FR2969617A1

FR2969617A1 - New recombinant protein comprising the extracellular domain derived from Robo1 protein or a part of this domain, is Slit2 signaling pathway inhibitor, useful e.g. in the treatment of cancer, which is hepatocarcinoma, and angiogenesis

Info

Publication number: FR2969617A1
Application number: FR1061163A
Authority: FR
Inventors: Gleizes Frederique Dol; Dorbes Genevieve Gueguen
Original assignee: Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2012-06-29

Abstract

Recombinant protein comprising the extracellular domain derived from Robo1 protein or a part of this domain, is new. ACTIVITY : Cytostatic; Angiogenesis Inhibitor. MECHANISM OF ACTION : Slit2 signaling pathway inhibitor.

Description

Protéine de fusion Robot-Fc et son utilisation dans le traitement des tumeurs. La présente invention concerne une protéine recombinante Robot-Fc et son utilisation pour traiter les maladies dans lesquelles une protéine Slit est surexprimée. En particulier, la présente invention concerne l'utilisation d'une protéine Robo-Fc pour traiter le cancer, notamment les hépatocarcinomes. Elle concerne également une composition comprenant une telle protéine recombinante. Un autre aspect de l'invention consiste en l'utilisation d'une molécule Robot-Fc en tant qu'outil de diagnostic pour détecter la surexpression d'une molécule de la famille Slit chez un patient. Les ligands Slits ont tout d'abord été décrits pour leur rôle dans la répulsion de la pousse des axones dans le développement neuronal. Depuis, la voie de régulation Robo/Slit a également été décrite dans l'angiogenèse tumorale. En effet, la voie Robo4/SIit2 a été décrite pour inhiber la réponse des cellules endothéliales au VEGF (Jones C.A. et al. Nat. Med 14, 448-453 (2008). La régulation par la voie Robo/Slit permet de canaliser la prolifération excessive de néo vaisseaux non matures ou bourgeons endothéliaux (angiogenèse non productive) et de maturer ces vaisseaux. L'expression de SIit2 au niveau transcriptionnel a été démontré dans plusieurs lignées cancéreuses humaines notamment HCT116 issue de carcinome de colon, Skov-3 issue de carcinome ovarien, HeLa issue de cancer du col de l'utérus, MDA-MB-435 issue de mélanome, Hec-1A issue de cancer de l'utérus et enfin 769-P issue de carcinome rénal (Stella MC et al., Mol Biol Cell. 2009 Vol. 20, Issue 2, 642-657). Une surexpression de la protéine SIit2 a également été démontrée sur des tissus humains issus de carcinomes : carcinome buccal (Wang et al. 2008, Cancer Sci. 2008 Mar;99(3):510-7), carcinome de la prostate (Latil et al. 2003 Int J Cancer. 2003 Jan 20;103(3):306-15), du colon (Wang et al. 2003, Cancer Cell, Volume 4, Issue 1, July 2003, Pages 19-29), du foie (Avci et al, 2008, BMC cancer, 8:392). Plus récemment, la surexpression de la protéine SIit2 a été montrée sur des échantillons d'endométriose (Shen et al, 2009, AJP 175 (2): 479). La protéine Robot se présente sous deux isoformes a et b. Le domaine extracellulaire de la protéine Robot isoforme b (NP_598334) comprend 5 domaines immunoglobuline : Ig1, Ig2, Ig3, Ig4 et Ig5. La protéine Robo interagit avec les ligands Slit au niveau des domaines Ig1 et Ig2. Liu et al. (2004, Mol. Oeil Neurosci, 26 :232-240) ont démontré l'importance du domaine Ig2 dans l'interaction avec Slit et dans l'activité de Robo (chémorépulsion). Robot-Fc fusion protein and its use in the treatment of tumors. The present invention relates to a recombinant Robot-Fc protein and its use for treating diseases in which a Slit protein is overexpressed. In particular, the present invention relates to the use of a Robo-Fc protein for treating cancer, including hepatocarcinoma. It also relates to a composition comprising such a recombinant protein. Another aspect of the invention is the use of a Robot-Fc molecule as a diagnostic tool for detecting overexpression of a Slit family molecule in a patient. Slits ligands were first described for their role in the repulsion of axonal growth in neuronal development. Since then, the Robo / Slit regulatory pathway has also been described in tumor angiogenesis. Indeed, the Robo4 / SIit2 pathway has been described to inhibit the endothelial cell response to VEGF (Jones CA et al Nat Med 14, 448-453 (2008).) The regulation by the Robo / Slit pathway allows channeling the Excessive proliferation of non-mature neo-vessels or endothelial buds (nonproductive angiogenesis) and maturation of these vessels The expression of SIit2 at the transcriptional level has been demonstrated in several human cancer lines including HCT116 derived from colon carcinoma, Skov-3 from ovarian carcinoma, HeLa from cervical cancer, MDA-MB-435 from melanoma, Hec-1A from uterine cancer and finally 769-P from renal carcinoma (Stella MC et al., Mol Biol Cell 2009 Vol 20, Issue 2, 642-657) Overexpression of SIit2 protein has also been demonstrated in human carcinoma tissues: carcinoma of the mouth (Wang et al., 2008, Cancer Sci., 2008 Mar; (3): 510-7), carcinoma of the prostate (Latil et al., 2003 Int J Cancer, 2003 Jan 20, 103 (3): 306-15), colon (Wang et al. 2003, Cancer Cell, Volume 4, Issue 1, July 2003, Pages 19-29), liver (Avci et al., 2008, BMC Cancer, 8: 392). More recently, overexpression of the SIit2 protein has been shown on endometriosis samples (Shen et al., 2009, AJP 175 (2): 479). The Robot protein comes in two isoforms a and b. The extracellular domain of the Robot isoform b protein (NP_598334) comprises 5 immunoglobulin domains: Ig1, Ig2, Ig3, Ig4 and Ig5. Robo protein interacts with Slit ligands at the Ig1 and Ig2 domains. Liu et al. (2004, Mol Eye Neurosci, 26: 232-240) demonstrated the importance of the Ig2 domain in interaction with Slit and in Robo activity (chemorépulsion).

L'utilisation d'anticorps spécifiques des protéines Robot et SIit2 a été décrite dans la demande WO2003/075860. Ces anticorps permettent d'inhiber l'angiogenèse tumorale. Cependant, il serait intéressant de proposer une approche alternative pour traiter le cancer, notamment une molécule capable d'inhiber la voie de signalisation de Slit-2. Les inventeurs ont développé une stratégie de récepteurs Robot chimères solubles capables de lier les ligands Slits et par conséquent d'inhiber la signalisation intracellulaire de la voie Robo/Slit. De manière surprenante, les molécules Robo1-Fc selon l'invention ont un effet anti-angiogène en empêchant la formation de vaisseaux matures et non en inhibant la prolifération des cellules endothéliales. Elles ont également un effet antitumoral dans le cancer du poumon et du foie. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention a pour objet une protéine recombinante Robo-Fc comprenant le domaine extracellulaire de la protéine Robot isoforme b ou un partie de ce domaine, une région de jonction (linker) et un domaine Fc. Dans un mode particulier de réalisation, le domaine extracellulaire de la protéine Robot isoforme b est constitué des domaines Ig1 et Ig2. Ces domaines correspondent au peptide de SEQ ID NO.2 codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO.1. The use of antibodies specific for the Robot and SIit2 proteins has been described in application WO2003 / 075860. These antibodies make it possible to inhibit tumor angiogenesis. However, it would be interesting to propose an alternative approach to treat cancer, especially a molecule capable of inhibiting the Slit-2 signaling pathway. The inventors have developed a strategy of soluble chimeric Robot receptors capable of binding Slits ligands and consequently of inhibiting intracellular signaling of the Robo / Slit pathway. Surprisingly, the Robo1-Fc molecules according to the invention have an anti-angiogenic effect by preventing the formation of mature vessels and not by inhibiting the proliferation of endothelial cells. They also have an antitumor effect in lung and liver cancer. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The subject of the present invention is a recombinant Robo-Fc protein comprising the extracellular domain of the Robot isoform b protein or a part thereof, a linker region and an Fc domain. In a particular embodiment, the extracellular domain of the Robot isoform b protein consists of the Ig1 and Ig2 domains. These domains correspond to the peptide of SEQ ID NO.2 encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO.1.

La protéine de fusion comprend également une région de jonction, aussi appelée « linker ». Dans le cadre de la présente invention, le linker permet d'apporter de la stabilité à la protéine recombinante, notamment en limitant le clivage in vivo. Des linkers pouvant être utilisés dans une molécule Robot-Fc sont par exemple GluArgProSerPheVal et GIyGIyGlyGlySer. L'homme du métier a les connaissances suffisantes pour choisir un linker adapté à cette utilisation. The fusion protein also comprises a junction region, also called a "linker". In the context of the present invention, the linker makes it possible to bring stability to the recombinant protein, in particular by limiting the cleavage in vivo. Linkers that can be used in a Robot-Fc molecule are, for example, GluArgProSerPheVal and GIyGIyGlyGlySer. The skilled person has sufficient knowledge to choose a linker suitable for this use.

Le domaine Fc des molécules recombinantes Robot-Fc selon l'invention correspond à un fragment cristallisable d'une immunoglobuline. Ce fragment Fc peut provenir de différentes immunoglobulines IgG1, Ig2, IgG3 ou IgG4. Il est responsable de la fonction effectrice de la réponse immune (WO2008/065543). The Fc domain of the recombinant Robot-Fc molecules according to the invention corresponds to a crystallizable fragment of an immunoglobulin. This Fc fragment can come from different immunoglobulins IgG1, Ig2, IgG3 or IgG4. It is responsible for the effector function of the immune response (WO2008 / 065543).

Dans un mode de réalisation selon l'invention, le domaine Fc provient d'une immunoglobuline IgG4, dans lequel trois mutations ponctuelles ont été introduites de sorte à augmenter la stabilité pont disulfure entre les 2 domaines Fc (Angla et al., 1993, Mol. Immunol., 30: 105-108) et à éliminer l'activité effectrice résiduelle du IgG4-Fc (WO 97/09351). In one embodiment of the invention, the Fc domain is derived from an IgG4 immunoglobulin, in which three point mutations have been introduced so as to increase the disulfide bridge stability between the 2 Fc domains (Angla et al., 1993, Mol. Immunol., 30: 105-108) and removing the residual effector activity of IgG4-Fc (WO 97/09351).

Des molécules Robot-Fc selon l'invention comprenant les domaines Ig1 et Ig2 de Robot isoforme b, un linker et un domaine IgG4 muté comme décrit précédemment sont Robot-Fc L1, Robot-Fc L2 et Robot-Fc L3. Robot-Fc L1 correspond à la protéine de séquence SEQ ID NO.4, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO.3. Robot-Fc molecules according to the invention comprising the Ig1 and Ig2 domains of robot isoform b, a linker and a mutated IgG4 domain as previously described are Robot-Fc L1, Robot-Fc L2 and Robot-Fc L3. Robot-Fc L1 corresponds to the protein of sequence SEQ ID NO.4, encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO.3.

Robot-Fc L2 correspond à la protéine de séquence SEQ ID NO.6, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO.5. Robot-Fc L1 et Robot-Fc L2 diffèrent par la nature du linker. Robot-Fc L3 correspond à la protéine de séquence SEQ ID NO.24, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO.23. Robot-Fc L2 corresponds to the protein of sequence SEQ ID NO.6, encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO.5. Robot-Fc L1 and Robot-Fc L2 differ by the nature of the linker. Robot-Fc L3 corresponds to the protein of sequence SEQ ID NO.24, encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO.23.

Elle correspond à Robot-Fc L1 dans laquelle les deux acides aminés situés en position Nt ont été tronqués de sorte à augmenter l'homogénéité lors de la production. L'invention a également pour objet des protéines dont la séquence protéique correspond aux séquences SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.6 ou SEQ ID NO.24 ou présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% d'identité avec les séquences SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.6 ou SEQ ID NO.24. Ces variants protéiques présentent la même activité biologique que les protéines de ayant pour séquence SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.6 ou SEQ ID NO.24, en particulier leur capacité à interagir avec les protéines de la famille Slit. It corresponds to Robot-Fc L1 in which the two amino acids located in the Nt position have been truncated so as to increase the homogeneity during production. The subject of the invention is also proteins whose protein sequence corresponds to the sequences SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.6 or SEQ ID NO.24 or present at least 80%, 85%, 90 %, 95% or 99% identity with the sequences SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.6 or SEQ ID NO.24. These protein variants have the same biological activity as proteins having the sequence SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.6 or SEQ ID NO.24, in particular their ability to interact with the proteins of the Slit family.

Les protéines Robot-Fc selon l'invention peuvent être produite par transfection des plasmides d'expression codant pour ces protéines dans tout type cellulaire adapté à l'expression de protéines recombinantes eucaryotes : HEK293, CHO, ... puis récupérées dans le surnageant de culture et purifiées selon les méthodes classiques. La caractérisation des protéines Robot-Fc L1, Robot-Fc L2 et Robot-Fc L3 selon l'invention a permis de confirmer qu'elles présentent les qualités requises pour leur administration en tant qu'agent biothérapeutique. Une protéine Robot-Fc selon l'invention a la capacité d'interagir avec une protéine de la famille Slit. Les protéines Robot-Fc selon l'invention reconnaissent spécifiquement les protéines SIit1, SIit2 et SIit3 humaines et la protéine SIit2 murine, en particulier par interaction avec leur domaine D2. Leur affinité est similaire vis-à-vis des 3 membres de la famille Slit. The Robot-Fc proteins according to the invention may be produced by transfection of the expression plasmids encoding these proteins into any cell type suitable for the expression of eukaryotic recombinant proteins: HEK293, CHO, etc., then recovered in the supernatant of culture and purified according to conventional methods. The characterization of the Robot-Fc L1, Robot-Fc L2 and Robot-Fc L3 proteins according to the invention has confirmed that they have the qualities required for their administration as a biotherapeutic agent. A Robot-Fc protein according to the invention has the capacity to interact with a protein of the Slit family. The Robot-Fc proteins according to the invention specifically recognize the human SIit1, SIit2 and SIit3 proteins and the murine SIit2 protein, in particular by interaction with their D2 domain. Their affinity is similar vis-à-vis the 3 members of the Slit family.

Un autre objet selon l'invention correspond aux molécules d'acides nucléiques codant les protéines selon l'invention. Ainsi les molécules d'acides nucléiques correspondant aux séquences SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.5 ou SEQ ID NO.23 ou présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% d'identité avec les molécules ayant pour séquence SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.5 ou SEQ ID NO.23 font partie de l'invention. Un autre objet selon l'invention consiste en l'utilisation d'une protéine Robot-Fc selon l'invention pour traiter les maladies dans lesquelles une protéine de la famille Slit est surexprimée. Les protéines de la famille Slit qui peuvent être ciblées par les Robot-Fc selon l'invention sont SR-1, Slit-2 ou Slit-3. Il a été montré que Robot pouvaient interagir avec les différents membres de la famille Slit. De ce fait, il est avantageux de noter que les protéines Robot-Fc sont capables d'inhiber simultanément les voies de signalisation médiées par SIit1, SIit2 et SIit3, ce qui permet d'élargir le spectre thérapeutique en comparaison aux anticorps qui ne sont spécifiques que d'une de ces voies. Dans un autre mode de réalisation, une protéine Robot-Fc est utilisée pour traiter les maladies dans lesquelles une protéine de la famille Slit est surexprimée en inhibant l'angiogenèse sans inhiber la prolifération des cellules endothéliales. Cette activité antiangiogénique liée à un défaut de maturation des vaisseaux est appelée « angiogenèse non-productive ». En effet, les études expérimentales ont montré que les molécules Robot-Fc selon l'invention sont capables d'inhiber la formation de tubules, sans inhiber la prolifération des cellules endothéliales. Elles permettent de réduire de façon très significative le volume tumoral dans un modèle murin de cancer pulmonaire. Dans un mode préféré de réalisation, les protéines Robot-Fc pouvant être utilisées pour traiter les maladies dans lesquelles une protéine Slit est surexprimée sont Robot-Fc L1, Robot-Fc L2 et Robot-Fc L3. De manière générale, les maladies susceptibles d'être traitées par une protéine Robot-Fc selon l'invention sont toutes les maladies dans lesquelles une inhibition de la voie Slit peut avoir un effet thérapeutique, en particulier les maladies dans lesquelles une protéine de la famille Slit est surexprimée, et notamment celles dans lesquelles SIit2 est surexprimée. Les molécules Robot-Fc selon l'invention liant spécifiquement la molécule Slit-2, il est intéressant de noter que celles-ci sont capables d'inhiber simultanément les deux voies dans lesquelles Slit-2 est impliquée, à savoir les voies Robot/Slit-2 et Robo4/Slit-2. Les protéines Robot-Fc selon l'invention peuvent donc être utilisées pour traiter le cancer, notamment le cancer du pancréas, le cancer du colon, le cancer colorectal avec ou sans métastase lymphatique, le cancer du sein, le cancer du poumon et les métastases pulmonaires, le cancer ovarien, le cancer du col de l'utérus, les mélanomes, le cancer rénal, le cancer buccal, le cancer de la prostate, le cancer du foie... Dans un mode de réalisation particulier, les protéines Robo-Fc sont utilisées pour traiter le cancer du poumon. Another object according to the invention corresponds to the nucleic acid molecules encoding the proteins according to the invention. Thus, the nucleic acid molecules corresponding to the sequences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5 or SEQ ID NO. 23 or having at least 80%, 85%, 90%, 95% or 99%. % identity with the molecules having for sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ ID NO.23 are part of the invention. Another object according to the invention is the use of a Robot-Fc protein according to the invention for treating diseases in which a protein of the Slit family is overexpressed. The proteins of the Slit family that can be targeted by the Robot-Fc according to the invention are SR-1, Slit-2 or Slit-3. It has been shown that Robot could interact with different members of the Slit family. Therefore, it is advantageous to note that the Robot-Fc proteins are capable of simultaneously inhibiting the signaling pathways mediated by SIit1, SIit2 and SIit3, which makes it possible to broaden the therapeutic spectrum in comparison with antibodies that are not specific. than one of these ways. In another embodiment, a Robot-Fc protein is used to treat diseases in which a protein of the Slit family is overexpressed by inhibiting angiogenesis without inhibiting endothelial cell proliferation. This antiangiogenic activity related to a lack of maturation of the vessels is called "non-productive angiogenesis". Indeed, experimental studies have shown that the Robot-Fc molecules according to the invention are capable of inhibiting the formation of tubules, without inhibiting the proliferation of endothelial cells. They make it possible to very significantly reduce the tumor volume in a mouse model of lung cancer. In a preferred embodiment, the Robot-Fc proteins that can be used to treat diseases in which a Slit protein is overexpressed are Robot-Fc L1, Robot-Fc L2 and Robot-Fc L3. In general, the diseases that can be treated by a Robot-Fc protein according to the invention are all the diseases in which inhibition of the Slit pathway can have a therapeutic effect, in particular diseases in which a protein of the family Slit is overexpressed, especially those in which SIit2 is overexpressed. Since the Robot-Fc molecules according to the invention specifically bind the Slit-2 molecule, it is interesting to note that they are capable of simultaneously inhibiting the two pathways in which Slit-2 is involved, namely the Robot / Slit pathways. -2 and Robo4 / Slit-2. The Robot-Fc proteins according to the invention can therefore be used to treat cancer, especially pancreatic cancer, colon cancer, colorectal cancer with or without lymphatic metastasis, breast cancer, lung cancer and metastases. pulmonary cancer, ovarian cancer, cervical cancer, melanoma, renal cancer, oral cancer, prostate cancer, liver cancer ... In a particular embodiment, the Fc are used to treat lung cancer.

Dans un autre mode de réalisation particulier, les protéines Robo-Fc sont utilisées pour traiter le cancer du foie ou hépatocarcinome. Les molécules Robot-Fc selon l'invention peuvent également utilisées en tant que médicament anticancéreux en alternative ou en complément aux thérapeutiques actuelles. En particulier, ces molécules peuvent être administrées en association (simultanée ou non) avec des composés anti-cancéreux. Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant une protéine Robot-Fc telle que définie précédemment et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptable. Les protéines Robot-Fc selon l'invention peuvent être formulées dans des compositions pharmaceutiques en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, etc. Préférentiellement, les compositions pharmaceutiques contiennent des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc., ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Un autre aspect de l'invention consiste en l'utilisation d'une molécule Robot-Fc en tant qu'outil de diagnostic pour détecter la surexpression d'une molécule de la famille Slit chez un patient. En effet, il a été montré que la voie Slit est impliquée dans de nombreux cancers. La mise à disposition d'un test pour évaluer une dérégulation de la voie de signalisation des Slit est très utile dans le but de sélectionner les patients susceptibles de répondre à un traitement reposant sur l'administration d'une molécule Robot-Fc. Cet outil de diagnostic peut se présenter sous forme d'un kit prêt à l'emploi, comprenant une molécule Robot-Fc sous une forme adaptée à sa mise en contact avec un échantillon biologique de patient (sang, urine, biopsie de tumeurs) susceptible de présenter une surexpression d'une molécule Slit. La molécule Robo- Fc peut être préalablement marquée ou non, et l'association Robo-Fc et Slit est détecter de sorte à évaluer une augmentation de l'expression d'une protéine Slit dans l'échantillon biologique en comparaison avec un échantillon témoin. Ce kit peut par exemple se présenter sous forme d'un kit ELISA. In another particular embodiment, Robo-Fc proteins are used to treat liver cancer or hepatocarcinoma. The Robot-Fc molecules according to the invention can also be used as an anti-cancer drug as an alternative to or in addition to current therapies. In particular, these molecules can be administered in combination (simultaneous or not) with anti-cancer compounds. Another subject of the invention relates to a composition comprising a Robot-Fc protein as defined above and one or more pharmaceutically acceptable excipients. The Robot-Fc proteins according to the invention can be formulated in pharmaceutical compositions for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular administration, etc. Preferentially, the pharmaceutical compositions contain pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation. It may be in particular salt solutions (monosodium phosphate, disodium, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular freeze-dried, which by the addition of sterilized water or physiological saline as appropriate, allow the constitution of injectable solutions. Another aspect of the invention is the use of a Robot-Fc molecule as a diagnostic tool for detecting overexpression of a Slit family molecule in a patient. Indeed, it has been shown that the Slit pathway is involved in many cancers. The provision of a test to evaluate a deregulation of the Slit signaling pathway is very useful in order to select the patients likely to respond to a treatment based on the administration of a Robot-Fc molecule. This diagnostic tool may be in the form of a ready-to-use kit comprising a Robot-Fc molecule in a form adapted to its contact with a biological sample of a patient (blood, urine, tumor biopsy) susceptible to overexpress a Slit molecule. The Robo-Fc molecule may be labeled beforehand or not, and the Robo-Fc and Slit combination is detected so as to evaluate an increase in the expression of a Slit protein in the biological sample in comparison with a control sample. This kit may for example be in the form of an ELISA kit.

DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Plasmides d'expression des protéines Robot-Fc L1, Robot-Fc L2 et Robot-Fc L3. Figure 2 : Evaluation de l'interaction des variants de protéine de fusion Robot-Fc avec la protéine SIit2 par ELISA. DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1: Plasmids for Expression of Robot-Fc L1, Robot-Fc L2 and Robot-Fc L3 Proteins. Figure 2: Evaluation of the interaction of the variants of Robot-Fc fusion protein with the SIit2 protein by ELISA.

Figure 3 : Affinité de Robot-Fc pour les cellules HEK293 n'exprimant pas Slit-2 mesurée par FACS. Figure 4 : Affinité de Robot-Fc pour les cellules HEK293 exprimant SIit2 mesurée par FACS. Figure 5 : Profil pharmacocinétique des protéines Robot-Fc après une injection iv 15 chez la souris. A. Administration de Robot-Fc L1 B. Administration de Robot-Fc L2. Figure 6: Effet de la molécule Robot-Fc L1 dans un test co-culture avec des cellules endothéliales et des cellules mesenchymateuses A. Robot-Fc L1 inhibe la formation de tubule en culture. B. Robot-Fc L1 inhibe significativement la formation 20 de pseudo-tubule induite par le VEGF. Figure 7 : Evaluation de l'effet de la molécule Robot-Fc L1sur un modèle ex vivo d'anneau aortique chez la souris. A : Description du protocole de préparation d'un anneau aortique et de la mesure des tubules. B : a. Contrôle ; b. Robot-Fc Slit-2-moins 500 pg/mL + VEGF 10 ng/mL ; c. Robot-Fc L1 500 pg/mL + VEGF 10 25 ng/mL. Figure 8 : Poids tumoral moyen (cellules HepG2 dans le lobe gauche du foie de souris SCID) 28 jours après injection des cellules, dans le groupe contrôle et le groupe ayant reçu 4 injections de Robot-Fc à 25mg/kg. Figure 3: Robot-Fc affinity for HEK293 cells not expressing Slit-2 measured by FACS. Figure 4: Robot-Fc affinity for HEK293 cells expressing SIit2 measured by FACS. Figure 5: Pharmacokinetic profile of Robot-Fc proteins after iv injection in mice. A. Robot-Fc Administration L1 B. L2 Robot-Fc Administration. Figure 6: Effect of the Robot-Fc L1 molecule in a co-culture assay with endothelial cells and mesenchymal cells A. Robot-Fc L1 inhibits tubule formation in culture. B. Robot-Fc L1 significantly inhibits VEGF-induced pseudo-tubule formation. Figure 7: Evaluation of the effect of the Robot-Fc L1 molecule on an ex vivo model of aortic ring in mice. A: Description of the protocol for the preparation of an aortic ring and measurement of the tubules. B: a. Control; b. Robot-Fc Slit-2-minus 500 μg / mL + VEGF 10 ng / mL; vs. Robot-Fc L1 500 μg / mL + VEGF 10 25 μg / mL. Figure 8: Average tumor weight (HepG2 cells in the left lobe of SCID mouse liver) 28 days after injection of the cells, in the control group and the group that received 4 injections of Robot-Fc at 25 mg / kg.

EXEMPLES Exemple 1 : Préparation des protéines Robot-Fc a. Constructions permettant l'expression des protéines recombinantes Robo1-Fc utilisées comme agents biothérapeutiques. EXAMPLES Example 1: Preparation of Robot-Fc Proteins a. Constructs allowing the expression of recombinant Robo1-Fc proteins used as biotherapeutic agents.

Les protéines recombinantes Robot-Fc sont constituées d'une fusion entre les 2 premiers domaines immunoglobuline (Ig1-Ig2) de la protéine Robot humaine isoforme b (NP_598334) et le domaine Fc de l'immunoglobuline G4 humaine (hIgG4-Fc, SwissProt IGHG4_HUMAN). Pour obtenir la construction Robot-Fc L1, un fragment du cDNA (SEQ ID N0.1) correspondant aux domaines immunoglobuline (Ig) Ig1 et Ig2 de cette protéine (SEQ ID NO.2) suivi d'un linker GluArgProSerPheVal a été amplifié par PCR à partir de la banque de cDNA de coeur foetal humain (ref. HL5042T Clontech). Ce fragment amplifié a ensuite été cloné dans le vecteur d'expression eucaryote pXL4904 (décrit à la Figure 1) afin que les deux domaines Ig de Robot soient exprimés en fusion avec le domaine Fc de l'IgG4 humaine en position C-terminale. Trois mutations ponctuelles ont été introduites dans le domaine IgG4-Fc pour obtenir les caractéristiques suivantes : S241 P (numérotation Kabat) afin de stabiliser la liaison par pont disulfure dans la région charnière de Fc ; L248E afin d'éliminer l'activité effectrice résiduelle du domaine IgG4-Fc ; Absence de la lysine C-terminale afin de réduire l'hétérogénéité de la protéine. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.3. La protéine recombinante obtenue est nommée Robot-Fc L1 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.4. Pour obtenir la construction Robot-Fc L2, le même cDNA correspondant aux domaines Ig1-Ig2 mais sans le linker mentionné a été cloné dans le vecteur d'expression eucaryote pXL4909 (décrit à la Figure 1) qui permet l'expression de ces domaines Ig en fusion avec le même domaine Fc de l'IgG4 contenant les 3 mutations ponctuelles décrites dans la construction de Robot-Fc L1, mais en introduisant cette fois un linker GIyGIyGlyGlySer en amont du domaine Fc . La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.5 La protéine recombinante obtenue est nommée Robo1- Fc L2 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.6. b. Construction des protéines Robot-Fc utilisées comme contrôles Pour obtenir la construction Robot-Fc Slit-2-moins, le cDNA cloné précédemment dans le plasmide pXL4904 a été modifié par PCR pour introduire les mutations ponctuelles permettant les substitutions de la leucine position 38 en glutamine et la phénylalanine en position 89 en tyrosine. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.7. La protéine recombinante obtenue est nommée Robot-Fc Slit-2 moins et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.8. The recombinant Robot-Fc proteins consist of a fusion between the first 2 immunoglobulin (Ig1-Ig2) domains of the human Robot isoform b protein (NP_598334) and the Fc domain of the human immunoglobulin G4 (hIgG4-Fc, SwissProt IGHG4_HUMAN ). To obtain the Robot-Fc L1 construct, a cDNA fragment (SEQ ID NO.1) corresponding to the immunoglobulin (Ig) Ig1 and Ig2 domains of this protein (SEQ ID NO.2) followed by a GluArgProSerPheVal linker was amplified by PCR from the human fetal heart cDNA library (ref HL5042T Clontech). This amplified fragment was then cloned into the eukaryotic expression vector pXL4904 (described in FIG. 1) so that the two Robot Ig domains are expressed in fusion with the Fc domain of human IgG4 at the C-terminal position. Three point mutations were introduced into the IgG4-Fc domain to obtain the following characteristics: S241 P (Kabat numbering) in order to stabilize the disulfide bridge bond in the Fc hinge region; L248E to remove residual effector activity from the IgG4-Fc domain; Absence of C-terminal lysine to reduce the heterogeneity of the protein. The cDNA sequence used to express this recombinant protein corresponds to the sequence SEQ ID NO.3. The recombinant protein obtained is named Robot-Fc L1 and corresponds to the protein sequence SEQ ID NO.4. To obtain the Robot-Fc L2 construct, the same cDNA corresponding to the Ig1-Ig2 domains but without the mentioned linker was cloned into the eukaryotic expression vector pXL4909 (described in Figure 1) which allows the expression of these Ig domains. in fusion with the same Fc domain of IgG4 containing the 3 point mutations described in the construction of Robot-Fc L1, but this time introducing a GIyGIyGlyGlySer linker upstream of the Fc domain. The cDNA sequence used to express this recombinant protein corresponds to the sequence SEQ ID No. 5. The recombinant protein obtained is named Robo1-Fc L2 and corresponds to the protein sequence SEQ ID No. 6. b. Construction of Robot-Fc Proteins Used as Controls To obtain the Robot-Fc Slit-2-minus construct, the cDNA cloned previously in plasmid pXL4904 was modified by PCR to introduce point mutations allowing the substitution of leucine position 38 in glutamine. and phenylalanine at position 89 in tyrosine. The cDNA sequence used to express this recombinant protein corresponds to the sequence SEQ ID No. 7. The recombinant protein obtained is named Robot-Fc Slit-2 minus and corresponds to the protein sequence SEQ ID NO.8.

Pour obtenir la construction Robot-Fc Héparine-moins, le cDNA cloné dans le plasmide pXL4904 a été modifié par PCR pour introduire les mutations ponctuelles permettant les substitutions de l'arginine position 97 en alanine et la lysine position 98 en alanine. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.9. La protéine recombinante obtenue est nommée Robot-Fc Héparine-moins et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO. 10. c. Production des différentes protéines Robot-Fc Les deux protéines Robot-Fc L1 et Robot-Fc L2 ont été produites par transfection transitoire dans la lignée HEK293 (cellules FreeStyle 293-F réf 51-0029 Invitrogen selon les recommandations du fournisseur) à l'aide des plasmides pXL4904 et pXL4909 respectivement, et des plasmides accessoires pXL4544 et pXL4551 permettant l'expression de deux enzymes de glycosylation des N-glycans, i.e. la a-2,3-sialyltransférase et la 8-1,4-galactosyltransférase comme cela a été décrit dans la demande WO2008/065543. Ces protéines ont aussi été produites par transfection dans la lignée CHO (cellules CHO-S, réf 11619-012 Invitrogen selon les recommandations du fournisseur) à l'aide des plasmides pXL4904 et pXL4909 respectivement. Les protéines Robot-Fc L1 et Robot-Fc L2 exprimées dans le surnageant de culture des cellules HEK293 ont été purifiées par chromatographie sur colonne d'affinité protéine A (MabSelect ref. 17-5199-02 Amersham Biosciences) et élution en tampon 20 mM NaCl / 100 mM acide acétique puis formulée en tampon PBS (réf. 190-094, Invitrogen). Les protéines recombinantes Robot-Fc Slit-2-moins et Robot-Fc Héparine-moins ont été produites et purifiées de la même manière. d. Caractérisation physico-chimique des protéines recombinantes Robot-Fc L'analyse en SDS-PAGE et en gel perméation ont permis de montrer que les protéines étaient dimériques et pures à plus de 96%. L'analyse par masse spectrométrie a permis de démontrer l'identité de ces protéines, la masse mesurée de la protéine déglycosylée étant en parfait accord avec la masse calculée in silico. L'analyse de la composition en monosaccharides et la quantification des acides sialiques des N-glycans comme décrit par Saddic et al. 2002. (Methods Mol. Biol. 194:23-36 and Anumula et a1.1998. Glycobiology 8:685-694) ont permis de démontrer que les protéines étaient très largement sialylées. Les résultats sont présentés dans le tableau 1. On notera que l'analyse N-terminale des molécules Robot-Fc L1 et Robot-Fc L2 ont montré que ces protéines purifiées contenaient une proportion variable (0 à 40%) d'une forme tronquée des 2 premiers résidus (Ser20 et Arg21). Tableau 1 : Identité des protéines Robot-Fc Robot-Fc L1 Robot-Fc L2 Masse (SDS-PAGE 56 kDa 55 kDa conditions réductrices) Masse (SEC, HPLC) 180 kDa 180 kDa Masse (LC/MS après 48812 Da 48410 Da déglycosylation) Profil des N-Glycans fortement sialylés fortement sialylés (HPLC) 21.4 % asialoglycans 20.1 % asialoglycans Composition en N-glycans complexes N-glycans complexes monosaccharides (HPLC) entièrement fucosylés entièrement fucosylés pas de O-glycans pas de O-glycans 10 Exemple 2 : Préparation des protéines Slit utilisées comme ligand. Le cDNA codant pour la protéine SIit2 humaine, correspond à la protéine de référence NP_004778. Des fragments de ce cDNA ont été amplifiés par PCR à partir de la banque de cDNA de cerveau humain (réf. 639300, Clontech). To obtain the Robot-Fc Heparin-minus construct, the cDNA cloned into the plasmid pXL4904 was modified by PCR to introduce point mutations allowing substitutions of arginine position 97 to alanine and lysine position 98 to alanine. The cDNA sequence used to express this recombinant protein corresponds to the sequence SEQ ID NO.9. The recombinant protein obtained is named Robot-Fc Heparin-minus and corresponds to the protein sequence SEQ ID NO. 10. c. Production of the different Robot-Fc proteins The two Robot-Fc L1 and Robot-Fc L2 proteins were produced by transient transfection in the HEK293 line (FreeStyle 293-F cells, ref. 51-0029 Invitrogen according to the supplier's recommendations) using plasmids pXL4904 and pXL4909 respectively, and accessory plasmids pXL4544 and pXL4551 allowing the expression of two N-glycans glycosylation enzymes, ie α-2,3-sialyltransferase and 8-1,4-galactosyltransferase as has been previously reported. described in WO2008 / 065543. These proteins were also produced by transfection into the CHO line (CHO-S cells, ref 11619-012 Invitrogen according to the supplier's recommendations) using the plasmids pXL4904 and pXL4909 respectively. The Robot-Fc L1 and Robot-Fc L2 proteins expressed in the culture supernatant of HEK293 cells were purified by affinity column chromatography protein A (MabSelect ref 17-5199-02 Amersham Biosciences) and elution in 20 mM buffer. NaCl / 100 mM acetic acid and then formulated in PBS buffer (ref 190-094, Invitrogen). The recombinant proteins Robot-Fc Slit-2-less and Robot-Fc Heparin-minus were produced and purified in the same way. d. Physicochemical Characterization of Robot-Fc Recombinant Proteins SDS-PAGE and permeation gel analysis showed that the proteins were dimeric and more than 96% pure. The mass spectrometry analysis made it possible to demonstrate the identity of these proteins, the measured mass of the deglycosylated protein being in perfect agreement with the mass calculated in silico. The analysis of the monosaccharide composition and the quantification of sialic acids of N-glycans as described by Saddic et al. 2002. (Methods Mol Biol., 194: 23-36 and Anumula et al., 1998, Glycobiology 8: 685-694) demonstrated that the proteins were highly sialylated. The results are shown in Table 1. It will be noted that the N-terminal analysis of the Robot-Fc L1 and Robot-Fc L2 molecules showed that these purified proteins contained a variable proportion (0 to 40%) of a truncated form. first 2 residues (Ser20 and Arg21). Table 1: Protein Identity Robot-Fc Robot-Fc L1 Robot-Fc L2 Mass (SDS-PAGE 56 kDa 55 kDa Reducing Conditions) Mass (SEC, HPLC) 180 kDa 180 kDa Mass (LC / MS after 48812 Da 48410 Da deglycosylation ) Profile of Highly Sialylated Highly Sialylated N-Glycans (HPLC) 21.4% Asialoglycans 20.1% Asialoglycans Composition of N-Glycans Complexes N-Glycans Complex Monosaccharides (HPLC) Fully Fucosylated Fully Fucosylated No O-Glycans No O-Glycans Example 2 : Preparation of Slit proteins used as ligand. The cDNA coding for the human SIit2 protein corresponds to the reference protein NP_004778. Fragments of this cDNA were amplified by PCR from the human brain cDNA library (Ref 639300, Clontech).

Le cDNA correspondant au domaine D2 a été cloné dans le vecteur d'expression eucaryote pXL4911 afin d'exprimer ce domaine contenant un Histag en position C-terminale. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.11. La protéine recombinante obtenue est nommée Slit-2-D2 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.12. The cDNA corresponding to the D2 domain was cloned into the eukaryotic expression vector pXL4911 in order to express this domain containing a Histag in the C-terminal position. The cDNA sequence used to express this recombinant protein corresponds to the sequence SEQ ID No. 11. The recombinant protein obtained is named Slit-2-D2 and corresponds to the protein sequence SEQ ID NO.12.

Le cDNA correspondant aux domaines D1-D2 a été cloné dans le vecteur d'expression eucaryote pXL4912 afin d'exprimer ces deux domaines contenant un Histag en position C-terminale. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.13. La protéine recombinante obtenue est nommée SR-2-D1 D2 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.14. Le cDNA correspondant à la partie extracellulaire (Nt) de la protéine SIit2 a été cloné dans le vecteur d'expression eucaryote pXL5033 afin d'exprimer cette protéine avec un Histag en position C-terminale. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.15. La protéine recombinante obtenue est nommée Slit-2-N et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.16. Le cDNA codant pour le domaine D2 de la protéine SIit2 murine, et correspondant au domaine D2 de la protéine de référence décrite NP_848919 a été obtenu à partir du cDNA cloné dans le plasmide pXL4911. Quatre fragments permettant de générer les cinq mutations ponctuelles ont été générés par PCR avec le pXL4911 comme matrice puis ces fragments ont été utilisés comme matrice pour amplifier le cDNA codant pour le domaine D2 total par PCR séquentielle. La protéine porte les mutations Thr311Ser, Lys313Arg, IIe329Leu, IIe411VaI et Pro418AIa lui permettant d'être identique au domaine D2 de la protéine SIit2 murine. Ce plasmide permet d'exprimer le domaine D2 de la protéine SIit2 murine avec un Histag en position C-terminale. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.17. La protéine recombinante obtenue est nommée mSlit-2-D2 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.18. Le cDNA codant pour la protéine SIit1 humaine, correspond à la protéine de référence décrite NP_003052. Un fragment de ce cDNA a été amplifié par PCR à partir de la banque de cDNA de cerveau humain (réf. 639300, Clontech). Le cDNA correspondant au domaine D2 a été cloné dans le vecteur d'expression eucaryote pXL5020 afin d'exprimer ce domaine contenant un Histag en position C-terminale. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.19. La protéine recombinante obtenue est nommée Slit-1-D2 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.20. Le cDNA codant pour la protéine SIit3 humaine, correspond à la protéine de référence décrite NP_003053. Un fragment de ce cDNA a été amplifié par PCR à partir de la banque de cDNA de cerveau humain (réf. 639300, Clontech). Le cDNA correspondant au domaine D2 a été cloné dans le vecteur d'expression eucaryote pXL5021 afin d'exprimer ce domaine contenant un Histag en position C-terminale. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.21. La protéine recombinante obtenue est nommée Slit-3-D2 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.22. Les trois protéines nommées Slit-2-D2 SR-2-D1 D2 et Slit-2-N ont été produites par transfection transitoire dans la lignée HEK293 (cellules FreeStyle 293-F selon les recommandations du fournisseur Invitrogen) à l'aide du plasmide pXL4911 (respectivement pXL4912 ou pXL5033). Les protéines Slit-2-D2 et SR-2-D1 D2 exprimées dans le surnageant de culture des cellules HEK293 ont été purifiées par chromatographie sur colonne de Sépharose Ni-chelating (réf. 17-0409-03, Amersham Biosciences) et élution en tampon imidazole puis formulée en tampon PBS (réf. 14190-094, Invitrogen) ajusté à 1 M NaCl. L'analyse par masse spectrométrie (LC/MS) a permis de démontrer l'identité de ces protéines. De façon comparable, les trois protéines nommées mSlit2-D2, SIit1-D2 et SIit3-D2 ont été produites purifiées et caractérisées. The cDNA corresponding to the D1-D2 domains was cloned into the eukaryotic expression vector pXL4912 in order to express these two domains containing a Histag in the C-terminal position. The cDNA sequence used to express this recombinant protein corresponds to the sequence SEQ ID NO.13. The recombinant protein obtained is named SR-2-D1 D2 and corresponds to the protein sequence SEQ ID NO.14. The cDNA corresponding to the extracellular portion (Nt) of the SIit2 protein was cloned into the eukaryotic expression vector pXL5033 in order to express this protein with a C-terminal Histag. The cDNA sequence used to express this recombinant protein corresponds to the sequence SEQ ID NO.15. The recombinant protein obtained is named Slit-2-N and corresponds to the protein sequence SEQ ID NO.16. The cDNA coding for the D2 domain of the murine SIit2 protein, and corresponding to the D2 domain of the reference protein described NP_848919, was obtained from the cDNA cloned in the plasmid pXL4911. Four fragments for generating the five point mutations were generated by PCR with pXL4911 as a template and then these fragments were used as a template to amplify the cDNA coding for the total D2 domain by sequential PCR. The protein carries the mutations Thr311Ser, Lys313Arg, IIe329Leu, IIe411VaI and Pro418AIa allowing it to be identical to the D2 domain of the murine SIit2 protein. This plasmid makes it possible to express the D2 domain of the murine SIit2 protein with a Histag in the C-terminal position. The cDNA sequence used to express this recombinant protein corresponds to the sequence SEQ ID No. 17. The recombinant protein obtained is named mSlit-2-D2 and corresponds to the protein sequence SEQ ID NO.18. The cDNA coding for the human SIit1 protein corresponds to the reference protein described NP_003052. A fragment of this cDNA was amplified by PCR from the human brain cDNA library (Ref 639300, Clontech). The cDNA corresponding to the D2 domain was cloned into the eukaryotic expression vector pXL5020 in order to express this domain containing a Histag in the C-terminal position. The cDNA sequence used to express this recombinant protein corresponds to the sequence SEQ ID NO.19. The recombinant protein obtained is named Slit-1-D2 and corresponds to the protein sequence SEQ ID NO.20. The cDNA coding for the human SIit3 protein corresponds to the reference protein described NP_003053. A fragment of this cDNA was amplified by PCR from the human brain cDNA library (Ref 639300, Clontech). The cDNA corresponding to the D2 domain was cloned into the eukaryotic expression vector pXL5021 in order to express this domain containing a Histag in the C-terminal position. The cDNA sequence used to express this recombinant protein corresponds to the sequence SEQ ID NO.21. The recombinant protein obtained is named Slit-3-D2 and corresponds to the protein sequence SEQ ID NO.22. The three proteins named Slit-2-D2 SR-2-D1 D2 and Slit-2-N were produced by transient transfection in the line HEK293 (FreeStyle 293-F cells according to the recommendations of the supplier Invitrogen) using the plasmid pXL4911 (respectively pXL4912 or pXL5033). The Slit-2-D2 and SR-2-D1 D2 proteins expressed in the culture supernatant of HEK293 cells were purified by Sepharose Ni-chelating column chromatography (Ref 17-0409-03, Amersham Biosciences) and elution by imidazole buffer then formulated in PBS buffer (ref.11490-094, Invitrogen) adjusted to 1 M NaCl. Mass spectrometry (LC / MS) analysis demonstrated the identity of these proteins. In a comparable manner, the three proteins named mSlit2-D2, SIit1-D2 and SIit3-D2 were produced purified and characterized.

Exemple 3 : Etude de l'affinité des protéines recombinantes Robot-Fc pour les protéines Slit et pour l'héparine à l'aide de trois méthodes : ELISA, SPR et FACS a. Affinité des protéines Robot-Fc pour l'héparine Pour déterminer l'affinité des constructions Robot-Fc à l'héparine, 2 mg de protéine Robot-Fc, purifié et formulée dans 10 mM phosphate pH 7.0 a été chromatographié sur une colonne héparine (1 mL HiTrap Heparin-Sepharose HP, GE Heathcare) par élution avec un gradient linéaire de NaCl de 0 à 1,5 M. Sur le tableau 2 est indiquée la concentration en NaCl de 448 mM nécessaire pour éluer la protéine Robot-Fc L1 comme décrit dans la littérature (Fukuhara, N. et al. 2008 J. Biol. Chem. 283 p16226-16234). Tableau 2 : Affinité de Robot-Fc à l'héparine Construit Robot-Fc Décrochage de la colonne héparine [NaCI], mM Robot-Fc L1 448 Robot-Fc Héparine-moins Absence de fixation Ces résultats montrent que la protéine Robot-Fc Héparine-moins qui n'est pas 15 retenue sur cette colonne donc qu'elle n'a plus d'affinité à l'héparine. Cette protéine est donc un mutant héparine négatif. b. Evaluation de l'interaction des variants de protéine Robot-Fc avec le domaine D2 de la protéine SIit2 humaine Cet exemple décrit l'interaction des 2 variants nommés Robot-Fc L1 et Robot-Fc L2 20 avec leur ligand naturel (dans ces expériences le domaine D2 de SIit2 humain) par dosage ELISA. La protéine humaine SIit2-D2 a été fixé sur des boites Immulon-4 enzyme-linked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Une gamme de concentration (de 20 pg/mL à 0.02 pg/mL) des variants Robot-Fc L1 et Robot-Fc L2 ont été ajoutés puis détectés grâce à l'anticorps de chèvre anti-humain IgG conjugué à la péroxidase (Sigma ; réf. A0170-dilution au 1:50000). La révélation a été réalisée avec le substrat TMB- H2O2 (Interchim ; réf UP664780) et les mesures avec le lecteur de plaques à 450 nm. Les résultats obtenus sont reportés dans la figure 2. Ils montrent que Les deux variants Robot-Fc L1 et L2 interagissent spécifiquement avec la protéine Slit-2 humaine (en particulier avec le domaine D2). c. Evaluation de l'interaction de la protéine Robot-Fc avec les variants humains de la famille Slit, à savoir SR-1 et Slit-3 Cet exemple décrit l'interaction de la protéine de fusion Robot-Fc L1 avec les variants Slit-1-D2, Slit-2-D2 et Slit-3-D2 par dosage ELISA. Le domaine D2 des variants Slit humains ont été fixé sur des boites Immulon-4 enzyme-linked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Une gamme de concentration (de 1 pg/mL à 0.001 pg/mL) de la protéine de fusion Robot-Fc L1 a été ajouté puis détecté grâce à l'anticorps de chèvre anti-humain IgG conjugué à la péroxidase (Sigma ; réf. A0170-dilution au 1:50000). La révélation a été réalisée avec le substrat TMB-H2O2 (Interchim ; réf UP664780) et les mesures avec le lecteur de plaques à 450 nm. De même le variant Robot-Fc Slit-2-moins qui est muté au niveau du site de liaison à SIit2, a été évalué suivant une gamme de concentration (de 20 pg/mL à 0.02 pg/mL) par dosage ELISA dans les mêmes conditions décrites ci-dessus. Les résultats obtenus sont reportés dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 : Affinité de Robot-Fc pour les variants humains de la protéine Slit Protéine Slit (ligand) Protéine Robot-Fc EC50 (pg/mL) CV (%) Slit-2-D2 Robot-Fc L1 1.32 E-01 3.3 Slit-1-D2 Robot-Fc L1 7.88 E-02 3.9 Slit-3-D2 Robot-Fc L1 2.60 E-01 12 Slit-2-D2 Robot-Fc Slit-2-moins 1.78 E+01 18 Ces résultats montrent que la protéine Robot-Fc interagit spécifiquement avec les trois protéines de la famille, SR-1, Slit-2 et Slit-3 (en particulier avec leur domaine D2). De plus, la protéine Robot-Fc Slit-2-moins n'a plus d'affinité à l'héparine et elle est donc un mutant héparine négatif. d. Evaluation de l'interaction de la protéine Robot-Fc avec la protéine Slit-2 murine Cet exemple décrit l'interaction de la protéine de fusion Robot-Fc L1 avec la protéine murine mSlit-2-D2 par dosage ELISA. Example 3: Study of the affinity of the recombinant Robot-Fc proteins for the Slit proteins and for heparin using three methods: ELISA, SPR and FACS a. Affinity of Robot-Fc Proteins for Heparin To determine the affinity of Robot-Fc constructs to heparin, 2 mg of Robot-Fc protein, purified and formulated in 10 mM phosphate pH 7.0 was chromatographed on a heparin column ( 1 mL HiTrap HP Heparin-Sepharose, GE Heathcare) eluting with a linear gradient of NaCl from 0 to 1.5 M. Table 2 shows the NaCl concentration of 448 mM required to elute the Robot-Fc L1 protein as described in the literature (Fukuhara, N. et al., 2008 J. Biol Chem 283 p16226-16234). Table 2: Robot-Fc affinity to heparin Constructed Robot-Fc Heparin column stall [NaCl], mM Robot-Fc L1 448 Robot-Fc Heparin-less Absence of fixation These results show that the Robot-Fc protein Heparin which is not retained on this column so that it no longer has affinity to heparin. This protein is therefore a negative heparin mutant. b. Evaluation of the Interaction of the Robot-Fc Protein Variants with the D2 Domain of the Human SIit2 Protein This example describes the interaction of the 2 variants named Robot-Fc L1 and Robot-Fc L2 with their natural ligand (in these experiments the D2 domain of human SIit2) by ELISA assay. The human SIit2-D2 protein was fixed on Immulon-4 enzyme-linked plates (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). A concentration range (from 20 μg / ml to 0.02 μg / ml) of the Robot-Fc L1 and Robot-Fc L2 variants was added and then detected using peroxidase-conjugated goat anti-human IgG antibody (Sigma; A0170-dilution to 1: 50000). Revelation was performed with the TMB-H2O2 substrate (Interchim, ref. UP664780) and measurements with the plate reader at 450 nm. The results obtained are shown in FIG. 2. They show that the two variants F1-L1 and L1-Fc interact specifically with the human Slit-2 protein (in particular with the D2 domain). vs. Evaluation of the interaction of the Robot-Fc protein with the human variants of the Slit family, namely SR-1 and Slit-3 This example describes the interaction of the Robot-Fc L1 fusion protein with the Slit-1 variants -D2, Slit-2-D2 and Slit-3-D2 by ELISA assay. The D2 domain of human Slit variants were fixed on Immulon-4 enzyme-linked plates (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). A concentration range (from 1 μg / mL to 0.001 μg / mL) of the Robot-Fc L1 fusion protein was added and then detected by the peroxidase-conjugated goat anti-human IgG antibody (Sigma; A0170-1: 50000 dilution). Revelation was performed with the TMB-H2O2 substrate (Interchim, ref. UP664780) and measurements with the plate reader at 450 nm. Similarly, the Slit-2-less Robot-Fc variant which is mutated at the SIit2 binding site, was evaluated according to a concentration range (from 20 μg / mL to 0.02 μg / mL) by ELISA assay in the same conditions described above. The results obtained are shown in Table 3 below. Table 3: Robot-Fc affinity for human variants of protein Slit Protein Slit (ligand) Robot-Fc Protein EC50 (pg / mL) CV (%) Slit-2-D2 Robot-Fc L1 1.32 E-01 3.3 Slit -1-D2 Robot-Fc L1 7.88 E-02 3.9 Slit-3-D2 Robot-Fc L1 2.60 E-01 12 Slit-2-D2 Robot-Fc Slit-2-minus 1.78 E + 01 18 These results show that the Robot-Fc protein specifically interacts with the three family proteins, SR-1, Slit-2 and Slit-3 (especially with their D2 domain). In addition, the Robot-Fc protein Slit-2-less has no affinity to heparin and is therefore a negative heparin mutant. d. Evaluation of the Interaction of the Robot-Fc Protein with the Murine Slit-2 Protein This example describes the interaction of the Robot-Fc L1 fusion protein with the murine mSlit-2-D2 protein by ELISA assay.

La protéine murine mSlit-2-D2 a été fixée sur une boite Immulon-4 enzyme-linked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Une gamme de concentration (de 2 pg/mL à 0.002 pg/mL) de la protéine de fusion Robot-Fc L1 a été ajouté puis détecté grâce à l'anticorps de chèvre anti-humain IgG conjugué à la péroxidase (Sigma ; réf. A0170-dilution au 1:50000). La révélation a été réalisée avec le substrat TMB-H2O2 (Interchim ; réf UP664780) et les mesures avec le lecteur de plaques à 450 nm. Les résultats obtenus sont reportés dans le tableau 4 ci-dessous. Tableau 4 : Affinité de Robot-Fc L1 à la protéine Slit-2 murine Protéine étudiée EC50 (pg/mL) CV (%) mSlit2-D2 2.21 E-01 18 Ces résultats montent que la protéine Robot-Fc interagit spécifiquement avec la 20 protéine Slit-2 murine e. Affinité de Robot-Fc à la protéine Slit mesurée par SPR Cet exemple décrit la détermination de la constante d'affinité de la protéine de fusion Robot-Fc L1 avec la protéine Slit-2 humaine (dans cette expérience Slit-2-D2) par SPR (Surface Plasmon Resonance ; BlAcore 2000). L'interaction entre la protéine 25 Robot-Fc et la protéine SIit2 humaine a été analysée après avoir fixé la protéine de fusion Robot-Fc sur une chips CM5. Les mesures de cinétiques sont réalisées selon le protocole de Canziani et al (2004. Anal. Biochem. 325 :301-307). Tableau 5 : Constante d'affinité de Robo-Fc L1 avec SIit2-D2 humain par SPR (analyse de type steady-state) Protéine KD (nM) Robot-Fc L1 32 Une seconde méthode qui consiste à déterminer la constante d'affinité entre la protéine de fusion Robot-Fc L1 et la protéine SIit2 humaine a été analysée après avoir fixé la protéine Slit-2-D2 sur la chips CM5. Les mesures de cinétiques sont réalisées selon le protocole de Canziani et al (2004. Anal. Biochem. 325 :301-307) par la méthode de Sctachard suivant un modèle avec deux sites de liaison non équivalents. Tableau 6 : Constante d'affinité de Robot-Fc avec SIit2-D2 humain par SPR selon le modèle bi-phasique de Scatchard Robot -Fc L1 KD (nM) Site de haute affinité KD1 : 1,5 Site de faible affinité KD2 :160 f. Affinité de Robot-Fc à Slit mesurée par FACS Cet exemple décrit l'affinité de la protéine Robot-Fc sur cellules mammifères HEK293 exprimant SIit2. Les cellules HEK293 décrites et utilisées comme dans l'exemple 1, ont été transfectées soit avec un plasmide ballast, n'ayant pas de cDNA codant dans la cellule mammifère, soit le plasmide pXL4911 codant pour la protéine Slit-2-D2; soit le plasmide pXL4912 codant pour la protéine SR-2-D1 D2 ; ou soit pXL5033 codant pour la protéine Slit-2-N décrit dans l'exemple 2. Les cellules ont été réparties en plaque 96-puits 48 heures post-transfection, et la protéine Robot-Fc a été ajoutée dans une gamme de concentrations de 0,01 à 3mg/L pendant 30 min à 40C. La protéine Robot-Fc est soit l'agent bio-thérapeutique Robo-Fc L1, soit le mutant Robot-Fc Slit-2-moins, soit le mutant Robot-Fc Héparine-moins. Les cellules ont été lavées et l'anticorps anti-Fc humain marqué à l'Alexa 488 (réf : A-11013, Invitrogen) a été incubé pendant 30 min à 40C. Puis les cellules HEK293 marquées sont quantifiées par FACS (Geomean). La figure 3 décrit la fixation des cellules HEK293 à la protéine Robot-Fc via la fluorescence mesurée en FACS en absence d'expression de Slit-2. La protéine Robot-Fc ainsi que le mutant Robot-Fc Slit-2-moins se fixent aux cellules HEK293 alors que le mutant Robot-Fc Héparine-moins ne se fixe pas. Robot-Fc se fixe donc en partie aux cellules HEK293 via le binding à l'héparine aux faibles concentrations en Robot-Fc de 0,3 à 0,03 mg/L. The murine mSlit-2-D2 protein was fixed on an enzyme-linked Immulon-4 box (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). A concentration range (from 2 μg / mL to 0.002 μg / mL) of the Robot-Fc L1 fusion protein was added and then detected by the peroxidase-conjugated goat anti-human IgG antibody (Sigma; A0170-1: 50000 dilution). Revelation was performed with the TMB-H2O2 substrate (Interchim, ref. UP664780) and measurements with the plate reader at 450 nm. The results obtained are reported in Table 4 below. Table 4: L1 Robot-Fc Affinity to Murine Slit-2 Protein Study Protein EC50 (pg / mL) CV (%) mSlit2-D2 2.21 E-01 18 These results show that the Robot-Fc protein specifically interacts with 20 murine Slit-2 protein e. Robit-Fc Affinity to Slit Protein Measured by SPR This example describes the determination of the affinity constant of the Robot-Fc L1 fusion protein with human Slit-2 protein (in this Slit-2-D2 experiment) by SPR (Surface Plasmon Resonance, BlAcore 2000). The interaction between the Robot-Fc protein and the human SIit2 protein was analyzed after attaching the Robot-Fc fusion protein to a CM5 chip. The kinetic measurements are carried out according to the protocol of Canziani et al (2004. Anal Biochem 325: 301-307). Table 5: Robo-Fc L1 affinity constant with human SIit2-D2 by SPR (steady state analysis) Protein KD (nM) Robot-Fc L1 32 A second method which consists in determining the affinity constant between the Robot-Fc L1 fusion protein and the human SIit2 protein was analyzed after having fixed the Slit-2-D2 protein on the CM5 chips. The kinetic measurements are carried out according to the protocol of Canziani et al (2004. Anal Biochem 325: 301-307) by the Sctachard method according to a model with two non-equivalent binding sites. Table 6: Robot-Fc affinity constant with human SIit2-D2 by SPR according to the bi-phasic model of Scatchard Robot -Fc L1 KD (nM) High affinity site KD1: 1.5 Low affinity site KD2: 160 f. FACS-Fc-Slit affinity measured by FACS This example describes the affinity of the Robot-Fc protein on mammalian cells HEK293 expressing SIit2. The HEK293 cells described and used as in Example 1, were transfected with either a plasmid ballast, having no cDNA encoding in the mammalian cell, or the plasmid pXL4911 encoding the protein Slit-2-D2; either the plasmid pXL4912 coding for the protein SR-2-D1 D2; or pXL5033 encoding the Slit-2-N protein described in Example 2. The cells were plated into a 96-well plate 48 hours post-transfection, and the Robot-Fc protein was added in a range of 0.01 to 3mg / L for 30 min at 40C. The Robot-Fc protein is either the Robo-Fc L1 bio-therapeutic agent, or the Slit-2-less Robot-Fc mutant or the Heparin-less Robot-Fc mutant. The cells were washed and the Alexa 488-labeled human anti-Fc antibody (ref: A-11013, Invitrogen) was incubated for 30 min at 40C. Then the labeled HEK293 cells are quantified by FACS (Geomean). Figure 3 depicts binding of HEK293 cells to Robot-Fc protein via fluorescence measured in FACS in the absence of Slit-2 expression. The Robot-Fc protein and the Slit-2-less Robot-Fc mutant bind to HEK293 cells while the Robot-Fc Heparin-min mutant does not bind. Robot-Fc therefore binds in part to HEK293 cells via heparin binding at low Robot-Fc concentrations of 0.3 to 0.03 mg / L.

La figure 4 décrit le binding des cellules HEK293 à la protéine Robot-Fc via la fluorescence mesurée en FACS quand Slit-2-N est exprimée par transfection transitoire. Seule la protéine Robot-Fc se fixe aux cellules HEK293 exprimant Slit-2-N. Les mutants Robot-Fc Slit-2-moins et Robot-Fc Héparine-moins ne se fixent pas (ou quasiment pas) dans la gamme de concentrations de Robot-Fc de 3.0 à 0, 3 mg/L par rapport à la protéine Robot-Fc L1 biothérapeutique. Le tableau 7 décrit les constantes d'affinité mesurées par FACS de la protéine Robot-Fc lorsque les protéines Slit-2-N, SR-2-D1 D2 ou Slit-2-D2 sont exprimées dans la lignée HEK293. Figure 4 depicts binding of HEK293 cells to Robot-Fc protein via fluorescence measured in FACS when Slit-2-N is expressed by transient transfection. Only Robot-Fc protein binds to HEK293 cells expressing Slit-2-N. The Robot-Fc Slit-2-minus and Robot-Fc Heparin-min mutants do not bind (or almost no) in the Robot-Fc concentration range of 3.0 to 0.3 mg / L relative to the Robot protein. -Fc L1 biotherapeutics. Table 7 describes the FACS measured affinity constants of the Robot-Fc protein when the Slit-2-N, SR-2-D1 D2 or Slit-2-D2 proteins are expressed in the HEK293 line.

Tableau 7 : Affinité de Robot-Fc à la protéine Slit-2 sur cellule par FACS Robot -Fc ligand Protéine exprimée Kp (nM) transitoirement dans HEK293 Robot-Fc L1 Slit-2-N 1,2 SR-2-D1 D2 0,98 Slit-2-D2 Fixation très faible Robot-Fc Héparine-moins Slit-2-N 43 SR-2-D1 D2 41 Robot-Fc Slit-2-moins Slit-2-N Pas de fixation Comme dans les exemples précédents, le mutant Robot-Fc Slit-2-moins s'est avéré Slit-2 négatif et le mutant Robot-Fc Héparine-moins présente une affinité plus faible à SIit2 que la protéine bio-thérapeutique. Robot-Fc se fixe sur Slit-2-N et SR-2-D1 D2 exprimées par les cellules HEK293 avec des affinités comparables qui sont meilleures que celle avec Slit-2-D2. Exemple 4: Propriétés pharmacocinétiques des protéines Robot-Fc L1 et Robot -Fc L2 Cet exemple décrit le profil pharmacocinétique et la concentration plasmatique de la protéine Robot-Fc injectée une fois chez la souris en intraveineuse (iv). Trois souris Balb/C (pour chaque temps) ont été injectées via la veine caudale avec chacune des protéines Robot-Fc à 2.5 mg/mL à raison de 100 pL/10 g (z' 25 mg/kg). Aux temps prédéterminés (0,5 ; 1 ; 6 ; 24 ; 48 ; et 72 h après administration), les souris ont été anesthésiées, le sang a été prélevé et collecté dans un tube contenant 10 pL de citrate (CPD-A, C-4431 Sigma) et 2 pL d'inhibiteurs de protéase (Complete Protease Inhibitor Mix, Roche Molecular Biochemical). Les tubes ont été centrifugés et les échantillons de plasma ont été collectés et congelés à -20°C. La protéine SIit2 (Slit-2-D2) a été coatée dans les puits des boites de 96-puits, les échantillons de plasma dilués au 1/5000 et 1/20000 ont été mis en contact pendant une heure à 37°C. L'anticorps anti-Fc humain conjugué à la péroxidase (réf. 31413, Pierce) a été ensuite incubé puis révélé avec le TMB-H2O2 (ref UP664780, Interchim) et l'absorbance a été lue à 450 nm. Une gamme étalon a été réalisée avec chaque protéine Robot-Fc purifiée. Les concentrations plasmatiques des protéines Robot-Fc L1 et Robot-Fc L2 sont représentées sur la figure 5. Les paramètres pharmacocinétiques sont décrits dans le tableau 8 suivant et montrent que la protéine est stable après injection chez la souris. Tableau 8 : Paramètres pharmacocinétiques des protéines Robot-Fc après injection iv chez la souris Protéine à Co T 12 AUC (0-last) AUC (0-24h) CI Vdss 25 mg/kg pg/mL pg.h/mL pg.h/mL mL/H/kg mL/kg Robot-Fc 203 158 3655 1879 2,2 470 L1 Robot-Fc 198 142 3973 2042 2,2 417 L2 Exemple 5 : Description de la protéine bio-thérapeutique Robot-Fc améliorée pour son homogénéité en position N-terminale. Cet exemple décrit le plasmide d'expression, la production et la caractérisation physico-chimique d'une autre protéine Robot-Fc nommée Robot-Fc L3 qui est différente de la protéine Robot-Fc L1 par l'absence des deux premiers résidus Ser20 et Arg21. Le cDNA cloné dans le plasmide pXL4904 a été modifié par PCR pour éliminer les codons Ser20 et Arg21 et fusionné le codon suivant (Leu22) à la séquence codante 19 du signal peptide de l'nterleukine 2. Le plasmide d'expression pXL5004 a alors été généré, voir figure 1. La séquence du cDNA utilisée pour exprimer cette protéine recombinante correspond à la séquence SEQ ID NO.23. La protéine Robot-Fc L3 a été produite, purifiée et caractérisée comme décrit dans l'exemple 1. L'analyse N-terminale a montré que cette protéine purifiée était parfaitement homogène. La protéine recombinante obtenue est nommée Robot-Fc L3 et correspond à la séquence protéique SEQ ID NO.24. Exemple 6: Evaluation de l'interaction de la protéine Robot-Fc L3 avec la protéine SIit2 humaine. Table 7: Robot-Fc affinity to cell-based Slit-2 protein by FACS Robot -Fc ligand Protein expressed Kp (nM) transiently in HEK293 Robot-Fc L1 Slit-2-N 1,2 SR-2-D1 D2 0 , 98 Slit-2-D2 Very weak fixation Robot-Fc Heparin-less Slit-2-N 43 SR-2-D1 D2 41 Robot-Fc Slit-2-less Slit-2-N No fixation As in the previous examples , the Slit-2-less Robot-Fc mutant was found to be Slit-2 negative and the Robot-Fc Heparin-min mutant has a lower affinity to SIit2 than the bio-therapeutic protein. Robot-Fc binds to Slit-2-N and SR-2-D1 D2 expressed by HEK293 cells with comparable affinities that are better than that with Slit-2-D2. Example 4: Pharmacokinetic properties of Robot-Fc L1 and Robot-Fc L2 proteins This example describes the pharmacokinetic profile and the plasma concentration of the Robot-Fc protein injected once in the intravenous (iv) mouse. Three Balb / C mice (for each time) were injected via the tail vein with each of the Robot-Fc proteins at 2.5 mg / ml at 100 μl / 10 g (25 mg / kg). At the predetermined times (0.5; 1; 6; 24; 48; and 72 hours after administration), the mice were anesthetized, the blood was collected and collected in a tube containing 10 μl of citrate (CPD-A, C). 441 Sigma) and 2 μl of protease inhibitors (Complete Protease Inhibitor Mix, Roche Molecular Biochemical). The tubes were centrifuged and the plasma samples were collected and frozen at -20 ° C. The SIit2 protein (Slit-2-D2) was coated in the wells of the 96-well dishes, the plasma samples diluted to 1/5000 and 1/20000 were contacted for one hour at 37 ° C. The peroxidase-conjugated human anti-Fc antibody (P / N 31413, Pierce) was then incubated and then revealed with TMB-H2O2 (ref UP664780, Interchim) and the absorbance read at 450 nm. A standard range was performed with each purified Robot-Fc protein. The plasma concentrations of the Robot-Fc L1 and Robot-Fc L2 proteins are shown in FIG. 5. The pharmacokinetic parameters are described in the following Table 8 and show that the protein is stable after injection in the mouse. Table 8: Pharmacokinetic Parameters of Robot-Fc Proteins After IV Injection in Mouse Protein Co T 12 AUC (0-last) AUC (0-24h) CI Vdss 25 mg / kg pg / mL pg.h / mL pg.h mL / kg / ml / H / kg mL / kg Robot-Fc 203 158 3655 1879 2.2 470 L1 Robot-Fc 198 142 3973 2042 2.2 417 L2 Example 5: Description of the improved biological-therapeutic Robot-Fc protein for its homogeneity in the N-terminal position. This example describes the expression plasmid, the production and the physicochemical characterization of another Robot-Fc protein named Robot-Fc L3 which is different from the Robot-Fc L1 protein by the absence of the first two residues Ser20 and Arg21. The cDNA cloned into the plasmid pXL4904 was modified by PCR to remove the Ser20 and Arg21 codons and fused the next codon (Leu22) to the coding sequence 19 of the peptide signal of nterleukin 2. The expression plasmid pXL5004 was then generated, see Figure 1. The cDNA sequence used to express this recombinant protein corresponds to the sequence SEQ ID NO.23. The Robot-Fc L3 protein was produced, purified and characterized as described in Example 1. N-terminal analysis showed that this purified protein was perfectly homogeneous. The recombinant protein obtained is named Robot-Fc L3 and corresponds to the protein sequence SEQ ID NO.24. Example 6 Evaluation of the Interaction of the Robot-Fc L3 Protein with the Human SIit2 Protein

Cet exemple décrit l'interaction de la protéine de fusion Robot-Fc L3 avec la protéine SIit2 humaine (Slit-2-D2) par dosage ELISA. La protéine Slit-2-D2 humaine a été fixée sur des boites Immulon-4 enzyme-linked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Une gamme de concentration (de 1 pg/mL à 0.001 pg/mL) de la protéine de fusion Robot-Fc L3 a été ajouté puis détecté grâce à l'anticorps de chèvre anti-humain IgG conjugué à la péroxidase (Sigma ; réf. A0170-dilution au 1:50000). La révélation a été réalisée avec le substrat TMB-H2O2 (Interchim ; réf UP664780) et les mesures avec le lecteur de plaques à 450 nm. Les résultats obtenus sont reportés dans le tableau 9 ci-dessous. Tableau 9: Affinité de la protéine Robot-Fc L3 pour la protéine SIit2 - Comparaison avec la protéine Robot-Fc L1 Protéines étudiées EC50 CV (%) (pg/ml) Robot-Fc L1 0,13 3,3 Robot-Fc L3 0,17 4,4 Ces résultats montrent que les affinités des deux variants Robot-Fc L1 et Robo1-Fc L3 pour la protéine SIit2-D2 sont comparables. This example describes the interaction of the Robot-Fc L3 fusion protein with the human SIit2 protein (Slit-2-D2) by ELISA assay. Human Slit-2-D2 protein was fixed on Immulon-4 enzyme-linked plates (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). A concentration range (from 1 μg / mL to 0.001 μg / mL) of the Robot-Fc L3 fusion protein was added and then detected using peroxidase-conjugated goat anti-human IgG antibody (Sigma; A0170-1: 50000 dilution). Revelation was performed with the TMB-H2O2 substrate (Interchim, ref. UP664780) and measurements with the plate reader at 450 nm. The results obtained are reported in Table 9 below. Table 9: Affinity of the Robot-Fc L3 protein for the SIit2 protein - Comparison with the Robot-Fc L1 protein. Proteins studied EC50 CV (%) (μg / ml) Robot-Fc L1 0.13 3.3 Robot-Fc L3 0.17 4.4 These results show that the affinities of the two variants Robot-Fc L1 and Robo1-Fc L3 for the protein SIit2-D2 are comparable.

Exemple 7: Evaluation de l'activité de la protéine Robo-Fc sur la neovascularisation a. Modèle in vitro de co-culture de cellules endothéliales et de fibroblastes : activité spécifique de la molécule Robot-Fc L1 Le modèle d'angiogenèse in vitro correspond à un réarrangement de cellules endothéliales veineuses humaines sur une monocouche de fibroblastes de derme humain. Brièvement, les fibroblastes (Lonza) sont ensemencés dans des plaques de 24 puits (Becton Dickinson) à 40 000 cellules/puits dans 1 ml de milieu. Après 3 jours de prolifération (J3), des cellules endothéliales veineuses humaines (HUVEC- Lonza) sont ensemencées sur la monocouche de cellules fibroblastiques à 10 000 cellules/puits dans 500 pl de milieu EGM® (Endothelial Basal Medium, Lonza) + 2% SVF (sérum de veau foetal - Lonza) + hEGF (Epidermal Growth Factor Humaine Recombinante - Lonza) 10 pg/ml. Les cellules sont stimulées avec le VEGF (R&D Systems) 30 ng/ml, avec la molécule Robot-Fc L1 ou un contrôle négatif Robot-Fc Slit-2-moins à la concentration de 500pg/ml (J3 à J9). Après 3 jours, le milieu est remplacé et les puits sont stimulés en fonction des conditions de l'expérimentation. Après 2 jours, les cellules sont fixées par de l'éthanol et marquées avec un anticorps spécifique des HUVECs anti-CD31, suivi d'un anticorps anti-alkaline phosphaphatase puis révélés avec un substrat alkaline-phosphatase (J11). Une quantification des tubules marqués avec l'anticorps anti-CD31 est réalisée grâce à des acquisitions d'image faite au microscope (objectif X4) et l'analyse de la longueur des pseudo-tubules est effectuée à l'aide d'un logiciel d'image (BI000M-logiciel Visiolab 2000) (Figure 6). Example 7 Evaluation of Robo-Fc Protein Activity on Neovascularization a. In vitro model of co-culture of endothelial cells and fibroblasts: specific activity of the Robot-Fc L1 molecule The in vitro angiogenesis model corresponds to a rearrangement of human venous endothelial cells on a monolayer of human dermal fibroblasts. Briefly, fibroblasts (Lonza) are seeded in 24-well plates (Becton Dickinson) at 40,000 cells / well in 1 ml of medium. After 3 days of proliferation (J3), human venous endothelial cells (HUVEC-Lonza) are seeded on the monolayer of fibroblast cells at 10,000 cells / well in 500 μl of EGM® medium (Endothelial Basal Medium, Lonza) + 2% SVF (fetal calf serum - Lonza) + hEGF (Recombinant Human Epidermal Growth Factor - Lonza) 10 μg / ml. The cells are stimulated with VEGF (R & D Systems) 30 ng / ml, with the Robot-Fc L1 molecule or a negative control Robot-Fc Slit-2-less at the concentration of 500 μg / ml (J3 to J9). After 3 days, the medium is replaced and the wells are stimulated according to the conditions of the experiment. After 2 days, the cells are fixed with ethanol and labeled with an antibody specific for anti-CD31 HUVECs, followed by an anti-alkaline phosphaphatase antibody and then revealed with an alkaline-phosphatase substrate (J11). Quantitation of the tubules labeled with the anti-CD31 antibody is carried out by means of microscope image acquisitions (objective X4) and the analysis of the length of the pseudo-tubules is carried out with the aid of a computer software. image (BI000M-Visiolab 2000 software) (Figure 6).

Dans ce test d'angiogenèse in vitro, Robot-Fc L1 (500pg/ml) montre une activité inhibitrice de la formation des tubules formés par les HUVECs. Cette inhibition s'élève à 82% et elle est statistiquement significative par rapport à l'effet obtenu avec la molécule Robot-Fc Slit-2-moins (contrôle négatif). b. Modèle ex vivo d'anneau aortique de souris: activité spécifique de la molécule Robot-Fc L1 La molécule Robot-Fc L1 a été évaluée dans un modèle d'anneau aortique de souris. Brièvement, des aortes de souris sont prélevées et nettoyées et découpées en tronçon de 1 mm (JO). Ces anneaux sont inclus dans du collagène de rat en présence de VEGF à 10 ng/ml, de la molécule Robot-Fc L1 ou d'un contrôle négatif Robot-Fc Slit-2-moins à la concentration de 500pg/ml. Des tubules vont se former à partir de l'anneau mimant ainsi in vitro la formation de néovaisseaux. Après 6 jours, une quantification des tubules marqués est réalisée grâce à des acquisitions d'image faite au microscope (objectif X3) (Figure 7A) et l'analyse de la longueur des pseudo-tubules est effectuée à l'aide d'un logiciel d'image (BI000M-logiciel Visiolab 2000) (Figure 7). In this in vitro angiogenesis assay, Robot-Fc L1 (500 μg / ml) shows inhibitory activity of tubule formation formed by HUVECs. This inhibition amounts to 82% and is statistically significant compared to the effect obtained with the Robot-Fc Slit-2-less molecule (negative control). b. Ex vivo Model of Mouse Aortic Ring: Specific Activity of the Robot-Fc L1 Molecule The Robot-Fc L1 molecule was evaluated in a mouse aortic ring model. Briefly, mouse aorta are removed and cleaned and cut into a 1 mm (JO) section. These rings are included in rat collagen in the presence of VEGF at 10 ng / ml, the Robot-Fc L1 molecule or a negative control Robot-Fc Slit-2-less at a concentration of 500 μg / ml. Tubules will form from the ring thus mimicking in vitro the formation of neovessels. After 6 days, a quantification of the marked tubules is carried out thanks to microscope image acquisitions (objective X3) (FIG. 7A) and the analysis of the length of the pseudo-tubules is carried out using software image (BI000M-Visiolab 2000 software) (Figure 7).

Dans ces conditions expérimentales, Robot-Fc L1 (500pg/ml) montre une forte activité inhibitrice de la formation des tubules formés en comparaison avec la molécule Robot-Fc Slit-2-moins utilisée comme contrôle négatif. Ces résultats suggèrent que Robot-Fc L1 est capable d'inhiber la formation de néovaisseaux sans inhiber la prolifération des cellules endothéliales. Cette activité antiangiogénique liée à un défaut de maturation des vaisseaux est appelée « angiogenèse non-productive ». Exemple 8 : Evaluation de la protéine Robot-Fc L1 dans un modèle de tumeur pulmonaire chez la souris. La molécule Robot-Fc L1 a été évaluée dans un modèle de tumeur cancéreuse pulmonaire chez la souris C57/B16. a. Modèle murin de tumeur pulmonaire Pour établir le modèle murin de tumeur pulmonaire, des souris C57/B16 femelles âgées de 8 semaines ont été anesthésiées. La zone au niveau de l'omoplate gauche de la souris a été rasée et désinfectée. Une incision de 1 cm a été pratiquée au dessus de l'omoplate. Les cellules à injecter sont issues d'une lignée tumorale Lewis lung carcinoma (ATCC, CRL-1642). Les cellules ont été mélangées à du Matrigel® dans un rapport de 1 vol de Matrigel pour 4 vol de cellules .La concentration cellulaire était de 62500 cellules/mi. Les cellules ont été injectées dans le poumon à raison de 20pI par souris puis la plaie a été suturée. Under these experimental conditions, Robot-Fc L1 (500 μg / ml) shows a strong inhibitory activity of tubule formation formed in comparison with the Slit-2-less Robot-Fc molecule used as a negative control. These results suggest that Robot-Fc L1 is able to inhibit the formation of neovessels without inhibiting endothelial cell proliferation. This antiangiogenic activity related to a lack of maturation of the vessels is called "non-productive angiogenesis". Example 8 Evaluation of the Robot-Fc L1 Protein in a Mouse Tumor Model. The Robot-Fc L1 molecule was evaluated in a model of pulmonary cancer tumor in C57 / B16 mice. at. Murine lung tumor model To establish the murine lung tumor model, 8-week-old female C57 / B16 mice were anesthetized. The area at the left shoulder blade of the mouse has been shaved and disinfected. A 1 cm incision was made above the scapula. The cells to be injected come from a Lewis lung carcinoma (ATCC, CRL-1642) tumor line. The cells were mixed with Matrigel® at a ratio of 1 vol Matrigel to 4 vol of cells. The cell concentration was 62500 cells / ml. The cells were injected into the lung at the rate of 20 μl per mouse and then the wound was sutured.

Au bout de 23 jours, les souris ont été euthanasiées. La cage thoracique a été ouverte, le poumon gauche et la chaine médiastinale ont été prélevés. La tumeur présente sur le poumon gauche a été mesurée à l'aide d'un pied à coulisse électronique pour déterminer le volume tumoral selon la formule : 12xLx0.52. La chaine médiastinale est pesée. Les résultats sont exprimés en valeur moyenne ± ecart-type à la moyenne. L'analyse statistique a été faite par un test paramétrique de Student. b. Traitement des souris porteuses d'une tumeur pulmonaire avec la protéine recombinante Robot-Fc Le traitement à l'aide de la protéine Robot-Fc a été réalisé comme suit : Une préparation contenant la protéine Robot-Fc a été injectée à la dose de 25 mg/kg/jour par voie intrapéritonéale à J10, J14, J17, et J21 post injection des cellules tumorales. Le groupe contrôle a été injecté avec du tampon PBS (10m1/kg). c. Résultats A J23, le volume moyen des tumeurs obtenues dans le groupe traité avec la protéine recombinanate Robot-Fc etait de 21,45± 2,16 mm3 ; le volume moyen des tumeurs obtenues dans le groupe contrôle était de 39,93±8,41 mm3. La réduction du volume tumoral chez les animaux traités avec la protéine Robot-Fc est de 46%. Cette différence est statistiquement significative (p<0.05). Le poids moyen de la chaîne médiastinale (ganglions métastatiques) obtenue dans le groupe traité avec la protéine Robot-Fc est de 12.50± 1.26 mg. Le poids moyen de la chaîne médiastinale obtenue dans le groupe contrôle est de 30.67± 7.69 mg. La réduction du poids de la chaine médiastinale pour le groupe traité avec la protéine Robot-Fc est de 59% à la limite de la significativité (p=0.07). After 23 days, the mice were euthanized. The rib cage was opened, the left lung and the mediastinal chain were removed. The tumor on the left lung was measured using an electronic caliper to determine the tumor volume according to the formula: 12xLx0.52. The mediastinal chain is weighed. The results are expressed as mean value ± standard deviation at the mean. Statistical analysis was done by a Student parametric test. b. Treatment of mice carrying a pulmonary tumor with the recombinant Robot-Fc protein The treatment using the Robot-Fc protein was carried out as follows: A preparation containing the Robot-Fc protein was injected at a dose of 25 mg / kg / day intraperitoneally at D10, D14, D17, and D21 post injection of tumor cells. The control group was injected with PBS buffer (10 ml / kg). vs. Results At D23, the average volume of tumors obtained in the group treated with the Robot-Fc recombinanate protein was 21.45 ± 2.16 mm3; the mean tumor volume obtained in the control group was 39.93 ± 8.41 mm3. The reduction in tumor volume in animals treated with the Robot-Fc protein is 46%. This difference is statistically significant (p <0.05). The average weight of the mediastinal chain (metastatic lymph nodes) obtained in the group treated with the Robot-Fc protein is 12.50 ± 1.26 mg. The average weight of the mediastinal chain obtained in the control group is 30.67 ± 7.69 mg. The reduction in the weight of the mediastinal chain for the group treated with the Robot-Fc protein is 59% at the limit of significance (p = 0.07).

Exemple 9: Evaluation de la protéine Robot-Fc L1 dans un modèle d'hépatocarcinome humain chez la souris. La molécule Robot-Fc L1 a été évaluée dans un modèle d'hépatocarcinome humain chez la souris SCID. a. Modèle orthotopique d'hépatocarcinome humain chez la souris SCID. Example 9 Evaluation of the Robot-Fc L1 Protein in a Model of Human Hepatocarcinoma in the Mouse The Robot-Fc L1 molecule was evaluated in a model of human hepatocarcinoma in SCID mice. at. Orthotopic model of human hepatocarcinoma in SCID mice.

Les souris SCID femelles sont anesthésiées (avec un le mélange de kétamine/xylazine) et la zone d'incision est rasée. La peau est nettoyée et désinfectée avant de réaliser une incision sous-costale de l cm de la peau et de la paroi musculaire. Une partie du lobe du foie est délicatement extraite du péritoine afin de réaliser l'injection des cellules. Un volume de 50 pl de la suspension cellulaire (HepG2 provenant de ATCC, cellules d'hépatoblastome humain mélangées avec du Matrigel ® à 40.106cellules/mI) est injecté dans le lobe gauche. Le lobe est remplacé dans la cavité abdominale. Le péritoine est fermé avec de la colle chirurgicale puis la peau est suturée avec des agrafes. Les souris sont traitées avec le Robot-Fc solubilisé dans du PBS à 25 mg/kg, injection par la voie i.p. deux fois par semaine. Le traitement commence deux semaines après l'implantation des cellules. Quatre semaines après l'inoculation avec les cellules, les animaux sont sacrifiés pour l'autopsie. b.Traitement des souris porteuses d'un hépatocarcinome humain avec la protéine recombinante Robot-Fc Robot-Fc a été évalué dans ce modèle avec un traitement 2 fois par semaine à la dose de 25mg/kg. Le poids des souris est mesuré le premier et le dernier jour du protocole. Le poids des tumeurs a été mesuré 28 jours après l'injection des cellules après sacrifice des animaux. c. Résultats Le développement tumoral entraine une perte de poids importante des animaux témoins au cours du protocole alors que les animaux traités avec le Robot-Fc présentent un poids identique en fin d'expérimentation (Tableau 10). En fin d'expérimentation, après 4 injections par voie i.p. de Robot-Fc, le poids tumoral moyen du groupe traité Robo-1-Fc est significativement réduit de 30 % (p < 0.05) en comparaison avec le groupe témoin ayant reçu des injections de solvant (Figure 8).30 Tableau 10 : Poids des animaux en début et fin de protocole Poids moyen des souris (g) JO J28 Moyenne (+/- écart-type moyen) Contrôle (n=11) 19.24 ± 0.48 16.46 ± 0.54 Robot-Fc (n=13) 19.17 ± 0.31 19.07 ± 0.63 The female SCID mice are anesthetized (with a mixture of ketamine / xylazine) and the incision area is shaved. The skin is cleaned and disinfected before making a subcostal incision of 1 cm of skin and muscle wall. Part of the lobe of the liver is gently extracted from the peritoneum to perform the injection of the cells. A volume of 50 μl of the cell suspension (HepG2 from ATCC, human hepatoblastoma cells mixed with Matrigel ® at 40 × 10 6 cells / ml) is injected into the left lobe. The lobe is replaced in the abdominal cavity. The peritoneum is closed with surgical glue and then the skin is sutured with staples. The mice are treated with the solubilized Robot-Fc in PBS at 25 mg / kg, injection by the i.p. twice a week. The treatment begins two weeks after the implantation of the cells. Four weeks after inoculation with the cells, the animals are sacrificed for autopsy. b.Treatment of mice bearing human hepatocarcinoma with the recombinant Robot-Fc Robot-Fc protein was evaluated in this model with treatment twice a week at a dose of 25 mg / kg. The weight of the mice is measured on the first and the last day of the protocol. The tumor weight was measured 28 days after the injection of the cells after sacrifice of the animals. vs. Results The tumor development causes a significant weight loss of the control animals during the protocol whereas the animals treated with Robot-Fc have an identical weight at the end of the experiment (Table 10). At the end of the experiment, after 4 injections by i.p. of Robot-Fc, the mean tumor weight of the Robo-1-Fc treated group was significantly reduced by 30% (p <0.05) compared with the control group that received solvent injections (Figure 8). Table 10: Weight animals at the beginning and end of protocol Mean mouse weight (g) OJ J28 Mean (+/- average standard deviation) Control (n = 11) 19.24 ± 0.48 16.46 ± 0.54 Robot-Fc (n = 13) 19.17 ± 0.31 19.07 ± 0.63

Claims

REVENDICATIONS1. A recombinant Robot-Fc protein comprising the extracellular domain of a Robot protein or a portion thereof, a linker and an Fc domain, wherein said extracellular domain is from the isoform b of the Robot protein.

The protein of claim 1, wherein the extracellular domain of Robot comprises Ig1 and Ig2 immunoglobulin domains.

3. Protein according to claim 2, wherein the extracellular domain of Robot has at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO.2.

4. Protein according to one of the preceding claims wherein the Fc domain is derived from human immunoglobulin G4.

5. Protein according to claim 4 wherein the Fc domain comprises mutations S241 P and L248E and in which lysine located in the C-terminal position is absent.

6. Protein according to one of claims 1 to 4, the sequence has at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO.6 or SEQ ID NO. 24.

7. Molecule of nucleic acids corresponding to the sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 23 or having at least 80% identity with the molecules having as SEQ sequence ID NO.1, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.5 or SEQ ID NO.23.

8. Robot-Fc recombinant protein for treating diseases in which a protein of the Slit family is overexpressed.

Protein according to claim 8 for treating cancer.

10. Protein according to one of claims 8 or 9 which does not inhibit the proliferation of endothelial cells.

11. Protein according to one of claims 8 to 10 for treating lung cancer 26

12. Protein according to one of claims 8 to 10 for treating liver cancer.

13. Protein according to one of claims 8 to 11, this protein derived from the isoform b of the Robot protein.

14. Protein according to claim 13, this protein being as defined in claims 2 to 6.

15. A pharmaceutical composition comprising a recombinant Robot-Fc protein as defined in claims 1 to 6 and at least one excipient.