ES2861428T3 - Liposomas que presentan una relación N:P útil para suministro de moléculas de ARN - Google Patents

Abstract

Un liposoma en el que se encapsula un ARN que codifica un inmunógeno, en el que el liposoma comprende un lípido catiónico y el liposoma y el ARN presentan una relación N:P de entre 4:1 y 16:1, y en el que la relación N:P no se encuentra entre 7:1 y 9:1, en el que la "relación N:P" se refiere a la relación molar de átomos de nitrógeno protonables en los lípidos catiónicos del liposoma con respecto a los fosfatos en el ARN, en el que el lípido presenta una amina terciaria, y en el que el lípido presenta un pKa en el intervalo de 5,0 a 7,6.

Description

DESCRIPCIÓN

Liposomas que presentan una relación N:P útil para suministro de moléculas de ARN

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Campo técnico

Esta invención pertenece al campo del suministro no viral de ARN para inmunización.

Técnica antecedente

El suministro de ácidos nucleicos para la inmunización de animales ha sido un objetivo durante varios años. Se han probado diversos enfoques, incluidos el uso de ADN o ARN, de vehículos para suministro viral o no viral (o incluso ningún vehículo para suministro, en una vacuna “desnuda”), de vectores replicantes o no replicantes o de vectores virales o no virales.

Continúa existiendo la necesidad de vacunas de ácido nucleico adicionales y mejoradas y, en particular, de formas mejoradas para el suministro de vacunas de ácido nucleico.

Divulgación

Los liposomas de la invención presentan una relación N:P de 4:1 a 16:1, en los que la relación N:P no se encuentra entre 7:1 y 9:1. De acuerdo con la divulgación, la inmunización con ácido nucleico se logra mediante el suministro de un ARN encapsulado en un liposoma que comprende un lípido catiónico, en el que el liposoma y el ARN presentan una relación N:P de entre 1:1 y 20:1. La “relación N:P” se refiere a la relación molar de átomos de nitrógeno en el lípido catiónico con respecto a los fosfatos en el ARN. Los liposomas resultan útiles para el suministro in vivo de ARN a una célula de vertebrado.

De este modo, la divulgación proporciona un liposoma en el que se encapsula un ARN, en el que el liposoma comprende un lípido catiónico, el ARN codifica un inmunógeno, y el liposoma y el ARN presentan una relación N:P de entre 1:1 y 20:1.

La divulgación proporciona, además, un procedimiento de preparación de un liposoma que encapsula un ARN que codifica un inmunógeno, en el que el liposoma se forma a partir de la mezcla de componentes formadores de liposomas con un ARN que codifica un inmunógeno, en el que los ingredientes formadores de liposomas comprenden un lípido catiónico, y en el que el lípido catiónico y el ARN se mezclan en una relación N:P de entre 1:1 y 20:1.

El documento WO 2011/005799 A2 describe un liposoma que comprende un lípido catiónico y un inmunógeno que codifica un inmunógeno de RSV en el que el lípido catiónico y el ARN presentan una relación N:P de 8:1.

Liposomas

Diversos lípidos anfifílicos pueden formar bicapas en un medio acuoso para encapsular un núcleo acuoso que contiene ARN como un liposoma. Estos lípidos pueden presentar un grupo principal hidrófilo aniónico, catiónico o zwitteriónico. La formación de liposomas de fosfolípidos aniónicos se remonta a la década de 1960, y se han estudiado los lípidos formadores de liposomas catiónicos desde la década de 1990. Algunos fosfolípidos son aniónicos, mientras que otros son zwitteriónicos y otros son catiónicos. Las clases adecuadas de fosfolípidos incluyen, pero sin limitación, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas y fosfatidilgliceroles, y algunos fosfolípidos útiles se enumeran en la Tabla 1. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, pero sin limitación, dioleoil trimetilamonio propano (DOTAP), 1,2-diesteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DSDMA), 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DODMA), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLenDMA). Los lípidos zwitteriónicos incluyen, pero sin limitación, lípidos zwitteriónicos de acilo y lípidos zwitteriónicos de éter. Ejemplos de lípidos zwitteriónicos útiles son DPPC, DOPC y dodecilfosfocolina. Los lípidos pueden ser saturados o insaturados. Resulta preferente el uso de, al menos, un lípido insaturado para la preparación de liposomas. Si un lípido insaturado presenta dos colas, ambas colas pueden ser insaturadas o puede presentar una cola saturada y una cola insaturada.

Las partículas liposomales de la divulgación se pueden formar a partir de un solo lípido o a partir de una mezcla de lípidos, con la condición de que se utilice al menos un lípido catiónico. Cuando se utiliza una mezcla, esta puede comprender lípidos tanto saturados como insaturados. Por ejemplo, una mezcla útil con respecto a la divulgación puede comprender DlinDMA (catiónico, insaturado), DSPC (zwitteriónico, saturado) y/o DMG (aniónico, saturado). Cuando se utiliza una mezcla de lípidos, no todos los lípidos componentes de la mezcla se deben cargar, p. ej., uno o más lípidos anfifílicos, incluido un lípido catiónico, se puede mezclar con colesterol.

Las partículas liposomales de la divulgación incluyen al menos un lípido catiónico cuyo grupo principal incluye al menos un átomo de nitrógeno que es capaz de protonarse. El número de estos átomos de nitrógeno lipídico que se pueden protonar en el liposoma contribuyen a la “relación N:P” que se utiliza en la presente memoria.

Los lípidos catiónicos de la invención presentan un nitrógeno protonable con un pKa que se encuentra en el intervalo de 5,0 a 7,6. El lípido con un pKa en este intervalo presenta una amina terciaria; tales lípidos se comportan de manera diferente con respecto a los lípidos tales como DOTAP o DC-Chol, que presentan un grupo amina cuaternaria. A pH fisiológico, las aminas con un pKa en el intervalo de 5,0 a 7,6 presentan carga superficial neutral o reducida, mientras que un lípido tal como DOTAP es fuertemente catiónico. Los inventores han descubierto que los liposomas que se forman a partir de lípidos de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) resultan menos adecuados para el suministro de ARN que codifica inmunógenos en comparación con los liposomas que se forman a partir de lípidos de amina terciaria (p. ej., DLinDMA).

En este intervalo de pKa, los lípidos preferentes presentan un pKa de 5,5 a 6,7, p. ej., entre 5,6 y 6,8, entre 5,6 y 6,3, entre 5,6 y 6,0, entre 5,5 y 6,2 o entre 5,7 y 5,9. El pKa es el pH al cual el 50 % de los lípidos se encuentran cargados, a medio camino entre el punto donde los lípidos se encuentran completamente cargados y el punto donde los lípidos se encuentran completamente descargados. Se puede medir de diversas maneras pero se mide preferentemente mediante el uso de un procedimiento que se describe a continuación en la sección denominada “medición de pKa”. Comúnmente, el pKa se debe medir para el lípido individual en lugar de para el lípido en el contexto de una mezcla que incluye, además, otros lípidos (p. ej., no como se realiza en la referencia 5, donde parece que se tratara del pKa de un SNALP en lugar de aquel de los lípidos individuales).

Los lípidos preferentes con un pKa en este intervalo presentan una amina terciaria. Por ejemplo, estos pueden comprender 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA; pKa 5,8) y/o 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLenDMA). Otro lípido adecuado que presenta una amina terciaria es 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DODMA). Véase referencia 1. Se pueden utilizar, además, algunos de los lípidos de aminoácidos de la referencia 2, al igual que determinados lípidos de aminoácidos de la referencia 3. En la referencia 4 se divulgan otros lípidos útiles con aminas terciarias en sus grupos principales.

La porción hidrófila de un lípido se puede PEGilar (es decir, se puede modificar mediante unión covalente de un polietilenglicol). Esta modificación puede aumentar la estabilidad y evitar la adsorción no específica de los liposomas. Por ejemplo, los lípidos se pueden conjugar con PEG mediante el uso de técnicas tales como aquellas que se divulgan en la referencia 1 y 5. Se pueden utilizar diversas longitudes de PEG, p. ej., entre 0,5 y 8 kDa.

Cuando se forma un liposoma a partir de una mezcla de lípidos, resulta preferente que la proporción de aquellos lípidos que presentan un nitrógeno protonable se encuentre entre el 20 % y el 80 % de la cantidad total de lípidos, p. ej., entre el 30 %-70 % o entre el 40 %-60 %. El resto del contenido de lípidos se puede elaborar a partir de p. ej., colesterol (p. ej., 35 %-50 % de colesterol) y/o DMG (de manera opcional, PEGilado) y/o DSPC. Tales mezclas se utilizan a continuación. Estos valores de % son porcentajes en moles. En los ejemplos, se utiliza una mezcla de DSPC, DlinDMA, PEG-DMG y colesterol.

Las partículas liposomales se dividen normalmente en tres grupos: vesículas multilaminares (MLV); vesículas unilaminares pequeñas (SUV); y vesículas unilaminares grandes (LUV). Las MLV presentan múltiples bicapas en cada vesícula, formando varios compartimentos acuosos individuales. Las SUV y las LUV presentan una sola bicapa que encapsula un núcleo acuoso; las SUV presentan comúnmente un diámetro de <50 nm, y las LUV presentan un diámetro de >50 nm. Las partículas liposomales de la divulgación son, de manera ideal, LUV con un diámetro en el intervalo de 50 nm a 220 nm. Para una composición que comprende una población de LUV con diferentes diámetros: (i) al menos el 80 % en número debe presentar diámetros en el intervalo de 20 nm a 220 nm, (ii) el diámetro promedio (Zav, en intensidad) de la población se encuentra, de manera ideal, en el intervalo de 40 nm a 200 nm y/o (iii) los diámetros deben presentar un índice de polidispersidad <0,2.

En la presente memoria, el lípido DLinDMA se denomina, a veces, RV01; este es un lípido catiónico preferente para su uso con la divulgación, aunque en algunas divulgaciones los liposomas no comprenden DLinDMA:

Otro lípido útil, que se divulga en la referencia 4, se denomina, a veces, en la presente memoria, RV05:

El lípido DOTAP se denomina, a veces, en la presente memoria, RV13, pero no es un lípido preferente.

Procedimiento de mezcla

Las técnicas para preparar liposomas adecuados se conocen bien en la técnica, p. ej., véanse las referencias 6 a 8. Un procedimiento útil se describe en la referencia 9 e incluye la mezcla de (i) una solución etanólica de los lípidos (ii) una solución acuosa del ácido nucleico y (iii) un tampón, continuando con la mezcla, la puesta en equilibrio, la dilución y la purificación. Los liposomas preferentes de la divulgación se pueden obtener mediante este procedimiento de mezcla.

Un procedimiento útil de preparación de un liposoma que contiene ARN comprende las etapas de: (a) mezclar ARN con un lípido a un pH que se encuentra por debajo del pKa del lípido pero por encima de 4,5; luego (b) aumentar el pH para que se encuentre por encima del pKa del lípido. De este modo, un lípido catiónico se carga positivamente durante la formación de liposomas en la etapa (a), pero el cambio de pH a partir de entonces significa que la mayoría (o la totalidad) de los grupos cargados positivamente se vuelven neutrales. Este procedimiento resulta ventajoso para la preparación de los liposomas de la divulgación, y, al evitar un pH por debajo de 4,5 durante la etapa (a), se mejora la estabilidad del ARN encapsulado.

El pH en la etapa (a) se encuentra por encima de 4,5 y, de manera ideal, por encima de 4,8. Mediante el uso de un pH en el intervalo de 5,0 a 6,0 o en el intervalo de 5,0 a 5,5, se pueden proporcionar liposomas adecuados.

El pH aumentado en la etapa (b) se encuentra por encima del pKa del lípido. El pH se aumenta de manera ideal a un pH inferior a 9, y, preferentemente, inferior a 8. En base al pKa del lípido, el pH en la etapa (b) se puede incrementar de este modo para encontrarse en el intervalo de 6 a 8, p. ej., a pH 6,5 ± 0,3. El aumento de pH de la etapa (b) se puede lograr transfiriendo los liposomas a un tampón adecuado, p. ej., en solución salina con tampón de fosfato. El aumento de pH de la etapa (b) se realiza, de manera ideal, después de que haya ocurrido la formación de liposomas.

El ARN que se utiliza en la etapa (a) se puede encontrar en solución acuosa, para mezclarse con una solución orgánica del lípido (p. ej., una solución etanólica, como en la referencia 9). Luego, la mezcla se puede diluir para formar liposomas, después de lo cual se puede aumentar el pH en la etapa (b).

El ARN

Los liposomas de la divulgación incluyen una molécula de ARN que (a diferencia del ARNip) codifica un inmunógeno. Después de la administración in vivo de los liposomas, el ARN se libera y se traduce dentro de una célula para proporcionar el inmunógeno in situ.

El ARN es de cadena , por lo que se puede traducir sin la necesidad de ninguna de las etapas de replicación de intervención, tal como transcripción inversa. Los ARN de cadena preferentes son autorreplicantes, a diferencia de la referencia 10. Una molécula de ARN autorreplicante (replicón) puede conducir, cuando se suministra a una célula incluso sin proteínas, a la producción de múltiples ARN hijos mediante transcripción de sí mismo (mediante una copia antisentido que se genera de sí mismo). De este modo, una molécula de ARN autorreplicante consiste comúnmente en una molécula de cadena que se puede traducir de manera directa después del suministro a una célula, y esta traducción proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN que produce luego transcritos tanto antisentido como en sentido a partir del ARN suministrado. De este modo, el ARN suministrado conduce a la producción de múltiples ARN hijos. Estos ARN hijos, así como los transcritos subgenómicos colineales, se pueden traducir por sí mismos para proporcionar la expresión in situ de un inmunógeno codificado, o se pueden transcribir para proporcionar transcritos adicionales con el mismo sentido con respecto al ARN suministrado que se traducen para proporcionar la expresión in situ del inmunógeno. Los resultados completos de esta secuencia de transcripciones consisten en una gran amplificación del número de los ARN de replicón introducidos y, de esta manera, el inmunógeno codificado se convierte en un producto de polipéptido principal de las células.

Un sistema adecuado para lograr la autorreplicación de esta manera consiste en el uso de un replicón en base a un alfavirus. Estos replicones son ARN de cadena que conducen a la traducción de una replicasa (o replicasatranscriptasa) después del suministro a una célula. La replicasa se traduce como una poliproteína que se escinde de manera automática para proporcionar un complejo de replicación que crea copias de cadena - genómica del ARN suministrado de cadena . Estos transcritos de cadena - se pueden transcribir por sí mismos para proporcionar copias adicionales del ARN parental de cadena y para proporcionar, además, un transcrito subgenómico que codifica el inmunógeno. La traducción del transcrito subgenómico conduce, de este modo, a la expresión in situ del inmunógeno por la célula infectada. Los replicones de alfavirus adecuados pueden usar una replicasa de un virus Sindbis, un virus del bosque de Semliki, un virus de encefalitis equina del este, un virus de encefalitis equina de Venezuela, etc. Se pueden utilizar secuencias de virus mutantes o de tipo salvaje, p. ej., el mutante TC83 atenuado de VEEV se ha utilizado en replicones [11].

Una molécula de ARN autorreplicante preferente codifica, de este modo, para (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir ARN de la molécula de ARN autorreplicante y (ii) un inmunógeno. La polimerasa puede ser una replicasa de alfavirus, p. ej., que comprende una o más de las proteínas de alfavirus nsP1, nsP2, nsP3 y nsP4.

Mientras que los genomas naturales de alfavirus codifican proteínas estructurales de virión de manera adicional a la poliproteína de replicasa no estructural, resulta preferente que las moléculas de ARN autorreplicantes de la divulgación no codifiquen para proteínas estructurales de alfavirus. De este modo, un ARN autorreplicante preferente puede conducir a la producción de copias de ARN genómico de sí mismo en una célula, pero no a la producción de viriones que contienen ARN. La falta de capacidad para producir estos viriones significa que, a diferencia de un alfavirus de tipo salvaje, la molécula de ARN autorreplicante no se puede perpetuar por sí misma de manera infecciosa. Las proteínas estructurales de alfavirus que son necesarias para la perpetuación en virus de tipo salvaje se encuentran ausentes de los ARN autorreplicantes de la divulgación y, en su lugar, se encuentran los genes que codifican inmunógeno de interés, de manera tal que el transcrito subgenómico codifica para el inmunógeno en lugar de las proteínas estructurales de virión de alfavirus.

De este modo, una molécula de ARN autorreplicante útil con la divulgación puede presentar dos marcos de lectura abierta. El primero marco de lectura abierta (5') codifica para una replicasa; el segundo marco de lectura abierta (3') codifica para un inmunógeno. En algunas divulgaciones, el ARN puede presentar marcos de lectura abierta adicionales (p. ej., en dirección 3'), p. ej., para codificar inmunógenos adicionales (véase a continuación) o para codificar polipéptidos auxiliares.

Una molécula de ARN autorreplicante preferente presenta una caperuza 5' (p. ej., un 7-metilguanosina). Esta caperuza puede mejorar la traducción in vivo del ARN. En algunas divulgaciones, se debe seleccionar la secuencia 5' de la molécula de ARN autorreplicante para asegurar la compatibilidad con la replicasa codificada.

Una molécula de ARN autorreplicante puede presentar una cola 3'-poli-A. Además, puede incluir una secuencia de reconocimiento de poli-A-polimerasa (p. ej., AAUAAA) cerca de su extremo 3'.

Las moléculas de ARN autorreplicantes pueden presentar diversas longitudes, pero presentan comúnmente una longitud de 5000 a 25000 nucleótidos, p. ej., 8000 a 15000 nucleótidos o 9000 a 12000 nucleótidos. De este modo, el ARN es más largo que el que se observa en el suministro de ARNip.

Las moléculas de ARN autorreplicantes son comúnmente monocatenarias. Los ARN monocatenarios pueden desencadenar, de manera general, un efecto adyuvante mediante la unión a TLR7, TLR8, ARN-helicasas y/o PKR. El ARN suministrado en forma bicatenaria (ARNbc) se puede unir a TLR3, y este receptor se puede activar por ARNbc que se forma ya sea durante la replicación de un ARN monocatenario o en la estructura secundaria de un ARN monocatenario.

El ARN autorreplicante se puede preparar de manera conveniente mediante transcripción in vitro (IVT). La IVT puede utilizar un molde (ADNc) que se crea y se propaga en forma de plásmido en bacterias o que se crea de manera sintética (por ejemplo, mediante síntesis génica y/o procedimientos de ingeniería de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)). Por ejemplo, una ARN polimerasa dependiente de ADN (tal como las ARN polimerasas del bacteriófago T7, T3 o SP6) se puede utilizar para transcribir el ARN autorreplicante a partir de un molde de ADN. Se pueden utilizar reacciones de adición de caperuza y de poli-A adecuadas según sea necesario (aunque la poli-A del replicón se codifica normalmente en el molde de a Dn ). Estas ARN polimerasas pueden presentar requisitos estrictos para los nucleótidos transcritos en 5' y, en algunas divulgaciones, estos requisitos deben coincidir con los requisitos de la replicasa codificada para asegurar que el ARN transcrito con IVT pueda funcionar de manera eficaz como sustrato para su replicasa autocodificada.

Como se analizó en la referencia 12, el ARN autorreplicante puede incluir (de manera adicional a cualquier estructura de caperuza en 5') uno o más nucleótidos que presentan una base nitrogenada modificada. Por ejemplo, un ARN autorreplicante puede incluir una o más bases nitrogenadas modificadas de pirimidina, tal como residuos de pseudouridina y/o 5-metilcitosina. En algunas divulgaciones, sin embargo, el ARN no incluye bases nitrogenadas modificadas y puede no incluir nucleótidos modificados, es decir, todos los nucleótidos en el ARN son ribonucleótidos A, C, G y U convencionales (a excepción de cualquier estructura de caperuza en 5', que puede incluir un 7'-metilguanosina). En otras divulgaciones, el ARN puede incluir una caperuza en 5' que comprende un 7'-metilguanosina, y los primeros 1, 2 o 3 ribonucleótidos en 5' se pueden encontrar metilados en la posición 2' de la ribosa.

Un ARN que se utiliza con la divulgación incluye, de manera ideal, solo enlaces de fosfodiéster entre nucleósidos, pero, en algunas divulgaciones, puede contener enlaces fosforamidato, fosforotioato y/o metilfosfonato.

De manera ideal, un liposoma incluye menos de 10 especies diferentes de ARN, p. ej., 5, 4, 3 o 2 especies diferentes; más preferentemente, un liposoma incluye una especie de ARN individual, es decir, todas las moléculas de ARN en el liposoma presentan la misma secuencia y la misma longitud.

La relación N:P

La divulgación utiliza liposomas que se preparan para presentar una relación N:P de entre 1:1 y 20:1. Como se menciona anteriormente, la “relación N:P” se refiere a la relación molar de átomos de nitrógeno protonables en los lípidos catiónicos del liposoma (comúnmente, de manera única, en el grupo principal de lípidos) con respecto a los fosfatos en el ARN.

La relación N:P de la invención es de 4:1 a 16:1, en la que la relación N:P no se encuentra entre 7:1 y 9:1.

Las relaciones N:P de la divulgación incluyen relaciones de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 18:1, de aproximadamente 4:1 a 16:1, de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 14:1, de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 12:1. Las relaciones N:P de la divulgación se encuentran entre 3:1 y 11:1. Las relaciones N:P útiles como se ejemplifican a continuación incluyen 2:1, 4:1, 8:1 y 10:1.

Como se muestra a continuación, la relación N:P puede presentar un impacto en la inmunogenicidad, siendo incluidas relaciones inferiores, p. ej., inferiora 8:1, inferior a 7:1, inferiora 6:1, inferior a 5:1 o <4:1, p. ej., entre 2:1 y 4:1 inclusive.

En algunas divulgaciones, la relación N:P no se encuentra entre 7:1 y 9:1. En algunas divulgaciones, la relación N:P no se encuentra entre 7,5:1 y 8,5:1. En algunas divulgaciones, la relación N:P no es 8:1.

La relación N:P se puede modificar mediante la variación de las proporciones de lípido catiónico y ARN durante la formación de liposomas. Esto se logra de la manera más conveniente mediante la modificación de la concentración de ARN en el material acuoso que se utiliza durante la formación de liposomas a partir de una combinación adecuada de componentes formadores de liposomas. Por ejemplo, en el procedimiento que se menciona anteriormente, la solución etanólica de lípidos formadores de liposomas se puede mantener constante mientras que la concentración de ARN en la solución acuosa se varía. Una mayor concentración de ARN reducirá la relación N:P, mientras que una concentración inferior de ARN aumentará la relación N:P.

Para determinados propósitos, la relación N:P se puede basar en supuestos. Por ejemplo, si se supone que |jg de una molécula de ARN contiene 3 nmol de fosfato aniónico, y se supone que cada jg de DlinDMA contiene 1,6 nmol de nitrógeno catiónico, el cálculo se puede simplificar por conveniencia.

El inmunógeno

Las moléculas de ARN que se utilizan con la divulgación codifican un inmunógeno de polipéptido. Después de la administración de los liposomas, el inmunógeno se traduce in vivo y puede provocar una respuesta inmune en el receptor. El inmunógeno puede provocar una respuesta inmune contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito (o, en algunas divulgaciones, contra un alérgeno; y en otras divulgaciones, contra un antígeno tumoral). La respuesta inmune puede comprender una respuesta de anticuerpos (que incluye, normalmente, IgG) y/o una respuesta inmune mediada por células. El inmunógeno de polipéptido provocará comúnmente una respuesta inmune que reconoce el polipéptido bacteriano, viral, fúngico o parasitario (o alérgeno o tumor) correspondiente, pero, en algunas divulgaciones, el polipéptido puede actuar como un mimotopo para provocar una respuesta inmune que reconoce un sacárido bacteriano, viral, fúngico o parasitario. El inmunógeno será comúnmente un polipéptido de superficie, p. ej., una adhesina, una hemaglutinina, una glicoproteína de envoltura, una glicoproteína espicular, etc.

Las moléculas de ARN pueden codificar un inmunógeno de polipéptido individual o múltiples polipéptidos. Se pueden presentar múltiples inmunógenos como un inmunógeno de polipéptido individual (polipéptido de fusión) o como polipéptidos separados. Si los inmunógenos se expresan como polipéptidos separados, entonces uno o más de estos se pueden proporcionar con un IRES en dirección 5' o un elemento promotor de virus adicional. De manera alternativa, se pueden expresar múltiples inmunógenos a partir de una poliproteína que codifica inmunógenos individuales fusionados con una proteasa autocatalítica corta (p. ej., proteína 2A del virus de la fiebre aftosa), o como inteínas.

El ARN codifica un inmunógeno. Para evitar dudas, la divulgación no incluye el ARN que codifica una luciferasa de luciérnaga o que codifica una proteína de fusión de la p-galactosidasa de E. coli o que codifica una proteína verde fluorescente (GFP). Además, el ARN no es ARN del timo de ratón total. Además, la divulgación no incluye ARN que codifica una fosfatasa alcalina secretada.

En algunas divulgaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra una de estas bacterias:

Neisseria meningitidis: inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, proteínas de membrana tales como adhesinas, autotransportadoras, toxinas, proteínas de adquisición de hierro y proteína de unión a factor H. Una combinación de tres polipéptidos útiles se describe en la referencia 13.

Streptococcus pneumoniae: en la referencia 14 se divulgan inmunógenos de polipéptido útiles. Estos incluyen, pero sin limitación, la subunidad RrgB pilus, el precursor beta-N-acetil-hexosaminidasa (spr0057), spr0096, proteína de estrés general GSP-781 (spr2021, SP2216), serina/treonina-cinasa StkP (SP1732) y adhesina de superficie neumocócica PsaA.

Streptococcus pyogenes: los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, los polipéptidos que se divulgan en las referencias 15 y 16.

Moraxella catarrhalis.

Bordetella pertussis: los inmunógenos de pertussis útiles incluyen, pero sin limitación, toxina otoxoide de pertussis (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA), pertactina y aglutinógenos 2 y 3.

Staphylococcus aureus: los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, los polipéptidos que se divulgan en la referencia 17, tales como hemolisina, esxA, esxB, proteína de unión a ferricromo (sta006) y/o la lipoproteína sta011. Clostridium tetani: el inmunógeno común es toxoide tetánico.

Cornynebacterium diphtheriae: el inmunógeno común es toxoide diftérico.

Haemophilus influenzae: los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, los polipéptidos que se divulgan en las referencias 18 y 19.

Pseudomonas aeruginosa

Streptococcus agalactiae: los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, los polipéptidos que se divulgan en la referencia 15.

Chlamydia trachomatis: los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, OmpHlike, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrAy MurG (p. ej., como se divulga en la referencia 20. LcrE [21] y HtrA [22] son dos inmunógenos preferentes.

Chlamydia pneumoniae: los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, los polipéptidos que se describen en la referencia 23.

Helicobacter pylori: los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, CagA, VacA, NAP y/o ureasa [24].

Escherichia coli: los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, inmunógenos derivados de E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteroagregativa (EAggEC), E. coli difusamente adherente (DAEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli patógena extraintestinal (ExPEC) y/o E. coli enterohemorrágica (EHEC). Las cepas ExPEC incluyen E. coli uropatógena (UPEC) y E. coli relacionada con meningitis/sepsis (MNEC). Los inmunógenos de polipéptido UPEC útiles se describen en las referencias 25 y 26. Los inmunógenos de MNEC útiles se describen en la referencia 27. Un inmunógeno útil para varios tipos de E. coli es AcfD [28].

Bacillus Anthracis

Yersinia pestis: Los inmunógenos útiles incluyen, pero sin limitación, aquellos que se describen en las referencias 29 y 30.

Staphylococcus epidermis

Clostridium perfringens o Clostridium botulinums

Legionella pneumophila

Coxiella burnetii

Brucella, tal como B.abortus, B.canis, B.melitensis, B.neotomae, B.ovis, B.suis, B.pinnipediae.

Francisella, tal como F. novicida, F. philomiragia, F. tularensis.

Neisseria gonorrhoeae

Treponema pallidum

Haemophilus ducreyi

Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium

Staphylococcus saprophyticus

Yersinia enterocolitica

Mycobacterium tuberculosis

Rickettsia

Listeria monocytogenes

Vibrio cholerae

Salmonella typhi

Borrelia burgdorferi

Porphyromonas gingivalis

Klebsiella

En algunas divulgaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra uno de estos virus:

Ortomixovirus: los inmunógenos útiles pueden provenir de un virus de la influenza A, B o C, tal como las proteínas de hemaglutinina, neuraminidasa o matriz M2. Cuando el inmunógeno es una hemaglutinina del virus de la gripe A, puede ser de cualquier subtipo, p. ej., H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16.

Virus de Paramyxoviridae: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, los derivados de pneumovirus (p. ej., virus sincitial respiratorio, RSV), rubulavirus (p. ej., virus de las paperas), paramixovirus (p. ej., virus de la parainfluenza), metaneumovirus y morbillivirus (p. ej., virus del sarampión). Sin embargo, en algunas divulgaciones, el inmunógeno no es una proteína de RSV.

Poxviridae: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos que derivan de Orthopoxvirus tales como Variola vera, incluyendo, pero sin limitación, Variola major y Variola minor.

Picornavirus: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados de picornavirus, tales como los enterovirus, los rinovirus, los heparnavirus, los cardiovirus y los aftovirus. En una divulgación, el enterovirus es un poliovirus, p. ej., un poliovirus tipo 1, tipo 2 y/o tipo 3. En otra divulgación, el enterovirus es un enterovirus EV71. En otra divulgación, el enterovirus es un virus de coxsackie A o B.

Bunyavirus: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados de un Orthobunyavirus, tales como el virus de la encefalitis de California, un flebovirus, tal como el virus de la fiebre del Valle del Rift, o un nairovirus, tal como el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo.

Heparnavirus: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados de un heparnavirus, tal como el virus de la hepatitis A (VHA).

Filovirus: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados de un filovirus, tal como un virus del Ébola (incluidos un virus del ébola de Zaire, Costa de Marfil, Reston o Sudán) o un virus de Marburgo.

Togavirus: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados de un togavirus, tales como un rubivirus, un alfavirus o un arterivirus. Esto incluye el virus de la rubéola.

Flavivirus: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados de un flavivirus, tales como el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), el virus del dengue (tipos 1, 2, 3 o 4), el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa, el virus del bosque de Kyasanur, el virus de la encefalitis del Nilo occidental, el virus de la encefalitis de St. Louis, el virus de la encefalitis de primavera-verano ruso, el virus de la encefalitis de Powassan.

Pestivirus: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados de un pestivirus, tales como la diarrea viral bovina (BVDV), la fiebre porcina clásica (CSFV) o la enfermedad de frontera (BDV).

Hepadnavirus: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados de un hepadnavirus, tales como el virus de la hepatitis B. Una composición puede incluir el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg).

Otros virus de hepatitis: una composición puede incluir un inmunógeno de un virus de la hepatitis C, un virus de la hepatitis delta, un virus de la hepatitis E o un virus de la hepatitis G.

Rhabdovirus: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados de un rabdovirus, tales como un lyssavirus (p. ej., un virus de la rabia) y vesiculovirus (VSV).

Caliciviridae: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados de Calciviridae, tales como el virus Norwalk (norovirus) y virus similares a Norwalk, tales como el virus Hawaii y el virus de montaña de nieve.

Coronavirus: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados de un coronavirus SARS, bronquitis infecciosa aviar (IBV), virus de la hepatitis del ratón (MHV) y el virus de la gastroenteritis transmisible porcina (TGEV). El inmunógeno de coronavirus puede ser un polipéptido espicular.

Retrovirus: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados de un oncovirus, un lentivirus (p. ej., VIH-1 o VIH-2) o un espumavirus.

Reovirus: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados de un ortoreovirus, un rotavirus, un orbivirus o un coltivirus.

Parvovirus: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados del parvovirus B19.

Herpesvirus: los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados de un herpesvirus humano, tales como, sólo a modo ejemplar, virus del herpes simple (HSV) (p. ej., HSV tipos 1 y 2), virus de la varicela-zóster (VZV), virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), herpesvirus 6 humano (HHV6), herpesvirus 7 humano (HHV7) y herpesvirus 8 humano (Hh V8).

Papovavirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero sin limitación, aquellos derivados de papilomavirus y poliomavirus. El virus del papiloma (humano) puede ser del serotipo 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 o 65, p. ej., de uno o más de los serotipos 6, 11, 16 y/o 18.

Adenovirus: los inmunógenos virales incluyen aquellos derivados del serotipo 36 de adenovirus (Ad-36).

En algunas divulgaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra un virus que infecta a los peces, tal como: virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV), virus de la enfermedad pancreática del salmón (SPDV), virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), virus del bagre de canal (CCV), virus de la enfermedad de linfocistis de los peces (FLDV), virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), herpesvirus de koi, virus similar al picorna del salmón (que se conoce también como virus similar al picorna del salmón atlántico), virus del salmón de lago (LSV), rotavirus del salmón atlántico (ASR), virus de la enfermedad de la fresa de la trucha (TSD), virus del tumor del salmón coho (CSTV) o virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV).

Los inmunógenos fúngicos se pueden derivar de dermatofitos, que incluyen: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporumtortum, Microsporum equinum, Microsporum yeso, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceurn y/o Trichophyton faviforme; o de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolasa, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis y Enterocytozoon bieneusi; las menos comunes son Brachiola spp., Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp., Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp., Mucor spp., Absidia spp., Mortierella spp., Cunninghamella spp., Saksenaea spp., Alternaria spp., Curvularia spp., Helminthosporium spp., Fusarium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Monolinia spp., Rhizoctonia spp., Paecilomyces spp., Pithomyces spp., y Cladosporium spp.

En algunas divulgaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra un parásito del género Plasmodium, tal como P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale. De este modo, la divulgación se puede utilizar para inmunizar contra la malaria. En algunas divulgaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra un parásito de la familia Caligidae, particularmente, aquellos virus de los géneros Lepeophtheirus y Caligus, p. ej., piojos de mar tales como Lepeophtheirus salmonis o Caligus rogercresseyi.

En algunas divulgaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra: alérgenos de polen (alérgenos de polen de árbol, hierba, maleza y pasto); alérgenos de insectos o arácnidos (alérgenos inhalantes, de saliva y veneno, p, ej., alérgenos de ácaro, alérgenos de cucaracha y mosquito, alérgenos de veneno de himenóptera); alérgenos de caspa y pelo animal (p. ej., de perro, gato, caballo, rata, ratón, etc.); y alérgenos de alimento (p. ej., una gliadina). Alérgenos importantes de polen de árboles, pastos y hierbas se originan como tales de los órdenes taxonómicos de Fagales, Oleales, Pinales y Platanaceae, incluidos, pero sin limitación, abedul (Betula), aliso (Alnus), avellano (Corylus), carpe (Carpinus) y olivo (Olea), cedro (Cryptomeria y Juniperus), plátano (Platanus), el orden de Poales, incluidas los pastos de los géneros Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale y Sorghum, los órdenes de Asterales y Urticales, incluidas las hierbas de los géneros Ambrosia, Artemisia y Parietaria. Otros alérgenos inhalantes importantes son aquellos de ácaros del polvo doméstico del género Dermatophagoides y Euroglyphus, ácaros de almacenamiento, p. ej., Lepidoglyphys, Glycyphagus y Tyrophagus, aquellos de cucarachas, mosquitos y pulgas, p. ej., Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocepphalides, y aquellos de mamíferos tales como gatos, perros y caballos, los alérgenos de veneno, incluidos los que se original como tales a partir de insectos que pican o muerden, tales como aquellos del orden taxonómico de Himenóptera, incluidas las abejas (Apidae), las avispas (Vespidea) y las hormigas (Formicoidae).

En algunas divulgaciones, el inmunógeno es un antígeno tumoral que se selecciona a partir de: (a) antígenos de cáncer de testículo tales como NYESO-1, SSX2, SCP1 así como los polipéptidos de la familia RAGE, BAGE, GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 y MAGE-12 (que se pueden utilizar, por ejemplo, para dirigirse a melanomas, tumores de pulmón, cabeza y cuello, NSCLC, tumores de mama, gastrointestinales y de vejiga; (b) antígenos mutados, por ejemplo, p53 (que se relacionan con diversos tumores sólidos, p. ej., cáncer colorrectal, de pulmón, cabeza y cuello), p21/Ras (que se relaciona con, p. ej., melanoma, cáncer de páncreas y cáncer colorrectal), CDK4 (que se relaciona con, p. ej., melanoma), MUM1 (que se relaciona con, p. ej., melanoma), caspasa-8 (que se relaciona con, p. ej., cáncer de cabeza y cuello), CIA 0205 (que se relaciona con, p. ej., cáncer de vejiga), HLA-A2-R1701, beta catenina (que se relaciona con, p. ej., melanoma), TCR (que se relaciona con, p. ej., linfoma no Hodgkin de células T), BCR-abl (que se relaciona con, p. ej., leucemia mielógena crónica), triosafosfato isomerasa, KIA 0205, CDC-27 y LDLR-FUT; (c) antígenos sobreexpresados, por ejemplo, galectina 4 (que se relaciona con, p. ej., cáncer colorrectal), galectina 9 (que se relaciona con, p. ej., enfermedad de Hodgkin), proteinasa 3 (que se relaciona con, p. ej., leucemia mielógena crónica), WT 1 (que se relaciona con, p. ej., diversas leucemias), anhidrasa carbónica (que se relaciona con, p. ej., cáncer renal), aldolasa A (que se relaciona con, p. ej., cáncer de pulmón), PRAME (que se relaciona con, p. ej., melanoma), HER-2/neu (que se relaciona con, p. ej., cáncer de mama, colon, pulmón y ovario), mamaglobina, alfa-fetoproteína (que se relaciona con, p. ej., hepatoma), KSA (que se relaciona con, p. ej., cáncer colorrectal), gastrina (que se relaciona con, p. ej., cáncer gástrico y pancreático), proteína catalítica de telomerasa, MUC-1 (que se relaciona con, p. ej., cáncer de mama y de ovario), G-250 (que se relaciona con, p. ej., cáncer de células renales), p53 (que se relaciona con, p. ej., cáncer de mama, colon) y antígeno carcinoembrionario (que se relaciona con, p. ej., cáncer de mama, cáncer de pulmón y cánceres del tracto gastrointestinal tales como cáncer colorrectal); (d) antígenos en común, por ejemplo, antígenos de diferenciación de melanoma-melanocito, tales como MART-1/Melan A, gp100, MC1R, receptor de hormona estimuladora de melanocitos, tirosinasa, proteína-1 relacionada con tirosinasa/TRP1 y proteina-2 relacionada con tirosinasa/TRP2 (que se relaciona con, p. ej., melanoma); (e) antígenos relacionados con la próstata tales como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, que se relacionan con, p. ej., con cáncer de próstata; (f) idiotipos de inmunoglobulina (que se relacionan con mieloma y linfomas de células B, por ejemplo). En determinadas divulgaciones, los inmunógenos tumorales incluyen, pero sin limitación, p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYLRAR, antígenos del virus de Epstein Barr, EBNA, antígenos del virus del papiloma humano (HPV), incluidos E6 y E7, antígenos del virus de la hepatitis B y C, antígenos del virus linfotrópico de células T humanas, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2/proteína relacionada con ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS y similares.

Composiciones farmacéuticas

Los liposomas de la divulgación resultan útiles como componentes en composiciones farmacéuticas para inmunizar sujetos contra diversas enfermedades. Estas composiciones incluirán comúnmente un vehículo farmacéuticamente aceptable además de los liposomas. En la referencia 31 se encuentra disponible un análisis detallado de los vehículos farmacéuticamente aceptables.

Una composición farmacéutica de la divulgación puede incluir uno o más inmunopotenciadores de molécula pequeña. Por ejemplo, la composición puede incluir un agonista de TLR2 (p. ej., Pam3CSK4), un agonista de TLR4 (p. ej., un fosfato de aminoalquil glucosaminida, tal como E6020), un agonista de TLR7 (p. ej., imiquimod), un agonista de TLR8 (p. ej., resiquimod) y/o un agonista de TLR9 (p. ej., IC31). Cualquier agonista como tal presenta, de manera ideal, un peso molecular de <2000 Da. En algunas divulgaciones, tales agonistas se encuentran además encapsulados en el liposoma (p. ej., junto con el ARN), pero en otras divulgaciones no se encuentran encapsulados.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden incluir las partículas en agua corriente (p. ej., w.f.i.) o en un tampón p. ej., un tampón de fosfato, un tampón de Tris, un tampón de borato, un tampón de succinato, un tampón de histidina o un tampón de citrato. Las sales de tampón se incluirán comúnmente en el intervalo de 5 mM a 20 mM.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden presentar un pH entre 5,0 y 9,5, p. ej., entre 6,0 y 8,0.

Las composiciones de la divulgación pueden incluir sales de sodio (p. ej., cloruro de sodio) para suministrar tonicidad. Una concentración de 10 ± 2 mg/ml de NaCl es común, p. ej., de aproximadamente 9 mg/ml.

Las composiciones de la divulgación pueden incluir quelantes de iones metálicos. Estos pueden prolongar la estabilidad del ARN mediante el retiro de iones que pueden acelerar la hidrólisis del fosfodiéster. De este modo, una composición puede incluir uno o más de EDTA, EGTA, BAPTA, ácido pentético, etc. Tales quelantes se presentan comúnmente a una concentración de 10 pM a 500 pM, p. ej., 0,1 mM. Una sal de citrato, tal como citrato de sodio, puede actuar además como un quelante, mientras que proporciona también, de manera ventajosa, actividad como tampón.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden presentar una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, p. ej., entre 240 a 360 mOsm/kg o entre 290 a 3 l0 mOsm/kg.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden incluir uno o más conservantes, tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. Son preferentes las composiciones sin mercurio y se pueden preparar vacunas sin conservantes.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación son preferentemente estériles.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación son preferentemente no pirogénicas, p. ej., que contienen <1 EU (unidad de endotoxina, una medida convencional) por dosis, y preferentemente <0,1 EU por dosis.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación preferentemente no contienen gluten.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación se pueden preparar en forma de dosis unitaria. En algunas divulgaciones, una dosis unitaria puede presentar un volumen de entre 0,1 y 1,0 ml, p. ej., aproximadamente 0,5 ml.

Las composiciones se pueden preparar como inyectables, como soluciones o suspensiones. La composición se puede preparar para administración pulmonar, p. ej., mediante un inhalador, mediante el uso de un pulverizador de partículas finas. La composición se puede preparar para administración nasal, ótica u ocular, p. ej., como pulverizador o gotas. Los inyectables para administración intramuscular son comunes.

Las composiciones comprenden una cantidad de partículas eficaces desde el punto de vista inmunológico, así como cualquier otro componente, según sea necesario. La expresión “cantidad eficaz desde el punto de vista inmunológico”, se refiere a que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, resulta eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía en base a la salud y la condición física del individuo para tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo para tratar (p. ej., primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunológico del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección conveniente, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico a cargo del tratamiento en cuanto a la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad se encuentre en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar mediante ensayos de rutina. El contenido de partículas y ARN de las composiciones de la divulgación se expresará de manera general en términos de la cantidad de ARN por dosis. Una dosis preferente presenta <100 pg de ARN (p. ej., de 10 pg a 100 pg, tal como aproximadamente 10 pg, 25 pg, 50 pg, 75 pg o 100 pg), pero la expresión se puede ver incluso a niveles inferiores.

La divulgación proporciona, además, un dispositivo de suministro (p. ej., jeringa, nebulizador, pulverizador, inhalador, parche dérmico, etc.) que contiene una composición farmacéutica de la divulgación. Este dispositivo se puede utilizar para administrar la composición a un sujeto vertebrado.

Las partículas de la divulgación no incluyen ribosomas.

Procedimientos de tratamiento y usos médicos.

Los liposomas y las composiciones farmacéuticas de la divulgación son para un uso in vivo con el fin de provocar una respuesta inmune contra un inmunógeno de interés.

La divulgación proporciona un procedimiento de generación de una respuesta inmune en un vertebrado que comprende la etapa de administración de una cantidad eficaz de un liposoma o composición farmacéutica de la divulgación. La respuesta inmune resulta preferentemente protectora e implica preferentemente anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. El procedimiento puede generar una respuesta de refuerzo.

La divulgación proporciona, además, un liposoma o composición farmacéutica de la divulgación para su uso en un procedimiento de generación de una respuesta inmune en un vertebrado.

La divulgación proporciona, además, el uso de un liposoma de la divulgación en la fabricación de un medicamento para generar una respuesta inmune en un vertebrado.

Al generar una respuesta inmune en el vertebrado mediante estos usos y procedimientos, el vertebrado se puede proteger contra diversas enfermedades y/o infecciones, p. ej., contra enfermedades bacterianas y/o virales como se analizó anteriormente. Las partículas y las composiciones son inmunogénicas y más preferentemente son composiciones de vacuna. Las vacunas de acuerdo con la divulgación pueden ser profilácticas (es decir, para impedir una infección) o terapéuticas (es decir, para tratar una infección), pero serán comúnmente profilácticas.

El vertebrado es preferentemente un mamífero, tal como un ser humano o un mamífero veterinario (p. ej., animales pequeños, tales como perros o gatos; o animales grandes, tales como caballos, ganado, ciervos, cabras, cerdos); en algunas divulgaciones, el vertebrado no es un ratón o una rata algodonera o una vaca. Cuando la vacuna se destina a un uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (p. ej., un niño pequeño o un bebé) o un adolescente; cuando la vacuna se destina para un uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Además, se puede administrar una vacuna originalmente destinada a niños a adultos, p. ej., para evaluar la seguridad, la dosis, la inmunogenicidad, etc.

Las vacunas que se preparan de acuerdo con la divulgación se pueden usar para tratar tanto a niños como a adultos. De este modo, un paciente adulto puede tener menos de 1 año, menos de 5 años, 1 a 5 años, 5 a 15 años, 15 a 55 años o al menos 55 años. Los pacientes preferentes para recibir las vacunas son los ancianos (p. ej., >50 años, >60 años, y preferentemente >65 años), los jóvenes (p. ej., <5 años), pacientes hospitalizados, trabajadores de la salud, personal de las fuerzas armadas y la milicia, mujeres embarazadas, enfermos crónicos o pacientes inmunodeficientes. Sin embargo, las vacunas no resultan adecuadas únicamente para estos grupos y se pueden usar de manera más general en una población.

Las composiciones de la divulgación se administrarán de manera general directamente a un paciente. El suministro directo se puede realizar por inyección parenteral (p. ej., subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intradérmica o al espacio intersticial de un tejido). Las vías de suministro alternativas incluyen la administración rectal, oral (p. ej., comprimido, pulverizador), bucal, sublingual, vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, auditiva, pulmonar u a través de otra mucosa. La administración intradérmica e intramuscular son dos vías preferentes. La inyección se puede realizar mediante una aguja (p. ej. una aguja hipodérmica), pero se puede utilizar, de manera alternativa, una inyección sin aguja. Una dosis intramuscular común es de 0,5 ml.

La divulgación se puede utilizar para provocar inmunidad sistémica y/o de la mucosa, preferentemente para provocar una inmunidad sistémica y/o de la mucosa mejorada.

La dosis puede ser mediante una pauta de dosis individual o una pauta de múltiples dosis. Se pueden utilizar múltiples dosis en una pauta de inmunización primaria y/o en una pauta de inmunización de refuerzo. En una pauta de múltiples dosis, las diversas dosis pueden ser dadas por la misma vía o vías diferentes, p. ej., un cebador parenteral y un refuerzo de la mucosa, un cebador de la mucosa y un refuerzo parenteral, etc. Comúnmente, se administrarán múltiples dosis con al menos 1 semana de diferencia (p. ej., aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). En una divulgación, se pueden administrar múltiples dosis aproximadamente a las 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas después del nacimiento, p. ej., a la edad de 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas, como se utiliza frecuentemente en el Programa Ampliado de Inmunización de la Organización Mundial de la Salud (“EPI”). En una divulgación alternativa, se administran dos dosis primarias con aproximadamente dos meses de diferencia, p. ej., aproximadamente 7, 8 o 9 semanas de diferencia, continuando con una o más dosis de refuerzo aproximadamente de 6 meses a 1 año después de la segunda dosis primaria, p. ej., aproximadamente, 6, 8, 10 o 12 meses después de la segunda dosis primaria. En una divulgación adicional, se administran tres dosis primarias con aproximadamente dos meses de diferencia, p. ej., aproximadamente 7, 8 o 9 semanas de diferencia, continuando con una o más dosis de refuerzo que se aplican aproximadamente 6 meses a 1 año después de la tercera dosis primaria, p. ej., aproximadamente 6, 8, 10 o 12 meses después de la tercera dosis primaria.

General

La práctica de la presente divulgación empleará, a menos que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro del conocimiento de la técnica. Tales técnicas se explican de manera completa en la literatura. Véanse, p. ej., las referencias 32 a 38, etc.

El término “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consiste en”, p. ej., una composición “que comprende” X puede consistir en, de manera exclusiva, X o puede incluir algo adicional, p. ej., X Y.

El término “aproximadamente” con respecto a un valor numérico x es opcional y se refiere a, por ejemplo, x ± 10 %.

La expresión “de manera sustancial” no excluye “por completo”, p. ej., una composición que se encuentra “ libre de manera sustancial” de Y se puede encontrar libre por completo de Y. Cuando sea necesario, la expresión “de manera sustancial” se puede omitir de la definición de la divulgación.

Las referencias a la carga, los cationes, los aniones, los iones híbridos, etc., se consideran a pH 7.

TLR3 es el receptor 3 tipo Toll. Es un receptor individual de la membrana y que desempeña un papel clave en el sistema inmunitario innato. Los agonistas de TLR3 que se conocen incluyen poli(I:C). “TLR3” es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su ID HGNC único es HGNC: 11849. La secuencia RefSeq para el gen TLR3 humano es G i: 2459625.

TLR7 es el receptor 7 tipo Toll. Es un receptor individual que de la membrana y que desempeña un papel clave en el sistema inmunitario innato. Los agonistas de TLR7 que se conocen incluyen p. ej., imiquimod. “TLR7” es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su ID HGNC único es HGNC: 15631. La secuencia RefSeq para el gen TLR7 humano es GI: 67944638.

TLR8 es el receptor 8 tipo Toll. Es un receptor individual de la membrana y que desempeña un papel clave en el sistema inmunitario innato. Los agonistas de TLR8 que se conocen incluyen p. ej., resiquimod. “TLR8” es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su ID HGNC único es HGNC: 15632. La secuencia RefSeq para el gen TLR8 humano es Gl: 20302165.

La familia de receptores tipo RIG-I (“RLR”) incluye diversas ARN-helicasas que desempeñan funciones clave en el sistema inmunológico innato [39]. RLR-1 (que se conoce además como RIG-I o gen I inducible por ácido retinoico) presenta dos dominios de reclutamiento de caspasa próximos a su extremo N-terminal. El nombre HGNC aprobado para el gen que codifica la RLR-1-helicasa es “DDX58” (para el polipéptido 58 de la secuencia DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)) y el ID de HGNC único es HGNC: 19102. La secuencia RefSeq para el gen RLR-1 humano es Gl: 77732514. RLR-2 (que se conoce también como MDA5 o gen 5 asociado a la diferenciación de melanoma) presenta, además, dos dominios de reclutamiento de caspasa próximos a su extremo N-terminal. El nombre HGNC aprobado para el gen que codifica la RLR-2-helicasa es “IFlH1” (para interferón inducido con el dominio 1 de helicasa C) y el ID HGNC único es HGNC: 18873. La secuencia RefSeq para el gen RLR-2 humano es Gl: 27886567. RLR-3 (que se conoce además como LGP2 o laboratorio de genética y fisiología 2) no presenta dominios de reclutamiento de caspasa. El nombre HGNC aprobado para el gen que codifica la RLR-3-helicasa es “DHX58” (para polipéptido 58 de la secuencia DEXH (Asp-Glu-X-His)) y el ID HGNC único es HGNC: 29517. La secuencia RefSeq para el gen RLR-3 humano es Gl: 149408121.

PKR es una proteína cinasa dependiente de ARN de cadena doble. Desempeña un papel clave en el sistema inmunológico innato. “EIF2AK2” (para la cinasa 2 del factor 2-alfa de iniciación de traducción eucariótica) es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica esta enzima, y su ID HGNC único es HGNC: 9437. La secuencia RefSeq para el gen PKR humano es Gl: 208431825.

Modos de realización de la divulgación

Replicones de ARN

A continuación se utilizan diversos replicones. En general, estos se basan en un genoma de alfavirus híbrido con proteínas no estructurales del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), una señal de empaquetamiento del virus sindbis y una 3'UTR del virus sindbis o un mutante VEEV. El replicón mide aproximadamente 10 kb de largo y presenta una cola de poli-A.

El ADN plasmídico que codifica replicones de alfavirus (denominados: pT7-mVEEV-FL.RSVF o A317; pT7-mVEEV-SEAP o A306; pSP6-VCR-GFP o A50) sirvió como un modelo para la síntesis de ARN in vitro. Los replicones contienen los elementos genéticos del alfavirus necesarios para la replicación del ARN pero carecen de aquellos que codifican productos génicos necesarios para el ensamblaje de partículas; en cambio, las proteínas estructurales se reemplazan por una proteína de interés (ya sea un reportero, tal como SEAP o GFP o un inmunógeno, tal como la proteína RSV F de longitud completa) y, de esta manera, los replicones no resultan capaces de inducir la generación de partículas infecciosas Un promotor de bacteriófago (T7 o SP6) de secuencia 5' del ADNc del alfavirus facilita la síntesis del replicón de ARN in vitro y una ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV) de secuencia 3' inmediata con respecto a la cola de poli(A) genera el extremo 3' a través de su actividad de autoescisión.

A continuación de la linealización del ADN plasmídico en dirección 3' de la ribozima de HDV con una endonucleasa de restricción adecuada, los transcritos de repetición se sintetizaron in vitro mediante el uso de ARN polimerasa dependiente de ADN derivado de bacteriófago T7 o SP6. Las transcripciones se realizaron durante 2 horas a 37 °C en presencia de 7,5 mM (ARN polimerasa de T7) o 5 mM (ARN polimerasa de SP6) de cada uno de los nucleósidos trifosfatos (ATP, CTP, GTP y UTP), continuando con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Ambion). A continuación de la transcripción, el ADN del molde se digirió con TURBO DNasa (Ambion). El ARN de replicón se precipitó con LiCl y se reconstituyó en agua libre de nucleasa. Al ARN sin caperuza se le colocó una caperuza de manera postranscripcional con enzima de colocación de caperuza de vaccinia (VCE) mediante el uso del sistema de colocación de caperuza ScriptCap m7G (Epicenter Biotechnologies) como se describe en el manual del usuario; los replicones con caperuza colocada de esta manera presentan el prefijo “v”, p. ej., vA317 es el replicón A317 con colocación de caperuza mediante VCE. El ARN con caperuza colocada postranscripcionalmente se precipitó con LiCl y se reconstituyó en agua libre de nucleasa. La concentración de las muestras de ARN se determinó midiendo la OD²⁶⁰nm. La integridad de los transcritos in vitro se confirmó mediante desnaturalización por electroforesis en gel de agarosa.

Encapsulación liposomal

Se encapsuló ARN en liposomas que se elaboraron mediante el procedimiento de las referencias 9 y 40. Los liposomas se elaboraron con DSPC al 10 % (zwitteriónico), DlinDMA al 40 % (catiónico), colesterol al 48 % y DMG conjugado con PEG al 2 % (PEG de 2 kDa). Estas proporciones se refieren al % de moles en el liposoma total.

Se sintetizó DlinDMA (1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano) mediante el uso del procedimiento de la referencia 5. Se adquirió DSPC (1,2-diastearoil-sn-glicero-3-fosfocolina) de Genzyme. El colesterol se obtuvo de Sigma-Aldrich. DMG conjugado con PEG (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol), sal de amonio), DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano, sal de cloruro) y DC-Chol, (3p-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol-clorhidrato se obtuvieron de Avanti Polar Lipids.

En general, se han utilizado ocho procedimientos diferentes de preparación de liposomas de acuerdo con la divulgación. Estos se mencionan en el texto como procedimientos (A) a (H) y difieren principalmente con respecto a las etapas de filtración y TFF. Los detalles son los siguientes:

(A) se prepararon soluciones madre frescas de lípidos en etanol. Se pesaron 37 mg de DlinDMA, 11,8 mg de DSPC, 27,8 mg de colesterol y 8,07 mg de PEG DMG 2000 y se disolvieron en 7,55 ml de etanol. La solución madre de lípidos recién preparada se agitó suavemente a 37 °C durante aproximadamente 15 min para formar una mezcla homogénea. Luego, se agregaron 755 pl de la solución madre a 1245 ml de etanol para elaborar una solución madre de lípidos de trabajo de 2 ml. Esta cantidad de lípidos se utilizó para formar liposomas con 250 pg de ARN. Se preparó además una solución de trabajo de 2 ml de ARN a partir de una solución madre de ~ 1 pg/ml en tampón de citrato 100 mM (pH 6). Tres viales de vidrio de 20 ml (con barras de agitación) se enjuagaron con solución RNase Away (Molecular BioProducts, San Diego, CA) y se lavaron con abundante agua MilliQ antes de su uso para descontaminar los viales de las RNasas. Uno de los viales se utilizó para la solución de trabajo de ARN y los otros para recolectar las mezclas de lípidos y ARN (como se describe más adelante). Las soluciones de lípidos y de trabajo se calentaron a 37 °C durante 10 minutos antes de cargarse en jeringas con seguro Luer de 3 cc. Se cargaron 2 ml de tampón de citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 cc. Las jeringas que contenían el ARN y los lípidos se conectaron a un mezclador T (unión PEEK™ 500 pm, Idex Health Science, Oak Harbor, WA) mediante el uso de tubería FEP (etilen-propileno fluorado; una tubería FEP presenta un diámetro interno de 2 mm x diámetro externo de 3 mm, suministrada por Idex Health Science). La salida del mezclador T consistió también en una tubería FEP. La tercera jeringa que contenía el tampón de citrato se conectó a una pieza separada con respecto a la tubería FEP. Luego, todas las jeringas se accionaron a un caudal de 7 ml/min mediante el uso de una bomba de jeringa. Las salidas de la tubería se colocaron para recolectar las mezclas en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). Se extrajo la barra de agitación y se permitió que la solución de etanol/agua alcanzara el equilibrio a temperatura ambiente durante 1 hora. Se cargaron 4 ml de la mezcla en una jeringa de 5 cc, que se conectó a una pieza de tubería FEP y en otra jeringa de 5 cc conectada a una tubería FEP de longitud equivalente, se cargó una cantidad igual de tampón de citrato 100 mM pH 6). Las dos jeringas se accionaron a un caudal de 7 ml/min mediante el uso de la bomba de jeringa y la mezcla final se recolectó en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). A continuación, la mezcla que se recolectó a partir de la segunda etapa de la mezcla (liposomas) se pasó a través de una membrana Mustang Q (un soporte de intercambio aniónico que se une y retira moléculas aniónicas, que se obtuvo de Pall Corporation, AnnArbor, MI, EE. UU.). Antes de pasar los liposomas, 4 ml de NaOH 1M, 4 ml de NaCl 1M y 10 ml de tampón de citrato 100 mM (pH 6) se pasaron de manera sucesiva a través de la membrana Mustang. Los liposomas se calentaron durante 10 min a 37 °C antes de pasarse a través de la membrana. A continuación, los liposomas se concentraron a 2 ml y se dializaron contra 10 a 15 volúmenes de IX PBS mediante el uso de TFF antes de recuperar el producto final. El sistema de TFF y las membranas de filtración de fibra hueca se adquirieron de Spectrum Labs y se utilizaron de acuerdo con las directrices del fabricante. Se utilizaron membranas de filtración de fibra hueca de polisulfona (número de pieza P/N: XIAB-100-20P) con un umbral de tamaño de poro de100 kD y un área de superficie de 8 cm2. Para los experimentos in vitro e in vivo, las formulaciones se diluyeron hasta alcanzar la concentración de ARN requerida con iX PBS.

(B) Como en el procedimiento (A), a excepción de que, después de agitar, se agregaron 226,7 pl de la solución madre a 1773 ml de etanol para formar una solución madre de lípidos de trabajo de 2 ml, modificando, de este modo, la relación lípido:ARN.

(C) Como en el procedimiento (B) a excepción de que se omitió la filtración Mustang, entonces los liposomas se pasaron del vial de vidrio de 20 ml a la diálisis de TFF.

(D) Como en el procedimiento (C) a excepción de que la TFF utilizó membranas de fibra hueca de polietersulfona (PES) (número de pieza P-C1-100E-100-01N) con un umbral de tamaño de poro de 100 kD y un área de superficie de 20 cm2.

(E) Como en el procedimiento (D) a excepción de que se utilizó una membrana Mustang, como en el procedimiento (A).

(F) Como en el procedimiento (A) a excepción de que se omitió la filtración Mustang, por lo que los liposomas se pasaron del vial de vidrio de 20 ml a la diálisis de TFF.

(G) Como en el procedimiento (D) a excepción de que se preparó una solución de trabajo de 4 ml de ARN a partir de una solución madre de ~ 1 pg/pl en tampón de citrato 100 mM (pH 6). Luego se prepararon cuatro viales de vidrio de 20 ml de la misma manera. Dos de ellos se utilizaron para la solución de trabajo de ARN (2 ml en cada vial) y los otros para recolectar las mezclas de lípidos y ARN, como en (C). En lugar de usar un mezclador T, las jeringas que contenían el ARN y los lípidos se conectaron a un chip de unión Mitos Droplet (un dispositivo de microfluidos de vidrio que se obtuvo de Syrris, número de pieza 3000158) mediante el uso de tubería PTFE (diámetro interno de 0,03 pulgadas x diámetro externo de 1/16 de pulgada) mediante el uso de un conector de 4 vías de borde (Syrris). Dos corrientes de ARN y una corriente de lípidos se accionaron mediante bombas de jeringa y la mezcla del etanol y la fase acuosa se realizó en la unión X (100 pm x 105 pm) del chip. El caudal de las tres corrientes se mantuvo en 1,5 ml/min, por lo tanto, la relación de caudal acuoso total con respecto al caudal etanólico fue de 2:1. La salida de la tubería se colocó para recolectar las mezclas en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). Se retiró la barra de agitación y se permitió que el etanol/solución acuosa se equilibrara a temperatura ambiente durante 1 h. Luego se cargó la mezcla en una jeringa de 5 cc, que se ajustó en otra pieza de la tubería PTFE; en otra jeringa de 5 cc con tubería de PTFE de longitud equivalente, se cargó el mismo volumen de tampón de citrato 100 mM (pH 6). Las dos jeringas se accionaron a un caudal de 3 ml/min mediante el uso de una bomba de jeringa y la mezcla final se recolectó en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). A continuación, los liposomas se concentraron a 2 ml y se dializaron contra 10 a 15 volúmenes de 1X PBS mediante el uso de TFF, como en (D).

(H) Como en el procedimiento (A) a excepción de que la solución madre de lípidos de trabajo de 2 ml se elaboró mediante la mezcla de 120,9 pl de la solución madre de lípidos con 1879 ml de etanol. Además, después de mezclar los liposomas del vial de 20 ml en el mezclador T, se cargaron en un casete de diálisis Pierce Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific, resistencia adicional, capacidad de 0,5 a 3 ml) y se dializaron contra 400 a 500 ml de IX p Bs durante la noche a 4 °C en un recipiente de plástico esterilizado en autoclave antes de recuperar el producto final.

Los procedimientos (A) a (H) como se divulgan anteriormente utilizan una relación N:P de 8:1 para una cantidad especificada de ARN. Esta relación se puede variar fácilmente mediante el cambio de la concentración de ARN en la solución de trabajo de ARN.

Medición de pKa

El pKa de un lípido se mide en agua a temperatura y presión convencionales mediante el uso de la siguiente técnica:

• Se prepara una solución de 2 mM de lípidos en etanol pesando el lípido y disolviéndolo en etanol. Se prepara una solución de 0,3 mM de ácido nitrosulfónico de tolueno de sonda fluorescente (TNS) en etanol:metanol 9:1, preparando primero una solución 3 mM de TNS en metanol y diluyéndola luego a 0,3 mM con etanol.

• Se prepara un tampón acuoso que contiene fosfato de sodio, citrato de sodio, acetato de sodio y cloruro de sodio, en las concentraciones de 20 mM, 25 mM, 20 mM y 150 mM, respectivamente. El tampón se divide en ocho, partes y el pH se ajusta con HCl 12N o NaOH 6N a 4,44-4,52, 5,27, 6,15-6,21, 6,57, 7,10-7,20, 7,72-7,80, 8,27­ 8,33 y 10,47-11,12. Se mezclan 400 pl de solución de lípidos 2 mM y 800 pl de solución de TNS 0,3 mM.

• Se añaden 7,5 pl de mezcla de sonda/lípidos a 242,5 pl de tampón en una placa de 96 pocillos de 1 ml. Esto se hace con los ocho tampones. Después de la mezcla, se transfieren 100 pl de cada mezcla de sonda/lípido/tampón a una placa negra de 250 pl con fondo transparente de 96 pocillos (p. ej., modelo COSTAR 3904, Corning). Una manera conveniente de realizar esta mezcla consiste en utilizar el manipulador de líquidos de alto rendimiento Tecan Genesis RSP150 y software Gemini.

• Se mide la fluorescencia de cada mezcla de sonda/lípido/tampón (p. ej., con un espectrofotómetro SpectraMax M5 y software SoftMax pro 5.2) con excitación de 322 nm, emisión de 431 nm (corte automático a 420 nm).

• Después de la medición, el valor de fluorescencia de fondo de un pocillo vacío en la placa de 96 pocillos se retira de cada mezcla de sonda/lípido/tampón. Los valores de intensidad de fluorescencia se normalizan luego al valor del pH más bajo. Luego, la intensidad de fluorescencia normalizada se representa de manera gráfica con respecto al pH y se proporciona una línea de mejor ajuste.

• Se encuentra el punto de la línea de mejor ajuste en el que la intensidad de fluorescencia normalizada es igual a 0,5. El pH que corresponde a la intensidad de fluorescencia normalizada igual a 0,5 se encuentra y se considera el pKa del lípido.

Este procedimiento proporciona un pKa de 5,8 para DLinDMA, un lípido catiónico preferente para su uso con la divulgación.

Variación de la relación N:P para el suministro de inmunógenos

El replicón autorreplicante (vA317) que codifica la proteína F de RSV. Se administraron vacunas intramusculares bilaterales a ratones BALB/c, 4 u 8 animales por grupo (50 j l por pata) los días 0 y 21 con el replicón (1 |jg) de manera individual o formulado como liposomas con los RV01, RV05 o RV13. Los liposomas RV01 presentaron DlinDMA al 40 %, DSPC al 10 %, colesterol al 48 % y PEG-DMG al 2 %. Los liposomas RV05(01) presentaron lípidos catiónicos al 40 %, colesterol al 48 %, DSPC al 10 % y PEG-DMG al 2 %; los liposomas RV05(02) presentaron lípidos catiónicos al 60 %, colesterol al 38 % y PEG-DMG al 2 %. Los liposomas RV13 presentaron DOTAP al 40 %, DPE al 10 %, colesterol al 48 % y PEG-DMG al 2 %. A modo de comparación, el ADN plasmídico desnudo (20 jg ) que expresa el mismo antígeno RSV-F se suministró mediante electroporación o con liposomas RV01(10) (0,1 jg de ADN). Se utilizaron cuatro ratones como un grupo de control sin tratamiento previo.

Estos liposomas se prepararon mediante el procedimiento (D), a excepción de RV01(05) para el que se utilizó el procedimiento (B). La concentración de ARN se varió para suministrar diferentes relaciones N:P como se muestra en la tabla que sigue a continuación.

El diámetro de partícula promedio Z, el índice de polidispersidad y la eficacia de encapsulación de los liposomas son como se muestran a continuación; mostrándose, además, la relación N:P:

Se recolectó suero para análisis de anticuerpos los días 14, 36 y 49. Se recolectaron bazos de ratones el día 49 para el análisis de células T.

Los títulos de IgG sérica específicos de F (GMT) son como se muestran a continuación:

continuación

La relación de células T que son positivas para citocinas y específicas para el péptido RSV F51-66 son como se muestran a continuación; mostrándose solo cifras que son, de manera significativa, estadísticamente superiores a cero:

De este modo, las formulaciones de liposomas mejoraron de manera significativa la inmunogenicidad con respecto a los controles de ARN desnudo, como se determina mediante los títulos de IgG específicos de F aumentados y las frecuencias de las células T. El ADN plasmídico que se formuló con liposomas o se administró desnudo mediante el uso de electroporación, resultó, de manera significativa, menos inmunogénico que el ARN autorreplicante que se formuló mediante liposomas.

Las vacunas de ARN RV01 y RV05 resultaron más inmunogénicas en comparación con la vacuna RV13 (DOTAP). Estas formulaciones presentaban características físicas comparables y se formularon con el mismo ARN autoreplicante, pero contenían diferentes lípidos catiónicos. RV01 y RV05 presentan una amina terciaria en el grupo principal con un pKa de aproximadamente 5,8, e incluyen, además, colas de alquilo insaturadas. RV13 presenta colas de alquilo insaturadas pero su grupo principal presenta una amina cuaternaria y resulta muy fuertemente catiónico. Estos resultados sugieren que los lípidos con aminas terciarias con pKa en el intervalo de 5,0 a 7,6 son superiores a los lípidos tales como DOTAP, que son fuertemente catiónicos, cuando se utilizan en un sistema de suministro de liposomas para ARN.

La relación N:P causó un impacto en cuanto a la inmunogenicidad, con 4:1 (RV01 (09)) >8:1 (RV01(10)) >16:1 (RV01 (08)).

Tabla 1: fosfolípidos útiles

DDPC 1,2-didecanoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

DEPA 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfato

(continuación)

DEPC 1.2- erucoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

DEPE 1.2- dierucoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DEPG 1.2- dierucoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...) DLOPC 1.2- linoleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

DLPA 1.2- dilauroil-sn-glicero-3-fosfato

DLPC 1.2- dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

DLPE 1.2- dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DLPG 1.2- dilauroil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...) DLPS 1.2- dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilserina

DMG 1.2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DMPA 1.2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfato

DMPC 1.2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DMPE 1.2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DMPG 1.2- miristoil-sn-glicero-3 [fosfatidil-rac-(1-glicerol...) DMPS 1.2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina DOPA 1.2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfato

DOPC 1.2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

DOPE 1.2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DOPG 1.2- dioleoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...) DOPS 1.2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina

DPPA 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato

DPPC 1.2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DPPE 1.2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DPPG 1.2- dipalmitoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...) DPPS 1.2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina DPyPE 1.2- difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DSPA 1.2- distearoil-sn-glicero-3-fosfato

DSPC 1.2- distearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DSPE 1.2- diostearpil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DSPG 1.2- distearoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...) (continuación)

DSPS 1.2- distearoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina

EPC PC de huevo

HEPC PC de huevo hidrogenado

HSPC PC de soja hidrogenado de alta pureza

HSPC PC de soja hidrogenado

LYSOPC MIRÍSTICO 1 -miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

LYSOPC PALMÍTICO 1 -palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

LYSOPC ESTEÁRICO 1-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

Leche de Esfingomielina MPPC 1-miristoil,2-palmitoil-sn-glicero 3-fosfatidilcolina

MSPC 1-miristoil,2-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina PMPC 1-palmitoil,2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina POPC 1-palmitoil,2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

POPE 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina POPG 1.2- dioleoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1 -glicerol)...] PSPC 1-palmitoil,2-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina SMPC 1-estearoil,2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina SOPC 1-estearoil,2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

SPPC 1-estearoilo,2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina

Referencias

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Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un liposoma en el que se encapsula un ARN que codifica un inmunógeno, en el que el liposoma comprende un lípido catiónico y el liposoma y el ARN presentan una relación N:P de entre 4:1 y 16:1, y en el que la relación N:P no se encuentra entre 7:1 y 9:1, en el que la “relación N:P” se refiere a la relación molar de átomos de nitrógeno protonables en los lípidos catiónicos del liposoma con respecto a los fosfatos en el ARN, en el que el lípido presenta una amina terciaria, y en el que el lípido presenta un pKa en el intervalo de 5,0 a 7,6.

2. El liposoma de la reivindicación 1, que presenta un diámetro en el intervalo de 50 nm a 220 nm.

3. El liposoma de cualquier reivindicación anterior, en el que el ARN es un ARN autorreplicante.

4. El liposoma de la reivindicación 3, en el que el ARN autorreplicante codifica (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir ARN de la molécula de ARN autorreplicante y (ii) un inmunógeno.

5. El liposoma de la reivindicación 4, en el que el ARN presenta dos marcos de lectura abierta, el primero de los cuales codifica una replicasa de alfavirus y el segundo de los cuales codifica el inmunógeno.

6. El liposoma de cualquier reivindicación anterior, en el que el ARN presenta una longitud de 9000 a 12000 nucleótidos.

7. El liposoma de cualquier reivindicación anterior, en el que el inmunógeno puede provocar una respuesta inmune in vivo contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito, de manera opcional, en el que el inmunógeno puede provocar una respuesta inmune in vivo contra la glucoproteína F del virus sincitial respiratorio.

8. Una composición farmacéutica que comprende un liposoma de cualquier reivindicación anterior.