ES2923769T3 - Procedimientos relacionados con composiciones de células dendríticas activadas para sujetos con cánceres avanzados - Google Patents

Procedimientos relacionados con composiciones de células dendríticas activadas para sujetos con cánceres avanzados Download PDF

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Abstract

La presente divulgación proporciona células dendríticas parcialmente maduras y activadas que producen niveles de citoquinas/quimioquinas, por ejemplo, una o cualquier combinación de, y/o la totalidad de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFα, que son se correlacionó con mejores resultados clínicos, tiempos de supervivencia significativamente mayores y tiempos significativamente mayores hasta la recurrencia del tumor o del cáncer. Las cantidades umbral determinadas de estas citoquinas se pueden usar para (i) una prueba de potencia inmunoterapéutica para células dendríticas activadas, (ii) seleccionar pacientes que responden, (iii) rechazar pacientes que no responden y (iv) para detectar la activación de células dendríticas o agentes de maduración que también pueden inducir la producción de la cantidad umbral de citocinas/quimiocinas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos relacionados con composiciones de células dendríticas activadas para sujetos con cánceres avanzados
ANTECEDENTES
[0001] Los pacientes con tumores sólidos irresecables, avanzados localmente o metastásicos tienen un pronóstico pobre y pocas opciones terapéuticas, especialmente después de haber fallado terapias estándares. Amato, Semin. Oncol. 27:177-186, 2000; Bramwell et al., Cochrane Database Syst. Rev. 3:Cd003293, 2003; Klelger et al., Ann. Oncol.
25:1260-1270, 2014). Recientemente han habido varios avances prometedores en inmunoterapias de cáncer (Ito et al., Biomed. Res. Int. 2015:605478, 2015; West, JAMA Oncol. 1:115, 2015); sin embargo, para aumentar una respuesta inmune eficaz frente a cáncer, el sistema inmune primero debe estar preparado para atacar células cancerígenas. (Melero et al., Nat. Rev. Cancer 15:457-472, 2015). Especialmente, los antígenos específicos de tumor deben introducirse en células T utilizando células presentadoras de antígenos, las que a su vez inducen diferenciación de células T en células T citotóxicas activadas (CTLs). (Ito et al., Biomed. Res. Int. 2015:605478, 2015; MacKeon et al., Front. Immunol. 6:243, 2015).
[0002] Las células dendríticas (DCs) se especializan en el inicio de respuestas inmunes, a través de la absorción y posterior presentación al sistema inmune de compuestos antigénicos. Las DCs estimulan tanto las células B como las células T y producen moléculas coestimuladoras, tales como citocinas, para dirigir la expansión de CTL. (Banchereau et al., Nature 392:245-252, 1998). En consideración de la habilidad de las DCs a inducir una respuesta inmune amplia, en los últimos años se ha desarrollado rápidamente el estudio de inmunoterapia basado en DC. Los ensayos clínicos de vacunas de cáncer basadas en DC han demostrado diferentes grados de promesas y actualmente varios productos se encuentran en la última etapa de ensayo clínico. (Anguille et al., Pharmacol. Rev. 67:731-753, 2015). Diferentes Dcs que se encuentran en la sangre se conocen por su presentación cruzada de antígenos eficaz y su habilidad de migrar para drenar de manera eficaz a nódulos linfáticos. Sin embargo, las DCs componen menos de 1% de células mononucleares de sangre periférica, lo que significa que no existe suficiente material celular para generar una composición para iniciar y mantener una inmunidad específica tumoral. (MacKeon, Front. Immunol. 6:243, 2015; Anguille et al., Pharmacol. Rev. 67:731-753, 2015) Como resultado, DCs generadas ex vivo derivaron de monocitos recogidos del sujeto a tratar, por ejemplo, leucoféresis; sin embargo, actualmente se investigan las estrategias que utilizan otros tipos de DC. Después de producir DCs, normalmente las células se someten a pulsación con un antígeno y se infectan de nuevo en el paciente. La elección y la fuente del antígeno, (por ejemplo, antígeno específico de tumor purificado o asociado a tumor).
[0003] En estudios preclínicos, las DC activadas (aDC; DCVax®-Direct) mostraron ser superiores a DC inmaduras en liquidación de tumores en ratones, después de inyección intratumoral.
[0004] Las células dendríticas (DCs) son las células presentadoras de antígeno profesionales del sistema inmune que se considera ser capaz de activar tanto las células T sin tratar como de memoria. Las células dendríticas están altamente preparadas ex vivo para su uso en la inmunoterapia, particularmente para inmunoterapia de cáncer. La preparación de células dendríticas con propiedades inmunoestimuladoras óptimas requiere un entendimiento y utilización de la biología de estas células para el cultivo ex vivo. Se han descrito diferentes protocolos para el cultivo de estas células, con diferentes ventajas atribuidas a cada protocolo.
[0005] La activación de células dendríticas inicia el proceso que convierte las DCs inmaduras, que son similares fenotípicamente a células de Langerhans de la piel, en las células presentadoras de antígeno maduras, que pueden migrar a los nódulos linfáticos. Este proceso da lugar a la pérdida gradual y progresiva de la capacidad de absorción fuerte de antígeno, que caracteriza la célula dendrítica inmadura, y en la sobrerregulación de la expresión de moléculas de superficie celular coestimuladoras y diferentes citocinas. Diferentes estímulos pueden iniciar la maduración de DCs. Este proceso es complejo y como mínimo la maduración completa in vitro de células dendríticas, y particularmente células dendríticas monocíticas, que dependen del agente de maduración de células dendríticas utilizado, puede llevar hasta 48 horas para completarse. Una de las consecuencias de la maduración es un cambio en las propiedades migratorias in vivo de las células. Por ejemplo, la inducción de maduración de células dendríticas inmaduras induce diferentes receptores de quimiocinas, que incluyen CCR7, que dirigen las células hacia las regiones de células T de drenaje de nódulos linfáticos, en las que las DCs maduras activan células T frente a los antígenos presentes sobre la superficie de DC en el contexto de moléculas MHC de clase I y clase II. Los términos «activación» y «maduración» y «activado» y «maduro» describen el proceso de inducción y ejecución de la transición desde una Dc inmadura (que se caracteriza parcialmente por la habilidad de absorber el antígeno) a una DC madura (que se caracteriza por la habilidad de simular de manera eficaz de nuevo las respuestas de células T). Típicamente los términos se utilizan de manera intercambiable en la técnica.
[0006] Se cree que los protocolos conocidos de maduración de DCs se enfrentan durante o después de la exposición a antígenos. Un primer ejemplo de este enfoque es el uso de un medio condicionado por monocitos (MCM) como un medio de cultivo celular. MCM se genera in vitro utilizando monocitos de cultivo y se utiliza como una fuente de factores de maduración. (Véanse, por ejemplo, US 2002/0160430). Se informa que los componentes principales en MCM responsables de maduración son las citocinas (pro)inflamatorias Interleucina 1 beta (IL-1p), Interleucina 6 (IL-6) y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa). Otros agentes de maduración de células dendríticas incluyen, por ejemplo, agonistas de receptores similares a Toll en mezclas de citocinas, tales como factor de necrosis tumoral a (TNFa), interleucina (IL)-1p, IL-6 y prostaglandina E2 (PGE2).
[0007] Por consiguiente, la maduración de DCs puede desencadenarse o iniciarse por una multitud de diferentes factores que actúan a través de un huésped de secuencias de transducción de señal. Por consiguiente, no existe ninguna secuencia o resultado de maduración único, pero, de hecho, existe un universo de etapas de DC maduras, cada una con sus propias características funcionales diferentes. Teóricamente esto tiene sentido dado que las diferentes amenazas al cuerpo a las que tiene que responder el sistema inmune son múltiples y necesitan diferentes estrategias de ataque. Como un ejemplo, mientras la infección bacteriana se elimina mejor con los macrófagos activados suplementados con anticuerpos específicos, una infección vírica se ataca mejor a través de células T citotóxicas que eliminan de manera eficaz células infectadas con virus. La eliminación de células cancerígenas involucra típicamente una combinación de células T citotóxicas, células asesinas naturales y anticuerpos.
[0008] Por consiguiente, la maduración in vitro de DCs puede modificarse para inducir al sistema inmune favorecer un tipo de respuesta inmune sobre la otra, es decir, polarizar la respuesta inmune. La maduración direccional de DCs describe la idea que el resultado del proceso de maduración dicta el tipo de respuesta inmune resultante que proviene del tratamiento con las DCs maduras. En su forma más simple, la maduración direccional da lugar a una población de DC que produce citocinas que dirigen una respuesta de células T polarizada o a una respuesta inmune de tipo Thl o de tipo Th2. Interferón y, interferón a y ácido poliisosínico: policitidílico se han utilizado para suplementar un agente de maduración de células dendríticas para genera DCs polarizadas de tipo 1 maduras que secretan IL-12. Las Dcs maduras doblan un perfil de tipo (TH1) 1 de célula T auxiliar que produce célula asesina natural y activación de CTL. (Maillard et al., Cancer Res. 64:5934-5937, 2004; Trinchieri, Blood 84:4008-4027, 1994). La activación de CTL desencadena un estado proinflamatorio, estimulando a estas células a eliminar las células tumorales directamente. (Coulie et al., Nat. Rev. Cancer 14:135-146, 2014).
[0009] Las DCs expresan hasta nueve diferentes receptores similares a Toll (TLR1 hasta TLR9), cada uno de los cuales puede utilizarse para desencadenar la maduración. No sorprendentemente, la interacción de productos bacterianos con TLR2 y TLR4 da lugar a mutación direccional de DCs que da como resultado respuesta polarizada más apropiada para tratar infecciones bacterianas. En cambio, la maduración desencadena a través de TLR7 o TLR9 parece provocar más una respuesta de tipo antivírico. Como un ejemplo adicional, la adición de interferón gamma (IFN-y) a mayoría de protocolos de maduración da lugar a la producción de interleucina 12 por las DCs maduras, lo que impone una respuesta inmune de tipo Thl. En cambio, la inclusión de prostaglandina E2 tiene el efecto opuesto.
[0010] Las células dendríticas completamente maduras difieren de manera cualitativa y cuantitativa de las DCs inmaduras. Cuando estén totalmente maduras, las DCs expresan altos niveles de antígenos MHC de clase I y clase II y altos niveles de moléculas coestimuladoras de células T, tales como CD80 y CD86. Estos cambios aumentan la capacidad de las células dendríticas de activar células T dado que aumentan la densidad de antígeno sobre la superficie celular, así como la magnitud de la señal de activación de células T a través de los equivalentes de las moléculas estimuladoras en las células T, por ejemplo, CD28 y similares. Además, las DCs maduras producen grandes cantidades de citocinas, que estimulan y polarizan la respuesta de células T. Estas citocinas incluyen interleucina 12 asociada a la respuesta inmune de tipo Th1 y interleucina-10 y interleucina-4 asociadas a respuesta inmune de tipo Th2.
[0011] Generalmente, los procedimientos para la generación de DC ex vivo comprenden obtener una población de células enriquecida para las células precursoras de DC de un sujeto y, a continuación, diferenciar las células precursoras de DC in vitro en las DCs completamente maduras antes de introducirlas de nuevo en el sujeto. Típicamente durante este proceso las DCs que están madurando se ponen en contacto con antígeno para la absorción y el procesamiento a medida que las DCs se convierten en maduras. Algunos creen que las DCs deben diferenciarse en fase terminal o se volverán a diferenciarse en monocitos/macrófagos y perderán mucho de su habilidad potenciadora inmune. Se ha logrado con éxito la maduración ex vivo de DCs generadas a partir de monocitos utilizando los procedimientos y agentes bien conocidos en la técnica.
[0012] Las células dendríticas (DCs) se reconocen como el vehículo preferido para inmunoterapia activa de cáncer. Los experimentos en animales han demostrado el potencial de DC basado en inmunoterapia tanto en la protección de ratones de formación de tumores como en la eliminación de tumores establecidos. Estos logros como mínimo se han duplicado parcialmente en humanos en pequeños ensayos clínicos. La transición desde ensayos de seguridad o prueba de concepto hasta ensayos más grande en los que la actividad o la eficacia puede demostrarse ha sido dificultada por la naturaleza complicada y engorrosa de preparación de DC tal como se describe anteriormente. Como consecuencia, pocas empresas se han interesado en desarrollar vacunas de cáncer basadas en DC a pesar del gran valor terapéutico potencial de tales productos.
[0013] Además de maduración, el procedimiento de administración tiene un impacto importante en los resultados. La vía de administración debe permitir a las DCs alcanzar los nódulos linfáticos, de tal modo que puedan inducir diferenciación de células T. Anteriormente se han estudiado diferentes procedimientos, que incluyen inyección intravenosa, intradérmica y intranodal. (Anguille et al., Pharmacol. Rev. 67:731-753, 2015). La inyección intratumoral (IT) de DCs es una forma específica de inmunoterapia basada en DC. Tras la inyección, las DCs naive absorben y procesan antígeno(s) in vivo de, por ejemplo, células tumorales apoptóticas o que están muriendo (necróticas) y ambiente tumoral, y presentan el(los) antígeno(s) a células T después de la migración a los nódulos linfáticos. Efectivamente, se descubrió que la eficacia de tales tratamientos en modelos de animales tiene correlación con el grado de apoptosis en el tumor (Candido et al., Cancer Res. 61:228-236, 2001), lo que sugiere que este enfoque es completamente compatible con los tumores que se tratan con agentes quimioterapéuticos o radiación antes de la inyección de DCs. A parte de eso, varios grupos han demostrado que tal terapia de combinación es parcialmente eficaz frente a tumores establecidos (Nikitina et al., Int. J. Cancer 94:825-833, 2001; Tanaka et al., Int. J. Cancer 101:265-269, 2002; Tong et al., Cancer Res. 61:7530-7535, 2001).
[0014] Dado que las células tumorales in vivo son la fuente de antígeno, la inyección intratumoral se priva de la necesidad tanto de la selección como la producción de antígenos tumorales, dado que actualmente se utilizan en la mayoría de enfoques de terapias basadas den in vitro DC. La selección de un antígeno tumoral a menudo se basa en la necesidad de empresas de tener una posición exclusiva y los pocos antígenos tumorales identificados hasta la fecha no han sido aprobados para proporcionar un beneficio clínico importante. Además, el uso de tales antígenos tumorales a menudo da lugar a una composición o vacuna inmunogénica monovalente, que puede perder su eficacia, si las células tumorales se disminuyen la expresión del antígeno utilizado en la inmunización. Además, la necesidad de producir el antígeno tumoral bajo las condiciones necesarias utilizando Buenas Prácticas de Fabricación (BPF) añade costes adicionales a los procedimientos tradicionales de inmunización basados en DC.
[0015] La inyección IT de DCs puede someter a las células dendríticas a un ambiente tumoral inmunosupresor. Los tumores se conocen por producir citocinas que desactivan las DCs o que tienen la habilidad de desviar la respuesta de células T hacia una respuesta inmune de tipo Th2 menos eficaz. Varios grupos han utilizado modificación genética de DCs para intentar a superar estos efectos supresores, especialmente a través de la producción de la citocina Interleucina 12 (IL-12; Nishioka et al., Cancer Res. 59:4035-4041, 1999; Melero et al., Gene Therapy 6:1779-1784, 1999) o la expresión de ligando CD40 (Kikuchi et al., Blood 96:91-99, 2000). Los resultados prometedores descritos por estos grupos demuestran adicionalmente la viabilidad de la inyección IT de DCs como un enfoque terapéutico.
[0016] Triozzi et al. (Cancer 89:2647-2654, 2000) describe la inyección IT de DCs en pacientes con melanoma metastásico o cáncer de mama. Obtuvieron regresión tumoral en 4 pacientes con melanoma y en dos pacientes con carcinoma de mama. Las biopsias de las lesiones con regresión demostraron la infiltración de células T, sugiriendo que la DC activó en efecto una respuesta inmune contra las células tumorales. En general, estos datos demostraron que la inyección IT de DCs era factible en humanos y podría proporcionar beneficio clínico importante. Sin embargo, se ha observado importante regulación a la bja de antígenos MHC de clase II y de la molécula coestimuladora B7-2 (CD86) en DCs inyectadas. Se esperaría que la regulación a la baja de estas moléculas críticas redujera el potencial inmunoestimulante de las DCs.
[0017] Se ha dado a conocer un procedimiento para superar esta regulación a la baja en WO 2004/053072 donde se descubrió que la regulación a la baja puede evitarse a través de maduración parcial de las DCs antes de la administración. En este procedimiento los precursores de células dendríticas (células de la médula ósea después de la lisis de glóbulos rojos o precursores de células dendríticas monocíticas) primero se introdujeron in vitro para diferenciarse en células dendríticas inmaduras y posteriormente, las células dendríticas inmaduras se introdujeron para empezar la maduración utilizando cultivo de las células con un agente de maduración de células dendríticas, tal como BCG y IPNy, lipopolisacárido (LPS), factor de necrosis tumoral a (TNFa), un compuesto de imidazoquinolina, un polirribonucleótido sintético de doble cadena, un agonista de un receptor similar a Toll (TLR), una secuencia de ácidos nucleicos que contiene diseños CpG no metilados conocidos por inducir la maduración de DC, combinaciones de citocinas, tales como, por ejemplo, factor de necrosis tumoral a (TNFa), combinado con interleucina 1p (IL-1p), interleucina 6 (IL-6) y prostaglandina E2 (PGE2), o cualquier combinación de los mismos. Se permitió que las células dendríticas inmaduras continuasen la maduración durante un periodo de tiempo inferior al que se determinó previamente para las células dendríticas inmaduras para madurar completamente. Si se dejase que las células dendríticas madurasen completamente in vitro, las células serían incapaces de absorber y procesar al antígeno para la administración posterior al paciente. Los procedimientos dados a conocer en el presente documento demuestran que se debería permitir a las células dendríticas a madurar durante un periodo de tiempo suficiente para la activación de tal modo que se generen los niveles importantes de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFatal como se establecen en el presente documento antes del aislamiento de las células dendríticas inmaduras parcialmente y la formulación para la administración a un paciente o un individuo que necesita inmunoestimulación.
[0018] De forma inesperada se ha determinado que las células dendríticas activadas que producen determinadas cantidades o cantidades límites de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa tienen un nivel de potencia inmunoterapéutica que tiene correlación con el resultado clínico mejorado, medido por tales características como tiempo de supervivencia aumentado y/o tiempo aumentado de reaparición de cáncer. Como tal, las células dendríticas activadas que producen por encima de las cantidades límites de iL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa proporcionan composiciones mejoradas para su uso en la administración a un sujeto y las composiciones demuestran una habilidad aumentada para producir un resultado clínico positivo. Strioga et al (Critical Reviews in Immunology, 33(6):489-547 (2013)) describe vacunas de cáncer basadas en células dendríticas terapéuticas. Jin et al (Journal of Translational Medicine 2010, 8:4) describe características moleculares de células dendríticas maduras e implicaciones para ensayos de calidad de terapias con células dendríticas.
RESUMEN
[0019] La presente invención se define en las reivindicaciones. Este sumario se proporciona para presentar una selección de conceptos en una forma simplificada que se describen con más detalle a continuación en la Descripción Detallada. Este sumario no pretende identificar las características clave de temática reivindicada ni pretende ser utilizado como una ayuda en la determinación del ámbito del temario reivindicado.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0020] Los aspectos anteriores y muchas de las ventajas auxiliares de esta invención se apreciarán con más facilidad en cuando los mismos se entiendan mejor mediante referencia a la siguiente descripción detallada, cuando se considera en conjunto con los dibujos que la acompañan, en donde:
FIGURAS 1A hasta 1C representan la infiltración de células T después del tratamiento con DC activadas. La tinción inmunoquímica muestra que los linfocitos infiltrantes de tumor, que incluyen células T activadas CD3+, células auxiliares CD4+ y células asesinas CD8+, aumentaron desde la base de referencia en 15 de 27 pacientes con biopsia. Las imágenes representativos son de un tumor de sarcoma de células claras tratado con 6 millones de DCs activadas/ inyección. Se administraron dos inyecciones en el momento de la biopsia. La amplificación es de 20x, y la barra de escala representa 200 pm. La Figura 1B y la Figura 1C representan la producción de citocinas por las células T activadas. Las secciones de tejidos se investigaron para: La Figura 1B IPNy y la Figura 1C muestran la expresión de TNFa utilizando ARNscope (puntos oscuros) y comanchado para la expresión de CD3 (puntos más claros) utilizando inmunohistoquímica. Las flechas negras representan células T activadas de CD3+ que expresan sus citocinas respectivas. Las flechas blancas representan células que producen citocinas de CD3-, probablemente macrófagos. Las imágenes representativas son de un tumor de sarcoma de células claras tratado con 6 millones de DCs activadas/inyección. Se administraron dos inyecciones en el momento de la biopsia. La amplificación es de 20x y la barra de escala representa 100 pm.
Las FIGURAS 2A hasta 2F representan descripciones de DCs activadas. La Figura 2A muestra la correlación entre la producción de IL-8 (ng/106 DCs/día) y supervivencia total. La curva de Kaplan-Meyer de la producción y supervivencia de IL-8. La línea discontinua indica la supervivencia en pacientes inyectados con DCs que producen < 985 ng/106 DCs/día (la concentración media de IL-8); la línea continua representa aquellos inyectados con células que producen > 985 ng/106 DCs/día. La Figura 2B muestra la correlación entre la producción de IL- 12p40 (ng/106 DCs/día) y supervivencia total. La curva de Kaplan-Meyer de la producción y supervivencia de IL- 12p40. La línea discontinua indica la supervivencia en pacientes inyectados con DCs que producen < 330 ng/106 DCs/día (la concentración media de IL-12p40); la línea continua representa aquellos inyectados con células que producen > 330 ng/106 DCs/día. La Figura 2C muestra el número de pacientes con enfermedad estable (EE) durante la semana 8 y la supervivencia. La curva de Kaplan-Meyer de pacientes con EE durante la semana 8 en comparación con aquella de pacientes con enfermedad progresiva (EP) durante la semana 8. La línea discontinua indica la supervivencia en pacientes con EP durante la semana 8; la línea continua representa aquellos pacientes con EE durante la semana 8. La supervivencia general era ligeramente diferente entre los dos grupos (p = 0,04). La Figura 2D muestra la producción de TNFa utilizando DCs activadas y el estado de enfermedad durante la semana 8. El número de pacientes con EE durante la semana 8 se muestra con barras negras, y el número de pacientes con EP se muestra con barras blancas. No existían pacientes con EP durante la semana 8 entre pacientes con niveles de TNFa> 130 ng/106 DCs/día. En un análisis multivariado, la producción de TNFa tiene correlación con la supervivencia (p = 0,016). Para Figura 2A - Figura 2D, n = 39. Las asociaciones entre la supervivencia de pacientes y los niveles de expresión de los marcadores de superficie celular. La Figura 2E mide manchado para MHC-II y la Figura 2F muestra manchado para CD86 (n = 25 en ambas figuras). La Figura 2E la línea continua indica pacientes con células que tienen > 12.000 de intensidad media de fluorescencia (MFI) que se mancha MHC-II; la línea discontinua indica pacientes con células que tienen 6.200-12.000 de MFI; y la línea de puntos representa pacientes con células que tienen < 6.200 de MFI. La Figura 2F la línea continua indica pacientes con células que tienen > 3.400 de intensidad media de fluorescencia (MFI) cuando se manchan para CD86; la línea discontinua indica pacientes con células que tienen 2.000-3.400 de MFI; y la línea de puntos representa pacientes con células que tienen < 2.000 de MFI. Se utilizó el análisis log-rank para la Figura 2A - Figura 2C y la Figura 2E - Figura 2F. Se utilizó el análisis de chi cuadrado para la Figura 2D.
La FIGURA 3 muestra el fenotipo de células dendríticas activadas. Se exponen los histogramas representativos de citometría de flujo de diferentes marcadores de activación de células dendríticas. Los histogramas en gris oscuro son de la población de monocitos recogida durante leucoféresis. Los histogramas en gris claro son de DCs activadas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0021] La presente invención se define en las reivindicaciones. La divulgación describe un procedimiento in vitro para la determinación de la potencia inmunoterapéutica de una composición de células dendríticas activadas, el procedimiento que comprende las etapas de:
(i) preparar células dendríticas activadas; (ii) determinar las cantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa; (iii) comparar la cantidad determinada de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa con una cantidad límite; y (iv) determinar que la composición de células dendríticas activadas es de baja potencia inmunoterapéutica si una o cualquier combinación de, y/o todas de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa se encuentran por debajo del umbral; o que la composición de células dendríticas activadas es de alta potencia inmunoterapéutica si una o cualquier combinación de, y/o todas de IL-6, IL-8, IL-12 y TNFa se encuentran por encima del umbral.
[0022] En la presente divulgación se describe también un procedimiento in vitro para aumentar la potencia inmunoterapéutica de una población de DC activadas, el procedimiento comprende las etapas de: (i) preparación de una población de células dendríticas activadas; (ii) determinación de las cantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa; (iii) comparación de la cantidad determinada de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa con una cantidad límite; (iv) determinación si alguna de una o cualquier combinación de, y/o todas de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa se encuentra por debajo del umbral; y (v) adición de una cantidad suficiente de un agente que puede inducir la producción de una o cualquier combinación de, y o todas de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa utilizando DC activadas ara producir la cantidad de IL- 6, IL-8, IL-12 y/o TNFa superior a la cantidad límite de tal modo que se forme una población de DC activadas con una potencia inmunoterapéutica aumentada.
[0023] Asimismo, la divulgación describe un procedimiento in vitro para seleccionar a un paciente que responderá a la administración de células dendríticas activadas determinando la potencia inmunoterapéutica de una composición de células dendríticas activadas derivada del paciente, el procedimiento que comprende las etapas de: (i) preparación de células dendríticas activadas; (ii) determinación de las cantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa; (iii) comparación de la cantidad determinada de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa con una cantidad límite; y (iv) determinación de que la composición de células dendríticas activadas es de baja potencia inmunoterapéutica si una o cualquier combinación de, y/o todas de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa se encuentran por debajo del umbral, o que la composición de células dendríticas activadas es de alta potencia inmunoterapéutica, si una de o cualquier combinación de, y/o todas de IL-6, IL-8, IL-12 y TNFa se encuentran por encima del umbral y selección de aquellos pacientes que se encuentran por encima del umbral como pacientes que responderán.
[0024] Aún más, la divulgación describe un procedimiento in vitro para seleccionar a un paciente que responderá a la administración de células dendríticas activadas determinando la potencia inmunoterapéutica de una composición de células dendríticas activadas derivada del paciente, el procedimiento que comprende las etapas de: (i) preparación de células dendríticas activadas; (ii) determinación de las cantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa; (iii) comparación de la cantidad determinada de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa con una cantidad límite; y (iv) determinación de que la composición de células dendríticas activadas es de baja potencia inmunoterapéutica si una de o cualquier combinación de, y/o todas de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa se encuentran por debajo del umbral, o que la composición de células dendríticas activadas es de alta potencia inmunoterapéutica, si una o cualquier combinación de, y/o todas de IL-6, IL-8, IL -12 y TNFa se encuentran por encima del umbral y selección de aquellos pacientes que se encuentran por debajo del umbral como pacientes que responderán.
[0025] La divulgación describe adicionalmente un procedimiento in vitro para seleccionar agentes de maduración de células dendríticas para producir células dendríticas activadas con potencia inmunoterapéutica aumentada, el procedimiento que comprende las etapas de: (i) preparación de células dendríticas activadas poniendo en contacto células dendríticas inmaduras con un agente de maduración de células dendríticas de prueba; (ii) determinación de las cantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa; (iii) comparación de la cantidad determinada de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa con una cantidad límite; y (iv) determinación de que la composición de células dendríticas activadas es de baja potencia inmunoterapéutica si una o cualquier combinación de, y/o todas de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa se encuentran por debajo del umbral; o que la composición de células dendríticas activadas es de alta potencia inmunoterapéutica si una o cualquier combinación de, y/o todas de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa se encuentran por encima del umbral y selección del agente de maduración de células dendríticas que induce la producción de células dendríticas activadas por encima del umbral. Cuando se determina el agente de maduración de células dendríticas, se puede utilizar para inducir la producción de células dendríticas parcialmente maduras y activadas tal como se describe en el presente documento.
[0026] Típicamente, las células dendríticas activadas producen cantidades límite desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200 ng/1 millón de células/24 horas de IL-6; desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 2000 ng/1 millones de células/24 horas de IL-8; como mínimo desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 70 ng/1 millón de células/24 horas de TNFa; como mínimo desde aproximadamente 75 hasta aproximadamente 100 ng/1 millón de células/24 horas de la subunidad de IL-12 p40; y desde aproximadamente 1 hasta 3 ng/1 millón de células/24 horas de IL-12 p70 biológicamente activa. Las células dendríticas activadas pueden producir también desde aproximadamente 75 hasta aproximadamente 150 ng/1 millón de células/24 horas de IL-6; desde aproximadamente 750 hasta aproximadamente 1500 ng/1 millón de células/24 horas de IL-8; como mínimo desde aproximadamente 100 ng/1 millón de células/24 horas de IL-12 p40; como mínimo desde aproximadamente 1 hasta 3 ng/1 millón de células/24 horas de IL-12 p70; y como mínimo desde aproximadamente 30 hasta 70 ng/1 millón de células/24 horas de TNFa o aproximadamente 100 ng/1 millón de células/24 horas de IL-6, y 1000 ng/1 millón de células/24 horas de IL-8, como mínimo aproximadamente 100 ng/1 millón células/24 horas de IL-12 p40; como mínimo aproximadamente 2 ng/1 millón de células/24 horas de IL-12 p70; y como mínimo aproximadamente 30 ng de TNFa.
[0027] Las células dendríticas activadas utilizadas pueden prepararse mediante las siguientes etapas: (i) aislamiento de una población de células que comprende PBMCs humanos de sangre periférica; (ii) enriquecimiento de la población celular que comprende PBMCs humanos para precursores de células dendríticas monocíticas humanas; (iii) cultivo de la población celular enriquecida con los precursores de células dendríticas monocíticas humanas con un medio de cultivo de tejidos suplementado con una cantidad eficaz de un agente de diferenciación de células dendríticas durante un periodo de tiempo suficiente para diferenciar los precursores de células dendríticas monocíticas humanas en células dendríticas humanas inmaduras; (iv) cultivo de la población celular enriquecida con células dendríticas humanas inmaduras con una cantidad eficaz de un agente de maduración de células dendríticas para activar las células dendríticas humanas inmaduras; y (v) aislamiento y lavado de las células dendríticas activadas.
[0028] Las células dendríticas activadas pueden prepararse mediante las siguientes etapas: (i) aislamiento de una población celular que comprende precursores de células dendríticas monocíticas humanas; (ii) cultivo de la población celular enriquecida con precursores de células dendríticas monocíticas humanas con un medio de cultivo de tejidos suplementado con una cantidad eficaz de un agente de diferenciación de células dendríticas durante un periodo de tiempo suficiente para diferenciar los precursores de células dendríticas monocíticas humanas en células dendríticas humanas inmaduras; (iii) cultivo de la población celular enriquecida con células dendríticas humanas inmaduras con una cantidad eficaz de un agente de maduración de células dendríticas para activar las células dendríticas humanas inmaduras; y (iv) aislamiento y lavado de las células dendríticas humanas activadas. El agente de diferenciación de células dendríticas puede ser GM-CSF sin ninguna otra citocina, o GM-CSF en combinación con IL-4, IL-7, IL-13 o IL-15.
[0029] Se puede obtener los precursores de células dendríticas monocíticas de piel, bazo, médula ósea, timo, nódulos linfáticos, sangre de cordón umbilical o sangre periférica. En determinadas realizaciones, las células precursoras de células dendríticas monocíticas son precursores de células dendríticas monocíticas no activadas. Además, los precursores de células dendríticas monocíticas pueden obtenerse del sujeto particular a tratar, o si el individuo no posee un número suficiente de precursores de células dendríticas monocíticas reactivas, los precursores de células dendríticas monocíticas pueden obtenerse de un sujeto particular sano emparejado con HLA con el sujeto particular a tratar.
[0030] El agente de maduración de células dendríticas útil en los procedimientos para la producción de células dendríticas parcialmente maduras puede ser Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) desactivado, BCG en combinación con interferón y (IPNy), lipopolisacárido (LPS), factor de necrosis tumoral a (TNFa), un compuesto de imidazoquinolina, un polirribonucleótido sintético de doble cadena, un agonista de un receptor similar a Toll (TLR), una secuencia de ácidos nucleicos que contiene diseños CpG no metilados para inducir la maduración de células dendríticas o cualquier combinación de los mismos. El BCG desactivado puede comprender BCG completo, constituyentes de pared celular de BCG, lipoarabidomananos derivados de BCG o componentes de BCG y el BCG puede convertirse en BCG desactivado utilizando desactivación por calor, tratamiento con formalina o una combinación de los mismos. Típicamente, la cantidad eficaz de BCG es desde aproximadamente 105 hasta 107 ufc por mililitro de medio de cultivo tisular y la cantidad eficaz de IFNy es desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 1.000 Unidades por mililitro de medio de cultivo tisular. Además, el compuesto de imidazoquinolina puede ser un compuesto de imidazoquinolina-4-amina y típicamente, es 4-amino-2-etoximetil-a,a-dimetil-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-1-5 etanol o 1-(2-metilpropil)-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-4-amina, o un derivado de los mismos. Típicamente, el polinucleótido sintético de doble cadena es poli[I]:poli[C(12)U].
[0031] Las células dendríticas son una población variada de células presentadoras de antígeno que se encuentra en una variedad de tejidos linfáticos y no linfáticos. (Véanse, Liu, Cell 106:259-262, 2001; Steinman, Ann. Rev. Immunol.
9:271-296, 1991). Las células dendríticas incluyen células dendríticas linfáticas del bazo, células de Langerhans de la epidermis y células encubiertas en la circulación sanguínea. Comúnmente, las células dendríticas se clasifican como un grupo basado en su morfología, altos niveles de expresión de MHC de clase II en superficie y ausencia de determinados otros marcadores de superficie que se expresan en células T, células B, monocitos y células asesinas naturales. En particular, las células dendríticas derivadas de monocitos (también denominadas células dendríticas monocíticas) normalmente expresan CD11c, CD80, CD86 y son HLA-DR+, pero son CD14'.
[0032] En cambio, los precursores de células dendríticas monocíticas (típicamente monocitos) normalmente son CD14+. Los precursores de células dendríticas monocíticas pueden obtenerse de cualquier tejido en el que residen, particularmente tejidos linfáticos, tales como el bazo, médula ósea, nódulos linfáticos y timo. Los precursores de células dendríticas monocíticas pueden aislarse también del sistema circulatorio.
[0033] La sangre periférica es una fuente fácilmente accesible de precursores de células dendríticas monocíticas. La sangre de cordón umbilical es otra una fuente de precursores de células dendríticas monocíticas. Los precursores de células dendríticas monocíticas pueden aislarse de una variedad de organismos en los que se puede provocar una respuesta inmune. Tales organismos incluyen animales, por ejemplo, que incluyen humanos y animales no humanos, tales como primates, mamíferos (que incluyen perros, gatos, ratones y ratas), pájaros (que incluyen gallinas), así como también especies transgénicas de los mismos.
[0034] Los precursores de células dendríticas monocíticas y/o células dendríticas inmaduras pueden aislarse de un sujeto sano o de un sujeto que necesita inmunoestimulación, tal como, por ejemplo, un paciente con cáncer u otro sujeto del cual la inmunoestimulación celular puede ser beneficiosa o deseada (es decir, un sujeto que padece una infección bacteriana o vírica o una condición hiperplásica y similares). Los precursores de células dendríticas y/o células dendríticas inmaduras pueden obtenerse también de un individuo sano emparejado con HLA que necesita inmunoestimulación. Cuando los precursores de células dendríticas y/o células dendríticas inmaduras aislados de un sujeto no forman una composición de células dendríticas activadas que genera factores de potencia inmunoestimulante de un nivel apropiado, se puede utilizar las células precursoras dendríticas o células dendríticas inmaduras de un donante normal emparejado con HLA.
Precursores de Células Dendríticas y Células Dendríticas Inmaduras
[0035] Se conocen en la técnica los procedimientos para aislar poblaciones celulares enriquecidas con precursores de células dendríticas, tales como precursores de células dendríticas no activadas, y células dendríticas inmaduras de diferentes fuentes, que incluyen sangre y médula ósea. Por ejemplo, los precursores de células dendríticas y las células dendríticas inmaduras pueden aislarse recogiendo sangre heparinizada, mediante aféresis o leucoféresis, utilizando preparación de capas leucocitarias, rosetones, centrifugación, centrifugación mediante un gradiente de densidades (por ejemplo, utilizando Ficoll® (tal como FICOLL-PAQUE®), PERCOLL® (partículas de sílice coloidal (15-30 nm de diámetro) recubiertas con polivinilpirrolidona (PVP) no dializable), sacarosa y similares), lisis diferencial de células, filtración y similares. Se puede preparar una población leucocitaria, tal como, por ejemplo, recogiendo sangre de un sujeto, desfibrinando para eliminar las plaquetas y lisando los glóbulos rojos. Los precursores de células dendríticas y células dendríticas inmaduras pueden enriquecerse opcionalmente con precursores de células dendríticas monocíticas utilizando, por ejemplo, centrifugación con un gradiente PERCOLL®, panoramización de anticuerpos y similares.
[0036] Los precursores de células dendríticas y células dendríticas inmaduras pueden prepararse opcionalmente en un sistema cerrado, aséptico. Tal como se utiliza en el presente documento, los términos «sistema cerrado, aséptico» o «sistema cerrado» hacen referencia a un sistema en el que la exposición a aire no estéril, ambiental o circulatorio u otras condiciones no estériles se minimiza o se elimina. Los sistemas cerrados para aislar a los precursores de células dendríticas y células dendríticas inmaduras excluyen de manera general centrifugación mediante un gradiente de densidades en tubos con parte superior abierta, transferencia al aire libre de células, cultivo de células en placas de cultivo tisular o matraces no sellados y similares. Los sistemas cerrados permiten transferencia aséptica de los precursores de células dendríticas y células dendríticas inmaduras desde un recipiente de recogida inicial a un recipiente con cultivo tisular cerrado sin exposición al aire no estéril.
[0037] Otro procedimiento indicado para aislar a los precursores de células dendríticas es utilizar un sustrato de plástico tratado comercialmente (por ejemplo, perlas o perlas magnéticas) para eliminar de manera selectiva monocitos adherentes y otros «precursores de células no dendríticas». (Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. Números 5.994.126 y 5.851.756). Los monocitos adherentes y los precursores de células no dendríticas se descartan mientras que las células no adherentes se retienen para el cultivo y la maduración ex vivo. En otro procedimiento, las células de aféresis se cultivaron en bolsas de cultivo de plástico a los que se añadieron perlas con microportadores de plástico, es decir, poliestireno o estireno, para aumentar el área de superficie de la bolsa.
[0038] Las células se cultivaron durante un periodo de tiempo suficiente para que determinadas células se adhiriesen a las perlas y las células no adherentes se eliminaron con lavado de la bolsa. (Maffei, et al., Transfusion 40:1419-1420, 2000; WO 02/44338). En otras determinadas realizaciones, los precursores de células dendríticas monocíticas se aíslan utilizando adherencia a un sustrato de unión a monocito, tal como se describe en WO 03/010292.
[0039] Por ejemplo, una población de leucocitos (por ejemplo, asilada mediante leucoféresis) se puede poner en contacto con un precursor de células dendríticas monocíticas que se adhiere a un sustrato. Cuando la población de leucocitos se pone en contacto con el sustrato, los precursores de células dendríticas monocíticas en la población leucocitaria se adhieren de manera preferente al sustrato. Otros leucocitos (que incluyen otros precursores potenciales de células dendríticas) muestran afinidad de unión reducida al sustrato, permitiendo, de este modo, a los precursores de células dendríticas enriquecerse de manera preferida sobre la superficie del sustrato.
[0040] Los sustratos adecuados incluyen, por ejemplo, aquellos que tienen un área de superficie grande en relación con volumen. El sustrato puede ser, por ejemplo, un sustrato de partículas o fibroso. Los sustratos de partículas adecuados incluyen, por ejemplo, partículas de vidrio, partículas de plástico, partículas de plástico recubiertas con vidrio, partículas de poliestireno recubiertas con vidrio y otras perlas adecuadas para la absorción de proteínas. Los sustratos fibrosos adecuados para su uso en la presente invención incluyen tubos microcapilares y membranas con microvellosidades y similares. Es sustrato de partículas o fibroso típicamente permite eluir los precursores de células dendríticas monocíticas sin reducir de manera sustancial la viabilidad de las células adheridas. Un sustrato de partículas o fibroso puede ser sustancialmente no poroso para facilitar la elución de precursores de células dendríticas monocíticas o células dendríticas del sustrato. Un sustrato «sustancialmente no poroso» es un sustrato en el que como mínimo una mayoría de poros presentes en el sustrato es menor que las células para minimizar el atrapamiento de las células en el sustrato.
[0041] La adherencia de los precursores de células dendríticas monocíticas al sustrato opcionalmente puede potenciarse utilizando la adición de un medio de unión. El medio de unión adecuado incluye, por ejemplo, medio de cultivo de precursores de células dendríticas monocíticas (por ejemplo, AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, XVIVO 15® y similares) suplementado, individualmente o en cualquier combinación, con, por ejemplo, citocinas (por ejemplo, Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos/Macrófagos (GM-CSF), o GM-CSF en combinación con Interleucina 4 (IL-4), Interleucina 15 (IL-15) o Interleucina 13 (IL-13)), plasma sanguíneo, suero (por ejemplo, suero humano, tal como sueros autólogos o alogénicos), proteínas purificadas, tales como albumina de suero, cationes divalentes (por ejemplo iones de calcio y/o magnesio) y otros moléculas que ayudan con la adherencia específica de precursores de células dendríticas monocíticas al sustrato o que previenen la adherencia de precursores de células dendríticas no monocíticas al sustrato. En determinadas realizaciones, el plasma o suero sanguíneo puede desactivarse con calor. El plasma desactivado con calor puede ser autólogo o heterólogo para los leucocitos.
[0042] Después de la adherencia de los precursores de células dendríticas monocíticas al sustrato, los leucocitos no adherentes se separan de los complejos de precursores/sustratos de células dendríticas monocíticas. Se puede utilizar cualquier medio adecuado para separar las células no adherentes de los complejos. Por ejemplo, se puede dejar a reposar la mezcla de los leucocitos no adherentes y los complejos, y dejar a decantar o drenar a los leucocitos y medio no adherentes. Alternativamente, se puede centrifugar la mezcla y se puede decantar o drenar el sobrenadante que contiene los leucocitos no adherentes de los complejos comprimidos.
[0043] En otro procedimiento, se puede aislar a los precursores de células dendríticas monocíticas de una población de células enriquecida con leucocitos preparados utilizando un dispositivo de filtración de flujo tangencial, tal como se describe en la Publicación de la Solicitud de la Patente Internacional Número WO 2004/000444, presentada 19 de junio de 2003, actualmente la Patente de EE. UU. Número 7.695.627.
[0044] Un dispositivo de filtración de flujo tangencial útil para el aislamiento de una población de células enriquecida con precursores de células dendríticas monocíticas puede comprender una unidad eliminadora que contiene una cámara de flujo transversal, una cámara de filtrado y un filtro colocados entre ellos. El filtro se encuentra en comunicación fluida por un lado, la superficie retentada, con la cámara de flujo transversal, y por otro lado, la superficie de filtrado con la cámara de filtrado. La cámara de flujo transversal tiene una entrada adaptada para introducir una muestra de constituyentes sanguíneos que comprenden leucocitos en la cámara de flujo transversal y en paralelo con la superficie rentada del filtro. Se proporciona también una salida en la cámara del flujo transversal colocada en el centro en una parte de la cámara opuesta a la superficie retentada del filtro. El filtro adecuado para su uso en el dispositivo de filtración de flujo tangencial tiene típicamente un tamaño medio de poros que oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 micrones. El filtro puede tener un tamaño medio de poro desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 7 micrones. También se puede incluir un medio para proporcionar una velocidad predeterminada de entrada de la muestra en la entrada de la cámara de flujo transversal y un medio para controlar una velocidad de filtración de filtrado a través del filtro y en la cámara de filtrado. El medio de control de velocidad de filtración limita la velocidad de filtración hasta inferior a la velocidad de filtración sin oposición para el filtro. La muestra que comprende constituyentes sanguíneos puede proporcionarse por un dispositivo de fuente tal como un dispositivo de leucoféresis o un recipiente que contiene una muestra recogida de un dispositivo de leucoféresis.
[0045] Los precursores de células dendríticas monocíticas y poblaciones de células enriquecidas con precursores pueden cultivarse ex vivo o in vitro para diferenciación y maduración y/o expansión parcial. Tal como se utiliza en el presente documento, las células dendríticas inmaduras aisladas, precursores de células dendríticas y otras células hacen referencia a células, que, por la acción humana, existen fuera de su ambiente nativo y, por lo tanto, no son un producto de la naturaleza. Las células aisladas pueden existir en forma purificas, en forma semi purificada o en un ambiente no nativo. En resumen, la diferenciación de células dendríticas in vitro y/o ex vivo típicamente implica cultivo de precursores de células dendríticas monocíticas o poblaciones de células que contienen precursores de células dendríticas, en presencia de uno o más agentes de diferenciación de células dendríticas. Los agentes de diferenciación adecuados pueden incluir, por ejemplo, factores de crecimiento celular (por ejemplo, citocinas tales como (GM-CSF), o una combinación de GM-CSF y Interleucina 4 (lL-4), Interleucina 13 (lL-13), Interleucina 15 (IL-15), o Interleucina 7 (IL-7)). Los precursores de células dendríticas monocíticas pueden diferenciarse de células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos.
[0046] Los precursores de células dendríticas pueden cultivarse y diferenciarse en condiciones adecuadas de cultivo in vitro. El medio adecuado de cultivo tisular de células dendríticas incluye, pero no se limita a, AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15®, y similares. El medio de cultivo tisular puede suplementarse con suero, plasma, aminoácidos, vitaminas, citocinas, tales como GM-CSF y/o IL-4, IL-7, IL-13, IL-15, cationes divalentes y similares, para fomentar la diferenciación de las células. Se puede cultivar a los precursores de células dendríticas en un medio libre de suero. Las condiciones de cultivo pueden excluir de manera opcional cualquier producto derivado de animal. Una combinación típica de citocinas utilizada con un medio de cultivo de células dendríticas comprende aproximadamente 500 unidades/ml de cada uno de GM-CSF y IL-4, IL-7, IL-15 o IL-13. En una realización típica en la que se utilizan los precursores de células dendríticas no activadas se puede suplementar a un medio típico de cultivo tisular de células dendríticas con GM-CSF sin cualquier otra citocina. Cuando GM- CSF se utiliza solo, el medio de cultivo tisular también se suplementa típicamente con una concentración alta de proteína humana o animal para prevenir la adhesión del precursor de células dendríticas monocíticas no activadas al sustrato de cultivo tisular activando de este modo la maduración del precursor de células dendríticas. Típicamente se añade la proteína humana o animal a una concentración superior a 1% y típicamente se utiliza a una concentración de 10% o inferior. La proteína humana o animal puede ser una albumina, tal como albumina de suero humana, suero, plasma, gelatina un poliaminoácido y similares.
[0047] Los precursores de células dendríticas, cuando se diferencian para formar células dendríticas inmaduras, son similares fenotípicamente a células de Langerhan. Típicamente las células dendríticas inmaduras son CD14-y CD11c+, expresan bajos niveles de CD86 y CD83, y son capaces de capturar a antígenos solubles a través de endocitosis especializada.
[0048] Los agentes de maduración de células dendríticas pueden incluir, por ejemplo, pero no se limitan a, BCG, LPS, TNFa, una combinación de TNFa, interleucina (IL)-1p, IL-6, y prostaglandina E2 (PGE2), un compuesto de imidazoquinolina, por ejemplo, un compuesto de imidazoquinolina- 4-amina, tal como 4-amino-2-etoximetil-pD,Dadimetil-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-1-etanol (denominado R848) o 1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina, y sus derivados (Véanse, por ejemplo, WO2000/47719
[0049] ), un polinucleótido sintético de cadena doble, por ejemplo, poli[I]:poli[C(12)U], y similares, agonistas de un receptor similar a Toll (TLR), tal como TLR-3, TLR-4, TLR-7 y/o t LR-9, una secuencia de ácidos nucleicos que contiene diseños CpG no metilados conocidos para inducir la maduración de DC y similares o cualquier combinación de los mismos. Adicionalmente, interferón y puede combinarse con uno o más de los agentes de maduración de células dendríticas mencionados anteriormente para influenciar la maduración de las células dendríticas inmaduras con relación a un fenotipo que puede inducir una respuesta de tipo Th1. Las cantidades eficaces de BCG típicamente oscilan entre un equivalente hasta aproximadamente 105 hasta 107 ufc por mililitro de medio de cultivo tisular antes de desactivación. Las cantidades eficaces de IFNy típicamente oscilan entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1000 U por mililitro de medio de cultivo tisular.
[0050] El Bacilo de Calmette-Guerin (BCG) es una cepa avirulenta de Mycobacterium bovis. Tal como se utiliza en el presente documento, BCG hace referencia a BCG completo así como a constituyentes de pared celular, lipoarabidomananos derivados de BCG y otros componentes de BCG. Opcionalmente BCG se desactiva, tal como BCG desactivado con calor, BCG tratado con formalina o utilizando combinaciones de calor y otros procedimientos de desactivación y similares. Se utiliza una cantidad eficaz de un compuesto de imidazoquinolina, por ejemplo, un compuesto de imidazoquinolina-4-amina, tal como 4-amino-2-etoximetil-a,a-dimetil-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-1-etanol (denominado R848) puede ser desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 pg/ml de medio de cultivo, más típicamente desde 5 hasta aproximadamente 10 pg/ml de medio de cultivo. El compuesto de imidazoquinolina puede utilizarse por sí solo o puede combinarse con, por ejemplo, BCG y/o IPNy), o un agonista de TLR adicional.
[0051] Las DCs inmaduras típicamente se ponen en contacto con cantidades eficaces del agente de maduración de células dendríticas, tal como BCG y IPNy, durante un periodo de tiempo suficiente para inducir maduración y para activar, pero no madurar completamente las células dendríticas. Típicamente se necesita un periodo de incubación de como mínimo 24 horas para la maduración completa, cuando se utilizan BCG y IPNy para madurar células dendríticas y dependiendo del agente de maduración de células dendríticas utilizado, se necesita un periodo típico de incubación de aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas para la maduración completa.
[0052] Dependiendo del agente de maduración de células dendríticas utilizado el periodo de tiempo puede ser desde aproximadamente 5 horas hasta aproximadamente 19 horas o superior. Más típicamente, cuando se utilizan BCG y IPNy el periodo de tiempo para la maduración parcial y la activación óptima de las células dendríticas puede ser desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 19 horas o superior. Las células dendríticas inmaduras pueden cultivarse y madurarse y activarse parcialmente en condiciones adecuadas de cultivo de maduración. El medio adecuado de cultivo tisular incluye, pero no se limita a, AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15®, y similares. El medio de cultivo tisular puede suplementarse con aminoácidos; vitaminas; citocinas, tales como GM-CSF por sí solo (Véanse, por ejemplo, la Patente de EE. UU. Número 8.389.278, o GM-CSF en combinación con IL-4, IL-7, IL-13 o IL-15; cationes divalentes; y similares, para facilitar la inducción de maduración de las células. Una citocina típica puede ser GM-CSF por sí solo con una concentración alta de proteína humana o animal o GM-CSF cuando se utiliza a una concentración de aproximadamente 500 unidades/ml hasta aproximadamente 1000 unidades/ml de GM-CSF y se utilizan 100 ng/ml de IL-4, IL-13 o IL-15.
[0053] La maduración parcial y la activación de células dendríticas inmaduras puede controlarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica para las células dendríticas. Los marcadores de superficie celular pueden detectarse en los ensayos habituales en la técnica, tales como citometría de flujo, inmunohistoquímica y similares. Las células pueden controlarse para la producción de citocinas (por ejemplo, utilizando ELISA, otro inmunoensayo o mediante el uso de una variedad de oligonucleótidos). En DCs cultivadas y parcialmente maduradas y activadas de manera óptima de acuerdo con la presente invención en presencia de un agente de maduración de células dendríticas, tal como, por ejemplo, pero no limitado a, se puede medir BCG y IPNy, un nivel aumentado de JAK2 fosforilado (cinasa activada por jano 2) en comparación con células dendríticas inmaduras para indicar el inicio de maduración utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. La inducción de la expresión de marcadores de superficie celular y citocinas, así como la fosforilación de moléculas de señalización, por ejemplo, jak2, también se conoce como un indicador de que las células dendríticas se condicionan para la absorción de antígeno in vivo y la inducción de una respuesta inmune cuando las células dendríticas se hayan administrado a un individuo.
[0054] Las células dendríticas inmaduras se someten a maduración solamente durante un periodo de tiempo necesario para iniciar la maduración de células dendríticas inmaduras y para madurar y activar parcialmente las células dendríticas. Típicamente, se ha descubierto que un periodo de tiempo de aproximadamente 5, o 8, o 10 hasta 19 horas de incubación con una cantidad eficaz de BCG y una cantidad eficaz de IPNy madura y activa parcialmente las células dendríticas para su uso como una combinación cuando se combinan con un portador farmacéuticamente aceptable para su administración a un sujeto. Las DCs completamente maduras pierden la habilidad de absorber un antígeno y muestran la sobrerregulación de moléculas coestimuladoras de superficie celular y diferentes citocinas. Específicamente, las DCs maduras expresan altos niveles de antígenos MHC de clase I y II en comparación con células dendríticas inmaduras, y las células dendríticas maduras se identifican generalmente como CD80+, CD83+, CD86+ y CD14-. Mayor expresión de MHC lleva a un aumento en la densidad de antígeno sobre la superficie de DC mientras que la sobrerregulación de moléculas coestimuladoras CD80 y CD86 fortalece la señal de activación de células T a través de los equivalentes de las moléculas coestimuladoras, tales como CD28 en las células T. Las células dendríticas maduras y activadas parcialmente tal como se utilizan en la presente divulgación comprenden aquellas células dendríticas que cuando se exponen a un agente de maduración de células dendríticas muestran una sobrerregulación en la expresión de una molécula coestimuladora sobre la superficie celular en comparación con células dendríticas inmaduras. Estas moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, CD80, CD86 y/o CD54. Las células pueden expresar o no CD83, pero las células mantienen la habilidad de absorber y procesar al antígeno de manera eficaz. Además, las células dendríticas maduras parcialmente y de manera óptima pueden producir uno o cualquier combinación de, y/o todos de TNF-a, IL-6, IL-8, IL-10 y/o IL-12 los que no se producen de manera típica en cantidades importantes por las células dendríticas inmaduras.
[0055] La invención implica determinar las cantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 p40 y TNF-a de células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras.
[0056] Las células dendríticas activadas que producen determinadas cantidades de uno o cualquier combinación de, y/o todos de IL-6, IL-8, IL- 12 y/o TNFa han sido correlacionados actualmente con resultado clínico mejorado. Un resultado clínico mejorado puede medirse, por ejemplo, utilizando tiempo aumentado de supervivencia y/o tiempo aumentado antes de reaparición de tumor en comparación con individuos no tratados o con individuos tratados con un protocolo estándar de tratamiento aprobado. Se ha descubierto en la presente descripción que las células dendríticas activadas que producen desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200 ng/1 millón de células/24 horas de IL-6, desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 2000 ng/1 millón de células/24 horas de IL-8; como mínimo desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 70 ng/1 millón de células/24 horas de TNFa; y/o como mínimo desde aproximadamente 75 hasta aproximadamente 100 ng/1 millón de células/24 horas de subunidad de IL-12 p40 y desde aproximadamente 1 hasta 3 ng/1 millón de células/24 horas de IL-12 p70 biológicamente activo tiene una potencia inmunológica que tiene correlación con el resultado clínico mejorado. Estas citocinas/quimiocinas pueden oscilar entre aproximadamente 75 y aproximadamente 150 ng/1 millón de células/24 horas y preferiblemente aproximadamente100 ng/1 millón de células/24 horas de IL-6; desde aproximadamente 750 hasta aproximadamente 1500 ng/1 millón de células/24 horas y preferiblemente aproximadamente 1000 ng/1 millón de células/24 horas de IL-8; como mínimo aproximadamente 100 ng/1 millón de células/24 horas de IL-12 p40 y preferiblemente como mínimo aproximadamente 100 ng/1 millón de células/24 horas de IL-12 p70 y producen una potencia inmunológica que tiene correlación con el resultado clínico mejorado. Tal como se divulga previamente un resultado clínico mejorado se caracteriza por un tiempo de supervivencia aumentado significativamente o un tiempo aumentado significativamente de reaparición de tumor o cáncer en comparación con un individuo con el mismo cáncer o tumor el que no es tratado o ha sido tratado utilizando el estándar de tratamiento establecido actualmente.
[0057] Las células dendríticas completamente maduras no se utilizan para la presente invención dado que cuando son completamente maduras, las células no absorben y procesan más de manera eficaz al antígeno. Es más, las células dendríticas inmaduras tal como se utilizan en los procedimientos anteriores no se utilizan, dado que los ambientes inmunosupresivos típicamente se encuentran dentro de un tumor o en el tejido que rodea a un tumor, incluyen concentraciones sustanciales de citocinas conocidas por prevenir el procesamiento de antígeno por las células dendríticas inmaduras. La presente invención utiliza las células dendríticas humanas no completamente maduras activadas. En la presente divulgación, la maduración parcial y la activación óptima de las células dendríticas inmaduras regula a la baja a los receptores de citocinas sobre la superficie de la célula volviéndolos menos sensible o receptivos a cualquier efecto inmunosupresor de citocinas presentes en el espacio intratumoral o tejido circundante y proporciona las células que pueden absorber y procesar de manera eficaz a los antígenos presentes dentro del espacio intratumoral o tejido circundante. Las células dendríticas absorben y procesan cantidades sustanciales de antígenos tumorales de células tumorales apoptóticas y que están muriendo que se encuentran dentro del espacio intratumoral o en el tejido circundante. Cuando las células dendríticas parcialmente maduras y activadas de manera óptima administradas han madurado dentro del espacio intratumoral medidas por, por ejemplo, la expresión del receptor de quimiocinas CCR7, las células dendríticas migran a los nódulos linfáticos donde las células dendríticas que actualmente presentan a antígeno se pondrán en contacto con células T para sobrerregular la respuesta inmune a cualquier antígeno tumoral representado por las células dendríticas.
[0058] Las DCs diferentes de la divulgación pueden conservarse, por ejemplo, utilizando crioconservación como precursores de células dendríticas monocíticas, células dendríticas inmaduras antes de maduración o después de maduración parcial o en combinación con o sin un portador farmacéuticamente aceptable. Los agentes de crioconservación que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, polivinilpirrolidona, polietilenglicol, albumina, dextrano, sacarosa, etilenglicol, i-eritritol, D-ribitol, D-manitol, D-sorbitol, inositol, D-lactosa, cloruro de colina, aminoácidos, metanol, acetamida, monoacetato de glicerol y sales inorgánicas. Una velocidad de enfriamiento lenta controlada puede ser crítica. Diferentes agentes crioprotectores y diferentes tipos de células tienen típicamente diferentes velocidades de enfriamiento óptimo.
[0059] La calor de fase de fusión cuando agua se convierte en hielo típicamente debería ser mínima. El procedimiento de enfriamiento puede llevarse a cabo mediante el uso, por ejemplo, de un dispositivo de enfriamiento programable o un procedimiento de baño en metanol. Los dispositivos de enfriamiento programables permiten la determinación de velocidades de enfriamiento óptimo y facilitan el enfriamiento reproducible estándar. Los congeladores con velocidad controlada programable tales como Cryomed® o Planar® permiten el ajuste del régimen de enfriamiento con la curva de velocidad de enfriamiento deseada.
[0060] Después del enfriamiento completo, las células precursoras monocíticas, DCs inmaduras y/o DCs parcialmente inmaduras o con o sin un portador farmacéuticamente aceptable pueden transferirse rápidamente a un recipiente de almacenamiento criogénico de larga duración. En una realización típica, las muestras puede almacenarse criogénicamente en nitrógeno líquido (-196 °C) o su vapor (-165° C). Los estudios y los procedimientos para la manipulación, crioconservación y almacenamiento a largo plazo de células madre hematopoyéticas, particularmente, de médula ósea o sangre periférica, se aplican en gran parte a las células de la invención. Tal análisis se puede encontrar, por ejemplo, en las siguientes referencias. : Taylor et al., Cryobiology 27:269-78 (1990); Gorin, Clinics in Haematology 15:19-48 (1986); Bone-Marrow Conservation, Culture and Transplantation, Proceedings of a Panel, Moscú, Jul. 2226, 1968, International Atomic Energy Agency, Vienna, páginas 107-186.
[0061] Las células congeladas preferiblemente se descongelan rápidamente (por ejemplo, en un baño de agua mantenido a 37 °C - 41 °C) y se enfrían inmediatamente después de la descongelación. Puede ser conveniente tratar las células para prevenir la aglutinación celular después de la descongelación. Para prevenir la aglutinación, se puede utilizar varios procedimientos, que incluyen, pero no se limitan a la adición antes y/o después del enfriamiento de DNasa (Spitzer et al., Cancer 45: 3075-85 (1980)), dextrano y citrato con bajo peso molecular, hidroxietil-almidón (Stiff et al., Cryobiology 20: 17-24 (1983)), y similares. El agente crioprotector, si es tóxico en humanos, debería eliminarse antes del uso terapéutico de las DCs parcialmente maduras descongeladas. Una forma en la que se elimina el agente crioprotector es mediante disolución hasta una concentración insignificante. Cuando se han descongelado y se han recuperado los precursores de células dendríticas monocíticas, células dendríticas inmaduras y/o DCs parcialmente maduras, pueden utilizarse en procedimientos adicionales o para continuar con la producción de células dendríticas activadas parcialmente maduras o para producir un producto farmacéuticamente formulado. Las células dendríticas parcialmente maduras y óptimamente activadas formuladas pueden administrarse tal como se describe en el presente documento en lo que respecta a DCs parcialmente maduras y óptimamente activadas no congeladas.
Determinación de Potencia Inmunoterapéutica de las Células Dendríticas Parcialmente Maduras y Activadas
[0062] La cantidad de diferentes citocinas y quimiocinas inflamatorias puede medirse utilizando los procedimientos bien conocidos en la técnica. En la presente divulgación las cantidades de uno o mas o una combinación de y/o todos de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa producido por las células dendríticas activadas pueden asociarse con el resultado clínico mejorado. De nuevo, la invención implica determinar las cantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 p40 y TNF-a de células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras. Un resultado clínico mejorado puede medirse, por ejemplo, utilizando un periodo de tiempo aumentado de supervivencia significativamente y/o un periodo de tiempo aumentado significativamente antes de reaparición de tumor en comparación con individuos no tratados o con individuos tratados con un protocolo estándar de tratamiento aprobado. Se descubrió de forma inesperada que las células dendríticas activadas que generan desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200 ng/1 millón de células/24 horas de IL-6, desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 2000 ng/1 millón de células/24 horas de IL-8; como mínimo desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 70 ng/1 millón de células/24 horas de TNFa; y/o como mínimo desde aproximadamente 75 hasta aproximadamente 100 ng/1 millón de células/24 horas de la subunidad de IL-12 p40 y desde aproximadamente 1 hasta 3 ng/1 millón de células/24 horas de IL-12 p70 biológicamente activa que tiene una potencia inmunológica que tiene correlación con el resultado clínico mejorado. Estas citocinas/quimiocinas pueden oscilar entre aproximadamente 75 y aproximadamente 150 ng/1 millón de células/24 horas y preferiblemente aproximadamente 100 ng/1 millón de células/24 horas de IL-6; desde aproximadamente 750 hasta aproximadamente 1500 ng/1 millón de células/24 horas y preferiblemente aproximadamente 1000 ng/1 millón de células/24 horas de IL-8; como mínimo aproximadamente 100 ng/1 millón de células/24 horas de IL-12 p40 y preferiblemente como mínimo aproximadamente 100 ng/1 millón de células/24 horas de IL-12 p70.
[0063] Estas células dendríticas activadas pueden utilizarse para una prueba de potencia inmunoterapéutica para determinar si una composición de células dendríticas activadas produciría probablemente un resultado clínico mejorado cuando se administra de nuevo al individuo. Adicionalmente, en el presente documento se describe que la prueba de potencia inmunoterapéutica puede utilizarse para seleccionar a los pacientes que son más propensos a desarrollar una respuesta inmune importante, rechazar muchas de las composiciones de células dendríticas, que no se esperaría que produjeran una respuesta inmune importante cuando se administran de nueve al individuo; o puede utilizarse para cribar a los agentes de activación de células dendríticas que pueden generar los niveles deseados de uno o cualquier combinación de, y/o todos de f IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa.
[0064] En el presente documento se describe que cuando la sangre periférica aislada de un individuo no produce células dendríticas activadas capaces de generar los niveles deseados de uno o cualquier combinación de, y/o todos de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa, que el paciente pueda necesitar para el tratamiento con las células dendríticas activadas aisladas de un donante normal emparejado con HLA.
[0065] Los procedimientos in vitro descritos en esta divulgación para la determinación de la potencia inmunoterapéutica de una composición de células dendríticas activadas puede comprender las etapas de i) preparación de células dendríticas activadas utilizando cualquier de los procedimientos expuestos anteriormente; ii) determinación de las cantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa utilizando cualquier procedimiento bien conocido en la técnica; (iii) comparación de la cantidad determinada de uno o cualquier combinación de, y/o todos de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa con una cantidad límite; (iv) determinación de que la composición de células dendríticas activadas es de baja potencia inmunoterapéutica si uno o cualquier combinación de, y/o todos de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa se encuentran por debajo del umbral; o que la composición de células dendríticas activadas es de alta potencia inmunoterapéutica si uno o cualquier combinación de, y/o todos de IL-6, IL-8, IL-12 y TNFa se encuentran por encima del umbral. Las cantidades límites para IL-6, IL-8, IL-12 y TNFa se exponen anteriormente. Si las células dendríticas activadas demuestran alta potencia inmunoterapéutica, las células dendríticas activadas pueden formularse para su administración con un portador farmacéuticamente aceptable.
[0066] En la presente divulgación se describe también un procedimiento in vitro para aumentar la potencia inmunoterapéutica de una población de DC activadas. El procedimiento comprende las etapas de:
i) preparación de una población de células dendríticas activadas; ii) determinación de las cantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa utilizando un procedimiento bien conocido en la técnica; iii) comparación de la cantidad determinada de uno o de cualquier combinación de, y/o de todos de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa con una cantidad límite; iv) determinación si uno o cualquier combinación de, y/o todos de IL-6, IL-8, IL-12 y o TNFa se encuentran por debajo del umbral; v) adición de una cantidad suficiente de un agente que puede inducir la producción de uno o cualquier combinación de, y o todos de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa utilizando las DC activadas para producir la cantidad de IL-6, IL-8, IL-12 y/o TNFa superior a la cantidad límite de tal modo que se forme una población de DC activadas con una potencia inmunoterapéutica aumentada.
Administración In Vivo de Células Dendríticas Parcialmente Maduras
[0067] En el presente documento se describen las composiciones de células dendríticas parcialmente maduras y activadas o una población de células enriquecidas y que contiene tales células para su uso en los procedimientos de tratamiento de un sujeto que tiene, por ejemplo, un cáncer o un tumor. Dichos procedimientos descritos en el presente documento pueden llevarse a cabo obteniendo precursores de células dendríticas o células dendríticas inmaduras, diferenciando y madurando parcialmente aquellas células en presencia de un agente de maduración de células dendríticas, tal como BCG e IPNy, o cualquier otro agente de maduración de células dendríticas, tal como aquellos enumerados anteriormente. Se puede proporcionar las células dendríticas parcialmente maduras y activadas a un médico en un estado criogénico. Antes de la administración, las células se descongelan rápidamente, se enfrían y se formulan con un portador, excipiente, tampón y/o diluyente fisiológicamente aceptable utilizando procedimientos y composiciones bien conocidos por el experto. Se puede proporcionar las células dendríticas parcialmente maduras y activadas a un médico en un estado criogénico. Típicamente, desde aproximadamente 102 hasta aproximadamente 1010 de células se suspenden en un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato. Las células se inyectan en el tumor directamente o en una región cercana a, adyacente a o en un vaso sanguíneo circulatorio o conducto linfático que está en contacto con el tumor o la capa del tumor para asegurar que las células tienen acceso al antígeno de cáncer o tumor.
[0068] Por ejemplo, pero no como una limitación, las células pueden administrarse directamente en un tumor, en la capa del tumor después de la eliminación quirúrgica o extirpación del tumor, espacio peritumoral, en un nódulo linfático drenado que se encuentra en contacto directo con el tumor, en un vaso sanguíneo o conducto linfático que lleva a, o nutre un tumor u órgano afectado por el tumor, por ejemplo, la vena porta o una vena o arteria pulmonar y similares. La administración de las células dendríticas parcialmente y óptimamente maduras descritas en el presente documento puede ser o simultánea o posterior a otros tratamientos para el tumor, tal como quimioterapia o terapia con radiación. Es más, las células dendríticas parcialmente maduras descritas en el presente documento puede administrarse conjuntamente con otro agente, cuyo agente actúa como un adyuvante para la maduración de la célula dendrítica y/o el procesamiento de antígeno dentro del tumor o región cercana o adyacente al tumor. Adicionalmente, las células dendríticas pueden formularse o componerse también como una matriz de liberación lenta para su implantación en un una región o alrededor del tumor o la capa del tumor de tal modo que las células se liberen lentamente en el tumor, o la capa tumoral, para ponerse en contacto con los antígenos tumorales.
[0069] Un tumor tal como se utiliza en la presente divulgación incluye tumores sólidos, tales como, por ejemplo y no como limitación, un sarcoma; un tumor pancreático; un tumor colorrectal; un melanoma; un tumor pulmonar; un tumor de mama; un tumor de ovarios; un tumor de cabeza o cuello; un tumor de estómago; un tumor de próstata; un tumor esofágico; un tumor cervical o vaginal; un tumor cerebral, tal como, un glioblastoma, un astrocitoma, un meningioma o una meduloblastoma; y similares. Los tumores sólidos adicionales también se someten a tratamiento utilizando una composición o un procedimiento descrito en el presente documento.
[0070] Las células dendríticas parcialmente maduras y activadas descritas en el presente documento pueden administrarse utilizando cualquier procedimiento apropiado para la formulación y el modo de administración. Por ejemplo, las células pueden combinarse con un portador farmacéuticamente aceptable y administrarse utilizando una jeringuilla, un catéter, una cánula y similares. Tal como se indica anteriormente, las células pueden formularse en una matriz de liberación lenta. Cuando se administra de este modo, la formulación puede administrarse utilizando un procedimiento apropiado para la matriz utilizada. El experto en la técnica conoce bien otros procedimientos y modos de administración.
[0071] Las composiciones descritas en el presente documento pueden utilizarse por sí solas para su uso en los procedimientos de tratamiento de un individuo descrito en el presente documento. Así mismo, las composiciones pueden utilizarse en combinación con cualquier otro procedimiento para tratar un cáncer o un tumor. Por ejemplo, los procedimientos pueden utilizarse en combinación con extirpación quirúrgica de un tumor, quimioterapia (fármacos citotóxicos, agentes apoptóticos, anticuerpos y similares), terapia con radiación, crioterapia, braquiterapia, inmunoterapia (administración de células dendríticas activas maduras específicas para antígeno, células NK, anticuerpos específicos para células cancerígenas o un antígeno tumoral, etc.), y similares. Cualquiera y todos de estos procedimientos pueden utilizarse en cualquier combinación. Los tratamientos de combinación pueden ser simultáneos o secuenciales y pueden administrarse en cualquier orden tal como se determina por el médico tratante.
[0072] En otra divulgación las células dendríticas y el sujeto beneficiario tienen el mismo haplotipo de MHC (HLA). Los procedimientos de determinación del haplotipo de HLA de un sujeto se conocen en la técnica. En una divulgación relacionada las células dendríticas maduras son alogénicas en relación al sujeto beneficiario. Las células alogénicas se emparejan típicamente con como mínimo un alelo de MHC (por ejemplo, que comparte como mínimo uno pero no todos los alelos de MHC). En una divulgación menos típica las células dendríticas y el sujeto beneficiario son todos alogénicos en relación uno con el otro, pero todos tienen como mínimo un alelo de MHC en común.
[0073] Una respuesta inmune antitumoral puede medirse utilizando cualquiera o más procedimientos bien conocidos. Por ejemplo, una respuesta antitumoral puede medirse utilizando una reducción en el tamaño de un tumor, la inducción de muerte de células tumorales o necrosis de células tumorales, una reducción en proliferación de células tumorales o utilizando la infiltración de células T específicas de antígeno para el tumor (TILs) y similares.
Ejemplos
[0074] El siguiente ejemplo se proporciona solamente con fines ilustrativos de diferentes aspectos de la presente descripción y no debería interpretarse como el que limita los procedimientos y la composición descritos en el presente documento de ningún modo.
[0075] En este ejemplo las células dendríticas activadas se ponen a prueba en un estudio de aumento de dosis en diferentes tumores sólidos.
Procedimientos
[0076] Cuarenta sujetos se inscribieron para este estudio de aumento de dosis para poner a prueba la seguridad y la viabilidad de inyección intratumoral de DC activadas (aDC), que incluyen células dendríticas activadas de manera óptima, en tumores sólidos. Los sujetos de 18-75 años de edad con enfermedad localmente avanzada o metastásica los que se sometieron a como mínimo un régimen de tratamiento antitumoral en un periodo de 12 semanas de prueba eran aptos para el estudio. Otro criterio de idoneidad incluyó tener un estado de realización de Grupo de Oncología Cooperativa del Este (ECOG) de 0 o 1, tener como mínimo una masa tumoral inyectable superior a 1 cm en diámetro y ubicada lejos de cualquier estructura vascular mayor o áreas no susceptibles a inflamación (por ejemplo, tumores de vías respiratorias superiores), generar un número suficiente de monocitos para producir un curso de dosis completa, tener una esperanza de vida superior a 6 meses, y tener la médula ósea y la función renal adecuadas. Los sujetos con una historia de enfermedad autoinmune o trasplantes de órganos se excluyeron del estudio. Otro criterio de exclusión incluyo tener un estatus positivo para VIH-1, 2 o HTLV-I o II; someterse a quimioterapia mielosupresora o mielotóxica intensa 4 semanas antes de la primera inyección; recibir inmunoterapia de cáncer en un periodo de 2 años; tener metástasis cerebral no tratada; necesitar terapias continuadas con esteroides o anticoagulantes; o tener una infección aguda o incontrolada. Las características de los sujetos se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1. Características de punto de referencia de pacientes tratados
Características, n=39 Total
Edad, años, promedio (rango) Sexo,53 (30 - 73)
n (%)
Hombre 18(46,2)
Mujer 21(53,8)
Tipo de enfermedad, n (%)
Adenocáncer pancreático 5 (12,8)
Sarcoma 9 (23,1)
Colorrectal 7 (17,9)
Neuroendocrino 4 (10,3)
Melanoma 6 (15,4)
Pulmón 3(7,7)
Mama 2(5,1)
Ovárico 1(2,6)
Vejiga 1(2,6)
Colangiocarcinoma 1(2,6)
Número de terapias anteriores, n (%)
<< 2 20(51,3)
3-5 12 (30,8)
>> 6 7 (17,9)
Diseño de Estudio
[0077] Esto era una evaluación de la seguridad y la eficacia de DCs activadas. La parte de aumento de la dosis del estudio utilizó un modelo «3 3». Se incluyeron tres niveles de dosis en este estudio: 2 millones, 6 millones y 15 millones de DCs activadas por inyección.
[0078] Cada sujeto se sometió a leucoféresis para recoger monocitos, las células precursoras de DC. Las DCs activadas (aDC; nombre comercial DCVax®-Direct) se prepararon tal como se describe a continuación. La primera inyección de aDC se realizó aproximadamente 3 semanas después de la leucoféresis, y las inyecciones posteriores se administraron 1, 2, 8, 16 y 32 semanas después de la primera inyección. Todas las inyecciones se administraron utilizando guiado por imagen, o ultrasonido o tomografía computarizada (TC) para colocar una aguja guía dentro del tumor y a continuación una aguja más fina administró el producto directamente en el tejido tumoral. Para cada inmunización, se utilizaron de 3 a 4 pases de agujas para administrar las células dentro de los límites del tumor, potenciando la exposición de aDC a células tumorales muertas y que estaban muriendo mientras se evitaba la administración de un bolo único al centro necrótico de la masa tumoral. Después de las inyecciones, los sujetos se observaron durante 2 horas tomando constantes vitales (frecuencia cardíaca, temperatura y presión arterial) cada 30 minutos.
Toxicidades limitantes de dosis (TLD) y dosis máxima tolerada (DMT)
[0079] TLD se definió como cualquiera de los siguientes: > reacciones en el sitio de inyección > grado 3, desarrollo de señales y síntomas clínicos de enfermedad autoinmune, reacción alérgica > grado 2, reacción inmunológica > grado 2 que duró 3 o más días o precisó intervención con fármacos, Criterio de Toxicidad Común del Instituto Nacional de Cáncer > grado 3 (NCI CTC) v.4 de toxicidad o de grado 4 o casos que ponen en riesgo la vida que no tienen relación con la evolución de neoplasia. La dosis máxima tolerada (DMT) se definió como el nivel más alto de dosis en el cual no más de un tercio de sujetos experimentan toxicidades limitantes de dosis (TLD).
Evaluación de eficacia
[0080] Se evaluó la eficacia de tratamiento utilizando estudios por imagen por tomografía computarizada (TC) o resonancia magnética (RM) de acuerdo con el Criterio de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos v. 1.1 (Eisenhauer et al., Eur. J. Cancer 4:228-247, 2009) o el criterio relacionado con respuesta inmune (Hoos et al., J. Nat'l. Cancer Inst. 102:1388-1397, 2010). En resumen, Enfermedad Progresiva (EP) se definió como un aumento de > 20% en la suma de los diámetros de lesiones diana en comparación con la suma más pequeña observada durante el estudio, y la suma absoluta debe aumentar > 5 mm. Enfermedad Estable (EE) se definió como la que tiene insuficiente reducción tumoral para cualificar una respuesta parcial (> 30% reducción de diámetro de lesión diana), mientras que también tiene insuficiente crecimiento tumoral para cualificar EP.
Preparación de DCs activadas
[0081] Los monocitos se purificaron a partir del producto de leucoféresis utilizando filtración de flujo tangencial. Las células se colocaron en las bolsas de cultivo tisular Teflon (Saint-Gobain, Malvern, PA) y se diferenciaron en DC inmaduras durante 5 días en presencia de factor estimulante de colonias de macrófagos (GM-CSF plus 2% de albumina de suero humano). Las células se cultivaron durante 5 días y, a continuación, se añadieron micobacterias BCG muertas y IPNy para inducir la activación de DC durante un periodo de tiempo desde aproximadamente 10 hasta 19 horas. Después de la activación, las células dendríticas activadas se volvieron a suspender en un pequeño volumen de RPMI-1640, 40% de albumina de suero humano y 10% de DMSO y las células se criopreservaron en alícuotas de dosis única. Se realizó la citometría de flujo en las células en busca de marcadores de activación de células dendríticas (Figura 3).
Determinación del nivel de citocinas
[0082] Se utilizó un conjunto de perlas magnéticas múltiples personalizado (Luminex Corp., Austin, TX) para TNFa, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 y IL- 12p40 y un conjunto único para IL-12p70 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para determinar las concentraciones de citocinas en sobrenadantes aclarados de cultivos de producto DCVax-Direct de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los datos se presentan como el valor promedio de determinaciones duplicadas normalizadas por un millón de DCs vivas.
Evaluación de biopsias tumorales
[0083] Los tumores a los que se realizó una biopsia se fijaron con formalina y se insertaron en parafina (FFPE) utilizando los procedimientos estándares. Toda la inmunohistoquímica se realizó por QualTek Molecular Laboratories (Santa Barbara, CA).
[0084] La detección in situ de transcripciones de IPNy y TNFa en especímenes FFPE se realizó utilizando el ensayo de ARNscope con sondas Hs-IFNy y Hs-TNFa (cat#310501 y 310421 respectivamente, Advanced Cell Diagnostics (ACD), EE. UU.), así como sonda de control positivo PPIB (cat#313901), y Equipo de Reactivo ARNscope 2.0 HD (Brown) (cat#310035, ACD, EE. UU.) de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante. Para verificar la especificidad de ARNscope de IPNy y TNFa, se pusieron a prueba los PBMCs de tres donantes sanos antes y después de la estimulación de células T. Para estimular las células T, los PBMCs se aislaron utilizando Ficoll-Paque (Sigma-Aldrich), se volvieron a suspender en un medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal y se trataron con 50 ng/mL de forbol miristato acetato (PMA) y 1 pg/mL de ionomicina (Sigma-Aldrich) durante 5 horas a 37°C y 5% de CO2. Las células se fijaron en 10% de formalina tamponada neutra (NBF) en Histogel®, se procesaron y se incrustaron en bloques de FFPe . Las secciones (5 pm) se pusieron a prueba utilizando ARNscope tal como se indica anteriormente. Las células T estimuladas mostraron un aumento fuerte tanto en IPNy como TNFa en comparación con las células no tratadas. Las imágenes digitales de los portaobjetos teñidos se obtuvieron con un escáner de portaobjetos digital Aperio ScanScope XT.
Análisis estadístico
[0085] Se realizaron los análisis estadísticos para determinar si los niveles de citocinas se asociaban con el resultado. Adicionalmente, se evaluó si las características de base de referencia o factores de tratamiento eran predictivos de los niveles de citocinas o resultado. La respuesta se midió basándose en dos variables: EE durante la semana 8 como una medida binaria y duración de supervivencia. Los ajustes no se realizaron para la prueba de multiplicidad. Un valor p de 0,05 se consideró estadísticamente importante.
[0086] Primero, se generaron las medidas descriptivas para los niveles de citocinas, que incluyen las correlaciones entre las medidas de potencia. Después, se evaluó la asociación entre las características de base de referencia o factores de tratamiento con niveles de citocinas utilizando los procedimientos no paramétricos de ANOVA (Wilcoxon). Se revisaron los gráficos de dispersión para todas las mediciones para todos los pares de niveles de citocinas. Se utilizó un modelo de riesgos proporcionales para ajustar la supervivencia como una función de los niveles individuales de citocinas y se utilizó una regresión retrospectiva para determinar si las mediciones específicas eran más predictivas en un modelo conjunto. Se utilizó un modelo logísti
niveles individuales de citocinas y se utilizó una regresión retrospectiva para determinar si las mediciones específicas eran más predictivas en un modelo conjunto. Se utilizaron modelos de riesgos proporcionales, modelos logísticos, pruebas de tendencias o pruebas x 2 de cociente de probabilidad para evaluar la asociación de características de base de referencia y factores de tratamiento con supervivencia y EE a las 8 semanas como apropiados para la medición y el punto final. Para los gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier basados en los niveles de citocinas, se utilizó el valor promedio para cada citocina como el punto límite entre los dos grupos.
[0087] Basándose en los análisis y una revisión de los gráficos de dispersión, un grupo de observaciones resultó ser atípico o posiblemente un conjunto único de sujetos (se describe con más detalle en Resultados). Los análisis se repitieron con estos registros de sujetos eliminados. Los análisis se completaron utilizando la versión 9.3 de SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC).
Resultados
Sujetos
[0088] En general, se inscribieron 40 sujetos en el estudio. De estos, un sujeto se consideró no evaluable debido a una formulación incorrecta de las aDCs. Las estadísticas demográficas y características clínicas se exponen en la Tabla 1. La edad media de sujeto era de 53 años (rango 30 - 73 años). El estudio incluyó a 21 mujeres (53,8%). Se incluyó un gran número de tipos de tumores en el estudio, con el más común siendo sarcoma (n = 8), cáncer colorrectal (n = 7), y melanoma (n = 6). Los sujetos tenían una media de tres lesiones (rango = desde 1 hasta 5 lesiones). El rango promedio de tratamientos anteriores era de dos (promedio = 3; rango = desde 1 hasta 9). Todos los procedimientos se realizaron sobre una base de paciente no hospitalizado con guía por imagen (tomografía computarizada) o ultrasonido) facilitado por sedación consiente por un radiólogo intervencionista. Con la dosis de 2 millones de aDC, se administró a 16 sujetos una media de cuatro inyecciones (rango = desde 1 hasta 6 inyecciones). Con la dosis de 6 millones de aDC, se administró a 20 sujetos una media de tres inyecciones (rango = desde 2 hasta 6 inyecciones). Con la dosis de 15 millones de aDC, se administró a tres sujetos una media de cuatro inyecciones (rango = desde 3 hasta 4 inyecciones). Solamente se inyectó un tumor por sujeto.
[0089] Las aDC se administraron por la vía intratumoral utilizando la guía por imagen, con una dosis de 2 millones, 6 millones o 15 millones de DC vivas, activadas, autólogas por inyección. Durante cada visita para inyección (días 0, 7, 14, a continuación, semanas 8, 16 y 32), se inyectó una única lesión. Para preparar las aDC para la inyección intratumoral, se activaron a través de la exposición a BCG y IPNyD. Se recogieron los sobrenadantes de DC activadas para medir la producción de citocinas. Se evaluaron las biopsias tumorales para necrosis tumoral y para la infiltración de linfocitos. El tamaño de tumor se controló utilizando los procedimientos de visualización estándar y se recogió la sangre para el control inmune.
Seguridad y supervivencia
[0090] De manera general, la inyección intratumoral utilizando la guía por imagen se toleró bien y era viable. En total, se realizaron inyecciones por la vía intratumoral en 16 sujetos con el nivel de dosis de 2 millones, 20 con 6 millones y 3 con 15 millones. No se observó ninguna toxicidad limitante de dosis (TLDs) durante el aumento de la dosis, y, por lo tanto, no se determinó una dosis máxima tolerada (DMT). La dosis máxima probada (15 millones de aDCs) se toleró bien. Los efectos adversos relacionados con el tratamiento del estudio se exponen en la Tabla 2.
Tabla 2. Efectos adversos relacionados con el tratamiento.
Células dendríticas activadas (aDCs/inyección)
2 millones, n = 16 6 millones, n = 20 15 millones, n = 3 Total, n (%)b Efecto Adversoa G1-G2 G3-G4 G1-G2 G3-G4 G1-G2 G3-G4
Pirexia 15 0 14 0 2 0 31 (79,5) Escalofríos 10 0 5 0 1 0 16 (41,0) Fatiga 8 0 2 2 0 0 12 (30,8)
Células dendríticas activadas (aDCs/inyección)-continuación
2 millones, n = 16 6 millones, n = 20 15 millones, n = 3 Total, n (%)b Efecto Adversoa G1-G2 G3-G4 G1-G2 G3-G4 G1-G2 G3-G4
Sitio de inyección 8 0 3 0 0 0 11 (28,2) dolor/malestar
Sudores nocturnos 5 0 5 0 0 0 10 (25,6) Disminución de apetito 6 0 2 0 1 0 9 (23,1) Mialgia 4 0 3 0 0 0 7 (17,9) Dolor de cabeza 3 0 1 0 0 0 4 (10,3) Náusea 3 0 0 0 1 0 4 (10,3) Vómito 3 0 0 0 1 0 4 (10,3) Anemia 1 0 0 1 0 0 2 (5,1) Enfermedad similar a 1 0 1 0 0 0 2 (5,1) gripe
Dolor 0 0 2 0 0 0 2 (5,1) Pérdida de peso 0 0 1 0 1 0 2 (5,1) Dolor abdominal 0 0 1 0 0 0 1 (2,6) Dolor de espalda 0 0 1 0 0 0 1(2,6) Dolor de mama 0 0 1 0 0 0 1 (2,6) Deshidratación 1 0 0 0 0 0 1 (2,6) Ojo seco 1 0 0 0 0 0 1(2,6) Boca seca 1 0 0 0 0 0 1 (2,6) Disnea 0 0 1 0 0 0 1 (2,6) Edema facial 0 0 1 0 0 0 1 (2,6) Hidronefrosis 1 0 0 0 0 0 1 (2,6) Hipocalemia 0 0 0 1 0 0 1 (2,6) Hipomagnesemia 1 0 0 0 0 0 1 (2,6) Insomnio 1 0 0 0 0 0 1 (2,6) Malestar
musculoesquelético 1 0 0 0 0 0 1 (2,6) Edema periférico 1 0 0 0 0 0 1 (2,6) Sensibilización de la piel 0 0 1 0 0 0 1 (2,6) Síndrome de respuesta
inflamatoria sistémica 0 0 0 1 0 0 1 (2,6) Taquicardia 0 0 1 0 0 0 1 (2,6) Abreviaturas: aDCs, células dendríticas activadas; G, grado (según el Criterio de Terminología del Instituto Nacional de Cáncer para Efectos Adversos versión 4).
a Cuando se observan los efectos adversos en datos múltiples en diferentes grados, se enumera el grado más alto observado.
B Porcentaje de pacientes totales, N = 39.
[0091] Se observaron los efectos adversos relacionados con el tratamiento en 32 sujetos (82,1%), pero la mayoría de todos ellos eran de grado 1 o 2 y la mayoría se resolvieron hacia el final del periodo de estudio. Los efectos adversos más comunes eran pirexia (n = 31, 79,5%), escalofríos (n = 16, 41,0%), fatiga (n = 12, 23,1%), dolor o malestar en el sitio de inyección (n = 11, 28,2%), sudores nocturnos (n = 10, 25,6%), apetito disminuido (n = 9, 23,1%), y mialgia (n = 7, 17,9%).
[0092] Existieron cuatro efectos adversos relacionados con el tratamiento de grado 3 (10,3%) y uno de grado 4 (2,6%), todos con la dosis de 6 millones de aDCs por inyección.
Histología
[0093] Se recogieron los datos de biopsia en serie de 28 sujetos. En total, se recogieron 104 biopsias. Se observó necrosis nueva o aumentada en 14 sujetos a los que se realizó biopsia (57%). Se observaron números nuevos o aumentados de linfocitos estromales en 14 sujetos a los que se realizó biopsia (50,0%); números nuevos o aumentados de linfocitos infiltrantes en 15 sujetos a los que se realizó biopsia (54%); y tanto linfocitos infiltrantes como estromales se observaron en 8 sujetos a los que se realizó biopsia (29%). Las biopsias se recogieron durante la semana 3 y la semana 8 y se generaron las células T peritumorales e intratumorales detectadas con la infiltración después de tratamiento a las 8 semanas. Por consiguiente, la respuesta inmune se inició en algún momento dentro de esta franja de tiempo. En algunos sujetos, la acumulación de células T se detecto 2 o 3 semanas después de la primera inyección. Estas células T pueden representar una respuesta inmune antitumoral preexistente que se localiza en el tumor después de la inyección con DC activadas.
[0094] Se observó la expresión PD-L1 de novo o aumentada de manera importante en 19 de 25 biopsias tumorales evaluadas. Entre las biopsias tintadas tanto con linfocitos como con PD-L1, se observó la expresión de PD-L1 nueva o aumentada en 9 de 12 sujetos con células T infiltrantes nuevas o aumentadas y en 11 de 12 sujetos con linfocitos estromales nuevos o aumentados. Entre los 19 sujetos totales con la expresión de PD-L1 nueva o aumentada, 14 tenían linfocitos o peritumorales o infiltrantes.
[0095] Cuando se observaron las células T, eran principalmente una mezcla de células CD4+ y CD8+; sin embargo, habían pocos casos donde se detectaron exclusivamente las células T CD4+ o CD8+. En algunos casos, las células T constituyeron más de 30% del total de las células en la sección de biopsia (Véanse, también la Figura 1A).
[0096] Para evaluar la funcionalidad de células T asociadas a tumor e infiltrantes, se realizó un análisis de ARNscope para la expresión de IPNy y TNFa en tejidos seleccionados. La mayoría de las células T en las muestras puestas a prueba eran positivas para ambas citocinas (Figuras 1B y 1C), sugiriendo que las células T funcionales eran captadas por el tumor. También se detecto el macrófago tisular que expresa TNFa.
Niveles de atocinas, supervivencia y enfermedad estable (EE)
[0097] Se evaluaron los niveles de citocinas de las aDCs antes de la inyección en el sujeto. Dado que cada lote de aDCs se derivó de los monocitos propios del sujeto, existió un grado amplio de variabilidad intra-sujeto observado en los niveles de citocinas. Por consiguiente, las correlaciones internas entre los niveles de citocinas y las asociaciones entre los niveles de citocinas y las características de base de referencia, factores de tratamiento, supervivencia y EE se evaluaron a las 8 semanas.
[0098] Durante los análisis estadísticos, tres sujetos tuvieron DCs activadas que tenían altos niveles de IL-8 y IL-6, pero bajos niveles de TNFa. Estos sujetos aparecían sistemáticamente como atípicos estadísticos. El primer sujeto atípico era un sujeto con melanoma hombre de 51 años del grupo de tratamiento con 6 millones de aDC. Tenía 5 lesiones y se sometió a una serie de tratamiento previamente. Recibió tres inyecciones, tuvo EE a las 8 semanas y murió aproximadamente 9 meses después de la primera inyección. El segundo sujeto atípico era un sujeto con cáncer de mama mujer de 59 años del grupo de tratamiento con 6 millones de aDC. Tenía 3 lesiones y se sometió a ocho series de tratamiento previamente. Recibió tres inyecciones y murió aproximadamente 1 mes después de la primera inyección. El tercer sujeto atípico era un sujeto con cáncer de pulmón hombre de 52 años del grupo de tratamiento con 15 millones de aDC. Tenía tres lesiones y se sometió a cinco series de tratamiento previamente. Recibió tres inyecciones, tuvo EP (Enfermedad Progresiva) a las 8 semanas y murió aproximadamente 3,5 meses después de la primera inyección. Los tres sujetos tenían una carga importante de enfermedad y un pronóstico extremadamente pobre. Los tres sujetos no tenían otras características destacadas conocidas que los separaron del resto de los objetos del estudio. Un análisis preliminar de las aDCs de uno de los sujetos sugiere que los monocitos purificados pueden haber fallado para transformarse completamente en aDCs. En los análisis posteriores, los datos del sujeto atípico se han excluido.
Correlaciones internas entre niveles de citocinas
[0099] Para evaluar la calidad de activación y el efecto de las citocinas producidas por las aDCs, se determinaron los niveles de TNFa, IL-6, IL-8, IL-10, Il12p40 y IL-12p70. Existió un alto nivel de correlación interna entre diferentes citocinas evaluadas. Aquellos valores se correlacionaron con el resultado (enfermedad estable (EE) o supervivencia) en los análisis univariados. De forma separada, se utilizó un modelo de regresión retroactiva para evaluar la fuerza predictiva relativa de las medidas e identificar las combinaciones variables basadas en un modelo conjunto, empezando con todos los factores. Las citocinas correlacionadas se clasificaron en tres grupos. El primer grupo incluyó IL-6, Il-12p40 y en un grado menor TNFa. El valor r de Pearson para IL-6 y IL-12p40 era de 0,64 (p = 0,004). El valor r para IL-6 y TNFa era de 0,88 (p = < 0,001). El valor r para IL-8 y IL-12p40 era de 0,641 (p< 0,001). El segundo grupo contenía IL-10 y IL-8. El valor r para IL-18 y IL-10 era de 0,63 (p< 0,001). El tercer grupo contenía IL-12p40 y IL-12p70, que tenía un valor r de 0,55 (p < 0,001). Debería señalarse que el tiempo corto de activación utilizado para generar las aDCs no era óptimo para detectar el complemento entero de la producción de EL-12p70.
Asociación entre los niveles de citocinas y características de base de referencia y factores de tratamiento
[0100] A continuación, se determinaron las asociación entre el nivel de citocinas y características de base de referencia y factores de tratamiento, que incluyen indicaciones, número de lesiones, tratamiento anterior, dosis, número de inyecciones, edad, suma o el diámetro de tumor más grande (SLD) y recuento absoluto de leucocitos durante el cribado utilizando los análisis de regresión. SLD se asoció de manera negativa con los niveles de IL-8 (R2 = 0,20; p = 0,006), IL-12p40 (R2 = 0,14; p = 0,026) y IL-12p70 (R2 = 0,11; p = 0,051), y se asoció de manera positiva con los niveles de IL-10 (R2 = 0,023). a Lc se asoció de manera positiva con IL-12p40 (R2 = 0,26; p = 0,002). Ni SLD ni ALC se asoció de manera independiente con la supervivencia.
Asociaciones entre los niveles de citocinas y la supervivencia
[0101] Los niveles de citocinas se ajustaron de manera individual en un modelo de riesgos proporcional para determinar si eran predictivos de supervivencia. Los análisis univariados indicaron que la IL-6 (p = 0,048), IL-8 (p = 0,014) y IL-12p40 (p = 0,016) se asociaban con la supervivencia. Específicamente, los niveles de IL-8 superiores a 985 ng/106 de células/día y los niveles de IL-12p40 superiores a 330 /106 de células/día mostraron supervivencia general significativamente más alta (p = 0,0022 y p = 0,0077, respectivamente; Figuras 2A y 2B).
[0102] Se realizó un análisis preliminar para evaluar un modelo conjunto de pares de citocinas aisladas y determinar interacciones de factor potencial. La combinación de IL-8 y IL-12p40 se asoció con un término de interacción potencialmente importante (p = 0,020). El modelo de interacción conjunta indica que los sujetos con los valores altos de ambas IL-8 y IL-12p40 pueden responder mejor de manera general. Los resultados sugieren que puedan existir relaciones más complejas entre las medidas de potencia de DC y los resultados clínicos.
Asociación entre el nivel de citocinas y Enfermedad Estable durante la semana 8
[0103] El análisis de Kaplan-Meyer mostró que la supervivencia se asociaba de manera importante con la EE de la Semana 8 (p = 0,004), Figura 2C); por lo tanto, se determinó si existían los marcadores de citocinas asociados con la EE. Los niveles de citocinas se ajustaron individualmente con un modelo logístico para determinar si eran predictivos de la EE de la Semana 8. El análisis univariado reveló una asociación positiva entre la EE de Semana 8 y TNFa (p = 0,015, Figura 2D), y esta asociación se confirmó en un modelo de regresión retroactiva multivariado (p = 0,014).
Otras mediciones de la calidad de DC
[0104] Se analizaron las aDC inyectadas de 25 sujetos para la expresión de marcador de superficie. Las correlaciones débiles entre la supervivencia y los niveles de expresión (intensidad media de fluorescencia dividida en terciles) de antígenos MHC de clase I (rango log p para evolución = 0,07) y la molécula coestimuladora CD86 (rango log p para evolución = 0,1), que proporciona ayuda adicional para la hipótesis que la calidad de DC es un impulsor primario para el resultado de sujeto cuando se administra por la vía intratumoral (Figura 2E y Figura 2F).
[0105] Se observó la estabilización de enfermedad en más sujetos tratados con aDC que producían altos niveles de TNF (p < 0,01). La supervivencia se asocia del mismo modo con los niveles altos de producción de TNFa, IL-6 y IL-8.
[0106] En este estudio, se puso a prueba la seguridad y la eficacia de células dendríticas autólogas activadas (aDCs). Las aDCs se inyectaron por la vía intratumoral, como un tratamiento para los sujetos con tumores sólidos irresecables, avanzados localmente o metastásicos. Los sujetos se trataron con 2, 6, o 15 millones de aDCs por inyección durante la semana 0, 1,2, 8, 16 y 32, o hasta que las aDCs ya no eran más autólogas para su administración. No se observó ninguna TLD y, por lo tanto, no existió ninguna DMT. Esta observación es coherente con otros estudios de vacunas con DC en las que no se identificaron ni TLD ni DMT (Butterfield, Front. Immunol. 4:454, 2013, Draube et al., PLoS One 6:e18801, 2011). Dado que las vacunas con DC utilizan células autólogas, no era sorprendente que existía toxicidad limitante. Se ha señalado previamente que una dosis de vacuna con DC está limitada únicamente por el número de células que pueden extraerse durante la leucoféresis y convertirse para el tratamiento, a la que se le denomina la dosis máxima viable (Anguille et al., Pharmacol. Rev. 67:731-753, 2015).
[0107] La dosis máxima administrada en el presente documento era de 15 millones de aDCs por inyección; sin embargo, esta dosis grande podría no ser necesaria para generar una respuesta eficaz de células T. Un metaanálisis grande de ensayos de vacuna con DC de cáncer renal y de próstata identificó una correlación positiva entre la dosis y el resultado (Draube et al., PLoS One 6:e18801, 2011). Sin embargo, varios otros estudios han mostrado que pocas células pueden alcanzar respuestas inmunes equivalentes con relativamente pocas DCs, siempre y cuando las DCs alcancen eficazmente el nódulo de drenaje (Tel et al., Cancer Res. 73:1063-1075, 2013; Aarntzen et al., Clin. Cancer Res. 19:1525-1533, 2013, Verdijk et al., Expert Opin. Biol. Ther. 87:865-874, 2008), Celli et al., Blood 120:3945-3948, 2012). Relativamente pocos efectos adversos relacionados con el tratamiento, de grado bajo se vieron con un tratamiento con aDC en este estudio. Estos efectos adversos estaban principalmente asociados con la activación del sistema inmune, tal como pirexia. Estos resultados, asociados con la insuficiencia de DMT, indican que aDCs son un tratamiento seguro para tumores sólidos.
[0108] En lo que se refiere a la eficacia de las aDCs, las biopsias de tumores inyectados mostraron el aumento de necrosis e infiltración de linfocitos, que incluyen células auxiliares CD4+ y células asesinas CD8+. En casos individuales, se observó reactividad inmune tanto con infiltración rápida como retrasada de células T en biopsias de pacientes y necrosis extensiva. Estas observaciones precedieron una reducción demostrable en el tamaño del tumor (los datos no se muestra). Los estudios han mostrado que la infiltración aumentada y la acumulación de determinados tipos de células T, tales como linfocitos estromales y CTLs, en tumores tiene fuerte correlación con los resultados mejorados en diferentes tumores sólidos (Tosolini et al., Cancer Res. 71:1263-1271,2011; Smyth et al., Adv. Immunol.
90:1-50, 2006; Clemente et al., Cancer 77:1303-1310, 1996). Además, PD-L1 aumentó en 19 de 25 tumores puestos a prueba, y esta regulación positiva refleja probablemente la respuesta del tumor a la activación inmune, particularmente debido a que las biopsias tumorales que fueran positivas para las células T era más probables de tener la expresión aumentada de PD-L1. PD-L1 es una molécula coinhibidora obtenida durante la infiltración de linfocitos que regulan a la baja la actividad de células T para controlar las reacciones inmune excesivas, y tumores utilizan para evadir las respuesta inmunes (Ito et al., Biomed. Res. Int. 2015:605478, 2015, Anguille et al., Pharmacol. Rev. 67:731-753, 2015). En consideración que los datos anteriores de PD-L1 procedían de tumores con biopsias, la aparición de la expresión de PD-L1 puede servir como un marcador de la inducción de respuesta inmune antitumoral exitosa, más que una indicación de la regulación a la baja de respuesta inmune. En general, estos resultados proporcionan pruebas de que aDCs estimulan una respuesta eficaz de células T en tumores sólidos.
[0109] Para que el tratamiento con aDC sea eficaz, debería mejorar también los resultados en pacientes. En el presente documento se plantea una hipótesis de que el mecanismo de supervivencia se relacionaba con la potencia de DC, tal como se midió utilizando las citocinas secretadas por las aDCs. Por lo tanto, los niveles de citocinas de las aDCs se evaluaron antes de inyectarlas en los tumores. Se observó que IL-12p40 se asociaba de manera importante con supervivencia. IL-12p40 es una subunidad del complejo heterodimérico de IL-12, también denominado lL-12p70. IL-12 es conocida por estimular las células asesinas naturales y madurar las células T. Se conoce también por ayudar a convertir las células Th2 en las células Th1 que tienen actividad antitumoral (Del Vecchio et al., Clin. Cancer Res.
12:4677-4685, 2007). Por lo tanto, las aDCs que producen Il-12p40 son ideales para una vacuna de DC eficaz.
Además, la secreción de IL-8 se asocia con la supervivencia. Específicamente, la secreción alta de IL-8 mostró una supervivencia general significativamente más alta. IL-8 en gran medida se considera que se asocia negativamente con el cáncer. IL-8 favorece la angiogénesis, proliferación celular y supervivencia celular; sin embargo, también fomenta la infiltración de células inmunes en el microambiente tumoral (Waugh y Wilson, Clin. Cancer Res. 14:6735-6741, 2008). En el caso de inmunoterapia con BCG, IL-8 se asoció con el desarrollo de una respuesta inmune antitumoral (de Boer et al., Urol. Res. 25:31-34, 1997). Parece posible que la aplicación localizada de aDCs que producen IL-8 estimuló la infiltración de células inmunes en el tumor. Además, el modelo de regresión indicó que la combinación de los dos se asociaba positivamente con la supervivencia. Esta observación indica que la combinación de IL-8 y IL-12p40 (y posiblemente otras citocinas), más que las citocinas individuales, puede ser la clave para la supervivencia mejorada. Actualmente, no está claro si las citocinas secretadas que mostraron a tener una correlación con la supervivencia tienen una importancia funcional directa o si sirven como medidas sensibles de potencia general de DC. Las asociaciones observadas entre los parámetros de base de referencia de pacientes y la potencia d DC tal como se midieron utilizando la producción de citocinas sugieren que los factores, tales como SLD y ALC pueden a predisponer a los pacientes hacia un beneficio mayor de terapias basadas en DC, aunque los valores de R2 sugieren que aquellos parámetros de bases de referencia solamente explican hasta 25% de la variación en niveles de citocinas. Esta posibilidad merece atención adicional en estudios posteriores con más poblaciones de pacientes homogéneos y será el sujeto de futuras investigaciones.
[0110] El análisis de supervivencia adicional de los pacientes tratados con aDC mostró que EE durante la semana 8 se correlacionó de manera significante con la supervivencia. Estos datos indican que si se puede estabilizar el tumor utilizando aDCs, a continuación, las probabilidades de supervivencia libre de evolución aumentan de manera significante. Por consiguiente, se investigó que las citocinas se asociaban con EE de la Semana 8. El análisis de los niveles de citocinas mostró que TNFa se asociaba de manera positiva con la EE de la Semana 8. TNFa es una citocina bien caracterizada ampliamente asociada con la regulación positiva de la respuesta inmune, que incluye maduración de DC e imprimación, proliferación y captación de células T(Calzascia et al., J. Clin. Invest. 117:3833-3845, 2007; van Horssen et al., Oncologist 11:397-408, 2006). Los estudios en humanos han mostrado que se puede utilizar la perfusión de ramas aisladas de TNFa para tratar sarcomas avanzados de tejidos blandos (Eggermont et al., Lancet Oncol. 4:429-437, 2006). Además, TNFa ha mostrado ser crítico para las respuestas inmunes antitumorales en ratones (Calzascia et al., J. Clin. Invest. 117:3833-3845, 2007). La asociación positiva observada en el presente documento entre TNFa es compatible con estos resultados. También se observó una correlación interna importante entre IL-6, IL-8 y IL-12p40; sin embargo, la importancia aparente podría ser el resultado de una correlación interna entre IL-8 y IL-12p40 más que una biológicamente relevante. Alternativamente, podría ser una reflexión de la potencia general de DC, tal como se trató anteriormente. Esta hipótesis se respalda con las tendencias correlativas entre la supervivencia y la expresión de MHC-II y CD86, marcadores de maduración crítica de DC, sobre la superficie de las aDCs (Steinman and Banchereau, Nature 449:419-426, 2007).
[0111] En el presente documento se ha demostrado que las DCs activadas (aDCs) son una opción de tratamiento seguro, viable para pacientes con tumores sólidos. Se han identificado que las citocinas específicas, cuando una o más es secretada por las aDCs, llevan a la estabilización de enfermedad, dando lugar a supervivencia prolongada. Teniendo en cuenta los datos anteriores, está claro que las aDCs son un tratamiento prometedor para prolongar la supervivencia de pacientes con tumores sólidos irresecables, localmente avanzados o metastásicos sin toxicidad importante en tumores sólidos múltiples y pueden provocar tanto respuestas inmunes locales como sistémicas. Los resultados clínicos tales como estabilización de enfermedad y supervivencia se asocian de manera significante con las medidas de potencia de DC, tales como producción de citocinas in vivo.
[0112] Basándose en los resultados en el presente documento se ha descubierto que (i) la inyección intratumoral (i.t.) de células dendríticas activadas es segura y se tolera bien; (ii) los resultados clínicos después de la inyección intratumoral de DC activadas tienen correlación con la potencia de DC, medida por la producción de citocinas; (iii) las citocinas individuales muestran asociaciones diferentes con parámetros de resultados clínicos, sugiriendo correlaciones complejas entre función de DC y posible benéfico terapéutico.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento in vitro para determinar la potencia inmunoterapéutica de una composición de células dendríticas humanas no completamente maduras activadas para su uso en el tratamiento de un tumor sólido, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
i) preparar células dendríticas activadas que no hayan madurado completamente, tal como se mide reteniendo la capacidad para captar y procesar de manera eficaz un antígeno;
ii) determinar las cantidades relativas de interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), interleucina 12 p40 (IL-12 p40) y factor de necrosis tumoral a (TNFa) de la composición de células dendrítica activadas y no completamente maduras; iii) comparar la cantidad determinada de IL-6, IL-8, IL-12 p40 y TNFa con una cantidad umbral; y
iv) determinar que la composición de células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras es de baja potencia inmunoterapéutica si todos de IL-6, IL-8, IL-12 p40 y TNFa están por debajo del umbral; o que la composición de células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras es de alta potencia inmunoterapéutica si todos de IL-6, IL-8, IL-12 p40 y TNFa están por encima del umbral.
2. Procedimiento in vitro para seleccionar un paciente que tiene un tumor sólido que responderá o no a la administración de células dendríticas humanas no completamente maduras activadas mediante la determinación de la potencia inmunoterapéutica de una composición de células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras derivadas del paciente, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
i) preparar una composición que comprende células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras, tal como se mide reteniendo la capacidad para captar y procesar de manera eficaz un antígeno;
ii) determinar las cantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 p40 y TNFa de las células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras;
iii) comparar la cantidad determinada de IL-6, IL-8, IL-12 p40 y TNFa con una cantidad umbral; y
iv) determinar que la composición de células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras es de baja potencia inmunoterapéutica si todos de IL-6, IL-8, IL-12 p40 y TNFa están por debajo del umbral; o que la composición de células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras es de alta potencia inmunoterapéutica si todos de IL-6, IL-8, IL-12 p40 y TNFa están por encima del umbral y seleccionar los pacientes por encima del umbral como pacientes que responderán o seleccionar los pacientes por debajo del umbral como pacientes que no responderán.
3. Procedimiento in vitro para seleccionar un agente de maduración de células dendríticas para producir células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras con potencia inmunoterapéutica incrementada para su uso en el tratamiento de un tumor sólido, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
i) preparar células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras poniendo en contacto células dendríticas inmaduras con un agente de maduración de células dendríticas de prueba durante un período de tiempo suficiente para inducir la maduración de las células dendríticas inmaduras, pero sin permitir que las células dendríticas maduren por completo, tal como se determina por la capacidad de las células dendríticas para captar y procesar de manera eficaz un antígeno;
ii) determinar las cantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 p40 y TNFa;
iii) comparar la cantidad determinada de IL-6, IL-8, IL-12 p40 y TNFa con una cantidad umbral; y
iv) determinar que la composición de células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras es de baja potencia inmunoterapéutica si todos de IL-6, IL-8, IL-12 p40 y TNFa están por debajo del umbral, o que la composición de células dendríticas activadas y no completamente maduras es de alta potencia inmunoterapéutica si todos de IL-6, IL-8, IL-12 p40 y TNFa están por encima del umbral y seleccionar el agente de maduración de células dendríticas que induce la producción in vitro de la composición de células dendríticas activadas y no completamente maduras por encima del umbral.
4. Procedimiento in vitro de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras producen de 50 a 200 ng/1 millón de células/24 horas de IL-6; de 500 a 2000 ng/1 millón de células/24 horas de IL-8; y/o al menos de 75 a 100 ng/1 millón de células/24 horas de la subunidad IL-12 p40.
5. Procedimiento in vitro de la reivindicación 4, en el que las células dendríticas no completamente maduras activadas humanas producen de 75 a 150 ng/1 millón de células/24 horas de IL-6; de 750 a 1500 ng/1 millón de células/24 horas de IL-8; y/o al menos 100 ng/1 millón de células/24 horas de IL-12 p40; preferiblemente
en el que las células dendríticas activadas y no completamente maduras producen 100 ng/1 millón de células/24 horas de IL-6 y 1000 ng/1 millón de células/24 horas de IL-8 y/o al menos 100 ng/1 millón células/24 horas de IL-12 p40.
6. Procedimiento in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras se preparan mediante las siguientes etapas:
i) aislar una población celular que comprende células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de sangre periférica;
ii) enriquecer la población celular que comprende PBMC humanas para precursores de células dendríticas monocíticas humanas;
iii) cultivar la población celular enriquecida en precursores de células dendríticas monocíticas humanas con un medio de cultivo tisular suplementado con una cantidad eficaz de un agente de diferenciación de células dendríticas durante un período de tiempo suficiente para diferenciar los precursores de células dendríticas monocíticas humanas en células dendríticas humanas inmaduras;
iv) cultivar la población celular enriquecida en células dendríticas humanas inmaduras con una cantidad eficaz de un agente de maduración de células dendríticas para activar y no madurar completamente las células dendríticas humanas inmaduras, tal como se determina mediante la eficacia de las células dendríticas humanas para captar y procesar un antígeno; y
v) aislar y lavar las células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras.
7. Procedimiento in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras se preparan mediante las siguientes etapas:
i) aislar una población celular enriquecida y que comprende precursores de células dendríticas monocíticas humanas; ii) cultivar la población celular enriquecida en precursores de células dendríticas monocíticas humanas con un medio de cultivo tisular suplementado con una cantidad eficaz de un agente de diferenciación de células dendríticas durante un período de tiempo suficiente para diferenciar los precursores de células dendríticas monocíticas humanas en células dendríticas humanas inmaduras;
iii) cultivar la población celular enriquecida en células dendríticas humanas inmaduras con una cantidad eficaz de un agente de maduración de células dendríticas para activar e inducir la maduración de las células dendríticas humanas inmaduras; y
iv) aislar y lavar las células dendríticas humanas activadas y no completamente maduras.
8. Procedimiento in vitro, según la reivindicación 6 o 7, en el que los precursores de células dendríticas monocíticas humanas se obtienen de piel, bazo, médula ósea, timo, ganglios linfáticos, sangre de cordón umbilical o sangre periférica.
9. Procedimiento in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que las células precursoras de células dendríticas monocíticas humanas son precursores de células dendríticas monocíticas humanas no activadas.
10. Procedimiento in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que los precursores de células dendríticas monocíticas humanas se obtienen del sujeto individual a tratar por el tumor sólido; o en el que los precursores de células dendríticas monocíticas humanas se obtienen de un sujeto individual sano con HLA compatible con el sujeto individual a tratar por el tumor sólido.
11. Procedimiento in vitro, según la reivindicación 6 o 7, en el que el agente de diferenciación de células dendríticas humanas es GM-CSF sin ninguna otra citocina, o GM-CSF en combinación con IL-4, IL-7, IL-13 o IL -15.
12. Procedimiento in vitro, según la reivindicación 6 o 7, en el que el agente de maduración de células dendríticas humanas es un Bacillus Calmette-Guerin (BCG) inactivado, interferón y (IPNy), lipopolisacárido (LPS), factor de necrosis tumoral a (TNFa), un compuesto de imidazoquinolina, un polirribonucleótido sintético de doble cadena, un agonista de un receptor tipo Toll (TLR), una secuencia de ácidos nucleicos que contiene motivos CpG no metilados que se sabe que inducen la maduración de células dendríticas, o cualquier combinación de los mismos; preferiblemente
en el que el agente de maduración es una combinación de BCG e IPNy y el polirribonucleótido de doble cadena sintético es poli[I]:poli[C(12)U].
13. Procedimiento in vitro, según la reivindicación 12, en el que el BCG inactivado comprende BCG completo, constituyentes de la pared celular de BCG, lipoarabidomananos derivados de BCG o componentes de BCG; preferiblemente
en el que el BCG inactivado es BCG inactivado por calor, BCG tratado con formalina o BCG inactivado por calor y tratado con formalina.
14. Procedimiento in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, en el que la cantidad efectiva de BCG es de 105 a 107 ufc por mililitro de medio de cultivo de tejido y la cantidad efectiva de IFNy es de 100 a 1.000 Unidades por mililitro de medio de cultivo de tejido.
15. Procedimiento in vitro, según la reivindicación 12, en el que el compuesto de imidazoquinolina es un compuesto de imidazoquinolina-4-amina; preferiblemente
en el que el compuesto de imidazoquinolina-4-amina es 4-amino-2-etoximetil-a,a-dimetil-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-1-5 etanol o 1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina, o un derivado de los mismos.
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