FR3075965A1

FR3075965A1 - NON-INVASIVE METHOD FOR DETERMINING THE FERTILITY AND / OR SEX OF AN EGG BASED ON AT LEAST ONE FLUORESCENCE CHARACTERISTIC

Info

Publication number: FR3075965A1
Application number: FR1763079A
Authority: FR
Inventors: Samuel Baron; Lise Catherinot; Yatma Sarr; Marc Schortgen; Gerald Thouand; Antony Ali Assaf
Original assignee: TRONICO; Universite de Nantes
Current assignee: TRONICO; Universite de Nantes
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2019-06-28

Abstract

Il est proposé un procédé non invasif de détermination de la fertilité et/ou du sexe d'un œuf comprenant une coquille, comprenant les étapes suivantes : obtention (92, 93) d'au moins une caractéristique de fluorescence de la coquille ; et prédiction (94) de la fertilité et/ou du sexe de l'œuf en fonction de ladite au moins une caractéristique de fluorescence. Il est également proposé un système mettant en œuvre ce procédé.There is provided a non-invasive method for determining the fertility and / or sex of an egg comprising a shell, comprising the steps of: obtaining (92, 93) at least one fluorescence characteristic of the shell; and predicting (94) the fertility and / or sex of the egg based on the at least one fluorescence characteristic. It is also proposed a system implementing this method.

Description

Procédé non invasif de détermination de la fertilité et/ou du sexe d’un œuf en fonction d’au moins une caractéristique de fluorescence.Non-invasive method of determining the fertility and / or sex of an egg based on at least one fluorescence characteristic.

1. DOMAINE TECHNIQUE1. TECHNICAL AREA

Le domaine de l’invention est celui de l’aviculture.The field of the invention is that of poultry farming.

Plus précisément, l’invention concerne une technique (procédés et systèmes) non invasive de détermination de la fertilité d’un œuf et/ou du sexe de celui-ci (c’est-à-dire le genre, mâle ou femelle, de l’embryon contenu dans l’œuf si celui-ci a été fécondé).More specifically, the invention relates to a non-invasive technique (methods and systems) for determining the fertility of an egg and / or the sex thereof (that is to say the genus, male or female, of the embryo contained in the egg if it has been fertilized).

2. ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE2. TECHNOLOGICAL BACKGROUND

On connaît depuis de nombreuses années, dans le domaine avicole, la problématique récurrente de la détermination de la fertilité et du sexe des œufs avant leur éclosion.We have known for many years, in the poultry sector, the recurring problem of determining the fertility and sex of eggs before they hatch.

Traditionnellement, le sexage s’effectue sur les poussins d’un jour par une intervention humaine, principalement via deux techniques : l’observation des plumes et l’observation du cloaque. Bien qu’efficaces, un inconvénient majeur de ces deux techniques est qu’elles interviennent trop tard dans le cycle de production. Par exemple, pour les poules pondeuses, il faut 21 jours d’incubation pour séparer les femelles des mâles (ces derniers étant éliminés). En résumé, ces techniques traditionnelles sont chronophages et posent des problèmes de coût et d’éthique.Traditionally, sexing is carried out on day-old chicks by human intervention, mainly via two techniques: observation of feathers and observation of the cloaca. Although effective, a major drawback of these two techniques is that they intervene too late in the production cycle. For example, for laying hens, it takes 21 days of incubation to separate the females from the males (the latter being eliminated). In summary, these traditional techniques are time consuming and pose cost and ethical issues.

Les travaux actuels sur le sujet sont donc orientés vers des techniques de sexage in-ovo, c’est-à-dire la détermination du sexe de l’embryon dans l’œuf (avant éclosion) avec l’objectif d’être au plus tôt lors de l’incubation, voire avant. En effet, la détermination du genre des embryons à un stade précoce de l’incubation permet d’améliorer la production avicole, avec à la fois un gain de temps et un gain financier.Current work on the subject is therefore oriented towards in-ovo sexing techniques, that is to say the determination of the sex of the embryo in the egg (before hatching) with the objective of being at most early in the incubation, or even before. Determining the genus of embryos at an early stage of incubation improves poultry production, saving both time and money.

Une première technique connue est décrite dans le document de brevet US6029080, qui propose une méthode de détermination utilisant la résonance magnétique nucléaire pour observer les organes reproducteurs de l’embryon dans l’œuf. Cette technique permet de trier les œufs en trois catégories: ceux contenant un embryon mâle, ceux contenant un embryon femelle et les œufs clairs (non fécondés). Mais cette technique d’observation n’est praticable qu’après refroidissement de l’œuf, afin de minimiser les mouvements de l’embryon. Un inconvénient de cette technique est que le refroidissement de l’œuf engendre des perturbations dans le développement futur de l’embryon. Un autre inconvénient est qu’elle intervient tard dans le développement de l’embryon. Encore un autre inconvénient réside dans la mise en œuvre relativement coûteuse d’une telle technique, induisant un frein à son développement industriel.A first known technique is described in patent document US6029080, which proposes a determination method using nuclear magnetic resonance to observe the reproductive organs of the embryo in the egg. This technique allows eggs to be sorted into three categories: those containing a male embryo, those containing a female embryo and clear (unfertilized) eggs. However, this observation technique is only practicable after the egg has cooled, in order to minimize the movements of the embryo. A disadvantage of this technique is that the cooling of the egg causes disturbances in the future development of the embryo. Another disadvantage is that it intervenes late in the development of the embryo. Yet another drawback lies in the relatively costly implementation of such a technique, inducing a brake on its industrial development.

Une deuxième technique connue est décrite dans le document de brevet US2011/0144473, qui décrit l’utilisation de la spectroscopie UV. Cette technique consiste à émettre une onde dans l’ultraviolet de manière à provoquer une auto-fluorescence d’une région du germe (blastoderme). Pour déterminer le sexe de l’embryon, on calcule puis on compare un coefficient de décroissance à une base de données, suite à l’observation de la décroissance de l’auto-fluorescence après arrêt de l’émission de l’onde UV. Cependant, un inconvénient de cette technique est qu’elle requiert un accès au blastoderme par un prélèvement invasif.A second known technique is described in patent document US2011 / 0144473, which describes the use of UV spectroscopy. This technique consists in emitting a wave in the ultraviolet so as to cause an auto-fluorescence of a region of the germ (blastoderm). To determine the sex of the embryo, a decay coefficient is calculated and then compared to a database, following the observation of the decay of the autofluorescence after the emission of the UV wave has stopped. However, a disadvantage of this technique is that it requires access to the blastoderm by an invasive sample.

Une troisième technique connue, basée sur l’utilisation de la spectroscopie IR sur le germe, est décrite dans l’article suivant : G. Steiner et al., « Gender Détermination of fertilized unincubated chicken eggs by infrared spectroscopie imaging », Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2011, Vol 400, n°9, p. 2775-2782. Cette méthode, également invasive, consiste en l’introduction d’une sonde dans la région du germe pour effectuer un prélèvement, afin d’en caractériser les cellules constitutives par une spectroscopie infrarouge.A third known technique, based on the use of IR spectroscopy on the germ, is described in the following article: G. Steiner et al., "Gender Determination of fertilized unincubated chicken eggs by infrared spectroscopy imaging", Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2011, Vol 400, n ° 9, p. 2775-2782. This method, also invasive, consists of the introduction of a probe into the region of the germ to take a sample, in order to characterize the constituent cells by infrared spectroscopy.

Une quatrième technique connue, elle aussi invasive, est décrite dans les documents W02016000678A1 et DE102016004051B3. Il est proposé un appareil de mesure et un procédé de traitement des données pour déterminer le sexe d’un embryon d’oiseau de manière optique dans l’œuf. Pour cela la coquille d’œuf est découpée et un vaisseau sanguin de l’embryon est repéré grâce à un système optique de repérage (« tracking »). Ce vaisseau sanguin est ensuite éclairé par un laser. Au sein de la lumière réémise par le vaisseau sanguin, on mesure (grâce à un capteur) soit le signal Raman seul (W02016000678A1), soit le signal de fluorescence et le signal Raman (DE102016004051B3), et le(s) signal(ux) mesuré(s) est(sont) comparé(s) à des valeurs seuils pour classer le signal optique en fonction du sexe de l’embryon. L’inconvénient majeur de cette quatrième technique est qu’elle est invasive. Elle nécessite donc une étape de découpe de la coquille et un moyen de refermer la coquille après la mesure. Ceci engendre des coûts, rend le procédé peu industrialisable et induit un grand risque de contamination bactériologique de l’œuf. Ensuite la détection de vaisseaux sanguins par un système spécifique peut être relativement longue (plusieurs dizaines de secondes), ce qui est peu compatible avec une industrialisation du procédé, avec des rendements élevés. De plus, l’éclairement direct de l’embryon par un laser est une approche à l’éthique discutable. Enfin, la mesure nécessite que les vaisseaux sanguins de l’embryon soient développés, impliquant une discrimination au plus tôt à 3,5 jours après le début de l’incubation.A fourth known technique, also invasive, is described in documents W02016000678A1 and DE102016004051B3. There is provided a measuring apparatus and a data processing method for determining the sex of a bird embryo optically in the egg. For this, the eggshell is cut and a blood vessel of the embryo is identified by an optical tracking system. This blood vessel is then lit by a laser. Within the light re-emitted by the blood vessel, we measure (thanks to a sensor) either the Raman signal alone (W02016000678A1), or the fluorescence signal and the Raman signal (DE102016004051B3), and the signal (s) (ux) measured (s) is (are) compared (s) with threshold values to classify the optical signal according to the sex of the embryo. The major drawback of this fourth technique is that it is invasive. It therefore requires a step of cutting the shell and a means of closing the shell after the measurement. This generates costs, makes the process difficult to industrialize and induces a great risk of bacteriological contamination of the egg. Then the detection of blood vessels by a specific system can be relatively long (several tens of seconds), which is hardly compatible with an industrialization of the process, with high yields. In addition, direct laser illumination of the embryo is a questionable ethical approach. Finally, the measurement requires that the blood vessels of the embryo be developed, implying discrimination no earlier than 3.5 days after the start of incubation.

Un inconvénient majeur des deuxième, troisième et quatrième techniques connues est donc qu’elles sont invasives : elles nécessitent soit l’introduction d’instruments et le prélèvement de cellules dans le germe, soit l’éclairement direct de l’embryon par un rayonnement lumineux (ex : laser) pouvant possiblement l’endommager. Ces opérations induisent des risques de contaminations et de surmortalité embryonnaire en plus d’une mise en œuvre complexe (découpe, prélèvement, etc.) et chronophage. Il a donc été proposé des techniques non invasives.A major drawback of the second, third and fourth known techniques is therefore that they are invasive: they require either the introduction of instruments and the removal of cells from the germ, or the direct illumination of the embryo by light radiation. (ex: laser) possibly damaging it. These operations induce risks of contamination and embryonic excess mortality in addition to a complex and time-consuming implementation (cutting, removal, etc.). Non-invasive techniques have therefore been proposed.

Une cinquième technique connue, non invasive, est décrite dans le document de brevet US2013/0044210. Elle consiste en une analyse hyper-spectrale (c’est-à-dire de l’infrarouge moyen au proche UV) d’un spectre optique en réflexion de l’œuf, en soustrayant la réponse spectrale de la coquille et en détectant les composants biologiques de l’œuf. Cette technique permet de déterminer, dès le deuxième jour (J2 d’incubation), si l’œuf est fécondé et, au douzième jour (J12 d’incubation), le genre de l’embryon. Un inconvénient majeur de cette technique est qu’elle nécessite une correction des mesures très importante, avec la soustraction du signal de la coquille seul (soustraction de sa réponse spectrale) et des perturbations environnementales (lumière, humidité, etc.). Il y a donc beaucoup d’informations non discriminantes à supprimer ce qui rend le procédé peu industrialisable. En outre, chaque œuf doit être posé sur un support spécifique, maintenant une distance connue entre la source de rayonnement, le détecteur et l’œuf. Ceci rend également cette technique difficilement industrialisable.A fifth known technique, non-invasive, is described in patent document US2013 / 0044210. It consists of a hyper-spectral analysis (that is to say from the medium infrared to the near UV) of an optical spectrum in reflection of the egg, by subtracting the spectral response from the shell and by detecting the components organic egg. This technique makes it possible to determine, from the second day (D2 of incubation), whether the egg is fertilized and, on the twelfth day (D12 of incubation), the genus of the embryo. A major drawback of this technique is that it requires a very significant correction of the measurements, with the subtraction of the signal from the shell alone (subtraction of its spectral response) and environmental disturbances (light, humidity, etc.). There is therefore a lot of non-discriminatory information to be deleted which makes the process difficult to industrialize. In addition, each egg must be placed on a specific support, maintaining a known distance between the radiation source, the detector and the egg. This also makes this technique difficult to industrialize.

Une sixième technique connue, également non invasive, est décrite dans le document de brevet WO 2016/005539. Ce document détaille l’utilisation de la réponse spectrale de la coquille pour y rechercher des informations moléculaires apparaissant lors de l’incubation de l’œuf (développement embryonnaire). Deux modes de réalisation sont décrits : la spectroscopie Raman et la spectroscopie ATR (spectroscopie infrarouge à réflexion totale). Un inconvénient de cette sixième technique est qu’elle ne peut pas être envisagée avant l’incubation (puisqu’elle s’appuie sur des informations moléculaires apparaissant lors de l’incubation). Un autre inconvénient est qu’une sonde de type Raman induit un signal de faible intensité contenu dans une quantité importante d’informations non-discriminantes à éliminer.A sixth known technique, also non-invasive, is described in patent document WO 2016/005539. This document details the use of the spectral response of the shell to search for molecular information appearing during the incubation of the egg (embryonic development). Two embodiments are described: Raman spectroscopy and ATR spectroscopy (infrared spectroscopy with total reflection). A disadvantage of this sixth technique is that it cannot be considered before incubation (since it is based on molecular information appearing during incubation). Another drawback is that a Raman type probe induces a weak signal contained in a large quantity of non-discriminating information to be eliminated.

Une septième technique connue, également non invasive, est décrite dans le document de brevet W02017094015A1. Elle propose une modification génétique sur un des chromosomes sexuels des races aviaires (Z ou W) afin de rendre les œufs d’un des sexes (soit mâle, soit femelle) bioluminescents lors du développement de l’embryon pendant l’incubation. Ceci permet le classement des œufs suivant le sexe du futur poussin. La modification génétique consiste en l’ajout d’un gène (luciferase) permettant la génération d’une molécule bioluminescente par l’embryon. Cette bioluminescence est ensuite mesurée de manière non-invasive. La présence ou non du signal bioluminescent, permet de déterminer le sexe de l’embryon dans l’œuf non éclos à partir du premier jour du développement embryonnaire (J1 d’incubation). L’inconvénient majeur de cette septième technique est qu’elle requiert une modification génétique donc la création d’espèces aviaires spécifiques. Par conséquent, en plus de poser des problèmes du point de vue de l’acceptation éthique, cette technique n’est pas valide sur toutes les souches aviaires actuelles (non modifiées) et pose des problèmes de conformité vis-à-vis de la réglementation car les nouvelles espèces créées sont considérées comme des OGM.A seventh known technique, also non-invasive, is described in patent document WO2017094015A1. She proposes a genetic modification on one of the sex chromosomes of avian races (Z or W) in order to make the eggs of one of the sexes (either male or female) bioluminescent during the development of the embryo during incubation. This allows the classification of eggs according to the sex of the future chick. Genetic modification consists of adding a gene (luciferase) allowing the generation of a bioluminescent molecule by the embryo. This bioluminescence is then measured non-invasively. The presence or absence of the bioluminescent signal makes it possible to determine the sex of the embryo in the unhatched egg from the first day of embryonic development (D1 of incubation). The major drawback of this seventh technique is that it requires genetic modification, therefore the creation of specific avian species. Consequently, in addition to posing problems from the point of view of ethical acceptance, this technique is not valid on all current avian strains (unmodified) and poses problems of compliance with regard to regulations. because the new species created are considered to be GMOs.

On notera que les techniques connues non invasives utilisent des substances discriminantes qui apparaissent au cours de l’incubation de l’œuf. Ainsi, celles sans modification génétique (les cinquième et sixième ci-dessus) ne sont pas utilisables avant le jour J2 ou J3 d’incubation, et celle avec modification génétique (la septième ci-dessus) n’est utilisable qu’à partir du jour J1 d’incubation.It will be noted that the known non-invasive techniques use discriminating substances which appear during the incubation of the egg. Thus, those without genetic modification (the fifth and sixth above) cannot be used before D2 or D3 incubation day, and those with genetic modification (the seventh above) can only be used from D1 day of incubation.

3. OBJECTIFS L’invention, dans au moins un mode de réalisation, a notamment pour objectif de pallier ces différents inconvénients de l’état de la technique.3. OBJECTIVES The invention, in at least one embodiment, aims in particular to overcome these various drawbacks of the state of the art.

Plus précisément, dans au moins un mode de réalisation de l’invention, un objectif est de fournir une technique de détermination de la fertilité et/ou du sexe d’un œuf, qui à la fois soit non invasive, ne nécessite pas de modification génétique et soit plus simple à mettre en œuvre (et donc plus facilement industrialisable) que les techniques connues précitées.More specifically, in at least one embodiment of the invention, an objective is to provide a technique for determining the fertility and / or sex of an egg, which is both non-invasive and does not require modification. genetic and is simpler to implement (and therefore more easily industrializable) than the aforementioned known techniques.

Un autre objectif, dans au moins un mode de réalisation de l’invention, est de fournir une telle technique qui permette une discrimination avant et/ou pendant l’incubation.Another objective, in at least one embodiment of the invention, is to provide such a technique which allows discrimination before and / or during incubation.

Un autre objectif, dans au moins un mode de réalisation de l’invention, est de fournir une telle technique qui soit fiable. 4. RÉSUMÉAnother objective, in at least one embodiment of the invention, is to provide such a technique which is reliable. 4. SUMMARY

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, il est proposé un procédé non invasif de détermination de la fertilité et/ou du sexe d’un œuf comprenant une coquille, comprenant les étapes suivantes : obtention d’au moins une caractéristique de fluorescence de la coquille ; et prédiction de la fertilité et/ou du sexe de l’œuf en fonction de ladite au moins une caractéristique de fluorescence.In a particular embodiment of the invention, there is provided a non-invasive method for determining the fertility and / or sex of an egg comprising a shell, comprising the following steps: obtaining at least one fluorescence characteristic shell; and predicting the fertility and / or sex of the egg as a function of said at least one fluorescence characteristic.

Le principe général de l’invention consiste donc à utiliser au moins une caractéristique de fluorescence de la coquille d’œuf, pour déterminer de manière in-ovo si l’œuf est fécondé et le cas échéant le sexe du futur poussin.The general principle of the invention therefore consists in using at least one fluorescence characteristic of the eggshell, in order to determine in-ovo whether the egg is fertilized and if so the sex of the future chick.

Cette approche tout à fait nouvelle et inventive résulte de la découverte par les inventeurs que la fluorescence de la coquille, avant ou pendant l’incubation de l’œuf, est différente d’un œuf à l’autre du point de vue de son intensité et de son évolution dans le temps, et que ces caractéristiques de fluorescence sont, in fine, reliées à la fécondation de l’œuf et en particulier au sexe du futur poussin. Plus précisément, la coquille d’œuf (comprenant la cuticule) est constituée principalement de carbonate de calcium ainsi que de nombreuses autres molécules organiques ou inorganiques (ex : sucres, protéines, hormones, etc.). Les types de ces autres molécules, et surtout leurs quantités, sont différents d’un œuf à l’autre, suivant de nombreux paramètres physico-chimiques propres à la conception de l’œuf (géniteurs, saisonnalité, etc.), et en particulier suivant le sexe du futur poussin pour les œufs fécondés. Ces autres molécules sont soit contenues initialement dans la coquille (avant incubation) ou apparaissent dans la coquille pendant le développement de l’embryon (pendant l’incubation) par échange/migration entre l’intérieur et l’extérieur de l’œuf.This completely new and inventive approach results from the discovery by the inventors that the fluorescence of the shell, before or during the incubation of the egg, is different from one egg to another in terms of its intensity. and its evolution over time, and that these fluorescence characteristics are, ultimately, related to the fertilization of the egg and in particular to the sex of the future chick. More specifically, the eggshell (including the cuticle) consists mainly of calcium carbonate as well as many other organic or inorganic molecules (e.g. sugars, proteins, hormones, etc.). The types of these other molecules, and especially their quantities, are different from one egg to another, according to many physicochemical parameters specific to the conception of the egg (spawners, seasonality, etc.), and in particular depending on the sex of the future chick for fertilized eggs. These other molecules are either initially contained in the shell (before incubation) or appear in the shell during the development of the embryo (during incubation) by exchange / migration between the inside and outside of the egg.

La solution proposée présente de nombreux avantages : • elle est non-invasive ; • elle ne nécessite pas de modification génétique ; • le phénomène physique mesuré (fluorescence) est plus intense que celui habituellement mesuré (phénomène Raman par exemple), donc le système mettant en œuvre le procédé peut être moins sensible pour une efficacité égale (le temps d’acquisition peut donc être réduit par rapport à une mesure Raman et le coût du dispositif industriel final peut également être réduit) ; • la mesure et son traitement sont rapides et compatibles avec un procédé industriel de masse ; • la détermination de la fertilité et/ou du sexe de l’œuf (mâle ou femelle) est possible avant incubation.The proposed solution has many advantages: • it is non-invasive; • it does not require genetic modification; • the physical phenomenon measured (fluorescence) is more intense than that usually measured (Raman phenomenon for example), therefore the system implementing the process can be less sensitive for equal efficiency (the acquisition time can therefore be reduced compared to to a Raman measure and the cost of the final industrial device can also be reduced); • measurement and processing are fast and compatible with a mass industrial process; • the fertility and / or sex of the egg (male or female) can be determined before incubation.

Selon une caractéristique particulière, l’étape d’obtention comprend : a) pour au moins une mesure associée à un point de mesure, sur ou dans la coquille, et une longueur d’onde d’excitation : a-1) collecte d’un signal optique émis par la coquille ; a-2) acquisition d’un spectre d’intensité du signal optique collecté ; et b) calcul de ladite au moins une caractéristique de fluorescence, en fonction dudit spectre.According to a particular characteristic, the obtaining step comprises: a) for at least one measurement associated with a measurement point, on or in the shell, and an excitation wavelength: a-1) collection of an optical signal emitted by the shell; a-2) acquisition of an intensity spectrum of the collected optical signal; and b) calculating said at least one fluorescence characteristic, as a function of said spectrum.

De cette façon, la solution proposée est simple à mettre en œuvre et facilement industrialisable.In this way, the proposed solution is simple to implement and easily industrializable.

Selon une caractéristique particulière, dans l’étape a) : les sous-étapes a-1) et a-2) sont exécutées pour une pluralité de mesures associées chacune à un couple distinct comprenant un point de mesure et une longueur d’onde d’excitation ; et la sous-étape a-2) est suivie d’une sous-étape a-3) de combinaison des spectres acquis lors des différentes exécutions de la sous-étape a-2), pour obtenir un spectre global ; et dans l’étape b), le calcul de ladite au moins une caractéristique de fluorescence est réalisé en fonction dudit spectre global.According to a particular characteristic, in step a): the sub-steps a-1) and a-2) are executed for a plurality of measurements each associated with a distinct pair comprising a measurement point and a wavelength d 'excitement; and sub-step a-2) is followed by a sub-step a-3) of combining the spectra acquired during the different executions of sub-step a-2), to obtain an overall spectrum; and in step b), the calculation of said at least one fluorescence characteristic is carried out as a function of said global spectrum.

La prise en compte d’une pluralité de mesures permet d’améliorer la précision de la ou les caractéristiques de fluorescence obtenues, et donc la qualité de la prédiction finale (fertilité et/ou sexe de l’œuf).Taking into account a plurality of measurements makes it possible to improve the accuracy of the fluorescence characteristic (s) obtained, and therefore the quality of the final prediction (fertility and / or sex of the egg).

Selon une caractéristique particulière, l’étape b) comprend : b-1) calcul d’une ligne de base de fluorescence dudit spectre ; et b-2) calcul de type « aire sous la courbe » pour ladite ligne de base de fluorescence ou au moins une zone de ladite ligne de base de fluorescence, pour obtenir une valeur d’intensité de fluorescence (Imes).According to a particular characteristic, step b) comprises: b-1) calculation of a fluorescence baseline of said spectrum; and b-2) "area under the curve" type calculation for said fluorescence baseline or at least one area of said fluorescence baseline, to obtain a fluorescence intensity value (Imes).

Selon une caractéristique particulière, l’étape a) est réalisée pour chacun d’une pluralité d’instants de mesure, permettant d’acquérir un dit spectre pour chacun des instants de mesure. En outre, l’étape b) comprend : pour chacun des spectres, les sous-étapes b-1) et b-2), pour obtenir une valeur d’intensité de fluorescence (Imes) ; et calcul d’au moins une caractéristique additionnelle de fluorescence, en fonction des valeurs d’intensité de fluorescence obtenues pour lesdits spectres.According to a particular characteristic, step a) is carried out for each of a plurality of measurement instants, making it possible to acquire a said spectrum for each of the measurement instants. In addition, step b) comprises: for each of the spectra, sub-steps b-1) and b-2), to obtain a fluorescence intensity value (Imes); and calculating at least one additional fluorescence characteristic, as a function of the fluorescence intensity values obtained for said spectra.

La prise en compte de mesures consécutives dans le temps permet d’obtenir des caractéristiques de fluorescence supplémentaires, et donc d’améliorer encore la qualité de la prédiction finale (fertilité et/ou sexe de l’œuf).Taking into account consecutive measurements over time makes it possible to obtain additional fluorescence characteristics, and therefore to further improve the quality of the final prediction (fertility and / or sex of the egg).

Selon une caractéristique particulière (liste non exhaustive), ladite au moins une caractéristique additionnelle de fluorescence appartient au groupe comprenant : une intensité de fluorescence initiale (Iini) ; une intensité de fluorescence maximale (Imax) ; une intensité de fluorescence minimale (Imin) ; une intensité de fluorescence moyenne (Imoy) ; et une vitesse de décroissance de fluorescence (τ).According to a particular characteristic (non-exhaustive list), said at least one additional fluorescence characteristic belongs to the group comprising: an initial fluorescence intensity (Iini); maximum fluorescence intensity (Imax); minimum fluorescence intensity (Imin); an average fluorescence intensity (Imoy); and a fluorescence decay rate (τ).

Dans une première implémentation particulière, l’étape de collecte est précédée d’une étape d’excitation optique de la coquille.In a first particular implementation, the collection step is preceded by a step of optical excitation of the shell.

Grâce à l’excitation optique de la coquille, la collecte du signal optique émis par la coquille peut être effectuée avec un appareil ayant une moins forte sensibilité.Thanks to the optical excitation of the shell, the collection of the optical signal emitted by the shell can be carried out with a device having a lower sensitivity.

Dans une deuxième implémentation particulière, l’étape de collecte n’est pas précédée d’une étape d’excitation optique de la coquille, et le signal optique collecté est un signal de luminescence.In a second particular implementation, the collecting step is not preceded by a step of optical excitation of the shell, and the collected optical signal is a luminescence signal.

Dans cette variante, on collecte le signal optique émis naturellement par la coquille (thermoluminescence, chimiluminescence, etc.). On s’affranchit donc d’un appareil d’excitation optique de la coquille. En contrepartie, le signal de luminescence ainsi collecté est de faible intensité par rapport au signal de fluorescence collecté dans la première implémentation, ce qui nécessite un appareil de collecte ayant une très forte sensibilité.In this variant, the optical signal emitted naturally by the shell is collected (thermoluminescence, chemiluminescence, etc.). We are therefore free from an optical excitation device for the shell. In return, the luminescence signal thus collected is of low intensity compared to the fluorescence signal collected in the first implementation, which requires a collection device having a very high sensitivity.

Selon une caractéristique particulière, l’étape a-1 de collecte d’un signal optique émis par la coquille comprend une collecte par spectrométrie Raman.According to a particular characteristic, step a-1 of collecting an optical signal emitted by the shell comprises a collection by Raman spectrometry.

De cette façon, on peut utiliser des appareils existants de spectrométrie Raman.In this way, existing Raman spectrometry devices can be used.

Selon une caractéristique particulière, ladite étape b) comprend en outre : b-3) une extraction de pics Raman à partir dudit spectre, consécutivement ou simultanément au calcul de ladite au moins une caractéristique de fluorescence, et la prédiction de la fertilité et/ou du sexe de l’œuf est fonction de ladite au moins une caractéristique de fluorescence et d’au moins une caractéristique desdits pics Raman.According to a particular characteristic, said step b) further comprises: b-3) an extraction of Raman peaks from said spectrum, consecutive or simultaneously to the calculation of said at least one fluorescence characteristic, and the prediction of fertility and / or the sex of the egg is a function of said at least one characteristic of fluorescence and of at least one characteristic of said Raman peaks.

Ainsi, en couplant une ou plusieurs caractéristiques Raman avec une ou plusieurs caractéristiques de fluorescence, on améliore les performances de la solution proposée.Thus, by coupling one or more Raman characteristics with one or more fluorescence characteristics, the performance of the proposed solution is improved.

Selon une caractéristique particulière, l’étape a-1) de collecte d’un signal optique émis par la coquille comprend une collecte directe avec un appareil dédié à la mesure de la fluorescence.According to a particular characteristic, step a-1) of collecting an optical signal emitted by the shell comprises direct collection with a device dedicated to measuring fluorescence.

De cette façon, on peut utiliser des appareils existants de mesure de fluorescence, notamment des appareils capables de fournir des cartographies spectrales et/ou 3 dimensions de la fluorescence, apportant plus d’informations qu’un simple spectre, et permettant donc d’améliorer la qualité de la prédiction finale (fertilité et/ou sexe de l’œuf).In this way, it is possible to use existing fluorescence measurement devices, in particular devices capable of providing spectral and / or 3-dimensional maps of fluorescence, providing more information than a simple spectrum, and therefore making it possible to improve the quality of the final prediction (fertility and / or sex of the egg).

Dans un autre mode de réalisation de l’invention, il est proposé un système non invasif de détermination de la fertilité et/ou du sexe d’un œuf comprenant une coquille.In another embodiment of the invention, there is provided a non-invasive system for determining the fertility and / or sex of an egg comprising a shell.

Ce système comprend des moyens d’obtention d’au moins une caractéristique de fluorescence de la coquille, et des moyens de prédiction de la fertilité et/ou du sexe de l’œuf en fonction de ladite au moins une caractéristique de fluorescence.This system comprises means for obtaining at least one fluorescence characteristic of the shell, and means for predicting the fertility and / or sex of the egg as a function of said at least one fluorescence characteristic.

Avantageusement, le système comprend des moyens de mise en œuvre des différentes étapes du procédé tel que décrit précédemment (dans l’un quelconque de ses différents modes de réalisation).Advantageously, the system includes means for implementing the different stages of the method as described above (in any one of its different embodiments).

5. LISTE DES FIGURES D’autres caractéristiques et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, donnée à titre d’exemple indicatif et non limitatif, et des dessins annexés, dans lesquels : la figure 1 présente la structure simplifiée d’un œuf fécondé ; la figure 2 est une vue en coupe de la structure de la coquille d’un œuf ; la figure 3 présente un système de détermination de la fertilité et/ou du sexe d’un œuf, selon un mode de réalisation générique de l’invention ; la figure 4 présente un système de détermination de la fertilité et/ou du sexe d’un œuf, selon une première implémentation particulière du mode générique de la figure 3 ; la figure 5 présente deux spectres Raman moyens obtenus avec le système de la figure 4, l’un pour des « œufs mâles » et l’autre pour des « œufs femelles », ainsi que les lignes de base de fluorescence extraites de ces deux spectres Raman ; la figure 6 illustre un découpage en six zones des deux lignes de base de fluorescence de la figure 5, en vue d’un calcul de type « aire sous la courbe » différencié pour chaque zone ; la figure 7 illustre deux courbes d’évolution dans le temps de l’intensité de la fluorescence, Tune pour des « œufs mâles » et l’autre pour des « œufs femelles » ; la figure 8 illustre un exemple de cartographie de fluorescence ; la figure 9 présente un organigramme d’un mode de réalisation particulier du procédé selon l’invention ; la figure 10 présente un exemple plus détaillé de l’étape 92 de la figure 9 ; et la figure 11 présente un exemple plus détaillé de l’étape 93 de la figure 9 ; et la figure 12 présente la structure d’un dispositif d’analyse selon un mode de réalisation particulier de l’invention.5. LIST OF FIGURES Other characteristics and advantages of the invention will appear on reading the following description, given by way of indicative and nonlimiting example, and the appended drawings, in which: FIG. 1 presents the simplified structure a fertilized egg; Figure 2 is a sectional view of the structure of the shell of an egg; Figure 3 shows a system for determining the fertility and / or sex of an egg, according to a generic embodiment of the invention; FIG. 4 presents a system for determining the fertility and / or sex of an egg, according to a first particular implementation of the generic mode of FIG. 3; Figure 5 shows two average Raman spectra obtained with the system of Figure 4, one for "male eggs" and the other for "female eggs", as well as the fluorescence baselines extracted from these two spectra Raman; FIG. 6 illustrates a division into six zones of the two fluorescence baselines of FIG. 5, for a calculation of the "area under the curve" type differentiated for each zone; FIG. 7 illustrates two curves over time of the intensity of the fluorescence, one for "male eggs" and the other for "female eggs"; FIG. 8 illustrates an example of fluorescence mapping; FIG. 9 presents a flow diagram of a particular embodiment of the method according to the invention; Figure 10 shows a more detailed example of step 92 of Figure 9; and Figure 11 shows a more detailed example of step 93 of Figure 9; and Figure 12 shows the structure of an analysis device according to a particular embodiment of the invention.

6. DESCRIPTION DÉTAILLÉE6. DETAILED DESCRIPTION

Sur toutes les figures du présent document, les éléments et étapes identiques sont désignés par une même référence numérique.In all the figures in this document, identical elements and steps are designated by the same reference numeral.

La figure 1 illustre un œuf 1 comprenant une coquille 10 et un contenu intérieur, ce dernier comprenant lui-même l’albumine 2, le vitellus 3 et le disque germinal 4.FIG. 1 illustrates an egg 1 comprising a shell 10 and an interior content, the latter itself comprising albumin 2, yolk 3 and germinal disc 4.

La figure 2 détaille la structure de la coquille 10, qui comprend une superposition de six couches, à savoir (en partant de l’albumine 2) : une membrane coquillère interne 11, une membrane coquillère externe 12, une couche mamillaire 13, une couche palissadique 14 (traversée par les pores 17), une monocouche de cristaux verticaux (15) et enfin une cuticule 16 (enveloppant l'ensemble des couches minérales).Figure 2 details the structure of the shell 10, which comprises a superposition of six layers, namely (starting from albumin 2): an inner shell membrane 11, an outer shell membrane 12, a mammary layer 13, a layer palisade 14 (crossed by pores 17), a monolayer of vertical crystals (15) and finally a cuticle 16 (enveloping all the mineral layers).

Comme déjà mentionné plus haut, la coquille d’œuf 10 est constituée principalement de carbonate de calcium ainsi que de nombreuses autres molécules organiques ou inorganiques (ex : sucres, protéines, hormones, etc.) (dont certaines sont à titre illustratif référencées 5 sur la figure 1).As already mentioned above, the eggshell 10 consists mainly of calcium carbonate as well as many other organic or inorganic molecules (ex: sugars, proteins, hormones, etc.) (some of which are by way of illustration referenced 5 on Figure 1).

Les inventeurs ont découvert que les types de ces autres molécules 5, et surtout leurs quantités, sont différents d’un œuf à l’autre suivant de nombreux paramètres physico-chimiques propres à la conception de l’œuf (géniteurs, saisonnalité, etc.), et en particulier suivant le sexe du futur poussin pour les œufs fécondés. Ces autres molécules sont soit contenues initialement dans la coquille (avant incubation) ou apparaissent dans la coquille pendant le développement de l’embryon (pendant l’incubation) par échange/migration entre l’intérieur et l’extérieur de l’œuf.The inventors have discovered that the types of these other molecules 5, and especially their quantities, are different from one egg to another according to many physicochemical parameters specific to the conception of the egg (spawners, seasonality, etc. ), and in particular according to the sex of the future chick for fertilized eggs. These other molecules are either initially contained in the shell (before incubation) or appear in the shell during the development of the embryo (during incubation) by exchange / migration between the inside and outside of the egg.

En d’autres termes, les inventeurs ont découvert que la fluorescence de la coquille, qui est émise par ces autres molécules 5, avant ou pendant l’incubation de l’œuf, sont différentes d’un œuf à l’autre du point de vue de son intensité et de son évolution dans le temps, et que ces caractéristiques de fluorescence sont, in fine, reliées à la fécondation de l’œuf et en particulier au sexe du futur poussin.In other words, the inventors have discovered that the fluorescence of the shell, which is emitted by these other molecules 5, before or during the incubation of the egg, is different from one egg to another from the point of given its intensity and its evolution over time, and that these fluorescence characteristics are, ultimately, related to the fertilization of the egg and in particular to the sex of the future chick.

La solution proposée est basée sur cette découverte, avec l’utilisation du signal (optique) de fluorescence émis par la coquille d’œuf pour déterminer de manière in-ovo si l’œuf est fécondé et le cas échéant le sexe du futur poussin.The proposed solution is based on this discovery, with the use of the (optical) fluorescence signal emitted by the eggshell to determine in-ovo whether the egg is fertilized and if so the sex of the future chick.

On présente maintenant, en relation avec la figure 3. un système 30 de détermination de la fertilité et/ou du sexe d’un œuf 1, selon un mode de réalisation générique de l’invention.We now present, in relation to FIG. 3, a system 30 for determining the fertility and / or sex of an egg 1, according to a generic embodiment of the invention.

Le système 30 comprend : • des moyens (31) d’éclairement de la coquille de l’œuf, permettant de stimuler l’émission de la fluorescence de la coquille ; • des moyens (32) de collecte du signal optique réémis par la coquille (comptage des photons collectés en fonction de leur énergie, de façon à calculer un spectre d’intensité du signal optique collecté) ; • des moyens (33) d’analyse du signal optique collecté (spectre), permettant d’obtenir une ou plusieurs caractéristiques de fluorescence de la coquille (intensité, évolution dans le temps, etc.) ; et • des moyens (34) de prédiction de la fertilité et/ou du sexe de l’œuf en fonction de la ou les caractéristiques de fluorescence (par exemple par comparaison à des paramètres seuils préalablement définis).The system 30 includes: • means (31) for illuminating the shell of the egg, making it possible to stimulate the emission of fluorescence from the shell; • means (32) for collecting the optical signal re-emitted by the shell (counting the collected photons as a function of their energy, so as to calculate an intensity spectrum of the collected optical signal); • means (33) for analyzing the collected optical signal (spectrum), making it possible to obtain one or more fluorescence characteristics of the shell (intensity, evolution over time, etc.); and • means (34) for predicting the fertility and / or sex of the egg as a function of the fluorescence characteristic (s) (for example by comparison with previously defined threshold parameters).

La figure 9 illustre les étapes du procédé mis en œuvre par le système 30 précité, à savoir : éclairement de la coquille de l’œuf (étape 91), collecte du signal optique réémis par la coquille (étape 92), obtention d’une ou plusieurs caractéristiques de fluorescence de la coquille par analyse du signal optique collecté (étape 93), et prédiction de la fertilité et/ou du sexe de l’œuf en fonction de la ou les caractéristiques de fluorescence (étape 94).FIG. 9 illustrates the steps of the method implemented by the aforementioned system 30, namely: illumination of the egg shell (step 91), collection of the optical signal re-emitted by the shell (step 92), obtaining a or several fluorescence characteristics of the shell by analysis of the optical signal collected (step 93), and prediction of the fertility and / or sex of the egg as a function of the fluorescence characteristic (s) (step 94).

Par « fluorescence de la coquille » on entend dans ce cas la lumière réémise par la coquille (après une excitation optique) avec un décalage (par exemple vers le rouge) par rapport à la longueur d’onde du signal lumineux d’excitation.By "shell fluorescence" in this case is meant the light re-emitted by the shell (after an optical excitation) with an offset (for example towards red) relative to the wavelength of the excitation light signal.

Dans une variante, le système 30 ne comprend pas les moyens (31) d’éclairement de la coquille de l’œuf. Dans ce cas, les moyens de collecte et d’analyse comptent et analysent les photons émis naturellement par la coquille (thermoluminescence, chimiluminescence, etc.). Le signal collecté, qualifié de « luminescence », est de plus faible intensité que dans le cas où la coquille est éclairée, ce qui nécessite des appareils de mesure ayant une plus forte sensibilité.In a variant, the system 30 does not include the means (31) for lighting the eggshell. In this case, the means of collection and analysis count and analyze the photons emitted naturally by the shell (thermoluminescence, chemiluminescence, etc.). The signal collected, qualified as "luminescence", is of lower intensity than in the case where the shell is lit, which requires measuring devices having a higher sensitivity.

Dans la suite de la description, on présente en détail deux manières particulières d’obtenir la ou les caractéristiques de fluorescence de la coquille (c'est-à-dire d’implémentation des moyens de collecte 32 et d’analyse 33) : l’une basée sur l’utilisation d’un spectromètre Raman, l’autre sur l’utilisation d’un appareil de spectroscopie dédié à la mesure de la fluorescence (fluorimètre classique, microscope à fluorescence, etc.). A) Implémentation avec un spectromètre Raman A-a Description de la procédure de collecte et de l’appareillageIn the following description, we present in detail two particular ways of obtaining the fluorescence characteristic (s) of the shell (that is to say of implementing the collection means 32 and analysis means 33): 'one based on the use of a Raman spectrometer, the other on the use of a spectroscopy device dedicated to the measurement of fluorescence (conventional fluorimeter, fluorescence microscope, etc.). A) Implementation with a Raman spectrometer A-a Description of the collection procedure and the apparatus

On présente maintenant, en relation avec la figure 4, un système 40 de détermination de la fertilité et/ou du sexe d’un œuf 1, selon une implémentation particulière du mode générique de la figure 3.We now present, in relation to FIG. 4, a system 40 for determining the fertility and / or sex of an egg 1, according to a particular implementation of the generic mode of FIG. 3.

Dans cette première implémentation, la ou les caractéristiques de fluorescence de la coquille 1 sont extraites de mesures effectuées avec un équipement 41 (par exemple le modèle « i-Raman Plus » (marque déposée) de la société BWTek) intégrant un spectromètre Raman 41a et un dispositif d’éclairement 41b.In this first implementation, the fluorescence characteristic or characteristics of the shell 1 are extracted from measurements carried out with equipment 41 (for example the “i-Raman Plus” model (registered trademark) of the company BWTek) integrating a Raman spectrometer 41a and an illumination device 41b.

Dans cette première implémentation, on utilise la spectroscopie Raman afin de déterminer la fertilité et/ou le sexe d’un œuf. Il est clair cependant que des variantes de cette première implémentation peuvent être envisagées, avec tout type de spectroscopie permettant d’obtenir la réponse spectrale d’au moins une portion d’au moins une couche de la coquille, la seule condition étant que la fluorescence puisse être calculée (déduite, extraite) de cette réponse spectrale. L’œuf est éclairé par un dispositif d’éclairement 41b contenant par exemple une source de lumière monochromatique (exemple Laser) dans l’UV/Visible ou IR, par exemple à 532 nm, focalisé sur la coquille de l’œuf 1 par un système optique de type sonde en contact 44. Une fibre optique 42 relie le dispositif d’éclairement 41b et la sonde en contact 44.In this first implementation, Raman spectroscopy is used to determine the fertility and / or sex of an egg. It is clear however that variants of this first implementation can be envisaged, with any type of spectroscopy making it possible to obtain the spectral response of at least a portion of at least one layer of the shell, the only condition being that the fluorescence can be calculated (deducted, extracted) from this spectral response. The egg is illuminated by an illumination device 41b containing for example a monochromatic light source (example Laser) in the UV / Visible or IR, for example at 532 nm, focused on the shell of the egg 1 by a optical system of the contact probe type 44. An optical fiber 42 connects the lighting device 41b and the contact probe 44.

Dans des variantes, il est également possible d’utiliser une ou des sondes sans contact, ou encore un ou des systèmes de microscope optique (objectif) avec ou sans contact.In variants, it is also possible to use one or more contactless probes, or even one or more optical microscope systems (objective) with or without contact.

Le signal optique réémis par la coquille de l’œuf est collecté par le spectromètre Raman 41a, via la sonde en contact 44 et la fibre optique 42. Dans une variante, le signal optique réémis par la coquille de l’œuf est collecté via une autre sonde et une autre fibre optique (par exemple dans le cas où le spectromètre Raman 41a n’est pas intégré dans le même équipement que le dispositif d’éclairement 41b). A partir du signal collecté, le spectromètre Raman 41a génère un spectre qui est transmis, par un lien filaire (câble 45) ou sans fil, à un ordinateur (calculateur) 43. A partir du ou des spectres qu’il reçoit, l’ordinateur 43 calcule une ou plusieurs caractéristiques de fluorescence de la coquille et prédit à partir de celle(s)-ci la fertilité et/ou le sexe de l’œuf. En d’autres termes, l’ordinateur 43 réalise les fonctions des moyens d’analyse et de prédiction référencés 33 et 34 sur la figure 3.The optical signal re-emitted by the egg shell is collected by the Raman spectrometer 41a, via the contact probe 44 and the optical fiber 42. In a variant, the optical signal re-emitted by the egg shell is collected via a another probe and another optical fiber (for example in the case where the Raman spectrometer 41a is not integrated in the same equipment as the lighting device 41b). From the collected signal, the Raman spectrometer 41a generates a spectrum which is transmitted, by a wired link (cable 45) or wirelessly, to a computer (computer) 43. From the spectra or spectra it receives, the computer 43 calculates one or more characteristics of the fluorescence of the shell and predicts from this (these) the fertility and / or sex of the egg. In other words, the computer 43 performs the functions of the analysis and prediction means referenced 33 and 34 in FIG. 3.

En résumé, comme illustré sur la figure 10. l’étape 92 de collecte comprend, pour chaque mesure (associée à un point de mesure et une longueur d’onde d’excitation), la collecte d’un signal optique émis par la coquille (étape 921) et l’acquisition d’un spectre d’intensité du signal optique collecté (étape 922).In summary, as illustrated in FIG. 10. the collection step 92 comprises, for each measurement (associated with a measurement point and an excitation wavelength), the collection of an optical signal emitted by the shell (step 921) and the acquisition of an intensity spectrum of the collected optical signal (step 922).

Pour chaque mesure, associée à un point de mesure (sur ou dans la coquille) et une longueur d’onde d’excitation, l’excitation (i.e. l’éclairement) et la collecte des photons peuvent être effectuées simultanément ou l’une après l’autre. En outre, elles peuvent être réalisées au même endroit ou délocalisées l’une par rapport à l’autre.For each measurement, associated with a measurement point (on or in the shell) and an excitation wavelength, the excitation (ie the illumination) and the collection of photons can be carried out simultaneously or one after the other. In addition, they can be carried out in the same place or delocalized from one another.

Dans tous les cas, le spectromètre Raman 41a délivre un spectre pour chaque mesure.In all cases, the Raman spectrometer 41a delivers a spectrum for each measurement.

Par ailleurs, il est possible d’effectuer plusieurs mesures pour le même œuf (et donc d’obtenir plusieurs spectres correspond à un même instant), en jouant sur les deux paramètres suivants : le point de mesure (sur ou dans la coquille) et la longueur d’onde d’excitation. Ainsi, pour une même longueur d’onde d’excitation, il est possible d’effectuer des mesures en plusieurs points de mesure, situés dans une même zone de la coquille de l’œuf (équateur, pôle, etc.) ou dans différentes zones de la coquille de l’œuf.Furthermore, it is possible to carry out several measurements for the same egg (and therefore to obtain several spectra corresponds to the same instant), by playing on the following two parameters: the measurement point (on or in the shell) and the excitation wavelength. Thus, for the same excitation wavelength, it is possible to carry out measurements at several measurement points, located in the same area of the egg shell (equator, pole, etc.) or in different egg shell areas.

Il est également possible, pour au moins un couple comprenant un point de mesure donné et une longueur d’onde d’excitation donnée, d’effectuer plusieurs mesures consécutives dans le temps (et donc d’obtenir plusieurs spectres correspondant à des instants différents), pour le même œuf. Ceci permet d’avoir des informations sur l’évolution du signal de fluorescence au cours du temps. Pour cela, l’œuf est par exemple éclairé pendant un temps tinsol fixe (valeur : par exemple de zéro à plusieurs minutes) puis plusieurs mesures (par exemple de une à plusieurs dizaines) d’une durée t,^ (par exemple de 1 fs à plusieurs minutes) sont collectées avec un temps tpause (par exemple de quelques ms à plusieurs minutes) entre deux mesures successives.It is also possible, for at least one pair comprising a given measurement point and a given excitation wavelength, to carry out several consecutive measurements over time (and therefore to obtain several spectra corresponding to different instants) , for the same egg. This provides information on the evolution of the fluorescence signal over time. For this, the egg is for example lit for a fixed time tinsol (value: for example from zero to several minutes) then several measurements (for example from one to several tens) of duration t, ^ (for example from 1 fs to several minutes) are collected with a time tpause (for example from a few ms to several minutes) between two successive measurements.

Pour chaque mesure, le signal optique collecté et fourni au spectromètre Raman 41a comprend l’émission Rayleigh, l’émission Raman et l’émission de fluorescence. Dans le spectromètre Raman 41a, les photons collectés sont filtrés (par un filtre optique) pour éliminer le signal Rayleigh (étape optionnelle), puis dispersés par un dispositif optique (du type réseau de diffraction ou prisme par exemple) suivant leur longueur d’onde (énergie) sur un capteur comptant les photons pour chaque longueur d’onde (par exemple un CCD ou un photomultiplicateur). En sortie de ce capteur, on dispose donc, pour chaque mesure, d’un spectre d’intensité du signal optique collecté. A-b Description de l’analyse des donnéesFor each measurement, the optical signal collected and supplied to the Raman spectrometer 41a includes the Rayleigh emission, the Raman emission and the fluorescence emission. In the Raman 41a spectrometer, the collected photons are filtered (by an optical filter) to eliminate the Rayleigh signal (optional step), then dispersed by an optical device (of the diffraction grating or prism type for example) according to their wavelength (energy) on a sensor counting the photons for each wavelength (for example a CCD or a photomultiplier). At the output of this sensor, there is therefore, for each measurement, an intensity spectrum of the collected optical signal. A-b Description of data analysis

On présente maintenant en détail les fonctions d’analyse et de prédiction réalisées par l’ordinateur 43.We now present in detail the analysis and prediction functions performed by the computer 43.

Les données recueillies par l’ordinateur sont des spectres d’intensité du signal optique (axe des y ; proportionnel au nombre de photons/seconde) en fonction de la longueur d’onde des photons ou du décalage Raman en nombre d’onde « Rshift » (axe des x). Le décalage Raman est typiquement dans la gamme 100 à 4000 cm"1. Les données utiles sont par exemple plus spécifiquement comprises entre 400 et 1800 cm'1.The data collected by the computer are spectra of intensity of the optical signal (y-axis; proportional to the number of photons / second) as a function of the wavelength of the photons or of the Raman shift in number of waves "Rshift "(X-axis). The Raman offset is typically in the range 100 to 4000 cm −1. The useful data are for example more specifically between 400 and 1800 cm −1.

La figure 5 présente deux spectres Raman moyens obtenus avec le système de la figure 4, l’un (référencé 51) pour des « œufs femelles » et l’autre (référencé 52) pour des « œufs mâles ». La figure 5 présente également les lignes de base (« baseline ») de fluorescence extraites de ces deux spectres Raman 51, 52 ; elles sont référencées 53 et 54 respectivement.Figure 5 shows two average Raman spectra obtained with the system of Figure 4, one (referenced 51) for "female eggs" and the other (referenced 52) for "male eggs". FIG. 5 also presents the baseline (“baseline”) of fluorescence extracted from these two Raman spectra 51, 52; they are referenced 53 and 54 respectively.

Comme illustré sur la figure 11. pour un spectre donné (correspondant à une ou plusieurs mesures, comme détaillé ci-après), l’étape 93 d’obtention de caractéristique(s) de fluorescence de la coquille comprend : • étape 932 : calcul de la ligne de base de fluorescence du spectre ; et • étape 933 : calcul de type « aire sous la courbe » pour la ligne de base de fluorescence (ou, dans une variante, pour au moins une zone de la ligne de base de fluorescence), pour obtenir une valeur d’intensité de fluorescence (Imes). En d’autres termes, la valeur d’intensité de fluorescence correspond à l’aire sous la ligne de base de fluorescence (ou sous une portion de celle-ci) et ne tient donc pas compte des pics Raman.As illustrated in FIG. 11. for a given spectrum (corresponding to one or more measurements, as detailed below), step 93 of obtaining the fluorescence characteristic (s) of the shell comprises: • step 932: calculation the fluorescence baseline of the spectrum; and • step 933: calculation of the “area under the curve” type for the fluorescence baseline (or, in a variant, for at least one area of the fluorescence baseline), to obtain an intensity value of fluorescence (Imes). In other words, the fluorescence intensity value corresponds to the area under the fluorescence baseline (or under a portion of it) and therefore does not take Raman peaks into account.

La figure 6 illustre un découpage en six zones (référencées 61 à 66) des deux lignes de base de fluorescence (référencées 53 et 54) de la figure 5, en vue d’un tel calcul de type « aire sous la courbe » différencié pour chaque zone.FIG. 6 illustrates a division into six zones (referenced 61 to 66) of the two fluorescence baselines (referenced 53 and 54) of FIG. 5, with a view to such a calculation of the “area under the curve” type differentiated for each area.

La valeur d’intensité de fluorescence des œufs femelles est supérieure à celle des œufs mâles, permettant leur discrimination dans l’étape 94.The fluorescence intensity value of female eggs is higher than that of male eggs, allowing their discrimination in step 94.

Comme mentionnés plus haut, dans certaines mises en œuvre, plusieurs mesures sont effectuées pour un instant t, conduisant à l’obtention d’une pluralité de spectres. Dans ce cas, l’étape 93 comprend une première étape 931 d’obtention d’un spectre global par combinaison de cette pluralité de spectres (par exemple par soustraction, addition, combinaison linéaire, etc.).As mentioned above, in some implementations, several measurements are made for an instant t, leading to the obtaining of a plurality of spectra. In this case, step 93 comprises a first step 931 of obtaining a global spectrum by combining this plurality of spectra (for example by subtraction, addition, linear combination, etc.).

Comme mentionnés également plus haut, dans certaines mises en œuvre, plusieurs mesures sont effectuées à des instants consécutifs (tl, t2, etc.), avec obtention d’un spectre (simple ou global pour chaque instant). Dans ce cas, les étapes 931, 932 et 933 sont réalisées pour chaque instant, permettant d’obtenir une valeur d’intensité de fluorescence (Imes) pour chaque instant. Puis, dans une étape 934, l’ordinateur calcule une ou plusieurs caractéristiques additionnelles de fluorescence, en fonction des valeurs d’intensité de fluorescence successives dans le temps.As also mentioned above, in some implementations, several measurements are made at consecutive times (tl, t2, etc.), with the obtaining of a spectrum (simple or global for each instant). In this case, steps 931, 932 and 933 are carried out for each instant, making it possible to obtain a fluorescence intensity value (Imes) for each instant. Then, in a step 934, the computer calculates one or more additional fluorescence characteristics, as a function of the successive fluorescence intensity values over time.

En effet, le suivi de l’évolution dans le temps de l’intensité de fluorescence permet d’extraire de nombreuses caractéristiques comme par exemple : une intensité de fluorescence initiale (Iini), une intensité de fluorescence maximale (Imax), une intensité de fluorescence minimale (Imin), une intensité de fluorescence moyenne (Imoy), une vitesse de décroissance de fluorescence (τ), etc.Indeed, monitoring the evolution over time of the fluorescence intensity makes it possible to extract many characteristics such as for example: an initial fluorescence intensity (Iini), a maximum fluorescence intensity (Imax), an intensity of minimal fluorescence (Imin), average fluorescence intensity (Imoy), fluorescence decay rate (τ), etc.

La figure 7 illustre deux courbes d’évolution dans le temps de l’intensité de la fluorescence, l’une (référencée 72) pour des « œufs mâles » et l’autre (référencée 71) pour des « œufs femelles ».FIG. 7 illustrates two curves over time of the intensity of the fluorescence, one (referenced 72) for "male eggs" and the other (referenced 71) for "female eggs".

La ou les caractéristiques de fluorescence (Imes, Iini, Imax, Imin, I τ, etc.) sont ensuite utilisées dans l’étape 94 de prédiction.The fluorescence characteristic (s) (Imes, Iini, Imax, Imin, I τ, etc.) are then used in step 94 of prediction.

Une étape optionnelle (non représentée) peut être effectuée préalablement à l’étape 94, qui consiste à simplifier la ou les données (réduction des données), par exemple avec une fonction de réduction dimensionnelle comme l’analyse en composante principale (ACP), afin d’extraire l’information d’intérêt pour une utilisation dans l’étape 94.An optional step (not shown) can be carried out before step 94, which consists in simplifying the data or data (reduction of the data), for example with a dimensional reduction function such as the analysis in principal component (PCA), in order to extract the information of interest for use in step 94.

Deux exemples de réalisation de l’étape 94 de prédiction sont détaillés ci-dessous (prédiction en utilisant seulement les caractéristiques de fluorescence dans le premier exemple, et prédiction en utilisant les caractéristiques de fluorescence et l’information Raman dans le second exemple). A-b-1 Méthode 1 : prédiction avec seulement les caractéristiques de fluorescenceTwo exemplary embodiments of the prediction step 94 are detailed below (prediction using only the fluorescence characteristics in the first example, and prediction using the fluorescence characteristics and Raman information in the second example). A-b-1 Method 1: prediction with only fluorescence characteristics

Comme déjà décrit plus haut, lors d’une série de mesures sur un œuf, le système calcule l’aire sous la ligne de base de fluorescence (donc sans prendre en compte l’information Raman contenu dans les pics de faible largeur spectrale) pour chaque mesure, par exemple à l’aide d’équations mathématiques d’ajustement, ce qui permet d’évaluer l’intensité de la fluorescence de cette mesure (Imes) et/ou en fonction du temps sur les valeurs d’intensité de fluorescence obtenues à différents instants. Par exemple, dix mesures consécutives permettent d’obtenir l’évolution dans le temps de la fluorescence, montrant les différences entre un œuf « femelle » et un œuf « mâle » (figure 7). L’aire sous la courbe peut être calculée sous toute la ligne de base de fluorescence (et donc pour tout le spectre) ou sous des zones particulières de la ligne de base (et donc pour une partie du spectre). L’utilisation d’une ou plusieurs caractéristiques de fluorescence (réduite ou non), comparées à des valeurs seuils, permet de classer les œufs dans la bonne catégorie (non-fécondé, mâle ou femelle). Ces valeurs seuils sont préalablement établies sur un échantillon d’apprentissage, par exemple avec une des méthodes suivantes : • méthodes de classification supervisée (SVM, LDA, RF, KNN, réseau de neurones, etc.) ; • méthodes de régression logistique (moindres carrés partiels (PLS, PLSDA) ou de régression pénalisée (LASSO, Ridge ou elastic net) ; • modèles probabilistes (modèles bayésiens, modèles MCMC (Markov ChainAs already described above, during a series of measurements on an egg, the system calculates the area under the baseline of fluorescence (therefore without taking into account the Raman information contained in the peaks of small spectral width) to each measurement, for example using mathematical adjustment equations, which makes it possible to evaluate the intensity of the fluorescence of this measurement (Imes) and / or as a function of time on the fluorescence intensity values obtained at different times. For example, ten consecutive measurements make it possible to obtain the evolution over time of the fluorescence, showing the differences between a "female" egg and a "male" egg (Figure 7). The area under the curve can be calculated under the entire fluorescence baseline (and therefore for the entire spectrum) or under particular areas of the baseline (and therefore for part of the spectrum). The use of one or more fluorescence characteristics (reduced or not), compared with threshold values, makes it possible to classify the eggs in the right category (unfertilized, male or female). These threshold values are previously established on a learning sample, for example with one of the following methods: • supervised classification methods (SVM, LDA, RF, KNN, neural network, etc.); • logistic regression methods (partial least squares (PLS, PLSDA) or penalized regression (LASSO, Ridge or elastic net) • probabilistic models (Bayesian models, MCMC models (Markov Chain

Monte-Carlo), modèles mixtes) ; • etc.Monte-Carlo), mixed models); • etc.

Dans le cas d’utilisation des valeurs d’intensité de fluorescence (Imes), celles obtenues sur l’ensemble de la courbe ou sur les zones situées sur la droite de la figure 6 (zones 65 et 66, figure 6) sont les plus informatives. A-b-2 Méthode 2 : prédiction avec les caractéristiques de fluorescence et l’information RamanWhen using fluorescence intensity values (Imes), those obtained on the whole of the curve or on the zones situated on the right of figure 6 (zones 65 and 66, figure 6) are the most informative. A-b-2 Method 2: prediction with fluorescence characteristics and Raman information

Dans la deuxième méthode de prédiction, on ajoute l’information Raman à celle de la fluorescence. Le signal Raman, comme le signal de fluorescence est caractéristique des molécules présentes sur et dans la coquille. Par conséquent, les pics Raman contiennent également des informations sur la fertilité de l’œuf et/ou le sexe du poussin même si ces pics Raman sont de faible intensité et de petites largeurs spectrales comparées à la fluorescence. Le signal Raman peut donc être un complément optionnel à la fluorescence pour la prédiction de la fertilité et/ou du sexe de l’œuf.In the second prediction method, we add Raman information to that of fluorescence. The Raman signal, like the fluorescence signal, is characteristic of the molecules present on and in the shell. Therefore, the Raman peaks also contain information on the fertility of the egg and / or the sex of the chick even if these Raman peaks are of low intensity and small spectral widths compared to fluorescence. The Raman signal can therefore be an optional complement to fluorescence for predicting the fertility and / or sex of the egg.

Dans le cadre de cette deuxième méthode, deux types de procédures peuvent être employées ayant chacune leur pertinence en fonction d’un contexte particulier (nombre d’œufs à traiter/heure, précision souhaitée, etc.). A-b-2-i Première procédureWithin the framework of this second method, two types of procedures can be used, each having their relevance according to a particular context (number of eggs to be processed / hour, desired precision, etc.). A-b-2-i First procedure

La première procédure réside, dans un premier temps, en l’extraction de l’information de fluorescence comme dans la méthode 1 (étapes 931 à 934, figure 11).The first procedure resides, firstly, in extracting the fluorescence information as in method 1 (steps 931 to 934, FIG. 11).

Ensuite (étape 935, figure 11), l’information Raman est extraite après soustraction de la ligne de base de fluorescence d’un spectre unique, ou d’un spectre brut global, ou de la moyenne ou de la médiane des spectres bruts ou globaux consécutifs (suppression de l’information de fluorescence). Les pics Raman seuls, contenus dans le signal optique et qui sont caractéristiques de la fertilité et/ou du sexe de l’œuf, sont ensuite obtenus par des méthodes mathématiques de sélection de variables qui peuvent être basées par exemple sur : • les moindres carrés partiels (exemple la fonction « splsda ») ; • la régression pénalisée (exemple « Lasso ») ; • la sélection pas à pas (exemple « stepwise » avec « package caret ») ; • les forêts aléatoires (« Random forest ») ; • etc.Then (step 935, FIG. 11), the Raman information is extracted after subtracting the fluorescence baseline from a single spectrum, or from a global gross spectrum, or from the mean or from the median of the gross spectra or consecutive global (suppression of fluorescence information). The Raman peaks alone, contained in the optical signal and which are characteristic of the fertility and / or sex of the egg, are then obtained by mathematical methods of selection of variables which can be based for example on: • least squares partial (example the "splsda" function); • penalized regression (example "Lasso"); • step by step selection (example “stepwise” with “package caret”); • Random forests; • etc.

Les variables d’intérêt Raman ainsi obtenues, et les paramètres de fluorescence (obtenus par la méthode 1) sont ensuite comparés à des valeurs seuils permettant l’affectation de l’œuf dans la catégorie non-fécondé, mâle ou femelle. Ces valeurs seuils sont préalablement établies sur un échantillon d’apprentissage, par exemple avec une des méthodes suivantes : • méthodes de classification supervisée (SVM, LDA, RF, KNN, réseau de neurones, etc.) ; • méthodes de régression logistique (moindres carrés partiels (PLS, PLSDA) ou de régression pénalisée (LASSO, Ridge ou elastic net) ; • modèles probabilistes (modèles bayésiens, modèles MCMC (Markov ChainThe Raman variables of interest thus obtained, and the fluorescence parameters (obtained by method 1) are then compared with threshold values allowing the assignment of the egg to the unfertilized category, male or female. These threshold values are previously established on a learning sample, for example with one of the following methods: • supervised classification methods (SVM, LDA, RF, KNN, neural network, etc.); • logistic regression methods (partial least squares (PLS, PLSDA) or penalized regression (LASSO, Ridge or elastic net) • probabilistic models (Bayesian models, MCMC models (Markov Chain

Monte-Carlo), modèles mixtes) ; • etc. A-b-2-ii Deuxième procédureMonte-Carlo), mixed models); • etc. A-b-2-ii Second procedure

La deuxième procédure consiste à extraire les informations de fluorescence (aussi appelées caractéristiques de fluorescence ou encore variables d’intérêt de fluorescence) et les informations Raman en même temps à partir d’un spectre brut unique, ou d’un spectre brut global, ou de la moyenne ou de la médiane des spectres bruts ou globaux consécutifs, mesuré(s) sur un œuf, avec par exemple une méthode de réduction de dimension comme l’ACP.The second procedure consists in extracting the fluorescence information (also called fluorescence characteristics or fluorescence variables of interest) and the Raman information at the same time from a single raw spectrum, or from a global raw spectrum, or the average or the median of the gross or consecutive global spectra, measured on an egg, with for example a size reduction method like the ACP.

Les informations de fluorescence et Raman sont ensuite comparées à des valeurs seuils permettant l’affectation de l’œuf dans la catégorie non-fécondé, mâle ou femelle. Ces valeurs seuils sont préalablement établies sur un échantillon d’apprentissage avec soit : • des méthodes de classification supervisée (SVM, LDA, RF, KNN, réseau de neurones, etc.) ; • des méthodes de régression logistique (moindres carrés partiels (PFS, PFSDA) ou de régression pénalisée (FASSO, Ridge ou elastic net) ; • des modèles probabilistes (modèles bayésiens, modèles MCMC (Markov ChainThe fluorescence and Raman information is then compared to threshold values allowing the assignment of the egg to the unfertilized category, male or female. These threshold values are previously established on a learning sample with either: • supervised classification methods (SVM, LDA, RF, KNN, neural network, etc.); • logistic regression methods (partial least squares (PFS, PFSDA) or penalized regression (FASSO, Ridge or elastic net); • probabilistic models (Bayesian models, MCMC models (Markov Chain

Monte-Carlo), modèles mixtes) ; • etc. B) Mesure avec un fluorimètre B-a Description de la procédure de collecte et de l’appareillageMonte-Carlo), mixed models); • etc. B) Measurement with a fluorimeter B-a Description of the collection procedure and the equipment

Une deuxième implémentation particulière du mode générique de la figure 3 consiste en la mesure de fluorescence réémise par la coquille d’œuf directement avec des appareils dédiés à l’acquisition de la fluorescence (simple ou multiphoton). Ces appareils contiennent un ou des dispositifs d’éclairement polychromatique (ex : lampe Xe), monochromatique constant (ex : Laser) ou monochromatique accordable (ex : Laser suivi d’un oscillateur paramétrique optique (OPO)). L’éclairement sur la coquille (ou son environnement proche) est focalisé (c.-à-d. spot lumineux ponctuel) (exemple : objectif ou microscope confocal) ou non (c.-à-d. spot lumineux avec une large surface), en mode continu ou en mode pulsé pendant la mesure.A second particular implementation of the generic mode of FIG. 3 consists in measuring the fluorescence re-emitted by the eggshell directly with devices dedicated to the acquisition of fluorescence (single or multiphoton). These devices contain one or more polychromatic lighting devices (e.g. Xe lamp), constant monochromatic (e.g. Laser) or tunable monochromatic (e.g. Laser followed by an optical parametric oscillator (OPO)). The illumination on the shell (or its close environment) is focused (i.e. point light spot) (example: objective or confocal microscope) or not (i.e. light spot with a large surface ), in continuous mode or in pulsed mode during the measurement.

La collecte du signal de fluorescence est effectuée par un dispositif optique avec : collecte du signal (fente, objectif), séparation des photons suivant leur énergie (sauf ci caméra CCD) (monochromateur, réseau, prisme), et comptage par un capteur des photons (barrette CCD, photomultiplicateur, caméra CCD). L’analyse peut donc être effectuée sur différents types de surface/volurne, unique ou multiple, tel que : • au moins une localisation sur une petite surface de la coquille (< 1 cm2) (exemple d’appareil : spectromètre Flurorolog3 (marque déposée) de Horiba) ; • au moins une surface large, voire sur l’intégralité de la surface de la coquille (exemple d’appareil : Imager IVIS (marque déposée) de SpectrumBL) ; • au moins un volume 3D (surface et profondeur, xyz) de la coquille (exemple d’appareil : TCS SP8 CARS (marque déposée) de Leica).The fluorescence signal is collected by an optical device with: signal collection (slit, objective), separation of photons according to their energy (except here CCD camera) (monochromator, grating, prism), and counting by a photon sensor (CCD strip, photomultiplier, CCD camera). The analysis can therefore be carried out on different types of surface / surface, single or multiple, such as: • at least one location on a small surface of the shell (<1 cm2) (example of device: Flurorolog3 spectrometer (registered trademark) ) from Horiba); • at least one large surface, or even the entire surface of the shell (example of a device: Imager IVIS (registered trademark) of SpectrumBL); • at least one 3D volume (surface and depth, xyz) of the shell (device example: TCS SP8 CARS (registered trademark) of Leica).

Comme dans la première implémentation, il est possible d’effectuer plusieurs mesures pour le même œuf, en jouant sur les deux paramètres suivants : le point de mesure et la longueur d’onde d’excitation. Il est également possible d’effectuer plusieurs mesures consécutives dans le temps.As in the first implementation, it is possible to carry out several measurements for the same egg, by playing on the following two parameters: the measurement point and the excitation wavelength. It is also possible to take several consecutive measurements over time.

Quel que soit le type de surface/volume analysé(e), les données récoltées sont un spectre d’émission ou une multitude de spectres d’émission en fonction de différentes longueurs d’onde d’excitation formant des cartographies de fluorescence 3D (xyz) pour une mesure (un exemple est illustré sur la figure 8t. C’est-à-dire que pour chaque longueur d’onde d’excitation, on obtient un spectre d’émission avec l’intensité des photons réémis par l’échantillon (en z) en fonction de leurs longueurs d’onde (en y). Le balayage en longueur d’onde de l’excitation permet d’avoir une multitude de spectres yz. Ces données peuvent alors être reportées dans un graphique 3D avec les longueurs d’onde d’excitation indexées sur l’axe x.Whatever the type of surface / volume analyzed, the data collected is an emission spectrum or a multitude of emission spectra as a function of different excitation wavelengths forming 3D fluorescence maps (xyz ) for a measurement (an example is illustrated in FIG. 8t. That is to say that for each excitation wavelength, an emission spectrum is obtained with the intensity of the photons re-emitted by the sample (in z) according to their wavelengths (in y). The wavelength scanning of the excitation allows to have a multitude of yz spectra. These data can then be plotted in a 3D graph with the excitation wavelengths indexed on the x axis.

Dans le cas où il n’y a qu’une seule longueur d’onde d’excitation, la mesure obtenue est similaire à celle obtenue avec un spectromètre Raman. L’avantage d’avoir une cartographie de fluorescence 3D est que cela apporte une information plus riche qu’un spectre unique, pouvant améliorer la discrimination des œufs non-fécondés, mâles ou femelles.In the case where there is only one excitation wavelength, the measurement obtained is similar to that obtained with a Raman spectrometer. The advantage of having a 3D fluorescence mapping is that it provides richer information than a single spectrum, which can improve the discrimination of unfertilized eggs, male or female.

De même, la mesure peut être statique dans le temps ou intégré dans le temps afin de suivre l’évolution des signaux en fonction du temps.Similarly, the measurement can be static over time or integrated over time in order to follow the evolution of signals as a function of time.

Les données de fluorescence peuvent être complétées par des analyses optiques complémentaires (optionnelles) comme par exemple une analyse spectroscopique Raman ou une analyse CARS (Cohérent anti-Stokes Raman Spectroscopy) ou des analyses non-optiques (optionnelles) comme l’EDX (Energie Dispersive de rayons X), la spectroscopie de masse, etc. B-b Description de l’analyse des données L’analyse des données obtenue par la technique B suit une méthode similaire à la méthode 1 des données dérivées de mesures Raman (cf. § A relatif à la première implémentation).The fluorescence data can be supplemented by additional optical analyzes (optional) such as for example a Raman spectroscopic analysis or a CARS analysis (Coherent anti-Stokes Raman Spectroscopy) or non-optical analyzes (optional) such as EDX (Energy Dispersive ), mass spectroscopy, etc. B-b Description of the data analysis The data analysis obtained by technique B follows a method similar to method 1 of the data derived from Raman measurements (cf. § A relating to the first implementation).

Elle consiste, lors d’une série de mesures sur un œuf, à calculer l’aire sous la courbe (de la ligne de base de fluorescence) de toutes les mesures, ce qui permet d’évaluer l’intensité de la fluorescence d’une mesure unique (Imes) et/ou en fonction du temps sur les mesures consécutives. Le calcul d’aire sous la courbe peut également se faire directement (sans équation d’ajustement pour évaluer la ligne de base car l’information Raman contenue dans le signal, du fait de sa très faible intensité par rapport à la fluorescence dans la gamme spectrale mesurée, peut être considérée comme négligeable). L’aire sous la courbe peut être calculée sous tout le spectre ou sous des zones particulières du spectre. Comme mentionné plus haut, l’évolution dans le temps permet d’extraire de nombreuses caractéristiques additionnelles de fluorescence (Iini, Imax, Imin, Imoy, F etc.) sur l’ensemble des spectres ou sur des zones du spectre donnant un jeu de paramètres. L’utilisation d’une ou de plusieurs caractéristiques de fluorescence comparée(s) à une ou plusieurs valeurs seuils permet de classer les œufs dans la bonne catégorie (non-fécondé, mâle ou femelle).It consists, during a series of measurements on an egg, in calculating the area under the curve (of the fluorescence baseline) of all the measurements, which makes it possible to evaluate the intensity of the fluorescence of a single measurement (Imes) and / or as a function of time on consecutive measurements. The area under the curve can also be calculated directly (without an adjustment equation to assess the baseline because the Raman information contained in the signal, due to its very low intensity compared to the fluorescence in the range measured spectral, can be considered negligible). The area under the curve can be calculated over the entire spectrum or under specific areas of the spectrum. As mentioned above, the evolution over time makes it possible to extract many additional fluorescence characteristics (Iini, Imax, Imin, Imoy, F etc.) over all of the spectra or over areas of the spectrum giving a set of settings. The use of one or more fluorescence characteristics compared to one or more threshold values makes it possible to classify the eggs in the right category (unfertilized, male or female).

Pour les deux implémentations (A et B) décrites plus haut, une étape de prétraitement des données (techniques standards, comme par exemple : « Quality Control » (QC), détection des mesures non utilisables, etc.) et de normalisation peut s’avérer nécessaire au préalable pour améliorer la qualité des mesures. Ceci est optionnel car dépendant de la qualité initiale des mesures.For the two implementations (A and B) described above, a step of preprocessing the data (standard techniques, such as for example: "Quality Control" (QC), detection of unusable measurements, etc.) and normalization can be done. prove necessary beforehand to improve the quality of the measurements. This is optional as it depends on the initial quality of the measurements.

La figure 12 présente la structure simplifiée de l’ordinateur 43 de la figure 4, mettant en œuvre au moins les étapes 93 et 94 de la figure 9. Cet ordinateur comprend une mémoire vive 122 (par exemple une mémoire RAM), une unité de traitement 121, équipée par exemple d’un processeur, et pilotée par un programme d’ordinateur 1230 stocké dans une mémoire morte 123 (par exemple une mémoire ROM ou un disque dur). A l’initialisation, les instructions de code du programme d’ordinateur sont par exemple chargées dans la mémoire vive 122 avant d’être exécutées par le processeur de l’unité de traitement 121.FIG. 12 presents the simplified structure of the computer 43 of FIG. 4, implementing at least steps 93 and 94 of FIG. 9. This computer comprises a random access memory 122 (for example a RAM memory), a unit of processing 121, equipped for example with a processor, and controlled by a computer program 1230 stored in a read only memory 123 (for example a ROM memory or a hard disk). At initialization, the code instructions of the computer program are for example loaded into the RAM 122 before being executed by the processor of the processing unit 121.

Cette figure 12 illustre seulement une manière particulière, parmi plusieurs possibles, de réaliser les différents algorithmes détaillés ci-dessus, en relation avec les figures 9 et 11 notamment. En effet, la technique de l’invention se réalise indifféremment sur une machine de calcul reprogrammable (un ordinateur PC, un processeur DSP ou un microcontrôleur) exécutant un programme comprenant une séquence d’instructions, ou sur une machine de calcul dédiée (par exemple un ensemble de portes logiques comme un FPGA ou un ASIC, ou tout autre module matériel).This FIG. 12 illustrates only one particular way, among several possibilities, of implementing the different algorithms detailed above, in relation to FIGS. 9 and 11 in particular. Indeed, the technique of the invention is carried out indifferently on a reprogrammable computing machine (a PC computer, a DSP processor or a microcontroller) executing a program comprising a sequence of instructions, or on a dedicated computing machine (for example a set of logic gates such as an FPGA or an ASIC, or any other hardware module).

Dans le cas où l’invention est implantée sur une machine de calcul reprogrammable, le programme correspondant (c’est-à-dire la séquence d’instructions) pourra être stocké dans un médium de stockage amovible (tel que par exemple une disquette, un CD-ROM, une clé USB ou un DVD-ROM) ou non, ce médium de stockage étant lisible partiellement ou totalement par un ordinateur ou un processeur.In the case where the invention is implemented on a reprogrammable calculation machine, the corresponding program (that is to say the sequence of instructions) may be stored in a removable storage medium (such as for example a floppy disk, CD-ROM, USB key or DVD-ROM) or not, this storage medium being partially or totally readable by a computer or a processor.

Claims

1. Non-invasive method for determining the fertility and / or sex of an egg comprising a shell, characterized in that it comprises the following steps: obtaining (92, 93) at least one fluorescence characteristic of the shell; and predicting (94) fertility and / or sex of the egg based on said at least one fluorescence characteristic.

2. Method according to claim 1, in which the obtaining step comprises: a) for at least one measurement associated with a measurement point, on or in the shell, and an excitation wavelength: a- 1) collection (921) of an optical signal emitted by the shell; a-2) acquisition (922) of an intensity spectrum of the collected optical signal; and b) calculating (93) said at least one fluorescence characteristic, as a function of said spectrum.

3. Method according to claim 2, in which, in step a): the sub-steps a-1) and a-2) are executed for a plurality of measurements each associated with a separate pair comprising a measurement point and an excitation wavelength; and sub-step a-2) is followed by a sub-step a-3) (931) of combining the spectra acquired during the different executions of sub-step a-2), to obtain an overall spectrum; and in which, in step b), the calculation of said at least one fluorescence characteristic is carried out as a function of said global spectrum.

4. Method according to claim 2 or 3, wherein step b) comprises: b-1) calculation (932) of a fluorescence baseline of said spectrum; and b-2) calculation (933) of “area under the curve” type for said fluorescence baseline or at least one area of said fluorescence baseline, to obtain a fluorescence intensity value (Imes).

5. Method according to any one of claims 2 to 4, in which step a) is carried out for each of a plurality of measurement instants, making it possible to acquire a said spectrum for each of the measurement instants, and in which step b) comprises: for each of the spectra, the sub-steps b-1) and b-2), to obtain a fluorescence intensity value (Imes); and calculating (934) at least one additional fluorescence characteristic, as a function of the fluorescence intensity values obtained for said spectra.

The method according to claim 5, wherein said at least one additional fluorescence characteristic belongs to the group comprising: an initial fluorescence intensity (Iini); maximum fluorescence intensity (Imax); minimum fluorescence intensity (Imin); an average fluorescence intensity (Imoy); and a fluorescence decay rate (τ).

7. Method according to any one of claims 2 to 6, wherein the collecting step is preceded by a step (91) of optical excitation of the shell.

8. Method according to any one of claims 2 to 6, in which the collecting step is not preceded by a step of optical excitation of the shell, and in which the collected optical signal is a luminescence signal .

9. Method according to any one of claims 2 to 8, in which step a-1 of collecting an optical signal emitted by the shell comprises a collection by Raman spectrometry.

10. The method according to claim 9, wherein said step b) further comprises: b-3) an extraction (935) of Raman peaks from said spectrum, consecutive or simultaneously to the calculation of said at least one fluorescence characteristic, and wherein the prediction of fertility and / or sex of the egg is a function of said at least one fluorescence characteristic and at least one characteristic of said Raman peaks.

11. Method according to any one of claims 2 to 8, in which step a-1) of collecting an optical signal emitted by the shell comprises direct collection with an apparatus dedicated to measuring fluorescence.

12. Non-invasive system for determining the fertility and / or sex of an egg comprising a shell, characterized in that it comprises: means (32, 33) for obtaining at least one fluorescence characteristic of the shell ; and means (34) for predicting the fertility and / or sex of the egg as a function of said at least one fluorescence characteristic.