FR2824073A1 - Template-mediated, ligation-oriented method for randomly shuffling polynucleotide (e.g. DNA shuffling), genetic recombination or molecular breeding, by adjacently hybridizing at least two fragments on an assembly template - Google Patents
Template-mediated, ligation-oriented method for randomly shuffling polynucleotide (e.g. DNA shuffling), genetic recombination or molecular breeding, by adjacently hybridizing at least two fragments on an assembly template Download PDFInfo
- Publication number
- FR2824073A1 FR2824073A1 FR0105573A FR0105573A FR2824073A1 FR 2824073 A1 FR2824073 A1 FR 2824073A1 FR 0105573 A FR0105573 A FR 0105573A FR 0105573 A FR0105573 A FR 0105573A FR 2824073 A1 FR2824073 A1 FR 2824073A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- fragments
- polynucleotide sequences
- polynucleotide
- sequences
- ligation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
- C12N15/1027—Mutagenizing nucleic acids by DNA shuffling, e.g. RSR, STEP, RPR
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
revendication 23.claim 23.
PROCÉDÉ DE CREATION IN VITRO DE SEQUENCES METHOD FOR IN VITRO CREATION OF SEQUENCES
POLYNUCLEOTIDIQUES RECOMBINEES PAR LIGATION ORIENTEE POLYNUCLEOTIDE RECOMBINANT BY ORIENTED LIGATION
La présente invention se rapporte à une méthode d'obtention in vitro de séquences polynucléotidiques recombinées par ligation orientée. L'invention vise tout particulièrement à générer puis sélectionner des séquences polynucléotidiques susceptibles de présenter une ou plusieurs propriétés avantageuses par rapport aux propriétés correspondantes de séquences de référence et donc capables de conférer un phénotype amélioré et/ou de The present invention relates to a method for obtaining in vitro recombinant polynucleotide sequences by oriented ligation. The invention particularly aims to generate and then select polynucleotide sequences capable of having one or more advantageous properties compared to the corresponding properties of reference sequences and therefore capable of imparting an improved phenotype and / or
produire des protéines améliorées. produce improved proteins.
On entend par séquence de référence une séquence ayant des propriétés proches de celles recherchées. On ent end par in vitro tout événement, réaction By reference sequence is meant a sequence having properties close to those sought. Any event, reaction is understood by in vitro
ou procédé qui n'a pas lieu dans un organisme vivant. or process that does not take place in a living organism.
On entend par ligation un procédé qui permet de créer une liaison phosphodiester entre deux fragments By ligation is meant a process which makes it possible to create a phosphodiester bond between two fragments
d'acides nucléiques.nucleic acids.
On entend par ligation orientée tout procédé de ligation qui permet d'assembler dans un ordre déterminé des molécules d'acides nucléiques, notamment par hybridation desdites molécules d'acides nucléiques sur au moins une By oriented ligation is meant any ligation method which makes it possible to assemble nucleic acid molecules in a determined order, in particular by hybridization of said nucleic acid molecules on at least one
matrice nucléotidique.nucleotide matrix.
On entend par séquence polynucléotidique toute By polynucleotide sequence is meant any
molécule d'acide nucléique simple ou double brin. single or double stranded nucleic acid molecule.
Différentes techniques ont été développées pour favoriser la recombinaison in vitro entre différentes séquences polynucléotidiques, parmi celles-ci on peut citer plus particulièrement le DNA-Shuffling et le StEP toutes Different techniques have been developed to promote in vitro recombination between different polynucleotide sequences, among these there may be mentioned more particularly DNA-Shuffling and StEP all
deux fondées sur l'utilisation de la PCR. two based on the use of PCR.
Le DNA-Shuffling comporte deux étapes, la fragmentation aléatoire par la DNAse I de séquences polynucléotidiques, et une amplification par PCR dans laquelle les fragments précédemment générés servent d'amorces. A chaque étape d'hybridation, le changement de matrice provoque des recombinaisons au niveau des régions ayant des séquences homologues. Le StEP consiste à mélanger différentes séquences polynucléotidiques contenant diverses mutations en présence d'une paire d'amorces. Ce mélange est soumis à une réaction de type PCR dans laquelle les étapes d'hybridation et de polymérisation sont regroupées en une seule étape de très courte durée. Ces conditions permettent l'hybridation des amorces mais diminuent la vitesse de polymérisation, de facon à ce que les fragments qui sont partiellement synthétisés sthybrident aléatoirement sur les séquences polynucléotidiques portant les différentes mutations, permettant ainsi la recombinaison. Dans chacune de ces deux méthodes, l'étape de polymérisation est indispensable au processus de recombinaison. Ainsi, en fonction des polymérases choisies, cette étape de polymérisation peut être génératrice de mutations supplémentaires non souhaitées. En outre, à partir d'un certain nombre de cycles, le DNA- Shuffling et le StEP reposent sur le principe de l'hybridation d'une "méga amorce" sur une matrice, ce qui entraîne probablement des difficultés de mise en oeuvre pour des séquences DNA-Shuffling comprises two stages, the random fragmentation by DNAse I of polynucleotide sequences, and an amplification by PCR in which the fragments previously generated serve as primers. At each hybridization step, the change of matrix causes recombinations at the level of regions having homologous sequences. StEP consists of mixing different polynucleotide sequences containing various mutations in the presence of a pair of primers. This mixture is subjected to a PCR type reaction in which the hybridization and polymerization steps are combined into a single step of very short duration. These conditions allow the hybridization of the primers but decrease the rate of polymerization, so that the fragments which are partially synthesized randomly hybridize on the polynucleotide sequences carrying the different mutations, thus allowing recombination. In each of these two methods, the polymerization step is essential to the recombination process. Thus, depending on the polymerases chosen, this polymerization step can generate additional unwanted mutations. In addition, from a certain number of cycles, DNA-Shuffling and StEP are based on the principle of hybridization of a "mega primer" on a matrix, which probably leads to implementation difficulties for sequences
polynucléotidiques dont la taille est supérieure à 1,5 Kpb. polynucleotides whose size is greater than 1.5 Kbp.
Enfin, ces deux techniques ne permettent pas de contrôler le taux de recombinaisons, puisque celles-ci se font aléatoirement au cours des étapes successives de polymérisation. La présente invention vise précisément à palier les inconvénients ci-dessus en offrant une méthode simple de préparation d'au moins une séquence polynucléotidique recombinée, en utilisant un procédé de ligation orientée de fragments obtenus à partir d'une banque de séquences polynucléotidiques. On entend par banque de séquences polynucléotidiques un ensemble de séquences polynucléotidiques contenant au moins deux séquences Finally, these two techniques do not make it possible to control the rate of recombinations, since these are carried out randomly during the successive stages of polymerization. The present invention aims precisely to overcome the above drawbacks by providing a simple method for preparing at least one recombinant polynucleotide sequence, using a method of oriented ligation of fragments obtained from a library of polynucleotide sequences. By polynucleotide sequence bank is meant a set of polynucleotide sequences containing at least two sequences
polynucléotidiques hétérologues.heterologous polynucleotides.
Dans une forme de mise en _uvre de l' invention, ce but est atteint grâce à un procédé comprenant les étapes suivantes: a) la fragmentation d'une banque de séquences polynucléotidiques, b) la dénaturation des fragments ainsi obtenus, c) l'hybridation de fragments obtenus à l'étapes (b) avec une ou plusieurs matrice(s) d'assemblage, d) la ligation orientée desdits fragments pour obtenir au moins une séquence polynucléotidique recombinée, Lorsque la matrice d'assembalge est double brin, elle est préalablement dénaturce avant l'étape (c) In one form of implementation of the invention, this object is achieved by a process comprising the following steps: a) fragmentation of a library of polynucleotide sequences, b) denaturation of the fragments thus obtained, c) hybridization of fragments obtained in steps (b) with one or more assembly matrix (s), d) oriented ligation of said fragments to obtain at least one recombinant polynucleotide sequence, When the assembly matrix is double strand, it is previously denatured before step (c)
comme par exemple au cours de l'étape (b). as for example during step (b).
Le procédé de l 'invention permet de recombiner de manière aléatoire différents fragments au cours des étapes (b), (c) et (d) au sein d'une séquence polynucléotidique. Ce procédé reproduit donc in vitro les phénomènes de recombinaison qui peuvent se produire in vivo en les favorisant. Le procédé de l' invention est donc tout particulièrement intéressant pour recombiner des séquences polynucléotidiques entre elles afin de générer de nouvelles séquences polynucléotidiques Ces séquences polynucléotidiques recombinées sont susceptibles de présenter des propriétés avantageuses par rapport aux propriétés correspondantes de séquences de référence et donc capables de conférer un phénotype The method of the invention makes it possible to randomly recombine different fragments during steps (b), (c) and (d) within a polynucleotide sequence. This process therefore reproduces in vitro the recombination phenomena that can occur in vivo by promoting them. The process of the invention is therefore particularly advantageous for recombining polynucleotide sequences with one another in order to generate new polynucleotide sequences. These recombined polynucleotide sequences are capable of exhibiting advantageous properties compared to the corresponding properties of reference sequences and therefore capable of conferring a phenotype
amélioré et/ou de produire des protéines améliorées. improved and / or produce improved proteins.
Ce but est atteint grâce à un procédé comprenant les étapes suivantes: a) la fragmentation d'une banque de séquences polynucléotidiques, b) la dénaturation des fragments, c) l'hyEridation de fragments obtenus à l'étape (b) avec une ou plusieurs matrice(s) d'assemblage, d) la ligation orientée desdits fragments pour obtenir au moins une séquence polynucléotidique recombinée, e) la sélection des séquences polynucléotidiques recombinées présentant des propriétés avantageuses par rapport aux propriétés correspondantes à This object is achieved by a process comprising the following steps: a) fragmentation of a library of polynucleotide sequences, b) denaturation of the fragments, c) hybridization of fragments obtained in step (b) with one or more several assembly matrix (s), d) the oriented ligation of said fragments to obtain at least one recombined polynucleotide sequence, e) the selection of the recombinant polynucleotide sequences having advantageous properties compared to the properties corresponding to
une ou plusieurs séquences de référence. one or more reference sequences.
La ou les matrice(s) d'assemblage peuvent-être simple ou double brin. Dans le cas ou l'une de ces matrices est double brin, elle est préalablement dénaturée pour être ajoutée sous forme simple brin à l'étape (c) comme par The assembly matrix (s) may be single or double strand. In the case where one of these matrices is double stranded, it is previously denatured to be added in single stranded form in step (c) as by
exemple au cours de l'étape (b).example during step (b).
Le procédé de l'invention peut comprendre à l'issue de l'étape (e) la répétition des étapes (a), (b), (c) et (d). Dans ce cas, la banque de séquences polynucléotidiques contient au moins une séquence The method of the invention can comprise at the end of step (e) the repetition of steps (a), (b), (c) and (d). In this case, the polynucleotide sequence bank contains at least one sequence
polynucléotidique recombinée qui a été sélectionnée en (e). recombinant polynucleotide which has been selected in (e).
Le procédé de l' invention peut aussi comprendre à l'issue de l'étape (d) et avant l'étape (e), la répétition des étapes (b), (c) et (d), ou des étapes (a), The method of the invention can also comprise at the end of step (d) and before step (e), the repetition of steps (b), (c) and (d), or of steps (a )
(b), (c) et (d).(b), (c) and (d).
Ce dernier mode de réalisation est particulièrement utile dans le cas o à l' issue de l'étape (d) tous les fragments ne sont pas ligués. Dans ce cas, le procédé de l' invention comprend en outre, à la fin de l'étape (d) et avant l'étape (e), un ou plusieurs cycles des réactions suivantes: dénaturation des fragments ligués et non ligués issus de l'étape (d), éventuellement en présence d'une ou plusieurs matrice(s) d'assemblage, hybridation desdits fragments avec une ou plusieurs matrice(s) d'assemblage si celle(s)-ci n'est (ne sont) pas présente(s) lors de la dénaturation, This last embodiment is particularly useful in the case where at the end of step (d) not all of the fragments are ligated. In this case, the process of the invention also comprises, at the end of step (d) and before step (e), one or more cycles of the following reactions: denaturation of the ligated and non-ligated fragments originating from step (d), optionally in the presence of one or more assembly matrix (s), hybridization of said fragments with one or more assembly matrix (s) if this (these) is (are not ) not present during denaturing,
- ligation desdits fragments.- ligation of said fragments.
Ces réactions de dénaturation, hybridation et ligation, sont équivalentes aux étapes (b), (c) et (d), mais réalisées non pas avec les fragments de l'étape (a) mais avec les fragments ligués et non ligués issus de These denaturation, hybridization and ligation reactions are equivalent to steps (b), (c) and (d), but carried out not with the fragments of step (a) but with the ligated and non-ligated fragments originating from
l'étape (d).step (d).
Selon une forme de mise en _uvre paticulière du procédé, les séquences polynucléotidiques de la banque sont simple brin. L'usage de fragments d'ADN simple brin est particulièrement adapté à la recombinaison de familles de gènes pour lesquelles une matrice simple brin donnée ou un mélange de matrices simple brin différentes seront hybridées à des fragments simple brin issus d'une banque de gènes homologues. Puisqu'il n'y a pas de séquences strictement complémentaires entre elles parmi la population de fragments, l'hybridation ne sera pas biaisée vers les séquences sauvages entre les fragments ou entre fragments et matrices. La température d'hybridation peut alors être ajustée en fonction du degré d'homologie entre les séquences, générant ainsi des molécules recombinées avec le degré de recombinaison le plus élevé possible. Des banques de molécules recombinées sont ainsi créées, avec une meilleure valeur en terme de diversité, augmentant considérablement les chances de trouver le bon mutant a According to a particular implementation of the method, the polynucleotide sequences of the library are single strand. The use of single-stranded DNA fragments is particularly suitable for the recombination of gene families for which a given single-stranded template or a mixture of different single-stranded templates will be hybridized to single-stranded fragments from a homologous gene bank. . Since there are no strictly complementary sequences between them among the population of fragments, the hybridization will not be biased towards the wild sequences between the fragments or between fragments and matrices. The hybridization temperature can then be adjusted according to the degree of homology between the sequences, thus generating recombinant molecules with the highest possible degree of recombination. Banks of recombinant molecules are thus created, with a better value in terms of diversity, considerably increasing the chances of finding the right mutant a
l'issue du minimum de cycles de recombinaison. the outcome of the minimum number of recombination cycles.
Pour obtenir des molécules simple brin d'ADN, un phagemide de type Bluescript ou un vecteur de la famille To obtain single stranded DNA molecules, a Bluescript phagemid or a vector of the family
des phages filamenteux comme M13mpl8 peuvent être utilisés. filamentous phages like M13mpl8 can be used.
Une autre facon de procéder consiste à générer des molécules double brin par PCR en utilisant une amorce phosphorylée en 5' et l'autre non phosphorylée. La digestion par l'exonucléase du phage lambda détruira les brins d'ADN phosphorylés en 5', laissant les brins non phosphorylés intacts. Une autre méthode de génération de moléaules simple brin consiste à faire une amplification Another way to proceed is to generate double stranded molecules by PCR using a 5 'phosphorylated primer and the other non-phosphorylated. Digestion by phage lambda exonuclease will destroy the 5 'phosphorylated DNA strands, leaving the unphosphorylated strands intact. Another method of generating single-stranded molecules is to amplify
par PCR assymétrique à partir d'une matrice d'ADN méthylée. by asymmetric PCR from a methylated DNA template.
La digestion par Dpn I détruira les brins méthylés, laissant intacts les produits de l'amplification qui pourront alors être purifiés après dénaturation. Selon une forme particulière de réalisation, le procédé de l' invention comprend à l' issue de l'étape (e) le choix d'au moins une séquence polynucléotidique recombinée pour effectuer au moins une répétition des étapes (a), (b), Digestion with Dpn I will destroy the methylated strands, leaving the amplification products intact which can then be purified after denaturation. According to a particular embodiment, the method of the invention comprises at the end of step (e) the choice of at least one recombined polynucleotide sequence to perform at least one repetition of steps (a), (b) ,
(c), (d) et (e).(c), (d) and (e).
Le procédé de l' invention peut comprendre en outre, une ou plusieurs des étapes suivantes: - la séparation des séquences polynucléotidiques recombinées de la ou des matrice(s) d'assemblage avant l'étape (e), l'amplification des séquences The method of the invention can also comprise one or more of the following steps: - the separation of the recombinant polynucleotide sequences from the assembly matrix (s) before step (e), the amplification of the sequences
polynualéctidiques recombinces avant l'étape (e). recombinant polynualctidics before step (e).
- le clonage de séquences polynualéotidiques recombinées éventuellement après séparation des brins recombinés de la ou des matrices Dans une forme de mise en _uvre avantageuse de la méthode, les extrémités des fragments générés à l'étape (a) sont telles qu'il peut y avoir hybridation adjacente de ces extrémités au moins à une matrice dassemblage à létape (c) et ligation de ces fragments les uns avec les autres à l'étape (d). Les séquences polynucléotidiques de la banque sur laquelle le procédé de l' invention est effectué doivent être telles que les fragments obtenus au cours du procédé présentent des extrémités telles que décrites ci-dessus. Ces fragments peuvent être notamment obtenus au cours de l'étape (a), ou au cours de l'étape (d) - Cloning of recombined polynualotide sequences possibly after separation of the recombined strands from the template (s) In an advantageous form of implementation of the method, the ends of the fragments generated in step (a) are such that there may be adjacent hybridization of these ends at least to an assembly matrix in step (c) and ligation of these fragments with each other in step (d). The polynucleotide sequences of the library on which the process of the invention is carried out must be such that the fragments obtained during the process have ends as described above. These fragments can be obtained in particular during step (a), or during step (d)
par ligation de fragments.by ligation of fragments.
Une forme de mise en oeuvre avantageuse du procédé de l' invention consiste à réaliser simultanément les étapes (c) et (d) selon une réaction dite de RLR pour An advantageous form of implementation of the process of the invention consists in simultaneously carrying out steps (c) and (d) according to a so-called RLR reaction for
l'expression anglaise de "Recombining Ligation Reaction". the English expression of "Recombining Ligation Reaction".
Outre les avantages indiqués précédemment, le procédé de l' invention est remarquable en ce qu'il favorise et accélère la recombinaison aléatoire in vitro de séquences polynucléotidiques, ces séquences polynucléotidiques pouvant être des gènes. On entend par gène un fragment ou une séquence d'ADN associée à une fonction biologique. Un gène peut être obtenu de différentes façons, dont la synthèse chimique, la synthèse par polymérisat ion ou par extraction dudit gène à part i r In addition to the advantages indicated above, the process of the invention is remarkable in that it promotes and accelerates the random in vitro recombination of polynucleotide sequences, these polynucleotide sequences possibly being genes. By gene is meant a DNA fragment or sequence associated with a biological function. A gene can be obtained in various ways, including chemical synthesis, synthesis by polymerization or by extraction of said gene apart from i r
d'une source d'acides nucléiques.from a source of nucleic acids.
La recombinaison in vi tro des séquences polynucléotidiques de la banque initiale par le procédé de l' invention permet donc d'obtenir une nouvelle banque contenant des séquences ayant acquis une ou plusieurs caractéristiques des séquences de la banque précédente. Le procédé de l' invention constitue donc une technique The in vi tro recombination of the polynucleotide sequences of the initial library by the method of the invention therefore makes it possible to obtain a new library containing sequences having acquired one or more characteristics of the sequences of the preceding library. The process of the invention therefore constitutes a technique
d'évolution in vitro.in vitro evolution.
Le procédé de l' invention constitue une alternative à la PCR recombinatoire tel le que mise en oeuvre dans les techniques de DNA shuffling ou de StEP, puisqu'il ne nécessite pas d'étape de polymérisation in vi tro pour aboutir à la recombinaison. Au contraire, l'étape clef du procédé de l' invention est l'étape (d) de ligation sur une matrice d' assemblage (ou ligation orientée), ce qui assure un très haut degré de fidélité au The method of the invention constitutes an alternative to recombinant PCR such as that implemented in DNA shuffling or StEP techniques, since it does not require an in vitro polymerization step to achieve recombination. On the contrary, the key step of the process of the invention is step (d) of ligation on an assembly matrix (or oriented ligation), which ensures a very high degree of fidelity to the
cours des événements de recombinaison. during recombination events.
Le procédé de l 'invention est remarquable en ce qu'il permet d' augmenter considérablement l'efficacité du réassemblage des fragments à liguer en utilisant la ligation orientée. En effet, dans le cas d'une séquence découpée en n fragments, il existe de très nombreuses possibilités de réassociation des fragments en utilisant un procédé de ligation classique (sans utilisation d'une matrice de réassemblage qui oriente la ligation), parmi lesquelles une seule forme est intéressante. Dans le cas du procédé de l 'invention, la ligation est orientée par la matrice d'assemblage, ce qui permet d'obtenir directement The method of the invention is remarkable in that it makes it possible to considerably increase the efficiency of reassembly of the fragments to be ligated by using oriented ligation. Indeed, in the case of a sequence cut into n fragments, there are very numerous possibilities of reassembly of the fragments using a conventional ligation method (without the use of a reassembly matrix which guides the ligation), among which a only form is interesting. In the case of the process of the invention, the ligation is oriented by the assembly matrix, which makes it possible to obtain directly
la seule forme intéressante.the only interesting form.
La fragmentation de ces séquences polynucléotidiques à l'étape (a) peut se faire soit de The fragmentation of these polynucleotide sequences in step (a) can be done either
manière contrôlée, soit de manière aléatoire. controlled manner, or randomly.
Dans le cas d'une fragmentation réalisée de manière contrôlée, la fragmentation permet de maîtriser avec précision le degré de recombinaison voulu et la position des points de recombinaison. Selon une forme de réalisation préférce du procédé de l'invention, l'étape (a) consiste à soumettre les séquences polynucléotidiques de la banque à une hydrolyse par l' action d'une ou plusieurs enzymes de restriction. Ainsi, dans une forme de mise en _uvre particulière du procédé de l' invention, le degré de recombinaison et la position des points de recombinaison des séquences polynucléotidiques recombinées sont In the case of fragmentation carried out in a controlled manner, the fragmentation makes it possible to precisely control the degree of recombination desired and the position of the recombination points. According to a preferred embodiment of the method of the invention, step (a) consists in subjecting the polynucleotide sequences of the library to hydrolysis by the action of one or more restriction enzymes. Thus, in a particular embodiment of the process of the invention, the degree of recombination and the position of the recombination points of the recombined polynucleotide sequences are
déterminés par la fragmentation de l'étape (a). determined by the fragmentation of step (a).
Ainsi, plus le nombre de fragments générés par séquence est grand, plus le nombre de fragments nécessaires pour recomposer une séquence est élevé, ce qui entraîne un taux de recombinaison élevé. En outre, la nature et la position des extrémités des fragments générés dans ce mode de réalisation du procédé de l' invention peuvent être connues et contrôlées, ce qui permet: - de contrôler avec précision les zones o la recombinaison a lieu, ou - d'induire la recombinaison entre des séquences polynucléotidiques, par exemple des gènes, si les extrémités des fragments sont créées dans des zones d'homologie entre ces séquences, ou des zones d'homologies Thus, the greater the number of fragments generated per sequence, the greater the number of fragments necessary to recompose a sequence, which results in a high recombination rate. In addition, the nature and the position of the ends of the fragments generated in this embodiment of the process of the invention can be known and controlled, which makes it possible: - to precisely control the zones where the recombination takes place, or - d induce recombination between polynucleotide sequences, for example genes, if the ends of the fragments are created in areas of homology between these sequences, or areas of homologies
entre ces séquences et la ou les matrices d' assemblage. between these sequences and the assembly matrix (s).
Dans le cas d'une fragmentation aléatoire, tout moyen euzymatique ou mécanique connu de l'homme de métier capable de couper aléatoirement l'ADN pourra être utilisé, comme par exemple une digestion par la Dnase I ou une sonication. Le procédé de l' invention permettant d' augmenter considérablement l'efficacité de réassemblage des fragments à liguer, il peut donc être appliqué à l' orientation de la ligation multi-moléaulaire à bouts francs. Dans cette application, on utilise comme matrice d'assemblage aux étapes (b) ou (c) des oligonucléotides simple ou double brin juste complémentaires de l'extrémité 3' d'un fragment et 5' du fragment adjacent, ce qui permet l'hybridation adjacente de ces deux extrémités sur la même matrice après l'étape de dénaturation. Une fois hybridées, les extrémités des fragments peuvent être liguées entre elles de fa,con à orienter le sens de ligation des fragments à bout francs. La même approche peut être envisagée pour In the case of random fragmentation, any euzymatic or mechanical means known to those skilled in the art capable of randomly cutting DNA may be used, such as for example digestion with Dnase I or sonication. Since the method of the invention makes it possible to considerably increase the efficiency of reassembly of the fragments to be ligated, it can therefore be applied to the orientation of multi-molar ligation with free ends. In this application, as assembly matrix in steps (b) or (c), single or double-stranded oligonucleotides are used which are just complementary to the 3 ′ end of a fragment and 5 ′ of the adjacent fragment, which allows the adjacent hybridization of these two ends on the same matrix after the denaturation step. Once hybridized, the ends of the fragments can be ligated together so as to orient the direction of ligation of the blunt-ended fragments. The same approach can be considered for
l 'orientation de la ligation de fragments à bouts cohésifs. the orientation of the ligation of fragments with cohesive ends.
Une mise en _uvre toute préférée du procédé de l'invention consiste à ajouter des enzymes capables, à l'étape (c) et/ou à l'étape (d), de reconnaître et de dégrader et/ou couper de manière spécifique les extrémités non hybridées de fragments, lorsque celles-ci recouvrent d'autres fragments hybridés sur la même matrice. Un exemple préféré de ce type d' enzyme est l'euzyme Flap endonucléase. Une mise en _uvre particulière du procédé de l' invention consiste donc à utiliser des enzymes du type Flap endonucléases lorsque les fragments générés à l'étape (a) peuvent se recouvrir lors de l'hyEridation sur la A very preferred implementation of the process of the invention consists in adding enzymes capable, in step (c) and / or in step (d), of recognizing and degrading and / or cutting specifically the non-hybridized ends of fragments, when these cover other hybridized fragments on the same matrix. A preferred example of this type of enzyme is the enzyme Flap endonuclease. A particular implementation of the process of the invention therefore consists in using enzymes of the Flap endonuclease type when the fragments generated in step (a) can overlap during hybridization on the
matrice d'assemblage à l'étape (c). assembly matrix in step (c).
Ainsi, lors de l'hybridation de fragments d'ADN sur une matrice, ces euzymes ont pour propriété de reconnaître et de couper de manière spécifique les extrémités non hybridées de ces fragments, lorsque celles ci recouvrent d'autres fragments hybridés sur la même matrice. Lorsque les fragments utilisés au cours du procédé de l' invention sont double brin, une forme particulière de l'invention consiste à utiliser des Thus, during the hybridization of DNA fragments on a matrix, these euzymes have the property of recognizing and specifically cutting the non-hybridized ends of these fragments, when these cover other fragments hybridized on the same matrix . When the fragments used during the process of the invention are double stranded, a particular form of the invention consists in using
enzymes de type exonucléase spécifiques du simple brin. single strand specific exonuclease enzymes.
Ces enzymes auront pour propriété de reconnaître et de dégrader de manière spécifique les extrémités simple brin non hybridées de ces fragments, lorsque celles-ci recouvrent d'autres fragments hybridés sur la même matrice. Au cours de l'étape (c) d'hybridation, l'utilisation de ce type d'euzymes (notamment Flap, ou exonucléase spécifique du simple brin) permet donc d' augmenter le nombre d'extrémités adjacentes pouvant être liguées à l'étape (d), ce qui est particulièrement important dans le cas de fragments obtenus par coupure aléatoire, car ces fragments présentent des zones de recouvrement les uns avec les autres lorsqu'ils These enzymes will have the property of recognizing and degrading in a specific manner the non-hybridized single-strand ends of these fragments, when these cover other fragments hybridized on the same matrix. During step (c) of hybridization, the use of this type of enzymes (in particular Flap, or single strand specific exonuclease) therefore makes it possible to increase the number of adjacent ends which can be ligated to the step (d), which is particularly important in the case of fragments obtained by random cutting, since these fragments have overlapping zones with each other when they
s'hyDrident sur la matrice d'assemblage. is hybridized on the assembly matrix.
Dans une mise en _uvre particulière du procédé de l 'invention utilisant une ligase active à haute température et préférentiellement thermostable à l'étape (d), les euzymes capables de reconnaître et/ou de couper de manière spécifique les extrêmités non hybridées des fragments, ajoutées à l'étape (c) et/ou à l'étape (d) auront les mêmes propriétés de thermorésistance et In a particular implementation of the process of the invention using a ligase active at high temperature and preferably thermostable in step (d), the enzymes capable of recognizing and / or cutting specifically the non-hybridized ends of the fragments, added in step (c) and / or in step (d) will have the same heat resistance properties and
d'activité à haute température que ladite ligase. activity at high temperature than said ligase.
La banque de séquences polynucléotidiques sur laquelle est effectuée le procédé de l' invention peut être générce par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple à partir d'un gène sauvage par étapes de mutagénèse dirigée successives, par PCR "error prone " (2), par mutagénèse aléatoire chimique, par mutagénèse aléatoire in vivo, ou en combinant des gènes de familles proches ou distinctes au sein de la même espèce ou d'espèces différentes de façon à disposer d'une variété de séquences The polynucleotide sequence bank on which the process of the invention is carried out can be generated by any method known to those skilled in the art, for example from a wild-type gene by successive directed mutagenesis steps, by PCR "error prone "(2), by chemical random mutagenesis, by random mutagenesis in vivo, or by combining genes from close or distinct families within the same or different species so as to have a variety of sequences
polynucléotidiques dans ladite banque. polynucleotides in said bank.
Parmi ces techniques, l' invention envisage plus particulièrement, un procédé dans lequel la banque de séquences polynucléotidiques est obtenue par une réaction de polymérisation en chaîne réalisée dans des conditions qui permettent de créer des mutations ponctuelles aléatoires. La banque initiale de séquences polynucléotidiques peut être constituée de séquences synthétiques qui seront fragmentées à l'étape (a) ou qui Among these techniques, the invention more particularly contemplates a method in which the polynucleotide sequence bank is obtained by a polymerase chain reaction carried out under conditions which make it possible to create random point mutations. The initial library of polynucleotide sequences can consist of synthetic sequences which will be fragmented in step (a) or which
peuvent constituer les fragments de l'étape (a). may constitute the fragments of step (a).
Selon une forme de réalisation préférée du procédé de l' invention, l 'étape (a) consiste à soumettre les séquences polynucléotidiques de la banque à une hydrolyse par l' action d'une ou plusieurs enzymes de restriction. Pour accroître le degré de recombinaison généré par le procédé de l'invention, il suffit d' augmenter le nombre de fragments de restriction en utilisant des enzymes de restriction ayant un grand nombre de sites de coupure sur les séquences polynucléotidiques de la banque, ou en combinant plusieurs enzymes de restriction. Dans le cas de l'utilisation d'une ligase thermostable et thermoactive, la taille du plus petit fragment ainsi généré sera avantageusement supérieure ou égale à 40 b ou 40 pb, afin de conserver une température d'hybridation compatible avec celle de l'étape (d) de ligation qui est généralement de According to a preferred embodiment of the method of the invention, step (a) consists in subjecting the polynucleotide sequences of the library to hydrolysis by the action of one or more restriction enzymes. To increase the degree of recombination generated by the process of the invention, it suffices to increase the number of restriction fragments by using restriction enzymes having a large number of cleavage sites on the polynucleotide sequences of the library, or by combining several restriction enzymes. In the case of the use of a thermostable and thermoactive ligase, the size of the smallest fragment thus generated will advantageously be greater than or equal to 40 b or 40 bp, in order to maintain a hybridization temperature compatible with that of the step (d) ligation which is generally
l'ordre de 65 C.around 65 C.
L'étape (a) peut encore être réalisée en générant une banque de fragments par traitement aléatoire euzymatique ou mécanique. En particulier, l'étape (a) peut consister en un traitement aléatoire avec la DNAse I d'une banque de séquences polynucléotidiques. Dans le cas o l'on utilise à l'étape (a) une fragmentation enzymatique ou mécanique aléatoire, cette forme de mise en oeuvre du procédé de l' invention a la particularité de permettre l'utilisation des fragments générés par ce traitement comme matrices les uns pour les autres, pour l'hybridation au cours de l'étape (c) ou de la réaction de RLR des Step (a) can also be carried out by generating a bank of fragments by euzymatic or mechanical random processing. In particular, step (a) can consist of a random treatment with DNAse I of a library of polynucleotide sequences. In the case where a random enzymatic or mechanical fragmentation is used in step (a), this form of implementation of the process of the invention has the particularity of allowing the use of the fragments generated by this treatment as matrices for each other, for hybridization during step (c) or the RLR reaction of
étapes (c) et (d) simultanées.simultaneous steps (c) and (d).
L'étape (b) peut être réalisée en combinant au moins deux banques de fragments distinctes générées séparément à l'étape (a) à partir de la même banque initiale par des traitements différents, comme par exemple avec des euzymes de restriction différentes. Dans le cas de la mise en oeuvre de telles banques, on utilise les fragments obtenus à l'étape (a) comme matrices les uns pour les autres, pour l'hyEridation au cours de l'étape (c) ou Step (b) can be carried out by combining at least two libraries of distinct fragments generated separately in step (a) from the same initial library by different treatments, as for example with different restriction enzymes. In the case of the implementation of such libraries, the fragments obtained in step (a) are used as matrices for each other, for the hybridization during step (c) or
de la réaction de RLR des étapes (c) et (d) simultanées. of the RLR reaction of steps (c) and (d) simultaneously.
Les fragments de l'étape (a) du procédé de l' invention peuvent également être générés par des réactions d'amplification (telle que la PCR) menées sur les séquences polynucléotidiques de la banque. Deux solutions sont notamment envisageables. Dans un premier cas, les oligonucléotides amorces peuvent être conçus de manière à générer des fragments dont les extrémités sont adjacentes tout au long de la séquence d'assemblage. Dans un deuxième cas, les oligonualéotides amorces sont conçus de façon à générer des fragments ayant des séquences communes, ces fragments pouvant servir de matrice d'assemblage les uns pour les autres à l'étape (b) ou à The fragments of step (a) of the process of the invention can also be generated by amplification reactions (such as PCR) carried out on the polynucleotide sequences of the library. Two solutions are notably possible. In a first case, the priming oligonucleotides can be designed so as to generate fragments whose ends are adjacent throughout the assembly sequence. In a second case, the priming oligonualéotides are designed so as to generate fragments having common sequences, these fragments being able to serve as assembly matrix for each other in step (b) or in
l'étape (c).step (c).
L'efficacité de recombinaison du procédé de l' invention est fonction du nombre de fragments générés par séquence polynucléotidique à l'étape (a). En conséquence, le procédé de l'invention utilisera des séquences polynucléotidiques ayant été fragmentés en n fragments, n The recombination efficiency of the process of the invention is a function of the number of fragments generated per polynucleotide sequence in step (a). Consequently, the method of the invention will use polynucleotide sequences which have been fragmented into n fragments, n
étant avantageusement supérieur ou égal à trois. advantageously being greater than or equal to three.
La matrice d'assemblage à l'étape (b) ou (c) est par exemple une séquence polynucléotidique issue de la banque initiale ou une séquence consensus de ladite banque, simple ou double brin. Dans le cas o la ou les matrices d' assemblage sont incorporées directement à l' étape (c) de l'invention, cette matrice doit être sous forme simple brin. Selon une variante du procédé de l'invention, les matrices d' assemblage des étapes (b) ou (c) sont The assembly matrix in step (b) or (c) is for example a polynucleotide sequence from the initial library or a consensus sequence from said library, single or double strand. In the case where the assembly matrix (s) are incorporated directly in step (c) of the invention, this matrix must be in single strand form. According to a variant of the method of the invention, the matrices for assembling steps (b) or (c) are
constituées d'oligonucléotides simples ou doubles brins. consisting of single or double stranded oligonucleotides.
Selon une forme particulière de mise en oeuvre du procédé de l'invention, des oligonucléotides, simple ou double brin, de longueur variable, sont ajoutés à l'étape (b) ou (c) en plus de la matrice. Ces oligonucléotides sont concus pour pouvoir se substituer à une partie des fragments à l'étape (c), en effet, leur séquence est telle que: - s'ils sont parfaitement homologues avec la séquence du fragment qu'ils remplacent, ils favorisent certaines combinaisons, ou - s'ils sont partiellement hétérologues avec la séquence du fragment qu'ils remplacent, ils introduisent According to a particular form of implementation of the method of the invention, oligonucleotides, single or double strand, of variable length, are added in step (b) or (c) in addition to the matrix. These oligonucleotides are designed to be able to replace part of the fragments in step (c), in fact, their sequence is such that: - if they are perfectly homologous with the sequence of the fragment which they replace, they favor certain combinations, or - if they are partially heterologous with the sequence of the fragment they replace, they introduce
une ou des mutations dirigées supplémentaires. one or more directed mutations.
On entend par séquences hétérologues, deux séquences dont la composition en bases diffère d' au moins By heterologous sequences is meant two sequences whose base composition differs from at least
une base.a base.
Avant l'étape (e) du procédé de l'invention, il est possible de séparer les séquences polynucléotidiques recombinées de la matrice d' assemblage grâce à un marqueur présent sur la matrice d'assemblage ou sur les séquences polynucléotidiques recombinces. Il est en effet possible de marquer chaque brin de la matrice selon des techniques connues de l'homme du métier. Par exemple, le marqueur de la matrice d' assemblage peut être un haptène et l'on sépare les séquences polynucléotidiques recombinées de la matrice d' assemblage par des techniques connues de l'homme du métier, comme par exemple un anticorps anti-haptène fixé sur un support ou une réaction biotine-streptavidine, si Before step (e) of the process of the invention, it is possible to separate the recombined polynucleotide sequences from the assembly matrix by means of a marker present on the assembly matrix or on the recombined polynucleotide sequences. It is indeed possible to mark each strand of the matrix according to techniques known to those skilled in the art. For example, the marker of the assembly matrix can be a hapten and the recombined polynucleotide sequences of the assembly matrix are separated by techniques known to those skilled in the art, such as for example an anti-hapten antibody attached on a biotin-streptavidin support or reaction, if
l'haptène est un marqueur biotine.hapten is a biotin marker.
D'autres techniques peuvent être employées pour séparer les séquences polynucléotidiques recombinées de la matrice d'assemblage. La matrice d'assemblage peut aussi être préparée spécifiquement de façon à faciliter son élimination à la fin du procédé de l' invention. Elle peut ainsi être synthétisée par amplification PCR utilisant des dATP méthylés, ce qui permet sa dégradation par l'endonucléase de restriction Dpn I. Dans ce cas, les séquences polynucléotidiques recombinées ne doivent pas contenir de dATP méthylés. La matrice peut aussi avoir été préparée par amplification PCR en utilisant des dUTP, ce qui permet sa dégradation par traitement avec une uracyl DNA-glycosylase. A l' inverse, il est possible de protéger les séquences polynucléotidiques recombinées en les amplifiant par PCR sélective avec des oligonucléotides portant des groupements phosphorothioates en 5'. Un traitement avec une exonucléase permet alors de dégrader Other techniques can be used to separate the recombinant polynucleotide sequences from the assembly matrix. The assembly matrix can also be specifically prepared so as to facilitate its elimination at the end of the process of the invention. It can thus be synthesized by PCR amplification using methylated dATP, which allows its degradation by the restriction endonuclease Dpn I. In this case, the recombined polynucleotide sequences must not contain methylated dATP. The matrix can also have been prepared by PCR amplification using dUTP, which allows its degradation by treatment with an uracyl DNA-glycosylase. Conversely, it is possible to protect the recombined polynucleotide sequences by amplifying them by selective PCR with oligonucleotides carrying 5 'phosphorothioate groups. Treatment with an exonuclease then makes it possible to degrade
spécifiquement la matrice d' assemblage. specifically the assembly matrix.
Le procédé de l' invention peut comprendre avant le clonage éventuel de l'étape (e), une étape d'amplification des séquences polynucléotidiques recombinées. Toute technique d'amplification est acceptable notamment une amplification par PCR. Une des plus simple consiste à réaliser une PCR qui permet d'amplifier spécifiquement les séquences polynucléotidiques recombinces grâce à des amorces qui ne peuvent s'hybrider que sur les extrémités des séquences recombinées. Les produits PCR sont ensuite clonés pour être caractérisés et les séquences polynucléotidiques présentant des propriétés avantageuses par rapport aux propriétés correspondantes de séquences de référence sont sélectionnées. L' invention a pour objet de générer des séquences polynucléotidiques susceptibles de présenter des propriétés avantageuses par rapport aux propriétés correspondantes de séquences de référence. Les séquences polynucléotides recombinées obtenues à l'étape (d) et éventuellement clonées sont criblées par tout moyen approprié pour sélectionner les séquences polynucléotidiques recombinées ou les clones présentant des propriétés avantageuses par rapport aux propriétés correspondantes de séquences de référence. On entend, par exemple, par propriétés avantageuses la thermostabilité d'une enzyme ou sa qualité à pouvoir fonctionner dans des conditions de pH ou de température ou de concentration saline plus adaptées à un procédé enzymatique, que les protéines témoins habituellement utilisées pour ledit procédé. A titre d'exemple d'un tel procédé, on peut citer un procédé industriel de désencollage des fibres textiles ou de blanchiment des pâtes à papier ou de la production d'arômes dans l'industrie laitière, les procédés de biocatalyse pour la synthèse par voie enzymatique de nouvelles molécules thérapeutiques, etc Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l' invention, la banque de séquence polynucléotidique peut donc être le résultat d'un crible ayant permis de sélectionner par tout moyen approprié les séquences polynucléotidiques présentant des propriétés avantageuses par rapport à des séquences témoins. Les séquences ainsi sélectionnées constituent une banque restreinte. Mais, il est aussi possible de partir d'une banque non restreinte afin de conserver la représentativité The method of the invention can comprise, before the cloning, if necessary, of step (e), a step of amplification of the recombined polynucleotide sequences. Any amplification technique is acceptable, in particular PCR amplification. One of the simplest consists in carrying out a PCR which makes it possible to specifically amplify the recombined polynucleotide sequences by means of primers which can only hybridize at the ends of the recombined sequences. The PCR products are then cloned to be characterized and the polynucleotide sequences having advantageous properties compared to the corresponding properties of reference sequences are selected. The object of the invention is to generate polynucleotide sequences capable of exhibiting advantageous properties compared to the corresponding properties of reference sequences. The recombinant polynucleotide sequences obtained in step (d) and optionally cloned are screened by any appropriate means to select the recombinant polynucleotide sequences or the clones having advantageous properties compared to the corresponding properties of reference sequences. By advantageous properties is meant, for example, the thermostability of an enzyme or its quality to be able to function under conditions of pH or temperature or of salt concentration more suitable for an enzymatic process, than the control proteins usually used for said process. An example of such a process that may be mentioned is an industrial process for desizing of textile fibers or bleaching paper pulp or for producing flavors in the dairy industry, biocatalysis processes for synthesis by enzymatic pathway of new therapeutic molecules, etc. According to an advantageous embodiment of the process of the invention, the polynucleotide sequence bank can therefore be the result of a screen having made it possible to select by any appropriate means the polynucleotide sequences having advantageous properties compared to control sequences. The sequences thus selected constitute a restricted bank. However, it is also possible to start from an unrestricted bank in order to maintain representativeness
des propriétés contenues dans cette banque. properties contained in this bank.
Les séquences codant pour la ou les protéines présentant une ou des propriétés avantageuses par rapport aux protéines de référence sont alors sélectionnées, par des criblages in vivo ou in vi tro, et peuvent servir à constituer une nouvelle banque pour une éventuelle réitération du procédé de l' invention. Une mise en _uvre avantageuse du procédé de l' invention consiste donc à utiliser comme banque plusieurs séquencespolynucléotidiques sélectionnées après une première mise en _uvre du procédé de l 'invention, éventuellement mélangées avec d'autres séquences polynucléotidiques. Parmi les techniques de criblage qui peuvent être appliquées à chacun des clones de l'étape (e), les techniques de criblage par expression in vitro utilisant notamment la transcription in vitro des séquences polynucléotidiques recombinces puis la traduction in vitro des mRNAs obtenus, présentent l'avantage de s'affranchir des problèmes de physiologie cellulaire, et de tous les inconvénients liés au clonage d'expression in vivo. En outre, ce type de criblage est facilement automatisable, ce qui permet de cribler un The sequences coding for the protein (s) having one or more advantageous properties compared to the reference proteins are then selected, by screening in vivo or in vitro, and can be used to constitute a new library for a possible reiteration of the process of l invention. An advantageous implementation of the method of the invention therefore consists in using as a bank several polynucleotide sequences selected after a first implementation of the method of the invention, optionally mixed with other polynucleotide sequences. Among the screening techniques which can be applied to each of the clones of step (e), the screening techniques by in vitro expression using in particular the in vitro transcription of the recombined polynucleotide sequences and then the in vitro translation of the mRNAs obtained, present l advantage of overcoming cellular physiology problems, and of all the drawbacks linked to the cloning of expression in vivo. In addition, this type of screening is easily automated, which makes it possible to screen a
nombre élevé de séquences polynucléotidiques recombinées. high number of recombinant polynucleotide sequences.
L'invention concerne aussi une séquence polynucléotidique recombinée obtenue par un procédé selon l'invention, ainsi qu'un vecteur contenant une telle séquence polynualéotidique recombince, un hôte cellulaire transformé par une séquence polynucléotidique recombinée ou un vecteur de l' invention, ainsi qu'une protéine codée par cette séquence polynucléotidique recombinée. L'invention comprend également les banques correspondantes de séquences polynucléotidiques recombinces, de vecteurs, d'hôtes The invention also relates to a recombinant polynucleotide sequence obtained by a method according to the invention, as well as a vector containing such a recombinant polynucleotide sequence, a cell host transformed by a recombinant polynucleotide sequence or a vector of the invention, as well as a protein encoded by this recombinant polynucleotide sequence. The invention also includes the corresponding libraries of recombinant polynucleotide sequences, vectors, hosts
cellulaires ou de protéines.cell or protein.
Exemple:Example:
Cet exemple a pour objectif de générer des séquences polynucléotidiques recombinées du gène de résistance à la kanamycine en utilisant la ligation orientée de fragments simples brin Dans un premier temps, le gène de résistance à la kanamycine (1 Kb) de pACYC184 est cloné dans le polylinker de M13mpl8 de telle façon que le phagemide The purpose of this example is to generate recombinant polynucleotide sequences of the kanamycin resistance gene using the oriented ligation of single-stranded fragments. First, the kanamycin resistance gene (1 Kb) of pACYC184 is cloned into the polylinker. of M13mpl8 in such a way that the phagemid
simple brin contient le brin non codant du gène. single strand contains the non-coding strand of the gene.
En parallèle, ce gène est amplifié par une PCR mutagène (error prone PCR) avec deux amorces qui sont complémentaires de la séquence du vecteur M13mpl8 de par et d'autre de la séquence du gène. L'amorce pour le brin non codant est phosphorylée alors que l'amorce pour le brin codant ne l'est pas. Le produit de la PCR mutagène est digéré par l'exonucléase de lambda, ce qui génère une banque de brins codants de mutants du gène de la résistance In parallel, this gene is amplified by mutagenic PCR (error prone PCR) with two primers which are complementary to the sequence of the vector M13mpl8 on either side of the gene sequence. The primer for the non-coding strand is phosphorylated while the primer for the coding strand is not. The mutagenic PCR product is digested by lambda exonuclease, which generates a bank of coding strands of resistance gene mutants
à la kanamycine.with kanamycin.
Cette banque de moléaules simple brin est digérée par un mélange d' enzymes de restriction, à savoir Hae III, Hinf I et Taq I. Cette banque de fragments simple brin ainsi obtenue est alors hybridée au phagemide simple brin et liguaturée avec une ligase thermostable. Cette étape est répétée plusieurs fois, jusqu'à ce que les fragments de petite taille ne puissent plus être observés lors d'un dépôt sur un gel d'agarose alors que la bande correspondant au simple brin du gène complet de la résistance à la kanamycine devienne un composant majeur du This bank of single-stranded molecules is digested by a mixture of restriction enzymes, namely Hae III, Hinf I and Taq I. This bank of single-stranded fragments thus obtained is then hybridized to the single-stranded phagemid and ligated with a thermostable ligase. This step is repeated several times, until the small fragments can no longer be observed during deposition on an agarose gel while the band corresponding to the single strand of the complete gene for resistance to kanamycin become a major component of the
" smear " de molécules simple brin visibles sur le gel. "smear" of single strand molecules visible on the gel.
La bande correspondant à la taille du gène est alors découpée du gel et purifiée. Elle est ensuite hybridée avec deux oligonualéotides (40 mer) complémentaires des séquences de M13mpl8 de chaque côté du gène, et ce duplex partiel est digéré par Eco RI et Sph I puis ligaturée dans un vecteur M13 mpl8 digéré par les The band corresponding to the size of the gene is then cut from the gel and purified. It is then hybridized with two oligonualotides (40 mer) complementary to the sequences of M13mpl8 on each side of the gene, and this partial duplex is digested with Eco RI and Sph I and then ligated in a vector M13 mpl8 digested with
mêmes enzymes.same enzymes.
Les cellules transformées avec le produit de ligation sont criblées pour une résistance accrue à la kanamyaine. Le clonage des moléaules simple brin recombinées peut éventuellement être réalisé par une PCR avec deux amorces du gène de taille complète et clonage du produit double brin de cette amplification. Pour éviter les mutations indésirables, cette amplification sera réalisée avec la polymérase de type Pfu et par un nombre limité de cycles. Les plasmides des clones significativement plus résistants à la kanamycine que la souche initiale sont purifiés et utilisés comme matrices pour une PCR à la polymérase Pfu, dans des conditions de haute fidélité, avec le couple d'amorces phospshorylé/non phosphorylé tel que défini précédemment. Ceci génére la seconde génération de fragments simple brin, après un traitement à l'exonualéase de lambda et la fragmentation avec les euzymes de restriction. Les enzymes utilisées à cette étape peuvent être composées d'un mélange différent (Bst NI, Taq I et Mnl I). Les étapes de recombinaison et de sélection sont répétées plusieurs fois, jusqu'à ce qu'un accroissement substantiel de la résistance à la kanamycine Cells transformed with the ligation product are screened for increased resistance to kanamyaine. Cloning of the recombined single-stranded molecules can optionally be carried out by PCR with two primers of the full-size gene and cloning of the double-stranded product of this amplification. To avoid unwanted mutations, this amplification will be carried out with the Pfu type polymerase and by a limited number of cycles. The plasmids of the clones significantly more resistant to kanamycin than the initial strain are purified and used as templates for a Pfu polymerase PCR, under high fidelity conditions, with the pair of phospshorylated / non-phosphorylated primers as defined above. This generates the second generation of single-stranded fragments, after treatment with lambda exonualease and fragmentation with restriction enzymes. The enzymes used in this step can be composed of a different mixture (Bst NI, Taq I and Mnl I). The recombination and selection steps are repeated several times, until a substantial increase in resistance to kanamycin
soit obtenu.be obtained.
Claims (23)
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0105573A FR2824073B1 (en) | 2001-04-25 | 2001-04-25 | PROCESS FOR THE IN VITRO CREATION OF RECOMBINANT POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES BY ORIENTED LIGATION |
AU2002338443A AU2002338443B2 (en) | 2001-04-25 | 2002-04-25 | Template-mediated, ligation-oriented method of nonrandomly shuffling polynucleotides |
CA002445258A CA2445258A1 (en) | 2001-04-25 | 2002-04-25 | Template-mediated, ligation-oriented method of nonrandomly shuffling polynucleotides |
JP2002583635A JP4533584B2 (en) | 2001-04-25 | 2002-04-25 | Template-adjusted ligation orientation method that non-randomly shuffles polynucleotides |
PCT/IB2002/002778 WO2002086121A1 (en) | 2001-04-25 | 2002-04-25 | Template-mediated, ligation-oriented method of nonrandomly shuffling polynucleotides |
EP02743543A EP1381680A1 (en) | 2001-04-25 | 2002-04-25 | Template-mediated, ligation-oriented method of nonrandomly shuffling polynucleotides |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0105573A FR2824073B1 (en) | 2001-04-25 | 2001-04-25 | PROCESS FOR THE IN VITRO CREATION OF RECOMBINANT POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES BY ORIENTED LIGATION |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FR2824073A1 true FR2824073A1 (en) | 2002-10-31 |
FR2824073B1 FR2824073B1 (en) | 2003-12-19 |
Family
ID=8862680
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FR0105573A Expired - Fee Related FR2824073B1 (en) | 2001-04-25 | 2001-04-25 | PROCESS FOR THE IN VITRO CREATION OF RECOMBINANT POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES BY ORIENTED LIGATION |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
FR (1) | FR2824073B1 (en) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5605793A (en) * | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
FR2782323A1 (en) * | 1998-08-12 | 2000-02-18 | Proteus | In vitro recombination of polynucleotide fragments to obtain sequences with improved properties involves ligation on an assembly matrix |
US6143527A (en) * | 1996-05-06 | 2000-11-07 | American Home Products Corporation | Chain reaction cloning using a bridging oligonucleotide and DNA ligase |
-
2001
- 2001-04-25 FR FR0105573A patent/FR2824073B1/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5605793A (en) * | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
US6143527A (en) * | 1996-05-06 | 2000-11-07 | American Home Products Corporation | Chain reaction cloning using a bridging oligonucleotide and DNA ligase |
FR2782323A1 (en) * | 1998-08-12 | 2000-02-18 | Proteus | In vitro recombination of polynucleotide fragments to obtain sequences with improved properties involves ligation on an assembly matrix |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
WEISBERG E P ET AL: "SIMULTANEOUS MUTAGENESIS OF MULTIPLE SITES: APPLICATION OF THE LIGASE CHAIN REACTION USING PCR PRODUCTS INSTEAD OF OLIGONUCLEOTIDES", BIOTECHNIQUES, EATON PUBLISHING, NATICK, US, vol. 15, no. 1, 1 July 1993 (1993-07-01), pages 68 - 70,72-74,, XP000385832, ISSN: 0736-6205 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2824073B1 (en) | 2003-12-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1104457B1 (en) | Method for obtaining in vitro recombined polynucleotide sequences, sequence banks and resulting sequences | |
US6991922B2 (en) | Process for in vitro creation of recombinant polynucleotide sequences by oriented ligation | |
JP4700805B2 (en) | How to make a highly diverse library | |
CA2308292C (en) | Method of dna shuffling | |
US6951719B1 (en) | Process for obtaining recombined nucleotide sequences in vitro, libraries of sequences and sequences thus obtained | |
EP1311670B1 (en) | Method for massive directed mutagenesis | |
US20010041333A1 (en) | High throughput screening for a bioactivity or biomolecule | |
AU782529C (en) | Sequence based screening | |
CA2673579C (en) | Method for preparing bacteriophages modified by the insertion of random sequences in the screening proteins of said bacteriophages | |
FR2824073A1 (en) | Template-mediated, ligation-oriented method for randomly shuffling polynucleotide (e.g. DNA shuffling), genetic recombination or molecular breeding, by adjacently hybridizing at least two fragments on an assembly template | |
KR100446417B1 (en) | Method for generating recombinant dna library using unidirectional single-stranded dna fragments | |
EP0575338A1 (en) | Multisite integration cassette for the genome of a yeast | |
US20020119535A1 (en) | Method for recombining polynucleotides | |
EP1544296A1 (en) | Method for massive directed mutagenesis | |
FR2738841A1 (en) | METHOD FOR POLYMERIZING NUCLEIC ACID SEQUENCES AND APPLICATIONS THEREOF | |
CA2673004C (en) | Method for the random diversification of a genetic sequence while preserving the identity of some inner segments of said genetic sequence | |
US20200181666A1 (en) | Nucleic acid mutagenesis methods | |
US20050064498A1 (en) | High throughput screening for sequences of interest | |
US20020031771A1 (en) | Sequence based screening | |
WO2000071730A1 (en) | Method for inserting a nucleic acid fragment in a vector, uses thereof and kits therefor | |
FR2883885A1 (en) | In vitro production of recombinant polynucleotides comprises preparing a mixture of plasmid molecules and a phosphorylated hybrid oligonucleotide primer, and subjecting the mixture to elongation cycle | |
JP2009125008A (en) | Method for producing hybrid polynucleotide | |
US20060003314A1 (en) | Methods for peptide and protein display in nucleic acid arrays | |
FR2883886A1 (en) | Preparing soluble or better expressed variants of proteins and peptides, useful e.g. for industrial enzymes or antibodies, by expressing gene mutants as fusions with the kanamycin resistance gene | |
FR2546179A1 (en) | Production of catechol 2,3-oxygenase by yeasts, plasmid for obtaining it and application |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 15 |
|
ST | Notification of lapse |
Effective date: 20161230 |