ITTO20080894A1 - USE OF THE APTOGLOBINE, APTOGLOBINE-BINDING PEPTIDES, POLYMERS CONTAINING THEMSELVES AND THEIR USE - Google Patents
USE OF THE APTOGLOBINE, APTOGLOBINE-BINDING PEPTIDES, POLYMERS CONTAINING THEMSELVES AND THEIR USE Download PDFInfo
- Publication number
- ITTO20080894A1 ITTO20080894A1 IT000894A ITTO20080894A ITTO20080894A1 IT TO20080894 A1 ITTO20080894 A1 IT TO20080894A1 IT 000894 A IT000894 A IT 000894A IT TO20080894 A ITTO20080894 A IT TO20080894A IT TO20080894 A1 ITTO20080894 A1 IT TO20080894A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- haptoglobin
- peptide
- apoe
- peptides
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 72
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 52
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title claims description 11
- 102000014702 Haptoglobin Human genes 0.000 claims description 60
- 108050005077 Haptoglobin Proteins 0.000 claims description 60
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 claims description 52
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 claims description 52
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 7
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 claims description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 5
- 201000010252 Hyperlipoproteinemia Type III Diseases 0.000 claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 206010060751 Type III hyperlipidaemia Diseases 0.000 claims description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 208000034599 Dysbetalipoproteinemia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 claims description 2
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 claims description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 2
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 claims 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 7
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 6
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 4
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 4
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 4
- 101001130226 Homo sapiens Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 102100031538 Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 206010022822 Intravascular haemolysis Diseases 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 102000001851 Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010015340 Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein-1 Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000036523 atherogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 208000020887 hyperlipoproteinemia type 3 Diseases 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000392810 Inbio Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 235000011483 Ribes Nutrition 0.000 description 1
- 241000220483 Ribes Species 0.000 description 1
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010030694 avidin-horseradish peroxidase complex Proteins 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000003259 immunoinhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 230000008604 lipoprotein metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
DESCRIZIONE DESCRIPTION
del brevetto per invenzione industriale dal titolo: of the patent for industrial invention entitled:
“USO DELL'APTOGLOBINA, PEPTIDI LEGANTI L'APTOGLOBINA, POLIMERI CONTENENTI GLI STESSI E LORO USO” "USE OF APTOGLOBIN, APTOGLOBIN-BINDING PEPTIDES, POLYMERS CONTAINING THE SAME AND THEIR USE"
di BIOINDUSTRY PARK DEL CANAVESE S.P.A. of BIOINDUSTRY PARK DEL CANAVESE S.P.A.
di nazionalità italiana of Italian nationality
con sede: VIA RIBES 5 with registered office: VIA RIBES 5
COLLERETTO GIACOSA (TO) COLLERETTO GIACOSA (TO)
Inventori: ABRESCIA Paolo, BUCCI Enrico, CIGLIANO Luisa, CORPILLO Davide, SALVATORE Alfonso Inventors: ABRESCIA Paolo, BUCCI Enrico, CIGLIANO Luisa, CORPILLO Davide, SALVATORE Alfonso
* * * * * *
La presente invenzione è relativa all’uso dell’aptoglobina, a peptidi leganti l’aptoglobina, a polimeri contenenti gli stessi e al loro uso. The present invention relates to the use of haptoglobin, haptoglobin-binding peptides, polymers containing the same and their use.
Stato dell’Arte State of the art
L’apolipoproteina E (ApoE) è una proteina che nell’uomo si compone di 299 aminoacidi, trasporta le lipoproteine, le vitamine liposolubili e il colesterolo nel sistema linfatico e quindi nel sangue. E’ sintetizzata principalmente nel fegato, ma si trova anche in altri tessuti, tra cui il cervello, i reni e la milza. Nel sistema nervoso, è sintetizzata principalmente dai tipi cellulari non neuronali, soprattutto l’astroglia e la microglia, mentre i neuroni esprimono i recettori per ApoE. Apolipoprotein E (ApoE) is a protein that in humans is made up of 299 amino acids, transports lipoproteins, fat-soluble vitamins and cholesterol into the lymphatic system and then into the blood. It is synthesized mainly in the liver, but is also found in other tissues, including the brain, kidneys and spleen. In the nervous system, it is mainly synthesized by non-neuronal cell types, especially astroglia and microglia, while neurons express the receptors for ApoE.
Ad oggi, sono stati identificati 7 recettori per ApoE, To date, 7 ApoE receptors have been identified,
Rinaldo PLEBANI 1 (Iscrizione Albo nr.358/BM) tutti appartenenti alla famiglia dei recettori per le LDL. ApoE è una proteina essenziale per il normale catabolismo delle lipoproteine e dei trigliceridi. Inizialmente, ApoE è stata identificata come un attore importante nel metabolismo delle lipoproteine e nei disordini cardiovascolari. Più recentemente, è emerso un importante ruolo di ApoE anche in molte condizioni patologiche e fisiologiche non legate direttamente al trasporto delle lipoproteine, tra cui la regolazione della risposta immune e l’apprendimento. Rinaldo PLEBANI 1 (Registration nr. 358 / BM) all belonging to the family of LDL receptors. ApoE is an essential protein for the normal catabolism of lipoproteins and triglycerides. Initially, ApoE was identified as a major player in lipoprotein metabolism and cardiovascular disorders. More recently, an important role of ApoE has also emerged in many pathological and physiological conditions not directly linked to the transport of lipoproteins, including the regulation of the immune response and learning.
Difetti in ApoE sono stati riscontrati nella disbetalipoproteinemia familiare (iperlipoproteinemia di tipo III), in cui livelli elevati di colesterolo e trigliceridi circolanti sono correlati alla alterata rimozione dal circolo dei chilomicroni, delle VLDL e delle LDL. Defects in ApoE have been found in familial dysbetalipoproteinemia (type III hyperlipoproteinemia), in which elevated levels of circulating cholesterol and triglycerides are related to impaired removal from the circulation of chylomicrons, VLDLs and LDLs.
Nel sistema nervoso ApoE è particolarmente abbondante, e sembra giocare un ruolo particolarmente importante. In particolare, oltre al ben noto ruolo come fattore di rischio per l’Alzheimer esercitato da una particolare isoforma della proteina, alterazioni di ApoE sono state descritte in neonati a rischio di paralisi cerebrale. Inoltre, nel liquor cerebrospinale (CSF) questa apolipoproteina, in forma libera o lipidata, gioca ruoli apparentemente importanti per la aggregazione o Rinaldo PLEBANI 2 (Iscrizione Albo nr.358/BM) solubilizzazione di β-amiloide, fenomeni alla base rispettivamente della neurodegenerazione da Alzheimer e del trasporto di β-amiloide al torrente ematico [Sadowski M, et al. e Chan W et al.]. Particelle simili alle HDL, contenenti ApoE e colesterolo, sono presenti nel CSF [Demeester N et al.] e possono veicolare β-amiloide ai neuroni attraversando la barriera ematoencefalica (BBB) [Donahue JE et al.]. La transcitosi di queste lipoproteine e del corrispondente carico di colesterolo e β-amiloide dal CSF al sangue avviene grazie ai recettori per ApoE presenti sulle cellule endoteliali dei capillari cerebrali [Rebeck GW et al.]. ApoE is particularly abundant in the nervous system, and appears to play a particularly important role. In particular, in addition to the well-known role as a risk factor for Alzheimer's exerted by a particular isoform of the protein, alterations of ApoE have been described in infants at risk of cerebral palsy. Furthermore, in the cerebrospinal fluid (CSF) this apolipoprotein, in free or lipidated form, plays apparently important roles for the aggregation o Rinaldo PLEBANI 2 (Registration nr. 358 / BM) solubilization of β-amyloid, phenomena at the base respectively of the neurodegeneration from Alzheimer's disease and β-amyloid transport to the bloodstream [Sadowski M, et al. and Chan W et al.]. HDL-like particles, containing ApoE and cholesterol, are present in CSF [Demeester N et al.] And can carry β-amyloid to neurons by crossing the blood brain barrier (BBB) [Donahue JE et al.]. The transcytosis of these lipoproteins and of the corresponding cholesterol and β-amyloid load from the CSF to the blood occurs thanks to the ApoE receptors present on the endothelial cells of the cerebral capillaries [Rebeck GW et al.].
Nel torrente ematico, ApoE è coinvolta sia nell’aterogenesi che nella risposta infiammatoria. In the bloodstream, ApoE is involved in both atherogenesis and the inflammatory response.
Per quel che riguarda la risposta infiammatoria e la sua regolazione, è stata inizialmente dimostrata un’attività modulatoria di ApoE sui linfociti, descritta in origine come un’attività immuno-inibitoria delle LDL in vitro [Macy M et al., Akeson AL et al., Cuthbert JA et al., Hui DY et al.]. Questa attività è stata successivamente assegnata ad ApoE; in particolare, sia multimeri di ApoE che lipoproteine contenenti ApoE hanno dimostrato di inibire la proliferazione indotta da antigene su colture di linfociti [Dyer CA et al., Kelly ME et al., Mistry MJ et al., Laskowitz DT et al.]. Inoltre, è stato osservato che ApoE blocca la risposta di tipo I in vivo, modulando l’espressione di IL-12 e l’attività dei linfociti T-helper [K. Ali Circulation Research. 2005;97:922.]. ApoE è prodotta durante la risposta immune dai macrofagi [Basu SK et al., Werb Z et al., Takemura R et al.] che attivano le cellule T mediante presentazione dell’antigene; i linfociti T attivati rilasciano interferon-γ (IFN-γ), il quale a sua volta inibisce l’espressione di ApoE da parte dei macrofagi [Mistry MJ et al.]. Questo implica un’intricata rete di controllo della risposta immune, al cui centro vi è un meccanismo di feed-back mediato da ApoE. Nel topo, la deficienza di ApoE causa un’alterata rimozione dei corpi apoptotici generati dalla risposta infiammatoria, e risulta in una condizione proinfiammatoria sistemica. As regards the inflammatory response and its regulation, a modulatory activity of ApoE on lymphocytes was initially demonstrated, originally described as an immuno-inhibitory activity of LDL in vitro [Macy M et al., Akeson AL et al. ., Cuthbert JA et al., Hui DY et al.]. This activity was subsequently assigned to ApoE; in particular, both ApoE multimers and ApoE-containing lipoproteins have been shown to inhibit antigen-induced proliferation on lymphocyte cultures [Dyer CA et al., Kelly ME et al., Mistry MJ et al., Laskowitz DT et al.]. Furthermore, it has been observed that ApoE blocks the type I response in vivo, modulating the expression of IL-12 and the activity of T-helper lymphocytes [K. Ali Circulation Research. 2005; 97: 922.]. ApoE is produced during the immune response by macrophages [Basu SK et al., Werb Z et al., Takemura R et al.] Which activate T cells through antigen presentation; activated T lymphocytes release interferon-γ (IFN-γ), which in turn inhibits the expression of ApoE by macrophages [Mistry MJ et al.]. This implies an intricate immune response control network, at the center of which is an ApoE-mediated feedback mechanism. In mice, ApoE deficiency causes an altered removal of the apoptotic bodies generated by the inflammatory response, and results in a systemic proinflammatory condition.
Per quel che riguarda invece la patologia aterosclerotica, nella maggioranza dei casi l’aterosclerosi è di fatto un disturbo infiammatorio. Sebbene l’attenzione sia stata inizialmente puntata sull’accumulo dei lipidi nel lume vasale, con la conseguente formazione della placca, l’aterosclerosi trova la sua origine in una simultanea alterazione sia del trasporto dei lipidi, che del potere ossidativo ematico e della risposta immune. In particolare, la progressione nello sviluppo della placca sembra essere guidata da un complesso gioco di citochine e cellule infiammatorie, che vede coinvolte interleuchine, macrofagi e linfociti T. ApoE regola l’efflusso di colesterolo dai macrofagi, oltre che dalle cellule schiumose all’origine della placca aterosclerotica. I linfociti T, regolati da ApoE, partecipano all’accrescimento della placca aterosclerotica, alimentando la risposta infiammatoria contro di essa. La conseguenza della deficienza di ApoE nella patogenesi aterosclerotica è ben documentata ed è stata studiata su un modello murino ApoE-/- disponibile da qualche anno. Tale modello ha evidenziato il ruolo sostanzialmente protettivo di ApoE, la cui mancanza provoca un’estesa aterogenesi. As for atherosclerotic disease, in most cases, atherosclerosis is in fact an inflammatory disorder. Although the attention was initially focused on the accumulation of lipids in the vessel lumen, with the consequent formation of plaque, atherosclerosis finds its origin in a simultaneous alteration of both the transport of lipids, the blood oxidative power and the immune response. . In particular, the progression in plaque development appears to be driven by a complex game of cytokines and inflammatory cells, involving interleukins, macrophages and T lymphocytes. ApoE regulates the outflow of cholesterol from macrophages, as well as from foamy cells at the origin. of atherosclerotic plaque. T lymphocytes, regulated by ApoE, participate in the growth of the atherosclerotic plaque, fueling the inflammatory response against it. The consequence of ApoE deficiency in atherosclerotic pathogenesis is well documented and has been studied on an ApoE - / - mouse model that has been available for some years. This model has highlighted the substantially protective role of ApoE, the lack of which causes extensive atherogenesis.
Attualmente si sta cercando di individuare ligandi di ApoE che blocchino la sua attività per identificare una possibile via attraverso la quale la patologia aterosclerotica può svilupparsi. Currently, efforts are being made to identify ApoE ligands that block its activity to identify a possible route through which atherosclerotic disease can develop.
Si è inoltre alla ricerca di inibitori di tali ligandi in modo che quest’ultima possa svolgere il suo ruolo protettivo contro lo sviluppo della placca aterosclerotica. We are also looking for inhibitors of these ligands so that the latter can play its protective role against the development of atherosclerotic plaque.
L’individuazione di un meccanismo che aumenti il livello di ApoE sarebbe quindi auspicabile; in questo senso, sebbene siano stati fatti tentativi di utilizzo di terapia genica nel modello murino, che in qualche caso hanno portato anche all’innalzamento della proteina circolante, non sono stati ottenuti risultati soddisfacenti. The identification of a mechanism that increases the level of ApoE would therefore be desirable; in this sense, although attempts have been made to use gene therapy in the mouse model, which in some cases have also led to an increase in the circulating protein, satisfactory results have not been obtained.
Scopo della presente invenzione è pertanto quello di individuare ligandi di ApoE che portano ad una deficienza di tale proteina per poter comprendere i meccanismi della patologia aterosclerotica. The aim of the present invention is therefore to identify ApoE ligands which lead to a deficiency of this protein in order to understand the mechanisms of atherosclerotic pathology.
Inoltre scopo della presente invenzione è quello di individuare inibitori di tali ligandi utili nei casi in cui è necessario innalzare l’attività di ApoE in modo che quest’ultima possa svolgere ad esempio il suo ruolo protettivo contro una eccessiva risposta infiammatoria e di conseguenza anche contro lo sviluppo della placca aterosclerotica. Furthermore, the purpose of the present invention is to identify inhibitors of these ligands useful in cases where it is necessary to increase the activity of ApoE so that the latter can perform, for example, its protective role against an excessive inflammatory response and consequently also against the development of atherosclerotic plaque.
Tali scopi sono raggiunti mediante l’uso di aptoglobina secondo le rivendicazioni 1 e 2, mediante i peptidi delle rivendicazioni 3 e 4 ed il loro uso secondo le rivendicazioni 15 e 16. These purposes are achieved through the use of haptoglobin according to claims 1 and 2, through the peptides of claims 3 and 4 and their use according to claims 15 and 16.
Definizioni Definitions
A meno che non sia specificato esplicitamente il contrario, i seguenti termini presentano il significato qui sotto indicato. Unless otherwise explicitly specified, the following terms have the meanings given below.
Nel presente testo per “percentuale di identità” e “% di identità” tra due sequenze di amminoacidi (peptidi) o di acidi nucleici (nucleotidi) si intende la percentuale di residui amminoacidici o nucleotidici identici in posizioni corrispondenti nelle due sequenze allineate in modo ottimale. In this text, "percentage of identity" and "% of identity" between two sequences of amino acids (peptides) or nucleic acids (nucleotides) means the percentage of identical amino acid or nucleotide residues in corresponding positions in the two optimally aligned sequences .
Per determinare la “percentuale di identità” delle due sequenze di amminoacidi o di acidi nucleici, le sequenze vengono tra loro allineate; per raggiungere un confronto ottimale, nelle sequenze possono venire introdotte interruzioni (vale a dire cancellazioni o inserimenti – i quali possono eventualmente essere anche disposti all’estremità delle sequenze) (gap). I residui amminoacidici e nucleotidici in posizioni corrispondenti vengono quindi confrontati. Quando una posizione nella prima sequenza è occupata dal medesimo residuo amminoacidico o nucleotide che occupa la corrispondente posizione nella seconda sequenza, le molecole sono identiche in quella posizione. La percentuale di identità tra due sequenze è funzione del numero di posizioni identiche condivise dalle sequenze [vale a dire % di identità = (numero delle posizioni identiche / numero totale delle posizioni) X 100]. To determine the "percentage of identity" of the two amino acid or nucleic acid sequences, the sequences are aligned with each other; to achieve an optimal comparison, interruptions can be introduced in the sequences (i.e. deletions or insertions - which may possibly also be arranged at the end of the sequences) (gap). The amino acid and nucleotide residues at corresponding positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide that occupies the corresponding position in the second sequence, the molecules are identical in that position. The percentage of identity between two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences [ie% identity = (number of identical positions / total number of positions) X 100].
Secondo una vantaggiosa forma di attuazione, le sequenze hanno la stessa lunghezza. According to an advantageous embodiment, the sequences have the same length.
Vantaggiosamente, le sequenze confrontate non presentano interruzioni (o inserimenti). Advantageously, the compared sequences do not show interruptions (or insertions).
La percentuale di identità può venire ottenuta utilizzando algoritmi matematici. Un esempio non limitativo di un algoritmo matematico utilizzato per il confronto di due sequenze è l’algoritmo di Karlin ed Altschul [Proc. The percentage of identity can be obtained using mathematical algorithms. A non-limiting example of a mathematical algorithm used for the comparison of two sequences is the algorithm of Karlin and Altschul [Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 2264-2268] modificato da Karli ed Altschul [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 5873-5877]. Tale algoritmo è incorporato nei programmi BLASTn e BLASTp di Altschul [Altschul, et al, J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410]. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 2264-2268] modified by Karli and Altschul [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 5873-5877]. This algorithm is incorporated in Altschul's BLASTn and BLASTp programs [Altschul, et al, J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410].
Allo scopo di ottenere allineamenti anche in presenza di una o più interruzioni (o inserimenti) è possibile utilizzare metodi che assegnano una penalità relativamente elevata a ciascuna interruzione (o inserimento) ed una penalità inferiore per ciascun residuo amminoacidico o nucleotidico aggiuntivo nell’interruzione (tale residuo amminoacidico o nucleotide aggiuntivo viene definito come estensione dell’interruzione). Alte penalità determineranno, ovviamente, allineamenti ottimizzati con un minore numero di interruzioni. In order to obtain alignments even in the presence of one or more interruptions (or insertions), it is possible to use methods that assign a relatively high penalty to each interruption (or insertion) and a lower penalty for each additional amino acid or nucleotide residue in the interruption (such amino acid residue or additional nucleotide is defined as the extension of the break). High penalties will, of course, result in optimized alignments with fewer interruptions.
Un esempio di un programma atto a realizzare questo tipo di allineamento è il programma BLAST come descritto in Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402. A questo scopo i programmi BLASTn e BLASTp possono essere utilizzati con i parametri di default. Utilizzando i programmi BLAST viene tipicamente impiegata la matrice BLOSUM62. An example of a program to achieve this type of alignment is the BLAST program as described in Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402. For this purpose the BLASTn and BLASTp programs can be used with the default parameters. When using BLAST programs, the BLOSUM62 matrix is typically used.
Un esempio vantaggioso e non limitativo di un programma per realizzare un allineamento ottimale è GCG Winsconsin Bestfit package [Università del Winsconsin, USA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387]. Anche in questo caso vengono utilizzati i parametri di default che per una sequenza di amminoacidi prevedono una penalità di -12 per una interruzione ed una penalità di -4 per ciascuna estensione. An advantageous and non-limiting example of a program for achieving optimal alignment is GCG Winsconsin Bestfit package [University of Winsconsin, USA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387]. Also in this case the default parameters are used which for a sequence of amino acids provide a penalty of -12 for an interruption and a penalty of -4 for each extension.
Nel presente testo per “percentuale di omologia” e “% di omologia” tra due sequenze di amminoacidi o di acidi nucleici si intende la percentuale di residui amminoacidici o nucleotidi omologhi in posizioni corrispondenti nelle due sequenze allineate in modo ottimale. In this text, "homology percentage" and "homology%" between two amino acid or nucleic acid sequences means the percentage of amino acid residues or homologous nucleotides in corresponding positions in the two optimally aligned sequences.
La percentuale di omologia fra due sequenze viene determinata in modo sostanzialmente identico a quanto sopra descritto per la determinazione della percentuale di identità eccetto per il fatto che nel calcolo vengono considerate anche le posizioni omologhe e non solo le posizioni identiche. The percentage of homology between two sequences is determined in a substantially identical way to that described above for the determination of the percentage of identity except for the fact that homologous positions are also considered in the calculation and not only identical positions.
Per quanto riguarda una sequenza di nucleotidi, due posizioni omologhe presentano due nucleotidi differenti ma che all’interno del proprio codone portano alla codificazione del medesimo amminoacido. As for a sequence of nucleotides, two homologous positions have two different nucleotides but which within their codon lead to the coding of the same amino acid.
Per quanto riguarda una sequenza di amminoacidi, due posizioni omologhe presentano due amminoacidi omologhi, vale a dire amminoacidi dotati di proprietà chimico-fisiche simili, per esempio, amminoacidi appartenenti a medesimi gruppi come: aromatici (Phe, Trp, Tyr), acidi (Glu, Asp), polari (Gln, Asn), basici (Lys, Arg, His), alifatici (Ala, Leu, Ile, Val), con un gruppo idrossi (Ser, Thr), con catena laterale corta (Gly, Ala, Ser, Thr, Met). Ci si aspetta che sostituzioni tra tali amminoacidi omologhi non cambino il fenotipo delle proteine (sostituzioni conservative di amminoacidi). Specifici esempi di sostituzioni conservative sono note in questo campo tecnico e sono descritte in varia letteratura (ad es., Bowie et al., Science, 247:1306-1310 (1990)]. Regarding a sequence of amino acids, two homologous positions have two homologous amino acids, i.e. amino acids with similar physico-chemical properties, for example, amino acids belonging to the same groups such as: aromatics (Phe, Trp, Tyr), acids (Glu , Asp), polar (Gln, Asn), basic (Lys, Arg, His), aliphatic (Ala, Leu, Ile, Val), with a hydroxy group (Ser, Thr), with short side chain (Gly, Ala, Ser, Thr, Met). Substitutions between such homologous amino acids are expected not to change the phenotype of the proteins (conservative amino acid substitutions). Specific examples of conservative substitutions are known in this technical field and are described in various literature (eg, Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990)].
Ulteriori esempi di programmi e/o articoli relativi alla determinazione di allineamenti e delle percentuali di omologia e/o identità sono indicati in, ad esempio, US2008003202, US2007093443, WO06048777. Further examples of programs and / or articles relating to the determination of alignments and percentages of homology and / or identity are indicated in, for example, US2008003202, US2007093443, WO06048777.
Nel presente testo per “posizione corrispondente” si intende una posizione in una sequenza di un polipeptide o di acidi nucleici che corrisponde (si affaccia), a seguito di un allineamento, ad una determinata posizione di una sequenza di riferimento. In this text, "corresponding position" means a position in a sequence of a polypeptide or nucleic acids that corresponds (faces), following an alignment, to a certain position of a reference sequence.
Breve descrizione delle figure Brief description of the figures
Per una migliore comprensione della presente invenzione, essa viene ora descritta anche con riferimento alle figure allegate, che illustrano quanto segue: For a better understanding of the present invention, it is now also described with reference to the attached figures, which illustrate the following:
- la Figura 1 illustra i risultati dell’elettroforesi su gel denaturante e riducente di una miscela di peptidi ottenuta dalla digestione di ApoE con CNBr; - Figure 1 illustrates the results of electrophoresis on denaturing and reducing gel of a mixture of peptides obtained from the digestion of ApoE with CNBr;
- la Figura 2 illustra i risultati dell’elettroforesi su gel denaturante e riducente di una miscela di peptidi ottenuta dalla digestione di ApoE con trombina; - Figure 2 illustrates the results of electrophoresis on denaturing and reducing gel of a mixture of peptides obtained from the digestion of ApoE with thrombin;
- la Figura 3 illustra i peptidi ottenuti dalla frammentazione della sequenza 65-191 di ApoE; Figure 3 illustrates the peptides obtained from the fragmentation of the ApoE sequence 65-191;
- la Figura 4 illustra la percentuale di aptoglobina legata in funzione della concentrazione dei peptidi secondo la presente invenzione. Figure 4 illustrates the percentage of bound haptoglobin as a function of the concentration of the peptides according to the present invention.
Descrizione dettagliata dell’invenzione Detailed description of the invention
E’ stato identificato che l’aptoglobina è un ligando dell’apolipoproteina E e che quindi è utilizzabile per poter identificare e comprendere i meccanismi della patologia aterosclerotica. It has been identified that haptoglobin is a ligand of apolipoprotein E and therefore can be used to identify and understand the mechanisms of atherosclerotic disease.
Secondo un altro aspetto dell’invenzione, l’aptoglobina può essere inoltre utilizzata per la preparazione di un medicamento per la diagnosi di una patologia selezionata nel gruppo costituito da Alzheimer, diabete, patologie cardiovascolari. According to another aspect of the invention, haptoglobin can also be used for the preparation of a medicament for the diagnosis of a pathology selected in the group consisting of Alzheimer's, diabetes, cardiovascular diseases.
L’aptoglobina è una proteina polimorfa, costituita da due catene (α e β) unite tra loro a formare multimeri con stechiometrie diverse. L’aptoglobina è sintetizzata principalmente nel fegato, ma molti altri organi e tessuti sono stati riconosciuti come siti di sintesi di questa proteina [Smeets MB et al., Kalmovarin N et al.]. Haptoglobin is a polymorphic protein, consisting of two chains (α and β) joined together to form multimers with different stoichiometries. Haptoglobin is mainly synthesized in the liver, but many other organs and tissues have been recognized as sites of synthesis of this protein [Smeets MB et al., Kalmovarin N et al.].
L’aptoglobina è nota da molto tempo per la sua capacità di legare l’emoglobina libera e trasportarla al fegato per la sua distruzione catabolica [Sadrzadeh SM et al.]. Haptoglobin has long been known for its ability to bind free hemoglobin and transport it to the liver for its catabolic destruction [Sadrzadeh SM et al.].
Recentemente, è stato descritto il legame fra l’aptoglobina e la principale apolipoproteina ematica, ApoA-I [Porta A et al.]. ApoA-I è il maggior costituente delle HDL e promuove l’efflusso del colesterolo dalle cellule, stimola l’enzima LCAT ad esterificare il colesterolo per il trasporto al fegato, e favorisce la cattura e l’endocitosi delle HDL da parte degli epatociti [Xu S et al, Temel RE et al]. Livelli elevati di aptoglobina, come quelli riscontrabili durante un processo infiammatorio, aboliscono la capacità di ApoA-I di stimolare LCAT [Balestrieri M et al.]. In vitro, è stato dimostrato che un peptide mimetico di ApoA-I, con sequenza corrispondente alla sequenza di ApoA-I identificata per la sua capacità di legare LCAT, spiazza l’aptoglobina da ApoA-I, ripristinando la capacità di quest’ultima proteina di stimolare LCAT anche in presenza di elevate concentrazioni di aptoglobina [Spagnuolo MS et al.]. Recently, the link between haptoglobin and the main blood apolipoprotein, ApoA-I [Porta A et al.] Has been described. ApoA-I is the major constituent of HDL and promotes the efflux of cholesterol from cells, stimulates the LCAT enzyme to esterify cholesterol for transport to the liver, and promotes HDL capture and endocytosis by hepatocytes [Xu S et al, Temel RE et al]. High levels of haptoglobin, such as those found during an inflammatory process, abolish the ability of ApoA-I to stimulate LCAT [Balestrieri M et al.]. In vitro, an ApoA-I mimetic peptide, with sequence corresponding to the ApoA-I sequence identified for its ability to bind LCAT, has been shown to displace haptoglobin from ApoA-I, restoring the ability of the latter protein. to stimulate LCAT even in the presence of high concentrations of haptoglobin [Spagnuolo MS et al.].
Per quel che riguarda l’aterosclerosi, è stato ampiamente dimostrato il coinvolgimento diretto dell’aptoglobina, ed in particolare del suo fenotipo 2-2, che è un fattore di rischio per disordini aterosclerotici e connesse complicazioni cardiovascolari. Possono essere coinvolti molti, distinti meccanismi mediati dall’aptoglobina: per esempio, è risultato che il genotipo dell’aptoglobina è predittivo per quel che riguarda l’accumulo di ferro nella placca, la perossidazione dei lipidi in situ e la quantità di macrofagi ritrovati sulla placca stessa [Levy AP et al.]. As regards atherosclerosis, the direct involvement of haptoglobin has been amply demonstrated, and in particular of its 2-2 phenotype, which is a risk factor for atherosclerotic disorders and related cardiovascular complications. Many distinct haptoglobin-mediated mechanisms may be involved: for example, the haptoglobin genotype has been found to predict iron accumulation in plaque, lipid peroxidation in situ, and the amount of macrophages found on plaque. plaque itself [Levy AP et al.].
E’ infine interessante notare come in studi di popolazione i fenotipi di ApoE e di aptoglobina, che come si è visto sono entrambe coinvolte nella patologia aterosclerotica, quando considerati in combinazione hanno effetto moltiplicativo per quanto riguarda il rischio di patologia aterogenetica, con il rischio massimo osservato in presenza dell’allele 4 di ApoE e del fenotipo 2-2 dell’aptoglobina [Braeckman L et al.]. Finally, it is interesting to note that in population studies the phenotypes of ApoE and haptoglobin, which as we have seen are both involved in atherosclerotic disease, when considered in combination have a multiplicative effect as regards the risk of atherogenetic disease, with the maximum risk observed in the presence of the ApoE allele 4 and the haptoglobin phenotype 2-2 [Braeckman L et al.].
Secondo un ulteriore aspetto dell’invenzione vengono forniti dei peptidi leganti l’aptoglobina comprendenti da 11 a 30 aminoacidi di una sequenza avente il 90% di identità con una sequenza selezionata tra SEQ ID:1 e SEQ ID: 2. According to a further aspect of the invention, haptoglobin-binding peptides are provided comprising from 11 to 30 amino acids of a sequence having 90% identity with a sequence selected between SEQ ID: 1 and SEQ ID: 2.
Vengono inoltre forniti peptidi leganti l’aptoglobina comprendenti da 11 a 30 aminoacidi di una sequenza selezionata tra SEQ ID:1 e SEQ ID: 2. Haptoglobin-binding peptides are also supplied comprising from 11 to 30 amino acids of a sequence selected between SEQ ID: 1 and SEQ ID: 2.
Vantaggiosamente i peptidi secondo l’invenzione sono ligandi selettivi di aptoglobina in grado di competere con ApoE per la formazione di un complesso stabile. Advantageously, the peptides according to the invention are selective haptoglobin ligands capable of competing with ApoE for the formation of a stable complex.
I ligandi ad oggi utilizzati per l’aptoglobina sono anticorpi mono- e policlonali specifici, utilizzati principalmente per saggi diagnostici di tipo nefelometrico o turbidimetrico e per la purificazione mediante immunoaffinità. In particolare, gli anticorpi disponibili hanno applicazione soprattutto nella diagnostica umana, in particolare di emolisi intravascolare, stati infiammatori e oncologici specifici e nella diagnostica veterinaria, ad esempio, per determinare mastiti, disordini respiratori, infezioni in atto. Svantaggiosamente l’utilizzo in vivo su paziente umano a scopo terapeutico dei suddetti anticorpi non è proponibile, perché gli anticorpi non sono umani/umanizzati. The ligands currently used for haptoglobin are specific mono- and polyclonal antibodies, mainly used for diagnostic tests of the nephelometric or turbidimetric type and for purification by immunoaffinity. In particular, the available antibodies are mainly used in human diagnostics, in particular in intravascular haemolysis, specific inflammatory and oncological states and in veterinary diagnostics, for example, to determine mastitis, respiratory disorders, infections in progress. Disadvantageously, the in vivo use of the aforementioned antibodies on human patients for therapeutic purposes is not feasible, because the antibodies are not human / humanized.
Al contrario, molecole di dimensioni ridotte, contenenti uno o più peptidi secondo la presente invenzione, possono essere ingegnerizzate per aumentarne la stabilità e la vita plasmatica e abbassarne l’immunogenicità. Infine, dal punto di vista della produzione, piccoli peptidi presentano costi ridotti e una più facile produzione GMP rispetto ad anticorpi e proteine ricombinanti in genere. On the contrary, small molecules, containing one or more peptides according to the present invention, can be engineered to increase their stability and plasma life and lower their immunogenicity. Finally, from the point of view of production, small peptides have reduced costs and easier GMP production compared to antibodies and recombinant proteins in general.
Preferibilmente, i peptidi secondo la presente invenzione presentano l’estremità N terminale acetilata e/o l’estremità C terminale ammidata e possono essere polipeptidi ricombinanti, polipeptidi sintetici e peptidomimetici. Preferably, the peptides according to the present invention have the acetylated N terminal end and / or the amidated C terminal end and can be recombinant polypeptides, synthetic polypeptides and peptidomimetics.
Secondo un ulteriore aspetto vengono forniti acidi nucleici codificanti i peptidi dell’invenzione, preferibilmente selezionati nel gruppo costituito da RNA, DNA, e cDNA. According to a further aspect, nucleic acids are provided encoding the peptides of the invention, preferably selected from the group consisting of RNA, DNA, and cDNA.
Le sequenze identificate possono essere clonate in una cellula bersaglio, che esprima i peptidi stessi o polipeptidi contenenti la loro sequenza, allo scopo di ottenerne quantità elevate, ed eventualmente di secernere le sequenze prodotte nel mezzo extracellulare, per applicazioni in vitro e in vivo. The identified sequences can be cloned into a target cell, which expresses the peptides themselves or polypeptides containing their sequence, in order to obtain high quantities, and possibly to secrete the sequences produced in the extracellular medium, for in vitro and in vivo applications.
Inoltre, le sequenze aminoacidiche identificate o sequenze ad esse omologhe possono essere clonate all’interno di vettori virali, per ottenere particelle virali altamente funzionalizzate con i peptidi stessi, da usare come agenti ad alta affinità in grado di spiazzare efficientemente ApoE dal suo complesso con aptoglobina. Furthermore, the identified amino acid sequences or sequences homologous to them can be cloned inside viral vectors, to obtain viral particles highly functionalized with the peptides themselves, to be used as high affinity agents able to efficiently displace ApoE from its complex with haptoglobin. .
I peptidi dell’invenzione possono essere inoltre utilizzati anche come monomeri per la preparazione di polimeri sia dendrimerici o lineari. The peptides of the invention can also be used as monomers for the preparation of both dendrimeric or linear polymers.
I peptidi possono essere covalentemente coniugati, in un peptide lineare o ramificato, attraverso un linker di natura peptidica o meno, consistente per esempio ma non esclusivamente in residui di lisina, acido glutammico, zuccheri ramificati o meno, polietilenglicoli. The peptides can be covalently conjugated, in a linear or branched peptide, through a linker of a peptide nature or not, consisting for example but not exclusively in lysine residues, glutamic acid, branched or non-branched sugars, polyethylene glycols.
Alternativamente possono essere preparati multimeri delle sequenze proposte, allo scopo di aumentare l’affinità e/o l’avidità dei peptidi ottenuti. Alternatively, multimers of the proposed sequences can be prepared, in order to increase the affinity and / or avidity of the peptides obtained.
Ancora in alternativa, le sequenze identificate possono essere funzionalizzate con gruppi atti ad aumentarne solubilità, trasporto, emivita serica, stabilità, oppure in grado di migliorarne la farmacocinetica, includendo tra le modifiche a titolo non esclusivo l’aggiunta di gruppi carichi, di glicani e/o glucosidi, gruppi fosforici, gruppi acetile, gruppi eteroaromatici più o meno coniugati. Still alternatively, the identified sequences can be functionalized with groups able to increase their solubility, transport, serum half-life, stability, or able to improve their pharmacokinetics, including among the modifications, but not exclusively, the addition of charged groups, glycans and / or glycosides, phosphoric groups, acetyl groups, more or less conjugated heteroaromatic groups.
I peptidi, come tali o in forma di polimeri, possono essere formulati in una composizione farmaceutica con eccipienti, solubilizzanti, stabilizzanti, al fine di ottenere uno o più prodotti con migliorate proprietà farmacologiche. The peptides, as such or in the form of polymers, can be formulated in a pharmaceutical composition with excipients, solubilizers, stabilizers, in order to obtain one or more products with improved pharmacological properties.
Inoltre i peptidi, singolarmente, sotto forma di polimero o formulati in una composizione farmaceutica, possono essere utilizzati per la preparazione di un medicamento per il trattamento di una patologia selezionata nel gruppo costituito da aterosclerosi, disbetalipoproteinemia, disordini cardiovascolari, ipercolesterolemia, infiammazione acuta, infiammazione cronica. Furthermore, the peptides, individually, in the form of a polymer or formulated in a pharmaceutical composition, can be used for the preparation of a medicament for the treatment of a pathology selected in the group consisting of atherosclerosis, dysbetalipoproteinemia, cardiovascular disorders, hypercholesterolemia, acute inflammation, inflammation chronic.
In alternativa possono anche essere utilizzati per l’isolamento di aptoglobina in un campione biologico, preferibilmente sangue, plasma, siero, liquor cerebrospinale. Alternatively, they can also be used for the isolation of haptoglobin in a biological sample, preferably blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid.
Vantaggiosamente è possibile utilizzare i peptidi dell’invenzione per legare l’aptoglobina libera, in modo da diminuirne il titolo e diminuirne quindi la capacità di interferire con ApoE. In questo caso, i peptidi possono essere funzionalizzati ad esempio ad un supporto solido per trattamento extracorporeo, che funzioni da filtro molecolare per la cattura dell’aptoglobina, oppure possono essere utilizzati in combinazione con anticorpi per marcare l’aptoglobina circolante allo scopo di rimuoverla con tecniche note. Advantageously, it is possible to use the peptides of the invention to bind free haptoglobin, in order to decrease its titer and therefore decrease its ability to interfere with ApoE. In this case, the peptides can be functionalized for example to a solid support for extracorporeal treatment, which functions as a molecular filter for the capture of haptoglobin, or they can be used in combination with antibodies to label the circulating haptoglobin in order to remove it with known techniques.
Inoltre, la possibilità di isolare l’aptoglobina trova applicazione quando è necessario purificare aptoglobina a partire da liquidi biologici, ad esempio mediante cromatografia di affinità. Furthermore, the possibility of isolating haptoglobin finds application when it is necessary to purify haptoglobin starting from biological liquids, for example by affinity chromatography.
Infine, in quelle applicazioni veterinarie in cui è necessario determinare la quantità di aptoglobina presente in diversi liquidi biologici (come ad esempio sangue o latte), è possibile utilizzare i peptidi secondo l’invenzione, eventualmente utilizzando anche un anticorpo secondario per evidenziare la presenza di aptoglobina e quantificarne il livello. Finally, in those veterinary applications in which it is necessary to determine the amount of haptoglobin present in different biological liquids (such as blood or milk), it is possible to use the peptides according to the invention, possibly also using a secondary antibody to highlight the presence of haptoglobin and quantify its level.
La cattura extracorporea di aptoglobina può trovare applicazione laddove sia necessaria la determinazione e/o la purificazione dell’aptoglobina o di alcune sue isoforme, ad esempio nella diagnostica umana (emolisi intravascolare, stati infiammatori e oncologici specifici), nella diagnostica veterinaria (mastiti, disordini respiratori, infezioni in atto) o per la preparazione di aptoglobina purificata (ad esempio a scopo di ricerca, come standard per test diagnostici, come metodo per preparare la proteina per applicazioni terapeutiche). Extracorporeal capture of haptoglobin can find application where the determination and / or purification of haptoglobin or some of its isoforms is necessary, for example in human diagnostics (intravascular haemolysis, specific inflammatory and oncological states), in veterinary diagnostics (mastitis, disorders respiratory infections, ongoing infections) or for the preparation of purified haptoglobin (e.g. for research purposes, as a standard for diagnostic tests, as a method of preparing the protein for therapeutic applications).
Secondo la presente invenzione viene inoltre fornito un anticorpo monoclonale che riconosce specificamente uno dei peptidi secondo l’invenzione. According to the present invention, a monoclonal antibody is also provided which specifically recognizes one of the peptides according to the invention.
Ulteriori caratteristiche della presente invenzione risulteranno dalla descrizione che segue di alcuni esempi meramente illustrativi e non limitativi. Further characteristics of the present invention will emerge from the following description of some merely illustrative and non-limiting examples.
ESEMPI EXAMPLES
Esempio 1 Example 1
Identificazione dei siti di legame per l’aptoglobina sulla proteina ApoE. Identification of binding sites for haptoglobin on the ApoE protein.
La digestione di ApoE con CNBr è stata effettuata secondo un metodo standard, come riportato da Innerarity et al. [J Biol Chem. 1983;258:12341-12347], usando 13,5 nmoli di proteina umana purificata [Vinci Biochem, genotipo E3]. Digestion of ApoE with CNBr was performed according to a standard method, as reported by Innerarity et al. [J Biol Chem. 1983; 258: 12341-12347], using 13.5 nmoles of purified human protein [Vinci Biochem, genotype E3].
La frammentazione è risultata in una miscela di peptidi diversi. Si è quindi proceduto ad effettuare una elettroforesi su gel denaturante e riducente (18% di acrilammide) della miscela di peptidi ottenuta; l’elettroforesi è stata condotta come descritto da Schagger et al. [Anal Biochem. 1987;166:368-379]. Dopo l’elettroforesi, i gel sono stati fissati in acido acetico al 10% contenente 25% isopropanolo, e sono quindi stati colorati con Coomassie R-250 (0,05% nella soluzione di fissaggio) e decolorati in 10% acido acetico. Il risultato è riportato in Figura 1. Fragmentation resulted in a mixture of different peptides. An electrophoresis was then carried out on a denaturing and reducing gel (18% acrylamide) of the mixture of peptides obtained; electrophoresis was conducted as described by Schagger et al. [Anal Biochem. 1987; 166: 368-379]. After electrophoresis, the gels were fixed in 10% acetic acid containing 25% isopropanol, and were then stained with Coomassie R-250 (0.05% in the fixing solution) and decoloured in 10% acetic acid. The result is shown in Figure 1.
Per identificare i peptidi in grado di legare aptoglobina, l’elettroforesi è stata ripetuta omettendo il passaggio di colorazione e fissazione. Si è proceduto quindi ad un esperimento di western blotting, come descritto da Porta et al. [Zygote 1999;7:67-77]. In particolare, le proteine sono state trasferite sotto l’azione di un campo elettrico, utilizzando una unità per il blotting semi-dry [Schleicher & Schuell, Dassel, Germany], per 3 h a 4°C. La membrana è stata incubata per una notte a 4°C con 0,1 mg/ml di aptoglobina in TBS (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) contenente 0,05% Tween-20 (T-TBS). Dopo ripetuti lavaggi con lo stesso tampone, la membrana è stata trattata (1 h, 37°C) con anticorpo antiaptoglobina rabbit anti-Hpt IgG (diluizione 1:100 in T-TBS), e subito dopo la membrana è stata incubata (1 h, 37°C) con anticorpo secondario GAR-HRP IgG (diluizione 1:300), per essere quindi sviluppata mediante incubazione con 0,02% H2O2 e 4 mM 4-cloro-1-naftolo. To identify the peptides capable of binding haptoglobin, the electrophoresis was repeated omitting the staining and fixation step. A western blotting experiment was then carried out, as described by Porta et al. [Zygote 1999; 7: 67-77]. In particular, the proteins were transferred under the action of an electric field, using a semi-dry blotting unit [Schleicher & Schuell, Dassel, Germany], for 3 h at 4 ° C. The membrane was incubated overnight at 4 ° C with 0.1 mg / ml of haptoglobin in TBS (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) containing 0.05% Tween-20 (T- TBS). After repeated washing with the same buffer, the membrane was treated (1 h, 37 ° C) with rabbit anti-Hpt IgG anti-haptoglobin antibody (dilution 1: 100 in T-TBS), and immediately afterwards the membrane was incubated (1 h, 37 ° C) with secondary GAR-HRP IgG antibody (dilution 1: 300), to be then developed by incubation with 0.02% H2O2 and 4 mM 4-chloro-1-naphthol.
Le bande ottenute per western-blotting corrispondono a peptidi di ApoE in grado di legare aptoglobina, e sono mostrate in Figura 1; le corrispondenti bande del gel colorato mediante Coomassie sono quindi state tagliate, tripsinizzate e identificate mediante spettrometria di massa HPLC-ESI con tecniche standard. In particolare, la banda a 24 KDa che mostra maggiore reattività per l’aptoglobina è risultata corrispondere a due frammenti di ApoE, che coprono gli aminoacidi 65-272 e 68-272 rispettivamente. Per restringere ulteriormente il sito di legame con aptoglobina, si è effettuata una digestione di ApoE con trombina. Il taglio con trombina produce due frammenti (residui 1-191 e 216-299 rispettivamente), che sono stati esaminati per la loro capacità di legare aptoglobina esattamente come descritto per i peptidi derivati da taglio con CNBr. Il frammento di dimensioni maggiori è risultato legare aptoglobina, come illustrato in Figura 2, incrociando i dati delle due digestioni appare evidente che il sito di legame di ApoE per l’aptoglobina deve essere compreso tra gli aminoacidi D65 e R191. The bands obtained by western-blotting correspond to ApoE peptides capable of binding haptoglobin, and are shown in Figure 1; the corresponding bands of the Coomassie colored gel were then cut, trypsinized and identified by HPLC-ESI mass spectrometry with standard techniques. In particular, the 24 KDa band showing greater reactivity for haptoglobin was found to correspond to two fragments of ApoE, which cover amino acids 65-272 and 68-272 respectively. Digestion of ApoE with thrombin was performed to further narrow the binding site with haptoglobin. Thrombin cleavage yields two fragments (residues 1-191 and 216-299 respectively), which were examined for their ability to bind haptoglobin exactly as described for CNBr cleavage-derived peptides. The larger fragment was found to bind haptoglobin, as shown in Figure 2, by crossing the data of the two digestions it is clear that the binding site of ApoE for haptoglobin must be between the amino acids D65 and R191.
Esempio 2 Example 2
Sintesi di peptidi contenenti il sito di legame di ApoE per l’aptoglobina Synthesis of peptides containing the ApoE binding site for haptoglobin
La sequenza 65-191 di ApoE, identificata come contenente il sito di legame per l’aptoglobina, è stata suddivisa in nove peptidi parzialmente sovrapposti, la cui sequenza è riportata in Figura 3. La sintesi è stata effettuata con chimica Fmoc standard in fase solida [Inbios Srl, Napoli], e tutti i peptidi sono stati biotinilati in posizione N terminale e amidati in posizione C terminale. La purezza di tutti i peptidi è risultata superiore al 98%, come evidenziato dal tracciato HPLC e dall’analisi di spettrometria di massa effettuata dal fornitore. The ApoE sequence 65-191, identified as containing the binding site for haptoglobin, was split into nine partially overlapping peptides, the sequence of which is shown in Figure 3. The synthesis was carried out with standard solid phase Fmoc chemistry [Inbios Srl, Naples], and all the peptides were biotinylated in the N terminal position and amidated in the C terminal position. The purity of all peptides was higher than 98%, as evidenced by the HPLC trace and by the mass spectrometry analysis carried out by the supplier.
Esempio 3 Example 3
Test di legame all’aptoglobina dei peptidi e loro identificazione Haptoglobin binding test of peptides and their identification
Allo scopo di identificare fra i 9 peptidi dell’esempio 2 quelli capaci di legare l’aptoglobina, è stata effettuata una batteria di test ELISA, essenzialmente come descritto in letteratura [Spagnuolo MS et al.]. In particolare, i pozzetti delle apposite piastre di microtitolazione sono stati incubati per una notte con 1 μg di aptoglobina in 50 μl di coating buffer (7 mM Na2CO3, 17 mM NaHCO3, 1,5 mM NaN3, pH 9,6) a 10°C. Aliquote di 55 μl di ogni peptide biotinilato (1, 3, 10, 30 μM) sono state incubate nei pozzetti (1 h a 37°C). I peptidi legati sono stati rivelati mediante incubazione con 60 μl di Avidin-HRP (diluizione 1:10000 in T-TBS con 0,25% BSA). Il colore sviluppato a 492 nm è stato quantificato per via spettrofotometrica come descritto in letteratura [Porta A et al. Zygote. 1999;7:67-77]. In order to identify among the 9 peptides of example 2 those capable of binding haptoglobin, an ELISA test battery was carried out, essentially as described in the literature [Spagnuolo MS et al.]. In particular, the wells of the appropriate microtiter plates were incubated overnight with 1 μg of haptoglobin in 50 μl of coating buffer (7 mM Na2CO3, 17 mM NaHCO3, 1.5 mM NaN3, pH 9.6) at 10 ° C. 55 μl aliquots of each biotinylated peptide (1, 3, 10, 30 μM) were incubated in the wells (1 h at 37 ° C). Bound peptides were revealed by incubation with 60 μl of Avidin-HRP (dilution 1: 10000 in T-TBS with 0.25% BSA). The color developed at 492 nm was quantified by spectrophotometry as described in the literature [Porta A et al. Zygote. 1999; 7: 67-77].
I risultati ottenuti hanno dimostrato che le sequenze SEQ ID:1 (<88>ETRARLSKELQAAQARL<104>), presente in PE2 e PE3 come da Figura 3, e SEQ ID:2 (<131>EELRVRLASHLRKLRKLRLL<150>), presente in PE5 e PE6 come da Figura 3, costituiscono due diversi siti di legame di ApoE per l’aptoglobina. The results obtained showed that the sequences SEQ ID: 1 (<88> ETRARLSKELQAAQARL <104>), present in PE2 and PE3 as shown in Figure 3, and SEQ ID: 2 (<131> EELRVRLASHLRKLRKLRLL <150>), present in PE5 and PE6 as shown in Figure 3, constitute two different binding sites of ApoE for haptoglobin.
Esempio 4 Example 4
Test di competizione in vitro dei peptidi In vitro competition test of peptides
Allo scopo di testare in vitro l’attività dei peptidi identificati, sono stati condotti degli esperimenti ELISA di competizione fra ApoE e i peptidi per il legame all’aptoglobina. In particolare, i pozzetti delle micropiastre utilizzate sono stati preincubati con ApoE, come descritto per l’aptoglobina nell’esempio 3. Sono quindi state preparate miscele di aptoglobina (1 μM) con ciascuno dei peptidi esaminati (0, 1, 5, 10, o 20 μM) in CB-TBS buffer (5mM CaCl2, 0,2% BSA, 130 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,3); queste miscele sono state quindi tenute 2 h a 37°C e quindi incubate nei pozzetti con ApoE (2 h, 37°C). I peptidi sono stati utilizzati in forma lipidata; la lipidazione è stata condotta con le procedure descritte da Sparks et al.[Biochemistry. 1999;38:1727-1735]. Come anticorpi primari per la rivelazione della formazione dei complessi aptoglobina-ApoE, sono stati usati rabbit anti-Hpt IgG (60 μl diluiti 1:1500 in T-TBS con 0,25% BSA). Come anticorpo secondario, è stato usato GAR-HRP IgG (65 μl di una diluizione 1:3000, 1 h a 37°C). Il colore sviluppato a 492 nm è stato quantificato per via spettrofotometrica come descritto in letteratura [Porta A et al. Zygote. 1999;7:67-77]. I campioni sono stati analizzati in triplicato. In Figura 4 è riportata la percentuale di aptoglobina legata in funzione della concentrazione di ogni peptide competitore utilizzato nel test. I dati relativi al peptide PE4, PE8 e PE9 non sono mostrati, perché in questo saggio questi peptidi hanno mostrato forte aggregazione. E’ evidente che i peptidi PE5 e PE6, contenenti la sequenza In order to test the activity of the identified peptides in vitro, ELISA competition experiments were conducted between ApoE and the peptides for binding to haptoglobin. In particular, the wells of the microplates used were pre-incubated with ApoE, as described for haptoglobin in Example 3. Mixtures of haptoglobin (1 μM) were then prepared with each of the peptides examined (0, 1, 5, 10, or 20 μM) in CB-TBS buffer (5mM CaCl2, 0.2% BSA, 130 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.3); these mixtures were then kept 2 h at 37 ° C and then incubated in the wells with ApoE (2 h, 37 ° C). The peptides were used in lipid form; lipidation was carried out with the procedures described by Sparks et al. [Biochemistry. 1999; 38: 1727-1735]. Rabbit anti-Hpt IgG (60 μl diluted 1: 1500 in T-TBS with 0.25% BSA) were used as primary antibodies for the detection of the formation of haptoglobin-ApoE complexes. As a secondary antibody, GAR-HRP IgG (65 μl of a 1: 3000 dilution, 1 h at 37 ° C) was used. The color developed at 492 nm was quantified by spectrophotometry as described in the literature [Porta A et al. Zygote. 1999; 7: 67-77]. Samples were analyzed in triplicate. Figure 4 shows the percentage of bound haptoglobin as a function of the concentration of each competitor peptide used in the test. Data for the peptide PE4, PE8 and PE9 are not shown, because in this assay these peptides showed strong aggregation. It is evident that the peptides PE5 and PE6, containing the sequence
<131>EELRVRLASHLRKLRKLRLL<150>(SEQ ID:2), riescono a competere in maniera più efficiente degli altri con la proteina intera. Pertanto, questa sequenza peptidica, utilizzata a dosi opportune, è in grado di liberare ApoE dall’interazione con aptoglobina. <131> EELRVRLASHLRKLRKLRLL <150> (SEQ ID: 2), are able to compete more efficiently than others with the whole protein. Therefore, this peptide sequence, used at appropriate doses, is able to free ApoE from interaction with haptoglobin.
Inoltre, nella stessa figura è evidente come un certo grado di attività sia mostrato anche dal peptide PE2, contenente la sequenza<88>ETRARLSKELQAAQARL<104>(SEQID:1), già identificata nell’esempio 3 come legante l’aptoglobina. Furthermore, in the same figure it is evident how a certain degree of activity is also shown by the PE2 peptide, containing the sequence <88> ETRARLSKELQAAQARL <104> (SEQID: 1), already identified in example 3 as a haptoglobin binder.
Claims (18)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT000894A ITTO20080894A1 (en) | 2008-12-02 | 2008-12-02 | USE OF THE APTOGLOBINE, APTOGLOBINE-BINDING PEPTIDES, POLYMERS CONTAINING THEMSELVES AND THEIR USE |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT000894A ITTO20080894A1 (en) | 2008-12-02 | 2008-12-02 | USE OF THE APTOGLOBINE, APTOGLOBINE-BINDING PEPTIDES, POLYMERS CONTAINING THEMSELVES AND THEIR USE |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ITTO20080894A1 true ITTO20080894A1 (en) | 2010-06-03 |
Family
ID=41404565
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
IT000894A ITTO20080894A1 (en) | 2008-12-02 | 2008-12-02 | USE OF THE APTOGLOBINE, APTOGLOBINE-BINDING PEPTIDES, POLYMERS CONTAINING THEMSELVES AND THEIR USE |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
IT (1) | ITTO20080894A1 (en) |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5168045A (en) * | 1989-08-18 | 1992-12-01 | The Scripps Research Institute | Diagnostic systems and methods using polypeptide analogs of apolipoprotein e |
US5177189A (en) * | 1989-08-18 | 1993-01-05 | The Scripps Research Institute | Polypeptide analogs of Apolipoprotein E |
WO1999045950A2 (en) * | 1998-03-11 | 1999-09-16 | Duke University | Methods of suppressing microglial activation |
WO2002015923A1 (en) * | 2000-08-24 | 2002-02-28 | The Regents Of The University Of California | Orally administered peptides to ameliorate atherosclerosis |
WO2003026479A2 (en) * | 2001-09-21 | 2003-04-03 | Cognosci, Inc. | Methods of suppressing microglial activation |
WO2004001421A2 (en) * | 2002-06-21 | 2003-12-31 | Innogenetics N.V. | Method for the diagnosis and differential diagnosis of neurological diseases |
US6930085B2 (en) * | 2002-04-05 | 2005-08-16 | The Regents Of The University Of California | G-type peptides to ameliorate atherosclerosis |
WO2007000584A1 (en) * | 2005-06-28 | 2007-01-04 | Ai2 Limited | Treatment of fungal and/or protist infections |
-
2008
- 2008-12-02 IT IT000894A patent/ITTO20080894A1/en unknown
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5168045A (en) * | 1989-08-18 | 1992-12-01 | The Scripps Research Institute | Diagnostic systems and methods using polypeptide analogs of apolipoprotein e |
US5177189A (en) * | 1989-08-18 | 1993-01-05 | The Scripps Research Institute | Polypeptide analogs of Apolipoprotein E |
WO1999045950A2 (en) * | 1998-03-11 | 1999-09-16 | Duke University | Methods of suppressing microglial activation |
WO2002015923A1 (en) * | 2000-08-24 | 2002-02-28 | The Regents Of The University Of California | Orally administered peptides to ameliorate atherosclerosis |
WO2003026479A2 (en) * | 2001-09-21 | 2003-04-03 | Cognosci, Inc. | Methods of suppressing microglial activation |
US6930085B2 (en) * | 2002-04-05 | 2005-08-16 | The Regents Of The University Of California | G-type peptides to ameliorate atherosclerosis |
WO2004001421A2 (en) * | 2002-06-21 | 2003-12-31 | Innogenetics N.V. | Method for the diagnosis and differential diagnosis of neurological diseases |
WO2007000584A1 (en) * | 2005-06-28 | 2007-01-04 | Ai2 Limited | Treatment of fungal and/or protist infections |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
D'ANDREA LUCA D ET AL: "Peptides reproducing the ApoA-I 141-164 region: Studies on Hpt recognition", UNDERSTANDING BIOLOGY USING PEPTIDES SPRINGER, 233 SPRING STREET, NEW YORK, NY 10013, UNITED STATES, 2006, & 19TH AMERICAN PEPTIDE SYMPOSIUM; SAN DIEGO, CA, USA; JUNE 18 -23, 2005, pages 449 - 450, XP009127623 * |
JUNG S M ET AL: "Both plasma retinol-binding protein and haptoglobin precursor allele 1 in CSF: Candidate biomarkers for the progression of normal to mild cognitive impairment to Alzheimer's disease", NEUROSCIENCE LETTERS, LIMERICK, IE, vol. 436, no. 2, 9 May 2008 (2008-05-09), pages 153 - 157, XP022613103, ISSN: 0304-3940, [retrieved on 20080318] * |
WEISGRABER K H ET AL: "The receptor-binding domain of human apolipoprotein E. Monoclonal antibody inhibition of binding.", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 25 OCT 1983, vol. 258, no. 20, 25 October 1983 (1983-10-25), pages 12348 - 12354, XP002562339, ISSN: 0021-9258 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Osbourn et al. | HpARI protein secreted by a helminth parasite suppresses interleukin-33 | |
Schmidt et al. | Rational engineering of a minimized immune inhibitor with unique triple-targeting properties | |
Nykiforuk et al. | Expression and recovery of biologically active recombinant Apolipoprotein AIMilano from transgenic safflower (Carthamus tinctorius) seeds | |
Silva-Álvarez et al. | Echinococcus granulosus Antigen B binds to monocytes and macrophages modulating cell response to inflammation | |
Zhang et al. | Staphylococcus aureus expresses a cell surface protein that binds both IgG and β2-glycoprotein I | |
KR20210027377A (en) | Fusion protein containing progranulin | |
Domingo-Espín et al. | Site-specific glycations of apolipoprotein AI lead to differentiated functional effects on lipid-binding and on glucose metabolism | |
PT1534320E (en) | Apolipoprotein l-i for the treatment of trypanosomal diseases | |
US20150031621A1 (en) | Method for purification of complement factor h | |
Ke et al. | Chemical composition-oriented receptor selectivity of L5, a naturally occurring atherogenic low-density lipoprotein | |
JP2022526334A (en) | Methods of Treatment of Tauopathy Disorders by Targeting New Tau Species | |
JP5679992B2 (en) | Composite and production method | |
Oldoni et al. | Naturally occurring variants in LRP1 (low-density lipoprotein receptor–related protein 1) affect HDL (high-density lipoprotein) metabolism through ABCA1 (ATP-binding cassette A1) and SR-B1 (scavenger receptor class B type 1) in humans | |
Zhou et al. | Soluble expression and sodium channel activity of lt16a, a novel framework XVI conotoxin from the M-superfamily | |
Kieselbach et al. | A segment corresponding to amino acids Val170‐Arg182 of bovine arrestin is capable of binding to phosphorylated rhodopsin | |
Deng et al. | Role of conserved proline residues in human apolipoprotein A-IV structure and function | |
ITTO20080894A1 (en) | USE OF THE APTOGLOBINE, APTOGLOBINE-BINDING PEPTIDES, POLYMERS CONTAINING THEMSELVES AND THEIR USE | |
Sauer et al. | Separation of truncated basic fibroblast growth factor from the full-length protein by hydrophobic interaction chromatography | |
Lamarca et al. | Two isoforms of PSAP/MTCH1 share two proapoptotic domains and multiple internal signals for import into the mitochondrial outer membrane | |
Lepage et al. | The self-association of two N-terminal interaction domains plays an important role in the tetramerization of TRPC4 | |
WO2022177990A2 (en) | Modified sars-cov-2 spike polypeptides and nanoparticles thereof | |
Song et al. | ATP synthase β-chain overexpression in SR-BI knockout mice increases HDL uptake and reduces plasma HDL level | |
Worms et al. | Expression, purification and stabilization of human serotonin transporter from E. coli | |
US8993518B2 (en) | Compositions and methods for treating antiphospholipid syndrome | |
US20140303353A1 (en) | Methods for processing coagulation factors |