IT202100003080A1 - A METHOD FOR CAPTURING BACTERIA FROM SUSPENSION AND RELATED DEVICE - Google Patents
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Description
UN METODO PER LA CATTURA DI BATTERI DA SOSPENSIONI A METHOD FOR CAPTURING BACTERIA FROM SUSPENSION
E RELATIVO DISPOSITIVO AND RELATED DEVICE
Campo dell?Invenzione Field of Invention
La presente invenzione si riferisce a un metodo per la cattura di batteri da loro sospensioni liquide, utile ad esempio per la determinazione rapida della carica batterica e per l?allestimento rapido di antibiogrammi senza l?utilizzo di colture batteriche. L?invenzione si riferisce inoltre a un dispositivo per realizzare questo metodo, comprendente uno o pi? supporti, per esempio vetrini da microscopio, funzionalizzati nei confronti dei batteri. The present invention refers to a method for capturing bacteria from their liquid suspensions, useful for example for the rapid determination of the bacterial load and for the rapid preparation of antibiograms without the use of bacterial cultures. The invention further relates to a device for carrying out this method, comprising one or more? supports, for example microscope slides, functionalized against bacteria.
Stato dell?Arte State of art
? noto che i batteri presenti in sospensioni liquide hanno una tendenza naturale ad accumularsi all?interfaccia aria-liquido. L?accumulo di batteri all?interfaccia arialiquido ? un fenomeno studiato, in particolare, in campo ambientale, poich? gioca un ruolo importante in molti ambienti naturali: i batteri si accumulano nei micro-strati superficiali dei sistemi acquatici, dove si concentrano molecole organiche fonte di nutrimento quali lipidi, proteine, e polisaccaridi, formando una comunit? batterica che comunque ? una popolazione ragionevolmente rappresentativa di quella presente anche nella massa della sospensione. ? It is known that bacteria present in liquid suspensions have a natural tendency to accumulate at the air-liquid interface. The accumulation of bacteria at the air-liquid interface? a phenomenon studied, in particular, in the environmental field, since? plays an important role in many natural environments: bacteria accumulate in the superficial micro-layers of aquatic systems, where organic molecules are concentrated as sources of nourishment such as lipids, proteins, and polysaccharides, forming a community bacterial that anyway ? a reasonably representative population of that also present in the bulk of the suspension.
? noto, pi? in generale, che i microorganismi tendono ad accumularsi vicino ai confini tra fasi eterogene che si creano tra diversi sistemi, come per esempio le interfacce solido-liquido, liquido-liquido e gas-liquido. Questo perch? le interfacce sono siti di accumulo di nutrienti organici e inorganici e quindi attirano i microorganismi in cerca di nutrienti. Il fenomeno con cui i batteri e altri organismi si spostano secondo uno stimolo chimico presente nel loro ambiente ? noto come chemiotassi. Alcuni studi hanno valutato l?effetto dell?idrofobicit? della parete cellulare dei batteri sul loro accumulo all?interfaccia aria-liquido. Tra i tanti lavori presenti in letteratura, si veda ad esempio Schaefer A. et al. Environ. Sci. Technol. 1998, 32, 3704-3712, dove ? riportato uno studio sull?accumulo all?interfaccia aria-liquido di batteri appartenenti a quattro diversi ceppi con differente grado di idrofobicit? della loro parete cellulare batterica, studiati sia in sistemi statici sia in sistemi dinamici grazie allo sviluppo di bolle di aria all?interno del liquido. I risultati di questi esperimenti hanno mostrato che tutti i ceppi batterici testati si accumulavano all?interfaccia aria-liquido in entrambi i casi, sia nel sistema statico, sia in quello dinamico, con un maggior grado di accumulo all?interfaccia da parte dei batteri aventi la parete cellulare con una maggiore caratteristica idrofobica. ? known, more in general, that microorganisms tend to accumulate near the boundaries between heterogeneous phases that are created between different systems, such as for example the solid-liquid, liquid-liquid and gas-liquid interfaces. This why? interfaces are sites of accumulation of organic and inorganic nutrients and therefore attract microorganisms in search of nutrients. The phenomenon whereby bacteria and other organisms move according to a chemical stimulus present in their environment? known as chemotaxis. Some studies have evaluated the effect of hydrophobicity? of the bacterial cell wall on their accumulation at the air-liquid interface. Among the many works present in the literature, see for example Schaefer A. et al. Environs. Sci. Technol. 1998, 32, 3704-3712, where? reported a study on the accumulation at the air-liquid interface of bacteria belonging to four different strains with different degrees of hydrophobicity? of their bacterial cell wall, studied both in static and dynamic systems thanks to the development of air bubbles inside the liquid. The results of these experiments showed that all bacterial strains tested accumulated at the air-liquid interface in both cases, both in the static and dynamic systems, with a higher degree of accumulation at the interface by bacteria having the cell wall with increased hydrophobic characteristic.
Nello studio sopra menzionato il comportamento dei batteri era considerato rilevante per studiare, ad esempio, i fenomeni di degradazione batterica degli inquinanti in sistemi acquosi. In the aforementioned study, the behavior of bacteria was considered relevant for studying, for example, the phenomena of bacterial degradation of pollutants in aqueous systems.
I batteri per? sono anche di grande interesse medico, poich? possono essere patogeni e dunque provocare negli animali o esseri umani delle infezioni anche gravi, oppure possono diventare patogeni se si trovano in un?area del corpo dove non dovrebbero trovarsi, oppure se il loro numero aumenta troppo, come pu? accadere in organismi debilitati in caso di abbassamento delle difese immunitarie. The bacteria for? are also of great medical interest, since? they can be pathogenic and therefore cause even serious infections in animals or humans, or they can become pathogenic if they are in an area of the body where they shouldn't be, or if their number increases too much, how can it? occur in debilitated organisms in case of lowering of the immune system.
Storicamente, nel combattere le infezioni causate da batteri, gli antibiotici sono stati fondamentali, basti pensare alla penicillina e alla sua produzione industriale per fronteggiare il diffondersi delle infezioni nei militari durante la II Guerra Mondiale, che rappresent? una vera e propria rivoluzione nel mondo della medicina. E ancora oggi gli antibiotici sono farmaci essenziali per curare le infezioni causate da batteri, come le polmoniti batteriche o le setticemie, ma anche per proteggere i pazienti con difese immunitarie ridotte a causa di chemioterapie o malattie croniche prevenendo l?insorgere di infezioni batteriche. Historically, in fighting infections caused by bacteria, antibiotics have been fundamental, just think of penicillin and its industrial production to deal with the spread of infections in the military during World War II, which represented? a real revolution in the world of medicine. And still today antibiotics are essential medicines to treat infections caused by bacteria, such as bacterial pneumonia or septicemia, but also to protect patients with reduced immune defenses due to chemotherapy or chronic diseases by preventing the onset of bacterial infections.
Negli anni, per?, l?uso inappropriato degli antibiotici ha contribuito all?insorgenza della cosiddetta antibiotico-resistenza, dovuta alla comparsa di batteri resistenti agli antibiotici, cos? che il trattamento delle infezioni batteriche con antibiotici pu? diventare pi? lungo e complicato, e talvolta pu? non portare a guarigione. Un esempio di antibiotico-resistenza ? quello di Klebsiella pneumoniae, un batterio spesso trovato nell?intestino umano, dove in condizioni normali ? innocuo; in persone immunocompromesse ed esposte a forme virulente del batterio, esso pu? invece causare gravi infezioni e in alcuni casi anche la morte del paziente. Questo batterio ha sviluppato una resistenza antimicrobica a varie classi di antibiotici, rendendo difficili le cure dei pazienti, specialmente negli ospedali. Over the years, however, the inappropriate use of antibiotics has contributed to the onset of so-called antibiotic resistance, due to the appearance of bacteria resistant to antibiotics, as well as that the treatment of bacterial infections with antibiotics can? become more long and complicated, and sometimes pu? not lead to healing. An example of antibiotic resistance? that of Klebsiella pneumoniae, a bacterium often found in the human intestine, where under normal conditions? harmless; in immunocompromised people and exposed to virulent forms of the bacterium, it can? instead cause serious infections and in some cases even the death of the patient. This bacterium has developed antimicrobial resistance to various classes of antibiotics, making patient care difficult, especially in hospitals.
Tradizionalmente, per identificare una cura efficace di un?infezione batterica si ricorre in ambito clinico ai cosiddetti antibiogrammi, ossia dei test di valutazione in vitro della sensibilit? o della resistenza del batterio a diversi antibiotici, cos? da poter scegliere quello pi? efficace ad inibire il batterio per poi somministrarlo al paziente. Traditionally, in order to identify an effective cure for a bacterial infection, so-called antibiograms are used in the clinical setting, i.e. in vitro sensitivity evaluation tests. or the resistance of the bacterium to various antibiotics, cos? to be able to choose the most? effective at inhibiting the bacterium and then administering it to the patient.
L?antibiogramma tradizionale prevede il prelievo di un campione dal paziente e la formazione di colonie batteriche in terreno di coltura, dopodich? per contatto della superficie del terreno di coltura con dischetti imbevuti dell?antibiotico si osserva la reazione dei batteri con il dischetto, andando a valutare il cosiddetto ?alone di inibizione?. Maggiore ? l?ampiezza dell?alone, maggiore ? l?efficacia dell?antibiotico sulla crescita del batterio presente nel campione e maggiori saranno le probabilit? del paziente di rispondere favorevolmente all?antibiotico. Al contrario, la mancata formazione di un alone o un alone di scarsa ampiezza indicano che l?infezione non risponder? adeguatamente alla terapia con l?antibiotico testato. The traditional susceptibility test involves taking a sample from the patient and forming bacterial colonies in the culture medium, after which by contact of the surface of the culture medium with disks soaked in the antibiotic, the reaction of the bacteria with the disk is observed, evaluating the so-called ?inhibition halo?. Greater ? the? amplitude of the? halo, greater? the effectiveness of the antibiotic on the growth of the bacterium present in the sample and the greater the chances of the patient to respond favorably to the antibiotic. Conversely, a lack of halo formation or a halo of low width indicates that the infection will not respond to infection. adequately to the therapy with the tested antibiotic.
Se la fase diagnostica finale con la scelta della terapia ? molto rapida ed immediata, questo tipo di test ha, tuttavia, tempi troppo lunghi nell?allestimento dell?antibiogramma. Per la crescita delle colonie batteriche si impiegano, infatti, generalmente 1-2 giorni. Questi tempi, che possono raddoppiare o triplicare nel caso di batteri a crescita lenta, sono evidentemente inconciliabili con l?emergenza di cura di certe infezioni. If the final diagnostic phase with the choice of therapy ? very rapid and immediate, however, this type of test takes too long to prepare the antibiogram. In fact, the growth of bacterial colonies generally takes 1-2 days. These times, which can double or triple in the case of slow-growing bacteria, are evidently irreconcilable with the need to cure certain infections.
Esistono poi strumenti pi? rapidi, quali gli spettrometri di massa, ma il loro impiego non ? molto comune poich? si tratta di strumentazione molto costosa, che richiede inoltre personale altamente specializzato per l?uso. Questo ? uno dei motivi per cui certe infezioni continuano ancora oggi ad essere curate con antibiotici a largo spettro, dunque in modo non ottimale e con tempi di remissione pi? lunghi. Are there any more tools? rapid, such as mass spectrometers, but their use is not? very common since? it is a matter of very expensive instrumentation, which also requires highly specialized personnel for use. This ? one of the reasons why certain infections still continue to be treated with broad-spectrum antibiotics, therefore in a non-optimal way and with shorter remission times? long.
Alla luce di quanto esposto sopra, ? tuttora molto sentita nel settore l?esigenza di velocizzare le prove in vitro di resistenza agli antibiotici a partire da campioni biologici prelevati a pazienti cos? da poter emettere in tempi pi? rapidi diagnosi corrette ed impostare le terapie antibiotiche pi? efficaci. In light of the above, The need to speed up the in vitro tests of resistance to antibiotics starting from biological samples taken from such patients is still very much felt in the sector. to be able to issue in more times? rapid correct diagnosis and set the antibiotic therapies pi? effective.
Scopi e sommario dell?Invenzione Purposes and summary of the Invention
? scopo della presente invenzione superare gli inconvenienti summenzionati dell?arte nota. ? object of the present invention to overcome the aforementioned drawbacks of the prior art.
In particolare, un compito della presente invenzione ? quello di rendere disponibile un metodo molto semplice e rapido per la cattura di una quantit? di batteri adeguata a realizzare un antibiogramma. In particular, a task of the present invention ? to make available a very simple and rapid method for the capture of a quantity? of bacteria adequate to perform an antibiogram.
Un altro compito della presente invenzione ? quello di rendere disponibile un metodo che consenta di determinare in modo rapido la carica batterica di un campione analizzato. Another task of the present invention ? that of making available a method that allows the bacterial load of an analyzed sample to be determined quickly.
Ancora, un compito della presente invenzione ? quello di rendere disponibile un dispositivo che garantisca un uso facile ed economico per la cattura di batteri da una sospensione liquida. Again, a task of the present invention ? that of making available a device that guarantees easy and economic use for the capture of bacteria from a liquid suspension.
Questi ed altri scopi della presente invenzione sono raggiunti mediante un metodo e un dispositivo per la cattura di batteri da loro sospensioni liquide in accordo con l?invenzione. These and other aims of the present invention are achieved by a method and a device for capturing bacteria from their liquid suspensions in accordance with the invention.
In accordo con un primo aspetto, l?invenzione riguarda un metodo per la cattura di batteri da una loro sospensione in un liquido. Il metodo prevede le fasi di: In accordance with a first aspect, the invention relates to a method for capturing bacteria by suspending them in a liquid. The method includes the steps of:
(i) predisporre un supporto avente una superficie bioattiva configurata per la cattura di batteri; (i) providing a support having a bioactive surface configured to capture bacteria;
(ii) predisporre una sospensione liquida di batteri; (ii) preparing a liquid suspension of bacteria;
(iii) immergere parzialmente il supporto nella sospensione liquida, in posizione tale che la superficie bioattiva intercetti l?interfaccia aria-liquido della sospensione; (iv) imporre un movimento relativo tra il supporto e la sospensione, cos? da catturare sulla superficie bioattiva una striscia di batteri; (iii) partially immerse the support in the liquid suspension, in such a position that the bioactive surface intercepts the air-liquid interface of the suspension; (iv) impose a relative movement between the support and the suspension, so? to capture a strip of bacteria on the bioactive surface;
(v) estrarre il supporto recante la superficie bioattiva dalla sospensione. (v) extracting the support bearing the bioactive surface from the suspension.
Preferibilmente la superficie bioattiva ? una superficie preventivamente attivata mediante trattamento al plasma oppure una superficie dotata almeno in parte di un rivestimento che favorisce l?adesione di batteri. Il rivestimento della superficie bioattiva pu? comprendere una o pi? tra: poli-L-lisina, molecole con cariche positive, molecole derivate da silani, ossidi metallici con affinit? verso i batteri. Preferably the bioactive surface ? a surface previously activated by plasma treatment or a surface provided at least in part with a coating which promotes the adhesion of bacteria. The bioactive surface coating can understand one or more between: poly-L-lysine, molecules with positive charges, molecules derived from silanes, metal oxides with affinity? towards the bacteria.
In alcune forme di realizzazione la superficie bioattiva comprende inoltre zone aventi un rivestimento funzionalizzato antagonista, adatto cio? a generare uno stimolo chemiotattico negativo e a contrastare i batteri. Preferibilmente il rivestimento funzionalizzato antagonista comprende molecole bioattive antagoniste selezionate tra antibiotici batteriostatici, antibiotici battericidi, e/o anticorpi. Preferibilmente le zone aventi rivestimento funzionalizzato antagonista hanno forma di bande che attraversano l?interfaccia aria-liquido. Preferibilmente i rivestimenti della superficie bioattiva hanno spessore micro-metrico o nano-metrico. In some embodiments, the bioactive surface further comprises regions having an antagonistic, i.e. suitable, functionalized coating. to generate a negative chemotactic stimulus and to counteract bacteria. Preferably the functionalized antagonistic coating comprises antagonistic bioactive molecules selected from bacteriostatic antibiotics, bactericidal antibiotics, and/or antibodies. Preferably the zones having an opposing functionalized coating have the form of bands crossing the air-liquid interface. Preferably the coatings of the bioactive surface have a micro-metric or nano-metric thickness.
Preferibilmente la fase (iv) ? condotta per un tempo compreso tra 15 e 120 minuti, ancor pi? preferibilmente tra 30 e 60 minuti. Preferably phase (iv) ? conducted for a time between 15 and 120 minutes, even more? preferably between 30 and 60 minutes.
Preferibilmente la fase (iv) ? condotta alla temperatura di massima sopravvivenza dei batteri, preferibilmente a circa 37?C. Preferably phase (iv) ? carried out at the temperature of maximum survival of the bacteria, preferably at about 37°C.
In alcune forme di realizzazione, la fase (iv) del metodo comprende porre in rotazione la superficie bioattiva nella sospensione. Preferibilmente la fase (iv) ? condotta ponendo in rotazione la superficie bioattiva a una velocit? compresa tra 40 e 120 rpm, preferibilmente a 60 rpm. In some embodiments, step (iv) of the method comprises rotating the bioactive surface in the slurry. Preferably phase (iv) ? conducted by rotating the bioactive surface at a speed? between 40 and 120 rpm, preferably at 60 rpm.
In alcune forme di realizzazione, il metodo comprende inoltre le fasi di: In some embodiments, the method further comprises the steps of:
- fissare i parametri del metodo; - fix the parameters of the method;
- applicare il metodo in accordo con quanto descritto sopra a una o pi? sospensioni liquide di concentrazione batterica nota; - apply the method in accordance with what is described above to one or more? liquid suspensions of known bacterial concentration;
- contare i batteri catturati in ciascuna sospensione liquida di concentrazione batterica nota; - count the bacteria captured in each liquid suspension of known bacterial concentration;
- ottenere una curva di taratura che mette in relazione le quantit? di batteri catturati e le concentrazioni batteriche note; - obtain a calibration curve that relates the quantities? of bacteria caught and known bacterial concentrations;
- applicare il metodo in accordo con quanto descritto sopra a una sospensione liquida di concentrazione batterica ignota; - apply the method according to what described above to a liquid suspension of unknown bacterial concentration;
- contare i batteri catturati nella sospensione liquida di concentrazione batterica ignota; e - count the bacteria captured in the liquid suspension of unknown bacterial concentration; And
- tramite la curva di taratura, ottenere una stima della concentrazione batterica ignota. - using the calibration curve, obtain an estimate of the unknown bacterial concentration.
In accordo con un secondo aspetto, l?invenzione riguarda un dispositivo per la cattura di batteri da una sospensione liquida. Il dispositivo comprende: In accordance with a second aspect, the invention relates to a device for capturing bacteria from a liquid suspension. The device includes:
- un contenitore adatto a contenere una sospensione liquida di batteri; - a container suitable for containing a liquid suspension of bacteria;
- un supporto comprendente una superficie bioattiva configurata per la cattura di batteri; - a support comprising a bioactive surface configured for the capture of bacteria;
- mezzi di presa configurati per reggere il supporto; e - gripping means configured to hold the support; And
- mezzi di azionamento configurati per imporre un movimento relativo tra la sospensione liquida e il supporto. - actuating means configured to impose a relative movement between the liquid suspension and the support.
Preferibilmente la superficie bioattiva ? una superficie preventivamente attivata mediante trattamento al plasma oppure una superficie dotata almeno in parte di un rivestimento che favorisce l?adesione di batteri. Il rivestimento della superficie bioattiva pu? comprendere una o pi? tra: poli-L-lisina, molecole con cariche positive, molecole derivate da silani, ossidi metallici con affinit? verso i batteri. Preferably the bioactive surface ? a surface previously activated by plasma treatment or a surface provided at least in part with a coating which promotes the adhesion of bacteria. The bioactive surface coating can understand one or more between: poly-L-lysine, molecules with positive charges, molecules derived from silanes, metal oxides with affinity? towards the bacteria.
In alcune forme di realizzazione la superficie bioattiva comprende zone aventi un rivestimento funzionalizzato antagonista, adatto cio? a generare uno stimolo chemiotattico negativo e a contrastare i batteri. Preferibilmente il rivestimento funzionalizzato antagonista comprende molecole bioattive antagoniste selezionate tra antibiotici batteriostatici, antibiotici battericidi, e/o anticorpi. Preferibilmente le zone aventi rivestimento funzionalizzato antagonista hanno forma di bande. Preferibilmente i rivestimenti della superficie bioattiva hanno spessore micro-metrico o nano-metrico. In some embodiments, the bioactive surface comprises regions having an antagonistic, i.e. suitable, functionalized coating. to generate a negative chemotactic stimulus and to counteract bacteria. Preferably the functionalized antagonistic coating comprises antagonistic bioactive molecules selected from bacteriostatic antibiotics, bactericidal antibiotics, and/or antibodies. Preferably the zones having the opposing functionalized coating are in the form of bands. Preferably the coatings of the bioactive surface have a micro-metric or nano-metric thickness.
In alcune forme di realizzazione il dispositivo dell?invenzione comprende inoltre mezzi per il riscaldamento del contenitore. Preferibilmente i mezzi per il riscaldamento del contenitore comprendono un termostato e una camicia riscaldante atta ad ospitare il contenitore. In some embodiments the device of the invention further comprises means for heating the container. Preferably the means for heating the container comprise a thermostat and a heating jacket able to house the container.
Preferibilmente il dispositivo comprende una pluralit? di supporti comprendenti ciascuno una superficie bioattiva. Preferably, the device comprises a plurality of supports each comprising a bioactive surface.
Il metodo e il dispositivo dell?invenzione permettono di catturare, in modo efficace e rapido, batteri da sospensioni batteriche. Ci? risulta particolarmente utile, ad esempio, per la determinazione rapida della carica batterica presente in un campione biologico e per l?allestimento rapido di antibiogrammi. L?invenzione risolve i problemi tecnici messi in luce sopra per i test in vitro noti per la valutazione della resistenza antibiotica. In particolare, l?invenzione permette di ottimizzare i tempi richiesti per condurre il test di resistenza antibiotica arrivando pi? rapidamente a una diagnosi corretta in caso di infezioni batteriche e ad una terapia antibiotica efficace. Ancora, l?invenzione consente di ottenere in tempi rapidi una stima della carica batterica presente in una sospensione liquida. Inoltre, l?invenzione consente di abbassare i costi in termini di reagenti e strumenti necessari rispetto ai metodi ad oggi utilizzati. The method and device of the invention make it possible to capture bacteria from bacterial suspensions in an effective and rapid manner. There? it is particularly useful, for example, for the rapid determination of the bacterial load present in a biological sample and for the rapid preparation of antibiograms. The invention solves the technical problems highlighted above for known in vitro tests for the evaluation of antibiotic resistance. In particular, the invention makes it possible to optimize the time required to conduct the antibiotic resistance test by arriving more quickly. quickly to a correct diagnosis in case of bacterial infections and to effective antibiotic therapy. Furthermore, the invention allows to quickly obtain an estimate of the bacterial load present in a liquid suspension. Furthermore, the invention allows to lower the costs in terms of necessary reagents and tools compared to the methods currently used.
Ulteriori importanti caratteristiche del metodo, del dispositivo e del relativo kit secondo l?invenzione sono definite nelle rivendicazioni dipendenti. Further important characteristics of the method, of the device and of the relative kit according to the invention are defined in the dependent claims.
Breve Descrizione delle Figure Brief Description of the Figures
Le caratteristiche e i vantaggi del metodo e del dispositivo per la cattura dei batteri da loro sospensioni liquide, utili all?allestimento rapido di antibiogrammi, secondo la presente invenzione, saranno chiaramente illustrate nella seguente descrizione a titolo di esempio non limitativo di loro forme realizzative, anche con riferimento alle figure annesse in cui: The characteristics and advantages of the method and device for capturing bacteria from their liquid suspensions, useful for the rapid preparation of antibiograms, according to the present invention, will be clearly illustrated in the following description by way of non-limiting example of their embodiments, also with reference to the annexed figures in which:
- la Figura 1 mostra un diagramma di flusso del metodo in accordo con l?invenzione - Figure 1 shows a flowchart of the method according to the invention
- la Figura 2 mostra in modo schematico una vista in sezione di una forma di realizzazione del dispositivo in accordo con l?invenzione; - Figure 2 schematically shows a sectional view of an embodiment of the device in accordance with the invention;
- le Figure 3a e 3b mostrano le immagini al microscopio ottico con ingrandimento 5x di due strisce dense in cellule batteriche raccolte su un supporto (vetrino da microscopio) come descritto nell?Esempio 1 che segue; - Figures 3a and 3b show the optical microscope images with 5x magnification of two strips dense in bacterial cells collected on a support (microscope slide) as described in Example 1 below;
- le Figure 4a e 4b mostrano ingrandimenti 40x rispettivamente delle immagini di figura 3a e 3b; - Figures 4a and 4b show 40x enlargements respectively of the images of Figure 3a and 3b;
- la Figura 5 ? un grafico dell?andamento del numero di batteri catturati per unit? di superficie con il metodo dell?invenzione in funzione della temperatura dell?esperimento, come descritto nell?Esempio 3 che segue; - Figure 5 ? a graph of the trend of the number of bacteria captured per unit? surface area with the method of the invention as a function of the temperature of the experiment, as described in Example 3 below;
- la Figura 6 mostra in grafico la correlazione tra i conteggi di batteri catturati con il dispositivo dell?invenzione da una sospensione con concentrazione batterica nota e le concentrazioni batteriche note stesse, come descritto nell?Esempio 4 che segue; e - la figura 7 mostra schematicamente alcuni supporti in accordo con l?invenzione. Descrizione Dettagliata dell?Invenzione - Figure 6 graphs the correlation between the counts of bacteria captured with the device of the invention from a suspension with known bacterial concentration and the known bacterial concentrations themselves, as described in Example 4 below; and - figure 7 schematically shows some supports in accordance with the invention. Detailed description of the Invention
Con riferimento alla figura 1, viene illustrato un diagramma di flusso del metodo secondo una forma di realizzazione della presente invenzione. With reference to Fig. 1 , a flowchart of the method according to an embodiment of the present invention is illustrated.
Il metodo di figura 1 permette di catturare batteri in sospensione in un liquido. Il metodo comprende le fasi di: The method of figure 1 allows to capture bacteria suspended in a liquid. The method includes the steps of:
(i) predisporre un supporto avente una superficie bioattiva configurata per la cattura di batteri (blocco 100); (i) providing a support having a bioactive surface configured to capture bacteria (block 100);
(ii) predisporre una sospensione liquida di batteri (blocco 101); (ii) preparing a liquid suspension of bacteria (block 101);
(iii) immergere parzialmente il supporto nella sospensione liquida, in posizione tale che la superficie bioattiva intercetti l?interfaccia aria-liquido della sospensione (blocco 102); (iii) partially immerse the support in the liquid suspension, in such a position that the bioactive surface intercepts the air-liquid interface of the suspension (block 102);
(iv) imporre un movimento relativo tra il supporto e la sospensione, cos? da catturare sulla superficie bioattiva una striscia di batteri (blocco 103); (iv) impose a relative movement between the support and the suspension, so? a strip of bacteria to be captured on the bioactive surface (block 103);
(v) estrarre il supporto recante la superficie bioattiva dalla sospensione (blocco 104). (v) extracting the support bearing the bioactive surface from the suspension (block 104).
Con riferimento alla figura 2, viene descritto di seguito un dispositivo 10 in accordo con una forma di realizzazione della presente invenzione. Il dispositivo 10 per la cattura di batteri da loro sospensioni liquide 12 di questa invenzione, che realizza il metodo descritto sopra, comprende: With reference to Figure 2 , a device 10 according to an embodiment of the present invention is described below. The device 10 for capturing bacteria from their liquid suspensions 12 of this invention, which implements the method described above, comprises:
? un contenitore 14 adatto a contenere una sospensione liquida 12 di batteri; ? un supporto 16 comprendente una superficie bioattiva 18 configurata per la cattura di batteri; ? a container 14 suitable for containing a liquid suspension 12 of bacteria; ? a support 16 comprising a bioactive surface 18 configured for the capture of bacteria;
? mezzi di presa 20 configurati per reggere il supporto 16; ? gripping means 20 configured to hold the support 16;
? mezzi di azionamento 22 configurati per imporre un movimento relativo tra la sospensione liquida 12 e il supporto 16. ? actuation means 22 configured to impose a relative movement between the liquid suspension 12 and the support 16.
Nell?ambito di questa invenzione con l?espressione ?supporto? si intende un qualsiasi supporto 16 solido che sia in grado di recare una superficie bioattiva 18 nei confronti dei batteri, come verr? descritto pi? in dettaglio successivamente. Per esempio, un supporto 16 molto funzionale ? rappresentato dal cosiddetto vetrino portaoggetti, comunemente utilizzate in microscopia per collocarvi sopra un campione da osservare al microscopio. In modo in s? noto, il vetrino portaoggetti pu? essere realizzato in vetro o in un polimero adatto al contatto con le sostanze e i reagenti impiegati in microscopia. Per quanto riguarda l?invenzione, non ? necessario che il supporto 16 sia trasparente e in alcune forme di realizzazione esso pu? essere opaco. In the context of this invention with the expression ?support? is meant any solid support 16 which is able to bear a bioactive surface 18 towards bacteria, as it will be? described more in detail later. For example, a very functional 16 support ? represented by the so-called slide holder, commonly used in microscopy to place a sample on it to be observed under the microscope. So in itself? known, the slide can? be made of glass or a polymer suitable for contact with the substances and reagents used in microscopy. As for the invention, isn't it? It is necessary that the support 16 is transparent and in some embodiments it can? be opaque.
Il supporto 16 utilizzato per realizzare il metodo dell?invenzione comprende una o pi? superfici bioattive 18 configurate per la cattura di batteri, cio? superfici dotate di affinit? verso i batteri. In altre parole, la superficie bioattiva 18 ? in grado di attirare e di trattenere i batteri con cui viene a contatto. La superficie bioattiva 18 pu? essere ottenuta in modi differenti. The support 16 used to implement the method of the invention comprises one or more bioactive surfaces 18 configured for the capture of bacteria, that is? surfaces with affinity? towards the bacteria. In other words, the bioactive surface 18 ? capable of attracting and retaining the bacteria it comes into contact with. The bioactive surface 18 can? be obtained in different ways.
La superficie bioattiva 18 del supporto 16 pu? ad esempio essere una superficie preventivamente attivata mediante trattamento al plasma. In modo in s? noto, il trattamento al plasma di una superficie (ad esempio di vetro o di polimero) modifica la struttura superficiale del materiale, aumentandone la tensione superficiale e quindi la bagnabilit?. In modo analogo, l?attivazione mediante plasma rende disponibili sulla superficie del supporto 16 dei legami positivi che attirano e legano la membrana cellulare dei batteri che risulta carica negativamente. The bioactive surface 18 of the support 16 can for example being a surface previously activated by plasma treatment. So in itself? known, the plasma treatment of a surface (for example of glass or polymer) modifies the surface structure of the material, increasing its surface tension and therefore its wettability. In an analogous way, activation by plasma makes positive bonds available on the surface of the support 16 which attract and bind the cell membrane of the bacteria which is negatively charged.
In aggiunta o in alternativa, la superficie bioattiva 18 pu? essere rivestita almeno in parte con una sostanza che ha affinit? con i batteri e che dunque ne favorisce l?adesione. Ad esempio, un rivestimento adatto per ottenere la superficie bioattiva 18 pu? essere ottenuto con molecole quali poli-L-lisina oppure con molecole derivate dai silani o da alcuni ossidi metallici. Additionally or alternatively, the bioactive surface 18 can be coated at least in part with a substance that has affinity? with the bacteria and which therefore favors their adhesion. For example, a coating suitable for obtaining bioactive surface 18 can be obtained with molecules such as poly-L-lysine or with molecules derived from silanes or from some metal oxides.
Ancora, in accordo con alcune forme di realizzazione dell?invenzione, la superficie bioattiva 18 del supporto 16 pu? a sua volta comprendere delle zone aventi un rivestimento funzionalizzato antagonista 24, fatto cio? di sostanze che generano uno stimolo chemiotattico negativo, adatto quindi a contrastare i batteri. Il rivestimento funzionalizzato antagonista pu? ad esempio comprendere molecole bioattive antagoniste adatte ad allontanare i batteri, e/o adatte a rallentare o fermare la proliferazione dei batteri, e/o adatte ad uccidere i batteri. Le molecole bioattive antagoniste possono ad esempio essere selezionate tra: antibiotici batteriostatici, antibiotici battericidi, e/o anticorpi. Again, in accordance with some embodiments of the invention, the bioactive surface 18 of the support 16 can in turn comprising areas having an opposing functionalized coating 24, which is done? of substances that generate a negative chemotactic stimulus, therefore suitable for fighting bacteria. The antagonist functionalized coating can? for example comprising antagonistic bioactive molecules suitable for repelling bacteria, and/or suitable for slowing down or stopping the proliferation of bacteria, and/or suitable for killing bacteria. The antagonistic bioactive molecules can for example be selected from: bacteriostatic antibiotics, bactericidal antibiotics, and/or antibodies.
In una forma di realizzazione dell?invenzione, il supporto 16 comprende la superficie bioattiva 18 in cui zone adatte a favorire la cattura e l?adesione dei batteri sono alternate a zone di rivestimento funzionalizzato antagonista 24. Preferibilmente tali zone alternate sono in forma di bande che, in uso, attraversano l?interfaccia arialiquido. Figura 7 mostra schematicamente tre esempi di supporti 16 che, nello specifico, assumono la forma di un vetrino portaoggetti per microscopia. Nell?esempio di Figura 7a la superficie bioattiva 18 si estende su tutto il supporto 16. Nell?esempio di Figura 7b la superficie bioattiva 18 si estende solo su una fascia limitata del supporto 16. Nell?esempio di Figura 7c la superficie bioattiva 18, che si estende solo su una fascia limitata del supporto 16 come in Figura 7b, comprende anche delle zone (a forma di bande) aventi un rivestimento funzionalizzato antagonista 24. In one embodiment of the invention, the support 16 comprises the bioactive surface 18 in which areas suitable for promoting the capture and adhesion of bacteria are alternated with areas of functionalized antagonistic coating 24. Preferably these alternating areas are in the form of bands which , in use, cross the air-liquid interface. Figure 7 schematically shows three examples of supports 16 which, specifically, take the form of a microscope slide. In the example of Figure 7a, the bioactive surface 18 extends over the entire support 16. In the example of Figure 7b, the bioactive surface 18 extends only over a limited area of the support 16. In the example of Figure 7c, the bioactive surface 18, which extends only over a limited band of the support 16 as in Figure 7b, also comprises areas (in the form of bands) having an antagonistic functionalized coating 24.
Preferibilmente, i rivestimenti predisposti sul supporto 16 per ottenere la superficie bioattiva 18 hanno spessore micro-metrico o nano-metrico. Preferably, the coatings arranged on the support 16 to obtain the bioactive surface 18 have a micro-metric or nano-metric thickness.
La fase (iv) del metodo dell?invenzione, che implica la cattura dei batteri dalla sospensione liquida 12 direttamente sulla superficie bioattiva 18, pu? avere durate differenti. Ad esempio, tale fase pu? avere una durata di tempo compresa tra circa 15 minuti e circa 120 minuti, nel quale si realizza una cattura efficace dei batteri. Risultati ottimali di cattura dei batteri uniti alla rapidit? del metodo si ottengono per un tempo compreso tra circa 30 minuti e circa 60 minuti. Phase (iv) of the method of the invention, which involves the capture of bacteria from the liquid suspension 12 directly on the bioactive surface 18, can have different durations. For example, this phase can have a duration of time ranging from about 15 minutes to about 120 minutes, in which effective capture of the bacteria is achieved. Optimal bacteria capture results combined with rapidity? of the method are obtained for a time ranging from about 30 minutes to about 60 minutes.
Il risultato ottimale del metodo, dal punto di vista della cattura, ? la formazione di una striscia densa e ben visibile di batteri sulla superficie bioattiva 18, laddove quest?ultima era attraversata dall?interfaccia aria-liquido durante la fase (iv) stessa. La persona esperta non ha alcuna difficolt? ad individuare la striscia di batteri, anche senza doverne dare una definizione rigorosa, ad esempio in termini di densit? di batteri per unit? di superficie. Esempi di queste strisce sono mostrati nelle figure 3a e 3b. The optimal result of the method, from the point of view of capture, is the formation of a dense and clearly visible band of bacteria on the bioactive surface 18, where the latter was crossed by the air-liquid interface during step (iv) itself. Does the expert person have no difficulty? to identify the strip of bacteria, even without having to give a rigorous definition, for example in terms of density? of bacteria per unit? surface. Examples of these streaks are shown in Figures 3a and 3b.
Tutte le fasi del metodo dell?invenzione possono essere condotte a temperatura ambiente, ad esempio intorno a circa 20?C. Tuttavia, la fase (iv) che implica la cattura dei batteri risulta pi? efficiente, a parit? di altre condizioni, se condotta ad una temperatura moderatamente pi? alta della temperatura ambiente, alla quale si ha la massima sopravvivenza dei batteri da catturare, ad esempio ad una temperatura compresa entro i 40?C, preferibilmente a circa 37?C. All the steps of the method of the invention can be carried out at room temperature, for example around about 20°C. However, the phase (iv) which involves the capture of the bacteria is more? efficient, on par? of other conditions, if conducted at a temperature moderately pi? higher than the ambient temperature, at which there is maximum survival of the bacteria to be captured, for example at a temperature comprised within 40°C, preferably at about 37°C.
La cattura dei batteri nel metodo di questa invenzione pu? essere effettuata ponendo in movimento il supporto 16 nella sospensione, in modo che almeno una parte della superficie bioattiva 18 intercetti, muovendosi nella sospensione liquida 12, l?interfaccia aria-liquido dove i batteri tendono a concentrarsi, come ? noto e dimostrato nello stato dell?arte. In questo modo l?efficienza di cattura dei batteri viene massimizzata. Come la persona esperta pu? ben comprendere, il movimento del supporto 16 nella sospensione liquida 12 pu? essere ottenuto in differenti modi, in s? noti. Ad esempio, ? possibile muovere il supporto 16 rispetto al contenitore 14 che contiene la sospensione liquida 12, oppure ? possibile muovere il contenitore 14 rispetto al supporto 16, o infine ? possibile muovere entrambi con velocit? diverse. The capture of bacteria in the method of this invention can be carried out by moving the support 16 in the suspension, so that at least a part of the bioactive surface 18 intercepts, moving in the liquid suspension 12, the air-liquid interface where the bacteria tend to concentrate, how? known and proven in the state of the art. In this way the efficiency of capture of bacteria is maximized. How can the expert person? well understand, the movement of the support 16 in the liquid suspension 12 pu? be obtained in different ways, in s? notice. For example, ? Is it possible to move the support 16 with respect to the container 14 which contains the liquid suspension 12, or is it possible? possible to move the container 14 with respect to the support 16, or finally? is it possible to move both with speed? different.
In una forma realizzativa alternativa del metodo di questa invenzione, il movimento relativo tra il supporto 16 e la sospensione liquida 12 pu? essere ottenuto mettendo in movimento la sola sospensione liquida 12, mantenendo fermi sia il contenitore 14 sia il supporto 16. In questo caso, la sospensione liquida 12 pu? essere posta in movimento secondo un qualsiasi metodo di movimentazione dei liquidi noto nell?arte, che potr? essere selezionato senza alcuno sforzo da un tecnico con conoscenze ordinarie del settore secondo le condizioni al contorno e le esigenze del caso, ad esempio mediante un sistema di agitazione magnetica o meccanica. In an alternative embodiment of the method of this invention, the relative movement between the support 16 and the liquid slurry 12 can be obtained by moving only the liquid suspension 12, keeping both the container 14 and the support 16 stationary. In this case, the liquid suspension 12 can? be set in motion according to any liquid handling method known in the art, which could? be selected without any effort by a technician with ordinary knowledge of the sector according to the surrounding conditions and the needs of the case, for example by means of a magnetic or mechanical stirring system.
Il movimento relativo tra la superficie bioattiva 18 del supporto 16 e la sospensione liquida 12 pu? essere un movimento di rotazione, traslazione, oscillazione o vibrazione. Gli studi della Richiedente hanno evidenziato che il movimento preferibile ? quello di rotazione. The relative movement between the bioactive surface 18 of the support 16 and the liquid suspension 12 can be a rotation, translation, oscillation or vibration movement. The Applicant's studies have shown that the preferable movement ? that of rotation.
La velocit? di rotazione del supporto 16, imposta dalla velocit? di rotazione dei mezzi di azionamento 22 descritti di seguito, pu? essere ad esempio compresa tra pochi giri al minuto (revolutions per minute o rpm) e circa 250 rpm, preferibilmente tra circa 40 e circa 120 rpm, e pi? preferibilmente la velocit? di rotazione ? di circa 60 rpm. Velocit? di rotazione inferiori a 40 rpm mostrano una diminuzione dell?efficienza di cattura, per quanto anche a velocit? molto basse si osserva la presenza di una striscia pi? sottile ma densa in batteri; a velocit? superiori a 120 rpm, dopo la cattura si osserva invece una perdita della simmetria lineare della striscia densa in batteri, anche se ? chiaramente evidente un aumento notevole della quantit? di batteri catturati. In ogni caso, la velocit? di movimento ottimale, anche nel caso di movimenti oscillatori o vibratori del supporto 16, potr? essere calibrata senza sforzo alcuno da un tecnico ordinario del settore in funzione del risultato voluto. The speed? of rotation of the support 16, set by the speed? of rotation of the drive means 22 described below, can? be, for example, between a few revolutions per minute (revolutions per minute or rpm) and about 250 rpm, preferably between about 40 and about 120 rpm, and more? preferably the speed? of rotation ? of about 60 rpm. Speed? of rotation lower than 40 rpm show a decrease of? efficiency of capture, as even at speed? very low is observed the presence of a strip pi? thin but thick in bacteria; at speed higher than 120 rpm, after the capture a loss of the linear symmetry of the dense stripe in bacteria is instead observed, even if ? clearly evident a significant increase in the amount? of captured bacteria. In any case, the speed? of optimal movement, even in the case of oscillatory or vibratory movements of the support 16, could be calibrated without any effort by an ordinary technician in the sector according to the desired result.
In accordo con una forma di realizzazione dell?invenzione, illustrata in Figura 2, il dispositivo 10 comprende mezzi 26 per il riscaldamento del contenitore 14. Ad esempio, i mezzi di riscaldamento 26 possono comprendere un termostato e una camicia riscaldante atta ad ospitare il contenitore 14. In questo modo il dispositivo 10 ? in grado di mantenere il contenitore 14 e la sospensione alla temperatura desiderata durante la fase di cattura dei batteri. In accordance with an embodiment of the invention, illustrated in Figure 2, the device 10 comprises means 26 for heating the container 14. For example, the heating means 26 can comprise a thermostat and a heating jacket adapted to house the container 14. In this way the device 10 ? capable of maintaining the container 14 and the suspension at the desired temperature during the bacteria capture step.
Qualsiasi mezzo di riscaldamento 26 adeguato a riscaldare a una temperatura moderatamente pi? alta della temperatura ambiente, come sopra descritto, pu? essere utilizzato nel dispositivo 10 di questa invenzione. Ad esempio, i mezzi di riscaldamento 26 possono comprendere delle resistenze elettriche e/o delle celle di Peltier. Any heating medium 26 adequate to heat to a moderately hotter temperature. high ambient temperature, as described above, pu? be utilized in the device 10 of this invention. For example, the heating means 26 can comprise electric resistors and/or Peltier cells.
In accordo con alcune forme di realizzazione, il dispositivo 10 descritto sopra pu? comprendere una pluralit? di supporti 16, aventi ciascuno una superficie bioattiva 18, per l?effettuazione in contemporanea di pi? sessioni di cattura di batteri, ad esempio per l?allestimento di pi? campionamenti, tanti quanti sono le superfici bioattive 18. In accordance with some embodiments, the device 10 described above can understand a plurality of supports 16, each having a bioactive surface 18, for the simultaneous execution of several? bacteria capture sessions, for example for the preparation of more? sampling, as many as there are bioactive surfaces 18.
In accordo con una sua forma di realizzazione, il metodo dell?invenzione consente di valutare la quantit? di batteri presenti in un campione di una sospensione liquida 12. La Richiedente infatti ha sviluppato una particolare forma di realizzazione del metodo che comprende le fasi di: In accordance with one embodiment thereof, the method of the invention makes it possible to evaluate the quantity of bacteria present in a sample of a liquid suspension 12. In fact, the Applicant has developed a particular embodiment of the method which comprises the steps of:
- fissare i parametri del metodo; - fix the parameters of the method;
- applicare il metodo descritto sopra a una o pi? sospensioni liquide 12 di concentrazione batterica nota; - apply the method described above to one or more? liquid suspensions 12 of known bacterial concentration;
- contare i batteri catturati in ciascuna sospensione liquida 12 di concentrazione batterica nota; - counting the bacteria captured in each liquid suspension 12 of known bacterial concentration;
- ottenere una curva di taratura che mette in relazione le quantit? di batteri catturati e le concentrazioni batteriche note; - obtain a calibration curve that relates the quantities? of bacteria caught and known bacterial concentrations;
- applicare il metodo descritto sopra a una sospensione liquida 12 di concentrazione batterica ignota; - applying the method described above to a liquid suspension 12 of unknown bacterial concentration;
- contare i batteri catturati nella sospensione liquida 12 di concentrazione batterica ignota; e - counting the bacteria captured in the liquid suspension 12 of unknown bacterial concentration; And
- tramite la curva di taratura, ottenere una stima della concentrazione batterica ignota. - using the calibration curve, obtain an estimate of the unknown bacterial concentration.
Questa particolare forma di realizzazione del metodo pu? essere particolarmente utile, oltre che in ambito clinico (sia medico sia veterinario), anche in ambito ambientale, ad esempio per la valutazione dell?inquinamento batterico nelle acque. This particular embodiment of the method can? be particularly useful, as well as in the clinical field (both medical and veterinary), also in the environmental field, for example for the evaluation of bacterial pollution in water.
Gli esperimenti condotti dalla Richiedente e descritti di seguito hanno mostrato che il presente metodo, nella sua semplicit?, ? estremamente efficace nella cattura dei batteri da loro sospensioni liquide 12, in un ampio intervallo di condizioni. The experiments conducted by the Applicant and described below have shown that the present method, in its simplicity, is extremely effective in capturing bacteria from their liquid suspensions 12 , under a wide range of conditions.
Come la persona esperta pu? ben considerare, la presente invenzione supera gli inconvenienti della tecnica nota. How can the expert person? well considered, the present invention overcomes the drawbacks of the prior art.
In particolare, la presente invenzione rende disponibile un metodo molto semplice e rapido per la cattura di una quantit? di batteri adeguata a realizzare un antibiogramma. In particolare, il metodo dell?invenzione consente di catturare in un tempo di circa 1 ora la quantit? di batteri paragonabile a quella che in modo in s? noto ? ottenuta in almeno 2 giorni di coltura in vitro. In particular, the present invention provides a very simple and rapid method for capturing a quantity of bacteria adequate to perform an antibiogram. In particular, the method of the invention makes it possible to capture the quantity of bacteria comparable to that which in a way in s? known ? obtained in at least 2 days of in vitro culture.
Inoltre, la presente invenzione rende disponibile un metodo che consente di determinare in modo rapido la carica batterica di un campione analizzato. Furthermore, the present invention makes available a method which allows the bacterial load of an analyzed sample to be rapidly determined.
Ancora, la presente invenzione rende disponibile un dispositivo 10 che garantisce un uso facile ed economico per la cattura di batteri da una sospensione liquida 12. Furthermore, the present invention makes available a device 10 which guarantees easy and economic use for the capture of bacteria from a liquid suspension 12.
L?invenzione rende disponibile un metodo e un dispositivo 10 per la cattura di batteri che consentono di allestire antibiogrammi per valutare la resistenza dei batteri agli antibiotici senza colture batteriche. Tale risultato non ? possibile con nessun altro metodo o dispositivo 10 noto alla Richiedente. Inoltre, l?invenzione consente di mantenere costi bassi in termini sia di strumentazione sia di personale addetto. The invention provides a method and a device 10 for capturing bacteria which allow to prepare antibiograms for evaluating the resistance of bacteria to antibiotics without bacterial cultures. Isn't this result? possible with no other method or device 10 known to the Applicant. Furthermore, the invention allows to maintain low costs in terms of both instrumentation and assigned personnel.
Un ulteriore importante vantaggio del presente dispositivo 10 e metodo ? il costo molto pi? basso per i reagenti e gli strumenti rispetto alle tecniche note: nel presente metodo infatti non ? richiesta la coltura dei batteri, ma essi vengono semplicemente raccolti laddove si trovano in maggiore concentrazione, all?interfaccia aria-liquido, e catturati direttamente sulla superficie bioattiva 18 dove possono essere contati e sottoposti alla valutazione della resistenza agli antibiotici. A further important advantage of the present device 10 and method ? the cost much more? low for the reagents and the instruments compared to the known techniques: in fact, in the present method it is not culture of the bacteria is required, but they are simply collected where they are found in greatest concentration, at the air-liquid interface, and captured directly on the bioactive surface 18 where they can be counted and subjected to antibiotic resistance evaluation.
In particolare, in confronto con le colture batteriche e i metodi noti di cattura e concentrazione batterica, il presente metodo ? molto pi? rapido poich? impiega tempi dell?ordine dei minuti per arrivare a completamento, rispetto ai molto pi? lunghi richiesti per le colture batteriche. In particular, in comparison with bacterial cultures and known methods of bacterial capture and concentration, the present method is much more quick because takes times of? the order of minutes to get to completion, compared to the much more? long required for bacterial cultures.
Nel seguito sono riportati esempi illustrativi, non limitativi, della presente invenzione. Illustrative, non-limiting examples of the present invention are given below.
PARTE SPERIMENTALE EXPERIMENTAL PART
Esempio 1 - Cattura di batteri con il metodo dell?invenzione Example 1 - Capture of bacteria with the method of the invention
Il dispositivo 10 di Figura 2 ? stato utilizzato per catturare i batteri presenti in un campione di urine precedentemente prelevato a un paziente e versato all?interno del contenitore 14 facente parte del dispositivo 10. La concentrazione batterica stimata era di circa 10 milioni di batteri per mL. A temperatura ambiente (circa 20?C), un vetrino da microscopio, che funge da supporto 16, di circa 0.5 mm di spessore e 20 mm di larghezza, recante una superficie bioattiva 18 di poli-L-lisina, ? stato posto in rotazione alla velocit? di 30 rpm all?interno del campione, grazie ai mezzi di azionamento 22 del dispositivo 10. Gi? dopo 30 minuti ? stata osservata una cattura regolare e piuttosto densa di batteri, che ? aumentata notevolmente mantenendo il vetrino in rotazione per un tempo complessivo di 120 minuti. In Figura 3 sono visibili le immagini al microscopio ottico con ingrandimento 5x dello spessore batterico sul vetrino ottenute con tempo di cattura rispettivamente di 120 minuti (Figura 3a: 500 ?m) e di 30 minuti (Figura 3b: 300 ?m). In Figura 4 sono visibili invece le immagini al microscopio ottico con ingrandimento 40x delle due strisce batteriche sul vetrino ottenute con tempo di cattura rispettivamente di 120 minuti (Figura 4a) e di 30 minuti (Figura 4b). Tali risultati mostrano che per tempi pi? lunghi di permanenza del vetrino nel campione, viene catturato un numero pi? alto di batteri, ma in entrambi i casi il lasso temporale per la cattura ? dell?ordine dei minuti. The device 10 of Figure 2 ? was used to capture the bacteria present in a urine sample previously taken from a patient and poured into the container 14 forming part of the device 10. The estimated bacterial concentration was about 10 million bacteria per mL. At room temperature (about 20°C), a microscope slide, which acts as a support 16, about 0.5 mm thick and 20 mm wide, bearing a bioactive surface 18 of poly-L-lysine, is been placed in rotation at the speed? of 30 rpm inside the sample, thanks to the drive means 22 of the device 10. Already? after 30 minutes? been observed a regular and rather dense capture of bacteria, which? significantly increased by keeping the slide in rotation for a total time of 120 minutes. Figure 3 shows the optical microscope images with 5x magnification of the bacterial thickness on the slide obtained with a capture time of 120 minutes (Figure 3a: 500 ?m) and 30 minutes (Figure 3b: 300 ?m) respectively. Figure 4 instead shows the optical microscope images with 40x magnification of the two bacterial strips on the slide obtained with a capture time of 120 minutes (Figure 4a) and 30 minutes (Figure 4b) respectively. These results show that for times pi? long permanence of the slide in the sample, is captured a number pi? high in bacteria, but in both cases, the time frame for the capture? of the order of minutes.
Esperimenti analoghi nelle stesse condizioni sopra descritte sono stati condotti anche utilizzando supporti 16 recanti superfici bioattive 18 diverse, ottenendo analoghi risultati in termini di cattura dei batteri. In particolare, sono stati utilizzati vetrini da microscopio rivestiti con derivati da silani e altri materiali quali alcuni ossidi metallici che hanno una certa affinit? con la parete cellulare in genere. Tali materiali sono in s? noti e disponibili commercialmente. Analogous experiments under the same conditions described above were also carried out using supports 16 bearing different bioactive surfaces 18, obtaining analogous results in terms of bacteria capture. In particular, microscope slides coated with silane derivatives and other materials such as some metal oxides that have a certain affinity have been used. with the cell wall in general. These materials are in s? known and commercially available.
Sono stati inoltre testati vetrini da microscopio senza alcun rivestimento ma trattati al plasma cos? da pulire e attivare la superficie del vetrino. Anche in questo caso, nelle stesse condizioni di cattura sopra descritte, si ? osservata una buona capacit? di cattura dei batteri dalla sospensione anche se inferiore rispetto all?efficienza di cattura ottenuta con i supporti 16 rivestiti sopra descritti. Were also tested microscope slides without any coating but treated with plasma so? to clean and activate the slide surface. Also in this case, under the same capture conditions described above, yes? observed a good capacity? of capture of the bacteria from the suspension even if lower than the capture efficiency obtained with the coated supports 16 described above.
Esempio 2 ? Valutazione della vitalit? batterica dopo la cattura con il metodo dell?invenzione Example 2 ? Assessment of vitality bacterial after capture with the method of the invention
Per verificare la vitalit? dei batteri catturati con il metodo dell?invenzione, si ? proceduto ad un esperimento in parallelo con due diversi gruppi di vetrini da microscopio rivestiti con una superficie di poli-L-lisina e tenuti in bagno per una notte in ipoclorito di sodio, quindi lavati con acqua sterile. To check the vitality? of the bacteria captured with the method of the invention, yes? carried out a parallel experiment with two different sets of microscope slides coated with a surface of poly-L-lysine and soaked overnight in sodium hypochlorite, then washed with sterile water.
Il primo gruppo di vetrini ? stato utilizzato con il dispositivo 10 dell?invenzione per la cattura di batteri da una sospensione batterica, mentre il secondo gruppo di vetrini ? stato utilizzato con lo stesso dispositivo 10 e posto in rotazione per lo stesso periodo di tempo (120 minuti) in un liquido privo di batteri, costituito da PBS sterile (soluzione salina tamponata con fosfato, Phosphate Buffered Saline). I due gruppi di supporti 16 sono stati quindi messi in coltura per 24 ore in tubi sterili da 50 mL contenenti brodo di coltura. I vetrini utilizzati per la cattura dei batteri dalla sospensione batterica hanno mostrato un chiaro intorbidimento del brodo di coltura in cui sono stati immersi, segno che i batteri catturati sul vetrino erano ancora vitali e in grado di proliferare, cos? da intorbidire il brodo di coltura. Al contrario, i vetrini utilizzati per il liquido senza batteri non formavano alcun intorbidimento, ma il brodo di coltura restava perfettamente limpido, senza alcuna crescita batterica. The first group of slides ? been used with the device 10 of the invention for the capture of bacteria from a bacterial suspension, while the second group of slides ? was used with the same device 10 and placed in rotation for the same period of time (120 minutes) in a liquid free of bacteria, consisting of sterile PBS (Phosphate Buffered Saline). The two groups of supports 16 were then cultured for 24 hours in sterile 50 mL tubes containing culture broth. The slides used for the capture of bacteria from the bacterial suspension showed a clear clouding of the culture broth in which they were immersed, a sign that the bacteria captured on the slide were still viable and able to proliferate, thus to cloud the culture broth. In contrast, the slides used for the bacteria-free liquid did not form any cloudiness, but the culture broth remained perfectly clear, with no bacterial growth.
Esempio 3 ? Valutazione dell?influenza di vari parametri sull?efficienza di cattura dei batteri con il metodo dell?invenzione Example 3 ? Evaluation of the influence of various parameters on the efficiency of capture of bacteria with the method of the invention
Effetto del materiale del contenitore 14 e dell?area superficiale dell?interfaccia aria-liquido - Per verificare l?efficacia di cattura di batteri da loro sospensioni con il metodo dell?invenzione, indipendentemente dall?estensione dell?interfaccia liquido-aria e dal materiale del contenitore 14, si sono effettuate prove in parallelo usando sempre lo stesso volume (100 mL) di urina precedentemente prelevata a un paziente con infezione batterica, ma posta in contenitori diversi, tutti di forma cilindrica ma di diverso materiale e di diversa area superficiale dell?interfaccia aria-urina. I contenitori usati erano: un cilindro graduato in vetro con area superficiale di 12.57 cm<2>, un becher in vetro con area superficiale di 28.27 cm<2>, un becher in vetro con area superficiale di 38.48 cm<2>, un contenitore 14 in plastica con area superficiale di circa 24 cm<2 >ed infine un contenitore 14 di plastica con area superficiale di circa 50 cm<2>. Le prove sono state condotte a temperatura ambiente (circa 19?C), con una velocit? di rotazione del dispositivo 10 di 60 rpm e tempi di cattura di 60 minuti. In tutte le prove effettuate si ? riscontrata una cattura dei batteri efficiente, senza che la scelta di un materiale o di una forma del contenitore 14 avesse un effetto positivo o negativo significativo sull?efficienza di cattura dei batteri da parte delle superfici bioattive 18 dei supporti 16. Effect of the material of the container 14 and of the surface area of the air-liquid interface - To verify the effectiveness of capture of bacteria from their suspensions with the method of the invention, regardless of the extension of the liquid-air interface and of the material of the container 14, tests were carried out in parallel using always the same volume (100 mL) of urine previously collected from a patient with bacterial infection, but placed in different containers, all of a cylindrical shape but of different material and different surface area of the ?air-urine interface. The containers used were: a glass graduated cylinder with a surface area of 12.57 cm<2>, a glass beaker with a surface area of 28.27 cm<2>, a glass beaker with a surface area of 38.48 cm<2>, a container 14 made of plastic with a surface area of about 24 cm<2> and finally a container 14 made of plastic with a surface area of about 50 cm<2>. The tests were conducted at room temperature (about 19? C), with a speed? of rotation of the device 10 of 60 rpm and capture times of 60 minutes. In all the tests carried out, yes ? efficient capture of bacteria was found, without the choice of a material or shape of the container 14 having a significant positive or negative effect on the efficiency of capture of bacteria by the bioactive surfaces 18 of the supports 16.
Effetto della forma del contenitore 14 ? Sono state effettuate in parallelo anche prove di efficacia della cattura di batteri con il metodo dell?invenzione realizzato con contenitori di forma diversa, uno di forma cilindrica e uno a forma di parallelepipedo. Le prove sono state effettuate a temperatura ambiente (circa 18?C) su una sospensione batterica di urina per un tempo di cattura di 60 minuti e velocit? del dispositivo 10 di 60 rpm. I risultati ottenuti in queste condizioni di misura non hanno evidenziato differenze significative tra le due prove effettuate con contenitori di forma diversa, cos? che si pu? concludere che la forma del contenitore 14 non ha un effetto sull?efficienza di cattura dei batteri maggiore dell?errore nella conta batterica. Effect of the shape of the container 14 ? In parallel, tests of the effectiveness of the capture of bacteria with the method of the invention were also carried out, made with containers of different shapes, one cylindrical and one parallelepiped-shaped. The tests were carried out at room temperature (about 18°C) on a bacterial suspension of urine for a capture time of 60 minutes and a speed of of the device 10 of 60 rpm. The results obtained in these measurement conditions did not show significant differences between the two tests carried out with containers of different shapes, so? what can you do? conclude that the shape of the container 14 does not have a greater effect on the efficiency of capturing bacteria than the error in the bacterial count.
Effetto della temperatura della sospensione ? Sono state effettuate prove di cattura di batteri con il dispositivo 10 dell?invenzione in un intervallo di temperature dalla temperatura ambiente (18-20?C) fino a 40?C, trovando che un moderato aumento della temperatura rispetto ai valori della temperatura ambiente ha un effetto positivo sull?efficienza di cattura dei batteri. Le prove sono state effettuate su due sospensioni, la prima con una concentrazione batterica di 3 milioni di CFU/mL (colony-forming unit per millilitro cio? unit? formanti colonie per millilitro) e la seconda con concentrazione di 28 milioni di CFU/mL, nell?intervallo tra 20?C e 40?C con tempo di cattura 30 minuti e velocit? di rotazione del vetrino di 60 rpm. Per la seconda sospensione sono state effettuate due serie di prove, utilizzando supporti 16 recanti due diverse superfici bioattive 18. Uno dei supporti 16, un vetrino da microscopio, utilizzato nel dispositivo 10 dell?invenzione in queste prove aveva una superficie bioattiva 18 a base di rivestimento di poli-L-lisina, e l?altro recante una superfice caricata positivamente. Vetrini per microscopio carichi positivamente sono comunemente disponibili in commercio e sono ampiamente apprezzati per la loro capacit? di immobilizzare cellule e tessuti. In Figura 5 ? riportato l?andamento del numero di batteri catturati per immagine (quindi per unit? di superficie) in funzione della temperatura della prova. Il conteggio del numero di batteri per immagine ? stato fatto usando un microscopio ottico e registrando una immagine ogni circa 0.5 mm lungo la striscia di batteri raccolta sul vetrino di supporto 16. In questo modo si sono raccolte un numero di immagini, statisticamente valido per ogni vetrino (maggiore di 30), su cui si ? fatta la conta dei batteri. Le immagini sono state registrate con un obiettivo 40x. ? stato osservato che un moderato aumento di temperatura, ottenibile con la camicia riscaldante di una forma realizzativa del presente dispositivo 10, favoriva la motilit? dei batteri aumentando l?efficienza della cattura. Risultati ottimali sono stati osservati per temperature intorno a 37?C. Effect of suspension temperature? Bacteria capture tests have been carried out with the device 10 of the invention in a range of temperatures from ambient temperature (18-20°C) up to 40°C, finding that a moderate increase in temperature with respect to ambient temperature values has a positive effect on the efficiency of capturing bacteria. The tests were carried out on two suspensions, the first with a bacterial concentration of 3 million CFU/mL (colony-forming unit per milliliter, i.e. colony-forming units per milliliter) and the second with a concentration of 28 million CFU/mL , in the range between 20?C and 40?C with capture time 30 minutes and speed? of rotation of the slide by 60 rpm. For the second suspension, two series of tests were carried out, using supports 16 bearing two different bioactive surfaces 18. One of the supports 16, a microscope slide, used in the device 10 of the invention in these tests had a bioactive surface 18 based on poly-L-lysine coating, and the other bearing a positively charged surface. Positively charged microscope slides are commonly commercially available and are widely appreciated for their ability to slide. to immobilize cells and tissues. In Figure 5 ? reported the trend of the number of bacteria captured per image (therefore per unit of surface) as a function of the test temperature. Counting the number of bacteria per image ? was done using an optical microscope and recording an image every approximately 0.5 mm along the strip of bacteria collected on the support slide 16. In this way, a number of images were collected, statistically valid for each slide (greater than 30), on which Yes ? count the bacteria. Images were recorded with a 40x objective. ? It was observed that a moderate increase in temperature, obtainable with the heating jacket of one embodiment of the present device 10, promoted the motility of the device 10. of bacteria by increasing the efficiency of the capture. Optimal results have been observed for temperatures around 37?C.
Effetto della velocit? del movimento di rotazione ? Sono state effettuate prove di cattura di batteri a diverse velocit? di rotazione della superficie bioattiva 18 nella sospensione batterica da 20 rpm a 120 rpm, con un dispositivo 10 dell?invenzione in cui i di mezzi di azionamento 22 erano dotati di un potenziometro per regolare la velocit? di rotazione del supporto 16 nella sospensione. La concentrazione delle sospensioni batteriche testate ? stata misurata sia con camera di conta di B?rker-T?rk sia mediante metodo tradizionale di coltura su terreno generico. Vetrini da microscopio rivestiti con poli-L-lisina sono stati utilizzati, cos? come altri vetrini con rivestimento carico positivamente disponibili in commercio. L?analisi dei dati ottenuti ha mostrato che per velocit? di rotazione dei vetrini tra 40 rpm e 80 rpm i risultati erano migliori in termini di simmetria della striscia di batteri catturata sul vetrino e di efficienza di cattura; si osservava cio? in questi casi una striscia ben dritta e densa di batteri. Velocit? di rotazione molto inferiori a 40 rpm hanno mostrato una diminuzione dell?efficienza di cattura ma anche a velocit? molto basse si ? osservata la presenza di una striscia densa di batteri. A velocit? superiori a 120 rpm dopo la cattura si ? osservata la perdita della simmetria lineare della striscia densa in batteri, anche se ? evidente un aumento notevole della quantit? di batteri catturati. La velocit? di rotazione di 60 rpm ? risultata essere quella che permetteva di ottenere i migliori risultati in termini di densit? batterica e di forma della striscia densa in batteri. Speed effect? of the rotational movement? Were tests of capture of bacteria at different speeds? of rotation of the bioactive surface 18 in the bacterial suspension from 20 rpm to 120 rpm, with a device 10 of the invention in which the actuation means 22 were equipped with a potentiometer for regulating the speed? of rotation of the support 16 in the suspension. The concentration of the bacterial suspensions tested? was measured both with B?rker-T?rk counting chamber and by traditional method of culture on generic medium. Microscope slides coated with poly-L-lysine were used, so as other commercially available positively charged coated slides. L?analysis of the data obtained has shown that for speed? rotation of the slides between 40 rpm and 80 rpm the results were better in terms of symmetry of the strip of bacteria captured on the slide and capture efficiency; was that observed? in these cases a very straight and dense streak of bacteria. Speed? rotation much lower than 40 rpm have shown a decrease in? efficiency of capture but also at speed? very low yes? observed the presence of a dense streak of bacteria. At speed? higher than 120 rpm after the capture yes ? observed the loss of the linear symmetry of the dense stripe in bacteria, even if ? evident a significant increase in the amount? of captured bacteria. The speed? of rotation of 60 rpm ? turned out to be the one that allowed to obtain the best results in terms of density? bacterial and form of dense streak in bacteria.
Esempio 4 ? Valutazione della correlazione tra numero di batteri catturati con il metodo dell?invenzione e concentrazione dei batteri nella sospensione Example 4 ? Evaluation of the correlation between the number of bacteria captured with the method of the invention and the concentration of bacteria in the suspension
Con la ripetizione delle prove come descritto sopra nell?Esempio 1 in diverse condizioni, ? stata verificata l?esistenza di una correlazione tra il numero di batteri catturati in una sospensione batterica con il metodo dell?invenzione e la concentrazione batterica nella sospensione stessa. Si ? cos? ottenuta una curva di taratura che permette di risalire dal numero di batteri catturati alla loro concentrazione nella sospensione. Per fare ci? occorre fissare una serie di parametri della prova condotta in accordo con il metodo: tempo di cattura; tipo di superficie bioattiva 18 utilizzata; temperatura; velocit? del supporto 16 (velocit? di rotazione in caso di movimento rotatorio, o frequenza delle oscillazioni/vibrazioni o velocit? di traslazione negli altri tipi di movimentazione possibile); metodo di rilevazione e metodo di conta. L?ottenimento della curva di taratura apre la possibilit? a valutazioni di tipo quantitativo sui batteri presenti nel campione di partenza. In pratica, fissati i parametri della prova elencati sopra (che influenzano l?efficienza di cattura) ? stata trovata una correlazione tra numero di batteri per immagine (a 40X) raccolti da una sospensione lungo la striscia batterica ottenuta con il metodo dell?invenzione e la concentrazione batterica nella sospensione stessa, misurata con due metodi diversi comunemente impiegati. Il primo metodo di misura noto utilizza una camera per conta cellulare di B?rker-T?rk; il secondo metodo noto utilizza la classica coltura batterica che esprime la concentrazione in CFU/mL. I risultati di tali misure sono rappresentati in Figura 6, dove sono visibili sia le misure di concentrazione fatte con la celletta di B?rker-T?rk (asse y a sinistra nel grafico) sia le misure fatte utilizzando il metodo tradizionale della coltura batterica (asse y a destra), e i relativi conteggi medi di batteri catturati con le superfici attivate dell?invenzione. With the repetition of the tests as described above in Example 1 under different conditions, ? the existence of a correlation between the number of bacteria captured in a bacterial suspension with the method of the invention and the bacterial concentration in the suspension itself was verified. Yes ? what? obtained a calibration curve which allows to trace the number of bacteria captured to their concentration in the suspension. To do what? it is necessary to fix a series of parameters of the test carried out in accordance with the method: capture time; type of bioactive surface 18 used; temperature; speed? of the support 16 (speed? of rotation in the case of rotary movement, or frequency of the oscillations/vibrations or speed? of translation in the other types of movement possible); detection method and counting method. Obtaining the calibration curve opens the possibility? to quantitative evaluations on the bacteria present in the starting sample. In practice, having fixed the test parameters listed above (which influence the capture efficiency)? a correlation was found between the number of bacteria per image (at 40X) collected from a suspension along the bacterial strip obtained with the method of the invention and the bacterial concentration in the suspension itself, measured with two different commonly used methods. The first known measurement method uses a B?rker-T?rk cell count chamber; the second known method uses the classic bacterial culture which expresses the concentration in CFU/mL. The results of these measurements are shown in Figure 6, where both the concentration measurements made with the B?rker-T?rk cell (y axis on the left in the graph) and the measurements made using the traditional bacterial culture method ( right y-axis), and the related average counts of bacteria captured with the activated surfaces of the invention.
La presente invenzione ? stata descritta sopra con riferimento alle sue forme di realizzazione preferite, ma ulteriori forme di realizzazione preferite possono esistere, tutte comprese in uno stesso core inventivo, come definito dall?ambito delle rivendicazioni annesse. The present invention ? been described above with reference to its preferred embodiments, but further preferred embodiments may exist, all included in the same inventive core, as defined by the scope of the appended claims.
Claims (22)
Priority Applications (2)
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Applications Claiming Priority (1)
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| IT102021000003080A IT202100003080A1 (en) | 2021-02-11 | 2021-02-11 | A METHOD FOR CAPTURING BACTERIA FROM SUSPENSION AND RELATED DEVICE |
Publications (1)
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Family Applications (1)
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| WO2022172163A1 (en) | 2022-08-18 |
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