ES2856232B2

ES2856232B2 - Biomarcadores para predecir la respuesta de un sujeto a una terapia con bcg, metodos y usos basados en los mismos

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Publication number: ES2856232B2
Application number: ES202030244A
Authority: ES
Inventors: Porto Marta Gloria Dueñas; Cabrera Cristian Suárez; González Jesús María Paramio; Ramos Félix Guerrero
Original assignee: Centro de Investigaciones Energeticas Medioambientales y Tecnologicas CIEMAT; Fundacion Investigacion Biomedica Hospital Universitario 12 Octubre
Current assignee: Centro de Investigaciones Energeticas Medioambientales y Tecnologicas CIEMAT; Fundacion Investigacion Biomedica Hospital Universitario 12 Octubre
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2020-03-25
Publication date: 2023-11-24
Anticipated expiration: 2040-03-25
Also published as: EP4112745A1; US20230220483A1; WO2021191485A1; ES2856232A1

Description

DESCRIPCIÓN

BIOMARCADORES PARA PREDECIR LA RESPUESTA DE UN SUJETO A UNA

TERAPIA CON BCG, MÉTODOS Y USOS BASADOS EN LOS MISMOS

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención comprende biomarcadores, en concreto, microARNs (miARNs) o combinaciones de miARNs relacionados con métodos para predecir la respuesta de un sujeto con cáncer de vejiga a una terapia con Bacillus Calmette Guerin (BCG), basados en los niveles de expresión de dichos biomarcadores y con kits para llevar a cabo dichos métodos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer de vejiga es la neoplasia maligna más común del tracto urinario, siendo una enfermedad altamente prevalente que afecta principalmente a personas mayores. Es el undécimo cáncer más común diagnosticado en todo el mundo y una causa importante de mortalidad relacionada con tumores, con aproximadamente 150,000 muertes por año. El cáncer de vejiga se puede dividir en dos clases principales basadas en el estadio tumoral, (i) cáncer de vejiga no músculo invasivo (CVNMI), que está confinado al urotelio (carcinoma in situ (CIS), estadio Ta) o a la lámina propia (estadio T1); y (ii) cáncer de vejiga músculo-invasivo (CVMI) (estadios T2, T3 y T4).

El CVNMI representa la forma más frecuente de cáncer de vejiga, hallándose en el 70-80% de los pacientes en el momento del diagnóstico y se trata principalmente mediante resección transuretral del tumor de vejiga (RTUV). Los pacientes con mayor riesgo de recurrencia se tratan, tras la resección, con instilaciones intravesicales seriadas con Bacillus Calmette Guerin (BCG), una cepa atenuada de Mycobacterium bovis que se ha utilizado como vacuna contra la tuberculosis y que ha demostrado ser eficaz contra el cáncer de vejiga.

Kiselyov et al. describieron marcadores celulares y moleculares relevantes para la respuesta inmunológica desencadenada por la instilación de BCG en pacientes con cáncer de vejiga no músculo invasivo (CVNMI) y modelos matemáticos del tratamiento del CVNMI con BCG (Kiselyov et al, 2015).

El tratamiento con BCG presenta grandes efectos secundarios que afectan seriamente la calidad de vida de los pacientes, tales como inflamación severa, cistitis, uretritis, dolor pélvico, fiebre, dolor articular, dolor lumbar y dolor al orinar, por lo que existe, en el estado del arte, la necesidad de desarrollar un método de predicción de respuesta a BCG preciso, que evite aplicar BCG a un paciente que no responde a dicha terapia, con el consiguiente beneficio de evitar los efectos secundarios graves asociados a la terapia con BCG.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, las formas singulares, tales como "el”, "la”, incluyen también las formas plurales, a menos que el contenido indique claramente lo contrario.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, el término "comprende” y sus variantes no son de naturaleza limitativa y, por lo tanto, no pretenden excluir otras características técnicas. El término "comprende” y sus variantes, a lo largo de la descripción y las reivindicaciones, incluye, específicamente, el término "consiste en” y sus variantes.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados a lo largo de la descripción y reivindicaciones, tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en el campo de la invención.

En la presente patente, "microARN o "miARN” (en inglés, miRNA) se refiere a moléculas de ARN no codificantes de entre, generalmente, 20 y 25 nucleótidos de longitud, que se encuentran en varios organismos, incluyendo animales. Es habitual en la técnica nombrar a los miARNs utilizando el prefijo "miR” y un número de identificación único. Como excepción, se utilizan también los términos lin-4 y let-7 para nombrar a los primeros miARN que fueron identificados, originalmente en el organismo Caenorhabditis elegans y han mantenido su nombre desde entonces. El miARN maduro (el producto de expresión del gen) se designa, por ejemplo, como miR-21, mientras que mir-21 se refiere al gen que codifica para dicho miARN maduro. Es habitual en la técnica incluir un prefijo adicional de tres letras, que hace referencia al organismo. Así, hsa-miR-21 hace referencia al miR-21 humano (hsa hace referencia a Homo sapiens). Todos los miARNs de la presente invención son miARNs humanos, por ejemplo, el miR-21, en el contexto de la presente invención, hace referencia a hsa-miR-21. La presencia de letras después del número de identificación del miARN hace referencia a secuencias maduras estrechamente relacionadas; por ejemplo, hsa-miR-121a y hsa-miR-121b hacen referencia a secuencias maduras estrechamente relacionadas. El término "5p” y "3p” al final del nombre del miARN hace referencia a la secuencia del brazo 5’ o 3’, respectivamente. Las secuencias maduras de los miARNs y las secuencias de los genes que codifican para dichas secuencias maduras de los miARNs, están generalmente disponibles en bases de datos accesibles. Ejemplos de bases de datos accesibles especializadas en secuencias de ARN son miRBase (http://www.mirbase.org/) y RNACentral (https://rnacentral.org/).

En la presente patente, el término “predecir” se refiere a evaluar la probabilidad, según la cual, un sujeto responde al tratamiento al que se refiere esta patente. Como es comúnmente entendido por los expertos, generalmente, dicha evaluación no pretende ser correcta para el 100% de los sujetos a evaluar. El término, sin embargo, requiere que se pueda predecir la respuesta a dicha terapia de una parte estadísticamente significativa de los sujetos. Se puede determinar si una parte es estadísticamente significativa utilizando diversas herramientas de evaluación estadística bien conocidas en la técnica, tales como la determinación de intervalos de confianza y la determinación del valor p, por ejemplo, a través de pruebas binomiales. Los intervalos de confianza preferidos son al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%. Preferiblemente, la probabilidad prevista por la presente invención permite que la predicción sea correcta para al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o al menos 90%, de los sujetos de una cohorte o población dada. Preferiblemente, el método de predicción tiene una sensibilidad y especificidad suficientemente grandes como se describe a continuación. Preferiblemente, la sensibilidad prevista por la presente invención permite que la predicción sea correcta para al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% de los sujetos de un cohorte o población dada.

En la presente patente, “valor p” (en inglés, p-value), se refiere a un valor de probabilidad, que oscila entre 0 y 1 y representa una medida de significación estadística. El valor p es la probabilidad de que un valor estadístico calculado sea posible dada una hipótesis nula cierta. El valor p ayuda a diferenciar resultados que son producto del azar de resultados que son estadísticamente significativos. Para un resultado particular, si el valor p es menor que un valor arbitrariamente definido, se considera como un resultado estadísticamente significativo y permite rechazar la hipótesis nula. Preferiblemente, dicho valor es 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 o 0,0001.

En la presente patente, la precisión de una predicción se puede obtener mediante la aplicación de métodos estándar de estadística. En particular, dicha predicción se puede obtener por las características de funcionamiento del receptor (ROC, del inglés Receiver-Operating Characteristics). El gráfico ROC es un gráfico de todos los pares de sensibilidad versus especificidad, resultantes de variar continuamente el umbral de decisión en todo el rango de datos observados. El rendimiento clínico de un método de predicción depende de su precisión, es decir, de su capacidad para asignar correctamente los sujetos a un determinado pronóstico o diagnóstico. El gráfico ROC indica la superposición entre las dos distribuciones al trazar la sensibilidad frente al valor 1 - valor de especificidad para el rango completo de valores de corte adecuados para hacer una distinción. En el eje "y” se encuentra la sensibilidad, o la relación (o %) de verdaderos positivos, que se define como la relación entre el número de verdaderos positivos y la suma del número de verdaderos positivos y el número de falsos negativos. En el eje "x” está la relación de falsos positivos, o 1 - especificidad (o 100 % -especificidad %), que se define como la relación entre el número de falsos positivos y la suma del número de verdaderos negativos y el número de falsos positivos. Cada punto en el gráfico ROC representa un par de sensibilidad/especificidad correspondiente a un valor de corte particular. Una prueba con discriminación perfecta (sin solapamiento en las dos distribuciones de resultados) tiene un gráfico ROC que pasa a través de la esquina superior izquierda, donde la relación de verdaderos positivos es 1,0, o 100% (sensibilidad perfecta) y la relación de falsos positivos es 0 (especificidad perfecta). El diagrama teórico para una prueba sin discriminación (distribuciones idénticas de resultados para los dos grupos) es una línea diagonal de 45° desde la esquina inferior izquierda, hasta la esquina superior derecha. La mayoría de los gráficos se encuentran entre estos dos extremos. Cualitativamente, cuanto más cerca esté el gráfico de la esquina superior izquierda, mayor será la precisión general de la prueba. Dependiendo de un intervalo de confianza deseado, se puede derivar un valor de corte del gráfico ROC que permita la predicción de un evento determinado con un equilibrio adecuado de sensibilidad y especificidad, respectivamente. Por consiguiente, la referencia a utilizar para los métodos de la presente invención puede generarse, preferiblemente, estableciendo un ROC para dicha cohorte como se describe anteriormente y derivando un valor de corte a partir de la misma. Dependiendo de la sensibilidad y especificidad deseadas para un método de predicción, el gráfico ROC permite obtener valores de corte adecuados. Preferiblemente, las cantidades de referencia se encuentran dentro del rango de valores que representan una sensibilidad de al menos 75% y una especificidad de al menos 45%, o una sensibilidad de al menos 80% y una especificidad de al menos 40%, o una sensibilidad de al menos 85% y una especificidad de al menos 33%, o una sensibilidad de al menos 90% y una especificidad de al menos 25%.

En la presente patente, "AUC” se refiere al valor bajo la curva en un gráfico ROC. Los valores de AUC más altos indican un mejor rendimiento del método y los valores posibles de AUC varían de 0,5 (sin capacidad de predicción) a 1,0 (capacidad de predicción perfecta).

En la presente patente, el término "sujeto”, se refiere a animales, preferentemente mamíferos, y, más preferentemente, humanos. Más preferentemente, dicho sujeto tuvo en el pasado o, tiene en el presente, o se sospecha que tiene, o está en riesgo de tener, cáncer de vejiga. Aún más preferentemente, dicho sujeto ha tenido cáncer de vejiga y tiene, o se sospecha que tiene riesgo de recurrencia de cáncer vejiga. Los sujetos que están afectados por dicha enfermedad pueden ser identificados por los síntomas que acompañan a la enfermedad, que son conocidos en el estado de la técnica. Sin embargo, un sujeto que se sospecha que está afectado por la enfermedad mencionada puede ser también un sujeto aparentemente sano, por ejemplo, investigado mediante un examen clínico de rutina, o puede ser un sujeto que corre el riesgo de desarrollar la enfermedad mencionada. Los grupos de riesgo para la enfermedad se conocen en el estado de la técnica. Los grupos de riesgo de recurrencia de cáncer de vejiga se conocen en el estado de la técnica.

En la presente patente, "terapia con Bacillus Calmette-Guérín (BCG)” se refiere a una terapia contra el cáncer que ha demostrado ser eficaz contra el cáncer de vejiga. El BCG es una cepa atenuada de Mycobacterium bovis que se ha utilizado como vacuna contra la tuberculosis. Se utilizó por primera vez para tratar el cáncer de vejiga en 1976. El BCG es un potente estimulador de los mecanismos de defensa del huésped y puede inducir la regresión del tumor en huéspedes inmunocompetentes. La instilación repetida de BCG produce una reacción inmune inespecífica dentro de la vejiga que permite que se desprendan células del tejido de la vejiga, especialmente aquellas células cancerosas que se dividen rápidamente. El BCG se suele administrar después de que los tumores superficiales de la vejiga han sido extirpados durante una operación. El BCG se administra por vía intravesical a través de un catéter que se coloca en la vejiga y se administra repetidamente durante un periodo de tiempo. El BCG ha surgido como un tratamiento intravesical eficaz para el cáncer superficial de vejiga y el carcinoma in situ (CIS). Los efectos del BCG en el cáncer de vejiga son sólo locales y no hay protección contra el desarrollo de tumores en las zonas donde no hay contacto con el BCG.

En la presente patente el "nivel de expresión” de un miARN en una muestra de un sujeto puede determinarse mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Según la naturaleza de la muestra, la cantidad de un miARN puede determinarse mediante técnicas basadas en la PCR para cuantificar la cantidad de un polinucleótido o mediante otros métodos como la espectrometría de masas o la secuenciación, o uno de los métodos descritos en los ejemplos.

En la presente patente, la "relación de niveles de expresión” se obtiene mediante una operación matemática, tal como la división o multiplicación, entre los niveles de expresión de los miARN dentro de una combinación de miARNs, o entre una variable derivada de dichos niveles de expresión, tal como el valor Ct. De forma preferente, dicha combinación es un par.

De forma preferente, la relación de niveles de expresión de un par de miARNs se determina dividiendo el nivel de expresión de un primer miARN del par de miARNs por el nivel de expresión del segundo miARN del par de miARN.

En la presente patente, el término "muestra” se refiere a una muestra de un fluido corporal; a una muestra de células, o a una muestra de un tejido, o de un órgano; o a una muestra de fluido de lavado/enjuague obtenida de una superficie corporal externa o interna. Las muestras pueden obtenerse mediante técnicas bien conocidas e incluyen, preferentemente, biopsias. Más preferentemente, las muestras son muestras de fluidos corporales, por ejemplo, preferiblemente, sangre, plasma, suero, orina, saliva, líquido lagrimal y fluidos obtenibles de las glándulas mamarias, por ejemplo, la leche. Más preferentemente, las muestras son muestras de orina. Más preferentemente, las muestras de fluidos corporales están libres de células del sujeto. Las muestras de tejidos u órganos pueden obtenerse de cualquier tejido u órgano mediante, por ejemplo, una biopsia u otros procedimientos quirúrgicos. Más preferentemente, las muestras de tejido son muestras de tejido de vejiga. Se pueden obtener células de los fluidos corporales o de los tejidos u órganos mediante técnicas de separación como la filtración, la centrifugación o la clasificación celular. Preferentemente, las muestras de células, tejidos u órganos se obtienen de los fluidos corporales, células, tejidos u órganos que se sabe o se sospecha que contienen los miARNs de la presente invención. Más preferentemente, las muestras están obtenidas de aquellos fluidos corporales, células, tejidos u órganos que contienen los miARNs de la invención descritos a continuación en esta patente.

En la presente patente, el "nivel de expresión” de un miARN puede determinarse mediante técnicas bien conocidas en la técnica, que incluyen, pero sin limitación, RT-qPCR, métodos basados en micromatrices de ADN y el sistema de análisis nCounter® de NanoString Technologies, Inc.

En la presente patente, "RT-qPCR” significa reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real y se refiere a una técnica de cuantificación de la cantidad de transcritos de ARN correspondientes a un gen particular presentes en muestras. En particular, se puede usar para determinar la expresión de genes en células y tejidos. Al igual que la PCR convencional, emplea un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado y una ADN polimerasa termoestable. A dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que permita medir la tasa de generación de uno o más productos específicos en un termociclador provisto de sensores de fluorescencia, tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada. Dicha medición se realiza tras cada ciclo de amplificación. En muchos casos, el molde que se emplea para la PCR cuantitativa no es ADN, sino que puede ser ADN complementario (ADNc), de hebra simple, obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN). La cuantificación puede realizarse en términos absolutos o relativos. En el primer caso, la estrategia es relacionar la señal de amplificación obtenida con el contenido en ADN empleando una curva de calibrado. En el segundo caso, se expresa el cambio en los niveles de expresión de ARN mensajero (ARNm) utilizando ADN complementario obtenido por retrotranscripción del ARNm. La cuantificación relativa no requiere curva de calibrado y se sustenta en la comparación entre el nivel de expresión del gen a estudiar, respecto a un gen de referencia (también llamado control, normalizador o, en inglés, housekeeping gene). Se conocen diferentes métodos en la técnica para evaluar los resultados de la RT-qPCR, siendo uno de ellos el método ACt, en el que “Ct” significa valores umbral del ciclo. Durante la reacción de la RT-qPCR, se mide el número de ciclos de cada muestra en el cual la fluorescencia cruza una línea arbitraria (indicadora de la amplificación de la PCR), el umbral del ciclo. Este punto de cruce es el valor Ct. Para cuantificar la expresión génica de un gen particular, se divide el Ct de un ácido nucleico procedente del gen de interés por el Ct del ácido nucleico procedente del gen de referencia, en la misma muestra, para normalizar la variación en la cantidad del ARN, entre diferentes muestras y obtener la expresión relativa de la muestra con respecto al gen de referencia.

El sistema de análisis nCounter® de NanoString Technologies, Inc. utiliza pares de sondas específicas para determinados genes que hibridan directamente con el ARNm en solución y evita utilizar reacciones de retrotranscripción o amplificación. En el primer paso del ensayo, las sondas de ADN hibridan directamente con una región de 70-100 pares de bases del ARNm en solución. La sonda de marcaje fluorescente consiste en una secuencia de 35-50 pares de bases complementarias a la molécula de ARNm diana y una única secuencia de ADN que hibrida con seis segmentos de ARN etiquetados con una de cuatro sondas fluorescentes de colores diferentes. Las sondas fluorescentes crean un “código de color” de seis posiciones y cuatro colores, único para cada molécula diana. Se utiliza una sonda de captura formada por biotina y una secuencia de 35-50 pares de bases, complementaria a la molécula de ARNm diana, que permite la inmovilización de los complejos sondas/diana en un portaobjetos con una capa de estreptavidina. Tras la hibridación, se realizan los pasos de purificación de la muestra en una plataforma automática. En primer lugar, se eliminan las sondas de captura y de marcaje sobrantes mediante pasos sucesivos de captura utilizando esferas magnéticas seguidos de la unión de los complejos sondas/diana a puntos aleatorios en la superficie de un cartucho, a través de la unión estreptavidina-biotina. Por último, los complejos sondas/diana se alinean e inmovilizan en el cartucho. Seguidamente, el cartucho se coloca en un analizador digital para la recogida de datos. Cada molécula diana de interés se identifica mediante el "código de color" presente en la sonda de mareaje asociada. En ese momento se cuentan las sondas de marcaje en la superficie del cartucho correspondientes a cada molécula diana y se analizan los datos.

En la presente patente, el término “comparar” se refiere a contrastar el nivel de expresión o relación de niveles de expresión de miARNs o pares de miARNs, a los que se hace referencia en la presente patente, en la muestra que se va a analizar con un nivel de expresión o relación de niveles de expresiones de dicho miARN o par de miARN en una muestra de referencia adecuada, tal como se especifica más adelante en la presente descripción. La comparación se refiere a la de los parámetros o valores correspondientes, por ejemplo, una cantidad absoluta de miARN se compara con una cantidad de referencia absoluta de dicho miARN; una concentración de miARN se compara con una concentración de referencia de dicho miARN; una señal de intensidad obtenida del miARN en una muestra se compara con el mismo tipo de señal de intensidad de dicho miARN en una muestra de referencia. La comparación referida puede ser llevada a cabo manualmente o asistida por ordenador. En el caso de una comparación asistida por ordenador, el valor de la cantidad determinada puede compararse con los valores correspondientes a las referencias adecuadas que se almacenan en una base de datos mediante un programa informático. En consecuencia, el resultado de la identificación a que se hace referencia en el presente documento podrá facilitarse automáticamente en un formato de salida adecuado.

En la presente patente, el término “valor de referencia” , se deriva de muestras de sujetos obtenidas después de la terapia con BCG, para las cuales se sabe si los sujetos de los que derivan dichas muestras responden o no a la terapia con BCG. Este valor de referencia puede ser una cifra discreta o puede ser un rango de valores. Evidentemente, el valor de referencia puede variar entre especies individuales de miARN. Por lo tanto, el sistema de medición, preferiblemente, se calibra con una muestra o con una serie de muestras que comprenden cantidades conocidas de cada miARN específico. El valor de referencia aplicable para un sujeto individual puede variar dependiendo de varios parámetros fisiológicos, como la edad, o la subpoblación. Por lo tanto, un valor de referencia adecuado puede determinarse, mediante los métodos de la presente invención, a partir de una muestra de referencia para analizarse juntos, es decir, simultáneamente, o posteriormente, con la muestra de prueba. Además, preferiblemente, se puede usar un valor de corte como un valor de referencia. Preferentemente, un valor de referencia puede derivarse de una muestra de un sujeto o grupo de sujetos, que se sabe que responden a la terapia con BCG. Preferentemente, un valor de referencia también puede derivarse de una muestra de un sujeto o grupo de sujetos, que se sabe que no responden a la terapia con BCG. Debe entenderse que los valores antes mencionados pueden variar, debido a estadísticas y errores de medición. Los valores de referencia pueden calcularse para un grupo, o cohorte de sujetos, como se especifica en el presente documento, en función de los valores promedio para un miARN dado, mediante la aplicación de métodos estándar de estadística.

En la presente patente, el término “diferencia en la comparación” se refiere a una disminución o a un aumento del nivel de expresión, o relación de niveles de expresión de miARNs, o pares de miARNs, a los que se hace referencia en la presente patente, en la muestra que se va a analizar, respecto a un nivel de expresión, o niveles de expresión, de dicho miARN, o par de miARNs, en una muestra de referencia adecuada, tal como se especificó anteriormente. Preferiblemente, dicha diferencia, es estadísticamente significativa, es decir, una disminución estadísticamente significativa, o un aumento estadísticamente significativo. Se puede determinar si una diferencia es estadísticamente significativa, utilizando diversas herramientas de evaluación estadística, bien conocidas en la técnica, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza y determinación del valor p, por ejemplo, a través de pruebas binomiales. Los intervalos de confianza preferidos son al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%. Los niveles de significación de las pruebas estadísticas son, preferiblemente, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 o 0,0001.

En la presente patente, el término “indicativo/a” se refiere a que, una diferencia entre el nivel de expresión, o relación de niveles de expresión de miARNs, o pares de miARNs, a los que se hace referencia en la presente patente, en la muestra que se va a analizar, respecto a un nivel de expresión o niveles de expresiones de dicho miARN o par de miARNs, en una muestra de referencia adecuada, permite predecir, si un sujeto responde al tratamiento con BCG, al que se refiere esta patente.

El problema técnico a resolver consiste en obtener un método de predicción de respuesta a BCG mejorado, que tenga una alta precisión, que evite aplicar BCG a un paciente que no responde a dicha terapia con el consiguiente beneficio de evitar los efectos secundarios graves asociados a la terapia con BCG.

La presente invención, definida por las reivindicaciones, proporciona una solución a dicho problema técnico.

La presente invención proporciona un método de predicción de respuesta a BCG mejorado, que tiene una alta precisión.

Los ejemplos evidencian que el método de predicción de respuesta a BCG es un método altamente preciso.

En la presente invención, se identificaron pares de miARNs que servían para distinguir pacientes respondedores, de pacientes no respondedores a BCG. Dichos pares de miARNs de la invención son: miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182, miR223/miR-182 y miR-21/miR-106a.

Adicionalmente, se identificaron miARNs diferencialmente expresados en los tumores de los pacientes que mostraron una respuesta satisfactoria en contraste con los que presentaron recurrencia del tumor, en un periodo inferior a tres años. Dichos miARNs de la invención son: miR-21, miR-106a, miR-17, miR-222, miR-429, miR-223, let-7c, miR-29a, miR-199a, miR-199b, miR-23a, miR-218, miR-125b, miR-23b, miR-1, miR-483, miR-145, miR-4443, miR-874, miR-497, miR-143, miR-574, miR-579, miR-342 y miR-99a.

La presente invención proporciona un método in vitro para predecir la respuesta de un sujeto con cáncer de vejiga a una terapia con Bacillus Calmette-Guérin (BCG), que comprende determinar en una muestra obtenida de dicho sujeto el nivel de expresión o relación de niveles de expresión de:

(i) al menos un par de miARNs seleccionado del grupo que consiste en: miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182, miR223/miR-182 y miR-21/miR-106a; o combinaciones de dichos pares; o

(ii) al menos un miARN seleccionado del grupo que consiste en: miR-21, miR-106a, miR-17, miR-222, miR-429, miR-223, let-7c, miR-29a, miR-199a, miR-199b, miR-23a, miR-218, miR-125b, miR-23b, miR-1, miR-483, miR-145, miR-4443, miR-874, miR-497, miR-143, miR-574, miR-579, miR-342 y miR-99a, o combinaciones de los mismos; y comparar dicho nivel de expresión o relación de niveles de expresión con un valor de referencia.

El método de la invención, basado en los miARNs, o en las combinaciones de miARNs de la invención descritos anteriormente, predice qué pacientes van a mostrar una respuesta favorable al tratamiento mediante instilaciones intravesicales con BCG. Es decir, predice qué pacientes se beneficiarán de este tipo de terapia de aquéllos que, a pesar de recibir este tratamiento, mostrarán una recurrencia de la enfermedad.

El método de la invención presenta ventajas sustanciales, tales como evitar aplicar BCG a un paciente que no responde a dicha terapia con el consiguiente beneficio de evitar los efectos secundarios graves asociados a la terapia con BCG, tales como inflamación severa, cistitis, uretritis, dolor pélvico, fiebre, dolor articular, dolor lumbar y dolor al orinar.

Los miARNs y combinaciones de miARNs de la invención se pueden detectar en cualquier muestra de un sujeto. De forma preferente, dichos miARNs y combinaciones de miARNs se detectan en muestras de tejido o de orina. De forma más preferente, dichas muestras de orina son previas a la cirugía anterior al tratamiento con BCG.

En una realización preferente del método de la invención, dicho método comprende determinar en una muestra obtenida de dicho sujeto el nivel de expresión o relación de niveles de expresión de un miARN, o de un par de miARNs, seleccionado del grupo que consiste en: miR-21, miR-106a, miR-17, miR-222, miR-429, miR-223, let-7c, miR-29a, miR-199a, miR-199b, miR-23a, miR-218, miR-125b, miR-23b, miR-1, miR-483, miR-145, miR-4443, miR-874, miR-497, miR-143, miR-574, miR-579, miR-342 y miR-99a, miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182, miR223/miR-182 y miR-21/miR-106a.

En una realización más preferente del método de la invención, dicho método comprende determinar en una muestra obtenida de dicho sujeto el nivel de expresión o relación de niveles de expresión de un miARN, o de un par de miARNs, seleccionado del grupo que consiste en: miR-21-5p, miR-106a-5p, miR-17-5p, miR-222-3p, miR-429, miR-223-3p, let-7c-5p, miR-29a-3p, miR-199a-3p, miR-199b-3p, miR-199b-5p, miR-23a-3p, miR-218-5p, miR-125b-5p, miR-23b-3p, miR-199a-5p, miR-1-3p, miR-483-3p, miR-145-5p, miR-4443, miR-874-5p, miR-497-5p, miR-143-3p, miR-574-3p, miR-579-3p, miR-342-3p, miR-99a-5p, miR-21-5p/miR-182-5p, miR-222-3p/miR-182-5p, miR-429/miR-182-5p, miR223-3p/miR-182-5p y miR-21-5p/miR-106a-5p.

En una realización preferente del método de la invención, la muestra es una muestra de tejido o de orina.

En una realización más preferente del método de la invención, la muestra de tejido es una muestra de tejido tumoral de cáncer de vejiga.

En una realización preferente del método de la invención, la combinación de miARNs es miR-21/miR-106a.

En una realización preferente del método de la invención, se determina la relación de los niveles de expresión de al menos un par de miARNs seleccionado del grupo que consiste en: miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182 y miR223/miR-182, siendo la muestra, una muestra de tejido.

En una realización preferente del método de la invención, se determina la relación de los niveles de expresión de al menos un par de miARNs seleccionado entre: miR-21/miR-182, o miR-21/miR-106a, siendo la muestra, orina.

En una realización preferente del método de la invención, dicho miARN está seleccionado entre: miR-106a, o miR-21, siendo la muestra, orina.

La presente invención también proporciona el uso in vitro de un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en:

(i) al menos un par de miARNs seleccionado entre: miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182, miR223/miR-182 y miR-21/miR-106a; o combinaciones de dichos pares; o (ii) miR-21, miR-106a, miR-17, miR-222, miR-429, miR-223, let-7c, miR-29a, miR-199a, miR-199b, miR-23a, miR-218, miR-125b, miR-23b, miR-1, miR-483, miR-145, miR-4443, miR-874, miR-497, miR-143, miR-574, miR-579, miR-342 y miR-99a; o combinaciones de los mismos;

para predecir la respuesta de un sujeto con cáncer de vejiga, a una terapia con Bacillus Calmette-Guérin (BCG), en el que el nivel de expresión, o relación de niveles de expresión de dicho biomarcador, en una muestra obtenida de dicho sujeto, es indicativo de la respuesta de dicho sujeto a la terapia con BCG.

En una realización preferente del uso de la invención, dicho biomarcador es un miARN o par de miARNs, seleccionado del grupo que consiste en: miR-21, miR-106a, miR-17, miR-222, miR-429, miR-223, let-7c, miR-29a, miR-199a, miR-199b, miR-23a, miR-218, miR-125b, miR-23b, miR-1, miR-483, miR-145, miR-4443, miR-874, miR-497, miR-143, miR-574, miR-579, miR-342, miR-99a, miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182 y miR223/miR-182.

En una realización preferente del uso de la invención, la muestra es una muestra de tejido, o de orina.

En una realización más preferente del uso de la invención, la muestra de tejido es una muestra de tejido tumoral de cáncer de vejiga.

En una realización preferente del uso de la invención, el biomarcador es el par de miARNs: miR-21/miR-106a.

En una realización preferente del uso de la invención, dicho biomarcador está seleccionado del grupo de pares de miARNs que consiste en: miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182 y miR223/miR-182, siendo la muestra, una muestra de tejido.

En una realización preferente del uso de la invención, dicho biomarcador está seleccionado entre los pares de miARNs que consisten en: miR-21/miR-182, o miR-21/miR-106a, siendo la muestra, orina.

En una realización preferente del uso de la invención, dicho biomarcador está seleccionado entre: miR-21, o miR-106a, siendo la muestra, orina.

La presente invención también proporciona un kit para predecir la respuesta de un sujeto con cáncer de vejiga a una terapia con Bacillus Calmette-Guérín (BCG), que comprende los reactivos necesarios para determinar, en una muestra obtenida de dicho sujeto, el nivel de expresión o relación de niveles de expresión de:

(i) al menos un biomarcador seleccionado del grupo de pares de miARNs que consiste en:

miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182, miR223/miR-182 y miR-21/miR-106a; o combinaciones de dichos pares; o

(ii) al menos un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en: miR-21, miR-106a, miR-17, miR-222, miR-429, miR-223, let-7c, miR-29a, miR-199a, miR-199b, miR-23a, miR-218, miR-125b, miR-23b, miR-1, miR-483, miR-145, miR-4443, miR-874, miR-497, miR-143, miR-574, miR-579, miR-342 y miR-99a; o combinaciones de los mismos.

En una realización preferente del kit de la invención, dicho biomarcador es un miARN, o par de miARNs, seleccionado del grupo que consiste en: miR-21, miR-106a, miR-17, miR-222, miR-429, miR-223, let-7c, miR-29a, miR-199a, miR-199b, miR-23a, miR-218, miR-125b, miR23b, miR-1, miR-483, miR-145, miR-4443, miR-874, miR-497, miR-143, miR-574, miR-579, miR-342, miR-99a, miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182 y miR223/miR-182.

En una realización preferente del kit de la invención, la muestra ensayada en dicho kit es una muestra de tejido, o de orina.

En una realización más preferente del kit de la invención, la muestra de tejido ensayada en dicho kit es una muestra de tejido tumoral de cáncer de vejiga.

En una realización preferente del kit de la invención, el biomarcador es el par de miARNs: miR-21/miR-106a.

En una realización preferente del kit de la invención, dicho biomarcador está seleccionado del grupo de pares de miARNs que consiste en: miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182 y miR223/miR-182, siendo la muestra ensayada en dicho kit, una muestra de tejido.

En una realización preferente del kit de la invención, dicho biomarcador está seleccionado entre los pares de miARNs que consisten en: miR-21/miR-182, o miR-21/miR-106a, siendo la muestra ensayada en dicho kit, orina.

En una realización preferente del kit de la invención, dicho biomarcador está seleccionado entre: miR-21, o miR-106a, siendo la muestra ensayada en dicho kit, orina.

En una realización preferente del uso o kit de la invención, dicho biomarcador es un miARN o par de miARNs, seleccionado del grupo que consiste en: miR-21-5p, miR-106a-5p, miR-17-5p, miR-222-3p, miR-429, miR-223-3p, let-7c-5p, miR-29a-3p, miR-199a-3p, miR-199b-3p, miR-199b-5p, miR-23a-3p, miR-218-5p, miR-125b-5p, miR-23b-3p, miR-199a-5p, miR-1-3p, miR-483-3p, miR-145-5p, miR-4443, miR-874-5p, miR-497-5p, miR-143-3p, miR-574-3p, miR-579-3p, miR-342-3p, miR-99a-5p, miR-21-5p/miR-182-5p, miR-222-3p/miR-182-5p, miR-429/miR-182-5p, miR223-3p/miR-182-5p y miR-21-5p/miR-106a-5p.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Representación de las relaciones de valores de Ct de los pares miR-21-5p/miR-182-5p (A), miR-222-3p/miR-182-5p (B), miR223-3p/miR-182-5p (C) y miR-429/miR-182-5p (D) entre pacientes respondedores (R) y no respondedores (NR) a BCG. Se muestra la media de cada grupo y su desviación estándar. Curvas ROC para las relaciones de niveles de expresión de los pares miR-21-5p/miR-182-5p (E), miR-222-3p/miR-182-5p (F), miR223-3p/miR-182-5p (G) y miR-429/miR-182-5p (H), obtenidas a partir de los resultados mostrados en las gráficas A-D. Los valores de AUC de las curvas ROC fueron los siguientes: 0,90 (E), 0,88 (F), 0,84 (G) y 0,87 (H).

Figura 2. Representación de las relaciones de valores de Ct de los pares miR-21-5p/miR-182-5p (A) y miR-21-5p/miR-106a-5p (B) entre pacientes respondedores (R) y no respondedores (NR) a BCG. Se muestra la media de cada grupo y su desviación estándar. Curvas ROC para las relaciones de niveles de expresión de los pares miR-21-5p/miR-182-5p (C) y miR-21-5p/miR-106a-5p (D), obtenidas a partir de los resultados mostrados en las gráficas A-B. Los valores de AUC de las curvas ROC obtenidos fueron 0,79 (C) y 0,76 (D).

Figura 3. Representación de los valores de Ct de miR-182-5p (A), miR-106a-5p (B) y miR-21-5p (C) entre pacientes respondedores (R) y no respondedores (NR) a BCG. Se muestra la media de cada grupo y su desviación estándar. Correlación entre los valores de Ct de miR-182-5p (D), miR-106a-5p (E) y miR-21-5p (F) en tejido y en orina.

DESCRIPCIÓN DE MODOS DE REALIZACIÓN

Cohortes de pacientes

Se utilizaron muestras de tres cohortes de pacientes procedentes del Hospital 12 de Octubre de Madrid, España: cohorte de descubrimiento, cohorte de validación y cohorte de prueba.

La Tabla 1 muestra las características y parámetros clínico-patológicos de los pacientes de la cohorte de descubrimiento, que estaba compuesta por 39 pacientes (25 respondedores y 14 no respondedores a la terapia con BCG). Se disponía de muestras de tejido tumoral primario parafinado de dichos pacientes, tomadas en el momento de la resección transuretral del tumor de vejiga (RTUV) y a los que posteriormente se sometió a terapia con instilación de BCG.

Tabla 1

Tx = estadio tumoral no determinado

La Tabla 2 muestra las características y parámetros clínico-patológicos de los pacientes de la cohorte de validación, que estaba compuesta por 43 pacientes (28 respondedores y 15 no respondedores a la terapia con BCG). Se disponía de muestras de tejido tumoral primario parafinado de dichos pacientes, tomadas en el momento de la resección transuretral del tumor de vejiga (RTUV) y a los que posteriormente se sometió a terapia con instilación de BCG.

Tabla 2

La Tabla 3 muestra las características y parámetros clínico-patológicos de los pacientes de la cohorte de prueba, que estaba compuesta por 20 pacientes (11 respondedores y 9 no respondedores a la terapia con BCG). Se disponía de muestras orina de dichos pacientes obtenidas previamente a la resección transuretral del tumor de vejiga (RTUV) y a los que posteriormente se sometió a terapia con instilación de BCG.

Tabla 3

Tx = estadio tumoral no determinado; Gx = grado tumoral no determinado.

Ejemplo 1. miARNs diferencialmente expresados en muestras de tejido de pacientes respondedores y no respondedores a la terapia con BCG

En muestras de tejido tumoral parafinado de los 39 pacientes con cáncer de vejiga tratados con BCG de la cohorte de descubrimiento (25 respondedores y 14 no respondedores a la terapia con BCG), se detectó la expresión de miARNs mediante el ensayo digital nCounter Human v3 miRNA panel (NanoString Technologies, Inc.). Dichas muestras de tejido tumoral primario parafinado de pacientes de la cohorte de descubrimiento fueron tomadas en el momento de la resección transuretral del tumor de vejiga (RTUV) y a los que posteriormente se sometió a terapia con instilación de BCG.

Se realizó un análisis estadístico de los resultados del ensayo digital. En dicho análisis estadístico, se identificaron 26 miARNs diferencialmente expresados (7 inducidos y 19 reprimidos) entre pacientes respondedores y no respondedores a la terapia con BCG (Tabla 4). Dichos 26 miARNs estaban diferencialmente expresados en los tumores de los pacientes que mostraron una respuesta satisfactoria respecto a los que presentaron recurrencia del tumor en un periodo inferior a 3 años.

Los valores de incremento relativo de expresión entre pacientes respondedores y no respondedores a la terapia con BCG se muestran en la Tabla 4. Dichos valores de incremento relativo de expresión entre pacientes respondedores y no respondedores a la terapia con BCG oscilan entre 20,37 (para miR-579-3p) y -7.28 (para miR-1-3p).

Adicionalmente, se detectó la expresión de los 26 miARNs mediante RT-qPCR y se realizó un análisis estadístico de los datos obtenidos con ambos ensayos. La Tabla 4 muestra el valor p obtenido en el análisis estadístico entre respondedores (R) y no respondedores (NR) obtenidos en el ensayo digital y en el ensayo por RT-qPCR.

Tabla 4

En negrita, miARNs inducidos, el resto de miARNs son miARNs reprimidos. NS: no significativo.

* Las secuencias de dichos miARNs son idénticas

** En el ensayo de Nanostring, dicho miARN y miR-17-5p, que solo se distingue de miR-106a-5p en un nucleótido, son indistinguibles.

La Tabla 5 muestra la correspondencia entre las secuencias del listado de secuencias y las

secuencias maduras de los miARNs.

Tabla 5

Ejemplo 2. Pares de miARNs en la predicción de respuesta a la terapia con BCG

En muestras de tejido tumoral parafinado de los 43 pacientes con cáncer de vejiga tratados con BCG de la cohorte de validación (28 respondedores y 15 no respondedores a la terapia con BCG), se obtuvieron los valores de Ct mediante RT-qPCR de cada uno de los 26 miARNs de la Tabla 4. Dichas muestras de tejido tumoral primario parafinado de pacientes de la cohorte de validación fueron tomadas en el momento de la resección transuretral del tumor de vejiga (RTUV) y a los que posteriormente se sometió a terapia con instilación de BCG.

Se realizó un análisis estadístico para evaluar la capacidad de pares de los 26 miARNs de la Tabla 4 para discriminar entre muestras correspondientes a pacientes respondedores y pacientes no respondedores a BCG. Sorprendentemente, los pares miR-21-5p/miR-182-5p, miR-222-3p/miR-182-5p, miR-429/miR-182-5p y miR223-3p/miR-182-5p diferenciaban pacientes respondedores de pacientes no respondedores a BCG con una muy elevada significación estadística y muy elevados valores AUC. La Figura 1 muestra los valores de las relaciones de Ct, obtenidas dividiendo el valor de Ct del miARN que disminuye por el valor de Ct del miARN que aumenta. El valor de Ct es inversamente proporcional a la cantidad de miARN detectado en la muestra y, en consecuencia, los valores de las relaciones de Ct obtenidos son positivos. Los valores AUC obtenidos iban desde 0,84 para el par miR223-3p/miR-182-5p hasta 0,90 para el par miR-21-5p/miR-182-5p (Figura 1).

Ejemplo 3. Evaluación de miARNs y pares de miARNs en la predicción de respuesta a la terapia con BCG en muestras de orina

Se evaluó la capacidad de los biomarcadores miR-21-5p, miR-182-5p y miR-106a-5p y los pares miR-21-5p/miR-182-5p y miR-21-5p/miR-106a-5p para discriminar entre muestras correspondientes a pacientes respondedores y pacientes no respondedores a BCG en muestras de orina de los 20 pacientes de la cohorte de prueba (11 respondedores y 9 no respondedores a la terapia con BCG), que habían sido obtenidas previamente a la resección transuretral del tumor de vejiga (RTUV) en dichos pacientes y a los que posteriormente se sometió a terapia con instilación de BCG.

Se realizó un análisis estadístico para evaluar la capacidad de dichos biomarcadores para discriminar entre muestras correspondientes a pacientes respondedores y pacientes no respondedores a BCG en muestras de orina.

Sorprendentemente, los pares miR-21-5p/miR-106a-5p y miR-21-5p/miR-182-5p diferenciaban pacientes respondedores de pacientes no respondedores a la terapia con BCG con una elevada significación estadística y elevados valores AUC. Los valores AUC obtenidos fueron 0,79 para el par miR-21-5p/miR-106a-5p y 0,76 para el par miR-21-5p/miR-182-5p (Figura 2), lo que demuestra que dichos pares de miARNs son buenos predictores de la respuesta de los pacientes de cáncer de vejiga a la terapia con BCG.

Los valores de expresión Ct de miR-21-5p, miR-182-5p y miR-106a-5p diferenciaban pacientes respondedores de pacientes no respondedores a la terapia con BCG en muestras de orina con una elevada significación estadística (Figura 3A-C). Por tanto, los miARNs miR-21-5p y miR-106a-5p son buenos predictores de la respuesta de los pacientes con cáncer de vejiga a la terapia con BCG. Los valores de expresión de miR-21-5p y miR-106a-5p mostraron una buena correlación con los niveles obtenidos en tejido tumoral (Figura 3D-F).

LISTA DE REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• Kiselyov et al. (2015). Treatment of non-muscle invasive bladder cáncer with Bacillus Calmette-Guerin (BCG): Biological markers and simulation studies. BBA Clin., 10(4), 27 34.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para predecir la respuesta, de un sujeto con cáncer de vejiga, a una terapia con Bacillus Calmette-Guérin (BCG), que comprende determinar en una muestra obtenida de dicho sujeto el nivel de expresión o relación de niveles de expresión de: (i) al menos un par de miARNs seleccionado del grupo que consiste en: miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182, miR223/miR-182 y miR-21/miR-106a; o combinaciones de dichos pares; o

(ii) al menos un miARN seleccionado del grupo que consiste en: miR-21, miR-106a, miR-17, miR-222, miR-429, miR-223, let-7c, miR-29a, miR-199a, miR-199b, miR-23a, miR-218, miR-125b, miR-23b, miR-1, miR-483, miR-145, miR-4443, miR-874, miR-497, miR-143, miR-574, miR-579, miR-342 y miR-99a; o combinaciones de los mismos; y comparar dicho nivel de expresión o relación de niveles de expresión, con un valor de referencia, en el que, una diferencia en dicha comparación, es indicativa de la respuesta de dicho sujeto a la terapia con BCG.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la muestra es una muestra de tejido, o de orina.

3. El método según la reivindicación 2, en el que la muestra de tejido es una muestra de tejido tumoral de cáncer de vejiga.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se determina la relación de niveles de expresión de al menos un par de miRNAS seleccionado entre: miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182 y miR223/miR-182; siendo la muestra, una muestra de tejido.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se determina la relación de niveles de expresión de al menos un par de miRNAs seleccionado entre: miR-21/miR-182, o miR-21/miR-106a; siendo la muestra, orina.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se determina el nivel de expresión de un miARN seleccionado entre: miR-21, o miR-106a; siendo la muestra, orina.

7. Uso in vitro de un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en:

(i) al menos un par de miARNs seleccionado entre: miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182, miR223/miR-182 y miR-21/miR-106a; o combinaciones de dichos pares; o

(ii) miR-21, miR-106a, miR-17, miR-222, miR-429, miR-223, let-7c, miR-29a, miR-199a, miR-199b, miR-23a, miR-218, miR-125b, miR-23b, miR-1, miR-483, miR-145, miR-4443, miR-874, miR-497, miR-143, miR-574, miR-579, miR-342 y miR-99a; o combinaciones de los mismos;

para predecir la respuesta de un sujeto con cáncer de vejiga, a una terapia con Bacillus Calmette-Guérín (BCG), en el que el nivel de expresión, o relación de niveles de expresión de dicho biomarcador, en una muestra obtenida de dicho sujeto, es indicativo de la respuesta de dicho sujeto a la terapia con BCG.

8. El uso según la reivindicación 7, en el que la muestra es una muestra de tejido, o de orina.

9. El uso según la reivindicación 8, en el que la muestra de tejido, es una muestra de tejido tumoral, de cáncer de vejiga.

10. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que dicho biomarcador está seleccionado del grupo de pares de miARNs que consiste en: miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182 y miR223/miR-182, siendo la muestra, una muestra de tejido.

11. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que dicho biomarcador está seleccionado entre los pares de miARNs: miR-21/miR-182, o miR-21/miR-106a, siendo la muestra, orina.

12. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que dicho biomarcador está seleccionado entre: miR-21, o miR-106a, siendo la muestra, orina.

13. Un kit para predecir la respuesta de un sujeto con cáncer de vejiga a una terapia con Bacillus Calmette-Guérín (BCG), que comprende los reactivos necesarios para determinar, en una muestra obtenida de dicho sujeto, el nivel de expresión o relación de niveles de expresión de:

(i) al menos un biomarcador seleccionado del grupo de pares de miARNs que consiste en: miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182, miR223/miR-182 y miR-21/miR-106a; o combinaciones de dichos pares; o

14. El kit según la reivindicación 13, en el que la muestra ensayada en dicho kit es una muestra de tejido, o de orina.

15. El kit según la reivindicación 14, en el que la muestra de tejido ensayada en dicho kit es una muestra de tejido tumoral de cáncer de vejiga.

16. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicho biomarcador está seleccionado del grupo de pares de miARNs que consiste en: miR-21/miR-182, miR-222/miR-182, miR-429/miR-182 y miR223/miR-182; siendo la muestra ensayada en dicho kit, una muestra de tejido.

17. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicho biomarcador está seleccionado entre los pares de miARNs: miR-21/miR-182, o miR-21/miR-106a; siendo la muestra ensayada en dicho kit, orina.

18. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicho biomarcador está seleccionado entre: miR-106a, o miR-21; siendo la muestra ensayada en dicho kit, orina.