-CD8 and anti-CD5 I was stimulated by. After 88 hours of stimulation, cells had 1 μCi [^Three[H] -thymidine was applied for 8 hours. result Is shown as cpm and standard error from one donor. Each treatment group It was performed in quadruplicate. Anti-CD28 provides a second signal to purified T cells from HIV + donors. And showed the same effect as IL-2. Anti-CD5 alone and in combination with anti-CD28 Had no effect, but enhanced the proliferative response in T cells from healthy donors.Minimum cell density required for a proliferative response Seven types from HIV + donors in the immobilized anti-CD3 / soluble anti-CD28 system The following tests were performed to determine the minimum cell density required to grow cells . T cells from HIV + and healthy donors were isolated from AET-treated SRBCs as described above. Purified using the E-rosette method. T cell purity 99.4% for HIV + donor And 99.2% of healthy donors. T cells were prepared at an initial concentration of 1 × 10⁶From unit / mL Serially diluted and plated in 96-well plates. The final cell number / well is 10 It was in the range of 0000-1000. Each experimental group was tested in quadruplicate. Conclusion The results are shown in Table 4. Table 4: Minimum cell density required for T cell proliferative response with anti-CD3 / anti-CD28 system ^*E-b using AET-treated SRBC from healthy donors and HIV + donors Immobilized anti-CD3 mAb and 2 The ability to respond to 00 ng / mL soluble anti-CD28 mAb was examined. T cells Incubate with anti-CD3 / anti-CD28 or medium alone for 88 hours and then for another 8 hours Over, [^Three[H] -thymidine was applied. Results are shown as cpm ± standard error I have. The test was performed in duplicate for each treatment group. One donor in each treatment group Using. T cells from HIV + donors are 2.5 × 10^FivePieces / mL (25 per well At a cell density greater than 2,000 cells) in the anti-CD3 / anti-CD28 system Showed a response. T cells from healthy donors have a density of 5 × 10^FourPieces / mL (5000 (Well / well). T cells from HIV + donor Was about 50% lower than T cells from healthy donors.HIV removal method H9 continuous cell line Reconstructing the immune system of AIDS patients requires a large number of CD4 + cells. Because the cells have latent and active HIV-1, they contain the virus. There is a need for a method of isolating the starting population of non-CD4 + cells. 100% effective removal method Otherwise, by stimulating replication by activating host cells, the virus Occupies the medium rapidly. Whether CD4 + cells can be removed from HIV-1 AIDS patients For clarity, an HIV infected continuous cell line was used. Cell line H9 (Gall from NTH) o Provided by Dr .; ACTT deposit number CRL8543) I did It is a CD4 + human lymphocyte lineage. It is grown continuously in the culture medium and HIV-1 Can be grown continuously.24 ELISA Using a commercially available kit (DuPont), assay the amount of virus in the cell culture. The efficiency of the removal experiment was monitored. The kit contains 5000 cells One virus particle can be detected. In the test, HIVp24 nuclear antigen A highly specific rabbit polyclonal antibody is used. 96 Fix to well plate. The antibody was treated with 5% Triton-X to lyse the cells. After that, the p24 antigen released into the cell culture supernatant is captured. Captured p The 24-nuclear antigen forms a complex with the anti-p24 biotin-treated polyclonal antibody. The obtained complex is treated with streptavidin-HRP (horseradish peroxidase). Check with zygote. Produces a yellow-like color in proportion to the amount of captured HIV p24 antigen Incubate with orthophenyldiamine-HCl (ORD). And the complex is detected. Measure the absorbance of each well with a microplate reader (Dy Measured with natech, Minireader 11) and calibrated against the absorbance of known value of p24 antigen Was done. To increase the sensitivity of the test, Test cells were co-cultured with PHA-activated normal lymphocytes.result The theory used in the elimination protocol is based on the known phenotypic behavior of infected cells. It is. HIV cells with an active virus have an env gene on their cell surface. Express the products gp120 and gp41. HIV + with active virus Since cells have been reported to take up the CD4 receptor, Sex selection was investigated. H-uninfected HIV-1 as measured by flow cytometry. 9 cells (H9-) are 85% CD4 +, whereas infected H9 cells (H9 +) Was 4% CD4 +. Experiment of mixing 10 million H9 cells at the following ratio Planned. (1) 10% H9 + and 90% H9- (2) 30% H9 + and 70% H9- (3) 60% H9 + and 30% H9- (4) 80% H9 + and 20% H9- Positive selection of CD4 using immunomagnetic beads was performed on cells from each group. . For a sample of cells positively selected, P24 was examined using a commercial ELISA test (no co-culture). The results are shown in Table 5. I have. Table 5: Removal of HIV-1-infected H9 cells ^*Same as negative control Continuous cell line H9 (H9 +) and uninfected H9 (H9-) infected with HIV-1 Were mixed in various ratios. Cells expressing the CD4 surface antigen are identified as specific mAbs and The mixture was removed using immunomagnetic beads. Removal of the amount of p24 antigen in the medium Measured before and after the process. In all groups except the 100% H9 + group, the levels were below the limit of detection in this assay. Successfully removed Luz. Check that the negative fraction is virus-free Clearly keep or not 3 × 10 in cRPMI⁶Indicator cells (activated with PHA for 72 hours) Normal lymphocytes) and 10⁹With 24 NHS in a 24-well plate The vesicles were incubated for 20 days. On day 7, fresh indicator cells were added again . On days 7, 14, and 20, one from each group was administered by Triton-X. × 10⁸Individual cells were lysed and assayed for p24. Table 6 shows the results Is shown. Table 6: Co-culture of indicator cells and virus-depleted H9 cells For H9 + cells mixed with H9− cells at various ratios, using immunomagnetic beads To remove CD4 + cells. The H9-fraction was co-cultured with PHA-stimulated lymphocytes . On day 0, day 7, day 14 and day 20, the p24 The presence of Rus antigen was examined. These results indicate that the initial virus removal was not 100% effective and the sensitivity of the assay was Below the level indicates that the virus may still be present. Virus free 1 x 10 cells from each group to further attempt to obtain⁶Serial dilution And in 2000 wells of a 24-well plate, 500 cells per well Was performed. The cells are allowed to grow for 14 days and then, together with the indicator cells, Co-culture was performed for 20 days in the same manner as described above. After 20 days, according to the method described above, The pull was analyzed for p24 antigen. The results are shown in Table 7. Table 7: Virus removal after plating at 500 cells / well Co-culture of H9 cells and indicator cells ^*Both values are higher than the negative control. Mix with H9-cells at various ratios to remove CD4 + cells, H9 + cells co-cultured with papocytes for 20 days The cells were serially diluted to 500 cells per well of a 24-well plate. Fine Vesicles were grown for 14 days and assayed for p24 viral antigen. H9 The percentage of positives in wells from each ratio of + cells / H9- cells is shown. I have. These results show that virus-infected cells can be identified by positive selection by serial dilution. It could be removed. To further validate this method, Negative wells were accumulated and cultured with indicator cells for an additional 20 days. I The outlying group also remained negative for the p24 antigen (data not shown). . Thus, the combination of positive selection of CD4 + cells followed by serial dilutions is It should be useful as a removal method. To further examine the sensitivity of the assay system, 500 cells / well from H9 + cells 2x from well to less than 1 / well (defined as 2x dilution above 1 / well) Serial dilutions were made. The results are shown in Table 8. Table 8: Sensitivity test of p24 antigen assay by serial dilution of H9 + cells The absorbance of a known concentration of p24 antigen in a commercially available ELISA (DuPont) was determined using the HIV- Compared to the absorbance of cell lysates from one infected continuous cell line (H9). These results indicate that the assay is extremely sensitive, with 0.0 Detection of p24 at <1 / well, down to concentrations as low as 157 ng / mL it can.Virus removal from HIV + donor The serial dilution and positive selection of CD4 + cells from the H9 test Cell-free populations Was done. The method is sensitively monitored by a commercial p24 assay be able to. However, this method does remove latent virus from cells. Not. Host cells must be activated to propagate latent virus Absent. The immobilized anti-CD3 system proves to be an effective activator of the cell ing. After activation, virus-free cells must be protected, and If not, the cell will be infected soon, as with the indicator cells in the p24 assay Become so. Uninfected CD4 + cells were protected with anti-CD4 mAb.Materials and methods Lymphocytes were isolated from AIDS patients according to the leukocyte separation method described above. Unfractionated Samples of cells were examined for p24 in a 20-day co-culture test. Macropha Similar samples were examined after page attachment, CD4 positive selection and CDB positive selection . CD4 + cells were activated on immobilized CD3 mAb in 24-well plates. Soluble anti-CD28 was added to the medium and cells were harvested 7 days later. CD4 + cells again Positive selection was performed using immunomagnetic beads labeled with anti-CD4 and coated with GAM. Sun Sex-selected cells were relabeled with anti-CD3 and GAM-coated at 25,000 cells / well. Added to covered 96-well plate. Anti-CD28 was added to the growth medium. Seven days later, supernatants from each well were examined for p24 antigen. All negative wells were accumulated and CD4 positive selection was performed again using immunomagnetic beads. . Positively selected cells were labeled again with anti-CD3 mAb and re-labeled 25000 cells / well. Plates. Anti-CD28 was added to the medium and after 24 days p24 was added to the wells. Examined. Re-accumulate negative wells and remove cells from residual virus using only anti-CD28 Except that anti-CD4 (leu 3a, Becton Dickinson) was added to protect Propagated according to the method. Grow cells to more than 10 million cells and 1 million cells The aliquots were collected and subjected to co-culture with indicator cells, and after 20 days the cell lysate A p24 measurement was obtained.result The results are shown in Table 9. Table 9: Virus removal of lymphocytes from HIV + donors Before removal of macrophages by attachment to a plastic T-flask, After removal of virions, positive selection of CD4 + and CD8 + cells followed by HIV + cell Amount of p24 antigen recovered from 1 million cell lysates CD4 + cells were plated at 25,000 cells per well of a 96-well plate Were grown on immobilized anti-CD3 mAb and soluble anti-CD28 mAb for 7 days. Next, each well was assayed for p24 antigen. The results are shown in Table 10 is there. Table 10: HIV-1 in wells of expanded CD4 + cells purified from HIV + donor Detection Purified from peripheral blood of AIDS patients, immobilized anti-CD3 mAb and soluble CD2 96 wells containing 25000 CD4 + cells grown on 8 mAb for 7 days Amount of p24 antigen recovered from rate wells. Each group contains a separate study from the same patient. FIG. The percentage of negative wells was very stable. Accumulate cells from negative wells And grown with immobilized anti-CD3 and anti-CD28, The stained cells were protected. All cells were plated in a 24-well plate at 2.5 × 10^FivePieces / C The plate was cultured in a well. Table 11 shows the number of CD4 + cells recovered after 6 days in culture. It is shown in Table 11: Accumulated CD4 + cells depleted of active and latent virus after 6 days of growth Expand CD4 + cells from active and latent viruses in 24-well plates Bred. 6 in culture with immobilized anti-CD3 mAb and anti-CD28 mAb After a period of days, the cells were collected and counted. Accumulate cells from 24-well plate and incubate in spinner flask for 3 days Has been recorded. Next, it is labeled again with anti-CD4 and GAM-coated immunomagnetic The rosette was formed with a small dose. Positive selection cells 1 × 10⁶Individuals were co-cultured with indicator cells for 20 days. 3 groups Cell lysates for all were negative for p24 (data not shown) No). The results indicate that the method does not include viruses from the peripheral blood of AIDS patients. It shows that a good CD4 + cell fraction can be obtained. Cells from these three groups are accumulated, relabeled with anti-CD3 mAb, and 200 ng / mL. GAM coated cartridges in a small hollow fiber device with anti-CD28 mAb Was inoculated. After 21 days of culture, 1.7 × 10⁸Individual cells were collected. From collection Three days later, cells were relabeled with anti-CD3 mAb and 200 ng / mL anti-CD28m One GAM-coated cartridge of the bulk device was inoculated with the Ab. Culture 2 One day later, 1.1 × 10^TenIndividual cells were collected. Three days after collection, cells were replaced with anti-CD3 Relabel with mAb and add 200 ng / mL anti-CD28 mAb GAM-coated cartridges were inoculated. After culturing for 18 days, 6.4 × 10^Ten Individual CD4 + cells were collected. Cells were negative for p24.CD4 + function test CD4 + cells isolated and expanded in this way still function normally To show whether it could be done, its ability to enhance NK activity was evaluated. AIDS patients Are known to have a reduced NK function. Some reports indicate that exogenous Clearly, IL-2 can significantly enhance NK function in AIDS patients in vitro It has become. This study shows that CD4 + cells with depleted proliferating virus are effective It was revealed.Materials and methods The NK sensitive cell line K562 was used as target cells. The cells are grown at 37 ° C. for 6 100 μCi / mL [⁵¹Cr] sodium chromate (New England N 1 × 10 in cRPMI containing uclear, Boston, MA)⁷Suspended at a concentration of pcs / mL Chrome labeling. Next, the cells were washed twice, and 5 × 1 cells were added in 100 μL aliquots. 0^FourThe wells of a round-bottom 96-well plate were re-turbidized at a concentration of cells / mL. 5 × 10⁶Monocytes-deficient lymphocytes from AIDS patients suspended at 50 μL was added to each well containing the target cells. Effector except CD4 +: target Add 50 μl of additional media or CD4 + cells to each well so that the target ratio is 50: 1. L was added. 5% CO at 100% humidity_TwoMedium, 37 ° C for 1 hour After centrifugation, the plate was centrifuged at 800 xg for 12 minutes, One was collected and counted on a liquid scintillation counter. Lysis of each target cell The percent media was determined by the following equation: % Dissolution = cpm_test-Cpm_control/ Cpm_max-Cpm_control× 100 Where cpm_testIs the count of chromium released per minute in the presence of lymphocytes And cpm_controlIndicates release in the presence of medium alone, cpm_maxIs BRIS 3 shows release in the presence of -35 detergent (Sigma, St. Louis, MO). Each test was performed in quadruplicate. Average cpm_testAnd average cpm_controlIs the student's t A significant difference in percent lysis was determined by comparison by test. Table 12 shows the results. It is shown in Table 12: NK of lymphocytes from AIDS patients supplemented with self-depleted CD4 + cells Activity NK of one AAIDS patient after reconstitution with autoviral depleted CD4 + cells Activity. The number of cells added is shown in parentheses. The result is the average of four samples ± SE It is shown. The NK activity of AIDS patients of 26.2 ± 6.5% was 60.2 ± 6% of healthy controls. . It was significantly lower than 4%. By adding IL-2, healthy subjects and AID There was a significant increase in NK activity in S patients, but the effect in AIDS patients was It was much larger. Addition of 1000 autologous CD4 + cells shows almost no NK activity There was no rise. 5000 pieces and 10000 pieces When CD4 + cells were added, the activity increased significantly to normal levels. When 50,000 CD4 + are added, the effect is the same as when 10,000 are added. Met. From these results, CD4 + cells isolated and expanded by this protocol It is clear that IL-2 can be produced. The results are further Reinfusion of a number of these CD4 + cells should restore immune function It supports the evidence thatPurification of HIV-specific T cells HIV-specific class I restricted T cells are present in the blood of AIDS patients It has been known. It is a source of CD8 +, CD28 +, CD11, CD25 + lymphocytes. Presumed to be a busset. These were activated in vivo (IL2R + and Same CD25 +) Tc (same CD28 + as 9.3). Isolate these cells CD8 (leu 2a, Becton Dickinson) and CD28 (provided by K. Sagawa) KOLT-2), and CD25 (IL-2R, Coulter) mAb and GA A series of positive selection steps were performed using M-coated immunomagnetic beads. Positive selections occur in the order of CD8, CD28 and finally CD25. This One subset of this isolated cell should be HIV specific. This Other in vivo T cells of the group may also be of therapeutic significance. It harms the patient May be specific to other incidental agents that give In AIDS patients, the percentage of CD25 + cells was usually high. Key In all 6 patients, the mean CD25 + cells were 14 ± 8%, whereas It was 3 ± 2.5% in 6 healthy controls.CD8 + function test Isolated from AIDS patients, 5.3 x 10^TenCD8 + CD28 grown up to Ability to lyse HIV-infected autologous CD4 + lymphocytes for + CD25 + T cells I checked my strength. Target lymphocytes were obtained from the same patient from whom the effector cells were isolated. Proliferating CD4 + cells without virus. Transfer the CD4 + cells to 24 wells 5 x 10 in 1 mL of cRPMI in plate^FiveActive on immobilized anti-CD3 at pcs / mL It has become. 10⁹1 mL of H9 + supernatant containing U / mL IL-2 was added to each well . 5% CO at 100% humidity_TwoAfter incubation at 37 ° C for 4 days in CD4 + cells were collected from the wells. Cells are transformed in the same manner as described for K562 target cells.⁵¹With Cr Labeled. All cells were treated with effector: target ratios of 100: 1, 50: 1 and 25. : 1 and plated in a 96-well round bottom plate. The percent dissolution as described above Was determined in accordance with Each test was performed in triplicate. The results are shown in Table 13. Table 13: CD8 +, CD28 +, CD25 + killer T isolated from HIV + patients Cells; ability to lyse self-HIV infected cells For CD8 +, CD28 +, CD25 + Tc isolated from AIDS patients, The ability to lyse autologous CD4 + cells infected with HIV-1 was examined. Dissolution percent Is⁵¹Calculated from Cr release assay. These results indicate that there is considerable effector function. Dissolving parse Low percentage of HIV-infected targets (74% CD4 + It was still) Both are due to the high background. The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. If any, in form and detail, without departing from the spirit and scope of the invention. Obviously, changes can be made. Is the change obvious to the person skilled in the art Accordingly, the invention should be limited only by the attached claims.

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成９年９月２日（１９９７．９．２）【補正内容】請求の範囲１．（ａ）哺乳動物から単核細胞を含む体液もしくは組織を有する材料を採取する段階；（ｂ）外因性インターロイキン−２不在下に、生体外で細胞活性化および細胞増殖を誘発するだけの量で細胞表面に存在する細胞表面蛋白に特異的な１以上の活性化蛋白と該細胞とを接触させる段階；ならびに（ｃ）臨床的に有効な数までの高い細胞密度を与える条件下で細胞を増殖させる段階を有してなる臨床的に有効な数の免疫細胞を形成する方法。２．前記接触段階前または接触段階時に、細胞の一部もしくは全ての所定の調節免疫細胞への生体外分化が誘発される条件下で、前記材料中の細胞を処理する請求項１に記載の方法。３．前記接触段階前または接触段階時に、細胞の一部もしくは全ての所定のエフェクタ免疫細胞への生体外分化が誘発される条件下で、前記材料中の細胞を処理する請求項１に記載の方法。４．増殖細胞の精製を行う請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。５．免疫細胞が所定の抗原に対して特異的である請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。６．増殖細胞がＴｈ１、Ｔｈ２またはＴｈ３細胞支配的である請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。７．インターフェロン−γおよびＩＬ−２のいずれかもしくは両方の存在下に生体外で前記免疫細胞を活性化して、Ｔｈ１細胞の分化を生じさせる請求項１または２に記載の方法。８．抗γ−インターフェロンモノクローナル抗体および／または抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体の存在下もしくは不在下で、ＩＬ−４存在下に前記細胞を活性化して、Ｔｈ２細胞の分化を生じさせる請求項１または２に記載の方法。９．細胞表面分子に特異的な蛋白が、免疫細胞表面蛋白に特異的な１以上のモノクローナル抗体である請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。１０．前記モノクローナル抗体が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４およびＣＤ４５ＲＯの１以上に対して特異的なモノクローナル抗体の組み合わせと組み合わせて、ＣＤ３またはＣＤ２に対して特異的である請求項９に記載の方法。１１．細胞増殖を中空繊維バイオリアクタで行う請求項１ないし１０のいずれかに記載の方法。１２．免疫細胞を１０⁹個超まで増殖させる請求項１ないし１１のいずれかに記載の方法。１３．免疫細胞を１０¹⁰個超まで増殖させる請求項１ないし１１のいずれかに記載の方法。１４．前記増殖細胞がエフェクタ免疫細胞である請求項１または２に記載の方法。１５．前記増殖細胞が調節免疫細胞である請求項１または２に記載の方法。１６．（ａ）哺乳動物から単核細胞を含む体液もしくは組織を有する材料を採取する段階；（ｂ）外因性インターロイキン−２不在下に、該材料中の細胞に存在する細胞表面蛋白に特異的な、生体外で細胞活性化および細胞増殖を誘発するだけの量の１以上の活性化蛋白と該細胞とを接触させる段階；（ｃ）臨床的に有効な数までの高い細胞密度を与える条件下に前記細胞を増殖させる段階：ならびに（ｄ）得られた細胞を、段階（ａ）で細胞を採取した哺乳動物に注入する段階を有してなる自己細胞療法。１７．増殖細胞を精製してから哺乳動物への注入を行う請求項１６に記載の方法。１８．増殖細胞が調節免疫細胞である請求項１６または１７に記載の方法。１９．増殖細胞がエフェクタ免疫細胞である請求項１６または１７に記載の方法。２０．（ａ）哺乳動物から単核細胞を含む材料を採取する段階；（ｂ）該細胞を活性化して、それのサイトカイン産生プロファイルを変える段階；ならびに（ｃ）細胞増殖を誘発し、臨床的に有効な細胞するまでの高い細胞密度を与える条件下に細胞を増殖させる段階を有してなる臨床的に有効な数の調節免疫細胞を形成する方法。２１．サイトカインプロファイルを変えた免疫細胞を精製してから注入を行う請求項２０に記載の方法。２２．サイトカインプロファイルを変えた免疫細胞が所定の抗原に対して特異的である請求項２０に記載の方法。２３．前記単核細胞を活性化して、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞に分化させる請求項２０ないし２２のいずれかに記載の方法。２４．増幅細胞がＴｈ１様細胞またはＴｈ２様細胞である請求項２０ないし２２のいずれかに記載の方法。２５．前記免疫細胞を、インターフェロン−γおよびＩＬ−２のいずれかもしくは両方の存在下に生体外で活性化して、Ｔｈ１細胞への分化を生じさせる請求項２０ないし２２のいずれかに記載の方法。２６．活性化時に抗ＩＬ−４モノクローナル抗体も存在する請求項２５記載の方法。２７．抗γ−インターフェロンモノクローナル抗体および／または抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体の存在下もしくは不在下で、ＩＬ−４存在下に前記免疫細胞を活性化して、Ｔｈ２細胞への分化を生じさせる請求項２６に記載の方法。２８．前記細胞を、１以上のモノクローナル抗体存在下に増殖させる請求項２０ないし２７のいずれかに記載の方法。２９．前記モノクローナル抗体が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４およびＣＤ４５ＲＯの１以上に特異的なモノクローナル抗体の組み合わせと組み合わせて、ＣＤ３またはＣＤ２に対して特異的である請求項２８に記載の方法。３０．細胞の増殖を中空繊維バイオリアクタで行う請求項２０ないし２９のいずれかに記載の方法。３１．細胞を１０⁹個超まで増殖させる請求項２０ないし３０のいずれかに記載の方法。３２．細胞を１０¹⁰個超まで増殖させる請求項２０ないし３０のいずれかに記載の方法。３３．（ａ）ＨＩＶ感染患者からＣＤ４⁺細胞を単離する段階；（ｂ）細胞活性化を誘発できるだけの量で細胞に存在する細胞表面蛋白に特異的な１以上の蛋白活性化物質と該細胞とを接触させる段階；（ｃ）活性化後にＨＩＶ^-である細胞ＣＤ４⁺を選択する段階；ならびに（ｄ）細胞増殖を誘発し、選択した細胞を臨床的に有効な数まで増殖させる段階を有してなる臨床的に有効な数のヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）除去ＣＤ４＋細胞を製造する方法。３４．段階（ｂ）で、Ｔｈ１細胞分化を促進する条件下で細胞の活性化を行う請求項３３に記載の方法。３５．段階（ｃ）において、選択されたＣＤ４⁺細胞を複数の小分け部分に活性化後に分け、ＨＩＶ^-部分を選択して合体する段階をさらに有する請求項３３に記載の方法。３６．段階（ｂ）で、蛋白活性化物質が抗ＣＤ３モノクローナル抗体およびインターフェロン−γの組み合わせたものを含む請求項３３に記載の方法。３７．段階（ｄ）で、蛋白活性化物質が、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体およびインターフェロン−γである請求項３５に記載の方法。３８．前記細胞がＣＤ８⁺細胞である請求項１に記載の方法。３９．請求項１に記載の方法によって製造された臨床的に有効な数のＣＤ４⁺ 細胞を含有する組成物。４０．請求項３３に記載の方法によって製造されるＨＩＶ除去ＣＤ４⁺細胞を含有する組成物。４１．ＣＤ４⁺細胞がＴｈ１細胞支配的である請求項３９に記載の組成物。４２．ＣＤ４⁺細胞がＴｈ２細胞支配的である請求項３９に記載の組成物。４３．請求項３３に記載の方法によって製造された臨床的に有効な数のＨＩＶ除去ＣＤ４⁺細胞を含有する組成物と、臨床的に有効な数のＣＤ８⁺エフェクタ細胞を含有する組成物とを含む組み合わせ物。４４．請求項３３に記載の方法によって製造された臨床的に有効な数のＨＩＶ除去ＣＤ４⁺細胞を投与する段階を有してなるＨＩＶ感染患者の治療方法。４５．さらに臨床的に有効な数のＣＤ８⁺エフェクタ細胞を投与する段階を有し、該エフェクタ細胞をＨＩＶ除去ＣＤ４⁺細胞より前、該細胞より後、あるいは該細胞と同時に投与される請求項４４に記載の方法。４６．（ａ）治療対象患者から、単核細胞を含む組織もしくは体液検体を採取する段階；（ｂ）該細胞を生体外で活性化して、サイトカイン産生プロファイルを変える段階；（ｃ）細胞増殖を誘発し、臨床的に有効な数の調節免疫細胞までの高い細胞密度を与える条件下に細胞増殖を行う段階；ならびに（ｄ）インビボの調節免疫細胞均衡を変えるだけの数の細胞を再注入する段階を有してなる患者を自己免疫細胞で治療する方法。４７．細胞を処理して、Ｔｈ２様細胞に分化させる請求項４６に記載の方法。４８．患者が自己免疫疾患もしくは慢性炎症を特徴とする疾患と診断される請求項４７に記載の方法。４９．細胞を処理して、Ｔｈ１様細胞に分化させる請求項４６に記載の方法、５０．患者がアレルギー性障害もしくは感染疾患と診断される請求項４９に記載の方法。５１．患者が同種異系ドナーもしくは異種ドナーからの臓器もしくは組織の移植を受ける請求項４６に記載の方法。５２．免疫細胞を、１以上の病原性微生物からの１以上の抗原に曝露させ、再注入して、その後患者を同じ病原体からの感染から保護する請求項４９に記載の方法。５３．臨床的に有効な数のヒト調節Ｔ細胞を含有する組成物。５４．細胞が１リットル以下の容量に含まれている請求項５３に記載の組成物。５５．細胞が５００ｍＬ以下の容量に含まれている請求項５３に記載の組成物。５６．前記容量が２５０ｍＬ以下である請求項５５に記載の組成物。５７．細胞濃度が約１０⁷〜１０⁸個／ｍＬ以上である請求項５３ないし５６のいずれかに記載の組成物。５８．１０⁹個以上の調節免疫細胞を含む請求項５３ないし５６のいずれかに記載の組成物。５９．１０⁹個以上のＴｈ３細胞を含む請求項５３に記載の組成物。６０．１０¹⁰個以上の細胞を含有する請求項５８または５９に記載の組成物。６１．細胞がＴｈ１細胞である請求項５３ないし５８のいずれかに記載の組成物。６２．細胞がＴｈ２細胞である請求項５３ないし５８のいずれかに記載の組成物。６３．自己免疫疾患治療向け医薬品製造への請求項５３ないし５９のいずれかに記載の組成物の使用。６４．前記疾患が、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）から選択されるか、あるいは移植拒絶の予防が目的である請求項５３ないし５８のいずれかに記載の組成物の使用。６５．インシュリン依存性糖尿病の治療のための移植膵島の拒絶を予防するための請求項６４の使用。６６．アレルギー、感染性の障害もしくは疾患、腫瘍を治療するための医薬品の製造のため、あるいはワクチンとしての請求項５３ないし５８のいずれかに記載の組成物の使用。６７．多発性硬化症もしくはインシュリン依存性糖尿病を治療するための医薬品の製造のための請求項５９に記載の組成物の使用。６８．請求項５３ないし６２のいずれかに記載の組成物と、臨床的に有効な数のヒトエフェクタＴ細胞を含む組成物とを有してなる組み合わせ物。６９．ヒト調節細胞およびヒトエフェクタ細胞の濃度がそれぞれ、約１０⁷〜１０⁸個／ｍＬ以上である請求項６８に記載の組み合わせ物。７０．前記組成物を混合した請求項６８または６９に記載の組み合わせ物。７１．治療上有効な数の調節免疫細胞を含む組成物を投与することで、該疾患の症状を軽減するか、あるいは該疾患の進行を遅延させる段階を有する自己免疫障害を治療する方法。７２．前記疾患が、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病または炎症性腸疾患である請求項７１に記載の方法。７３．免疫細胞群がＴｈ２様である請求項７１に記載の方法。７４．調節免疫細胞の数が１０⁹個以上である請求項７１に記載の方法。７５．前記細胞が１リットル以下の容量に含まれる請求項７４に記載の方法。７６．前記疾患が慢性関節リウマチであり、前記組成物が、慢性関節リウマチ患者から単核細胞を採取する段階；関節炎の慢性炎症病変を抑制もしくは低減するだけの量のＴｈ２細胞を含む組成物が得られる条件下で該細胞を増殖させる段階；および得られた細胞組成物を当該患者に注入する段階を有してなる方法によって製造される請求項７１に記載の方法。７７．Ｔｈ２細胞の数が１０⁹個以上である請求項７６に記載の方法。７８．前記細胞が１リットル以下の容量に含まれている請求項７６に記載の方法。７９．Ｔｈ２細胞が記憶細胞である請求項７６に記載の方法。８０．Ｔｈ２細胞を、抗インターフェロン−γもしくは抗ＩＬ−２モノクローナル抗体またはそれらの混合物の存在下に生体外で活性化してから、注入を行う請求項７９に記載の方法。８１．前記疾患が多発性硬化症であり、前記組成物が、多発性硬化症患者から単核細胞を採取する段階；症状を軽減するか多発性硬化症の進行を遅延もしくは停止させるだけの量のＴｈ３細胞を含む組成物が得られる条件下で該細胞を増殖させる段階；および得られた細胞組成物を当該患者に注入する段階を有してなる方法によって製造される請求項７１に記載の方法。８２．細胞の数が１０⁹個以上である請求項７１ないし８１のいずれかに記載の方法。８３．前記細胞が１リットル以下の容量に含まれている請求項７１ないし８２のいずれかに記載の方法。８４．細胞が記憶表現型を有する請求項７１ないし８３のいずれかに記載の方法。８５．前記細胞が、ミエリンあるいはミエリン抗原の脳炎誘発性エピトープに特異的である請求項８１に記載の方法。８６．前記疾患が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）であり、前記組成物が、ＩＢＤ患者から単核細胞を採取する段階；症状を軽減するかＩＢＤの進行を遅延もしくは停止させるだけの量のＴｈ２細胞を含む組成物が得られる条件下で該細胞を増殖させる段階；および得られた細胞組成物を当該患者に注入する段階を有してなる方法によって製造される請求項７１に記載の方法。８７．細胞の数が１０⁹個以上である請求項８６に記載の方法。８８．前記細胞が１リットル以下の容量に含まれている請求項８６に記載の方法。８９．前記疾患がクローン病（ＣＤ）または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である請求項８６に記載の方法。９０．Ｔｈ２細胞がインテグリン，α４，β７を発現する請求項８６に記載の方法。９１．臓器移植または組織移植を受ける前に患者から単核細胞を採取する段階；移植される臓器もしくは組織の拒絶を予防するだけの量のＴｈ２細胞を含む組成物が得られる条件下に該細胞を増殖させる段階；ならびに得られた細胞組成物を当該患者に注入する段階を有してなる移植拒絶の抑制方法。９２．細胞の数が１０⁹個以上である請求項９１に記載の方法。９３．前記細胞が１リットル以下の容量に含まれている請求項９１に記載の方法。９４．移植組織が移植ランゲルハンス島である請求項９１に記載の方法。９５．前記細胞が、同種抗原または移植される組織もしくは臓器に固有の抗原に特異的である請求項９１に記載の方法。９６．ＩＤＤＭと診断された患者もしくはＩＤＤＭ発症の危険性の高い患者から単核細胞を採取する段階；島の破壊を予防もしくは遅延させるだけの量のＴｈ２細胞を含む組成物が得られる条件下で前記細胞を増殖する段階；ならびに得られた細胞組成物を当該患者に注入する段階を有してなるインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の治療方法。９７．細胞の数が１０⁹個以上である請求項９６に記載の方法。９８．前記細胞が１リットル以下の容量に含まれている請求項９６または９７に記載の方法。９９．臓器または組織の移植を受ける前に患者から単核細胞を採取する段階；アレルギーの症状を軽減するだけの数のＴｈ１細胞を含む組成物が得られる条件下で該細胞を増殖する段階；ならびに得られた細胞組成物を当該患者に注入する段階を有してなるアレルギーの治療方法。１００．細胞の数が１０⁹個以上である請求項９９に記載の方法。１０１．前記細胞が１リットル以下の容量に含まれている請求項９９または１００に記載の方法。１０２．前記細胞が１以上のアレルゲンに対して特異的である請求項９９ないし１０１のいずれかに記載の方法。１０３．臓器または組織の移植を受ける前に患者から単核細胞を採取する段階：治療上有効な数のＴｈ１細胞を含む組成物が得られる条件下で該細胞を増殖する段階；ならびに得られた細胞組成物を当該患者に注入する段階を有してなる感染性疾患または癌の治療方法、。１０４．細胞の数が１０⁹個以上である請求項１０３に記載の方法。１０５．前記細胞が１リットル以下の容量に含まれている請求項１０３または１０４に記載の方法。１０６．治療上有効な数の調節細胞およびエフェクタ細胞を同時注入する段階を有してなる感染性疾患または癌を治療する方法。１０７．病原体もしくは腫瘍に対して特異的であるＣＤ８⁺エフェクタ細胞および細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を同時注入する段階をさらに有してなる請求項１０６に記載の方法。１０８．調節細胞がＴｈ１細胞である請求項１０６または１０７に記載の方法。１０９．調節細胞が病原体もしくは腫瘍に対して特異的である請求項１０６ないし１０８のいずれかに記載の方法。１１０．前記疾患が腎細胞癌であり、前記抗原がＨｓｐ７０である請求項１０３または１０６に記載の方法。１１１．細胞の数が１０⁹個以上である請求項１０３ないし１１０のいずれかに記載の方法。１１２．前記細胞が１リットル以下の容量に含まれている請求項１０３ないし１１１のいずれかに記載の方法。１１３．Ｔｈ１細胞もしくはＴｈ１様細胞を誘発する１以上のサイトカインの存在下に、患者から得た単離単核細胞を所定のワクチン抗原に曝露することで、該抗原に特異的なＴｈ１細胞もしくはＴｈ１様細胞を得る段階；ならびに得られた細胞を増殖させて再注入する段階を有してなる予防接種方法。１１４．細胞の数が１０⁹個以上である請求項１１３に記載の方法。１１５．前記細胞が１リットル以下の容量に含まれている請求項１１３または１１４に記載の方法。１１６．前記細胞が記憶表現型を有する請求項１１３ないし１１５のいずれかに記載の方法。１１７．前記サイトカインが、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γから選択される請求項１１３ないし１１６のいずれかに記載の方法。１１８．得られる細胞がＣＤ４⁺、ＣＤ８⁺またはそれらの混合物である請求項１１３ないし１１５のいずれかに記載の方法。１１９．ヒトにおける免疫細胞の調節均衡を変える方法において、該ヒトに対して、臨床的に有効な数の自己調節Ｔ細胞を含む組成物を投与する段階を有してなる方法。１２０．１０⁹個以上の細胞を投与する請求項１６に記載の方法。１２１．１０¹⁰個以上の細胞を投与する請求項１６に記載の方法。１２２．前記細胞がＴｈ１細胞である請求項１または１６に記載の方法。１２３．前記細胞がＴｈ２細胞である請求項１または１６に記載の方法。１２４．前記細胞がＴｈ３細胞である請求項１または１５に記載の方法。１２５．臨床的に有効な数のエフェクタ免疫細胞を投与する段階をさらに有してなり、該エフェクタ免疫細胞の投与を前記調節細胞投与の前もしくは後に行う請求項１６に記載の方法。１２６．自己免疫疾患治療への請求項５３に記載の組成物の使用。１２７．前記疾患が、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）から選択されるか、あるいは移植拒絶の予防を目的としたものである請求項１２６に記載の組成物の使用。１２８．インシュリン依存性糖尿病の治療のための移植島の拒絶を予防する請求項１２６に記載の組成物の使用。１２９．アレルギー、感染性の障害もしくは疾患、腫瘍を治療するための、あるいはワクチンとしての請求項５３の組成物の使用。１３０．多発性硬化症またはインシュリン依存性糖尿病を治療するための請求項５９に記載の組成物の使用。１３１．前記組成物が１０⁹個以上の調節細胞を含む請求項１２６ないし１３０のいずれかに記載の使用。１３２．前記組成物が１リットル以下、好ましくは５００ｍＬ以下、さらに好ましくは２５０ｍＬ以下の容量を有する請求項１２６ないし１３１のいずれかに記載の組成物の使用。１３３．前記疾患が慢性関節リウマチである請求項１２６に記載の組成物の使用。１３４．前記疾患が多発性硬化症である請求項１２６に記載の組成物の使用。１３５．ＨＩＶ感染治療のための請求項３９ないし４２のいずれかに記載の組成物の使用。１３６．ＨＩＶ感染治療のための医薬品を製剤するための請求項３９ないし４２のいずれかに記載の組成物の使用。１３７．（ａ）哺乳動物から、単核細胞を含む体液もしくは組織を有する材料を採取する段階；（ｂ）前記細胞を処理して、前記単核細胞の一部の所定の調節免疫細胞への分化を誘発する段階；ならびに（ｃ）生体外で細胞増殖を誘発するだけの量で細胞に存在する細胞表面蛋白に特異的な１以上の活性化蛋白と前記細胞を接触させて、臨床的に有効な数の調節免疫細胞を形成する段階を有してなる自己細胞療法のための調節免疫細胞を臨床的に有効な数で形成する方法。１３８．細胞を精製するかまたは前記材料から除去する請求項１３７に記載の方法。１３９．前記処理段階または接触段階を外因性サイトカイン不在下に行う請求項１３７または１３８に記載の方法。１４０．前記調節細胞が所定の抗原に対して特異的である請求項１３７ないし１３９のいずれかに記載の方法。１４１．前記調節細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞である請求項１３７ないし１４０のいずれかに記載の方法。１４２．前記調節細胞がＴｈ１、Ｔｈ２またはＴｈ３細胞である請求項１４１に記載の方法。１４３．前記調節細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である請求項１３７ないし１４０のいずれかに記載の方法。１４４．前記調節細胞がエフェクタ細胞でもある請求項１４３に記載の方法。１４５．前記材料を、インターフェロン−γおよびＩＬ−２のいずれかまたは両方で処理して、Ｔｈ１細胞の分化を誘発する請求項１３７ないし１４４のいずれかに記載の方法。１４６．前記材料を、抗γ−インターフェロンモノクローナル抗体および／または抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体の存在下もしくは不在下に、ＩＬ−４で処理して、Ｔｈ２細胞への分化を起こす請求項１３７ないし１４４のいずれかに記載の方法。１４７．細胞表面蛋白に特異的な蛋白が、免疫細胞表面蛋白に特異的な１以上のモノクローナル抗体である請求項１３７ないし１４６のいずれかに記載の方法。１４８．前記モノクローナル抗体が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４およびＣＤ４５ＲＯの１以上に特異的なモノクローナル抗体の組み合わせと組み合わせて、ＣＤ３またはＣＤ２に対して特異的である請求項１４７に記載の方法。１４９．細胞の増殖を中空繊維バイオリアクタで行う請求項１３７ないし１４８のいずれかに記載の方法。１５０．免疫細胞を１０⁹個超まで増殖させる請求項１３７ないし１４８のいずれかに記載の方法。１５１．免疫細胞を１０¹⁰個超まで増殖させる請求項１３７ないし１４８のいずれかに記載の方法。１５２．増殖細胞がＴｈ１、Ｔｈ２またはＴｈ３支配的である請求項１３７ないし１５１のいずれかに記載の方法。１５３．前記調節細胞を患者に投与する請求項１３７ないし１５２のいずれかに記載の方法。１５４．前記増殖細胞が１リットル以下の容量に含まれる請求項１３７ないし１５４のいずれかに記載の方法。１５４．前記増殖細胞が５００ｍＬ以下の容量に含まれる請求項１３７ないし１５４のいずれかに記載の方法。１５５．前記増殖細胞が５００ｍＬ以下の容量に含まれる請求項１３７ないし１５４のいずれかに記載の方法。１５６．前記増殖細胞が２５０ｍＬ以下の容量に含まれる請求項１３７ないし１５４のいずれかに記載の方法。１５７．段階（ａ）で、前記単核細胞を処理して単離ＣＤ４＋細胞とする請求項３３に記載の方法。[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Submission date] September 2, 1997 (1997.9.2) [Correction contents] The scope of the claims 1. (A) Collecting a material having a body fluid or a tissue containing a mononuclear cell from a mammal To do; (B) Cell activation and cells in vitro in the absence of exogenous interleukin-2 One or more specific cell surface proteins present on the cell surface in an amount sufficient to induce proliferation; Contacting the cell with an activating protein; (C) growing the cells under conditions that provide a high cell density up to a clinically effective number Stage A method of forming a clinically effective number of immune cells comprising: 2. Before or during the contacting step, some or all of the cells Treating cells in said material under conditions that induce in vitro differentiation into nodal immune cells The method of claim 1. 3. Before or during the contacting step, some or all of the cells Treating cells in the material under conditions that induce in vitro differentiation into effector immune cells. The method of claim 1, wherein the method comprises: 4. 4. The method according to claim 1, wherein the proliferating cells are purified. The method described. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the immune cells are specific for a predetermined antigen. The method described in. 6. 3. The proliferating cell is a Th1, Th2 or Th3 cell dominant cell. 5. The method according to any one of 5. 7. In the presence of either or both of interferon-γ and IL-2 2. The method of claim 1, wherein the immune cells are activated in vitro to cause differentiation of Th1 cells. Or the method of 2. 8. Anti-γ-interferon monoclonal antibody and / or anti-IL-12 Activating the cells in the presence of IL-4 in the presence or absence of a monoclonal antibody 3. The method according to claim 1 or 2, wherein the method sensitizes to cause differentiation of Th2 cells. 9. A protein specific for a cell surface molecule is converted to one or more models specific for an immune cell surface protein. The method according to any one of claims 1 to 8, which is a noclonal antibody. 10. The monoclonal antibody is CD4, CD8, CD11a, CD27, Monoclonal specific for one or more of CD28, CD44 and CD45RO Specific for CD3 or CD2 in combination with a combination of antibodies Claim 9 the method of. 11. 11. The method according to claim 1, wherein the cell growth is performed in a hollow fiber bioreactor. The method described in Crab. 12. 10 immune cells⁹The method according to any one of claims 1 to 11, wherein the cells are grown to more than one. The described method. 13. 10 immune cells^TenThe method according to any one of claims 1 to 11, wherein the cells are grown to more than one. The described method. 14． The method according to claim 1, wherein the proliferating cells are effector immune cells. Law. 15. 3. The method according to claim 1, wherein the proliferating cells are regulatory immune cells. 16. (A) collecting a material having a body fluid or a tissue containing a mononuclear cell from a mammal; Taking; (B) cells present in cells in the material in the absence of exogenous interleukin-2 Extensive enough to induce cell activation and cell proliferation in vitro, specific for surface proteins Contacting the cell with one or more activating proteins; (C) growing said cells under conditions that provide a high cell density up to a clinically effective number Steps to make: and (D) injecting the obtained cells into the mammal from which the cells were collected in step (a) Autologous cell therapy. 17． The method according to claim 16, wherein the proliferating cells are purified and then injected into a mammal. Law. 18. The method according to claim 16 or 17, wherein the proliferating cells are regulatory immune cells. 19. The method according to claim 16 or 17, wherein the proliferating cells are effector immune cells. Law. 20. (A) collecting a material containing a mononuclear cell from a mammal; (B) activating the cell to alter its cytokine production profile Floor; and (C) Inducing cell proliferation and providing high cell density to clinically effective cells Growing cells under different conditions A method of forming a clinically effective number of regulatory immune cells comprising: 21. Purify immune cells with altered cytokine profile before injection The method according to claim 20. 22. Immune cells with altered cytokine profile are specific for a given antigen 21. The method of claim 20, wherein the method is targeted. 23. Activate the mononuclear cells to differentiate into Th1 cells or Th2 cells A method according to any of claims 20 to 22. 24. The expanded cells are Th1-like cells or Th2-like cells. 3. The method according to any of 2. 25. The immune cell may be any of interferon-γ and IL-2. Or activated in vitro in the presence of both to cause differentiation into Th1 cells Item 23. The method according to any one of Items 20 to 22. 26. 26. The method of claim 25, wherein an anti-IL-4 monoclonal antibody is also present upon activation. Method. 27. Anti-γ-interferon monoclonal antibody and / or anti-IL-1 2 In the presence or absence of the monoclonal antibody, 27. The method of claim 26, wherein the vesicles are activated to cause differentiation into Th2 cells. 28. 3. The method of claim 2, wherein said cells are grown in the presence of one or more monoclonal antibodies. 28. The method according to any of 0 to 27. 29. The monoclonal antibody is CD4, CD8, CD11a, CD27, On one or more of CD28, CD44 and CD45RO CD3 or CD2 in combination with specific monoclonal antibody combinations 29. The method of claim 28, which is specific for 30. 30. The method according to claim 20, wherein the cell growth is performed in a hollow fiber bioreactor. The method described in any of them. 31. 10 cells⁹The method according to any one of claims 20 to 30, wherein the cells are grown to more than one. The method described. 32. 10 cells^TenThe method according to any one of claims 20 to 30, wherein the cells are grown to more than one. The method described. 33. (A) CD4 from HIV infected patient⁺Isolating the cells; (B) Specific to cell surface proteins present in cells in amounts sufficient to induce cell activation Contacting the cell with one or more specific protein activators; (C) HIV after activation^-Cell CD4⁺Selecting; and (D) Inducing cell proliferation and growing the selected cells to a clinically effective number Floor Clinically effective number of human immunodeficiency virus (HIV) depleted CD4 + comprising A method for producing cells. 34. In step (b), the cells are activated under conditions that promote Th1 cell differentiation A method according to claim 33. 35. In step (c), the selected CD4⁺Use cells in multiple subdivisions Divided after sex, HIV^-34. The method of claim 33 further comprising the step of selecting and merging portions. The method described in. 36. In step (b), the protein activator is an anti-CD3 monoclonal antibody and 34. The method of claim 33 comprising a combination of interferon- [gamma]. 37. In step (d), the protein activator is an anti-CD28 monoclonal antibody and 36. The method according to claim 35, which is interferon-γ. 38. Said cells are CD8⁺2. The method of claim 1, wherein the method is a cell. 39. A clinically effective number of CD4 produced by the method of claim 1.⁺ A composition containing cells. 40. An HIV-removed CD4 produced by the method of claim 33.⁺Cells Composition containing. 41. CD4⁺40. The composition of claim 39, wherein the cells are Th1 cell dominant. 42. CD4⁺40. The method of claim 39, wherein the cells are Th2 cell dominant. A composition as described. 43. 34. A clinically effective number of HIV produced by the method of claim 33. Removal CD4⁺A composition containing cells, Clinically effective number of CD8⁺Composition containing effector cells And a combination comprising: 44. 34. A clinically effective number of HIV produced by the method of claim 33. Removal CD4⁺A method for treating an HIV-infected patient comprising the step of administering cells. 45. More clinically effective number of CD8⁺Including the step of administering effector cells. And removing the effector cells with HIV-depleted CD4⁺Before the cell, after the cell, or 46. The method of claim 44, wherein is administered simultaneously with said cells. 46. (A) Tissue or body fluid sample containing mononuclear cells is collected from the patient to be treated To do; (B) activating the cells in vitro to alter the cytokine production profile Stage; (C) high cell density that induces cell proliferation and reaches a clinically effective number of regulatory immune cells Performing cell growth under conditions that provide Love (D) re-injecting as many cells as alters the regulatory immune cell balance in vivo A method for treating a patient having an autoimmune cell. 47. 47. The method of claim 46, wherein the cells are treated to differentiate into Th2-like cells. 48. Patients who are diagnosed with an autoimmune disease or a disease characterized by chronic inflammation 48. The method according to claim 47. 49. 47. The method of claim 46, wherein the cells are treated to differentiate into Th1-like cells. 50. 50. The method of claim 49, wherein the patient is diagnosed with an allergic disorder or infectious disease. The method described. 51. Transfer of organs or tissues from allogeneic or xenogeneic donors 47. The method of claim 46, wherein the plant is received. 52. Exposing immune cells to one or more antigens from one or more pathogenic microorganisms 50. The method of claim 49, wherein the injection is performed to subsequently protect the patient from infection from the same pathogen. Method. 53. A composition comprising a clinically effective number of human regulatory T cells. 54. Claims wherein the cells are contained in a volume of 1 liter or less. 53. The composition according to 53. 55. 54. The composition of claim 53, wherein the cells are contained in a volume of 500 mL or less. . 56. 56. The composition of claim 55, wherein said volume is no more than 250 mL. 57. Cell concentration of about 10⁷-10⁸57 / ml or more. A composition according to any of the above. 58. 10⁹57. Any of claims 53 to 56 comprising more than one regulatory immune cell. A composition as described. 59. 10⁹54. The composition of claim 53, comprising at least one Th3 cell. 60. 10^Ten60. The composition according to claim 58 or 59, comprising at least one cell. 61. The composition according to any one of claims 53 to 58, wherein the cell is a Th1 cell. object. 62. The composition according to any one of claims 53 to 58, wherein the cell is a Th2 cell. object. 63. 60. Any of claims 53 to 59 for the manufacture of a medicament for treating an autoimmune disease Use of a composition according to claim 1. 64. The disease is selected from rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease (IBD) 57. The method according to any of claims 53 to 58, wherein the purpose is to prevent transplant rejection. Use of the described composition. 65. Prevent rejection of transplanted islets for the treatment of insulin-dependent diabetes 65. Use of claim 64 for: 66. Drugs for treating allergies, infectious disorders or diseases, and tumors The method according to any one of claims 53 to 58, for the manufacture of a vaccine or as a vaccine. Use of the composition described. 67. Pharmaceutical for treating multiple sclerosis or insulin-dependent diabetes Use of the composition according to claim 59 for the manufacture of an article. 68. 63. A composition as claimed in any of claims 53 to 62, wherein said composition is clinically effective. Composition comprising a number of human effector T cells And a combination comprising: 69. The concentration of human regulatory cells and human effector cells was about 10⁷~ 10⁸69. The combination of claim 68, wherein the number is at least pcs / mL. 70. 70. The combination of claim 68 or 69, wherein said composition is mixed. 71. By administering a composition comprising a therapeutically effective number of regulatory immune cells, the disease Autoimmune with a step of reducing symptoms of or delaying the progress of the disease How to treat a disorder. 72. The disease is rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, insulin-dependent sugar 72. The method of claim 71, wherein the method is urinary or inflammatory bowel disease. 73. 72. The method of claim 71, wherein the immune cell population is Th2-like. 74. 10 regulatory immune cells⁹72. The method of claim 71, wherein the number is at least one. 75. 75. The method of claim 74, wherein said cells are contained in a volume of 1 liter or less. 76. The disease is rheumatoid arthritis, and the composition is rheumatoid arthritis. Collecting mononuclear cells from a patient; A group comprising an amount of Th2 cells sufficient to suppress or reduce a chronic inflammatory lesion of arthritis Growing the cells under conditions that result in a product; and Manufactured by a method comprising injecting the obtained cell composition into the patient Be done 72. The method of claim 71. 77. 10 Th2 cells⁹77. The method of claim 76, wherein the number is at least one. 78. 77. The method of claim 76, wherein said cells are contained in a volume of 1 liter or less. Law. 79. 77. The method according to claim 76, wherein the Th2 cells are memory cells. 80. Th2 cells were transformed with anti-interferon-γ or anti-IL-2 monoclonal Activate ex vivo in the presence of null antibodies or mixtures thereof before injecting 80. The method of claim 79. 81. The disease is multiple sclerosis, and the composition comprises: Collecting mononuclear cells from a patient with multiple sclerosis; An amount of T sufficient to reduce symptoms or slow or stop the progression of multiple sclerosis growing the cells under conditions that result in a composition comprising h3 cells; and Manufactured by a method comprising injecting the obtained cell composition into the patient Be done 72. The method of claim 71. 82. 10 cells⁹82. The method according to claim 71, wherein the number is at least one. the method of. 83. Claims wherein said cells are contained in a volume of 1 liter or less Item 70. The method according to any one of Items 71 to 82. 84. 84. The method of any of claims 71 to 83, wherein the cell has a memory phenotype. Law. 85. The cells are capable of binding to encephalitis-inducing epitopes of myelin or myelin antigens. 82. The method of claim 81 that is specific. 86. The disease is inflammatory bowel disease (IBD), and the composition comprises: Harvesting mononuclear cells from an IBD patient; Th2 cells that are sufficient to reduce symptoms or slow or stop IBD progression Growing the cells under conditions that result in a composition comprising the cells; and Manufactured by a method comprising injecting the obtained cell composition into the patient Be done 72. The method of claim 71. 87. 10 cells⁹89. The method of claim 86, wherein the number is at least one. 88. 87. The method of claim 86, wherein the cells are contained in a volume of 1 liter or less. Law. 89. The disease is Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis 89. The method of claim 86, wherein the method is (UC). 90. 87. The method of claim 86, wherein the Th2 cells express integrins, α4, β7. Method. 91. Collecting mononuclear cells from a patient before receiving an organ or tissue transplant ; A set containing Th2 cells in an amount sufficient to prevent rejection of the transplanted organ or tissue Growing the cells under conditions that result in an adult; and Injecting the obtained cell composition into the patient A method for suppressing transplant rejection, comprising: 92. 10 cells⁹92. The method of claim 91, wherein the number is at least one. 93. 92. The method of claim 91, wherein the cells are contained in a volume of 1 liter or less. Law. 94. 92. The method of claim 91, wherein the transplanted tissue is a transplanted islet of Langerhans. 95. The cell is an allogeneic antigen or an antigen specific to the tissue or organ to be transplanted. 92. The method of claim 91 which is specific to 96. Patients diagnosed with IDDM or at risk of developing IDDM Collecting mononuclear cells from highly rugged patients; A composition comprising an amount of Th2 cells sufficient to prevent or delay islet destruction is obtained. Growing said cells under conditions that are; Injecting the obtained cell composition into the patient A method for treating insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM), comprising: 97. 10 cells⁹97. The method of claim 96, wherein the number is at least one. 98. 97. The cell of claim 96 or 97, wherein the cell is contained in a volume of 1 liter or less. The method described in. 99. Collecting mononuclear cells from a patient before receiving an organ or tissue transplant; A condition whereby a composition comprising a sufficient number of Th1 cells to reduce allergic symptoms is obtained. Growing said cell under conditions; and Injecting the obtained cell composition into the patient A method for treating allergy comprising: 100. 10 cells⁹100. The method of claim 99, wherein the number is at least one. 101. 100. The cell of claim 99 or 1 wherein the cell is contained in a volume of 1 liter or less. 00. The method of claim 00. 102. 100. The method of claim 99, wherein the cells are specific for one or more allergens. 101. The method according to any of 101. 103. Removing mononuclear cells from a patient before receiving an organ or tissue transplant : Growing the cells under conditions that result in a composition comprising a therapeutically effective number of Th1 cells Stage; and Injecting the obtained cell composition into the patient A method for treating an infectious disease or cancer, comprising: 104. 10 cells⁹104. The method of claim 103, wherein the number is at least one. 105. 103. The cell according to claim 103, wherein the cell is contained in a volume of 1 liter or less. 104. The method according to 104. 106. Co-injecting a therapeutically effective number of regulatory and effector cells A method for treating an infectious disease or cancer comprising: 107. CD8 specific for pathogen or tumor⁺Effector cells And cytotoxic T lymphocytes (CTL) 107. The method of claim 106, further comprising the step of entering. 108. 108. The method according to claim 106 or 107, wherein the regulatory cell is a Th1 cell. . 109. 107. The method of claim 106, wherein the regulatory cells are specific for a pathogen or a tumor. 108. The method according to any of the chairs 108. 110. 11. The disease is renal cell carcinoma, and the antigen is Hsp70. 107. The method according to 3 or 106. 111. 10 cells⁹110. Any of claims 103 to 110 The method described in. 112. 104. The cell is contained in a volume of 1 liter or less. 111. The method according to any of 111. 113. One or more cytokines that induce Th1 cells or Th1-like cells; In the presence, by exposing isolated mononuclear cells obtained from the patient to a predetermined vaccine antigen, Obtaining Th1 cells or Th1-like cells specific for the antigen; Proliferating and reinjecting the obtained cells A vaccination method comprising: 114. 10 cells⁹114. The method of claim 113, wherein the number is at least one. 115. 113. The cell of claim 113, wherein the cells are contained in a volume of 1 liter or less. 114. The method according to 114. 116. 115. Any of claims 113-115, wherein said cells have a memory phenotype. The method described in. 117. The cytokine is selected from IL-12 and IFN-γ. 118. The method according to any of claims 113-116. 118. The cells obtained are CD4⁺, CD8⁺Or a mixture thereof. 113. The method according to any of 113 to 115. 119. A method of altering the regulatory balance of immune cells in a human, the method comprising: And administering a composition comprising a clinically effective number of self-regulating T cells. How to be. 120. 10⁹17. The method of claim 16, wherein more than one cell is administered. 121. 10^Ten17. The method of claim 16, wherein more than one cell is administered. 122. The method according to claim 1, wherein the cell is a Th1 cell. 123. 17. The method according to claim 1, wherein the cells are Th2 cells. 124. The method according to claim 1, wherein the cells are Th3 cells. 125. Further comprising administering a clinically effective number of effector immune cells. And administering the effector immune cells before or after the administration of the regulatory cells. The method of claim 16. 126. Use of the composition according to claim 53 for the treatment of an autoimmune disease. 127. The disease is selected from rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease (IBD) 127. The method of claim 126, wherein the treatment is for the purpose of preventing transplant rejection. Use of the composition. 128. Prophylaxis to prevent rejection of transplanted islets for the treatment of insulin-dependent diabetes 127. Use of the composition of claim 126. 129. To treat allergies, infectious disorders or diseases, or tumors 54. Use of the composition of claim 53 as a vaccine. 130. Claims for treating multiple sclerosis or insulin-dependent diabetes Use of the composition according to Item 59. 131. The composition is 10⁹Claims 126 to 13 comprising more than one regulatory cell. Use according to any of 0. 132. The composition is 1 liter or less, preferably 500 ml or less, more preferably 131. A method as claimed in any of claims 126 to 131, preferably having a capacity of 250 mL or less. Use of the described composition. 133. 127. Use of a composition according to claim 126 wherein the disease is rheumatoid arthritis. for. 134. 127. Use of the composition of claim 126, wherein said disease is multiple sclerosis. 135. 43. A set according to any of claims 39 to 42 for the treatment of HIV infection. Use of imitation. 136. Claims 39 to 4 for formulating a medicament for the treatment of HIV infection Use of the composition according to any one of the above items 2. 137. (A) A material having a body fluid or tissue containing a mononuclear cell from a mammal Harvesting; (B) treating said cells to separate a portion of said mononuclear cells into predetermined regulatory immune cells; Inducing transformation; and (C) cell surface proteins present in cells in amounts sufficient to induce cell proliferation in vitro Contacting the cell with one or more specific activating proteins Touching to form a clinically effective number of regulatory immune cells. A method for forming a clinically effective number of regulatory immune cells for vesicle therapy. 138. 138. The method of claim 137, wherein cells are purified or removed from said material. Method. 139. Claims wherein the treating or contacting step is performed in the absence of an exogenous cytokine 137. The method according to item 137 or 138. 140. 137-137, wherein said regulatory cells are specific for a given antigen 139. The method according to any of 139. 141. 137. The method of claims 137 to 140, wherein said regulatory cells are CD4 + T cells. The method described in any of them. 142. 141. The said regulatory cell is a Th1, Th2 or Th3 cell. The method described in. 143. 137. The method of claims 137 to 140, wherein said regulatory cells are CD8 + T cells. The method described in any of them. 144. 144. The method of claim 143, wherein said regulatory cells are also effector cells. 145. The material may be any of interferon-γ and IL-2 or Treatment with both induces Th1 cell differentiation A method according to any of claims 137 to 144. 146. The material is prepared by using an anti-γ-interferon monoclonal antibody and / or Or treatment with IL-4 in the presence or absence of an anti-IL-12 monoclonal antibody. 148, wherein the differentiation into Th2 cells occurs. The method described. 147. One or more proteins specific to cell surface proteins are specific to immune cell surface proteins 147. The method according to any of claims 137 to 146, wherein the method is a monoclonal antibody. . 148. The monoclonal antibody is CD4, CD8, CD11a, CD27; Monoclonal antibodies specific for one or more of CD28, CD44 and CD45RO Claims that are specific for CD3 or CD2 in combination with a body combination 147. The method according to item 147. 149. 137-14, wherein the cells are grown in a hollow fiber bioreactor. 9. The method according to any one of items 8. 150. 10 immune cells⁹148. The method of claims 137 to 148, wherein the cells are grown to more than one. The method described in any of them. 151. 10 immune cells^Ten148. The method of claims 137 to 148, wherein the cells are grown to more than one. The method described in any of them. 152. Claim 137. The proliferating cells are Thl, Th2 or Th3 dominant. 151. The method according to any of items 151. 153. 153. The method of any of claims 137 to 152, wherein said regulatory cells are administered to a patient. The method described in. 154. 137. The proliferating cells are contained in a volume of 1 liter or less. 154. The method according to any of 154. 154. 137. The proliferating cells are contained in a volume of 500 mL or less. 154. The method according to any of 154. 155. 137. The proliferating cells are contained in a volume of 500 mL or less. 154. The method according to any of 154. 156. 137-137 wherein the proliferating cells are contained in a volume of 250 mL or less. 154. The method according to any of 154. 157. In step (a), the mononuclear cells are processed into isolated CD4 + cells. Item 34. The method according to Item 33.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ 25/00 31/00 29/00 １０１ 31/18 31/00 35/00 31/18 37/04 35/00 37/06 37/04 37/08 37/06 Ｃ１２Ｎ 5/02 37/08 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/02 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｑ 1/02 16/28 // Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 16/28 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 3/10 A61P 29/00 101 25/00 31/00 29/00 101 31/18 31/00 35 / 00 31/18 37/04 35/00 37/06 37/04 37/08 37/06 C12N 5/02 37/08 C12Q 1/02 C12N 5/02 C07K 14/705 C12Q 1/02 16/28 // C07K 14/705 C12N 5/00 B 16/28 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD , RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT , RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN

Claims

[Claims] 1. Harvesting a material having a body fluid or tissue containing a mononuclear cell from a mammal; and cells in vitro, in the absence of exogenous interleukin-2, specific for cell surface proteins present on cells in said material. A method for forming an immune cell, comprising the step of contacting said material with one or more activating proteins in an amount sufficient to induce proliferation to grow the cells to a clinically effective number. 2. 2. The method of claim 1, wherein the cells in the material are treated before or during the contacting step under conditions that induce in vitro differentiation of some or all of the cells into predetermined regulatory immune cells. 3. 2. The method of claim 1, wherein the cells in the material are treated before or during the contacting step under conditions that induce in vitro differentiation of some or all of the cells into predetermined effector immune cells. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the proliferating cells are purified. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the immune cells are specific for a predetermined antigen. 6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the proliferating cells are predominantly Th1, Th2, or Th3 cells. 7. The method according to claim 1 or 2, wherein the immune cells are activated in vitro in the presence of one or both of interferon-γ and IL-2 to cause Th1 cell differentiation. 8. The method according to claim 1 or 2, wherein the cell is activated in the presence or absence of anti-γ-interferon and / or anti-IL-12 in the presence of IL-4 to cause differentiation of Th2 cells. 9. The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the protein specific to the cell surface molecule is one or more monoclonal antibodies specific to the immune cell surface protein. 10. 10. The method of claim 9, wherein said monoclonal antibody is specific for CD3 or CD2 in combination with one or more combinations of CD4, CD8, CD11a, CD27, CD28, CD44 and CD45RO. 11. The method according to any one of claims 1 to 10, wherein the growth is performed in a hollow fiber bioreactor. 12. 12. The method according to any of claims 1 to 11, wherein the immune cells are expanded to more than 10 ⁹ . 13. 12. The method according to any one of claims 1 to 11, wherein the immune cells are grown to more than 10 ¹⁰ cells. 14． 3. The method according to claim 1, wherein the cells are effector immune cells. 15. 3. The method according to claim 1, wherein the cells are regulatory immune cells. 16. Collecting a material having a body fluid or tissue containing a mononuclear cell from a mammal; cell growth in vitro in the absence of exogenous interleukin-2, specific for a cell surface protein present on cells in the material Proliferating cells to a clinically effective number by contacting the material with one or more activating proteins in an amount sufficient to induce the disease; and injecting the resulting cells into a mammal. Self-cell therapy. 17． 17. The method according to claim 16, wherein the proliferating cells are purified and then injected into a mammal. 18. The method according to claim 16 or 17, wherein the proliferating cells are regulatory immune cells. 19. The method according to claim 16 or 17, wherein the proliferating cells are effector immune cells. 20. Harvesting a material comprising mononuclear cells from a mammal; treating the cells to alter their cytokine production profile; and growing the cells to a clinically effective number. Immune cell formation method. 21. 21. The method according to claim 20, wherein the injection is performed after purifying the immune cells having altered cytokine profile. 22. 21. The method of claim 20, wherein the immune cells with altered cytokine profile are specific for a given antigen. 23. 23. The method according to any of claims 20 to 22, wherein the mononuclear cells are treated to differentiate into Th1 cells or Th2 cells. 24. 23. The method according to claim 20, wherein the obtained cell group is Th1-like cells or Th2-like cells. 25. 23. The method according to any of claims 20 to 22, wherein the immune cells are activated in vitro in the presence of one or both of interferon-γ and IL-2 to cause differentiation into Th1 cells. 26. 26. The method of claim 25, wherein the anti-IL-4 mAb is also present upon activation. 27. 27. The method of claim 26, wherein the effector cells are activated in the presence or absence of anti-gamma-interferon and / or anti-IL-12 in the presence of IL-4 to cause differentiation into Th2 cells. 28. The method according to any one of claims 20 to 27, wherein the medium for growing mononuclear cells contains one or more monoclonal antibodies. 29. 29. The method of claim 28, wherein said monoclonal antibody is specific for CD3 or CD2 in combination with one or more combinations of CD4, CD8, CD11a, CD27, CD28, CD44 and CD45RO. 30. The method according to any one of claims 20 to 29, wherein the cell is grown in a hollow fiber bioreactor. 31. The method according to any one of claims 20 to 30 cells are grown up to 10 ⁹ than. 32. 31. The method according to any of claims 20 to 30, wherein the cells are grown to more than ¹⁰ < ¹⁰ > cells. 33. Isolating CD4 ⁺ cells from a patient infected with human immunodeficiency virus (HIV); contacting the cells with one or more protein activators; selecting cells CD4 ⁺ that are HIV ⁻ ; A method of producing virus-depleted CD4 + cells comprising growing the cells to a clinically effective number. 34. 34. The method of claim 33, wherein the contacting step comprises activating under conditions that promote Th1 cell differentiation. 35. Growing a plurality of aliquots in the presence of a mitogen after the selection of CD4 ⁺ that is HIV ⁻ and before expanding the selected cells; selecting those that are HIV ⁻ from the aliquots 34. The method of claim 33, further comprising the step of: expanding the selected cells to a clinically effective number. 36. 34. The method of claim 33, wherein the cells are activated with an anti-CD3 mAb in the presence of interferon- [gamma] (IFN- [gamma]). 37. 36. The method of claim 35, wherein after activation, the cells are grown in the presence of an anti-CD28 mAb and IFN- [gamma]. 38. 2. The method of claim 1, wherein said cells are CD8 ⁺ cells. 39. A composition comprising a clinically effective number of CD4 ⁺ cells. 40. A composition comprising virus-depleted CD4 ⁺ cells produced by the method of claim 33. 41. 40. The composition of claim 39, wherein the CD4 ⁺ cells are Th1 cell dominant. 42. 40. The composition of claim 39, wherein the CD4 ⁺ cells are Th2 cell dominant. 43. A combination comprising a composition comprising a clinically effective number of virus-depleted CD4 ⁺ cells and a composition comprising a clinically effective number of CD8 ⁺ effector cells. 44. A method for treating an HIV-infected patient comprising administering a clinically effective number of virus-depleted CD4 ⁺ cells. 45. 45. The method of claim 44, further comprising administering a clinically effective number of CD8 ⁺ effector cells, wherein said effector cells are administered before, after, or simultaneously with said CD4 ⁺ cells. . 46. Collecting a tissue or body fluid sample comprising a mononuclear cell from a mammal; treating the cell in vitro to obtain a composition comprising a clinically effective number of regulatory immune cells; in vivo regulatory immunity A method of treating a patient with autoimmune cells comprising re-injecting as many cells as alters the cell balance. 47. 47. The method of claim 46, wherein the cells are treated to differentiate into Th2-like cells. 48. 48. The method of claim 47, wherein the patient is diagnosed with an autoimmune disease or a disease characterized by chronic inflammation. 49. 47. The method of claim 46, wherein the cells are treated to differentiate into Th1-like cells. 50. The method of claim 49, wherein the patient is diagnosed with an allergic disorder or infectious disease. 51. 47. The method of claim 46, wherein the patient receives an organ or tissue transplant from an allogeneic or xenogeneic donor. 52. 50. The method of claim 49, wherein the immune cells are exposed to one or more antigens from one or more pathogenic microorganisms and re-infused, subsequently protecting the patient from infection from the same pathogen. 53. A composition comprising a clinically effective number of human regulatory T cells. 54. 54. The composition of claim 53, wherein the cells are contained in a volume of 1 liter or less. 55. 54. The composition of claim 53, wherein the cells are contained in a volume of 500 mL or less. 56. 56. The composition of claim 55, wherein said volume is no more than 250 mL. 57. A composition according to any one of claims 53 to 56 cell concentration of about 10 ⁷ to 10 ⁸ cells / mL or more. 58. A composition according to any one of claims 53 to 56 containing 10 ⁹ or more regulatory immune cells. 59. The composition of claim 53 containing 10 ⁹ or more Th3 cells. 60. 60. The composition according to claim 58 or 59, comprising 10 ¹⁰ or more cells. 61. The composition according to any one of claims 53 to 58, wherein the cell is a Th1 cell. 62. The composition according to any one of claims 53 to 58, wherein the cell is a Th2 cell. 63. Use of the composition according to any of claims 53 to 59 for the manufacture of a medicament for treating an autoimmune disease. 64. The use of the composition according to any one of claims 53 to 58, wherein the disease is selected from rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease (IBD), or for preventing or rejecting transplantation. 65. 65. Use according to claim 64, wherein the composition is used to prevent rejection of transplanted islets for the treatment of insulin dependent diabetes. 66. Use of a composition according to any of claims 53 to 58 for the manufacture of a medicament for treating allergies, infectious disorders or diseases, tumors or as a vaccine. 67. 60. Use of a composition according to claim 59 for the manufacture of a medicament for treating multiple sclerosis or insulin dependent diabetes. 68. 63. A combination comprising a composition according to any of claims 53 to 62 and a composition comprising a clinically effective number of human effector T cells. 69. 69. The combination of claim 68, wherein the concentration of the human regulatory cells and human effector cells is about 10 < ⁷ > to 10 < ⁸ > cells / mL or more, respectively. 70. 70. The combination of claim 68 or 69, wherein said composition is mixed. 71. A method of treating an autoimmune disorder comprising the step of alleviating the symptoms of the disease or slowing the progression of the disease by administering a composition comprising a therapeutically effective number of regulatory immune cells. 72. 72. The method of claim 71, wherein said disease is rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, insulin dependent diabetes mellitus or inflammatory bowel disease. 73. 72. The method of claim 71, wherein the immune cell population is Th2-like. 74. 72. The method of claim 71, wherein the number of regulatory immune cells is 10 ⁹ or more. 75. 75. The method of claim 74, wherein said cells are contained in a volume of 1 liter or less. 76. Collecting the mononuclear cells from a rheumatoid arthritis patient, wherein the disease is rheumatoid arthritis; and obtaining a composition comprising an amount of Th2 cells sufficient to suppress or reduce chronic inflammatory lesions of arthritis. 72. The method of claim 71, comprising growing the cells under conditions; and injecting the resulting cell composition into the patient. 77. The method according to claim 76, wherein the number of Th2 cells is 10 ⁹ or more. 78. 77. The method of claim 76, wherein said cells are contained in a volume of 1 liter or less. 79. 77. The method according to claim 76, wherein the Th2 cells are memory cells. 80. 80. The method of claim 79, wherein the Th2 cells are activated in vitro in the presence of interferon- [gamma], IL-2, or a mixture thereof prior to injecting. 81. Harvesting mononuclear cells from a patient with multiple sclerosis, wherein the composition is T or an amount of T sufficient to reduce symptoms or slow or stop the progression of multiple sclerosis. 72. The method of claim 71, wherein the method comprises producing a composition comprising h3 cells under conditions that yield the cells; and injecting the resulting cell composition into the patient. . 82. The method according to any one of claims 71 to 81, wherein the number of cells is 10 ⁹ or more. 83. The method according to any one of claims 71 to 82, wherein the cells are contained in a volume of 1 liter or less. 84. 84. The method of any of claims 71 to 83, wherein the cells have a memory phenotype. 85. 82. The method of claim 81, wherein said cells are specific for myelin or an encephalitogenic epitope of a myelin antigen. 86. Harvesting mononuclear cells from an IBD patient; wherein the composition comprises an amount of Th2 cells sufficient to reduce symptoms or to slow or stop the progression of IBD. 72. The method of claim 71, wherein the method comprises producing the cells under conditions that result in a composition; and injecting the resulting cell composition into the patient. 87. 89. The method according to claim 86, wherein the number of cells is at least 10 ⁹ . 88. 87. The method of claim 86, wherein said cells are contained in a volume of 1 liter or less. 89. 87. The method of claim 86, wherein said disease is Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC). 90. 87. The method of claim 86, wherein the Th2 cells express integrins, α4, β7. 91. Harvesting mononuclear cells from the patient prior to receiving an organ or tissue transplant; growing the cells under conditions that result in a composition comprising Th2 cells in an amount sufficient to prevent rejection of the transplanted organ or tissue A method for suppressing transplant rejection, comprising the step of: injecting the obtained cell composition into the patient. 92. 92. The method according to claim 91, wherein the number of cells is 10 ⁹ or more. 93. 92. The method of claim 91, wherein said cells are contained in a volume of 1 liter or less. 94. 92. The method according to claim 91, wherein the transplanted tissue is a transplanted islet of Langerhans. 95. 92. The method of claim 91, wherein said cells are specific for an alloantigen or an antigen specific to the tissue or organ to be transplanted. 96. Collecting mononuclear cells from a patient diagnosed with IDDM or a patient at high risk of developing IDDM; said cells under conditions that result in a composition comprising Th2 cells in an amount sufficient to prevent or delay islet destruction; A method of treating insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) comprising: injecting the obtained cell composition into the patient. 97. 97. The method according to claim 96, wherein the number of cells is 10 ⁹ or more. 98. The method according to claim 96 or 97, wherein the cells are contained in a volume of 1 liter or less. 99. Harvesting mononuclear cells from the patient prior to receiving an organ or tissue transplant; growing the cells under conditions that result in a composition comprising enough Th1 cells to reduce the symptoms of allergy; Injecting the cell composition into a patient. 100. 100. The method according to claim 99, wherein the number of cells is 10 ⁹ or more. 101. 100. The method of claim 99 or 100, wherein said cells are contained in a volume of 1 liter or less. 102. 102. The method of any of claims 99-101, wherein said cells are specific for one or more allergens. 103. Harvesting mononuclear cells from the patient prior to receiving an organ or tissue transplant; growing the cells under conditions that result in a composition comprising a therapeutically effective number of Th1 cells; and the resulting cell composition A method of treating an infectious disease or cancer, comprising injecting a substance into the patient. 104. 104. The method of claim 103, wherein the number of cells is at least 10 ⁹ . 105. 105. The method of claim 103 or 104, wherein the cells are contained in a volume of 1 liter or less. 106. A method of treating an infectious disease or cancer comprising co-injecting a therapeutically effective number of regulatory cells and effector cells. 107. 107. The method of claim 106, further comprising co-injecting CD8 ⁺ effector cells and cytotoxic T lymphocytes (CTL) that are specific for the pathogen or tumor. 108. 108. The method according to claim 106 or 107, wherein the regulatory cells are Th1 cells. 109. 109. The method according to any of claims 106 to 108, wherein the regulatory cells are specific for a pathogen or a tumor. 110. 107. The method according to claim 103 or 106, wherein said disease is renal cell carcinoma and said antigen or Hsp70. 111. The method according to any one of claims 103 to 110, wherein the number of cells is 10 ⁹ or more. 112. 112. The method according to any of claims 103 to 111, wherein said cells are contained in a volume of 1 liter or less. 113. By exposing isolated mononuclear cells obtained from a patient to a predetermined vaccine antigen in the presence of one or more cytokines that induce Th1 cells or Th1-like cells, Th1 cells or Th1-like cells specific to the antigen are exposed. And a method of inoculating the cells comprising growing and reinjecting the obtained cells. 114. 114. The method of claim 113, wherein the number of cells is at least 10 ⁹ . 115. 115. The method of claim 113 or 114, wherein said cells are contained in a volume of 1 liter or less. 116. 116. The method of any of claims 113-115, wherein said cells have a memory phenotype. 117. 117. The method according to any of claims 113 to 116, wherein said cytokine is selected from IL-12 and IFN-γ. 118. The method according to any of claims 113 to 115, wherein the obtained cells are CD4 ⁺ , CD8 ⁺ or a mixture thereof. 119. A method of altering the regulatory balance of immune cells in a human, comprising administering to the human a composition comprising a clinically effective number of autoregulatory T cells. 120. 17. The method according to claim 16, wherein more than 10 ⁹ cells are administered. 121. 17. The method of claim 16, wherein ¹⁰ or more cells are administered. 122. The method according to claim 1, wherein the cell is a Th1 cell. 123. 17. The method according to claim 1, wherein the cells are Th2 cells. 124. The method according to claim 1, wherein the cells are Th3 cells. 125. 17. The method of claim 16, further comprising administering a clinically effective number of effector immune cells, wherein the administering of the effector immune cells occurs before or after the administration of the regulatory cells. 126. Use of the composition according to claim 53 for the treatment of an autoimmune disease. 127. 127. The use according to claim 126, wherein the disease is selected from rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease (IBD) or for the purpose of preventing transplant rejection. 128. 127. The use according to claim 126, wherein the composition is used to prevent transplantation islet rejection for the treatment of insulin dependent diabetes. 129. 54. Use of the composition of claim 53 for treating an allergy, infectious disorder or disease, tumor, or as a vaccine. 130. 60. Use of the composition of claim 59 for treating multiple sclerosis or insulin dependent diabetes. 131. 130. Use according to any of claims 126 to 130, wherein said composition comprises 10 ⁹ or more regulatory cells. 132. 132. Use according to any of claims 126 to 131, wherein the composition has a volume of 1 liter or less, preferably 500 ml or less, more preferably 250 ml or less. 133. 127. The use according to claim 126, wherein said disease is rheumatoid arthritis. 134. 127. The use according to claim 126, wherein said disease is multiple sclerosis. 135. Use of a composition according to any of claims 39 to 42 for the treatment of HIV infection. 136. Use of a composition according to any of claims 39 to 42 for formulating a medicament for the treatment of HIV infection.