JP2001509025A

JP2001509025A - 固相捕獲可能なターミネーターによる核酸配列方法

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Publication number: JP2001509025A
Application number: JP53435798A
Authority: JP
Inventors: ジンユエジュ
Original assignee: インサイトファーマスーティカルズインク
Priority date: 1997-01-15
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 2001-07-10
Also published as: DE69726454T2; ATE255167T1; EP0953056B1; EP0953056A1; DE69726454D1; WO1998031833A1; CA2275196A1; US5876936A; AU6012698A

Abstract

(57)【要約】本発明は、固相捕獲可能チェーン−ターミネーターを利用した酵素的核酸配列方法に関するものである。本方法においては、断片が獲得可能なチェーン−ターミネーターを有した場合、配列断片が生じる。そして、断片が固相上に捕獲され、配列反応の残りの成分から区別される。そして、断片は固相から開放され、サイズが区別され、検出されて、核酸配列が決定される配列データを導き出す。

Description

【発明の詳細な説明】固相捕獲可能なターミネーターによる核酸配列方法序章技術背景本発明の分野は、核酸の配列方法に関するものである。発明の背景分子生物学の分野において、核酸配列決定方法は、非常に重要な手段の一つである。１９７０年代において、ＤＮＡ塩基配列を決定する初の方法が開発されて以来、塩基配列方法においては、今や過半数のオペレイションが自動化され、従って、ヒト−ゲノムを含む全ゲノムの大規模な配列が可能となった。現在大きく分けて２つのＤＮＡ塩基配列決定法、即ち（１）化学分析法又はマクサム−ギルバート法、及び（２）酵素法又はジデオキシ−チェーン−ターミネーター法（サンガー法とも云われている）があり、後者の方がより一般的に使用され、自動処理には適している。ＤＮＡ塩基配列法における関心事は、自動塩基配列決定方法であって、そこでは、サイズによって区別された断片又は酵素法のプライマー伸長生成物を標識する為に蛍光性標識が使用される。現在、自動ＤＮＡ塩基配列決定法としては、３つの異なった方法が存在する。第一の方法に関して、ＤＮＡ断片は、１種の蛍光体で標識され、（各塩基に１レーンの）隣接の配列レーンを移行（ｒｕｎ）する。アンソージ、その他(Ａｎｓｏｒｇｅｅｔａｌ)、核酸Ｒｅｓ．（１９８７年）１５：４５９３〜４６０２を参照のこと。第二の方法に関して、ＤＮＡ断片は、４種の蛍光体で識別されたオリゴヌクレオチド−プライマーで標識され、全断片が、１レーンを移行する。スミス、その他、自然（１９８６年）３２１：６７４〜６７９を参照のこと。第三の方法に関して、各異なったチェーン−ターミネイティング−ジデオキシヌクレオチド（ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）が、異なった蛍光体で標識され、全断片が、１レーンを移行する。プロバー、その他(Ｐｒｏｂｅｒｅｔａｌ)、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７年）２３８：３３６〜３４１を参照のこと。第一の方法には、その低い処理能力は勿論のこと各レーンごとでの変異（ｌａｎｅ−ｔｏ −ｌａｎｅｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）といった潜在的問題が存在する。第二、第三の方法は、４種の色素が１レーザー源によって強く励起される必要があり、それらは、明瞭に異なった発光分光を持つこととなる。そうでないとすれば、複数のレーザーが必要となり、検出装置の複雑性と費用を増加させることになる。共通波長での励起時に、強い蛍光性信号を発するエネルギー移送プライマーの発生によって、第二の方法は、現在商業的に入手可能な配列装置を利用して粗配列データを作成する。だが、エネルギー移送プライマーを利用したとしても、第二の方法は、完全に満足できるものではない。第二の方法においては、全ての誤終結（ｆａｌｓｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）又は誤停止（ｆａｌｓｅｓｔｏｐ）した断片が検出され、高いバックグラウンドとなる。更に、第二の方法では、長反復配列を有したＤＮＡ鋳型の正確な配列を得ることは難しい。ロビンズ、その他、生物工芸学（１９９６年）２０：８６２〜８６８を参照のこと。第三の方法は、ターミネーターと統合されたＤＮＡ断片のみを検出することに利点がある。従って、誤停止を検出することによって生じるバックグラウンドが検出されない。しかし、色素標識されたターミネーターによる蛍光信号は、そう明るいものではなく、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリマーゼ（ＦＳ酵素）を持ってしても、過剰な色素ターミネーターを完全に浄化することは時間の無駄である。更に、非配列断片が検出され、バックグラウンド信号の一因となる。応用生物系Ｍｏｄｅｌ３７３ＡＤＮＡ塩基配列システム−ユーザー−ブリテン(Ｍｏｄｅｌ３７３ＡＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳｙｓｔｅｍＵｓｅｒＢｕｌｌｅｔｉｎ)、１１月１７日、Ｐ３、１９９０年８月。従って、長反復配列であっても高精度の配列データを提供できる改良された方法学の開発が望まれている。そのような方法学は、コンタミナティッドＲＮＡ（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄＲＮＡ）及び裸ＤＮＡ鋳型の結果である誤停止した配列断片及び非配列断片は勿論、塩化ナトリウム、酵素、過剰プライマー、鋳型等といった配列反応混合物の残存成分からも、ＤＮＡ塩基配列断片を分離する手段を含むものであることが望ましい。関連文献ＤＮＡ塩基配列決定法は、グリフィン−グリフィン、応用生化学及び生物工学（１９９３年）３８：１４７〜１５９、で検討された。自動ＤＮＡ塩基配列決定法における異なった標識方法の影響に関しては、「３７３Ａ色素プライマー及び色素ターミネーター−データの解読ガイド」と題されたパーキン−エルマー−ユーザー−ブリテン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＵｓｅｒＢｕｌｌｅｔｉｎ）(１９９０年８月、ナンバー１７)で議論された。様々な配列法の適用又は応用におけるビオチニレイティッド−ヌクレオチド（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）の使用は、米国特許第５、４８４、７０１号、第５、４０５、７４６号、第５、４０１、６３２号、及び以下の文献に説明されている。文献とは、ユ、その他、生物発光．化学発光（１９９５年）１０：２３９〜２４５、トン−スミス、Ｊ．ＤＮＡ塩基配列及びマッピング（１９９３年）４：１５１〜１６２、ワルバーグ、その他(Ｗａｈｌｂｅｒｇｅｔａｌ)、電気泳動法（１９９２年）１３：５４７〜５５１、トム− ミス、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２年）６４：６７２〜２６７７、リヴァク、その他(Ｌｉｖａｋｅｔａｌ)、核酸．Ｒｅｓ．（１９９２年）１８：４８３１〜４８３７、ワルバーグ、その他、分子とセルラー−プローブズ（１９９０年）４：２８５〜２９７、ワルバーグ、その他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．核酸．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０年）８７：６５６９〜６５７３、セリガー(Ｓｅｌｉｇｅｒ)、その他、ヌクレオチド−ヌクレオチド（１９９０年）９：３８３〜３８８、ベック、酵素学の方法（１９９０年）１８４：６１２〜６１７、リッチテリッチ(Ｒｉｃｈｔｅｒｉｃｈ)、核酸Ｒｅｓ．（１９８９年）１７：２１８１〜２１８６、ベック、その他、核酸Ｒｅｓ．（１９８９年）１７：５１１５〜５１２３、スタル、その他(Ｓｔａｈｌｅｔａｌ)、核酸Ｒｅｓ．（１９８８）１６：３０２５−３０３８である。要旨ここには、酵素的配列を通した核酸の配列決定方法が提供される。本方法において、捕獲可能なチェーン−ターミネーター（ｃａｐｔｕｒａｂｌｅｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）が、固相上に捕獲可能なプライマー伸長生成物（通常は、標識プライマー伸長生成物）を生産するのに使用される。そして、プライマー伸長生成物は、核酸配列を決定する配列データを出す為に、固相上に捕獲、分離され、固相から開放され、サイズを区別され、検出される。１つの好適な実施例において、プライマー伸長生成物を作る為に使用されるプライマーは、共通波長で励起するが標識された生成物が区別できるように４種の各チェーン−ターミネーティング−ベース（ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇｂａｓｅ）に関連した区別可能な蛍光性信号を供給する蛍光性エネルギー移送の蛍光標識で標識される。図面の簡単な説明図１は、以下を説明する概略図である。そこでは、色素標識されたプライマー及びビオチン−ターミネーターが、配列断片を生産するのに用いられ、次に配列断片がストレプタビジン−コーテッド−磁気ビード（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｃｏａｔｅｄｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄｓ）と分離する時、真配列断片（ｔｒｕｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｓ）のみが蛍光ＤＮＡ配列装置において検出される。誤停止された断片は捕獲されず、ＲＮＡから結果として得られる非配列プライマー伸長断片及び裸ＤＮＡ断片は検出されない。図２は、ビオチン−ターミネーターと生産される４つの配列サンプルの配列ゲルイメージ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｇｅｌｉｍａｇｅ）の一部を図示している。サンプル１〜３は、プライマーのピークを完全に消去するストレプタビジン− コーテッド磁気ビードによって精製される。サンプル４は、エタノール沈殿によって移精製され、大きなプライマーのピークを残す。図３Ａ及び３Ｂは、ストレプタビジン−コーテッド磁気ビード（３Ａ）によって精製されたビオチン−ターミネーター及びエネルギー移送（ＥＴ）プライマーとで発生する４色の配列データが、ＥＴプライマー及び通常のｄｄＮＴＰｓ（３Ｂ）で発生する配列データよりも一段と清浄なものであることを図示している。３Ｂの誤停止ピークは、配列エラーとなる。同配列領域においては、誤ピーク（ｆａｌｓｅｐｅａｋ）が、３Ａには見うけられなかった。図４Ａ及び４Ｂは、ストレプトアビジン−コーテッド磁気ビード（４Ａ）によって精製されたビオチン−ターミネーター及びＥＴプライマーとで発生する４色の配列データの分解能が、エタノール沈殿（４Ｂ）のみによって浄化された同配列サンプルよりも清浄なものであることを図示している。図５Ａ、５Ｂ、及び５Ｃは，ストレプトアビジン−コーテッド磁気ビードによって精製されたビオチン−ターミネーターで発生した４色の配列サンプル（ｐＧＥＭ）の完全なエレクトロフェログラムを図示している。前記データは、基本的にノイズフリー（ｎｏｉｓｅｆｒｅｅ）である。有効な配列は、８００ｂｐまで取得できる。図６は、従来のサンガー又は酵素配列法を説明する概略図である。図７は、従来の酵素的配列法を用いた結果を説明する概略図である。定義「酵素的配列」、「サンガー法」、「ジデオキシ技法」、及び「チェーン−ターミネーター技法」といった用語は、交互に使用され、主要開発者であるＦ．サンガーの名を取ってＤＮＡ塩基配列決定法を説明する上で代替的に使用されている。上記技法は、相補ＤＮＡ鎖を合成する為に、１本鎖ＤＮＡ鋳型、短ＤＮＡプライマー、及びポリマーセ酵素を使用する。プライマーは、まずアニール（ａｎｎｅａｌ）されて一本鎖の鋳型となり、反応混合物が４つのアリコートに分断され、デオキシヌクレオシド三燐酸塩（ｄＮＴＰｓ）及びジデオキシヌクレオチド三燐酸塩（ｄｄＮＴＰ）が追加され各チューブが異なったｄｄＮＴＰを持つようにする。ポリマーゼが、鋳型の相補塩基に対向するｄｄＮＴＰを結合するが、ｄｄＮＴＰに３’水酸基グループが不足しても、それ以上ｄＮＴＰｓが追加されることはない。ｄｄＮＴＰ−ｄＮＴＰ比は、ｄｄＮＴＰが注入されて（全てが１末端、プライマー、を共通に持った）重なった断片のセット（即ち、プライマー伸長生成物）が形成される全ての位置でポリマーゼが、成長するＤＮＡ鎖を終結させる割合となっている。４つの反応混合物がポリアクリルアミド−ゲルを通じて電気泳動された時に、ゲル帯パターン又はラダー（ｌａｄｄｅｒ）が形成され、そこからＤＮＡ配列を直接読むことができるように、前記断片が標識される。図６及び図７にその工程が略図として図示されている。「標識された」とは、放射性、酵素的、及び蛍光性標識を含む検出可能な標識を意味する。「酵素的に生産された」とは、少なくとも一部が酵素作用の結果として生産されたという意味で、例えば、酵素が触媒作用を及ぼす時、ヌクレオチド断片が生産され、大きな配列が２以上の断片に分離することを意味する。「プライマー」とは、相補的なものであり、一本鎖ヌクレオチド配列のある部分が配列されるようにハイブリダイズィング（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）することが可能なポリマー配列を意味し、プライマーを使用してインヴィトロＤＮＡ合成を開始する。「プライマー伸長生成物」とは、プライマー配列及び酵素的配列中に生産されるチェーン−ターミネーターから成るポリヌクレオチド断片を意味する。「捕獲可能成分(ｃａｐｔｕｒａｂｌｅｍｏｉｅｔｙ)」、「捕獲可能チェーン −ターミネーター(ｃａｐｔｕｒａｂｌｅｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ)」、及び類似成分は、交互に使用され、３‘末端ヌクレオチド配列に結合した（固相上の成分との結合が可能な）分子成分を表現している。実施例の詳細な説明ここに酵素的配列を通して核酸配列を決定する改良方法が提供されている。本方法において、プライマーは、捕獲可能なチェーン−ターミネーターと伴に使用され、固相上に捕獲可能なプライマー伸長生成物を生産する。そこでは、プライマー伸長生成物は、（例えば、プライマー伸長生成物を生産する為の標識プライマーを利用することによって）標識される。プライマー伸長生成物を生産後、プライマー伸長生成物は、固相上に捕獲されることによって分離される。そして、分離されたプライマー伸長生成物は、固相から開放され、サイズが分けられ、検出され、核酸配列が決定される配列データを導き出す。本発明の詳細が説明される前に、特定実施例の変形例が形成され、それらは更に下記請求項の範疇に収まる様に、本発明が下記の特定の実施例に限定されるものではないことと理解されるべきである。更に、ここに適用された用語は、特定の実施例を説明するためのものであり、この用語に制限されるように意図されたものではないとも理解されるべきである。代わりに、本発明の適用範囲は、下記請求項によって確立されるものである。文脈が明確にそうでない意を示している以外は、本明細書及び下記請求項に使用された単数用語の“ａ”、“ａｎ”、及び“ｔｈｅ”が複数引用を含む可能性があると理解されるべきである。定義されていない場合、ここに使用された全技術用語及び科学用語は、本発明の属する分野の当業者にとって共通に理解されているのと同じ意味で使用されている。酵素的配列によって核酸（例えばＤＮＡ）の配列を決定する方法は、従来技術でも知られており、サムブルック、その他(Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ)、「分子クローンニング：ラボラトリー−マニュアル」(コールド−スプリング−ハーバー−ラボラトリー出版、１９８９年)とグリフィン−グリフィン(ＧｒｉｆｆｉｎａｎｄＧｒｉｆｆｉｎ)、「ＤＮＡ塩基配列決定法、最新イノベーションとこれからの傾向」、応用生化学及び生物工学（１９９３年）３８：１４７〜１５９、それらの開示事項は本発明にもここに引用されるものとする。サンガー法は、概略図として図６に示されている。一般的に、酵素的配列方法（サンガー− ジデオキシ又はチェーン−ターミネーション方法とも呼ばれる）において、鋳型ＤＮＡの各塩基での終結を示す異なってサイズされたオリゴヌクレオチド断片は、酵素的に生産され、サイズで区別され、核酸配列を決定する配列データを導き出す。そのサイズの区別の結果が、図７に示されている。その方法における第一ステップとしては、配列されるべき核酸の各異なった塩基に、異なってサイズされたオリゴヌクレオチドのファミリーを生産する。例えば、全４種の塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔより成る一本鎖ＤＮＡに対して、（各塩基に１つずつ）４つの異なってサイズされたオリゴヌクレオチドのファミリーが生産される。図６を参照のこと。異なってサイズされたオリゴヌクレオチドのファミリーを生産する為には、配列された核酸（即ち、鋳型核酸）における各塩基が、鋳型核酸の１塩基に対して、オリゴヌクレオチド−プライマー、ポリマーゼ、ヌクレオチド、及びジデオキシヌクレオチドと結合される。そして、各オリゴヌクレオチドのファミリーは、（例えば、エレクトロフェログラムによって）異なったサイズに区別し、核酸配列を決定する配列データ（例えば、区別パターン又はエレクトロフェログラム）を取得する為に検出される。図７を参照のこと。本発明の方法を更に詳しく説明する前に、本方法に利用される重要なチェーン −ターミネーター試薬に関して説明する。本方法に重要なのは、捕獲可能なチェーン−ターミネーターを利用して、３’末端の捕獲成分より成る、異なってサイズされたオリゴヌクレオチド断片のファミリー（以降、プライマー伸長生成物とする）を生産することである。プライマー伸長生成物を生産する為に用いられたプライマー配列は、チェーン伸長状態（ｃｈａｉｎｅｘｔｅｎｓｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）のターゲット又は鋳型核酸より成る核酸をハイブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）するに十分長いものである。そこで、プライマーの長さは、一般的に６〜４０、通常は１５〜３０ヌクレオチドである。一般的に、プライマーは、合成ヌクレオチド、類似物、又は擬態（例えばペプチド核酸）等である。プライマーは、直接（十分な部分が知られている）３’末端ターゲット核酸にハイブリダイズされるが、都合が良いことに、ユニバーサル−プライマー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍｅｒ）が利用可能で、ターゲット配列の側面に位置する公知のベクトル配列にアニールできる。ユニバーサル−プライマー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍｅｒ）は、公知のものであり、民間入手可能であり、ｐＵＣ／Ｍ１３、λｇｔ１０、λｇｔ１１等を含む。本発明の１つの好適な実施例において、本発明に利用されるプライマーは、検出可能な標識より成る。従来技術において、放射性、化学発光、及び蛍光標識といった様々な標識が知られており、それらの利用が本発明に適している。本方法が、特にプライマー伸長生成物の自動検出方法への適用に向いている場合、蛍光性標識の利用が好ましい。本発明に利用される蛍光標識されたプライマーは、一般的には、オリゴヌクレオチドの１塩基に付いた少なくとも１種の蛍光性成分より成る。本発明に使用されるプライマーは、様々な異なった蛍光性成分で標識され、蛍光剤又は蛍光体が、当然高いモル吸光度（ｈｉｇｈｍｏｌａｒａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）(一般的にモル吸光度は、少なくとも１０³ｃｍ^-1Ｍ^-1であり、通常は少なくとも１０⁴ｃｍ^-1Ｍ^-1であり、好ましくは１０⁵ｃｍ^-1Ｍ^-1である)及び高蛍光量子収量（蛍光量子収量が一般的に、少なくとも０．１、通常は約０．２、好ましくは約０．５）を有するべきである。単一の蛍光剤で標識されたプライマーに関して、その蛍光剤で吸収した光の波長が、一般的には約３００〜９００ｎｍ、通常は約４００〜８００ｎｍであり、典型的な最高吸光度は約５００〜８００ｎｍの波長で起こる。単一的に標識されたプライマーに使用される特定の蛍光剤としては、フルオレスセンイ、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン色素等が挙げられ、このことは更に、スミス、その他、自然（１９８６年）３２１；６４７〜６７９、に説明され、そこでの開示事項は本発明にも引用される。本方法の特に重要な用途は、エネルギー移送標識蛍光性プライマーの使用であり、そこでのプライマーは、エネルギー移送関係にあるドナー及びアクセプター蛍光剤成分を有する。エネルギー移送標識プライマーは、ジュ、その他(Ｊｕｅｔａｌ)、自然医学（１９９６年）２：２４６〜２４９、そしてＰＣＴ国際出願番号９５／０１２０５及びＰＣＴ国際出願番号９６／１３１３４に説明され、それらは本発明に引用されるものとする。本発明のその他の実施例としては、標識プラーマーの代わりに、蛍光標識ｄＵＴＰのような、プライマー伸長生成物と結合して標識プライマー伸長生成物となる、標識ジデオキシヌクレオチドを用いる。本方法において捕獲チェーン−ターミネーターとして使われるジデオキシヌクレオチドは、固相上に存在する機能に結合可能な機能を有している。２つの機能の反応により起こる結合は、洗浄時にも安定しているが、特定の化学若しくは物理的手段によって分離可能な程度に十分強力なものでなければならない。一般的に、チェーン−ターミネーター−ジデオキシヌクレオチドは、固相上に存在する特定の結合対の他方構成要素と結合可能な特定の結合対の一方構成要素を有する。特定の結合対としては、抗体と抗原、ビオチンとストレプトアビジン、スルフィドと金（Ｃｈｅｎｇ＆Ｂｒａｊｔｅｒ−Ｔｏｔｈ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６年）６８：４１８０〜４１８５）等のようなリガンドとレセプターを含むものが挙げられる。そして、リガンドかレセプターかのいずれか（通常はリガンド）は、チェーン−ターミネーター上に存在する。チェーンーターミネーターとして使用される特に重要なものとしては、ビオチン−ジデオキシヌクレオチドが挙げられる。ジデオキシヌクレオチドは、先行技術に開示されており、商業的にも入手可能（例えば、ビオチン−１１−ｄｄＡＴＰ、ビオチン−１１−ｄｄＧＴＰ、ビオチン−１１−ｄｄＣＴＰ、ビオチン−１１−ｄｄＴＴＰ等）である。本方法に戻り、本方法で配列可能な核酸は、一般的に適したベクトルでクローニングされたデオキシリボ核酸であり、様々なベクトルが従来技術によって開示され、商業的にも入手可能であり、それらとしてはＭ１３ｍｐ１８、ｐＧＥＭ、ｐＳｐｏｒｔ等が挙げられる。本方法の第一ステップとしては、配列される配列の４種の異なった各塩基又はターゲットＤＮＡの為の反応混合物を準備する。各反応混合物は、酵素的に生産されて同じ塩基で終結するプライマー伸長生成物のファミリー（通常は、標識プライマー伸長生成物）より成る。言い換えれば、本方法を実施するにあたって、まず、ターゲットＤＮＡを鋳型として異なってサイズされたプライマー伸長生成物であるＡ、Ｇ、Ｃ、及びＴを生産する。異なってサイズされたプライマー伸長生成物の４つのファミリーを生産する為、鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリマーゼ、（標識可能な）プライマー、４種の異なったデオキシヌクレオチド、及び捕獲可能なジデオキシヌクレオチドがプライマー伸長反応混合物に結合される。それらの成分は、複数のプライマー伸長生成物を生産するに十分なコンディションで反応する。それらのプライマー伸長生成物は、捕獲可能なジデオキシヌクレオチド及び後続のチェーン−ターミネーターのランダム結合の為に、異なってサイズされている。従って、異なってサイズされたプライマー伸長生成物のＡファミリーを生産するには、上記リストの試薬が、反応混合物に結合される。そこでは、ジデオキシヌクレオチドが、捕獲可能な成分（例えば、ビオチン−１１−ｄｄＡＴＰのようなビオチンｄｄＡＴＰ）を有するように修正されたｄｄＡＴＰである。異なってサイズされたプライマー伸長生成物の残りのＧ、Ｃ、及びＴファミリーは、適切なジデオキシヌクレオチドを利用して、同じような手順で生産される。標識されたプライマーが各プライマー伸長生成物ファミリーを生産するのに使用される場所には、標識されたプライマーは、同じでも異なっていても良い。各プライマー伸長生成物の４つのファミリーの生産の為には、標識されたプライマーが異なり、標識は殆ど同じ波長で励起できるが、区別可能な信号を提供できることが好ましい。異なってサイズされたプライマー伸長生成物が伴に同じ分離培地に存在する時、区別可能な信号を有した標識を使用することによって、前記生成物を区別する機会が得られる。その結果、優れた配列データが得られ、従って、より正確な配列決定を行うことができる。例えば、約４７０〜４８０ｎｍの波長で励起可能な（５２５ｎｍで発光する）第一蛍光性標識を有したプライマー伸長生成物のＡファミリーを準備する。Ｇ、Ｃ、及びＴファミリーの生産に使用される標識は、Ａファミリーに使用したのと同じ波長で励起されるが、夫々５５５ｎｍ、５８０ｎｍ、及び６０５ｎｍで発光する。従って、プライマー伸長標識は、全４種の標識が殆ど同じ波長で吸収されるが、異なった波長で発光し、発光された光の波長が、検出可能で区別可能な量（例えば、少なくとも１５ｎｍの違い）で異なっている。本方法の次のステップは、プライマー伸長生成物の隔離である。プライマー伸長生成物は、まずプライマー伸長生成物を、３’末端プライマー伸長生成物の捕獲成分を通して固相上に捕獲し、反応混合物の残りの成分から固相を区別することによって隔離される。プライマー伸長生成物の捕獲は、固相を有したプライマー伸長生成物のファミリーより成る反応混合物に接触することによって起こる。固相は、その表面に特定の結合対の一方を有する。特定の結合対の他方は、上記のように、プライマー伸長生成物に結合される。接触は、特定の結合対の安定した結合を提供するのに十分なコンディションのもとで起こる。本方法の遂行に当たっては、様々な異なった固相が適しており、そのような相は、従来技術においても知られており、商業的にも入手可能である。ここでの特定の固相は、ポリスチレン−ペッグ(ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅｐｅｇ)、シート、ビード(ｂｅａｄｓ)、磁気ビード、金面（ｇｏｌｄｓｕｒｆａｃｅ）等を含む。そのような固相の表面は、特定の結合対を有するように変更される。（例えばビオチニレイテッド−プライマー伸長生成物に関して、ストレプタビジン−コーテッド磁気ビードが固相として使用される。）固相上のプライマー伸長反応生成物の捕獲後、固相は、鋳型ＤＮＡ、過剰プライマー、過剰デオキシ及びジデオキシヌクレオチド、ポリマーゼ、塩化ナトリウム、捕獲成分を持たない伸長生成物等といった反応混合物の残りの成分から区別される。区別は、如何なる便利な方法論を利用しても施行可能である。その方法として典型的なものは、固相を洗浄する工程を含み、次のステップに遠心法等を取り入れることができる。固相を区別するに利用される特定の方法は、使用される方法が固相からプライマー伸長反応生成物の結合リンクを分離しないものである限り、本発明にとって致命的な要求事項とはならない。そして、プライマー伸長生成物は、固相より開放される。生成物は、特定の結合対間の結合性質によっては、化学的及び物理的手段を有した如何なる従来技術を用いても開放できる。例えば、結合がビオチン−ストレプトアビジン結合である場合、（ビオチン−ストレプトアビジン結合を分離し、プライマー伸長生成物を固相より開放する）アルムアミド等のような化学的分離剤を固相に接触させることによって分離する。そして、開放されたプライマー伸長生成物は、溶出、遠心等を含んだ如何なる従来手段を用いても、固相より区別することができる。本方法の次のステップとして、プライマー伸長生成物のサイズを区別する。プライマー伸長生成物のサイズ区別は、一般的に電気泳動法を通じて達成でき、その場合、プライマー伸長生成物が従来技術に知られるような電界の影響下にある分離培地を介して移動する。代わりに、非標識プライマー伸長生成物が検出される質量分析（ＭＳ）での配列に関し、配列断片は、フライト−チェンバー（ｆｌｉｇｈｔｃｈａｍｂｅｒ）の時間で区別され、断片の質量で検出される。ロスキー、その他(Ｒｏｓｋｅｙｅｔａｌ)、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．アメリカ（１９９６年）９３：４７２４〜４７２９を参照のこと。本方法論は、正確な配列データを取得するのに特に重要なものとなる。何故なら、捕獲可能なチェーン−ターミネーターで終結するプライマー伸長生成物のみを供給する手段を提供し、その他の全集団を排除することによって正確な結果を得ることができる。断片がサイズ区別される方法において、サイズ区別されたプライマー伸長生成物が検出され、サイズ区別された生成物の検出が、ターゲット又は鋳型ＤＮＡの配列を決定する配列データを導き出す。例えば、断片ファミリーが、従来からある４つの別々（ターゲットＤＮＡの各塩基に１つ）のレーンのスラブ−ゲルにおいて区別されると、区別パターンという形で配列データが得られる。図７を参照のこと。そして、ターゲットＤＮＡ配列が、その区別パターンより（例えば、ゲルを分析することによって）得られる。図７左の塩基を参照のこと。代わりに、自動検出装置が利用され、全反応生成物が、同じ電気泳動培地にて区別されると、配列データは、従来技術で知られるように、エレクトロフェログラムという形を取り、そこからＤＮＡ配列が決定される。標識されたプライマーが利用され、標識されたプライマーの特質が、標識プライマー伸長生成物ファミリーが同じ電気泳動培地（例えば、スラブ−ゲルの単一レーンや、同じ毛細管や、異なった電気泳動メディア）(例えば、スラブ−ゲルの異なったレーン又は異なった毛細管)において区別できるかを一部決定する。同じ検出可能な単一物（ｓｉｎｇｌｅ）を生産する同じ標識プライマーが、各異なったファミリーにプライマー伸長生成物を生産するのに使用されると、プライマー伸長生成物ファミリーは、異なった電気泳動メディアに電気泳動的に区別されるので、核酸の各塩基に対するプライマー伸長生成物ファミリーが区別可能となる。プライマー伸長生成物の各ファミリーを生産する為に異なった標識プライマーが使用され、生成物ファミリーは、一緒にグループ化され、電気泳動的に同じ電気泳動培地において区別される。この好適な方法において、プライマー伸長生成物ファミリーが、プライマー伸長生成物の生産ステップに続く如何なる段階においても、結合又は寄せ集め（ｐｏｏｌｅｄ）が可能となる。従って、プライマー伸長生成物は、電気泳動区別前に、固相に接触する前か、固相に向かうか、若しくは固相から区別された後で集めること（ｃａｎｂｅｐｏｏｌｅｄ）が可能である。ここに本配列方法を実行する為のキットも提供される。少なくとも、前記キットは、捕獲可能なチェーンターミネーター（例えば、ビオチン−ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、及びｄｄＧＴＰ）を有す。プライマー伸長生成物が標識された実施例において、キットは、更に標識デオキシヌクレオチド又好ましくは標識プライマーといった標識プライマー伸長生成物の生産手段を有し、そこで、好ましくは標識プライマーが、同じ波長で吸収され、区別可能な蛍光性信号を発するエネルギー移送標識プライマーである。便宜上、キットには、更に１つ以上の酵素配列に利用性の高い（例えば、ベクトル、ポリマーゼ、デオキシヌクレオチド、バッファー等の）試薬を追加することができる。更に、キットは、複数の容器を含み、各容器は、１つ以上の必要な（標識プライマー、非標識プライマー又は標識プライマー、ｄＮＴＰｓ、蛍光性ｄＮＴＰｓのフラクションを含むｄＮＴＰｓ、捕獲可能なｄｄＮＴＰ、ポリマーゼ等の）試薬を含む。キットは、更に（磁気ビードで被覆したストレプトアビジン等の）捕獲可能なｄｄＮＴＰと結合可能な成分から成る固相を含む。以下の例は、実例であって、これらに限定されるものではない。実験ＤＮＡ塩基配列決定手順塩基配列は、ＡＢＩ３７７配列器（アプライド−バイオシステム）に、Ｍ１３ｍｐ１８又はｐＧＥＭ鋳型ＤＮＡ、エネルギー移送プライマー（−４０Ｍ１３ｆｏｒｗａｒｄ又は−２８Ｍ１３ｒｅｖｅｒｓｅ）(ヴァンドアー−ホーン、その他、（ＶａｎｄｏｒＨｏｒｎｅｔａｌ）コメント、１９９６年、２３、７、アマーシャム−ライフ−サイエンス（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）を参照のこと)、及びサーモ−シィークエンセ（ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ）(アマ−シャム−ライフ−サイエンス)を用いて行われた。ビオチン −ターミネーター（ＢＩＯＴＩＮ−１１１−ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、及びｄｄＣＴＰ）は、ＮＥＮライフ−サイエンス（ボストンＵＳＡ）から入手できる。各色素／ｄｄＮＴＰの組み合わせに１つ、計４つの反応が試験された。ｄｄＣＴＰを含んだ反応は、Ｆ１０Ｆプライマー、Ｆ１０ＧプライマーとｄｄＡＴＰ、Ｆ１０ＴプライマーとｄｄＧＴＰ、そして、Ｆ１０ＲとｄｄＴＴＰと伴に試験された。これら特定のプライマーは、上記のヴァンドアー−ホーン、その他(ＶａｎｄｅｒＨｏｒｎｅｔａｌ)、に説明されている。Ａ及びＧ反応の為に、ｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ混合物１．６μｌ（７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰを各７００ｍＭとビオチン−１１−ｄｄＡＴＰ又はビオチン−１１−ｄｄＧＴＰを２．５μＭ）が、反応バッファー０．４μｌ（２６０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣＩｐＨ９．５、６５ｍＭＭｇＣｌ₂）、プライマー０．２ｐｍｏｌ、サーモ−ジィークエンセ１．０ｐｌ(１．７Ｕ／μｌ)、及びＤＮＡ鋳型２μｌと混合された。Ｔ及びＣ反応の為に、ｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ混合物３．２μｌ（７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰを各６１３ｍＭとビオチン−１１−ｄｄＴＴＰ又はビオチン−１１−ｄｄＣＴＰを２．５μＭ）が、反応バッファー０．８ μｌ(２６０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣＩｐＨ９．５、６５ｍＭＭｇＣｌ₂)、プライマー０．４ｐｍｏｌ、サーモ−シィークエンセ（ＴＨｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ）２．０μｌ(１．７Ｕ／μｌ)、及びＤＮＡ鋳型４μｌと混合された。配列サンプルに対して、摂氏９６度で２０秒間、摂氏５０度で２０秒間、摂氏６０度で３分間を３１サイクル実施した。そして、１０ｘＴＥバッファー４μｌ加えて、各配列に４つの反応混合液を停止し、１つのバイアル（ｖｉａｌ）で結合される。固相の精製手順ストレプトアビジン−コーテッド磁気ビード（ダイナビーズＭ２８０）８０μｌが、結合洗浄緩衝液（ｂｉｎｄｉｎｇａｎｄｗａｓｈｉｎｇｂｕｆｆｅｒ又はＢ＆Ｗ）(１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ及び２．０ＭＮａＣＬ）２ｘ８０μｌで洗浄され、Ｂ＆Ｗ緩衝液５０μｌで再び懸濁される。全配列反応混合液は、（ダイナルからの）ストレプトアビジン−コーテッド磁気ビーズと結合され、時より混ぜられながら１時間摂氏５０度で定温放置される。磁気ビーズが磁石で固定化される一方、上澄み液が取り除かれた。そして、ビーズは、Ｂ＆Ｗ緩衝液２ｘ１００μｌで２回、１００μｌｘＴＥで１回、脱イオン水１００μｌで１回洗浄された。ビオチニレイテッド配列ＤＮＡ断片は、摂氏９４度で５分間、１０ｍＭＥＤＴＡを含むホルムアミド６μｌにおける磁気ビーズから溶離され、上澄み液１μｌが、３７７インストウルメント（３７７Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）中のポリアクリルアミド７Ｍウレア変性ゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ７Ｍｕｒｅａｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｅｌ）４％にロード（ｌｏａｄ）された。ＡＢＩ３３７ＤＮＡ配列器を有した１ｘＴＢＥ緩衝液とを利用して、４８Ａラン−モードで、１０時間電気泳動された。結果図５Ａ、５Ｂ、及び５Ｃは、上記方法に従ってストレプトアビジン−コーテッド磁気ビーズを利用して精製された後のビオチン−ターミネーターで生産されたｐＧＥＭの４色の配列サンプルの完全電気泳動を示す。そのデータには、本質的にノイズがない。有効な配列は、８００ｂｐまで得られる。同じような結果が他の鋳型で得られた。比較結果本方法で入手可能な結果をエタノール沈殿で得られる結果と比較する為に、ビオチン−ターミネーターを利用して４つの配列サンプルを用意した。そのうち３つの配列サンプルは、ストレプトジン−コーテッド−ビーズを利用して精製され、一方残りのサンプルは、エタノール沈殿にかけられる。図２は、ビオチン−ターミネーターで生産された４つの配列サンプルの配列ゲルイメージの一部である。サンプル１〜３は、完全にプライマー−ピークが除去されるストレプトアビジン−コーテッド磁気ビーズで精製された。サンプル４は、エタノール沈殿によって精製され、大きなプライマー−ピークが残る。配列断片は、鋳型として、Ｍ１３−４０、Ｆ１０Ｆ、Ｆ１０Ｇ、Ｆ１０Ｔ、及びＦ１０Ｒと４色のエネルギー移送プライマー、Ｍ１３ｍｐ１８とｐＧＥＭを利用して生産される。一方のセット（３Ａ）では、ビオチン−ターミネーターが利用され、一方他方のセット（３Ｂ）では、標準の非ビオチニレイテッド−ターミネーターが利用される。セット３Ａの配列断片は、ストレプトアビジン−コーテッド磁気ビーズで精製され、一方セット３Ｂの断片は、ストレプトアビジン−コーテッド磁気ビーズで精製されない。図３Ａ及び３Ｂは、ビオチン−ターミネーターで生産された４色配列データであり、ストレプトアビジン−コーテッド磁気ビーズ（３Ａ）で精製された後のエネルギー移送（ＥＴ）プライマーが、ＥＴプライマーと標準ｄｄＮＴＰｓ(３Ｂ９で生産された配列データより一層清浄なものであることを示している。３Ｂにおける誤停止ピーク（ｆａｌｓｅｓｔｏｐｐｅａｋ）は、配列エラーとなった。同配列領域において、誤ピークは３Ａには見うけられなかった。図４Ａ及び４Ｂは、ストレプトビビジン−コーテッド磁気ビーズ（４Ａ）で精製された後のビオチン−ターミネーターとＥＴプライマーで生産された４色配列データの分解能が、エタノール沈殿（４Ｂ）によってのみ精製された同じ配列サンプルより良いことが図示されている。上記の結果及び検討項目は、標識プライマーと固相捕獲可能なチェーン−ターミネーターを酵素的配列法に利用することによって、たとえ長ＤＮＡ鎖であっても、非常に正確な配列データを得ることができることを実証した。本方法を利用することによって、誤停止、セルフ−プライミングＲＮＡｓｅｌｆ−ｐｒｉｍｉｎｇＲＮＡ)、及び裸２本鎖ＤＮＡの為にバックグラウンドが除去されると、真ＤＮＡ配列断片のみが隔離され、検出される。更に、本方法を使用することによって、塩化ナトリウム、過剰プライマー、鋳型核酸、及び他の配列断片生産に必要な試薬が、検出及び隔離以前に配列断片から区別され、結果の改善となる。本明細書に引用された全ての出版物及び特許出願は、あたかも各々の出版物又は特許出願が明らかに夫々引用されるべく表示されたかの様に、ここに引用されるものとする。出版物の引用は、出願日以前の開示を示すもので、本発明が従来技術によって出版物より前に発明されたと主張する権利が無いということを承認したと解釈されるべきではない。明確性と理解性を目的として、前述の発明が図や例によってある程度詳細に説明されているが、本発明の開示事項を参照することによってある程度の変更及び改修が本請求項の精神又は範疇から離れること無しに実施可能であることは当業者にとって自明なことである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】ここにクレームされるのは：１．（ａ）核酸、ポリマーゼ(ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ)、デオキシヌクレオチド、オリゴヌクレオチド−プライマー及び捕獲可能なデオキシ−チェーン−ターミネーター（ｃａｐｔｕｒａｂｌｅｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を、捕獲可能なプライマー伸長生成物を生産するに十分なコンディションで、結合されることによって酵素的に生産された捕獲可能なプライマー伸長生成物のファミリーから構成された夫々の反応混合物が、前記核酸の各塩基に応じて準備し、（ｂ）固相に捕獲されたプライマー伸長生成物を生産する為に、固相上に存在する成分と前記チェーン−ターミネーターの相互作用を通じて、各反応混合物を、捕獲可能な前記チェーン−ターミネーターより成る前記プライマー伸長生成物を捕獲可能な固相に接触させ、（ｃ）前記固相に捕獲されたプライマー伸長生成物を反応混合物から区別し、（ｄ）前記プライマー伸長生成物を固相から開放し、（ｅ）配列データを導き出す為に、サイズを区別し、前記の開放されたプライマー伸長生成物を検出し、（ｆ）前記配列データより前記核酸の配列を決定する、核酸の配列決定方法。２．前記プライマー伸長生成物が標識されていることを特徴とする、請求項１に記載の、核酸の配列決定方法。３．少なくとも一つの前記プライマー及びデオキシヌクレオチドが標識されていることを特徴とする、請求項２に記載の、核酸の配列決定方法。４．前記標識が、蛍光性標識であることを特徴とする、請求項２又は３の、核酸の配列決定方法。５．前記蛍光性標識が、エネルギー移送標識であることを特徴とする、請求項４の、核酸の配列決定方法。６．前記成分が特定の結合対の構成要素（ｍｅｍｂｅｒｓｏｆａｓｐｅｃｉｆｉｃｂｉｎｄｉｎｇｐａｉｒ）であることを特徴とする、請求項１〜５の何れかに記載の、核酸の配列決定方法。７．請求項１〜６に記載の方法に従って生産される、プライマー伸長生成物。８．前記生成物が標識されることを特徴とする、請求項７に記載の、プライマー伸長生成物。９．少なくとも一つの標識されたオリゴヌクレオチド−プライマー標識ｄＮＴＰｓと、固相捕獲可能チェーン−ターミネーターとより成る、核酸配列決定に使用するキット。１０．更に固相を有した、請求項９に記載のキット。