FR2817479A1 - CELL ACTIVATION COMPOSITION, MANUFACTURING METHOD THEREOF AND USE THEREOF FOR THE TREATMENT OF LESIONS - Google Patents
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Abstract
Description
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Composition d'activation cellulaire, son procédé de fabrication et son utilisation pour le traitement de lésions. Cellular activation composition, its manufacturing process and its use for the treatment of lesions.
La présente invention concerne une composition implantable apte à stimuler physiologiquement des cellules renfermant des substances actives, en vue du traitement, par lesdites substances actives de lésions du corps humain ou animal ainsi qu'un procédé de fabrication d'une telle composition et l'utilisation d'une matrice biopolymérique déshydratée pour la fabrication d'une telle composition. The present invention relates to an implantable composition capable of physiologically stimulating cells containing active substances, for the purpose of treatment, by said active substances of lesions of the human or animal body, as well as a process for manufacturing such a composition and the use thereof. a dehydrated biopolymeric matrix for the manufacture of such a composition.
De nombreuses cellules sont aujourd'hui connues pour leur aptitude à libérer des substances actives, telles que des facteurs de croissance, utiles pour le traitement du corps humain ou animal. Tel est le cas des thrombocytes encore appelés plaquettes qui libèrent des facteurs tels que le PAF (facteur d'activation des plaquettes), le PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes), le TFG (facteur de croissance tumoral), l'EGF (facteur de croissance épidermique). Il en est de même des macrophages monocytes qui libèrent le PDGF, le FGF (facteur de croissance des fibroblastes), le FAF (facteur d'activation des Many cells are known today for their ability to release active substances, such as growth factors, useful for the treatment of the human or animal body. This is the case of thrombocytes, also called platelets, which release factors such as PAF (platelet activation factor), PDGF (platelet-derived growth factor), TFG (tumor growth factor), EGF ( epidermal growth factor). The same is true of monocyte macrophages which release PDGF, FGF (fibroblast growth factor), FAF (activation factor for
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fibroblastes), le TGF. Toutefois, pour permettre cette libération, ces cellules sont activées par un activateur cellulaire. Les activateurs cellulaires des thrombocytes utilisés aujourd'hui sont classiquement le collagène, la thrombine, la trypsine, l'ADP, la sérotonine ou l'adrénaline. fibroblasts), TGF. However, to allow this release, these cells are activated by a cellular activator. The cellular activators of thrombocytes used today are conventionally collagen, thrombin, trypsin, ADP, serotonin or adrenaline.
Ces activateurs présentent toutefois, du fait de leur nature et de leur origine, des risques d'immunisation et des risques biologiques. En effet, l'utilisation de protéines telles que la thrombine peut générer, lors d'un contact ultérieur avec la même substance, une réaction anaphylactique mettant en jeu le pronostic vital. Par ailleurs, il existe des risques de transmission virale (hépatite, HIV, prion) lors de l'utilisation de protéines d'origine animale. However, because of their nature and origin, these activators present risks of immunization and biological risks. Indeed, the use of proteins such as thrombin can generate, during a subsequent contact with the same substance, an anaphylactic reaction involving life-threatening. In addition, there are risks of viral transmission (hepatitis, HIV, prion) when using proteins of animal origin.
Sur cette base, plusieurs voies ont été explorées à ce jour. La première voie consiste à activer les cellules in vitro en vue de permettre la libération des facteurs de croissance puis à utiliser directement les substances actives libérées sur les lésions à traiter. Cette voie est notamment décrite dans le brevet EP-A-0202298. On this basis, several avenues have been explored to date. The first route consists in activating cells in vitro in order to allow the release of growth factors and then in directly using the active substances released on the lesions to be treated. This route is described in particular in patent EP-A-0202298.
Toutefois, cette première voie ne permet pas d'obtenir une libération contrôlée et dans le temps de substances actives dans l'organisme. Par ailleurs, cette voie nécessite la mise en oeuvre d'étapes complexes pour l'isolement et la collecte des substances actives libérées. However, this first route does not make it possible to obtain a controlled and long-term release of active substances in the body. Furthermore, this route requires the implementation of complex steps for the isolation and collection of the released active substances.
Une autre voie, basée sur le même principe que précédemment, consiste à incorporer ces substances actives dans une composition comprenant de la fibrine et/ou au moins un précurseur de celle-ci et au moins un autre polymère et/ou au moins un précurseur de celui-ci comme cela est décrit dans la demande internationale WO 00/15248. Une telle solution présente les mêmes inconvénients que ceux cités précédemment. Another route, based on the same principle as above, consists in incorporating these active substances in a composition comprising fibrin and / or at least one precursor thereof and at least one other polymer and / or at least one precursor of this as described in international application WO 00/15248. Such a solution has the same drawbacks as those mentioned above.
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Enfin, une autre voie consiste à réaliser une composition contenant d'une part des cellules lyophilisées et soumises à un traitement d'inactivation ou de destruction des virus d'autre part un biomatériau constitué d'une colle tissulaire ou de collagène comme l'illustre la demande internationale WO 99/24044. Dans ce cas, les cellules sont soumises à un traitement qui ne leur permet pas toujours de retrouver l'ensemble de leurs aptitudes fonctionnelles après reconstitution du lyophilisat. En outre, à nouveau le choix du biopolymère présente des risques d'immunisation et des risques biologiques tels que des risques de transmission virale, en particulier dans le cas du collagène ou de la thrombine, protéines d'origine animale. Enfin, un activateur classique, la thrombine, est à nouveau utilisé. Finally, another way consists in producing a composition containing on the one hand lyophilized cells and subjected to a treatment for inactivation or destruction of viruses on the other hand a biomaterial consisting of a tissue glue or collagen as illustrated international application WO 99/24044. In this case, the cells are subjected to a treatment which does not always allow them to recover all of their functional abilities after reconstitution of the lyophilisate. In addition, once again the choice of biopolymer presents risks of immunization and biological risks such as risks of viral transmission, in particular in the case of collagen or thrombin, proteins of animal origin. Finally, a classic activator, thrombin, is again used.
Cette composition, bien qu'intéressante car permettant une libération progressive de substances actives, ne donne pas satisfaction du fait des problèmes évoqués ci-dessus. This composition, although interesting because it allows a gradual release of active substances, is not satisfactory because of the problems mentioned above.
Le but de la présente invention est donc de proposer une composition dont la conception permet l'obtention d'une composition prête à l'emploi autorisant la mise en oeuvre de traitements autologues. The aim of the present invention is therefore to propose a composition the design of which makes it possible to obtain a ready-to-use composition authorizing the use of autologous treatments.
Un autre but de la présente invention est de proposer une composition renfermant un activateur de type universel adaptable à tout type de cellules, cette composition permettant une libération prolongée dans le temps de substances actives contenues dans des cellules susceptibles d'être prélevées sur l'organisme à traiter. Another object of the present invention is to provide a composition containing an activator of universal type adaptable to any type of cells, this composition allowing a prolonged release over time of active substances contained in cells capable of being removed from the body. treat.
Un autre but de la présente invention est de proposer un procédé de fabrication d'une composition du type précité dont la mise en oeuvre est particulièrement aisée de manière à obtenir une composition prête à l'emploi directement incorporable à un prélèvement cellulaire. Another object of the present invention is to provide a process for manufacturing a composition of the aforementioned type, the implementation of which is particularly easy so as to obtain a ready-to-use composition which can be directly incorporated into a cell sample.
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A cet effet, l'invention a pour objet une composition implantable apte à stimuler physiologiquement des cellules renfermant au moins une substance active en vue du traitement par lesdites substances actives de lésions du corps humain ou animal, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'au moins une matrice biopolymérique stérile déshydratée renfermant un activateur cellulaire nonenzymatique provoquant, au contact de cellules renfermant au moins une substance active, une libération par lesdites cellules de leur (s) substance (s) active (s), cet activateur cellulaire étant libérable à l'état hydraté de la matrice biopolymérique par solubilisation dans le milieu d'hydratation du biopolymère de manière à provoquer, au contact de cellules éventuellement présentes dans le milieu d'hydratation de la matrice biopolymérique, une libération des substances actives contenues dans lesdites cellules. To this end, the subject of the invention is an implantable composition capable of physiologically stimulating cells containing at least one active substance for the purpose of treatment by said active substances of lesions of the human or animal body, characterized in that it consists of '' at least one dehydrated sterile biopolymer matrix containing a nonenzymatic cellular activator causing, in contact with cells containing at least one active substance, a release by said cells of their active substance (s), this cellular activator being liberable in the hydrated state of the biopolymeric matrix by solubilization in the hydration medium of the biopolymer so as to cause, in contact with cells possibly present in the hydration medium of the biopolymeric matrix, a release of the active substances contained in said cells .
Grâce à cette composition, les performances d'activation des cellules résultent de la synergie entre l'activité du biopolymère et l'activité de l'activateur cellulaire. Thanks to this composition, the activation performance of the cells results from the synergy between the activity of the biopolymer and the activity of the cellular activator.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention,
l'activateur cellulaire est constitué d'une charge calcique. Cet activateur, qui peut être qualifié d'universel du fait de sa nature, peut être introduit soit par voie passive dans la cellule du fait de la surconcentration extra-cellulaire générant une diffusion calcique passive dans lesdites cellules, soit par l'intermédiaire du biopolymère interagissant avec la membrane de la cellule et favorisant l'entrée d'ions calcium dans ladite cellule. According to a preferred embodiment of the invention,
the cellular activator consists of a calcium charge. This activator, which can be qualified as universal due to its nature, can be introduced either passively into the cell due to the extra-cellular over-concentration generating passive calcium diffusion in said cells, or via the biopolymer interacting with the cell membrane and promoting the entry of calcium ions into said cell.
L'invention a encore pour objet un procédé de fabrication d'une composition implantable apte à la stimulation physiologique de cellules renfermant des substances actives en vue notamment du traitement par lesdites substances actives de lésions du corps humain ou animal, caractérisé The subject of the invention is also a method of manufacturing an implantable composition suitable for physiological stimulation of cells containing active substances with a view in particular to the treatment by said active substances of lesions of the human or animal body, characterized
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en ce qu'on fixe un activateur cellulaire sur une matrice biopolymèrique stérile et en ce qu'on déshydrate le biopolymère par lyophilisation. in that a cell activator is fixed on a sterile biopolymeric matrix and in that the biopolymer is dehydrated by lyophilization.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une matrice biopolymérique stérile déshydratée renfermant un activateur cellulaire provoquant, au contact des cellules renfermant au moins une substance active, une libération par lesdites cellules de leur (s) substance (s) active (s) pour la fabrication d'une composition implantable de traitement des lésions du corps humain ou animal, cette composition étant du type précité. The subject of the invention is also the use of a dehydrated sterile biopolymeric matrix containing a cellular activator causing, in contact with the cells containing at least one active substance, a release by said cells of their active substance (s) ( s) for the manufacture of an implantable composition for treating lesions of the human or animal body, this composition being of the aforementioned type.
L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation de l'invention. The invention will be clearly understood on reading the following description of exemplary embodiments of the invention.
Conformément à l'invention, la composition, objet de l'invention, est constituée d'au moins une matrice biopolymérique stérile déshydratée renfermant un activateur cellulaire non-enzymatique provoquant, au contact des cellules renfermant au moins une substance active, une libération par lesdites cellules de leur (s) substance (s) active (s). In accordance with the invention, the composition which is the subject of the invention consists of at least one dehydrated sterile biopolymeric matrix containing a non-enzymatic cellular activator causing, on contact with the cells containing at least one active substance, a release by said cells of their active substance (s).
La stérilisation de la matrice biopolymérique peut être obtenue de diverses manières, notamment par traitement par rayonnements, par la vapeur humide ou par microfiltration. Cette dernière méthode est préférée. Cette méthode permet en outre, lorsqu'elle s'accompagne d'une ultrafiltration, de purifier le polymère de manière à améliorer la biocompatibilité suivant la norme ISO/EN 10993, notamment le caractère non-pyrogène. La microfiltration s'effectue en milieu dilué et de préférence en mode tangentiel. Il en est de même de l'ultrafiltration qui permet en outre de reconcentrer le biopolymère. The sterilization of the biopolymeric matrix can be obtained in various ways, in particular by radiation treatment, by wet steam or by microfiltration. The latter method is preferred. This method also makes it possible, when accompanied by ultrafiltration, to purify the polymer so as to improve the biocompatibility according to ISO / EN 10993 standard, in particular the non-pyrogenic character. Microfiltration takes place in a dilute medium and preferably in tangential mode. The same is true of ultrafiltration which also makes it possible to reconcentrate the biopolymer.
A titre d'exemple, la purification d'un polymère For example, the purification of a polymer
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polysaccharidique peut s'effectuer comme suit. Le matériel nécessaire est constitué d'une pompe péristaltique fonctionnant en boucle sur une cartouche de filtration tangentielle sartocon microsart (marques déposées) de chez SARTORIUS à membrane en polysulfone. polysaccharide can be done as follows. The necessary equipment consists of a peristaltic pump operating in a loop on a sartocon microsart (registered trademarks) tangential filtration cartridge from SARTORIUS with a polysulfone membrane.
Cette pompe est équipée d'une cartouche de microfiltration à 0,2 Mm et d'une cartouche d'ultrafiltration 100000D. This pump is equipped with a 0.2 Mm microfiltration cartridge and a 100000D ultrafiltration cartridge.
La solution de polymère choisie est une solution de pectine LM (fabricant DANISCO) à 0,5%. Le débit de la pompe est choisi à 125 ml/mn, la température est de 250C et le temps de circulation de cinq heures. La pression de rétentat est de 7 psig. The polymer solution chosen is a 0.5% LM pectin solution (manufacturer DANISCO). The pump flow is chosen at 125 ml / min, the temperature is 250C and the circulation time five hours. The retentate pressure is 7 psig.
La microfiltration permet d'obtenir à partir d'une solution opalescente une solution transparente pratiquement incolore et dépourvue de germes. Microfiltration makes it possible to obtain, from an opalescent solution, a practically colorless and germ-free transparent solution.
L'ultrafiltration permet d'obtenir une solution cristalline, décolorée et dépyrogénée puisque le dosage des endotoxines par la méthode LAL montre un dosage d'endotoxines réduit de 2,5 UI endotoxines/mg à 0,06 UI/mg. De plus, le polymère voit sa concentration en solution augmentée puisque, après filtration, elle est égale à 4, 5 %. Ultrafiltration makes it possible to obtain a crystalline, discolored and depyrogenic solution since the assay of endotoxins by the LAL method shows an assay of endotoxins reduced from 2.5 IU endotoxins / mg to 0.06 IU / mg. In addition, the polymer sees its concentration in solution increased since, after filtration, it is equal to 4.5%.
De préférence, la matrice telle que décrite ci-desssus est constituée d'au moins un biopolymère polysaccharidique. Preferably, the matrix as described above consists of at least one polysaccharide biopolymer.
Ce biopolymère polysaccharidique peut être constitué d'au moins un polysaccharide neutre choisi parmi l'agarose, la cyclodextrine, l'amidon, l'hydroxyéthylamidon , la cellulose, les dérivés éther de cellulose, les dérivés acétate de cellulose, les dérivés acyle de cellulose, le glucomanne, le guar. This polysaccharide biopolymer can consist of at least one neutral polysaccharide chosen from agarose, cyclodextrin, starch, hydroxyethyl starch, cellulose, cellulose ether derivatives, cellulose acetate derivatives, cellulose acyl derivatives , the glucomanne, the guar.
Le biopolymère polysaccharidique peut encore être constitué The polysaccharide biopolymer can also be constituted
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d'au moins un dérivé de polysaccharide aminé choisi parmi la chitine, le chitosan, le glucane, la polygalactosamine. Ce biopolymère polysaccharidique peut encore être constitué d'au moins un polysaccharide carboxylé choisi dans le groupe de la pectine, la gomme arabique, la gomme ghutte, le karaya, la gellane, la xanthane, le beijerane, le hyaluronane et la cellulose carboxyméthylée. at least one amino polysaccharide derivative chosen from chitin, chitosan, glucan, polygalactosamine. This polysaccharide biopolymer can also consist of at least one carboxylated polysaccharide chosen from the group of pectin, gum arabic, gum ghutte, karaya, gellan, xanthan, beijerane, hyaluronan and carboxymethylated cellulose.
Ce biopolymère peut encore être constitué d'au moins un polysaccharide choisi dans le groupe des polysaccharides sulfatés incluant les carragenanes, les furcellaranes, les sulfates de cellulose et le sulfate de dextran. This biopolymer can also consist of at least one polysaccharide chosen from the group of sulfated polysaccharides including carrageenans, furcellaranes, cellulose sulfates and dextran sulfate.
Enfin ce biopolymère peut être choisi dans le groupe constitué par l'alcool polyvinylique, le polyvinylacétate, le polyvinylpyrolidone et les polyesters. Finally, this biopolymer can be chosen from the group consisting of polyvinyl alcohol, polyvinylacetate, polyvinylpyrolidone and polyesters.
L'avantage d'un biopolymère polysaccharidique est en outre de favoriser la conservation des cellules, en particulier lorsque celles-ci seront soumises, après mise en contact avec le biopolymère, à un traitement de conservation tel qu'une congélation. The advantage of a polysaccharide biopolymer is furthermore to favor the conservation of the cells, in particular when these will be subjected, after being brought into contact with the biopolymer, to a preservation treatment such as freezing.
L'activateur cellulaire est quant à lui constitué d'une charge calcique, généralement sous forme d'un sel soluble par exemple (chlorure, acétate, sulfate). Pour permettre l'incorporation à la matrice de cet activateur, au moins l'un des biopolymères constitutif de la matrice comporte des groupements électro-attractifs tels que des groupements carboxyle ou hydroxyle auxquels l'activateur cellulaire est lié par liaison ionique ou dative. The cellular activator consists of a calcium charge, generally in the form of a soluble salt for example (chloride, acetate, sulfate). To allow incorporation into the matrix of this activator, at least one of the biopolymers constituting the matrix comprises electro-attractive groups such as carboxyl or hydroxyl groups to which the cellular activator is linked by ionic or dative bond.
Ainsi, dans un premier mode de réalisation de l'invention, la fabrication de la composition s'effectue comme suit. Thus, in a first embodiment of the invention, the manufacture of the composition is carried out as follows.
Trois grammes de hyaluronane de sodium sont soumis à une étape de microfiltration et d'ultrafiltration conformément à ce qui a été décrit ci-dessus puis introduits de manière Three grams of sodium hyaluronan are subjected to a microfiltration and ultrafiltration step in accordance with what has been described above and then introduced so
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aseptique sous hotte dans une poche souple. 0, 45g de chlorure de calcium en solution dans 30 ml d'eau distillée sont également introduits dans ladite poche de manière aseptique. aseptic under hood in a flexible pocket. 0.45 g of calcium chloride in solution in 30 ml of distilled water are also introduced into said bag aseptically.
La quantité de calcium introduite au cours de cette étape est choisie de telle sorte que la charge calcique libérée dans le milieu d'hydratation du polymère après réhydratation de ce polymère est au moins égale à 3 % (m/m) de la masse de polymère déshydraté. The amount of calcium introduced during this step is chosen so that the calcium load released in the hydration medium of the polymer after rehydration of this polymer is at least equal to 3% (m / m) of the mass of polymer dehydrated.
L'ensemble est mélangé dans un homogénéisateur de type péristaltique, tel qu'un stomacher, puis lyophilisé dans des conditions telles que suit. La poche est congelée dans une position à plat pour en minimiser l'épaisseur puis séchée par lyophilisation sur un plateau après ouverture de la poche pour permettre la sublimation de l'eau. The whole is mixed in a peristaltic type homogenizer, such as a stomacher, then lyophilized under conditions as follows. The bag is frozen in a flat position to minimize the thickness and then dried by lyophilization on a tray after opening the bag to allow sublimation of the water.
Dans ce cas, la liaison entre le biopolymère et l'activateur cellulaire est une liaison qui s'effectue par l'intermédiaire des groupements carboxyle. In this case, the bond between the biopolymer and the cellular activator is a bond which takes place via the carboxyl groups.
Dans un autre mode de réalisation de la composition, le biopolymère est un biopolymère poreux tel que de l'amidon et l'activateur cellulaire est à nouveau une solution d'un sel calcique telle que du chlorure de calcium mélangée au biopolymère de la matrice avant déshydratation de la matrice biopolymérique. Le dépôt de sel calcique s'effectue dans ce cas dans les pores du biopolymère avec un léger effet dipôle des groupements hydroxyles. In another embodiment of the composition, the biopolymer is a porous biopolymer such as starch and the cellular activator is again a solution of a calcium salt such as calcium chloride mixed with the biopolymer of the matrix before dehydration of the biopolymer matrix. In this case, the calcium salt is deposited in the pores of the biopolymer with a slight dipole effect of the hydroxyl groups.
La préparation de la composition s'effectue alors comme suit. lg d'amidon est mélangé à 0,125 g de chlorure de calcium (CaC12) en solution dans 5 ml d'eau distillée. Ce mélange introduit de manière stérile dans une poche est soumis à un séchage par lyophilisation ou sous hotte à flux laminaire. De manière analogue, lg de PVA (polyvinylacétate) peut être mélangé à 0, 150g d'acétate de The preparation of the composition is then carried out as follows. lg of starch is mixed with 0.125 g of calcium chloride (CaCl2) dissolved in 5 ml of distilled water. This mixture introduced in a sterile manner into a bag is subjected to drying by lyophilization or in a laminar flow hood. Similarly, 1 g of PVA (polyvinylacetate) can be mixed with 0.150 g of acetate.
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calcium en solution dans 10 ml d'eau distillée. L'ensemble, introduit de manière stérile dans une poche, est ensuite séché sous hotte à flux laminaire. calcium in solution in 10 ml of distilled water. The assembly, introduced in a sterile manner into a pocket, is then dried under a laminar flow hood.
Au moment de l'utilisation de la composition, il est nécessaire de procéder à la réhydratation de la composition et de la mettre en contact avec des cellules à activer. When using the composition, it is necessary to rehydrate the composition and bring it into contact with cells to be activated.
La réhydration permet la libération par solubilisation de l'activateur dans le milieu d'hydratation. Rehydration allows release by solubilization of the activator in the hydration medium.
Du fait de la nature du polymère, la matrice biopolymérique, de préférence résorbable, se présente à l'état hydraté sous forme d'un gel ou d'une pâte. Due to the nature of the polymer, the biopolymeric matrix, preferably absorbable, is present in the hydrated state in the form of a gel or a paste.
La résorption de la matrice peut être obtenue par différents moyens en fonction de la nature du polymère. En effet, pour être résorbé, le polymère est dégradé soit physiquement par érosion, soit chimiquement par hydrolyse, soit par une combinaison des deux modes de dégradation. The resorption of the matrix can be obtained by different means depending on the nature of the polymer. Indeed, to be absorbed, the polymer is degraded either physically by erosion, or chemically by hydrolysis, or by a combination of the two modes of degradation.
Certains polymères sont ainsi érodés, désintégrés et solubilisés puis éliminés par l'organisme, sans modification, par voie urinaire comme cela est le cas pour le dextrane. D'autres, tels que les polyalkanoates, à l'inverse, subissent des hydrolyses chimiques entraînant la formation de molécules métabolisables. D'autres enfin, sont métabolisés après hydrolyse enzymatique comme cela est le cas pour la chitine, le hyaluronane et les glucanes. Certain polymers are thus eroded, disintegrated and dissolved, then eliminated by the body, without modification, via the urine, as is the case for dextran. Others, such as polyalkanoates, on the other hand, undergo chemical hydrolysis resulting in the formation of metabolizable molecules. Others are metabolized after enzymatic hydrolysis, as is the case for chitin, hyaluronan and glucans.
Cette résorption est plus particulièrement importante dans le cas d'une application de la composition au traitement de lésions internes du corps humain ou animal. This absorption is more particularly important in the case of an application of the composition to the treatment of internal lesions of the human or animal body.
Le milieu d'hydratation est quant à lui fonction du type de cellules utilisées. Ces cellules peuvent être des monocytes ou des thrombocytes. Ainsi, dans le cas où les cellules contenant des substances actives libérables sous l'action The hydration medium depends on the type of cells used. These cells can be monocytes or thrombocytes. Thus, in the case where the cells containing active substances releasable under the action
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de l'activateur cellulaire sont des thrombocytes incorporant des facteurs de croissance et/ou d'angiogénèse, on utilise de préférence comme milieu d'hydratation le plasma contenant ces thrombocytes. Ce plasma, appelé plasma riche en plaquettes (PRP), est obtenu à partir d'un prélèvement de sang constitué de préférence par le sang du patient à traiter. Ainsi, 60 millilitres de sang et 6 millilitres d'une solution de citrate et de dextrose sont soumis à une centrifugation à 140 g pendant vingt minutes à 40C. A l'issue de cette centrifugation, on obtient 50 ml de plasma riche en plaquettes. Ce plasma riche en plaquettes est directement introduit, de manière aseptique, dans la poche contenant la matrice biopolymérique stérile, puis soumis à une agitation au moyen d'un appareil tel qu'un stomacher pour permettre l'absorption du plasma par la matrice biopolymérique. Cette absorption est facilitée par le fait qu'au moins un des biopolymères constitutifs de la matrice est amphiphile. Il est également possible d'utiliser, dans le cas où le plasma riche en plaquettes est soumis à une nouvelle centrifugation, uniquement le culot plaquettaire et de le mélanger avec une solution physiologique aqueuse, telle qu'une solution de Ringer stérile, renfermant des cations, de préférence monovalents, tels que du sodium, aptes à être échangés avec les ions calcium de la matrice biopolymérique au cours de son hydratation. of the cell activator are thrombocytes incorporating growth and / or angiogenesis factors, the plasma containing these thrombocytes is preferably used as hydration medium. This plasma, called platelet rich plasma (PRP), is obtained from a blood sample preferably made up of the blood of the patient to be treated. Thus, 60 milliliters of blood and 6 milliliters of a citrate and dextrose solution are subjected to centrifugation at 140 g for twenty minutes at 40C. At the end of this centrifugation, 50 ml of platelet-rich plasma are obtained. This platelet-rich plasma is directly introduced, aseptically, into the pocket containing the sterile biopolymer matrix, then subjected to stirring by means of an apparatus such as a stomacher to allow absorption of the plasma by the biopolymer matrix. This absorption is facilitated by the fact that at least one of the biopolymers constituting the matrix is amphiphilic. It is also possible to use, if the platelet-rich plasma is subjected to a new centrifugation, only the platelet pellet and to mix it with an aqueous physiological solution, such as a sterile Ringer solution, containing cations , preferably monovalent, such as sodium, capable of being exchanged with the calcium ions of the biopolymeric matrix during its hydration.
On constate en effet que la solution de Ringer utilisée notamment dans le milieu chirurgical présente une composition sensiblement similaire à celle du plasma sanguin, notamment en ce qui concerne la présence du type d'ions présents dans ladite solution à savoir des ions sodium, calcium, potassium et chlorure. It can be seen that the Ringer solution used in particular in the surgical environment has a composition substantially similar to that of blood plasma, in particular with regard to the presence of the type of ions present in said solution, namely sodium, calcium ions, potassium and chloride.
Pour confirmer l'efficacité de la composition ci-dessus, une étude a été effectuée portant sur un gel de pectate placé dans un milieu biologique reconstitué. Ainsi, 3g de pectate de sodium LM ont été mélangés avec 0, 83g de To confirm the effectiveness of the above composition, a study was carried out on a pectate gel placed in a reconstituted biological medium. Thus, 3g of LM sodium pectate were mixed with 0.83g of
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chlorure de calcium (CaCl2) en solution dans 30 ml de milieu biologique reconstitué. Par milieu biologique reconstitué, on entend ici un milieu constitué de 500 ml de sérum physiologique Aguettant (marque déposée) additionné de 0,13 g de chlorure de calcium sec. Ce milieu est soumis à une microfiltration sur membrane de 0,2 Mm avant d'être mélangé au pectate de sodium LM. L'ensemble pectate/chlorure de calcium en solution est introduit dans une poche puis soumis à un mélange au moyen d'un stomacher comme décrit ci-dessus avant d'être lyophilisé. calcium chloride (CaCl2) in solution in 30 ml of reconstituted biological medium. By reconstituted biological medium is meant here a medium consisting of 500 ml of Aguettant physiological serum (registered trademark) added with 0.13 g of dry calcium chloride. This medium is subjected to microfiltration on a 0.2 Mm membrane before being mixed with LM sodium pectate. The whole pectate / calcium chloride in solution is introduced into a bag and then subjected to a mixture by means of a stomacher as described above before being lyophilized.
Environ 3g de pectate de calcium du lyophilisat ci-dessus sont ensuite mis en contact avec 50 ml de plasma riche en plaquettes. Le mélange est homogénéisé. Ce mélange est placé dans le compartiment supérieur d'un insert, ce compartiment supérieur étant séparé d'un compartiment inférieur par une membrane. Le compartiment inférieur contient le milieu biologique reconstitué décrit ci-dessus. About 3 g of calcium pectate from the above lyophilisate are then brought into contact with 50 ml of platelet-rich plasma. The mixture is homogenized. This mixture is placed in the upper compartment of an insert, this upper compartment being separated from a lower compartment by a membrane. The lower compartment contains the reconstituted biological medium described above.
La membrane laisse diffuser le PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes permettant la prolifération cellulaire) qui est dosé à des temps déterminés dans le liquide biologique du compartiment inférieur de l'insert. The membrane allows PDGF (growth factor derived from platelets allowing cell proliferation) to diffuse, which is dosed at specified times in the biological fluid of the lower compartment of the insert.
Ce dosage du PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes) est effectué sur vingt-quatre heures par mesure de la concentration de ce facteur de croissance par millilitre de solution. Les résultats sont fournis dans le tableau ci-après.
This assay for PDGF (growth factor derived from platelets) is carried out over twenty-four hours by measuring the concentration of this growth factor per milliliter of solution. The results are provided in the table below.
Concentration To To + lh To + 5h To + 12h To + 24h cumulée de PDGF dans la 0 32 187 260 284 solution en mg/ml Ces résultats montrent clairement une libération progressive du facteur de croissance dans le milieu d'hydratation du polymère.Concentration To To + lh To + 5h To + 12h To + 24h cumulative PDGF in the 0 32 187 260 284 solution in mg / ml These results clearly show a gradual release of the growth factor in the hydration medium of the polymer.
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