JP2001163895A - Fluorescent nucleotide - Google Patents

Fluorescent nucleotide

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JP2001163895A
JP2001163895A JP34788699A JP34788699A JP2001163895A JP 2001163895 A JP2001163895 A JP 2001163895A JP 34788699 A JP34788699 A JP 34788699A JP 34788699 A JP34788699 A JP 34788699A JP 2001163895 A JP2001163895 A JP 2001163895A
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Japan
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group
compound
nucleic acid
fluorescent nucleotide
synthesis
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JP34788699A
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Japanese (ja)
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Hiroko Inomata
弘子 猪股
Hiroshi Shinoki
浩 篠木
Masayoshi Kojima
政芳 小島
Yukio Sudo
幸夫 須藤
Junji Nishigaki
純爾 西垣
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Fujifilm Holdings Corp
Original Assignee
Fuji Photo Film Co Ltd
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new fluorescent nucleotide useful for labeling a nucleic acid. SOLUTION: This fluorescent nucleotide is represented by the formula A-B-C, wherein, A is a residue of a natural or synthetic nucleotide, an oligonucleotide, a polynucleotide or a derivative thereof, and linked to B with the base part in the residue; B is a divalent linking group or a single bond; and C is a monovalent group derived from the general formula (I) and linked to B with a reactive group present in R1 or R2.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光標識試薬とし
て有用なアザメチン化合物を用いた蛍光ヌクレオチド並
びにその利用に関するものである。
[0001] The present invention relates to a fluorescent nucleotide using an azamethine compound useful as a fluorescent labeling reagent and its use.

【0002】[0002]

【従来の技術】相同核酸配列の検出のために最も多く用
いられる分子生物学的方法の1つはDNA/DNA、R
NA/RNA又はRNA/DNAハイブリッド形成であ
る。この方法ではプローブとして用いる核酸(DNA又
はRNA)を標識し、この標識された核酸を検出すべき
核酸(DNA又はRNA)とハイブリダイゼーションさ
せる。プローブとして用いた核酸と検出すべき核酸の間
に相同性が存在する場合、それぞれの相補的な1本鎖の
核酸がハイブリダイゼーションし、2本鎖が形成され、
その2本鎖をプローブの標識により検出する。
BACKGROUND OF THE INVENTION One of the most commonly used molecular biology methods for the detection of homologous nucleic acid sequences is DNA / DNA, R
NA / RNA or RNA / DNA hybridization. In this method, a nucleic acid (DNA or RNA) used as a probe is labeled, and the labeled nucleic acid is hybridized with a nucleic acid (DNA or RNA) to be detected. When there is homology between the nucleic acid used as the probe and the nucleic acid to be detected, each complementary single-stranded nucleic acid hybridizes to form a double strand,
The double strand is detected by labeling the probe.

【0003】従来より核酸をプローブとして用いる場
合、ラジオアイソトープでプローブを標識する方法が用
いられ、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーショ
ンの有無はオートラジオグラフィーにより検出されてい
た。遺伝子プローブを標識する際にラジオアイソトープ
を利用する方法は特に感度が高い点で優れているが、ラ
ジオアイソトープの取り扱いに付随して実験室の安全性
の確保及び放射性化合物の廃棄の問題という繁雑さが存
在していた。また、ラジオアイソトープは半減期を有す
るため、一定期間しか用いることができないという問題
点もあった。
Conventionally, when a nucleic acid is used as a probe, a method of labeling the probe with a radioisotope has been used, and the presence or absence of hybridization between the probe and the target nucleic acid has been detected by autoradiography. The use of radioisotopes for labeling gene probes is particularly advantageous in terms of high sensitivity, but the complexity of handling radioisotopes involves ensuring laboratory safety and disposing of radioactive compounds. Existed. In addition, since radioisotopes have a half-life, there is also a problem that they can be used only for a certain period.

【0004】上記理由から、より簡便な方法として非放
射性標識法が開発されてきており、例えば、遺伝子プロ
ーブをビオチン分子(欧州特許第0 063 879号明
細書)又はジゴキシゲニン分子(欧州特許第0 324
474 A1号明細書)を用いて標識する方法が知られ
ている。標識核酸プローブと検出すべき核酸配列とのハ
イブリダイゼーションを行った後、形成された2本鎖核
酸の中にはビオチン分子またはジゴキシゲニン分子が存
在する。ハイブリダイゼーション後、これらに対して
(ストレプト)アビジン−マーカー酵素複合体又はジゴ
キシゲニンへの抗−ジゴキシゲニン抗体−マーカー酵素
複合体を結合することによって、プローブがハイブリダ
イゼーションした核酸を検出することができる。しかし
ながら、このような酵素を用いた検出法は、感度や特異
性の面で十分なものではなかった。
[0004] For the above reasons, a non-radioactive labeling method has been developed as a simpler method. For example, a gene probe is used as a biotin molecule (EP 063 879) or a digoxigenin molecule (EP 0 324).
474 A1) is known. After hybridization between the labeled nucleic acid probe and the nucleic acid sequence to be detected, a biotin molecule or a digoxigenin molecule is present in the formed double-stranded nucleic acid. After hybridization, the nucleic acid hybridized with the probe can be detected by binding the (strept) avidin-marker enzyme complex or the anti-digoxigenin antibody-marker enzyme complex to digoxigenin. However, the detection method using such an enzyme has not been sufficient in terms of sensitivity and specificity.

【0005】また上記方法以外にも、蛍光色素で標的物
質を標識する方法が種々研究されている。蛍光標識試薬
に求められる性能としては、(1)高い蛍光量子収率を
有すること、(2)高い分子吸光係数を有すること、
(3)水溶性で、かつ水性溶媒中で凝集して自己消光を
起こさないこと、(4)加水分解を受けにくいこと、
(5)光分解が起こりにくいこと、(6)バックグラウ
ンド蛍光の影響を受けにくいこと、(7)標的物質と共
有結合を生じさせる反応性置換基が導入されていること
などが挙げられる。蛍光標識試薬として古くから知られ
ているフルオレセインイソチオシアネート(FIT
C)、ローダミンイソチオシアネートは高い蛍光量子収
率を有するものの、分子吸光係数が低く、また励起及び
発光波長が500nm−600nmであるため、例えば
ブロッティングに用いるメンブレンのバックグラウンド
蛍光の影響を受けやすいという欠点がある。
[0005] In addition to the above methods, various methods for labeling a target substance with a fluorescent dye have been studied. The performance required of the fluorescent labeling reagent is (1) having a high fluorescence quantum yield, (2) having a high molecular extinction coefficient,
(3) water-soluble and does not undergo self-quenching by aggregating in an aqueous solvent; (4) being less susceptible to hydrolysis;
(5) It is difficult for photodecomposition to occur, (6) It is hard to be affected by background fluorescence, and (7) A reactive substituent which causes a covalent bond with a target substance is introduced. Fluorescein isothiocyanate (FIT) which has long been known as a fluorescent labeling reagent
C) Although rhodamine isothiocyanate has a high fluorescence quantum yield, it has a low molecular extinction coefficient and has an excitation and emission wavelength of 500 nm to 600 nm, and thus is susceptible to the background fluorescence of a membrane used for blotting, for example. There are drawbacks.

【0006】分子吸光係数の高い色素としては、例えば
米国特許第5486616号明細書、特開平2−191
674号公報、同5−287209号公報、同5−28
7266号公報、同8−47400号公報、同9−12
7115号公報、同7−145148号公報、同6−2
22059号公報に記載されたシアニン色素、Journal
of Fluorescence, 5, 231ページ(1995年)に記載され
たバルビツール酸オキソノール等のポリメチン色素が知
られているが、これらは水に溶けにくく、また溶解して
も加水分解が生じる等の問題がある。また、色素同士の
分子間相互作用が強いために水性媒体中で凝集体を生
じ、そのため蛍光の自己消光が観測される場合が多い。
また、特開平2−191674号公報等に記載されてい
るシアニン色素は比較的安定な発色団にスルホン酸基を
導入することで水溶性を付与し、かつ凝集体の形成を抑
制した優れた色素であるが、蛍光量子収率が充分に高い
とは言えず、またスルホン酸基の導入により色素の合成
が困難になるという問題点があった。このような状況か
ら、蛍光が強い特性に加えて、水溶性が高く安定で凝集
による蛍光消光が起こらない蛍光色素の開発が求められ
ていた。
As dyes having a high molecular extinction coefficient, for example, US Pat. No. 5,486,616, JP-A-2-191.
Nos. 674, 5-287209, 5-28
No. 7266, No. 8-47400, No. 9-12
Nos. 7115, 7-145148 and 6-2
No. 22059, cyanine dyes, Journal
Polymethine dyes such as oxonol barbiturates described in of Fluorescence, 5, page 231 (1995) are known. However, these are difficult to dissolve in water and have problems such as hydrolysis when dissolved. is there. In addition, since the intermolecular interaction between the dyes is strong, aggregates are formed in the aqueous medium, so that self-quenching of fluorescence is often observed.
Further, the cyanine dyes described in JP-A-2-191677 are excellent dyes which impart water solubility by introducing a sulfonic acid group into a relatively stable chromophore and suppress the formation of aggregates. However, there are problems that the fluorescence quantum yield cannot be said to be sufficiently high, and that the introduction of a sulfonic acid group makes it difficult to synthesize a dye. Under such circumstances, in addition to the property of strong fluorescence, there has been a demand for the development of a fluorescent dye which has high water solubility, is stable and does not cause fluorescence quenching due to aggregation.

【0007】蛍光が強いその他の色素骨格として、英国
特許第870,753号明細書に記載されたアザインド
レニンシアニン色素の例があるが、該特許には水溶性、
凝集性、水溶液安定性等、蛍光標識試薬に必須の特性に
関する記載が無く、さらには標的物質と共有結合を生じ
させる反応性置換基を導入した例も記載されていないこ
とから、このアザインドレニンシアニン色素の蛍光標識
試薬としての適性は全く未知であった。また、特開平4
−358143号公報、同3−135553号公報、同
1−280750号公報、欧州特許第341958号公
報には、アザインドレニンシアニンを写真用途に適用し
た例が示されているが、これらはアザインドレニンシア
ニンの吸収特性を利用したものであり、発光特性に着目
してそれらを積極的に利用したものではなかった。
[0007] As another dye skeleton having strong fluorescence, there is an example of an azaindolenine cyanine dye described in British Patent No. 870,753.
This azaindolenine is not described because there is no description about the essential properties of the fluorescent labeling reagent, such as aggregability and aqueous solution stability, and further, there is no description of an example of introducing a reactive substituent that causes a covalent bond with a target substance. The suitability of cyanine dyes as fluorescent labeling reagents was unknown at all. In addition, Japanese Unexamined Patent Application Publication No.
JP-A-358143, JP-A-3-135553, JP-A-1-280750, and EP 341958 show examples in which azaindolenine cyanine is applied to photographic applications. It was based on the absorption characteristics of renin cyanine, and was not focused on the emission characteristics and was not actively utilized.

【0008】[0008]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とし
た。即ち、本発明は、核酸の標識のために有用な新規な
蛍光ヌクレオチドを提供することを解決すべき課題とし
た。
SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art. That is, an object of the present invention is to provide a novel fluorescent nucleotide useful for labeling a nucleic acid.

【0009】[0009]

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた結果、蛍光標識試薬と
して最近開発されたアザアメチン化合物を用いてヌクレ
オチドと複合体を形成し、その複合体を用いて核酸を標
識および検出した結果、核酸への取り込み率および検出
の際の蛍光強度が優れていることを見出し、本発明を完
成するに至った。
Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, formed a complex with a nucleotide using an azamethine compound recently developed as a fluorescent labeling reagent. As a result of labeling and detecting the nucleic acid using the complex, it was found that the incorporation rate into the nucleic acid and the fluorescence intensity upon detection were excellent, and the present invention was completed.

【0010】即ち、本発明によれば、式:A−B−Cで
表される蛍光ヌクレオチドが提供される。[式中、Aは
天然又は合成のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は
ポリヌクレオチドあるいはそれらの誘導体の残基を示
し、上記残基中の塩基部分でBと結合し、Bは2価の連
結基または単結合を示し、Cは下記一般式(I)から誘
導される1価の基であり、R1またはR2中に存在する反
応性基でBと結合している。
That is, according to the present invention, there is provided a fluorescent nucleotide represented by the formula: ABC. [In the formula, A represents a residue of a natural or synthetic nucleotide, oligonucleotide, polynucleotide or a derivative thereof, and binds to B at a base moiety in the residue, and B represents a divalent linking group or a single bond. Wherein C is a monovalent group derived from the following general formula (I), and is bonded to B by a reactive group present in R 1 or R 2 .

【化2】 (式中、R1及びR2はそれぞれ独立に、Bと共有結合し
得る反応性基で置換されていてもよいアルキル基を示
し;R3、R4、R5、及びR6はそれぞれ独立にアルキル
基を示すが、R3とR4、及び/又はR5とR6は互いに結
合してそれらが結合する炭素原子とともに飽和の炭素環
を形成してもよく;V1、V2、V3、V4、V 5、V6、V
7、V8、V9、及びV10はそれぞれ独立に水素原子又は
一価の置換基を示し、これらのうち隣接する2つの基は
互いに結合して環を形成してもよく;L1、L2、及びL
3は置換又は無置換のメチン基を示し;m、n、s、及
びtは0又は1を示し、ただしm+n=1かつs+t=
1であり;pは1、2、又は3を示し;Mは対イオンを
示し;qは分子の電荷を中和するのに必要な数を示
す)]
Embedded image(Where R1And RTwoAre independently and covalently linked to B
Represents an alkyl group which may be substituted with a reactive group
RThree, RFour, RFive, And R6Are each independently alkyl
Represents a group, but RThreeAnd RFourAnd / or RFiveAnd R6Are connected to each other
A saturated carbocycle with the carbon atoms to which they are attached
May be formed; V1, VTwo, VThree, VFour, V Five, V6, V
7, V8, V9, And VTenAre each independently a hydrogen atom or
Represents a monovalent substituent, of which two adjacent groups are
L may combine with each other to form a ring;1, LTwo, And L
ThreeRepresents a substituted or unsubstituted methine group; m, n, s, and
And t represent 0 or 1, provided that m + n = 1 and s + t =
P is 1, 2, or 3; M is a counter ion
Represents the number required to neutralize the molecular charge
)]

【0011】好ましくは、R1及びR2のうち少なくとも
一つはB中のアミノ基、ヒドロキシル基、又はチオール
基と共有結合し得る活性エステル基で置換されたアルキ
ル基である。より好ましくは、R1及びR2のうち少なく
とも一つはカルボキシル基で置換されたアルキル基であ
る。
Preferably, at least one of R 1 and R 2 is an alkyl group substituted with an active ester group capable of covalently bonding to an amino group, a hydroxyl group or a thiol group in B. More preferably, at least one of R 1 and R 2 is an alkyl group substituted with a carboxyl group.

【0012】好ましくは、Aはヌクレオチドあるいはそ
れらの誘導体の残基である。より好ましくは、Aは
(1)AMP、ADP、ATP、GMP、GDP、GT
P、CMP、CDP、CTP、UMP、UDP UT
P、TMP、TDP、TTP、2−Me−AMP、2−
Me−ADP、2−Me−ATP、1−Me−GMP、
1−Me−GDP、1−Me−GTP、5−Me−CM
P、5−Me−CDP、5−Me−CTP、5−MeO
−CMP、5−MeO−CDP、5−MeO−CTPか
ら成るヌクレオチドから成る群、(2)前記ヌクレオチ
ドに対応するデオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌ
クレオチドから成る群、並びに(3)前記(1)および
(2)に記載のヌクレオチドからさらに誘導される誘導
体、から成る群から選ばれる天然又は合成のヌクレオチ
ド又はその誘導体の残基を示す。
Preferably, A is the residue of a nucleotide or a derivative thereof. More preferably, A is (1) AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GT
P, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP UT
P, TMP, TDP, TTP, 2-Me-AMP, 2-
Me-ADP, 2-Me-ATP, 1-Me-GMP,
1-Me-GDP, 1-Me-GTP, 5-Me-CM
P, 5-Me-CDP, 5-Me-CTP, 5-MeO
A group consisting of nucleotides consisting of -CMP, 5-MeO-CDP and 5-MeO-CTP; (2) a group consisting of deoxynucleotides and dideoxynucleotides corresponding to the nucleotides; and (3) the above (1) and (2). And natural or synthetic nucleotides or derivatives thereof selected from the group consisting of derivatives further derived from the nucleotides described in 1. above.

【0013】好ましくは、Bは−CH2−、−CH=C
H−、−C≡C−、−CO−、−O−、−S−、−NH
−またはこれらの組み合わせから成る連結基であって、
連結基上の水素原子は置換基でさらに置換されていても
よい連結基である。より好ましくは、Bはアミノアリル
基である。
Preferably, B is -CH 2- , -CH = C
H-, -C≡C-, -CO-, -O-, -S-, -NH
Or a linking group consisting of a combination thereof,
A hydrogen atom on the linking group is a linking group which may be further substituted with a substituent. More preferably, B is an aminoallyl group.

【0014】本発明の別の側面によれば、核酸合成酵素
と鋳型核酸と本発明の蛍光ヌクレオチドとを用いて核酸
合成反応を行うことを含む、蛍光標識された核酸の調製
方法が提供される。好ましくは、核酸合成反応は、逆転
写反応、ターミナルトランスフェラーゼ反応、ランダム
プライム法、PCR法またはニックトランスレーション
法から成る群から選ばれる反応である。
According to another aspect of the present invention, there is provided a method for preparing a fluorescently labeled nucleic acid, comprising performing a nucleic acid synthesis reaction using a nucleic acid synthase, a template nucleic acid and the fluorescent nucleotide of the present invention. . Preferably, the nucleic acid synthesis reaction is a reaction selected from the group consisting of a reverse transcription reaction, a terminal transferase reaction, a random prime method, a PCR method and a nick translation method.

【0015】本発明のさらに別の側面によれば、本発明
の蛍光ヌクレオチドで標識された核酸プローブまたはプ
ライマーが提供される。本発明のさらに別の側面によれ
ば、本発明の蛍光ヌクレオチドから成る核酸検出用試薬
または診断薬が提供される。本発明のさらに別の側面に
よれば、(1)本発明の蛍光ヌクレオチド、(2)核酸
合成酵素および(3)緩衝液を含む、核酸検出用キット
が提供される。
According to still another aspect of the present invention, there is provided a nucleic acid probe or primer labeled with the fluorescent nucleotide of the present invention. According to still another aspect of the present invention, there is provided a nucleic acid detecting reagent or diagnostic agent comprising the fluorescent nucleotide of the present invention. According to still another aspect of the present invention, there is provided a kit for detecting a nucleic acid, comprising (1) the fluorescent nucleotide of the present invention, (2) a nucleic acid synthase, and (3) a buffer.

【0016】[0016]

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施態様および実
施方法について詳細に説明する。本発明は式:A−B−
Cで表される蛍光ヌクレオチドに関する。上記式中、A
は天然又は合成のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又
はポリヌクレオチドあるいはそれらの誘導体の残基を示
す。天然又は合成のヌクレオチドとしては、(1)AM
P、ADP、ATP、GMP、GDP、GTP、CM
P、CDP、CTP、UMP、UDP UTP、TM
P、TDP、TTP、2−Me−AMP、2−Me−A
DP、2−Me−ATP、1−Me−GMP、1−Me
−GDP、1−Me−GTP、5−Me−CMP、5−
Me−CDP、5−Me−CTP、5−MeO−CM
P、5−MeO−CDP、5−MeO−CTPから成る
ヌクレオチドから成る群、(2)前記ヌクレオチドに対
応するデオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオ
チドから成る群、並びに(3)前記(1)および(2)
に記載のヌクレオチドからさらに誘導される誘導体、か
ら成る群から選ばれる天然又は合成のヌクレオチド又は
その誘導体が挙げられるが、これらに限定されるわけで
はない。天然又は合成のヌクレオチドのより具体的な例
としては、ATP、CTP、GTP、TTP、UTP、dATP、dCTP、dGT
P、dTTP、dUTP、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP、ddUTP、
又はこれらの誘導体などを挙げることができるが、これ
らに限定されるわけではない。
DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, embodiments and a method for implementing the present invention will be described in detail. The present invention has the formula: AB-
The fluorescent nucleotide represented by C. In the above formula, A
Represents a residue of a natural or synthetic nucleotide, oligonucleotide or polynucleotide or a derivative thereof. Examples of natural or synthetic nucleotides include (1) AM
P, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CM
P, CDP, CTP, UMP, UDP UTP, TM
P, TDP, TTP, 2-Me-AMP, 2-Me-A
DP, 2-Me-ATP, 1-Me-GMP, 1-Me
-GDP, 1-Me-GTP, 5-Me-CMP, 5-
Me-CDP, 5-Me-CTP, 5-MeO-CM
A group consisting of nucleotides consisting of P, 5-MeO-CDP, 5-MeO-CTP; (2) a group consisting of deoxynucleotides and dideoxynucleotides corresponding to the nucleotides; and (3) the above (1) and (2)
And derivatives derived from the nucleotides described in (1), or natural or synthetic nucleotides or derivatives thereof selected from the group consisting of, but not limited to. More specific examples of natural or synthetic nucleotides include ATP, CTP, GTP, TTP, UTP, dATP, dCTP, dGT
P, dTTP, dUTP, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP, ddUTP,
Or a derivative thereof, but is not limited thereto.

【0017】オリゴヌクレオチドとは、上記ヌクレオチ
ドまたはその誘導体が1〜50個程度、好ましくは1〜
30個程度、さらに好ましくは1〜20個程度重合して
成るものであり、構成単位の各ヌクレオチドは同一でも
相違していてもよい。ポリヌクレオチドとは、上記ヌク
レオチドまたはその誘導体が多数重合して重合体であ
り、その大きさ(長さ)は特に限定されず、例えば塩基
数として数bpから数kbに至るものでもよい。本明細
書で用いる蛍光ヌクレオチドと言う用語は、核酸成分が
上記したようなヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよ
びポリヌクレオチドである場合の全てを含む意味で用い
られる。
Oligonucleotides include about 1 to 50 nucleotides or derivatives thereof, preferably 1 to 50 nucleotides or derivatives thereof.
It is formed by polymerizing about 30, more preferably about 1 to 20, and each nucleotide of the structural unit may be the same or different. The polynucleotide is a polymer obtained by polymerizing a large number of the above nucleotides or derivatives thereof, and the size (length) thereof is not particularly limited, and may be, for example, a number of bases ranging from several bp to several kb. As used herein, the term fluorescent nucleotide is used to include all cases where the nucleic acid component is a nucleotide, oligonucleotide and polynucleotide as described above.

【0018】Aはヌクレオチド残基中の塩基部分でBと
結合する。ヌクレオチド残基の塩基部分としては、プリ
ン誘導体とピリミジン誘導体が挙げられる。プリン塩基
中における連結基Bとの結合部位は、糖成分と結合する
9位以外であれば特に制限されず、例えばプリン塩基が
アデニンの場合には2位または8位で、あるいは6位に
存在するアミノ基で連結基Bと結合することができ、プ
リン塩基がグアニンの場合には1位または8位で、ある
いは2位に存在するアミノ基で連結基Bと結合すること
ができる。ピリミジン塩基中における連結基Bとの結合
部位は、糖成分と結合する1位以外であれば特に限定さ
れず、例えばピリミジン塩基がシトシンの場合には5位
または6位、あるいは4位に存在するアミノ基で連結基
Bと結合することができ、ピリミジン塩基がチミンの場
合には3位または6位、あるいは5位に存在するメチル
基で連結基Bと結合することができ、またピリミジン塩
基がウラシルの場合には3位、5位または6位で連結基
Bと結合することができる。
A binds to B at a base moiety in a nucleotide residue. Examples of the base portion of the nucleotide residue include a purine derivative and a pyrimidine derivative. The binding site to the linking group B in the purine base is not particularly limited as long as it is other than the 9-position that binds to the sugar component. For example, when the purine base is adenine, it is present at the 2- or 8-position, or at the 6-position. When the purine base is guanine, it can be bonded to the linking group B at the 1-position or 8-position, or at the 2-position amino group. The binding site to the linking group B in the pyrimidine base is not particularly limited as long as it is other than position 1 which binds to the sugar component. For example, when the pyrimidine base is cytosine, it is located at position 5 or 6 or position 4 When the pyrimidine base is thymine, the amino group can bind to the linking group B, and when the pyrimidine base is thymine, the amino group can bind to the linking group B at a methyl group located at the 3-, 6-, or 5-position. In the case of uracil, it can bind to the linking group B at the 3-, 5- or 6-position.

【0019】上記式中、Bは2価の連結基または単結合
を示す。連結基の種類は、本発明の蛍光ヌクレオチドの
性質(即ち、蛍光ヌクレオチドの化合物としての安定
性、水溶性、核酸への取込み率、または蛍光強度など)
に大きな影響をもたらさない限り、特に限定されない。
当業者ならば、Aで表されるヌクレオチド部分とCで表
される蛍光化合物成分とを連結するのに適した2価の連
結基を適宜選択することができる。連結基Bは、一般的
には−CH2−、−CH=CH−、−C≡C−、−CO
−、−O−、−S−、−NH−またはこれらの組み合わ
せから成る連結基であって、連結基上の水素原子は置換
基でさらに置換されていてもよい。連結基の主鎖の炭素
数は特に限定されないが、一般的には1〜50、好まし
くは1〜20、より好ましくは1〜10、特に好ましく
は1〜5である。
In the above formula, B represents a divalent linking group or a single bond. The type of the linking group depends on the properties of the fluorescent nucleotide of the present invention (ie, the stability of the fluorescent nucleotide as a compound, water solubility, incorporation rate into nucleic acid, or fluorescence intensity)
There is no particular limitation as long as it does not significantly affect
Those skilled in the art can appropriately select a divalent linking group suitable for linking the nucleotide moiety represented by A and the fluorescent compound component represented by C. Linking group B is generally -CH 2 -, - CH = CH -, - C≡C -, - CO
-, -O-, -S-, -NH- or a linking group thereof, wherein a hydrogen atom on the linking group may be further substituted with a substituent. The number of carbon atoms in the main chain of the linking group is not particularly limited, but is generally 1 to 50, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and particularly preferably 1 to 5.

【0020】上記式中、Cは下記一般式(I)から誘導
される1価の基であり、R1またはR2中に存在する反応
性基でBと結合している。
In the above formula, C is a monovalent group derived from the following general formula (I), and is bonded to B by a reactive group present in R 1 or R 2 .

【0021】[0021]

【化3】 Embedded image

【0022】(式中、R1及びR2はそれぞれ独立に、B
と共有結合し得る反応性基で置換されていてもよいアル
キル基を示し;R3、R4、R5、及びR6はそれぞれ独立
にアルキル基を示すが、R3とR4、及び/又はR5とR6
は互いに結合してそれらが結合する炭素原子とともに飽
和の炭素環を形成してもよく;V1、V2、V3、V4、V
5、V6、V7、V8、V9、及びV10はそれぞれ独立に水
素原子又は一価の置換基を示し、これらのうち隣接する
2つの基は互いに結合して環を形成してもよく;L1
2、及びL3は置換又は無置換のメチン基を示し;m、
n、s、及びtは0又は1を示し、ただしm+n=1か
つs+t=1であり;pは1、2、又は3を示し;Mは
対イオンを示し;qは分子の電荷を中和するのに必要な
数を示す)
Where R1And RTwoAre each independently B
Optionally substituted with a reactive group capable of covalently bonding with
A kill group; RThree, RFour, RFive, And R6Are independent
Represents an alkyl group, but RThreeAnd RFourAnd / or RFiveAnd R6
Are bound together and saturated with the carbon atoms to which they are attached.
V may form a sum carbocycle; V1, VTwo, VThree, VFour, V
Five, V6, V7, V8, V9, And VTenAre each independently water
Represents an atom or a monovalent substituent;
The two groups may be joined together to form a ring;1,
LTwo, And LThreeRepresents a substituted or unsubstituted methine group; m,
n, s, and t represent 0 or 1, provided that m + n = 1
S + t = 1; p represents 1, 2, or 3;
Indicates a counter ion; q is required to neutralize the molecular charge
Indicate number)

【0023】本明細書において、アルキル基又はアルキ
ル部分を含む置換基(例えばアルコキシ基など)のアル
キル部分は、直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組
み合わせのいずれでもよく、特に言及しない場合を除
き、炭素原子数が1〜20程度である。R1及びR2が示
すアルキル基は同一でも異なっていてもよく、例えば、
メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル
基、シクロプロピル基、n−ブチル、sec−ブチル
基、tert−ブチル基、シクロプロピルメチル基、n
−ペンチル基、n−ヘキシル基、シクロヘキシル基など
を挙げることができる。R1及びR2が示すアルキル基
は、アルキル鎖上の任意の位置に1又は2個以上の置換
基を有していてもよい。2個以上の置換基を有する場合
には、それらは同一でも異なっていてもよい。
In the present specification, the alkyl moiety of the alkyl group or a substituent containing an alkyl moiety (for example, an alkoxy group) may be any of straight-chain, branched-chain, cyclic, or a combination thereof. Unless otherwise specified, the number of carbon atoms is about 1 to 20. The alkyl groups represented by R 1 and R 2 may be the same or different, for example,
Methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl, sec-butyl group, tert-butyl group, cyclopropylmethyl group, n
-Pentyl, n-hexyl, cyclohexyl and the like. The alkyl group represented by R 1 and R 2 may have one or more substituents at any position on the alkyl chain. When it has two or more substituents, they may be the same or different.

【0024】R1及びR2が示すアルキル基上の置換基の
種類は特に制限されないが、一般式(I)の化合物を蛍
光標識としてヌクレオチドに導入するために、ヌクレオ
チド(またはヌクレオチドに結合した連結基)との間で
共有結合、イオン結合、水素結合などの結合を形成でき
る反応性置換基が導入されていることが好ましい(本明
細書において「反応性置換基」とは、上記の特徴を有す
る置換基を意味する)。
The type of the substituent on the alkyl group represented by R 1 and R 2 is not particularly limited. However, in order to introduce the compound of the general formula (I) as a fluorescent label into a nucleotide, the nucleotide (or a linkage bonded to the nucleotide) is used. It is preferable that a reactive substituent capable of forming a bond such as a covalent bond, an ionic bond, or a hydrogen bond with the group is introduced (in the present specification, the “reactive substituent” has the above-described characteristics. Having substituents).

【0025】R1及びR2が示すアルキル基上に導入可能
な反応性置換基としては、例えば、サクシンイミジルエ
ステル基、ハロゲン置換トリアジニル基、ハロゲン置換
ピリミジニル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセ
チル基、マレイミジル基、アジリジニル基などを挙げる
ことができる。これらの反応性置換基のほか、例えば、
ハロゲン原子(本明細書において「ハロゲン原子」とい
う場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨ
ウ素原子のいずれでもよい)、メルカプト基、シアノ
基、ニトロ基、カルボキシル基、リン酸基、スルホ基、
ヒドロキシ基、アミノ基、イソチオシアナート基、イソ
シアナート基、炭素原子数が1〜8のアルコキシ基(例
えば、メトキシ基、エトキシ基など)、炭素原子数が6
〜20のアリールオキシ基(例えば、フェノキシ基、ナ
フトキシ基など)、炭素原子数が2〜10のアルコキシ
カルボニル基(例えば、メトキシカルボニル基、エトキ
シカルボニル基)、炭素原子数が6〜20のアリールオ
キシカルボニル基(例えば、フェノキシカルボニル基な
ど)、炭素原子数が2〜10のアシル基(例えば、アセ
チル基、ピバロイル基など)、炭素原子数が2〜8のア
シルオキシ基(例えば、アセチルオキシ基、ベンゾイル
オキシ基など)、炭素原子数が2〜8のアシルアミノ基
(例えば、アセチルアミノ基など)、炭素原子数が1〜
8のスルホニル基(例えば、メタンスルホニル基、エタ
ンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基など)、炭素原
子数が1〜20のスルフィニル基(例えば、メタンスル
フィニル基、エタンスルフィニル基、ベンゼンスルフィ
ニル基など)、炭素原子数が1〜8のスルホニルアミノ
基(例えば、メタンスルホニルアミノ基、エタンスルホ
ニルアミノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基など)、炭
素原子数が1〜10のカルバモイル基(例えば、カルバ
モイル基、メチルカルバモイル基、モリホリノカルバモ
イル基など)、炭素原子数が1〜20の置換アミノ基
(例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ベンジ
ルアミノ基、アニリノ基、ジフェニルアミノ基など)、
炭素原子数が2〜10のスルファモイル基(例えば、メ
チルスルファモイル基、エチルスルファモイル基、ピペ
リジノスルファモイル基など)、炭素原子数が0〜15
のアンモニウム基(例えば、トリメチルアンモニウム
基、トリエチルアンモニウム基など)、炭素原子数が0
〜15のヒドラジノ基(例えば、トリメチルヒドラジノ
基など)、炭素原子数が1〜15のウレイド基(例え
ば、ウレイド基、N,N-ジメチルウレイド基など)、炭素
原子数が1〜15のイミド基(例えば、スクシンイミド
基など)、炭素原子数が1〜20のアルキルチオ基(例
えば、メチルチオ基、エチルチオ基など)、炭素原子数
が6〜20のアリールチオ基(例えば、フェニルチオ
基、p−メチルフェニルチオ基、p−クロロフェニルチ
オ基、2−ピリジルチオ基、ナフチルチオ基など)、炭
素原子数1〜20の置換又は無置換のヘテロ環基(例え
ば、ピリジル基、5−メチルピリジル基、チエニル基、
フリル基、モルホリノ基、テトラヒドロフリル基、2−
ピラジル基など)、炭素原子数2〜18の不飽和炭化水
素基(例えば、ビニル基、エチニル基、1−シクロヘキ
セニル基、ベンジリジン基、ベンジリデン基など)、炭
素原子数が6〜20の置換若しくは無置換のアリール基
(例えば、フェニル基、4−スルホフェニル基、2,5
−ジスルホフェニル基、4−カルボキシフェニル基、ナ
フチル基など)、炭素原子数が1〜20のアルキル基
(例えば、メチル基、エチル基、プロピル基など)が挙
げられる。
Examples of the reactive substituent that can be introduced on the alkyl group represented by R 1 and R 2 include a succinimidyl ester group, a halogen-substituted triazinyl group, a halogen-substituted pyrimidinyl group, a sulfonyl halide group, an α-haloacetyl group, Maleimidyl group, aziridinyl group and the like can be mentioned. In addition to these reactive substituents, for example,
A halogen atom (a “halogen atom” in the present specification may be a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom), a mercapto group, a cyano group, a nitro group, a carboxyl group, a phosphate group, Sulfo group,
A hydroxy group, an amino group, an isothiocyanate group, an isocyanate group, an alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms (for example, methoxy group, ethoxy group, etc.),
To 20 aryloxy groups (for example, phenoxy group, naphthoxy group, etc.), an alkoxycarbonyl group having 2 to 10 carbon atoms (for example, methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group), and an aryloxy group having 6 to 20 carbon atoms. A carbonyl group (eg, phenoxycarbonyl group), an acyl group having 2 to 10 carbon atoms (eg, acetyl group, pivaloyl group), an acyloxy group having 2 to 8 carbon atoms (eg, acetyloxy group, benzoyl) An oxy group), an acylamino group having 2 to 8 carbon atoms (for example, an acetylamino group, etc.),
8 sulfonyl groups (eg, methanesulfonyl group, ethanesulfonyl group, benzenesulfonyl group, etc.), sulfinyl groups having 1 to 20 carbon atoms (eg, methanesulfinyl group, ethanesulfinyl group, benzenesulfinyl group, etc.), carbon atom A sulfonylamino group having 1 to 8 carbon atoms (for example, methanesulfonylamino group, ethanesulfonylamino group, benzenesulfonylamino group, etc.); a carbamoyl group having 1 to 10 carbon atoms (for example, carbamoyl group, methylcarbamoyl group, A substituted amino group having 1 to 20 carbon atoms (eg, a methylamino group, a dimethylamino group, a benzylamino group, an anilino group, a diphenylamino group, etc.);
A sulfamoyl group having 2 to 10 carbon atoms (for example, a methylsulfamoyl group, an ethylsulfamoyl group, a piperidinosulfamoyl group, etc.), and a carbon atom number of 0 to 15
(E.g., trimethylammonium group, triethylammonium group, etc.) having 0 carbon atoms
To 15 hydrazino groups (e.g., trimethylhydrazino group, etc.), ureido groups having 1 to 15 carbon atoms (e.g., ureido groups, N, N-dimethylureido groups, etc.), and imides having 1 to 15 carbon atoms. Group (e.g., succinimide group), alkylthio group having 1 to 20 carbon atoms (e.g., methylthio group, ethylthio group, etc.), arylthio group having 6 to 20 carbon atoms (e.g., phenylthio group, p-methylphenyl) A thio group, a p-chlorophenylthio group, a 2-pyridylthio group, a naphthylthio group, etc., a substituted or unsubstituted heterocyclic group having 1 to 20 carbon atoms (for example, a pyridyl group, a 5-methylpyridyl group, a thienyl group,
Furyl, morpholino, tetrahydrofuryl, 2-
A pyrazyl group), an unsaturated hydrocarbon group having 2 to 18 carbon atoms (for example, a vinyl group, an ethynyl group, a 1-cyclohexenyl group, a benzylidine group, a benzylidene group, etc.), a substituted or unsubstituted group having 6 to 20 carbon atoms. Unsubstituted aryl group (for example, phenyl group, 4-sulfophenyl group, 2,5
-Disulfophenyl group, 4-carboxyphenyl group, naphthyl group, etc.) and an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms (eg, methyl group, ethyl group, propyl group, etc.).

【0026】R1及びR2の好ましい例として、カルボキ
シル基、イソチオシアナート基、サクシンイミジルエス
テル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル基、
又はマレイミジル基が置換した炭素原子数1〜15のア
ルキル基、及びカルボキシル基、イソチオシアナート
基、サクシンイミジルエステル基、スルホニルハライド
基、α−ハロアセチル基、又はマレイミジル基が置換し
た炭素原子数7〜20のアリールアルキル基を挙げるこ
とができる。さらに好ましい例として、カルボキシル
基、イソチオシアナート基、又はサクシンイミジルエス
テル基が置換した炭素原子数1〜10のアルキル基を挙
げることができる。
Preferred examples of R 1 and R 2 include a carboxyl group, an isothiocyanate group, a succinimidyl ester group, a sulfonyl halide group, an α-haloacetyl group,
Or an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms substituted by a maleimidyl group, and a carboxyl group, an isothiocyanate group, a succinimidyl ester group, a sulfonyl halide group, an α-haloacetyl group, or a carbon atom having 7 to 15 carbon atoms substituted by a maleimidyl group. And 20 arylalkyl groups. More preferred examples include an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms substituted by a carboxyl group, an isothiocyanate group, or a succinimidyl ester group.

【0027】R3、R4、R5、及びR6としては、例えば
炭素原子数が1〜20のアルキル基を用いることがで
き、アルキル基上の任意の位置にR1及びR2で例示した
置換基(好ましくは反応性置換基を除く)を有していて
もよい。また、R3とR4とは互いに連結して飽和の炭素
環を形成してもよく、R5とR6とが互いに連結して飽和
の炭素環を形成してもよい。飽和の炭素環としては、3
〜8員環、好ましくは5又は6員環を挙げることができ
る。炭素環の環上にはアルキル基などの置換基が1又は
2個以上存在していてもよい。R3、R4、R5、及びR6
として、好ましくは炭素原子数が1〜6のアルキル基を
挙げることができ、さらに好ましくは炭素原子数が1〜
3のアルキル基を挙げることができる。
As R 3 , R 4 , R 5 and R 6 , for example, an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms can be used, and R 1 and R 2 are exemplified at arbitrary positions on the alkyl group. (Preferably excluding a reactive substituent). R 3 and R 4 may be connected to each other to form a saturated carbocyclic ring, or R 5 and R 6 may be connected to each other to form a saturated carbocyclic ring. As a saturated carbocyclic ring, 3
And an 8-membered ring, preferably a 5- or 6-membered ring. One or more substituents such as an alkyl group may be present on the carbocyclic ring. R 3 , R 4 , R 5 , and R 6
As an example, an alkyl group having preferably 1 to 6 carbon atoms can be mentioned, and more preferably 1 to 6 carbon atoms.
3 alkyl groups.

【0028】V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7
8、V9、及びV10はそれぞれ独立に水素原子又は一価
の置換基を示す。V1、V2、V3、V4、V5、V6
7、V8、V9、及びV10が示す置換基の種類は特に限
定されず、それらは同一でも異なっていてもよい。これ
らの基が示す置換基としては、例えば、R1及びR2が示
すアルキル基上の置換基として例示したもの(反応性置
換基を含む)を用いることができる。
V 1 , V 2 , V 3 , V 4 , V 5 , V 6 , V 7 ,
V 8 , V 9 and V 10 each independently represent a hydrogen atom or a monovalent substituent. V 1, V 2, V 3 , V 4, V 5, V 6,
The types of the substituents represented by V 7 , V 8 , V 9 , and V 10 are not particularly limited, and they may be the same or different. As the substituents represented by these groups, for example, those exemplified as the substituents on the alkyl group represented by R 1 and R 2 (including reactive substituents) can be used.

【0029】V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7
8、V9、及びV10のうち隣接する2つの基は互いに連
結して飽和又は不飽和の環を形成してもよい。形成され
る環としては、5〜7員環を挙げることができる。不飽
和環は縮合芳香族環を形成していてもよい。不飽和環は
酸素原子、窒素原子、硫黄原子等のヘテロ原子を含んで
いてもよい。形成される環の環上の任意の位置にはR1
及びR2でアルキル基上の置換基として例示した置換
基、又はアルキル基が1又は2個以上置換していてもよ
い。
V 1 , V 2 , V 3 , V 4 , V 5 , V 6 , V 7 ,
Two adjacent groups among V 8 , V 9 and V 10 may be linked to each other to form a saturated or unsaturated ring. Examples of the ring formed include a 5- to 7-membered ring. The unsaturated ring may form a condensed aromatic ring. The unsaturated ring may contain a hetero atom such as an oxygen atom, a nitrogen atom and a sulfur atom. R 1 may be located at any position on the ring to be formed.
And one or more of the substituents exemplified as the substituent on the alkyl group for R 2 and R 2 may be substituted.

【0030】V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7
8、V9、及びV10の好ましい例としては、例えば、水
素原子、炭素原子数が1〜6のアルキル基(R1及びR2
が示すアルキル基上の置換基として例示した置換基(反
応性置換基を含む)が任意の位置に置換していてもよ
い)、炭素原子数が6〜20のアリール基(R1及びR2
が示すアルキル基上の置換基(反応性置換基を含む)と
して例示した置換基)が任意の位置に置換していてもよ
い)、ハロゲン原子、炭素原子数が1〜10のチオアル
キル基、炭素原子数が1〜10のアルキルスルホン基、
リン酸基、カルボキシル基、スルホ基、炭素原子数が1
〜10のアルコキシ基、置換アミノ基、イソチオシアナ
ート基、イソシアナート基、サクシンイミジルエステル
基、ハロゲン置換トリアジニル基、ハロゲン置換ピリミ
ジニル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル
基、マレイミジル基、アジリジニル基などを挙げること
ができる。
V 1 , V 2 , V 3 , V 4 , V 5 , V 6 , V 7 ,
Preferred examples of V 8 , V 9 and V 10 include, for example, a hydrogen atom and an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (R 1 and R 2
May be substituted at any position as a substituent on the alkyl group represented by (including a reactive substituent), and an aryl group having 6 to 20 carbon atoms (R 1 and R 2
A substituent (including a reactive substituent) on the alkyl group represented by may be substituted at any position), a halogen atom, a thioalkyl group having 1 to 10 carbon atoms, a carbon atom An alkylsulfone group having 1 to 10 atoms,
Phosphoric acid group, carboxyl group, sulfo group, having 1 carbon atom
To 10 alkoxy groups, substituted amino groups, isothiocyanate groups, isocyanate groups, succinimidyl ester groups, halogen-substituted triazinyl groups, halogen-substituted pyrimidinyl groups, sulfonyl halide groups, α-haloacetyl groups, maleimidyl groups, aziridinyl groups and the like. Can be mentioned.

【0031】さらに好ましくは、水素原子、ハロゲン原
子、炭素原子数が6〜20のアリール基(イソチオシア
ナート基、イソシアナート基、サクシンイミジルエステ
ル基、カルボキシル基、又はスルホ基が置換していても
よい)、スルホ基、炭素原子数が1〜10のアルコキシ
基(イソチオシアナート基、イソシアナート基、サクシ
ンイミジルエステル基、カルボキシル基、又はスルホ基
が置換していてもよい)、炭素原子数が1〜10のアル
キルチオ基(イソチオシアナート基、イソシアナート
基、サクシンイミジルエステル基、カルボキシル基、又
はスルホ基が置換していてもよい)、イソチオシアナー
ト基、サクシンイミジルエステル基、スルホニルハライ
ド基、α−ハロアセチル基、又はマレイミジル基であ
る。
More preferably, a hydrogen atom, a halogen atom, or an aryl group having 6 to 20 carbon atoms (an isothiocyanate group, an isocyanate group, a succinimidyl ester group, a carboxyl group, or a sulfo group may be substituted). Good), a sulfo group, an alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms (which may be substituted with an isothiocyanate group, an isocyanate group, a succinimidyl ester group, a carboxyl group, or a sulfo group), 1 to 10 alkylthio groups (which may be substituted with an isothiocyanate group, an isocyanate group, a succinimidyl ester group, a carboxyl group, or a sulfo group), an isothiocyanate group, a succinimidyl ester group, a sulfonyl halide group, It is an α-haloacetyl group or a maleimidyl group.

【0032】L1、L2、及びL3はそれぞれ独立に置換
又は無置換のメチン基を示す。メチン基上の置換基の個
数、置換位置、置換基の種類は特に限定されず、2個以
上の置換基が存在する場合にはそれらは同一でも異なっ
ていてもよい。置換基として、例えば、置換又は無置換
の炭素原子数が1から15、好ましくは炭素原子数が1
〜10、特に好ましくは炭素原子数が1〜5のアルキル
基(例えば、メチル基、エチル基、カルボキシエチル基
など)、置換又は無置換の炭素原子数が6〜30、好ま
しくは炭素原子数が6〜20、さらに好ましくは炭素原
子数が6〜15のアリール基(例えば、フェニル基、o
−カルボキシフェニル基など)、置換又は無置換の炭素
原子数が3〜20、好ましくは炭素原子数が4〜15、
さらに好ましくは炭素原子数が6〜10のヘテロ環基
(例えば、N,N−ジメチルバルビツール酸基など)、
ハロゲン原子、炭素原子数が1〜20、好ましくは1〜
15、さらに好ましくは1〜10のアルコキシ基(例え
ば、メトキシ基、エトキシ基など)、炭素原子数が0〜
20、好ましくは炭素原子数が2〜15、さらに好まし
くは炭素原子数が4〜15のアミノ基(例えば、メチル
アミノ基、ジメチルアミノ基、N−メチル−N−フェニ
ルアミノ基、N−メチルピペラジノ基など)、炭素原子
数が1〜15、好ましくは炭素原子数が1〜10、さら
に好ましくは炭素原子数が1〜8のアルキルチオ基(例
えば、メチルチオ基、エチルチオ基など)、炭素原子数
が6〜20、好ましくは炭素原子数が6〜18、さらに
好ましくは炭素原子数が6〜15のアリールチオ基(例
えば、フェニルチオ基、p−メチルチオ基など)などを
挙げることができる。L1、L2、及びL3上に置換する
2つの置換基が互いに結合して環を形成してもよい。例
えば、L2、及びL3上に置換する2つの置換基が互いに
結合して炭素原子数が2又は3のアルキレン鎖となって
環を形成してもよい。
L 1 , L 2 and L 3 each independently represent a substituted or unsubstituted methine group. The number, position and type of substituents on the methine group are not particularly limited, and when two or more substituents are present, they may be the same or different. Examples of the substituent include a substituted or unsubstituted carbon atom having 1 to 15, preferably 1 carbon atom.
Alkyl groups having 1 to 5 carbon atoms (e.g., methyl group, ethyl group, carboxyethyl group, etc.), substituted or unsubstituted carbon atoms having 6 to 30, preferably carbon atoms having 1 to 5 carbon atoms. An aryl group having 6 to 20, more preferably 6 to 15 carbon atoms (for example, phenyl group, o
-Carboxyphenyl group), substituted or unsubstituted carbon atoms having 3 to 20, preferably 4 to 15 carbon atoms,
More preferably, a heterocyclic group having 6 to 10 carbon atoms (eg, N, N-dimethylbarbituric acid group and the like),
A halogen atom having 1 to 20 carbon atoms, preferably 1 to
15, more preferably 1 to 10 alkoxy groups (eg, methoxy group, ethoxy group, etc.), 0 to 0 carbon atoms
20, preferably an amino group having 2 to 15 carbon atoms, more preferably 4 to 15 carbon atoms (eg, a methylamino group, a dimethylamino group, an N-methyl-N-phenylamino group, an N-methylpiperazino group) Etc.), an alkylthio group having 1 to 15 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms, more preferably 1 to 8 carbon atoms (for example, methylthio group, ethylthio group, etc.), and 6 carbon atoms. To 20, preferably 6 to 18 carbon atoms, more preferably 6 to 15 carbon atoms such as an arylthio group (e.g., phenylthio group, p-methylthio group). Two substituents on L 1 , L 2 and L 3 may be bonded to each other to form a ring. For example, two substituents on L 2 and L 3 may be bonded to each other to form an alkylene chain having 2 or 3 carbon atoms to form a ring.

【0033】pは1、2、又は3を示すが、pが1又は
2である場合が好ましい。特にpが1の場合、半導体レ
ーザー又はヘリウム−ネオンレーザー励起(励起波長6
30〜650nm)における励起効率が非常に高くなるの
で、pが1の場合が最も好ましい。m、n、s、又はt
は0又は1を示すが、m+n=1かつs+t=1の条件
を満たす。
P represents 1, 2, or 3, and preferably represents 1 or 2. In particular, when p is 1, the semiconductor laser or helium-neon laser excitation (excitation wavelength 6
Since the excitation efficiency at 30 to 650 nm) is very high, p is most preferably 1. m, n, s, or t
Represents 0 or 1, but satisfies the conditions of m + n = 1 and s + t = 1.

【0034】Mは対イオンを示すが、陽イオン又は陰イ
オンのいずれでもよい。陽イオンは無機陽イオン又は有
機陽イオンのいずれでもよく、例えば、ナトリウムイオ
ン、カリウムイオン、リチウムイオンなどのアルカリ金
属イオン、テトラアルキルアンモニウムイオン、ピリジ
ニウムイオンなどの有機イオンを挙げることができる。
陰イオンは無機陰イオン又は有機陰イオンのいずれでも
よく、ハロゲン陰イオン(例えば、フッ素イオン、塩素
イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなど)、置換アリー
ルスルホン酸イオン(例えば、p−トルエンスルホン酸
イオン、p−クロルベンゼンスルホン酸イオンなど)、
アリールジスルホン酸イオン(例えば、1,3−ベンゼ
ンジスルホン酸イオン、1,5−ナフタレンジスルホン
酸イオンなど)、アルキル硫酸イオン(例えば、メチル
硫酸イオンなど)、硫酸イオン、チオシアン酸イオン、
過塩素酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ピクリ
ン酸イオン、酢酸イオン、トリフルオロメタンスルホン
酸イオンなどがを挙げることができる。また、Mは水素
イオンでもよい。好ましい対イオンの例として、例え
ば、アンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、ハロゲ
ン陰イオン、置換アリールスルホン酸イオンなどを挙げ
ることができ、さらに好ましくはアルカリ金属イオン、
ハロゲン陰イオン、置換アリールスルホン酸イオンを挙
げることができる。qは分子の電荷を中和するのに必要
な数を表わすが、一般式(I)で表される化合物が分子
内対イオンを形成する場合には、qが0となる場合もあ
る。
M represents a counter ion, and may be either a cation or an anion. The cation may be either an inorganic cation or an organic cation, and examples thereof include alkali metal ions such as sodium ion, potassium ion and lithium ion, and organic ions such as tetraalkylammonium ion and pyridinium ion.
The anion may be either an inorganic anion or an organic anion, a halogen anion (eg, a fluorine ion, a chloride ion, a bromine ion, an iodine ion, etc.), a substituted aryl sulfonate ion (eg, a p-toluene sulfonate ion, p-chlorobenzenesulfonate ion),
Aryl disulfonate ions (e.g., 1,3-benzenedisulfonate ion, 1,5-naphthalenedisulfonic acid ion, etc.), alkyl sulfate ions (e.g., methyl sulfate ion, etc.), sulfate ion, thiocyanate ion,
Examples include perchlorate ion, tetrafluoroborate ion, picrate ion, acetate ion, and trifluoromethanesulfonic acid ion. M may be a hydrogen ion. Examples of preferred counter ions include, for example, ammonium ion, alkali metal ion, halogen anion, substituted aryl sulfonate ion, and more preferably, alkali metal ion,
Examples include a halogen anion and a substituted aryl sulfonate ion. q represents a number necessary to neutralize the charge of the molecule, but q may be 0 when the compound represented by the general formula (I) forms an intramolecular counter ion.

【0035】また、一般式(I)の化合物は置換基の種
類に応じて1以上の不斉炭素を有する場合があるが、光
学異性体やジアステレオ異性体などの立体異性体、立体
異性体の混合物、ラセミ体などのいずれの場合も本発明
の範囲に包含される。上記一般式(I)で表される化合
物の好ましい例を以下に示すが、本発明の範囲は下記の
具体的化合物によって限定されることはない。
The compound of the general formula (I) may have one or more asymmetric carbon atoms depending on the type of the substituent, but it may be a stereoisomer such as an optical isomer or a diastereomer, or a stereoisomer. And racemic forms are included in the scope of the present invention. Preferred examples of the compound represented by the general formula (I) are shown below, but the scope of the present invention is not limited by the following specific compounds.

【0036】[0036]

【化4】 Embedded image

【0037】[0037]

【化5】 Embedded image

【0038】[0038]

【化6】 Embedded image

【0039】[0039]

【化7】 Embedded image

【0040】[0040]

【化8】 Embedded image

【0041】[0041]

【化9】 Embedded image

【0042】[0042]

【化10】 Embedded image

【0043】[0043]

【化11】 Embedded image

【0044】[0044]

【化12】 Embedded image

【0045】[0045]

【化13】 Embedded image

【0046】[0046]

【化14】 Embedded image

【0047】[0047]

【化15】 Embedded image

【0048】本明細書の実施例に代表的化合物の製造方
法を具体的に示したので、当業者は下記の実施例の具体
的説明を参照しつつ、原料化合物、反応条件、試薬など
を適宜選択し、必要に応じて実施例に記載した方法に修
飾ないし改変を加えることによって、上記一般式(I)
に包含される任意の化合物を製造することが可能であ
る。もっとも、上記一般式(I)で表される化合物の製
造方法は特に限定されず、いかなる方法により製造した
ものも本発明で使用できることは言うまでもない。な
お、一般式(I)の化合物は特願平11−264845
号明細書にも記載されており、特願平11−26484
5号明細書に記載の内容は全て引用により本明細書中に
取り込むものとする。上記一般式(I)で表される化合
物は、本発明の蛍光ヌクレオチドにおいて蛍光標識成分
として使用される。
The method for producing a typical compound is specifically shown in the examples of the present specification, and those skilled in the art can appropriately refer to the following specific description of the examples to determine the raw material compounds, reaction conditions, reagents and the like. The above formula (I) can be selected and optionally modified or modified in the methods described in the examples.
It is possible to produce any compound encompassed by However, the method for producing the compound represented by the general formula (I) is not particularly limited, and it goes without saying that any compound produced by any method can be used in the present invention. The compound of the general formula (I) is disclosed in Japanese Patent Application No. 11-264845.
And Japanese Patent Application No. Hei 11-26484.
No. 5 is incorporated herein by reference in its entirety. The compound represented by the general formula (I) is used as a fluorescent label component in the fluorescent nucleotide of the present invention.

【0049】ヌクレオチドに一般式(I)で表される化
合物を蛍光標識として導入するための手法は種々知られ
ており、当業者に利用可能な手段を適宜選択して利用す
ることが可能である。例えば、ヌクレオチド中のアミノ
基、水酸基などの官能基と一般式(I)の化合物中のカ
ルボキシル基、活性エステル基等の反応性置換基をイオ
ン結合的又は共有結合的に直接結合させるか、あるいは
ヌクレオチドの一部に連結基を導入するなどの化学修飾
を行った後に一般式(I)の化合物を反応させればよ
い。反応後に生成した蛍光ヌクレオチドは、クロマトグ
ラフィー、電気泳動、再結晶などの汎用の分離技術によ
り精製することができる。
There are various known techniques for introducing the compound represented by the general formula (I) into a nucleotide as a fluorescent label, and a means available to those skilled in the art can be appropriately selected and used. . For example, a functional group such as an amino group or a hydroxyl group in a nucleotide is directly bonded to a reactive substituent such as a carboxyl group or an active ester group in the compound of the general formula (I) by ionic bonding or covalent bonding, or The compound of general formula (I) may be reacted after chemical modification such as introduction of a linking group into a part of the nucleotide. The fluorescent nucleotide generated after the reaction can be purified by a general-purpose separation technique such as chromatography, electrophoresis, and recrystallization.

【0050】本発明はさらに、本発明の蛍光ヌクレオチ
ドの利用にも関する。即ち、本発明の蛍光ヌクレオチド
は核酸の検出のために利用することができる。本発明の
蛍光ヌクレオチドを、核酸の検出などのDNA解析に用
いる場合には、例えば、ルース(Jerry L. Ruth, DNA,
3, 123 (1984))に記載の方法でプローブ又はプライマ
ーに本発明の蛍光ヌクレオチドを取り込ませることがで
きる。即ち、本発明は、核酸合成酵素と鋳型核酸と本発
明の蛍光ヌクレオチドとを用いて核酸合成反応を行うこ
とを含む、蛍光標識された核酸の調製方法をも提供す
る。
The present invention further relates to the use of the fluorescent nucleotide of the present invention. That is, the fluorescent nucleotide of the present invention can be used for nucleic acid detection. When the fluorescent nucleotide of the present invention is used for DNA analysis such as nucleic acid detection, for example, loose (Jerry L. Ruth, DNA,
3, 123 (1984)), the fluorescent nucleotide of the present invention can be incorporated into a probe or primer. That is, the present invention also provides a method for preparing a fluorescently labeled nucleic acid, comprising performing a nucleic acid synthesis reaction using a nucleic acid synthase, a template nucleic acid, and the fluorescent nucleotide of the present invention.

【0051】本明細書で言う核酸合成酵素の具体例とし
ては、DNAポリメラーゼ(Klenow酵素、TaqDNAポ
リメラーゼなど全てのDNAポリメラーゼを含む)、R
NAポリメラーゼ、逆転写酵素またはターミナルトラン
スフェラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されな
い。鋳型核酸の種類はDNAでもRNAでもよく、天然
由来のDNAまたはRNA、組み換えDNAまたはRN
A、化学合成DNAまたはRNAの何れでもよい。核酸
合成反応は、例えば、鋳型DNA、非蛍光のヌクレオチ
ド混合物、本発明の蛍光ヌクレオチド、および核酸合成
酵素を用いて、酵素反応に適した条件(塩濃度、pH、
温度など)下において行うことができる。このような核
酸合成法は当業者に周知であり、標識の目的などに応じ
て、使用する材料や試薬などは当業者ならば適宜選択す
ることができる。
Specific examples of the nucleic acid synthase referred to in this specification include DNA polymerase (including all DNA polymerases such as Klenow enzyme and Taq DNA polymerase), R
Examples include, but are not limited to, NA polymerase, reverse transcriptase or terminal transferase. The type of template nucleic acid may be DNA or RNA, and DNA or RNA of natural origin, recombinant DNA or RN
A, Any of chemically synthesized DNA or RNA may be used. The nucleic acid synthesis reaction is carried out, for example, using a template DNA, a non-fluorescent nucleotide mixture, the fluorescent nucleotide of the present invention, and a nucleic acid synthase, under conditions suitable for the enzymatic reaction (salt concentration, pH,
Temperature, etc.). Such a nucleic acid synthesis method is well known to those skilled in the art, and the materials and reagents to be used can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose of labeling and the like.

【0052】各種方法を用いて本発明の蛍光ヌクレオチ
ドで核酸(DNA又はRNA)を標識することができ
る。ランダムプライム法はDNAを標識するための一つ
方法であり、任意の組み合わせのヘキサヌクレオチド配
列の混合物をプライマー(ランダムプライマー)として
使用し、このランダムプライマーを標識すべき核酸にハ
イブリダイゼーションさせる。このランダムプライマー
の3’−OH末端から出発し、1本鎖に相補的な鎖をKl
enow酵素などのDNAポリメラーゼ又は他のDNAポリ
メラーゼを用いて合成するが、その際DNAポリメラー
ゼの基質である4種のデオキシリボヌクレオチドが相補
鎖中に挿入される。これらのデオキシリボヌクレオチド
の少なくとも1種として本発明の蛍光ヌクレオチドを用
いることにより、蛍光ヌクレオチドで標識された相補的
DNAが合成される。
The nucleic acid (DNA or RNA) can be labeled with the fluorescent nucleotide of the present invention using various methods. The random prime method is one method for labeling DNA. A mixture of hexanucleotide sequences in any combination is used as a primer (random primer), and the random primer is hybridized to a nucleic acid to be labeled. Starting from the 3'-OH end of this random primer, a strand complementary to a single strand is
It is synthesized using a DNA polymerase such as an enow enzyme or another DNA polymerase, in which four deoxyribonucleotides which are substrates of the DNA polymerase are inserted into a complementary strand. By using the fluorescent nucleotide of the present invention as at least one of these deoxyribonucleotides, a complementary DNA labeled with the fluorescent nucleotide is synthesized.

【0053】ランダムプライマーの代わりに、特異的配
列を有するオリゴDNA(特異的プライマー)を用いる
ことができる。特異的プライマーは鋳型DNA中の相補
的領域に結合し、鋳型DNAに対する相補的DNAの合
成は特異的プライマーの3’−OH末端から開始され
る。ランダムプライム法の場合と同様に、相補的DNA
が合成される際に本発明の蛍光ヌクレオチドが取込まれ
ることにより、蛍光標識された相補的DNAが合成され
る。
In place of the random primer, an oligo DNA having a specific sequence (specific primer) can be used. The specific primer binds to a complementary region in the template DNA, and synthesis of a complementary DNA to the template DNA starts from the 3'-OH end of the specific primer. As with the random prime method, the complementary DNA
When the fluorescent nucleotide of the present invention is incorporated when is synthesized, a fluorescently labeled complementary DNA is synthesized.

【0054】ニックトランスレーション法は、DNアー
ゼIの2本鎖DNAへの作用を利用した方法である。D
NアーゼIの作用により鋳型2本鎖DNAの1本鎖に切
断される箇所が生じる。同時に大腸菌DNAポリメラー
ゼIと、この酵素の基質である4種のデオキシリボヌク
レオチドと、本発明の蛍光ヌクレオチドとを反応混合物
中に添加しておく。大腸菌DNAポリメラーゼIは、切
断された1本鎖の5’−末端デオキシリボヌクレオシド
を切断し、同時に基質のデオキシリボヌクレオチド1個
を遊離している3’−OH末端の隣接に挿入する。この
過程を繰り返すことにより切断部位が3’末端に移動し
ていく。基質のヌクレオチド中に本発明の蛍光ヌクレオ
チドを含めることによって、ニックトランスレーション
法を用いて蛍光DNAが合成することができる。
The nick translation method is a method utilizing the action of DNase I on double-stranded DNA. D
Due to the action of Nase I, a site is cut into a single strand of the template double-stranded DNA. At the same time, Escherichia coli DNA polymerase I, four types of deoxyribonucleotides which are substrates of the enzyme, and the fluorescent nucleotide of the present invention are added to the reaction mixture. E. coli DNA polymerase I cleaves the cleaved single-stranded 5'-terminal deoxyribonucleoside and simultaneously inserts one substrate deoxyribonucleotide adjacent to the free 3'-OH terminus. By repeating this process, the cleavage site moves to the 3 'end. By including the fluorescent nucleotide of the present invention in the nucleotide of the substrate, fluorescent DNA can be synthesized using the nick translation method.

【0055】2本鎖又は1本鎖DNAの3’末端を標識
する場合には、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌク
レオチドを3’−OH末端に結合する酵素であるターミ
ナルトランスフェラーゼを用いることができる。ターミ
ナルトランスフェラーゼは少なくとも1種のデオキシリ
ボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを基質として必要
とする。本発明の蛍光ヌクレオチドをターミナルトラン
スフェラーゼの基質として用いることによって、3’−
OH末端で伸長された蛍光標識核酸を合成することがで
きる。
When labeling the 3 'end of double-stranded or single-stranded DNA, a terminal transferase which is an enzyme that binds deoxyribonucleotide or ribonucleotide to the 3'-OH end can be used. Terminal transferase requires at least one deoxyribonucleotide or ribonucleotide as a substrate. By using the fluorescent nucleotide of the present invention as a substrate for terminal transferase, 3′-
Fluorescently labeled nucleic acids extended at the OH terminus can be synthesized.

【0056】逆転写反応法は1本鎖RNAから相補的D
NAを合成する反応である。先ず、プライマーとしてオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをRNAの相補的部分に
アニーリングさせた後に、逆転写酵素を用いて伸長反応
を行うことによって、RNA鎖に相補的なDNA鎖がプ
ライマーの3’−OH末端から出発して合成される。こ
のDNA合成においても4種のデオキシリボヌクレオチ
ドが酵素基質として使用され、本発明の蛍光ヌクレオチ
ドをその中に添加しておくことによって逆転写反応中に
蛍光ヌクレオチドが伸長していくDNA鎖に挿入され、
蛍光標識DNAが合成される。
The reverse transcription method uses complementary D from single-stranded RNA.
This is a reaction for synthesizing NA. First, an oligodeoxyribonucleotide is annealed to a complementary portion of RNA as a primer, and then an extension reaction is performed using a reverse transcriptase, so that a DNA strand complementary to the RNA strand starts from the 3′-OH end of the primer. And synthesized. In this DNA synthesis, four types of deoxyribonucleotides are used as enzyme substrates, and the fluorescent nucleotides of the present invention are inserted into the growing DNA strand during the reverse transcription reaction by adding the fluorescent nucleotides therein,
Fluorescently labeled DNA is synthesized.

【0057】DNAからRNAを合成する酵素を用い
て、本発明の蛍光ヌクレオチドで標識されたRNAを合
成することもできる。DNAからRNAを合成する酵素
としては、SP6、T3又はT7RNAポリメラーゼな
どのファージによりコードされるRNAポリメラーゼで
ある。これらの酵素はSP6、T3又はT7プロモータ
ーを含む2本鎖DNAならびにRNA合成のための酵素
であり、基質としての4種類のリボヌクレオチドが使用
される。基質の一つとして本発明の蛍光ヌクレオチドを
使用することによって、蛍光標識されたRNAを合成す
ることができる。
The RNA labeled with the fluorescent nucleotide of the present invention can be synthesized using an enzyme for synthesizing RNA from DNA. Enzymes for synthesizing RNA from DNA include phage-encoded RNA polymerases such as SP6, T3 or T7 RNA polymerase. These enzymes are enzymes for synthesizing double-stranded DNA and RNA containing SP6, T3 or T7 promoters, and use four types of ribonucleotides as substrates. By using the fluorescent nucleotide of the present invention as one of the substrates, a fluorescently labeled RNA can be synthesized.

【0058】あるいはまた、ポリメラーゼ連鎖反応(P
CR)を用いて本発明の蛍光ヌクレオチドで標識された
核酸を合成することもできる。PCRでは、生物試料中
の検出すべき核酸は1本鎖に変性され、2種のプライマ
ーがこの一本鎖核酸にアニーリングする。アニーリング
後、ポリメラーゼ(好ましくはTaqDNAポリメラーゼ)
及び酵素基質としてのデオキシリボヌクレオチドにより
伸長反応を行う。プライマーの3’−OH末端から出発
して相補的DNAが合成され、二本鎖DNAが形成され
る。この工程を繰り返すことにより、試料中に含まれる
検出すべきDNAを増幅することができる。TaqDNA
ポリメラーゼによる伸長反応の際に、基質の一つとして
本発明の蛍光ヌクレオチドを用いることにより、蛍光標
識された増幅核酸が得られる。
Alternatively, the polymerase chain reaction (P
CR) can be used to synthesize a nucleic acid labeled with the fluorescent nucleotide of the present invention. In PCR, a nucleic acid to be detected in a biological sample is denatured into a single strand, and two kinds of primers anneal to the single-stranded nucleic acid. After annealing, a polymerase (preferably Taq DNA polymerase)
An extension reaction is performed with deoxyribonucleotides as enzyme substrates. Starting from the 3'-OH terminus of the primer, complementary DNA is synthesized to form double-stranded DNA. By repeating this step, the DNA to be detected contained in the sample can be amplified. TaqDNA
By using the fluorescent nucleotide of the present invention as one of the substrates during the extension reaction by the polymerase, a fluorescently labeled amplified nucleic acid can be obtained.

【0059】上記のようにして調製された、本発明の蛍
光ヌクレオチドで標識された蛍光核酸は、ハイブリダイ
ゼーションによる相同核酸配列の検出のための遺伝子プ
ローブとして用いることができる。標的核酸のハイブリ
ダイズした蛍光ヌクレオチドは、蛍光強度計で蛍光強度
を測定することにより容易に検出することができる。
The fluorescent nucleic acid labeled with the fluorescent nucleotide of the present invention prepared as described above can be used as a gene probe for detecting a homologous nucleic acid sequence by hybridization. The hybridized fluorescent nucleotide of the target nucleic acid can be easily detected by measuring the fluorescence intensity with a fluorescence intensity meter.

【0060】上記で詳述した通り、本発明の蛍光ヌクレ
オチドは遺伝子プローブの標識のために用いることがで
きるので、核酸検出用の試薬または診断薬として有用で
ある。本発明の蛍光ヌクレオチドを核酸検出用の試薬ま
たは診断薬として用いる場合には、1種又は2種以上の
添加物を配合して試薬組成物の形態で供給することがで
きる。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、pH調節剤、防腐
剤など適宜の添加物を用いて、溶液剤などの所望の形態
の試薬を調製することができる。試薬の形態およびその
製造方法は、当業者が適宜選択可能である。
As described in detail above, since the fluorescent nucleotide of the present invention can be used for labeling a gene probe, it is useful as a reagent for detecting nucleic acids or a diagnostic agent. When the fluorescent nucleotide of the present invention is used as a reagent for nucleic acid detection or a diagnostic agent, one or more additives can be blended and supplied in the form of a reagent composition. For example, a reagent in a desired form such as a solution can be prepared using appropriate additives such as a buffer, a solubilizer, a pH adjuster, and a preservative. The form of the reagent and the method for producing the reagent can be appropriately selected by those skilled in the art.

【0061】本発明の蛍光ヌクレオチドはまた、上記し
た核酸合成反応に使用する酵素、並びに緩衝液などと一
緒に、核酸検出用キットの形態で供給することもでき
る。キットに含めるべき試薬の種類はキットの目的に応
じて適宜選択することができ、蛍光ヌクレオチド、核酸
合成酵素、緩衝液に加えて、1種類以上(好ましくは4
種類)の非蛍光のヌクレオチド混合物、精製水などを挙
げることもできる。また、ランダムプライマー、オリゴ
dTプライマー、あるいは目的に応じた特異的プライマ
ーなどのプライマーをキットに含めることもできる。以
下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明
は実施例によって限定されることはない。本発明の精神
から離れることなく、実施例に記載の材料および方法を
変更、改良または置換することができることは当業者に
は自明である。
The fluorescent nucleotide of the present invention can also be supplied in the form of a kit for detecting a nucleic acid, together with the enzyme used in the above-described nucleic acid synthesis reaction and a buffer. The types of reagents to be included in the kit can be appropriately selected depending on the purpose of the kit. In addition to the fluorescent nucleotide, the nucleic acid synthetase, and the buffer, one or more (preferably 4
Kind), a non-fluorescent nucleotide mixture, purified water and the like. In addition, a primer such as a random primer, an oligo dT primer, or a specific primer depending on the purpose can be included in the kit. The present invention will be specifically described with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples. It will be apparent to those skilled in the art that the materials and methods described in the examples can be modified, improved, or substituted without departing from the spirit of the invention.

【0062】[0062]

【実施例】以下の合成例で合成した化合物1、4、6、
7、9、10、11、12、13、14、17、並びに
18〜22は各々、本明細書中に好ましい化合物として
示した化合物X−1、X−4、X−6、X−7、X−
9、X−10、X−11、X−12、X−13、X−1
4、X−17、X−18〜X−22に対応する。 合成例1:化合物1の合成 化合物1の合成スキームを以下に示す。
Examples Compounds 1, 4, 6, and 6 synthesized in the following synthesis examples
7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, and 18 to 22, each of the compounds X-1, X-4, X-6, X-7, which are shown as preferred compounds herein. X-
9, X-10, X-11, X-12, X-13, X-1
4, X-17 and X-18 to X-22. Synthesis Example 1: Synthesis of Compound 1 A synthesis scheme of Compound 1 is shown below.

【0063】[0063]

【化16】 Embedded image

【0064】(化合物1bの合成)化合物1a(2.3
6g,10mmol)をアセトン(10ml)に溶解し、
6−ブロモヘキサン酸エチル(3.3g,15mmol)
を加えて5時間加熱還流を行った。本反応では目的部位
以外のヘテロ環窒素原子(インドール環部分)へのアルキ
ル化も進行するが、反応液に反応後酢酸エチル(50m
l)とヘキサン(50ml)を加えて生じるオイル成分を
デカンテーションにより分離させ、該オイルに酢酸エチ
ル(10ml)とィソプロピルアルコール(5ml)を加え
て30分間加熱還流を行なうことにより目的とするピリ
ジン環窒素4級化生成物である化合物1bのみを結晶化
させることができた。 収量:2.8g、収率:60% mass(posi):379
(Synthesis of Compound 1b) Compound 1a (2.3
6 g, 10 mmol) in acetone (10 ml),
Ethyl 6-bromohexanoate (3.3 g, 15 mmol)
Was added and the mixture was heated under reflux for 5 hours. In this reaction, alkylation to a heterocyclic nitrogen atom (indole ring portion) other than the target site also proceeds, but after the reaction mixture is reacted with ethyl acetate (50 m
l) and hexane (50 ml) are added to separate the oil component produced by decantation. Ethyl acetate (10 ml) and isopropyl alcohol (5 ml) are added to the oil, and the mixture is heated under reflux for 30 minutes to obtain the desired oil. Only compound 1b, which is a pyridine ring nitrogen quaternization product, could be crystallized. Yield: 2.8 g, yield: 60% mass (posi): 379

【0065】(化合物1cの合成)化合物1b(2.3g,
5mmol)をピリジン(5ml)、酢酸(2ml)の混合
溶媒に溶解させ、オルソギ酸トリエチル(1ml)とトリ
エチルアミン(1ml)を加えて140℃にて1時間反応
を行なった。反応液に酢酸エチル(50ml)を加えると
化合物1cを含む固体が析出する。これを濾過して取り
出し精製せずに次の反応に用いた。mass(posi):768
(Synthesis of Compound 1c) Compound 1b (2.3 g,
5 mmol) was dissolved in a mixed solvent of pyridine (5 ml) and acetic acid (2 ml), and triethyl orthoformate (1 ml) and triethylamine (1 ml) were added, followed by a reaction at 140 ° C. for 1 hour. When ethyl acetate (50 ml) is added to the reaction solution, a solid containing compound 1c precipitates. This was filtered out and used for the next reaction without purification. mass (posi): 768

【0066】(化合物1の合成)前記未精製の化合物1c
全量をメタノール(10ml)、テトラヒドロフラン(5
ml)および水(10ml)に溶解し、10%水酸化ナト
リウム水溶液(5ml)を加えて室温で30分間反応させ
た。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(10ml)
を加えた後、減圧濃縮すると化合物1の粗結晶が析出す
る。粗結晶をゲル濾過(SEPHADEX LH−20)
により精製し、化合物1を得た。 収量:0.7g、収率:40%(化合物1bより) mass(nega):709(M-Na) 吸収極大(メタノール):634nm 分子吸収係数:190000
(Synthesis of Compound 1) Unpurified Compound 1c
The whole amount was methanol (10 ml) and tetrahydrofuran (5
ml) and water (10 ml), 10% aqueous sodium hydroxide solution (5 ml) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes. Saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (10 ml)
, And concentrated under reduced pressure to precipitate a crude crystal of Compound 1. Gel filtration of crude crystals (SEPHADEX LH-20)
To give Compound 1. Yield: 0.7 g, Yield: 40% (from compound 1b) mass (nega): 709 (M-Na) Maximum absorption (methanol): 634 nm Molecular absorption coefficient: 190,000

【0067】合成例2:化合物4の合成 化合物1aを5−(3−メトキシフェニル)−7−アザ
インドレニンに変えて化合物1で示した合成方法と全く
同様の操作で化合物4を合成した。 mass(nega):769(M-Na) 吸収極大(メタノール):636nm 分子吸収係数:190000
Synthesis Example 2: Synthesis of Compound 4 Compound 4 was synthesized in exactly the same manner as the synthesis method shown in Compound 1, except that Compound 1a was changed to 5- (3-methoxyphenyl) -7-azaindolenin. mass (nega): 769 (M-Na) Absorption maximum (methanol): 636 nm Molecular absorption coefficient: 190000

【0068】合成例3:化合物9の合成 化合物1aを5−ベンゾフラニル−7−アザインドレニ
ンに変えて化合物1で示した合成方法と全く同様の操作
で化合物9を合成した。 mass(nega):790(M-Na) 吸収極大(メタノール):658nm 分子吸収係数:200000
Synthesis Example 3: Synthesis of Compound 9 Compound 9 was synthesized in exactly the same manner as the synthesis method shown in Compound 1, except that Compound 1a was changed to 5-benzofuranyl-7-azaindolenin. mass (nega): 790 (M-Na) Absorption maximum (methanol): 658 nm Molecular absorption coefficient: 200000

【0069】合成例4:化合物6の合成 化合物6の合成スキームを以下に示す。Synthesis Example 4: Synthesis of Compound 6 A synthesis scheme of Compound 6 is shown below.

【0070】[0070]

【化17】 Embedded image

【0071】(化合物6bの合成)化合物6a(2.7
g,10mmol)をアセトン(10ml)に溶解し、ヨ
ウ化メチル(4.3g,30mmol)を加えて2時間加
熱還流を行った。反応開始1時間後から析出し始めた化
合物6bの淡黄色結晶を酢酸エチル(20ml)を加えて
濾取して化合物6bを得た。 収量:3.2g、収率:80% mass(posi):281
(Synthesis of Compound 6b) Compound 6a (2.7)
g, 10 mmol) was dissolved in acetone (10 ml), methyl iodide (4.3 g, 30 mmol) was added, and the mixture was heated under reflux for 2 hours. One hour after the start of the reaction, pale yellow crystals of the compound 6b which started to precipitate were added with ethyl acetate (20 ml) and collected by filtration to obtain a compound 6b. Yield: 3.2 g, yield: 80% mass (posi): 281

【0072】(化合物6cの合成)化合物6b(4.1
g,10mmol)とN,N‘−ジフェニルホルムアミ
ジン(9.8g,50mmol)および無水酢酸(5ml)
を混合させ、60℃で1時間、100℃で3時間反応さ
せた。反応液に酢酸エチル(50ml)を添加すると化合
物6cが析出した。 収量:3.3g、収率:60% mass(posi):426
(Synthesis of Compound 6c) Compound 6b (4.1
g, 10 mmol), N, N'-diphenylformamidine (9.8 g, 50 mmol) and acetic anhydride (5 ml).
And reacted at 60 ° C. for 1 hour and at 100 ° C. for 3 hours. Compound 6c was precipitated when ethyl acetate (50 ml) was added to the reaction solution. Yield: 3.3 g, yield: 60% mass (posi): 426

【0073】(化合物6dの合成)化合物6a(2.66
g,10mml)をジメチルホルムアミド(10ml)に
溶解し、6−ブロモヘキサン酸エチル(5.9g,30
mmol)を加えて120℃で1.5時間反応を行っ
た。本反応では目的部位以外のヘテロ環窒素原子(イン
ドール環部分)へのアルキル化も進行するが、反応液に
反応後酢酸エチル(50ml)を加えて生じるオイル成分
をデカンテーションにより分離させ、ジエチルエーテル
により結晶化させると目的とするピリジン環窒素4級化
生成物である化合物6dのみを得ることができた。 収量:2.3g、収率:60% mass(posi):380
(Synthesis of Compound 6d) Compound 6a (2.66)
g, 10 mml) in dimethylformamide (10 ml) and ethyl 6-bromohexanoate (5.9 g, 30 ml).
(mmol) was added and reacted at 120 ° C. for 1.5 hours. In this reaction, alkylation to the heterocyclic nitrogen atom (indole ring portion) other than the target site also proceeds, but after the reaction, ethyl acetate (50 ml) is added, and the resulting oil component is separated by decantation to give diethyl ether. As a result, only compound 6d, which is the target pyridine ring nitrogen quaternization product, was obtained. Yield: 2.3 g, yield: 60% mass (posi): 380

【0074】(化合物6の合成)化合物6c(2.76
g,5mmol)と化合物6d(1.9g,5mmo
l)をジメチルホルムアミド(20ml)に溶解させ、ト
リエチルアミン(2ml)を加えて室温で30分反応さ
せた。反応液に酢酸メチル(30ml)を加えると化合物
6の粗結晶が析出した。得られた粗結晶をメタノール再
結晶により精製して化合物6を得た。 収量:1.8g、収率:55% mass(posi):671 吸収極大(メタノール):637nm 分子吸収係数:190000
(Synthesis of Compound 6) Compound 6c (2.76)
g, 5 mmol) and compound 6d (1.9 g, 5 mmol)
l) was dissolved in dimethylformamide (20 ml), triethylamine (2 ml) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes. When methyl acetate (30 ml) was added to the reaction solution, crude crystals of compound 6 precipitated. The obtained crude crystals were purified by methanol recrystallization to obtain Compound 6. Yield: 1.8 g, Yield: 55% mass (posi): 671 Absorption maximum (methanol): 637 nm Molecular absorption coefficient: 190000

【0075】合成例5:化合物7の合成 化合物6(0.67g,1mmol)をジメチルホルム
アミド(2ml)に溶解させ、サルファ−ロリオキシドジ
メチルホルムアミドコンプレックス(0.76g,5m
mol)を添加して90℃にて5時間反応させた。反応
液にアセトン(30ml)を添加すると化合物7の粗結晶
が析出したのでそれを濾取した。粗結晶をメタノールに
溶解させ、酢酸カリウム(0.5g)を添加して造塩反応
を行うと、化合物7が析出した。 収量:0.59g、収率:65% mass(nega):868 吸収極大(メタノール):640nm 分子吸収係数:190000
Synthesis Example 5: Synthesis of Compound 7 Compound 6 (0.67 g, 1 mmol) was dissolved in dimethylformamide (2 ml), and sulfuryl oxide dimethylformamide complex (0.76 g, 5 m
mol) was added and reacted at 90 ° C. for 5 hours. When acetone (30 ml) was added to the reaction solution, a crude crystal of Compound 7 precipitated, and was collected by filtration. The crude crystals were dissolved in methanol, and potassium acetate (0.5 g) was added to carry out a salt formation reaction, whereby Compound 7 was precipitated. Yield: 0.59 g, Yield: 65% mass (nega): 868 Maximum absorption (methanol): 640 nm Molecular absorption coefficient: 190000

【0076】合成例6:化合物10の合成 化合物10の合成スキームを以下に示す。Synthesis Example 6: Synthesis of Compound 10 A synthesis scheme of Compound 10 is shown below.

【0077】[0077]

【化18】 Embedded image

【0078】(化合物10bの合成)化合物10a(2.
76g,10mml)をフセトン(10ml)に溶解さ
せ、ブタンサルトン(2.0g,15mmol)を加えて
5時間加熱還流を行うと化合物10bが析出するので酢
酸エチル(20ml)を添加してこれを濾取した。 収量:3.3g、収率:80% mass(posi):412
(Synthesis of Compound 10b) Compound 10a (2.
76 g, 10 mml) was dissolved in fusetone (10 ml), butanesultone (2.0 g, 15 mmol) was added, and the mixture was heated under reflux for 5 hours to precipitate compound 10b. Ethyl acetate (20 ml) was added, and this was filtered. did. Yield: 3.3 g, yield: 80% mass (posi): 412

【0079】(化合物10cの合成)化合物10b(4.
1g,10mmol)とN,N‘−ジフェニルホルムア
ミジン(9.8g,50mmol)および無水酢酸(5m
l)を混合させ、60℃で1時間、100℃で3時間反
応させた。反応液に酢酸エチル(50ml)を添加すると
化合物10cが析出した。 収量:2.8g、収率:50% mass(posi):557
(Synthesis of Compound 10c) Compound 10b (4.
1 g, 10 mmol), N, N'-diphenylformamidine (9.8 g, 50 mmol) and acetic anhydride (5 m
1) were mixed and reacted at 60 ° C. for 1 hour and at 100 ° C. for 3 hours. When ethyl acetate (50 ml) was added to the reaction solution, compound 10c was precipitated. Yield: 2.8 g, yield: 50% mass (posi): 557

【0080】(化合物10eの合成)化合物6dの合成法
に準じて化合物10dから化合物10eを合成した。 mass(posi):380
(Synthesis of Compound 10e) Compound 10e was synthesized from compound 10d according to the method for synthesizing compound 6d. mass (posi): 380

【0081】(化合物10の合成)化合物10c(2.7
9g,5mmol)と化合物6d(1.9g,5mmo
l)をジメチルホルムアミド(20ml)に溶解させ、ト
リエチルアミン(2ml)を加えて室温で30分反応さ
せた。反応液に酢酸メチル(30ml)を加えると化合物
10の粗結晶が析出した。得られた粗結晶をメタノール
とクロロホルムの混合溶媒からの再結晶により精製して
化合物10を得た。 収量:1.8g、収率:45% mass(posi):803 吸収極大(メタノール):646nm 分子吸収係数:190000
(Synthesis of Compound 10) Compound 10c (2.7)
9 g, 5 mmol) and compound 6d (1.9 g, 5 mmol)
l) was dissolved in dimethylformamide (20 ml), triethylamine (2 ml) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes. When methyl acetate (30 ml) was added to the reaction solution, crude crystals of Compound 10 were precipitated. The obtained crude crystals were purified by recrystallization from a mixed solvent of methanol and chloroform to obtain Compound 10. Yield: 1.8 g, Yield: 45% mass (posi): 803 Absorption maximum (methanol): 646 nm Molecular absorption coefficient: 190000

【0082】合成例7:化合物11の合成 化合物10(0.80g,1mmol)をジメチルホル
ムアミド(2ml)に溶解させ、サルファ−ロリオキシド
ジメチルホルムアミドコンプレックス(0.46g,3
mmol)を添加して90℃にて5時間反応させた。反
応液にアセトン(30ml)を添加すると化合物11の粗
結晶が析出したのでそれを濾取した。粗結晶をメタノー
ルに溶解させ、酢酸カリウム(0.5g)を添加して造塩
反応を行うと、化合物11が析出した。 収量:0.46g、収率:50% mass(nega):882 吸収極大(メタノール):648nm 分子吸収係数:190000
Synthesis Example 7: Synthesis of Compound 11 Compound 10 (0.80 g, 1 mmol) was dissolved in dimethylformamide (2 ml), and sulfololoxide dimethylformamide complex (0.46 g, 3 mmol) was dissolved.
mmol) and reacted at 90 ° C. for 5 hours. When acetone (30 ml) was added to the reaction solution, crude crystals of Compound 11 were precipitated, and were collected by filtration. The crude crystals were dissolved in methanol, and potassium acetate (0.5 g) was added to perform a salt-forming reaction, whereby Compound 11 was precipitated. Yield: 0.46 g, Yield: 50% mass (nega): 882 Maximum absorption (methanol): 648 nm Molecular absorption coefficient: 190000

【0083】合成例8:化合物12の合成 化合物10の合成法に準じて化合物12を合成した。 mass(posi):803 吸収極大(メタノール):646nm 分子吸収係数:190000Synthesis Example 8: Synthesis of Compound 12 Compound 12 was synthesized according to the synthesis method of Compound 10. mass (posi): 803 Absorption maximum (methanol): 646 nm Molecular absorption coefficient: 190000

【0084】合成例9:化合物13の合成 化合物11の合成法に準じて化合物13を合成した。 mass(posi):882 吸収極大(メタノール):648nm 分子吸収係数:190000Synthesis Example 9: Synthesis of Compound 13 Compound 13 was synthesized according to the synthesis method of Compound 11. mass (posi): 882 Absorption maximum (methanol): 648 nm Molecular absorption coefficient: 190000

【0085】合成例10:化合物14の合成 化合物14の合成スキームを以下に示す。Synthesis Example 10: Synthesis of Compound 14 A synthesis scheme of Compound 14 is shown below.

【0086】[0086]

【化19】 Embedded image

【0087】(化合物14bの合成)化合物14a(1.
9g,10mmol)をアセトン(10ml)に溶解し、
ヨウ化メチル(4.3g,30mmol)を加えて2時間
加熱還流を行った。反応液に酢酸メチル(40ml)を加
えると析出する結晶を濾取して化合物14bを得た。 収量:4.0g、収率:85% mass(posi):349
(Synthesis of Compound 14b) Compound 14a (1.
9 g, 10 mmol) in acetone (10 ml),
Methyl iodide (4.3 g, 30 mmol) was added, and the mixture was heated under reflux for 2 hours. When methyl acetate (40 ml) was added to the reaction solution, the precipitated crystals were collected by filtration to obtain Compound 14b. Yield: 4.0 g, yield: 85% mass (posi): 349

【0088】(化学物14cの合成)化合物14b(2.
4g,5mmol)をピリジン(5ml)、酢酸(2ml)
の混合溶媒に溶解させ、オルソギ酸トリエチル(1ml)
とトリエチルアミン(1ml)を加えて140℃にて1時
間反応を行った。反応液に酢酸エチル(50ml)とヘキ
サン(50ml)を加えると化合物14cを含む固体が析
出する。これを濾過して取り出し精製せずに次の反応に
用いた。 mass(posi):708
(Synthesis of Chemical Compound 14c) Compound 14b (2.
4 g, 5 mmol) in pyridine (5 ml), acetic acid (2 ml).
In a mixed solvent of triethyl orthoformate (1 ml)
And triethylamine (1 ml) were added and reacted at 140 ° C. for 1 hour. When ethyl acetate (50 ml) and hexane (50 ml) are added to the reaction solution, a solid containing compound 14c precipitates. This was filtered out and used for the next reaction without purification. mass (posi): 708

【0089】(化合物14の合成)前記未精製の化合物1
4c全量をメタノール(10ml)、テトラヒドロフラン
(5ml)および水(10ml)に溶解し、10%水酸化ナ
トリウム水溶液(5ml)を加えて室温で2時間反応させ
た。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(10ml)
を加えた後、減圧濃縮すると化合物14の粗結晶が析出
する。粗結晶をゲル濾過(SEPHADEX LH−2
0)により精製し、化合物14を得た。 収量:0.59g、収率:35%(化合物14bより) mass(nega):650(M-Na) 吸収極大(メタノール):632nm 分子吸収係数:170000
(Synthesis of Compound 14) Unpurified Compound 1
4c to methanol (10 ml), tetrahydrofuran
(5 ml) and water (10 ml), 10% aqueous sodium hydroxide solution (5 ml) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 2 hours. Saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (10 ml)
, And concentrated under reduced pressure to precipitate a crude crystal of compound 14. The crude crystals were subjected to gel filtration (SEPHADEX LH-2).
Purification according to 0) gave compound 14. Yield: 0.59 g, Yield: 35% (from compound 14b) mass (nega): 650 (M-Na) Maximum absorption (methanol): 632 nm Molecular absorption coefficient: 170,000

【0090】合成例11:化合物17の合成 化合物17の合成スキームを以下に示す。Synthesis Example 11: Synthesis of Compound 17 A synthesis scheme of Compound 17 is shown below.

【0091】[0091]

【化20】 Embedded image

【0092】(化合物17bの合成)化合物17a
(2.6g,16.2mmol)をアセトン(10ml)
に溶解し、6−ブロモヘキサン酸エチル(3.6g,1
6.2mmol)を加えて5時間加熱還流を行った。本
反応では目的部位以外のヘテロ環窒素原子(インドール
環部分)へのアルキル化も進行するが、反応液に反応後
酢酸エチル(50ml)とヘキサン(50ml)を加えて生
じるオイル成分をデカンテーションにより分離させ、該
オイルに酢酸エチル(10ml)とイソプロピルアルコー
ル(5ml)を加えて30分間加熱還流を行なうことによ
り目的とするピリジン環窒素4級化生成物である化合物
17bのみを結晶化させることができた。 収量:4.0g、収率:65% mass(posi):337
(Synthesis of Compound 17b) Compound 17a
(2.6 g, 16.2 mmol) in acetone (10 ml)
And dissolved in ethyl 6-bromohexanoate (3.6 g, 1
(6.2 mmol) and heated under reflux for 5 hours. In this reaction, alkylation to the heterocyclic nitrogen atom (indole ring portion) other than the target site also proceeds, but after the reaction, the oil component generated by adding ethyl acetate (50 ml) and hexane (50 ml) is decanted. Separation, ethyl acetate (10 ml) and isopropyl alcohol (5 ml) were added to the oil, and the mixture was heated under reflux for 30 minutes to crystallize only the desired pyridine ring nitrogen quaternary product, compound 17b. did it. Yield: 4.0 g, yield: 65% mass (posi): 337

【0093】(化合物17cの合成)化合物17b(4.0
g,10.4mmol)をピリジン(5ml)、酢酸(2m
l)の混合溶媒に溶解させ、オルソギ酸トリエチル(2m
l)とトリエチルアミン(0.5ml)を加えて140℃
にて1時間反応を行なった。反応液に酢酸エチル(50
ml)とヘキサン(50ml)を加えると化合物17cを
含む固体が析出する。これを濾過して取り出し精製せず
に次の反応に用いた。 mass(posi):615
(Synthesis of Compound 17c) Compound 17b (4.0
g, 10.4 mmol) in pyridine (5 ml) and acetic acid (2 m
l) in a mixed solvent, and triethyl orthoformate (2 m
l) and triethylamine (0.5 ml).
For 1 hour. Ethyl acetate (50
ml) and hexane (50 ml) precipitate a solid containing compound 17c. This was filtered out and used for the next reaction without purification. mass (posi): 615

【0094】(化合物17の合成)前記未精製の化合物1
7c全量をメタノール(10ml)と水(10ml)に溶解
し、10%水酸化ナトリウム水溶液(5ml)を加えて室
温で30分間反応させた。反応液に飽和炭酸水素ナトリ
ウム水溶液(10ml)を加えた後メタノールを減圧濃縮
すると化合物17の粗結晶が析出する。粗結晶をゲル濾
過(SEPHADEX LH−20)により精製し、化合
物17を得た。 収量:1.5g、収率:50%(化合物17bより) H−NMR(DMSO−d6)δ;8.90(t,1
H),8.08(d,2H), 7.80(d,2
H),6.98(t,2H),6.00(d,2H),
4.42(t,4H),2.13(t,4H),1.7
8(m,4H),1.58(m,4H),1.37
(s,12H),1.12(m,4H) 吸収極大(メタノール):609nm 分子吸収係数:120000
(Synthesis of Compound 17) Unpurified Compound 1
The whole amount of 7c was dissolved in methanol (10 ml) and water (10 ml), a 10% aqueous sodium hydroxide solution (5 ml) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes. A saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate (10 ml) was added to the reaction solution, and then methanol was concentrated under reduced pressure, whereby crude crystals of compound 17 were precipitated. The crude crystals were purified by gel filtration (SEPHADEX LH-20) to obtain Compound 17. Yield: 1.5 g, Yield: 50% (from compound 17b) H-NMR (DMSO-d6) δ; 8.90 (t, 1)
H), 8.08 (d, 2H), 7.80 (d, 2
H), 6.98 (t, 2H), 6.00 (d, 2H),
4.42 (t, 4H), 2.13 (t, 4H), 1.7
8 (m, 4H), 1.58 (m, 4H), 1.37
(S, 12H), 1.12 (m, 4H) Absorption maximum (methanol): 609 nm Molecular absorption coefficient: 120,000

【0095】合成例12:化合物18の合成 化合物1の合成で用いた化合物1aを5−(4−メチル
フェニル)−7−アザインドレニンに代えて化合物1で
示した合成方法と同様の操作で化合物18を合成した。 mass(nega):738(M-Na) 吸収極大(メタノール):636nm 分子吸光係数:190000
Synthesis Example 12: Synthesis of Compound 18 The same operation as the synthesis method shown for Compound 1 was conducted, except that Compound 1a used in the synthesis of Compound 1 was replaced with 5- (4-methylphenyl) -7-azaindolenine. Compound 18 was synthesized. mass (nega): 738 (M-Na) Absorption maximum (methanol): 636 nm Molecular absorption coefficient: 190,000

【0096】合成例13:化合物19の合成 化合物18を濃硫酸に溶解し、100℃にて30分間反
応させた。反応液を氷冷して10%水酸化ナトリウム水
溶液でpH8に調節した後、減圧濃縮を行った。得られ
た残渣をセファデックスLH20で3回精製して化合物
19を得た。 mass(nega):942(M-Na) 吸収極大(メタノール):636nm 分子吸光係数:190000
Synthesis Example 13: Synthesis of Compound 19 Compound 18 was dissolved in concentrated sulfuric acid and reacted at 100 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was ice-cooled, adjusted to pH 8 with a 10% aqueous sodium hydroxide solution, and then concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified three times using Sephadex LH20 to obtain Compound 19. mass (nega): 942 (M-Na) Absorption maximum (methanol): 636 nm Molecular absorption coefficient: 190,000

【0097】合成例14:化合物20の合成 化合物6の合成で用いた化合物6aを5−(4−メチル
フェニル)−7−アザインドレニンに代えて化合物6で
示した合成方法と同様の操作で化合物20を合成した。 mass(nega):639(M-Na) 吸収極大(メタノール):636nm 分子吸光係数:190000
Synthesis Example 14: Synthesis of Compound 20 The same procedure as the synthesis method shown for Compound 6 was used, except that Compound 6a used in the synthesis of Compound 6 was replaced with 5- (4-methylphenyl) -7-azaindolenine. Compound 20 was synthesized. mass (nega): 639 (M-Na) Absorption maximum (methanol): 636 nm Molecular absorption coefficient: 190,000

【0098】合成例15:化合物21の合成 化合物19の合成で用いた化合物18を化合物20に代
えて化合物19で示した合成方法と同様の操作で化合物
20を合成した。 mass(nega):798(M-K) 吸収極大(メタノール):638nm 分子吸光係数:195000
Synthesis Example 15: Synthesis of Compound 21 Compound 20 was synthesized in the same manner as in the synthesis method of Compound 19, except that Compound 18 used in the synthesis of Compound 19 was replaced with Compound 20. mass (nega): 798 (MK) Absorption maximum (methanol): 638 nm Molecular extinction coefficient: 195000

【0099】合成例16:化合物22の合成 化合物22の合成スキームを以下に示す。Synthesis Example 16: Synthesis of Compound 22 A synthesis scheme of Compound 22 is shown below.

【0100】[0100]

【化21】 Embedded image

【0101】(化合物22bの合成)化合物22a
(5.0g、19mmol)を47%臭化水素水(50
ml)に溶解し、3時間加熱還流を行った。反応液を室
温まで冷却した後、水を加えて化合物22bを結晶化さ
せた。 収量:3.8g、収率:80% mass(posi):253(M+H)
(Synthesis of Compound 22b) Compound 22a
(5.0 g, 19 mmol) in 47% aqueous hydrogen bromide (50
ml) and heated under reflux for 3 hours. After cooling the reaction solution to room temperature, water was added to crystallize Compound 22b. Yield: 3.8 g, yield: 80% mass (posi): 253 (M + H)

【0102】(化合物22cの合成)化合物22b
(3.0g、12mmol)をジメチルホルムアミド
(30ml)に溶解し、氷冷下で62.5%水素化ナト
リウム(0.46g、12mmol)とプロパンサルト
ン(1.5g、12mmol)を加えてそのまま1時間
反応させた。反応液に酢酸エチルとイソプロピルアルコ
ールを添加して化合物22cを結晶化させた。 収量:4.4g、収率:93% mass(nega):373(M-Na)
(Synthesis of Compound 22c) Compound 22b
(3.0 g, 12 mmol) was dissolved in dimethylformamide (30 ml), and 62.5% sodium hydride (0.46 g, 12 mmol) and propane sultone (1.5 g, 12 mmol) were added under ice cooling. The reaction was performed for 1 hour. Ethyl acetate and isopropyl alcohol were added to the reaction solution to crystallize compound 22c. Yield: 4.4 g, yield: 93% mass (nega): 373 (M-Na)

【0103】(化合物22dの合成)化合物22c
(3.0g、7.6mmol)をジメチルホルムアミド
(5ml)に溶解し、6−ブロモヘキサン酸エチル
(3.3g、15mmol)を加えて120℃で6時間
反応を行った。本反応では目的部位以外のヘテロ環窒素
原子(インドール環部分)へのアルキル化も進行するが、
反応液にイソプロピルアルコール(5ml)を加えて30
分間加熱還流を行うことにより目的とするピリジン環窒
素4級化生成物である化合物22dのみを結晶化するこ
とができた。 収量:2.8g、収率:72% mass(nega):488(M-Na)
(Synthesis of Compound 22d) Compound 22c
(3.0 g, 7.6 mmol) was dissolved in dimethylformamide (5 ml), and ethyl 6-bromohexanoate (3.3 g, 15 mmol) was added, followed by a reaction at 120 ° C. for 6 hours. In this reaction, alkylation to a heterocyclic nitrogen atom (indole ring portion) other than the target site also proceeds,
Isopropyl alcohol (5 ml) was added to the reaction
By heating and refluxing for one minute, only the target pyridine ring nitrogen quaternization product, compound 22d, could be crystallized. Yield: 2.8 g, yield: 72% mass (nega): 488 (M-Na)

【0104】(化合物22の合成)化合物10c(2.7
9g,5mmol)と化合物22d(2.6g,5mm
ol)をジメチルホルムアミド(100ml)に溶解さ
せ、トリエチルアミン(2ml)を加えて40℃で1時
間反応させた。反応液に酢酸メチル(30ml)を加える
と化合物22の粗結晶が析出した。得られた粗結晶をメ
タノールとクロロホルムの混合溶媒からの再結晶により
精製して化合物22を得た。 収量:1.8g、収率:40% mass(posi):910(M-Na) 吸収極大(メタノール):648nm 分子吸光係数:195000
(Synthesis of Compound 22) Compound 10c (2.7)
9 g, 5 mmol) and compound 22d (2.6 g, 5 mm
ol) was dissolved in dimethylformamide (100 ml), triethylamine (2 ml) was added, and the mixture was reacted at 40 ° C for 1 hour. When methyl acetate (30 ml) was added to the reaction solution, crude crystals of compound 22 were precipitated. The obtained crude crystals were purified by recrystallization from a mixed solvent of methanol and chloroform to obtain Compound 22. Yield: 1.8 g, Yield: 40% mass (posi): 910 (M-Na) Absorption maximum (methanol): 648 nm Molecular absorption coefficient: 195000

【0105】実施例1:化合物17−dUTP結合体の合成 5mg(2.5部)の化合物17を0.1Mの MES緩衝液2mlに溶解
し、WSC塩酸塩3.66mg(5部)及びSulfo-NHS 4.20mg(5部)
を加え室温で15分間攪拌した。これに、アミノアリル-d
UTP(Sigma)2.2mgを200μlの0.1MのMESに溶解して添加
し、室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)10
0μlを加え反応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-OD
S-AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、30%メタノー
ル水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取ク
ロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)に
より精製し純度95%の目的物を得た(収率71%)。 MS分析値:M- 1128
Example 1 Synthesis of Compound 17-dUTP Conjugate 5 mg (2.5 parts) of compound 17 was dissolved in 2 ml of 0.1 M MES buffer, and 3.66 mg (5 parts) of WSC hydrochloride and 4.20 mg of Sulfo-NHS were dissolved. (5 copies)
Was added and stirred at room temperature for 15 minutes. In addition, aminoallyl-d
2.2 mg of UTP (Sigma) was dissolved in 200 μl of 0.1 M MES and added, followed by reaction at room temperature for 2 hours. 1 M Tris buffer (pH 7.5) 10
After adding 0 μl to stop the reaction, 8 g of ODS silica (YMC-OD
It was adsorbed on a column packed with S-AQ 120A) and eluted with a 30% aqueous methanol solution. After the eluate was concentrated, it was further purified by medium pressure preparative chromatography (YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B) to obtain the desired product with a purity of 95% (yield 71%). MS analysis value: M-1128

【0106】[0106]

【化22】 Embedded image

【0107】実施例2:化合物14−dUTP結合体の合成 5.5mg(2.5部)の化合物14を200μlのDMSOに溶解し、WS
C塩酸塩3.1mg(5部)及びSulfo-NHS 3.55mg(5部)を加え
室温で15分間攪拌した。これに、2mlの0.1M MESに溶解
したアミノアリル-dUTP(Sigma)2.2mgを添加し、室温で2
時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)100μlを加え
反応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ 120
A)を充填したカラムに吸着させ、45%メタノール水溶液
で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取クロマトグ
ラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)により精製
し純度94%の目的物を得た(収率66%)。 MS分析値:M- 1206
Example 2 Synthesis of Compound 14-dUTP Conjugate 5.5 mg (2.5 parts) of Compound 14 was dissolved in 200 μl of DMSO, and
3.1 mg (5 parts) of C hydrochloride and 3.55 mg (5 parts) of Sulfo-NHS were added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes. To this, 2.2 mg of aminoallyl-dUTP (Sigma) dissolved in 2 ml of 0.1 M MES was added and added at room temperature.
Allowed to react for hours. After stopping the reaction by adding 100 μl of 1 M Tris buffer (pH 7.5), 8 g of ODS silica (YMC-ODS-AQ120
The mixture was adsorbed on a column packed with A) and eluted with a 45% aqueous methanol solution. After the eluate was concentrated, it was further purified by medium pressure preparative chromatography (YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B) to obtain the desired product with a purity of 94% (yield 66%). MS analysis value: M-1206

【0108】実施例3:化合物1−dUTP結合体の合成 6.00mg(2.5部)の化合物1を200μlのDMSOに溶解し、WSC
塩酸塩3.1mg(5部)及びSulfo-NHS 3.55mg(5部)を加え室
温で30分間攪拌した。これに、2mlの0.1M MESに溶解し
たアミノアリル-dUTP(Sigma)2.2mgを添加し、室温で2時
間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反
応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ 120A)
を充填したカラムに吸着させ、50%メタノール水溶液で
溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取クロマトグラ
フィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)により精製し
純度92%の目的物を得た(収率74%)。 MS分析値:M- 1266
Example 3 Synthesis of Compound 1-dUTP Conjugate 6.00 mg (2.5 parts) of Compound 1 was dissolved in 200 μl of DMSO and
3.1 mg (5 parts) of hydrochloride and 3.55 mg (5 parts) of Sulfo-NHS were added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. To this, 2.2 mg of aminoallyl-dUTP (Sigma) dissolved in 2 ml of 0.1 M MES was added and reacted at room temperature for 2 hours. After stopping the reaction by adding 100 μl of 1 M Tris buffer (pH 7.5), 8 g of ODS silica (YMC-ODS-AQ 120A)
Was eluted with a 50% aqueous methanol solution. After the eluate was concentrated, the eluate was further purified by medium pressure preparative chromatography (YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B) to obtain the desired product with a purity of 92% (yield 74%). MS analysis value: M-1266

【0109】実施例4:化合物10−dUTP結合体の合成 3.27mg(1.0部)の化合物10を200μlのDMSOに溶解し、W
SC塩酸塩0.76mg(1.1部)及びSulfo-NHS 0.86mg(1.1部)
を加え室温で30分間攪拌した。これに、2mlの0.1MのMES
に溶解したアミノアリル-dUTP(Sigma)2.2mgを添加し、
室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)100μl
を加え反応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ
120A)を充填したカラムに吸着させ、40%メタノール水
溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取クロマ
トグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)により
精製し純度95%の目的物を得た。(収率77%) MS分析値:M- 1359
Example 4 Synthesis of Compound 10-dUTP Conjugate 3.27 mg (1.0 part) of Compound 10 was dissolved in 200 μl of DMSO, and
SC hydrochloride 0.76 mg (1.1 parts) and Sulfo-NHS 0.86 mg (1.1 parts)
Was added and stirred at room temperature for 30 minutes. To this, 2ml of 0.1M MES
2.2 mg of aminoallyl-dUTP (Sigma) dissolved in
The reaction was performed at room temperature for 2 hours. 100 μl of 1 M Tris buffer (pH 7.5)
Was added to stop the reaction, and then 8 g of ODS silica (YMC-ODS-AQ
The mixture was adsorbed on a column packed with 120A) and eluted with a 40% aqueous methanol solution. After the eluate was concentrated, it was further purified by medium pressure preparative chromatography (YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B) to obtain the desired product with a purity of 95%. (Yield: 77%) MS analysis: M-1359

【0110】実施例5:化合物19−dUTP結合体の合成 1.00mg(1.0部)の化合物19を300μlの0.1M MESに溶解
し、WSC塩酸塩0.44mg(2.2部)及びSulfo-NHS 0.50mg(2.
2部)を加え室温で60分間攪拌した。これに、0.25mg(0.
4部)のアミノアリル-dUTP(Sigma)を加え、さらに1M炭
酸緩衝液(pH9.0)300μlを添加して室温で一
晩反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反
応を停止させた後、中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZ
EN Ultrapack ODS-S-40B)により精製し純度90%の目的
物を得た。(収率62%) MS分析値:M- 1513
Example 5 Synthesis of Compound 19-dUTP Conjugate 1.00 mg (1.0 part) of compound 19 was dissolved in 300 μl of 0.1 M MES, and 0.44 mg (2.2 parts) of WSC hydrochloride and 0.50 mg of Sulfo-NHS ( 2.
2 parts) and stirred at room temperature for 60 minutes. Add 0.25 mg (0.
4 parts) of aminoallyl-dUTP (Sigma) was added, and 300 μl of 1M carbonate buffer (pH 9.0) was further added, followed by reaction at room temperature overnight. After stopping the reaction by adding 100 μl of 1 M Tris buffer (pH 7.5), medium pressure preparative chromatography (YAMAZ
The product was purified by EN Ultrapack ODS-S-40B) to obtain the desired product with a purity of 90%. (Yield: 62%) MS analysis: M-1513

【0111】実施例6:化合物22−dUTP結合体の合成 1.00mg(1.0部)の化合物22を300μlの0.1M MESに溶解
し、WSC塩酸塩0.23mg(1.1部)及びSulfo-NHS 0.26mg(1.
1部)を加え室温で60分間攪拌した。これに、0.66mg(1.
0部)のアミノアリル-dUTP(Sigma)を加え、さらに1M炭
酸緩衝液(pH9.0)300μlを添加して室温で一
晩反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反
応を停止させた後、中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZ
EN Ultrapack ODS-S-40B)により精製し純度96%の目的
物を得た。(収率44%) MS分析値:M- 1503
Example 6 Synthesis of Compound 22-dUTP Conjugate 1.00 mg (1.0 parts) of compound 22 was dissolved in 300 μl of 0.1 M MES, and 0.23 mg (1.1 parts) of WSC hydrochloride and 0.26 mg of Sulfo-NHS ( 1.
1 part) and stirred at room temperature for 60 minutes. Add 0.66mg (1.
(0 parts) of aminoallyl-dUTP (Sigma), and 300 μl of 1M carbonate buffer (pH 9.0) was further added thereto, followed by reaction at room temperature overnight. After stopping the reaction by adding 100 μl of 1 M Tris buffer (pH 7.5), medium pressure preparative chromatography (YAMAZ
The product was purified by EN Ultrapack ODS-S-40B) to obtain the desired product with a purity of 96%. (Yield: 44%) MS analysis: M-1503

【0112】使用例1:転写反応を用いた蛍光標識DN
Aプローブの作製 ヒト肝臓mRNA(Clontech社)(0.5μg)および
オリゴdTプライマー(dT18-21、 Gibco BRL)
(0.5μg)を混合し、70℃で10分間加熱した
後、氷上で急冷した。この混合物に、RNaseOUT
(Gibco BRL)(40U)、dATP(500μM)、
dGTP(500μM)、dCTP(500μM)、d
TTP(200μM)、実施例1で得た化合物17−dU
TP結合体(100μM)、SuperScriptII
逆転写酵素(Gibco BRL)(400U)、DEP
C処理水(全量20ulになる量)を添加し、42℃で
2時間反応させた。反応終了後、EDTA及びNaOH
を添加し65℃で1時間インキュベートすることで、反
応の停止とmRNAの分解を行った。反応液をCent
riSepカラム(PRINCETON SEPARA
TION,INC)に通し、未反応の化合物17−dUTP
結合体などを除去して精製した。
Use Example 1: Fluorescent Labeled DN Using Transcription Reaction
Preparation of probe A Human liver mRNA (Clontech) (0.5 μg) and oligo dT primer (dT 18-21 , Gibco BRL)
(0.5 μg), heated at 70 ° C. for 10 minutes, and quenched on ice. To this mixture, RNaseOUT
(Gibco BRL) (40 U), dATP (500 μM),
dGTP (500 μM), dCTP (500 μM), d
TTP (200 μM), compound 17-dU obtained in Example 1
TP conjugate (100 μM), SuperScript II
Reverse transcriptase (Gibco BRL) (400U), DEP
C-treated water (total amount of 20 ul) was added and reacted at 42 ° C. for 2 hours. After completion of the reaction, EDTA and NaOH
Was added and incubated at 65 ° C. for 1 hour to terminate the reaction and degrade mRNA. Centrifuge the reaction solution
riSep column (PRINCETON SEPARA
Unreacted compound 17-dUTP
The conjugate was removed and purified.

【0113】また、比較用として、化合物17−dUTP結
合体の代わりに色素(Cy5)で標識した比較用の蛍光
ヌクレオチド(Cy5−AP3−dUTP;Amersham p
harmacia biotech)を使用して上記と同様に逆転写反応
を行い、反応物を精製した。精製後の反応液をそれぞれ
アガロースゲル電気泳動し、SYBR GreenII
(Molecular Probes)で染色後FLA
2000(富士写真フイルム)でスキャンした。その結
果、本発明の化合物17−dUTP結合体を使用した方が蛍
光強度が強く、より鮮明に検出できることが判明した。
また、蛍光光度計で蛍光強度を測定し、260nmの吸
光度よりDNA量を測定し、それらの結果から計算した
取り込み率及びプローブ1μM当たりの蛍光強度を計算
した。これらの結果を表1に示す。表1から分かるよう
に、本発明の化合物17−dUTP結合体を使用した場合の
方が取り込み率および蛍光強度が高かった。
For comparison, a fluorescent nucleotide for comparison (Cy5-AP3-dUTP; Amershamp) labeled with a dye (Cy5) instead of the compound 17-dUTP conjugate was used.
reverse transcription reaction was carried out in the same manner as described above using harmacia biotech), and the reaction product was purified. Each of the purified reaction solutions was subjected to agarose gel electrophoresis, and SYBR Green II was used.
FLA after staining with (Molecular Probes)
Scanned with 2000 (Fuji Photo Film). As a result, it was found that when the compound 17-dUTP conjugate of the present invention was used, the fluorescence intensity was higher and the detection could be performed more clearly.
In addition, the fluorescence intensity was measured with a fluorometer, the amount of DNA was measured from the absorbance at 260 nm, and the incorporation rate and the fluorescence intensity per 1 μM of the probe were calculated from the results. Table 1 shows the results. As can be seen from Table 1, the uptake rate and the fluorescence intensity were higher when the compound 17-dUTP conjugate of the present invention was used.

【0114】[0114]

【表1】 [Table 1]

【0115】使用例2:PCR法による蛍光色素ラベル
化DNAプローブの作製 PCR反応液の組成: 鋳型DNA:10pg プライマー1および2:各0.5μM dATP,dGTP,dCTP:各200μM dTTP:各150μM 化合物17−dUTP結合体またはCy5-AP3-dUTP:50μM Pyrobest DNA polymerase (TAKARA):0.5u
nit 減菌水:全量で20μl (注:鋳型DNAとしては、pCR-ScriptTMSK(+)
(STRATAGENE社)にα−2−HS−グリコプロテイン遺
伝子を組み込んだものを使用し、プライマー1および2
の配列は各々配列表1および2に示す)
Usage Example 2: Preparation of DNA Probe Labeled with Fluorescent Dye by PCR Method Composition of PCR Reaction Solution: Template DNA: 10 pg Primers 1 and 2: 0.5 μM each dATP, dGTP, dCTP: 200 μM each dTTP: 150 μM each compound 17-dUTP conjugate or Cy5-AP3-dUTP: 50 μM Pyrobest DNA polymerase (TAKARA): 0.5 u
nit sterilized water: 20 μl in total volume (Note: pCR-Script SK (+)
(STRATAGENE) into which α-2-HS-glycoprotein gene was incorporated, and primers 1 and 2 were used.
Are shown in Sequence Listings 1 and 2, respectively)

【0116】上記組成液をPCR反応液として使用し、
94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒のサ
イクルを30サイクル行い、PCR反応を行った。反応
液をCentriSepカラム(PRINCETON
SEPARATION,INC)に通し、未反応の蛍光
ヌクレオチドなどを除去し、生成物を精製した。精製後
の反応液をアガロースゲル電気泳動し、SYBR Gr
eenII(Molecular Probes)で染
色後FLA2000(富士写真フイルム)でスキャンし
た。その結果、本発明の化合物17−dUTP結合体を使用
した方が蛍光強度が強く、より鮮明に検出できることが
判明した。また、蛍光光度計で蛍光強度を測定し、26
0nmの吸光度よりDNA量を測定し、それらの結果か
ら計算した取り込み率及びプローブ1μM当たりの蛍光
強度を計算した。これらの結果を表2に示す。表2から
分かるように、本発明の化合物17−dUTP結合体を使用
した場合の方が取り込み率および蛍光強度が高かった。
Using the above composition solution as a PCR reaction solution,
30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds were performed 30 times to perform PCR reaction. The reaction solution is applied to a CentriSep column (PRINCETON).
(SEPARATION, INC) to remove unreacted fluorescent nucleotides and the like, and purify the product. The purified reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and SYBR Gr
After staining with eenII (Molecular Probes), scanning was performed with FLA2000 (Fuji Photo Film). As a result, it was found that when the compound 17-dUTP conjugate of the present invention was used, the fluorescence intensity was higher and the detection could be performed more clearly. The fluorescence intensity was measured with a fluorometer,
The DNA amount was measured from the absorbance at 0 nm, and the incorporation rate and the fluorescence intensity per 1 μM of the probe were calculated from the results. Table 2 shows the results. As can be seen from Table 2, the uptake rate and the fluorescence intensity were higher when the compound 17-dUTP conjugate of the present invention was used.

【0117】[0117]

【表2】 [Table 2]

【0118】[0118]

【発明の効果】本発明の蛍光ヌクレオチドは新規物質で
あり、DNA合成の際の取り込み率および取り込み後の
蛍光強度が良好であるため、核酸の標識物質として有用
である。
Industrial Applicability The fluorescent nucleotide of the present invention is a novel substance, and is useful as a labeling substance for nucleic acids because of its good uptake rate during DNA synthesis and good fluorescence intensity after uptake.

【0119】[0119]

【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Fuji Photo Film Co.Ltd., <120> Fluorescent Nucleotide <130> 99389M <160> 2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 1 tggccgcctt caacgctcag 20 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 2 tcaggcactt tcattaacag gcacat 26[Sequence list] SEQUENCE LISTING <110> Fuji Photo Film Co. Ltd., <120> Fluorescent Nucleotide <130> 99389M <160> 2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 1 tggccgcctt caacgctcag 20 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 2 tcaggcactt tcattaacag gcacat 26

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小島 政芳 埼玉県朝霞市泉水3丁目11番46号 富士写 真フイルム株式会社朝霞研究所内 (72)発明者 須藤 幸夫 埼玉県朝霞市泉水3丁目11番46号 富士写 真フイルム株式会社朝霞研究所内 (72)発明者 西垣 純爾 神奈川県南足柄市中沼210番地 富士写真 フイルム株式会社足柄研究所内 Fターム(参考) 4B024 AA11 CA01 CA05 CA09 CA12 DA20 HA08 HA13 4B063 QA01 QQ08 QQ42 QQ52 QQ53 QR08 QR32 QR42 QR56 QR62 QR66 QS03 QS16 QS25 QS36 QX02 4C057 BB02 BB05 DD01 LL10 LL17 LL18 LL19 LL21 LL22 LL29 LL40 LL41 LL42 LL44 LL45 MM02 MM05  ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Inventor Masayoshi Kojima 3-11-46 Izumi, Asaka-shi, Saitama Prefecture Fujisha Shin Film Co., Ltd. Asaka Research Laboratory (72) Inventor Yukio Sudo 3--11 Izumi, Asaka-shi, Saitama No. 46 Fuji Photo Shin Film Co., Ltd., Asaka Research Laboratory (72) Inventor Junji Nishigaki 210 Nakanakanuma, Minamiashigara-shi, Kanagawa Prefecture Fuji Photo Film Co., Ltd. Ashigara Research Laboratory F-term (reference) 4B024 AA11 CA01 CA05 CA09 CA12 DA20 HA08 HA13 4B063 QA01 QQ08 QQ42 QQ52 QQ53 QR08 QR32 QR42 QR56 QR62 QR66 QS03 QS16 QS25 QS36 QX02 4C057 BB02 BB05 DD01 LL10 LL17 LL18 LL19 LL21 LL22 LL29 LL40 LL41 LL42 LL44 LL45 MM02 MM05

Claims (12)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 式:A−B−C で表される蛍光ヌクレオチド。[式中、Aは天然又は合
成のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレ
オチドあるいはそれらの誘導体の残基を示し、上記残基
中の塩基部分でBと結合し、Bは2価の連結基または単
結合を示し、Cは下記一般式(I)から誘導される1価
の基であり、R1またはR2中に存在する反応性基でBと
結合している。 【化1】 (式中、R1及びR2はそれぞれ独立に、Bと共有結合し
得る反応性基で置換されていてもよいアルキル基を示
し;R3、R4、R5、及びR6はそれぞれ独立にアルキル
基を示すが、R3とR4、及び/又はR5とR6は互いに結
合してそれらが結合する炭素原子とともに飽和の炭素環
を形成してもよく;V1、V2、V3、V4、V 5、V6、V
7、V8、V9、及びV10はそれぞれ独立に水素原子又は
一価の置換基を示し、これらのうち隣接する2つの基は
互いに結合して環を形成してもよく;L1、L2、及びL
3は置換又は無置換のメチン基を示し;m、n、s、及
びtは0又は1を示し、ただしm+n=1かつs+t=
1であり;pは1、2、又は3を示し;Mは対イオンを
示し;qは分子の電荷を中和するのに必要な数を示
す)]
1. A fluorescent nucleotide represented by the formula: ABC. Wherein A is natural or synthetic
Mature nucleotides, oligonucleotides or polynucleotides
Indicates the residue of otide or a derivative thereof;
Binds to B at a base moiety in B, and B is a divalent linking group or
C represents a monovalent group derived from the following general formula (I)
And R is1Or RTwoWith a reactive group present in
Are combined. Embedded image(Where R1And RTwoAre independently and covalently linked to B
Represents an alkyl group which may be substituted with a reactive group
RThree, RFour, RFive, And R6Are each independently alkyl
Represents a group, but RThreeAnd RFourAnd / or RFiveAnd R6Are connected to each other
A saturated carbocycle with the carbon atoms to which they are attached
May be formed; V1, VTwo, VThree, VFour, V Five, V6, V
7, V8, V9, And VTenAre each independently a hydrogen atom or
Represents a monovalent substituent, of which two adjacent groups are
L may combine with each other to form a ring;1, LTwo, And L
ThreeRepresents a substituted or unsubstituted methine group; m, n, s, and
And t represent 0 or 1, provided that m + n = 1 and s + t =
P is 1, 2, or 3; M is a counter ion
Represents the number required to neutralize the molecular charge
)]
【請求項2】 R1及びR2のうち少なくとも一つがB中
のアミノ基、ヒドロキシル基、又はチオール基と共有結
合し得る活性エステル基で置換されたアルキル基であ
る、請求項1に記載の蛍光ヌクレオチド。
2. The method according to claim 1, wherein at least one of R 1 and R 2 is an alkyl group substituted with an active ester group capable of covalently bonding to an amino group, a hydroxyl group, or a thiol group in B. Fluorescent nucleotide.
【請求項3】 R1及びR2のうち少なくとも一つがカル
ボキシル基で置換されたアルキル基である請求項1また
は2に記載の蛍光ヌクレオチド。
3. The fluorescent nucleotide according to claim 1, wherein at least one of R 1 and R 2 is an alkyl group substituted with a carboxyl group.
【請求項4】 Aがヌクレオチドあるいはそれらの誘導
体の残基である、請求項1から3の何れか1項に記載の
蛍光ヌクレオチド。
4. The fluorescent nucleotide according to claim 1, wherein A is a residue of a nucleotide or a derivative thereof.
【請求項5】 Aが(1)AMP、ADP、ATP、G
MP、GDP、GTP、CMP、CDP、CTP、UM
P、UDP UTP、TMP、TDP、TTP、2−M
e−AMP、2−Me−ADP、2−Me−ATP、1
−Me−GMP、1−Me−GDP、1−Me−GT
P、5−Me−CMP、5−Me−CDP、5−Me−
CTP、5−MeO−CMP、5−MeO−CDP、5
−MeO−CTPから成るヌクレオチドから成る群、
(2)前記ヌクレオチドに対応するデオキシヌクレオチ
ドおよびジデオキシヌクレオチドから成る群、並びに
(3)前記(1)および(2)に記載のヌクレオチドか
らさらに誘導される誘導体、から成る群から選ばれる天
然又は合成のヌクレオチド又はその誘導体の残基を示
す、請求項1から4の何れか1項に記載の蛍光ヌクレオ
チド。
5. A is (1) AMP, ADP, ATP, G
MP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UM
P, UDP UTP, TMP, TDP, TTP, 2-M
e-AMP, 2-Me-ADP, 2-Me-ATP, 1
-Me-GMP, 1-Me-GDP, 1-Me-GT
P, 5-Me-CMP, 5-Me-CDP, 5-Me-
CTP, 5-MeO-CMP, 5-MeO-CDP, 5
-A group consisting of nucleotides consisting of MeO-CTP;
(2) natural or synthetic selected from the group consisting of deoxynucleotides and dideoxynucleotides corresponding to the nucleotides, and (3) derivatives further derived from the nucleotides of (1) and (2). The fluorescent nucleotide according to any one of claims 1 to 4, which indicates a residue of the nucleotide or a derivative thereof.
【請求項6】 Bが−CH2−、−CH=CH−、−C
≡C−、−CO−、−O−、−S−、−NH−またはこ
れらの組み合わせから成る連結基であって、連結基上の
水素原子は置換基でさらに置換されていてもよい連結基
である、請求項1から5の何れか1項に記載の蛍光ヌク
レオチド。
Wherein B is -CH 2 -, - CH = CH -, - C
A linking group comprising C-, -CO-, -O-, -S-, -NH- or a combination thereof, wherein a hydrogen atom on the linking group may be further substituted with a substituent. The fluorescent nucleotide according to any one of claims 1 to 5, which is:
【請求項7】 Bがアミノアリル基である、請求項1〜
6の何れか1項に記載の蛍光ヌクレオチド。
7. The method according to claim 1, wherein B is an aminoallyl group.
7. The fluorescent nucleotide according to any one of 6.
【請求項8】 核酸合成酵素と鋳型核酸と請求項1から
7の何れか1項に記載の蛍光ヌクレオチドとを用いて核
酸合成反応を行うことを含む、蛍光標識された核酸の調
製方法。
8. A method for preparing a fluorescently labeled nucleic acid, comprising performing a nucleic acid synthesis reaction using a nucleic acid synthase, a template nucleic acid and the fluorescent nucleotide according to any one of claims 1 to 7.
【請求項9】 核酸合成反応が、逆転写反応、ターミナ
ルトランスフェラーゼ反応、ランダムプライム法、PC
R法またはニックトランスレーション法から成る群から
選ばれる反応である、請求項8に記載の方法。
9. The nucleic acid synthesis reaction includes a reverse transcription reaction, a terminal transferase reaction, a random prime method, and a PC.
The method according to claim 8, which is a reaction selected from the group consisting of the R method and the nick translation method.
【請求項10】 請求項1から7の何れか1項に記載の
蛍光ヌクレオチドで標識された核酸プローブまたはプラ
イマー。
A nucleic acid probe or primer labeled with the fluorescent nucleotide according to any one of claims 1 to 7.
【請求項11】 請求項1から7の何れか1項に記載の
蛍光ヌクレオチドから成る核酸検出用試薬または診断
薬。
11. A nucleic acid detecting reagent or a diagnostic agent comprising the fluorescent nucleotide according to any one of claims 1 to 7.
【請求項12】 (1)請求項1から7の何れか1項に
記載の蛍光ヌクレオチド、(2)核酸合成酵素および
(3)緩衝液を含む、核酸検出用キット。
12. A kit for detecting a nucleic acid, comprising: (1) the fluorescent nucleotide according to any one of claims 1 to 7, (2) a nucleic acid synthase, and (3) a buffer.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003034696A (en) * 2001-07-19 2003-02-07 Fuji Photo Film Co Ltd Fluorescent nucleotide and labeling method using the same
EP1889880A2 (en) 2002-02-14 2008-02-20 FUJIFILM Corporation Method for optical measurement of multi-stranded nucleic acid
CN114773875A (en) * 2022-03-15 2022-07-22 大连理工大学 Azaindole-squarylium cyanine dye, and synthesis method and application thereof

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003034696A (en) * 2001-07-19 2003-02-07 Fuji Photo Film Co Ltd Fluorescent nucleotide and labeling method using the same
JP4676654B2 (en) * 2001-07-19 2011-04-27 富士フイルム株式会社 Fluorescent nucleotide and labeling method using the same
EP1889880A2 (en) 2002-02-14 2008-02-20 FUJIFILM Corporation Method for optical measurement of multi-stranded nucleic acid
CN114773875A (en) * 2022-03-15 2022-07-22 大连理工大学 Azaindole-squarylium cyanine dye, and synthesis method and application thereof
CN114773875B (en) * 2022-03-15 2023-09-12 大连理工大学 Azaindole-squaraine dye, and synthetic method and application thereof

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