FR2982278A1

FR2982278A1 - METHOD FOR CLASSIFYING FIXED TISSUE SAMPLES INCLUDED IN PARAFFIN

Info

Publication number: FR2982278A1
Application number: FR1159956A
Authority: FR
Inventors: Samia Mourah; Celeste Lebbe; Anne Janin; Fabien Calvo; Mickael Guedj
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Priority date: 2011-11-03
Filing date: 2011-11-03
Publication date: 2013-05-10
Also published as: WO2013064789A1

Abstract

L'invention concerne un procédé de classification d'un échantillon de tissu fixé et inclus en paraffine, dans lequel on détermine si ledit échantillon à tester, désigné échantillon « j », est d'une qualité suffisante pour une étude de l'expression génique par quantification de son ARN, ledit procédé comprenant la comparaison du niveau d'expression de n gènes de référence dans ledit échantillon « j » par rapport au niveau d'expression contrôle desdits n gènes de référence.A method of classifying a fixed and paraffin-embedded tissue sample, wherein it is determined whether said test sample, designated Sample "j", is of sufficient quality for a gene expression study. by quantifying its RNA, said method comprising comparing the level of expression of n reference genes in said sample "j" relative to the level of expression control of said n reference genes.

Description

L'invention concerne un procédé de classification d'un échantillon de tissu fixé et inclus en paraffine, avant une évaluation transcriptionnelle de biomarqueurs. The invention relates to a method of classifying a tissue sample fixed and embedded in paraffin, before a transcriptional evaluation of biomarkers.

Arrière-plan technologique de l'invention : La détermination des niveaux d'expression des gènes dans des tissus est primordiale pour diagnostiquer de manière exacte et personnalisée les pathologies, et est de plus en plus utilisée pour établir la stratégie de traitement. Des méthodes pharmacogénomiques permettent en outre d'identifier les patients susceptibles de répondre, ou non, à un traitement. La source de tissu standard pour une évaluation transcriptionnelle de biomarqueurs est traditionnellement du tissu frais congelé. Pourtant, les tissus fixés au formol et inclus en paraffine (ou tissus FFPE pour « formalin-fixed, paraffin-embedded ») représentent de loin la source la plus abondante de tumeurs, et sont même les seules matières disponibles en ce qui concerne les tumeurs primaires comme les mélanomes (Ravo et al, 2008, Lab Invest, 88 :430-440). L'utilisation de tissus archivés serait aussi précieuse pour mener des études rétrospectives. Des analyses transcriptionnelles sur ces tissus fixés et inclus en paraffine sont possibles et ont été menées pour valider des signatures de biomarqueurs associés à des caractéristiques cliniques, des taux de survie, ou des réponses thérapeutiques (Coudry et aI, 2007, J. Mol. Diag, 9 :70-79 ; Cronin et aI, 2004, Am. J. Pathol, 164 :35-42). Malheureusement, ces analyses ne sont pas menées en routine du fait de la détérioration de l'ARN dans ces tissus stockés. En effet, la faible qualité des ARN extraits réduit la fiabilité des quantifications de biomarqueurs (Mittempergher et aI, 2011, PLoS One 6 :e17163). BACKGROUND OF THE INVENTION: The determination of the levels of expression of genes in tissues is essential for the accurate and personalized diagnosis of pathologies, and is increasingly used to establish the treatment strategy. Pharmacogenomic methods can also identify patients who may or may not respond to treatment. The standard tissue source for transcriptional evaluation of biomarkers is traditionally fresh frozen tissue. However, formalin-fixed, paraffin embedded tissue (or FFPE for "formalin-fixed, paraffin-embedded" tissue) is by far the most abundant source of tumors, and is even the only material available for tumors. primary such as melanomas (Ravo et al, 2008, Lab Invest, 88: 430-440). The use of archived tissue would also be valuable for conducting retrospective studies. Transcriptional analyzes on these fixed and paraffin-embedded tissues are possible and have been conducted to validate biomarker signatures associated with clinical features, survival rates, or therapeutic responses (Coudry et al., 2007, J. Mol. Diag 9: 70-79, Cronin et al., 2004, Am J. Pathol, 164: 35-42). Unfortunately, these analyzes are not conducted routinely because of the deterioration of the RNA in these stored tissues. Indeed, the low quality of the extracted RNAs reduces the reliability of biomarker quantifications (Mittempergher et al., 2011, PLoS One 6: e17163).

II existe donc un besoin en une méthode permettant de sélectionner les échantillons de tissu fixé et inclus en paraffine, qui puissent être utilisés pour des analyses transcriptionnelles. Résumé de l'invention : L' invention répond à ce besoin en fournissant un procédé de classification d'un échantillon de tissu fixé et inclus en paraffine, dans lequel on détermine si ledit échantillon à tester, désigné échantillon «j », est d'une qualité suffisante pour une étude de l'expression génique par quantification de son ARN, ledit procédé comprenant la comparaison du niveau d'expression de n gènes de référence dans ledit échantillon « j » par rapport au niveau d'expression contrôle desdits n gènes de référence. There is therefore a need for a method for selecting fixed and paraffin-embedded tissue samples that can be used for transcriptional analyzes. SUMMARY OF THE INVENTION: The invention addresses this need by providing a method of classifying a fixed and paraffin-embedded tissue sample, wherein it is determined whether said test sample, designated "j" sample, is a quality sufficient for a study of the gene expression by quantification of its RNA, said method comprising comparing the level of expression of n reference genes in said sample "j" with respect to the level of expression control of said n genes of reference.

Les échantillons présentant un niveau d'expression des gènes de référence comparable au niveau d'expression contrôle, à savoir au niveau d'expression de ces mêmes gènes dans les échantillons contrôles, sont sélectionnés, et sont notamment utiles pour réaliser des études transcriptionnelles fiables. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé comprend : la détermination du niveau d'expression desdits n gènes de référence dans l'échantillon «j » à tester, et la détermination de la déviation n si 2 où n est le nombre de gènes de références, pi et oi sont respectivement la moyenne et la déviation standard pour l'expression d'un gène « i » de référence établie au préalable ou évaluée sur un jeu d'échantillons contrôles de bonne qualité ; xij est le niveau d'expression dudit gène i évaluée dans l'échantillon «j », la valeur de la déviation indiquant si l'échantillon « j » est de qualité suffisante pour une étude de l'expression génique ou une analyse transcriptomique. De préférence l'échantillon de tissu est un échantillon de tissu tumoral, de préférence un mélanome, avec de préférence encore n supérieur ou égal à 4, et lesdits n gènes de référence comprennent au moins les gènes de l'actine 13, HPRT, TBP et TRFC. Samples with a level of expression of the reference genes comparable to the level of expression control, namely the level of expression of these same genes in the control samples, are selected, and are particularly useful for performing reliable transcriptional studies. In a preferred embodiment, the method comprises: determining the level of expression of said n reference genes in the sample "j" to be tested, and determining the deviation n if 2 where n is the number of genes of references, pi and oi are respectively the mean and the standard deviation for the expression of a reference "i" gene previously established or evaluated on a set of good quality control samples; xij is the level of expression of said i gene evaluated in the sample "j", the value of the deviation indicating whether the sample "j" is of sufficient quality for a study of the gene expression or a transcriptomic analysis. Preferably, the tissue sample is a tumor tissue sample, preferably a melanoma, more preferably n greater than or equal to 4, and said n reference genes comprise at least the actin 13, HPRT, TBP genes. and TRFC.

Légende des figures : La Figure 1 représente un « Boxplot » de niveaux d'ARNm moyens de 19 gènes d'intérêt et 10 gènes «de ménage» (« housekeeping ») dans tous les échantillons congelés et FFPE (fixés au formol et inclus en paraffine). Figure legend represents a "Boxplot" of average mRNA levels of 19 genes of interest and 10 "housekeeping" genes in all frozen and FFPE samples (formalin-fixed and included in paraffin).

La Figure 2A montre une étude de la corrélation entre les échantillons congelés et les échantillons FFPE au niveau de la médiane de chaque gène, évaluée chez tous les patients. Le coefficient de corrélation de Pearson ajusté était de 0,88 (p<0,0001). La Figure 2B montre des exemples de patients avec des corrélations « bonnes », ou « mauvaises » entre les échantillons congelés et les échantillons FFPE. Figure 2A shows a study of the correlation between frozen samples and FFPE samples at the median level of each gene, evaluated in all patients. The adjusted Pearson correlation coefficient was 0.88 (p <0.0001). Figure 2B shows examples of patients with "good" or "bad" correlations between frozen samples and FFPE samples.

La Figure 3 montre des corrélations corrigées échantillons FFPE/échantillons congelés pour chaque individu. Le test de corrélation teste l'hypothèse « la corrélation n'est pas valable ». Le seuil représente le seuil de rejet (alpha=5%) selon le test multiple de Bonferroni. Les individus à répartir sont ceux qui se trouvent en dessous du seuil. Figure 3 shows correlations corrected FFPE samples / frozen samples for each individual. The correlation test tests the hypothesis "the correlation is not valid". The threshold represents the rejection threshold (alpha = 5%) according to the Bonferroni multiple test. The individuals to be distributed are those who are below the threshold.

Description détaillée de l'invention : Les inventeurs proposent maintenant une méthode simple et peu coûteuse pour identifier les échantillons fixés inclus en paraffine non exploitables, et sélectionner les échantillons de qualité suffisante pour permettre une quantification de leur ARN. Définitions Par « échantillon de tissu fixé et inclus en paraffine », on entend toute biopsie de tissu, de préférence humain ou animal, fixé par toute méthode connue de l'homme du métier, et inclus en paraffine. Une méthode classique de fixation inclut la fixation au formol ou à l'éthanol. Les échantillons comprennent généralement au moins 10, au moins 100, ou au moins 1000 molécules d'ARN différentes. Par échantillon de « qualité suffisante », ou de « bonne qualité », on entend que l'ARN de l'échantillon n'est pas substantiellement dégradé ou reste quantifiable, permettant une étude de l'expression génique ou du transcriptome, ou apte à servir dans une réaction d'amplification, notamment par RT-PCR quantitative. A l'inverse, un échantillon de « qualité insuffisante » ou de « mauvaise qualité » est un échantillon dont l'ARN est trop dégradé pour être apte à une étude de l'expression génique ou du transcriptome, ou est inapte à servir dans une réaction d'amplification, notamment par RT-PCR quantitative. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The inventors now propose a simple and inexpensive method for identifying the non-exploitable paraffin embedded fixed samples, and selecting the samples of sufficient quality to allow quantification of their RNA. Definitions By "fixed and paraffin embedded tissue sample" is meant any tissue biopsy, preferably human or animal, fixed by any method known to those skilled in the art, and included in paraffin. A conventional method of attachment includes formalin or ethanol fixation. The samples generally comprise at least 10, at least 100, or at least 1000 different RNA molecules. A sample of "sufficient quality" or "good quality" means that the RNA in the sample is not substantially degraded or remains quantifiable, allowing a study of gene expression or transcriptome, or suitable for serve in an amplification reaction, in particular by quantitative RT-PCR. Conversely, a sample of "poor quality" or "poor quality" is a sample whose RNA is too degraded to be suitable for gene expression or transcriptome study, or is unsuitable for use in a patient. amplification reaction, in particular by quantitative RT-PCR.

Par « niveau d'expression contrôle », on entend un niveau d'expression déterminé au préalable ou évaluée sur un jeu d'échantillons contrôles de bonne qualité. Par « jeu d'échantillons contrôles de bonne qualité », on entend des échantillons de tissu congelés ou fixés inclus en paraffine présentant des niveaux d'expression des ARNs des gènes de référence corrélés avec les niveaux d'expression des ARNs extraits des tissus congelés. Les échantillons contrôles sont du même type que les échantillons à tester (c'est- à-dire qu'ils proviennent par exemple du même type d'organe, présentant une même pathologie). Par « gènes de références », on entend des gènes ubiquitaires ou « de ménage » (« housekeeping »), dont l'expression ne varie substantiellement pas, notamment en fonction de l'âge, du sexe, ou de l'état du patient, ou du tissu (sain ou tumoral par exemple). Echantillons de tissu L'échantillon de tissu à tester peut être n'importe quel échantillon de tissu dont on souhaite déterminer le niveau d'expression génique ou réaliser une analyse transcriptomique. By "control expression level" is meant an expression level previously determined or evaluated on a set of good quality control samples. By "good quality control sample set" is meant paraffin-embedded frozen or fixed tissue samples having expression levels of the reference gene RNAs correlated with the expression levels of the RNAs extracted from the frozen tissues. The control samples are of the same type as the samples to be tested (that is to say that they come for example from the same type of organ, presenting the same pathology). "Reference genes" means ubiquitous or "housekeeping" genes, the expression of which does not substantially vary, in particular as a function of the age, gender, or condition of the patient , or tissue (healthy or tumoral for example). Tissue Samples The tissue sample to be tested may be any tissue sample whose gene expression level is desired or perform transcriptomic analysis.

II peut s'agir d'un tissu sain, ou d'un tissu d'un patient atteint d'une pathologie particulière, ou dans un état particulier. Dans un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un échantillon de tissu tumoral. It may be a healthy tissue, or a tissue of a patient with a particular pathology, or in a particular condition. In a preferred embodiment, it is a sample of tumor tissue.

En particulier, il peut s'agir d'un échantillon de mélanome. Il peut également s'agir d'un échantillon d'un tissu tumoral de sein, de poumon ou de rein, par exemple, ou encore un échantillon de tissu tumoral de cancer du colon, de la prostate, gastrique, du pancréas, de col de l'utérus, des ovaires, du foie, de la vessie, de la thyroïde, du cerveau, ou une hémopathie maligne (l'échantillon de tissu étant alors une biopsie de moêlle). Les gènes de référence : Les gènes de référence peuvent varier en fonction du type d'échantillons à tester. In particular, it may be a melanoma sample. It may also be a sample of a breast, lung or kidney tumor tissue, for example, or a tumor sample of cancer of the colon, prostate, gastric, pancreas, cervix uterine, ovarian, liver, bladder, thyroid, brain, or hematological malignancy (the tissue sample is then a biopsy of moel). Reference genes: The reference genes may vary depending on the type of samples to be tested.

Dans un mode de réalisation particulier, le nombre de gènes de références est supérieur ou égal à 4, et lesdits n gènes de référence comprennent au moins les gènes de l'actine, de préférence actine 13, HPRT (gène codant pour l'hypoxanthine phosphoribosyltransférase), TBP (gène codant pour la protéine de liaison à la TATA-BOX) et TFRC (gène codant pour le récepteur à la transferrine). Ceci est particulièrement adapté dans le cas où l'échantillon de tissu est un échantillon de mélanome. Il peut s'agir d'un mélanome primaire, ou avec métastases cutanées, ou encore avec des métastases au niveau des ganglions lymphatiques. De préférence, le procédé est mis en oeuvre en déterminant les niveaux d'expression de ces 4 gènes seulement. In a particular embodiment, the number of reference genes is greater than or equal to 4, and the said n reference genes comprise at least the actin genes, preferably actin 13, HPRT (gene coding for hypoxanthine phosphoribosyltransferase ), TBP (gene encoding the TATA-BOX binding protein) and TFRC (gene encoding the transferrin receptor). This is particularly suitable in the case where the tissue sample is a melanoma sample. It may be a primary melanoma, or with cutaneous metastases, or with metastases in the lymph nodes. Preferably, the method is implemented by determining the expression levels of these 4 genes only.

Quantification des transcrits des gènes de référence, et classification de l'échantillon : Le procédé de l'invention vise à classifier un échantillon de tissu sans même avoir à analyser l'expression d'autres gènes que les seuls gènes de référence. Au terme du procédé, l'échantillon est classé comme de « bonne qualité » ou de « mauvaise qualité ». Si l'échantillon est classé comme de « bonne qualité », alors il peut servir à une analyse de l'expression de tout autre gène d'intérêt, ou à une analyse du transcriptome. Le procédé de l'invention comprend la détermination du niveau d'expression génique, à savoir la quantification des ARNm, des gènes de référence. Cette quantification peut être menée par toute méthode connue de l'homme du métier, en particulier par RT-PCR quantitative (qRT-PCR). Quantification of reference gene transcripts, and classification of the sample: The method of the invention aims to classify a tissue sample without having to analyze the expression of genes other than the only reference genes. At the end of the process, the sample is classified as "good quality" or "poor quality". If the sample is classified as "good quality", then it can be used for analysis of the expression of any other gene of interest, or for transcriptome analysis. The method of the invention comprises determining the level of gene expression, namely the quantification of mRNAs, reference genes. This quantification can be carried out by any method known to those skilled in the art, in particular by quantitative RT-PCR (qRT-PCR).

L'étape préalable est l'extraction de l'ARN et sa purification, par toute méthode connue, par exemple par la méthode de Chomcynsky et Sacchi, 1987, Anal. Biochem 162 :156-159, ou par des méthodes améliorées (cf par exemple VV001/46402). L'extraction implique l'élimination de la paraffine, par exemple en utilisant des xylènes comme solvants ou par incubation à 65-75°C dans un tampon de lyse. L'extraction de l'ARN peut être ensuite réalisée par précipitation ou par chromatographie par exemple. Des étapes de contrôles, par exemple par électrophorèse sur gel, peuvent être incluses. The preliminary step is the extraction of the RNA and its purification, by any known method, for example by the method of Chomcynsky and Sacchi, 1987, Anal. Biochem 162: 156-159, or by improved methods (see for example VV001 / 46402). Extraction involves the removal of paraffin, for example using xylenes as solvents or by incubation at 65-75 ° C in lysis buffer. The extraction of the RNA can then be carried out by precipitation or by chromatography for example. Control steps, for example by gel electrophoresis, may be included.

La RT-PCR quantitative peut utiliser différentes techniques d'agents intercalants ou sondes fluorescentes. Une technique usuelle met en oeuvre un fluorophore spécifique de l'ADN, du type SyBr Green, et on mesure alors l'agumentation de fluorescence à la fin de chaque étape d'élongation. Selon une autre technique usuelle, on peut aussi utiliser une sonde interne fluorescente spécifique du produit amplifié. Plusieurs types de formats de sondes sont disponibles. Par exemple, on peut utiliser Le Light Cycler de Roche, avec deux sondes d'hybridation, qui hybrident « tête-bêche » sur leur séquence cible, l'une des deux sondes portant à son extrémité une fluorescéine. Dans un mode de réalisation préférée, on utilise des sondes d'hydrolyse ou TaqMan®, qui utilisent l'activté 5'exonucléasique de la Taq polymérase pour hydrolyser une sonde fluorescente fixée sur sa cible. On peut par ailleurs utiliser des « molecular beacons » (Stratagene) qui sont des sondes d'hybridation en épingle à cheveux, la boucle de la sonde étant complémentaire de la séquence ciblée. Le procédé de l'invention permet de sélectionner les échantillons dans lesquels l'intégrité des ARN permet une analyse transcriptionnelle. Les échantillons sont sélectionnés pour exprimer des gènes de référence à un niveau comparable comparable au niveau d'expression de ces mêmes gènes dans les échantillons contrôles. Les inventeurs ont ainsi mis au point une méthode statistique capable d'identifier les échantillons dont les niveaux d'expression sont corrélés avec ceux d'échantillons congelés, en quantifiant les transcrits de seulement quelques gènes de référence. Quantitative RT-PCR can use different techniques of intercalators or fluorescent probes. One usual technique uses a DNA-specific fluorophore of the SyBr Green type, and the fluorescence labeling is then measured at the end of each elongation step. According to another usual technique, it is also possible to use an internal fluorescent probe specific for the amplified product. Several types of probe formats are available. For example, the Roche Light Cycler can be used with two hybridization probes, which hybridize "head-to-tail" on their target sequence, one of the two probes carrying a fluorescein at its end. In a preferred embodiment, hydrolysis probes or TaqMan®, which utilize the exonuclease activity of Taq polymerase, are used to hydrolyze a fluorescent probe attached to its target. It is also possible to use "molecular beacons" (Stratagene) which are hairpin hybridization probes, the loop of the probe being complementary to the targeted sequence. The method of the invention makes it possible to select the samples in which the integrity of the RNAs allows a transcriptional analysis. The samples are selected to express reference genes at a comparable level comparable to the level of expression of these same genes in the control samples. The inventors have thus developed a statistical method capable of identifying the samples whose expression levels are correlated with those of frozen samples, by quantifying the transcripts of only a few reference genes.

Cette approche s'est basée sur le postulat que le niveau d'expression de ces gènes de référence devrait être globalement stable entre les échantillons de bonne qualité. Une déviation de l'expression par rapport aux échantillons contrôles de bonne qualité peut être calculée comme suit : n si (Xii - 2 0-i où n est le nombre de gènes de références, pi et ai sont respectivement la moyenne et la déviation standard pour l'expression d'un gène « i » de référence établies au préalable ou évaluées sur ledit jeu d'échantillons contrôles de bonne qualité ; xij est le niveau d'expression dudit gène i évaluée dans l'échantillon «j », la valeur de la déviation indiquant si l'échantillon « j » est de qualité suffisante pour une étude de l'expression génique. This approach was based on the assumption that the level of expression of these reference genes should be generally stable between good quality samples. A deviation of the expression from the good quality control samples can be calculated as follows: n if (Xii - 2 0-i where n is the number of reference genes, pi and ai are the mean and the standard deviation respectively for the expression of a reference "i" gene previously established or evaluated on said set of good quality control samples; xij is the level of expression of said i gene evaluated in the sample "j", the value of the deviation indicating whether the sample "j" is of sufficient quality for a study of gene expression.

Plus précisément, la significativité de la déviation peut être testée par un test classique de Chi au carré, avec n degrés de liberté : SiJ 2(7/) HO Si la valeur p est non-significative, on conclut qu'il n'y a pas de déviation, et l'échantillon est classé comme « de bonne qualité ». More precisely, the significance of the deviation can be tested by a classical Chi squared test, with n degrees of freedom: SiJ 2 (7 /) HO If the p value is nonsignificant, we conclude that there is no significant difference. There is no deviation, and the sample is classified as "good quality".

Si la valeur p est significative, on conclut qu'il y a une déviation substantielle, et l'échantillon est classé comme « de mauvaise qualité ». Dans un mode de réalisation particulier, le test peut être réalisé sans faire appel à de nouveaux échantillons contrôles de bonne qualité, les valeurs mu et sigma de référence ayant été au préalable établies. Ainsi, les valeurs valeurs p et a de référence, représentant les moyennes/écarts-types de chaque gène de référence sont p = 8.15 et a = 1.86 pour le gène de l'actine [3 ; p = -15.06 et a= 2.03 pour le gène de HPRT ; p = -2.55 et a= 1.41 pour le gène TBP p = -14.34 et a = 1.91 pour le gène TRFC. Les échantillons classés comme « de bonne qualité » peuvent servir à une analyse de l'expression de tout autre gène d'intérêt, ou à une analyse du transcriptome. Lors de ces analyses subséquentes, de préférence par RT-PCR, un contrôle interne peut être encore souhaitable, mais une normalisation avec d'autres gènes de référence n'est plus nécessaire. Les figures et exemples illustrent l'invention sans en limiter la portée. If the p value is significant, it is concluded that there is a substantial deviation, and the sample is classified as "poor quality". In a particular embodiment, the test can be performed without using new quality control samples, the mu and sigma reference values having been previously established. Thus, the reference values p and a, representing the means / standard deviations of each reference gene, are p = 8.15 and a = 1.86 for the actin gene [3; p = -15.06 and a = 2.03 for the HPRT gene; p = -2.55 and a = 1.41 for the TBP gene p = -14.34 and a = 1.91 for the TRFC gene. Samples classified as "good quality" can be used for analysis of the expression of any other gene of interest, or for transcriptome analysis. In these subsequent analyzes, preferably by RT-PCR, internal control may still be desirable, but normalization with other reference genes is no longer necessary. The figures and examples illustrate the invention without limiting its scope.

Exemples : Exemple 1 : Sélection de tissues FFPE de mélanome pour une analyse transcriptionnelle MATERI ELS ET METHODES Patients Les inventeurs ont étudié des échantillons de tissus recueillis de 2000 à 2005, congelés ou fixés par le formol et inclus dans la paraffine (FFPE), pour les mêmes sections de tumeur, issues de 25 patients avec des mélanomes primaires (7 patients), des mélanomes avec métastases cutanées (4 patients), et des mélanomes avec des métastases au niveau des noyaux lymphatiques (14 patients). Echantillon, extraction de l'ARN, et transcription inverse Tous les tissus de mélanomes frais congelés ont été divisés, la moitié est maintenue sous forme congelés, et l'autre sous forme fixés dans le formol et inclus en paraffine. Plus de 90% du tissu est composé de cellules tumorales. Cinq sections de 10gm d'échantillons congelés et dix sections de 10gm de blocs FFPE ont subi une extraction d'ARN. Examples: Example 1: Selection of Melanoma FFPE Tissues for Transcriptional Analysis MATERIALS AND METHODS Patients The inventors studied tissue samples collected from 2000 to 2005, frozen or formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE), to the same tumor sections, from 25 patients with primary melanomas (7 patients), melanomas with cutaneous metastases (4 patients), and melanomas with metastases at the level of the lymphatic nuclei (14 patients). Sample, RNA Extraction, and Reverse Transcription All frozen fresh melanoma tissues were divided, half were kept frozen, and the other half fixed in formalin and embedded in paraffin. More than 90% of the tissue is composed of tumor cells. Five sections of 10gm of frozen samples and ten 10gm sections of FFPE blocks were extracted with RNA.

L'ARN total des 25 paires de blocs FFPE archivés et des tumeurs congelées apparentées a été extrait avec la méthode de Chomcynsky et Sacchi et al, supra, pour les échantillons congelés et en utilisant le kit d'extraction d'ARN FFPE de Qiagen, après le traitement au xylène pour les échantillons FFPE, selon le protocole du fabricant. Chaque échantillon a été traité avec de la DNase I, pour éliminer toute trace d'ADN génomique. La transcription inverse a été menée avec un Super-Script II (Invitrogen). Le rendement total en ARN a été déterminé en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Tech, Wilmington, DE). L'intégrité de l'ARN a été évaluée par électrophorèse Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies) comparée à l'ARN de référence standard comme décrit précédemment (Cronin et al, supra). Les sondes et amorces pour RT-PCR ont été conçues, testées, et validées. Les sondes fluorogéniques ont été doublement marquées, avec 5-FAM comme rapporteur, et TAMRA comme quencheur. Les séquences des amorces utilisées sont indiquées ci-après : Pour le gène de l'actine 3 : Amorce sens CTGGCACCCAGCACAATG (SEQ ID NO :1) Amorce anti-sens GCCGATCCACACGGAGTACT (SEQ ID NO :2) Pour le gène de HPRT1: Amorce sens TTATGGACAGGACTGAACGTCTTG (SEQ ID NO :3) Amorce anti-sens GCACACAGAGGGCTACAATGTG (SEQ ID NO :4) Pour le gène de TBP: Amorce sens CACgAACCACggCACTgATT (SEQ ID NO :5) Amorce anti-sens TTTTCTTgCTgCCAgTCTggAC (SEQ ID NO :6) Pour le gène de TFRC: Amorce sens CTTTGCCAGTTGGAGTGCTG (SEQ ID NO :7) Amorce anti-sens ACGAAAGGTATCCCTCTAGCCAT (SEQ ID NO :8) Quantification muliparamétrique des transcrits Biomarqueurs d'invasion et d'angiogénèse/lymphangiogénèse : VEGF (formes solubles VEGF121 et VEGF165), VEGF récepteurs (VEGFR1 et VEGFR2à, PDGF-A, PDGF-B, récepteurs PDGF (PDGFR-alpha et beta), les serine protéases (uPA PAI-1) et métalloprotéinase de matrice (MMP1, 2, 9, et 14), inhibiteurs MMP (TIMP1, 2), inducteur de protéase EMM PRI N, facteurs de transcription régulateurs de l'angiogénèse/lymphangiogénèse HIFI a, PROX-1. Transcrits de référence étudiés : HPRT, TBP, microglobine B2, GAPDH, ACTBP, GUS, PPIA, TFRC, 18S, 5S, RPLP1, RPLPO, RPL5, RPL19, actine-alpha, et actine-beta. Normalisation Pour comparer les profils d'expression entre les échantillons, une normalisation basée sur les 15 gènes de référence a été menée pour corriger les différences venant de la variabilité de la qualité de l'ARN et de la quantité totale d'ARN dans chaque essai. La quantification relative de chaque transcrit s'est inspirée des travaux de Cronin et al, supra. The total RNA of archived FFPE block pairs and related frozen tumors were extracted with the method of Chomcynsky and Sacchi et al, supra, for frozen samples and using the Qiagen FFPE RNA extraction kit, after xylene treatment for FFPE samples, according to the manufacturer's protocol. Each sample was treated with DNase I to remove all traces of genomic DNA. Reverse transcription was conducted with Super-Script II (Invitrogen). Total RNA yield was determined using a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Tech, Wilmington, DE). RNA integrity was assessed by Agilent 2100 Bioanalyzer electrophoresis (Agilent Technologies) compared to standard reference RNA as previously described (Cronin et al, supra). Probes and primers for RT-PCR were designed, tested, and validated. Fluorogenic probes were doubly labeled, with 5-FAM as reporter, and TAMRA as quencher. The sequences of the primers used are indicated below: For the actin 3 gene: sense primer CTGGCACCCAGCACAATG (SEQ ID NO: 1) GCCGATCCACACGGAGTACT antisense primer (SEQ ID NO: 2) For the HPRT1 gene: sense primer TTATGGACAGGACTGAACGTCTTG (SEQ ID NO: 3) Anti-sense primer GCACACAGAGGGCTACAATGTG (SEQ ID NO: 4) For the TBP gene: sense primer CACgAACCACggCACTgATT (SEQ ID NO: 5) TTTTCTTgCTgCCAgTCTggAC (SEQ ID NO: 6) antisense primer TFRC gene: sense primer CTTTGCCAGTTGGAGTGCTG (SEQ ID NO: 7) ACGAAAGGTATCCCTATAGCCAT antisense primer (SEQ ID NO: 8) Multivarametric transcript quantization Invasion and angiogenesis / lymphangiogenesis biomarkers: VEGF (soluble forms VEGF121 and VEGF165), VEGF receptors (VEGFR1 and VEGFR2a, PDGF-A, PDGF-B, PDGF receptors (PDGFR-alpha and beta), serine proteases (uPA PAI-1) and matrix metalloproteinase (MMP1, 2, 9, and 14), inhibitors MMP (TIMP1, 2), EMM PRI N protease inducer, transcript factors Regulatory ion of angiogenesis / lymphangiogenesis HIFI a, PROX-1. Reference transcripts studied: HPRT, TBP, microglobin B2, GAPDH, ACTBP, GUS, PPIA, TFRC, 18S, 5S, RPLP1, RPLPO, RPL5, RPL19, actin-alpha, and actin-beta. Standardization To compare the expression profiles between the samples, standardization based on the reference genes was conducted to correct the differences arising from the variability in the quality of the RNA and the total amount of RNA in each assay. . The relative quantification of each transcript was inspired by the work of Cronin et al, supra.

Analyse Statistique Les analyses statistiques ont été menées avec le logiciel R1 (version 2.13.1). Les valeurs p sont considérées significatives sous la barre des 5% après ajustement de Bonferroni pour des tests multiples. Statistical analysis The statistical analyzes were carried out with the software R1 (version 2.13.1). P-values are considered significant below the 5% mark after Bonferroni adjustment for multiple tests.

RESULTATS Comparaison des profils d'expression des ARN de tissus de mélanomes FFPE et à l'état congelé : L'expression de 25 gènes impliqués dans l'angiogénèse, la lymphangiogénèse et l'invasion tumorale a été analysée dans des mélanomes malins. Pour cela, l'ARN total a été préparé pour 25 paires apparentées d'échantillons congelés et FFPE. Une inspection de l'ARN par électrophorèse par le Bioanalyzer d'Agilent a montré un profil d'ARN non dégradé typique dans les échantillons congelés, tandis que les extraits de FFPE présentaient un ARN dégradé d'environ 150 et 50 pb, selon les échantillons. RESULTS Comparison of RNA expression patterns of FFPE melanoma tissues and in the frozen state: The expression of 25 genes involved in angiogenesis, lymphangiogenesis and tumor invasion was analyzed in malignant melanomas. For this, total RNA was prepared for 25 related pairs of frozen samples and FFPE. An RNA inspection by Agilent's Bioanalyzer showed a typical undegraded RNA profile in the frozen samples, whereas the FFPE extracts had a degraded RNA of about 150 and 50 bp, depending on the samples. .

L'hétérogénéité dans la qualité et la quantité d'ARN extrait est connue pour être principalement causée par les variations dans la quantité de tissu, le type de fixation et le retard de la fixation après l'intervention chirurgicale. En outre, l'efficacité de la transcription inverse et de la PCR elle-même peut représenter un paramètre de variabilité supplémentaire. Aussi, les mesures de qRT-PCR des gènes d'intérêt ont été normalisées vis-à-vis d'un jeu validé de gènes «de ménage» (housekeeping). Ce jeu validé a été déterminé en comparant 15 gènes «de ménage» (housekeeping) différents entre tissus congelés et tissus FFPE, 10 gènes ayant été retenus comme gènes de référence, pour leur expression stable (moyennes très proches entre échantillons congelés et FFPE). La Figure 1 représente un « Boxplot » de niveaux d'ARNm moyens de 19 gènes d'intérêt et 10 gènes «de ménage» (« housekeeping ») dans tous les échantillons congelés et FFPE, montrant des moyennes comparables pour la plupart des gènes, mais pas tous. Ainsi par exemple, VEGFR-2 et PDGFR-beta montrent des moyennes étroitement apparentées, alors que MMP1 et PDGFR-alpha étaient non-apparentés. La Figure 2A montre une étude de la corrélation entre les échantillons congelés et les échantillons FFPE au niveau de la médiane de chaque gène, évaluée chez tous les patients, atteignant un coefficient de corrélation de Pearson « très bon », de 0,88 (p<0,0001). Heterogeneity in the quality and amount of RNA extracted is known to be primarily caused by variations in the amount of tissue, the type of fixation and the delay in fixation after surgery. In addition, the efficiency of reverse transcription and PCR itself may represent an additional parameter of variability. Also, the qRT-PCR measurements of the genes of interest were normalized against a valid set of housekeeping genes. This validated game was determined by comparing 15 different "housekeeping" genes between frozen tissues and FFPE tissues, 10 genes having been selected as reference genes, for their stable expression (very close averages between frozen samples and FFPE). Figure 1 represents a "Boxplot" of mean mRNA levels of 19 genes of interest and 10 "housekeeping" genes in all frozen and FFPE samples, showing comparable averages for most genes, but not all. For example, VEGFR-2 and PDGFR-beta show closely related means, whereas MMP1 and PDGFR-alpha are unrelated. Figure 2A shows a study of the correlation between frozen samples and FFPE samples at the median level of each gene, evaluated in all patients, achieving a "very good" Pearson correlation coefficient of 0.88 (p. <0.0001).

La Figure 2B montre des exemples de patients avec des corrélations « bonnes », ou « mauvaises » entre les échantillons congelés et les échantillons FFPE (coefficients de corrélation de Pearson de 0,87 et 0,48 avec p<0,0001 et p=0,007 respectivement). Sur les 25 échantillons analysés, 21 ont été classés « bons », 1 « moyen », et 3 « mauvais » (cf Figure 3). Identification des échantillons avec une bonne corrélation de l'expression génique entre état congelé et FFPE : Les inventeurs ont ensuite mis au point une méthode statistique capable d'identifier les échantillons de mélanome avec une bonne corrélation congelé/FFPE, afin d'écarter les échantillons dont les niveaux d'expression ne sont pas corrélés, sur la base des données de paraffine pour des gènes de référence seulement. Cette approche s'est basée sur le postulat que le niveau d'expression de ces gènes de référence devrait être globalement stable entre les échantillons bons. Les inventeurs ont alors défini un profil moyen d'expression dit « Mean-Good-Expression-Profile » MGEP) comme la moyenne des profils d'expression des échantillons « bons » et les échantillons déviant significativement du MGEP comme des profils mauvais. La déviation par rapport au MGEP a été calculée comme suit : si (Xii - 2 0-i La déviation a été mesurée et testée par un test classique de Chi au carré, avec n degrés de liberté : SiJ 2(7/) HO Si la valeur p est non-significative, on conclut qu'il n'y a pas de déviation par rapport au MGEP, et l'échantillon est classé « bon ». Si la valeur p est significative, on conclut qu'il y a une déviation substantielle par rapport au MGEP, et l'échantillon est classé « mauvais». Figure 2B shows examples of patients with "good" or "bad" correlations between frozen samples and FFPE samples (Pearson correlation coefficients of 0.87 and 0.48 with p <0.0001 and p = 0.007 respectively). Of the 25 samples analyzed, 21 were rated "good", 1 "average", and 3 "bad" (see Figure 3). Identification of samples with a good correlation of gene expression between frozen state and FFPE: The inventors then developed a statistical method capable of identifying melanoma samples with good frozen correlation / FFPE, in order to rule out samples whose expression levels are not correlated, based on paraffin data for reference genes only. This approach was based on the assumption that the expression level of these reference genes should be globally stable between good samples. The inventors then defined a Mean Mean Good Expression Profile (MGEP) as the average of the expression profiles of the "good" samples and the samples deviating significantly from the MGEP as bad profiles. The deviation from the MGEP was calculated as follows: if (Xii -20-i The deviation was measured and tested by a standard Chi square test, with n degrees of freedom: SiJ 2 (7 /) HO Si the p-value is nonsignificant, it is concluded that there is no deviation from the MGEP, and the sample is rated "good." If the p-value is significant, it is concluded that there is a Substantial deviation from the MGEP, and the sample is rated "bad".

Parmi les 21 bons échantillons identifiés, 14 ont été utilisés comme échantillons « contrôles de bonne qualité », pour construire le MGEP (la sélection étant basée sur une valeur p de corrélation inférieure à 10-3). Les 7 bons échantillons restant et les 3 mauvais échantillons ont été utilisés pour validation. Le jeu de gènes de référence avec le coefficient moyen minimum de variation sur les échantillons contrôles de qualité a été choisi : il incluait les 4 gènes actine, HPRT, TBP, TRFC. Avec ce jeu de gènes de référence, l'approche basée sur le profil MGEP a parfaitement discriminé les 21 échantillons des 3 mauvais (100% de prédiction). Of the 21 good samples identified, 14 were used as "good quality control" samples, to construct the MGEP (the selection being based on a correlation p value of less than 10-3). The remaining 7 good samples and the 3 bad samples were used for validation. The set of reference genes with the minimum average coefficient of variation on the quality control samples was chosen: it included the 4 genes actin, HPRT, TBP, TRFC. With this set of reference genes, the MGEP profile-based approach discriminated perfectly against the 21 samples of the 3 bad ones (100% prediction).

Claims

REVENDICATIONS1. A method of classifying a fixed and paraffin-embedded tissue sample, wherein it is determined whether said test sample, designated sample "j", is of sufficient quality for a study of gene expression by quantification of its RNA said method comprising comparing the level of expression of n reference genes in said sample "j" relative to the level of expression control of said n reference genes.

The method of claim 1, said method comprising: - determining the level of expression of said n reference genes in the sample "j" to be tested, and - determining the deflection n if 2 253. 4 5. where n is the number of reference genes, pi and o are respectively the mean and the standard deviation for the expression of a reference "i" gene previously established or evaluated on a set of control samples. of good quality ; xd is the level of expression of said i gene evaluated in the sample "j", the value of the deviation indicating whether the sample "j" is of sufficient quality for a study of gene expression or transcriptomic analysis. The method of claim 1 or 2, wherein the tissue sample is a tumor tissue sample. The method of claim 3, wherein the tissue sample is a melanoma sample. The method of claim 4, wherein n is greater than or equal to 4, and said n reference genes comprise at least the actin, HPRT, TBP and TRFC.6 genes. The method of claim 5 wherein n = 4 and said reference genes are Actin 13, HPRT, TBP and TRFC genes. The method of claim 6, wherein the p and a values for each of said reference genes are p = 8.15 and a = 1.86 for the actin gene [3; p = -15.06 and a = 2.03 for the HPRT gene; p = -2.55 and a = 1.41 for the TBP gene p = -14.34 and a = 1.91 for the TRFC gene. The method of claim 3, wherein the tissue sample is a sample of breast, kidney or lung tumor tissue, or colon, prostate, gastric, pancreatic, cervical cancer. uterus, ovaries, liver, bladder, thyroid, brain, or hematological malignancy. 9. Method according to one of claims 1 to 8, wherein the expression of the reference genes is quantified by quantitative RT-PCR. The method according to one of claims 1 to 9, wherein the fixed and paraffin embedded tissue sample is a formalin fixed tissue sample.