ES2946541T3 - Métodos de diagnóstico y seguimiento utilizando proteínas en orina como marcadores en la nefropatía por IgA - Google Patents
Métodos de diagnóstico y seguimiento utilizando proteínas en orina como marcadores en la nefropatía por IgA Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere al uso de marcadores seleccionados de un grupo que consiste en alfa-IB-glucoproteína (A1BG), alfa-l-glucoproteína ácida 1 (ORM1), regiones C de la cadena Ig lambda-2 (IGLC2) y serotransferrina (TF) en métodos para el diagnóstico, seguimiento y diferenciación de la nefropatía por IgA. Además, se proporcionan los kits de diagnóstico correspondientes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos de diagnóstico y seguimiento utilizando proteínas en orina como marcadores en la nefropatía por IgA
Campo técnico
La solicitud se relaciona con el campo de los métodos de diagnóstico de la nefropatía por IgA. La presente invención está dirigida a métodos para el diagnóstico y seguimiento utilizando proteínas de la orina, en particular alfa-1B-glucoproteína (A1BG), orosomucoide 1 (ORM1) y regiones C de la cadena lambda-2 de Ig (IGLC2), como marcadores en la nefropatía por IgA.
Antecedentes de la invención
La nefropatía por IgA (IgAN) es la glomerulonefritis primaria más común en todo el mundo que puede conducir a una enfermedad renal crónica (ERC). La ERC representa un creciente problema de salud pública a nivel mundial, que provoca una gran carga socioeconómica para la sociedad. La prevalencia de la ERC es de hasta el 14,2% en EE. UU., el 10,2% en Noruega y el 11,9% en Polonia. Se estima que más de 4 millones de personas en Polonia padecen ERC y el número de pacientes con enfermedad renal en etapa terminal (ESRD) en diálisis en Polonia supera los 18000, además de los 13300 receptores de trasplante renal. Tanto las etapas tempranas de la ERC como de la ESRD están asociadas con una alta morbilidad y una mayor utilización de la atención médica. Por ejemplo, en Inglaterra, según un informe reciente publicado por NHS Kidney Care, la enfermedad renal crónica cuesta más que el cáncer de mama, pulmón, colon y piel juntos. Por lo tanto, la IgAN centra la atención de investigadores, médicos y proveedores de atención médica. Los individuos afectados por IgAN desarrollan complejos de anticuerpos característicos que contienen IgA que se depositan en el riñón produciendo lesión tisular. Hasta la fecha, la biopsia renal con evaluación histopatológica es el mejor método disponible para diagnosticar la IgAN. La IgAN es un rasgo genéticamente complejo, y no se sabe mucho sobre su patogenia y fisiopatología. Por lo tanto, las opciones de tratamiento actualmente son limitadas y basadas en datos empíricos.
Se espera que con un diagnóstico y tratamiento tempranos, sea posible retrasar o incluso detener la progresión de las enfermedades renales, tales como la IgAN. También existe una necesidad apremiante de personalizar la atención médica y encontrar nuevas terapias dirigidas molecularmente en esta enfermedad. Un gran potencial para nuevos hallazgos con respecto a los procedimientos de diagnóstico para la enfermedad renal radica en las tecnologías '-ómicas', que pueden proporcionar nuevos datos con respecto a la biología de IgAN. Cabe destacar, sin embargo, que si bien los métodos basados en la genética pueden proporcionar información relacionada con la patogenia de la enfermedad, los más directamente relacionados con su fisiopatología son la expresión y producción de proteínas. La información de detección más precisa en cuanto a la presencia de proteínas específicas la proporciona la proteómica. Por tanto, una de las herramientas diagnósticas más prometedoras es la proteómica de la orina, sobre todo porque el material biológico se puede obtener fácilmente y procede directamente del órgano enfermo, el riñón. De hecho, se informó anteriormente que la presencia de proteínas urinarias es indicativa de daño glomerular y fibrosis intersticial. Durante la última década, varios estudios valiosos han relacionado la proteómica con la IgAN, y se ha informado de varias proteínas de la orina consideradas específicas de la IgAN. El estudio publicado por Mucha K. et al. (Pol Arch Med Wewn. 2014;124 (7-8):380-386) presenta un análisis sistemático de la proteómica de la orina de pacientes con enfermedad renal, a saber, IgAN frente a testigos sanos. En particular, los descubrimientos de alfa-1B-glucoproteína (A1 BG), alfa-1 -glucoproteína ácida 1 (ORM1), regiones C de la cadena lambda-2 de Ig (IGLC2) y serotransferrina (TF) no se han divulgado en Mucha et al. La proteómica urinaria como medio para identificar marcadores en pacientes con vasculitis asociada a ANCA, nefropatía por IgA y nefritis por púrpura de Henoch-Schonlein también fue tratada por Siwy J. et al. (Nephrology Dialysis Transplantation 2015; 30 (Suppl. 3): iii40-iii41).
Los métodos para la detección de enfermedades renales mediante el perfilado de proteínas son conocidos en la técnica anterior. Por ejemplo, el documento WO2003002757 (A1) se relaciona con métodos mejorados para detectar una etapa temprana de enfermedad renal y/o complicaciones renales de una enfermedad, particularmente diabetes, y describe la glucoproteína ácida a1 (también conocida como orosomucoide) que se usa en un método para diagnosticar una enfermedad renal y/o complicaciones renales de una enfermedad en un sujeto. La enfermedad comprende una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en diabetes insípida, diabetes tipo I, diabetes II y enfermedad renal, incluida la nefropatía por IgA. Un perfil de fragmentación de proteínas urinarias, en términos de tamaño y secuencia de fragmentos particulares derivados de proteínas filtradas intactas junto con la posición donde se produce la escisión de las enzimas a lo largo de la cadena polipeptídica de la proteína es característico del estado patológico del riñón.
El documento CN102590491 (A) da a conocer un método de ensayo y un kit de ensayo para la detección temprana o el diagnóstico de enfermedades del sistema urinario. El método descrito en el mismo se basa en la identificación y cuantificación de los siguientes marcadores proteicos: COL6A1, GC, RBP4, DNASE1, GAA, SERPING1, CTSD, KNG1, UMOD, PIGR, AHSG, A1BG, AMBP, Az Gp 1, PTGDS, HPX, CD14 y ORM1. En este documento, se sugieren combinaciones específicas de marcadores de proteínas para el carcinoma de células renales, el cáncer de vejiga, la lesión renal aguda, la diabetes tipo II, la nefropatía por IgA, la cistitis intersticial, la enfermedad renal poliquística y el rechazo agudo del trasplante de riñón.
El documento US20160061845 (A1) describe un método para diagnosticar y tratar a un sujeto que tiene un síndrome nefrótico, que comprende la etapa de determinar el nivel de uno o más biomarcadores en un biofluido, en el que el biomarcador indica un nivel de una proteína seleccionada de vitamina D-proteína de unión (VDBP), lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL), fetuina A, AGP1, AGP2, A2MCG y prealbúmina.
El documento US8927220 (B2) se refiere al desarrollo de una proteína que puede utilizarse para diagnosticar la nefropatía por IgA y la nefropatía de la membrana basal glomerular delgada (en adelante, denominada ''TGBM"), y utilizarse como biomarcador para diagnosticar los casos graves de las mismas, y más concretamente a una proteína biomarcadora que muestra niveles aumentados/disminuidos en la orina de pacientes con nefropatía por IgA o con nefropatía por TGBM en comparación con los de la orina de personas normales, y un kit de diagnóstico que utiliza la proteína biomarcadora, que se puede usar para diagnosticar nefropatía por IgA y nefropatía por TGBM de forma temprana, y predecir y determinar el grado de progresión de la enfermedad por adelantado. La proteína biomarcadora que muestra niveles aumentados/disminuidos en la orina de pacientes con nefropatía por IgA o por TGBM se selecciona de una amplia lista de biomarcadores que incluyen el precursor de ceruloplasmina, el precursor de alfa-1-antitripsina, el precursor de serotransferrina, el fragmento variante de transferrina y el precursor de alfa-2-macroglobulina.
El documento US20140038203 (A1) da a conocer un método para detectar o predecir la aparición o la magnitud de una enfermedad renal, tal como la enfermedad renal aguda (AKI), anteriormente denominada insuficiencia renal aguda 1ARF. En varios aspectos, se proporcionan métodos y kits para detectar proteínas urinarias específicas asociadas con el diagnóstico o pronóstico de AKI usando (a) angiotensinógeno, apolipoproteína A-IV, factor derivado del epitelio pigmentario, timosina J34, proteína I de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, mioglobina, proteína de unión a la vitamina D, complemento C4-B, profilina-1, alfa-i antitripsina, cadena alfa de fibrinógeno, glutatión peroxidasa 3, superóxido dismutasa [Cu Zn], complemento C3, antitrombina neutrófilo defensina I, y (b) ribonucleasa no secretora, proteína I relacionada con Ly-6/uPAR secretada, precursor del factor de crecimiento proepidérmico (proteína pro-EGF) y glucoproteína CD59. También se describen los siguientes marcadores: serotransferrina (P02787), alfa-1-glucoproteína ácida 1 (P02763), alfa-1-glucoproteína ácida 2 (ORM2) (P19652), alfa-IB-glucoproteína (P04217), regiones C de la cadena lambda-2 de Ig (IGLC2) (POCG05), glucoproteína VI plaquetaria (GP6) (Q9HCN6), SERPINA1, SERPINA3, SERPINA5, SERPINA7 y dipeptidasa citosólica no específica (CNDP2).
El documento WO2013152989 (A2) se refiere a un ensayo de biomarcadores de diagnóstico y/o terapéuticos y/o de pronóstico y/o de estratificación del paciente para el pronóstico y/o diagnóstico y/o terapia del cáncer colorrectal y/o del cáncer de pulmón y/o del cáncer de páncreas que comprende la medición combinada de al menos dos, preferiblemente al menos tres biomarcadores de proteínas/péptidos y/o fragmentos de biomarcadores de proteínas seleccionados de un primer grupo que consiste en: CP; SERPINA3; PON1; opcionalmente en combinación con al menos uno o ambos biomarcadores de proteína/péptido y/o fragmentos de biomarcadores de proteínas seleccionados de un segundo grupo que consiste en: IGFBP3; ATRN; LR61; TIMP1. En esta publicación también se divulga el marcador SERPINA6.
El documento WO2011035323 (A1) se refiere a métodos y composiciones para el seguimiento, diagnóstico, pronóstico y determinación de regímenes de tratamiento en sujetos que padecen o se sospecha que padecen una lesión renal. En particular, los métodos descritos en el mismo utilizan una pluralidad de ensayos, uno o más de los cuales están configurados para detectar un marcador de lesión renal como biomarcadores de diagnóstico y pronóstico en lesiones renales. Se pueden combinar indicios clínicos adicionales con el o los resultados del ensayo de marcadores de lesión renal. Estos incluyen otros biomarcadores relacionados con el estado renal. Los ejemplos incluyen los siguientes que consisten en el inhibidor de metaloproteinasa 2, el receptor 1 de lipoproteínas de baja densidad oxidadas solubles, la interleucina-2, el factor de von Willebrand, el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, el miembro 11B de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, la elastasa de neutrófilos, la interleucina-1 beta, la proteína de unión a ácidos grasos de tipo cardíaco, la beta-2-glucoproteína 1, el ligando CD40 soluble, el factor de coagulación VII, la quimiocina 2 con motivo C-C, IgM, CA 19-9, IL-10, TNF-01 y mioglobina. También describe la ferritina (cadena ligera, P02793; cadena pesada P02794) y alfa-1-glucoproteína ácida 1 (P02763).
El documento US2014235503 A1 indica CNDP1 (también conocida como carnosinasa) como proteína asociada con la función/disfunción renal y la publicación en Postepy Hig. Medicina. Dosw. (2012); vol. 66, páginas 215-221 divulga los resultados de estudios relacionados con el papel de la carnosinasa en enfermedades renales, particularmente en la insuficiencia renal aguda inducida por isquemia/reperfusión, la nefropatía diabética, la nefrotoxicidad inducida por gentamicina y también en la regulación de la presión arterial.
Aunque el número de diferentes marcadores relacionados con las enfermedades renales es significativo, todavía existe la necesidad de proporcionar métodos y ensayos de diagnóstico altamente selectivos y sensibles que permitan el diagnóstico y el seguimiento de la IgAN. Además, existe la necesidad de métodos que sean adecuados para diferenciar la IgAN de otras enfermedades renales crónicas.
Divulgación de la invención
La presente invención pretende resolver los problemas identificados anteriormente. Los presentes inventores han revelado que la concentración de proteínas en orina de alfa-1B-glucoproteína (A1BG), alfa-1-glucoproteína ácida 1 (ORM1), regiones C de la cadena lambda-2 de Ig (IGLC2) y el nivel de serotransferrina (TF) cambia en muestras de
orina recogidas de pacientes que padecen nefropatía IgA (IgAN), en comparación con individuos sanos o con enfermedades renales de diferente etiología, en particular poliquistosis renal autosómica dominante (PQRAD) y nefritis lúpica (NL). En particular, la expresión de dichos marcadores en pacientes con IgAN es mayor que en individuos sanos o con enfermedades renales de otra etiología, como la PQRAD y la NL. El término "expresión" como se usa en este documento corresponde a cantidades de dichos marcadores o sus niveles de concentración en una muestra de orina.
Los marcadores indicados anteriormente son únicos para IgAN y se han seleccionado en base al análisis de muestras de orina de pacientes que padecen IgAN, PQRAD, NL y testigos sanos. En el presente documento se describe que los niveles de cada proteína y sus fragmentos de longitud no completa, es decir, proteínas marcadoras truncadas en uno o ambos lados de la secuencia de aminoácidos de la proteína completa, y/o la combinación de las mismas, se correlacionan con el tipo de enfermedad, permitiendo así la detección de IgAN en un paciente, su diferenciación de enfermedades renales que tienen una etiología diferente y el seguimiento de la respuesta del paciente de IgAN a un tratamiento.
Por consiguiente, en el presente documento se describe el uso de una combinación de alfa-1 B-glucoproteína (A1BG), alfa-1-glucoproteína ácida 1 (ORM1) y regiones C de la cadena lambda-2 de Ig (IGLC2), opcionalmente además en combinación con uno o ambos de serotransferrina (TF) y glucoproteína VI plaquetaria (GP6), en donde dichos marcadores también comprenden los fragmentos no completos de los mismos, como marcadores en el diagnóstico, seguimiento y diferenciación de IgAN. La Tabla 1 a continuación enumera los números de acceso de identificación en Uniprot y sumariza las funciones conocidas para A1 BG, ORM1, IGLC2 y TF.
Tabla 1. La descripción general de las proteínas utilizadas de acuerdo con la presente invención
A continuación se presentan breves características moleculares y funcionales de cada una de las moléculas reportadas:
1. La alfa-1B-glucoproteína (A1BG) es una proteína humana de 54,3 kDa que está constituida por 495 aminoácidos y codificada por el gen A1BG localizado en 19q13.43 (por Entrez Gene). La proteína muestra similitud de secuencia con las regiones variables de algunas proteínas miembros de la familia supergénica de las inmunoglobulinas y contiene cinco dominios de tipo V similares a Ig (similares a inmunoglobulinas). La función de la proteína en los sistemas biológicos aún no se ha establecido. Se ha informado que la proteína A1BG puede ser objeto de fragmentación y que el fragmento A1BG de 13,8 kDa tiene un alto poder discriminatorio para la resistencia a los esteroides en el síndrome nefrótico pediátrico, pero solo está presente en un subconjunto de pacientes (véase Piyaphanee N et al. Proteomics Clin Appl. 2011; 5:334-42).
2. La alfa-1-glucoproteína ácida 1 (AGP1) de ser humano, también conocida como orosomucoide 1 (ORM1), es una glucoproteína de 41-43 kDa codificada por el gen localizado en el genoma humano en 9q32 (por Entrez Gene). En seres humanos, el resto peptídico es una cadena simple de 201 aminoácidos de 23,5 kDa de peso molecular. Los carbohidratos constituyen aproximadamente el 45% restante del peso molecular de la proteína modificada postraduccionalmente, unida en forma de cinco a seis glicanos ligados a N de tipo complejo altamente sialilados. AGP1 pertenece a la familia de proteínas de la fase aguda. En consecuencia, su concentración sérica aumenta en respuesta a una lesión, inflamación o infección del tejido sistémico. Este aumento en la concentración sérica resulta principalmente de una producción elevada de proteínas en el hígado, como parte de una respuesta de fase aguda. La expresión del gen AGP1 es objeto de regulación mediante una combinación de los principales mediadores reguladores de una respuesta de fase aguda, es decir, una red de citocinas que contiene principalmente interleucina-1beta (IL-1beta), factor alfa de necrosis tumoral (TNFαlfa), interleucina-6 y una variedad de citoquinas relacionadas con IL-6, así como glucocorticoides. La función biológica de AGP1 no está clara. La principal capacidad conocida de AGP1 es unirse y transportar numerosos fármacos lipófilos básicos y neutros de origen endógeno (p. ej., hormonas esteroides) y exógeno (tal como el fenobarbital). El principal factor que influye en las actividades inmunomoduladoras o de unión de AGP1 está relacionado con la composición de los carbohidratos unidos al polipéptido AGP1.
3. Las regiones C de la cadena lambda-2 de Ig (IGLC2) están codificadas por un gen que pertenece a la familia de genes de la región constante de las cadenas lambda de las inmunoglobulinas. El gen IGLC2 reordenado (localizado en 22q11.2, por Entrez gene) codifica la proteína constituida por aproximadamente 106 aminoácidos de un peso teórico de aproximadamente 11,2 kDa. La función principal de la proteína IGLC2 es la participación en el reconocimiento y la unión de antígenos, así como el posterior inicio y regulación de la respuesta inmunitaria específica a un antígeno.
4. La serotransferrina (TF), también conocida como transferrina o siderofilina, es una glucoproteína sérica de fase aguda de ~80 kDa responsable del transporte de iones Fe3+ desde los sitios de absorción y degradación del hemo hasta los sitios de almacenamiento o degradación. El sitio principal de producción es el hígado, pero esta proteína también se puede producir en tejidos periféricos. La serotransferrina juega un papel en múltiples procesos en el cuerpo humano. En el síndrome nefrótico, la pérdida urinaria de transferrina puede ser uno de los mecanismos causantes de una anemia microcítica resistente al hierro. Utilizada como biomarcador de orina, se ha informado que la serotransferrina es uno de los predictores de la disminución de la función renal en la nefritis lúpica (véase Abulaban KM et al. Lupus. 2016, en prensa).
5. La glucoproteína plaquetaria VI (GP6) es una proteína de la membrana plaquetaria de 58 kD que desempeña una función sustancial en la activación y agregación de las plaquetas inducida por el colágeno. Actúa como un actor importante en la homeostasis y la integridad vascular. Por ejemplo, se ha demostrado que la inhibición de la GP6 plaquetaria protege contra la lesión miocárdica por isquemia-reperfusión (véase Pachel C et al. Arterioescler Thromb Vase Biol.2016;36(4):629-35). En relación con las enfermedades renales, se ha informado que el reclutamiento de plaquetas al glomérulo inflamado, que es crucial en la patogenia de ciertas formas de glomerulonefritis, ocurre vía una ruta dependiente de alfaIIbbeta3/GPVI (véase Devi S, Am J Pathol.
2010;177(3): 1131-42).
En la primera realización de la invención se proporciona un método de diagnóstico de nefropatía por IgA en un sujeto. Este método de la invención comprende:
(a) Una etapa de identificación de una combinación de A1BG, ORM1 e IGLC2, en el que dichos marcadores también comprenden fragmentos no completos de las mismas, en una muestra de orina de dicho sujeto y
(b) Una etapa de comparación cuantitativa o semicuantitativa de los marcadores identificados en la etapa (a) con los marcadores identificados en un individuo sano.
Preferiblemente, en el método de la invención se identifica y compara una TF o una GP6 como marcador adicional.
La expresión "un fragmento de longitud no completa", como se usa en el presente documento, se refiere a proteínas marcadoras truncadas en uno o ambos lados de la secuencia de aminoácidos de la proteína completa. Un fragmento de longitud no completa del marcador A1BG es cualquier fragmento de proteína A1BG que tenga un peso molecular inferior a 85 kDa y preferiblemente cualquier proteína que tenga un peso molecular de 13 - 60 kDa. Más preferiblemente, un fragmento de longitud no completa del marcador A1BG es un fragmento de longitud de rango medio de 35 - 60 kDa y/o un fragmento de longitud inferior de 13 - 17 kDa. Un fragmento de marcador TF de longitud no completa es cualquier fragmento de proteína TF que tenga un peso molecular inferior a 80 kDa y preferiblemente cualquier proteína que tenga un peso molecular de 10 - 70 kDa. Para otros dos marcadores no se observaron fragmentos de longitud no completa.
La expresión "comparación cuantitativa" se refiere a una comparación realizada utilizando una técnica de medición cuantitativa, en la que se miden cantidades absolutas. Un ejemplo de tal técnica incluye la espectrometría de masas y ELISA. La expresión "comparación semicuantitativa" se refiere a una comparación realizada utilizando una técnica de medición semicuantitativa, en la que se determinan cantidades relativas. Un ejemplo de tal técnica incluye la transferencia Western.
En dicho método de la invención se analiza una muestra de orina recogida de un sujeto, en donde dicho análisis comprende una etapa de separación de todas las partes sólidas de la muestra, por ejemplo por filtración, centrifugación, o cualquier otro método adecuado, y posteriormente una etapa de identificación de una combinación de A1 BG, ORM1 e IGLC2, y opcionalmente GP6 y TF, así como sus fragmentos no completos, en dicha muestra de orina.
La presencia de los marcadores en la muestra de orina en el método de la invención se puede determinar preferiblemente mediante espectrometría de masas (MS). En este aspecto de la invención, la secuencia de aminoácidos puede identificarse en función de la relación masa-carga utilizada para generar espectros de masas de alta resolución. Un ejemplo de ese método se presenta en el Ejemplo 1 a continuación. En un aspecto preferido de esta invención, se puede usar una espectrometría de masas en tándem (MS/MS) como se describió anteriormente, por ejemplo, en Aebersold R y Mann M, Nature, 2003, 422(6928), 198-207, y en Yates III J. R., Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, 2004, 33, 297-316. Alternativamente, también se pueden usar diferentes técnicas basadas en MS para identificar las combinaciones de marcadores identificadas anteriormente en muestras de orina (tales como MALDI (desorción láser asistida por matriz) espectrometría de masas de imágenes (MALDI-IMS), cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), e ionización por electropulverización ESI MS y su
combinación),
En una realización más preferida, la combinación de A1BG, ORM1 e IGLC2, y opcionalmente GP6 y TF, puede identificarse en dicha muestra de orina mediante métodos basados en ELISA, que incluyen ELISA microfluídico, electroforesis de proteínas y transferencia Western, que incluyen electroforesis microfluídica y transferencia Western utilizando electroforesis capilar. Estos métodos son bien conocidos en la técnica.
El método ELISA microfluídico ultrasensible en fase sólida se informó y describió, por ejemplo, en Lab Chip 2013; 13(21), 4190-4197. Este método es útil en la detección cuantitativa rápida y ultrasensible de proteínas de baja abundancia. La estrategia ELISA en fase sólida basada en micropocillos proporciona una plataforma ampliable para desarrollar los sistemas de inmunoensayo de microfluidos de próxima generación que integran y automatizan las mediciones digitales y analógicas para mejorar aún más la sensibilidad, los rangos dinámicos y la reproducibilidad del análisis proteómico.
El otro método, ensayos de electroforesis microfluídica para la caracterización rápida de proteínas, fue caracterizado y tratado en el seminario web de audio Science/AAAS (14/11/2012) por el Dr. Joey Studts de Boehringer Ingelheim en Alemania, el Dr. Timothy Blanc de ImClone Systems en Branchburg, Nueva Jersey y el Dr. Bahram Fathollahi de PerkinElmer en San Francisco, California. Lo que se trató allí se refirió a la aplicación de tecnologías microfluídicas de alto rendimiento al análisis de proteínas bioterapéuticas. Estos ensayos basados en microfluidos brindan una buena solución porque abordan las limitaciones de SDS-PAGE, así como otros ensayos de separación que dependen de la electroforesis capilar convencional en particular en el tiempo de análisis, que puede reducirse a un minuto o menos por muestra. Las ventajas incluyen la miniaturización, la integración y la automatización, que permiten a los laboratorios realizar experimentos en un tiempo de respuesta rápido y, por lo tanto, un análisis analítico más rápido para reducir el tiempo y los gastos en el desarrollo del proceso.
En la publicación Anal Chem. 2011; 83(4), 1350-1355, Anderson et al. describieron un sistema a microescala de transferencia Western basado en la separación de complejos de proteína y dodecilsulfato de sodio por electroforesis capilar en gel seguido por deposición en la membrana de transferencia para inmunoensayo. En el sistema, el capilar de separación se conecta a tierra a través de un capilar de vaina a una etapa móvil de traducción X-Y, que mueve una membrana de transferencia más allá de la salida del capilar para la deposición de proteínas. Los resultados obtenidos demuestran una reducción sustancial en los requisitos de tiempo y una mejora en la sensibilidad de la masa en comparación con las transferencias Western convencionales. El método de transferencia Western que utiliza electroforesis capilar promete analizar muestras de bajo volumen con reactivos y tiempo reducidos, al mismo tiempo que conserva el contenido de información de un método de transferencia Western típico.
El método de análisis descrito anteriormente hace posible determinar patrones de marcadores útiles en el seguimiento de una respuesta de un paciente a un tratamiento para IgAN. La solución de la invención puede eliminar la necesidad de realizar una biopsia para confirmar el diagnóstico de IgAN.
En una realización adicional, se proporciona un método para seguir una respuesta a un tratamiento para IgAN, en donde (a) en un primer momento, se realiza un análisis cuantitativo o semicuantitativo de una combinación de A1BG, ORM1 e IGLC2, en donde dichos marcadores también comprenden los fragmentos no completos de los mismos, en una muestra de orina de un sujeto; (b) posteriormente se realiza el mismo análisis en un momento posterior, y (c) se evalúa la respuesta al tratamiento de la nefropatía IgA en base a la comparación de los resultados obtenidos en las etapas (a) y (b), en donde la menor la expresión del marcador es indicativa de una respuesta a la respuesta al tratamiento. Preferiblemente, en las etapas (a) -(c) como marcadores adicionales se usan TF o GP6, o los fragmentos no completos de los mismos. Más preferiblemente, se repiten las etapas (a) y (b) del método de seguimiento de la invención.
También se divulga en el presente documento un kit para el diagnóstico, diferenciación y seguimiento de la nefropatía por IgA en un sujeto, que comprende al menos dos anticuerpos que se unen específicamente a marcadores seleccionados de un grupo que consiste en A1BG, ORM1, IGLC2 y TF, en donde dichos marcadores también comprenden los fragmentos no completos de los mismos, y en donde dicho kit está equipado con medios de identificación de marcadores que se unen a los anticuerpos de dicho kit. El término "anticuerpoVanticuerpos" incluye también fragmentos o derivados de anticuerpos que se unen específicamente a los marcadores. El kit puede determinar o proporcionar instrucciones para calcular una proporción o relación entre los marcadores. Además, el anticuerpo o los anticuerpos del kit divulgado en el presente documento pueden conjugarse con un marcador, como un fluoróforo o una enzima, o alternativamente, el kit puede estar provisto de cualquier otro medio de detección conocido en el campo, que permita la identificación de los marcadores unidos a los anticuerpos. El anticuerpo o anticuerpos del kit de la invención pueden estar comprendidos en un dispositivo de flujo lateral. En la forma de realización más preferida, el kit comprende un chip microfluídico. El kit puede comprender además un prospecto que proporcione instrucciones para medir los niveles de expresión de los marcadores en una muestra de orina. El kit puede comprender además instrucciones para determinar la probabilidad de desarrollar una IgAN que progresa o empeora en el sujeto.
La invención también proporciona el uso de una combinación de marcadores proteicos que consisten en A1BG, ORM1 e IGLC2 para el diagnóstico y seguimiento de la nefropatía por IgA. Preferiblemente, de acuerdo con el uso de la invención, la serotransferrina (TF) o un fragmento truncado de la misma que tiene un peso molecular de 10 - 70 kDa o la glucoproteína plaquetaria VI (GP6) se usa como marcador adicional para el diagnóstico y el seguimiento de la nefropatía por IgA.
Breve descripción de los dibujos
La invención se describirá en relación con las siguientes figuras de dibujos, en los que:
La Fig. 1 presenta los resultados de la muestra del análisis de transferencia Western del contenido de A1 BG, ORM1, IGLC2 y TF en muestras de orina derivadas de pacientes con enfermedades renales frente a testigos sanos.
La Fig. 2A muestra la evaluación mediante transferencia Western de la proteína A1BG en muestras de orina seleccionadas de participantes del estudio con enfermedades renales (lado izquierdo de las transferencias) en comparación con sujetos sanos (lado derecho de las transferencias). Se puede notar la presencia de varias subformas de la proteína dentro de varios pesos moleculares. Las mediciones de densitometría se realizaron para los rangos superior, medio e inferior por separado. Como se muestra en la Fig. 2B, cada uno de los rangos moleculares se correlacionó de manera diferente con el diagnóstico clínico y también en comparación con la evaluación acumulativa de todos los rangos (Fig. 2C).
La Fig. 3 muestra un sumario de las lecturas de densitometría de la transferencia Western de la proteína ORM1 en muestras de orina seleccionadas de participantes en el estudio con enfermedades renales en comparación con sujetos sanos.
La Fig. 4 muestra un sumario de las lecturas de densitometría de la transferencia Western de la proteína IGLC2 (~30 kDa) en muestras de orina seleccionadas de participantes en el estudio con enfermedades renales en comparación con sujetos sanos.
La Fig. 5 muestra un sumario de las lecturas de densitometría de la transferencia Western de la proteína TF en muestras de orina seleccionadas de participantes en el estudio con enfermedades renales en comparación con sujetos sanos.
La Fig. 6 (A) presenta los resultados de la muestra del análisis de transferencia Western del contenido de GP6 en muestras de orina derivadas de pacientes con enfermedades renales frente a testigos sanos, y la Fig. 6 (B) muestra un resumen de las lecturas de densitometría de la transferencia Western de la proteína GP6 en muestras de orina seleccionadas de participantes en el estudio con enfermedades renales en comparación con sujetos sanos.
Ejemplos
Ejemplo 1
Fase de descubrimiento
El enfoque metodológico de la fase de descubrimiento ha sido descrito en Mucha et al. A continuación, se enumera la información más pertinente.
Características de los pacientes
Grupos de pacientes
El estudio incluyó a 30 pacientes con IgAN y 30 voluntarios sanos de la misma edad y sexo que sirvieron como testigos. Los datos demográficos y clínicos de ambos grupos se presentan en Mucha, et al. (Material complementario en línea, Tabla S1). Brevemente, se incluyeron pacientes con IgAN comprobada por biopsia en diferentes estadios de enfermedad renal crónica (ERC) y mayores de 18 años. Los criterios de inclusión para el grupo testigo fueron los siguientes: edad mayor de 18 años y ausencia de enfermedad renal u otras enfermedades crónicas que requieran tratamiento. Los criterios de exclusión para ambos grupos incluyeron: infección activa, antecedentes de malignidad, trasplante de órgano previo o embarazo actual. Para estimar la GFR se utilizaron las ecuaciones de la Colaboración Epidemiológica de la Enfermedad Renal Crónica, que son las más precisas, se han evaluado en poblaciones grandes y diversas y son aplicables para uso clínico. El protocolo del estudio fue aprobado por el comité de ética local y se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes. El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki.
Recolección de orina
Se recolectaron muestras de todos los individuos de acuerdo con un protocolo de estudio uniforme, siguiendo las recomendaciones sobre recolección de muestras proteómicas de orina. La orina del chorro medio de la segunda o tercera mañana se recogió en recipientes de orina estériles 1 a 3 h después de la micción anterior. El pH de cada muestra se estabilizó en 7,2 mediante la adición de 1/10 vol. de HEPES 1M pH 7,2 inmediatamente después de la recolección. Luego, las muestras se agitaron con vórtex durante 2 min, se centrifugaron a 3000 x g a temperatura
ambiente durante 10 min para eliminar los residuos, se filtraron (filtro de 0,4 μm, Rotilabo-Spritzenfilter, Roth, Karlsruhe, Alemania) y se dividieron en alícuotas de 1 mL que se almacenaron a -80 °C antes de su uso posterior.
Filtración de muestras
Se lavaron filtros de membrana de peso molecular de corte de 10 kDa (Amicon Ultra-0.5, UFC501096, Millipore, Billerica, Estados Unidos) dos veces con agua MilliQ (MQ) antes de su uso. La orina se centrifugó a través de la membrana a 14.000 x g durante 15 min. A continuación, se añadieron 500 μL de MQ al retenido y se repitió la etapa de centrifugación. Para recuperar la muestra concentrada y desalada, el filtro se colocó boca abajo y se centrifugó en un tubo de microcentrífuga limpio durante 2 min a 1000 x g. La concentración de proteína se midió por el método de Bradford. Se almacenaron alícuotas de muestras a -80 °C.
Preparación de la muestra
30 muestras de IgAN se dividieron en 3 muestras agrupadas de enfermedades (DPS I, II y III) y, de manera similar, 30 muestras testigo se dividieron en 3 muestras testigo agrupadas (CPS I, II y III). La coincidencia de edad y sexo se conservó dentro de los 3 pares de grupos de muestra agrupados. Todos los DPS y CPS se obtuvieron en 2 réplicas técnicas (marcadas como A y B) cada una, formando un conjunto de 12 muestras agrupadas para compararlas después de las etiquetas isobáricas para el etiquetado de cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ). Como se utilizó 4-plex iTRAQ, se compararon 2 réplicas técnicas de DPS y CPS en 1 experimento de enfoque isoeléctrico/cromatografía de líquidos-espectrometría de masas/espectrometría de masas (IEHLC-MS/MS). Para analizar 12 muestras, se llevaron a cabo un conjunto de 3 experimentos independientes IEHLC-MS/MS. Las alícuotas con péptidos extraídos se almacenaron a -80 °C para el análisis IEHLC-MS/MS.
Espectrometría de masas
Procesamiento cualitativo de datos de MS/MS. Los datos de MS/MS se preprocesaron con Mascot Distiller (v. 2.3.2.0, Matrix Science, Londres, Reino Unido). La búsqueda de datos utilizando el motor de búsqueda MASCOT se realizó en la base de datos Swiss-Prot con la taxonomía restringida a Homo sapiens (20236 secuencias) en un procedimiento de 3 etapas descrito en otro lugar para calcular los errores de medición de MS y MS/MS y para recalibrar los datos para el MASCOT repetido para eliminar el sesgo sistemático. Las proporciones de proteínas se calcularon como la proporción mediana de las proporciones de sus péptidos. La significación estadística de una proporción de proteína única se evaluó mediante un programa interno, Diffprot. Los valores de P calculados se ajustaron para ensayos múltiples utilizando un procedimiento de control de tasa de descubrimiento falso, lo que dio valores de la relación de proteína q.
Resultados de la fase de descubrimiento
Como resultado del análisis cualitativo (identificación de péptidos y proteínas) en cada uno de los 3 experimentos IEHLC-MS-MS/MS, se identificaron 761, 951 y 956 proteínas, respectivamente, cada una representada por 2 o más péptidos. Los resultados de estas observaciones se presentaron parcialmente en Mucha et al. El descubrimiento de alfa-1B-glucoproteína (A1BG), alfa-1-glucoproteína ácida 1 (AGP1, ORM1), regiones C de la cadena lambda-2 de Ig (IGLC2) y serotransferrina (TF) como marcadores de IgAN se reporta en la presente invención (Tabla 2).
Tabla 2. Lecturas de péptidos de proteómica urinaria específica para alfa-1B-glucoproteína (A1BG), alfa-1-glucoproteína ácida 1 (AGP1, ORM1), regiones C de la cadena lambda-2 de Ig (IGLC2) y serotransferrina (TF) obtenidas en la fase de descubrimiento de la invención.
Ejemplo 2
Fase de validación
La principal diferencia entre las fases de descubrimiento y validación es la transición de la evaluación de las muestras de orina agrupadas (es decir, la fase de descubrimiento) a la evaluación individual de cada proteína en un paciente determinado o una persona sana y una correlación directa de estos resultados con los parámetros clínicos conocidos en cada caso (es decir, la fase de validación).
Características del paciente
El estudio incluyó a 133 pacientes con enfermedad renal y 19 testigos sanos. La enfermedad renal incluyó IgAN (77 casos), PQRAD (29) y NL (27).
Recolección de muestras
Las muestras de orina se recolectaron de acuerdo con el protocolo estandarizado en el Instituto de Trasplantes de la Universidad Médica de Varsovia.
SDS-PAGE
Las muestras se descongelaron a temperatura ambiente (~23 °C), luego se suspendieron mediante pipeteo intensivo o se mezclaron usando un vórtice. Se añadió tampón Leammli a las muestras de orina para alcanzar las siguientes concentraciones finales: SDS 2%; glicerol 10%; p-mercaptoetanol 5%; azul de bromofenol 0,002%; Tris-HCl 0,125 M; pH 6,8. Las muestras se hirvieron a 95 °C durante 2 min. Se cargaron 10 μL de cada muestra en el gel de gradiente Mini-PROTEAN TGX 4-15%.
Análisis de transferencia Western
El método desarrollado por el Departamento de Biología Molecular, Instituto de Bioquímica y Biofísica, Academia Polaca de Ciencias (solicitud de patente no P.415033) permite ensayar todas las proteínas de interés en las muestras de orina. Permite el análisis de todos los biomarcadores proteicos seleccionados con una exactitud que no alcanzan los métodos clásicos. Hasta la fecha, el análisis del proteoma de la orina en medicina comienza con la centrifugación de la muestra (en línea con las pautas de la Confederación Europea de Medicina de Laboratorio), lo que resulta en la pérdida de proteínas que son insolubles y existen como agregados o productos de degradación. Esta fracción sólida es crucial porque las proteínas progresan hacia formas insolubles al azar, dependiendo de la proteína, el estado del paciente, su dieta y las propiedades de la orina. Por esa razón, en el presente estudio se ha utilizado la orina entera en forma de suspensión, que luego se analizó mediante la técnica de transferencia Western. Eso da la oportunidad de examinar todas las proteínas presentes en una determinada muestra de orina. Las ventajas de este método son importantes para la diagnosis medicinal. El método no es invasivo para los pacientes, permite recolectar las muestras de los pacientes incluso unas pocas veces al día y consume relativamente poco tiempo. Para el análisis de transferencia Western, las muestras de proteínas de orina se separaron en geles SDS-PAGE, como se describió anteriormente, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron en tampón de bloqueo apropiado (leche en polvo baja en grasa al 5% o albúmina de suero bovino en TBS-Tween 20 (TBST)). Después de una incubación en el anticuerpo primario (A1BG (F-9); número de catálogo sc-374415; Santa Cruz), las células se lavaron en TBST y se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante. La reacción de quimioluminiscencia para HRP se desarrolló utilizando SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific) y se visualizó con el reproductor de bioimágenes Stella 8300. Se realizaron lecturas de densitometría de cada una de las bandas en las transferencias. Se agruparon ocho muestras de pacientes elegidas al azar y se usaron en cada transferencia Western como punto de referencia. Las lecturas de densitometría de otra banda en una membrana de transferencia Western dada se dividieron entre la lectura del punto de referencia respectivo. Los resultados se denominaron "densidad de banda relativa".
Lista de anticuerpos utilizados para la transferencia Western: A1BG (n.° de cat. sc-374415, Santa Cruz), ORM1 (sc-69753, Santa Cruz), IGLC2 (sc-33134, Santa Cruz), TF (sc-21011, Santa Cruz), GP6 (sc-20149, Santa Cruz).
Resultados
Los resultados del análisis de transferencia Western representativo de la presencia de A1BG, ORM1, IGLC2 y TF en muestras de orina se presentan en la Figura 1.
A1BG basada en el análisis de transferencia de Western, se hace evidente que los participantes del estudio con enfermedades renales muestran la presencia de diferentes formas de la proteína (para los fines de esta invención segregadas dentro del rango de pesos moleculares alto [~80 kDa], medio [~45 kDa] y bajo [~15 kDa]), que se presentan en diferentes proporciones. En la Figura 2A se presenta una comparación directa de muestras seleccionadas de pacientes con enfermedad renal versus pacientes sanos. Las relaciones mutuas entre las formas visibles pueden ser importantes en la fisiopatología de la enfermedad dada. De hecho, como se presenta en la Figura 2B, varias subformas de A1BG se correlacionan de manera diferente con el tipo de enfermedad renal y también de manera diferente en
comparación con la evaluación acumulativa de la proteína (Figura 2C). En particular, las bandas del rango inferior tienden a ser más prominentemente elevadas en pacientes con IgAN.
La fase de validación descrita anteriormente también se realizó para los otros marcadores, en particular ORM1, IGLC2 y TF y los resultados se presentan en las Figs. 3-5. Los resultados también se presentan para GP6 (Fig. 6). Aunque GP6 se expresa en promedio a niveles más altos en NL que en IgA, según los resultados y datos de los presentes inventores, la compilación de 4 proteínas reportadas en la compilación GP6 puede aumentar la sensibilidad y especificidad del ensayo.
Claims (9)
1. Un método de diagnóstico de nefropatía por IgA en un sujeto, que comprende:
(a) Una etapa de identificación de una combinación de alfa-1B-glucoproteína (A1BG) o un fragmento truncado de la misma que tiene un peso molecular de 13 - 60 kDa, orosomucoide 1 (ORM1) y regiones C de la cadena lambda-2 de Ig (IGLC2) como marcadores proteicos, en una muestra de orina de dicho sujeto y
(b) Una etapa de comparación cuantitativa o semicuantitativa de los marcadores identificados en la etapa (a) con los marcadores identificados en un individuo sano.
2. El método según la reivindicación 1, en el que se identifica y compara una serotransferrina (TF) o un fragmento truncado de la misma que tiene un peso molecular de 10 - 70 kDa o glucoproteína plaquetaria VI (GP6) como marcador adicional.
3. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que los marcadores se identifican usando técnicas que comprenden espectrometría de masas, o un ensayo basado en anticuerpos, o una combinación de dichas técnicas.
4. El método según la reivindicación 3, en el que el ensayo basado en anticuerpos es la transferencia Western.
5. Un método para el seguimiento de una respuesta a un tratamiento de nefropatía por IgA, en el que:
a) En un primer momento se realiza el análisis cuantitativo o semicuantitativo de una combinación de alfa-1B-glucoproteína (A1BG) o un fragmento truncado de la misma con un peso molecular de 13 a 60 kDa, orosomucoide 1 (ORM1) y las regiones C de la cadena lambda-2 de Ig (IGLC2) como marcadores proteicos en una muestra de orina de un sujeto;
(b) Posteriormente se lleva a cabo el mismo análisis en un momento posterior, y
(c) La respuesta al tratamiento de la nefropatía por IgA se evalúa en base a la comparación de los resultados obtenidos en las etapas (a) y (b), en donde la menor expresión del marcador es indicativa de una respuesta al tratamiento.
6. El método según la reivindicación 5, en el que en las etapas (a) -(c) se usa como marcador adicional serotransferrina (TF) o un fragmento truncado de la misma que tiene un peso molecular de 10 - 70 kDa o glucoproteína VI plaquetaria (GP6).
7. El método según la reivindicación 5 ó 6, en el que (a), (b) y (c) se repiten.
8. Uso de una combinación de marcadores proteicos que consisten en alfa-1B-glucoproteína (A1BG), orosomucoide 1 (ORM1) y regiones C de la cadena lambda-2 de Ig (IGLC2) para el diagnóstico y seguimiento de la nefropatía por IgA.
9. El uso según la reivindicación 8, en el que la serotransferrina (TF) o un fragmento truncado de la misma que tiene un peso molecular de 10 - 70 kDa o la glucoproteína plaquetaria VI (GP6) se usa como marcador adicional para el diagnóstico y seguimiento de la nefropatía por IgA.
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