FR2734843A1 - Bio-conversion of substrate with microbe auxotrophic for cpd. in medium deficient in this cpd. - Google Patents
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Abstract
Description
NOUVEAU PROCEDE DE BIOCONVERSION MICROBIENNE.NEW PROCESS FOR MICROBIAL BIOCONVERSION.
La présente invention a pour objet un nouveau procédé de bioconversion enzymatique, et ses applications, notamment dans le cadre de l'obtention d'arômes. The present invention relates to a new enzymatic bioconversion process, and its applications, in particular in the context of obtaining aromas.
Les arômes tiennent une place importante dans l'industrie agroalimentaire et représentent un marché de plusieurs milliards de francs. Le marché mondial des arômes alimentaires est en progression constante depuis plusieurs années. A l'intérieur de ce marché, les arômes dits "naturels" bénéficient d'un préjugé favorable auprès de l'opinion publique. Ces arômes "naturels" sont actuellement produits soit par extraction de matières végétales, soit par bioconversion enzymatique ou microbienne. Aromas hold an important place in the food industry and represent a market of several billion francs. The global food flavoring market has been growing steadily for several years. Within this market, so-called "natural" aromas benefit from a favorable prejudice among public opinion. These "natural" flavors are currently produced either by extraction of plant materials, or by enzymatic or microbial bioconversion.
Parmi les arômes, les lactones qui confèrent le goût de pêche ou celui de noix de coco sont très recherchées et ont une grande importance économique pour les industries aromatiques et agro-alimentaires. Ces lactones sont à l ' origine des odeurs fruitées des cultures de certaines levures et de champignons filamenteux. Among the aromas, the lactones which confer the peach or coconut taste are highly sought after and have great economic importance for the aromatic and food industries. These lactones are at the origin of the fruity odors of the cultures of certain yeasts and filamentous fungi.
Parmi les champignons, les basidiomycètes tels que Polyporus durus,
Bjerkandera adusta, Poria aurea, Ischnoderma benzoinum et Tyromyces sambuceus sont capables de produire des lactones (Gross et Asther, 1989,
Sciences des aliments, 9: 427454). Dans tous les cas, il s'agit d'une production de lactones par biosynthèse et les rendements restent faibles (de l'ordre de quelques milligrammes par litre).Among the fungi, basidiomycetes such as Polyporus durus,
Bjerkandera adusta, Poria aurea, Ischnoderma benzoinum and Tyromyces sambuceus are capable of producing lactones (Gross and Asther, 1989,
Food Science, 9: 427454). In all cases, it is a production of lactones by biosynthesis and the yields remain low (of the order of a few milligrams per liter).
La capacité des levures à effectuer la bioconversion de certains acides gras en lactones a été décrite dès 1963 (Okui et al., 1963, J. Biochem., 54: 536-540). La levure modèle Saccharomyces cerevisiae peut également produire certaines lactones à des teneurs industriellement intéressantes (Boog et al., 1990, brevet EP 0371 568; Boog et al., 1991, brevet EP 0409 321; Van der Schaft et de Laat, 1991, brevet EP 0425 001). Par ailleurs, plusieurs publications (Cardillo et al., 1989, J. Org. Chem., 54: 49794980; Albrecht et al., 1992, J. Org. Chem., 57: 1954-1956; Ercoli et al., 1992, Biotech. The capacity of yeasts to carry out the bioconversion of certain fatty acids into lactones has been described since 1963 (Okui et al., 1963, J. Biochem., 54: 536-540). The model yeast Saccharomyces cerevisiae can also produce certain lactones at industrially advantageous levels (Boog et al., 1990, patent EP 0371 568; Boog et al., 1991, patent EP 0409 321; Van der Schaft and de Laat, 1991, patent EP 0425 001). In addition, several publications (Cardillo et al., 1989, J. Org. Chem., 54: 49794980; Albrecht et al., 1992, J. Org. Chem., 57: 1954-1956; Ercoli et al., 1992 , Biotech.
Letters, 14: 665-668) et brevets (Farbood et Willis, 1983, brevet
WO 8301072; Cardillo et al., 1990, brevet EP 0356 291; Cardillo et al., 1991, brevet EP 0412 880) mettent en évidence la capacité de champignons (Cladosporium suaveolens) et de levures (Sporidiobolus salmonicolor,
Yarrowia lipolytica, Pichia guillermondii, Pichia etchellsii, Kluyveromyces lactis) à effectuer la bioconversion d'acides gras en lactones et notamment l'acide ricinoléique (acide 12-hydroxy octadec-9-énoique) en y-décalactone. Letters, 14: 665-668) and patents (Farbood and Willis, 1983, patent
WO 8301072; Cardillo et al., 1990, patent EP 0356,291; Cardillo et al., 1991, patent EP 0412 880) demonstrate the capacity of fungi (Cladosporium suaveolens) and yeasts (Sporidiobolus salmonicolor,
Yarrowia lipolytica, Pichia guillermondii, Pichia etchellsii, Kluyveromyces lactis) to carry out the bioconversion of fatty acids into lactones and in particular ricinoleic acid (12-hydroxy octadec-9-enoic acid) into y-decalactone.
Comme précédemment dans le cadre de l'utilisation de champignons, dans tous les cas où la production est obtenue par biosynthèse à partir des levures susmentionnées, celle-ci reste très faible (quelques milligrammes par litre).As before in the context of the use of mushrooms, in all cases where production is obtained by biosynthesis from the above-mentioned yeasts, it remains very low (a few milligrams per liter).
Dans les cas de bioconversion, si la production est industriellement intéressante (quelques grammes par litre), ce sont les rendements de bioconversion qui sont faibles. Actuellement seule la y-décalactone (R) est produite par l'industrie aromatique par biotransformation microbienne.In the case of bioconversion, if the production is industrially interesting (a few grams per liter), it is the bioconversion yields that are low. Currently only y-decalactone (R) is produced by the aromatic industry by microbial biotransformation.
Actuellement, seule la y-décalactone (R) est produite par l'industrie aromatique par biotransformation microbienne. Farbood et collaborateurs (WO 8301072) ont obtenu à partir d'huile de ricin une production de l'ordre de 1 g/l de y-décalactone après une fermentation de 7 jours. Plus récemment, la société
BASF a développé un procédé de production de y-décalactone en utilisant
Yarrowia lipolytica. Par bioconversion en fermenteur de 14 litres sur ricinoléate d'éthyle (70 g/l), une production de 5 g/l de -décalactone (DE 4126997 Al) après 3 jours de fermentation a ainsi été obtenue par BASF.Currently, only γ-decalactone (R) is produced by the aromatic industry by microbial biotransformation. Farbood et al. (WO 8301072) obtained from castor oil a production of the order of 1 g / l of y-decalactone after a fermentation of 7 days. More recently, the company
BASF has developed a process for the production of y-decalactone using
Yarrowia lipolytica. By bioconversion in a 14 liter fermenter on ethyl ricinoleate (70 g / l), a production of 5 g / l of -decalactone (DE 4126997 Al) after 3 days of fermentation was thus obtained by BASF.
L'Institut National de la Recherche Agronomique (I.N.R.A.) utilise S. ruinenii pour réaliser la bioconversion du ricinoléate de méthyle en R y-décalactone (FR 2705971 Al). Une production de 6,9 g/l après 14 jours de fermentation a ainsi été obtenue par l'I.N.R.A.The National Institute for Agronomic Research (I.N.R.A.) uses S. ruinenii to carry out the bioconversion of methyl ricinoleate to R y-decalactone (FR 2705971 Al). A production of 6.9 g / l after 14 days of fermentation was thus obtained by the I.N.R.A.
D'autres lactones peuvent aussi être obtenues par bioconversion d'autres substrats. Par exemple, après culture de Yarrowia lipolytica en présence d'acide hydroxylinoléique pendant 24 heures, on obtient des huiles brutes comportant les lactones suivantes: y-décanolide (19,7%), 6-décanolide (1,5%) et y-6-dodécénolide (0,66%) (brevet EP 412 880 A2), toutefois les rendements de bioconversion restent faibles. Other lactones can also be obtained by bioconversion of other substrates. For example, after culturing Yarrowia lipolytica in the presence of hydroxylinoleic acid for 24 hours, crude oils are obtained containing the following lactones: y-decanolide (19.7%), 6-decanolide (1.5%) and y- 6-dodecenolide (0.66%) (patent EP 412 880 A2), however the bioconversion yields remain low.
Les procédés de bioconversion microbienne actuellement proposés dans le cadre de la production d'arômes font appel à un grand nombre de souches, majoritairement des levures, et présentent des productions situées en général entre 1 et 2 g/l d'arôme, au bout de cinq à sept jours de culture sur milieu de biotransformation. Quelques productions plus importantes (autour de 5 g/l) ont été obtenues à l'aide des souches Yarrowia lipolytica, Candida petrophilum et
Cladosporium suaveolens (Farbood et Willis, 1983, Farbood et al., 1990,
Cardillo et al., 1990, susmentionnés). Cependant, ces valeurs ne sont atteintes qu'après une durée importante de culture (7 à 1 1 jours), sur des milieux qui contiennent souvent des substances potentiellement néfastes pour la note aromatique comme des extraits de viande (Farbood et Willis, 1983 susmentionné).Les plus fortes productivités ont été obtenues par Farbood et
Willis, 1983, susmentionné (0,9 g/l/j), Boog et al., 1990, susmentionné (0,75 g/l/j), et Cardillo et al., 1990, susmentionné (0,33 g/i/j). The microbial bioconversion processes currently proposed within the framework of the production of aromas call upon a large number of strains, mainly yeasts, and present productions generally situated between 1 and 2 g / l of aroma, at the end of five to seven days of culture on biotransformation medium. Some larger productions (around 5 g / l) were obtained using the strains Yarrowia lipolytica, Candida petrophilum and
Cladosporium suaveolens (Farbood and Willis, 1983, Farbood et al., 1990,
Cardillo et al., 1990, mentioned above). However, these values are only reached after a significant period of culture (7 to 11 days), on media which often contain substances potentially harmful to the aromatic note such as meat extracts (Farbood and Willis, 1983 mentioned above) The highest productivity was obtained by Farbood and
Willis, 1983, above mentioned (0.9 g / l / d), Boog et al., 1990, above mentioned (0.75 g / l / d), and Cardillo et al., 1990, above mentioned (0.33 g / i / j).
La présente invention a pour but de fournir un procédé de bioconversion microbienne permettant d'obtenir des produits déterminés, notamment des lactones, dans des quantités aussi importantes, sinon plus importantes, et en un temps nettement plus court, que le permettent les méthodes actuellement proposées dans ce domaine. The object of the present invention is to provide a microbial bioconversion process making it possible to obtain determined products, in particular lactones, in quantities which are as large, if not greater, and in a much shorter time than the methods currently proposed allow. in this domain.
La présente invention a également pour but de fournir un procédé de bioconversion microbienne dans lequel les produits déterminés obtenus sont, à l'état brut, en mélange avec des quantités plus faibles de constituants de milieux de culture, et sont donc plus faciles à purifier, que les produits obtenus par les méthodes actuelles. The present invention also aims to provide a microbial bioconversion process in which the determined products obtained are, in the raw state, mixed with lower amounts of constituents of culture media, and are therefore easier to purify, than the products obtained by current methods.
A ce titre, la présente invention a pour but de fournir un nouveau procédé de bioconversion microbienne dans lequel les milieux de culture utilisés n'affectent pas la note aromatique des lactones ou autres produits obtenus, car ne comprenant pas ou peu de substances telles que des extraits de viande, néfastes pour la qualité aromatique de ces produits. As such, the present invention aims to provide a new microbial bioconversion process in which the culture media used do not affect the aromatic note of the lactones or other products obtained, since they contain little or no substances such as meat extracts, harmful to the aromatic quality of these products.
L'invention a pour objet l'utilisation d'une (ou plusieurs) souche(s) de micro-organismes auxotrophes pour au moins un composé déterminé, dans le cadre de la mise en oeuvre de procédés de bioconversion microbienne de substrats déterminés, en vue de l'obtention de produits déterminés, l'étape de bioconversion de ces procédés étant effectuée dans un milieu de culture pour micro-organismes comprenant au moins un substrat susceptible d'être bioconverti par une (ou plusieurs) enzyme(s) produite(s) par la (ou les) souche(s) susmentionnée(s), ledit milieu de culture ne comprenant pas le (ou les) composé(s) déterminé(s) susmentionné(s), pour lequel (ou lesquels) lesdits micro-organismes sont auxotrophes, ou en comprenant en quantité suffisante pour que ce (ou ces) composé(s) permette(nt) I'induction de la production de l'(ou des) enzyme(s) susmentionnée(s) par ladite (ou lesdites) souche(s), sans pour autant permettre une croissance significative (à savoir une multiplication significative) de ladite (ou desdites) souche(s) dans le milieu de culture. The subject of the invention is the use of one (or more) strain (s) of auxotrophic microorganisms for at least one determined compound, within the framework of the implementation of microbial bioconversion processes of determined substrates, in with a view to obtaining determined products, the step of bioconversion of these processes being carried out in a culture medium for microorganisms comprising at least one substrate capable of being bioconverted by one (or more) enzyme (s) produced ( s) by the above-mentioned strain (s), said culture medium not comprising the above-mentioned determined compound (s), for which (or which) said micro -organisms are auxotrophic, or comprising in sufficient quantity so that this (or these) compound (s) allows (s) the induction of the production of the enzyme (s) mentioned above (s) by said ( or said) strain (s), without allowing significant growth (i.e. a multiplication significant cation) of said strain (s) in the culture medium.
Parmi les micro-organismes auxotrophes pour au moins un composé déterminé, susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la présente invention, on peut citer principalement les bactéries, les virus, les levures et les champignons. Among the auxotrophic microorganisms for at least one determined compound, capable of being used in the context of the present invention, mention may mainly be made of bacteria, viruses, yeasts and fungi.
Parmi les produits déterminés susceptibles d'être obtenus dans le cadre de la présente invention, on peut citer les lactones telles que celles obtenues par bioconversion d'acides gras par des levures, notamment la y-décalactone obtenue par bioconversion d'huile de ricin ou du ricinoléate de méthyle, par des levures du genre Yarrowia (telles que Y. lipotytica), ou du genre
Sporidiobolus (telles que S. ruinenii), ou encore du genre Fusarium. Toujours parmi les lactones susceptibles d'être produites dans le cadre de la présente invention, on peut citer également la y-décanolide, la 8décanolide, ou la y-6-dodécénolide obtenues par bioconversion d'acide hydroxylinoléique par des levures du genre Yarrowia (telles que Yarrowia lipotytica).Among the determined products capable of being obtained in the context of the present invention, mention may be made of lactones such as those obtained by bioconversion of fatty acids with yeasts, in particular γ-decalactone obtained by bioconversion of castor oil or methyl ricinoleate, by yeasts of the genus Yarrowia (such as Y. lipotytica), or of the genus
Sporidiobolus (such as S. ruinenii), or of the genus Fusarium. Still among the lactones capable of being produced within the framework of the present invention, mention may also be made of y-decanolide, 8decanolide, or y-6-dodecenolide obtained by bioconversion of hydroxylinoleic acid by yeasts of the genus Yarrowia ( such as Yarrowia lipotytica).
L'acide citrique peut également être cité en tant que produit déterminé susceptible d'être obtenu dans le cadre de la présente invention, par bioconversion de glucose ou de saccharose par des levures du genre Yarrowia (telles que Yarrowia lipolytica). Citric acid can also be cited as a specific product which can be obtained in the context of the present invention, by bioconversion of glucose or sucrose by yeasts of the genus Yarrowia (such as Yarrowia lipolytica).
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de la souche de Yarrowia lipolytica auxotrophe pour un composé déterminé, notamment pour l'uracile, dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé de bioconversion du ricinoléate de méthyle en vue de l'obtention de y-décalactone, l'étape de bioconversion dudit procédé étant effectuée dans un milieu de culture comprenant le ricinoléate de méthyle, mais ne comprenant pas d'uracile, ou autre composé déterminé susmentionné, ou comprenant de l'uracile, ou autre composé déterminé susmentionné, en quantité suffisante pour permettre l'induction de la production des enzymes de ladite souche nécessaires à la bioconversion du ricinoléate de méthyle en y-décalactone, sans pour autant permettre une croissance significative de la souche dans le milieu de culture. A more particular subject of the invention is the use of the strain of Yarrowia lipolytica auxotrophic for a determined compound, in particular for uracil, within the framework of the implementation of a process of bioconversion of methyl ricinoleate for the purpose of obtaining y-decalactone, the bioconversion step of said process being carried out in a culture medium comprising methyl ricinoleate, but not comprising uracil, or other determined compound mentioned above, or comprising uracil, or other determined compound mentioned above, in an amount sufficient to allow the induction of the production of the enzymes of said strain necessary for the bioconversion of methyl ricinoleate into γ-decalactone, without however allowing significant growth of the strain in the culture medium.
L'invention a également pour objet tout procédé de bioconversion microbienne d'un (ou plusieurs) substrat(s) déterminé(s), caractérisé en ce qu'il comprend:
- une étape d'ensemencement d'un milieu de culture pour microorganismes avec une (ou plusieurs) souche(s) de micro-organismes auxotrophes, pour un (ou plusieurs) composé(s) déterminé(s), ce milieu de culture comprenant un (ou plusieurs) substrat(s) susceptible(s) d'être bioconverti(s) par une (ou plusieurs) enzyme(s) produite(s) par la (ou les) souche(s) susmentionnée(s), mais ne comprenant pas le (ou les) composé(s) déterminé(s) susm
entionné(s), pour lequel (ou lesquels) lesdits micro-organismes sont auxotrophes ni, le cas échéant, d'autres composants nécessaires à la croissance des micro-organismes, ou comprenant le (ou les) composé(s) déterminé(s) susmentionné(s), et, le cas échéant, d'autres composants susmentionnés, en quantité suffisante pour que ce (ou ces) composé(s) et, le cas échéant, ces autres composants, permette(nt) l'induction de la production de l' (ou des) enzyme(s) susmentionnée(s) par ladite (ou lesdites) souche(s), sans pour autant permettre une croissance significative de la (ou des) souche(s) dans le milieu de culture,
- l'extraction et, le cas échéant, la purification, du (ou des) produit(s) résultant de la réaction de bioconversion du (ou des) substrat(s) déterminé(s) par une (ou plusieurs) enzyme(s) produite(s) par la (ou les) souche(s) auxotrophe(s) susmentionnée(s).The subject of the invention is also any process for microbial bioconversion of one (or more) determined substrate (s), characterized in that it comprises:
a step of seeding a culture medium for microorganisms with one (or more) strain (s) of auxotrophic microorganisms, for one (or more) determined compound (s), this culture medium comprising one (or more) substrate (s) capable of being bioconverted (s) by one (or more) enzyme (s) produced (s) by the above-mentioned strain (s), but not including the compound (s) determined above
entioned (s), for which (or which) said microorganisms are auxotrophic nor, if necessary, other components necessary for the growth of microorganisms, or comprising the (or) compound (s) determined (s) ) above-mentioned (s), and, where appropriate, other above-mentioned components, in sufficient quantity so that this (or these) compound (s) and, where appropriate, these other components, allow (s) the induction of the production of the abovementioned enzyme (s) by said strain (s), without however allowing significant growth of the strain (s) in the culture medium ,
- the extraction and, where appropriate, the purification, of the product (s) resulting from the bioconversion reaction of the substrate (s) determined by one (or more) enzyme (s) ) produced by the aforementioned auxotrophic strain (s).
Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend, préalablement à l'étape d'ensemencement du milieu de culture comprenant le (ou les) substrat(s) mais ne comprenant pas, ou en faible quantité, le (ou les) composé(s) déterminé(s) pour lequel (ou lesquels) lesdits micro-organismes sont auxotrophes, une étape de production d'une biomasse comprenant ladite (ou lesdites) souche(s) auxotrophe(s) susceptible(s) d'être mise(s) en culture dans le milieu susmentionné, cette étape de production de biomasse étant réalisée par mise en culture de la (ou des) souche(s) auxotrophe(s) susmentionnée(s) dans un milieu de culture susceptible de permettre une croissance significative de ladite (ou desdites) souche(s) susmentionnée(s), le milieu de culture comprenant le (ou les) composé(s) déterminé(s) susmentionné(s), mais ne comprenant pas le (ou les) substrat(s) susceptible(s) d'être converti(s) par des enzymes produites par le (ou les) souche(s) auxotrophe(s) susmentionnée(s). Advantageously, the method according to the invention comprises, prior to the step of seeding the culture medium comprising the substrate (s) but not comprising, or in small quantity, the compound (s) ) determined for which (or which) said microorganisms are auxotrophic, a step of producing a biomass comprising said (or said) auxotrophic strain (s) capable of being placed ) in culture in the abovementioned medium, this step of producing biomass being carried out by culturing the above-mentioned auxotrophic strain (s) in a culture medium capable of allowing significant growth of said aforementioned strain (s), the culture medium comprising the above-mentioned determined compound (s), but not comprising the substrate (s) capable of being converted by enzymes produced by the above-mentioned auxotrophic strain (s) ( s).
Cette étape préalable de production d'une biomasse importante de souches de micro-organismes a essentiellement pour but de permettre un ensemencement à haute densité des milieux de culture ne comprenant pas ou peu de composés pour lesquels lesdites souches sont auxotrophes, dans le cadre de la mise en oeuvre des procédés susmentionnés de l'invention. This prior step of producing a large biomass of strains of microorganisms essentially aims to allow a high density seeding of the culture media comprising no or few compounds for which said strains are auxotrophic, in the context of implementation of the above-mentioned methods of the invention.
Les souches de micro-organismes auxotrophes pour au moins un composé déterminé et susceptibles d'être utilisées dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention sont avantageusement choisies parmi celles décrites ci-dessus. The strains of auxotrophic microorganisms for at least one determined compound and capable of being used in the context of the implementation of a method according to the invention are advantageously chosen from those described above.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, les micro-organismes utilisés sont des levures, et les produits obtenus sont des lactones issues de la bioconversion d'acides gras utilisés en tant que substrats, lesdites lactones étant susceptibles d'être utilisées en tant qu'arômes. According to a particular embodiment of the process of the invention, the microorganisms used are yeasts, and the products obtained are lactones resulting from the bioconversion of fatty acids used as substrates, said lactones being capable of being used as flavorings.
L'invention a plus particulièrement pour objet tout procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel la souche utilisée est une souche mutante de Yarrowia lipolytica auxotrophe pour un composé déterminé, notamment pour l'uracile, et le substrat utilisé est le ricinoléate de méthyle. The invention more particularly relates to any process as described above, in which the strain used is a mutant strain of Yarrowia lipolytica auxotrophic for a determined compound, in particular for uracil, and the substrate used is methyl ricinoleate .
A ce titre, l'invention concerne plus particulièrement un procédé de production de hy-décalactone comprenant les étapes suivantes:
- une étape d'ensemencement d'un milieu de culture pour microorganismes, avec une souche mutante de Yarrowia lipolytica auxotrophe pour l'uracile, ce milieu de culture ne comprenant pas d'uracile, ni, le cas échéant, d'autres composants nécessaires à la croissance des micro-organismes tels que principalement du glucose et du lactate, ou comprenant de l'uracile et, le cas échéant, d'autres composants susmentionnés, en quantité suffisante pour permettre l'induction des enzymes produites par Yarrowia lipolytica, et plus particulièrement des enzymes impliquées dans la '3-oxydation, telles que l'Acyl-CoA oxydase (EC.6.2. 1.3) ou la 3-cétoacyl-CoA thiolase (EC.2.3.1.16), ledit milieu de culture comprenant du ricinoléate de méthyle,
- l'extraction et, le cas échéant, la purification de la y-décalactone produite par bioconversion du ricinoléate de méthyle par les enzymes produites par Yarrowia lipolytica.As such, the invention relates more particularly to a process for producing hy-decalactone comprising the following steps:
a step of seeding a culture medium for microorganisms, with a mutant strain of Yarrowia lipolytica auxotrophic for uracil, this culture medium comprising no uracil, or, if necessary, other necessary components the growth of microorganisms such as mainly glucose and lactate, or comprising uracil and, where appropriate, other components mentioned above, in an amount sufficient to allow the induction of the enzymes produced by Yarrowia lipolytica, and more particularly enzymes involved in 3-oxidation, such as Acyl-CoA oxidase (EC.6.2. 1.3) or 3-ketoacyl-CoA thiolase (EC.2.3.1.16), said culture medium comprising ricinoleate methyl,
- the extraction and, where appropriate, the purification of the y-decalactone produced by bioconversion of methyl ricinoleate by the enzymes produced by Yarrowia lipolytica.
Avantageusement, dans le cadre du procédé de production de y-décalactone susmentionné, l'ensemencement du milieu de culture avec la souche mutante de Yarrowia lipolytica est effectué à raison d'environ 10 g à environ 100 g en poids sec de levures par litre de milieu de culture, ledit milieu de culture comprenant du ricinoléate de méthyle à raison d'environ 15 g à environ 150 g par litre de milieu de culture, et comprenant de l'uracile à raison d'environ 5 à environ 100 mg par litre de milieu de culture, et le cas échéant, du glucose à raison d'environ 0,1 g à environ 1 g par litre de milieu de culture, et/ou du lactate à raison d'environ 0,1 g à environ 5 g par litre de milieu de culture. Advantageously, within the framework of the abovementioned process for producing y-decalactone, the culture medium is inoculated with the mutant strain of Yarrowia lipolytica is carried out at a rate of approximately 10 g to approximately 100 g by dry weight of yeasts per liter of culture medium, said culture medium comprising methyl ricinoleate in an amount of about 15 g to about 150 g per liter of culture medium, and comprising uracil in an amount of about 5 to about 100 mg per liter of culture medium, and if necessary, glucose at a rate of about 0.1 g to about 1 g per liter of culture medium, and / or lactate at a rate of about 0.1 g to about 5 g per liter of culture medium.
Avantageusement encore, le procédé susmentionné de production de y-décalactone comprend une étape préalable de production de Yarrowia lipolytica auxotrophe pour l'uracile, en quantité suffisante pour permettre l'ensemencement du milieu de culture tel que défini ci-dessus, avec cette dernière souche à raison d'environ 10 g à environ 100 g en poids sec de levures par litre de milieu de culture, cette étape préalable étant effectuée par mise en culture d'environ 3 g à environ 100 g en poids humide de levures (ce qui correspond à environ 1 g à environ 30 g en poids sec) par litre de milieu de culture, de l'espèce Yarrowia lipolytica auxotrophe pour l'uracile, dans un milieu comprenant de l'uracile à raison d'environ 100 mg à environ 500 mg par litre de milieu de culture, et d'autres composants nécessaires à la croissance de ces levures, tels que du glucose à raison d'environ 10 g à environ 50 g par litre de milieu de culture, et/ou du lactate à raison d'environ 20 g à environ 50 g par litre de milieu de culture. Advantageously still, the abovementioned process for the production of y-decalactone comprises a preliminary stage of production of Yarrowia lipolytica auxotrophic for uracil, in an amount sufficient to allow the seeding of the culture medium as defined above, with this latter strain. at a rate of approximately 10 g to approximately 100 g by dry weight of yeasts per liter of culture medium, this preliminary step being carried out by culturing from approximately 3 g to approximately 100 g by wet weight of yeasts (which corresponds about 1 g to about 30 g dry weight) per liter of culture medium, of the species Yarrowia lipolytica auxotrophic for uracil, in a medium comprising uracil at a rate of about 100 mg to about 500 mg per liter of culture medium, and other components necessary for the growth of these yeasts, such as glucose at a rate of about 10 g to about 50 g per liter of culture medium, and / or lactate at a rate of '' about 2 0 g to about 50 g per liter of culture medium.
Le procédé d'obtention de y-décalactone selon l'invention permet avantageusement d'obtenir entre environ 5 g/l à environ 15 g/l de y-décalactone dans un intervalle de temps d'environ 48 à environ 80 heures. The process for obtaining y-decalactone according to the invention advantageously makes it possible to obtain between approximately 5 g / l to approximately 15 g / l of y-decalactone in a time interval of approximately 48 to approximately 80 hours.
L'invention a également pour objet la souche de Yarrowia lipolytica PO1D auxotrophe pour l'uracile, telle qu'obtenue par mutation du gène URA3 de la souche Yarrowia lipolytica W29 (ATCC 24060), selon le protocole figurant dans la description détaillée qui suit de l'invention. A subject of the invention is also the strain of Yarrowia lipolytica PO1D auxotrophic for uracil, as obtained by mutation of the URA3 gene from the strain Yarrowia lipolytica W29 (ATCC 24060), according to the protocol appearing in the detailed description which follows of the invention.
L'invention vise également l'utilisation de la souche de Yarrowia lipolytica PO1D auxotrophe pour l'uracile, susmentionnée, pour la mise en oeuvre d'un procédé d'obtention de y-décalactone, tel que décrit ci-dessus. The invention also relates to the use of the strain of Yarrowia lipolytica PO1D auxotrophic for uracil, mentioned above, for the implementation of a process for obtaining y-decalactone, as described above.
L'extraction, et le cas échéant, la purification des produits déterminés, notamment de la y-décalactone, obtenus dans le cadre de la mise en oeuvre des procédés selon l'invention, peuvent être effectuées selon les techniques décrites dans les exemples qui suivent de réalisation de l'invention, ou encore par extraction à l'éther (US 3.076.750), par distillation (EP-A-0.371.568), par extraction par un solvant tel que le butylacétate (EP-A-0.409.321), par l'hexane (WO 83/01072), par séparation chromatographique et en particulier par HPLC (WO 89/12104). The extraction, and where appropriate, the purification of the determined products, in particular of the y-decalactone, obtained within the framework of the implementation of the methods according to the invention, can be carried out according to the techniques described in the examples which follow for carrying out the invention, or else by extraction with ether (US 3,076,750), by distillation (EP-A-0,371,568), by extraction with a solvent such as butylacetate (EP-A-0.409. 321), with hexane (WO 83/01072), by chromatographic separation and in particular by HPLC (WO 89/12104).
L'invention sera davantage illustrée dans les exemples qui suivent visant à améliorer la productivité du système de bioconversion, par l'utilisation d'une souche de Yarrowia lipolytica POlD auxotrophe pour l'uracile combinée avec un ensemencement à haute densité du milieu de bioconversion et en jouant sur les conditions du milieu pour obtenir à la fois une faible croissance et une induction maximale des enzymes impliquées dans la ss-oxydation (enzymes impliquées dans ladite bioconversion). The invention will be further illustrated in the following examples aimed at improving the productivity of the bioconversion system, by the use of a strain of Yarrowia lipolytica POlD auxotrophic for uracil combined with a high density seeding of the bioconversion medium and by playing on the conditions of the medium to obtain both low growth and maximum induction of the enzymes involved in ss-oxidation (enzymes involved in said bioconversion).
A) Obtention de la souche de Yarrowia lipolytica PO1D. A) Obtaining the strain of Yarrowia lipolytica PO1D.
Le gène URA3 de la souche Yarrowia lipolytica (W29, ATCC 24060) a été remplacé par un gène de fusion XPR2-SUC2 (fragment SalI du plasmide pINA302, voir figure 1). Les transformants sont sélectionnés en fonction de leur pouvoir d'utilisation du saccharose (phénotype Suc +, Nicaud et al.,
Current Genet., 1989, 16: 253-260). Toutes les souches sauvages de Y.The URA3 gene of the Yarrowia lipolytica strain (W29, ATCC 24060) was replaced by a XPR2-SUC2 fusion gene (SalI fragment of the plasmid pINA302, see FIG. 1). The transformants are selected according to their power to use sucrose (Suc + phenotype, Nicaud et al.,
Current Genet., 1989, 16: 253-260). All wild strains of Y.
lipolytica testées jusqu'à ce jour sont Suc-. Les transformants Suc+ (1000 2000/yg de fragment) ont été criblés en fonction de leur phénotype Ura- (à savoir en fonction de leur incapacité à utiliser l'uracile). 10 à 20% des transformants sont Ura- et la présence de copies discontinues du gène URA3 (ura 3-302) a été confirmée par hybridation selon la technique de Southern.lipolytica tested to date are Suc-. The Suc + transformants (1000 2000 / μg of fragment) were screened according to their Ura- phenotype (ie according to their inability to use uracil). 10 to 20% of the transformants are Ura- and the presence of discontinuous copies of the URA3 gene (ura 3-302) was confirmed by hybridization according to the Southern technique.
Afin d'obtenir d'autres dérivés de ces souches Ura-Suc+, les plasmides pINA 270 et pINA 322 ont été construits; ils portent le gène URA3 et soit le gène LEU2 délété, soit le gène XPR2 délété (voir figure 1). Ces délétions dans les gènes LEU2 et XPR2 ont été effectuées de la manière suivante. Les transformants Ura+ (105/yg de plasmide) ont été obtenus à l'aide de pINA 270 coupé au site unique NotI situé après le gène LEU2. Cinq transformants ont été ensemencés sur milieu YNB (Difco) contenant 15 mg/l d'uracile, 100 mg/l de leucine et 1,25 g/l d'acide fluoroorotique (5-FOA), à raison de 106 cellules par boîte d'ensemencement.Cinq clones 5-FOAR sont apparus à raison de 104/cellules en culture; l'analyse par Southern a permis de détecter que ces clones résultent de la ré-excision du plasmide intégré. 2% des clones 5-FOAR étaient Leu- et porteurs du gène délété LEU2. In order to obtain other derivatives of these Ura-Suc + strains, the plasmids pINA 270 and pINA 322 were constructed; they carry the URA3 gene and either the deleted LEU2 gene or the deleted XPR2 gene (see Figure 1). These deletions in the LEU2 and XPR2 genes were carried out as follows. The Ura + transformants (105 μg of plasmid) were obtained using pINA 270 cut at the unique NotI site located after the LEU2 gene. Five transformants were seeded on YNB medium (Difco) containing 15 mg / l of uracil, 100 mg / l of leucine and 1.25 g / l of fluoroorotic acid (5-FOA), at a rate of 106 cells per dish seeding. Five 5-FOAR clones appeared at a rate of 104 / cells in culture; Southern analysis made it possible to detect that these clones result from the re-excision of the integrated plasmid. 2% of the 5-FOAR clones were Leu- and carriers of the deleted LEU2 gene.
Ces souches (Ura-, Suc+, Leu-) ont été transformées en Ura+ en utilisant pINA 322 coupé au site unique MluI. La ré-excision du plasmide a été sélectionnée de la manière indiquée ci-dessus, et les dérivés XPR2- ont été isolés et leurs délétions LEU2 et XPR2 vérifiées (analyse par Southern). These strains (Ura-, Suc +, Leu-) were transformed into Ura + using pINA 322 cut at the unique MluI site. The re-excision of the plasmid was selected as indicated above, and the XPR2- derivatives were isolated and their LEU2 and XPR2 deletions verified (analysis by Southern).
En utilisant la procédure décrite ci-dessus, les souches POlA (Mat A, ura 3.302, leu 2.270) et PO1D (Mat A, ura 3.302, leu 2.270, xpr 2.322) ont été obtenues à partir de la souche W29. Using the procedure described above, the POlA (Mat A, ura 3.302, leu 2.270) and PO1D (Mat A, ura 3.302, leu 2.270, xpr 2.322) strains were obtained from the W29 strain.
B) Principes Généraux du procédé de l'invention. B) General principles of the process of the invention.
Le procédé de l'invention vise à améliorer la productivité du système de bioconversion. Pour cela, des souches mutantes de la levure Yarrowia lipolytica sont utilisées (souches YIP). Elles sont auxotrophes pour un composé X, tel que l'uracile. Il a été constaté, dans le cadre de la présente invention, que ces souches continuent à produire de la lactone en l'absence du composé X dans un milieu contenant 5 g/l de ricinoléate de méthyle (fig. 4). The method of the invention aims to improve the productivity of the bioconversion system. For this, mutant strains of the yarrow Yarrowia lipolytica are used (YIP strains). They are auxotrophic for a compound X, such as uracil. It was found, in the context of the present invention, that these strains continue to produce lactone in the absence of compound X in a medium containing 5 g / l of methyl ricinoleate (FIG. 4).
Cette auxotrophie des souches permet de développer un procédé original conduisant à une augmentation des teneurs en y-décalactone par unités de volume et de temps. Pour ce faire, un protocole en deux étapes est utilisé:
- production d'une quantité importante de biomasse par une préculture courte (16 h) dans un milieu glucosé comportant le composé X;
- inoculation d'un milieu à 30 g/l de ricinoléate de méthyle et dépourvu du composé X par une quantité élevée de biomasse (10 g/l) permettant de conduire la bioconversion dans un milieu à densité élevée en cellules en un temps court.This auxotrophy of the strains makes it possible to develop an original process leading to an increase in the contents of y-decalactone per unit of volume and time. To do this, a two-step protocol is used:
- Production of a significant amount of biomass by a short preculture (16 h) in a glucose medium comprising compound X;
- Inoculation of a medium with 30 g / l of methyl ricinoleate and devoid of compound X with a high amount of biomass (10 g / l) allowing bioconversion to be carried out in a medium with high cell density in a short time.
Les premiers essais ont été menés en fioles de culture de 250 ml contenant 100 ml de milieu à 27"C, pendant 7 jours avec une agitation de 110 tours/min. La cinétique de production de lactone est représentée sur la figure 5. La production obtenue en final était de 420 p.p.m., ce qui est une valeur élevée lors d'une culture en fiole (de l'ordre de 250 p.p.m. pour la levure Pichia guilliermondii utilisée comme modèle, par exemple). The first tests were carried out in 250 ml culture flasks containing 100 ml of medium at 27 ° C., for 7 days with stirring at 110 revolutions / min. The kinetics of lactone production are shown in FIG. 5. The production obtained in the end was 420 ppm, which is a high value during a culture in a flask (of the order of 250 ppm for the yeast Pichia guilliermondii used as a model, for example).
Une expérience utilisant un protocole similaire a ensuite été effectuée en fermenteur (27"C, agitation 200 tours/min., aération 0.2 v/v/m), de façon limitée dans le temps. 1,3 g/l de y-décalactone après 48 h de culture ont ainsi été obtenus. An experiment using a similar protocol was then carried out in a fermenter (27 "C, stirring 200 rpm, aeration 0.2 v / v / m), in a limited time. 1.3 g / l of y-decalactone after 48 h of culture were thus obtained.
Ces résultats sont particulièrement intéressants pour les raisons suivantes:
1) le milieu utilisé est simple et ne comprend pas de substances telles que des extraits de viandes, qui risqueraient d'entraîner la production de molécules indésirables;
2) la production d'arôme démarre très tôt sur le milieu de bioconversion (après 24 heures de culture, on retrouve déjà 0,7 g/l de lactone dans le milieu);
3) après 48 heures de culture, on obtient déjà une quantité d'arôme équivalente ou supérieure à la majorité des exemples actuellement connus dans ce domaine, qui généralement concernent des durées de culture nettement plus longues (Farbood et al., 1983; Cheetham et al., 1988; Page et al., 1989; Boog et al. 1990; Cardillo et al., 1990).These results are particularly interesting for the following reasons:
1) the medium used is simple and does not include substances such as extracts of meat, which could cause the production of undesirable molecules;
2) aroma production starts very early on the bioconversion medium (after 24 hours of culture, 0.7 g / l of lactone are already found in the medium);
3) after 48 hours of culture, an amount of aroma is already obtained equivalent to or greater than the majority of the examples currently known in this field, which generally relate to significantly longer culture times (Farbood et al., 1983; Cheetham and al., 1988; Page et al., 1989; Boog et al. 1990; Cardillo et al., 1990).
C) Exemples détaillés. C) Detailed examples.
I. Matériel et méthodes. I. Materials and methods.
1. Les milieux de culture. 1. Culture media.
- Préculture. - Preculture.
On effectue une préculture des souches de Yarrowia lipolytica POlD étudiées sur gélose M.E.A. (gélose au malt) pendant 48 h à 27"C. A preculture of the strains of Yarrowia lipolytica POlD studied is carried out on M.E.A. (malt agar) for 48 h at 27 "C.
- Milieu de culture = milieu de bioconversion: voir exemples 1 à 6 ciaprès. - Culture medium = bioconversion medium: see examples 1 to 6 below.
Milieu de préculture gélose M.E.A. (g/l). Agar preculture medium M.E.A. (g / l).
- Extrait de malt 30
- Peptone farine soja 3
- Agar-agar 15
2. Extractlon et dosage de r-décalactone. - Malt extract 30
- Peptone soy flour 3
- Agar-agar 15
2. Extractlon and assay of r-decalactone.
Extraction des molécules volatiles. Extraction of volatile molecules.
L'extraction de la fraction volatile à partir du milieu de culture se fait grâce à un appareil de type "Flath et Forrey" car les composés d'arôme sont en général très fortement liés au matériel biologique et une ébullition est nécessaire pour les extraire du milieu. The extraction of the volatile fraction from the culture medium is done using an apparatus of the "Flath and Forrey" type because the aroma compounds are generally very strongly linked to the biological material and a boiling is necessary to extract them from the middle.
L'extraction est basée sur un système de codistillation-réfrigération. The extraction is based on a codistillation-refrigeration system.
D'un côté on place le milieu de culture, de l'autre, on place le solvant (dichlorométhane). On chauffe les deux solutions, les vapeurs se mélangent et se condensent au contact du réfrigérant. Le solvant s'enrichit ainsi en molécules volatiles.On one side the culture medium is placed, on the other, the solvent (dichloromethane) is placed. The two solutions are heated, the vapors mix and condense on contact with the refrigerant. The solvent is thus enriched with volatile molecules.
Chromatographie: dosage de la y-décalactone. Chromatography: determination of y-decalactone.
L'extrait aromatique est injecté dans un chromatographe en phase gazeuse pour quantifier les molécules produites par les micro-organismes et en particulier la -décalactone. The aromatic extract is injected into a gas chromatograph to quantify the molecules produced by microorganisms and in particular -decalactone.
Le chromatographe utilisé est un Packard 437 A muni d'un détecteur à ionisation de flamme (300"C), d'un injecteur spitless (200"C), d'une colonne capillaire Spirawax (25 m de long, diamètre interne 0.32 mm) avec comme gaz vecteur, l'azote. The chromatograph used is a Packard 437 A fitted with a flame ionization detector (300 "C), a spitless injector (200" C), a Spirawax capillary column (25 m long, internal diameter 0.32 mm ) with nitrogen as the carrier gas.
3. Etude de la consommation du ncmoléate de méthyle. 3. Study of the consumption of methyl ncmoleate.
Le dosage de méthyle présent dans le milieu se fait également par chromatographie en phase gazeuse. Le chromatographe utilisé est un Delsi
Di200 muni d'un détecteur à ionisation de flamme (300"C), d'un injecteur spitless (200"C), d'une colonne capillaire Spirawax (50 m de long, diamètre interne 0.32 mm). Le gaz vecteur est l'azote. The methyl determination present in the medium is also carried out by gas chromatography. The chromatograph used is a Delsi
Di200 fitted with a flame ionization detector (300 "C), a spitless injector (200" C), a Spirawax capillary column (50 m long, internal diameter 0.32 mm). The carrier gas is nitrogen.
4. Modes opératoires. 4. Procedures.
4.1 Ensemencements-prélevements. 4.1 Sowing-withdrawals.
On réalise une préculture de 48 h en boîtes de Pétri sur gélose M.E.A. A 48 hour preculture is carried out in Petri dishes on M.E.A.
de la souche étudiée. Ensuite, la surface de la gélose est lavée avec de l'eau physiologique stérile, on obtient alors une suspension concentrée en levures.of the strain studied. Then, the agar surface is washed with sterile physiological water, a concentrated suspension of yeasts is then obtained.
Une numération sur cellule de Malassez permet de déterminer le volume de suspension nécessaire à l'ensemencement. A Malassez cell count makes it possible to determine the volume of suspension necessary for seeding.
Six fioles sont ensemencées: une correspond au temps 0, les 5 autres fioles sont placées sur une table d'agitation (220 tpm, 27"C) pendant une durée de bioconversion de 6, 12, 24, 48 ou 81 heures. Six flasks are inoculated: one corresponds to time 0, the other 5 flasks are placed on a stirring table (220 rpm, 27 "C) for a bioconversion time of 6, 12, 24, 48 or 81 hours.
4.2 Sulvl de la biomasse. 4.2 Sulvl of biomass.
Pour chaque fiole prélevée (correspondant à un temps de bioconversion donné), on peut évaluer la quantité de levures, soit en mesurant la biomasse totale (cellules/ml), la biomasse viable (cellules/ml) ou la biomasse sèche (g/l). For each vial withdrawn (corresponding to a given bioconversion time), the quantity of yeast can be evaluated, either by measuring the total biomass (cells / ml), the viable biomass (cells / ml) or the dry biomass (g / l ).
La biomasse totale est déterminée grâce à une numération sur cellule de
Malassez: nombre de cellules par ml de milieu.The total biomass is determined using a cell count of
Malassez: number of cells per ml of medium.
La biomasse viable est déterminée par ensemencement sur boîtes de Pétri de dilutions décimales (afin d'obtenir un nombre de colonies < 300), ce qui permet de déterminer le nombre d'unités formatrices de colonies donc de cellules viables par ml. The viable biomass is determined by seeding on Petri dishes with decimal dilutions (in order to obtain a number of colonies <300), which makes it possible to determine the number of colony-forming units therefore of viable cells per ml.
La biomasse sèche est déterminée par prélèvement de 2 fois 50 ml de milieu:
- 50 ml serviront au dosage de la quantité de ricinoléate présent à la fois dans le milieu et la biomasse.The dry biomass is determined by taking 2 times 50 ml of medium:
- 50 ml will be used for the determination of the amount of ricinoleate present in both the medium and the biomass.
- 50 ml de milieu sont centrifugés 15 min à 5000 g pour séparer la biomasse du milieu de culture. Le culot est lavé 2 fois dans de l'eau physiologique stérile puis passé sur un filtre Millipore (diamètre des pores 0.45 ym) préalablement taré. Le filtre est alors mis à l'étuve à 105"C jusqu'à poids constant afin de déterminer la biomasse sèche (g/l). - 50 ml of medium are centrifuged for 15 min at 5000 g to separate the biomass from the culture medium. The pellet is washed twice in sterile physiological water and then passed through a Millipore filter (pore diameter 0.45 μm) previously tared. The filter is then placed in an oven at 105 "C to constant weight to determine the dry biomass (g / l).
Le surnageant permettra, quant à lui, l'extraction des molécules volatiles et le dosage de la y-décalactone. The supernatant will allow the extraction of volatile molecules and the determination of y-decalactone.
4.3. Extractlon de la fraction volatile et dosage de la y-décalactone. 4.3. Extractlon of the volatile fraction and assay of y-decalactone.
L'extraction de la fraction volatile à partir du surnageant obtenu précédemment se fait grâce à l'appareil de Flath et Forrey précédemment décrit (2). Le pH du milieu est auparavant amené à une valeur inférieure à 2 (par ajout d'HCl concentré) pour permettre une lactonisation complète de l'acide 4-hydroxy-décanoïque. L'extraction se fait sur un volume précis de surnageant (environ 50 ml) auquel on ajoute 3 gouttes de Triton X100 (anti mousse) et 1 ml d'étalon interne (y-undécalactone) de concentration connue. The extraction of the volatile fraction from the supernatant obtained previously is done using the apparatus of Flath and Forrey previously described (2). The pH of the medium is previously brought to a value less than 2 (by adding concentrated HCl) to allow complete lactonization of the 4-hydroxy-decanoic acid. The extraction is carried out on a precise volume of supernatant (approximately 50 ml) to which 3 drops of Triton X100 (anti-foam) and 1 ml of internal standard (y-undecalactone) of known concentration are added.
20 ml de dichlorométhane sont co-distillés pendant 40 min puis seul le solvant est chauffé pendant encore 20 min (rinçage). Le dichlorométhane enrichi en molécules volatiles est récupéré: cet extrait est ensuite injecté en chromatographie.20 ml of dichloromethane are co-distilled for 40 min then only the solvent is heated for a further 20 min (rinsing). The dichloromethane enriched in volatile molecules is recovered: this extract is then injected by chromatography.
1 pl d'extrait aromatique est injecté dans le chromatographe décrit en 2. 1 pl of aromatic extract is injected into the chromatograph described in 2.
Les conditions chromatographiques sont les suivantes:
- température initiale: 40"C, température finale: 230"C,
- programme de température: 100min pendant 6 min puis 2"C/min. The chromatographic conditions are as follows:
- initial temperature: 40 "C, final temperature: 230" C,
- temperature program: 100 min for 6 min then 2 "C / min.
L'étalon interne y-undécalactone (y-C11), qui a un comportement analogue à la y-décalactone (y-C 10), permet de déterminer la concentration en y-décalactone dans le milieu. The internal standard y-undecalactone (y-C11), which behaves similar to y-decalactone (y-C 10), makes it possible to determine the concentration of y-decalactone in the medium.
4.4 Etude de la consommatlon de ricinoléate de méthyle. 4.4 Study of the consumption of methyl ricinoleate.
Le dosage de la quantité totale de ricinoléate de méthyle (présent dans le milieu et la biomasse) au temps 0 et après 81 heures de bioconversion permettra de déterminer si cet acide gras a été consommé par les levures. On effectue une extraction des lipides totaux sur le milieu et la biomasse selon le protocole suivant puis le ricinoléate est dosé en chromatographie en phase gazeuse. The assay of the total amount of methyl ricinoleate (present in the medium and the biomass) at time 0 and after 81 hours of bioconversion will make it possible to determine whether this fatty acid has been consumed by the yeasts. An extraction of the total lipids is carried out on the medium and the biomass according to the following protocol, then the ricinoleate is assayed by gas chromatography.
Extraction des lipides totaux. Total lipid extraction.
15 ml de milieu contenant la biomasse sont passés dans un broyeur à billes afin de casser les cellules de levures. 1 ml de ce broyat est prélevé pour faire l'extraction des lipides totaux. 15 ml of medium containing the biomass are passed through a ball mill in order to break the yeast cells. 1 ml of this ground material is removed to extract the total lipids.
A ce 1 ml de broyat sont ajoutés 2 ml de méthanol puis quelques gouttes de HCl 1 M pour ajuster le pH à 3 puis enfin 4 ml de chloroforme: à chaque étape, le tube est vortexé. To this 1 ml of ground material are added 2 ml of methanol then a few drops of 1 M HCl to adjust the pH to 3 then finally 4 ml of chloroform: at each stage, the tube is vortexed.
Après décantation, la phase aqueuse (phase supérieure) est éliminée, la phase chloroformique contenant les lipides. After decantation, the aqueous phase (upper phase) is eliminated, the chloroform phase containing the lipids.
A une partie aliquote (200 y1) de cette phase chloroformique sont ajoutés 40 yg d'étalon interne (acide heptacanoïque) et on réalise une méthylation de la façon suivante: le tout est séché sous azote et les acides gras sont repris dans 1 ml de méthanol. Après addition de 5 gouttes de H2SO4 concentré, les tubes sont fermés sous azote et placés au bain marie à 100"C pendant une heure. Après refroidissement, on ajoute 1 ml de K2CO3 5% (neutralisation) puis 2 ml d'hexane: l'hexane contient alors les acides gras. Après concentration sous azote de cet extrait, 1 yl est injecté dans le chromatographe décrit en 3. To an aliquot part (200 μl) of this chloroform phase are added 40 μg of internal standard (heptacanoic acid) and methylation is carried out as follows: the whole is dried under nitrogen and the fatty acids are taken up in 1 ml of methanol. After adding 5 drops of concentrated H2SO4, the tubes are closed under nitrogen and placed in a water bath at 100 "C for one hour. After cooling, 1 ml of 5% K2CO3 is added (neutralization) then 2 ml of hexane: l hexane then contains the fatty acids After concentration under nitrogen of this extract, 1 μl is injected into the chromatograph described in 3.
N.B. On utilise des tubes ou des pipettes en verre car on travaille avec du chloroforme et le travail se fait sous hotte aspirante. N.B. We use glass tubes or pipettes because we work with chloroform and the work is done in an extractor hood.
Les conditions chromatographiques sont les suivantes:
- température initiale: 50"C, température finale: 230"C,
- programme de température: 20min de 50"C à 230"C. The chromatographic conditions are as follows:
- initial temperature: 50 "C, final temperature: 230" C,
- temperature program: 20min from 50 "C to 230" C.
II. Exemples. II. Examples.
EXEMPLE 1. EXAMPLE 1.
Production de y-décalactone par incubation de Yarrowia lipolytica
PO1D sur milieu B.Y-decalactone production by incubation of Yarrowia lipolytica
PO1D on medium B.
Une fiole Erlenmeyer de 250 ml contenant du milieu B de composition suivante: ricinoléate de méthyle 5 g/l, extrait de levure 0,1 g/l, NH4C1 2,5 g/l, KH2P04 2,1 g/l, Na2HP04 3,6 g/l, MgSO4, 7H20 0,2 g/l, NaCi 0,1 g/l, FeSO4 0,005 g/l, ZnC12 5.104 g/l, CuSO4 0,001 g/l est ensemencée à raison de 7.106 cellules/ml. L'agitation et la température sont fixées respectivement à 110 tours/min et 270C. Le taux de croissance mesuré par évaluation de la biomasse sèche est de 0.003 h-1. La production de y-décalactone après 48h de culture est de 82 mg/l de milieu, avec une productivité de la biomasse de 24 mg/g de biomasse sèche/h pendant les premières 24 h. A 250 ml Erlenmeyer flask containing medium B of the following composition: methyl ricinoleate 5 g / l, yeast extract 0.1 g / l, NH4C1 2.5 g / l, KH2P04 2.1 g / l, Na2HP04 3 , 6 g / l, MgSO4, 7H20 0.2 g / l, NaCi 0.1 g / l, FeSO4 0.005 g / l, ZnC12 5.104 g / l, CuSO4 0.001 g / l is seeded at the rate of 7.106 cells / ml . The agitation and the temperature are fixed respectively at 110 revolutions / min and 270C. The growth rate measured by evaluation of the dry biomass is 0.003 h-1. The production of y-decalactone after 48 hours of culture is 82 mg / l of medium, with a biomass productivity of 24 mg / g of dry biomass / h during the first 24 hours.
EXEMPLE 2. EXAMPLE 2.
Production de y-décalactone par incubation de Yarrowia lipolytica
PO1D sur milieu A2 et B2.Y-decalactone production by incubation of Yarrowia lipolytica
PO1D on medium A2 and B2.
On prépare une préculture de Yarrowia lipolytica POlD dans des conditions indiques à la culture de l'exemple 1, à l'exception du ricinoléate de méthyle contenu dans le milieu B qui est remplacé par 15 g/l de glucose (milieu A), de 5 g/l de casaminoacides et de 500 mg/l d'uracile qui sont ajoutés au milieu (milieu A2). La totalité de la biomasse obtenue sur le milieu
A2 en fin de phase exponentielle de croissance est transférée sur un volume équivalent de milieu B2 (milieu B additionné de 5 g/l de casaminoacides et de 500 mg/l d'acides d'uracile), et cultivée dans des conditions identiques à l'exemple 1. Le taux de croissance maximal observé est de 0,081 h-1. La production de y-décalactone après 48 h de culture est de 128 mg/l. La productivité de la biomasse observée est de 1 mg/g/h.A preculture of Yarrowia lipolytica POlD is prepared under conditions suitable for the culture of Example 1, with the exception of the methyl ricinoleate contained in medium B which is replaced by 15 g / l of glucose (medium A), 5 g / l of casamino acids and 500 mg / l of uracil which are added to the medium (medium A2). All of the biomass obtained on the environment
A2 at the end of the exponential growth phase is transferred to an equivalent volume of medium B2 (medium B supplemented with 5 g / l of casamino acids and 500 mg / l of uracil acids), and cultivated under conditions identical to l Example 1. The maximum growth rate observed is 0.081 h-1. The production of y-decalactone after 48 h of culture is 128 mg / l. The productivity of the biomass observed is 1 mg / g / h.
EXEMPLE 3. EXAMPLE 3.
Production de y-décalactone par culture de Yarrowia lipolytica sur milieu A2 suivie d'une incubation sur milieu B3. Production of y-decalactone by culture of Yarrowia lipolytica on A2 medium followed by incubation on B3 medium.
Une préculture de Yarrowia lipolytica PO1D est menée dans 0,5 I de milieu A2, dans des conditions similaires à celles de l'exemple 2 pendant 20 heures. La totalité de la biomasse obtenue est transférée dans 100 ml de milieu B3, identique au milieu B mais contenant 30 g/l de ricinoléate de méthyle. Après six jours d'incubation, on obtient 420 mg/l de y-décalactone dans le milieu. A preculture of Yarrowia lipolytica PO1D is carried out in 0.5 I of A2 medium, under conditions similar to those of Example 2 for 20 hours. All of the biomass obtained is transferred to 100 ml of medium B3, identical to medium B but containing 30 g / l of methyl ricinoleate. After six days of incubation, 420 mg / l of y-decalactone are obtained in the medium.
EXEMPLE 4. EXAMPLE 4.
Production de y-décalactone par une culture de Yarrowia lipolytica
PO1D sur milieu A2 en fermenteur suivie d'une incubation sur milieu B3 en fermenteur.Y-decalactone production by a Yarrowia lipolytica culture
PO1D on medium A2 in a fermenter followed by an incubation on medium B3 in a fermenter.
Une préculture de Yarrowia lipolytica POlD est menée dans 5 l de milieu A2 en fermenteur de 7 l (T = 27"C, agitation 200 tpm, aération 0.1 v/v/m). La totalité de la biomasse (15 g) obtenue lorsqu'un tiers du glucose est consommé est transférée dans 2 I de milieu B3 dans un fermenteur de 2,5 1 (agitation 200 tpm, 27"C, aération 0.1 v/v/m). Après 162 heures d'incubation, on retrouve 115 mg/l de y-décalactone dans le milieu. La productivité du dispositif observée pendant les premières 24 h est de 1 mg/l/h. A preculture of Yarrowia lipolytica POlD is carried out in 5 l of A2 medium in a 7 l fermenter (T = 27 "C, stirring 200 rpm, aeration 0.1 v / v / m). All of the biomass (15 g) obtained when one third of the glucose is consumed is transferred into 2 l of B3 medium in a 2.5 l fermenter (200 rpm stirring, 27 "C, 0.1 v / v / m aeration). After 162 hours of incubation, 115 mg / l of y-decalactone are found in the medium. The productivity of the device observed during the first 24 hours is 1 mg / l / h.
EXEMPLES. EXAMPLES.
Production de y-décalactone par une culture de Yarrowia lipolytica
POlD sur milieu A2 suivie d'une incubation sur milieu B3 additionné de glucose en fermenteur.Y-decalactone production by a Yarrowia lipolytica culture
POID on A2 medium followed by incubation on B3 medium supplemented with fermenter glucose.
Une préculture de Yarrowia lipolytica est menée dans 5 1 de milieu A2 répartis dans 10 fioles Erlenmeyer de Il. La totalité de la biomasse obtenue (6,5 g) en fin de phase exponentielle de croissance est transférée dans 500 ml de milieu B3, additionné de 0,25 g de glucose, contenu dans un fermenteur de 2,5 1. L'incubation est menée à 270C, agitation 200 tpm, aération 0.2 v/v/m. A preculture of Yarrowia lipolytica is carried out in 5 l of A2 medium distributed in 10 Erlenmeyer flasks of II. The entire biomass obtained (6.5 g) at the end of the exponential growth phase is transferred to 500 ml of B3 medium, supplemented with 0.25 g of glucose, contained in a 2.5 1 fermenter. Incubation is carried out at 270C, stirring 200 rpm, aeration 0.2 v / v / m.
Après 48 h de culture, on obtient une concentration en y-décalactone de 1,28 g/l de milieu. La productivité du dispositif observée durant les premières 20 heures atteint 35 mg/l/h.After 48 h of culture, a concentration of y-decalactone of 1.28 g / l of medium is obtained. The productivity of the device observed during the first 20 hours reaches 35 mg / l / h.
EXEMPLE 6. EXAMPLE 6.
Production de y-décalactone par production de biomasse de Yarrowia lipolytica PO1D suivie d'une culture en conditions limitantes sur milieu B4. Production of y-decalactone by production of biomass of Yarrowia lipolytica PO1D followed by culture under limiting conditions on B4 medium.
Une préculture de Yarrowia lipolytica est menée dans des conditions similaires à celles décrites dans l'exemple 2, mais sur un milieu A3 identique au milieu A2 à l'exception d'une concentration en glucose de 20 g/l. La biomasse est transférée (21,5 g/l) puis cultivée en fermenteur de 5 1 (conditions identiques à celles de l'exemple 4) sur 1 l d'un milieu B6 de composition suivante: ricinoléate de méthyle 30 g/l, extrait de levure 0,5 g/l, NH4C1 2,5 g/l, KH2PO4 2,1 g/l, Na2HPO4 3,6 g/l, MgSO4, 7H2O 0,2 g/l, NaCI 0,1 g/l, FeSO4 0,005 g/l, ZnCl2 5.104 g/l, CuSO4 0,001 g/l, casaminoacides 5 g/l, uracile 20 mg/l. Après 75 h de culture, on obtient une concentration en y-décalactone de 9,5 g/l de milieu. A preculture of Yarrowia lipolytica is carried out under conditions similar to those described in Example 2, but on an A3 medium identical to the A2 medium except for a glucose concentration of 20 g / l. The biomass is transferred (21.5 g / l) and then cultivated in a 5 1 fermenter (conditions identical to those of Example 4) to 1 l of a B6 medium of the following composition: methyl ricinoleate 30 g / l, yeast extract 0.5 g / l, NH4C1 2.5 g / l, KH2PO4 2.1 g / l, Na2HPO4 3.6 g / l, MgSO4, 7H2O 0.2 g / l, NaCI 0.1 g / l, FeSO4 0.005 g / l, ZnCl2 5.104 g / l, CuSO4 0.001 g / l, casamino acids 5 g / l, uracil 20 mg / l. After 75 h of culture, a y-decalactone concentration of 9.5 g / l of medium is obtained.
Légende des figures. Legend of figures.
- les figures 1, 2 et 3 représentent les plasmides pINA302, pINA270 et pINA322 respectivement;
- la figure 4 représente la croissance de la levure Yarrowia lipolytica PO 1 D, ainsi que la production de lactone (y-décalactone) par cette dernière; la biomasse sèche est indiquée en g/l sur l'axe de gauche des ordonnées; la quantité de lactone obtenue est indiquée en p.p.m. sur l'axe de droite des ordonnées; le temps de culture est indiqué en heures en abscisse; la courbe -A- représente la croissance d'Y. lipolytica en milieu supplémenté en uracile; la courbe -± représente la production de lactone en milieu supplémenté en uracile; la courbe -*- représente la croissance d'Y. lipolytica en milieu non supplémenté en uracile; la courbe -*- représente la production de lactone en milieu non supplémenté en uracile;
- la figure 5 représente la production de lactone par culture d'Y. lipolytica PO1D en fioles, la concentration en ricinoléate de méthyle (RM) étant de 30 g/l; la quantité de lactone produite est indiquée en g/l en ordonnées; le temps de culture est indiqué en heures en abscisse. - Figures 1, 2 and 3 show the plasmids pINA302, pINA270 and pINA322 respectively;
- Figure 4 shows the growth of the yeast Yarrowia lipolytica PO 1 D, as well as the production of lactone (y-decalactone) by the latter; the dry biomass is indicated in g / l on the left axis of the ordinates; the quantity of lactone obtained is indicated in ppm on the right axis of the ordinates; the culture time is indicated in hours on the abscissa; the curve -A- represents the growth of Y. lipolytica in a medium supplemented with uracil; the curve - ± represents the production of lactone in a medium supplemented with uracil; the curve - * - represents the growth of Y. lipolytica in a medium not supplemented with uracil; the curve - * - represents the production of lactone in a medium not supplemented with uracil;
- Figure 5 shows the production of lactone by culture of Y. lipolytica PO1D in vials, the concentration of methyl ricinoleate (RM) being 30 g / l; the quantity of lactone produced is indicated in g / l on the ordinate; the culture time is indicated in hours on the abscissa.
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