JP2000513202A - Large-scale screening of nucleic acid sequencing or genetic replacement - Google Patents

Large-scale screening of nucleic acid sequencing or genetic replacement

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JP2000513202A JP09512176A JP51217697A JP2000513202A JP 2000513202 A JP2000513202 A JP 2000513202A JP 09512176 A JP09512176 A JP 09512176A JP 51217697 A JP51217697 A JP 51217697A JP 2000513202 A JP2000513202 A JP 2000513202A
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Abstract

(57)【要約】 標的配列または、核酸試料中の標的配列に於ける１つまたはそれより多くの遺伝的変化を同定するための核酸試料をスクリーニングするための高処理量方法を提供する。患者の試料中の標的核酸配列の同定の方法、及び任意に入れ換えられた対象の核酸配列の変化もまた明らかにされる方法。   (57) [Summary] A high-throughput method for screening a nucleic acid sample to identify a target sequence or one or more genetic changes in the target sequence in the nucleic acid sample is provided. A method of identifying a target nucleic acid sequence in a patient sample, and also a method wherein changes in the nucleic acid sequence of the subject, which are optionally replaced, are also revealed.

Description

【発明の詳細な説明】 核酸の塩基配列決定または遺伝的置換の大量スクリーニング法 発明の分野 本発明は、核酸試料の中の１つまたはそれ以上の遺伝的置換の存在を同定する ための核酸の大量スクリーニング法に関係する。本発明はまた、遺伝的変換に関 連する特定の標的核酸配列を同定することにも関係する。本発明の方法は、遺伝 病の分子的な原因を決定するため、および遺伝的なカウンセリングのための保因 者および胎児診断を提供するための遺伝的多型性を同定することに使用可能であ る。さらに、本発明は病気を引き起こす微生物を特に高解像度で同定することに 関係する。 発明の背景 ここ数年にわたって、ヒトの遺伝病の原因とみられる遺伝子が同定、クローニ ングされる総数が有意に増加してきた。病気に関係する配列の総数が増加するに つれて、その遺伝子の中の同定される突然変異の数も増加してきた。たった１つ または数個の突然変異が、強く病気の原因になる遺伝子もある（例えば、鎌形赤 血球症）（１）。しかし、ほどんどの病気の原因となる遺伝子は、原因となる多 くのさまざまな突然変異が存在し、有意な数の患者に存在するような単一突然変 異はない。それゆえ、研究および臨床的な診断のために、突然変異を解析する改 良した方法には、候補の遺伝子が本当に病気の原因遺伝子であることを確定する だけでなく、突然変異のデータベースを作成し、臨床診断解析を提供することが 必要とされる。さらに、発見される癌源遺伝子の数が増加するに従って（２-４ ）、効率的で費用のかからない非常に情報量の多い突然変異解析方法が、病気の 傾向および多遺伝子性の病気をより理解するために必要である。 この必要性から、２種類の広範な範疇に分類される突然変異を検出する技術が 開発されてきた（５、６）。遺伝子内の突然変異を探索するために作成された第 一のグループの技術は、一本鎖構造多型性（ＳＳＣＰ）（７）、変性勾配ゲル電 気泳動（ＤＧＧＥ）（８）、ヘテロ二量体解析（ＨＥＴ）（９）、化学的な切断 解析（ＣＣＭ）（１０）、リボヌクレアーゼ切断（ＲＮＡase）（１１）、およ び標的遺伝子の直接的な塩基配列決定（１２）を含む。これらの手法は非常に情 報量に富んでいるが、これらの操作は長い時間がかかり、大量に行いしかも、費 用を抑えて行うということとは相いれない。臨床的な診断を行う実験室において 非常に多くの数の試料（解析あたり５００試料以上）を、低費用で解析する必要 のある場合には、こうした探索の手法は、最近では、突然変異を検出する日常的 な手法として使用されていない（５）。 第二の技術においては、アリル特異的な増幅（ASA）（１３）、オリゴヌクレ オチドライゲイゲーション解析（ＯＬＡ）（１４）、プライマー伸長（１５）、 制限部位の人工的な導入（ＡＩＲＳ）（１６）、アリル特異的オリゴヌクレオチ ドハイブリダイゼーション（ASO）（１７）、およびこうした産物の派生物のよ うな、突然変異を解析するためのより直接的な方法が開発されてきた。ロボット 工学の導入に伴って、こうした直接的な突然変異解析方法によって、効率的な診 断の目的のために限られた数の突然変異のみを解析する必要がある場合には費用 が減少して処理量も増加した。しかし、病気の原因遺伝子の中における多くの突 然変異のうち同定されたものがごく少ない場合には、ほとんどの種類について試 験するためには、有意な検出頻度を得るために多くの数の突然変異を解析しなけ ればならない。 既知の突然変異を検出するための多くの方法が開発されてきた。一般に、こう した診断技術は、単純で費用を抑えるように設計される。しかし、近年開発され たほとんどすべての技術の限界は、同時に多くの試料について多くの突然変異を 解析することは不可能ということである。多くの試料を解析するためにもっとも 適した方法は、PCR産物をフィルター膜に結合させてアリル特異的なプローブで ハイブリダイゼーションするドットブロットである。しかし、ドットブロットの 標準的な手法において、目的の配列の個々のアリルまたは突然変異について、そ れぞれ別々のハイブリダイゼーションを行う。それゆえ、プローブの数が多い場 合には、この手法は煩わしいことになる。 残念なことに、現在の検査方法では、例えば１００個以上の突然変異のような 、 多重の突然変異の包括的な解析を行おうとしても、臨床診断を行う実験室におい て必要とされる大量の試料処理および費用の抑制を条件としては、容易に行うこ とはできない。それゆえ、多くの試料が一度の解析で解析されるような手法を開 発するための努力が必要になる。 発明の概要 本発明は、多くの核酸試料について塩基配列または遺伝的な変化（核酸の付加 、欠失または置換として定義される）を検出および同定するための大量方法を提 供し、以下によって行われる：支持体の上への複数の核酸試料の固定；プリンお よびピリミジンを含むポリマーへの多重性の提供；プリンおよびピリミジンを含 む多重性ポリマーによる固定した試料への同時のハイブリダイゼーション；プリ ンおよびピリミジンを含む多重性ポリマーの同定および、ハイブリダイゼーショ ンしたプリンおよびピリミジンを含む多重性ポリマーの同定による核酸配列また は１つまたはそれ以上の遺伝的な変化の同定。ハイブリダイゼーションしたプリ ンおよびピリミジンを含むポリマーは、例えば、塩基配列決定、直接的な標識、 間接的な標識、および特異的な長さのマーカーによる標識のような、当該技術分 野において既知の方法によって同定することが可能である。 本発明はまた、試料を固定しないで溶液中において（すなわち、支持体上では なく）プリンおよびピリミジンを含むポリマーと反応させる態様もまた含む。 標的核酸配列および/またはハイブリダイゼーションしたプリンおよびピリミ ジンを含むポリマーはどちらも検出および同定を促進するために増幅される。増 幅方法の例は、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）、ライゲース鎖反応(LCR)、gap-LCR 、ライゲーション増幅反応（ＬＡＲ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッ セイ（ＯＬＡ）、増幅免疫変異システム（ＡＲＭＳ）、競争的オリゴヌクレオチ ドプライミング（ＣＯＰ）、アリル特異的なPCR、Ｑベータレプリカーゼ増幅、 核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および枝わかれした鎖の増幅を含むがこれ に限らない。ハイブリダイゼーションは、さまざまなプリンおよびピリミジンを 含むポリマーと標的核酸配列との間に形成されたハイブリッドの融解温度の差異 を最小化にする条件下において行われる。 図面の簡単な説明 図１は、嚢胞性繊維症のトランスメンブレン制御遺伝子（CFTR）の異なるアリ ルに特異的な32Ｐで標識したASOでヒトゲノムＤＮＡを含む複数の同一のフィル ターをハイブリダイゼーションすることにより得られたオートラジオグラフィー の結果を示す。それぞれのハイブリダイゼーションで使用したASOは、それぞれ のフィルターの左に示している。それぞれのフィルターのレーン１は、それぞれ のASOに相補的な変異配列を持つＤＮＡを含む；レーン２-６は野生型の”正常な ”配列を含む。 図２Ａ-２Ｄは、嚢胞性繊維症のトランスメンブレン制御遺伝子（CFTR）の異 なるアリルに特異的な32Ｐで標識したASOでヒトゲノムＤＮＡを含む４枚の同一 のフィルターをハイブリダイゼーションすることにより得られたオートラジオグ ラフィーの結果を示す。それぞれのハイブリダイゼーションで使用したASOは、 それぞれのフィルターの左に示している。Ａと印を付けたレーンは、ＤＮＡ試料 の正のコントロールを含む。Ｂ-Ｅのレーンは、８Ｃ（二連試料の増幅の失敗） 、およびＤ７、Ｄ８およびＥ７（正のコントロール）を除いて、複製して解析し た患者の試料を含む。 図３Ａおよび３Ｂは、図１で同定した正のプール試料における特定の突然変異 の同定を示す。それぞれのフィルターの一番上の部分は、プール１およびプール ２と示したものにおけるASOに対する正のコントロール試料を含む。プール１、 レーン１、Ｇ５４２Ｘ；レーン２、Ｇ５５１Ｄ；レーン３、Ｒ５５３Ｘ；レーン ４、Ｗ１２８２Ｘ；レーン５、Ｎ１３０３Ｋ。プール２、レーン１、Δ５０７； レーン２、Ｒ１１７Ｈ；レーン３、６２１＋１Ｇ->Ｔ；レーン４、Ｓ５４９Ｎ； レーン５、Ｒ５６０Ｔ；レーン６、１７１７-１Ｇ-＞Ａ。Ｂのレーンはプール１ またはプール２の正の患者の試料を含む。プール1、レーン１および２は、図１ の試料４、レーンＤおよびＥを含む。プール２、レーン１および２は、図２の試 料３、レーンＤおよびＥを含む。レーン３および４は、図２の試料５、レーンＤ およびＥを含む。 図４は、本発明の方法を図式化して示したものである。 図５は、固定化した試料にプリンおよびピリミジンを含むポリマーをハイブリ ダーゼーションし、およびハイブリダーゼーションした産物を同定するためのラ ーゲーションを基とする技術の一般的な図式を示す。 図６は、産物の化学的な切断による塩基配列決定、すなわちマキサムギルバー ト法によるライゲーション産物を同定するための図式を示す。 図７は、従来のサンガー法による塩基配列決定反応を使用してライゲーション 産物を同定するための図式を示す。 図８は、サンガー法による塩基配列決定反応によってライゲーション産物を同 定するため別の方法の図式を示す。 図９は、一般的なプライミング塩基配列決法を使用して増幅したライゲーショ ン産物のサンガー法による塩基配列決定法を示す。 図１０は、ＭＡＳＤＡアッセイ用に複数のPCRによって増幅した病気を引き起 こす遺伝子座位を示す。ＤＮＡ試料（２ｍｇ）は、７個の異なる遺伝子の１つに 特異的な多重性に基づいて増幅し、ゲル電気泳動によって解析した。Ｍ＝φX174 /HaeIII分子量マーカー：１＝CFTR遺伝子内の８個の多重化したアンプリコン。 ２＝CFTR遺伝子内の９個の多重化したアンプリコン。３＝βグロビン遺伝子内の １個のアンプリコン。４＝ＨＥＸＡ遺伝子内の２個の多重化したアンプリコン。 ５＝ＧＣＲ遺伝子の（３＋１）多重性（３個の多重化したアンプリコン＋１個の 独立なアンプリコン）。６＝ＡＳＰＡ遺伝子内の３個の多重化したアンプリコン 。７BRCA1遺伝子内の４個の多重化したアンプリコン。８＝ＦＡＣＣ遺伝子内の ３個の多重化したアンプリコン。 図１１は、一回のハイブリダイゼーションにおいて７個の異なる遺伝子由来の ３３個の標的領域内の１０６個の異なる突然変異を同時に検出することを示す。 レーン1-7＝嚢胞性繊維症（ＣＦ）中に存在する６６個のCFTR突然変異の検出。 レーン８-９＝嚢胞性繊維症（ＣＦ-）突然変異の負のコントロール試料。レーン １０-１１＝βサラセミア（βThal）における１４個のβグロビンの突然変異、 および鎌形赤血球症（ＳＣＡ）２個のβグロビンの突然変異の検出。レーン１２ ＝テイサックス（ＴＳＤ）病における３個のＨＥＸＡ突然変異の検出。レーン１ ３＝ゴーシェ病における（ＧＣＲ）８個のＧＣＲ突然変異の検出。レーン１４＝ カナバン病における（ＣＤ）４個のＡＳＰＡ突然変異の検出。レーン１５＝乳癌 における（ＢＲＣ）５個のＢＲＣＡ１突然変異の検出。レーン１６＝ファンコニ 貧血における（ＦＡ）４個のＦＡＣＣ突然変異の検出。病気に特異的な負のコン トロール試料は、正の試料に続いてレーン１１-１６に示す。 図１２は、抽出したASOの化学的な切断によって生じたバンドのパターンを示 し、および突然変異の同定を示している。Ｃ＝Ｃ切断反応；Ｇ＝Ｇ切断反応。 図１３は、突然変異を同定する酵素による塩基配列決定方法によって生じたバ ンドのパターンを示す。突然変異を有する試料から抽出したASOを、鋳型の混合 物中においてサイクルシーケンス反応を開始するために使用した。個々の鋳型は 、特異的なASO（プライマーの部位）に相補的な領域、共通のスタッファー領域 （領域Ｂ）および下流の突然変異特異的な同定用の配列（領域Ａ）を含む。Ｃお よびＧシーケンスの限界から（それぞれの試料のレーンＣおよびＧ）、突然変異 特異的な同定用の配列より生じたフィンガープリントにより、特定のASOを明確 に同定し、それゆえ、突然変異は標的ＤＮＡに存在する。ＣＦ＝嚢胞性繊維症； ＢＴ＝βサラセミア；ＢＲＣ＝乳ガンに関係しているＢＲＣＡ１遺伝子。レーン １＝ＣＦ１７突然変異；レーン２＝ＣＦ２０突然変異；レーン３＝ＢＴ５突然変 異；レーン５＝ＣＦ負のコントロール；レーン６＝ＢＴ負のコントロール；レー ン７＝ＢＲＣ負のコントロール。 図１４は、一回のASOハイブリダイゼーションアッセイにおいて５００人以上 の異なる患者の試料における１０６個の異なる突然変異を同時に検出することを 示す。 発明の詳細な説明 すべての特許出願、特許および本明細書に記載した参考文献は、本明細書中に 参考文献として取り入れている。参考文献と相違する場合には、定義を含めて本 明細書の記載が優先する。 定義： １、本明細書において定義した”アリル特異的なオリゴヌクレオチド”（ASO ） は、既知の核酸部分と同一またはほとんど同一である配列を持つオリゴヌクレオ チドである。ASOは、しばしば一般的な”野生型”の塩基配列に比較してわずか に変化しているものを含む。この変化は、付加、欠失、または１つまたはそれ以 上のヌクレオチドの置換を含む。ASOは、核酸配列が既知である場合に、付加、 欠失、または置換を同定するように作成可能である。 ２、本明細書中において使用した”派生体”塩基配列は、付加、欠失、または １つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換によって、既知の配列とは異なってい る核酸配列を含む。 ３、本明細書中において使用した核酸配列の”増幅”は、ポリメラーゼ鎖反応 （PCR）（斉木ら、Science 239:487,1988）、リガーゼ鎖反応（Barany,Proc.Nat 1.Acad.Sci.USA 88:189,1991)(LCR),gap-LCR(Abravayaら、Nuc.Acids Res.23:67 5,1995),ライゲーション増幅反応(Wuら、Genomics 4:560,1989);ASPCR(Wuら、Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2757,1989),ARMS(Newtonら、Nuc.Acids Res.17:2503, 1989),または特定の核酸配列を濃縮する他の方法の使用を示している。 ４、核酸の”化学的なシーケンス”は、個々の塩基特異的な反応を使用して核 酸をランダムに切断するマキサムギルバート法(Maxim-Gilbertシーケンス、Maxi mおよびGilbert、1977,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:560)のような方法を示す。 ５、核酸の”酵素的な配列決定”は、一本鎖DNAを増幅してDNAポリメラーゼを 使用してランダムに終了させるサンガー(Sangerら、1977,Proc.Natl.Acad.Sci.U SA,74:5463)のような方法を示している。 ６、本明細書中において、”結合”および”ハイブリダイゼーションする”と いう言葉は、核酸：プリンおよびピリミジンを含む二量体ポリマーの形成を示す 場合にどちらも使用される。”親和性精製した”という言葉は、ハイブリダイゼ ーションを使用して精製することを示している。 ７、”大量”は、多くの核酸試料（例えば、50個または100個の核酸試料を越 える数）および試料の中の多くの標的配列を同時に処理してスクリーニングする 能力を示している。 ８、”プリンおよびピリミジンを含むポリマー”は、ワトソンクリックの塩基 対を形成できるプリンおよびピリミジンを含むDNA,RNAおよび他のポリマーを意 味しており、PNAのように糖リン酸骨格を持つ必要はない。J.Am.Chem.Soc.,114: 1895-97(1992)参照。 本発明は、多数の患者の試料について複数のCF突然変異を同時に解析するため の改変したアリル特異的なオリゴヌクレオチドの作成を提供する（２５）。本発 明の方法はさらに、一度の測定において多くの試料について（＞５００個）多く の突然変異を（＞１００個）費用を抑えて解析することが可能な多型性アリル特 異的診断測定(MASDA)を提供する。一般的な’チップ’技術のように（19-22）， MASDAは、DNA配列を解析するためにオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーショ ンを使用する。しかし、多くのオリゴヌクレオチドを使用する測定とは反対に、 本発明のMASDA技術では、標的DNAを固定支持体に固定し、溶液中のASOのプール （すなわち、突然変異特異的なオリゴヌクレオチドの混合物）と組み合わせて解 析する。さらに、ドットブロットを使用することによって、多数の試料の（＞５ ００個）多数の突然変異（＞１００個）について同時に解析することが可能にな る。組み合わせ解析の第一段階において、試料に存在する特定の突然変異に相当 するASOが、標的DNAによって集団からハイブリッドにより選択される。ハイブリ ダイゼーションしなかったASOを除去して、結合したASOに関連する配列特異的な バンドパターンが化学的または酵素的な配列決定によって現れて、試料に存在し た突然変異が容易に同定されるのである。モデルシステムとして、標的遺伝子CF TR(26),βグロビン(1),HEXA(27),GCR(28),ASPA(29),BRCA1(3),およびFACC(30)を 使用して、MASDAにより、一回の測定において解析される個々の患者の試料につ いて個々の病気が解析されるばかりではなく、一人の患者のDNA試料における１ つの遺伝子または複数の遺伝子内の多数の突然変異を同定することが可能である 。 本発明は、標的配列または配列の置換、さらには患者から単離したDNA中の特 定のDNA配列について大量の核酸試料をスクリーニングするための方法を含む。 この方法は、１つまたはそれ以上の遺伝子または遺伝的座位が興味の対象である 場合に応用可能である。また、本方法は、多数の興味のある標的配列の核酸試料 をすばやく経済的にスクリーニングすることが可能である。 ある態様において、特定の核酸配列は病気または症候群に含まれることが知ら れているゲノムDNA中の核酸部分、特定の遺伝子、または遺伝的座位を含む。こ の例は、嚢胞性繊維症、鎌形赤血球貧血症、βサラセミア、およびゴース病を含 むが、これに限らない。 別の態様においては、特異的な核酸配列は、特定の病気に関連があることは知 られていないが、その多型が知られているかまたはその疑いのある特定の遺伝子 または遺伝子座位の一部を含んでいる。 さらに別の態様においては、特異的な核酸配列は、例えば侵略性の微生物のゲ ノム等の外来の遺伝子配列の一部を含んでいる。非限定的な例には、細菌および それらのファージ、ウィルス、菌、原生動物などが含まれる。本方法は、異なる 変種または微生物の株を区別することが望まれるときに、適当な治療学的な干渉 を選択するために特に適用できる。 本発明に従って、標的となる核酸は患者より単離された核酸試料を表している 。この核酸はどのような細胞源または体液からも得ることができる。臨床の実施 において利用可能な細胞源の非限定的な例には、血球細胞、頬細胞、子宮頚細胞 、尿由来の上皮細胞、胎児の細胞、または剖検により得られた組織に存在する細 胞の全てが含まれる。体液は、血液、尿、髄液、精液、および感染または炎症部 位における組織滲出液を含み得る。核酸は、当該技術分野において標準的な多数 の方法のいずれかを用いて、細胞源または体液より抽出することができる。核酸 を抽出するために使用する特定の方法がその細胞源の性質に依存するであろうこ とは理解されるであろう。例えば、本発明の好まれる形での使用のために抽出さ れ得るDNAの最低限の量は約5pgである（4×109塩基対のゲノムサイズの細胞約1 つに相当する）。 一度抽出してしまえば、標的の核酸は、本発明において、さらなる操作なしで 使用することができる。代わりとしては、標的の核酸に存在する一つまたはそれ 以上の特異的な領域をPCRにより増幅することが可能である。この場合には、増 幅される領域はプライマーとしての利用のために、特定の隣接する配列の選択に より特定される。この工程での増幅により、標的となる配列群中に存在する特異 的な核酸配列の濃度の増加という利点が提供される。増幅され得る核酸配列の長 さは80bpから30kbpの範囲である（Saikiら、1988，Science，239:489）。 ある態様においては、特定の配列の増幅を前もって行うかまたはそれを行わな い標的となる核酸を、固相または半固相基質に結合させる。これにより、さまざ まな細胞源由来の多数の核酸試料の同時の加工およびスクリーニングが可能にな る。本発明における使用に適する基質の非限定的な例には、親和性捕獲のための 薬剤でコーティングしたニトロセルロースまたはナイロンのフィルター、グラス ビーズ、磁気ビーズ、処理済みまたは未処理のマイクロタイタープレート、ポリ マーゲル、アガロースなどが含まれる。標的の核酸を基質に結合させる方法が、 使用する特定の基質に依存するであろうことは、当業者により理解されるであろ う。例えば、ニトロセルロースへの結合は、核酸のフィルターへの単なる吸収と 、それに続く真空下での15分から2時間の75-80℃でのフィルターのベーキングに より行うことができる。代わりとしては、結合した核酸のさらなる処理を必要と しない、電荷を持たせたナイロンメンブレンが使用できる。アビジンでコーティ ングしたビーズまたはマイクロタイタープレートは、（例えばビオチン結合PCR プライマーの利用によって）ビオチンを結合させた標的の核酸を結合させるのに 使用できる。さらに、抗体による表面のコーティングおよび標的の核酸への抗体 特異的なハプテンの取込みにより、上記の固形支持体のいずれかに標的の核酸を 付着させるのに抗体を使用することができる。標的の核酸の固定化が通常は好ま しいが、ある態様においては、溶液中の標的にポリマーをハイブリダイズさせる 、すなわち、支持体に標的を結合させないことが望ましいであろう。例えば、ポ リマーを溶液中の標的にハイブリダイズさせ、続いて溶液中で高処理能カスクリ ーニングの発明に従った方法の一部のようにライゲーションさせることができる 。ライゲーション法はさらに以下で論じられている。 本発明を実施するにあたり、好ましくは固相または半固相基質に結合させた未 処理または増幅した標的の核酸を、プリンおよびピリミジンを含むポリマー（以 下では”ポリマー(polymer、またはpolymers)”とも呼ばれている）の混合物と 反応させる。これらのポリマーは、好ましくはアリル特異的なオリゴヌクレオチ ド（ASOs）である。10から200、好ましくは50から100、およびもっとも好ましく は50のASOが、一度のハイブリダイゼーションのためにプールできる。個々のASO の長さは16から25ヌクレオチド、好ましくは17ヌクレオチド長であろう。 プリンおよびピリミジンを含むポリマーは、当該技術分野において標準的な方 法、例えば商業的に入手可能な自動合成機を用いて化学的に合成することができ る。続いてこれらのポリマーは、放射性標識するか（例えば、ポリヌクレオチド キナーゼを用いて33Pで末端標識する）、または他の一般的に利用される”タグ ”またはレポーター分子に結合させる。例えば、（FITCまたはローダミンのよう な）蛍光色素、（アルカリフォスファターゼのような）酵素、ビオチン、または 他の周知の標識化合物を、直接または間接的に付着させることができる。さらに 、標準的な方法を用いて、多数の無秩序に順序を変えたポリマーを一度の反応で 合成することが可能である。以下で詳細に述べられているように、本発明は、ハ イブリダイズする個々の配列をハイブリダイゼーションに先だって決定すること を必要としない。むしろ、結合したポリマーの配列は後の工程で決定することが できる。 共に係属中の米国特許出願第07/957,205号（1992年10月６日提出）およびShub erら、1993，Human Molecular Genetics，2:153-158、に記載されているように 、ハイブリダイゼーション反応は、異なる配列を含むポリマーのようなポリマー がそれらと同じ長さで相補的なDNAにハイブリダイズするような条件下で行うこ とができる。これは以下によりなされる：１）同じ長さのポリマーを使用するこ と；および２）ハイブリダイゼーション混合物に、同一の長さであるが異なるグ アノシン＋シトシン（G＋C）組成のポリマー中の溶解温度の相違を排除する、適 当 な濃度の一つまたはそれ以上の薬剤を含むこと。この目的に使用可能な薬剤には 、限定されないが、塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）などの第四アンモニ ウム化合物が含まれる。 TMACは、非特異的な塩効果を介して、G-C塩基対間の水素結合エネルギーを減 少させるようにはたらく。同時に、それはA-T塩基対に特異的に結合し、これら の結合の温度安定性を増加させる。これらの相反する影響は、三つの水素結合を もつG-C塩基対と二つの水素結合をもつA-T塩基対の間の結合エネルギーの違いを 減少させる効果を有している。上記のように、一つ重要なことは、TMACの存在下 で形成された核酸のハイブリッドに対する核酸の溶解温度は、単にハイブリッド の長さの作用に過ぎないということである。第二の重要なことは、そらぞれのプ ローブに対する溶解曲線の勾配の上昇である。これらの効果が合わさって、ハイ ブリダイゼーションのストリンジェンシーが、１塩基対の違いが区別でき、非特 異的なハイブリダイゼーションを最小にする点まで増加させることができるので ある（Woodら、1985，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 82:1585）。 本発明を実施する際に、望むならばこれらの特性を阻害するどのような薬剤も 使用可能であることは、当業者には明らかであろう。そのような薬剤は、その薬 剤の存在下および非存在下でその濃度を徐々に増加させて、異なるテスト用オリ ゴヌクレオチドに対する溶解曲線を決定することにより容易に同定できる。これ は、標的の核酸をナイロンフィルターのような固形基質に付着し、同一の長さで あるが異なるG＋C組成の放射性標識したオリゴヌクレオチドをフィルターに個々 にハイブリダイズさせ、徐々に温度を増加させてフィルターを洗浄し、そして、 それぞれの温度でフィルターに結合している放射性標識されたプローブの相対量 を測定することにより行う。上記のハイブリダイゼーションおよび洗浄の工程の 間に存在すれば、異なるオリゴヌクレオチドに対するほぼ重複する勾配の急な溶 解曲線を生じる薬剤が利用可能である。 本発明を実施する際に、標的の核酸およびポリマーは、最大限の特異的なハイ ブリダイゼーション、および最小限の非特異的、すなわちバックグラウンドのハ イブリダイゼーションが得られるように、十分な時間および適当な条件下で反応 させることができる。考えられる条件には、それぞれのポリマーの濃度、ハイブ リダイゼーションの温度、塩濃度、および無関係な核酸の存在または非存在が含 まれる。さらに、ポリマーは少なくとも二つのグループに分けられ、それぞれの グループはハイブリダイゼーションを可能にする十分な数のポリマーを含んでい ることが認められるであろう。例えば、核酸試料にハイブリダイズさせるプール のポリマーの総数は、約50のポリマーのグループに分けるのが好ましいであろう 。それぞれのポリマーのグループは、連続的に支持体に固定化された核酸にハイ ブリダイズさせることができるが、それぞれのグループを含むポリマーは、実質 的に同時に核酸にハイブリダイズさせることができる。さらに、固定化された核 酸試料は少なくとも一つのプールのポリマーにハイブリダイズし、そのハイブリ ダイズしたポリマーを同定し、続いてその核酸試料を同一または異なるポリマー のプールで再度ハイブリダイズすることができる。それぞれのプリンおよびピリ ミジンを含むポリマーの濃度は、一般的にはハイブリダイゼーション溶液1ml当 たり0.025から0.2pmolの範囲である。既知の配列のポリマーを使用した場合、そ れぞれのポリマーに対する最適濃度は、それぞれのポリマーのシグナル対ノイズ の比（例えば、特異的結合対非特異的結合）を、標識したポリマーの濃度を徐々 に増加させて測定する、試験的ハイブリダイゼーションにより決定できる。バッ クグラウンドのハイブリダイゼーションをさらに減少させるためには、未標識の 変化させていない（すなわち、野生型）配列を含むオリゴヌクレオチドを、標識 したポリマーの濃度の1から100倍に相当する濃度で反応混合物中に入れることが できる。 ハイブリダイゼーションの温度は、使用するポリマーの長さにとって可能な限 り高くなるように最適化できる。これは上記の溶解曲線の決定法を用いて経験的 に決定できる。最適の時間、温度、ポリマーの濃度、および塩濃度の決定が協調 的に行われるべきであることは、当業者には理解されるであろう。 本発明により同定されるハイブリダイズしたポリマーは完全にハイブリダイズ していることが意図されている。上記の方法は不完全なハイブリダイゼーション を最小限にする。しかしながら、そのような方法は必ずしも必要というわけでは ない。実施例に記載されているライゲーション法においては、不完全なハイブリ ッドが形成されると思われるが、完全なハイブリッドが選択的に同定される。 ハイブリダイゼーションに続いて、もしも必要ならば、結合しなかったポリマ ーは、完全に対合した核酸：ポリマーのハイブリッドを保つような条件下で、TM ACまたは同様の化合物を含む溶液中で基質に結合した核酸を洗浄するなどして除 去する。温度、塩の性質および濃度、および洗浄の時間などの洗浄条件は、上記 のようにして経験的に決定する。この段階では、結合したポリマーの存在が決定 できるであろう。検出のためのさまざまな方法は、ポリマーに取り込ませた標識 またはタグに依存するであろう。例えば、標的の核酸に結合した、放射性標識し たか、または化学ルミネセンスのASOは、フィルターをX線フィルムに感光させる ことにより検出できる。 その代わりとして、蛍光標識を含むポリマーは、蛍光レポーターの特異的な吸 光波長における、レーザーまたはランプに基づいたシステムでの励起により検出 可能である。さらには、ポリマーは、プローブ配列に加えて、それぞれのポリマ ーのプールのメンバーに独特の分子量を与える修飾成分（MWME）を有している。 MWMEはハイブリダイゼーション反応には関係ないが、多数の方法のいずれかを用 いた相対的な分子量の決定により、分離されたポリマーの直接的な同定を可能に する。検出および同定のための他の方法は以下に記載されている。 所望の次の工程では、結合したポリマーを基質に結合した標的の核酸から分離 する。分離は、ポリマーのハイブリッドに対して核酸を不安定化させる、すなわ ち、塩濃度を下げること、温度を上げること、ホルムアミドにさらすこと、アル カリ等の、当該技術分野で知られている方法により行うことが可能である。例え ば、結合したポリマーは、標的の核酸-ポリマー複合体を水中でインキュベート し、そして核酸：ポリマーのハイブリッドの溶解温度以上に反応物を加熱するこ とにより分離可能である。これにより、分離されたポリマーのさらなる処理また は精製の必要はなくなる。 本発明に従って、ハイブリダイズしたポリマーは、標的の核酸から分離してい ようとしていまいと、当業者により容易に理解される多数の異なる方法により同 定され得る。そのポリマーの配列を決定することにより、核酸試料中の標的配列 または遺伝子の変化を同様にして同定することが可能である。 検出可能なシグナルを提供する独特のレポーターで直接標識することによって も、ポリマーを同定することが可能である。直接標識されたポリマーは、放射活 性、蛍光、比色分析、X線の回折または吸収、磁気、酵素活性、化学ルミネセン ス、および電子化学ルミネセンス等を用いて検出することができる。適当な標識 には、フルオロフォア、クロモフォア、（32Pおよび125I等の）放射性原子、高 電子密度試薬、および検出可能な産物を産生させる酵素が含まれる。L．Kricka ，Nonisotopic DNA Probe Techniques,第１および２章，Academic Press，1992 、（以下”Kricka”）を参照のこと。 ポリマーの直接的な標識に加えて、間接的な標識もまた利用可能である。例え ば、ビオチン-アビジン、ビオチン-ストレプトアビジン、ハプテン-抗ハプテン 抗体、糖-レクチン等を含む、間接的な標識のための多くの結合する組み合わせ が当該技術分野において知られている。本発明とともに使用した場合、結合する 組のうちの一つのメンバーはポリマーに結合でき、他の結合する組のメンバーは 上記のように直接標識できる。ハイブリダイゼーションに続いて、標的の核酸配 列に結合しているポリマーは、標識されたメンバーとともにインキュベーション し、続いて結合する組-標識の複合体を検出することにより同定できる。Bioconj ugate Chemistry，1:165-187(1990)；Kricka,第1および2章、を参照のこと。 さらには、ポリマーは独特の長さのマーカーを用いても同定することが可能で ある。すなわち、標的の核酸との水素結合の相互作用に関係のある部分に加えて 、あらかじめ決定されている独特の分子量を、それぞれ個々のポリマーに与える 構成成分を有するポリマーを供給することにより、分子量によって個々のポリマ ーを同定することが可能になるのである。例えば、Nucleic Acids Res.，22:452 7-4534(1994)、を参照のこと。 さらには、ハイブリダイズしたポリマーは、ハイブリダイゼーション用アレイ を用いて同定することができる。そのようなアレイにおいては、あらかじめ決定 されている配列のポリマーを含むプリンおよびピリミジンは、固形または半固形 支持体上の別々の位置に固定化されている。本発明とともに用いた場合、アレイ を含むそれぞれの固定されたポリマーの配列は、ポリマーのプールのメンバーの 配列に対して相補的である。標的の核酸とハイブリダイズするポリマーのプール のメンバーは、アレイを作っている固定されたポリマーとの再ハイブリダイゼー ションにより標的の核酸から分離した後に同定可能である。どのようなポリマー であるかは、アレイ上でのハイブリダイゼーションの位置により決定される。米 国特許第5,202,231号およびWO 8910977を参照のこと。 他の変更や可能性は、当該技術分野において通常の知識を有する者には容易に 明白となるものであり、また本発明の範囲内と同等のものと考えられる。 さらに特に、ある態様において、ハイブリッド形成した重合体は当該技術分野 において標準的である化学的手法を用いた配列決定(例えば、Maxam-Gilbert配列 決定法、Maxam and Gilbert，1977，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，74:560)に 使用される。この方法は配列決定の前に重合体が標的核酸から分離されることを 必要とせず、およびさらに、無作為に順列された重合体の混合物が使用される場 合に特に適切である。 もう一方の態様において、ハイブリッド形成した重合体は酵素的配列決定法(S anger et al.，1977，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，74:5463)によって同定さ れる。この場合、重合体に対して相補的な配列、および既に配列決定されており 「タグ(tag)」配列として機能する付加的な直線配列を持つオリゴヌクレオチド が合成される(以下の実施例4を参照)。重合体の標的核酸からの分離は、これら の「タグの付いた」オリゴヌクレオチドの混合物の存在下において行われる。サ ンガー配列決定法の条件下(例えば以下の実施例5を参照)でインキュベートした ときは、重合体はそれらに相補的な配列とハイブリッド形成し、および配列決定 反応におけるプライマーとして働く。その結果生じたプライムされた「タグ」配 列を決定することにより反応中に存在している重合体が同定される。 さらなる態様において、ハイブリッド形成した重合体は、付加的な「タグ」配 列(以下の実施例4を参照)を含むあるいは含まないような一般的なプライマー配 列および／または配列決定用プライマー配列を含む相補的なオリゴヌクレオチド とインキュベートされる。いずれの場合においても、重合体がその相補オリゴヌ クレオチドへ最初のハイブリッド形成を行うことにより、重合体が一本鎖の伸長 反応における開始プライマーとして働くことが可能になる。ある場合においては 、伸長産物は直接的にサイクル配列決定反応における鋳型(template)として使用 される。伸長産物のサイクル配列決定は配列決定産物の増幅をもたらす。相補オ リゴヌクレオチドの設計においては、配列決定が重合体自身または択一的に「タ グ」配列を通して配列決定が進行するように、配列決定用プライマーを位置させ る。 第２の場合においては、伸長産物は一般的なプライマー配列および配列決定用 プライマー配列を含む。この伸長産物は一般的なプライマーの存在下での増幅反 応へ加えられる。それゆえ、結合している重合体と相補的な配列を含むオリゴヌ クレオチドは選択的に増幅される。第２工程では、これらの増幅された配列は、 作りつけの配列決定用プライマー配列を用いたサンガー配列決定法へと送られる 。この場合は、配列決定用プライマーは上記のように「タグ」配列のすぐ上流に 配置される。このように、「タグ」配列の決定により二重鎖の重合体の配列が決 定 される。 本発明を実施するにおいて、重合体または相補的なタグの付いたオリゴヌクレ オチドの全配列の決定は必要ではない。個々の重合体を即時に同定するためには 、(完全な配列を得るために4つの反応が必要であるのに対して)1,2，または3つ の配列決定反応が特徴的な模様(「バーコード」と同様のもの)を産生するのに有 効であると考えられる。この考えは、放射性の示標(reporter)分子を用いてデジ タル化されたパターンを産生する自動配列決定法と同様に、非放射性標識した重 合体を用いてアナログまたはデジタル化された放射線写真を産生する手動配列決 定法に適切である。いずれの場合においても、確立されたデータベースとの比較 を電子的に行うことができる。このように、必要とされる配列決定反応の数を減 らすことによって、本発明の方法は多数の試料、および多数の核酸配列または各 試料における遺伝子上の変化の経済的な解析を促進する。 本発明は一回の反応において、可能性のある多数の重合体のスクリーニングを 同時に行うことを可能にする。実際は、同時に起こさせるハイブリッド形成のた めにプールする重合体の実際の数は、診断上の必要性によって決定される。例え ば、膵嚢胞性繊維炎(CF)においては、一つの特定の変異(Δ508)がCF患者の70%以 上の原因となっている。このように、本発明にしたがって標識されたまたはタグ のつけられたΔ508-特異的な重合体との予備的なハイブリッド形成と、それに続 く結合した重合体の検出によってΔ508アリルを同定および除去することができ るであろう。２番目の(「第２段階」)ハイブリッド形成において、他の、低頻度 のCFアリルをコードする多数の重合体が利用され、上に記載されている分離およ び配列決定に続く。 しかし、他の臨床的な状況においては、CFにおけるΔ508変異と同様に高頻度 で出現する単独の変異は存在しない。それゆえ、重合体のプールは、プール陽性 の試料における２段階解析において必要とされる独立なハイブリッド形成の数に よってのみ決定される。 加えて、従来の臨床検査では、膵嚢胞性繊維炎、β-サラセミアおよびゴーシ ェ病のような異なる臨床上の症状は互いに独立に検索される。これに対して本発 明は、病気の原因の可能性のある一つ以上の遺伝子における変異に相補的な多数 の重合体を用いて、異なる哺乳動物も含めた異なる試料源からの多数の核酸試料 を同時に検索することが可能である。 同方法において、臨床的な指標によって外来因子または微生物による感染が示 唆されるときは、本発明は可能性のある多数の外来の核酸を同時に検索すること を可能にする。さらに、特定の株、異体、変異体、および1またはそれ以上の微 生物の類もまた、検索において適当な重合体を用いることによって区別される。 本発明の方法は、第１段階または第２段階の検索において無作為に順列された 重合体を用いることによって、患者または侵入している微生物の核酸における可 能性のある新規の変異体アリルを明確にすることもまた可能にする。この態様に おいて、その次に配列決定へと続く結合重合体の分離によって正確な変異配列が 明らかになる。 本発明はさらに、本発明の核酸試料の高スループット検索を実施するためのキ ットを予定している。そのキットは、一組のセットであり、少なくとも以下の構 成物を含む：支持体、プリンおよびピリミジンを含む多数の重合体、適当な標識 用の構成物、および、重合体の配列決定に必要である酵素および試薬。 本発明のモデル系 8種類の異なる病気を表す7種類の異なる遺伝子標的が複合変異の検出のための 模範系として選ばれた(表１)。総計106の異なる変異が一回のハイブリッド形成 および検出過程において解析され、MASDA 106と呼ばれた。多数の変異が既知の 病 気遺伝子の過半数の中に同定されているが、この研究のために、選択してこれら の変異を使用した(表1の第3列および第4列)。最も臨床的に現れた各々の病気の 遺伝子内で選ばれた特異的な変異は診断上の適用に適切である。解析した大多数 の変異はCFTR遺伝子内に存在した。CF患者集団内最も頻繁に検出された変異に加 えて、不完全なままでの転写終結、およびそれに続く欠失型のタンパク質産物を 導く点変異も含まれた。106の異なる変異の存在または不在を問うために、総計3 3の異なる増幅産物が必要であった(表1第5列)。増幅は病気特異的な方法でのみ 行われたことを記すことは重要である。換言すれば、患者が膵嚢胞性繊維炎の保 因者であることが疑われたならば、DNA試料は膵嚢胞性繊維炎の遺伝子のみが増 幅された。 各々の病気遺伝子内で調べられた特異的変異は表1-Bに示されている。これら の表は増幅された領域の大きさ(bp)、および各々の増幅に用いられたプライマー もまた含む。 病気特異的な標的の増幅 可能である限り、必要とされるPCR反応の数を減少させるために多重PCRを行っ た(表1、第5列)。総計9の反応により、33の異なる遺伝子座の増幅を促進した。 全単独または多重PCR反応が病気特異的な方法で行われた。換言すれば、DNA試料 は適切な病気の遺伝子のみが増幅され、分析を行った全ての遺伝子座が増幅され るのではなかった。様々な病気特異的な増幅産物は図10に示されている。本明細 書において議論されている研究における66のCF変異を含むために、2回の多重PCR 反応を用いてCFTR遺伝子内の17の異なる領域が増幅された(図10、レーン1および 2)。増幅の大きさは130-510bpの範囲であった。1600bpの一つの増幅産物はβ-グ ロビン遺伝子内の変異に関連した14のβ-サラセミアおよび2つの鎌形赤血球貧血 を含むのに十分であった(図10、レーン3)。テイ・サックス病に対しては、3つの 変異を調べるために二重の増幅反応が計画された(図10、レーン4)。Canavans関 連変異を調べるために三重の増幅反応が行われた(図10、レーン6)。5つの乳 癌感受性関連変異に対して分離した四重の増幅(図10、レーン7)、およびファン コニ貧血関連変異に対して単独の三重の増幅(図10、レーン8)が行われた。ゴー シェ病に対しては、GCR擬遺伝子が三重の増幅および独立な1回のアンプリコン増 幅を必要とした。解析の都合上、両反応からの一定分量は蓄えられ、および分析 ゲルの同じレーンで電気泳動をおこなった(図10、レーン5)。 変異の検出 表1に列挙してある変異について、多数の試料に対して同時に解析するために 、標準フォワード・ドット・ブロット形式が使用され、1回の多重ハイブリッド 形成がおこなわれた(図11)。106の変異特異的オリゴヌクレオチドのG-C含量の値 は18%から76%の間であるが、塩化テトラメチルアンモニア(TMAC)(31)の使用によ り、全106の変異特異的オリゴヌクレオチドを混合し、および単一のプールにお いてハイブリッド形成することが可能となった。さらに、ハイブリッド形成およ び洗浄溶液にTMACが存在することにより、ハイブリッド形成と洗浄を同一温度で おこなうことが可能となった。図11に見られるように、106の変異特異的な正の 対照試料のみが放射性写真上にシグナルを生じ、負の対照試料に示されるように 、有意な非特異的シグナルを生じなかった。全体のシグナルの強度、および異な る変異特異的な正の対照試料に生じるシグナル／ノイズ比は、ハイブリッド形成 におけるそれぞれの変異特異的なオリゴヌクレオチドの濃度を調整することによ り最適化した。 変異の同定 プール陽性の試料内に存在する特異的な変異は、試料DNAからハイブリッド形 成したオリゴヌクレオチドを溶出し、オリゴヌクレオチドの配列を直接調べるこ とにより同定された。一つの案としては、溶出したオリゴヌクレオチドを固体の 支持体に結合させ、GおよびCの塩基特異的な化学修飾反応をおこない、反応産物 をポリアクリルアミドゲル電気泳動(32)により分離をおこなった。図12は、図3 のプール陽性試料(CF30，CF31，TS1，TS2，TS3，BT2，BT3*，BT6，およびBT7)か ら溶出した数種類のオリゴヌクレオチドから産生したCG限定的な配列決定のフィ ンガープリント(指紋)の例を表す。図12に示すそれぞれの溶出オリゴヌクレオチ ドは、プール陽性試料DNAに存在する特異的変異を明確に同定した特徴的な「指 紋」を生じた。106のASOの各々に対して独特のバンド様式が生じた。106の溶出 オリゴヌクレオチド全ての配列解析は、1回のプールされたハイブリッド形成か ら生じた陽性の結果が、異なるプローブ間の有意なクロス・ハイブリッド形成を もたない、特異的なハイブリッド形成を表すことを証明した。さらに、2種類の β-グロビン変異を持つ一つの試料(図12、レーンBT3*)は、2つの重なったオリゴ ヌクレオチド特異的なバンド様式からなる独特の「指紋」を生じた。これは、本 技術を用いて異型接合体の混合の遺伝子型が即座に同定されることを示した。 化学修飾および開裂過程に加えて、溶出オリゴヌクレオチドに対する酵素的な 実験計画も発達した。この過程は溶出された変異特異的オリゴヌクレオチドをサ イクル配列決定反応におけるプライマーとして用いることを含む。溶出されたオ リゴヌクレオチドは合成(77mer)鋳型の混合物を含むサイクル配列決定反応混合 物へと加えた。各々の合成鋳型は、蓄えられたハイブリッド形成反応に存在する 変異特異的オリゴヌクレオチドの一つに相補的なプライミング配列、および溶出 されたASOを同定する、変異特異的な独特の指紋を生じるための下流の特異的な 同定用配列を含んだ。図13は正の対照(変異体遺伝子型CF17，CF20 BT5およびBRC 5)および負の対照(正常遺伝子型CF neg.，BT neg.，およびBRC neg.)試料から溶 出したオリゴヌクレオチドを用いたサイクル配列決定反応から生じたCおよびGの バンド様式の例である。正の対照試料から溶出されたオリゴヌクレオチドとおこ なった各々の反応(図13、レーン1-4)は、変異特異的な指紋(領域A)が後に続くよ うな全ての合成鋳型(領域B)を含む、共通のバンド様式を生じた。変異特異的な 指紋に見られる様式は、対応するASOプライマー、およびその結果患者の試料に 存在する特異的な変異の明確な同定を可能にした。サイクル配列決定反応が負の 対照試料からの溶出物とおこなわれた場合は、バンド様式は検出されなかった( 図13、レーン5-7)。 大量スケールの試料解析 本発明のMASDA過程を実証するために、診断の環境において描かれているよう な変異を同定するためのMASDA技術の能力を調べるための盲目解析をおこなった 。図14は1回のハイブリッド形成アッセイにおける、106の異なる変異の存在に対 する500以上の異なるDNA試料の解析から生じたハイブリッド形成の結果を表す。 106の異なる変異の一つを持つと知られている全ての試料は、多重ハイブリッド 形成においてプール陽性として正しく同定された(図14)。 特異的な変異が化学的修飾および解裂の手順を行うことでそれぞれのプール陽 性の試料中に正確に同定された。単一のハイブリダイゼーション評価中で５００ 試料以上まで処理する試料が増やされた場合非特異的なバックグラウンドの増大 がまったく観察されなかったことを記すのは意義あることである。 以下の実施例は本発明を、その発明を制限する事なくさらに記述することを意 図している。 実施例１：変異陽性ゲノミックＤＮＡおよびゲノミック陰性ＤＮＡ試料Ａ）血 液からの試料ＤＮＡの調製 高ブドウ糖ＡＣＤVacutainersTM（黄色の蓋）に集められた全血液試料は遠心 分離され、軟膜が集められた(33)。１４ｍＭ ＮＨ4Ｃｌおよび１ｍＭ ＮａＨ ＣＯ3の１０対１（体積対体積比）の混合物によって２回洗うことで白血球が溶 解され、その核は核溶解緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、０．４ＭＮａＣ ｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、５００μｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ ）に懸濁され、３７℃に一晩置かれた。そして試料は４分の１体積の飽和ＮａＣ ｌによって抽出され、ＤＮＡはエタノールによって沈殿させられた。そしてＤＮ Ａは７０％エタノールによって洗浄され、乾燥され、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリ ス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解された。 Ｂ）口内細胞からの試料ＤＮＡの調製 口内細胞は滅菌されたサイトロジーブラシ(Scientific Producuts)またはメス ダクロンモップ(Medical Packaging Corp.)に、ブラシまたはモップを３０秒間 頬の内側で回すことで集められた。直後、または室温または４℃での保存の後に 以下の方法でＤＮＡが調製された。ブラシまたはモップはポリプロピレンマイク ロセントリフュージチューブ中の６００μｌ ５０ｍＭ ＮＡＯＨに浸され、ヴ ォルテックスされた。ブラシまたはモップが入ったままのチューブは９５℃で２ 分間熱せられ、その後ブラシまたはモップは注意深く除かれた。ＤＮＡを含む溶 液は６０μｌの１Ｍトリス、ｐＨ８．０によって中和され、再びヴォルテックス された(Mayall et al.,J.Med.Genet.27:658.1990)。ＤＮＡは４℃で保存された 。 Ｃ） クローン化された陽性対照ＤＮＡ試料 変異陽性ゲノミックＤＮＡが得られないときは変異を含む内在性遺伝子の４０ 塩基対の配列をもつオリゴヌクレオチドが合成され、pGEM-3Zf(+)ベクター(Prom ega Corporation,Madison,WI)にクローニングされ、それぞれのクローンに変異 が存在することが配列決定により検証された。 Ｄ）ハイブリダイゼーションＤＮＡ増幅に先立つ標的ＤＮＡの増幅 複雑な変異の検出のためのモデル系として変異が７つの異なった遺伝子の３３ の領域から選択された。その遺伝子は嚢胞性繊維症膜貫通伝導性調節遺伝子（Ｃ ＦＴＲ）、β−グロビン遺伝子、テイ．サック ヘキソサミニダーゼ遺伝子（Ｈ ＥＸＡ）、ゴーシェ遺伝子（ＧＣＲ）、カナヴァンアスパルトアシラーゼ遺伝子 （ＡＳＰＡ）、胸部癌多発遺伝子（ＢＲＣＡ１）、およびファンコニ貧血相補群 Ｃ遺伝子（ＦＡＣＣ）を含む。ＰＣＲ増幅が１−２μｇのゲノミックＤＮＡまた は１０ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いて、１０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．３， ５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，２００ｍＭ ｄＮＴＰｓ および ０．０５−０．１ｕｎｉｔ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ(Perkin-Elmer,Norwalk, CT)を含む１００ｍｌの反応緩衝液中で行われた。異なる疾患遺伝子の増幅のた めに、プライマーの濃度は０．２−１．６ｍＭの範囲で変化した。 ３またはそれ以上の増幅単位(ＣＦＴＲ 8-plexおよび9-plex、ＡＳＰＡ 3-p lex、ＢＲＣＡ１ 4-plex、及びＦＡＣＣ 3-plex)同時の複合体を含むＤＮＡ増 幅のために、プライマーはShuber et AL.(33)によって記載された、配列特異的 な領域と共通の”共通プライマー配列”のキメラを用いた。これらのプライマー は迅速なマルチプレックスの形成と一貫して安定した増幅を可能にした。 ＤＮＡ増幅はPerkin-Elmer 9600 Thermal Cycler(Perkin-Elmer,Norwalk,CT) を用いて行われた。ＣＦＴＲ，ＨＥＸＡ，ＡＳＰＡ，ＢＲＡＣ１およびＦＡＣＣ のために温度変化を伴う２８のサイクルと（９４℃／１０秒固定。４８秒温度変 化。６０℃／１０秒固定。３６秒温度変化。７２℃／１０秒固定。３８秒温度変 化）さいごに冷却の前に７４℃５分間固定を伴う方法でＤＮＡ増幅は行われた。 β−グロビンおよびＧＣＲのための増幅のプログラムは５５℃でのアニーリング を伴い、冷却前に最後に７４℃５分固定を伴う２８サイクル（９４℃／１０秒固 定。５５℃１０秒固定。７４℃１０秒固定。）によって構成された。 増幅産物は２％アガロースゲル電気泳動と、それに続く臭化エチヂウム染色お よびＵＶトランスイルミネーター(Fotdyne,New Berin,WI)上での視覚化によって 解析された。 Ｅ）固体基質へのＤＮＡの結合 Ｄ）と同様に調製された８μｌの増幅されたＤＮＡ溶液が５０μｌの変性溶液 （０．５ｍＭ ＮａＯＨ，２．０Ｍ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＥＤＴＡ）に加えら れ、ナイロンメンブレンフィルター(INC Biotrans)上にスポットされた。真空下 で８０℃１５分フィルターを加熱することでＤＮＡはメンブレンに固定された。 実施例２：アリル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯｓ）とのハイブリダイゼ ーション ＭＡＳＤＡ１０６ハイブリダイゼーション検査において調べられた特異的変異 ７つの異なる遺伝子から複雑な変異の検出検査の候補として変異が選ばれた。 調べられた１０６の変異は点突然変異、欠失変異、および挿入変異を含む。選ば れた変異および遺伝子増幅の詳細は表１−８に列挙されている。 表１．ＭＡＳＤＡ技術を用いて検査された疾患および変異の詳細を示し たモデル系表２a嚢胞性繊維症変異のＣＦＴＲ８回増幅での試験 表２ｂ嚢胞繊維症変異のＣＦＴＲ９回増幅での試験 表3：β-グロビン遺伝子の増幅で調べた、β-サラセミアおよび鎌形赤血球貧血 変異 表４：HEXA遺伝子増幅で調べたテイ・サックス変異表5：GCR遺伝子増幅で調べたゴーシェ変異 表6：ASPA遺伝子増幅で調べたCanavan変異 表7：BRCA1増幅で調べた乳癌感受性変異 表8：FACC増幅で調べたファンコニ貧血変異 オリゴヌクレオチドプール アリル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＯＳ）は１７塩基であり、合成され、Oper on Technologies(Alameda,CA)によってＨＰＬＣ精製された。すべてのオリゴヌ クレオチドは分光光度によって定量され、プールされる前に独立のハイブリダイ ゼーションの中で試験された。特定された量の個々のＡＳＯは合わせて１０６Ａ ＳＯのプールに入れられ、プールがプールハイブリダイゼーションに望ましいと 決定されたそれぞれの特異的なＡＳＯの要求された量を含むようにされた。プー ルされたＡＳＯの一部は凍結乾燥され、−２０℃で保存された。 既知の嚢胞性繊維症（ＣＦ）変異を示すＡＳＯの例が以下に提示される。 ＡＳＯ 配列（１７塩基） 野生型または正常な配列を表したＡＳＯの例が以下に示される。 ＡＳＯ 配列（１７塩基） ドットブロット 増幅された生成物はブロモフェノールブルーを含む（０．１％ブロモフェノー ルブルー３０ｍｌ／１０ｍｌ変性溶液）１．０Ｎ ＮａＯＨ，２．０Ｍ ＮａＣ １，２５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０を用いて室温で５分間変性された。変性生 成物は９６ウェル型ドットブロット装置(Life Technologies,Gaithersburg,MD) を用いてバイオトランスメンブレン(ICN Biomedica1s Inc.,Aurora,OH)上にブロ ットされた。メンブレンは２ｘ ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ クエン酸３ナトリウム）内で室温５分間中和され、真空オーブン内で８０℃１ ５分間加熱された。使用の直前に、メンブレンは蒸留水中ですすがれ、ハイブリ ダイゼーション溶液内に置かれた。 プローブの標識化 １０６のプールされたＡＯＳ（それぞれの変異を現している。）の一部が溶か されて、蒸留水に再懸濁され、１ｘ キナーゼ緩衝液(New England Biolabs,Bev erly,MA)、０．１３５ｎモルのγ−Ｐ−ＡＴＰ(Dupont,Boston,MA)および３５ユ ニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs,Beverly,MA)を含 む単一の反応で末端を標識された。標識反応液は３７℃で１時間保温された。キ ナーゼ反応の効率は０．７８Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4ｐＨ３．５緩衝液を用いたセルロ ースポリエチレンイミン（ＰＥＴ）プレート上でのクロマトグラフィーおよびそ れに続いてプレートをKodak X-Omat X-Ray film(Eastman Kodak Company,Roches ter,NY)に室温で５分間さらすことで測られた。 ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションはＴＭＡＣハイブリダイゼーション緩衝液（３．０Ｍ ＴＭＡＣ，０．６％ ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ６．８，５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’Ｓ 溶液、および４０μｇ／ｍｌ酵母Ｒ ＮＡ）内に入ったプールされ放射標識されたＡＯＳが加えられた上記実施例１と 同様に調整されたフィルターを含むプラスチッックバッグ内で行われた。 このプロトコールのために９６ウェルの一続きにスポットされたゲノミックの 試料が格子によって印をつけられ、ハイブリダイゼーションンによって同定され た陽性の試料が後の溶出およびＡＳＯ配列決定のために簡単に場所が分かるよう にされた。異なった変異陽性の試料から生ずる信号の強さはハイブリダイゼーシ ョン溶液内のそれぞれの変異特異的オリゴヌクレオチドの濃度を調整することで 最適化された。一様なハイブリダイゼーション信号を得るためにプールハイブリ ダイゼーション内のそれぞれの標識された変異ＡＯＳの最終濃度は０．００８か ら １．８ピコモル／ｍｌの間で変えられ、標識されていない正常なＡＯＳの濃度は 対応する変異ＡＯＳに対し０から２００倍過剰になるように変えられた。ハイブ リダイゼーションは５２℃で一晩かけてゆさぶられながら進行させられた。そし てメンブレンはバッグから除かれ洗浄緩衝液（３．０Ｎ ＴＭＡＣ，０．６％Ｓ ＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８）によって室温 で２０分洗浄され、続いて同じ緩衝液内で５２℃２０分間の２度目の洗浄をされ た。 洗浄されるとブロットはプラスチックのラップで包まれKodak X-Omat X-Ray fil m(Eastman Kodak Company,Rochester,NY)に−８０℃で１５分から１時間さらさ れた。 実施例３：ハイブリダイズしたＡＳＯの分離 実施例２と同様に行われたハイブリダイゼーションからのプール陽性の試料は 以下のように処理される：陽性のスポットは標準的な一つ穴の紙パンチによって ナイロン膜から円盤型に切り取られる。それぞれの切り取られた膜の円盤は別々 に１００μｌの滅菌水を含む０．３１５ｍｌ小型遠心チューブに入れられ、チュ ーブは１００℃で１５分間保温される。（図４） 実施例４：限定されたＡＳＯの同定のための相補的なオリゴヌクレオチドの設 計 多量体の配列は化学的配列決定によって直接決定され得る。もしくは多量体は 多量体に相補的な配列に加えて他の配列も含む相補的オリゴヌクレオチドと併せ て用いられ得る。これらの場合付加的な配列を含む延長産物を形成するためのプ ライマーとして働き、延長産物はＤＮＡ配列を決定される。 特異的な変異の同定 Ａ．化学的解裂による それぞれの変異陽性試料にハイブリダイズしたＡＳＯはＡＳＯを溶出し、配列 決定することで同定された。１０６のＡＳＯのプールのために”Ｃ”と”Ｇ”の 塩基だけの配列決定で明確にＡＳＯ配列を同定するのに十分であり、ＤＮＡ試料 内の対応する変異の明確な同定を可能にした。プールハイブリダイゼーションで 同定されたそれぞれの変異陽性試料をふくむ膜の領域は切り取られ、Ｂｉｏｔ ｒａｎｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅの円盤は１００ｍｌの蒸留水中に置かれ、９５℃で ０分間加熱され、結合したＡＳＯを溶出させられた。室温まで冷やした後、膜の 円盤は捨てられ、溶出したＡＳＯが化学的に配列決定された。 固体の支持体に結合したＡＳＯの固相での化学的解裂はRosenthal et al.(32) による方法に小さな変更を加えて、行われた。この方法は一つの反応管の中で全 ての結合したＡＳＯを同時に配列決定することを可能にした。化学的解裂の前に ＡＳＯを固体の支持体に結合させるためにＣＣＳ紙(32)の標識された小片（６ｍ ｍ ｘ ３ｍｍ）が溶出したＡＳＯを含むそれぞれのチューブに浸され、６５℃ で１時間保温された。全ての紙の小片は併せて２５ｍｌの蒸留水を含む一つの５ ０ｍｌチューブに入れられた。そして紙は室温で３回蒸留水で（２５ｍｌ／洗浄 ）洗浄され、（３０秒／洗浄）続いて９６％エタノール（２５ｍｌ／洗浄）によ って３回（３０秒／洗浄）洗浄された。ＡＳＯを結合した紙はお互いに混ざり合 う事なくひとまとめに洗浄され得る。 洗浄されると、紙は風乾され、それぞれの小片は二つに切られ、１／３は”Ｇ ”化学的解裂反応に割り当てられ、２／３っは”Ｃ”化学的解裂反応に割り当て られた。すべての”Ｃ”反応ＡＳＯ−固体支持体は合わせて１ｍｌの４．０Ｍヒ ドロキシルアミン ＨＣｌ ｐＨ６を含む一つのチューブに入れられた。”Ｇ” 反応の修飾のために合わせられた紙の小片は１ｍｌの５０ｍＭフォルミル化アン モニウム ｐＨ３．５に入れられ、７ｍｌのＤＭＳが加えられた。”Ｇ”及び” Ｃ”反応のそれぞれについて反応は室温で１０分間または２０分間保温されて行 われた。１００以上の配列決定反応の一まとめの処理が解裂生成物が相互に混じ り合う事なく行われた。 洗浄は一まとめの”Ｃ”反応紙および一まとめの”Ｇ”反応紙上で上記のＡＳ Ｏの固体支持体への結合後の洗浄のように行われた。紙はそして風乾され、紙の 小片は９６ウェルの増幅トレイ中の選定された場所に置かれた。 配列決定生成物を解裂させ、固体支持体膜から溶出させるため、新しく調製さ れたピペリジン（１０％（体積／体積）ピペリジン５０μｌ）がそれぞれのウェ ルに加えられ、トレイはゴムのガスケットにより覆われ、９０℃で３０分間温度 循環器の中で保温された。それぞれの解裂反応のために溶出した解裂生成物を 含むピペリジン溶液は新しい９６ウェルの増幅トレイに移され、ピペリジンは蒸 発させられた。蒸発の段階は５０％エタノール（３５μｌ／ウェル）で２度繰り 返された。ＡＳＯ解裂生成物はゲル電気泳動による決定の前に４ｍｌロード用色 素（９０％フォルムアミド、１ｘ ＴＢＥ、０．１％ ブロモフェノールブルー 、０．１％キシレンシアノール）に溶かされた。配列決定用ゲル（２０％ポリア クリルアミド／８Ｍ尿素／ＴＢＥ）は２００Ｖで１時間、事前の走行が行われ、 試料が載せられ電気泳動はブロモフェノールブルー色素が起点から１４ｃｍ移動 するまで続けられた。配列決定用ゲルはKodak X-Omat X-ray filmに２４−４８ 時間さらされた。 Ｂ．酵素による配列決定 化学的解裂に記載されたのと同様に変異陽性試料は同定され、スポットが切り 出され、ＡＳＯが溶出された。溶出された試料はそれぞれＭｉｃｒｏｃｏｎ−１ ０TM濃縮機(Amicon Inc.,Beverly,MA)に入れられ、１４，０００回転で３０分間 ベンチトップのマイクロフージの中で遠心分離された。両方の濃縮機は１回当た り１００μｌの蒸留水で２回洗浄された。（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−３TM濃縮機は対 応するＭｉｃｒｏｃｏｎ−１０TM濃縮機からの溶出物で洗浄された。）溶出した ＡＳＯはＭｉｃｒｏｃｏｎ−３TM濃縮機の上部から１回のすすぎ毎に２０μｌの 蒸留水を用いた３回の連続したすすぎによって採集され、分画がプールされた。 試料はＵｎｉＶａｐｏTM濃縮機(Integrated Separation Systems,Natick,MA)中 で凍結乾燥され、再び５μｌの蒸留水に溶解され、溶出されたＡＳＯを同定する ために設計された酵素的配列決定プロトコールにおいて配列決定用プライマーと して用いられた。配列決定反応は、それぞれの鋳型（７７塩基）が特異的なＡＳ Ｏに独自に相補的なプライマー結合部位としての３’領域（１７塩基）および” ＡＳＯ−特異的同定者配列”からなる２つ目の独自の領域（１７塩基）からなっ ているオリゴヌクレオチドの鋳型を含む。配列決定生成物は、溶出したＡＳＯが 独自の鋳型の相補的な領域に結合してプライマーとして働き下流の”ＡＳＯ特異 的同定者配列”の同一性を明らかにするための循環配列決定を許した場合にのみ 観察された。 サイクルシークエンス反応には、ASO特異的鋳型（5fM/鋳型）、Thermosequena se緩衝液濃縮液0.5μｌ（Amersham Life Science,Cleveland,OH）、Thermoseque nase（32U/μｌ）0.125μｌ、および“G”終結混合液（15mM dATP、15mM dCTP、 15mM dTTP、15mM 7-deaza-dGTP、および15mM dGTP）または“G”終結混合液（15 mMdATP、15mM dGTP、15mM dTTP、15mM 7-deaza-dCTP、および15mM dCTP）の反応 総容積6μｌの混合物が含まれる。サイクルシークエンス反応は、95℃30秒およ び70℃1分で30サイクル行い、次に70℃で2分保温した。シークエンス反応産物は 、15%アクリルアミド/7M尿素ゲルで分析し、次に-70℃で約16時間、Kodak X-Oma t X線フィルムに感光させた。 以下は、本明細書で以前に同定したR334W CF変異特異的ASOの相補鎖を含むい くつかの相補的オリゴヌクレオチドの例である。 例1：シークエンスプライマーとしてのASO SEQ ID NO:62 本態様においては、ASOをSangerシークエンス反応によって相補オリゴヌクレ オチドと保温し、配列を直接的に決定した。 例2：溶出ASOのサイクルシークエンス SEQ ID NO:63 本態様においては、ASOは1回の伸長反応のためのプライマーとして用いられる 。次に、ユニバーサルプライマーをシークエンス反応のプライマーとして用いて 、伸長反応産物についてサイクルシークエンス反応を行う（後述の実施例5参照 ）。 例3：Sangerシークエンス反応のための相補オリゴヌクレオチドの増幅 SEQ ID NO:64 本態様においては、ASOは1回の伸長反応のためのプライマーとして用いられる 。次に、ユニバーサルプライマー配列およびASOを増幅プライマーとして用いて 伸長反応産物を増幅する。最後に、シークエンス標的に対応するオリゴヌクレオ チドをプライマーとして用いて、増幅産物についてSangerシークエンス反応を行 う（後述の実施例6参照）。 実施例5：各種ASOのサイクルシークエンス反応 A）伸長反応 R334Wと呼称する、配列5'-TTCCAGAGGATGATTCC-3' SEQ ID NO:65を有する分離 した変異特異的オリゴヌクレオチドを、1回の伸長反応に必要な反応組成物を含 む反応混合液に加える。相補オリゴヌクレオチド（上述の実施例4の例2）は、5' 末端にユニバーサルプライマー配列を含み、これと25から30塩基隔てて3'末端に R334W相補配列を含む。伸長反応には、以下の構成物が含まれる： 25μｌ分離ASO 5μｌ 10×緩衝液（0.5mM トリス塩酸(pH7.5),0.1M MgCl2,10mMジチオスレ イトール） 1μｌ dNTP（各2.5M） 1μｌ相補オリゴヌクレオチド（100ng/ml) 13μｌ H2O 1μｌ（DNAポリメラーゼ）Klenow断片（10U/μｌ） 反応は、室温で30分間進行させた。 B）サイクルシークエンス反応： 以下の方法に従って、上記の反応液の一部を2またはそれ以上のジデオキシヌ クレオチド類似分子（ddNTP）を含むPCR反応混合液に加える： 10μｌ伸長反応産物 5μｌ 10×緩衝液（300mM トリス塩酸（pH9.0）,50mM MgCl2,300mM KCl） 5μｌ ユニバーサルプライマー（1pM） 10μｌ 2mM ddATP、ddCTP、ddGTP；dATP、dCTP、dGTP、dTTP 19μｌ H2O 1μｌ Taqポリメラーゼ（10U/μｌ） 30サイクルの増幅が行われ、ユニバーサルプライマー配列の下流のヌクレオチド に相当する位置で終結した、不均一な一連のランダムな終結産物が生じる。PCR 反応の産物は次に、変性ポリアクリルアミドゲルで分離され、このASOに特異的 なバンドのパターンが生じる。電気泳動のパターンを、放射性写真または蛍光測 定法によって解析する。 実施例6：相補オリゴヌクレオチドの増幅および配列決定 R334Wと呼称する、配列5'-TTCCAGAGGATGATTCC-3' SEQ ID NO:65を有する分離 した変異特異的オリゴヌクレオチドを、実施例5のA）の通りの伸長反応のための 反応構成物を含む反応混合液に加える。相補オリゴヌクレオチド（上述の実施例 4の例3）には、5'末端にユニバーサルプライマ一配列、“標識”配列、“シーク エンス標的”配列、次に3'末端にR334Wの相補配列が含まれる。伸長反応後、反 応液の一部を以下の構成物を含む増幅混合物に加える： 3μｌ 伸長反応産物 1μｌ ユニバーサル増幅プライマー（10μＭ） 2.5μ１ dATP、dTTP、dCTP、dGTP（各2mM） 2μｌ 40mM MgCl2 5μｌ 100mM トリス塩酸（pH8.3）、500mM KCl 26.4μｌ H2O 0.1μｌ AmpliTaq DNAポリメラーゼ（5U/μｌ） 次に、GeneAmp PCR System 9600 Thermocyclerによって反応液について35サイ クルの増幅を行った。次に2μｌの増幅産物を回収し、Sangerシークエンスを用 いてSangerシークエンス反応を行った。 実施例7：標的核酸としてのRNA 標的核酸としてDNAを記載した実施例1と同様の方法で、RNAもまた標的核酸と して用いられる。 A）標的細胞からのRNAの調製 細胞を遠心によって回収し、上清を除く。細胞塊を冷溶解緩衝液（140mM NaCl ,1.5mM MgCl2,1.0mMトリス塩酸（pH8.5）,0.5% NP-40,Rnasin（登録商標,Promeg a,inc.））に懸濁する。細胞塊を5000×g、4℃で5分間遠心することによって沈 澱させる。上清を新しいチューブに移し、EDTA濃度を10mMに合わせる。タンパク 質を、10mMトリス塩酸水溶液（pH8.5）で飽和したフェノールクロロホルムによ る抽出で除去する。水層に酢酸ナトリウム（pH5.2）および体積の2.5倍量の氷冷 エタノールを加えて10℃、一晩沈降させ、10000×g、4℃で30分間遠心すること に よってRNAを回収する。 B）増幅に先立つRNAのcDNAへの変換 本発明の方法においては、RNAは直接的に用いられ、または逆転写PCR法によっ て増幅されたDNAに変換される。この方法に従うと、1μｇのRNAを100pmolの適切 なプライマー、1mM dNTP、20μｌのPCR緩衝液（50mM KCl,20mM トリス（pH8.4） ,2.5mM MgCl2）中の1U/μｌRnasin（登録商標）、および200Uのリバーストラン スクリプターゼと混合する。混合液を23℃で10分、次に42℃で45分、次に95℃で 5分保温し、続いて急冷する。生ずるcDNAを増幅するためには、実施例1に記載さ れたのと同様の慣用的なPCR法が用いられ得る。 実施例8：特異的識別分子プローブ 分離したポリマーの同定を化学的または酵素的シークエンス反応を用いて行う 替わりに、直接的または間接的に検出され得る特異的な識別分子で各プローブ多 量体を標識することも可能である。以下に記載するものは、当該技術者が本発明 に有用であると理解し得る多岐の特異的識別分子プローブの内の一部を例示する に過ぎない。 A）蛍光標識 上述の実施例2に記載したのと同様の方法によって、固定した標的核酸とオリ ドヌクレオチドをハイブリッド形成させる。ただし、試料中の各ASOは32Pの替わ りに特異的蛍光プローブで標識される。例えば、ΔF508M、G542XM、G55IDM、お よびR553XMと呼称するASOは、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、フル オレセイン、およびCy3の各々で標識される。実施例3と同様に、結合したASOは 分離前に結合したことが検出される。この例においては、ASOの結合は結合した 標識の蛍光によって、視覚的または何らかの自動化された方法によって検出され る。分離後、蛍光励起に応答した光放射を測定することによって、ASOは明確に 同定され得る。 B）分子量標識 上述の実施例2に記載したのと同様の方法によって、固定した標的核酸とオ リドヌクレオチドをハイブリッド形成させる。ただし、試料中の各ASOは特異的 な分子量修飾物によってさらに標識される。例えば、実施例8Aに記載された4つ のASOはそれぞれ、異なった長さのヘキサエチレンオキシド（HEO）5'多量体尾部 を用いて誘導体化される。ΔF508M、G542XM、G55IDM、およびR553XMと呼称するA SOはそれぞれ、長さ5、10、15、および20HEOユニットで標識され得る。尾部は、 Nucleic Acid Res,22:4527に記載されたような標準的なDNA合成法を用いて付加 される。HEO尾部は水素結合には関与しないが、各ASOに特異的な分子量を付与す る。ASOはさらなる修飾なしに、一般的に認知された何らかの方法（例えばゲル または毛細管電気泳動）を用いて、分離したASOを分子量で識別することによっ て同定され得る。 C）その他の分子量標識法 ハイブリッド形成ポリマーの分子量による同定のさらなる利用法は、標的核酸 から分離後のポリマーに、付加的な数個のヌクレオチドを酵素的に加えることで ある。本方法の好ましい態様においては、分離したポリマーは、固定した標的核 酸とのハイブリッド形成後、標的核酸をプローブ探査するために用いられるポリ マー混合物中の一つに各々相補的な数種のオリゴヌクレオチドを含むチューブに 回収される。ポリマーに相補的な部分に加え、オリゴヌクレオチドにはさらにそ れ自身に特異的な長さの付加配列が含まれる。ポリマーおよびオリゴヌクレオチ ドがハイブリッド形成すると、ポリマーは次に、酵素的にポリマーを伸長させて 全長の相補オリゴヌクレオチドにするためのプライマーとして用いられ得る。こ の反応の間、上に記載した直接的または間接的標識が取り込まれる。伸長したオ リゴヌクレオチドは、確立された何らかの方法（例えばゲルまたは毛細管電気泳 動）を用いて、標識産物の相対的分子量を測定することによって同定され得る。 実施例9：ポリマーのライゲーション 試料と完全にハイブリッド形成したプローブポリマーを同定するための、ライ ゲーションに基づく方法が知られている。隣接するポリマープローブの接合部に おいて完全なハイブリッド形成と不完全なハイブリッド形成を区別するために、 そのような方法においては、ライゲーションがしばしば用いられる。これは特に 、遺伝的変異を決定するために有用である（Landegren et al.,1988,Science 24 1:1078）。LCRは、ライゲーションされた産物の増幅を行う一つの方法であり、 標的配列の有無を決定するための産物の充分量を得るために用いられ得る。Gap- LCRは、標的非依存性ライゲーションによって生成した背景値を減少させる、修 飾したLCRである。他のライゲーション依存増幅法は、以前に挙げた。図5には、 本発明において利用され得るライゲーション法のいくつかの例を模式的に示す。 これらの模式図においては、ポリマーは（例えば遺伝的変異部位の両側に位置す る）ライゲーションプローブを形成する。各組のポリマー（またはプローブ）の 一つには、捕捉分子が取り付けられる。ポリマーを固定した試料とハイブリッド 形成させライゲーションした後は、ハイブリッド形成していないポリマーの全て が洗浄除去され得る。ハイブリッド形成していないポリマーの洗浄除去は必ずし も必要ではないが、（特に大量のポリマーを試料と反応させる場合は（過剰量の ハイブリッド形成していないポリマーはシークエンス決定等によるライゲーショ ンされたポリマーの同定を阻害し得る））強く望まれる。また、溶液中でのプロ ーブのハイブリッド形成およびライゲーションが可能であるため、試料は固定さ れる必要はない。さらに、ライゲーション反応において用いられる条件下では、 不完全なハイブリッド分子が生成し得る。TMACおよび厳密な温度調整は、必要で ない場合がある。しかし、不完全なハイブリッド分子はライゲーションせず、そ のため同定されないため、偽陽性として認識されることはない。 より容易に同定できるようにするため、ライゲーションした産物を増幅するこ とができる。例えばＬＣＲ熱周期装置によってこれは成し遂げられる。かわりに 、ＰＣＲのようなほかの技術を用いても産物の増幅は可能である。また、十分量 の 多量体プローブが使用される場合、ライゲーション産物は増幅する必要がないの でハイブリダイゼーションの工程の前にＤＮＡ試料の総量を増幅することも可能 である。 ハイブリダイゼーションおよびライゲーションをした多量体は固体の支持物に 固定され、次にレポーター分子の有無が決定される。レポーター分子が存在する と、ライゲーションが起こり、標的分子の有無が決定される。 ライゲーションした多量体に特異的な標的配列の同定のための様々な機構は当 該業者にとって容易に理解されるであろう。４つのそのような機構について図６ -９に記述し、「モデル」1-4として示した。モデル１において遺伝的変異、また は標的核酸配列、または多量体のライゲーションを引き起こすランダムな置換変 異は、産物の化学的切断による塩基配列の決定、即ちマキシムギルバートシーク エンス反応により同定される（図６）。モデル２においてライゲーション産物は 従来のサンガーシークエンス反応により塩基配列決定される。特に、ライゲーシ ョン産物が固相に捉えられた後、ライゲーション産物とハイブリッド形成する配 列を含む配列の混合物に加えられる。塩基配列の決定が実行され、ライゲーショ ン産物が同定される（図７）。モデル３において、ライゲーション産物は直接従 来のサンガーシークエンス法により、記述したライゲーション産物の「Ｂ」部位 の配列に相補的な雑多なプライマーを用いて塩基配列決定される。次に塩基配列 決定は「Ｂ」プローブに加えられた共通の３’領域に相補的なプライマーを用い てなされる（図８）。モデル４において、ライゲーション産物は普遍プライマー 伸長塩基配列決定での線型増幅の鋳型として用いられる。反応は固相または溶液 に接した産物と起こる。その産物は従来通りサンガーシークエンス法により限界 配列に相補的なプライマーを用いて塩基配列決定される（図９）。 実施例１０ ＡＲＭＳ 多量体の増幅 不応性変異増幅系は変異決定のための良く知られたＰＣＲ型の系であり、本発 明で施行された。例えば、変異を含むと考えられる配列に相補的な多量体が合成 され、標的ＤＮＡにハイブリッド形成する場合にプライマーとして作用する。野 性型配列に対して相補的なプライマーは標識しない。変異配列に対して相補的な プライマーは標識する。第２多量体は第１のプライマーの組みとの組み合わせで 使用した場合にＰＣＲ増幅を可能にするプライマーと働くように設計され合成さ れる。第２の多量体は、結合組みの一方、例えば固相上で増幅したＰＣＲ産物を 捕捉し得るビオチンに付着させる。ポリマー／プライマーは試料にハイブリッド 形成し、ＰＣＲ熱サイクルを実行する。増幅した産物は表面に接着した結合相手 （例えばビオチン）を有する固相に露出する。支持体の表面に結合した増幅産物 のシグナルの存在は試料中に変異配列が存在することを示す。結合産物は前記の 方法、例えばサンガーシークエンス法により同定することが可能である。 本発明の方法論は複数変異の解析の実施に関わるハイブリッド形成の数を減ら す一方で大量の試料を処理法を本明細書において提供する。あらゆる診断検査の ためのプローブの数が非常に大量である場合、本発明の方法に従って多くの独立 したハイブリッド形成を陽性試料の混合物に対して実施することは、経費面にお いて最も効果がある。本発明のＭＡＳＤＡ法を用いることによって、個別の試料 のハイブリダイゼーションおよび独立したプローブのハイブリッド形成の欠点を 回避することが出来る。ＤＮＡ試料に対してハイブリッド形成した変異特異的オ リゴヌクレオチドの配列の抽出及び解析を行うことによりＭＡＳＤＡは第２の独 立したハイブリッド形成の必要を除く。すなわち、１日で数１００の異なる試料 を数１００の変異特異的オリゴヌクレオチドの混合物を含む１回のハイブリダー ションによって同時に解析できる。また、ハイブリッド形成し、溶出したオリゴ ヌクレオチドの短い単一のバンドのパターンの生成により、ゲルの複数のレーン にまたがる泳動サンプルの互い違いの泳動パターンにより複数の試料を解析でき る。それゆえ現在便利な自動塩基配列決定装置の使用で、特異的変異の同定は数 １００の陽性試料のプールに対して１５０試料／時間より多くの割合で容易に行 うことが出来る。 高い試料処理能力や複雑な変異の解析に加え、いくつかの他の利点が本発明の ＮＡＳＤＡ技術にはある。ＭＡＳＤＡは非常に柔軟な分子のプラットホームであ る。これは、関連遺伝子及び各々の遺伝子について同定された変異の数が急激に 変化する遺伝学的診断等の分野において大変重要である。溶液中にオリゴヌクレ オチドプローブを有することによって、必要に応じ混合及び合わせることが可能 である。即ち、臨床の研究所は経費的に最も効果的であるように診断の検定を設 定できる。試料の調製および標的の検出においても柔軟性が見られる。試料の核 酸はＤＮＡでもＲＮＡでもどちらでも可能である。 複数の標的の増幅の例証として、ＰＣＲは増幅の過程で利用した。しかし本発 明ＭＡＳＤＡはどの様な増幅技術とでも両立でき、変異の検出及び同定に先立つ どのような増幅産物の修飾も必要でない。これは、多くの試料がを１回の検定で 解析する必要のある時、大変重要な問題となる。試料となる核酸を断片化する必 要がないので、この研究で実施した多様なアンプリコンと同様に長いＰＣＲ産物 を解析することが可能である。 現在、遺伝子型／表現型協会の、既に知られた病原遺伝子内の既に知られたも のや新規の変異についての情報データベースの発展に多くの努力が払われている 。それに加えて、臨床での治療をしている患者の遺伝子型と彼らの様々な治療に 対する反応の関係の構築には、ますます多くの興味が持たれている。本発明ＭＡ ＳＤＡは前もって同定された発現した配列のタグまたは人のゲノム内に同定され た２対立遺伝子マーカーが表示するオリゴヌクレオチドライブラリーの作成を容 易にすると考えられる。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION         Large-scale screening of nucleic acid sequencing or genetic replacement Field of the invention   The present invention identifies the presence of one or more genetic substitutions in a nucleic acid sample For large-scale screening of nucleic acids. The present invention also relates to genetic conversion. It also involves identifying the particular target nucleic acid sequence to which it relates. The method of the present invention Carriers for determining the molecular cause of the disease and for genetic counseling Can be used to identify genetic polymorphisms to provide diagnosis of fetal and fetal individuals. You. In addition, the present invention relates to the identification of disease-causing microorganisms, especially at high resolution. Involved. Background of the Invention   Over the past few years, genes that are thought to be responsible for human genetic diseases have been identified, Have been significantly increased. As the total number of disease-related sequences increases As a result, the number of identified mutations in the gene has also increased. Only one Or some mutations can be highly disease-causing (eg, sickle red) Hemocytosis) (1). However, the genes responsible for most diseases are A single mutation that has many different mutations and is present in a significant number of patients There is no difference. Therefore, modifications to analyze mutations for research and clinical diagnosis A good way is to make sure the candidate gene is really the disease-causing gene Not only can it create a database of mutations and provide clinical diagnostic analysis Needed. Furthermore, as the number of discovered oncogenes increases (2-4 ), An efficient and inexpensive and very informative mutation analysis method Necessary to better understand trends and polygenic diseases.   This necessity has led to techniques for detecting mutations that fall into two broad categories. It has been developed (5, 6). No. created to search for mutations in the gene One group of techniques is single-stranded structural polymorphism (SSCP) (7), denaturing gradient gel electrophoresis. Electrophoresis (DGGE) (8), heterodimer analysis (HET) (9), chemical cleavage Analysis (CCM) (10), ribonuclease cleavage (RNAase) (11), and And direct sequencing of the target gene (12). These methods are very informative. Although informative, these operations take a long time, are large, and costly. It is incompatible with doing it with limited use. In a laboratory that performs clinical diagnosis Very large number of samples (more than 500 per analysis) need to be analyzed at low cost In some cases, these search techniques have recently become routine for detecting mutations. It is not used as an effective method (5).   In the second technique, allele-specific amplification (ASA) (13), oligonucleotide Acid dry gating analysis (OLA) (14), primer extension (15), Artificial introduction of restriction sites (AIRS) (16), allyl-specific oligonucleotides Dehybridization (ASO) (17), and the derivatives of these products More direct methods for analyzing mutations have been developed. robot With the introduction of engineering, such a direct mutation analysis method enables efficient diagnosis. Cost if only a limited number of mutations need to be analyzed for the purpose of Decreased and the throughput increased. However, many outbreaks in the disease-causing genes If only a small number of mutations are identified, test for most types. Analysis, a large number of mutations must be analyzed to obtain a significant detection frequency. I have to.   Many methods have been developed for detecting known mutations. Generally, Diagnostic techniques are designed to be simple and cost-effective. However, recently developed The limitations of almost all technologies are that many mutations can be It is impossible to analyze. Most suitable for analyzing many samples A suitable method is to bind the PCR product to a filter membrane and use an allele-specific probe. It is a dot blot for hybridization. But the dot blot In a standard manner, for each individual allele or mutation of the sequence of interest, Separate hybridization is performed for each. Therefore, when the number of probes is large, In this case, this technique becomes cumbersome.   Unfortunately, current testing methods, such as more than 100 mutations , Even if you want to do a comprehensive analysis of multiple mutations, Large volumes of sample processing and cost savings required I can not do such a thing. Therefore, methods have been developed that allow many samples to be analyzed in one analysis. Effort is needed to make it happen.                               Summary of the Invention   The present invention relates to the nucleotide sequence or genetic change (addition of nucleic acid) for many nucleic acid samples. , Defined as deletions or substitutions) Provided by: immobilizing a plurality of nucleic acid samples on a support; Providing multiplicity to polymers containing pyrimidine and pyrimidine; including purine and pyrimidine Hybridization to immobilized sample with multiplexed polymer; Identification and hybridization of multimeric polymers containing amino acids and pyrimidines Nucleic acid sequence or identification by the identification of multimeric polymers containing purified purines and pyrimidines Is the identification of one or more genetic changes. Hybridized pre Polymers containing amino acids and pyrimidines can be used, for example, for sequencing, direct labeling, Such techniques as indirect labeling and labeling with specific length markers It can be identified by known methods in the field.   The present invention also provides that the sample is not fixed in solution (ie, Rather) also includes embodiments that react with polymers containing purines and pyrimidines.   Target nucleic acid sequence and / or hybridized purines and pirimi Both gin-containing polymers are amplified to facilitate detection and identification. Increase Examples of width methods include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction (LCR), gap-LCR , Ligation amplification reaction (LAR), oligonucleotide ligation OLA, Amplified Immunomutation System (ARMS), Competitive Oligonucleotides Dopriming (COP), allele-specific PCR, Qbeta replicase amplification, Including nucleic acid sequence based amplification (NASBA) and branched chain amplification Not limited to Hybridization uses various purines and pyrimidines In the melting temperature of the hybrid formed between the containing polymer and the target nucleic acid sequence Under conditions that minimize                             BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   Figure 1 shows the different ants of the transmembrane regulatory gene (CFTR) in cystic fibrosis. Le specific32Multiple identical files containing human genomic DNA with P-labeled ASO Autoradiography obtained by hybridization of The result is shown. The ASO used for each hybridization was To the left of the filter. Lane 1 of each filter is Lanes 2-6 contain wild-type "normal" DNA. Including the sequence.   Figures 2A-2D show the differences in the cystic fibrosis transmembrane control gene (CFTR). Allele specific324 identical P-labeled ASOs containing human genomic DNA Autoradiographs obtained by hybridizing The results of Raffey are shown. The ASO used for each hybridization was They are shown to the left of each filter. Lanes marked A are DNA samples Including positive controls. Lane BE is 8C (failure of amplification of duplicate samples) And replicated and analyzed except for D7, D8 and E7 (positive control) Patient samples.   3A and 3B show specific mutations in the positive pool samples identified in FIG. 3 shows the identification of. The top part of each filter is Pool 1 and Pool Includes positive control samples for ASO in those designated as 2. Pool 1, Lane 1, G542X; Lane 2, G551D; Lane 3, R553X; Lane 4, W1282X; lane 5, N1303K. Pool 2, lane 1, Δ507; Lane 2, R117H; Lane 3, 621 + 1G-> T; Lane 4, S549N; Lane 5, R560T; Lane 6, 1717-1G-> A. B's lane is pool 1 Or, contains a sample of pool 2 positive patients. Pool 1, lanes 1 and 2 are shown in FIG. Sample 4, lanes D and E. Pool 2, lanes 1 and 2 are the samples of FIG. Includes fee 3, lanes D and E. Lanes 3 and 4 are sample 5, lane D of FIG. And E.   FIG. 4 shows a schematic representation of the method of the invention.   Fig. 5 shows the results of hybridization of a polymer containing purine and pyrimidine to the immobilized sample. To identify the products that have been converted and hybridized. 1 shows a general scheme of a ligation-based technique.   FIG. 6 shows the sequencing by chemical cleavage of the product, ie, Maxam Gilber. 1 shows a scheme for identifying a ligation product by the G. method.   FIG. 7 shows the results of ligation using the conventional Sanger sequencing reaction. 1 shows a scheme for identifying products.   FIG. 8 shows the ligation products obtained by the Sanger base sequencing reaction. 3 shows a schematic of another method for determining   FIG. 9 shows the ligation amplified using a general priming sequencing method. 1 shows a method for determining the nucleotide sequence of a product by the Sanger method.   FIG. 10 shows disease amplified by multiple PCR for MASDA assay. This shows the loci for rubbing. DNA sample (2 mg) is converted to one of seven different genes Amplification was based on specific multiplicity and analyzed by gel electrophoresis. M = φX174 / HaeIII molecular weight marker: 1 = 8 multiplexed amplicons within the CFTR gene. 2 = 9 multiplexed amplicons within the CFTR gene. 3 = within the β globin gene One amplicon. 4 = 2 multiplexed amplicons in HEXA gene. 5 = (3 + 1) multiplicity of GCR gene (3 multiplexed amplicons + 1 Independent amplicon). 6 = 3 multiplexed amplicons in ASPA gene . Four multiplexed amplicons within the 7BRCA1 gene. 8 = within the FACC gene Three multiplexed amplicons.   FIG. 11 shows the results from seven different genes in one hybridization. Figure 7 shows the simultaneous detection of 106 different mutations in 33 target regions. Lanes 1-7 = detection of 66 CFTR mutations present in cystic fibrosis (CF). Lanes 8-9 = negative control sample for cystic fibrosis (CF-) mutation. lane 10-11 = 14 β globin mutations in β thalassemia (β Thal), And the detection of two β-globin mutations in sickle cell disease (SCA). Lane 12 = Detection of three HEXA mutations in Tay-Sachs (TSD) disease. Lane 1 3 = Detection of (GCR) 8 GCR mutations in Gaucher disease. Lane 14 = Detection of four (CD) ASPA mutations in Canavan disease. Lane 15 = breast cancer (BRC) detection of 5 BRCA1 mutations in. Lane 16 = Fanconi Detection of (FA) 4 FACC mutations in anemia. Disease-specific negative con Troll samples are shown in lanes 11-16 following the positive sample.   FIG. 12 shows the band pattern generated by chemical cleavage of the extracted ASO. And shows the identification of the mutation. C = C cleavage reaction; G = G cleavage reaction.   FIG. 13 shows the sequence generated by the enzyme sequencing method to identify mutations. Shows the pattern of the command. ASO extracted from the sample with the mutation is mixed with the template Used to start the cycle sequence reaction in the product. Each mold is Region complementary to specific ASO (primer site), common stuffer region (Region B) and a downstream mutation-specific identification sequence (region A). C From the limits of the G and G sequences (lanes C and G of each sample) Fingerprints generated from specific identifying sequences identify specific ASOs Therefore, the mutation is present in the target DNA. CF = cystic fibrosis; BT = β thalassemia; BRC = BRCA1 gene associated with breast cancer. lane 1 = CF17 mutation; Lane 2 = CF20 mutation; Lane 3 = BT5 mutation Different; Lane 5 = CF negative control; Lane 6 = BT negative control; 7 = BRC negative control.   FIG. 14 shows that over 500 ASO hybridization assays The simultaneous detection of 106 different mutations in different patient samples Show.                             Detailed description of the invention   All patent applications, patents and references mentioned herein are hereby incorporated by reference. Incorporated as a reference. If it differs from the bibliography, The description in the specification takes precedence. Definition:   1. “Allyl-specific oligonucleotide” (ASO ) Is an oligonucleotide having a sequence that is identical or nearly identical to a known nucleic acid moiety It is a tide. ASOs often have only a small fraction of the common "wild-type" Including those that have changed to This change may be an addition, a deletion, or one or more changes. Includes substitutions for the above nucleotides. ASO is added when the nucleic acid sequence is known, It can be created to identify deletions or substitutions.   2. The "derivative" nucleotide sequence used in the present specification may be an addition, deletion, or Differs from a known sequence by the substitution of one or more nucleotides. Nucleic acid sequence.   3. "Amplification" of a nucleic acid sequence as used herein refers to the polymerase chain reaction. (PCR) (Saiki et al., Science 239: 487, 1988), ligase chain reaction (Barany, Proc. Nat) 1.Acad.Sci.USA 88: 189,1991) (LCR), gap-LCR (Abravaya et al., Nuc. Acids Res. 23:67 5,1995), ligation amplification reaction (Wu et al., Genomics 4: 560,1989); ASPCR (Wu et al., Pr. oc.Natl.Acad.Sci.USA 86: 2757,1989), ARMS (Newton et al., Nuc.Acids Res. 17: 2503, 1989), or other methods for enriching specific nucleic acid sequences.   4. The "chemical sequence" of nucleic acids is based on the nucleus using individual base-specific reactions. The Maxam-Gilbert method (Maxim-Gilbert sequence, Maxi and Gilbert, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560).   5. "Enzymatic sequencing" of nucleic acids involves amplifying single-stranded DNA and using DNA polymerase Sanger to terminate randomly using (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci.U. SA, 74: 5463).   6. As used herein, "binding" and "hybridize" The term refers to the formation of a dimeric polymer containing nucleic acid: purine and pyrimidine Both are used in cases. The term "affinity purified" refers to hybridase This indicates that the purification is performed using a solution.   7. "Large" refers to a large number of nucleic acid samples (eg, over 50 or 100 nucleic acid samples). Process and screen many target sequences in a sample simultaneously Shows ability.   8. “Purine and pyrimidine containing polymers” are Watson Crick bases. DNA, RNA and other polymers, including purine and pyrimidine, which can form pairs It tastes and does not need to have a sugar phosphate backbone like PNA. J. Am. Chem. Soc., 114: See 1895-97 (1992).   The present invention is intended to simultaneously analyze multiple CF mutations in multiple patient samples. (25). Departure Ming's method is also more for many samples (> 500) in one measurement Alleles that can be analyzed at low cost (> 100) Provides differential diagnostic measurements (MASDA). Like general 'chip' technology (19-22), MASDA is used to hybridize oligonucleotides to analyze DNA sequences. Use However, contrary to the measurement using many oligonucleotides, In the MASDA technique of the present invention, a target DNA is immobilized on an immobilized support, and a pool of ASO in a solution is prepared. (Ie, a mixture of oligonucleotides specific for the mutation) Analyze. In addition, by using dot blots, multiple samples (> 5 00) It is possible to analyze a large number of mutations (> 100) simultaneously. You. Equivalent to a specific mutation present in the sample in the first step of the combinatorial analysis ASOs are selected by hybrid from the population depending on the target DNA. Hybrid Remove undiluted ASO and remove the sequence-specific sequence associated with the bound ASO. Band patterns are revealed by chemical or enzymatic sequencing and are present in the sample. Mutations are easily identified. As a model system, target gene CF TR (26), β-globin (1), HEXA (27), GCR (28), ASPA (29), BRCA1 (3), and FACC (30) MASDA is used to analyze individual patient samples analyzed in a single measurement. Not only are individual illnesses analyzed, but one It is possible to identify multiple mutations in one or more genes .   The present invention provides for the replacement of target sequences or sequences, as well as features in DNA isolated from patients. Methods for screening large numbers of nucleic acid samples for a given DNA sequence. The method is of interest for one or more genes or genetic loci It is applicable to cases. The method can also be used for nucleic acid samples of a number of target sequences of interest. Can be screened quickly and economically.   In certain embodiments, a particular nucleic acid sequence is known to be involved in a disease or syndrome. Contains the nucleic acid portion, specific gene, or genetic locus in the genomic DNA that is being identified. This Examples of cystic fibrosis, sickle cell anemia, beta thalassemia, and Ghos's disease However, it is not limited to this.   In another embodiment, the specific nucleic acid sequence is not known to be associated with a particular disease. Specific gene for which the polymorphism is known or suspected Or contains part of a gene locus.   In yet another embodiment, the specific nucleic acid sequence is, for example, a gene for an invasive microorganism. It contains a part of a foreign gene sequence such as nom. Non-limiting examples include bacteria and These include phages, viruses, fungi, protozoa and the like. This method is different Appropriate therapeutic intervention when it is desired to distinguish between variants or strains of microorganisms Especially applicable for selecting   According to the invention, the target nucleic acid represents a nucleic acid sample isolated from the patient . The nucleic acid can be obtained from any cell source or body fluid. Clinical practice Non-limiting examples of cell sources available for use in blood cells, cheek cells, cervical cells , Cells present in urine-derived epithelial cells, fetal cells, or tissues obtained at necropsy All of the vesicles are included. Body fluids include blood, urine, cerebrospinal fluid, semen, and infected or inflamed areas. Tissue exudate at the site. Nucleic acids are standard multiples in the art. Can be extracted from a cell source or a body fluid using any of the methods described above. Nucleic acid That the particular method used to extract the cells will depend on the nature of the cell source. Will be understood. For example, extracted for use in the preferred form of the invention. The minimum amount of DNA that can be obtained is about 5 pg (4 x 109Approximately 1 cell with a genome size of base pairs One).   Once extracted, the target nucleic acid can be used in the present invention without further manipulation. Can be used. Alternatively, one or more of those present in the target nucleic acid The above specific regions can be amplified by PCR. In this case, The width of the region is used to select specific adjacent sequences for use as primers. More specific. Amplification in this step allows for the presence of specific The advantage is that the concentration of the specific nucleic acid sequence is increased. Length of nucleic acid sequence that can be amplified It ranges from 80 bp to 30 kbp (Saiki et al., 1988, Science, 239: 489).   In some embodiments, the amplification of a particular sequence may be prior or absent. The target nucleic acid is bound to a solid or semi-solid substrate. As a result, Processing and screening of large numbers of nucleic acid samples from different cell sources You. Non-limiting examples of suitable substrates for use in the present invention include those for affinity capture. Drug-coated nitrocellulose or nylon filters and glasses Beads, magnetic beads, treated or untreated microtiter plates, poly Margel, agarose and the like are included. The method of binding the target nucleic acid to the substrate, It will be appreciated by those skilled in the art that it will depend on the particular substrate used. U. For example, binding to nitrocellulose is a matter of simple absorption of nucleic acids into filters. For subsequent baking of the filter at 75-80 ° C for 15 minutes to 2 hours under vacuum More can be done. Alternatively, further processing of the bound nucleic acid is required No, a charged nylon membrane can be used. Coty in Avidin Coated beads or microtiter plates (eg, biotin-conjugated PCR To bind the target nucleic acid to which biotin is bound (by using primers) Can be used. In addition, surface coating with antibodies and antibodies to target nucleic acids By incorporating specific haptens, the target nucleic acid can be transferred to any of the above solid supports. Antibodies can be used to attach. Immobilization of the target nucleic acid is usually preferred. However, in some embodiments, the polymer is hybridized to a target in solution. That is, it may be desirable not to bind the target to the support. For example, The rimer is allowed to hybridize to the target in solution, followed by high throughput screening in solution. Ligation as part of the method according to the invention . Ligation methods are discussed further below.   In practicing the present invention, preferably the unbound solid or semi-solid substrate is used. The treated or amplified target nucleic acid is converted to a polymer containing purines and pyrimidines (hereinafter referred to as a polymer). A mixture of polymers (also referred to below as "polymers"). Let react. These polymers are preferably allyl-specific oligonucleotides. (ASOs). 10 to 200, preferably 50 to 100, and most preferably 50 ASOs can be pooled for a single hybridization. Individual ASO Will be 16 to 25 nucleotides in length, preferably 17 nucleotides in length.   Polymers including purines and pyrimidines are standard in the art. Can be chemically synthesized using, for example, commercially available automated synthesizers. You. Subsequently, these polymers are either radiolabeled (eg, polynucleotides). Using kinases33P), or other commonly used "tags" Or a reporter molecule. For example, (such as FITC or rhodamine A) fluorescent dyes, enzymes (such as alkaline phosphatase), biotin, or Other well-known labeling compounds can be attached, directly or indirectly. further , Using a standard method, a large number of randomly permuted polymers in a single reaction It is possible to synthesize. As described in detail below, the present invention Determining individual sequences to hybridize prior to hybridization Do not need. Rather, the sequence of the bound polymer can be determined in a later step. it can.   U.S. Patent Application Ser. No. 07 / 957,205, filed Oct. 6, 1992, and Shub er et al., 1993, Human Molecular Genetics, 2: 153-158. , The hybridization reaction is a polymer such as a polymer containing different sequences Under conditions that will hybridize to complementary DNA of the same length. Can be. This is done by: 1) using polymers of the same length. And 2) adding the same length but different groups to the hybridization mixture. Eliminates differences in dissolution temperatures in polymers of anosine + cytosine (G + C) composition This Contain one or more drugs at different concentrations. Drugs that can be used for this purpose include Quaternary ammonium, such as, but not limited to, tetramethylammonium chloride (TMAC) Compound.   TMAC reduces the hydrogen bonding energy between GC base pairs via non-specific salt effects. Work to reduce. At the same time, it specifically binds AT base pairs, Increase the temperature stability of the bond. These conflicting effects create three hydrogen bonds Of the binding energy between a GC base pair having two hydrogen bonds and an AT base pair having two hydrogen bonds Has the effect of reducing. As mentioned above, one important thing is that in the presence of TMAC The melting temperature of the nucleic acid relative to the nucleic acid hybrid formed in Is only a function of the length of The second important thing is that each It is an increase in the slope of the dissolution curve relative to the lobe. These effects combine to create a high The stringency of hybridization can be distinguished by one base pair, Can be increased to the point where extraordinary hybridization is minimized (Wood et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 1585).   In practicing the present invention, any agent that inhibits these properties, if desired, It will be apparent to those skilled in the art that they can be used. Such drugs are The concentration is gradually increased in the presence and absence of the agent to give different test It can be easily identified by determining a dissolution curve for the oligonucleotide. this Attaches the target nucleic acid to a solid substrate, such as a nylon filter, and Radiolabeled oligonucleotides of different but different G + C composition To the filter, gradually increasing the temperature to wash the filter, and The relative amount of radiolabeled probe bound to the filter at each temperature This is done by measuring The above hybridization and washing steps Intervening steep elution of nearly overlapping gradients for different oligonucleotides Drugs that produce solution curves are available.   In practicing the present invention, the target nucleic acids and polymers will have maximum specific high Hybridization, and minimal non-specific Perform the reaction for a sufficient time and under appropriate conditions so that hybridization can be obtained. Can be done. Possible conditions include the concentration of each polymer, Including the temperature of re-digestion, salt concentration, and the presence or absence of irrelevant nucleic acids. I will. Further, the polymers are divided into at least two groups, each of which The group contains a sufficient number of polymers to allow hybridization Will be recognized. For example, a pool that hybridizes to a nucleic acid sample Would be preferably divided into groups of about 50 polymers . Each group of polymers is continuously attached to a nucleic acid immobilized on a support. The polymers that can be hybridized, but containing each group, are substantially And simultaneously hybridize to the nucleic acid. In addition, immobilized nuclei The acid sample hybridizes to at least one pool of polymer, and the hybrid Identify the soybean polymer and then analyze the nucleic acid sample with the same or a different polymer. Can be hybridized again in the pool. Each pudding and piri The concentration of the polymer containing thymidine is generally 1 ml of the hybridization solution. The range is 0.025 to 0.2 pmol. If a polymer with a known sequence is used, The optimal concentration for each polymer is the signal-to-noise for each polymer. The ratio of (eg, specific binding to non-specific binding) is gradually increased by increasing the concentration of labeled polymer. Can be determined by experimental hybridization. Bag To further reduce background hybridization, unlabeled Oligonucleotides containing unaltered (ie, wild-type) sequences can be labeled At a concentration corresponding to 1 to 100 times the concentration of the polymer obtained. it can.   Hybridization temperatures should be as low as possible for the length of polymer used. Can be optimized to be higher. This is empirical using the dissolution curve determination method described above. Can be determined. Coordinate determination of optimal time, temperature, polymer concentration, and salt concentration It should be understood by those skilled in the art that this should be done in a specific manner.   The hybridized polymer identified according to the invention is completely hybridized It is intended to be. Above method is incomplete hybridization To minimize. However, such a method is not always necessary Absent. In the ligation method described in the examples, incomplete hybridization was observed. A perfect hybrid is selectively identified, although a full hybrid appears to form.   Following hybridization, if necessary, unbound polymer -Means TM under conditions that maintain perfectly paired nucleic acid: polymer hybrids. The nucleic acid bound to the substrate is removed by washing, etc. in a solution containing AC or a similar compound. Leave. Washing conditions such as temperature, salt properties and concentration, and washing time Is determined empirically as follows. At this stage, the presence of bound polymer is determined I can do it. Various methods for detection include labels incorporated into polymers Or it will depend on the tag. For example, radioactively labeled, bound to the target nucleic acid Hot or chemiluminescent ASO sensitizes filters to X-ray film Can be detected.   Instead, the polymer containing the fluorescent label can be used for specific absorption of the fluorescent reporter. Detected at the optical wavelength by excitation with a laser or lamp-based system It is possible. In addition, the polymer can be added to each polymer in addition to the probe sequence. And has a modifying component (MWME) that confers a unique molecular weight to members of the pool. MWME is not involved in the hybridization reaction, but uses any of a number of methods. Determination of relative molecular weights allows direct identification of separated polymers I do. Other methods for detection and identification are described below.   The desired next step is to separate the bound polymer from the target nucleic acid bound to the substrate I do. Separation destabilizes nucleic acids against polymer hybrids, i.e., Lowering the salt concentration, raising the temperature, exposing to formamide, This can be performed by a method known in the art, such as potash. example If the bound polymer is incubated with the target nucleic acid-polymer complex in water And heating the reaction above the melting temperature of the nucleic acid: polymer hybrid. And can be separated. This allows for further processing of the separated polymer or Eliminates the need for purification.   According to the present invention, the hybridized polymer is separated from the target nucleic acid. Once done, the same is done in a number of different ways that are readily understood by those skilled in the art. Can be determined. By determining the sequence of the polymer, the target sequence in the nucleic acid sample Alternatively, it is possible to identify gene changes in the same manner.   By direct labeling with a unique reporter that provides a detectable signal It is also possible to identify the polymer. Directly labeled polymers are radioactive , Fluorescence, colorimetry, X-ray diffraction or absorption, magnetism, enzymatic activity, chemiluminescent And electrochemiluminescence or the like. Appropriate sign Include fluorophores, chromophores, (32P and125Radioactive atoms (such as I), high Includes electron density reagents and enzymes that produce a detectable product. L. Kricka , Nonisotopic DNA Probe Techniques, Chapters 1 and 2, Academic Press, 1992 , ("Kricka").   In addition to direct labeling of the polymer, indirect labels are also available. example For example, biotin-avidin, biotin-streptavidin, hapten-anti-hapten Many binding combinations for indirect labeling, including antibodies, sugar-lectins, etc. Are known in the art. Combines when used with the present invention One member of the set can bind to the polymer, and the other binding member of the set Direct labeling can be performed as described above. Following hybridization, the target nucleic acid Row-bound polymer is incubated with labeled members Then, it can be identified by detecting the binding set-label complex. Bioconj See Ugate Chemistry, 1: 165-187 (1990); Kricka, Chapters 1 and 2.   In addition, polymers can be identified using unique length markers. is there. That is, in addition to the parts that are involved in hydrogen bonding interactions with the target nucleic acid, Gives each individual polymer a unique, predetermined molecular weight By supplying a polymer with constituent components, individual polymers can be Can be identified. For example, Nucleic Acids Res., 22: 452 7-4534 (1994).   Furthermore, the hybridized polymer is used as an array for hybridization. Can be identified. Predetermined for such arrays Purines and pyrimidines containing polymers of the given sequence are solid or semi-solid It is immobilized at separate positions on the support. Arrays when used with the present invention The sequence of each immobilized polymer, including Complementary to the sequence. Pool of polymers that hybridize to the target nucleic acid Members are rehybridized with the immobilized polymer making array Can be identified after separation from the target nucleic acid. What polymer Is determined by the location of the hybridization on the array. Rice See National Patent No. 5,202,231 and WO 8910977.   Other modifications and possibilities are readily available to those of ordinary skill in the art. It is evident and considered equivalent within the scope of the present invention.   More particularly, in some embodiments, the hybridized polymer is a compound of the art. Sequencing using chemical techniques that are standard in (e.g., the Maxam-Gilbert sequence Determination method, Maxam and Gilbert, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 560) used. This method ensures that the polymer is separated from the target nucleic acid prior to sequencing. If not needed and additionally a mixture of randomly permuted polymers is used It is particularly appropriate when:   In another embodiment, the hybridized polymer is enzymatically sequenced (S anger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 5463). It is. In this case, the sequence complementary to the polymer, and already sequenced Oligonucleotides with additional linear sequence to function as "tag" sequences Is synthesized (see Example 4 below). Separation of the polymer from the target nucleic acid Performed in the presence of a mixture of "tagged" oligonucleotides. Sa Incubated under the conditions of Nanger sequencing (see, eg, Example 5 below) Sometimes, polymers hybridize to sequences complementary to them and sequenced Serves as a primer in the reaction. The resulting primed “tag” distribution By determining the sequence, the polymer present in the reaction is identified.   In a further embodiment, the hybridized polymer has an additional "tag" arrangement. Generic primer arrangements with or without sequences (see Example 4 below) Complementary oligonucleotides containing sequences and / or sequencing primer sequences And incubated. In each case, the polymer is its complementary oligonucleotide. Initial hybridization to nucleotides allows the polymer to elongate a single strand It becomes possible to serve as a starting primer in the reaction. In some cases The extension product is used directly as a template in cycle sequencing reactions Is done. Cycle sequencing of the extension product results in amplification of the sequencing product. Complementary In designing oligonucleotides, sequencing is performed either on the polymer itself or alternatively on the Position the sequencing primer so that sequencing proceeds through the sequence. You.   In the second case, the extension product is used for general primer sequences and sequencing. Includes primer sequence. This extension product is used for amplification in the presence of common primers. It is added to the response. Therefore, oligonucleotides containing sequences complementary to the polymer to which they are attached Nucleotides are selectively amplified. In a second step, these amplified sequences are: Sent to Sanger sequencing using inbuilt sequencing primer sequences . In this case, the sequencing primer should be immediately upstream of the “tag” sequence as described above. Be placed. Thus, the determination of the “tag” sequence determines the sequence of the double-stranded polymer. Set Is done.   In practicing the present invention, a polymer or complementary tagged oligonucleotide It is not necessary to determine the entire sequence of the otide. To quickly identify individual polymers , 1, 2, or 3 (as opposed to 4 reactions to get a complete sequence) Sequencing reaction produces a characteristic pattern (similar to a "barcode"). It is considered to be effective. This idea is digitized using radioactive reporter molecules. As with automated sequencing methods that produce tall patterns, non-radiolabeled overlapping Manual sequencing to produce analog or digitized radiographs using coalescence Appropriate for the statute. In each case, comparison with the established database Can be performed electronically. In this way, the number of sequencing reactions required is reduced. By virtue of the method, the method of the present invention allows for multiple samples and multiple nucleic acid sequences Facilitates economic analysis of genetic changes in a sample.   The present invention screens for a large number of potential polymers in a single reaction. To be able to do it at the same time. In fact, the simultaneous hybridization The actual number of polymers to be pooled will be determined by the diagnostic need. example For example, in cystic fibritis (CF), one particular mutation (Δ508) It is the cause above. Thus, a tag or tag in accordance with the present invention Preliminary hybridization with a tagged Δ508-specific polymer followed by Identification and removal of Δ508 allyls by detection of tightly bound polymers Will be. In the second ("second stage") hybridization, other low frequency A number of polymers encoding CF allyls are utilized, and the separation and And sequencing.   However, in other clinical situations, as high as the Δ508 mutation in CF, There is no single mutation appearing in. Therefore, the pool of polymer is pool positive The number of independent hybridizations required in a two-step analysis Therefore, it is determined only.   In addition, conventional laboratory tests show that cystic fibritis, β-thalassemia and Different clinical symptoms, such as Parkinson's disease, are retrieved independently of each other. In contrast to this Ming is responsible for multiple complementation of mutations in one or more genes that may cause disease. Multiple nucleic acid samples from different sample sources, including different mammals, using polymers Can be searched simultaneously.   In this method, clinical indicators indicate infection by an exogenous agent or microorganism. When suggested, the present invention seeks to simultaneously search for a large number of possible foreign nucleic acids. Enable. In addition, certain strains, variants, variants, and one or more Organisms are also distinguished by using the appropriate polymer in the search.   The method of the present invention is a method of randomly permuting a first or second stage search. By using polymers, the potential for nucleic acids in patients or invading microorganisms It also makes it possible to identify potential new mutant alleles. In this aspect Then, the exact mutant sequence is determined by the separation of the binding polymer, which is followed by sequencing. It becomes clear.   The present invention further provides a key for performing a high-throughput search of the nucleic acid sample of the present invention. Is scheduled The kit is a set of at least the following components: Including products: supports, numerous polymers including purines and pyrimidines, suitable labels Components and enzymes and reagents required for polymer sequencing. Model system of the present invention   Seven Different Gene Targets Representing Eight Different Diseases for Detection of Complex Mutations Selected as an exemplary system (Table 1). A total of 106 different mutations form one hybridization And analyzed during the detection process and was designated MASDA 106. Many mutations are known disease Have been identified in the majority of the Were used (columns 3 and 4 of Table 1). Of each of the most clinically manifested diseases Specific mutations selected within the gene are relevant for diagnostic applications. The majority analyzed Was present in the CFTR gene. In addition to the most frequently detected mutations in the CF patient population Incomplete transcription termination and subsequent deletion of the protein product Leading point mutations were also included. A total of 3 to ask for the presence or absence of 106 different mutations Three different amplification products were required (Table 1, column 5). Amplification only in disease-specific manner It is important to note what has been done. In other words, if the patient has pancreatic cystic fibritis, If suspected, the DNA sample contains only the gene for cystic fibrosis. It was width.   The specific mutations tested within each disease gene are shown in Table 1-B. these The table shows the size of the amplified region (bp) and the primers used for each amplification. Also included. Amplification of disease-specific targets   Whenever possible, perform multiplex PCR to reduce the number of PCR reactions required. (Table 1, column 5). A total of 9 reactions promoted amplification of 33 different loci. All single or multiplex PCR reactions were performed in a disease-specific manner. In other words, a DNA sample Only the appropriate disease gene is amplified and all loci analyzed are amplified. It was not. Various disease-specific amplification products are shown in FIG. This specification Two multiplex PCRs to include 66 CF mutations in the study discussed in The reaction was used to amplify 17 different regions within the CFTR gene (Figure 10, lanes 1 and 2). The magnitude of the amplification ranged from 130-510 bp. One amplification product of 1600 bp 14 beta-thalassemia and two sickle cell anemias associated with mutations in the robin gene (FIG. 10, lane 3). For Tay-Sachs disease, three A duplicate amplification reaction was designed to check for mutations (Figure 10, lane 4). Canavans Seki A triplicate amplification reaction was performed to check for repeated mutations (FIG. 10, lane 6). 5 milk Quadruple amplification isolated for cancer susceptibility related mutations (Figure 10, lane 7), and fans A single triplicate amplification was performed for the Koni anemia-related mutation (FIG. 10, lane 8). Go For Shea's disease, the GCR pseudogene has triple amplification and an independent single amplicon increase. Needed width. For the sake of analysis, aliquots from both reactions are stored and analyzed. Electrophoresis was performed in the same lane of the gel (FIG. 10, lane 5). Mutation detection   To analyze the mutations listed in Table 1 for many samples simultaneously , One forward multiplex hybrid using standard forward dot blot format Formation took place (FIG. 11). G-C content values of 106 mutation-specific oligonucleotides Between 18% and 76%, but due to the use of tetramethylammonium chloride (TMAC) (31). Mix all 106 mutation-specific oligonucleotides and combine them into a single pool. Thus, it was possible to form a hybrid. In addition, hybridization and Hybridization and washing at the same temperature due to the presence of TMAC It is now possible to do so. As seen in FIG. 11, 106 mutation-specific positive Only the control sample produced a signal on the radiograph, as shown in the negative control sample. Produced no significant non-specific signal. The overall signal intensity, and different The signal-to-noise ratio generated in the mutation-specific positive control sample By adjusting the concentration of each mutation-specific oligonucleotide in Optimized. Mutation identification   Specific mutations present in the pool-positive sample are hybridized from the sample DNA. The synthesized oligonucleotide is eluted, and the oligonucleotide sequence can be directly examined. And was identified by One alternative is to use the eluted oligonucleotide as a solid After binding to the support, a base-specific chemical modification reaction of G and C is performed, and the reaction product Was separated by polyacrylamide gel electrophoresis (32). FIG. 12 shows FIG. Pool positive samples (CF30, CF31, TS1, TS2, TS3, BT2, BT3 *, BT6, and BT7) Of CG-limited sequencing produced from several oligonucleotides eluted from This shows an example of an unger print (fingerprint). Each eluted oligonucleotide shown in FIG. 12 Provides a distinctive “finger” that unambiguously identifies specific mutations present in pool-positive sample DNA. Crests ". A unique banding pattern resulted for each of the 106 ASOs. 106 elution Is sequence analysis of all oligonucleotides a single pooled hybridization? The resulting positive results indicate significant cross-hybridization between different probes. It has been shown to have no specific hybridization. In addition, two types One sample with the β-globin mutation (Figure 12, lane BT3 *) shows two overlapping oligos. A unique "fingerprint" consisting of a nucleotide-specific banding was generated. This is a book The technique was used to show that mixed genotypes of heterozygotes were immediately identified.   In addition to the chemical modification and cleavage processes, enzymatic The experimental design has evolved. This process supports the eluted mutation-specific oligonucleotide. Includes use as primers in cycle sequencing reactions. Eluted Ligonucleotides contain a mixture of synthetic (77-mer) templates, a cycle sequencing reaction mix Added to things. Each synthetic template is present in a stored hybridization reaction Priming sequence complementary to one of the mutation-specific oligonucleotides, and elution Downstream specific to generate mutation-specific unique fingerprints An identification sequence was included. Figure 13 shows positive controls (mutant genotype CF17, CF20 BT5 and BRC 5) and negative control (normal genotype CF neg., BT neg., And BRC neg.) Samples Of C and G resulting from the cycle sequencing reaction using the released oligonucleotide It is an example of a band style. Oligonucleotides eluted from the positive control sample Each reaction (Figure 13, lanes 1-4) was followed by a mutation-specific fingerprint (region A). A common band pattern was generated, containing all such synthetic templates (region B). Mutation-specific The pattern found on the fingerprint is the corresponding ASO primer and, consequently, the patient sample. Allowed unambiguous identification of specific mutations present. Negative cycle sequencing reaction When performed with the eluate from the control sample, no band pattern was detected ( Figure 13, lanes 5-7). Mass-scale sample analysis   As demonstrated in a diagnostic environment, to demonstrate the MASDA process of the present invention Blind analysis to test the ability of MASDA technology to identify unique mutations . FIG. 14 shows the presence of 106 different mutations in a single hybridization assay. 4 represents the results of hybridization resulting from the analysis of more than 500 different DNA samples. All samples known to have one of the 106 different mutations were multiplex hybrid It was correctly identified as pool positive in formation (FIG. 14).   Specific mutations can be performed in each pool by performing chemical modification and cleavage procedures. Was accurately identified in the sex samples. 500 in a single hybridization evaluation Non-specific background increase when more samples are processed It is significant to note that no was observed.   The following examples are intended to further describe the invention without limiting it. Figure.   Example 1 Mutation-Positive Genomic DNA and Genomic Negative DNA Sample A) Blood Preparation of sample DNA from liquid   Whole blood sample collected in high glucose ACD VacutainersTM (yellow lid) is centrifuged Separated and buffy coat was collected (33). 14 mM NHFourCl and 1 mM NaH COThreeWashed twice with a 10: 1 (volume to volume ratio) mixture of The nuclei were dissolved in nuclei lysis buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.4 M NaC). 1, 2 mM EDTA, 0.5% SDS, 500 μg / ml proteinase K ) And placed at 37 ° C. overnight. The sample is a quarter volume of saturated NaC and the DNA was precipitated with ethanol. And DN A is washed with 70% ethanol, dried, TE buffer (10 mM -HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA). B) Preparation of sample DNA from oral cells   Mouth cells should be sterile cytology brushes (Scientific Producuts) or female Apply brush or mop to Dacron Mop (Medical Packaging Corp.) for 30 seconds Collected by turning inside the cheeks. Immediately or after storage at room temperature or 4 ° C DNA was prepared by the following method. Brush or mop is a polypropylene microphone Soak in 600 μl 50 mM NAOH in a centrifuge tube. Altex was. Tubes with brushes or mops at 95 ° C Heated for a minute, then brush or mop was carefully removed. DNA containing DNA The solution was neutralized with 60 μl of 1 M Tris, pH 8.0, and again Vortex (Mayall et al., J. Med. Genet. 27: 658.1990). DNA was stored at 4 ° C . C) Cloned positive control DNA sample   When a mutation-positive genomic DNA cannot be obtained, 40 An oligonucleotide having a base pair sequence was synthesized, and the pGEM-3Zf (+) vector (Prom ega Corporation, Madison, WI) and mutated into each clone Was verified by sequencing. D) Amplification of target DNA prior to amplification of hybridization DNA   As a model system for the detection of complex mutations, mutations of 33 different genes Selected from the area. The gene is a cystic fibrosis transmembrane conductivity regulatory gene (C FTR), β-globin gene, Tay. Sac hexosaminidase gene (H EXA), Gaucher gene (GCR), Canavan aspart acylase gene (ASPA), breast cancer multiple gene (BRCA1), and Fanconi anemia complementation group C gene (FACC). PCR amplification is 1-2 μg genomic DNA or Uses 10 ng of plasmid DNA and 10 mM Tris HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgClTwo, 200 mM dNTPs and 0.05-0.1 unit / μl Taq polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, (CT) in 100 ml of reaction buffer. Amplification of different disease genes For this purpose, the concentrations of the primers varied in the range of 0.2-1.6 mM.   3 or more amplification units (CFTR 8-plex and 9-plex, ASPA 3-p lex, BRCA1 4-plex, and FACC 3-plex) Due to the width, the primers were sequence-specific, as described by Shuber et al. (33). A chimera having a common region and a common primer sequence was used. These primers Enabled rapid multiplex formation and consistently stable amplification.   DNA amplification was performed using a Perkin-Elmer 9600 Thermal Cycler (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) Was performed using CFTR, HEXA, ASPA, BRAC1 and FACC For 28 cycles with temperature change (fixed at 94 ° C / 10 seconds; temperature change for 48 seconds) Conversion. Fixed at 60 ° C for 10 seconds. Temperature change for 36 seconds. Fixed at 72 ° C for 10 seconds. 38 seconds temperature change DNA amplification was performed by a method involving fixing at 74 ° C. for 5 minutes before cooling to the ladder. The amplification program for β-globin and GCR is annealing at 55 ° C. 28 cycles with a final fixation at 74 ° C for 5 minutes (94 ° C / 10 sec. Fixed. Fixed at 55 ° C for 10 seconds. Fixed at 74 ° C for 10 seconds. ).   The amplification product was subjected to 2% agarose gel electrophoresis followed by ethidium bromide staining and And visualization on a UV transilluminator (Fotdyne, New Berin, WI) Was parsed. E) Binding of DNA to solid substrate   8 μl of the amplified DNA solution prepared as in D) (0.5 mM NaOH, 2.0 M NaCl, 25 mM EDTA) And spotted on a nylon membrane filter (INC Biotrans). Under vacuum The DNA was fixed on the membrane by heating the filter at 80 ° C. for 15 minutes.   Example 2: Hybridization with allyl specific oligonucleotides (ASOs) Solution   Specific mutations examined in the MASDA106 hybridization test   Mutations were selected as candidates for detection tests for complex mutations from seven different genes. The 106 mutations examined include point mutations, deletion mutations, and insertion mutations. Choice Details of the resulting mutations and gene amplifications are listed in Tables 1-8. Table 1. Provides details of diseases and mutations tested using MASDA technology       Model systemTable 2a Testing of Cystic Fibrosis Mutations with 8 CFTR Amplifications Table 2b Test of cystic fibrosis mutation with 9 CFTR amplifications Table 3: β-Thalassemia and Sickle Cell Anemia Determined by β-Globin Gene Amplification Mutation Table 4: Tay-Sachs mutations examined by HEXA gene amplificationTable 5: Gaucher mutations examined by GCR gene amplification Table 6: Canavan mutations examined by ASPA gene amplification Table 7: Breast cancer susceptibility mutations determined by BRCA1 amplification Table 8: Fanconi anemia mutations examined by FACC amplification   Oligonucleotide pool Allyl-specific oligonucleotides (AOS) are 17 bases, are synthesized, HPLC purified by on Technologies (Alameda, CA). All Oligonu Nucleotides are quantified spectrophotometrically and are independently hybridized before being pooled. It was tested in the experiment. The specified amount of individual ASOs totaled 106 A SO in a pool, and the pool is desirable for pool hybridization. It was included to include the required amount of each specific ASO determined. Pooh A portion of the filtered ASO was lyophilized and stored at -20 ° C.   Examples of ASOs exhibiting known cystic fibrosis (CF) mutations are presented below. ASO sequence (17 bases)   Examples of ASOs representing wild-type or normal sequences are shown below. ASO sequence (17 bases) Dot blot   The amplified product contains bromophenol blue (0.1% bromophenol Leblue 30ml / 10ml denaturing solution) 1.0N NaOH, 2.0M NaC Denatured with 1,25 mM EDTA pH 8.0 for 5 minutes at room temperature. Degeneration The product is a 96-well dot blot device (Life Technologies, Gaithersburg, MD) On a biotransmembrane (ICN Biomedica1s Inc., Aurora, OH) Was set. The membrane is 2x SSC (0.15M NaCl, 0.015M   (Trisodium citrate) at room temperature for 5 minutes and 80 ° C Heated for 5 minutes. Immediately before use, the membrane is rinsed in distilled water and hybridized. Placed in the Dication solution.   Probe labeling   Some of the 106 pooled AOSs (representing each mutation) were dissolved And resuspended in distilled water and 1x kinase buffer (New England Biolabs, Bev. erly, MA), 0.135 nmole of γ-P-ATP (Dupont, Boston, MA) and 35 units. Knitted T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs, Beverly, MA) The ends were labeled in a single reaction. The labeling reaction solution was kept at 37 ° C. for 1 hour. Ki The efficiency of the enzyme reaction is 0.78 M NaHTwoPOFourCellulos with pH 3.5 buffer Chromatography on poly (ethylene imine) (PET) plates Then, place the plate on Kodak X-Omat X-Ray film (Eastman Kodak Company, Roches ter, NY) at room temperature for 5 minutes.   Hybridization   Hybridization was performed using TMAC hybridization buffer (3.0M).   TMAC, 0.6% SDS, 1 mM EDTA, 10 mM sodium phosphate pH 6.8, 5 × Denhardt'S solution, and 40 μg / ml yeast R Example 1 above with added pooled and radiolabeled AOS contained in NA). The test was performed in a plastic bag containing a similarly conditioned filter.   Genomics spotted in a 96-well series for this protocol The sample is marked by a grid and identified by hybridization. Positive samples can be easily located for later elution and ASO sequencing Was. The signal strength arising from different mutation-positive samples By adjusting the concentration of each mutation-specific oligonucleotide in the solution Optimized. Pool hybridization to obtain a uniform hybridization signal Is the final concentration of each labeled mutant AOS in the ligation 0.008? La The normal unlabeled AOS concentration varied between 1.8 pmol / ml It was varied from 0 to 200-fold excess over the corresponding mutant AOS. Hive Redidation proceeded with shaking at 52 ° C. overnight. Soshi The membrane is removed from the bag and the wash buffer (3.0N TMAC, 0.6% S DS, 1 mM EDTA, 10 mM sodium phosphate pH 6.8) at room temperature For 20 minutes followed by a second wash in the same buffer at 52 ° C for 20 minutes. Was. Once washed, blots are wrapped in plastic wrap and Kodak X-Omat X-Ray fil m (Eastman Kodak Company, Rochester, NY) at -80 ° C for 15 minutes to 1 hour Was.   Example 3: Separation of hybridized ASO   Pool positive samples from hybridizations performed as in Example 2 Processed as follows: Positive spots are taken with a standard one-hole paper punch It is cut into a disc shape from a nylon membrane. Each cut membrane disk is separate Into a 0.315 ml small centrifuge tube containing 100 μl of sterile water, The tubes are kept at 100 ° C. for 15 minutes. (FIG. 4)   Example 4 Design of Complementary Oligonucleotides for Identification of Limited ASO Total   The sequence of the multimer can be determined directly by chemical sequencing. Or the multimer Combined with complementary oligonucleotides containing other sequences in addition to the sequence complementary to the multimer Can be used. In these cases, a process to form an extension product containing additional sequences Acting as a primer, the extension product is DNA sequenced.   Identification of specific mutations A. By chemical cleavage   ASO hybridized to each mutation-positive sample eluted ASO and sequenced Determined and identified. "C" and "G" for a pool of 106 ASOs Sequencing of only the bases is sufficient to clearly identify the ASO sequence and the DNA sample Allowed the unambiguous identification of the corresponding mutations within. With pool hybridization The area of the membrane containing each identified mutation-positive sample was excised and Biot The rans Membrane disc is placed in 100 ml of distilled water and Heated for 0 minutes to elute the bound ASO. After cooling to room temperature, The disc was discarded and the eluted ASO was chemically sequenced.   The solid-phase chemical cleavage of ASO bound to a solid support has been described by Rosenthal et al. (32) Made by the method, with minor changes. This method can be used in one reaction tube. All bound ASOs could be sequenced simultaneously. Before chemical cleavage A labeled piece (6 m) of CCS paper (32) to bind the ASO to the solid support mx 3 mm) in each tube containing the eluted ASO, 65 ° C For 1 hour. All pieces of paper were combined with one 5 ml containing 25 ml of distilled water. It was placed in a 0 ml tube. And the paper is distilled water three times at room temperature (25ml / wash ) Washed (30 sec / wash) followed by 96% ethanol (25 ml / wash) 3 times (30 seconds / wash). ASO-bound paper mixes with each other It can be washed together without any trouble.   Once washed, the paper is air-dried, each piece is cut in two, and one third is "G Assigned to "Chemical Cleavage Reaction, 2/3 Assigned to" C "Chemical Cleavage Reaction Was done. All "C" -reacted ASO-solid supports were combined with 1 ml of 4.0 M Placed in one tube containing droxylamine HCl pH6. "G" A piece of paper fitted for the modification of the reaction was 1 ml of 50 mM formylation solution. Monium pH 3.5 and 7 ml of DMS was added. "G" and " For each of the C "reactions, the reaction was incubated at room temperature for 10 or 20 minutes. Was done. A batch of more than 100 sequencing reactions results in a mixture of cleavage products It was done without conflict.   Washing was performed on the batch of "C" reaction paper and the batch of "G" reaction paper with the above AS. Washing was performed as after the binding of O to the solid support. The paper is then air-dried and The strips were placed at selected locations in a 96-well amplification tray.   Freshly prepared to dissociate and elute the sequencing products from the solid support membrane Piperidine (50 μl of 10% (vol / vol) piperidine) was added to each well. The tray is covered with a rubber gasket and heated at 90 ° C for 30 minutes. It was kept warm in the circulatory organ. The cleavage products eluted for each cleavage reaction The piperidine solution is transferred to a new 96-well amplification tray and the piperidine is evaporated. Was fired. The evaporation step was repeated twice with 50% ethanol (35 μl / well) Returned. ASO cleavage products are 4 ml loading color prior to determination by gel electrophoresis Element (90% formamide, 1x TBE, 0.1% bromophenol blue , 0.1% xylene cyanol). Gel for sequencing (20% poly) (Crylamide / 8M urea / TBE) is run at 200V for 1 hour in advance, Sample is loaded and electrophoresis moves bromophenol blue dye 14 cm from origin Continued until you do. Sequencing gel is available on Kodak X-Omat X-ray film 24-48 Time exposed. B. Enzymatic sequencing   Mutation-positive samples were identified and spots were cut as described for chemical cleavage. And ASO eluted. The eluted samples were each Microcon-1 0TMPlaced in a concentrator (Amicon Inc., Beverly, MA) at 14,000 rpm for 30 minutes Centrifuged in a benchtop microfuge. Both concentrators hit once Each well was washed twice with 100 μl of distilled water. (Microcon-3TMConcentrator vs. Corresponding Microcon-10TMWashed with eluate from the concentrator. Eluted ASO is Microcon-3TM20 μl per rinse from the top of the concentrator Three consecutive rinses with distilled water were collected and the fractions were pooled. The sample was UniVapoTMIn the thickener (Integrated Separation Systems, Natick, MA) Lyophilized and redissolved in 5 μl of distilled water to identify the eluted ASO Primers for sequencing in enzymatic sequencing protocols designed for It was used. The sequencing reaction was performed using a specific AS (77 bases) specific AS A 3 'region (17 bases) as a primer binding site uniquely complementary to O and " ASO-specific identifier sequence "consisting of a second unique region (17 bases) Oligonucleotide template. The sequencing product was eluted ASO Binds to the complementary region of the unique template and acts as a primer, downstream of ASO specific Only if circular sequencing to reveal the identity of the "identifier sequence" is permitted Was observed.   For the cycle sequencing reaction, ASO specific template (5fM / template), Thermosequena 0.5 μl of se buffer concentrate (Amersham Life Science, Cleveland, OH), Thermoseque 0.125 μl nase (32 U / μl) and “G” termination mixture (15 mM dATP, 15 mM dCTP, 15 mM dTTP, 15 mM 7-deaza-dGTP, and 15 mM dGTP) or “G” termination mixture (15 mMdATP, 15 mM dGTP, 15 mM dTTP, 15 mM 7-deaza-dCTP, and 15 mM dCTP) A total volume of 6 μl of the mixture is included. The cycle sequence reaction is performed at 95 ° C for 30 seconds. And 30 cycles at 70 ° C for 1 minute, and then kept at 70 ° C for 2 minutes. The sequence reaction product Analyzed on a 15% acrylamide / 7M urea gel, then at -70 ° C for about 16 hours, Kodak X-Oma t Exposure to X-ray film.   The following include the complement of the R334W CF mutation-specific ASO previously identified herein. It is an example of some complementary oligonucleotides. Example 1: ASO as a sequencing primer SEQ ID NO: 62   In this embodiment, ASO is complemented with a complementary oligonucleotide by a Sanger sequencing reaction. Incubated with otide and sequenced directly. Example 2: Elution ASO cycle sequence SEQ ID NO: 63   In this embodiment, ASO is used as a primer for one extension reaction . Next, using universal primers as primers for the sequencing reaction , A cycle sequence reaction is performed on the extension reaction product (see Example 5 described later). ). Example 3: Amplification of complementary oligonucleotides for Sanger sequencing reaction SEQ ID NO: 64  In this embodiment, ASO is used as a primer for one extension reaction . Next, using the universal primer sequence and ASO as amplification primers Amplify the extension reaction product. Finally, oligonucleotides corresponding to the sequence target Using the peptide as a primer, a Sanger sequencing reaction was performed on the amplification product. (See Example 6 described later). Example 5: Cycle sequence reaction of various ASOs A) Extension reaction   Isolation having the sequence 5'-TTCCAGAGGATGATTCC-3'SEQ ID NO: 65, termed R334W Containing the reaction composition necessary for one extension reaction To the reaction mixture. The complementary oligonucleotide (Example 2 of Example 4 above) has a 5 ' Contains a universal primer sequence at the end and is separated from the 3 'end by 25 to 30 bases. Includes R334W complementary sequence. The extension reaction includes the following components:     25μl separation ASO     5μl 10x buffer (0.5mM Tris-HCl (pH7.5), 0.1M MgClTwo, 10mM dithiole Itor)     1μl dNTP (2.5M each)     1 μl complementary oligonucleotide (100 ng / ml)     13 μl HTwoO     1 μl (DNA polymerase) Klenow fragment (10 U / μl) The reaction was allowed to proceed at room temperature for 30 minutes. B) Cycle sequence reaction:   According to the following method, a part of the above reaction solution is subjected to two or more Add to the PCR reaction mixture containing the nucleotide analog (ddNTP):     10 μl extension reaction product     5μl 10x buffer (300mM Tris-HCl (pH9.0), 50mM MgClTwo, 300mM KCl)     5μl universal primer (1pM)     10 μl 2 mM ddATP, ddCTP, ddGTP; dATP, dCTP, dGTP, dTTP     19 μl HTwoO     1 μl Taq polymerase (10 U / μl) 30 cycles of amplification are performed and the nucleotides downstream of the universal primer sequence A heterogeneous series of random termination products is produced, terminating at positions corresponding to PCR The products of the reaction are then separated on a denaturing polyacrylamide gel and the ASO-specific Band pattern is generated. Transfer the electrophoresis pattern by radiography or fluorometry. Analyze by standard method. Example 6: Amplification and sequencing of complementary oligonucleotides   Isolation having the sequence 5'-TTCCAGAGGATGATTCC-3'SEQ ID NO: 65, termed R334W The resulting mutation-specific oligonucleotide was used for an extension reaction as in A) of Example 5. Add to the reaction mixture containing the reaction components. Complementary oligonucleotide (see above example) Example 3) of 4) includes a universal primer sequence, a “label” sequence, Ence target "sequence, followed by the complementary sequence of R334W at the 3 'end. Add a portion of the reaction to an amplification mixture containing the following components:   3 μl extension reaction product   1 μl universal amplification primer (10 μM)   2.5μ1 dATP, dTTP, dCTP, dGTP (2mM each)   2μl 40mM MgClTwo   5 μl 100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 500 mM KCl   26.4μl HTwoO   0.1μl AmpliTaq DNA polymerase (5U / μl)   Next, the GeneAmp PCR System 9600 Thermocycler was used to test the reaction solution for 35 cycles. Cleavage amplification was performed. Next, collect 2 μl of the amplified product and use Sanger sequencing. And performed a Sanger sequencing reaction. Example 7: RNA as target nucleic acid   In the same manner as in Example 1 in which DNA is described as the target nucleic acid, RNA is also Used as A) Preparation of RNA from target cells   Cells are harvested by centrifugation and the supernatant is removed. Dissolve the cell mass in cold lysis buffer (140 mM NaCl , 1.5mM MgClTwo, 1.0 mM Tris-HCl (pH 8.5), 0.5% NP-40, Rnasin (registered trademark, Promeg) a, inc.)). Centrifuge the cell mass at 5000 xg for 5 minutes at 4 ° C. Let it settle. Transfer the supernatant to a new tube and adjust the EDTA concentration to 10 mM. Protein Was purified with phenol-chloroform saturated with 10 mM aqueous Tris-HCl (pH 8.5). Removal by extraction. Cool the aqueous layer with sodium acetate (pH 5.2) and 2.5 times the volume of ice Add ethanol and sediment at 10 ° C overnight, and centrifuge at 10,000 xg, 4 ° C for 30 minutes. To Thus, the RNA is recovered. B) Conversion of RNA to cDNA prior to amplification   In the method of the present invention, RNA is used directly or by reverse transcription PCR. Is converted to amplified DNA. According to this method, 1 μg of RNA is converted to 100 pmol Primer, 1 mM dNTP, 20 μl PCR buffer (50 mM KCl, 20 mM Tris (pH 8.4) , 2.5mM MgClTwo1) U / μl Rnasin® in) and 200 U reverse run Mix with scriptase. Mix at 23 ° C for 10 minutes, then at 42 ° C for 45 minutes, then at 95 ° C Incubate for 5 minutes, then quench. To amplify the resulting cDNA, the procedure described in Example 1 was used. The same conventional PCR method as used can be used. Example 8: Specific discriminating molecular probe   Identification of separated polymers using chemical or enzymatic sequencing reactions Instead, each probe is labeled with a specific discriminating molecule that can be detected directly or indirectly. It is also possible to label the dimer. What is described below is based on Illustrates some of a wide variety of specific discriminating molecular probes that may be useful for It's just A) Fluorescent label   In a similar manner as described in Example 2 above, the immobilized target nucleic acid and The nucleotide is hybridized. However, each ASO in the sample is replaced with 32P. Labeled with a specific fluorescent probe. For example, ΔF508M, G542XM, G55IDM, ASO, referred to as R553XM and Texas Red, Tetramethylrhodamine, Labeled with olecein and Cy3, respectively. As in Example 3, the bound ASO was Binding is detected before separation. In this example, the binding of the ASO was bound Detected by the fluorescence of the label, visually or by some automated method You. After separation, ASO is clearly defined by measuring light emission in response to fluorescence excitation. Can be identified. B) Molecular weight label     In a similar manner as described in Example 2 above, the immobilized target nucleic acid and The lid nucleotide is hybridized. However, each ASO in the sample is specific Further labeling with various molecular weight modifications. For example, the four described in Example 8A ASOs have different lengths of hexaethylene oxide (HEO) 5 'multimer tails Derivatized using A designated ΔF508M, G542XM, G55IDM, and R553XM SO can be labeled with 5, 10, 15, and 20 HEO units, respectively. The tail is Addition using standard DNA synthesis methods as described in Nucleic Acid Res, 22: 4527 Is done. HEO tails do not participate in hydrogen bonding but give each ASO a specific molecular weight You. ASO can be performed without further modification by any generally accepted method (eg, gel Or capillary electrophoresis) to identify the separated ASOs by molecular weight. Can be identified. C) Other molecular weight labeling methods   A further use of hybridization polymer identification by molecular weight is in the use of target nucleic acids. By adding several additional nucleotides enzymatically to the polymer after separation from is there. In a preferred embodiment of the method, the separated polymer is an immobilized target core. After hybridization with the acid, the poly is used to probe the target nucleic acid. Tubes containing several oligonucleotides each complementary to one of the Collected. In addition to the portion complementary to the polymer, the oligonucleotide has more It contains additional sequences of specific length to itself. Polymers and oligonucleotides When the hybrids hybridize, the polymer then enzymatically extends the polymer It can be used as a primer to make a full-length complementary oligonucleotide. This During the reaction, the direct or indirect labels described above are incorporated. Elongated Ligonucleotides may be synthesized by any established method (eg, gel or capillary electrophoresis). ) Can be identified by measuring the relative molecular weight of the labeled product. Example 9: Ligation of polymer   To identify the probe polymer that has completely hybridized to the sample, Gating based methods are known. At the junction of adjacent polymer probes In order to distinguish between perfect and incomplete hybridization in Ligation is often used in such methods. This is especially Is useful for determining genetic variation (Landegren et al., 1988, Science 24 1: 1078). LCR is one method of amplifying a ligated product, It can be used to obtain a sufficient quantity of the product to determine the presence or absence of the target sequence. Gap- LCR reduces the background value generated by target-independent ligation, It is a decorated LCR. Other ligation-dependent amplification methods have been previously mentioned. In FIG. Some examples of ligation methods that can be used in the present invention are schematically shown. In these schematics, the polymer (for example, on either side of the genetic mutation site) B) forming a ligation probe. For each set of polymer (or probe) For one, a capture molecule is attached. Hybrid with polymer-immobilized sample After formation and ligation, all non-hybridized polymer Can be washed away. Wash off non-hybridized polymer Is not necessary (especially if large quantities of polymer Non-hybridized polymers are ligated by sequence determination, etc. It can hinder the identification of loaded polymers))). In addition, professional in solution The sample is immobilized because hybridization and ligation of the probe is possible. Need not be. Furthermore, under the conditions used in the ligation reaction, Incomplete hybrid molecules can form. TMAC and strict temperature control are necessary May not be. However, incomplete hybrid molecules do not ligate and Therefore, it is not recognized as a false positive because it is not identified.   Amplify the ligated product for easier identification. Can be. This is accomplished, for example, by an LCR thermal cycler. Instead The product can also be amplified using other techniques such as PCR. Also, enough of If multimeric probes are used, the ligation product does not need to be amplified Can amplify the total amount of DNA sample before the hybridization step It is.   Hybridized and ligated multimers on solid support Once fixed, the presence or absence of the reporter molecule is then determined. Reporter molecule is present Ligation occurs, and the presence or absence of the target molecule is determined.   Various mechanisms for identifying target sequences specific for ligated multimers are not It will be readily understood by those skilled in the art. FIG. 6 for four such mechanisms -9 and described as "Model" 1-4. Genetic variation in model 1, Is the target nucleic acid sequence, or a random substitution change that causes multimer ligation. The difference is the determination of the base sequence by chemical cleavage of the product, ie, Maxim Gilbert seek. It is identified by the Ens reaction (FIG. 6). In model 2, the ligation product is The nucleotide sequence is determined by a conventional Sanger sequencing reaction. In particular, ligatures After the ligation product is captured on the solid phase, a sequence that hybridizes with the ligation product Added to a mixture of sequences containing rows. The nucleotide sequence is determined and the ligation Product is identified (FIG. 7). In model 3, the ligation product is directly The "S" site of the described ligation product using the upcoming Sanger sequencing method The nucleotide sequence is determined using a variety of primers complementary to the above sequence. Next, the base sequence The determination uses primers complementary to the common 3 'region added to the "B" probe. (Fig. 8). In model 4, the ligation product is a universal primer It is used as a template for linear amplification in elongation base sequence determination. Reaction is solid phase or solution Occurs with products in contact with. The product is limited by the Sanger sequencing method as before The nucleotide sequence is determined using a primer complementary to the sequence (FIG. 9). Example 10 Amplification of ARMS multimer   The refractory mutation amplification system is a well-known PCR-type system for mutation determination. Ming was enforced. For example, a multimer complementary to a sequence suspected of containing a mutation is synthesized. And acts as a primer when hybridizing to the target DNA. field Primers complementary to the sexual sequence are not labeled. Complementary to the mutant sequence The primer is labeled. The second multimer is used in combination with the first primer set. Synthesized and designed to work with primers that enable PCR amplification when used It is. The second multimer binds one of the binding pairs, eg, the PCR product amplified on the solid phase. Attach to biotin which can be captured. Polymer / primer hybrid to sample Form and perform PCR thermocycling. Amplified products are binding partners attached to the surface (Eg, biotin). Amplification product bound to the surface of the support The presence of the signal indicates that the mutant sequence is present in the sample. The binding product is It can be identified by any method, for example, the Sanger sequencing method.   The methodology of the present invention reduces the number of hybridizations involved in performing multiple mutation analyses. On the other hand, methods for processing large amounts of samples are provided herein. Of all diagnostic tests If the number of probes to be used is very large, many independent Performing a hybridisation on a mixture of positive samples is cost-effective. Is the most effective. By using the MASDA method of the present invention, individual samples Disadvantages of hybridization and hybridization of independent probes Can be avoided. Mutation-specific A hybridized to a DNA sample By extracting and analyzing the sequences of the oligonucleotides, MASDA provides a second source. Eliminates the need for standing hybridization. That is, several hundred different samples in one day Hybridizer containing a mixture of several hundred mutation-specific oligonucleotides Can be analyzed at the same time. The hybridized and eluted oligos Multiple lanes of the gel by generating a short single band pattern of nucleotides Multiple samples can be analyzed by the staggered electrophoresis pattern of You. Therefore, identification of specific mutations is limited by the use of currently convenient automated sequencing equipment. Easily run at a rate of more than 150 samples / hour for a pool of 100 positive samples I can do it.   In addition to high sample throughput and analysis of complex mutations, several other advantages There is NASDA technology. MASDA is a very flexible molecular platform You. This is because the number of related genes and the mutations identified for each It is very important in fields such as changing genetic diagnosis. Oligonucleotide in solution Mixing and combining as required by having an otide probe It is. That is, clinical laboratories set up diagnostic tests to be most cost-effective. Can be determined. There is also flexibility in sample preparation and target detection. Sample core The acid can be either DNA or RNA.   As an illustration of the amplification of multiple targets, PCR was utilized during the course of the amplification. But the original Ming MASDA is compatible with any amplification technology and precedes mutation detection and identification No modification of the amplification product is required. This means that many samples can be run in one test It becomes a very important issue when you need to analyze. It is necessary to fragment the sample nucleic acid. As long as it is not necessary, the long PCR products as well as the various amplicons performed in this study Can be analyzed.   At present, the genotype / phenotype association has already Much effort has been put into developing an information database about Noya and new mutations . In addition, the genotype of patients undergoing clinical treatment and their various treatments There is an increasing interest in building relationships between responses. The present invention MA SDA is a tag of a previously identified expressed sequence or identified in the human genome. The creation of an oligonucleotide library indicated by the biallelic marker It would be easier.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １.以下の工程を含む、核酸試料の標的配列中の１つ以上の遺伝的変化の同定の 方法： （i）１つまたはより多くの核酸試料の支持体上への固定； （ii）プリン及びピリミジンを含む個々の多量体が上記の固定した試料中の相補 的な標的配列とハイブリッド形成する条件下での上記の固定した試料と様々なプ リン及びピリミジンを含む多量体との同時的接触；および （iii）ハイブリッド形成したプリン及びピリミジンを含む多量体を同定して、 ハイブリッド形成したプリン及びピリミジンを含む多量体の同定により上記の遺 伝的変化を同定する。 ２.さらにハイブリッド形成したプリン及びピリミジンを含む多量体を上記の固 定した試料から同定の工程に先立って分離する事を含む請求項１の方法。 ３.以下の工程を含む核酸試料中に存在する１つ以上の標的配列の同定方法： （i）支持体上への１つ以上の核酸試料の固定； （ii）プリン及びピリミジンを含む個々の多量体が、上記の固定した試料中の相 補的な標的配列とハイブリッド形成する条件下での上記の固定した試料と様々な プリン及びピリミジンを含む多量体との同時的接触；および （iii）ハイブリッド形成したプリン及びピリミジンを含む多量体を同定して、 ハイブリッド形成したプリン及びピリミジンを含む多量体の同定により上記の標 的配列を同定する。 ４.さらにハイブリッド形成したプリン及びピリミジンを含む多量体を上記の固 定した試料から同定の工程に先立って分離する事を含む請求項３の方法。 ５.核酸試料は１つ以上の標的配列を含んでいると考えられる場合の請求項３の 方法。 ６.標的配列がウィルス、細菌、真菌類、及び原生動物の核酸配列からなる群か ら選択される請求項３の方法。 ７.以下の工程を含む、核酸試料中に存在する標的配列中の１つ以上のランダム に入れ替った遺伝的変化の同定方法： （i）支持体上に１つ以上の核酸試料の固定； （ii）プリン及びピリミジンを含む個々の多量体が、上記の固定した試料中の相 補的な標的配列とハイブリッド形成する条件下での上記の固定した試料と様々な プリン及びピリミジンを含む多量体との同時的接触；および （iii）ハイブリッド形成したプリン及びピリミジンを含む多量体を同定して、 ハイブリッド形成したプリン及びピリミジンを含む多量体の同定により上記の遺 伝的変化を同定する。 ８.上記のハイブリッド形成したプリン及びピリミジンを含む多量体を上記の固 定した試料から、同定の工程に先立って分離する請求項７の方法。 ９.固定の工程に於ける支持体が固相支持体、または半固相支持体である請求項 １、３、または７の方法。 １０.上記の同定の工程においてハイブリッド形成したプリン、及びピリミジン を含む多量体の塩基配列の決定が含まれる請求項１、３、または７の方法。 １１.遺伝的変化にヌクレオチドの挿入、欠如または置換が含まれる請求項１の 方法。 １２.核酸試料に１つ以上の遺伝的変化を含むと考えられる場合の請求項１の方 法。 １３.遺伝的変化が、嚢胞性繊維症、βサラセミア症候群、テイサックス病、鎌 形赤血球貧血、及びゴーシュ病からなる群から選択される病気に付随する、請求 項１２の方法。 １４.プリン及びピリミジンを含む多量体がおよそ１６から２５ヌクレオチドの 長さである請求項１の方法。 １５.標的配列を固定する工程に先立って、該配列を核酸試料から増幅する請求 項１の方法。 １６.増幅した配列がおよそ８０塩基対から３０Ｋ塩基対の長さである請求項１ の方法。 １７.固相支持体としてニトロセルロース膜、ナイロン膜、グラスビーズ、及び プラスチックからなる群から選択される請求項９の方法。 １８.半固相支持体として多量体ゲル、及びアガロースからなる群から選択され る請求項１の方法。 １９.上記の接触の工程において、およそ同じ長さの上記のプリン及びピリミジ ンを含む多量体と上記の標的配列の間に形成されるハイブリッドの融解温度が不 釣り合いにならないような効果の濃度の試薬が存在する請求項１の方法。 ２０.試薬が第４アンモニウム塩である場合の請求項１９の方法。 ２２.以下の同定工程を含む請求項１の方法： (a)上記のハイブリッド形成したプリン及びピリミジンを含む多量体と(i)上記の 多量体に相補的な配列、および(ii)付加的なあらかじめ決めた同一線型に並んだ 配列、を含む相補的な様々なオリゴヌクレオチドとの接触； (b)上記の多量体はプライマーとして、相補的なオリゴヌクレオチドは酵素によ る配列決定のための鋳型として用いる、酵素反応的な塩基配列決定；および (c)上記の多量体の存在の指標として、前もって決めた、同一線上にならんだ配 列を同定すること。 ２３.同定の工程に以下のものが含まれる請求項１の方法： (a)上記のハイブリッド形成したプリン及びピリミジンを含む多量体と(i)上記の 多量体に相補的な配列、および(ii)付加的なあらかじめ決めた同一線上に並んだ 配列、を含む相補的な様々なオリゴヌクレオチドとの接触； (b)上記の多量体をプライマーとして、相補的なオリゴヌクレオチドを鋳型とし て用いる１回の伸長反応； (c)伸長反応による産物の酵素反応による塩基配列決定；および (d)上記の多量体の存在を示す、前もって決めた、同一線上にならんだ配列の同 定。 ２４.プリン及びピリミジンの多量体に各々独自の分子量を持つように分子量の 修飾をするために、分子量修飾成分を付与する請求項１の方法。 ２５.プリン及びピリミジンの多量体に検出可能な標識をする請求項１の方法。 ２６.上記の固定した試料に対しハイブリッド形成しなかったプリン及びピリミ ジンを含む多量体を上記の同定の工程の前に除く請求項１の方法。[Claims] 1. Identification of one or more genetic alterations in a target sequence of a nucleic acid sample, comprising the steps of: Method: (I) immobilizing one or more nucleic acid samples on a support; (Ii) individual multimers, including purines and pyrimidines, complement each other in the fixed sample The immobilized sample described above and various reagents under conditions that hybridize with the Simultaneous contact with multimers containing phosphorus and pyrimidine; and (Iii) identifying a multimer comprising the hybridized purine and pyrimidine, Identification of multimers containing hybridized purines and pyrimidines led to the above Identify genetic changes. 2. In addition, a multimer containing a hybridized purine and pyrimidine may be 2. The method of claim 1 including separating from a defined sample prior to the step of identification. 3. A method for identifying one or more target sequences present in a nucleic acid sample comprising the following steps: (I) immobilizing one or more nucleic acid samples on a support; (Ii) the individual multimers, including purines and pyrimidines, are not The above fixed sample and various conditions under conditions that hybridize to the complementary target sequence Simultaneous contact with multimers containing purines and pyrimidines; and (Iii) identifying a multimer comprising the hybridized purine and pyrimidine, The identification of hybrids containing purines and pyrimidines led to the Identify the target sequence. 4. The multimer containing the hybridized purine and pyrimidine is further purified by 4. The method of claim 3 including separating from the determined sample prior to the step of identification. 5. The method of claim 3, wherein the nucleic acid sample is considered to contain one or more target sequences. Method. 6. Whether the target sequence is a group consisting of nucleic acid sequences of viruses, bacteria, fungi, and protozoa The method of claim 3 selected from: 7. One or more random sequences in the target sequence present in the nucleic acid sample, including the following steps: Method for identifying genetic changes that have been replaced: (I) immobilizing one or more nucleic acid samples on a support; (Ii) the individual multimers, including purines and pyrimidines, are not The above fixed sample and various conditions under conditions that hybridize to the complementary target sequence Simultaneous contact with multimers containing purines and pyrimidines; and (Iii) identifying a multimer comprising the hybridized purine and pyrimidine, Identification of multimers containing hybridized purines and pyrimidines led to the above Identify genetic changes. 8. Multimers containing the hybridized purines and pyrimidines are 8. The method of claim 7, wherein the sample is separated from the determined sample prior to the step of identification. 9. The support in the fixing step is a solid support or a semi-solid support. The method of 1, 3, or 7. 10. Purines and pyrimidines hybridized in the above identification step The method according to claim 1, 3, or 7, which comprises determining the base sequence of a multimer comprising: 11. The method of claim 1, wherein the genetic alteration comprises insertion, deletion or substitution of a nucleotide. Method. 12. The method of claim 1, wherein the nucleic acid sample is considered to contain one or more genetic changes. Law. 13. Genetic changes include cystic fibrosis, beta thalassemia syndrome, Tay-Sachs disease, sickle Associated with a disease selected from the group consisting of red cell anemia and Gauche disease Item 13. The method according to Item 12. 14. Multimers containing purines and pyrimidines of approximately 16 to 25 nucleotides The method of claim 1, wherein the length is a length. 15. Amplification of the target sequence prior to the step of immobilizing the sequence from a nucleic acid sample Item 1. The method of Item 1. 16. The amplified sequence is approximately 80 to 30K base pairs in length. the method of. 17. Nitrocellulose membrane, nylon membrane, glass beads as solid support, and 10. The method of claim 9, wherein the method is selected from the group consisting of plastics. 18. A semi-solid support selected from the group consisting of multimeric gels and agarose 2. The method of claim 1, wherein 19. In said contacting step, said purines and pyrimidis of approximately the same length The melting temperature of the hybrid formed between the multimer containing 2. The method of claim 1, wherein the concentration of the reagent is such that the effect is unbalanced. 20. The method of claim 19 wherein the reagent is a quaternary ammonium salt. 22. The method of claim 1, comprising the following identification steps: (a) a multimer containing the hybridized purine and pyrimidine as described above; Sequences complementary to the multimer, and (ii) additional predetermined collinear alignments Contact with a variety of complementary oligonucleotides, including sequences; (b) The above multimer is used as a primer and the complementary oligonucleotide is used as an enzyme. Enzymatic sequencing used as a template for sequencing; and (c) As an indicator of the presence of the multimer, a predetermined, collinear Identify columns. 23. The method of claim 1, wherein the step of identifying comprises: (a) a multimer containing the hybridized purine and pyrimidine as described above; Sequences that are complementary to the multimer, and (ii) additional predetermined collinear alignments Contact with a variety of complementary oligonucleotides, including sequences; (b) Using the above multimer as a primer and a complementary oligonucleotide as a template One extension reaction used for (c) sequencing of the product of the extension reaction by enzymatic reaction; and (d) the identity of a predetermined, collinear sequence indicating the presence of the above multimer. Fixed. 24. The purine and pyrimidine multimers have molecular weights so that each has its own molecular weight. The method of claim 1, wherein a molecular weight modifying component is provided for the modification. 25. The method of claim 1 wherein the purine and pyrimidine multimers are detectably labeled. 26. Purines and pirimi that did not hybridize to the fixed sample 2. The method of claim 1, wherein the multimer containing gin is removed prior to the step of identifying.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008007571A1 (en) * 2006-07-10 2008-01-17 Olympus Corporation Detection method for nucleic acid

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7291463B2 (en) 1996-01-23 2007-11-06 Affymetrix, Inc. Nucleic acid labeling compounds
US6965020B2 (en) 1996-01-23 2005-11-15 Affymetrix, Inc. Nucleic acid labeling compounds
WO1999015704A1 (en) * 1997-09-23 1999-04-01 Oncormed, Inc. Genetic panel assay for susceptibility mutations in breast and ovarian cancer
JP2003528564A (en) * 1998-06-06 2003-09-30 ジェノスティック ファーマ リミテッド Probes used for genetic profiling
WO2011151405A1 (en) 2010-06-04 2011-12-08 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Constitutively active prolactin receptor variants as prognostic markers and therapeutic targets to prevent progression of hormone-dependent cancers towards hormone-independence
WO2013074962A1 (en) * 2011-11-16 2013-05-23 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Mutation detection in higly homologous genomic regions

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5547839A (en) * 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
JP2802125B2 (en) * 1989-06-23 1998-09-24 キヤノン株式会社 Nucleic acid detection method
JPH06509946A (en) * 1992-06-17 1994-11-10 シティ・オブ・ホープ How to detect and identify nucleic acids
GB9323819D0 (en) * 1993-11-19 1994-01-05 Smithkline Beecham Biolog Anlytical method
US5849483A (en) * 1994-07-28 1998-12-15 Ig Laboratories, Inc. High throughput screening method for sequences or genetic alterations in nucleic acids

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008007571A1 (en) * 2006-07-10 2008-01-17 Olympus Corporation Detection method for nucleic acid

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