JP2001501453A

JP2001501453A - Human tumor necrosis factor δ and ε

Info

Publication number: JP2001501453A
Application number: JP09532553A
Authority: JP
Inventors: ニ，ジアン; ユ，ゴ―リエン; エル．ジェンツ，レイナー; ジェイ．ディロン，パトリック
Original assignee: ヒューマンジノームサイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-03-14
Filing date: 1996-03-14
Publication date: 2001-02-06
Also published as: DE69630710D1; CA2247285A1; AU5366596A; EP0897390A1; EP1362916A3; ATE254135T1; EP0897390A4; AU726486B2; CN1214050A; DK0897390T3; DE69630710T2; ES2210354T3; AU726486C; EP1362916A2; CA2247285C; WO1997033902A1; EP0897390B1; PT897390E

Abstract

The invention relates to human TNF delta and TNF epsilon polypeptides, polynucleotides encoding the polypeptides, methods for producing the polypeptides, in particular by expressing the polynucleotides, and agonists and antagonists of the polypeptides. The invention further relates to methods for utilizing such polynucleotides, polypeptides, agonists and antagonists for applications, which relate, in part, to research, diagnostic and clinical arts.

Description

【発明の詳細な説明】ヒト腫瘍壊死因子δおよびε 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；それらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの改変体または誘導体；それらのポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにそれらの改変体および誘導体を作製するためのプロセス；それらのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト；ならびにそれらのポリヌクレオチド、ポリペプチド、改変体、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストの使用に部分的に関する。特に、これらおよび他の点に関して、本発明は、ヒト腫瘍壊死因子δおよびεのポリヌクレオチドおよびポリペプチド（本明細書中以下で時々「TNFδ」および「TNFε」と呼ばれる）に関する。発明の背景ヒト腫瘍壊死因子α（TNF-α）およびβ（TNF-βまたはリンホトキシン）は、ポリペプチド媒介物の広範なクラスのメンバーに関連し、これは、インターフェロン、インターロイキンおよび成長因子を含み、集合的にサイトカインと呼ばれる（Beutler，B.およびCerami，A.，Annu.Rev.Immunol.，7:625-655，1989）。腫瘍壊死因子（TNF-αおよびTNF-β）は、最初、その抗腫瘍活性の結果として発見されたが、今日では、いくつかの形質転換細胞株のアポトーシス、細胞活性化および増殖の媒介を含む多数の生物学的活性を可能とする多面的なサイトカインとして、そしてさらに免疫調節および炎症において重要な役割を演じると認識されている。今日までに、TNF-リガンドスーパーファミリーの９つの既知のメンバー、TNF- α、TNF-β（リンホトキシン-α）、LT-β、OX40L、FASL、CD30L、CD27L、CD40L および4-1BBLが存在する。TNFリガンドスーパーファミリーのリガンドは、細胞外ドメインにおいて約20％の配列相同性（範囲；12〜36％）を有する酸性のTNF 様分子であり、そして主として膜結合形態として存在し、生物学的活性形態はトリマー/マルチマー複合体である。TNFリガンドスーパーファミリーの可溶性形態はこれまで、TNF、LTα、およびFASLに関してのみ同定されている（一般的な総説については、Gruss，H.およびDower，S.K.，Blood，85(12):3378-3404(1995)( これは、その全体が参考として本明細書中に援用される)を参照のこと）。これらのタンパク質は、細胞生存またはアポトーシスまたは細胞傷害性による細胞死の制御を含む、細胞増殖、活性化、および分化の調節に関与する(Armltag e，R.J.，Curr.Opin.Immunol.，6:407(1994)およびSmith，C.A.，Cell，75:959 1994）。 TNFは、単球、繊維芽細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞を含む多数の細胞タイプによって産生され、そして活性化マクロファージによって優勢に産生される。TNF-αは、腫瘍の迅速な壊死、免疫刺激、自己免疫疾患、移植片拒絶、寄生体に対する耐性、抗ウイルス応答の産生、敗血症性ショック、成長調節、血管内皮影響および代謝性影響において役割を有することが報告されている。TN F-αはまた、PAF-1、IL-1、GM-CSFおよびIL-6を含む、種々の因子を分泌するように内皮細胞をトリガーし、細胞増殖を促進する。さらに、TNF-αは、E-セレクチン、ICAM-1およびNCAM-1のような種々の細胞接着分子をアップレギュレートする。 TNFリガンドスーパーファミリーのメンバーによって媒介される種々の細胞性応答の誘導における最初の工程は、特定の細胞表面レセプターへのそれらの結合である。TNFレセプタースーパーファミリーは、現在は10の既知の膜タンパク質およびTNFR関連分子をコードするいくつかのウイルスのオープンリーディングフレームを含む。p75低親和性神経成長因子(NGF)レセプターは、このファミリーの最初にクローン化されたレセプターであった（Johnson，D.ら、Cell，47:545(19 86)）。引き続いて、TNFに対する２つの特定のレセプターのクローニングは、それらがNGFレセプターに関連したことを示す（Loetscher，H.ら、Cell，61:351(1 990)）。近年、新規のI型膜貫通TNFレセプタースーパーファミリーが確立されている。このファミリーは、p75神経成長因子レセプター、p60 TNFR-1、p80 TNFR −II、TNFR-RP/TNFR−III、CD27、CD30、CD40、4-1BB、OX40、およびFAS/APO-1 を含む。さらに、可溶性TNFレセプターをコードするいくつかのウイルスのオープンリーディングフレームが同定されている（例えば、Shope線維腫ウイルスのS FV-T2（Smith，C.A.ら、Biochem，Biophys.Res.Commun.，176:335，1991）およびワクシニアウイルスのVa53またはSaIF19R（Howard．S.T.，Virology，180:633 ,1991)）。これらのレセプターは、細胞外（アミノ末端）ドメイン中の複数のシステインリッチドメインによって特徴付けられ、これはリガンド結合に関与することが示されている。ヒトファミリーメンバー間のシステインリッチ細胞外領域における平均相同性は、25〜30％の範囲にある。明白に、正常および異常細胞の活性化および分化を調節する因子に関する必要性が存在する。それゆえ、正常および疾患状態の両方の細胞の活性化および分化を調節するそのような因子の同定および特徴付けに関する必要性が存在する。特に、形質転換細胞株のアポトーシスを制御し、細胞活性化および増殖を媒介し、そして免疫調節および炎症応答の一次媒介物として機能的に関連し、そしてとりわけ、機能障害または疾患を予防、改善または矯正することにおいて役割を演じ得る、TNFリガンドスーパーファミリーのメンバーに類似したさらなるTNFリガンドを単離し、そして特徴付ける必要性が存在する。発明の要旨これらおよび他の目的に向かって、新規のTNFδおよびTNFεと呼ばれる、図１および図２に示されるアミノ酸配列とヒトTNFαおよびTNFβのような腫瘍壊死因子ファミリー中の他のタンパク質の既知のアミノ酸配列との間の相同性によって腫瘍壊死因子リガンドであると仮説的に同定されている新規のポリペプチドを提供することが本発明の目的である。本発明のポリペプチドは、構造的および生物学的類似性に基づいてTNFリガンドスーパーファミリーの新規メンバーとして同定されている。さらに、TNFδおよびTNFεをコードするポリヌクレオチド、特に本明細書中で TNFδおよびTNFεと命名されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することが本発明のさらなる目的である。本発明のこの局面の特に好ましい実施態様において、ポリヌクレオチドは、図１および図２に示される配列中のヒトTNFδおよびTNFεをコードする領域を含む。本発明のこの局面に従って、mRNA、cDNA、ゲノムDNAを含む、ヒトTNFδをコードする単離された核酸分子が提供され、そして本発明のこの局面のさらなる実施態様において、生物学的、診断的、臨床的、または治療的に有用なその改変体、アナログ、または誘導体、あるいはそれらのフラグメント（改変体、アナログおよび誘導体のフラグメントを含む）が提供される。本発明のこの局面の特に好ましい実施態様には、ヒトTNFδおよびTNFεの天然に存在する対立遺伝子改変体が含まれる。本発明のこの局面に従って、1995年12月８日に寄託されたATCC受託番号第9737 7号に含まれるヒトcDNAによって発現される成熟ヒトTNFδポリペプチドおよび19 96年３月１日に奇託されたATCC受託番号第97457号に含まれるヒトcDNAによって発現される成熟ヒトTNFεポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。いくつかの形質転換細胞株を破壊し、細胞活性化および増殖を媒介し、そして免疫調節および炎症応答の一次媒介物として機能的に関連するTNFδポリペプチド、特にヒトTNFδおよびTNFεポリペプチドを提供することがまた、本発明の目的である。本発明のこの局面に従って、本明細書中でTNFδおよびTNFεと呼ばれるヒト起源の新規のポリペプチド、ならびに生物学的、診断的、または治療的に有用なそのフラグメント、改変体、および誘導体、そのフラグメントの改変体および誘導体、ならびに前記これらのアナログが提供される。本発明のこの局面の特に好ましい実施態様には、ヒトTNFδおよびTNFε遺伝子の天然に存在する対立遺伝子によってコードされるヒトTNFδおよびTNFεの改変体が存在する。前述のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、改変体および誘導体、改変体および誘導体のフラグメント、ならびに前記これらのアナログを産生するためのプロセスを提供することが本発明の別の目的である。本発明のこの局面の好ましい実施態様において、前述のTNFδおよびTNFεポリペプチドを産生する方法が提供される。この方法は、そこに発現可能に組み込まれた外因性由来ヒトTNFδ コードポリヌクレオチドおよびTNFεコードポリヌクレオチドを有する宿主細胞を、宿主中でのヒトTNFδおよびTNFεの発現のための条件下で培養する工程、次いで発現されたポリペプチドを回収する工程を包含する。本発明の別の目的に従って、とりわけ、研究、生物学的、診断的、および治療的目的のために前述のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する、産物、組成物、プロセス、および方法が提供される。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様に従って、産物、組成物、およびとりわけ以下の方法が提供される：TNFδおよびTNFεポリペプチドまたはTNFδ コードmRNAまたはTNFεコードmRNAポリペプチドを決定することによって、細胞におけるTNFδおよびTNFε発現を評価する方法；TNFδおよびTNFε遺伝子における欠損のような遺伝的変異および異常をアッセイする方法；ならびにTNFδまたはTNFε機能を増大するかまたはTNFδまたはTNFε機能障害を治療するために、T NFδまたはTNFεポリペプチドまたはポリヌクレオチドを生物に投与する方法。本発明のこの局面および他の局面の特定の好ましい実施態様に従って、ヒトTN FδまたはTNFε配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドおよび特にプローブが提供される。本発明のこの局面の特定のさらなる好ましい実施態様において、TNFδまたはT NFεポリペプチドに対する抗体が提供される。この点に関して特定の特に好ましい実施態様において、抗体は、ヒトTNFδまたはTNFεに対して高度に選択的である。本発明の別の局面に従って、TNFδまたはTNFεアゴニストが提供される。好ましいアゴニストには、TNFδ結合分子またはレセプター分子あるいはTNFε結合分子またはレセプター分子に結合する、TNFδまたはTNFεを模倣する分子、および TNFδ誘導またはε誘導応答を誘発するかまたは増大する分子が存在する。さらに、好ましいアゴニストには、TNFδおよびTNFεまたはTNFδおよびTNFεポリペプチド、あるいはTNFδ活性の他のモジュレーターと相互作用し、それによってT NFδおよびTNFεの効果または１つより多いTNFδおよびTNFεの効果を増強または増大する分子がある。本発明のさらに別の局面に従って、TNFδおよびTNFεアンタゴニストが提供される。好ましいアンタゴニストには、TNFδおよびTNFεレセプターまたは結合分子に結合するが、TNFδおよびTNFε誘導応答または１つより多いTNFδおよびTNF ε誘導応答を誘発しないようにTNFδおよびTNFεを模倣するアンタゴニストがある。さらに、好ましいアンタゴニストには、TNFδおよびTNFεの効果あるいは１つより多いのTNFδおよびTNFεの効果を阻害するようにTNFδおよびTNFεに結合または相互作用するか、またはTNFδおよびTNFεの発現を防止する分子がある。アゴニストおよびアンタゴニストは、TNFδおよびTNFεポリペプチドの作用を模倣するか、増大するか、または阻害するために使用され得る。それらは、例えば、敗血症性ショック、炎症、大脳マラリア、HIVウイルスの活性化、移植片宿主拒絶、骨吸収、慢性関節リウマチ、および悪液質を防止するために用いられ得る。本発明のさらなる局面では、インビトロ、エキソビボおよびインビボでの細胞への投与、または多細胞生物への投与のためのTNFδおよびTNFεポリヌクレオチドまたはTNFδおよびTNFεポリペプチドを含有する組成物が提供される。本発明のこの局面の特定の特に好ましい実施態様において、組成物は、疾患の処置のための宿主生物におけるTNFδおよびTNFεポリペプチドの発現のためのTNFδおよびTNFεポリヌクレオチドを含有する。この点に関して特に好ましいのは、TNFδ およびTNFεの異常な内在性の活性と関連する機能障害の処置のためのヒト患者における発現である。本発明の他の目的、特徴、利点、および局面は、以下の記載から当業者に明らかになる。しかし、以下の記載および特定の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すが、説明のためのみに示されることを理解されるべきである。開示される本発明の精神および範囲内の種々の変化および修飾が、以下の記載を読むことから、そして本開示の他の部分を読むことから当業者に容易に明らかになる。図面の簡単な説明以下の図面は本発明の特定の実施態様を示す。それらは、例に過ぎず、本明細書に他に開示される本発明を限定しない。図１は、ヒトTNFδのヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。図２は、ヒトTNFεのヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示す。図３は、TNFα、TNFβ、TNFδおよびTNFεポリペプチドのアミノ酸配間の類似性の領域（アラインメント報告）を示す。図４は、アミノ酸配列の関数としての、示された技術によって推定されるTNF δの構造的および機能的特徴を示す。図５は、アミノ酸配列の関数としての、示された技術によって推定されるTNF εの構造的および機能的特徴を示す。以下の例示的説明は、本明細書中、特に実施例で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供される。この説明は、便宜のために提供され、本発明を限定しない。用語DNAの「消化」は、DNAの特定の配列にのみ作用する制限酵素でのDNAの触媒性切断をいう。本明細書中で言及される種々の制限酵素は市販されており、そして使用のための反応条件、コファクターおよび他の必要なものは、当業者に公知であり、そして日常的である。分析目的では、代表的には１μｇのプラスミドまたはDNAフラグメントが、約2 0μｌの反応緩衝液中で約２ユニットの酵素で消化される。プラスミド構築のためにDNAフラグメントを単離する目的では、代表的に５〜50μｇのDNAが、比例してより大きな容量中で20〜250ユニットの酵素で消化される。特定の制限酵素に関する適切な緩衝液および基質量は、下記に引用されるような標準的な研究室マニュアルに記載されており、そしてそれらは、商業的供給者によって特定される。 37℃で約１時間のインキュベーション時間が通常用いられるが、条件は、標準的手順、供給者の指示および反応の特殊性に従って変化し得る。消化の後、反応が分析され得、そしてフラグメントは、当業者にとって日常的である周知の方法を用いて、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルを通す電気泳動によって精製され得る。用語「遺伝因子」は、一般に、ポリペプチドをコードする領域を含むポリヌクレオチド、あるいは転写もしくは翻訳または宿主細胞におけるポリペプチドの発現に重要である他のプロセスを調節する領域を含むポリヌクレオチド、あるいはポリペプチドをコードする領域およびそれに作動可能に連結された発現を調節する領域の両方を含むポリヌクレオチドを意味する。遺伝因子は、エピソーム因子として複製するベクター内に含まれ得る；すなわち、宿主細胞ゲノムと物理的に独立した分子である。それらは、真核細胞におけるメトトレキセート選択によるトランスフェクトされたDNAの増幅の間に生じるような、ミニ染色体内に含まれ得る。遺伝因子はまた、宿主細胞ゲノム内に；それらの天然の状態ではなく、むしろ操作（例えば、単離、クローニングおよび宿主細胞への導入）の後の精製されたDNAまたはとりわけベクター内の形態で含まれ得る。用語「単離された」は、天然の状態から「人間の手によって」変化したことを意味する；すなわち、それが天然に存在する場合、それは、本来の環境から変化されるか、または取り出されるか、あるいは両方である。この用語が本明細書中で用いられるように、例えば、天然に存在するポリヌクレオチドまたは生存する動物において天然に存在するポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然の状態の共存する物質から分離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いる。例えば、ポリヌクレオチドに関して、用語単離されたは、それが天然に存在する染色体および細胞から分離されていることを意味する。単離の一部として、または単離の後に、このようなポリヌクレオチドは、例えば、変異誘発のため、融合タンパク質を形成するため、そして宿主における伝播または発現のために他のポリヌクレオチドに結合され得る。単離されたポリヌクレオチド（単独またはベクターのような他のポリヌクレオチドと結合された）は、培養物または生物全体の宿主細胞に導入され得、この用語が本明細書中で用いられるように、この後でもこのようなDNAは依然として単離されている。なぜなら、それらは、天然に存在する形態または環境ではないからである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、天然に存在する組成物ではなく、そして、本明細書中で用いられるようなその用語の意味内の単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドをそこに残存する、例えば、細胞へのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入のための培地処方物、溶液のような組成物、例えば、化学または酵素反応のための組成物または溶液のような組成物中に存在し得る。用語「連結」は、２以上のポリヌクレオチド（しばしば、２本鎖DNAである）間にホスホジエステル結合を形成するプロセスをいう。連結のための技術は、当該分野で周知であり、そして連結に関するプロトコルは、標準的研究室マニュアルおよび参考文献（例えば、以下で引用されるような、Sambrookら、Molecular Cloning，a Laboratory Manual，第２版；Cold Spring Harbor Laboratory Pres s，Cold Spring Harbor，New York(1989)およびManiatisら、146頁）に記載されている。用語「オリゴヌクレオチド」は、比較的短いポリヌクレオチドをいう。しばしばこの用語は、１本鎖デオキシリボヌクレオチドをいう。しかし、同様に、とりわけ、１本鎖または２本鎖リボヌクレオチド、RNA:DNAハイブリッドおよび２本鎖DNAを意味し得る。オリゴヌクレオチド（例えば、１本鎖DNAプローブオリゴヌクレオチド）は、自動化オリゴヌクレオチド合成機において実行されるような化学法によってしばしば合成される。しかし、オリゴヌクレオチドは、種々の他の方法（インビトロ組換えDNA媒介技術を含む）ならびに細胞および生物におけるDNAの発現によって作製され得る。最初に、化学的に合成されたDNAは、代表的には、5'ホスフェートを伴わないで得られる。このようなオリゴヌクレオチドの5'末端は、組換えDNA分子を形成させるために代表的に用いられるDNAリガーゼを使用する連結反応によるホスホジエステル結合形成のための基質ではない。このようなオリゴヌクレオチドの連結が所望される場合、ホスフェートが、キナーゼおよびATPを使用するような標準的技術によって付加され得る。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの3'末端は、一般に遊離ヒドロキシル基を有し、そしてリガーゼ（例えば、T4 DNAリガーゼ）の存在下で、別のポリヌクレオチド（例えば、別のオリゴヌクレオチド）の5'ホスフェートとともにホスホジエステル結合を容易に形成する。周知であるように、この反応は、所望である場合、連結の前に他のポリヌクレオチドの5'ホスフェートを除去することによって、選択的に阻止され得る。プラスミドは、本明細書中で一般に、当業者に馴染み深い標準的な命名慣習に従って、先行する小文字のｐおよび/またはそれに続く大文字および/または数字によって命名される。本明細書中に開示される開始プラスミドは、商業的に入手可能であるか、非制限的原則において公然に入手可能であるか、または周知の公開された手順の日常的な適用によって入手可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。本発明に従って用いられ得る多くのプラスミドならびに他のクローニングおよび発現ベクターは、当業者に周知であり、そして容易に入手可能である。さらに、当業者は、本発明における使用に適する任意の数の他のプラスミドを容易に構築し得る。本発明における、このようなプラスミド、ならびに他のベクターの特性、構築および使用は、本開示から当業者に容易に明白である。用語「ポリヌクレオチド」は、一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。これは、未改変のRNAまたはDNAあるいは改変されたRNAまたはDNAであり得る。従って、例えば、本明細書中で用いられるポリヌクレオチドは、とりわけ、１本鎖および２本鎖DNA、１本鎖および２本鎖領域の混合物であるDNA、１本鎖および２本鎖RNA、ならびに１本鎖および２本鎖領域の混合物であるRNA、１本鎖またはより代表的には、２本鎖あるいは１本鎖および２本鎖領域の混合物であり得るDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子をいう。さらに、本明細書中で用いられるポリヌクレオチドは、RNAまたはDNAあるいは RNAおよびDNAの両方を含む３本鎖領域をいう。このような領域における鎖は、同じ分子または異なる分子に由来し得る。これらの領域は、１以上の分子の全てを含み得るが、より代表的には、いくつかの分子の領域のみを含む。３重らせん領域の分子の１つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書中で用いる用語ポリヌクレオチドは、１以上の改変塩基を含む上記のようなDNAまたはRNAを含む。従って、安定性または他の理由のために改変された骨格を有するDNAまたはRNAは、この用語が本明細書中で意図されるような「ポリヌクレオチド」である。さらに、ほんの２つの例を挙げれば、イノシンのような通常ではない塩基、またはトリチル化塩基のような改変塩基を含むDNAまたはRNA は、この用語が本明細書中で用いられるようなポリヌクレオチドである。種々の改変が、当業者に公知の多くの有用な目的に役立つDNAおよびRNAに行われていることが理解される。本明細書中で用いられるような用語ポリヌクレオチドは、このような化学的、酵素学的または代謝的に改変された形態のポリヌクレオチド、ならびにとりわけウイルスおよび細胞（単細胞および多細胞を含む）に特徴的である化学形態のDNAおよびRNAを含む。本明細書中で用いられる用語「ポリペプチド」は、下記のようなポリペプチドの全てを含む。ポリペプチドの基本構造は、周知であり、そして当該分野の無数の教科書および他の刊行物に記載されている。これに関連して、この用語は、本明細書中では、ペプチド結合によって直鎖状に互いに結合した２以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を意味するように用いられる。本明細書中で用いられるように、この用語は、短い鎖（これはまた、当該分野で一般に、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと呼ばれる）および長い鎖（これは当該分野で一般にタンパク質と呼ばれ、多くの型が存在する）の両方をいう。ポリペプチドが、20の天然に存在するアミノ酸と一般に呼ばれる20のアミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含有すること、および多くのアミノ酸（末端のアミノ酸を含む）が、天然のプロセス（例えば、プロセシングおよび他の翻訳後改変）、ならびに当該分野で周知である化学的改変技術のいずれかによって所定のポリペプチドにおいて改変され得ることが理解される。ポリペプチドにおいて天然に存在する一般的な改変でさえ、余りにも多くて本明細書中に完全に列挙し得ないが、それらは、基本的教科書、およびより詳細な論文、ならびに多数の研究文献に十分に記載されており、そしてそれらは当業者に周知である。本発明のポリペプチド中に存在し得る既知の改変の中には、少数の例を挙げれば、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合性の付着、ヘム部分の共有結合性の付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合性の付着、脂質または脂質誘導体の共有結合性の付着、ホスファチジルイノシトール(p hosphotidylinositol)の共有結合性の付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、共有結合性架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーRNA媒介性付加（例えば、アルギニル化）、およびユビキチン結合が存在する。このような改変は当業者に周知であり、そして科学文献に非常に詳細に記載されている。数種の特に一般的な改変、例えば、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のγ-カルボキシル化、水酸化，およびADP-リボシル化が、ほとんどの基本的教科書（例えば、Proteins‐Structure and Molecular Proper ties，第２版、T.E．Creighton，W.H．Freeman and Company，New York(1993)) に記載されている。この表題で多くの詳細な総説が入手可能である（例えば、Wo ld，F.，Posttranslational Protein Modifications:Perspectives and Prospec ts，1〜12頁、Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C．J ohnson，編、Academic Press，New York(1983):Seifterら、Analysis for prote in modifications and nonprotein cofactors．Meth.Enzymol.，182:626-646(19 90)およびRattanら、Protein Synthesis:Posttranslational Modifications and Aging，Ann．N.Y.Acad.Sci.，663:48-62(1992)により提供される総説）。周知であり、そして上記のように、ポリペプチドは、必ずしも完全に直鎖ではないことが理解される。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン結合の結果として分枝状であり得、そしてそれらは、一般に翻訳後事象（天然のプロセシング事象、および天然に生じないヒト操作によりもたらされる事象）の結果として分枝を有するかまたは有さない環状であり得る。環状、分枝状、および分枝した環状ポリペプチドは、同様に非翻訳の天然のプロセスおよび完全な合成法によって合成され得る。改変は、ポリペプチドの任意の場所に存在し得、これはペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む。実際、共有結合的改変による、ポリペプチドにおけるアミノ基またはカルボキシル基あるいは両方の妨害は、天然に存在するポリペプチドおよび合成ポリペプチドに共通であり、そしてこのような改変は、同様に、本発明のポリペプチド中に存在し得る。例えば、 E.coliにおいて作製されたポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質分解性プロセシングの前には、ほとんど必ずN-ホルミルメチオニンである。ポリペプチド中に存在する改変は、しばしば、それがどのように作製されるかに相関している。宿主においてクローン化された遺伝子を発現することによって作製されるポリペプチドに関して、例えば、大部分の改変の特性および程度は、宿主細胞の翻訳後改変能力およびポリペプチドアミノ酸配列中に存在する改変シグナルによって決定される。例えば、周知であるように、グリコシル化は、しばしば、E.coliのような細菌宿主において存在しない。従って、グリコシル化が所望である場合、ポリペプチドは、グリコシル化する宿主（一般に真核細胞）において発現されるべきである。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物細胞と同じ翻訳後グリコシル化を実行する。この理由のために、昆虫細胞発現系は、とりわけ、グリコシル化の天然のパターンを有する哺乳動物のタンパク質を効率的に発現させるために開発されている。同様の考慮が他の改変に適用される。同じ型の改変が、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じまたは異なる程度で存在し得る。さらに、所定のポリペプチドは、多くの型の改変を含有し得る。一般に、本明細書中で用いられるように、用語ポリペプチドは、このような改変の全て、特に宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現することによって合成されるポリペプチド中に存在する改変を含む。本明細書中で用いられるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの用語「改変体」は、それぞれ、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。この意味における改変体は、以下に記載されており、そして本開示中の他の場所で非常に詳細に記載されている。ポリヌクレオチド改変体は、ヌクレオチド配列において、別の基準ポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドである。一般に、差異は、基準と改変体とのヌクレオチド配列が全体にわたって緊密に類似しており、そして多くの領域で同一であるように限定される。以下に記載されるように、改変体のヌクレオチド配列における変化は、サイレントであり得る。すなわち、それらは、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を変化し得ない。変化が、この型のサイレント変化に限定される場合、改変体は、基準と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。以下に記載されるように、改変体のヌクレオチド配列における変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化し得る。このようなヌクレオチド変化は、以下に考察されるように、基準配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠損、融合および切断を生じ得る。ポリペプチド改変体は、アミノ酸配列において、別の基準ポリペプチドとは異なるポリペプチドである。一般に、差異は、基準と改変体との配列が、全体に亘って緊密に類似しており、そして多くの領域で同一であるように限定される。改変体および基準ポリペプチドは、１以上の置換、付加、欠損、融合および切断によってアミノ酸配列において異なり得、これらは任意の組み合わせで存在し得る。本明細書中で用いられる用語「レセプター分子」は、本発明のTNFδまたはTNF εポリペプチドと特異的に結合または相互作用する分子をいい、これには、古典的レセプター（これらが好ましい）のみならず、本発明のポリペプチドと特異的に結合または相互作用する他の分子もまた含まれる（これらはまた、それぞれ、「結合分子」および「相互作用分子」、そして「TNFδ結合分子」および「TNFδ 相互作用分子」または「TNFε結合分子」および「TNFε相互作用分子」と呼ばれる）。本発明のポリペプチドとこのような分子（レセプターあるいは結合分子または相互作用分子を含む）との間の結合は、本発明のポリペプチドに独占的であり得る（これは非常に高度に好ましい）か、または本発明のポリペプチドに対して高度に特異的であり得る（これは高度に好ましい）か、または本発明のポリペプチドを含むタンパク質の群に高度に特異的であり得る（これは好ましい）か、または少なくとも１つの群が本発明のポリペプチドを含む、タンパク質のいくつかの群に特異的であり得る。発明の詳細な説明本発明は、とりわけ、以下に非常に詳細に記載されるような、新規のTNFδおよびTNFεポリペプチドに関する。特に、本発明は、アミノ酸配列相同性によってTNFリガンドスーパーファミリーに関連するポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、図１に示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するTNFδ、およびATCC受託番号97377のヒトcDNAのTNFヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関する。本発明はまた、特に、図２に示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するTNFε、およびATCC受託番号97457のヒトcDNAのTNFε ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関する。これらの寄託物は、本明細書中で以降、寄託クローンまたは「寄託クローンのcDNA」と呼ばれる。図１および２に示されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、寄託クローンのヒトcDNAを配列決定することによって得られたことが理解される。従って、これらの２つの間の任意の矛盾に関しては、寄託クローンの配列が支配しており、そして図１および２の配列に対する任意の言及は、寄託クローンのヒトcDNAの配列に対する言及を含む。本発明の１つの局面に従って、図１および２の推定アミノ酸配列を有するTNF δおよびTNFεポリペプチドをコードする単離されたポリペプチドが提供される。図１に示されるポリヌクレオチド配列のような本明細書中に提供される情報を用いて、ヒトTNFδポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、開始物質としてヒト組織の細胞由来のmRNAを用いてcDNAをクローニングするための手順）を用いて入手され得る。本発明の実例として、図１に示されるポリヌクレオチドは、ヒト心臓組織の細胞に由来するcDNAライブラリーにおいて発見された。本発明のヒトTNFδは、寄託されたクローンにおけるヒトTNFδをコードするcD NAの配列決定の結果によって示されるように、TNFリガンドスーパーファミリーの他のタンパク質に構造的に関連する。このようにして得られたcDNA配列を、図１に示す。これは、推定分子量約25.871kDaを有する約233アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、公知のタンパク質のうち、TNFαに最も高い相同性を示す。図１のTNFδの全アミノ酸配列は、TNFαのアミノ酸配列に対して約38％の同一性を有する。ヒトTNFεポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、開始物質としてのヒト組織の細胞由来のmRNAを用いてcDNAをクローニングするためのもの）を用いて得られ得る。本発明の例示として、図２に示されるポリヌクレオチドは、ヒト心臓組織の細胞由来のcDNAライブラリーから発見された。本発明のヒトTNFεは、寄託されたクローンにおけるヒトTNFεをコードするcD NAの配列決定の結果によって示されるように、TNFリガンドスーパーファミリーの他のタンパク質に構造的に関連する。このようにして得られたcDNA配列を、図２に示す。TNFε配列は、図１に示されるTNFδの配列とほとんど同一であり、最初の50アミノ酸およびアミノ酸86からアミノ酸92を含むTNFδの領域を含まない。従って、TNFεは、TNFδのスプライシング改変体である。TNFεは、168アミノ酸残基を含み、そして図２の配列は、Ｎ-末端疎水性領域を全く含まないTNFεの成熟タンパク質を示す。このタンパク質は、TNFαに対して最も高い相同性を示す。図２のTNFεは、TNFαのアミノ酸配列に対して約20％の同一性を有する。本発明のポリヌクレオチドは、mRNAのようなRNAの形態、またはDNAの形態（例えば、クローニングによって得られるか、または化学合成技術によって産生されるか、あるいはそれらの組合せによるcDNAおよびゲノムDNAを含む）であり得る。DNAは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖DNAは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは非コード鎖（アンチセンス鎖ともいわれる）であり得る。ポリペプチドをコードするコード配列は、図１および２に示すポリヌクレオチドのコード配列に同一であり得る。これはまた、遺伝子コードの縮退（縮重）の結果として、図１および図２のDNAのポリヌクレオチドをコードする異なる配列を有するポリヌクレオチドであり得る。図１および図２のポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、以下を含み得るがこれらに限定されない：成熟ポリペプチドのコード配列それ自体；成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなるコード配列（例えば、プレ-またはプロ-またはプレプロ-タンパク質配列のようなリーダー配列または分泌配列をコードする配列）；前述のさらなるコード配列を含むかまたは含まない成熟ポリペプチドのコード配列、ならびにさらなる非コード配列（例えば、イントロンならびに転写、mRNAプロセシング（例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む）、リボソーム結合、およびmRNAの安定性において役割を果たす転写された非翻訳配列のような非コード5'および3'配列；さらなる機能性を提供するアミノ酸のようなさらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列。従って、例えば、ポリペプチドはペプチドのようなマーカー配列に融合され得、これにより、融合されたポリペプチドの精製を容易にする。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、マーカー配列は、とりわけpQEベクター（Q iagen，Inc.）において提供されるタグのようなヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くが市販されている。Gentzら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，86:821-8 24(1989)に記載されるように、例えばヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。HAタグは、例えば、Wilsonら、Cell，37:767(1984)に記載されているインフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する。上記に従って、本明細書中で用いられる用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、本発明のポリペプチド、特に図１および図２に示すアミノ酸配列を有するヒトTNFδおよびTNFεをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。この用語は、コードおよび/または非コード配列をもまた含み得るさらなる領域とともに、（例えば、イントロンによって中断された）ポリペプチドをコードする単一の連続する領域または非連続的領域を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明は、図１および２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体にさらに関する。ポリヌクレオチドの改変体は、天然に存在する対立遺伝子改変体のような天然に存在する改変体であり得るか、または天然に存在することが知られていない改変体であり得る。このような天然に存在しないポリペプチドの改変体は、ポリヌクレオチド、細胞、または生物に適用される技術を含む変異誘発技術によってなされ得る。この点に関する改変体には、上記のポリヌクレオチドとはヌクレオチド置換、欠失、または付加において異なる改変体がある。置換、欠失、または付加は、１つ以上のヌクレオチドを包含し得る。改変体はコードもしくは非コード領域またはその両方における変更であり得る。コード領域における変更は、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を生成し得る。この点に関して本発明の特に好ましい実施態様には、図１および２に示すTNF δおよびTNFεのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；その改変体、アナログ、誘導体、およびフラグメント、ならびに改変体、アナログ、および誘導体のフラグメントがある。この点に関してさらに特に好ましいものは、数個の、いくつかの、５〜10個の、１〜５個の、１〜３個の、２個の、１個の、または０個のアミノ酸残基が、任意の組合せで置換、欠失、または付加されている、図１および図２のTNFδおよびT NFεポリペプチドのアミノ酸配列を有するTNFδおよびTNFεをコードするポリヌクレオチドである。これらのうちで特に好ましいものは、サイレント置換、付加、および欠失であり、これらはTNFδおよびTNFεの特性および活性を変更しない。この点に関してまた特に好ましいものは、保存的置換である。最も高度に好ましいものは、図１および図２のアミノ酸配列を置換無しで有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明のさらに好ましい実施態様は、図１および２に示すアミノ酸配列を有するTNFδおよびTNFεポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも70％同一であるポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。あるいは、最も高度に好ましいものは、TNFδおよびTNFεポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも80％同一である領域を含むポリヌクレオチド、およびそれに相補的なポリヌクレオチドである。この点に関して、TNFδおよびTNFεポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも90％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、これらの特に好ましいポリヌクレオチドのうち、少なくとも 95％の同一性を有するものが特に好ましい。さらに、少なくとも95％の同一性を有するもののうち、少なくとも97％同一性を有するものが高度に好ましく、そしてこれらのうち少なくとも98％および少なくとも99％同一性を有するものが特に高度に好ましく、少なくとも99％同一性を有するものがより特に好ましい。この点に関する特に好ましい実施態様は、さらに、図１および２のcDNAによってコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明はさらに、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関して、本発明は特に、ストリンジェントな条件下で本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられるように、用語「ストリンジエントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間の塩基の少なくとも95％そして好ましくは少なくとも97％が相補的（例えば、G:C;A:T）である場合に起こることを意味する。本発明のポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書中においてさらに議論されるように、例えば、上述の本発明のポリヌクレオチドは、cDNAおよびゲノムDN Aについてのハイブリダイゼーションプローブとして、TNFδおよびTNFεをコードする全長cDNAおよびゲノムクローンを単離するため、そしてヒトTNFδおよびT NFε遺伝子に対して高い配列類似性を有する他の遺伝子のcDNAおよびゲノムクローンを単離するために用いられ得る。このようなプローブは一般に少なくとも15 個の塩基を含む。好ましくは、このようなプローブは少なくとも30塩基を有し、そして少なくとも50塩基を有し得る。例えば、TNFδおよびTNFε遺伝子のコード領域は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために、公知のDNA配列を用いたスクリーニングによって単離され得る。次いで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドは、ヒトcDNA、ゲノムDNA、またはmRNAのライブラリーをスクリーニングするために用いられ、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかが決定される。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、特に本明細書中でポリヌクレオチドアッセイに関してさらに議論されるように、ヒト疾患に対する処置および診断の発見のための研究試薬および材料として利用され得る。ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質であるポリペプチドおよびさらなるアミノ末端もしくはカルボキシル末端アミノ酸、または成熟ポリペプチドに対して内部のアミノ酸（例えば、成熟形態が１つより多いポリペプチド鎖を有している場合）をコードし得る。このような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態までのタンパク質のプロセシングにおいて役割を果たし得るか、タンパク質トラフィッキングを容易にし得るか、タンパク質の半減期を延長もしくは短縮し得るか、またはアッセイもしくは産生のためのタンパク質の操作を容易にし得る。インサイチュの場合に一般的であるが、さらなるアミノ酸が、細胞性酵素によって成熟タンパク質とは離れてプロセシングされ得る。１つ以上のプロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は、ポリペプチドの不活性な形態であり得る。プロ配列が除去される場合、このような不活性な前駆体は、一般に活性化される。プロ配列のいくつかまたは全ては、活性化前に除去され得る。一般に、このような前駆体はプロタンパク質と呼ばれる。まとめると、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、成熟タンパク質およびリーダー配列（これは、プレタンパク質と呼ばれ得る）、プレタンパク質のリーダー配列ではない１つ以上のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列および１つ以上のプロ配列（これらは一般に、ポリペプチドの活性でかつ成熟した形態を産生するプロセシング工程の間に除去される）を有するプレプロタンパク質（これはプロタンパク質に対する前駆体である）をコードし得る。ヒトTNFδおよびヒトTNFEεDNAを含有する寄託物は、上記のように、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。また上記のように、cDNA寄託物は、本明細書中で「寄託されたクローン」または「寄託されたクローンのcD NA」といわれる。クローンは1995年12月８日および1996年３月１日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland 20852 USAに寄託され、そしてそれぞれATCC受託番号第97377号および第97457号を割り当てられた。寄託された物質は、全長TNFδおよびTNFεヒトcDNAを含むpB luescript SK(-)プラスミド(Stratagene，La Jolla，CA)である。寄託は、特許手順の目的のための微生物の寄託の国際的認識の上にBudapest条約の規約の下になされた。株は、特許権の発行と同時に、変更不能にそして制限または条件なしに公衆に開放される。寄託物は、単に当業者に対する利便性としてのみ提供され、寄託物が米国特許法第112条のもとに要求されるような特許可能性のために要求されるという許可ではない。寄託された物質に含まれるポリヌクレオチドの配列、およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中の配列の任意の記載とのいかなる対立の事象においても管理される。寄託された物質を作製したり、使用したり、または販売するためには、ライセンスが必要とされ得、そしていかなるこのようなライセンスもここでは与えられない。本発明はさらに、図１および２の推定アミノ酸配列を有するヒトTNFδおよびT NFεポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドであり得る。特定の好ましい実施態様において、それは組換えポリペプチドである。本発明はまた、これらのポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１および２のポリペプチドをいう場合、このようなポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログは、プロタンパク質部分の切断によって活性化され、活性な成熟ポリペプチド産生し得るプロタンパク質を含む。図１および２のポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、以下のものであり得る：（i）1つ以上のアミノ酸残基が、保存されたアミノ酸残基もしくは非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによってコードされたものであり得るかもしくはあり得ないもの、あるいは（ii）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは（iii）成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を増大させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物に融合されたもの、あるいは（iv）さらなるアミノ酸が成熟ポリペプチド（例えば、リーダー配列、もしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に使用される配列）に融合されたもの。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の技術範囲内にあると考えられる。この点に関して本発明の特に好ましい実施態様には、図１および２に示される TNFδおよびTNFεのアミノ酸配列を有するポリペプチド、その改変体、アナログ、誘導体、およびフラグメント、ならびにそのフラグメントの改変体、アナログ、および誘導体がある。あるいは、この点に関して特に好ましい本発明の実施態様は、寄託されたクローンにおけるヒトcDNAのTNFδおよびTNFεのアミノ酸配列を有するポリペプチド、その改変体、アナログ、誘導体、およびフラグメント、ならびにそのフラグメントの改変体、アナログ、および誘導体である。好ましい改変体には、保存的アミノ酸置換が参照と異なる改変体がある。このような置換は、ポリペプチドの所定のアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸で置換する置換である。保存的置換として代表的に観察されるものは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、Leu、およびIleの間での互いの置換；ヒドロキシル残基Ser およびThrの置換、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基AsnとGlnとの間での置換、塩基性残基LysおよびArgの交換、ならびに芳香族残基Phe、Tyrの間での置換である。この点に関してさらに特に好ましいものは、図１および２のTNFδおよびTNFε ポリペプチドのアミノ酸配列、または寄託されたクローンにおけるcDNAのアミノ酸配列を有する改変体、アナログ、誘導体、およびフラグメント、ならびにそのフラグメントの改変体、アナログ、および誘導体であり、ここでは数個の、いくつかの、５〜10個の、１〜５個の、１〜３個の、２個の、１個の、または０個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換されたり、欠失されたり、または付加されている。これらのうちで特に好ましいものは、TNFδおよびTNFεの特性および活性を変更しないサイレント置換、付加、および欠失である。この点に関してまた特に好ましいものは、保存的置換である。最も高度に好ましいものは、置換なしで図１および２のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは均一にまで精製される。本発明のTGFδポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに配列番号２のポリペプチドに少なくとも70％の類似性（好ましくは少なくとも70％の同一性）、そしてより好ましくは配列番号２のポリペプチドに少なくとも90％の類似性（より好ましくは少なくとも90％の同一性）、そしてなお好ましくは配列番号２のポリペプチドに少なくとも95％の類似性（より好ましくは少なくとも95％の同一性）を有するポリペプチドを含み、そしてまたこのようなポリペプチドの部分であって、ポリペプチドのこのような部分が、一般に少なくとも30アミノ酸およびより好ましくは少なくとも50アミノ酸を含有するものを含む。本発明のTGFεポリペプチドは、配列番号４のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに配列番号４のポリペプチドに少なくとも70％の類似性（好ましくは少なくとも70％の同一性）、そしてより好ましくは配列番号４のポリペプチドに少なくとも90％の類似性（より好ましくは少なくとも90％の同一性）、そしてなお好ましくは配列番号４のポリペプチドに少なくとも95％の類似性（より好ましくは少なくとも95％の同一性）を有するポリペプチドを含み、そしてまたこのようなポリペプチドの部分であって、ポリペプチドのこのような部分が、一般に少なくとも30アミノ酸およびより好ましくは少なくとも50アミノ酸を含有するものを含む。当該分野で公知のように、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第二のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、対応する全長ポリペプチドをペプチド合成によって産生するために使用され得る；それゆえ、フラグメントは、全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために用いられ得る。フラグメントは、前述のTNFδおよびTNFεポリペプチドおよびそれらの改変体または誘導体のアミノ酸配列の部分であるが全てではない配列に完全に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このようなフラグメントは、「フリースタンディング」（すなわち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部ではなくまたは融合されていない）であり得、またはそれらは、それらが一部もしくは領域を形成するより大きなポリペプチド内に含まれ得る。より大きなポリペプチド内に含まれた場合、現在議論されているフラグメントは、最も好ましくは単一の連続する領域を形成する。しかし、いくつかのフラグメントは単一のより大きなポリペプチド内に含まれ得る。例えば、特定の好ましい実施態様は、異種プレおよびプロポリペプチド領域がTNFδおよびTNFεフラグメントのアミノ酸末端に融合され、そしてさらなる領域がそのフラグメントのカルボキシル末端に融合された、宿主内での発現のために設計された前駆体ポリペプチド内に含まれる本発明のTNFδおよびTNFεポリペプチドのフラグメントに関する。それゆえ、本明細書中で意図する意味の１つの局面におけるフラグメントは、TNFδおよびTNFεに由来する融合ポリペプチドまたは融合タンパク質の部分をいう。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例として、約30〜約233アミノ酸を有するフラグメントが言及され得る。この文脈において、「約」は、特に示された範囲、および数個、いくつか、５、４、３、２、または１個のアミノ酸だけいずれかの極限でまたは両方の極限でより大きいかまたはより小さい範囲を含む。例えば、この文脈での約100〜233アミノ酸は、100±数個、いくつか、５、４、３、２、または１個のアミノ酸から233±数個、いくつか、５、４、３、２、または１個のアミノ酸残基（すなわち100マイナス数個のアミノ酸〜233プラス数個のアミノ酸までの広さから、100プラス数個のアミノ酸〜233マイナス数個のアミノ酸までの狭さまで）のポリペプチドフラグメントを意味する。この点において非常に好ましいのは、いずれかまたは両方の端の値（extreme ）に５アミノ酸程度の増減を含む示した範囲（recited range）である。特に非常に好ましいのは、いずれかまたは両方の端の値に３アミノ酸程度の増減を含む示した範囲である。とりわけ特に非常に好ましいのは、いずれかまたは両方の端の値に１アミノ酸の増減を含む示した範囲、あるいは付加または欠失を伴わない示した範囲である。この点においてとりわけ最も非常に好ましいのは、約15〜約 233アミノ酸のフラグメントである。本発明のとりわけ好ましいフラグメントの中には、TNFδおよびTNFεの切断変異体がある。切断変異体は、アミノ末端を含む連続する一連の残基（すなわち、連続する領域、一部、または部分）またはカルボキシル末端を含む連続する一連の残基の欠失、あるいは、二重切断変異体のように、２つの連続する一連の残基（１つはアミノ末端を含み、そして１つはカルボキシル末端を含む）の欠失を除く、図１もしくは２のアミノ酸を有するTNFδおよびTNFεポリペプチド、またはその改変体もしくは誘導体を包含する。上記サイズ範囲を有するフラグメントもまた、切断フラグメントの好ましい実施態様であり、これは一般的にフラグメントの中でとりわけ好ましい。また、本発明のこの局面において好ましいのは、TNFδおよびTNFεの構造または機能属性によって特徴づけられるフラグメントである。この点において本発明の好ましい実施態様では、TNFδおよびTNFεのαヘリックスおよびαヘリックス形成領域（「α領域」）、βシートおよびβシート形成領域（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可動部、表面形成領域、ならびに高抗原性指標領域を含むフラグメントを包含する。これらの点における特定の好ましい領域は、TNFδについては図４およびTNFε については図５に示され、図１および２に示されるアミノ酸配列の分析によって同定された前述の型の領域を含むが、これに限定されない。図４および５に示されるように、このような好ましい領域は、Garnier-Robson α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域、Chou-Fasman α領域、β領域およびターン領域、Ky te-Doolittle親水性領域および親水性領域、Eisenberg αおよびβ両親媒性領域、Karplus-Schulz可動部、Emini表面形成領域、ならびにJameson-Wolf高抗原性指標領域を包含する。この点において非常に好ましいフラグメントの中には、いくつかの構造的特徴（例えば、上記に示されるいくつかの特徴）を組み合わせるTNFδおよびTNFεの領域を含むものがある。この点において、図１、２、４、および５のシグナルペプチド領域に続く残基によって規定される領域（これらは全て、ターン領域、親水性領域、可動部、表面形成領域、および高抗原性指標領域に非常に特徴のあるアミノ酸組成によって特徴づけられる）は、とりわけ非常に好ましい領域である。このような領域は、より大きなポリペプチド内に含まれ得るか、または上記で議論されたように、本発明の好ましいフラグメント自身であり得る。この段落(par agraph)で用いられる用語「約(about)」は、一般的に、フラグメントに関して上述の意味を有すると理解される。さらに好ましい領域は、TNFδおよびTNFε活性を媒介するものである。この点において最も非常に好ましいのは、TNFδおよびTNFεの化学的、生物学的、または他の活性を有するフラグメントであり、これは、同様の活性もしくは改良された活性、または減少した所望でない活性を有するものを含む。この点において非常に好ましいのは、配列もしくは位置または両方の配列において、そして関連したポリペプチド（例えば、図３に示される関連したポリペプチド）の活性領域に対して相同である領域を含むフラグメントであり、これは、ヒトTNFαおよびβ を含む。この点において特に好ましいフラグメントの中には、上記のような切断変異体がある。本発明はまた、とりわけ、前述のフラグメントをコードするポリヌクレオチド、フラグメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（特に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするもの）、およびフラグメントをコードするポリヌクレオチドを増幅するためのポリヌクレオチド（例えば、PCRプライマー）に関することが理解される。これらの点において、好ましいポリヌクレオチドは、上述のような好ましいフラグメントに相当するものである。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを組み込み、そして本発明のポリペプチドを発現するように遺伝子操作され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション、および形質転換の周知技術を用いて、宿主細胞に導入され得る。ポリヌクレオチドは、単独または他のポリヌクレオチドと組み合わせて導入され得る。このような他のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドに独立して導入され得るか、同時導入され得るか、または結合させて導入され得る。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、哺乳動物細胞における同時トランスフェクションおよび選択のための標準的な技術を用いて、選択可能なマーカーをコードする別の別個のポリヌクレオチドとともに宿主細胞にトランスフェクトされ得る。この場合、ポリヌクレオチドは、一般的に、宿主細胞ゲノムに安定して組み込まれる。あるいは、ポリヌクレオチドは、宿主中で増殖するための選択可能なマーカーを含むベクターに結合され得る。ベクター構築物は、前述の技術によって宿主細胞に導入され得る。一般的には、プラスミドベクターは、沈殿物（例えば、リン酸カルシウム沈殿）または荷電した脂質との複合体におけるDNAとして導入される。エレクトロポレーションもまた、ポリヌクレオチドを宿主に導入するために用いられ得る。ベクターがウイルスである場合、インビトロで封入され得るかまたはパッケージング細胞に導入され得、そして封入されたウイルスは、細胞に形質導入され得る。本発明のこの局面に従って、ポリヌクレオチドを作製するため、および細胞にポリヌクレオチドを導入するために適切な広範な種々の技術は当業者に周知であり、そして日常的である。このような技術は、Sambrookら（前掲）に完全に概説され、これはこれらの技術を詳述する多くのラボラトリーマニュアルの説明である。本発明のこの局面に従って、ベクターは、例えば、プラスミドベクター、一本鎖もしくは二本鎖ファージベクター、一本鎖もしくは二本鎖RN AまたはDNAウイルスベクターであり得る。このようなベクターは、細胞にDNAおよびRNAを導入するための周知技術によって、ポリヌクレオチド（好ましくは、D NA）として細胞に導入され得る。ベクター（ファージおよびウイルスベクターの場合）はまた、感染および形質導入のための周知技術によって、封入されたまたはキャプシド化されたウイルスとして細胞に導入され得、そして好ましくは導入される。ウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は一般的に、相補宿主細胞においてのみ生じる。ベクターの中で好ましいのは、特定の点において、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現のためのものである。一般的には、このようなベクターは、発現されるポリヌクレオチドに作動可能に連結された、宿主における発現に有効なシス作用制御領域を含む。適切なトランス作用因子は、宿主によって供給されるか、相補ベクターによって供給されるか、または宿主への形質導入の際のベクター自身によって供給されるかのいずれかである。この点において特定の好ましい実施態様では、ベクターは、特定の発現を提供する。このような特定の発現は、誘導性発現または細胞の特定の型においてのみの発現、あるいは誘導性および細胞特異的の両方であり得る。誘導性ベクターの中で特に好ましいのは、操作が容易な周囲の要因（例えば、温度および栄養添加物）によって発現が誘導され得るベクターである。本発明のこの局面に適切な種々のベクターは、原核生物および真核生物宿主における使用のための構成性および誘導性発現ベクターを含み、これは、当業者に周知であり、そして日常的に使用される。操作された宿主細胞は、従来の栄養培地で培養され得、これは、特に、プロモーターを活性化すること、形質転換体を選択すること、または遺伝子を増幅することに適切なように改変され得る。発現について選択された宿主細胞で以前に使用された培養条件（例えば、温度、pHなど）は、一般的に、当業者に明らかなように、本発明のポリペプチドの発現に適切である。非常に種々の発現ベクターは、本発明のポリペプチドを発現させるために用いられ得る。このようなベクターは、染色体、エピソーム、およびウイルス由来ベクターを包含する。例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染色体エレメント由来、バキュロウイルス、SV40のようなパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルスのようなウイルス由来のベクター、およびそれらの組合せ由来のベクター（例えば、コスミドまたはファージミドのようなプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝エレメント由来のもの）。これらは全て、本発明のこの局面による発現のために用いられ得る。一般的には、宿主においてポリペプチドを発現するためのポリヌクレオチドを、維持するか、増殖させるか、または発現するのに適切な任意のベクターが、この点において発現のために用いられ得る。適切なDNA配列は、任意の種々の周知および日常的な技術によって、ベクターに挿入され得る。一般的には、発現のためのDNA配列は、DNA配列および発現ベクターを１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで切断し、次いで、T4 DNAリガーゼを用いて共に制限フラグメントに結合することによって、発現ベクターに結合される。この目的に用いられ得る制限および連結のための手順は、当業者に周知であり日常的である。この点における適切な手順、および別の技術を用いて発現ベクターを構築するための適切な手順（これらもまた、当業者に周知であり日常的である）は、Sambrookら（本明細書中の他に引用される）に非常に詳細に示されている。発現ベクターのDNA配列は、適切な発現制御配列（単数または複数；例えば、m RNA転写を指向するプロモーターを含む）に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代表としては、λファージPLプロモーター、E．coli lac、trpおよびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスLTRのプロモーターが挙げられ、周知のプロモーターのうちほんの少数を挙げる。本発明のこの局面に用いられるのに適切である、述べられていない多数のプロモーターが周知であり、そして本明細書中の議論および実施例によって例示される様式で当業者によって容易に使用され得ることが理解される。一般的には、発現構築物は、転写開始および終止のための部位を含み、そして転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、開始部に転写開始AUG、および翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置した終止コドンを含む。さらに、構築物は、発現を調節ならびに発生させる制御領域を含み得る。一般的には、多くの通常実施される手順に従って、このような領域は転写を制御することによって作動する（例えば、特に、リプレッサー結合部位およびエンハンサー）。増殖および発現のためのベクターは、一般的に、選択可能なマーカーを含む。このようなマーカーはまた、増幅に適切であり得るか、またはこのベクターは、この目的のためのさらなるマーカーを含み得る。この点において、発現ベクターは、好ましくは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性を提供する。好ましいマーカーとしては、真核生物細胞培養物のためのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびE．coliおよび他の細菌を培養するためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。本明細書中の他に記載のような適切なDNA配列、ならびに適切なプロモーター、および他の適切な制御配列を含むベクターは、所望のポリペプチドのその中における発現に適切な種々の周知技術を用いて、適切な宿主に導入され得る。適切な宿主の代表例としては、E.coli、Streptomyces、およびSalmonella typhimuri um細胞のような細菌細胞；酵母細胞のような真菌細胞；Drosophila S2およびSpo doptera Sf9細胞のような昆虫細胞；CHO、COS、およびBowes黒色腫細胞のような動物細胞；および植物細胞が挙げられる。種々の発現構築物のための宿主は周知であり、そして当業者は、本開示によって、本発明のこの局面に従うポリペプチドを発現するための宿主を容易に選択し得る。より詳細には、本発明はまた、発現構築物のような組換え構築物を含み、これは、上記の配列の１つ以上を含む。構築物は、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターを含み、これは、本発明のこのような配列に挿入される。配列は、正方向または逆方向に挿入され得る。この点において特に好ましい実施態様では、構築物は、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを含む）をさらに含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターは、当業者に公知であり、そして本発明における使用に適切な多くの市販のベクターが存在する。以下のベクターは、市販されており、実施例として提供される。細菌における使用に好ましいベクターの中には、Qiagenから入手可能なpQE70、pQE60およびpQ E9；Stratageneから入手可能なpBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescript ベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；およびPharmaciaから入手可能なpt rc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5がある。好ましい真核生物ベクターの中には、Stratageneから入手可能なpWLNEO、pSV2CAT、p0G44、pXTLおよびpSG ；ならびにPharmaciaから入手可能なpSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVLがある。これらのベクターは、多くの市販および周知のベクターの例示として単独で列挙され、本発明のこの局面による使用のために当業者には利用可能である。例えば、宿主における本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖、または発現に適切ないかなる他のプラスミドまたはベクターもが、本発明のこの局面において使用され得ることが理解される。プロモーター領域は、プロモーター領域を欠くレポーター転写単位（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「cat」）転写単位）を、候補プロモーターフラグメント（すなわち、プロモーターを含み得るフラグメント）を導入するための制限部位（単数または複数）の下流に含むベクターを用いて任意の所望の遺伝子から選択され得る。周知のように、cat遺伝子の上流の制限部位のプロモーター含有フラグメントのベクターへの導入は、CAT活性の産生を発生させ、これは、標準的なCATアッセイによって検出され得る。この目的に適切なベクターは、周知であり、そして容易に入手可能である。このような２つのベクターは、pKK232-8およびpCM7である。従って、本発明のポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターは、周知で容易に入手可能なプロモーターだけでなく、前述の技術によって、レポーター遺伝子を用いて容易に得られ得るプロモーターもまた含む。本発明によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適切な公知の細菌プロモーターの中には、E．coli laclおよびlacZおよびプロモーター、T3および T7プロモーター、gptプロモーター、λPR、PLプロモーター、ならびにtrpプロモーターがある。この点において適切な公知の真核生物プロモーターの中には、CM V即時初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV 40プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（「RSV」）のようなレトロウイルスLTRのプロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン-Iプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターがある。宿主細胞における発現のための適切なベクターおよびプロモーターの選択は、周知の手順であり、そしてベクター構築物の発現、宿主へのベクターの導入、および宿主における発現のために不可欠な技術は、当業者には日常的である。本発明はまた、上記で議論された上記の構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核生物細胞、または酵母細胞のような下等真核生物細胞であり得るか、あるいは宿主細胞は、細菌細胞のような原核生物細胞であり得る。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE -デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によって行われ得る。このような方法は、多くの標準的な実験室マニュアル（例えば、Davi sら、Basic Methods in Molecular Biology，(1986)）に記載される。宿主細胞中の構築物は、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を産生する従来の方法において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチドシンセサイザーによって合成的に産生され得る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で、適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物由来のRNAを用いてこのようなタンパク質を産生するために使用され得る。原核生物および真核生物宿主での使用のための適切なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y．(1989)によって記載される。一般的には、組換え発現ベクターは、複製起点、下流の構造配列の転写を指向する高発現遺伝子由来のプロモーター、およびベクターに曝露した後のベクター含有細胞の単離を可能にする選択可能なマーカーを含む。適切なプロモーターの中には、特に、糖化酵素（例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（「PGＫ」））、a-因子、酸ホスファターゼ、および熱ショックタンパク質をコードする遺伝子由来のものがある。選択可能なマーカーは、E．coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS．cerevlsiaeのtrpl遺伝子を包含する。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増大され得る。エンハンサーは、通常は約10〜300bpのDNAのシス作用エレメントであり、与えられた宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大させるように作用する。エンハンサーの例としては、SV40エンハンサー（bp100〜270位の複製起点の後期側に位置する）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。本発明のポリペプチドの異種構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチドは、一般的に、それが発現のためのプロモーターに作動可能に連結されるように、標準的な技術を使用してベクターに挿入される。ポリヌクレオチドは、転写開始部位がリボソーム結合部位の5'に適切に位置されるように、配置される。リボソーム結合部位は、発現されるべきポリペプチドの翻訳を開始するAUGの5'である。一般的に、開始コドン（通常、AUG）で開始する他のオープンリーディングフレームは存在せず、そしてリボソーム結合部位と開始AUGとの間に位置される。また、一般的に、ポリペプチドの末端に翻訳停止コドンが存在し、そして転写された領域の3'末端に適切に配置されたポリアデニル化シグナルおよび転写末端シグナルが存在する。小胞体の内腔、周辺腔、または細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌のために、適切な分泌シグナルが、発現されるポリペプチドへ組み込まれ得る。シグナルはポリペプチドに対して内因性であり得るか、またはそれらは異種のシグナルであり得る。ポリペプチドは、改変された形態（例えば、融合タンパク質）で発現され、そして分泌シグナルだけでなくさらなる異種の機能性領域も含み得る。従って、例えば、さらなるアミノ酸（特に変更されたアミノ酸）の領域は、精製の間またはその後の取扱いおよび保管の間の、宿主細胞における安定性および持続性を改良するためにポリペプチドのN末端に付加され得る。また、領域は、精製を容易にするためにポリペプチドに添加され得る。このような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を引き起こすため、安定性を改良するため、および精製を容易にするための、ポリペプチドへのペプチド部分の付加は、当該分野において、良く知られておりかつ日常的な技術である。本発明に従う、増殖、維持、またはポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適切な原核生物宿主には、Escherichia coli、Bacillus subtilis、およびS almonella typhimuriumが挙げられる。Pseudomonas、Streptomyces、およびStap hylococcusの種々の種は、この点において適切な宿主である。さらに、当業者に公知である多くの他の宿主もまた、この点において使用され得る。代表的であるが非限定的な例として、細菌の使用のための有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝因子を含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含み得る。このような市販のベクターには、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala ,Sweden)およびGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)が挙げられる。これらのpBR322「骨格(backbone)」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。以下の適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖（ここで、選択されたプロモーターは、誘導性である）は、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導剤への曝露）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。次いで、細胞は、代表的には、遠心分離により収集され、物理的または化学的手段により破壊され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために維持される。タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、任意の簡便な方法（凍結-解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む）により破壊され得、これらの方法は当業者に周知である。種々の哺乳動物細胞培養系が、同様に発現のために使用され得る。哺乳動物発現系の例には、Gluzmanら、Cell,23:175(1981)に記載されるサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株が挙げられる。適合性のベクターを発現し得る他の細胞株には、例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、ヒト腎臓293およびBHK細胞株が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサーを含み、そしてまた任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー、およびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに5'隣接非転写配列（これらは発現のために必要である）を含む。この点における特定の好ましい実施態様において、SV40スプライス部位由来のDNA配列およびSV40ポリアデニル化部位は、これらのタイプの必要とされる非転写の遺伝的エレメントのために使用される。本発明のポリペプチドは回収され、そして周知の方法（硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む）により組換え細胞培養物から精製される。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）が精製のために使用される。タンパク質のリフォールディングのための周知の方法は、ポリペプチドが単離および精製の間に変性された場合に、活性コンフォメーションを再生するために使用され得る。本発明のポリペプチドには、天然の精製産物、化学的合成手順の産物、および組換え技術により原核生物または真核生物宿主（例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から産生される産物が挙げられる。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもよいし、またはグリコシル化されなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒介性プロセスの結果のようないくつかの場合において、開始改変メチオニン残基を含み得る。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、種々の適用（特にTNFδおよびTNFεの化学的および生物学的特性を利用する適用）のために本発明に従って使用され得る。これらには、形質転換細胞株のアポトーシス、細胞活性化および増殖の媒介、ならびに免疫調節抗菌剤、抗ウイルス剤、および病原に対する炎症応答感受性の一次メディエーターにおける適用がある。さらなる適用は、細胞、組織および生物の障害の診断および処置に関する。本発明のこれらの局面は、以下の考察によりさらに説明される。本発明はまた、相補的なポリヌクレオチドを検出するための本発明のポリヌクレオチドの使用（例えば、診断試薬としての）に関する。機能障害に関連する本発明のポリペプチドの変異形態の検出は、本発明のポリペプチドの過小発現、過剰発現、または変化した発現から生じる疾患（例えば、腫瘍のような新生物形成）または疾患への感受性の診断を加えるかまたは規定し得る診断ツールを提供する。本発明の遺伝子に変異を有する個体は、種々の技術によってDNAレベルで検出され得る。診断用の核酸は、患者の細胞（血液、尿、唾液、組織生検、および剖検材料）から得られ得る。ゲノムDNAは、直接検出に用いられ得るか、またはPCR を用いて分析前に酵素的に増幅され得る。PCR(Saikiら、Nature，324:163-166 1 986)。RNAまたはcDNAもまた、同様に用いられ得る。一例として、TNFδまたはTN Fεをコードする核酸に相補的であるPCRプライマーは、TNFδまたはTNFεの発現および変異を同定および分析するために用いられ得る。例えば、欠失および挿入は、増幅された産物の正常遺伝子型に比較した場合のサイズの変化によって検出され得る。点変異は、増幅されたDNAを放射性標識されたTNFδまたはTNFεのRNA あるいは放射性標識されたTNFδまたはTNFεのアンチセンスDNA配列にハイブリダイズさせることにより同定され得る。完全に適合した配列は、RNase A消化によりまたは融解温度の差により、ミスマッチした二重鎖から識別され得る。基準の遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の相違はまた、直接的DNA配列決定法により明らかにされ得る。さらに、クローン化DNAセグメントは、特定のDNAセグメントを検出するためのプローブとして用いられ得る。このような方法の感度は、PCRまたは別の増幅方法の適切な使用により大きく増強され得る。例えば、配列決定プライマーは、改変PCRによって生成された二本鎖PCR産物または一本鎖鋳型分子と共に使用される。配列決定は、放射能標識されたヌクレオチドを用いる従来の手順により、または蛍光タグを用いる自動配列決定手順により行われる。 DNA配列の差異に基づいた遺伝子試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるDNAフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により達成され得る。小さな配列欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動によって視覚化され得る。異なる配列のDNAフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルにおいて識別され得る。ここでゲル中の異なるDNAフラグメントの移動度は、それらの特異的融解温度または部分的融解温度に従って異なる位置でゲル内で遅れる（例えば、Myersら、Science，230:1242(1985)を参照のこと）。特定の位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、RNas e保護およびS1保護または化学的切断法（例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sc i.、83:4397-4401(1985))）により明らかにされ得る。従って、特定のDNA配列の検出は、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化学的切断、直接的DNA配列決定、または制限酵素の使用（例えば、制限断片長多型(RFLP)）およびゲノムDNAのサザンブロッティングのような方法によって達成され得る。より従来的なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はまた、インサイチュ分析によって検出され得る。本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識化試薬はほとんどない。本発明によるDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子との相関付けにおいて重要な第１工程である。この点における特定の実施態様において、本明細書中に開示されるcDNAは、本発明の遺伝子のゲノムDNAをクローニングするために使用される。これは、種々の周知の技術および一般に市販されているライブラリーを使用して達成され得る。ゲノムDNAは、この目的のための周知の技術を使用してインサイチュ染色体マッピングのために使用される。代表的には、染色体マッピングの日常的な手順に従う、いくつかの試みおよび誤りが、良好なインサイチュハイブリダイゼーションシグナルを与えるゲノムプローブを同定するために必要であり得る。いくつかの場合において、さらに、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を調製することにより染色体にマップされ得る。遺伝子の3'非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムDNA内で１より多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを本発明と共に使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式での大きなゲノムクローンのプールを用いて、部分的局在性の決定(sublocalization)が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識してフロー選別した (flow-sorted)染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる予備選択を包含する。 cDNAクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「FISH」）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、50または60ほどの短いcDNAを用いて使用され得る。この技術の総説については、Vermaら，Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques ，Pergamon Press，New York(1988)を参照のこと。一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝子地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V．M cKusick，Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University，Welch Me dical Libraryからオンラインで入手可能である)において見出される。次いで、同じ染色体領域にマップされる遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNA配列またはゲノム配列における差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたは全ての罹患個体に観察されるが、いずれの正常な個体にも観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であるようである。物理的マッピング技術および遺伝子マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガベースのマッピング解像度、および20kbあたり１遺伝子と仮定する）。本発明はまた、診断的アッセイ（例えば、細胞および組織における本発明のタンパク質のレベルを検出する（正常レベルおよび異常レベルの決定を含む）ための定量的および診断的アッセイ）に関する。従って、例えば、正常コントロール組織サンプルと比較した本発明のTNFタンパク質の過剰発現を検出するための、本発明に従う診断的アッセイは、例えば、新生物形成の存在を検出するために使用され得る。宿主由来のサンプルにおいてタンパク質（例えば、本発明のタンパク質）のレベルを決定するために使用され得るアッセイ技術は、当業者に周知である。このようなアッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、およびELISAアッセイが挙げられる。これらの中でELISAがしばしば好まれる。ELISAアッセイは、まず、本発明のタンパク質に特異的な抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を調製する工程を包含する。さらに、モノクローナル抗体に結合するレポーター抗体が、一般的に調製される。レポーター抗体は、検出試薬（例えば、放射性、蛍光性、または酵素的であり、本実施例においては西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素）に付着される。 ELISAアッセイを実施するために、サンプルが宿主から取り出され、そしてサンプル中でタンパク質と結合する固相支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意のフリーのタンパク質結合部位が、非特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）とインキュベートすることにより覆われる。次に、モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体がポリスチレンディッシュに付着した本発明の任意のタンパク質に付着する時間の間、ディッシュ中でインキュベートされる。非結合のモノクローナル抗体が、緩衝液で洗い出される。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したレポーター抗体がディッシュ中に置かれ、本発明のタンパク質に結合した任意のモノクローナル抗体へのレポーター抗体の結合が生じる。次いで、付着していないレポーター抗体が洗い出される。次いで、ペルオキシダーゼ活性のための試薬（比色定量基質が含まれる）がディッシュに添加される。一次および二次抗体を介して本発明のタンパク質に結合した固定されたペルオキシダーゼは、有色の反応産物を産生する。所定の時間において発色した色の量は、サンプル中に存在する本発明のタンパク質の量を示す。定量的な結果は、代表的には、検量線を参考にして得られる。競合アッセイが使用され得、ここで、固相支持体に付着した本発明のタンパク質に特異的な抗体および本発明の標識されたタンパク質ならびに宿主由来のサンプルが、固相支持体を通され(pass over)、そして固相支持体に付着して検出された標識の量がサンプル中の本発明のタンパク質の量と相関され得る。ポリペプチド、それらのフラグメント、もしくは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞が、それらに対する抗体を産生するための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を含む。当該分野で公知の種々の方法が、このような抗体およびフラグメントの産生のために使用され得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドの動物への直接注入か、またはポリペプチドの動物（好ましくは、非ヒト）への投与により得られ得る。次いで、そのように得られた抗体は、ポリペプチド自体へ結合する。このように、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえ、ネイティブなポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、ポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。モノクローナル抗体を調製するために、連続的な細胞株培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例には、ハイブリドーマ技術（Kohl er,G.およびMilstein,C.、Nature，256:495-497(1975)）、トリオーマ(trioma) 技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、Immunology Today，4:72(1983 )）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV-ハイブリドーマ技術( Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、77-96頁，Alan R.Liss,I nc．(1985)）が挙げられる。単鎖抗体の産生について記載される技術（米国特許第4,946,778号）は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を産生するために適合化され得る。また、トランスジェニックマウスまたは他の動物のような他の生物は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現するために使用され得る。上記の抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離するためかもしくは同定するために、またはアフィニティークロマトグラフィーによる単離および／または精製のための固相支持体へ抗体を吸着させることにより、本発明のポリペプチドを精製するために使用され得る。従って、本発明のポリペプチドは、新生物形成（例えば、腫瘍細胞増殖）を阻害するために使用され得る。本発明のポリペプチドは、アポトーシスおよび特定の細胞への細胞障害性を介して腫瘍の破壊を担い得る。本発明のポリペプチドはまた、接着細胞（例えば、LFA-1)のアップレギュレーションを誘導し、それゆえ、創傷治癒のために使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、増殖促進活性を必要とする疾患（例えば、再狭窄）の処置のために使用され得る。なぜなら、本発明のポリペプチドは、内皮起源の細胞における増殖効果を有するからである。それゆえ、本発明のポリペプチドはまた、内皮細胞発達において血管新生を調節するために使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、T細胞の活性化を刺激し、それゆえ、種々の寄生虫感染、細菌感染、およびウイルス感染に対する免疫応答を刺激するために使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、この点において、自己免疫疾患を処置および／または予防するために自己応答性のT細胞を排除するために使用され得る。自己免疫疾患の例には、I型糖尿病が挙げられる。本発明はまた、本発明のタンパク質を結合するレセプター分子のような分子を同定する方法を提供する。本発明のタンパク質に結合するタンパク質（例えば、レセプタータンパク質）をコードする遺伝子は、当業者に公知である多数の方法（例えば、リガンドパニングおよびFACSソーティング）により同定され得る。このような方法は、例えば、Coliganら、Current Protocols in Immunology 1(2): 第５章(1991)のような多くの研究室マニュアルに記載される。例えば、発現クローニングがこの目的のために使用され得る。このために、ポリアデニル化RNAは本発明のタンパク質に応答性の細胞から調製され、cDNAライブラリーはこのRNAから作製され、このライブラリーはプールに分割され、このプールは本発明のタンパク質に応答性でない細胞へ個々にトランスフェクトされる。次いで、トランスフェクト細胞は、本発明の標識されたタンパク質へ曝される。本発明のタンパク質は、種々の周知の技術（放射性ヨウ素化または部位特異的タンパク質キナーゼに対する認識部位の包含の標準的方法を含む）により標識され得る。曝露に続いて、この細胞は固定され、そしてサイトスタチン(cytosta tin)の結合が決定される。これらの手順は、スライドガラス上で簡便に実施される。 TNFδまたはTNFε結合細胞を産生したcDNAのプールが同定される。サブプールは、これらの陽性物(positives)から調製され、上記のように宿主細胞へトランスフェクトされ、そしてスクリーニングされる。繰り返しのサブプーリング(sub -pooling)および再スクリーニングプロセスを使用して、推定の結合分子（例えば、レセプター分子）をコードする一つ以上の単一のクローンが単離され得る。あるいは、標識されたリガンドは、それが結合する分子（例えば、レセプター分子）を発現する細胞から調製された細胞抽出物（例えば、膜または膜抽出物）に光親和性結合され得る。架橋物質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（「PA GE」）により分離され、そしてX線フィルムに曝される。リガンド-レセプターを含む標識複合体が切除され、ペプチドフラグメントに分解され、そしてタンパク質ミクロシーケンシングに供され得る。ミクロシーケンシングにより得られたアミノ酸配列は、推定のレセプター分子をコードする遺伝子を同定するためにcDNA ライブラリーをスクリーニングするための、独特のまたは縮重(degenerate)オリゴヌクレオチドプローブを設計するために使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、細胞中または無細胞調製物中でのTNFδまたはT NFε結合分子（例えば、レセプター分子）のTNFδまたはTNFε結合能力を評価するために使用され得る。本発明はまた、細胞上のTNFδまたはTNFεの作用（例えば、レセプター分子のようなTNFδまたはTNFε結合分子との相互作用）を増強またはブロックする化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。アゴニストは、本発明のポリペプチドの天然の生物学的機能を上昇させるか、または本発明のポリペプチドと類似の様式で機能する化合物であり、一方、アンタゴニストは、このような機能を減少させるかまたは排除する。例えば、細胞コンパートメント（例えば、膜または膜調製物のようなその調製物）は、TNFδまたはTNFεに結合する分子（例えば、TNFδまたはTNFεにより変調されるシグナル伝達経路または調節性経路の分子）を発現する細胞から調製され得る。この調製物は、TNFδまたはTNFεのアゴニストまたはアンタゴニストであり得る候補分子の非存在下または存在下において、標識されたTNFδまたはTNF εと共にインキュベートされる。候補分子の結合分子に結合する能力は、標識リガンドの結合の減少を反映する。無償で（すなわち、TNFδまたはTNFε結合分子に結合することにおける、TNFδまたはTNFεの効果を誘導することなく）結合する分子は、おそらく良好なアンタゴニストである。十分に結合し、そしてTNFδ またはTNFεと同一であるかまたは密接に関連する効果を導き出す分子は、アゴニストである。潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストのTNFδまたはTNFε様の効果は、例えば、候補分子の細胞または適切な細胞調製物との相互作用に続くセカンドメッセンジャー系の活性を測定すること、およびこの効果とTNFδまたはTNFεあるいはTNFδまたはTNFεと同じ効果を導き出す分子の効果とを比較することにより測定され得る。この点において有用であり得るセカンドメッセンジャー系には、AM Pグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネル、またはホスホイノシチド加水分解のセカンドメッセンジャー系が挙げられるが、これらには限定されない。 TFNδまたはTFNεアンタゴニストについてのアッセイの別の例は、TFNδまたはTFNεおよび潜在的アンタゴニストと、膜結合TFNδまたはTFNεレセプター分子または組換えTFNδまたはTFNεレセプター分子とを競合阻害アッセイに適切な条件下で組み合わせる競合アッセイである。TFNδまたはTFNεは、レセプター分子に結合したTFNδまたはTFNε分子の数が決定され、潜在的アンタゴニストの有効性を正確に評価し得るように放射能などにより標識され得る。潜在的アンタゴニストは、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、および本発明のポリペプチドに結合しそれによりその活性を阻害するか消失させる抗体を含む。潜在的アンタゴニストはまた、小有機分子、ペプチド、TFNδまたはTFNε誘導活性を誘導することなしにレセプター分子のような結合分子上の同じ部位に結合し、それにより本発明のポリペプチドの作用をそのレセプターへの結合から排除することにより防止する密接に関連したタンパク質または抗体のようなポリペプチドであり得る。別の潜在的アンタゴニストは、TFNδまたはTFNεに結合しそして膜結合TFNδ またはTFNεレセプターとの相互作用からそれを防止するTFNδまたはTFNεレセプターの可溶性形態である。この様式において、レセプターはそのリガンドにより刺激されない。潜在的アンタゴニストは、ポリペプチドの結合部位に結合しそして占有し、それにより正常な生物学的活性が防止されるようにレセプター分子のような細胞性結合分子に結合することを防止する小分子を含む。小分子の例は、小有機分子、ペプチド、または非ペプチドアンタゴニストを含むが、これらに限定されない。他の潜在的アンタゴニストはアンチセンス分子を含む。アンチセンス技術は、アンチセンスDNAまたはRNAを通じてまたは三重らせん形成を通じて遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技術は、例えば、Okano，J．Neuroc hem.，56:560，1991;Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)において議論される。三重らせん形成は、例えば、Leeら、Nucleic Acids Research，6:3073(1979);Cooneyら、 Science，241:456（1988）；およびDervanら、Science，251:1360(1991)において議論される。これらの方法は、ポリヌクレオチドの相補的DNAまたはRNAへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5'コード部分は、約10〜40塩基対の長さのアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために使用され得る。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され、それによりTFNδまたはTFNεの転写および産生を防止する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでRNAにハイブリダイズし、そしてmRNA分子のTFNδまたはTFNεポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスRNAまたはDNAがインビボで発現されて本発明のポリペプチドの産生を阻害するように細胞に送達され得る。アンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、本明細書中以下に記載のような）を有する組成物において用いられ得る。アンタゴニストは、例えば、TFNδまたはTFNεにより抑制されるリポタンパク質リパーゼの全身性欠失から生じる脂質除去欠損である悪液質を処置するために用いられ得る。アンタゴニストはまた、本発明のポリペプチドが病因性役割を果たしているようである大脳性マラリアを処置するために用いられ得る。アンタゴニストはまた、TFNδまたはTFNε誘導性炎症性サイトカイン（例えば、滑膜細胞におけるIL1）の産生を阻害することにより慢性関節炎リウマチを処置するために用いられ得る。関節炎を処置する場合、本発明のポリペプチドは好ましくは関節内注入される。アンタゴニストはまた、移植片の存在における免疫系の刺激を防止することにより、移植片-宿主拒絶を予防するために用いられ得る。アンタゴニストはまた、骨吸収を阻害するため、従って、骨粗鬆症を処置および／または予防するために用いられ得る。アンタゴニストはまた、抗炎症性因子として、および内毒素ショックを処置するために用いられ得る。この重要な症状は、細菌性および他の型の感染に対する過度な応答から生じる。本発明はまた、上記のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはアゴニストもしくはアンタゴニストを含む組成物に関する。従って、本発明のポリペプチドは、細胞、組織または器官で使用するための非滅菌または滅菌キャリア（単数または複数）（例えば、被験体に投与するために適切な薬学的キャリア）と組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、例えば、添加媒液または治療的有効量の本発明のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは添賦剤を含む。このようなキャリアは、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。処方は投与の様式に適するべきである。本発明はさらに、本発明の上記の組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む、薬学的パックおよびキットに関する。このような容器に、薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により処方された形態での注意書であって、ヒトへの投与のための製品の製造、使用、または販売の機関による認可を反映する注意書が付随し得る。本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独または他の化合物（例えば、治療的化合物）と組み合わせて用いられ得る。薬学的組成物は、任意の効果的、便利な様式（例えば、なかでも、局所的、経口、経肛、経膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路）で投与され得る。薬学的組成物は一般に、特定の病徴（単数または複数）の処置または予防のための有効量で投与される。一般に、組成物は少なくとも約10μｇ/kg体重の量で投与される。ほとんどの場合、これは１日当たり約8mg/kg体重を超えない量で投与される。好ましくは、ほとんどの場合、用量は１日約10μｇ/kg〜約１mg/kg体重である。最適な投与は、各処置の様式および病徴について、病徴、重篤度、投与の経路、症状の複雑さなどを考慮して、標準的な方法により決定されることが理解される。本発明のポリペプチドであるポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト、およびアンタゴニストは、このようなポリペプチドのインビボ発現により、「遺伝子治療」としばしばいわれる処置様式において本発明に従って用いられ得る。従って、例えば、患者由来の細胞はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えばDNAまたはRNA）でエクスビボで操作され得、次いで操作された細胞はポリペプチドで処置されるべき患者に提供され得る。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターの使用によりエクスビボで操作され得る。このような方法は当該分野で周知であり、そして本発明におけるこの使用は本明細書中の教示から明らかである。同様に、細胞は、当該分野で公知の手順によりインビボでのポリペプチドの発現のためにインビボで操作され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、上記のように、複製欠損レトロウイルスベクターにおける発現のために操作され得る。次いで、レトロウイルス発現構築物は、単離され得、そして本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターで、形質導入されたパッケージング細胞に導入され得、その結果、パッケージング細胞は今や目的の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する。これらのプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作しそしてインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらおよび他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかである。本明細書中上記のレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。１つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルスに由来する。このようなベクターは、ポリペプチドを発現するために１つ以上のプロモーターを含む。用いられ得る適切なプロモーターは、レトロウイルスLTR；SV40プロモーター；およびMillerら、Biotechniques，7:980-990(1989)に記載されるヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、または任意の他のプロモーター（例えば、ヒストン、RNAポリメラーゼIII、およびβ-アクチンプロモーターを含むが、これらに限定されない真核生物細胞性プロモーターのような細胞性プロモーター）を含むが、これらに限定されない。用いられ得る他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(TK)プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から、当業者には明白である。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下に置かれる。用いられ得る適切なプロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター：またはサイトメガロウイルス(C MV)プロモーターのような異種プロモーター；、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)プロモーター；MMTプロモーター、メタロチオネインプロモーターのような誘導性プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoAIプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスLTR（本明細書中に上記の改変レトロウイルスLTRを含む）；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターを含むが、これらに限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり得る。レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入して、プロデューサー細胞株を形成するために使用される。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例は、Miller，A.，Human Gene Therapy，1:5-14（1990 ）に記載のPE501、PA317、Y-2、Y-AM，PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、YCRE、YCR IP、GP+E-86、GP+envAm12、およびDAN細胞株を含むが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野に公知の任意の手段を通じてパッケージング細胞に形質導入され得る。このような手段は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびCaPO₄沈殿を含むが、これらに限定されない。１つの代替として、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム内にカプセル化されるか、または脂質に結合され、次いで宿主に投与され得る。プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生じる。次いで、このようなレトロウイスルベクター粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで真核生物細胞を形質導入するために用いられ得る。形質導入される真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞は、胚幹細胞、胚性癌腫細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を含むが、これらに限定されない。本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。実施例は、特定の実施態様に参照することにより本発明を例示するためにのみ提供される。これらの例示は、本発明の特定の局面を例示しているが、開示される発明の範囲の限定または制限を表現するものではない。全ての実施例は、別に詳細に記載されているところを除いて、当業者に周知かつ日常的である標準的技術を用いて実施された。以下の実施例の日常的分子生物学技術は、標準的研究参考書（例えば、「Sambrook」として本明細書中でいわれる、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版、；Cold Sp ring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y．(1989)に記載されるように実施され得る。別に特定される場合を除いて、以下の実施例中に示される全ての部または量は重量による。別に述べられない場合、以下の実施例においてフラグメントのサイズ分離は、Sambrookおよび他の多数の参照（例えば、Goeddelら、Nucleic Acids Res.，8:4057(1980)）におけるアガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動（「PAGE」）の標準的な技術を用いて実施される。別に記載されない場合、連結は、標準的緩衝液、インキュベーション温度および時間を用いて（0.5μｇのDNA当たり、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメントおよび約10ユニットのT4DNAリガーゼ（「リガーゼ」））が達成された。実施例１細菌を用いた可溶形態のヒトTFNδおよびTFNεの発現および精製寄託されたポリヌクレオチドにおいてヒトTNFδまたはTNFεをコードするDNA 配列を、ヒトTNFδまたはTNFεタンパク質のアミノ酸カルボキシル末端配列に特異的なそして遺伝子の3'側のベクター配列に特異的なPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。クローニングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ５'および３'配列に添加する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列5'GCG GGA TCC CAG AGC CTC ACC A CA G 3'を有し、これは下線を付した制限部位、それに続くATGコドンの115番目の塩基で始まる図に示される16ヌクレオチドのコード配列を含む。３'プライマーは、配列5'CGC AAG CTT ACA ATC ACA GTT TCA CAA AC 3'は、下線を付したHindIII制限部位、続いてストップコドンを含む図１および２に示すコード配列の最後の13ヌクレオチドに相補的な20ヌクレオチドを含む。制限部位は、細菌発現ベクターpQE-9の制限酵素部位に対して便利であり、これらの実施例において細菌発現のために使用された（Qiagen，Inc．Chatsworth ，CA）。pQE-9は、アンピシリン抗生物質耐性（Amp^r）をコードし、細菌の複製起点（ori）、IPTG誘導プロモーター、リボソーム結合部位（「RBS」）、6-His タグ、および制限酵素部位をコードする。増幅されたヒトTNFδDNAおよびベクターpQE-9の両方をBamHIおよびHindIIIで消化し、次いで消化されたDNAは一緒に連結された。TNF6DNAのpQE-9制限ベクターへの挿入は、TNFδコード領域を、ベクターのIPTG誘導プロモーターの下流に、これに作動可能に連結するように、そしてTNFδの翻訳のために適切に位置された開始AUGにインフレームに配置した。連結混合物を、標準的な手順を用いて、コンピテントなE.coli細胞に形質転換した。このような手順は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manua l、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (1989)に記載されている。プラスミドpREP4の多数のコピーを含有するE.coli株M 15/rep4（これは、lacリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性（Ka n^r）を付与する）を本明細書中に記載の例示的な実施例を行うにあたって使用した。この株（これは、TNFδを発現するために適切である多くの内の唯一である）は、Qiagenから市販されている。形質転換体をアンピシリンの存在下でLBプレート上で増殖するそれらの能力により同定した。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、そしてクローン化DNAの同定を制限分析により確認した。所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（100μｇ/ml）とカナマイシン（25μｇ/ml）との両方を補充したLB培地における液体培養で一晩（「O/N」）増殖させた。O/N培養物を用いて約1:100〜1:250の希釈で大規模な培養物に接種する。細胞を、0.4と0.6との間の600nmでの光学密度（OD₆₀₀）にまで増殖させた。次いで、イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド（「IPTG」）を加えて1mMの最終濃度にし、lacIリプレッサーを不活性化することにより、lacリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導した。細胞をさらに３〜４時間引き続きインキュベートした。次いで、細胞を遠心分離により収集し、標準的方法によって破壊した。日常的な収集技術を用いて破壊した細胞から封入体を精製し、タンパク質を封入体から８Ｍ尿素中へ可溶化した。可溶化したタンパク質を含む８Ｍ尿素溶液を、２×リン酸緩衝化生理食塩水（「PBS」）中でPD-10カラムを通し、それによって尿素を除去し、緩衝液を交換し、そしてタンパク質を再び折り畳んだ。タンパク質をクロマトグラフィーのさらなる工程によって精製してエンドトキシンを除去した。次いで、滅菌濾過した。滅菌濾過したタンパク質調製物を、 95μｇ/mLの濃度で２×PBS中で保存した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の標準的方法によるTNFδの調製物の分析によって、調製物が約20.8kDaの予想された分子量を有する約80％のモノマーを含んでいることが明らかになった。タンパク質を、ニッケルキレートカラム上で6-HISタグを含むタンパク質による型結合を可能にする条件下でクロマトグラフィーによって精製する。タンパク質を、６モルグアニジンHCl(pH5.0)中でカラムから溶出し、再生する。実施例２バキュロウイルス発現系における可溶性ヒトTFNδおよびTFNεのクローニングおよび発現寄託されたクローンにおける全長のヒトTNFδまたはTNFεタンパク質をコードするcDNA配列を、この遺伝子の５'および３'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する：５'プライマーは、配列5'GCG GGA TCC CCA GAG CCT CAC CAC AG 3'を有し、下線を付したBamHI制限酵素部位、それに続く図１および２のTNFδまたはTNFεの配列の16塩基を含有する。発現ベクター中に挿入されて、以下に記載のように、ヒトTNFδまたはTNFεをコードする増幅されたフラグメントの5'末端は、効率的なシグナルペプチドを提供する。真核生物細胞における翻訳の開始のための効率的なシグナルは、Kozak，M.，J．Mol．Biol．196:947-950(1987)によって記載されるように、構築物のベクター部分に適切に位置される。３'プライマーは、配列5'CGC TCT AGA ACA ATC ACA GTT TCA CAA AC 3'を有し、下線を付したXbaI制限部位、続いて終結コドンを含んで、図１および２に示す TNFδまたはTNFεコード配列の最後の13ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含む。増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルより単離する。次いで、このフラグメントをBamHIおよびAsp718で消化し、そして１％アガロースゲルで再び精製する。このフラグメントを、本明細書中でF2と命名する。ベクターpA2GPを用いて、TNFδまたはTNFεタンパク質をバキュロウイルス発現系において、標準的な方法（例えば、Summersら、A Manual of Methods for B aculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures，Texas Agricultura l Experimental Station Bulletin No．1555（1987）に記載される方法）を用いて発現する。この発現ベクターは、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強いポリヘドリンプロモーター、それに続く便利な制限部位を含む。AcMNPV gp67のシグナルペプチド（Ｎ末端メチオニンを含む）は、BamHI部位のちようど上流に位置する。サルウイルス40（「SV40」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、E.coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、その後ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。ポリヘドリン配列を、野生型ウイルスDNAとの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列で両端で隣接させ、クローン化ポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成する。当業者が容易に理解するように、構築が転写、翻訳、トラフィッキングなどのために適切に位置したシグナル（例えば、インフレームのAUGおよび必要ならばシグナルペプチド）を提供するならば、多くの他のバキュロウイルスベクターが、pA2-GPの代わりに用いられ得る。例えば、pAc373、pVL941、およびpAcIM1である。このようなベクターは、とりわけ、Luckowら、Virology，170:31-39に記載される。当該分野で公知の日常的な手順を用いて、プラスミドを制限酵素BamHIおよXba Iで消化し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca）を用いてDNAを１％アガロースゲルより単離する。このベクターDNAを、本明細書中で「V2」と命名する。フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連結する。E.coli HB101細胞を連結混合物で形質転換し、そして培養プレート上に広げる。BamHIおよびXhaIを用いて個々のコロニーからのDNAを消化し、次いでゲル電気泳動によって消化産物を分析することによって、ヒトTNFδまたはTNFε遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定する。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認する。このプラスミドを本明細書中でpBacTNFδを命名する。５μｇのプラスミドpBacTNFδを、FelgnerらProc．Natl．Acad．Sci．USA，84 :7413-7417(1987)によって記載されるリポフェクション法を用いて、1.0μｇの市販の線状化したバキュロウイルスDNA（「BaculoGold^TM baculovirus DNA」，P harmingen，San Diego，CA.）とともに同時トランスフェクトする。１μｇのBac uloGold^TMウイルスDNAおよび５μｇのプラスミドpBacTNFδを、50μｌの無血清グレース培地（Life Technologles Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、10μｌのリポフェクチンおよび90μｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートする。次いで、そのトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１ mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に滴下する。プレートを、新たに添加した溶液を混合するために、前後に振盪する。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を補充した１ mlのグレース昆虫培地を添加する。プレートをインキュベーターに戻し、そして 27℃で４日間培養を続ける。４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）に記載されるようにプラークアッセイを行う。青く染色されたプラークを産生するgal発現クローンの容易な同定および単離を可能にするために、「Blue Gal」（Life Technolog ies Inc.，Gaithersburg）を有するアガロースゲルを用いる。（このタイプの「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、Life Technologies Inc.、Gaithersbu rg、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜 10頁）においても見い出され得る）。連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に添加する。適切なインキュベーションの後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、200μｌのグレース培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁する。寒天を、短時間の遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、35mmディッシュに播種されたSf9細胞に感染するために用いる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いでそれらを４℃で保存する。適切に挿入されたTNFδまたはTNFεを含むクローンを、制限マッピングおよび配列決定を含むDNAまたはTNFε分析によって同定する。これを、本明細書中でV-TNFδと命名する。 Sf9細胞を、10％熱不活化FBSを補充したグレース培地中で増殖させる。細胞を、約２（約１〜約３）の感染多重度（MOI）で組換えバキュロウイルスV-TNFδで感染させる。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburgから入手可能）に置き換える。42時間後、５μＣｉの³⁵Ｓ-メチオニンおよび５μＣｉの³⁵Ｓシステイン（Amershamから入手可能）を添加する。細胞をさらに16時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離により収集し、溶解し、そして標識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可視化する。実施例３ TFN δ発現の組織分布ヒト組織におけるTFNδの発現レベルを調べるために、とりわけ、Sambrokら（前出）によって記載される方法を用いて、ノーザンブロット分析を行った。全細胞RNAサンプルをRNAzol^TMBシステム(Biotecx Laboratories，Inc．6023 South L oop East，Houston，TX 77033)で単離する。約10μｇの全RNAを組織サンプルから単離した。RNAを、１％アガロースゲルを通じて強度の変性条件下で電気泳動によりサイズ分離した。RNAをゲルからナイロンフィルター上にブロットし、次いでフィルターを検出可能に標識したポリヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションのために調製した。 TFNδをコードするmRNAを検出するためのプローブとして、寄託されたクローンのcDNAインサートのコード領域のアンチセンス鎖を、高い比活性で標識した。 cDNAを、Prime−Itキット（Stratageneから入手可能）を用いてプライマー伸張により標識した。反応を、50ngのcDNAを用いて、供給者によって推奨される標準的な反応プロトコルに従って行った。標識ポリヌクレオチドを、Select-G-50カラム(5603 Arapahoe Road，Boulder，CO 80303の5-Prime-3-Prime，Inc．から入手)を用いて、他の標識反応成分からカラムクロマトグラフィーにより精製した。標識プローブを、1,000,000cpm/mlの濃度で、７％SDS、0.5M NaPO₄、pH7.4の小用量において、65℃にて一晩フィルターにハイブリダイズした。その後、プローブ溶液を捨て、フィルターを室温にて２回洗浄し、そして0.5 ×SSC、0.1％SDSで２回、60℃で洗浄する。次いでフィルターを乾燥させ、そして増感スクリーンを用いて-70℃で一晩フィルムに感光させる。オートラジオグラフィーは、心臓において、次いで胎盤および腎臓において最も高い発現を有して、TFNδのmRNAが16個全ての組織において検出されたことを示す。実施例４ヒトTFNδまたはTFNεの遺伝子治療的発現線維芽細胞は皮膚生検により被験体から得る。得られた組織を組織培養培地に置き、そして小片に分離する。組織の小さな塊を、組織培養フラスコの湿った表面に置き、それぞれのフラスコには約10個の塊を置く。フラスコを逆さまにし、きつく閉め、そして室温に一晩放置する。室温で24時間後、フラスコを逆さまにし、そして組織の塊をフラスコの底に固定したままで、そして新鮮な培地（例えば、10％FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むHamのF12培地）を加える。次いで、この組織を37℃で約一週間インキュベートする。この時点で、新鮮な培地を添加し、そして数日おきに次々に交換する。培養でのさらに２週間後、線維芽細胞の単層が現れる。単層をトリプシン処理し、そしてより大きいフラスコに移す。遺伝子治療用のベクターを、発現されるべきフラグメントをクローニングするために制限酵素で消化する。消化ベクターを、自己連結を防止するために仔ウシ小腸ホスファターゼで処理する。脱リン酸化した直線状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そして精製する。活性TFNδまたはTFNεを発現し得るcDNAを単離する。必要な場合、ベクターへのクローニングのためにフラグメントの端を修飾する。例えば、5"オーバーハングを、DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を作製し得る。3'オーバーハング末端を、S1ヌクレアーゼを用いて除去し得る。リンカーをT4 DNAリガーゼで平滑末端に連結し得る。等量のモロニーマウス白血病ウイルス線形骨格およびTFNδまたはTFNεフラグメントを混合し、T4 DNAリガーゼを用いて連結する。連結混合物を、E.coliを形質転換するのに使用し、次いでこの細菌をカナマイシン含有寒天上にプレートする。カナマイシン表現型および制限分析は、ベクターが適切に挿入された遺伝子を有することを確認する。パッケージング細胞を、組織培養中で、10％仔ウシ血清（CS）、ペニシリン、およびストレプトマイシン添加Dulbecco改変Eagle培地（DMEM）中、コンフルエント濃度にまで増殖させる。標準的技術によりパッケージング細胞にTFNδまたはTFNε遺伝子を含むベクターを形質導入する。パッケージング細胞から回収されるTFNδまたはTFNε遺伝子を含む感染性ウイルス粒子は、ここでプロデューサー細胞と呼ばれる。新鮮な培地をプロデューサー細胞に加え、適切なインキュベーション時間の後に培地をコンフルエントプロデューサー細胞のプレートから回収する。培地（感染性ウイルス粒子を含む）を、ミリポアフィルターを通じて濾過し、剥離したプロデューサー細胞を除去する。次いでこの濾過した培地を線維芽細胞を感染させるのに使用する。培地を線維芽細胞のサブコンフルエントのプレートから除去し、そして即座に濾過した培地と交換する。ポリブレン(Aldrich)を形質導入を容易にするために培地に含ませ得る。適切なインキュベーションの後この培地を除去し新鮮な培地と交換する。ウイルス力価が高い場合、実質的にすべての線維芽細胞が感染しており、選択は必要でない。力価が低い場合は、拡大のための形質導入細胞を選択するためにneoやhisのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。次いで、操作された線維芽細胞を、単独でか、またはサイトデックス３ビーズのようなマイクロキャリアビーズ上でコンフルエントにまで増殖させた後のいずれかでラットに注入し得る。注入された線維芽細胞はTFNδまたはTFNε産物を産生し、そしてタンパク質の生物学的作用は宿主に伝達される。上述の説明および実施例において特に記載された以外にも、本発明は実施され得ることが明らかである。本発明の多くの改変および変形が上記の教示を考慮すれば可能であり、従って添付の請求の範囲の範囲内にある。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Human tumor necrosis factor δ and ε The present invention relates to newly identified polynucleotides and polypeptides; Variants or derivatives of polynucleotides and polypeptides; Making reotides and polypeptides, and variants and derivatives thereof Agonists and antagonists of those polypeptides; And their polynucleotides, polypeptides, variants, derivatives, agonists And partly to the use of antagonists. In particular, regarding these and other points. Thus, the present invention relates to polynucleotides and polypeptides of human tumor necrosis factors δ and ε. For peptides (hereinafter sometimes referred to as “TNFδ” and “TNFε”) . Background of the Invention Human tumor necrosis factor α (TNF-α) and β (TNF-β or lymphotoxin) Related to members of a broad class of polypeptide mediators, Containing Ron, interleukins and growth factors, collectively called cytokines (Beutler, B. And Ceram, A. , Annu. Rev. Immunol. , 7: 625-655, 1989). Tumor necrosis factors (TNF-α and TNF-β) were first reported as a result of their antitumor activity It was discovered, but today, apoptosis and cell activity of some transformed cell lines Versatile cytochromes capable of multiple biological activities including mediation of proliferation and proliferation Perceived to play a key role as an immune regulator and further in immune regulation and inflammation Have been. To date, nine known members of the TNF-ligand superfamily, TNF- α, TNF-β (Lymphotoxin-α), LT-β, OX40L, FASL, CD30L, CD27L, CD40L And 4-1BBL. TNF ligand superfamily ligands are cells Acidic TNF with about 20% sequence homology (range; 12-36%) in the ectodomain -Like molecules and exist primarily as membrane-bound forms, with biologically active forms It is a limer / multimer complex. Soluble forms of the TNF ligand superfamily Has been identified so far only for TNF, LTα, and FASL (general totals For the theory, Gruss, H. And Dower, S. K. , Blood, 85 (12): 3378-3404 (1995) ( This is hereby incorporated by reference in its entirety). These proteins may be responsible for cell survival or apoptosis or cytotoxicity. Involved in regulating cell proliferation, activation, and differentiation, including controlling cell death (Armltag e, R. J. , Curr. Opin. Immunol. , 6: 407 (1994) and Smith, C .; A. , Cell, 75: 959 1994). TNF has a large number including monocytes, fibroblasts, T cells, and natural killer (NK) cells. Produced by different cell types and predominantly by activated macrophages Be born. TNF-α is used for rapid tumor necrosis, immune stimulation, autoimmune diseases, transplant rejection , Resistance to parasites, production of antiviral responses, septic shock, growth regulation, It has been reported to have a role in vascular endothelial and metabolic effects. TN F-α also secretes a variety of factors, including PAF-1, IL-1, GM-CSF and IL-6. Trigger endothelial cells and promote cell proliferation. In addition, TNF-α is Up-regulates various cell adhesion molecules such as tin, ICAM-1 and NCAM-1 You. Different cellular properties mediated by members of the TNF ligand superfamily The first step in inducing a response is their binding to specific cell surface receptors It is. The TNF receptor superfamily currently comprises 10 known membrane proteins Open reading books of several viruses encoding TNFR and TNFR-related molecules Including frames. The p75 low affinity nerve growth factor (NGF) receptor is a member of this family. It was the first cloned receptor (Johnson, D. Cell, 47: 545 (19 86)). Subsequently, the cloning of two specific receptors for TNF was We show that they are related to the NGF receptor (Loetscher, H .; Cell, 61: 351 (1 990)). In recent years, a new type I transmembrane TNF receptor superfamily has been established I have. This family includes the p75 nerve growth factor receptor, p60 TNFR-1, p80 TNFR -II, TNFR-RP / TNFR-III, CD27, CD30, CD40, 4-1BB, OX40, and FAS / APO-1 including. In addition, several viruses encoding soluble TNF receptors A pun reading frame has been identified (eg, the S FV-T2 (Smith, C. A. Et al., Biochem, Biophys. Res. Commun. 176: 335, 1991) and And vaccinia virus Va53 or SaIF19R (Howard. S. T. , Virology, 180: 633 , 1991)). These receptors contain multiple screens in the extracellular (amino-terminal) domain. Characterized by a stain-rich domain, which is involved in ligand binding It has been shown. Cysteine-rich extracellular domain between human family members Average homology in the range of 25-30%. Obviously, the need for factors that regulate activation and differentiation of normal and abnormal cells Sex exists. Therefore, activation and differentiation of cells in both normal and disease states There is a need for the identification and characterization of such factors that modulate. Special Controlling the apoptosis of the transformed cell line, mediating cell activation and proliferation, And are functionally related as primary mediators of immunomodulatory and inflammatory responses, and Play a role in preventing, ameliorating or correcting a dysfunction or disease Get additional TNF ligands similar to members of the TNF ligand superfamily There is a need to isolate and characterize the compounds. Summary of the Invention Toward these and other purposes, the novel TNFδ and TNFε, FIG. And amino acid sequences shown in Figure 2 and tumor necrosis factors such as human TNFα and TNFβ By homology with known amino acid sequences of other proteins in the offspring family Providing a novel polypeptide hypothetically identified as a tumor necrosis factor ligand It is an object of the present invention to provide. The polypeptides of the present invention are based on TNF ligands based on structural and biological similarities. Has been identified as a new member of the supermarket family. In addition, polynucleotides encoding TNFδ and TNFε, particularly herein Provide polynucleotides encoding polypeptides designated TNFδ and TNFε It is a further object of the present invention to provide. In a particularly preferred embodiment of this aspect of the invention, the polynucleotide comprises 1 and the region encoding human TNFδ and TNFε in the sequences shown in FIG. . According to this aspect of the invention, human TNFδ, including mRNA, cDNA, genomic DNA, is encoded. Provided, and further practicing this aspect of the invention. In embodiments, biologically, diagnostically, clinically, or therapeutically useful variants thereof, Analogs or derivatives or fragments thereof (variants, analogs and And fragments of the derivatives). Particularly preferred embodiments of this aspect of the present invention include the natural TNFδ and TNFε Allele variants present in the genomic DNA. According to this aspect of the invention, ATCC Accession No. 9737, deposited on December 8, 1995. Mature human TNFδ polypeptide expressed by the human cDNA contained in No. 7 and 19 By the human cDNA contained in ATCC Accession No. 97457, deposited on March 1, 1996. Provided is an isolated nucleic acid molecule encoding a mature human TNFε polypeptide to be expressed Is done. Destroys several transformed cell lines, mediates cell activation and proliferation, and TNF.DELTA. Polypeptides are functionally related as primary mediators of immunomodulatory and inflammatory responses It is also an object of the present invention to provide polypeptides, particularly human TNFδ and TNFε polypeptides. It is a target. In accordance with this aspect of the invention, human origins referred to herein as TNFδ and TNFε. Source novel polypeptides and biologically, diagnostically or therapeutically useful , Variants and derivatives of the same, variants and derivatives of the fragments A body is provided, as well as analogs thereof. Particularly preferred embodiments of this aspect of the invention include the human TNFδ and TNFε genes Of human TNFδ and TNFε encoded by naturally occurring alleles of Escherichia coli The body exists. The aforementioned polypeptides, polypeptide fragments, variants and derivatives, modifications To produce fragments of the body and derivatives, and analogs thereof It is another object of the present invention to provide a process for: Preferred aspects of this aspect of the invention In a preferred embodiment, the method for producing a TNFδ and TNFε polypeptide described above comprises Provided. This method uses exogenously derived human TNFδ expressably incorporated therein. Host cells having a coding polynucleotide and a TNFε coding polynucleotide Culturing under conditions for expression of human TNFδ and TNFε in the host, Recovering the expressed polypeptide. According to another object of the present invention, there are, inter alia, research, biological, diagnostic, and therapeutic Utilizing the polypeptides and polynucleotides described above for objective purposes, products, Compositions, processes, and methods are provided. According to certain preferred embodiments of this aspect of the invention, the products, compositions, and In particular, the following methods are provided: TNFδ and TNFε polypeptide or TNFδ By determining the coding mRNA or TNFε coding mRNA polypeptide, cells For evaluating TNFδ and TNFε expression in Escherichia coli; Methods for assaying for genetic mutations and abnormalities such as deletions; and TNFδ or T to increase TNFε function or treat TNFδ or TNFε dysfunction A method of administering an NFδ or TNFε polypeptide or polynucleotide to an organism. According to certain preferred embodiments of this and other aspects of the invention, human TN Polynucleotides and especially probes that hybridize to Fδ or TNFε sequences Is provided. In certain further preferred embodiments of this aspect of the invention, TNFδ or TNF Antibodies to NFε polypeptides are provided. Certain particularly preferred in this regard In some embodiments, the antibody is highly selective for human TNFδ or TNFε. You. According to another aspect of the present invention, there is provided a TNFδ or TNFε agonist. Like New agonists include TNFδ binding molecules or receptor molecules or TNFε binding A molecule that mimics TNFδ or TNFε, which binds to a child or receptor molecule, and There are molecules that elicit or increase the TNFδ or ε-induced response. Further Particularly preferred agonists include TNFδ and TNFε or TNFδ and TNFε polypeptides. Interacts with the peptide, or other modulators of TNFδ activity, thereby Enhances the effects of NFδ and TNFε or more than one TNFδ and TNFε There are molecules that increase. According to yet another aspect of the present invention, there are provided TNFδ and TNFε antagonists. It is. Preferred antagonists include TNFδ and TNFε receptors or binding components. , But TNFδ and TNFε-induced responses or more than one TNFδ and TNF Antagonists mimic TNFδ and TNFε so as not to elicit an ε-induced response You. Further, preferred antagonists include the effects of TNFδ and TNFε or Binds to TNFδ and TNFε to inhibit the effect of more than one TNFδ and TNFε Or there are molecules that interact or prevent the expression of TNFδ and TNFε. Agonists and antagonists exert the effects of TNFδ and TNFε polypeptides. Can be used to mimic, increase, or inhibit. They are like For example, septic shock, inflammation, cerebral malaria, activation of HIV virus, transplantation Can be used to prevent primary rejection, bone resorption, rheumatoid arthritis, and cachexia You. In further aspects of the invention, cells in vitro, ex vivo and in vivo And TNFε polynucleotides for administration to or to multicellular organisms Or compositions comprising TNFδ and TNFε polypeptides are provided. The present invention In certain particularly preferred embodiments of this aspect of the invention, the composition is useful for treating a disease. TNFδ and TNFδ for expression of TNFδ and TNFε polypeptides in a host organism And a TNFε polynucleotide. Particularly preferred in this regard are TNFδ Human patients for the treatment of dysfunctions associated with abnormal endogenous activity of TNF and TNFε Is the expression in Other objects, features, advantages, and aspects of the present invention will become apparent to those skilled in the art from the following description. It will be. However, the description and specific examples that follow are preferred embodiments of the invention. It should be understood that these are shown for illustrative purposes only. Disclosed For various changes and modifications within the spirit and scope of the invention, please read the following description. And from reading other parts of the present disclosure will be readily apparent to those skilled in the art. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES The following drawings illustrate certain embodiments of the present invention. They are only examples and are not It does not limit the invention disclosed elsewhere herein. FIG. 1 shows the nucleotide and deduced amino acid sequence of human TNFδ. FIG. 2 shows the nucleotide and deduced amino acid sequence of human TNFε. FIG. 3 shows the similarity between amino acid sequences of TNFα, TNFβ, TNFδ and TNFε polypeptides. The sex region (alignment report) is shown. FIG. 4 shows TNF estimated by the indicated technique as a function of amino acid sequence. Shows the structural and functional characteristics of δ. FIG. 5 shows TNF estimated by the indicated technique as a function of amino acid sequence. 1 shows the structural and functional characteristics of ε. The following illustrative description provides specific terms that are frequently used herein, particularly in the examples. Provided to facilitate understanding. This description is provided for convenience and It does not limit the invention. The term “digestion” of DNA refers to the reaction of DNA with restriction enzymes that act only on specific sequences of DNA. Refers to medium-based cleavage. The various restriction enzymes mentioned herein are commercially available and Reaction conditions, cofactors and other necessary Knowledge and everyday. For analytical purposes, typically 1 μg of plasmid or DNA fragment contains about 2 μg. Digested with about 2 units of enzyme in 0 μl reaction buffer. Plasmid construction For the purpose of isolating DNA fragments for the purpose, typically 5-50 μg of DNA Digested with 20-250 units of enzyme in larger volumes. Appropriate buffers and substrate amounts for particular restriction enzymes are listed below. Are described in various standard laboratory manuals, and they are Specified by Incubation times of about 1 hour at 37 ° C are usually used, It can vary according to the specific procedure, supplier's instructions and the specificity of the reaction. After digestion, reaction Can be analyzed, and fragments can be analyzed by well-known methods routine to those of skill in the art. On an agarose or polyacrylamide gel. Can be made. The term "genetic element" generally refers to a polynucleotide comprising a region that encodes a polypeptide. Reotide, or transcription or translation or expression of a polypeptide in a host cell A polynucleotide containing a region that regulates other processes that are actually important, or Regulates a polypeptide-encoding region and expression operably linked thereto Polynucleotide that includes both regions. The genetic element may be contained in a vector that replicates as an episomal element; It is a molecule that is physically independent of the host cell genome. They are found in eukaryotic cells Occurs during amplification of transfected DNA by selective methotrexate selection As such, it can be contained within a minichromosome. Genetic elements may also be present in the host cell genome; Rather than in their natural state, manipulation (eg, isolation, cloning, and (Introduced into the main cell), purified DNA or especially in the form of a vector Can be The term “isolated” refers to a change from the natural state “by the hand of man”. Means; if it occurs naturally, it has changed from its natural environment Done or retrieved, or both. This term is used herein As used in, for example, naturally occurring polynucleotides or live Polypeptides naturally occurring in animals are not "isolated" Identical polynucleotide or polypeptide isolated from coexisting materials in their natural state Pide is "isolated." For example, for a polynucleotide, the term isolated Means that it has been isolated from naturally occurring chromosomes and cells I do. As part of or after isolation, such polynucleotides may be For example, for mutagenesis, to form a fusion protein, and for transmission in the host Alternatively, it can be linked to another polynucleotide for expression. Isolated polynucus Reotide (alone or conjugated to another polynucleotide such as a vector) Can be introduced into a host cell of a culture or an entire organism, as the term is used herein. As such, such DNA is still isolated after this. Why Because they are not naturally occurring forms or environments. Similarly, polynucleotides and polypeptides can be found in naturally occurring compositions. And within the meaning of the term as used herein The polynucleotide or polypeptide remains there, e.g., the polynucleotide Media formulations, compositions such as solutions for the introduction of a nucleotide or polypeptide For example, in a composition such as a composition or solution for a chemical or enzymatic reaction. Can be. The term “link” refers to two or more polynucleotides (often double-stranded DNA) It refers to the process of forming a phosphodiester bond between them. The technology for connection is Well known in the art, and protocols for ligation are described in standard laboratory manuals. And references (eg, Sambrook et al., Molecular, as cited below). Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition; Cold Spring Harbor Laboratory Pres s, Cold Spring Harbor, New York (1989) and Maniatis et al., p. 146). ing. The term "oligonucleotide" refers to a relatively short polynucleotide. For a while This term refers to single-stranded deoxyribonucleotides. But likewise, That is, single- or double-stranded ribonucleotides, RNA: DNA hybrids and two It can mean strand DNA. Oligonucleotides (eg, single-stranded DNA probe oligonucleotides) Frequently by chemical methods such as those performed on automated oligonucleotide synthesizers They are often synthesized. However, oligonucleotides can be used in a variety of other ways (in vitro Including recombinant DNA-mediated technology) and expression of DNA in cells and organisms Can be made. Initially, chemically synthesized DNA is typically without a 5 'phosphate Is obtained. The 5 'end of such an oligonucleotide forms a recombinant DNA molecule Ligation reaction using DNA ligase, which is typically used to It is not a substrate for diester bond formation. Such a sequence of oligonucleotides If conjugation is desired, the phosphate may be labeled using kinases and ATP. It can be added by standard techniques. The 3 'end of chemically synthesized oligonucleotides is generally free hydroxyl Group, and in the presence of a ligase (eg, T4 DNA ligase) Along with the 5 'phosphate of a nucleotide (eg, another oligonucleotide) A diester bond is easily formed. As is well known, this reaction is desired If necessary, remove the 5 'phosphate of the other polynucleotide before ligation. Thus, it can be selectively prevented. Plasmids are generally used herein in accordance with standard naming conventions that are familiar to those of skill in the art. Thus, a preceding lowercase p and / or subsequent uppercase letters and / or numbers Named by The starting plasmids disclosed herein are commercially available. Possible, publicly available on non-restrictive principles, or Can it be constructed from available plasmids by routine application of opened procedures Is one of Many plasmids that can be used in accordance with the present invention, as well as other plasmids Cloning and expression vectors are well known to those of skill in the art and are readily available. Noh. Further, those skilled in the art will recognize any number of other plugs suitable for use in the present invention. Sumids can be easily constructed. In the present invention, such a plasmid, and The properties, construction and use of other vectors will be readily apparent to those skilled in the art from this disclosure. . The term "polynucleotide" generally refers to any polyribonucleotide or polynucleotide. Refers to lideoxyribonucleotides. This can be unmodified RNA or DNA or modified It can be a modified RNA or DNA. Thus, for example, the Renucleotides are, inter alia, single- and double-stranded DNA, single- and double-stranded regions. DNA, single- and double-stranded RNA, and single- and double-stranded regions RNA that is a mixture of regions, single-stranded or more typically double-stranded or single-stranded And hybrid molecules containing DNA and RNA which can be a mixture of double-stranded regions . Further, the polynucleotide used herein may be RNA or DNA or Refers to a triple-stranded region containing both RNA and DNA. The chains in such a region are From the same molecule or different molecules. These regions hold all of one or more molecules But may more typically only include regions of some molecules. Triple helix One of the molecules in the spectrum is often an oligonucleotide. As used herein, the term polynucleotide refers to any of the above, including one or more modified bases. Including DNA or RNA. Therefore, modified for stability or other reasons DNA or RNA having a backbone is referred to as "poly" as the term is intended herein. Nucleotides ". In addition, just two examples, such as inosine DNA or RNA containing unusual bases or modified bases such as tritylated bases Is a polynucleotide as the term is used herein. Various modifications have been made to DNA and RNA that serve many useful purposes known to those of skill in the art. It is understood that it is. The term polynucleotide as used herein Can be used in such chemically, enzymatically or metabolically modified forms of polynucleotides. Otides, and especially viruses and cells (including single and multicellular) Includes DNA and RNA in distinctive chemical forms. As used herein, the term "polypeptide" refers to a polypeptide as described below. Including all. The basic structure of a polypeptide is well known and is innumerable in the art. Textbooks and other publications. In this context, the term In the description, two or more amino acids linked to each other linearly by peptide bonds Used to mean any peptide or protein, including This specification As used in this term, the term short chain (which is also commonly used in the art, For example, called peptides, oligopeptides and oligomers) and long chains ( This is commonly referred to in the art as protein, and there are many types). U. The polypeptide has 20 amino acids commonly referred to as the 20 naturally occurring amino acids Often contains other amino acids, and many amino acids (terminal amino acids) (Including acids) are naturally occurring processes (eg, processing and other post-translational modifications) And any given chemical modification technique known in the art. It is understood that modifications can be made in the peptide. Naturally in polypeptides Even the common modifications that exist are too numerous to fully list here However, they are the basic textbooks and more detailed papers, as well as And they are well known to those skilled in the art. Polype of the present invention Among the known modifications that may be present in peptides, acetylation, to name a few, Acylation, ADP-ribosylation, amidation, covalent attachment of flavin, heme moiety Covalent attachment of nucleotides or nucleotides or nucleotide derivatives Deposition, covalent attachment of lipids or lipid derivatives, phosphatidylinositol (p (hosphotidylinositol), covalent attachment, crosslinking, cyclization, disulfide bond formation Formation of covalent crosslinks, formation of cystine, formation of pyroglutamic acid, formyl , Γ-carboxylation, glycosylation, GPI anchor formation, hydroxylation, iodination, Methylation, myristoylation, oxidation, proteolytic processing, phosphorylation, Prenylation, racemization, selenoylation, sulphation, tracing of amino acids to proteins Transfer RNA-mediated addition (eg, arginylation), and ubiquitin binding Existence I do. Such modifications are well known to those skilled in the art and have been described in great detail in the scientific literature. Have been. Several particularly common modifications, such as glycosylation, lipid attachment, sulfation , Γ-carboxylation, hydroxylation, and ADP-ribosylation of glutamic acid residues Most basic textbooks (eg, Proteins-Structure and Molecular Proper ties, 2nd edition, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993)) It is described in. Many detailed reviews are available under this title (eg, Wo ld, F. , Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospec ts, pp. 1-12, Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. J Ohnson, Ed., Academic Press, New York (1983): Seifter et al., Analysis for prote. in modifications and nonprotein cofactors. Meth. Enzymol. , 182: 626-646 (19 90) and Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N. Y. Acad. Sci. , 663: 48-62 (1992)). As is well known, and as noted above, polypeptides are not necessarily perfectly linear. It is understood that there is no. For example, a polypeptide may be bound as a result of ubiquitin binding. They can be branched, and they are generally post-translational events (natural processing events). , And events caused by human manipulations that do not occur in nature) It can be cyclic with or without. Cyclic, branched, and branched ring Lipeptides are synthesized by similarly untranslated natural processes and completely synthetic methods Can be done. Modifications can be located anywhere in the polypeptide, including the peptide backbone, the amino acid Includes acid side chains and amino or carboxyl termini. In fact, covalent modification Interfere with amino and / or carboxyl groups in polypeptides Harm is common to naturally occurring and synthetic polypeptides, and Such modifications may also be present in a polypeptide of the present invention. For example, E. Amino-terminal residues of polypeptides made in E. coli are proteolytic Prior to processing, it is almost always N-formylmethionine. The modifications that are present in a polypeptide, often how it is made Is correlated to By expressing the cloned gene in the host For polypeptides made, for example, the properties and extent of most modifications are: The post-translational modification capacity of the host cell and the modification sequence present in the polypeptide amino acid sequence. Determined by Gunnar. For example, as is well known, glycosylation is often E. Not present in bacterial hosts such as E. coli. Therefore, glycosylation is not If desired, the polypeptide can be transferred to a glycosylating host (generally a eukaryotic cell). And should be expressed. Insect cells are often post-translationally the same as mammalian cells Perform glycosylation. For this reason, insect cell expression systems are, inter alia, Efficient expression of mammalian proteins with natural patterns of lycosylation Is being developed for Similar considerations apply to other modifications. The same type of modification Are present in the same or varying degrees at several sites in a given polypeptide. obtain. Further, a given polypeptide may contain many types of modifications. In general, As used herein, the term polypeptide refers to all such modifications, Polypeptides synthesized, in particular, by expressing polynucleotides in host cells Includes modifications present in the peptide. As used herein, the term "variant" of a polynucleotide or polypeptide '' Is a polynucleotide that differs from the reference polynucleotide or polypeptide, respectively. A nucleotide or polypeptide. Variants in this sense are described below And has been described in great detail elsewhere in this disclosure. A polynucleotide variant is another nucleotide sequence in a nucleotide sequence. It is a different polynucleotide from otide. In general, the difference is between the reference and the variant. The nucleotide sequences are closely similar throughout and, in many regions, identical. To be one. As described below, the nucleotide sequence of the variant Changes in the columns can be silent. That is, they are polynucleons The amino acid encoded by the tide cannot be changed. Change is this type of siren If the variant is limited to a polypeptide, the variant is a polypeptide having the same amino acid sequence as the reference. Code the tide. As described below, in the nucleotide sequence of the variant The change may be an amino acid in the polypeptide encoded by the reference polynucleotide. The sequence may vary. Such nucleotide changes, as discussed below, Amino acid substitutions, additions, and deletions in the polypeptide encoded by the reference sequence , Fusion and cleavage may occur. A variant polypeptide differs in amino acid sequence from another, reference polypeptide. Polypeptide. Generally, the difference is that the sequence of the reference and the variant And are confined to be identical in many areas. Break A variant and reference polypeptide may have one or more substitutions, additions, deletions, fusions and truncations. Thus, they may differ in amino acid sequence, and these may be present in any combination . As used herein, the term “receptor molecule” refers to TNFδ or TNF of the present invention. A molecule that specifically binds or interacts with an ε polypeptide, including classical Specific receptors (preferably these) as well as polypeptides of the invention Also included are other molecules that bind to or interact with (each of which also “Binding molecule” and “interacting molecule”, and “TNFδ binding molecule” and “TNFδ Called "interacting molecules" or "TNFε binding molecules" and "TNFε interacting molecules" ). The polypeptides of the present invention and such molecules (such as receptors or binding molecules). Or interacting molecules) is exclusive to the polypeptides of the invention. (Which is very highly preferred) or to the polypeptides of the invention. Can be highly specific (which is highly preferred), or the polypeptides of the invention. May be highly specific for a group of proteins containing the peptide (which is preferred), or Or any number of proteins, wherein at least one group comprises a polypeptide of the invention. May be specific to that group. Detailed description of the invention The present invention relates, inter alia, to novel TNFδ and novel as described in greater detail below. And TNFε polypeptides. In particular, the invention relates to amino acid sequence homology. And polynucleotides related to the TNF ligand superfamily About Chid. The invention particularly relates to the nucleotide and amino acid sequences shown in FIG. TNFδ with the sequence and the TNF nucleotides and ATCC accession number 97377 human cDNA. And amino acid sequences. The present invention also specifically relates to the nucleotides and nucleotides shown in FIG. And the TNFε of the human cDNA at ATCC Accession No. 97457 For nucleotide and amino acid sequences. These deposits are referred to hereinafter in this specification. Deposited, referred to as the deposited clone or "cDNA of the deposited clone". Shown in FIGS. 1 and 2 Nucleotide and amino acid sequence sequenced human cDNA of deposited clone It is understood that it was obtained by doing. Therefore, any between these two 1 and 2, the sequence of the deposited clone is dominant and Any reference to the sequence includes a reference to the sequence of the human cDNA of the deposited clone. . According to one aspect of the invention, a TNF having the deduced amino acid sequence of FIGS. Provided are isolated polypeptides encoding δ and TNFε polypeptides . The information provided herein, such as the polynucleotide sequence shown in FIG. The polynucleotide of the invention encoding the human TNFδ polypeptide can be used Standard cloning and screening procedures (eg, human population as starting material) Procedure for cloning cDNA using mRNA from tissue cells) Can be done. As an illustration of the present invention, the polynucleotide shown in FIG. Found in a cDNA library derived from tissue cells. The human TNFδ of the present invention is a cDNA encoding human TNFδ in the deposited clone. TNF ligand superfamily, as shown by the results of NA sequencing Is structurally related to other proteins. The cDNA sequence obtained in this way is It is shown in FIG. This is an estimated molecular weight of about 25. A protein of about 233 amino acid residues with 871 kDa Includes an open reading frame encoding the protein. This protein is Shows the highest homology to TNFα among known proteins. All amino acids of TNFδ in Fig. 1 The acid sequence has about 38% identity to the amino acid sequence of TNFα. Polynucleotides of the invention encoding a human TNFε polypeptide can be a standard Cloning and screening procedures (eg, using human tissue as starting material) For cloning cDNA using cell-derived mRNA) You. As an illustration of the present invention, the polynucleotide shown in FIG. It was discovered from a cell-derived cDNA library. The human TNFε of the present invention is a cDNA encoding human TNFε in the deposited clone. TNF ligand superfamily, as shown by the results of NA sequencing Is structurally related to other proteins. The cDNA sequence obtained in this way is 2 is shown. The TNFε sequence is almost identical to the sequence of TNFδ shown in FIG. Does not include the region of TNFδ, including the first 50 amino acids and amino acids 86 to 92 . Thus, TNFε is a splice variant of TNFδ. TNFε is 168 amino acids 2 and the sequence of FIG. 2 shows the formation of TNFε without any N-terminal hydrophobic region. Shows mature protein. This protein shows the highest homology to TNFα . TNFε in FIG. 2 has about 20% identity to the amino acid sequence of TNFα. The polynucleotide of the present invention may be in the form of RNA such as mRNA or in the form of DNA (eg, For example, obtained by cloning or produced by chemical synthesis techniques Or a combination thereof, including cDNA and genomic DNA) . DNA can be double-stranded or single-stranded. Single-stranded DNA contains the coding strand (the sense strand Or it is the non-coding strand (also known as the antisense strand). Said). The coding sequence encoding the polypeptide is the polynucleotide shown in FIGS. Code sequence. This is also a consequence of the degeneracy (degeneration) of the genetic code. As a result, different sequences encoding the polynucleotides of the DNA of FIGS. May be a polynucleotide having The polynucleotide of the present invention encoding the polypeptide of FIG. 1 and FIG. May include, but is not limited to: the coding sequence of the mature polypeptide itself A coding sequence for the mature polypeptide and additional coding sequences (eg, pre- or Or a leader or secretory sequence such as a pro- or prepro-protein sequence A mature polypeptide with or without the additional coding sequence described above. The coding sequence of the polypeptide, as well as additional non-coding sequences (eg, introns) And transcription, mRNA processing (eg, splicing and polyadenylation) Plays a role in ribosome binding and mRNA stability Non-coding 5 'and 3' sequences, such as transcribed untranslated sequences; provide additional functionality Additional coding sequences that encode additional amino acids, such as those provided. Thus, for example, a polypeptide can be fused to a marker sequence, such as a peptide. This facilitates purification of the fused polypeptide. This aspect of the invention In certain preferred embodiments, the marker sequence is, inter alia, a pQE vector (Q iagen, Inc. A) a hexahistidine peptide such as the tag provided in And Many are commercially available. Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 86: 821-8 24 (1989), For example, hexahistidine Simple fusion protein Provides convenient purification. The HA tag is For example, Wilson et al. Cell, 37: 767 (1984) Epitopes derived from influenza hemagglutinin protein Respond. According to the above, As used herein, the term "polypeptide encoding a polypeptide" "Nucleotides" A polypeptide of the invention, In particular, the amino acids shown in FIGS. 1 and 2 A polynucleotide comprising a sequence encoding human TNFδ and TNFε having the sequence Include. This term is May also contain coding and / or non-coding sequences Together with the realm (For example, Polypeptide interrupted by introns) A polynucleotide comprising a single contiguous or non-contiguous region encoding Include. The present invention Fragmentation of a polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIGS. , analog, And polynucleotides herein above that encode derivatives The invention further relates to variants of Variant of the polynucleotide, Naturally occurring conflicts Can it be a naturally occurring variant such as a genetic variant, Or naturally occurring It may be a variant that is not known. Such non-naturally occurring polypep A variant of the tide is Polynucleotide, cell, Or include technology applied to living things This can be done by mutagenesis techniques. Variants in this regard include: The above polynucleotide is a nucleotide substitution, Deletion, Or there are different variants in addition. Replacement, Deletion, Or addition 1 It may include more than one nucleotide. Variants may be coding or non-coding regions or Can be a change in both. Changes in the code area Conservative or Is a non-conservative amino acid substitution, Deletion, Or it may generate an addition. Particularly preferred embodiments of the present invention in this regard include: TNF shown in FIGS. 1 and 2 Polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence of δ and TNFε Tide; Its variants, analog, Derivatives, And fragments, And variants, analog, And derivative fragments. More particularly preferred in this regard are: Several, Several, 5-10 pieces , 1-5, 1-3 of Two, One, Or 0 amino acid residues Any Replace with a combination of Deletion, Or has been added, TNFδ and T in FIGS. 1 and 2 Polynucleotides encoding TNFδ and TNFε having the amino acid sequence of NFε polypeptide Creotide. Particularly preferred of these are: Silent replacement, Addition , And deletions, They do not alter the properties and activities of TNFδ and TNFε . Also particularly preferred in this regard are: It is a conservative substitution. Most highly preferred The new thing is A polypeptide having the amino acid sequence of FIGS. 1 and 2 without substitution The polynucleotide to be encoded. A further preferred embodiment of the present invention is FIG. Encoding TNFδ and TNFε polypeptides having the amino acid sequences shown in A polynucleotide that is at least 70% identical to the polynucleotide And this Is a polynucleotide complementary to a polynucleotide such as Or, most Highly preferred are Polynucleotides encoding TNFδ and TNFε polypeptides A polynucleotide comprising a region that is at least 80% identical to an otide, And it It is a complementary polynucleotide. In this regard, TNFδ and TNFε polypep A polynucleotide that is at least 90% identical to a polynucleotide encoding a tide Is particularly preferred, Of these particularly preferred polynucleotides, at least Those with 95% identity are particularly preferred. further, At least 95% identity Of those that have Those with at least 97% identity are highly preferred, Soshi Especially those having at least 98% and at least 99% identity Highly preferred, Those with at least 99% identity are more particularly preferred. A particularly preferred embodiment in this regard is further, The cDNA of FIGS. 1 and 2 Retains substantially the same biological function or activity as the mature encoded polypeptide. It is a polynucleotide that encodes a polypeptide having the polynucleotide. The invention further provides Polynucleotides that hybridize to the sequences described herein above About In this regard, The present invention, in particular, Reality under stringent conditions The present invention relates to a polynucleotide that hybridizes to the above polynucleotide in the specification. . As used herein, The term "stringent conditions" Hive Redidation is At least 95% and preferably at least 95% of the bases between the sequences And 97% are complementary (for example, G: C; A: T) means what happens. The polynucleotide assays of the invention are further discussed herein. So that For example, The polynucleotide of the present invention described above, cDNA and genomic DN As a hybridization probe for A, TNFδ and TNFε To isolate full-length cDNA and genomic clones And human TNFδ and T CDNA and genomic clones of other genes with high sequence similarity to the NFε gene Can be used to isolate the protein. Such probes generally have at least 15 Contains bases. Preferably, Such a probe has at least 30 bases, And may have at least 50 bases. For example, The coding region of the TNFδ and TNFε genes is Oligonucleotide probes In order to synthesize Isolated by screening using known DNA sequences obtain. Then Labeled oligo having a sequence complementary to the sequence of the gene of the present invention The nucleotide is Human cDNA, Genomic DNA, Or screen mRNA library Used for Probes hybridize to any member of the library It is determined whether to soy. Polynucleotides and polypeptides of the present invention Particularly in the present specification As discussed further with respect to the reotide assay, Treatment and treatment for human diseases And can be used as research reagents and materials for discovery of diagnostics. The polynucleotide is Polypeptides that are mature proteins and additional amino acids No-terminal or carboxyl-terminal amino acid, Or for mature polypeptides Some amino acids (for example, If the mature form has more than one polypeptide chain ). Such an array is Above all, From precursor to mature form Can it play a role in protein processing? Protein traffic Can you make the king easier, Whether it can increase or decrease the half-life of the protein, Ma Alternatively, the manipulation of the protein for assay or production may be facilitated. Insai It is common in the case of Ju, More amino acids, Matured by cellular enzymes It can be processed separately from the protein. Precursor tamper having a mature form of the polypeptide fused to one or more prosequences The quality is It can be an inactive form of the polypeptide. If the prosequence is removed Such an inert precursor, Generally activated. Some of the pro sequences or Everything is It can be removed before activation. In general, Such precursors are proproteins Called. Summary, The polynucleotide of the present invention, Mature protein, Mature protein And a leader sequence (this is (May be called preprotein), Preprotein A precursor of a mature protein having one or more prosequences that are not leader sequences of Or a leader sequence and one or more prosequences (which are generally Polypeptide Removed during the processing step to produce an active and mature form of Preproprotein (which is a precursor to proprotein) I can do it. Deposits containing human TNFδ and human TNFEε DNA are: As described above, America Deposited at the Type Culture Collection. Also, as mentioned above, cDNA The deposit is As used herein, the term "deposited clone" or "cD of the deposited clone" NA ". Clones were purchased on December 8, 1995 and March 1, 1996 by American Type culture collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland Deposited in 20852 USA, And ATCC accession numbers 97377 and 97457 respectively. Was assigned. The deposited material is PB containing full-length TNFδ and TNFε human cDNA luescript SK (-) plasmid (Stratagene, La Jolla, CA). The deposit is Budapest Article on international recognition of the deposit of microorganisms for the purpose of patent procedures Made under about terms. The stock is At the same time that the patent is issued, Immutable and restricted Or open to the public without conditions. Deposits are Simply for the convenience of those skilled in the art. Provided only by Patents whose deposits are required under 35 U.S.C. 112 It is not a permission required for performance. Polynu in the deposited material Nucleotide sequence, And amino acid sequence of polypeptide encoded thereby Is Control in any event of conflict with any of the sequences described herein. You. Create deposited materials, Use or Or to sell, Rye Sense may be needed, And any such license is granted here Not. The invention further provides Human TNFδ and T having the deduced amino acid sequences of FIGS. 1 and 2 Related to NFε polypeptides. The polypeptide of the present invention A recombinant polypeptide, Heaven Natural polypeptide, Alternatively, it can be a synthetic polypeptide. Certain preferred embodiments In It is a recombinant polypeptide. The present invention also provides Fragments of these polypeptides, analog, And induction About the body. The term "fragment", "Derivatives", And "analog" FIG. And 2 polypeptides, Essentially identical to such a polypeptide A polypeptide that retains a biological function or activity is meant. Therefore, analog Is Activated by cleavage of the proprotein part, Active mature polypeptide production Includes viable proprotein. Fragments of the polypeptide of FIGS. 1 and 2, Derivatives, Or analog Less than Can be: (I) one or more amino acid residues are Conserved amino acid residues Alternatively, non-conservative amino acid residues (preferably, (Conserved amino acid residue) And And these substituted amino acid residues are encoded by the genetic code. What may or may not have been Or (ii) one or more The acid residue containing a substituent, Or (iii) the mature polypeptide is a polypeptide Compounds that increase the half-life of Another like polyethylene glycol) Fused to the compound of Or (iv) the additional amino acid is a mature polypeptide (For example, Leader sequence, Or secretory sequence, Or mature polypeptide or Is the sequence used to purify the proprotein sequence). like this Fragment, Derivatives, And analog From the teachings herein, those skilled in the art Considered to be in range. Particularly preferred embodiments of the present invention in this regard include: Shown in FIGS. 1 and 2 A polypeptide having an amino acid sequence of TNFδ and TNFε, Its variants, analog , Derivatives, And fragments, And variants of the fragment, analog , And derivatives. Or, Particularly preferred embodiments of the invention in this regard Mr. Amino acid sequence of TNFδ and TNFε of human cDNA in the deposited clone A polypeptide having Its variants, analog, Derivatives, And fragments, And variants of the fragment, analog, And derivatives. Preferred variants include There are variants in which conservative amino acid substitutions differ from the reference. this Such a substitution is A given amino acid of a polypeptide can be replaced with another amino acid having similar properties. Substitution with an acid. What is typically observed as a conservative substitution is Aliphatic Amino acids Ala, Val, Leu, Substitution between Ile and Ile; Hydroxyl residue Ser And substitution of Thr, Exchange of the acidic residues Asp and Glu, Between the amide residues Asn and Gln Replacement, Exchange of the basic residues Lys and Arg, And the aromatic residue Phe, Between Tyr Permutation. More particularly preferred in this regard are: TNFδ and TNFε in FIGS. 1 and 2 The amino acid sequence of the polypeptide, Or amino acids of the cDNA in the deposited clone A variant having an acid sequence, analog, Derivatives, And fragments, And its A variant of the fragment, analog, And derivatives Here are a few Go A few, 5-10 pieces, 1-5, 1-3 of Two, One, Or zero Amino acid residues may be substituted in any combination, Deleted or Or added I have. Particularly preferred of these are: Properties and activity of TNFδ and TNFε Do not change silent replacement, Addition, And deletion. In this respect, Preferred for It is a conservative substitution. The most highly preferred are Without replacement 2 is a polypeptide having the amino acid sequence of FIGS. The polypeptides and polynucleotides of the present invention include: Preferably in isolated form Provided by And preferably, it is purified to homogeneity. The TGFδ polypeptide of the present invention comprises The polypeptide of SEQ ID NO: 2 (especially the mature polypeptide Peptide) as well as at least 70% similarity to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 (preferred). Or at least 70% identity), And more preferably the polypeptide of SEQ ID NO: 2 At least 90% similarity (more preferably at least 90% identity) to the Soshi Still more preferably, at least 95% similarity (more preferably) to the polypeptide of SEQ ID NO: 2. Preferably at least 95% identity) And again A portion of a polypeptide such as Such a portion of the polypeptide General Contains at least 30 amino acids and more preferably at least 50 amino acids Including things. The TGFε polypeptide of the present invention comprises The polypeptide of SEQ ID NO: 4 (especially the mature polypeptide Peptide) as well as at least 70% similarity to the polypeptide of SEQ ID NO: 4 (preferred). Or at least 70% identity), And more preferably the polypeptide of SEQ ID NO: 4 At least 90% similarity (more preferably at least 90% identity) to the Soshi Still more preferably, at least 95% similarity (more preferably) to the polypeptide of SEQ ID NO: 4. Preferably at least 95% identity) And again A portion of a polypeptide such as Such a portion of the polypeptide General Contains at least 30 amino acids and more preferably at least 50 amino acids Including things. As known in the art, "Similarity" between two polypeptides is One po The amino acid sequence of the polypeptide and its conserved amino acid substitutions into a second polypeptide. Determined by comparing to the sequence of the tide. A fragment or portion of a polypeptide of the present invention comprises Corresponding full length polypeptide Can be used to produce the peptide by peptide synthesis; therefore, Fragment Is It can be used as an intermediate to produce a full-length polypeptide. Of the present invention A fragment or portion of a polynucleotide is Full length polynucleotide of the present invention Can be used to synthesize The fragment is The aforementioned TNFδ and TNFε polypeptides and variants thereof Or is completely identical to part, but not all, of the amino acid sequence of the derivative. Polypeptide having an amino acid sequence of Such a fragment "F Standing ”(ie, not part of another amino acid or polypeptide). Or unfused), Or they are Some of them or It can be contained within a larger polypeptide that forms the region. Larger polypepti If included in the The fragment currently being discussed is Most preferably single Is formed. But, Some fragments are single larger May be included within a particular polypeptide. For example, Certain preferred embodiments include: Heterogeneous pre And the propolypeptide region at the amino acid terminus of the TNFδ and TNFε fragments Fused, An additional region is fused to the carboxyl terminus of the fragment. Was The invention contained within a precursor polypeptide designed for expression in a host To fragments of the clear TNFδ and TNFε polypeptides. therefore, This specification Fragments in one aspect of the intended meaning in the book are: TNFδ and TNFε Refers to the portion of the fusion polypeptide or fusion protein from which it is derived. As a typical example of the polypeptide fragment of the present invention, About 30 to about 233 amino Fragments with acids may be mentioned. In this context, "About" Especially indicated Range, And several, A few, 5, 4, 3, 2, Or one amino acid Include greater or lesser ranges at either or both extremes. No. For example, About 100-233 amino acids in this context 100 ± several, A few, 5, 4, 3, 2, Or 233 ± several from one amino acid, A few, 5, 4, 3, 2 , Or one amino acid residue (ie 100 minus several amino acids ~ 233 plus From the size of several amino acids, 100 plus several amino acids ~ 233 minus several Polypeptide fragments of up to amino acids). Very preferred in this regard is Either or both end values (extreme ) Is a recited range including an increase or decrease of about 5 amino acids. Especially non Always preferred is Include about 3 amino acids in either or both end values It is the range shown. Particularly particularly preferred are: Either or both ends Range including 1 amino acid change in the value of Or without additions or deletions It is the range shown. Most particularly preferred in this regard, About 15 to about It is a fragment of 233 amino acids. Among the particularly preferred fragments of the present invention are: Cleavage of TNFδ and TNFε There is a variant. The truncation mutant is A contiguous series of residues including the amino terminus (ie, Continuous area, part, Or part) or a continuous series containing carboxyl termini Deletion of residues, Or, Like the double truncation mutant, Two consecutive series of residues (One contains the amino terminus, And one containing the carboxyl terminus) And A TNFδ and TNFε polypeptide having the amino acid of FIG. 1 or 2, Or Includes variants or derivatives thereof. Fragments with the above size range Also, A preferred embodiment of the cleavage fragment, This is generally a fragment Especially preferred among the above. Also, Preferred in this aspect of the invention are: The structure of TNFδ and TNFε Is a fragment characterized by functional attributes. In this regard, the present invention In a preferred embodiment of Α-helix and α-helix of TNFδ and TNFε Formation area ("alpha area"), β sheet and β sheet forming region (“β region”), Ta And turn forming regions ("turn regions"), Coil and coil formation area ( "Coil area"), Hydrophilic region, Hydrophobic region, α amphiphilic region, β amphipathic region , movable part, Surface formation area, And fragments containing high antigenic index regions I do. Certain preferred areas at these points are: FIG. 4 and TNFε for TNFδ Is shown in FIG. By analysis of the amino acid sequence shown in FIGS. 1 and 2 Including the identified types of regions described above, It is not limited to this. Shown in FIGS. 4 and 5 So that Such a preferred area is Garnier-Robson α region, β region, Ta Area and coil area, Chou-Fasman α region, β region and turn region, Ky te-Doolittle hydrophilic region and hydrophilic region, Eisenberg α and β amphipathic domains , Karplus-Schulz moving parts, Emini surface formation area, And Jameson-Wolf high antigenicity The index area is included. Some highly preferred fragments in this regard include: Some structural features (For example, TNFδ and TNFε combining several features shown above) Some include regions. In this regard, Figure 1, 2, 4, And 5 signal pairs The region defined by the residues following the peptide region (all of which Turn area, parent Aqueous area, movable part, Surface formation area, Highly distinctive and highly antigenic indicator regions Characterized by the amino acid composition) A particularly preferred area . Such an area is May be contained within a larger polypeptide, Or discussed above As discussed, The preferred fragment of the present invention may itself be. This paragraph (par agraph), the term `` about '' Typically, Above about the fragment It will be understood to have the meaning set forth below. A more preferred area is It mediates TNFδ and TNFε activity. This point The most highly preferred in is TNFδ and TNFε chemical, biological, Also Is a fragment having another activity, this is, Similar activity or improved Activity Or those having a reduced undesirable activity. In this respect Always preferred is In the sequence or position or both sequences, And related Polypeptides (eg, In the active region of the related polypeptide shown in FIG. 3) A fragment containing a region homologous to this is, Human TNFα and β including. Some particularly preferred fragments in this regard include: Cutting as above There are variants. The present invention also provides Above all, Polynucleotide encoding the aforementioned fragment , Polynucleotide that hybridizes to the polynucleotide encoding the fragment Otide (especially Hybridizing under stringent conditions), and Polynucleotides for amplifying polynucleotides encoding fragments (For example, PCR primers). In these respects, Preferred polynucleotides are Corresponding to the preferred fragment as described above It is. The present invention also provides A vector comprising the polynucleotide of the present invention, Vector of the present invention Host cells that are genetically engineered with And the use of recombinant polypeptides of the invention For production. The host cell is Incorporating the polynucleotide of the present invention, And the polypep of the present invention. It can be engineered to express a tide. For example, The polynucleotide is infection , Transduction, Transfection, Transvection, And transformation Using knowledge technology, It can be introduced into a host cell. The polynucleotide is Alone or other Can be introduced in combination with the polynucleotide of the present invention. Such other polynucleones The tide is Can be independently introduced into the polynucleotide of the present invention, Can be introduced simultaneously Or Alternatively, they can be introduced in combination. Therefore, For example, Polynucleotide of the present invention The tide is For example, Of co-transfection and selection in mammalian cells Using standard techniques for Another separate poly that encodes a selectable marker It can be transfected into a host cell along with the nucleotides. in this case, Polinu Creotide is Typically, It is stably integrated into the host cell genome. Or, The polynucleotide is Selectable marker for growing in host Can be ligated. The vector construct is The host technology is Cells can be introduced. In general, Plasmid vectors are Sediment (for example, Rin Calcium precipitate) or as DNA in a complex with a charged lipid You. Electroporation also To introduce a polynucleotide into a host Can be used. If the vector is a virus, Bites that can be encapsulated in vitro Or into a packaging cell, And the encapsulated virus, Shape into cells Quality can be introduced. According to this aspect of the invention, To make a polynucleotide , And a wide variety of techniques suitable for introducing polynucleotides into cells are Is well known to traders, And everyday. Such technology is Sambrook et al. (Supra) ) Is fully outlined in This is a number of laboratory manuals that detail these technologies. This is Al's explanation. According to this aspect of the invention, The vector is For example, Plasmi Do vector, Single-stranded or double-stranded phage vector, Single- or double-stranded RN A or DNA viral vector. Such a vector is DNA to cells And well-known techniques for introducing RNA, Polynucleotide (preferably, D NA) can be introduced into cells. Vectors (of phage and viral vectors) Case) also By well-known techniques for infection and transduction, Also enclosed Can be introduced into cells as an encapsidated virus, And preferably introduction Is done. The viral vector is It may be replication competent or replication defective. rear Person, Virus growth is generally Occurs only in complementing host cells. Preferred among vectors are In certain respects, Polynucleotide of the present invention And for expression of the polypeptide. In general, Vector like this ー Operably linked to the polynucleotide to be expressed, Expression in host Cis-acting control region effective for Suitable trans-acting factors are Provided by the host Will be paid Supplied by a complementary vector, Or when transducing the host Or supplied by the vector itself. In certain preferred embodiments in this regard, The vector is Provides a specific expression I do. Such a specific expression is Inducible expression or only in certain types of cells Expression of Alternatively, it may be both inducible and cell-specific. Inducible vector Among them, particularly preferred is Surrounding factors that are easy to operate (for example, Temperature and nutrition ), The expression of which can be induced. Species suitable for this aspect of the invention Each vector is Constituency and use for prokaryotic and eukaryotic hosts And an inducible expression vector, this is, Well known to those skilled in the art, And daily use Used. The engineered host cells Can be cultured in conventional nutrient media, this is, In particular, promotion Activating the data, Selecting transformants, Or amplify genes It can be modified as appropriate. Previously used in the host cell selected for expression. Culture conditions used (eg, temperature, pH, etc.) Typically, Obvious to those skilled in the art Sea urchin Suitable for expression of a polypeptide of the invention. A great variety of expression vectors are Used to express the polypeptide of the present invention Can be Such a vector is Chromosomes, Episome, And virus-derived The reactor. For example, From bacterial plasmid, From bacteriophage, Yeast From the mother episome, From yeast chromosome elements, Baculovirus, Like SV40 Papova virus, Vaccinia virus, Adenovirus, Chicken pox Virus, Pseudorabies virus, And viruses such as retroviruses vector, And vectors derived from combinations thereof (eg, Cosmid or fa Derived from plasmid and bacteriophage genetic elements thing). These are all It can be used for expression according to this aspect of the invention. one Generally, A polynucleotide for expressing the polypeptide in a host, Wei Carry or Multiply or Or any vector suitable for expression, This point Can be used for expression. A suitable DNA sequence is By any of a variety of well-known and routine techniques, vector Can be inserted. In general, The DNA sequence for expression is DNA sequence and expression vector Cleaved with one or more restriction endonucleases, Then T4 DNA ligase And by binding together to the restriction fragment, Linked to an expression vector You. The procedures for restriction and ligation that can be used for this purpose are: Well known to those skilled in the art It is everyday. Proper procedures in this regard, And expression vector using another technique The appropriate steps to build the Well known to those skilled in the art Is) Shown in great detail in Sambrook et al. (Cited elsewhere herein). I have. The DNA sequence of the expression vector is A suitable expression control sequence (s); For example, m (Including a promoter that directs RNA transcription). like this As a representative of the promoter, λ phage PL promoter, E. coli lac, trp And tac promoters, SV40 early and late promoters, and retroviruses. Lus LTR promoter, just a few of the well-known promoters. I can. A number of unstated statements that are suitable for use in this aspect of the invention Promoters are well known and are exemplified by the discussion and examples herein. It is understood that it can be easily used by those skilled in the art in the manner described. Generally, the expression construct will contain sites for transcription initiation and termination, and In the transcribed region, it contains a ribosome binding site for translation. Fired by the structure The coding part of the mature transcript to be expressed is the transcription initiation AUG at the start, and is translated It includes a stop codon appropriately located at the end of the polypeptide. In addition, the constructs may contain control regions that regulate as well as engender expression. General In general, such regions control transcription according to many commonly practiced procedures. (Eg, in particular, repressor binding sites and enhancers -). Vectors for propagation and expression generally include a selectable marker. Such a marker may also be suitable for amplification, or the vector Additional markers for this purpose may be included. In this regard, expression vectors Preferably contains one or more selectable marker genes, Provides phenotypic characteristics for selection of host cells. The preferred marker is true Dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture, And E. Tetracycline or ampicillin for culturing E. coli and other bacteria Syrin resistance gene. A suitable DNA sequence as described elsewhere herein, as well as a suitable promoter , And other suitable control sequences are provided within the desired polypeptide. Can be introduced into a suitable host using a variety of well-known techniques suitable for expression in a host. Appropriate Typical examples of such hosts include E. coli. coli, Streptomyces, and Salmonella typhimuri bacterial cells such as um cells; fungal cells such as yeast cells; Drosophila S2 and Spo insect cells such as doptera Sf9 cells; such as CHO, COS, and Bowes melanoma cells Animal cells; and plant cells. Hosts for various expression constructs are well known And those skilled in the art, according to the present disclosure, will appreciate that polypeptides in accordance with this aspect of the present invention. The host for expressing the host can be easily selected. More specifically, the invention also includes recombinant constructs, such as expression constructs, Comprises one or more of the above sequences. The construct is a plasmid or viral vector Such vectors are inserted into such sequences of the invention. Arrangement The rows can be inserted in the forward or reverse direction. Particularly preferred embodiments in this regard In certain embodiments, the construct comprises a regulatory sequence (eg, a promoter) operably linked to the sequence. -). Many suitable vectors and promoters are known to those of skill in the art. And there are many commercially available vectors that are suitable for use in the present invention. I do. The following vectors are commercially available and are provided as examples. In bacteria Among the preferred vectors for use are pQE70, pQE60 and pQE available from Qiagen. E9: pBS vector, Phagescript vector, Bluescript available from Stratagene Vectors, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; and pt available from Pharmacia There are rc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 and pRIT5. Preferred eukaryotic vectors Include pWLNEO, pSV2CAT, p0G44, pXTL and pSG available from Stratagene And pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVL available from Pharmacia. This These vectors are listed solely as examples of many commercially and well-known vectors. And is available to those skilled in the art for use according to this aspect of the invention. For example, Introduction, maintenance, and propagation of the polynucleotide or polypeptide of the present invention in a host Or any other plasmid or vector suitable for expression is a subject of the present invention. It will be understood that it can be used in aspects. A promoter region is a reporter transcription unit that lacks the promoter region (eg, Chloramphenicol acetyltransferase ("cat") transcription unit) A candidate promoter fragment (ie, a fragment that may contain a promoter) Using a vector containing downstream of the restriction site (s) for introducing And any desired gene. As is well known, upstream of the cat gene Introduction of a fragment containing the promoter at the restriction site into the vector Which can be detected by a standard CAT assay. For this purpose Suitable vectors are well known and are readily available. Two such Are pKK232-8 and pCM7. Therefore, the polynucleotide of the present invention Promoters for expression of E. coli are not limited to well-known and readily available promoters. In addition, a promoter that can be easily obtained using a reporter gene by the aforementioned technique Also includes tar. Known bacteria suitable for expressing polynucleotides and polypeptides according to the invention Some promoters include E. coli. coli lacl and lacZ and promoters, T3 and T7 promoter, gpt promoter, λPR, PL promoter, and trp promoter Data. Among the known eukaryotic promoters that are suitable in this regard are CM V immediate early promoter, HSV thymidine kinase promoter, early and late SV 40 promoters, retrovirus LTRs such as Rous sarcoma virus ("RSV") Promoters, as well as metallotypes such as the mouse metallothionein-I promoter There is a thionein promoter. Suitable vectors for expression in host cells Selection of the promoter and promoter are well known procedures, and expression of the vector construct Essential techniques for introducing a vector into a host and for expression in the host include: It is routine for those skilled in the art. The present invention also relates to host cells containing the above-described constructs discussed above. Host The cells can be higher eukaryotic cells, such as mammalian cells, or lower, such as yeast cells. The host cell may be a eukaryotic cell, or the host cell may be a prokaryotic cell, such as a bacterial cell. Vesicles. Introduction of the construct into host cells can be achieved by calcium phosphate transfection, DEAE -Dextran-mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection By electroporation, transduction, infection, or other methods. Can be. Such methods are described in many standard laboratory manuals (eg, Davi s et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)). Host cells The construct in is a conventional method that produces the gene product encoded by the recombinant sequence. Can be used in the law. Alternatively, the polypeptide of the present invention may be a conventional peptide It can be produced synthetically by a synthesizer. The mature protein is suitable for use in mammalian cells, yeast, bacteria, or other cells. It can be expressed under the control of a promoter. The cell-free translation system is also a DNA construct of the present invention. Can be used to produce such proteins using RNA from a product. original Appropriate cloning and expression vectors for use in eukaryotic and eukaryotic hosts See, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold. Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) be written. Generally, a recombinant expression vector directs transcription of structural sequences downstream of the origin of replication. Highly expressed gene-derived promoter and vector after exposure to vector Includes a selectable marker that allows isolation of the containing cells. Of the appropriate promoter Some include, inter alia, saccharifying enzymes (eg, 3-phosphoglycerate kinase ("PGK")). ), The genes encoding a-factor, acid phosphatase, and heat shock proteins Some are derived from offspring. Selectable markers include E. coli. coli ampicillin resistance inheritance Child and S. cerevlsiae trpl gene. Transcription of a DNA encoding the polypeptide of the present invention by higher eukaryotes is enhanced. By inserting a sensor sequence into the vector. The enhancer is Usually a cis-acting element of about 10-300 bp of DNA, which is specific to a given host cell type. Acts to increase the transcriptional activity of the promoter in the cell. Enhancer example As the SV40 enhancer (located on the late side of the replication origin at bp 100 to 270), Cytomegalovirus early promoter enhancer, polyp late in the replication origin Oma enhancers and adenovirus enhancers. Polynucleotide of the invention encoding a heterologous structural sequence of the polypeptide of the invention Is generally such that it is operably linked to a promoter for expression. , Is inserted into the vector using standard techniques. Polynucleotides are transcribed It is positioned so that the start site is properly located 5 'of the ribosome binding site. Revo The sosome binding site is 5 'of the AUG that initiates translation of the polypeptide to be expressed. You. Generally, other open readings starting at the start codon (usually AUG) The frame is absent and is located between the ribosome binding site and the starting AUG . Also, generally, there will be a translation stop codon at the end of the polypeptide and Polyadenylation signal and transcription end properly positioned at the 3 'end of the defined region Signal is present. Secretion of translated protein into the lumen, periplasm, or extracellular environment of the endoplasmic reticulum To that end, an appropriate secretion signal can be incorporated into the expressed polypeptide. Shi Signals can be endogenous to the polypeptide or they can be heterologous signals. Can be null. The polypeptide is expressed in a modified form (eg, a fusion protein) and In addition to secretion signals as well as additional heterologous functional regions. So the example For example, regions of additional amino acids (especially altered amino acids) may be Improves stability and persistence in host cells during subsequent handling and storage Can be added to the N-terminus of the polypeptide to The region also facilitates purification To the polypeptide. Such a region is the region of the polypeptide It can be removed before final preparation. Stable, especially due to causing secretion or excretion Peptides to polypeptides to improve their properties and to facilitate purification The addition of parts is a well known and routine technique in the art. Propagating, maintaining, or generating polynucleotides and polypeptides according to the invention Currently suitable prokaryotic hosts include Escherichia coli, Bacillus subtilis, and S almonella typhimurium. Pseudomonas, Streptomyces, and Stap Various species of hylococcus are suitable hosts in this regard. In addition, Many other hosts that are known can also be used in this regard. As a representative but non-limiting example, useful expression vectors for bacterial use Is a commercially available vector containing the genetic elements of the well-known cloning vector pBR322 (ATCC 37017). It may include a selectable marker derived from a lathmid and a bacterial origin of replication. like this Examples of commercially available vectors include, for example, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala). , Sweden) and GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). these The pBR322 "backbone" portion of the Combined with the structural sequence. Transform the appropriate host strain below and grow the host strain to the appropriate cell density (this Here, the promoter selected is inducible) by appropriate means (eg, temperature Temperature shift or exposure to a chemical inducer), and the cells Cultured for a period. The cells are then typically collected by centrifugation and Disrupted by chemical or chemical means, and the resulting crude extract is subjected to further purification. To be maintained. Microbial cells used in protein expression can be any Simple method (freeze-thaw cycle, sonication, mechanical disruption, or cell lysing agent) These methods are well known to those skilled in the art. A variety of mammalian cell culture systems can be used for expression as well. From mammals Examples of current lines include the monkey kidney fibroblasts described in Gluzman et al., Cell, 23: 175 (1981). COS-7 strain. Other cell lines that can express compatible vectors include, for example, Examples include C127, 3T3, CHO, HeLa, human kidney 293 and BHK cell lines. Mammalian expression vectors contain an origin of replication, an appropriate promoter and enhancer. And also includes any necessary ribosome binding sites, polyadenylation sites, Price donor and acceptor sites, transcription termination sequences, and 5 'flanking Transcript sequences, which are required for expression. Certain preferences in this regard In a preferred embodiment, the DNA sequence from the SV40 splice site and the SV40 Nylation sites are responsible for these types of required non-transcribed genetic elements. Used for The polypeptides of the present invention can be recovered and used in well-known methods (such as ammonium sulfate or Is ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, Phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, Affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography And lectin chromatography) from recombinant cell culture. It is. Most preferably, high performance liquid chromatography ("HPLC") for purification Used for A well-known method for refolding proteins is If the peptide is denatured during isolation and purification, the active Can be used to produce. The polypeptides of the present invention include natural purified products, products of chemical synthetic procedures, and Prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, bacteria, yeast, higher plants) , Insects, and mammalian cells). Recombinant producer Depending on the host used in the sequence, the polypeptide of the invention may be glycosylated. It may or may not be glycosylated. In addition, the poly Peptides may also be used in some cases, such as as a result of a host-mediated process. Open It may contain an initially modified methionine residue. The polynucleotides and polypeptides of the present invention may be used in a variety of applications, especially TNFδ and And applications utilizing the chemical and biological properties of TNFε) according to the present invention. Can be used. These include apoptosis of transformed cell lines, cell activation and Mediates growth and proliferation and immunomodulatory antimicrobials, antivirals, and inflammation against pathogens There are applications in primary mediators of disease response susceptibility. Further applications are cells , The diagnosis and treatment of disorders of tissues and organisms. These aspects of the invention include: This is further explained by the following considerations. The present invention also provides a polynucleotide of the invention for detecting a complementary polynucleotide. It relates to the use of leotide (eg, as a diagnostic reagent). Books related to dysfunction Detection of a mutant form of the polypeptide of the present invention can be detected by underexpression, overexpression of the polypeptide of the present invention. Diseases resulting from overexpression or altered expression (eg, neoplasia such as tumors) ) Or provide diagnostic tools that can add or define a diagnosis of susceptibility to disease You. Individuals with mutations in the gene of the present invention can be detected at the DNA level by various techniques Can be done. Diagnostic nucleic acids are derived from patient cells (blood, urine, saliva, tissue biopsy, and autopsy). Test material). Genomic DNA can be used directly for detection or PCR Can be amplified enzymatically prior to analysis. PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 1 986). RNA or cDNA can be used as well. As an example, TNFδ or TN PCR primers that are complementary to the nucleic acid encoding Fε will express TNFδ or TNFε. And can be used to identify and analyze mutations. For example, deletions and insertions Is detected by a change in size of the amplified product compared to the normal genotype Can be done. Point mutations are radiolabeled TNFδ or TNFε RNA from amplified DNA. Alternatively, it hybridizes to a radiolabeled TNFδ or TNFε antisense DNA sequence. It can be identified by soybean. Perfectly matched sequences are ready for RNase A digestion More or by differences in melting temperatures can be distinguished from mismatched duplexes. Sequence differences between the reference gene and the mutated gene may also indicate a direct DNA sequence. It can be revealed by the column determination method. In addition, cloned DNA segments can be identified Can be used as a probe to detect a DNA segment. Such person The sensitivity of the method can be greatly enhanced by the appropriate use of PCR or another amplification method. For example, the sequencing primer may be a double-stranded PCR product generated by a modified PCR or Is used with single-stranded template molecules. Sequencing is performed using radiolabeled nucleotids. By conventional procedures using fluorescent tags or by automated sequencing procedures using fluorescent tags Done. Genetic testing based on DNA sequence differences can be performed on gels with or without denaturing agents. Achieved by detecting changes in the electrophoretic mobility of DNA fragments in obtain. Small sequence deletions and insertions are visualized by high-resolution gel electrophoresis. obtain. DNA fragments of different sequences are identified on denaturing formamide gradient gels. Can be separated. Here the mobility of different DNA fragments in the gel depends on their specificity Lag within the gel at different locations according to the local or partial melting temperature (eg, , Myers et al., Science, 230: 1242 (1985)). Sequence changes at specific positions can also be attributed to nuclease protection assays (eg, RNas e-protection and S1 protection or chemical cleavage methods (eg, Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sc i. 83: 4397-4401 (1985))). Therefore, the specific DNA sequence Detection includes hybridization, RNase protection, chemical cleavage, and direct DNA sequencing Or use of restriction enzymes (eg, restriction fragment length polymorphism (RFLP)) and genomic DNA It can be achieved by methods such as Southern blotting. More traditional gel electricity In addition to electrophoresis and DNA sequencing, mutations are also detected by in situ analysis. Can be issued. The sequences of the present invention are also valuable for chromosome identification. The sequence consists of individual human chromosomes The specific location above can be specifically targeted and hybridized to that location. In addition, there is now a need to identify specific sites on the chromosome. Currently, chromosome position Chromosome labeling based on actual sequence data (repeated polymorphism) available for labeling Few drugs. The mapping of DNA to chromosome according to the invention This is an important first step in correlating with the disease-related gene. In certain embodiments in this regard, the cDNA disclosed herein comprises Used to clone the genomic DNA of the gene of the invention. This can vary Using publicly known techniques and generally commercially available libraries . Genomic DNA is prepared using in-situ chromosome mapping using well-known techniques for this purpose. Used for ping. Typically, follow routine procedures for chromosome mapping. Some attempts and mistakes have led to good in situ hybridization. It may be necessary to identify genomic probes that give a signal. In some cases, in addition, sequences may be used to convert cDNA to PCR primers (preferred). Or 15-25 bp) can be mapped to the chromosome. 3 'untranslated gene Computer analysis of translation regions spans more than one exon in genomic DNA Used to quickly select primers that do not complicate the amplification process Is done. These primers are then used for somatic cell hybrids containing individual human chromosomes. Used for PCR screening of lids. The human gene corresponding to the primer Only containing hybrids yield amplified fragments. PCR mapping of somatic cell hybrids assigns specific DNA to specific chromosomes A quick procedure for Use the same oligonucleotide primer with the present invention Use a panel of fragments from a particular chromosome or size in a similar fashion Using a pool of genomic clones, sublocalization Can be achieved. Other mappings that can also be used to map to chromosomes Strategy was in situ hybridization, labeled and flow sorted (flow-sorted) Prescreening using chromosomes and chromosome-specific cDNA libraries Includes preselection by hybridization to construct libraries . Fluorescence in situ hybridization of cDNA clones to metaphase chromosome spreads ("FISH") can be used to provide accurate chromosomal location in one step You. This technique can be used with cDNAs as short as 50 or 60. Of this technology For a review, see Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques. See Pergamon Press, New York (1988). Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical The location can be correlated with the genetic map data. Such data is described, for example, in M cKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins University, Welch Me (available online from the dical Library). Then The relationship between a disease and a gene that maps to the same chromosomal region is described by linkage analysis (physical analysis). (Simultaneous inheritance of genes adjacent to the gene). Next, differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals Need to decide. The mutation is observed in some or all affected individuals, If not observed in any normal individual, this mutation is a causative agent of the disease. It is. At the current resolution of physical and genetic mapping techniques, disease A cDNA correctly located in a chromosomal region associated with a potential of between 50 and 500 It may be one of the causative genes. (This is a 1 megabase mapping resolution, And one gene per 20 kb). The present invention also relates to diagnostic assays (eg, cells of the invention in cells and tissues). To detect protein levels (including determining normal and abnormal levels) Quantitative and diagnostic assays). So, for example, normal control For detecting overexpression of the TNF protein of the present invention compared to a tissue sample, Diagnostic assays according to the invention are used, for example, to detect the presence of neoplasia. Can be used. In a sample derived from the host, the protein (eg, the protein Assay techniques that can be used to determine levels of is there. Such assays include radioimmunoassays, competitive binding assays. Say, Western blot analysis, and ELISA assays. these Among them, ELISA is often preferred. ELISA assays are first performed on the proteins of the invention. A step of preparing a specific antibody (preferably, a monoclonal antibody). In addition, reporter antibodies that bind to the monoclonal antibodies are generally prepared. . Reporter antibodies can be detection reagents (eg, radioactive, fluorescent, or enzymatic). In this example, it is attached to horseradish peroxidase enzyme). To perform the ELISA assay, a sample is removed from the host and Solid supports that bind proteins in the sample (eg, polystyrene dishes) ). Then, any free protein on the dish Binding site to non-specific proteins (eg, bovine serum albumin) Covered by batting. Next, the monoclonal antibody is Antibody attached to any protein of the invention attached to a polystyrene dish For a period of time in the dish. Unbound monoclonal anti The body is washed out with a buffer. Reporter conjugated to horseradish peroxidase -Any monoclonal antibody that has been placed in the dish and bound to the protein of the invention Binding of the reporter antibody to the local antibody occurs. Next, the non-attached report The target antibody is washed out. Then, a reagent for peroxidase activity (colorimetric Amount of substrate) is added to the dish. Book via primary and secondary antibodies The immobilized peroxidase bound to the protein of the invention produces a colored reaction product. Produce. The amount of color developed at a given time depends on the amount of the present invention present in the sample. 1 shows the amount of the protein. Quantitative results are typically obtained with reference to a calibration curve. Can be A competition assay may be used, where the protein of the invention is attached to a solid support. Quality-specific antibodies and labeled proteins of the invention and host-derived Pulls are passed over the solid support and attached to the solid support and detected. The amount of label provided can be correlated with the amount of the protein of the invention in the sample. Polypeptides, their fragments, or other derivatives, or their Analogs or cells that express them produce antibodies against them. Can be used as an immunogen. These antibodies are, for example, polyclonal or Can be a monoclonal antibody. The invention also includes chimeric antibodies, single chain antibodies, and And humanized antibodies, as well as Fab fragments or the products of an Fab expression library. Including. Various methods known in the art can be used to produce such antibodies and fragments. Can be used for raw. Antibodies raised against polypeptides corresponding to the sequences of the present invention are polypeptides Injection of the polypeptide directly into the animal, or the polypeptide (preferably non-human) into the animal. Can be obtained. The antibody so obtained is then used to express the polypeptide itself. Binds to the body. Thus, a sequence encoding only a fragment of a polypeptide Even used to generate antibodies that bind to the whole native polypeptide Can be Such antibodies can then be used to express polypeptides from tissues expressing the polypeptide. It can be used to isolate tide. Produced by continuous cell line culture to prepare monoclonal antibodies Any technique that provides antibodies can be used. Examples include hybridoma technology (Kohl er, G. And Milstein, C. , Nature, 256: 495-497 (1975)), trioma Technology, human B cell hybridoma technology (Kozbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983 )), And EBV-hybridoma technology for producing human monoclonal antibodies ( Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, I nc. (1985)). The technology described for the production of single-chain antibodies (US Pat. No. 4,946,778) Can be adapted to produce single-chain antibodies against a light immunogenic polypeptide product. You. Also, other organisms, such as transgenic mice or other animals, Can be used to express humanized antibodies to a clear immunogenic polypeptide product You. The above antibodies may be used to isolate clones expressing the polypeptide or to Isolation and / or isolation by affinity chromatography. Alternatively, by adsorbing the antibody to a solid support for purification, the polypeptide of the present invention can be used. It can be used to purify tide. Thus, the polypeptides of the present invention inhibit neoplasia (eg, tumor cell growth). Can be used to harm. The polypeptides of the invention can be used for apoptosis and identification. May be responsible for tumor destruction via cytotoxicity to other cells. The polypeptide of the present invention It also induces up-regulation of adherent cells (eg, LFA-1) and therefore Can be used for wound healing. The polypeptides of the present invention also have growth promoting activity. Can be used for the treatment of diseases that require (eg, restenosis). Because This is because the polypeptide of the present invention has a proliferative effect on cells of endothelial origin. . Therefore, the polypeptides of the invention also modulate angiogenesis in endothelial cell development. Can be used to save. The polypeptides of the present invention also stimulate T cell activation, and therefore Used to stimulate the immune response to live, bacterial, and viral infections Can be used. The polypeptides of the present invention also treat autoimmune diseases in this regard. Used to eliminate self-responsive T cells to place and / or prevent obtain. Examples of autoimmune diseases include type I diabetes. The invention also relates to molecules such as receptor molecules that bind the proteins of the invention. A method for identifying is provided. Proteins that bind to the proteins of the invention (eg, The gene encoding the receptor protein can be prepared by a number of methods known to those skilled in the art. (Eg, ligand panning and FACS sorting). This Methods such as, for example, Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2): It is described in many laboratory manuals, such as Chapter 5 (1991). For example, expression cloning can be used for this purpose. For this purpose, Riadenylated RNA is prepared from cells responsive to the protein of the present invention and has a cDNA library. The library is made from this RNA, the library is split into pools, Pools are individually transfected into cells that are not responsive to the protein of the invention. You. The transfected cells are then exposed to a labeled protein of the invention. You. The proteins of the present invention can be prepared by various well-known techniques (radioiodination or site-specific). (Including standard methods of inclusion of recognition sites for specific protein kinases) Can be done. Following exposure, the cells were fixed and cytostatin tin) is determined. These steps are conveniently performed on glass slides. You. A pool of cDNAs that produced TNFδ or TNFε binding cells is identified. Sub pool Are prepared from these positives and transfected into host cells as described above. Sfected and screened. Repeat subpooling (sub putative binding molecules (e.g., -pooling) and rescreening processes For example, one or more single clones encoding the receptor molecule) can be isolated. Alternatively, the labeled ligand is a molecule to which it binds (eg, a receptor Cell extract prepared from cells expressing the molecule (eg, a membrane or a membrane extract) Can be photoaffinity bound. The cross-linking material was polyacrylamide gel electrophoresis ("PA GE ") and exposed to X-ray film. Ligand-receptor Containing labeling complex is excised, degraded into peptide fragments, and Quality microsequencing. Micro-sequencing results The amino acid sequence is used to identify the gene encoding the putative receptor molecule. Unique or degenerate arrays for screening libraries It can be used to design gonucleotide probes. The polypeptides of the present invention can also provide TNFδ or TNF in cells or cell-free preparations. Assess TNFδ or TNFε binding ability of NFε binding molecule (eg, receptor molecule) Can be used to The invention also relates to the effects of TNFδ or TNFε on cells (eg, Interaction with a TNFδ or TNFε binding molecule such as Methods for screening compounds to identify objects are provided. Agonists Increasing the natural biological function of a polypeptide of the invention, or A compound that functions in a manner similar to a polypeptide, while an antagonist is Reduce or eliminate such features. For example, a cell compartment (eg, a membrane or its preparation such as a membrane preparation) Is a molecule that binds to TNFδ or TNFε (eg, is altered by TNFδ or TNFε). Prepared from cells that express regulated signaling or regulatory pathway molecules). Can be This preparation is an agonist or antagonist of TNFδ or TNFε. Labeled TNFδ or TNF in the absence or presence of possible candidate molecules Incubate with ε. The ability of a candidate molecule to bind to a binding molecule is determined by the labeling Reflects reduced Gand binding. Free (ie TNFδ or TNFε binding molecules Binding without inducing the effect of TNFδ or TNFε in binding to Molecules are probably good antagonists. Binds well and TNFδ Or molecules that elicit effects that are identical or closely related to TNFε, He is a nest. TNFδ or TNFε-like effects of potential agonists and antagonists are For example, a second message following the interaction of the candidate molecule with cells or appropriate cell preparations Measuring the activity of the sender system and the effect of this on TNFδ or TNFε or Is measured by comparing the effects of molecules that elicit the same effect as TNFδ or TNFε. Can be determined. Second messenger systems that may be useful in this regard include AM P-guanylate cyclase, ion channel, or phosphoinositide hydrolysis A second messenger system includes, but is not limited to. Another example of an assay for a TFNδ or TFNε antagonist is TFNδ or TFNε. Represents TFNε and potential antagonists and membrane-bound TFNδ or TFNε receptor Suitable for competitive inhibition assays with offspring or recombinant TFNδ or TFNε receptor molecules This is a competitive assay combined under conditions. TFNδ or TFNε is the receptor component The number of TFNδ or TFNε molecules bound to the molecule is determined and the potential antagonist It can be labeled with radioactivity or the like so that the efficacy can be accurately evaluated. Potential antagonists include small organic molecules, peptides, polypeptides, and Antibodies that bind to and thereby inhibit or abolish their activity No. Potential antagonists may also induce small organic molecules, peptides, TFNδ or TFNε. Binding to the same site on a binding molecule such as a receptor molecule without inducing Thereby eliminate the action of the polypeptide of the invention from binding to its receptor. A closely related protein or antibody such as an antibody that prevents It can be a peptide. Another potential antagonist binds TFNδ or TFNε and membrane bound TFNδ Or a TFNδ or TFNε receptor that prevents it from interacting with the TFNε receptor It is a soluble form of putter. In this manner, the receptor is activated by its ligand. Not stimulated. Potential antagonists bind and occupy the binding site of the polypeptide, and Cellular properties such as receptor molecules, thereby preventing normal biological activity Includes small molecules that prevent binding to binding molecules. Examples of small molecules are small organic molecules, Including but not limited to peptides or non-peptide antagonists. Other potential antagonists include antisense molecules. Antisense technology Gene expression through antisense DNA or RNA or through triple helix formation Can be used to control. Antisense technology is described, for example, in Okano, J .; Neuroc hem. , 56: 560, 1991; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988). Triple Cancer formation is described, for example, by Lee et al., Nucleic Acids Research, 6: 3073 (1979); Cooney et al. Science, 241: 456 (1988); and Dervan et al., Science, 251, 1360 (1991). Will be discussed. These methods involve binding of a polynucleotide to complementary DNA or RNA. Based on For example, a polynucleotide encoding a mature polypeptide of the invention The 5 'coding portion of the antisense RNA oligonucleotide is approximately 10-40 base pairs in length. Can be used to design tides. DNA oligonucleotides are involved in transcription Is designed to be complementary to the region of the gene Prevent transcription and production. Antisense RNA oligonucleotides are used in vivo To the RNA, and to the TFNδ or TFNε polypeptide of the mRNA molecule Block translations. The above oligonucleotides also include antisense RNAs. Or the DNA is expressed in vivo to inhibit the production of the polypeptide of the invention. It can be delivered to cells. An antagonist can be a pharmaceutically acceptable carrier (eg, hereinbelow). As described). Antagonists include, for example, lipoproteins that are inhibited by TFNδ or TFNε. To treat cachexia, a lipid removal deficiency arising from systemic deficiency of cytoplasmic lipase Can be used. Antagonists also indicate that the polypeptides of the present invention play a pathogenic role. It can be used to treat cerebral malaria that appears to be ill. Antago Nists also report TFNδ or TFNε-induced inflammatory cytokines (eg, synovial cells To treat rheumatoid arthritis by inhibiting the production of IL1) in Can be used. When treating arthritis, the polypeptides of the invention are preferably associated with It is injected intranodal. Antagonists may also prevent immune system stimulation in the presence of the graft. More, it can be used to prevent graft-host rejection. Antagonists also inhibit bone resorption, thus treating and treating osteoporosis. And / or to prevent it. Antagonists may also treat endotoxin shock as anti-inflammatory factors and Can be used to This important symptom is that it is resistant to bacterial and other types of infection. Resulting from excessive response. The present invention also relates to a polynucleotide or a polypeptide or an agonis as defined above. Or a composition comprising an antagonist. Therefore, the polypeptide of the present invention A non-sterile or sterile carrier (single) for use with cells, tissues or organs Or more) (eg, a pharmaceutical carrier suitable for administration to a subject). It can be used together. Such compositions may be, for example, excipients or therapeutically active substances. An effective amount of a polypeptide of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Including. Such carriers include saline, buffered saline, dextrose. Water, glycerol, ethanol, and combinations thereof. Not determined. The formulation should suit the mode of administration. The present invention further relates to one or more of the above compositions of the present invention filled with one or more components. Pharmaceutical packs and kits, including the above containers. Chemicals in such containers Or prescribed by a government agency that regulates the manufacture, use, or sale of biological products. Instructions in the form of a product, for the manufacture, use, or use of a product for administration to humans. A notice reflecting the approval of the agency of sale may be accompanied. The polypeptides and other compounds of the present invention can be used alone or in other compounds (eg, Therapeutic compound). Pharmaceutical compositions can be administered in any effective, convenient manner (eg, Oral, anal, vaginal, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intranasal, or intradermal) Can be administered. Pharmaceutical compositions generally are useful for treating or preventing a particular symptom or symptoms. Administered in an effective amount for administration. Generally, the composition will be present in an amount of at least about 10 μg / kg body weight. Is administered. In most cases this will not exceed about 8 mg / kg body weight per day. Given. Preferably, in most cases, the dose will be from about 10 μg / kg to about 1 mg / kg body daily. It is heavy. Optimal administration will depend on the type of symptom, the severity, Can be determined by standard methods, taking into account the route of administration, the complexity of the symptoms, etc. Understood. Polynucleotide which is a polypeptide of the present invention, polypeptide, agonist, And antagonists, by in vivo expression of such polypeptides It can be used according to the present invention in a treatment modality often referred to as "gene therapy". Thus, for example, a cell from a patient may be a polynucleotide encoding a polypeptide. Cells (eg, DNA or RNA) can be engineered ex vivo, and then the engineered cells It can be provided to a patient to be treated with the polypeptide. For example, a cell may be a cell of the invention. Use of a retroviral plasmid vector containing an RNA encoding a polypeptide Can be operated ex vivo. Such methods are well known in the art and Thus, this use in the present invention is apparent from the teachings herein. Similarly, cells may express polypeptides in vivo by procedures known in the art. It can be manipulated in vivo for realization. For example, the polynucleotide of the present invention As noted, it can be engineered for expression in a replication defective retroviral vector. You. The retroviral expression construct can then be isolated and the polypeptide of the invention Transduced with a retroviral plasmid vector containing the peptide-encoding RNA Can be introduced into the packaged cells, so that the packaging cells are now Produce infectious virus particles containing the gene of interest. These producers The vesicles manipulate cells in vivo and for expression of the polypeptide in vivo. It can be administered to a patient. Administration of the polypeptide of the present invention by such a method. These and other methods for clarifying will be apparent to those skilled in the art from the teachings of the present invention. The retrovirus from which the retroviral plasmid vector described above can be derived Lus contains Moloney Mouse Leukemia Virus, Spleen Necrosis Virus, Rous Sarcoma Rus, retroviruses such as Harvey sarcoma virus, avian leukemia virus, te Long monkey leukemia virus, human immunodeficiency virus, adenovirus, myeloproliferative Sarcoma virus and mammalian tumor virus, including but not limited to No. In one embodiment, the retroviral plasmid vector is Molonema Derived from the mouse leukemia virus. Such vectors contain one or more promoters for expressing the polypeptide. Including Suitable promoters that can be used include the retroviral LTR; Motor; and humans as described in Miller et al., Biotechniques, 7: 980-990 (1989). Cytomegalovirus (CMV) promoter, or any other promoter (eg, For example, contains histone, RNA polymerase III, and β-actin promoter However, cellular promoters such as, but not limited to, eukaryotic cellular promoters But not limited thereto. Other viral promoters that can be used Are adenovirus promoter, thymidine kinase (TK) promoter, and And B19 parvovirus promoters. The appropriate The choice of a motor will be apparent to those skilled in the art from the teachings contained herein. The nucleic acid sequence encoding the polypeptide of the present invention may be under the control of a suitable promoter. To be placed. Suitable promoters that can be used are adenovirus major late promoters. Adenovirus promoter such as motor: or cytomegalovirus (C Heterologous promoters such as MV) promoter; respiratory syncytial virus (RSV) pro Motor; inducible promoters such as MMT promoter, metallothionein promoter Motor; heat shock promoter; albumin promoter; ApoAI promoter Promoter; human globin promoter; herpes simplex thymidine kinase promoter Virus-like thymidine kinase promoter; retroviral LTR (Honmei The modified retrovirus LTR described above in the written description); β-actin promoter; And the human growth hormone promoter. promotion The promoter is also a natural promoter that controls the gene encoding the polypeptide. Can be Retroviral plasmid vector transduces packaging cell line , Used to form producer cell lines. Can be transfected Examples of such packaging cells are Miller, A .; , Human Gene Therapy, 1: 5-14 (1990 ) PE501, PA317, Y-2, Y-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, YCRE, YCR Including but not limited to IP, GP + E-86, GP + envAm12, and DAN cell lines. The vector can be used to transduce the packaging cells through any means known in the art. Can be entered. Such means include electroporation, the use of liposomes, And CaPO_FourIncluding but not limited to precipitation. As an alternative, retro Viral plasmid vectors can be encapsulated in liposomes or Can be bound to a substance and then administered to a host. The producer cell line is an infectious agent that contains a nucleic acid sequence encoding a polypeptide. This gives rise to torovirus vector particles. Then, such a retro virus vector Particles transduce eukaryotic cells either in vitro or in vivo Can be used for The eukaryotic cell to be transduced encodes the polypeptide. To express the nucleic acid sequence. Eukaryotic cells that can be transduced include embryonic stem cells, embryonic carcinomas Cells, as well as hematopoietic stem cells, hepatocytes, fibroblasts, myoblasts, keratinocytes, Including but not limited to endothelial cells and bronchial epithelial cells. The present invention is further described by the following examples. Examples are specific implementations By way of reference only, is provided only to illustrate the invention. These examples Illustrates certain aspects of the present invention, but does not limit the scope of the disclosed invention or It does not represent a restriction. All examples are well known to those skilled in the art, except where described in detail. Performed using standard techniques that are routine. The daily molecular organism of the following examples Science techniques are referred to herein as standard research references (eg, “Sambrook”). , Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed .; Cold Sp. ring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) It can be implemented as follows. Unless otherwise specified, all parts or amounts shown in the following examples are By weight. Unless otherwise stated, fragment sizes in the following examples Isolation is described by Sambrook and many other references (eg, Goeddel et al., Nucleic Acids). Res., 8: 4057 (1980)) and agarose and polyacrylamide gel electrolysis. Performed using standard techniques of electrophoresis ("PAGE"). Unless otherwise stated, Ligation was performed using standard buffer, incubation temperature and time (0.5 μg Approximately equimolar amounts of DNA fragment to be ligated and about 10 T4 DNA ligase ("ligase") was achieved. Example 1 Expression and purification of human TFNδ and TFNε in soluble form using bacteria DNA encoding human TNFδ or TNFε in the deposited polynucleotide The sequence is specific to the amino acid carboxyl terminal sequence of human TNFδ or TNFε protein. PCR oligonucleotide probes specific for vector sequences that are unique and 3 'to the gene Amplification was performed using a primer. Contains restriction sites to facilitate cloning The additional nucleotides are added to the 5 'and 3' sequences, respectively. The 5 'oligonucleotide primer has the sequence 5'GCGGGA TCC CAG AGC CTC ACC A CA G 3 ', which is an underlined restriction site followed by position 115 of the ATG codon Including the 16 nucleotide coding sequence shown in the figure starting with the base The 3 'primer has the sequence 5'CGCAAG CTT ACA ATC ACA GTT TCA CAA AC 3 ' Shown in FIGS. 1 and 2 containing a lined HindIII restriction site followed by a stop codon Includes 20 nucleotides complementary to the last 13 nucleotides of the coding sequence. Restriction sites are convenient for restriction enzyme sites on the bacterial expression vector pQE-9, Used in these examples for bacterial expression (Qiagen, Inc. Chatsworth , CA). pQE-9 is resistant to ampicillin antibiotic resistance (Amp^r) Code and bacterial replication Origin, IPTG-inducible promoter, ribosome binding site ("RBS"), 6-His Encodes a tag and a restriction enzyme site. Both amplified human TNFδ DNA and vector pQE-9 were digested with BamHI and HindIII. The digests were then ligated together. PQE-9 restriction vector for TNF6DNA Insertion of the TNFδ coding region into the vector downstream of the IPTG-inducible promoter. Operably linked to this, and properly positioned for TNFδ translation. The starting AUG was placed in-frame. Transform the ligation mixture into competent E. coli cells using standard procedures did. Such a procedure is described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manua. l, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). E. coli strain M containing multiple copies of plasmid pREP4 15 / rep4 (which expresses the lac repressor and also has kanamycin resistance (Ka n^r) Is used in performing the exemplary embodiments described herein. Was. This strain (this is the only of many that is suitable for expressing TNFδ ) Is commercially available from Qiagen. Transformants were transformed with LB plates in the presence of ampicillin. Identified by their ability to grow on a plate. Plasmid DNA resistant colonies And the identity of the cloned DNA was confirmed by restriction analysis. Clones containing the desired construct were ligated with ampicillin (100 μg / ml) and kanamycin. Overnight ("O / N") in liquid culture in LB medium supplemented with both (25 μg / ml) Bred. Use O / N culture to inoculate a large culture at a dilution of about 1: 100 to 1: 250 You. Cells are grown at an optical density at 600 nm between 0.4 and 0.6 (OD₆₀₀). Then, isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside ("IPTG") was added to 1 mM Lac repressor by finalizing and inactivating the lacI repressor -Induced transcription from a sensitive promoter. Continue the cells for another 3-4 hours Incubated. The cells are then collected by centrifugation and performed according to standard methods. Destroyed. The inclusion bodies are purified from the disrupted cells using routine collection techniques and The protein was solubilized from the inclusion bodies in 8M urea. 8M with solubilized protein Pass the urea solution through a PD-10 column in 2x phosphate buffered saline ("PBS"), Thereby removing the urea, changing the buffer, and refolding the protein It is. The protein is purified by an additional step of chromatography and The toxin was removed. It was then sterile filtered. Sterile filtered protein preparation, Stored in 2 × PBS at a concentration of 95 μg / mL. For analysis of TNFδ preparations by standard methods of polyacrylamide gel electrophoresis Thus, the preparation contains about 80% of the monomer with the expected molecular weight of about 20.8 kDa. It became clear that it was. The protein is converted to a protein containing a 6-HIS tag on a nickel chelate column. Purification by chromatography under conditions that allow for form binding. Protein The material is eluted from the column in 6 molar guanidine HCl (pH 5.0) and regenerated. Example 2 Of soluble human TFNδ and TFNε in baculovirus expression system Cloning and expression Encodes full-length human TNFδ or TNFε protein in the deposited clone CDNA sequences corresponding to the 5 'and 3' sequences of this gene Amplify using tide primers: The 5 'primer has the sequence 5'GCGGGA TCC CCA GAG CCT CAC CAC AG 3 ' BamHI restriction enzyme sites, followed by TNFδ or TNFε in FIGS. 1 and 2 Contains 16 bases of the sequence. Inserted into an expression vector, as described below, The 5 'end of the amplified fragment encoding human TNFδ or TNFε is efficient To provide a simple signal peptide. Efficiency for translation initiation in eukaryotic cells Typical signals are described by Kozak, M., J. et al. Mol. Biol. 196: 947-950 (1987) So that it is located in the vector portion of the construct. The 3 'primer has the sequence 5'CGCTCT AGA ACA ATC ACA GTT TCA CAA AC 3 ' , Including the underlined XbaI restriction site followed by a stop codon, as shown in FIGS. A nucleotide complementary to the last 13 nucleotides of the TNFδ or TNFε coding sequence. Including. The amplified fragment was purified using a commercially available kit (“Geneclean” BIO 101 Inc., La. (Jolla, Ca.) using a 1% agarose gel. Then this flag Is digested with BamHI and Asp718 and purified again on a 1% agarose gel. You. This fragment is designated herein as F2. TNFδ or TNFε protein can be generated from baculovirus using vector pA2GP. In the current system, standard methods (for example, Summers et al., A Manual of Methods for B aculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultura l Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987)) Expressed. The expression vector is Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Contains the strong polyhedrin promoter of (AcMNPV) followed by a convenient restriction site . The signal peptide of AcMNPV gp67 (including the N-terminal methionine) is located at the BamHI site. It is located upstream of Chidoro. Simian virus 40 ("SV40") polyadenylation site Used for efficient polyadenylation. Easy selection of recombinant viruses For example, the β-galactosidase gene from E. coli was Orientation followed by the polyadenylation signal of the polyhedrin gene. Po Rihedrin sequences are used for cell-mediated homologous recombination with wild-type viral DNA. Viable to express cloned polynucleotides, flanked on both ends by a bovine sequence Generate virus. As will be readily appreciated by those skilled in the art, construction involves transcription, translation, trafficking, etc. Properly positioned signals (eg, in-frame AUG and if necessary Signal peptide), many other baculovirus vectors , Can be used instead of pA2-GP. For example, pAc373, pVL941, and pAcIM1 You. Such vectors are described, inter alia, in Luckow et al., Virology, 170: 31-39. Is done. Plasmids were converted to restriction enzymes BamHI and Xba using routine procedures known in the art. Digest with I and then dephosphorylate using calf intestinal phosphatase. Then 1% DNA using a commercially available kit ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca) Isolate from agarose gel. This vector DNA is designated herein as "V2". I do. Fragment F2 and dephosphorylated plasmid V2 were ligated using T4 DNA ligase. Tie. E. coli HB101 cells are transformed with the ligation mixture and plated on culture plates. spread. Digest DNA from individual colonies with BamHI and XhaI, then Analysis of the digestion products by electrophoresis allows the detection of human TNFδ or TNFε Bacteria containing the plasmid with the gene are identified. Sequence of cloned fragment Is confirmed by DNA sequencing. This plasmid is designated herein as pBacTNFδ. Name. 5 μg of plasmid pBacTNFδ was transferred to Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 : 1.013 μg using the lipofection method described by Commercially available linearized baculovirus DNA ("BaculoGold^TM baculovirus DNA ”, P harmingen, San Diego, CA.). 1 μg Bac uloGold^TMViral DNA and 5 μg of plasmid pBacTNFδ were added to 50 μl of serum-free Microcells containing Grace's medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) Mix in sterile wells of the iterplate. Then, add 10 μl of Lipofectin and And 90 μl of Grace's medium, mix and incubate for 15 minutes at room temperature. To The transfection mixture was then added to serum-free Grace's medium 1 Sf9 insect cells (ATCC CRL 1711) seeded in 35 mm tissue culture plates with ml To be dropped. Shake plate back and forth to mix freshly added solution You. The plate is then incubated at 27 ° C. for 5 hours. 5 hours later, transformer The fection solution was removed from the plate and supplemented with 10% fetal bovine serum. Add ml Grace's insect medium. Return the plate to the incubator, and Continue culturing at 27 ° C for 4 days. After 4 days, the supernatant was collected and as described in Summers and Smith (supra). Perform plaque assay. Gal-expressing claw producing blue-stained plaques "Blue Gal" (Life Technolog) to enable easy identification and isolation of agarose gel with ies Inc., Gaithersburg) is used. (This type of " A detailed description of the plaque assay is also available from Life Technologies Inc., Gaithersbu rg, a user's guide to insect cell culture and baculovirology distributed at 10 page)). Four days after serial dilution, virus is added to the cells. Proper incubation Later, the plaque stained blue is picked up with the tip of an Eppendorf pipette. Then Agar containing recombinant virus, eppendorf containing 200 μl Grace's medium Resuspend in tube. The agar is removed by brief centrifugation and recombined. Baculovirus-containing supernatant is used to infect Sf9 cells seeded on 35 mm dishes Used to Four days later, the supernatants of these culture dishes are collected and then Store them at 4 ° C. Control clones containing properly inserted TNFδ or TNFε Identify by DNA or TNFε analysis, including restriction mapping and sequencing. this Is designated herein as V-TNFδ. Sf9 cells are grown in Grace's medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS. Cells At a multiplicity of infection (MOI) of about 2 (about 1 to about 3) with recombinant baculovirus V-TNFδ Infect. After 6 hours, the medium was removed and methionine and cysteine were removed. SF900 II medium without media (available from Life Technologies Inc., Gaithersburg) Replace with 42 hours later, 5 μCi³⁵S-methionine and 5 μCi³⁵S Add stain (available from Amersham). Incubate cells for another 16 hours Cells are then harvested by centrifugation, lysed, and labeled The proteins are visualized by SDS-PAGE and autoradiography. Example 3 TFN Tissue distribution of δ expression To determine the expression level of TFNδ in human tissues, among others, Sambrok et al. Northern blot analysis was performed using the method described by supra). All details RNAzol for vesicle RNA samples^TMB system (Biotecx Laboratories, Inc. 6023 South L oop East, Houston, TX 77033). Approximately 10 μg of total RNA was isolated from tissue samples. RNA, 1% agarose gel Size separation was performed by electrophoresis under strong denaturing conditions. Remove RNA from gel Blot on a filter and then filter the filter to detectably label Prepared for hybridization to nucleotide probes. The deposited clone was used as a probe to detect mRNA encoding TFNδ. The antisense strand of the coding region of the cDNA insert was labeled with high specific activity. The cDNA was primed using the Prime-It kit (available from Stratagene). Labeled with Reactions are performed using 50 ng of cDNA and standards recommended by the supplier. The reaction was performed according to a typical reaction protocol. Label the labeled polynucleotide with Select-G-50 Lamb (entered from 5-Prime-3-Prime, Inc., 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303) Purified from other labeled reaction components by column chromatography using . The labeled probe was used at a concentration of 1,000,000 cpm / ml in 7% SDS, 0.5 M NaPO._Four, PH 7.4 In small doses, hybridized to the filter at 65 ° C. overnight. Thereafter, the probe solution was discarded, the filter was washed twice at room temperature, and Wash twice with × SSC, 0.1% SDS at 60 ° C. The filter is then dried and Expose film to -70 ° C overnight using intensifying screen. Autoradiography is best performed in the heart, then in the placenta and kidney. Also had high expression, indicating that TFNδ mRNA was detected in all 16 tissues. Show. Example 4 Gene therapeutic expression of human TFNδ or TFNε Fibroblasts are obtained from the subject by skin biopsy. Transfer the obtained tissue to a tissue culture medium. Place and separate into small pieces. Place a small mass of tissue on a wet table in a tissue culture flask. Place on a surface and place about 10 clumps in each flask. Turn the flask upside down, Tighten tightly and leave at room temperature overnight. After 24 hours at room temperature, invert the flask While the tissue mass remains fixed at the bottom of the flask and fresh medium (eg, For example, Ham's F12 medium containing 10% FBS, penicillin, and streptomycin) Add. The tissue is then incubated at 37 ° C. for about one week. at this point, Fresh medium is added and changed every few days one after another. 2 more weeks in culture Later, a monolayer of fibroblasts appears. The monolayer is trypsinized and the larger Transfer to Lasco. Cloning the vector to be expressed, the fragment to be expressed Digest with restriction enzymes. Digest vector with calf to prevent self-ligation Treat with small intestinal phosphatase. Dephosphorylated linear vector is transferred to agarose And purified. A cDNA capable of expressing active TFNδ or TFNε is isolated. If necessary, go to vector Modify the ends of the fragments for cloning. For example, a 5 "overhang Can be treated with DNA polymerase to create blunt ends. 3 'overhang end The ends can be removed using S1 nuclease. Linker blunt with T4 DNA ligase Can be connected to the end. Equivalent Moloney murine leukemia virus linear skeleton and TFNδ or TFNε flag Mix and ligate using T4 DNA ligase. Consolidated mixture, form E.coli The bacteria are then plated on agar containing kanamycin. You. Kanamycin phenotype and restriction analysis were performed on the gene with the vector inserted properly. Make sure you have Packaging cells were cultured in tissue culture with 10% calf serum (CS), penicillin, Conflue in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with streptomycin To the desired concentration. TFNδ or packaging cells by standard techniques Transduces a vector containing the TFNε gene. Recovered from packaging cells Infectious virus particles containing the TFNδ or TFNε gene -Called cells. Add fresh medium to the producer cells and after the appropriate incubation time The medium is recovered from the plate of confluent producer cells. Medium (feel Filter (including infectious virus particles) through a Millipore filter. Remove the reducer cells. The filtered medium is then used to infect fibroblasts. Used to Remove medium from fibroblast subconfluent plate And immediately replace the filtered medium. Transform polybrene (Aldrich) It may be included in the medium for ease. After appropriate incubation, remove this medium. Left And replace with fresh medium. If the virus titer is high, virtually all fibroblasts The vesicle is infected and no selection is necessary. If titer is low, traits for expansion Retroviruses with selectable markers such as neo and his to select for incoming cells Vectors need to be used. The engineered fibroblasts were then used alone or with Cytodex 3 beads. After growing to confluence on microcarrier beads such as It can be injected into rats. Injected fibroblasts produce TFNδ or TFNε products And the biological action of the protein is transmitted to the host. The present invention may be practiced other than as specifically described in the above description and examples. It is clear that you get. Many modifications and variations of the present invention in light of the above teachings. It is possible if possible, and thus is within the scope of the appended claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/02 Ａ６１Ｐ 19/10 19/10 29/00 29/00 37/06 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/525 Ｃ０７Ｋ 14/525 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＬＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者ユ，ゴ―リエンアメリカ合衆国メリーランド 20878, ダーネスタウン，ストローベールレーン 13524 (72)発明者ジェンツ，レイナーエル. アメリカ合衆国メリーランド 20904, シルバースプリング，フェアランドパークドライブ 13404 (72)発明者ディロン，パトリックジェイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 92009, カールズバッド，スナイプコート 1055──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI theme coat ゛ (Reference) A61P 19/02 A61P 19/10 19/10 29/00 29/00 37/06 37/06 37/06 C07K 14/525 C07K 14/525 C12P 21/02 L C12N 5/10 C12N 5/00 B C12P 21/02 A61K 37/02 (72) Inventor Yu, Gorien United States of America Maryland 20878, Darnesstown, Strawvale Lane 13524 (72 Inventor Genz, Reiner L. United States Maryland 20904, Silver Spring, Fairland Park Drive 13404 (72) Inventor Dillon, Patrick Jay. United States California 92009, Carlsbad, Snipe Court 1055

Claims

[Claims] 1. At least 70% identity to a member selected from the group consisting of: An isolated polynucleotide comprising a polynucleotide having: (a) a polypeptide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 nucleotide; (b) a polypeptide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 nucleotide; (c) a polypeptide encoding a polypeptide comprising amino acids 39 to 233 of SEQ ID NO: 2 Renucleotide; (d) a polynucleotide that is complementary to the polynucleotide of (a), (b), or (c) ;and (e) containing at least 15 bases of the polynucleotide of (a), (b), (c), or (d) Polynucleotide. 2. The polynucleotide according to claim 1, wherein the polynucleotide is DNA. 3. 2. The polynucleotide according to claim 1, wherein said polynucleotide is RNA. 4. The polynucleotide according to claim 1, wherein the polynucleotide is genomic DNA. Chid. 5. 3. The polypeptide of claim 2, which encodes a polypeptide comprising the amino acid of SEQ ID NO: 2. Polynucleotide. 6. Encoding a polypeptide comprising amino acids 39 to 233 of SEQ ID NO: 2; The polynucleotide according to claim 2. 7. 3. The polypeptide of claim 2, which encodes a polypeptide comprising the amino acid of SEQ ID NO: 4. Polynucleotide. 8. 3. Encoding a polypeptide comprising amino acids 1-188 of SEQ ID NO: 4. 3. The polynucleotide according to item 1. 9. At least 70% identical to a member selected from the group consisting of: An isolated polynucleotide, including a polynucleotide: (A) amino acid sequence expressed by human cDNA contained in ATCC accession number 97377 A polynucleotide encoding a mature polypeptide having a sequence; (b) amino acid sequence expressed by human cDNA contained in ATCC Accession No. 97457 A polynucleotide encoding a mature polypeptide having a sequence; (c) a polynucleotide that is complementary to the polynucleotide of (a) or (b); (d) a polynucleotide comprising at least 15 bases of the polynucleotide of (a), (b), or (c). nucleotide. 10. 2. The method of claim 1, comprising nucleotides 447 to 1717 of SEQ ID NO: 1. Polynucleotides listed. 11. 2. The method of claim 1, comprising nucleotides 332 to 1717 of SEQ ID NO: 1. Polynucleotides listed. 12. 2. The method according to claim 1, comprising nucleotide 1 to nucleotide 564 of SEQ ID NO: 3. Polynucleotide. 13. A vector comprising the DNA according to claim 2. 14． A host cell comprising the vector of claim 13. 15. A polypeptide encoded by the DNA from the host cell of claim 14. A process for producing a polypeptide, comprising the step of expressing a peptide. 16. A step of genetically engineering a cell using the vector according to claim 12. , Whereby the polypeptide encoded by the human cDNA contained in the vector A process for producing cells that expresses 17． A polypeptide comprising a member selected from the group consisting of: (a) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; and (b) a polypeptide comprising amino acids 39 to 233 of SEQ ID NO: 2; (c) a polypeptide comprising amino acids 1-188 of SEQ ID NO: 4; and (d) at least 70% identity to the polypeptide of (a), (b), or (c); Polypeptide. 18. The polypeptide comprises amino acids 1 to 233 of SEQ ID NO: 2. Item 18. The polypeptide according to Item 17. 19. The polypeptide comprises amino acid 39 to amino acid 233 of SEQ ID NO: 2. Item 18. The polypeptide according to Item 17. 20. The polypeptide comprises amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 4. Item 18. The polypeptide according to Item 17. 21. A compound that inhibits activation of the polypeptide of claim 17. 22. 18. A method for treating a patient having a need for TNFδ, as claimed in claim 17. Administering to the patient a therapeutically effective amount of the polypeptide described above. 23. 18. A method for treating a patient having a need for TNFε, as claimed in claim 17. Administering to the patient a therapeutically effective amount of the polypeptide described above. 24. The therapeutically effective amount of the polypeptide is a DNA encoding the polypeptide. To the patient and expressing the polypeptide in vivo. 23. The method of claim 22, wherein the method is administered. 25. The therapeutically effective amount of the polypeptide is a DNA encoding the polypeptide. To the patient and expressing the polypeptide in vivo. 24. The method of claim 23, wherein the method is administered. 26. A method for treating a patient in need of inhibiting a TNFδ polypeptide. Administering a therapeutically effective amount of the compound of claim 21 to said patient. How. 27. A method for treating a patient in need of inhibiting a TNFε polypeptide. Administering to the patient a therapeutically effective amount of the compound of claim 21. How. 28. A disease or disorder associated with underexpression of the polypeptide of claim 17. A process for diagnosing susceptibility to, encoding said polypeptide A process comprising determining a mutation in a nucleic acid sequence. 29. Analyzing the presence of the polypeptide of claim 17 in a sample derived from the host. A diagnostic process comprising the steps of: 30. Binding to the polypeptide of claim 17 and inhibiting its activation A method for identifying a compound, comprising: A receptor for the polypeptide, wherein the receptor is the receptor for a compound. Associates with a second component that can provide a detectable signal in response to binding to the putter Cells expressing the receptor on its surface and an analytically detectable TNFδ polypeptide Contacting the peptide and the compound under conditions capable of binding to the receptor; And Detect the absence of a signal produced from the interaction of TNFδ with the receptor Thereby determine whether the compound binds to and inhibits the receptor. Process A method comprising: