FI85384C - Foerfarande foer hydrolysering av hemicellulosa med immobiliserade enzymer och produkt som omfattar ett immobiliserat hemicellulolytiskt enzym. - Google Patents

Description

1 85384

Menetelmä hemiselluloosan hydrolysoimiseksi immobilisoitu-jen entsyymien avulla ja immobilisoidun hemisellulolyyt-tisen entsyymin käsittävä tuote 5 Keksintö kohdistuu menetelmään ksylo-oligomeerejä sisältävän hemiselluloosasubstraatin hydrolysoimiseksi hemisellulolyyttisillä entsyymeillä, jotka on immobilisoi-tu adsorboimalla ne kiinteään kantajaan. Edelleen keksintö koskee kiinteän kantajan ja sille immobilisoidun hemisel-10 lulolyyttisen entsyymin tai entsyymiseoksen yhdistelmää tällaisen hydrolysointimenetelmän toteuttamiseksi. Menetelmä soveltuu hyvin ksyloosin valmistukseen ksylö-oligo-meerejä sisältävistä selluteollisuuden jäteliemistä ja höyryräjäytetyn kasviperäisen materiaalin vesiuutteista. 15 Hemisellulolyyttisiä entsyymejä eli hemisellulaa- seja ovat mm. ksylanaasi, B-ksylosidaasi ja esteraasit, jotka aktiivisesti pilkkovat hemiselluloosamateriaalia hydrolyyttisesti. Näistä ksylanaasi ja esteraasientsyymit pilkkovat esim. koivuksylaanin ksylaania ja asetyylisivu-20 ketjuja ja jäljelle jääneet ksylo-oligomeerit ovat substi-tuoimattomia ja näin hydrolysoitavissa pelkästään B-ksylo-sidaasilla. Lisäksi hemiselluloosaa hydrolysoivista ent-syymipreparaateista on löydetty useita vähemmän tunnettuja sivuaktiivisuuksia. Hemisellulolyyttisiä entsyymejä tuote-25 taan fermentoimalla tiettyjä mikro-organismeja, esim. Aspergillus- tai Trichoderma-sukujen homeita, ja entsyymi-preparaattina hemiselluloosaa hydrolysoitaessa voidaan käyttää kasvuliuosta sellaisenaan tai siitä erotettuja entsyymifraktioita.

30 Liuoksessa vapaina olevat hemisellulolyyttiset ent syymit ovat hydrolyysireaktion edellyttämissä olosuhteissa aktiivisia vain suhteellisen lyhyen ajan. Niiden käyttö on kallista ja talteenotto vaikeaa. Kiinteälle kantajalle immobilisoidut entsyymit ovat pysyvämpiä kuin vapaat ent-35 syymit ja myös helpommin uudelleen käytettävissä, minkä 2 85384 vuoksi on kehitetty lukuisia menetelmiä hemisellulolyyt-tisten entsyymien immobilisoimiseksi.

Liuoksen korkea suolapitoisuus on eräs pääongelmista hydrolysoitaessa teknistä hemiselluloosaliuosta immobi-5 lisoidun entsyymin avulla. Ionisella materiaalilla on taipumus syrjäyttää entsyymi kantajan pinnalta ja täten ko-lonni menettää nopeasti entsyymiaktiivisuutensa.

Hemisellulolyyttisiä entsyymejä on immobilisoitu esim. silikageelin, alumiinioksidin tai teräksen pinnalle 10 (Ogunteim, G.B., Proc. Annu. Biochem. Eng. Symp. 1978, voi. 8 s. 27-37), huokoiselle lasille (Rogalski, J. et ai., Enzyme Microb. Technol. 7 (1985) n:o 8, s. 27-37), kuiduille (Tavobilov, I. et ai., Priki. Biochim. Mikro-biol. 22(6) (1986) s. 742-749 tai bentsokinonisilokromi-15 kantajamateriaalille (SU-patentti 1055770, Baltsere D. et ai., 1982). Silikageelikantajamateriaalin käyttöä ovat ehdottaneet myös Shimizu (Biotechnology and Bioengineering, 29 (1987) s. 36-241) ja Allenza et ai. (Biotechnology and Bioengineering Symp. No 17 (1986) John Wiley & Sons 20 1987). Puls J. et ai. (Trans. Tech. Sect., Can. Pulp Pap.

Assoc. 3 s. 64-72 ja US-patentti 4 275 159, vast FI-pa-tentti 61718) ovat käyttäneet kantajana huokoisia lasihel-miä, silikageelihelmiä ja merihiekkaa hemisellulaasin ja ksylanaasifraktion immobilisoinnissa.

25 Kaikissa näissä tunnetuissa immobilisointimenetel- missä entsyymi on sidottu kantajaan käyttäen apuainetta, jonka vaikutuksesta kantajan pinta aktivoituu ja/tai kantajan ja entsyymin välille muodostuu kovalenttinen sidos. Yllä mainitussa FI-patenttijulkaisussa 61718 (Puis et ai.) 30 kuvatussa menetelmässä pääasiassa ksylanaasia sisältävä entsyymifraktio ja pääasiassa 8-ksylosidaasia sisältävä entsyymifraktio immobilisoidaan erikseen kumpikin omalle kantajalleen käyttäen kummallekin kiinnittäjänä glutaa-rialdehydiä, karbodi-imidiä tai TiCl4, ja näin saatuja kah-35 ta entsyymipreparaattia käytetään ksylaanin hydrolysoin- I: 3 85384 tiin. Oguntimein et ai. (Biotechnol. Bioeng. 22 (1980), s. 1127-1142) tutkivat kaupallisesta Aspergillus nigerillä tuotetusta entsyymipreparaatista puhdistetun B-ksylosidaa-sin immobilisointia kymmenelle eri kantajalle. Immobili-5 sointi todettiin erittäin vaikeaksi ja tyydyttäviä tuloksia aktiivisuuden ja stabiilisuuden suhteen saavutettiin ainoastaan TiCl4:n avulla alumiinioksidille ja glutaarial-dehydin avulla huokoiselle alkyyliamiinisilikageelille sidotulla entsyymillä.

10 Weckström, L. ja Leisola, M. (Advances in Biotech nology. Toim. M. Moo-Young ja C.W. Robinson, Proc. 6th Inter. Ferment. Symp. London Canada July 20-25 1980, Per-gamon Press 1981, s. 21-26) tutkivat sulfiittijäteliemen ksylaanin hydrolysointia Aspergillus nigerillä tuotetulla 15 entsyymipreparaatilla, joka oli kiinnitetty fenoliformal-dehydihartsiin (DUOLITE S 761) glutaarialdehydin avulla. Vertailukokeessa entsyymi adsorboitiin kantajaan ilman kiinnitysapuainetta. Näissä kokeissa todettiin glutaarialdehydin käyttö välttämättömäksi hartsiin adsorboituneen 20 entsyymiaktiivisuuden säilyttämiseksi. Glutaarialdehydin avulla immobilisoidun entsyymipreparaatin puoliintumisaika oli noin 30 vuorokautta.

Edelleen on tunnettua, että amfolyyttiset proteiinit kuten entsyymit adsorboituvat ioninvaihtajille. Ad-25 sorptiota on käytetty hyväksi puhtaiden entsyymien eristä miseksi erilaisista liuoksista. US-patentissa 4 168 250 on esitetty eräs tapa immobilisoida entsyymiä ioninvaihtaja-kantajalle. Julkaisussa esitetään glukoosi-isomeraasin immobilisointi agglomeroidulle kuitumaiselle ioninvaihto-30 selluloosakantajalle. Hemisellulolyyttisten entsyymien immobilisoinnista julkaisussa ei ole mitään mainintoja. EP-patentista 222838 (Davies et ai. 1987) on tunnettua immobilisoida gammaglobuliinia vahvalle anioninvaihtajalle.

35 GB-patenttijulkaisusta 1 597 436 tunnetaan entsyy- 4 85384 mipreparaatti, joka koostuu heikosta kationinvaihtokanta-jasta ja sille kiinnitysapuainetta lisäämättä immobilisoidusta entsyymistä. Julkaisun mukaan käytetty kantaja on amfoteerinen ioninvaihtohartsi, jolla on sekä kationin-5 että anioninvaihtoaktiivisuutta, ja käyttökelpoisiksi entsyymeiksi mainitaan lukuisia erilaisia entsyymejä.

Epäkohtana tunnetuissa hemisellulolyyttisten entsyymien immobilisontimenetelmissä on, että entsyymin aktiivisuus ei aina säily riittävän pitkään tyydyttävällä 10 tasolla ja toisaalta immobilisoinnissa käytetyn kiinnitys-apuaineen vuoksi kantajan regenerointi on liian monimutkainen sovellettavaksi teolliseen prosessiin.

Keksinnön tavoitteena on aikaansaada menetelmä he-miselluloosaliuoksen hydrolysoimiseksi immobilisoidulla 15 entsyymillä siten, että entsyymi säilyttää aktiivisuutensa oleellisesti heikentymättömänä pitkiä aikoja ja kantaja on helposti regeneroitavissa ja että hemiselluloosasubstraat-tina voidaan käyttää myös runsaasti ionisia aineosia sisältävää hemiselluloosaliuosta, esim. selluteollisuuden 20 jätelientä tai höyryräjäytetyn kasviperäisen materiaalin vesiuutetta.

Nämä tavoitteet saavutetaan keksinnön mukaisesti käyttämällä hemisellulolyyttistä entsyymiä tai entsyymi-seosta, joka on immobilisoitu heikolle kationinvaihtokan-25 tajalle käyttämättä immobilisoinnissa kiinnitysapuainei- ta.

Keksinnön kohteena on siten menetelmä ksylo-oligo-meereja sisältävän hemiselluloosaliuoksen hydrolysoimiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että hemisellu-30 loosaliuoksen pH säädetään heikosti happamelle alueelle ja liuos saatetaan kosketukseen hemisellulolyyttisen entsyymin kanssa, joka on immobilisoitu heikkoon kationinvaihto-kantajaan kiinnitysapuaineita lisäämättä. Edelleen keksinnön kohteena on tässä menetelmässä käytettävä entsyymipre-35 paraatti, joka käsittää heikon kationinvaihtokantajan ja 5 85384 sille ilman kiinnitysapuaineita immobilisoidun hemisellu-lolyyttisen entsyymin tai entsyymiseoksen.

Keksintö perustuu siihen yllättävään havaintoon, että hemisellulolyyttinen entsyymi, edullisesti B-ksylosi-5 daasi, voidaan immobilisoida onnistuneesti heikolle katio-ninvaihtokantajalle. Entsyymin kiinnitysapuaineiden, esim. glutaarialdehydin, lisääminen ei ole tarpeen.

Sopiva keksinnön mukaisesti käytettävä heikko ka-tioninvaihtokantaja on esimerkiksi makrohuokoinen akry-10 laattihartsi DUOLITE C 464 ja toinen sopiva kantaja on polystyreenillä vahvistettu agglomeroitu karboksimetyyli-selluloosa.

Keksinnön mukaisesti käytettävät hemisellulolyyt-tiset entsyymit kuuluvat hemisellulaasiryhmään, jota ta-15 vallisimmin tuotetaan fermentoimalla Trichoderma-sukuun kuuluvaa mikrobia. Tärkeimmät tämän ryhmän ksylanolyytti-set entsyymit ovat ksylanaasi, β-ksylosidaasi, asetyylies-teraasi ja α-glukuronidaasi. Näitä entsyymejä voidaan eristää entsyymiseoksista tunnetuilla fraktiointimenetel-20 millä kuten ammoniumsulfaattisaostuksella tai ultrasuoda- tuksella. Keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää joko mikrobin fermentoinnissa käytettyä kasvuliuosta sellaisenaan tai tästä fraktioituja entsyymijakeita. Edullisesti keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään Tri-25 choderma longibrachiatum -homeella (aikaisempi nimitys T. reesei) tuotettua entsyymiseosta tai sen fraktioita, esimerkiksi β-ksylosidaasijaetta, jos hemiselluloosasubstraa-tin sisältämä ksylaani on ensin esihydrolysoitu ksylo-oli-gomeereiksi.

30 Immobi li sointi suoritetaan yksinkertaisesti sekoit tamalla kantajaa puskuroidun entsyymiliuoksen kanssa. Ent-syymiliuos puskuroidaan suunnilleen pH-alueelle 3,5 - 5. Entsyymiliuoksen annetaan olla kantajan kanssa kosketuksissa 1-4 tunnin ajan sitoutumisen varmistamiseksi. Mi-35 käli hydrolyysi on tarkoitus suorittaa kolonnissa, voidaan immobilisointi suorittaa käytettävässä kolonnissa.

6 S5384 Näin saatu entsyymipreparaatti on erittäin pysyvä korkeissakin ionikonsentraatioissa. Tämä on erittäin odottamatonta, koska entsyymit tunnetun tekniikan mukaan elu-oidaan kantajalta suolaliuoksilla; keksinnön mukaisesta 5 entsyymipreparaatista niitä ei sen sijaan voitu irrottaa suolaliuoksella eluoimalla.

Kun hydrolyysissä käytetty immobilisoitu entsyymi on menettänyt toimintakykynsä, käytetty kolonni regeneroidaan. Käytetty entsyymi pestään pois edullisesti lai-10 mealla natriumhydroksidilla. Pesu poistaa adsorboituneet epäpuhtaudet loppuun kulutetun entsyymin ohella. Sen jälkeen kantaja elvytetään alkuperäiseen varausmuotoonsa laimealla hapolla ja lopuksi pestään vedellä. Sen jälkeen kolonni ladataan tuoreella entsyymiliuoksella.

15 Tarvittaessa kantaja voidaan pestä tehokkaammilla kin menetelmillä. Polymeeriset kantajat ovat kemiallisesti kestäviä ja niitä voidaan pestä korkeassa lämpötilassa vahvoilla kemikaaleilla. Tavallisesti yksinkertainen pesu natriumhydroksidilla on riittävä kantajan kuntoon saatta-20 miseksi.

Käytettäessä keksinnön mukaista immobilisoitua ent-syymipreparaattia kantaja voidaan regeneroida useita kertoja. Esim. 6 kertaa suoritetun regeneroinnin jälkeen ei havaittu merkittäviä muutoksia kolonnin ominaisuuksissa. 25 Regenerointi on prosessin taloudellisuuden kannalta erit täin merkittävä etu, sillä kantajamateriaalit ovat kalliita. Keksinnön mukaisessa menetelmässä regenerointi on helppoa, kun ei käytetä kiinnitysapuaineita.

Keksinnön mukainen hydrolyysimenetelmä soveltuu 30 hyvin ksyloosin valmistamiseen höyryräjäytetystä kasvis- materiaaliuutteesta ja selluteollisuuden jäteliemestä. Mikäli entsyymiseosten sijasta käytetään yksittäisiä puhdistettuja entsyymifraktioita, voidaan yksittäisiä immobi-lisoituja entsyymejä käyttää perättäisissä kolonneissa tai 35 esihydrolysoida substraatti osittain vapaalla entsyymi- l! 7 85384 seoksella oligosakkaridien molekyylipainon pienentämiseksi. Erittäin hyviä tuloksia on saatu esim. hydrolysoitaessa inunobilisoidulla β-ksylosidaasilla höyryräjäytettyä koivulastu-uutetta, joka on ensin esihydrolysoitu entsy-5 maattisesti ksylanaasilla ja esteraasilla.

Keksintöä valaistaan seuraavassa lähemmin esimerkkien avulla.

Ilmoitetut entsyymiaktiivisuudet on määritetty seuraavasti (Poutanen, K. ja Puls, J., Characteristics of 10 Trichoderma reesei β-xylosidase and its use in the hydrolysis of solubilized xylans, Applied Microbiology and Biotechnology 1988; reprinted in Publications 47, Technical Research Centre of Finland, Espoo 1988, Appendix 4); β-ksylosidaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen 15 substraattina 5-mM p-nitrofenyyli-S-D-ksylopyranosidia (PNPX, Sigma N-2132) 0,05-M sitraatti-fosfaattipuskurissa, pH 4,5. 200 μΐ entsyyminäytettä inkuboitiin 1,8 ml:ssa substraattia 50 °C:ssa 10 minuuttia. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 1 ml 1-M natriumvetykarbonaattia ja vapautunut 20 p-nitrofenoli mitattiin 400 nm:ssa. Aktiivisuus ilmoite taan kataleina.

Ksylanaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen substraattina l-%lista pyökkipuun ksylaania [valmistettu menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Ebringerova et ai., Holz-25 forschung 21 (1967) s. 74-77]. Hienoksi jauhettu ksylaani suspendoitiin homogenoimalla ja lämmittämällä 0,05-M sit-raatti-fosfaattipuskuriin, pH 5,3. Entsyyminäytettä (0,2 ml) inkuboitiin 1,8 ml:ssa substraattiliuosta 50 °C:ssa 5 minuuttia. Muodostuneet pelkistävät sokerit määritettiin 30 lisäämällä 3 ml DNS-reagenssia (Sumner, J.B. ja Somers, G.F., Dinitrosalisylic method for glucose. In; Laboratory experiments in biological chemistry, Academic Press, New York 1949, s. 38-39), keittämällä 5 minuuttia, jäähdyttämällä ja mittaamalla absorbanssi 540 nm:ssä. Vertailusoke-35 ri oli ksyloosi ja aktiivisuus ilmoitetaan kataleina.

8 85384

Asetyyliesteraasi määritettiin käyttäen substraattina 1-mM α-naftyyliasetaattia 0,05-M sitraattipuskuris-sa, pH 5,3. Substraatti liuotettiin ensin pieneen määrään etanolia. 0,2 ml entsyyminäytettä inkuboitiin 1,8 ml:ssa 5 substraattiliuosta 50 °C:ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen lisättiin 1 ml 0,01-%:ista Fast Corinth V Salt -liuosta 1-M asetaattipuskurissa, pH 4,3, joka sisälsi 20 % Tween 20:ta. 10 minuutin kuluttua luettiin absorbanssi 535 nm:ssä. Aktiivisuus ilmoitetaan kataleina.

10 Immobilisoitavana entsyyminä keksinnön mukaisessa hydrolyysimenetelmässä voidaan käyttää esimerkiksi entsyy-mipreparaattia Multifect K, valmistaja Cultor Oy, ksyla-naasiaktiivisuus 84000 nkat/ml.

Esimerkeissä käytettiin seuraavia kantajamateriaa- 15 leja:

Spezyme GDC, valmistaja Cultor Oy; agglomeroitu dietyyliaminoetyyliselluloosa-anioninvaihtaja, esimerkeissä käytetty lyhennettä DEAE; agglomeroitu polystyreenillä vahvistettu karboksi- 20 metyyliselluloosa, heikko kationinvaihtaja, esimerkeissä käytetty lyhennettä CMC; DUOLITE S 761, valmistaja Duolite International, Rohm S Haas; adsorptiohartsi, esimerkeissä käytetty lyhennettä DUOLads; 25 DUOLITE ES 562, valmistaja Duolite International,

Rohm & Haas; anioninvaihtaja, esimerkeissä käytetty lyhennettä DUOLani; DUOLITE C 464, valmistaja Duolite International, Rohm & Haas; heikko kationinvaihtaja, esimerkeissä käy- 30 tetty lyhennettä DUOLeat;

Piimää Standard Super Cell, valmistaja Johns-Man- ville;

Granuloitu aktiivihiili, valmistaja Chemviron CPG. CMC-kantajan valmistus 35 Agglomeroitu polystyreenillä vahvistettu karboksi- β 85384 metyyliselluloosakantaja voidaan valmistaa US-patenttijulkaisuissa 3823133 ja 4168250 kuvatulla tavalla. Tällöin polymeeri, puhdistettu kuitumainen selluloosa, täyteaine (esim. metallioksidi tai silikaatti) ja liukastava aine 5 (kuten magnesiumstearaatti, alumiinistearaatti, sopiva öljy tms.) sekoitetaan ja seos kuumennetaan plastiseen tilaan ekstruuderissa. Sen jälkeen seos suulakepuriste-taan ja jäähtynyt tuote hienonnetaan ja seulotaan keskimääräiseen hiukkaskokoon 100 - 1000 pm, edullisesti 350 -10 850 pm. Näin saadusta agglomeroidusta polystyreenillä vah vistetusta tuotteesta valmistetaan karboksimetyylijohdos kloorietikkahapolla käyttäen natriumsulfaattia reak-tioseoksen vesiaktiivisuuden vähentämiseksi. Valmiin tuotteen ioninvaihtokapasiteetti on 0,1 - 0,2 mekv./g.

15 Karboksimetylointia valaisee seuraava esimerkki:

150 g natriumsulfaattia liuottiin 335 ml:aan vettä 40 °C:ssa. Lisätiin 85 g 50-prosenttista NaOH-liuosta. Tähän emäksiseen liuokseen suspendoitiin 150 g agglome-roitua polystyreenillä vahvistettua selluloosahartsia, 20 jonka hiukkaskoko oli 350 - 850 pm, ja suspensio kuumennettiin 70 eC:seen. 75 g kloorietikkahapon 50-prosenttista vesiliuosta lisättiin hitaasti tunnin kuluessa, sen jälkeen lisättiin 65 g 50-prosenttista NaOH-liuosta ja lopuksi vielä 75 g 50-prosenttista kloorietikkahappoa samoin 25 tunnin kuluessa. Suspensiota pidettiin sen jälkeen 70 °C:ssa vielä 30 minuuttia ja jäähdytettiin sitten 40 eC:seen. Liete neutraloitiin pH-arvoon 6,5 150 ml:11a 1-M

rikkihappoa ja dekantoitiin veden kanssa, kunnes emäliuos oli kirkas eikä siinä ollut hienoja hiukkasia. Tuotetta 30 pestiin vedessä 85 °C:ssa yli yön liukoisten jäännösten poistamiseksi, dekantoitiin uudelleen ja valutettiin. Saadun tuotteen ioninvaihtokapasiteetti oli 0,16 mekv./g.

Esimerkki 1

Trichoderma longibrachiatum -viljelmän (aikaisempi 35 nimitys T. reesei) avulla aikaansaatu entsyymiseos immobi- 10 8 5 384 lisoitiin eri kantajille, joista kaksi (CMC ja DUOLcat) oli keksinnön mukaisesti käytettäviä heikkoja kationin-vaihtajia. Käytetyn entsyymiseoksen aktiivisuus oli seu-raava: 5 ksylanaasi 13865 nkat/ml β-ksylosidaasi 4200 nkat/ml esteraasi 720 nkat/ml.

Immobilisointi suoritettiin kahdella erilaisella koostumuksella, jotka olivat: 10 1. 20 g kantajamateriaalia 96 ml 0,05-M natriumsitraattipuskuria (pH 5,0) 4 ml entsyymiliuosta 2. 20 g kantajamateriaalia 92 ml 0,05-M natriumsitraattipuskuria (pH 5,0) 15 8 ml entsyymiliuosta.

Kantajamateriaalia sekoitettiin entsyymiliuoksen kanssa +4 °C:ssa 4 tunnin ajan. Sen jälkeen liuos suodatettiin ja sitoutuneen entsyymin aktiivisuus mitattiin.

Vertailun vuoksi entsyymit kiinnitettiin osassa 20 kokeita glutaarialdehydin (80 ml 2,5-prosenttista liuosta) kanssa sekoittamalla tunnin ajan. Ylimääräinen aldehydi pestiin pois noin 2 1:11a 0,05-M natriumsitraattipuskuria. Entsyymiaktiivisuudet mitattiin uudelleen glutaarialde-hydikiinnityksen jälkeen.

25 Näissä immobilisointikokeissa saadut tulokset on esitetty seuraavissa taulukoissa 1-3. Kaikissa kokeissa mitattiin entsyymiaktiivisuudet ennen kiinnittämistä glu-taarialdehydillä (taulukoissa kohdassa "sitoutunut") sekä kiinnittämisen jälkeen (taulukoissa kohdassa "kiinnitty-30 nyt").

|: n 85384 I -μ I 03 I υ I Q co (N i—I vo σ> o I O os ^ in oo ID h <N os <* in

I Q rH (N i—I

I I I

I Ή I c I <0 IQ 00 O 00 VO O'. 00 I O os ο ί* in in co

ID H VO ΓΗ σ> H

ip h os I (0 I T3 I (0 id oo ro h vo in vo I O os r-ι c» in σι vf

ID rH rH rH OS rH 0S

IQ rH rH (N <N

I -H I H I -H I ·Η <0 I .C

-n I . 00 Οι vO 0s- ^

(Ό I -P N O vf HI H VO

P I X iH vD OS

C I < rH OS rH

<0 I * I I I

I <0 I (0

I g 00 N 00 VO in OS

I -H os σι o in oo co

I -H rH 00 iH OS 00 -H

I Οι iH OS

I co iH os vo rH m

I u os cn in in Τί Οι Σ H S vf OS OS O

I CJ rH OS rH rH

I ω oo oo co νονοσι co I < os -η cn in os ο-

3 I M rH rH N OS H

3 I D rH OS

w

tH

>

•H

•H

μ X t? t <0 10 >1 >i

rH -H 3 -PC -PC

(0 3 3 >i 3 >1

0(0 W 3C-P 3C-P

«<0 -H -P 3 -P -P 3 -P

«G > Ο) -μ-μ-Η +J+J-H

D <0 -H \ O 3 G 0 3 C

• D H -H -P -oOd -oOG

D -P <0 P -P -H P -P -H

>4^ CO ic X · <0 "H -H · <0 -H -H

H !stf < C HfitflSiNHWX

12 8 5 384

I +J I (0 I 0 I Q

I Ο 00 00 O' VO 00 Ό iD o' oo Ό co in οι

IQ 00 00 [V CM

I I I

I -H

I c I id

I Q

I O 00 O VO vO 0s* CO

iD o> ^ m oo o» in

IQ CO rH N OS rH

I I I

I to I Ό I (0

I Q

I O 00 rH O' VO 00 VO

iD o' vo os co t''

I Q 00 OS rH S' IN

I -H I H I -H I -H

(0 I £ in 1—1 I · v id ι -μ oo m h vo vo o -μ I x ov vo oo o

C I < 00 OS P- VO

10 I I I I

I (0 I (0 ε

I ·Η 00 CS rH VO VO O

I tH O' O' 00 CO N

I & oo oo h p* p* oo I U 00 S' O vo O O' I Σ O' O' OS 00 rH 00 I O 00 OS OS P VO νί

ra I

3 I

3 I

to I ω

•H I < 00 CS rH VDOO

> I ω σ' s· -s· ω o p' •H IQ 00 pv p*

H

μ

X

id

H

to id -μ -μ id to >1 >i OS Ό 3 -μ c -μ c ..... -H 3 3 >1 3 >1 ocn to 3C+> 33-μ

«O -H +J3+J4J3+J

SCH > O) +J+JH +J+J-H

D>1 -H \ 0 3 C 0 3 C

iJW -Η μι -|->0C t-> O C

DJi +> (d Vh -μ -H h μ H

<1 X X · Id H *H · (0 Ή Ή h co. < c HEnwacosHtoiK: » 85384 I -μ

I (O

I o in cr> o h* «* I > «· ν ν ·.

ιο in h n m cv νο ι D cv η* οο η* οο ιη I Q μ

I I I

I -Η ι C

ι (0 ιη ^ η ο ιη ι ι-4 ν k ν » » ι O es η* η* ιη οο νο ι D cv νο οο ^ co σν I Q Η Η I Μ I Ό ι (0 ιη σ> οο σ> ο ι ι-4 ^ - - » - ι O (N o m ιη νο ιη ι D cv cv m tji οο οο

I Q ι—I iH rH

I -H

I rH

I -H l -H

ιο ι js in o oo On) r—) I I v v v s » (0 ι μ cm σ o m h* o μ ι x cv in vi to

C I < rH rH

(0 I « I I I

I (0 ι ιο in rH o o o ι E - - - » *· ι -H cm oo cm in ^ σι I -H CV VO VO Hi rH o

I O4 rH rH rH

ι in vo 00 cv 0 ΙΟ cm' IS cm' in cv vo ι Σ cv m cv tji σ 00

I O rH rH

ι in in ο Hi 0 I [l] * V Ί. ^ * ι < cm cm o m in Hi in iw Cv 00 00 ^1010

3 I Q rH

3

CO

*rl >

H

•H

-P -μ +j x m >i >1 00 <0 3 μ c μα μ 3 3 >1 3 >1 ora m 3 c μ 3 c μ ..... «m μ μ3μ μ3μ «10 > Ο) μμ-Η μ μ μ

D μ μ\ 0 3 G Ο 3 G

JO) μ μ το 0 G -o O C

ομ μ <0 μ μ μ μ μ μ < CO X X · 10 μ μ · (0 μ μ

Ε-< W < C

i4 8 5 3 8 4

Kuten taulukoista 1-3 ilmenee, kaikki entsyymit adsorboituivat heikoille kationinvaihtajille (CMC, DUOL-cat) ja immobilisoiduilla tuotteilla oli korkeat kokonais-aktiivisuudet. Kiinnittäminen glutaarialdehydillä ei pa-5 rantanut systeemiä.

Esimerkki 2

Immobilisoitujen entsyymien hydrolysoivaa vaikutusta tutkittiin kolonnikokein. Nämä kokeet suoritettiin neljässä laboratoriomittakaavan kolonnissa, joiden koot oli-10 vat 50 ml ja 100 ml. Entsyymi immobilisoitiin kolonneissa upottamalla kantajat entsyymiliuokseen neljän tunnin ajaksi. Sen jälkeen kantajat pestiin sitraattipuskuriliuoksel-la. 50 ml:n kolonnit täytettiin immobilisoitu entsyy-mi/kantaja -preparaatilla ilman tämän lisäkäsittelyä. 100 15 ml:n kolonnit täytettiin entsyymi/kantaja -preparaatilla, joka vertailun vuoksi oli käsitelty glutaarialdehydillä (GA) (1 tunti) entsyymien kiinnittämiseksi.

Immobilisointiin käytetyn entsyymiliuoksen analyysi : 20 β-ksylosidaasi 552 nkat/ml ksylanaasi 25000 nkat/ml esteraasi 240 nkat/ml

Immobilisointi: 50 ml entsyymiliuosta 25 350 ml 0,05-M sitraattipuskuria pH 5 100 g kantajaa.

Näin saatujen immobilisoitujen systeemien karakteristiset arvot ilmenevät seuraavasta taulukosta 4.

I; is «5384 TAULUKKO 4

Entsyymien immobilisointi CMC- ja DUOLITE C 464-kantajiin CMC-kantaja 5 Entsyymiaktiivisuus, nkat/g kantajaa β-ksylosidaasi ksylanaasi esteraasi

Entsyymiä lisätty 520 14700 200 10

Entsyymiä adsorboitunut 374 9540 150

Aktiivisuus 15 kantajassa 346 2970 126

Aktiivisuus GA-kiinnityksen jälkeen 300 3180 137 20 ___ DUOLITE-kantaj a

Entsyymiä lisätty 364 10288 140 25

Entsyymiä adsorboitunut 357 8375 84

Aktiivisuus 30 kantajassa 236 3272 68

Aktiivisuus GA-kiinnityksen jälkeen 250 2413 75 35 ie 8 5 384

Jatkuvatoimista hydrolyysiä varten valmistettiin yllä mainittuja entsyymipreparaatteja käyttäen seuraavat kolonnit: 1. 100 ml:n kolonni täytettiin 19,9 g:11a kuivaa 5 entsyymi/CMC-kantaja -yhdistelmää. Aktiivisuudet glutaari- aldehydikiinnityksen jälkeen olivat: β-ksylosidaasi 300 nkat/g ksylanaasi 3180 nkat/g esteraasi 137 nkat/g 10 2. 100 ml:n kolonni täytettiin 26,3 g:11a kuivaa entsyymi/DUOLITE -yhdistelmää. Aktiivisuudet glutaarial-dehydikiinnityksen jälkeen olivat: β-ksylosidaasi 250 nkat/g ksylanaasi 2413 nkat/g 15 esteraasi 75 nkat/g 3. 50 ml:n kolonni täytettiin 12,5 g:11a kuivaa entsyymi/CMC-kantaja -yhdistelmää. Kiinnitystä ei suoritettu. Aktiivisuudet olivat: β-ksylosidaasi 346 nkat/g 20 ksylanaasi 2970 nkat/g esteraasi 126 nkat/g 4. 50 ml:n kolonni täytettiin 14,5 g:11a kuivaa entsyymi/DUOLITE -yhdistelmää. Kiinnitystä ei suoritettu. Aktiivisuudet olivat: 25 β-ksylosidaasi 236 nkat/g ksylanaasi 3272 nkat/g esteraasi 68 nkat/g

Hydrolysoitava substraatti oli höyryräjäytetty koi-vulastu-uute (höyryräjäytysolosuhteet 210 °C, 4 minuut-30 tia), joka sisälsi ksyloosia 11 g/1 ja ksylaanioligomee-reja 23 g/1. Liuoksen kokonaiskuiva-ainepitoisuus oli 70 g/1 ja sen pH säädettiin arvoon 5. Suodatettu liuos syötettiin kulloinkin kolonnin alapäähän ja sen virtausnopeudet kolonneissa 1-4 olivat vastaavasti 14,4 ml/h, 15,0 35 ml/h, 6,9 ml/h ja 6,8 ml/h. Lämpötila oli 45 eC. Eluaatin i7 3 5 384 ksyloosipitoisuus mitattiin 2, 4 ja 7 vuorokauden kuluttua. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 5.

TAULUKKO 5 5 Eluaatin ksyloosipitoisuus (grammoina litrassa liuosta ja %:eina kuiva-aineesta)

Aika CMC /GA DUOLcat/GA CMC DUOLcat vrk_g/1 % k.a. g/1 % k.a. g/1 % k.a. g/1 % k.a.

10 2 29,2 41,6 33,4 47,8 25,6 36,6 35,1 50,1 4 26,9 38,4 31,0 44,2 24,3 34,7 32,9 47,0 7 22,5 32,1 33,1 47,3 25,4 36,2 32,4 46,2 15 Tulokset osoittavat, että kolonnien aktiivisuudet eivät merkittävästi heikentyneet 7 vuorokautta kestäneen kokeen aikana. Glutaarialdehydikiinnityksellä ei ollut vaikutusta kolonnin stabiilisuuteen.

Esimerkki 3 20 Immobilisoituja entsyymejä tutkittiin höyryräjäyte- tyistä koivulastuista saadun hemiselluloosaliuoksen hydro-lysoinnissa.

Immobilisointi suoritettiin kuten esimerkissä 1, paitsi että lämpötila oli 22 eC. Glutaarialdehydikiinni-25 tystä ei suoritettu.

Kantajat: 1. Seiluloosapohjäinen CMC- kantaja; partikkelikoko 350-850 pm; ioninvaihtokapasiteetti 0,15 mekviv./ml; tiheys 0,25 - 0,38 g/ml.

30 2. DUOLITE C 464; pH 3,8; vesipitoisuus 57 - 62 %; tiheys 0,75 g/ml.

Entsyymiliuos: β-ksylosidaasi 5400 nkat/ml esteraasi 400 " 35 ksylanaasi 99100 nkat/ml.

18 85384

Immobilisointi: 1. 50 ml entsyymiliuosta 25 ml 0,05 M sitraattipuskuria pH 5 37.5 g CMC-kantajaa 5 2. 50 ml entsyymiliuosta 25 ml 0,05 M sitraattipuskuria pH 5 37.5 g DUOLITE C 464 -kantajaa

Kutakin koetta varten kolonni täytettiin immobili-soiduilla entsyymeillä ja koivuhydrolysaatti syötettiin 10 kolonnien läpi. Hydrolysaatin pitoisuus oli 9,0 paino-%, pH 5, ja siinä oli ksyloosia 10 g/1 ja oligomeereja 32 g/1. Lämpötila oli 45 “C. Liuos johdettiin kolonnin läpi hitaasti, niin että hydrolyysin kokonaisaika oli 4 tuntia. Koetta jatkettiin 26 vuorokautta immobilisoidun entsyymin mahdol-15 lisen inaktivoitumisen selvittämiseksi, ja liuoksesta määritettiin ksyloosipitoisuus. Teoreettinen saanto on 55 % kuiva-aineesta.

Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 6.

20 TAULUKKO 6

Ksylaanin hydrolyysi ksyloosiksi jatkuvalla prosessilla käyttäen immobilisoituja entsyymejä CMC-kantaja DUOLITE-kantaja ksyloosia, ksyloosia, 25 Aika, vrk % kuiva-aineesta % kuiva-aineesta 1 56 53 4 48 5 57 9 49 42 30 14 42 15 40 20 40 21 49 42 26 44 35 i9 8 b 3 8 4

Konversioaste on hyvin korkea, lähellä teoreettista arvoa (55 % vapailla entsyymeillä). Merkittävää inaktivoi-tumista ei ollut havaittavissa kokeen aikana.

Kantaja voidaan regeneroida pesemällä inaktivoitunut 5 entsyymi pois emäksisellä liuoksella, elvyttämällä hapolla, pesemällä vedellä ja syöttämällä sen jälkeen tuoretta entsyymiä kolonniin. Entsyymi immobilisoituu kantajalle ja prosessia voidaan jatkaa.

Esimerkki 4 10 Kahta ksylo-oligomeeriliuosta hydrolysoitiin immo- bilisoidulla entsyymillä: Liuos 1 oli saatu kromatografisella erotuksella koivuhydrolysaatista, liuos 2 oli valmistettu höyryräjäytetystä koivu-uutteesta esihydroly-soimalla vapailla (immobilisoimattomilla) entsyymeillä.

15 Ennen esihydrolyysiä liuosten koostumukset olivat seuraa-vat:

Liuos 1 Liuos 2

Kuiva-ainetta, paino-% 7,0 12,5 pH 5,3 3,3 20 ksyloosia, g/1 7,4 16 ksylo-oligomeereja g/1 42 43 johtokyky, mS/cm 2,75 8,0

Liuos 2 esihydrolysoitiin vapaalla (immobilisoimat-tomalla) entsyymillä polymeerien koon pienentämiseksi. 25 Tällöin käytettiin samanlaista entsyymiseosta kuin seuraa-vassa immobilisoinnissa, esihydrolyysilämpötila oli 40 °C ja pH 5,0. Substraatin yhtä grammaa kohti lisättiin 0,015 ml entsyymiliuosta. Esihydrolyysin jälkeen liuos suodatettiin. Näin saadussa esihydrolysoidussa liuoksessa 2 oli 30 ksyloosia 30 g/1.

Trichoderma -fermentaatiosta saadut hemisellulaasi-entsyymit immobilisoitiin heikolle kationinvaihtajalle (DUOLITE C 464) sekoittamalla 4 tuntia pH 5:n sitraattipus-kurissa huoneenlämmössä (* 20 - 24 eC). Määritettiin ent-35 syymiaktiivisuudet, joiksi saatiin: 20 85384 ksylanaasi 47000 nkat/g esteraasi 174 nkat/g β-ksylosidaasi 1200 nkat/g β-ksylosidaasin immobilisaatiosaanto oil 100 %, 5 ksylanaasin 76 % ja estraasln 70 %.

Hydrolyysi suoritettiin kolonnissa jatkuvana prosessina, jolloin olosuhteet olivat seuraavat: kolonnin tilavuus 10 ml virtausnopeus 1 kolonnin tilavuus/tunti

10 lämpötila 45 eC

Tulokset kolonnin 15 vuorokautta jatkuneen käytön jälkeen olivat seuraavat: _Liuos 1 Liuos 2 ksyloosia, g/1 15 syöttöliuos 7,4 30 hydrolyysin jälkeen 36 51 glukoosia, g/1 hydrolyysin jälkeen 2 3 arabinoosia, g/1 20 hydrolyysin jälkeen 3 4 galaktoosia, g/1 hydrolyysin jälkeen 1 3 oligomeereja, g/1 hydrolyysin jälkeen 12 18 25 _

Kolonnissa ei esiintynyt entsyymin vakavaa hajoamista tai tehon heikkenemistä 15 vuorokautta kestäneen kokeen aikana. Regeneroituiin tutkimiseksi kolonni pestiin natrium-30 hydroksidiliuoksella, elvytettiin hapolla, pestiin vedellä ja ladattiin tuoreella entsyymillä.

Esimerkki 5

Regenerointikokeissa käytettiin DUOLITE C 464 - ja CMC -kantaj ia.

35 Kantaja pestiin kolonnissa 0,5-M natriumhydroksidi- li 2i 35384 liuoksella (4 x kolonnin tilavuus) 50 °C:n lämpötilassa. Sen jälkeen kantaja elvytettiin 0,5-M rikkihapolla, huuhdottiin vedellä ja puskuroitiin pH-arvoon 5 sitraattipus-kurilla.

5 Tuore entsyymi lisättiin kolonniin ja immobilisoi- tiin (ei kiinnitysapuaineita). Höyryräjäytettyä koivulastu-uutetta johdettiin kolonniin 100 kolonnitilavuutta.

Tämä sykli toistettiin 6 kertaa. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 7.

10 TAULUKKO 7

Toistettu immobilisointi (kolonnien regenerointi)

Entsyymiaktiivisuus, nkat/g kantajaa _β-ksylosidaasl esteraasi_ksylanaasi 15 CMC-kantaja Koe 1 tarjottu 1936 264 319200 sitoutunut 1312 150 163300

Koe 2 20 tarjottu 2420 330 415800 sitoutunut 1092 129 139300

Koe 3 tarjottu 1632 192 163800 sitoutunut * 44 * 25 Koe 4 tarjottu 2750 155 415800 sitoutunut 1367 * 193900

Koe 5 tarjottu 2750 275 300200 30 sitoutunut 1014 98 21300 PUOLITE C 464 -kantaja Koe 1 tarjottu 962 133 319200 sitoutunut 956 93 144500 35 22 85384

Koe 2 tarjottu 1285 178 215100 sitoutunut 1278 169 205000

Koe 3 5 tarjottu 844 101 84700 sitoutunut 791 57 15700

Koe 4 tarjottu 1426 80 215600 sitoutunut 1282 47 179900 10 Koe 5 tarjottu 1419 142 155000 sitoutunut 1375 92 134000

Koe 6 tarjottu 1165 142 186400 15 sitoutunut_*_51_38500 * ei mitattu

Tuloksista nähdään, että β-ksylosidaasin sitoutuminen DUOLITE-kantajaan pysyi melkein muuttumattomana, kun taas kahden muun entsyymin sitoutuminen heikkeni lievästi. 20 CMC-kantajan regenerointi ei onnistunut aivan yhtä hyvin, vaan kaikkien entsyymien sitoutumiset heikkenivät jonkin verran. Kokeet osoittivat, että immobilisointi voitiin toistaa useita kertoja käyttäen samaa kantajaa absorptio-kapasiteetin merkittävästi vähenemättä.

25 Esimerkki 6 Tässä kokeessa tutkittiin yksittäisen hemisellulaa-sientsyymin, β-ksylosidaasin sitoutumista heikkoon katio-ninvaihtokantajaan ja sen toimivuutta ksylo-oligomeerien hydrolysoij ana.

30 Trichoderma longibrachiatumilla tuotettu entsyymi- liuos, jonka sisältämät aktiivisuudet olivat - ksylanaasi 200000 nkat/ml - asetyyliesteraasi 1000 nkat/ml - β-ksylosidaasi 4200 nkat/ml 35 fraktioitiin kahteen jakeeseen (A ja B) saostaen lisäämällä 23 :< 5 3 8 4 anunoniumsulfaattia 20 % liuoksen painosta, sekoittaen kevyesti ja seisottaen lämpötilassa +4°C 24 tunnin ajan. Fraktiot erotettiin senrifugoimalla 5 minuutin ajan nopeudella 2000 rpm. β-ksylosidaasi rikastui liuosjakeeseen 5 A saannon ollessa 54 % ja puhdistumisen 3,3-kertainen. Muiden ksylanolyyttisten entsyymien määrät tässä jakeessa olivat hyvin vähäiset (ks. taulukko 8). β-ksylosidaasia puhdistettiin edelleen ultrasuodattamalla (UF) jaetta A Amicon-ultrasuodattimella suotimella PM 10, jonka erotus-10 alue on MP 10 000, kunnes liuoksen suolapitoisuus oli 4 %. Suolan poistumisen ohella β-ksylosidaasin puhtaus nousi edelleen (ks. taulukko 8).

TAULUKKO 8 15 Hemisellulaasin fraktioiminen ammoniumsulfaatilla

Spesifinen aktiivisuus nkat/ mg proteiinia hemisellu- Fraktiot Ultrasuod.

laasi A B fraktio 20 ksylanaasi 1430 130 1680 42 β-ksylosidaasi 30 100 12 195 asetyyliesteraasi 7,5 0,4 9 0,6 β-ksylosidaasi immobilisoitiin DU0LITE C 464:ään 25 käyttäen 60 ml uitrasuodatusjaetta A (β-ksylosidaasia 4600 nkat/ml) ja 20 ml hartsia, joita sekoitettiin 1 tunti 25 °C:ssa pHrssa 3,7. Pesun jälkeen hartsissa oli sitoutuneena β-ksylosidaasia 11 000 nkat/ml.

Näin immobilisoitua β-ksylosidaasia käytettiin ksy-30 lo-oligomeerien hydrolysointiin höyryräjäytetystä koivulas-tu-uutteesta, joka oli ensin esihydrolysoitu entsymaattisesti ksylaanin ja asetyylisivuketjujen pilkkomiseksi. Esi-hydrolyysissä käytetyt entsyymimäärät kuiva-ainegrammaa kohti olivat: ksylanaasia 1280 nkat, β-ksylosidaasia 25 35 nkat ja asetyyliesteraasia 7 nkat; hydrolyysiaika oli 24 24 8 5 384 h, pH 5 ja lämpötila 45 °C. Esihydrolyysiin käytetyn uutteen koostumus oli seuraava: kuiva-aine, % 10 pH 4,3 5 johtokyky, mS/cm 7 hiilihydraatit - ksyloosi, % liuoksen painosta 1,3 - glukoosi, " 0,1 - oligosakkaridit " 4,5 10 Esihydrolysoitua uutetta johdettiin immobilisoitua β-ksylosidaasia sisältävän kantajapatsaan läpi seuraavissa olosuhteissa: kolonnitilavuus 10 ml virtausnopeus 2 kolonnitilavuutta/h

15 lämpötila 45 eC

pH 4,3.

Hydrolyysiä immobilisoidulla entsyymillä jatkettiin yhtämittaisena ajona 30 vuorokautta, minkä jälkeen määritettiin liuoksen ksyloosi- ja oligosakkaridipitoisuudet. 20 Tulokset olivat seuraavat: pitoisuus, g/100 g ksyloosi oligosakkaridit Höyryräj äytetty koivulastu-uute 25 - sellaisenaan 1,3 4,5 - entsymaattisesti esihydrolysoituna 2,5 3,3 - esihydrolysaatti hydrolysoituna edelleen immobilisoi- 30 dulla β-ksylosidaasilla 5,0 0,8

Ksyloosisaanto oli laskenut tarkastelujakson (30 vrk) aikana vain 5 % lähtötilanteeseen verrattuna. Esimerkki 7

Immobilisoitua hemisellulaasia testattiin puolalai-35 sen sellutehtaan Celuloza Swiecien sivutuotteen pyökkiesi- li 25 8 5 3 84 hydrolysaatin ksylo-oligomeerien hydrolysointiin. Pyökki-esihydrolysaatin ksylo-oligomeerit oli puhdistettu kromatografisella erotuksella ennen hydrolyysiä immobilisoidulla hemisellulaasilla, ja sen koostumus oli seuraava: 5 kuiva-aine, % 7,3 pH 5,4 väri (Icumsa, pH 5) 184 000 johtokyky, mS/cm 4 hiilihydraatit 10 - ksyloosi 0,7 % l.p.* 9,5 % ka** - glukoosi 0,5 " 7,0 " - oligosakkaridit 3,9 " 53,5 * % liuoksen painosta, ** % kuiva-aineesta

Immobilisointiin käytettiin esimerkissä 6 mainittua 15 hemisellulaasipreparaattia. Immobilisoinnissa käytettiin hemisellulaasia 0,5 ml/g DUOLITE C 464 -kantajaa ja sitoutuminen saatiin aikaan 4 tunnin sekoituksella 25 °C:ssa pH:ssa 4,5. DUOLITE C 464-kantajaan sitoutui - ksylanaasia 78960 nkat/g hartsia luonnonpainosta 20 - β-ksylosidaasia 2050 nkat/g hartsia luonnonpainosta - asetyyliesteraasia 250 nkat/g hartsia luonnonpainosta

Pyökkiesihydrolysaatti hydrolysoitiin jatkuvatoimisessa kolonnissa seuraavissa olosuhteissa: kolonnitilavuus 10 ml 25 virtausnopeus 1 kolonnitilavuus/h pH 5,5

lämpötila 40 °C

Kolonnin kuormituksen aikana saatiin seuraavat ksy-loosisaannot: 26 8 5384

Ajoaika, vrk ksyloosi, ksyloosi, paino-% liuoksesta % kuiva-aineesta 1 2,9 40,1 5 3 3,0 41,0 6 2,65 36,3 7 2,65 36,3 14 2,65 36,3 18 2,65 36,3 l!

Claims (7)

27 8 5 3 8 4

1. Menetelmä ksylo-oligomeerejä sisältävän hemi-selluloosasubstraatin hydrolysoimiseksi immobilisoidulla 5 entsyymillä, tunnettu siitä, että hemiselluloo-saoligosakkarideja ja mahdollisesti ionisia aineosia sisältävän vesiliuoksen pH säädetään heikosti happamelle alueelle ja liuos saatetaan kosketukseen hemisellulolyyt-tisen entsyymin tai entsyymiseoksen kanssa, joka on

10 Trichoderma -sukuun kuuluvan mikro-organismin fermentoin-nin tuloksena saatu entsyymiseos tai sen fraktio, ja joka on kiinnitysapuaineita lisäämättä immobilisoitu regeneroitavissa olevaan heikkoon kationinvaihtokantajaan, ja ksy-loosi otetaan talteen liuoksesta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Trichoderma -sukuun kuuluva mikro-organismi on Trichoderma longibrachiatum (aikaisempi nimi Trichoderma reesei).

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että heikko kationinvaihtokantaja on polystyreenillä vahvistettu agglomeroitu karboksimetyy-liselluloosa.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heikko kationinvaihtokantaja 25 on DUOLITE C 464.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ksylo-oligomeereja sisältävä hemiselluloosasubstraatti on puunjalostusteollisuuden jäteliemi, kuten keiton jäteliemi tai keittoliemi 30 tai niiden osa.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ksylo-oligomeereja sisältävä hemiselluloosasubstraatti on höyryräjäytetyn kasviperäisen materiaalin vesiuute. 28 8 5 3 84

7. Regeneroitavissa olevaan kantajaan immobilisoi-dun entsyymin käsittävä entsyymipreparaatti, tunnet-t u siitä, että se koostuu heikosta kationinvaihtokanta-jasta, joka on polystyreenillä vahvistettu agglomeroitu 5 karboksimetyyliselluloosa tai DUOLITE C 464, ja sille kiinnitysapuainetta lisäämättä immobilisoidusta hemisellu-lolyyttisestä entsyymistä tai entsyymiseoksesta, joka on mikro-organismin Trichoderma longibrachiatum (aikaisempi nimi Trichoderma reesei) fermentoinnin tuloksena saatu 10 entsyymiseos tai sen fraktio. I: 29 ·< 5 384