IT202000006754A1 - Saggi per la rivelazione di SARS-CoV-2 - Google Patents

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Chiara Brambati
Simone Bocchetta
Giulia Minnucci
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Diasorin S P A
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Description

DESCRIZIONE dell?invenzione industriale dal titolo:
?Saggi per la Rivelazione di SARS-CoV-2?
DESCRIZIONE
RIFERIMENTO ALL?ELENCO DELLE SEQUENZE:
[0001] Questa domanda include uno o pi? Elenchi di Sequenze ai sensi del 37 C.F.R.
1.821 e seguenti, che sono descritti in supporti leggibili da computer (nome del file: SARS-CoV-2_0400_0020_ST25.txt, creato il 24 marzo 2020, con dimensioni di 4304 byte), il quale file ? qui incorporato come citazione nella sua interezza.
CAMPO DELL?INVENZIONE:
[0002] La presente invenzione ? diretta a metodi per testare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione, ivi incluso un campione clinico, e ad oligonucleotidi, reagenti e kit utili in tali saggi. In particolare, la presente invenzione ? diretta a saggi che sono rapidi, accurati e specifici per la rivelazione di SARS-CoV-2.
SFONDO DELL?INVENZIONE:
I. SARS-CoV-2
[0003] Sindrome Respiratoria Acuta Grave Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ? una specie di coronavirus recentemente identificata (in precedenza, il virus era stato provvisoriamente denominato ?2019 nuovo coronavirus? o ?2019-nCoV?). L'infezione da SARS-CoV-2 si diffonde mediante la trasmissione da uomo a uomo attraverso goccioline (?droplets?) o contatto diretto e si stima che l'infezione abbia un periodo di incubazione medio di 6,4 giorni e un Numero di Riproduzione di Base di 2,24-3,58 (cio? un tempo di raddoppio dell'epidemia di 6-8 giorni) (Fang, Y. et al. (2020) ?Transmission Dynamics Of The COVID-19 Outbreak And Effectiveness Of Government Interventions: A Data-Driven Analysis,? J. Med. Virol. doi: 10.1002/jmv.25750; Zhao, W.M. et al. (2020) ?The 2019 Novel Coronavirus Resource,? Yi Chuan. 42(2):212-221; Zhu, N. et al. (2020) ?A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019,? New Engl. J. Med. 382(8):727-733).
[0004] I pazienti infetti da SARS-CoV-2 manifestano COVID-19, una condizione inizialmente caratterizzata da febbre e tosse (Kong, I. et al. (2020) ?Early Epidemiological and Clinical Characteristics of 28 Cases of Coronavirus Disease in South Korea,? Osong Public Health Res Perspect. 11(1):8-14). In circa il 20% dei pazienti, COVID-19 progredisce in una grave malattia respiratoria e polmonite che ha una mortalit? del 5-10% (1-2% di mortalit? complessiva). Il coinvolgimento polmonare bilaterale con opacit? a vetro smerigliato ? ci? che si osserva pi? comunemente dalle immagini di tomografia computerizzata del torace (Lai, C.C. et al. (2020) ?Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) And Coronavirus Disease-2019 (COVID-19): The Epidemic And The Challenges,? Int. J. Antimicrob. Agents.
55(3):105924). Poich? non ? stata ancora identificata una cura per COVID-19, il trattamento attualmente consiste in una strategia "Quattro-Anti e Due-Equilibramenti" che include antivirus, anti-shock, anti-ipossiemia, anti-infezione secondaria e mantenimento dell?equilibrio acqua, elettroliti e acidi-basi e dell?equilibrio microecologico (Xu, K. et al. (2020) ?Management Of Corona Virus Disease-19 (COVID-19): The Zhejiang Experience,? Zhejiang Da Xue Bao Yi Xue Ban.49(1):0).
[0005] I coronavirus (CoV) appartengono alla sottofamiglia Orthocoronavirinae della famiglia Coronaviridae e dell'ordine Nidovirales. La famiglia di virus Coronaviridae ? costituita da virus a RNA a filamento singolo con involucro, che possiedono un genoma di RNA di senso positivo di lunghezza di 26 a 32 kilobasi. Sono stati identificati quattro generi di coronavirus, vale a dire Alfacoronavirus (?CoV), Betacoronavirus (?CoV), Deltacoronavirus (?CoV) e Gammacoronavirus (?CoV) (Chan, J.F. et al. (2013) ?Interspecies Transmission And Emergence Of Novel Viruses: Lessons From Bats And Birds,? Trends Microbiol.21(10):544-555). Analisi evolutive hanno mostrato che pipistrelli e roditori sono le fonti geniche della maggior parte degli ?CoV e ?CoV, mentre specie aviarie sono le fonti geniche della maggior parte dei ?CoV e ?CoV.
[0006] Prima del 2019, solo sei specie di coronavirus erano note essere patogene per gli esseri umani. Quattro di queste specie erano associate a sintomi clinici lievi, ma due coronavirus, Sindrome Respiratoria Acuta Grave (SARS) coronavirus (SARS-CoV) (Marra, M.A. et al. (2003) ?The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronavirus,? Science 300(5624):1399-1404) e Sindrome Respiratoria Mediorientale (MERS) coronavirus (MERS-CoV) (Mackay, I.M. (2015) ?MERS Coronavirus: Diagnostics, Epidemiology And Transmission,? Virol. J.12:222. doi: 10.1186/s12985-015-0439-5) erano associati a una mortalit? negli esseri umani che si avvicinava al 10% (Su, S. et al. (2016) ?Epidemiology, Genetic Recombination, And Pathogenesis Of Coronaviruses,? Trends Microbiol.24:490-502; Al Johani, S. et al. (2016) ?MERS-CoV Diagnosis: An Update,? J. Infect. Public Health 9(3):216-219).
[0007] SARS-CoV-2 ? strettamente correlato (88%) a due coronavirus di tipo Sindrome Respiratoria Acuta Grave derivati dai pipistrelli, bat-SL-CoVZC45 e bat-SL-CoVZXC21, ed ? pi? lontanamente correlato a SARS-CoV (79%) ed a MERS-CoV (50%) (Xie, C. et al. (2020) ?Comparison Of Different Samples For 2019 Novel Coronavirus Detection By Nucleic Acid Amplification Tests? Int. J. Infect. Dis. /doi.org/10.1016/j.ijid.2020.02.050; Mackay, I.M. (2015) ?MERS Coronavirus: Diagnostics, Epidemiology And Transmission,? Virol. J.12:222. doi: 10.1186/s12985-015-0439-5; Gong, S.R. et al. (2018) ?The Battle Against SARS And MERS Coronaviruses: Reservoirs And Animal Models,? Animal Model Exp. Med. 1(2):125-133; Yin, Y. et al. (2018) ?MERS, SARS And Other Coronaviruses As Causes Of Pneumonia,? Respirology 23(2):130-137). L'analisi filogenetica ha rivelato che SARS-CoV-2 rientrava nel sottogenere Sarbecovirus del genere Betacoronavirus, con una lunghezza del ramo relativamente lunga fino ai suoi parenti pi? prossimi bat-SL-CoVZC45 e bat-SL-CoVZXC21, e che era geneticamente distinto da SARS-CoV (Drosten et al. (2003) ?Identification Of A Novel Coronavirus In Patients With Severe Acute Respiratory Syndrome,? New Engl. J. Med. 348:1967-1976; Lai, C.C. et al. (2020) ?Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) And Coronavirus Disease-2019 (COVID-19): The Epidemic And The Challenges,? Int. J. Antimicrob. Agents. 55(3):105924; Lu, R. et al. (2020) ?Genomic Characterisation And Epidemiology Of 2019 Novel Coronavirus: Implications For Virus Origins And Receptor Binding,? The Lancet 395(10224):565-574; Zhou, Y. et al. (2020) ?NetworkBased Drug Repurposing For Novel Coronavirus 2019-nCoV/SARS-CoV-2,? Cell Discov. 6(14): doi.org/10.1038/s41421-020-0153-3).
[0008] Il genoma di SARS-CoV-2 ? stato sequenziato da almeno 170 isolati. La sequenza di riferimento ? GenBank NC_045512 (Wang, C. et al. (2020) ?The Establishment Of Reference Sequence For SARS-CoV-2 And Variation Analysis,? J. Med. Virol. doi: 10.1002/jmv.25762; Chan, J.F. et al. (2020) ?Genomic Characterization Of The 2019 Novel Human-Pathogenic Coronavirus Isolated From A Patient With Atypical Pneumonia After Visiting Wuhan,? Emerg. Microbes. Infect.
9(1):221-236).
[0009] Confronti delle sequenze di pi? isolati del virus (MN988668 e NC_045512, isolati da Wuhan in Cina, e MN938384.1, MN975262.1, MN985325.1, MN988713.1, MN994467.1, MN994468.1, e MN997409.1) rivelano un'identit? maggiore del 99,99% (Sah, R. et al. (2020) ?Complete Genome Sequence of a 2019 Novel Coronavirus (SARS-CoV-2) Strain Isolated in Nepal,? Microbiol. Resource Announcements 9(11): e00169-20, pagine 1-3; Br?ssow, H. (2020) ?The Novel Coronavirus?A Snapshot of Current Knowledge,? Microbial Biotechnology 0:(0):1-6). Il genoma di SARS-CoV-2 ? molto simile a quello del SARS-CoV umano, con un'identit? nucleotidica complessiva di circa l'82% (Chan, J.F. et al. (2020) ?Genomic Characterization Of The 2019 Novel Human-Pathogenic Corona Virus Isolated From A Patient With Atypical Pneumonia After Visiting Wuhan,? Emerg Microbes Infect 9:221-236; Chan, J.F. et al. (2020) ?Improved Molecular Diagnosis Of COVID-19 By The Novel, Highly Sensitive And Specific COVID-19-RdRp/Hel Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay Validated In Vitro And With Clinical Specimens,? J Clin. Microbiol. JCM.00310-20. doi: 10.1128/JCM.00310-20). Sulla base della sua omologia a coronavirus correlati, ? previsto che SARS-CoV-2 codifichi 12 regioni codificanti cornici di lettura aperte (ORF) (ORF1ab, S (proteina spike), 3, E (proteina dell?involucro), M (matrice), 7, 8, 9, 10b, N, 13 e 14. La disposizione di queste regioni codificanti ? mostrata in Figura 1. Due regioni codificanti ORF sono di particolare importanza per la presente invenzione: ORF1ab e il gene S (Lu, R. et al. (2020) ?Genomic Characterisation And Epidemiology Of 2019 Novel Coronavirus: Implications For Virus Origins And Receptor Binding,? Lancet 395(10224):565-574).
A. ORF1ab
[0010] ORF1ab ? composta da 21290 nucleotidi e codifica una cornice di lettura aperta di lunghezza di 7096 amminoacidi. Tramite uno slittamento di cornice ribosomiale -1, la proteina codificata ? una poliproteina (pp) composta da un primo segmento (pp1a) di 4401 residui amminoacidici e un secondo segmento (pp1ab) di 2695 residui amminoacidici (Chen, Y, et al. (2020) ?Emerging Coronaviruses: Genome Structure, Replication, And Pathogenesis,? J. Med. Virol. 92:418-423; Lu, R. et al. (2020) ?Genomic Characterisation And Epidemiology Of 2019 Novel Coronavirus: Implications For Virus Origins And Receptor Binding,? Lancet 395(10224):565-574). Entrambi i segmenti includono la stessa sequenza leader di lunghezza di 180 amminoacidi. La poliproteina include molteplici proteine non strutturali (nsp): una proteina nsp2 di lunghezza di 638 amminoacidi, una proteina nsp3 di lunghezza di 1945 amminoacidi, una proteina nsp4 di lunghezza di 500 amminoacidi, una proteina nsp5 di lunghezza di 306 amminoacidi, una proteina nsp6 di lunghezza di 290 amminoacidi, una proteina nsp7 di lunghezza di 83 amminoacidi, una proteina nsp8 di lunghezza di 198 amminoacidi, una proteina di legame a singolo filamento nsp9 di lunghezza di 113 amminoacidi, una proteina nsp10 di lunghezza di 139 amminoacidi, una RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp) nsp12 di lunghezza di 923 amminoacidi, una elicasi nsp13 di lunghezza di 601 amminoacidi, una 3??5? esonucleasi nsp14a2 di lunghezza di 527 amminoacidi, una endoRNAsi nsp15 di lunghezza di 346 amminoacidi e una 2'-O-ribosio-metiltransferasi nsp16 di lunghezza di 298 amminoacidi (Chen, Y, et al. (2020) ?Emerging Coronaviruses: Genome Structure, Replication, And Pathogenesis,? J. Med. Virol. 92:418-423; Lu, R. et al. (2020) ?Genomic Characterisation And Epidemiology Of 2019 Novel Coronavirus: Implications For Virus Origins And Receptor Binding,? Lancet 395(10224):565-574).
B. Il Gene S
[0011] Il gene S codifica la proteina spike di SARS-CoV-2. La proteina S di SARS-CoV viene funzionalmente scissa in due subunit?: il dominio S1 e il dominio S2 (He, Y. et al. (2004) ?Receptor-Binding Domain Of SARS-CoV Spike Protein Induces Highly Potent Neutralizing Antibodies: Implication For Developing Subunit Vaccine,? Biochem. Biophys. Res. Commun. 324:773-781). Il dominio S1 di SARS-CoV media il legame al recettore, mentre il dominio S2 di SARS-CoV media la fusione alla membrana (Li, F. (2016) ?Structure, Function, And Evolution Of Coronavirus Spike Proteins,? Annu. Rev. Virol. 3:237-261; He, Y. et al. (2004) ?Receptor-Binding Domain Of SARS-CoV Spike Protein Induces Highly Potent Neutralizing Antibodies: Implication For Developing Subunit Vaccine, Biochem. Biophys. Res. Commun.
324:773-781). E? possibile che il gene S di SARS-CoV-2 abbia una funzione simile. Pertanto, la proteina spike dei coronavirus ? considerata cruciale per la determinazione del tropismo d'ospite e della capacit? di trasmissione (Lu, G. et al. (2015) ?Bat-To-Human: Spike Features Determining ?Host Jump? Of Coronaviruses SARS-CoV, MERS-CoV, And Beyond,? Trends Microbiol. 23:468-478; Wang, Q. et al. (2016) ?MERS-CoV Spike Protein: Targets For Vaccines And Therapeutics,? Antiviral. Res.
133:165-177). A questo proposito, il dominio S2 della proteina spike di SARS-CoV-2 mostra un?elevata identit? di sequenza (93%) con bat-SL-CoVZC45 e bat-SL-CoVZXC21, ma il dominio S1 di SARS-CoV-2 mostra un grado di identit? molto pi? basso (68%) con questi virus derivati dai pipistrelli (Lu, R. et al. (2020) ?Genomic Characterisation And Epidemiology Of 2019 Novel Coronavirus: Implications For Virus Origins And Receptor Binding,? Lancet 395(10224):565-574). Pertanto, SARS-CoV-2 pu? legarsi a un recettore differente da quello legato dai virus ad esso correlati, derivati dai pipistrelli. ? stato proposto che SARS-CoV-2 possa legarsi all'enzima 2 di conversione dell'angiotensina (ACE2) come recettore cellulare (Lu, R. et al. (2020) ?Genomic Characterisation And Epidemiology Of 2019 Novel Coronavirus: Implications For Virus Origins And Receptor Binding,? Lancet 395(10224):565-574).
II. Saggi per la Rivelazione di SARS-CoV-2
[0012] SARS-CoV-2 ? stato identificato per la prima volta alla fine del 2019 e si ritiene che sia un virus unico che non esisteva in precedenza. Per il primo test diagnostico per SARS-CoV-2 si ? utilizzata una trascrizione inversa-PCR in tempo reale (rRT-PCR) con impiego di sonde e primer dei geni E, N e nsp12 (RNA polimerasi RNA-dipendente; RdRp) di SARS-CoV-2 (il saggio ?SARS-CoV-2-RdRp-P2?) (Corman, V.M. et al. (2020) ?Detection Of 2019 Novel Coronavirus (2019-nCoV) By Real-Time RT-PCR,? Eurosurveill.25(3):2000045; Spiteri, G. et al. (2020) ?First Cases Of Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) In The WHO European Region, 24 January To 21 February 2020,? Eurosurveill. 25(9) doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.9.2000178).
[0013] Le sonde impiegate in tali saggi erano sonde oligonucleotidiche ?TaqMan? che sono state marcate con un fluoroforo al terminale 5' dell'oligonucleotide e complessate con un estinguente al terminale 3' dell'oligonucleotide. Il principio della sonda ?TaqMan? ? basato sull?attivit? 5??3? esonucleasica della Taq polimerasi (Peake, I. (1989) ?The Polymerase Chain Reaction,? J. Clin. Pathol. ;42(7):673-676) per la scissione della sonda a doppia marcatura una volta ibridata a una sequenza bersaglio complementare. La scissione della molecola separa il fluoroforo dall?estinguente e porta quindi alla produzione di un segnale fluorescente rivelabile.
[0014] Nel saggio SARS-CoV-2-RdRp-P2 di Corman, V.M. et al. (2020), la RdRp Probe 2 e le sonde dei geni E ed N sono descritte come specifiche per SARS-CoV-2, mentre la RdRp Probe 2 ? descritta come una ?PanSarbeco-Probe? che, oltre a SARS-CoV-2, rivela SARS-CoV e coronavirus correlati alla SARS dei pipistrelli. Si afferma che il saggio ha fornito i suoi migliori risultati con utilizzo dei primer e delle sonde del gene E e del gene nsp12 (RdRp) (rispettivamente 5,2 e 3,8 copie per 25 ?L di reazione con una probabilit? di rivelazione del 95%). Il risultante limite di rivelazione (LoD) derivante da test in replica era di 3,9 copie per 25 ?L di reazione (156 copie/mL) per il saggio del gene E e di 3,6 copie per 25 ?L di reazione (144 copie/mL) per il saggio di nsp12 (RdRp). E? stato riportato che il saggio ? specifico per SARS-CoV-2 e che richiede meno di 60 minuti per il completamento.
[0015] Il Centro statunitense per la Prevenzione e il Controllo delle Malattie (CDC) ha sviluppato un protocollo di saggio mirato al gene N di SARS-CoV-2 basato sulla rRT-PCR (Won, J. et al. (2020) ?Development Of A Laboratory-Safe And Low-Cost Detection Protocol For SARS-CoV-2 Of The Coronavirus Disease 2019 (COVID-19),? Exp. Neurobiol.29(2) doi: 10.5607/en20009).
[0016] Pfefferle, S. et al. (2020) (?Evaluation Of A Quantitative RT-PCR Assay For The Detection Of The Emerging Coronavirus SARS-CoV-2 Using A High Throughput System,? Eurosurveill.25(9) doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.9.2000152) descrive l'utilizzo di un set di primer/sonde su misura mirato al gene E. I primer impiegati sono stati modificati con basi 2?-O-metiliche a livello della loro penultima base per prevenire la formazione di dimeri di primer. La sonda ZEN a doppia estinzione (IDT) ? stata utilizzata per ridurre la fluorescenza di fondo. Il LoD era di 689,3 copie/mL con 275,72 copie per reazione a una probabilit? di rivelazione del 95%. ? stato riportato che il saggio ? specifico per SARS-CoV-2 e che richiede meno di 60 minuti.
[0017] Chan, J.F. et al. (2020) (?Improved Molecular Diagnosis Of COVID-19 By The Novel, Highly Sensitive And Specific COVID-19-RdRp/Hel Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay Validated In Vitro And With Clinical Specimens,? J. Clin. Microbiol. JCM.00310-20. doi: 10.1128/JCM.00310-20) hanno esplorato l'utilizzo di geni di SARS-CoV-2 conservati e/o abbondantemente espressi come bersagli preferiti di saggi RT-PCR per il coronavirus. Tali geni includono i geni strutturali S ed N, il gene RdRp non strutturale e ORF1ab. Chan, J.F. et al. (2020) descrivono lo sviluppo di tre saggi di trascrittasi inversa-PCR in tempo reale (rRT-PCR) mirati ai geni della RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp)/elicasi (Hel), dello spike (S) e del nucleocapside (N) di SARS-CoV-2 e confrontano tali saggi con il saggio RdRp-P2 di Corman, V.M. et al. Il LoD del saggio SARS-CoV-2-RdRp/Hel, del saggio SARS-CoV-2-S e del saggio SARS-CoV-2-N era di l,8 TCID50/ml, mentre il LoD del saggio SARS-CoV-2-RdRp-P2 era di 18 TCID50/ml. La TCID50 ? la dose infettante la met? della coltura tissutale.
[0018] E? stato progettato un protocollo di saggio basato sulla rt-PCR mirato ai geni E, N, S e RdRp per l'auto-raccolta di un campione da un soggetto tramite tampone faringeo. Il saggio richiedeva la purificazione dell?RNA basata su Trizol, e la rivelazione ? stata effettuata tramite un saggio RT-PCR utilizzando SYBR Green come fluorocromo di rivelazione. ? stato riportato che il saggio richiede circa 4 ore per il completamento (Won, J. et al. (2020) (?Development Of A Laboratory-Safe And Low-Cost Detection Protocol For SARS-CoV-2 Of The Coronavirus Disease 2019 (COVID-19),? Exp. Neurobiol.29(2) doi: 10.5607/en20009).
[0019] Sebbene precedenti saggi rRT-PCR, come il saggio SARS-CoV-2-RdRp-P2 di Corman V.M. et al., siano in grado di rivelare SARS-CoV-2, i ricercatori hanno scoperto che essi soffrono di gravi carenze. In uso, ? stato riscontrato che tali precedenti saggi richiedono una laboriosa elaborazione manuale in batch e non consentono l'accesso casuale a singoli campioni (Cordes, A.K. et al. (2020) ?Rapid Random Access Detection Of The Novel SARS-Coronavirus-2 (SARS-CoV-2, Previously 2019-nCoV) Using An Open Access Protocol For The Panther Fusion,? J. Clin. Virol.125:104305 doi: 10.1016/j.jcv.2020.104305). Inoltre, sono richiesti lunghi tempi di risposta e operazioni complicate. Questi fattori fanno s? che tali saggi impieghino generalmente pi? di 2-3 ore per generare risultati. A causa di tali fattori, per elaborare tali saggi sono necessari laboratori certificati. La necessit? di attrezzature costose e di tecnici qualificati per eseguire tali saggi precedenti di rRT-PCR ostacola l'uso di tali saggi sul campo o in posizioni mobili. Pertanto, i ricercatori hanno osservato che tali saggi precedenti hanno un'idoneit? limitata per l?uso nella diagnosi e nello screening rapidi e semplici di pazienti, cosa necessaria per contenere un?epidemia (Li, Z. et al. (2020) ?Development and Clinical Application of A Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis,? J. Med. Virol. doi: 10.1002/jmv.25727).
[0020] Pi? significativamente, ? stato riscontrato che saggi rRT-PCR precedenti, come il saggio SARS-CoV-2-RdRp-P2 di Corman V.M. et al., sono carenti di specificit? per SARS-CoV-2 (reagendo in maniera crociata con SARS-CoV o con altri patogeni) (Chan, J.F. et al. (2020) ?Improved Molecular Diagnosis Of COVID-19 By The Novel, Highly Sensitive And Specific COVID-19-RdRp/Hel Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay Validated In Vitro And With Clinical Specimens,? J. Clin. Microbiol. JCM.00310-20) e forniscono un numero significativo di risultati falsi negativi (Li, Z. et al. (2020) ?Development and Clinical Application of A Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis,? J. Med. Virol. doi: 10.1002/jmv.25727).
[0021] Ad esempio, un'analisi retrospettiva di 4880 pazienti COVID-19 identificati clinicamente. Campioni ottenuti dalle vie respiratorie dei pazienti sono stati sottoposti ad amplificazione mediante rRT-PCR dei geni della cornice di lettura aperta 1ab (ORF1ab) e della proteina del nucleocapside (N) di SARS-CoV-2. Tamponi nasali e faringei dei pazienti sono stati valutati per COVID-19 utilizzando un test rRT-PCR quantitativo (qRT-PCR). Solo il 38,42% (1875 su 4880) degli effettivi pazienti COVID-19 ? stato identificato come positivo utilizzando il test rRT-PCR. Di quelli positivi, il 39,80% era positivo mediante determinazione con sonde del gene N di SARS-CoV-2 e il 40,98% era positivo mediante determinazione con sonde della ORF1ab di SARS-CoV-2 (Liu, R. et al. (2020) ?Positive Rate Of RT-PCR Detection Of SARS-CoV-2 Infection In 4880 Cases From One Hospital In Wuhan, China, From Jan To Feb 2020,? Clinica Chimica Acta 505:172-175).
[0022] Lo studio di Chan, J.F. et al. (2020) (?Improved Molecular Diagnosis Of COVID-19 By The Novel, Highly Sensitive And Specific COVID-19-RdRp/Hel Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay Validated In Vitro And With Clinical Specimens,? J. Clin. Microbiol. JCM.00310-20. doi: 10.1128/JCM.00310-20) ha scoperto che su 273 campioni di 15 pazienti con COVID-19 confermati in laboratorio, solo il 28% era SARS-CoV-2-positivo per entrambi i saggi SARS-CoV-2-RdRp/Hel e RdRp-P2. Il saggio SARS-CoV-2-RdRp/Hel era pi? sensibile, ma confermava ancora solo il 43,6% dei pazienti come affetto da infezione da SARS-CoV-2.
[0023] In uno studio differente, l'RNA ? stato estratto da 1070 campioni clinici di 205 pazienti affetti da COVID-19. E? stata poi utilizzata la trascrizione inversa-PCR in tempo reale (rRT-PCR) per amplificare la ORF1ab di SARS-CoV-2 al fine di confermare la diagnosi di COVID-19 (Wang, W. et al. (2020) (?Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens,? JAMA doi: 10.1001/jama.2020.3786). ? stato riportato che campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare mostrano le percentuali positive pi? alte (14 su 15; 93%), seguiti da espettorato (72 su 104; 72%), tamponi nasali (5 su 8; 63%), biopsia con spazzola fibrobroncoscopica (6 su 13; 46%), tamponi faringei (126 su 398; 32%), feci (44 su 153; 29%) e sangue (3 su 307; 1%). Nessuno dei 72 campioni di urina testati ha indicato un risultato positivo. Pertanto, ad esempio, i tamponi faringei di tali pazienti realmente affetti da COVID-19 non sono riusciti a diagnosticare con precisione l'infezione da SARS-CoV-2 nel 68% di quelli testati. Anche Zhang, W. et al. (2020) (?Molecular And Serological Investigation Of 2019-nCoV Infected Patients: Implication Of Multiple Shedding Routes,? Emerg. Microbes Infect. 9(1):386-389) descrive la presenza di SARS-CoV-2 nelle feci di pazienti COVID-19, tuttavia, i risultati del suo saggio rRT-PCR hanno mostrato pi? tamponi anali positivi che tamponi orali positivi in uno stadio pi? avanzato dell'infezione, suggerendo la diffusione virale e la capacit? di trasmissione dell?infezione attraverso una via orale-fecale. Un insegnamento simile ? fornito da Tang, A. et al. (2020) (?Detection of Novel Coronavirus by RT-PCR in Stool Specimen from Asymptomatic Child, China,? Emerg Infect Dis. 26(6). doi: 10.3201/eid2606.200301). Questo documento descrive che saggi RT-PCR mirati a ORF1ab e al gene N della nucleoproteina non sono riusciti a rivelare SARS-CoV-2 in campioni di tampone nasofaringeo ed espettorato, ma che sono stati in grado di rivelare il virus in campioni di feci.
[0024] In un ulteriore studio su individui affetti da COVID-19, ? stato osservato che anche saggi ripetuti per SARS-CoV-2 riportavano risultati negativi (Wu, X. et al. (2020) (?Co-infection with SARS-CoV-2 and Influenza A Virus in Patient with Pneumonia, China,? 26(6): pagine 1-7. La pubblicazione insegna che saggi esistenti per SARS-CoV-2 non hanno una sensibilit? sufficiente e quindi portano a diagnosi di falsi negativi.
[0025] Alla luce delle carenze riscontrate nell'utilizzo di saggi rRT-PCR precedenti, come il saggio SARS-CoV-2-RdRp-P2 di Corman V.M. et al., sono stati esplorati altri approcci per il saggio di SARS-CoV-2. Li, Z. et al. (2020) (?Development and Clinical Application of A Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis,? J. Med. Virol. doi: 10.1002/jmv.25727) insegna che potrebbe essere usato un saggio immunologico a flusso laterale ?point-of-care? per rivelare simultaneamente anticorpi IgM e IgG anti-SARS-CoV-2 nel sangue umano ed evitare cos? i problemi del saggio RdRp-P2 di Corman, V.M. et al. I saggi immunologici, tuttavia, potrebbero non riuscire a discriminare tra individui affetti da COVID-19 e individui che sono stati precedentemente infettati con SARS-CoV-2, ma che da allora sono guariti.
[0026] In sintesi, nonostante tutti gli sforzi precedenti, rimane la necessit? di un metodo per testare in modo rapido e accurato la presenza di SARS-CoV-2. La presente invenzione ? diretta a questo e ad altri scopi.
SINTESI DELL?INVENZIONE:
[0027] La presente invenzione ? diretta a metodi per testare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione, ivi incluso un campione clinico, e ad oligonucleotidi, reagenti e kit utili in tali saggi. In particolare, la presente invenzione ? diretta a saggi che sono rapidi, accurati e specifici per la rivelazione di SARS-CoV-2.
[0028] In dettaglio, l'invenzione fornisce un oligonucleotide, avente un terminale 5' e un terminale 3', in cui l'oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste essenzialmente della sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12.
[0029] L?invenzione fornisce inoltre un oligonucleotide, avente un terminale 5' e un terminale 3', in cui l'oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12.
[0030] L?invenzione fornisce inoltre l?oligonucleotide descritto sopra, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1.
[0031] L?invenzione fornisce inoltre l?oligonucleotide descritto sopra, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2.
[0032] L?invenzione fornisce inoltre l?oligonucleotide descritto sopra, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:3.
[0033] L?invenzione fornisce inoltre l?oligonucleotide descritto sopra, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:4.
[0034] L?invenzione fornisce inoltre l?oligonucleotide descritto sopra, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5.
[0035] L?invenzione fornisce inoltre l?oligonucleotide descritto sopra, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6.
[0036] L?invenzione fornisce inoltre l?oligonucleotide descritto sopra, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:7.
[0037] L?invenzione fornisce inoltre l?oligonucleotide descritto sopra, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:8.
[0038] L?invenzione fornisce inoltre l?oligonucleotide descritto sopra, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9.
[0039] L?invenzione fornisce inoltre l?oligonucleotide descritto sopra, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:10.
[0040] L?invenzione fornisce inoltre l?oligonucleotide descritto sopra, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11.
[0041] L?invenzione fornisce inoltre l?oligonucleotide descritto sopra, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:12.
[0042] L?invenzione fornisce inoltre l?oligonucleotide descritto sopra, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9, o della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:10, in cui l?oligonucleotide ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo.
[0043] L?invenzione fornisce inoltre l?oligonucleotide descritto sopra, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11, o della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:12, in cui l?oligonucleotide ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo.
[0044] L'invenzione fornisce inoltre la forma di realizzazione degli oligonucleotidi descritti sopra, in cui il fluoroforo ha una lunghezza d'onda di eccitazione compresa nell'intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d'onda di emissione compresa nell'intervallo di circa 447-705 nm.
[0045] L'invenzione fornisce inoltre la forma di realizzazione di tali oligonucleotidi descritti sopra, in cui il fluoroforo ? JOE o FAM.
[0046] L'invenzione fornisce inoltre un metodo per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui il metodo prevede di:
(I) incubare il campione clinico in vitro in presenza di:
(1) una trascrittasi inversa e una DNA polimerasi avente un?attivit? 5??3? esonucleasica; e
(2) un Primer Forward di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1;
(3) un Primer Reverse di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2;
(4) una Sonda di ORF1ab, la Sonda di ORF1ab essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, in cui la Sonda oligonucleotidica di ORF1ab ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e
in cui l'incubazione avviene in una reazione in condizioni sufficienti a consentire:
(a) ai Primer Forward e Reverse di ORF1ab di mediare un?amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi di una regione della ORF1ab di SARS-CoV-2 per produrre in tal modo molecole oligonucleotidiche amplificate di ORF1ab, se il SARS-CoV-2 ? presente nel campione clinico;
(b) alla Sonda di ORF1ab di ibridarsi alle molecole oligonucleotidiche amplificate di ORF1ab;
(c) all?attivit? 5??3? esonucleasica di idrolizzare la Sonda di ORF1ab ibridata, per separare in tal modo il suo fluoroforo dal suo estinguente e far s? che diventi rivelabile un segnale fluorescente; e
(II) determinare se il SARS-CoV-2 sia presente nel campione clinico determinando se sia divenuto rivelabile un segnale fluorescente del fluoroforo.
[0047] L?invenzione fornisce inoltre la forma di realizzazione del metodo descritto sopra, in cui il fluoroforo ha una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm.
[0048] L?invenzione fornisce inoltre la forma di realizzazione del metodo descritto sopra, in cui il fluoroforo ? JOE o FAM.
[0049] L?invenzione fornisce inoltre un metodo per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui il metodo prevede di:
(I) incubare il campione clinico in vitro in presenza di:
(1) una trascrittasi inversa e una DNA polimerasi avente un?attivit? 5??3? esonucleasica; e
(2) un Primer Forward del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5;
(3) un Primer Reverse del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6;
(4) una Sonda del Gene S, la Sonda del Gene S essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12, in cui la Sonda oligonucleotidica del Gene S ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e in cui l?incubazione avviene in una reazione in condizioni sufficienti a consentire:
(a) ai Primer Forward e Reverse del Gene S di mediare un?amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi di una regione del gene S di SARS-CoV-2 per produrre in tal modo molecole oligonucleotidiche amplificate del gene S, se il SARS-CoV-2 ? presente nel campione clinico;
(b) alla Sonda del Gene S di ibridarsi a molecole oligonucleotidiche amplificate del gene S;
(c) all?attivit? 5??3? esonucleasica di idrolizzare la Sonda del Gene S ibridata, per separare in tal modo il suo fluoroforo dal suo estinguente e far s? che diventi rivelabile un segnale fluorescente; e
(II) determinare se il SARS-CoV-2 sia presente nel campione clinico determinando se sia divenuto rivelabile un segnale fluorescente del fluoroforo.
[0050] L?invenzione fornisce inoltre la forma di realizzazione del metodo descritto sopra, in cui il fluoroforo ha una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm.
[0051] L?invenzione fornisce inoltre la forma di realizzazione degli oligonucleotidi descritti sopra, in cui il fluoroforo ? JOE o FAM.
[0052] L?invenzione fornisce inoltre un metodo per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui il metodo prevede di:
(I) incubare il campione clinico in vitro in presenza di:
(1) una trascrittasi inversa e una DNA polimerasi avente un?attivit? 5??3? esonucleasica; e
(2) un Primer Forward del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5;
(3) un Primer Reverse del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6;
(4) una Sonda del Gene S, la Sonda del Gene S essendo an oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12, in cui la Sonda oligonucleotidica del Gene S ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e
(5) un Primer Forward di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1;
(6) un Primer Reverse di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2;
(7) una Sonda di ORF1ab, la Sonda di ORF1ab essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, in cui la Sonda oligonucleotidica di ORF1ab ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; in cui la fluorescenza del fluoroforo della Sonda di ORF1ab ? distinguibile dalla fluorescenza del fluoroforo della Sonda del Gene S; e
in cui l?incubazione avviene in una reazione in condizioni sufficienti a consentire:
(a) ai Primer Forward e Reverse del Gene S di mediare un?amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi di una regione del gene S di SARS-CoV-2 per produrre in tal modo molecole oligonucleotidiche amplificate del gene S, se il SARS-CoV-2 ? presente nel campione clinico;
(b) alla Sonda del Gene S di ibridarsi alle molecole oligonucleotidiche amplificate del gene S;
(c) all?attivit? 5??3? esonucleasica di idrolizzare la Sonda del Gene S ibridata, per separare in tal modo il suo fluoroforo dal suo estinguente e far s? che diventi rivelabile un segnale fluorescente; e
(II) determinare se il SARS-CoV-2 sia presente nel campione clinico determinando se sia divenuto rivelabile un segnale fluorescente del fluoroforo.
[0053] L?invenzione fornisce inoltre le forme di realizzazione di tali metodi, in cui il fluoroforo della Sonda di ORF1ab e il fluoroforo della Sonda del Gene S hanno una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm.
[0054] L?invenzione fornisce inoltre le forme di realizzazione di tali metodi, in cui uno tra i fluorofori della Sonda di ORF1ab e della Sonda del Gene S ? JOE e l?altro di tali fluorofori ? FAM.
[0055] L?invenzione fornisce inoltre un kit per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui il kit comprende:
(I) un contenitore contenente un reagente, in cui il reagente comprende: (1) un Primer Forward di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1;
(2) un Primer Reverse di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2;
(3) una Sonda di ORF1ab, la Sonda di ORF1ab essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, in cui la Sonda oligonucleotidica di ORF1ab ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e
(II) istruzioni per l?uso di tale reagente per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 nel campione clinico.
[0056] L?invenzione fornisce inoltre le forme di realizzazione di tale kit, in cui il fluoroforo della Sonda di ORF1ab ha una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm.
[0057] L?invenzione fornisce inoltre le forme di realizzazione di tale kit, in cui il fluoroforo della Sonda di ORF1ab ? JOE o FAM.
[0058] L?invenzione fornisce inoltre un kit per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui il kit comprende:
(I) un contenitore contenente un reagente, in cui il reagente comprende:
(1) un Primer Forward del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5;
(2) un Primer Reverse del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6;
(3) una Sonda del Gene S, la Sonda del Gene S essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12, in cui la Sonda oligonucleotidica del Gene S ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e
(II) istruzioni per l?uso di tale reagente per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 nel campione clinico.
[0059] L?invenzione fornisce inoltre le forme di realizzazione di tale kit, in cui il fluoroforo della Sonda del Gene S ha una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm.
[0060] L?invenzione fornisce inoltre le forme di realizzazione di tale kit, in cui il fluoroforo della Sonda del Gene S ? JOE o FAM.
[0061] L?invenzione fornisce inoltre un kit per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui il kit comprende:
(I) reagenti per rivelare ORF1ab di SARS-CoV-2, in cui i reagenti per la rivelazione di ORF1ab di SARS-CoV-2 comprendono:
(1) un Primer Forward di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1;
(2) un Primer Reverse di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2; e
(3) una Sonda di ORF1ab, la Sonda di ORF1ab essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, in cui la Sonda oligonucleotidica di ORF1ab ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e
(II) istruzioni per l?uso di tali reagenti di rivelazione per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 nel campione clinico.
[0062] L?invenzione fornisce la forma di realizzazione di tale kit in cui il fluoroforo della Sonda di ORF1ab ha una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm. L?invenzione fornisce anche la forma di realizzazione di tale kit in cui il fluoroforo della ORF1ab ? JOE o FAM.
[0063] L?invenzione fornisce inoltre un kit per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui il kit comprende:
(I) reagenti per rivelare il gene S di SARS-CoV-2, in cui i reagenti per la rivelazione del gene S di SARS-CoV-2 comprendono:
(1) un Primer Forward del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5;
(2) un Primer Reverse del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6; e
(3) una Sonda del Gene S, la Sonda del Gene S essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12, in cui la Sonda oligonucleotidica del Gene S ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e
(II) istruzioni per l?uso di tali reagenti di rivelazione per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 nel campione clinico.
[0064] L?invenzione fornisce la forma di realizzazione di tale kit in cui il fluoroforo della Sonda del Gene S ha una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm. L?invenzione fornisce anche la forma di realizzazione di tale kit in cui il fluoroforo della ORF1ab ? JOE o FAM.
[0065] L?invenzione fornisce inoltre un kit per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui il kit comprende:
(I) (A) reagenti per rivelare ORF1ab di SARS-CoV-2, in cui i reagenti per la rivelazione di ORF1ab di SARS-CoV-2 comprendono: (1) un Primer Forward di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1;
(2) un Primer Reverse di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2; e
(3) una Sonda di ORF1ab, la Sonda di ORF1ab essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, in cui la Sonda oligonucleotidica di ORF1ab ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e
(B) reagenti per rivelare il gene S di SARS-CoV-2, in cui i reagenti per la rivelazione del gene S di SARS-CoV-2 comprendono: (1) un Primer Forward del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5;
(2) un Primer Reverse del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6; e
(3) una Sonda del Gene S, la Sonda del Gene S essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12, in cui la Sonda oligonucleotidica del Gene S ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; in cui la fluorescenza del fluoroforo della Sonda del Gene S ? distinguibile dalla fluorescenza del fluoroforo della Sonda di ORF1ab; e (II) istruzioni per l?uso di tale reagente per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 nel campione clinico.
[0066] L?invenzione fornisce inoltre le forme di realizzazione di tali kit in cui il fluoroforo della Sonda di ORF1ab e il fluoroforo della Sonda del Gene S hanno una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm.
[0067] L?invenzione fornisce inoltre le forme di realizzazione di tali kit in cui uno tra i fluorofori della Sonda di ORF1ab e della Sonda del Gene S ? JOE e l?altro di tali fluorofori ? FAM.
BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI:
[0068] La Figura 1 fornisce un?illustrazione della struttura di SARS-CoV-2 e delle sue cornici di lettura aperte (ORF). La sequenza presentata ? quella della sequenza di SARS-CoV-2 di riferimento (GenBank NC_045512).
[0069] La Figura 2 mostra l?allineamento e l?orientamento del Primer Forward di ORF1ab e del Primer Reverse di ORF1ab della presente invenzione e la regione di ORF1ab che questi primer amplificano in un saggio rRT-PCR per SARS-CoV-2. Le sequenze dei primer sono indicate con lettere maiuscole sottolineate; le sequenze delle sonde sono indicate con lettere maiuscole in riquadro.
[0070] La Figura 3 mostra l?allineamento e l?orientamento del Primer Forward del Gene S e del Primer Reverse del Gene S della presente invenzione e la regione del gene S che questi primer amplificano in un saggio rRT-PCR per SARS-CoV-2. Le sequenze dei primer sono indicate con lettere maiuscole sottolineate; le sequenze delle sonde sono indicate con lettere maiuscole in riquadro.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE:
[0071] La presente invenzione ? diretta a metodi per testare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione, ivi incluso un campione clinico, e ad oligonucleotidi, reagenti e kit utili in tali saggi. In particolare, la presente invenzione ? diretta a saggi che sono rapidi, accurati e specifici per la rivelazione di SARS-CoV-2.
[0072] Come qui utilizzato, un saggio per la rivelazione di SARS-CoV-2 ? detto essere ?specifico? per SARS-CoV-2 se pu? essere condotto in condizioni che gli consentono di rivelare SARS-CoV-2 senza mostrare reattivit? crociata con il DNA umano o il DNA (o cDNA) di altri patogeni, specialmente di altri patogeni coronavirali. In particolare, un saggio per la rivelazione di SARS-CoV-2 ? detto essere specifico per SARS-CoV-2 se pu? essere condotto in condizioni che gli consentono di rivelare SARS-CoV-2 senza mostrare reattivit? crociata con DNA (o cDNA) di Influenza A, Influenza B, Virus Respiratorio Sinciziale, Streptococcus di Gruppo A (Streptococcus pyogenes), Parainfluenza I, Parainfluenza III, Haemophilus parainfluenzae, Enterovirus o Adenovirus, o con SARS-CoV, MERS-CoV, o con coronavirus del tipo Sindrome Respiratoria Acuta Grave derivati dal pipistrello, come bat-SL-CoVZC45 o bat-SL-CoVZXC21. Pi? preferibilmente, un saggio per la rivelazione di SARS-CoV-2 ? detto essere specifico per SARS-CoV-2 se pu? essere condotto in condizioni che gli consentono di rivelare SARS-CoV-2 senza mostrare reattivit? crociata con DNA (o cDNA) di Adenovirus 1, Bordetella pertussis, Chlamydophila pneumoniae, Coronavirus 229E, Coronavirus NL63, Coronavirus OC43, Enterovirus 68, Haemophilus influenzae, Metapneumovirus umano (hMPV-9), Influenza A H3N2 (Hong Kong 8/68), Influenza B (Phuket 3073/2013), Legionella pneumophilia, MERS-Coronavirus, Mycobacterium tuberculosis, Parainfluenza di Tipo 1, Parainfluenza di Tipo 2, Parainfluenza di Tipo 3, Parainfluenza di Tipo 4A, Rinovirus B14, RSV A Long, RSV B Washington, SARS-Coronavirus, SARS-Coronavirus HKU39849, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, leucociti umani, o fluidi nasali umani combinati.
[0073] Come qui utilizzato, un saggio per la rivelazione di SARS-CoV-2 ? detto essere ?accurato? per SARS-CoV-2 se ? in grado di rivelare una dose virale di 400 copie/ml di SARS-CoV-2 con un LoD almeno dell?80%, e di rivelare una dose virale di 500 copie/ml di SARS-CoV-2 con un LoD almeno del 90%.
[0074] Come qui utilizzato, un saggio per la rivelazione di SARS-CoV-2 ? detto essere ?rapido? per SARS-CoV-2 se ? in grado di fornire una determinazione della presenza o dell?assenza di SARS-CoV-2 entro 2 ore, e pi? preferibilmente entro 90 minuti e, di massima preferenza, entro 1 ora dall?inizio del saggio.
III. Saggi Preferiti per la Rivelazione di SARS-CoV-2
A. Formati di Saggio Preferiti
[0075] La presente invenzione fornisce un saggio per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico. Tale rivelazione pu? essere effettuata in situ o in vitro, ma ? preferibilmente condotta in vitro. I campioni clinici che possono essere valutati includono qualsiasi campione clinico che possa contenere SARS-CoV-2 e includono campioni di sangue, campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare, campioni di feci, campioni di biopsia con spazzola fibrobroncoscopica, campioni di tampone nasale, campioni di tampone rinofaringeo, campioni di tampone faringeo, campioni di espettorato e campioni di urina. Preferibilmente, comunque, il campione clinico impiegato sar? un campione di tampone nasale, un campione di tampone rinofaringeo, un campione di tampone faringeo o un campione di espettorato e, di massima preferenza, il campione clinico impiegato sar? un campione di tampone rinofaringeo. In una forma di realizzazione, il campione verr? pretrattato per estrarre l'RNA che pu? essere presente nel campione. In alternativa, e pi? preferibilmente, il campione verr? valutato senza precedente estrazione dell?RNA.
[0076] La presente invenzione utilizza preferibilmente un saggio di trascrizione inversa ? reazione a catena della polimerasi in tempo reale (rRT-PCR) per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in campioni clinici. I saggi rRT-PCR sono ben noti e ampiamente utilizzati nella virologia diagnostica (vedere, p.es., Pang, J. et al. (2020) ?Potential Rapid Diagnostics, Vaccine and Therapeutics for 2019 Novel Coronavirus (2019-nCoV): A Systematic Review,? J. Clin. Med. 26;9(3)E623 doi: 10.3390/jcm9030623; Kralik, P. et al. (2017) ?A Basic Guide to Real-Time PCR in Microbial Diagnostics: Definitions, Parameters, and Everything,? Front. Microbiol.
8:108. doi: 10.3389/fmicb.2017.00108).
[0077] Per descrivere pi? facilmente i saggi rRT-PCR della presente invenzione, tali saggi possono essere considerati come implicanti una pluralit? di passaggi di reazione: (1) la trascrizione inversa dell?RNA di SARS-CoV-2 che pu? essere presente nel campione clinico che deve essere valutato per la presenza di SARS-CoV-2; (2) l?amplificazione PCR-mediata del cDNA di SARS-CoV-2 prodotto da tale trascrizione inversa;
(3) l?ibridazione di sonde SARS-CoV-2-specifiche a tali prodotti di amplificazione; (4) la scissione 5??3? esonucleasica, dipendente da filamento doppio, delle sonde SARS-CoV-2-specifiche ibridate; e
(5) la rivelazione dei fluorofori non estinti delle sonde a significare che il campione clinico valutato conteneva SARS-CoV-2.
[0078] Si comprender? che tali passaggi possono essere condotti separatamente (ad esempio, in due o pi? camere di reazione, oppure aggiungendo i reagenti per i diversi passaggi in momenti differenti, ecc.). Tuttavia, si preferisce che tali passaggi vengano condotti all'interno della stessa camera di reazione e che tutti i reagenti necessari per i saggi rRT-PCR della presente invenzione vengano forniti alla camera di reazione all'inizio del saggio. Si comprender? anche che sebbene la reazione a catena della polimerasi (PCR) (vedere, p.es., Ghannam, M,G, et al. (2020) ?Biochemistry, Polymerase Chain Reaction (PCR),? StatPearls Publishing, Treasure Is.; pp.1-4; Lorenz, T.C. (2012) ?Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting And Optimization Strategies,? J. Vis. Exp. 2012 May 22;(63):e3998; pp. 1-15) sia il metodo preferito per amplificare il cDNA di SARS-CoV-2 prodotto mediante la trascrizione inversa, in alternativa potrebbero essere impiegate altre tecnologie di amplificazione del DNA.
[0079] Di conseguenza, in una forma di realizzazione preferita, i saggi rRT-PCR della presente invenzione comprendono l'incubazione di un campione clinico in presenza di una DNA polimerasi, una trascrittasi inversa, una o pi? coppie di primer SARS-CoV-2-specifici, una o pi? sonde SARS-CoV-2-specifiche (in cui, tipicamente, almeno una sonda per ciascuna regione viene amplificata da una coppia di primer impiegata), desossinucleotidi trifosfato (dNTP) e tamponi. Le condizioni di incubazione sono rese cicliche per consentire la trascrizione inversa dell'RNA di SARS-CoV-2, l'amplificazione del cDNA di SARS-CoV-2, l'ibridazione di sonde SARS-CoV-2-specifiche a tale cDNA, la scissione delle sonde SARS-CoV-2-specifiche ibridate e la rivelazione di fluorofori non estinti delle sonde.
[0080] I saggi rRT-PCR della presente invenzione impiegano almeno un set di almeno un primer "Forward" che si ibrida a una porzione polinucleotidica di un primo filamento di una molecola di DNA e di almeno un primer "Reverse" che si ibrida a una porzione polinucleotidica di un secondo filamento (complementare) di tale molecola di DNA.
[0081] Preferibilmente, tali primer Forward e Reverse consentiranno l'amplificazione di una regione di ORF1ab, che codifica una poliproteina non strutturale di SARS-CoV-2 e/o di una regione del gene S, che codifica la glicoproteina superficiale degli spike virali ed ? necessaria per il targeting delle cellule ospiti; la glicoproteina superficiale degli spike di SARS-CoV-2 ? una proteina chiave per caratterizzare specificamente un coronavirus come SARS-CoV-2 (Chen, Y. et al. (2020) ?Structure Analysis Of The Receptor Binding Of 2019-Ncov,? Biochem. Biophys. Res. Commun. 525:135-140; Masters, P.S. (2006) ?The Molecular Biology Of Coronaviruses,? Adv. Virus Res.
66:193-292). L'amplificazione di uno solo di questi due bersagli ? sufficiente per la determinazione specifica della presenza di SARS-CoV-2 nei campioni clinici. Si preferisce, tuttavia, effettuare il saggio per SARS-CoV-2 amplificando entrambi questi bersagli.
[0082] La presenza di tali molecole amplificate viene preferibilmente rivelata utilizzando sonde che sono in grado di ibridarsi a una regione oligonucleotidica presente all'interno dell'oligonucleotide che viene amplificato dai primer SARS-CoV-2-specifici descritti sopra. Tale rivelazione pu? essere realizzata utilizzando qualsiasi metodo adatto, p.es. sonde a faro molecolare, primer-sonde scorpione, sonde TaqMan, ecc. (Navarro, E. et al. (2015) ?Real-Time PCR Detection Chemistry,? Clin. Chim. Acta 439:231-250). Tutti questi metodi impiegano un oligonucleotide che ? marcato con un fluoroforo e complessato con un estinguente della fluorescenza di tale fluoroforo.
[0083] In commercio sono disponibili e noti molti diversi fluorofori ed estinguenti (p.es., Biosearch Technologies, Gene Link), ed essi possono essere utilizzati secondo i metodi della presente invenzione. Fluorofori preferiti includono i fluorofori Biosearch Blue, Alexa488, FAM, Oregon Green, Rhodamine Green-X, NBD-X, TET, Alexa430, BODIPY R6G-X, CAL Fluor Gold 540, JOE, Yakima Yellow, Alexa 532, VIC, HEX, e CAL Fluor Orange 560 (che hanno una lunghezza d'onda di eccitazione compresa nell'intervallo di circa 352-538 nm e una lunghezza d'onda di emissione compresa nell'intervallo di circa 447-559 nm, la cui fluorescenza pu? essere estinta con l'estinguente BHQ1), o i fluorofori RBG, Alexa555, BODIPY 564/570, BODIPY TMR-X, Quasar 570, Cy3, Alexa 546, NED, TAMRA, Rhodamine Red-X, BODIPY 581/591, Redmond Red, CAL Fluor Red 590, Cy3.5, ROX, Alexa 568, CAL Fluor Red 610, BODIPY TR-X, Texas Red, CAL Fluor Red 635, Pulsar 650, Cy5, Quasar 670, CY5.5, Alexa 594, BODIPY 630/650-X, o Quasar 705 (che hanno una lunghezza d'onda di eccitazione compresa nell'intervallo di circa 524-690 nm e una lunghezza d'onda di emissione compresa nell'intervallo di circa 557-705 nm, la cui fluorescenza pu? essere estinta con l'estinguente BHQ2). Le sonde TaqMan SARS-CoV-2-specifiche della presente invenzione sono marcate ai loro terminali 5? con il fluoroforo 2',7'-dimetossi-4',5'-dicloro-6-carbossifluoresceina (?JOE?) o con il fluoroforo 5(6)-carbossifluoresceina (?FAM?). JOE ? un fluoroforo xantenico con un'emissione nell'intervallo del giallo (lunghezza d'onda di assorbimento di 520 nm; lunghezza d'onda di emissione di 548 nm). FAM ? una molecola di carbossifluoresceina con una lunghezza d'onda di assorbimento di 495 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 517 nm; viene tipicamente fornita sotto forma di miscela di due isomeri (5-FAM e 6-FAM). Quasar 670 ? simile ai coloranti cianinici e ha una lunghezza d'onda di assorbimento di 647 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 670 nm.
[0084] Il ?black hole quencher 1? (?BHQ1?) ? un estinguente preferito per i fluorofori FAM e JOE. BHQ1 estingue i segnali fluorescenti di 480-580 nm e ha un massimo di assorbimento a 534 nm.
[0085] Il ?black hole quencher 2? (?BHQ2?) ? un estinguente preferito per Quasar 670. BHQ2 estingue i segnali fluorescenti di 560-670 nm e ha un massimo di assorbimento a 579 nm.
[0086] JOE, FAM, Quasar 670, BHQ1 e BHQ2 sono ampiamente disponibili in commercio (p.es., Sigma Aldrich; Biosearch Technologies, etc.) e vengono accoppiati a oligonucleotidi utilizzando metodi ben noti (vedere, p.es., Zearfoss, N.R. et al. (2012) ?End-Labeling Oligonucleotides with Chemical Tags After Synthesis,? Meth. Mol. Biol. 941:181-193). Sonde oligonucleotidiche marcate di qualsiasi sequenza desiderata possono essere ottenute commercialmente (p.es., ThermoFisher Scientific) gi? marcate con un fluoroforo desiderato e complessate con un estinguente desiderato.
[0087] Come discusso sopra, la prossimit? dell?estinguente di una sonda TaqMan al fluoroforo della sonda determina un?estinzione del segnale fluorescente. L'incubazione della sonda in presenza di una 5??3? esonucleasi dipendente da doppio filamento (quale l?attivit? 5??3? esonucleasica della Taq polimerasi) scinde la sonda quando ibridata a una sequenza bersaglio complementare, separando cos? il fluoroforo dall?estinguente e consentendo la produzione di un segnale fluorescente rivelabile. La chimica e la progettazione delle sonde ?TaqMan? sono passate in rassegna da Holland, P.M. et al. (1991) (?Detection Of Specific Polymerase Chain Reaction Product By Utilizing The 5'?3' Exonuclease Activity Of Thermus Aquaticus DNA Polymerase,? Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88(16):7276-7280), da Navarro, E. et al. (2015) (?Real-Time PCR Detection Chemistry,? Clin. Chim. Acta 439:231-250), e da Gasparic, B.M. et al. (2010) (?Comparison Of Nine Different Real-Time PCR Chemistries For Qualitative And Quantitative Applications In GMO Detection,? Anal. Bioanal. Chem.
396(6):2023-2029).
[0088] In alternativa, si possono impiegare sonde a faro molecolare per rivelare oligonucleotidi di SARS-CoV-2 amplificati secondo la presente invenzione. Le sonde a faro molecolare sono anch?esse marcate con un fluoroforo e complessate con un estinguente. Tuttavia, in tali sonde, l?estinzione della fluorescenza del fluoroforo avviene solo quando l?estinguente ? direttamente adiacente al fluoroforo. Le sonde a faro molecolare sono quindi progettate per adottare una struttura a forcina quando libere in soluzione (portando cos? il colorante fluorescente e l?estinguente in stretta prossimit?). Quando una sonda a faro molecolare si ibrida a un bersaglio, il fluoroforo si separa dall'estinguente e la fluorescenza del fluoroforo diventa rivelabile. A differenza delle sonde TaqMan, le sonde a faro molecolare sono progettate per rimanere intatte durante la reazione di amplificazione e devono rilegarsi al bersaglio in ogni ciclo per la misurazione del segnale. La chimica e la progettazione delle sonde a faro molecolare sono passate in rassegna da Han, S.X. et al. (2013) (?Molecular Beacons: A Novel Optical Diagnostic Tool,? Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 61(2):139-148), da Navarro, E. et al. (2015) (?Real-Time PCR Detection Chemistry,? Clin. Chim. Acta 439:231-250), da Goel, G. et al. (2005) (?Molecular Beacon: A Multitask Probe,? J. Appl. Microbiol. 99(3):435-442) e da Zheng, J. et al. (2015) (?Rationally Designed Molecular Beacons For Bioanalytical And Biomedical Applications,? Chem. Soc. Rev.
44(10):3036-3055).
[0089] In alternativa, possono essere impiegate primer-sonde scorpione (Whitcombe, D. et al. (1999) ?Detection Of PCR Products Using Self-Probing Amplicons And Fluorescence,? Nat. Biotechnol. 17(8):804-807) per rivelare oligonucleotidi di SARS-CoV-2 amplificati secondo la presente invenzione. Le primer-sonde scorpione sono anch?esse progettate per adottare una struttura a forcina quando libere in soluzione e sono anche marcate con un fluoroforo al loro terminale 5? e complessate con un estinguente al loro terminale 3?. Le primer-sonde scorpione differiscono dalle sonde a faro molecolare in quanto la loro estremit? 3? ? attaccata alla loro estremit? 5? per mezzo di un bloccante di esaetilenglicole (HEG). Tale attacco impedisce l'estensione mediata dalla polimerasi del terminale 3? della primer-sonda scorpione. Tuttavia, dopo che la primer-sonda scorpione si ? legata al suo DNA bersaglio, la polimerasi copia la sequenza di nucleotidi dalla sua estremit? 3?. Nella fase di denaturazione successiva, la sequenza specifica della primer-sonda scorpione si lega alla regione complementare all'interno dello stesso filamento di DNA appena amplificato. Questa ibridazione apre la struttura a forcina e, di conseguenza, separa il fluoroforo delle molecole dal suo estinguente e consente di rivelare la fluorescenza.
[0090] In una forma di realizzazione preferita, le sonde della presente invenzione sono sonde TaqMan. Come descritto sopra, tali sonde sono marcate ai loro terminali 5' con un fluoroforo e sono complessate ai loro terminali 3' con un estinguente della fluorescenza di tale fluoroforo. Al fine di rivelare simultaneamente l'amplificazione di due porzioni polinucleotidiche di SARS-CoV-2, vengono impiegate due sonde TaqMan che hanno fluorofori differenti (con lunghezze d'onda di emissione differenti e distinguibili); gli estinguenti impiegati possono essere uguali o differenti. In una forma di realizzazione dell?invenzione, il terminale 5? della Sonda di ORF1ab ? marcato con il fluoroforo JOE e il terminale 3? di tale sonda ? complessato con l?estinguente BHQ1, e il terminale 5? della Sonda del Gene S ? marcato con il fluoroforo FAM e il terminale 3? di tale sonda ? complessato con l?estinguente BHQ1. In una forma di realizzazione alternativa, il terminale 5? della Sonda di ORF1ab ? marcato con il fluoroforo FAM e il terminale 5? della Sonda del Gene S ? marcato con il fluoroforo JOE. L?utilizzo di tali due fluorofori consente l?impiego di entrambe le sonde nello stesso saggio.
[0091] I primer e le sonde preferiti descritti di seguito sono stati progettati per la rivelazione specifica di SARS-CoV-2. ? stato mostrato che ciascun bersaglio da solo fornisce una rivelazione sensibile e specifica di SARS-CoV-2 senza rivelazione di, o reattivit? crociata con, altri coronavirus. L?invenzione include oligonucleotidi le cui sequenze nucleotidiche consistono di, consistono essenzialmente di, o sono ?varianti? di tali primer e sonde preferiti. Come qui utilizzato, un oligonucleotide ? una ?variante? di un altro oligonucleotide se conserva la funzione di tale oligonucleotide (ad esempio, agendo da primer o sonda specifico/a), ma:
(1) ? privo di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleotidi dei nucleotidi di tale primer o sonda, oppure
(2) ? privo di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dei 10 nucleotidi 3?-terminali di tale primer o sonda, oppure
(3) ? privo di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dei 10 nucleotidi 5?-terminali di tale primer o sonda, oppure
(4) ha una sequenza che differisce da quella di tale primer o sonda per il fatto di avere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o pi? di 10 nucleotidi addizionali, oppure (5) ha una sequenza che differisce da quella di tale primer o sonda per il fatto di avere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o pi? di 10 nucleotidi di sostituzione al posto dei nucleotidi presenti in tale primer o sonda, oppure
(6) possiede una combinazione di tali (1)-(5).
B. Primer di SARS-CoV-2-Specifici Preferiti
1. Primer di ORF1ab Preferiti
[0092] Il primo set di primer comprende un ?Primer Forward di ORF1ab? e un ?Primer Reverse di ORF1ab?, le cui sequenze sono adatte per amplificare una regione della ORF1ab di SARS-CoV-2. Sebbene secondo la presente invenzione possano essere impiegati qualsiasi Primer Forward e Reverse di ORF1ab che siano in grado di mediare tale amplificazione, si preferisce impiegare Primer Forward e Reverse di ORF1ab che possiedono vantaggi distintivi. Il Primer Forward di ORF1ab preferito della presente invenzione comprende, consiste essenzialmente di, o consiste di, la sequenza (SEQ ID NO:1) atggtagagttgatggtcaa, che corrisponde alla sequenza nucleotidica dei nucleotidi 19991-20010 del filamento senso della ORF1ab di SARS-CoV-2. Il Primer Reverse di ORF1ab preferito della presente invenzione comprende, consiste essenzialmente di, o consiste di, la sequenza (SEQ ID NO:2) taagactagcttgtttggga, che corrisponde alla sequenza nucleotidica dei nucleotidi 20088-20107 del filamento anti-senso della ORF1ab di SARS-CoV-2. Di conseguenza, questi primer amplificano un polinucleotide a doppio filamento avente la sequenza di nucleotidi 19991-20107 della ORF1ab di SARS-CoV-2. Tale ?Primer Forward di ORF1ab? preferito e tale ?Primer Reverse di ORF1ab? preferito hanno attributi distintivi per l'uso nella rivelazione di SARS-CoV-2.
[0093] La sequenza del filamento ?senso? dei nucleotidi 19991-20107 della ORF1ab di SARS-CoV-2 ? SEQ ID NO:3; la sequenza del filamento complementare (?antisenso?) ? SEQ ID NO:4:
SEQ ID NO:3: atggtagagt tgatggtcaa gtagacttat ttagaaatgc ccgtaatggt gttcttatta cagaaggtag tgttaaaggt ttacaaccat ctgtaggtcc caaacaagct agtctta SEQ ID NO:4: taagactagc ttgtttggga cctacagatg gttgtaaacc tttaacacta ccttctgtaa taagaacacc attacgggca tttctaaata agtctacttg accatcaact ctaccat
[0094] Sebbene si preferisca rivelare la presenza della ORF1ab usando primer che consistono delle sequenze di SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, l?invenzione contempla che, secondo i principi e gli scopi della presente invenzione, possano essere impiegati altri primer che consistono essenzialmente della sequenza di SEQ ID NO:1 o che consistono essenzialmente della sequenza di SEQ ID NO:2 (in quanto possiedono 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residui nucleotidici addizionali, ma mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4, e pi? preferibilmente mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica del complementare della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1 o la sequenza nucleotidica del complementare della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2), o ?varianti? di tali primer che mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4, e pi? preferibilmente mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica del complementare della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1 o la sequenza nucleotidica del complementare della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2. Tali ?Primer Varianti di ORF1ab? possono, per esempio:
(1) essere privi di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleotidi di SEQ ID NO:1 o di SEQ ID NO:2, oppure
(2) essere privi di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dei 10 nucleotidi 3?-terminali della sequenza di SEQ ID NO:1 o di SEQ ID NO:2, oppure
(3) essere privi di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dei 10 nucleotidi 5?-terminali della sequenza di SEQ ID NO:1 o di SEQ ID NO:2, oppure
(4) avere una sequenza che differisce da quella di SEQ ID NO:1 o di SEQ ID NO:2 per il fatto di avere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o pi? di 10 nucleotidi addizionali, oppure
(5) avere una sequenza che differisce da quella di SEQ ID NO:1 o di SEQ ID NO:2 per il fatto di avere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o pi? di 10 nucleotidi di sostituzione al posto dei nucleotidi presenti in SEQ ID NO:1 o in SEQ ID NO:2, oppure (6) combinazioni di tali (1)-(5).
[0095] L?allineamento e il relativo orientamento del Primer Forward di ORF1ab (SEQ ID NO:1) e del Primer Reverse di ORF1ab (SEQ ID NO:2) preferiti della presente invenzione e la regione della ORF1ab di SARS-CoV-2 che questi primer amplificano in un saggio rRT-PCR per SARS-CoV-2 sono mostrati in Figura 2.
2. Primer Preferiti del Gene S
[0096] Il secondo set di primer comprende un ?Primer Forward del Gene S? e un ?Primer Reverse del Gene S?, le cui sequenze sono adatte per amplificare una regione del gene S di SARS-CoV-2. Sebbene secondo la presente invenzione possano essere impiegati qualsiasi Primer Forward e Reverse del Gene S che siano in grado di mediare tale amplificazione, si preferisce impiegare Primer Forward e Reverse del Gene S che possiedono vantaggi distintivi. Il Primer Forward del Gene S preferito della presente invenzione comprende, consiste essenzialmente di, o consiste di, la sequenza (SEQ ID NO:5) ctaaccaggttgctgttctt, che corrisponde alla sequenza nucleotidica dei nucleotidi 23376-23395 del filamento senso del gene S di SARS-CoV-2. Il Primer Reverse del Gene S preferito comprende, consiste essenzialmente di, o consiste di, la sequenza (SEQ ID NO:6) cctgtagaataaacacgcca, che corrisponde alla sequenza nucleotidica dei nucleotidi 23459-23478 del filamento antisenso del gene S di SARS-CoV-2. Di conseguenza, questi primer amplificano un polinucleotide a doppio filamento avente la sequenza di nucleotidi 23376-23478 del gene S di SARS-CoV-2.
[0097] La sequenza del filamento ?senso? dei nucleotidi 23376-23478 del gene S di SARS-CoV-2 ? SEQ ID NO:7; la sequenza del filamento complementare (?antisenso?) ? SEQ ID NO:8:
SEQ ID NO:7: ctaaccaggt tgctgttctt tatcaggatg ttaactgcac agaagtccct gttgctattc atgcagatca acttactcct acttggcgtg tttattctac agg
SEQ ID NO:8: cctgtagaat aaacacgcca agtaggagta agttgatctg catgaatagc aacagggact tctgtgcagt taacatcctg ataaagaaca gcaacctggt tag
[0098] Sebbene si preferisca rivelare la presenza del gene S usando primer che consistono delle sequenze di SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6, l?invenzione contempla che, secondo i principi e gli scopi della presente invenzione, possano essere impiegati altri primer che consistono essenzialmente della sequenza di SEQ ID NO:5 o che consistono essenzialmente della sequenza di SEQ ID NO:6 (in quanto possiedono 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residui nucleotidici addizionali, ma mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8, e pi? preferibilmente mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica del complementare della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5 o la sequenza nucleotidica del complementare della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6), o ?varianti? di tali primer che mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8, e pi? preferibilmente mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica del complementare della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5 o la sequenza nucleotidica del complementare della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6. Tali ?Primer Varianti del Gene S? possono, per esempio:
(1) essere privi di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleotidi di SEQ ID NO:5 o di SEQ ID NO:6, oppure
(2) essere privi di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dei 10 nucleotidi 3?-terminali della sequenza di SEQ ID NO:5 o di SEQ ID NO:6, oppure
(3) essere privi di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dei 10 nucleotidi 5?-terminali della sequenza di SEQ ID NO:5 o di SEQ ID NO:6, oppure
(4) avere una sequenza che differisce da quella di SEQ ID NO:5 o di SEQ ID NO:6 per il fatto di avere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o pi? di 10 nucleotidi addizionali, oppure
(5) avere una sequenza che differisce da quella di SEQ ID NO:5 o di SEQ ID NO:6 per il fatto di avere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o pi? di 10 nucleotidi di sostituzione al posto dei nucleotidi presenti in SEQ ID NO:5 o in SEQ ID NO:6, oppure (6) combinazioni di tali (1)-(5).
[0099] L?allineamento e il relativo orientamento del Primer Forward del Gene S (SEQ ID NO:5) e del Primer Reverse del Gene S (SEQ ID NO:6) della presente invenzione e la regione del gene S di SARS-CoV-2 che questi primer amplificano in un saggio rRT-PCR per SARS-CoV-2 sono mostrati in Figura 3.
C. Sonde SARS-CoV-2-Specifiche Preferite
1. Sonda di ORF1ab Preferita
[00100] La sonda preferita per rivelare la regione di ORF1ab che viene amplificata dai Primer di ORF1ab preferiti descritti sopra (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2) comprende, consiste essenzialmente di, o consiste di, la sequenza nucleotidica (SEQ ID NO:9)tgcccgtaatggtgttcttattacaga (la ?Sonda di ORF1ab? preferita). In alternativa, potrebbe essere impiegato un oligonucleotide che comprende, consiste essenzialmente di, o consiste di, la sequenza nucleotidica complementare (SEQ ID NO:10) tctgtaataagaacaccattacgggca. L?allineamento e la posizione relativa della Sonda di ORF1ab preferita della presente invenzione sono mostrati in Figura 2.
[00101] Sebbene si preferisca rivelare la presenza della ORF1ab usando una sonda che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o una sonda che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:10, l?invenzione contempla che, secondo i principi e gli scopi della presente invenzione, possano essere impiegate altre sonde che consistono essenzialmente della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10 (in quanto possiedono 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residui nucleotidici addizionali, ma mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4, e pi? preferibilmente che mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10), o ?varianti? di tali sonde che mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4, e pi? preferibilmente che mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10. Tali ?Sonde Varianti di ORF1ab? possono, per esempio:
(1) essere prive di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleotidi di SEQ ID NO:9 o di SEQ ID NO:10, oppure
(2) essere prive di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dei 10 nucleotidi 3?-terminali della sequenza di SEQ ID NO:9 o di SEQ ID NO:10, oppure
(3) essere prive di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dei 10 nucleotidi 5?-terminali della sequenza di SEQ ID NO:9 o di SEQ ID NO:10, oppure
(4) avere una sequenza che differisce da quella di SEQ ID NO:9 o di SEQ ID NO:10 per il fatto di avere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o pi? di 10 nucleotidi addizionali, oppure
(5) avere una sequenza che differisce da quella di SEQ ID NO:9 o di SEQ ID NO:10 per il fatto di avere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o pi? di 10 nucleotidi di sostituzione al posto dei nucleotidi presenti in SEQ ID NO:9 o in SEQ ID NO:10, oppure
(6) combinazioni di tali (1)-(5).
2. Sonda Preferita del Gene S
[00102] La sonda preferita per rivelare la regione del gene S che viene amplificata dai Primer preferiti del Gene S descritti sopra (SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6) comprende, consiste essenzialmente di, o consiste di, la sequenza (SEQ ID NO:11)
tgcacagaagtccctgttgct (la ?Sonda del Gene S? preferita). In alternativa, potrebbe essere impiegato un oligonucleotide che comprende, consiste essenzialmente di, o consiste di, la sequenza nucleotidica complementare (SEQ ID NO:12)
agcaacagggacttctgtgca. L?allineamento e la posizione relativa della Sonda del Gene S della presente invenzione sono mostrati in Figura 3.
[00103] Sebbene si preferisca rivelare la presenza del gene S usando una sonda che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o una sonda che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:12, l?invenzione contempla che, secondo i principi e gli scopi della presente invenzione, possano essere impiegate altre sonde che consistono essenzialmente della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12 (in quanto possiedono 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residui nucleotidici addizionali, ma mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8, e pi? preferibilmente che mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12), o ?varianti? di tali sonde che mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8, e pi? preferibilmente che mantengono la capacit? di ibridarsi specificamente a molecole di DNA aventi la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12. Tali ?Sonde Varianti del Gene S? possono, per esempio:
(1) essere prive di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleotidi di SEQ ID NO:11 o di SEQ ID NO:12, oppure
(2) essere prive di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dei 10 nucleotidi 3?-terminali della sequenza di SEQ ID NO:11 o di SEQ ID NO:12, oppure
(3) essere prive di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dei 10 nucleotidi 5?-terminali della sequenza di SEQ ID NO:11 o di SEQ ID NO:12, oppure
(4) avere una sequenza che differisce da quella di SEQ ID NO:11 o di SEQ ID NO:12 per il fatto di avere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o pi? di 10 nucleotidi addizionali, oppure
(5) avere una sequenza che differisce da quella di SEQ ID NO:11 o di SEQ ID NO:12 per il fatto di avere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o pi? di 10 nucleotidi di sostituzione al posto dei nucleotidi presenti in SEQ ID NO:11 o in SEQ ID NO:12, oppure
(6) combinazioni di tali (1)-(5).
D. Attributi Distintivi dei Primer e delle Sonde Preferiti della Presente Invenzione
[00104] I saggi della presente invenzione possiedono particolari attributi distintivi che distinguono tali saggi dai saggi della tecnica anteriore. Una caratteristica della presente invenzione riguarda l'uso di almeno due regioni bersaglio di SARS-CoV-2 come base per la rivelazione in un saggio rRT-PCR. Pertanto, i saggi rRT-PCR della presente invenzione impiegano preferibilmente almeno due set di primer Forward e Reverse in modo da essere in grado di amplificare in modo specifico e simultaneo due regioni polinucleotidiche dell?RNA di SARS-CoV-2. In forme di realizzazione preferite, i primer di uno di questi due set di primer hanno sequenze che sono in grado di amplificare in modo specifico una regione di ORF1ab, ed i primer del secondo di questi due set di primer hanno sequenze che sono in grado di amplificare in modo specifico una regione del gene S.
[00105] L'utilizzo di due bersagli di amplificazione aumenta l'accuratezza dei saggi della presente invenzione poich? essi aiutano a garantire che tali saggi continueranno a rivelare SARS-CoV-2 anche qualora un bersaglio venisse eliminato dagli isolati clinici (ad esempio mediante mutazione spontanea). L'utilizzo di due bersagli di amplificazione aumenta anche la sensibilit? del saggio poich? ? possibile che l'amplificazione di un particolare bersaglio non fornisca una concentrazione rivelabile di prodotto amplificato, ad esempio a causa di problemi di processing o di manipolazione. Per il fatto di avere due bersagli, i saggi della presente invenzione hanno maggiori probabilit? di evitare tali risultati "falsi negativi".
[00106] La scelta dei geni ORF1ab e S come bersagli ? un'ulteriore caratteristica dei saggi della presente invenzione. Questi geni sono particolarmente caratteristici di SARS-CoV-2, e in effetti la regione bersaglio del gene S di SARS-CoV-2 (cio? il suo dominio S1) mostra un'omologia relativamente bassa (solo il 68%) con i geni S di altri coronavirus (per confronto, la ORF1a di SARS-CoV-2 mostra circa il 90% di omologia con la ORF1a di SARS-CoV; la ORF1b di SARS-CoV-2 mostra circa l'86% di omologia con la ORF1b di SARS-CoV (Lu, R. et al. (2020) ?Genomic Characterisation And Epidemiology Of 2019 Novel Coronavirus: Implications For Virus Origins And Receptor Binding,? The Lancet 395(10224):565-574). Pertanto, ? pi? probabile che i saggi della presente invenzione non amplifichino in modo errato sequenze di patogeni non SARS-CoV-2. Pertanto, i saggi della presente invenzione hanno maggiori probabilit? di evitare risultati "falsi positivi".
[00107] I saggi della presente invenzione impiegano sonde uniche per SARS-CoV-2 e rivelano SARS-CoV-2 in condizioni in cui non vengono rivelati patogeni non SARS-CoV-2. Come ulteriore attributo, i saggi della presente invenzione impiegano primer di sistema molto veloci che sono progettati per mediare lo stesso grado di amplificazione con gli stessi parametri di reazione e le stesse temperature di reazione.
[00108] Le temperature di fusione (Tm) dei primer di PCR determinano la loro cinetica di denaturazione da oligonucleotidi complementari e la loro cinetica di appaiamento a oligonucleotidi complementari (vedere, SantaLucia, J. (1998) A Unified View Of Polymer, Dumbbell, And Oligonucleotide DNA Nearest-Neighbor Thermodynamics,? Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95:1460-1465; von Ahsen, N. et al. (1999) ?Application Of A Thermodynamic Nearest-Neighbor Model To Estimate Nucleic Acid Stability And Optimize Probe Design: Prediction Of Melting Points Of Multiple Mutations Of Apolipoprotein B-3500 And Factor V With A Hybridization Probe Genotyping Assay On The Lightcycler,? Clin. Chem.45(12):2094-2101). Coppie di primer che presentano ?temperature di fusione sostanzialmente identiche? (cio? ? 2 ?C, pi? preferibilmente, ? 1 ?C, ancora pi? preferibilmente ? 0,5 ?C, e di massima preferenza ? 0,1 ?C, calcolate usando il metodo di SantaLucia, J. (1998)) massimizzano la resa complessiva dei prodotti che amplificano e la velocit? con cui tali prodotti vengono prodotti.
[00109] Significativamente, i primer Forward e Reverse di ORF1ab preferiti della presente invenzione mostrano tali temperature di fusione sostanzialmente identiche, il che costituisce un'ulteriore distinzione della presente invenzione. Il Primer Forward di ORF1ab preferito ha una Tm di impilamento di basi di 58,2?C, mentre il Primer Reverse di ORF1ab preferito ha una Tm di impilamento di basi di 58,1?C. Pertanto, l'uso dei Primer Forward e Reverse di ORF1ab preferiti della presente invenzione serve a massimizzare la resa complessiva del prodotto di ORF1ab amplificato e la velocit? con cui tale prodotto viene prodotto.
[00110] I Primer Forward e Reverse del Gene S preferiti della presente invenzione mostrano anch?essi temperature di fusione sostanzialmente identiche, il che costituisce un'ulteriore distinzione della presente invenzione. Il Primer Forward del Gene S preferito ha una Tm di impilamento di basi di 60?C, mentre il Primer Reverse del Gene S preferito ha una Tm di impilamento di basi di 59,9?C. Pertanto, l'uso dei Primer Forward e Reverse del Gene S preferiti della presente invenzione serve a massimizzare la resa complessiva del prodotto del Gene S amplificato e la velocit? con cui tale prodotto viene prodotto.
[00111] Significativamente, le temperature di fusione dei Primer Forward e Reverse di ORF1ab della presente invenzione sono sostanzialmente simili alle temperature di fusione dei Primer Forward e Reverse del Gene S preferiti della presente invenzione. Pertanto, questi due set di primer preferiti sono estremamente ben abbinati, il che costituisce un'ulteriore distinzione della presente invenzione. Il loro uso combinato serve a equalizzare la resa complessiva dei prodotti dei geni ORF1ab e S amplificati, che sono di lunghezza simile (117 nucleotidi contro 103 nucleotidi). Le temperature di fusione sostanzialmente simili dei set di primer impiegati e le lunghezze simili dei due prodotti amplificati sono ulteriori distinzioni della presente invenzione.
[00112] Nel progettare un saggio rRT-PCR, ? desiderabile che la sonda TaqMan impiegata abbia una Tm superiore di 5-10?C rispetto ai primer di amplificazione impiegati. La Sonda di ORF1ab impiegata ha una Tm di impilamento di basi di 66,2?C, una differenza di 8?C rispetto alla Tm dei Primer di ORF1ab preferiti della presente invenzione. La Sonda del Gene S impiegata ha una Tm di impilamento di basi corrispondente di 66,6?C, una differenza di 6,6?C rispetto alla Tm dei Primer del Gene S preferiti della presente invenzione. Pertanto, ciascuna delle sonde TaqMan preferite della presente invenzione presenta una Tm desiderata e le due sonde TaqMan preferite della presente invenzione presentano Tm sostanzialmente identiche. Queste sono ulteriori distinzioni della presente invenzione.
E. Piattaforma Preferita per Condurre i Saggi della Presente Invenzione
[00113] In una forma di realizzazione preferita, i primer e le sonde preferiti descritti sopra testano la presenza di SARS-CoV-2 utilizzando un Direct Amplification Disc (DiaSorin Molecular LLC) e SIMPLEXA? Direct Chemistry (DiaSorin Molecular LLC), processati attraverso una piattaforma per rRt-PCR LIAISON? MDX (DiaSorin Molecular LLC). I principi operativi della piattaforma per rRt-PCR LIAISON? MDX, della SIMPLEXA? Direct Chemistry e del Direct Amplification Disc di DiaSorin Molecular LLC sono descritti nel Brevetto US n. 9.067.205, nella Pubbl. di Brevetto US n. 2012/0291565 A1, in EP 2499498 B1, in EP 2709760 B1, tutti qui incorporati come citazione nella loro interezza.
[00114] In breve, la piattaforma per rRt-PCR LIAISON? MDX (DiaSorin) ? un termociclatore compatto e portatile che offre inoltre capacit? di centrifugazione e di processing della reazione. Il dispositivo ? in grado di mediare il riscaldamento (> 5?C/sec) e il raffreddamento (> 4?C/sec) del campione e di regolare la temperatura a ? 0,5?C (nell'intervallo compreso tra la temperatura ambiente e 99?C). La piattaforma per rRt-PCR LIAISON? MDX ha la capacit? di eccitare marcatori fluorescenti a 475 nm, 520 nm, 580 nm e 640 nm e di misurare la fluorescenza rispettivamente a 520 nm, 560 nm, 610 nm e 682 nm.
[00115] Il Direct Amplification Disc ? un dispositivo fluidico multicamera, orientato radialmente, in grado di processare l'amplificazione di sequenze bersaglio (se presenti) fino a 8 (50 ?L) campioni clinici alla volta. I campioni possono essere forniti direttamente al Direct Amplification Disc, sotto forma di materiale cellulare o di lisati, senza alcuna precedente estrazione di DNA o RNA.
[00116] In breve, un'aliquota del campione clinico e reagenti di reazione (vale a dire una DNA polimerasi, una trascrittasi inversa, una o pi? coppie di primer SARS-CoV-2-specifici (preferibilmente, i suddetti Primer Forward e Reverse di ORF1ab preferiti e i suddetti Primer Forward e Reverse del Gene S preferiti, due o pi? sonde SARS-CoV-2-specifiche (preferibilmente, la suddetta Sonda di ORF1ab preferita e la suddetta Sonda del Gene S preferita) e desossinucleotidi trifosfato (dNTP) e tamponi) vengono forniti separatamente a un'area di ricezione del Direct Amplification Disc (vedere il Brevetto US n.9.067.205, la Pubbl. del Brevetto US n.2012/0291565 A1, EP 2709760 B1). Preferibilmente, i reagenti di reazione necessari per la rRT-PCR vengono forniti usando "miscele master", che sono ampiamente disponibili in commercio (Applied Biosystems; ThermoFisher Scientific, ecc.). I primer possono essere forniti a una concentrazione compresa tra 0,1 e 0,5 ?M (5-25 pmol/ per 50 ?l di reazione). Le molecole di sonda possono essere fornite a una concentrazione compresa tra 0,05 e 0,25 ?M (2,5-12,5 pmol/ per 50 ?l di reazione).
[00117] Il dispositivo LIAISON? MDX centrifuga il Direct Amplification Disc per forzare in tal modo una porzione del campione e dei reagenti che devono essere trasferiti separatamente in vaschette di una camera di reazione. La centrifugazione sposta qualsiasi campione o reagente in eccesso in una camera di contenimento. Un laser all'interno del dispositivo LIAISON? MDX apre poi una prima valvola che consente al campione di fluire nella camera di reazione. La camera viene poi riscaldata (per esempio fino a 95?C); la temperatura elevata e la centrifugazione servono a lisare le cellule che possono essere presenti nel campione. Il laser all'interno del dispositivo LIAISON? MDX apre poi una seconda valvola che consente ai reagenti di fluire nella camera di reazione e di miscelarsi con il campione. Il dispositivo LIAISON? MDX inizia poi a sottoporre la reazione al termociclaggio tramite PCR. Pu? essere utilizzato un controllo interno per monitorare il corretto processing dello strumento e del campione e per rivelare insuccessi e/o inibizioni della RT-PCR.
[00118] Pu? essere impiegato un controllo interno per confermare che le condizioni di reazione siano adatte per l'amplificazione e la rivelazione del bersaglio. Un controllo interno adatto, ad esempio, ? un controllo che amplifica le sequenze del fago MS2. Un Primer Forward di Controllo Interno per il Fago MS2 adatto ha la sequenza (SEQ ID NO:13 tgctcgcggatacccg); un Primer Reverse di Controllo Interno per il Fago MS2 adatto ha la sequenza (SEQ ID NO:14 aacttgcgttctcgagcgat). L'amplificazione mediata da tali primer di controllo interno pu? essere rivelata usando una sonda TaqMan (Sonda di Controllo Interno per il Fago MS2) avente la sequenza (SEQ ID NO:15 acctcgggtttccgtcttgctcgt. In alternativa, possono essere impiegati altri primer di controllo interno per MS2 (Dreier, J. et al. (2005) ?Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays,? J. Clin. Microbiol. 43(9):4551-4557). La sonda pu? essere marcata con il fluoroforo Quasar 670 e complessata con l?estinguente BHQ2, o con qualsiasi altro fluoroforo e qualsiasi estinguente in grado di spegnere la fluorescenza di tale fluoroforo.
[00119] Il software LIAISON MDX esegue un ciclo di preriscaldamento per denaturare la proteina dell?involucro virale di SARS-CoV-2 e rilasciare in tal modo l'RNA di SARS-CoV-2. Questo passaggio ? seguito da trascrizione inversa e successiva amplificazione. Durante la fase di estensione del ciclo di PCR, l'attivit? 5? nucleasica della DNA polimerasi degrada qualsiasi sonda che si ? ibridata al prodotto amplificato nella reazione, facendo s? in tal modo che il marcatore fluorescente della sonda si separi dall?estinguente della sonda. Tale separazione consente di rivelare un segnale fluorescente. Ad ogni ciclo, ulteriori molecole del marcatore fluorescente vengono scisse dalle rispettive sonde, aumentando l'intensit? della fluorescenza.
[00120] I risultati della reazione sono monitorati e presentati agli utenti tramite il software di LIAISON? MDX. Tale software fornisce risultati di facile comprensione con la possibilit? di controllare le curve di amplificazione dopo una corsa. Il software traccia anche grafici di controllo qualit? e pu? essere interfacciato in modo bidirezionale con LIS per una facile integrazione nel flusso di lavoro del laboratorio. LIAISON? MDX consente l'accesso casuale a singoli campioni e consente quindi agli utenti di avviare l'analisi di nuovi campioni senza attendere il completamento di analisi avviate in precedenza. I risultati del saggio possono essere ottenuti in un'ora o meno. La Tabella 1 mostra l'Algoritmo Diagnostico del saggio.
[00121] Di conseguenza, se i valori CT della ORF1ab e del gene S sono entrambi ?40 per un campione di un paziente, il risultato viene riportato come "Rivelato" per l'RNA di SARS-CoV-2. Il controllo interno non ? applicabile. Se il valore CT della ORF1ab ? ?40 e il valore CT del gene S ? 0 per un campione di un paziente, il risultato viene riportato come "Rivelato" per l'RNA di SARS-CoV-2. Il controllo interno non ? applicabile. Se il valore CT della ORF1ab ? 0 e il valore CT del gene S ? ?40 per un campione di un paziente, il risultato viene riportato come "Rivelato" per l'RNA di SARS-CoV-2. Il controllo interno non ? applicabile. Se i valori CT della ORF1ab e del gene S sono entrambi 0 per un campione di un paziente e il CT del controllo interno non ? zero ed ? ?45, il risultato viene riportato come ?Non Rivelato? per l'RNA di SARS-CoV-2. Se i valori CT della ORF1ab e del gene S sono entrambi 0 per un campione di un paziente e anche il CT del controllo interno ? 0, il risultato viene riportato come ?Non valido?. Questo campione dovrebbe essere ritestato. Se il controllo interno ? ancora 0 nel saggio ripetuto, il test dovrebbe essere ripetuto con un nuovo campione, se clinicamente giustificato.
F. Kit
[00122] L'invenzione include inoltre kit per condurre i saggi descritti sopra. In una forma di realizzazione, tali kit includeranno uno o pi? contenitori contenenti reagenti per rivelare specificamente la ORF1ab di SARS-CoV-2 (p.es., un Primer Forward di ORF1ab, un Primer Reverse di ORF1ab, e una Sonda di ORF1ab) e istruzioni per l'uso di tali reagenti per rivelare SARS-CoV-2. Tali kit possono comprendere un Primer Forward Variante di ORF1ab, un Primer Reverse Variante di ORF1ab e/o una Sonda Variante di ORF1ab. Di massima preferenza, tali kit comprenderanno il suddetto Primer Forward di ORF1ab preferito, il suddetto Primer Reverse di ORF1ab preferito e la suddetta Sonda di ORF1ab preferita.
[00123] In una seconda forma di realizzazione, tali kit includeranno uno o pi? contenitori contenenti reagenti per rivelare specificamente il gene S di SARS-CoV-2 (p.es., un Primer Forward del Gene S, un Primer Reverse del Gene S, e una Sonda del Gene S) e istruzioni per l'uso di tali reagenti per rivelare SARS-CoV-2. Tali kit possono comprendere un Primer Forward Variante del Gene S, un Primer Reverse Variante del Gene S e/o una Sonda Variante del Gene S. Di massima preferenza, tali kit comprenderanno il suddetto Primer Forward del Gene S preferito, il suddetto Primer Reverse del Gene S preferito e la suddetta Sonda del Gene S preferita.
[00124] In una terza forma di realizzazione, tali kit includeranno uno o pi? contenitori contenenti reagenti per rivelare specificamente sia la ORF1ab di SARS-CoV-2 che il gene S di SARS-CoV-2 (p.es., un Primer Forward di ORF1ab, un Primer Reverse di ORF1ab, una Sonda di ORF1ab, un Primer Forward del Gene S, un Primer Reverse del Gene S, e una Sonda del Gene S) e istruzioni per l'uso di tali reagenti per rivelare SARS-CoV-2 e, di massima preferenza, comprenderanno il suddetto Primer Forward di ORF1ab preferito, il suddetto Primer Reverse di ORF1ab preferito, la suddetta Sonda di ORF1ab preferita, il suddetto Primer Forward del Gene S preferito, il suddetto Primer Reverse del Gene S preferito e la suddetta Sonda del Gene S preferita.
[00125] I contenitori di tali kit saranno fiale, provette, ecc., e i reagenti possono essere in forma liquida o possono essere liofilizzati. In alternativa, tali contenitori saranno un dispositivo fluidico multicamera che ? in grado di processare l'amplificazione di tali primer. Ad esempio, i kit della presente invenzione possono essere un Direct Amplification Disc (Brevetto US n.9.067.205) che ? stato precaricato con reagenti per amplificare le sequenze geniche di SARS-CoV-2 descritte sopra.
G. Forme di Realizzazione dell?Invenzione
[00126] Avendo ora generalmente descritto l'invenzione, la stessa sar? pi? facilmente compresa facendo riferimento alle seguenti Forme di Realizzazione numerate (?E?), che sono fornite a scopo illustrativo e non intendono limitare la presente invenzione se non specificato:
E1. Un oligonucleotide, avente un terminale 5? e un terminale 3?, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12.
E2. Un oligonucleotide, avente un terminale 5? e un terminale 3?, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12.
E3. L?oligonucleotide di E1 o E2, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, o consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1.
E4. L?oligonucleotide di E1 o E2, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, o consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2.
E5. L?oligonucleotide di E1 o E2, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, o consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:3.
E6. L?oligonucleotide di E1 o E2, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, o consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:4.
E7. L?oligonucleotide di E1 o E2, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, o consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5.
E8. L?oligonucleotide di E1 o E2, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, o consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6.
E9. L?oligonucleotide di E1 o E2, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, o consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:7.
E10. L?oligonucleotide di E1 o E2, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, o consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:8.
E11. L?oligonucleotide di E1 o E2, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, o consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9.
E12. L?oligonucleotide di E1 o E2, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, o consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:10.
E13. L?oligonucleotide di E1 o E2, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, o consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11.
E14. L?oligonucleotide di E1 o E2, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, o consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:12.
E15. L?oligonucleotide di E1, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, o consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:10, in cui l?oligonucleotide ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo.
E16. L?oligonucleotide di E15, in cui il fluoroforo ha una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm.
E17. L?oligonucleotide di E15, in cui il fluoroforo ? FAM o JOE.
E18. L?oligonucleotide di E1, in cui l?oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:12, in cui l?oligonucleotide ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo.
E19. L?oligonucleotide di E18, in cui il fluoroforo ha una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm.
E20. L?oligonucleotide di E18, in cui il fluoroforo ? FAM o JOE.
E21. Un metodo per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui il metodo prevede di:
(I) incubare il campione clinico in vitro in presenza di:
(1) una trascrittasi inversa e una DNA polimerasi avente un?attivit? 5??3? esonucleasica; e
(2) un Primer Forward di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1;
(3) un Primer Reverse di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2; e
(4) una Sonda di ORF1ab, la Sonda di ORF1ab essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, in cui la Sonda oligonucleotidica di ORF1ab ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e
in cui l?incubazione avviene in una reazione in condizioni sufficienti a consentire:
(a) ai Primer Forward e Reverse di ORF1ab di mediare un?amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi di una regione della ORF1ab di SARS-CoV-2 per produrre in tal modo molecole oligonucleotidiche amplificate di ORF1ab, se il SARS-CoV-2 ? presente nel campione clinico;
(b) alla Sonda di ORF1ab di ibridarsi a molecole oligonucleotidiche amplificate di ORF1ab; e
(c) all?attivit? 5??3? esonucleasica di idrolizzare la Sonda di ORF1ab ibridata, per separare in tal modo il suo fluoroforo dal suo estinguente e far s? che diventi rivelabile un segnale fluorescente; e
(II) determinare se il SARS-CoV-2 sia presente nel campione clinico determinando se sia divenuto rivelabile un segnale fluorescente del fluoroforo.
E22. Il metodo di E21, in cui il fluoroforo ha una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm.
E23. Il metodo di E21, in cui il fluoroforo ? FAM o JOE.
E24. Un metodo per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui il metodo prevede di:
(I) incubare il campione clinico in vitro in presenza di:
(1) una trascrittasi inversa e una DNA polimerasi avente un?attivit? 5??3? esonucleasica; e
(2) un Primer Forward del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5;
(3) un Primer Reverse del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6; e
(4) una Sonda del Gene S, la Sonda del Gene S essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12, in cui la Sonda oligonucleotidica del Gene S ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e
in cui l?incubazione avviene in una reazione in condizioni sufficienti a consentire:
(a) ai Primer Forward e Reverse del Gene S di mediare un?amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi di una regione del gene S di SARS-CoV-2 per produrre in tal modo molecole oligonucleotidiche amplificate del gene S, se il SARS-CoV-2 ? presente nel campione clinico;
(b) alla Sonda del Gene S di ibridarsi a molecole oligonucleotidiche amplificate del gene S; e
(c) all?attivit? 5??3? esonucleasica di idrolizzare la Sonda del Gene S ibridata, per separare in tal modo il suo fluoroforo dal suo estinguente e far s? che diventi rivelabile un segnale fluorescente; e
(II) determinare se il SARS-CoV-2 sia presente nel campione clinico determinando se sia divenuto rivelabile un segnale fluorescente del fluoroforo.
E25. Il metodo di E24, in cui il fluoroforo ha una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm.
E26. Il metodo di E24, in cui il fluoroforo ? FAM o JOE.
E27. Un metodo per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui il metodo prevede di:
(I) incubare il campione clinico in vitro in presenza di:
(1) una trascrittasi inversa e una DNA polimerasi avente un?attivit? 5??3? esonucleasica; e
(2) un Primer Forward del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5;
(3) un Primer Reverse del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6;
(4) una Sonda del Gene S, la Sonda del Gene S essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12, in cui la Sonda oligonucleotidica del Gene S ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo;
(5) un Primer Forward di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1;
(6) un Primer Reverse di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2; e
(7) una Sonda di ORF1ab, la Sonda di ORF1ab essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, in cui la Sonda oligonucleotidica di ORF1ab ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; in cui la fluorescenza del fluoroforo della Sonda di ORF1ab ? distinguibile dalla fluorescenza del fluoroforo della Sonda del Gene S; e in cui l?incubazione avviene in una reazione in condizioni sufficienti a consentire:
(a) ai Primer Forward e Reverse del Gene S di mediare un?amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi di una regione del gene S di SARS-CoV-2 per produrre in tal modo molecole oligonucleotidiche amplificate del gene S, se il SARS-CoV-2 ? presente nel campione clinico;
(b) alla Sonda del Gene S di ibridarsi a molecole oligonucleotidiche amplificate del gene S; e
(c) all?attivit? 5??3? esonucleasica di idrolizzare la Sonda del Gene S ibridata, per separare in tal modo il suo fluoroforo dal suo estinguente e far s? che diventi rivelabile un segnale fluorescente; e
(II) determinare se il SARS-CoV-2 sia presente nel campione clinico determinando se sia divenuto rivelabile un segnale fluorescente del fluoroforo.
E28. Il metodo di E24, in cui il campione clinico viene incubato in presenza aggiuntiva di:
(5) un Primer Forward di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1;
(6) un Primer Reverse di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2; e
(7) una Sonda di ORF1ab, la Sonda di ORF1ab essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, in cui la Sonda oligonucleotidica di ORF1ab ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; in cui la fluorescenza del fluoroforo della Sonda di ORF1ab ? distinguibile dalla fluorescenza del fluoroforo della Sonda del Gene S; e in cui la reazione viene ulteriormente incubata in condizioni sufficienti per consentire:
(a) ai Primer Forward e Reverse di ORF1ab di mediare un?amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi di una regione della ORF1ab di SARS-CoV-2 per produrre in tal modo molecole oligonucleotidiche di ORF1ab amplificate, se il SARS-CoV-2 ? presente nel campione clinico;
(b) alla Sonda di ORF1ab di ibridarsi a molecole oligonucleotidiche amplificate di ORF1ab; e
(c) all?attivit? 5??3? esonucleasica di idrolizzare la Sonda di ORF1ab ibridata, per separare in tal modo il suo fluoroforo dal suo estinguente e far s? che diventi rivelabile un segnale fluorescente; e
in cui detto SARS-CoV-2 viene determinato essere presente in detto campione clinico determinando se sia divenuto rivelabile un segnale fluorescente di almeno uno tra i fluorofori di detta Sonda di ORF1ab o di detta Sonda del Gene S.
E29. Il metodo di E28, in cui il fluoroforo della Sonda di ORF1ab e il fluoroforo della Sonda del Gene S hanno una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm.
E30. Il metodo di E28, in cui uno dei fluorofori della Sonda di ORF1ab e della Sonda del Gene S ? JOE e l?altro di tali fluorofori ? FAM.
E31. Un kit per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui il kit comprende:
(I) reagenti per rivelare ORF1ab di SARS-CoV-2, in cui i reagenti per la rivelazione di ORF1ab di SARS-CoV-2 comprendono: (1) un Primer Forward di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1;
(2) un Primer Reverse di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2; e
(3) una Sonda di ORF1ab, la Sonda di ORF1ab essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, in cui la Sonda oligonucleotidica di ORF1ab ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e
(II) istruzioni per l?uso di tali reagenti di rivelazione per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 nel campione clinico.
E32. Il kit di E31, in cui il fluoroforo della Sonda di ORF1ab ha una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm.
E33. Il kit di E31, in cui il fluoroforo della ORF1ab ? JOE o FAM.
E34. Un kit per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui il kit comprende:
(I) reagenti per rivelare il gene S di SARS-CoV-2, in cui i reagenti per la rivelazione del gene S di SARS-CoV-2 comprendono: (1) un Primer Forward del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5;
(2) un Primer Reverse del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6; e
(3) una Sonda del Gene S, la Sonda del Gene S essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12, in cui la Sonda oligonucleotidica del Gene S ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e
(II) istruzioni per l?uso di tali reagenti di rivelazione per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 nel campione clinico.
E35. Il kit di E34, in cui il fluoroforo della Sonda del Gene S ha una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm.
E36. Il kit di E34, in cui il fluoroforo del Gene S ? JOE o FAM.
E37. Un kit per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui il kit comprende:
(I) (A) reagenti per rivelare ORF1ab di SARS-CoV-2, in cui i reagenti per la rivelazione di ORF1ab di SARS-CoV-2 comprendono:
(1) un Primer Forward di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1;
(2) un Primer Reverse di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2; e
(3) una Sonda di ORF1ab, la Sonda di ORF1ab essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, in cui la Sonda oligonucleotidica di ORF1ab ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e (B) reagenti per rivelare il gene S di SARS-CoV-2, in cui i reagenti per la rivelazione del gene S di SARS-CoV-2 comprendono:
(1) un Primer Forward del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5;
(2) un Primer Reverse del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6; e
(3) una Sonda del Gene S, la Sonda del Gene S essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12, in cui la Sonda oligonucleotidica del Gene S ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; in cui la fluorescenza del fluoroforo della Sonda del Gene S ? distinguibile dalla fluorescenza del fluoroforo della Sonda di ORF1ab; e
(II) istruzioni per l?uso di tale reagente per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 nel campione clinico.
E38. Il kit di E37, in cui il fluoroforo della Sonda di ORF1ab e il fluoroforo della Sonda del Gene S hanno ciascuno una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm.
E39. Il kit di E37, in cui uno dei fluorofori della Sonda di ORF1ab e della Sonda del Gene S ? JOE e l?altro di tali fluorofori ? FAM.
ESEMPI
[00127] Avendo ora generalmente descritto l'invenzione, la stessa sar? pi? facilmente compresa facendo riferimento ai seguenti esempi, che sono forniti a scopo illustrativo e non intendono limitare la presente invenzione se non specificato.
Esempio 1
Progettazione dei Primer e delle Sonde Preferiti
[00128] Sono stati progettati due set di primer e sonde per la rivelazione specifica di SARS-CoV-2. E? stato mostrato che ciascun set di primer/sonde fornisce di per s? una rivelazione sensibile e specifica di SARS-CoV-2 senza rivelazione di, o reattivit? crociata con, altri coronavirus. Per progettare tali primer e sonde ? stata utilizzata la Sequenza di Riferimento di SARS-CoV-2 (NC_045512.2; isolato Wuhan-Hu-1 del virus della polmonite del mercato del pesce di Wuhan, genoma completo).
[00129] L'allineamento dei genomi dei CoV mostra un'identit? del 58% per la regione codificante proteine non strutturali e un'identit? del 43% per la regione codificante proteine strutturali tra diversi coronavirus, con un'identit? del 54% a livello di genoma completo. Ci? suggerisce che le proteine non strutturali siano pi? conservate e che le proteine strutturali mostrino una maggiore diversit? per l?adattamento ai loro diversi ambienti (Chen, Y, et al. (2020) ?Emerging Coronaviruses: Genome Structure, Replication, And Pathogenesis,? J. Med. Virol.92:418-423).
[00130] ? stata condotta un'analisi confrontando la sequenza di SARS-CoV-2 con le sequenze di sei altri CoV che possono infettare gli esseri umani e causare malattie respiratorie, al fine di selezionare una regione che sarebbe in grado di rivelare e discriminare in modo specifico SARS-CoV-2 da tali altri CoV. L'analisi si ? concentrata su regioni genomiche codificanti per proteine strutturali uniche di questo virus (Ji, W. et al. (2020) ?Cross?Species Transmission Of The Newly Identified Coronavirus 2019?nCoV,? J Med. Virol.92:433-440). Tuttavia, poich? ? possibile che tali regioni possano ricombinarsi frequentemente, in parallelo sono stati progettati dei primer mirati a regioni genomiche codificanti per proteine non strutturali.
[00131] Per quanto riguarda la selezione del gene S, il SARS-CoV-2 pu? essere generato mediante una ricombinazione omologa all'interno di una regione compresa tra le posizioni 21500 e 24000 (2500 bp), che copre la maggior parte della sequenza del gene S (Chen, Y, et al. (2020) ?Emerging Coronaviruses: Genome Structure, Replication, And Pathogenesis,? J. Med. Virol.92:418-423). In particolare, all'interno della regione di 2500 bp, Chen, Y, et al. (2020) hanno identificato una sequenza unica corrispondente ai primi 783 nucleotidi all'estremit? 5' del gene S. L'analisi BLAST di un frammento di 783 nucleotidi non ha fornito alcuna corrispondenza con nessuna sequenza presente nel database NCBI, fatta eccezione per l'isolato Wuhan-Hu-14 del virus della polmonite del mercato del pesce di Wuhan.
[00132] Per quanto riguarda la selezione della sequenza di ORF1ab, il SARS-CoV-2 ha una caratteristica regione codificante proteine non strutturali, che copre circa i due terzi della lunghezza del suo genoma e codifica 16 proteine non strutturali (nsp1-16); la sequenza mostra un'identit? del 58% con le sequenze di altri CoV (Chen, Y, et al. (2020) ?Emerging Coronaviruses: Genome Structure, Replication, And Pathogenesis,? J. Med. Virol. 92:418-423). Questa regione di circa 20 kb ? stata scelta per la progettazione di diversi set di primer specifici per SARS-CoV-2.
[00133] Tutti i set di primer progettati per essere mirati a ORF1ab e al gene S sono stati testati sulle sequenze genomiche complete di SARS-CoV2 disponibili nel database Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID), utilizzando il software Geneious Prime. Le sequenze sono state mappate sulla Sequenza di Riferimento di SARS-CoV-2 (NC_045512.2), e i primer e le sonde identificati sono stati testati sul consensus. L'analisi ha mostrato che tutte le regioni riconosciute dai primer e dalle sonde identificati hanno un'omologia del 100% con tutte le sequenze di SARS-CoV-2 disponibili.
[00134] Oltre a verificare la specificit? della progettazione, sono state esaminate le sequenze dei sei CoV in grado di infettare gli esseri umani causando malattie respiratorie (cio? HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, HKU1, SARS-CoV e MERS-CoV). I numeri di accesso per tali sequenze sono: NC_002645.1 (Coronavirus Umano 229E); NC_006213.1 (Coronavirus Umano OC43 ceppo ATCC VR-759);
NC_005831.2 (Coronavirus Umano NL63), NC_006577.2 (Coronavirus Umano HKU1), NC_004718.3 (SARS-coronavirus) e NC_019843.3 (Coronavirus della Sindrome Respiratoria Mediorientale).
[00135] Per mezzo di tale analisi sono state identificate le sequenze dei suddetti Primer Forward e Reverse di ORF1ab preferiti (rispettivamente SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2), dei suddetti Primer Forward e Reverse del Gene S preferiti (rispettivamente SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6), della suddetta Sonda di ORF1ab preferita (SEQ ID NO:9) e della suddetta Sonda del Gene S preferita (SEQ ID NO:11).
Esempio 2
Specificit? del Saggio per SARS-CoV-2
[00136] In seguito ad analisi in silico, ? stato osservato che un saggio SIMPLEXA? SARS-CoV-2 Direct con utilizzo dei suddetti Primer Forward e Reverse preferiti di ORF1ab e del Gene S e delle suddette Sonde preferite di ORF1ab e del Gene S rivelava tutti i ceppi del virus SARS-CoV-2 e non mostrava alcuna reattivit? crociata con specie non-SARS-CoV-2.
[00137] Oltre all'analisi in silico, ? stata eseguita un'analisi in vitro della specificit?. I risultati del test sui campioni in vitro sono presentati nella Tabella 2.
[00138] ? stato anche riscontrato che il saggio dimostra una specificit? del 100% su una matrice negativa (Universal Transport Medium (UTM); Copan Diagnostics). Non sono stati osservati segnali non specifici.
[00139] In conclusione, ? stato osservato che i suddetti Primer Forward e Reverse di ORF1ab preferiti e la suddetta Sonda di ORF1ab preferita sono in grado di rivelare SARS-CoV-2 senza mostrare reattivit? crociata con il DNA umano o con il DNA (o cDNA) di altri patogeni. Inoltre, ? stato osservato che i suddetti Primer Forward e Reverse del Gene S preferiti e la suddetta Sonda del Gene S preferita sono in grado di rivelare SARS-CoV-2 senza mostrare reattivit? crociata con il DNA umano o con il DNA (o cDNA) di altri patogeni. Il saggio ? quindi specifico per SARS-CoV-2.
[00140] L'osservazione che il saggio della presente invenzione riporta la rivelazione di SARS-CoV-2 quando viene impiegato solo uno di tali set di primer e sonde (ovvero, un set di sonde e primer che ha come bersaglio ORF1ab o un set di sonde e primer che ha come bersaglio il gene S) indica che, usando entrambi questi set di sonde e primer, si pu? aumentare la sensibilit? del saggio in caso di basse cariche virali e che l'accuratezza del saggio non verr? compromessa da alcuna mutazione puntiforme che pu? verificarsi durante la diffusione del COVID-19 nella popolazione.
[00141] Per dimostrare il miglioramento della sensibilit? del saggio ottenuto utilizzando entrambi i set di primer e sonde preferiti, ? stata testata una preparazione di particelle virali di SARS-CoV2 (derivanti dall?isolato 2019nCoV/Italy-INMI1) in un tampone orale-matrice UTM a dosi comprese tra 10<-5 >e 10<-8 >TCID50/mL. Come riportato in Tabella 3 e in Tabella 4, relativamente alla rivelazione di sequenze di ORF1ab o di sequenze del gene S, ? stato riscontrato che l'uso di entrambi i set di primer e sonde preferiti aumenta la sensibilit? del saggio, ottenendo la rivelazione della dose di 10<-8 >TCID50/mL anzich? di 10<-7 >TCID50/mL.
[00142] I risultati ottenuti a 10<-8 >TCID50/mL (400 copie/mL) sono riassunti in Tabella 4.
[00143] I dati utilizzati nella Tabella 4 erano basati su una dose virale di 10<-8 >TCID50/mL (400 copie/mL). Quando i campioni contenevano 500 copie di RNA virale / mL, i saggi della presente invenzione mostravano una capacit? del 100% di rivelare SARS-CoV-2 (Tabella 5).
[00144] Questo livello di sensibilit? (determinato con RNA genomico virale) riflette il tipo di risultati che si otterrebbe utilizzando campioni clinici contenenti SARS-CoV-2. I saggi della presente invenzione forniranno quindi agli operatori sanitari indicazioni analitiche che consentiranno loro di interpretare meglio i risultati del saggio nella pratica clinica.
[00145] Tutte le pubblicazioni e tutti i brevetti menzionati in questa descrizione sono qui incorporati come citazione parimenti a come se ogni singola pubblicazione o domanda di brevetto fosse specificatamente e individualmente indicata essere incorporata come citazione nella sua interezza. Sebbene l'invenzione sia stata descritta in relazione a sue forme di realizzazione specifiche, si comprender? che essa pu? essere soggetta a ulteriori modifiche e che questa domanda intende coprire qualsivoglia variazioni, usi o adattamenti dell'invenzione che seguono, in generale, i principi dell?invenzione e includono scostamenti dalla presente descrizione rientranti nella pratica nota o consuetudinaria dell'arte a cui appartiene l'invenzione e che possono essere applicati alle caratteristiche essenziali di cui sopra.

Claims (1)

  1. RIVENDICAZIONI Rivendicazione 1. Oligonucleotide, avente un terminale 5? e un terminale 3?, in cui detto oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12. Rivendicazione 2. Oligonucleotide secondo la rivendicazione 1, in cui detto oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1. Rivendicazione 3. Oligonucleotide secondo la rivendicazione 1, in cui detto oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2. Rivendicazione 4. Oligonucleotide secondo la rivendicazione 1, in cui detto oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5. Rivendicazione 5. Oligonucleotide secondo la rivendicazione 1, in cui detto oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6. Rivendicazione 6. Oligonucleotide secondo la rivendicazione 1, in cui detto oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, in cui detto oligonucleotide ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza di detto fluoroforo. Rivendicazione 7. Oligonucleotide secondo la rivendicazione 1, in cui detto oligonucleotide ha una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12, in cui detto oligonucleotide ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza di detto fluoroforo. Rivendicazione 8. Metodo per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui detto metodo prevede di: (I) incubare detto campione clinico in vitro in presenza di: (1) una trascrittasi inversa e una DNA polimerasi avente un?attivit? 5??3? esonucleasica; e (2) un Primer Forward di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1; (3) un Primer Reverse di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2; (4) una Sonda di ORF1ab, detta Sonda di ORF1ab essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, in cui detta Sonda oligonucleotidica di ORF1ab ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza di detto fluoroforo; e in cui detta incubazione avviene in una reazione in condizioni sufficienti a consentire: (a) a detti Primer Forward e Reverse di ORF1ab di mediare un?amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi di una regione della ORF1ab di SARS-CoV-2 per produrre in tal modo molecole oligonucleotidiche amplificate di ORF1ab, se detto SARS-CoV-2 ? presente in detto campione clinico; (b) a detta Sonda di ORF1ab di ibridarsi a molecole oligonucleotidiche amplificate di ORF1ab; (c) a detta attivit? 5??3? esonucleasica di idrolizzare la Sonda di ORF1ab ibridata, per separare in tal modo detto suo fluoroforo da detto suo estinguente e far s? che diventi rivelabile un segnale fluorescente; e (II) determinare se detto SARS-CoV-2 sia presente in detto campione clinico determinando se sia divenuto rivelabile un segnale fluorescente di detto fluoroforo. Rivendicazione 9. Metodo secondo la rivendicazione 8, in cui detto fluoroforo ha una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm. Rivendicazione 10. Metodo secondo la rivendicazione 9, in cui detto fluoroforo ? JOE o FAM. Rivendicazione 11. Metodo per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui detto metodo prevede di: (I) incubare detto campione clinico in vitro in presenza di: (1) una trascrittasi inversa e una DNA polimerasi avente un?attivit? 5??3? esonucleasica; e (2) un Primer Forward del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5; (3) un Primer Reverse del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6; (4) una Sonda del Gene S, detta Sonda del Gene S essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12, in cui detta Sonda oligonucleotidica del Gene S ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza di detto fluoroforo; e in cui detta incubazione avviene in una reazione in condizioni sufficienti a consentire: (a) a detti Primer Forward e Reverse del Gene S di mediare un?amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi di una regione del gene S di SARS-CoV-2 per produrre in tal modo molecole oligonucleotidiche amplificate del gene S, se detto SARS-CoV-2 ? presente in detto campione clinico; (b) a detta Sonda del Gene S di ibridarsi a molecole oligonucleotidiche amplificate del gene S; (c) a detta attivit? 5??3? esonucleasica di idrolizzare la Sonda del Gene S ibridata, per separare in tal modo detto suo fluoroforo da detto suo estinguente e far s? che diventi rivelabile un segnale fluorescente; e (II) determinare se detto SARS-CoV-2 sia presente in detto campione clinico determinando se sia divenuto rivelabile un segnale fluorescente di detto fluoroforo. Rivendicazione 12. Metodo secondo la rivendicazione 11, in cui detto fluoroforo ha una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm. Rivendicazione 13. Metodo secondo la rivendicazione 12, in cui detto fluoroforo ? JOE o FAM. Rivendicazione 14. Metodo secondo la rivendicazione 11, in cui detto campione clinico viene incubato in presenza aggiuntiva di: (5) un Primer Forward di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1; (6) un Primer Reverse di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2; (7) una Sonda di ORF1ab, detta Sonda di ORF1ab essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, in cui detta Sonda oligonucleotidica di ORF1ab ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza di detto fluoroforo; in cui la fluorescenza di detto fluoroforo di detta Sonda di ORF1ab ? distinguibile dalla fluorescenza di detto fluoroforo di detta Sonda del Gene S; e in cui detta reazione viene ulteriormente incubata in condizioni sufficienti per consentire: (a) a detti Primer Forward e Reverse di ORF1ab di mediare un?amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi di una regione della ORF1ab di SARS-CoV2 per produrre in tal modo molecole oligonucleotidiche di ORF1ab amplificate, se detto SARS-CoV-2 ? presente in detto campione clinico; (b) a detta Sonda di ORF1ab di ibridarsi a molecole oligonucleotidiche amplificate di ORF1ab; (c) a detta attivit? 5??3? esonucleasica di idrolizzare la Sonda di ORF1ab ibridata, per separare in tal modo detto suo fluoroforo da detto suo estinguente e far s? che diventi rivelabile un segnale fluorescente; e in cui detto SARS-CoV-2 viene determinato essere presente in detto campione clinico determinando se sia divenuto rivelabile un segnale fluorescente di almeno uno tra i fluorofori di detta Sonda di ORF1ab o di detta Sonda del Gene S. Rivendicazione 15. Metodo secondo la rivendicazione 11, in cui detto fluoroforo di detta Sonda di ORF1ab e detto fluoroforo di detta Sonda del Gene S hanno una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm. Rivendicazione 16. Metodo secondo la rivendicazione 14, in cui uno di detti fluorofori di detta Sonda di ORF1ab e di detta Sonda del Gene S ? JOE e l?altro di tali fluorofori ? FAM. Rivendicazione 17. Kit per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui detto kit comprende: (I) reagenti per rivelare ORF1ab di SARS-CoV-2, in cui i reagenti per la rivelazione di ORF1ab di SARS-CoV-2 comprendono: (1) un Primer Forward di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1; (2) un Primer Reverse di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2; e (3) una Sonda di ORF1ab, la Sonda di ORF1ab essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, in cui la Sonda oligonucleotidica di ORF1ab ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e (II) istruzioni per l?uso di tali reagenti di rivelazione per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 nel campione clinico. Rivendicazione 18. Kit per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui detto kit comprende: (I) reagenti per rivelare il gene S di SARS-CoV-2, in cui i reagenti per la rivelazione del gene S di SARS-CoV-2 comprendono: (1) un Primer Forward del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5; (2) un Primer Reverse del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6; e (3) una Sonda del Gene S, la Sonda del Gene S essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12, in cui la Sonda oligonucleotidica del Gene S ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e (II) istruzioni per l?uso di tali reagenti di rivelazione per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 nel campione clinico. Rivendicazione 19. Kit secondo la rivendicazione 17 o 18, in cui detto fluoroforo ha una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm. Rivendicazione 20. Kit secondo la rivendicazione 19, in cui detto fluoroforo ? JOE o FAM. Rivendicazione 21. Kit per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione clinico, in cui detto kit comprende: (I) (A) reagenti per rivelare ORF1ab di SARS-CoV-2, in cui i reagenti per la rivelazione di ORF1ab di SARS-CoV-2 comprendono: (1) un Primer Forward di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:1; (2) un Primer Reverse di ORF1ab avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:2; e (3) una Sonda di ORF1ab, la Sonda di ORF1ab essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, in cui la Sonda oligonucleotidica di ORF1ab ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; e (B) reagenti per rivelare il gene S di SARS-CoV-2, in cui i reagenti per la rivelazione del gene S di SARS-CoV-2 comprendono: (1) un Primer Forward del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:5; (2) un Primer Reverse del Gene S avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:6; e (3) una Sonda del Gene S, la Sonda del Gene S essendo un oligonucleotide avente una sequenza nucleotidica che consiste di, consiste essenzialmente di, o ? una variante di, la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12, in cui la Sonda oligonucleotidica del Gene S ha un terminale 5? che ? marcato con un fluoroforo e un terminale 3? che ? complessato con un estinguente della fluorescenza del fluoroforo; in cui la fluorescenza del fluoroforo della Sonda del Gene S ? distinguibile dalla fluorescenza del fluoroforo della Sonda di ORF1ab; e (II) istruzioni per l?uso di tale reagente per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 nel campione clinico. Rivendicazione 22. Kit secondo la rivendicazione 21, in cui detto fluoroforo di detta Sonda di ORF1ab e detto fluoroforo di detta Sonda del Gene S hanno una lunghezza d?onda di eccitazione compresa nell?intervallo di circa 352-690 nm e una lunghezza d?onda di emissione compresa nell?intervallo di circa 447-705 nm. Rivendicazione 23. Kit secondo la rivendicazione 22, in cui uno di detti fluorofori di detta Sonda di ORF1ab e di detta Sonda del Gene S ? JOE e l?altro di tali fluorofori ? FAM.
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