ES2846746T3 - Composiciones, sistemas y métodos para detectar acontecimientos usando fijaciones ancladas o adyacentes a nanoporos - Google Patents

Abstract

Una composición que incluye: un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados; una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas, estando la región de cabeza anclada a una polimerasa y dispuesta en el primer lado del nanoporo, estando la región de cola dispuesta en el segundo lado, incluyendo el cuerpo alargado un resto; la polimerasa dispuesta adyacente al primer lado del nanoporo; y un primer nucleótido que incluye un primer marcador alargado, incluyendo el primer marcador alargado un primer resto que interactúa con el resto de la fijación en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones, sistemas y métodos para detectar acontecimientos usando fijaciones ancladas o adyacentes a nanoporos

Campo

La presente solicitud se refiere en general a la detección de acontecimientos moleculares, tales como el movimiento de una molécula o una parte de esa molécula.

Antecedentes

Se ha invertido una cantidad significativa de tiempo y energía académicos y corporativos en la detección de acontecimientos, tales como el movimiento de una molécula o una parte de esa molécula, en particular cuando la molécula es ADN o una enzima que se une al ADN, tal como una polimerasa. Por ejemplo, Olsen et al., "Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment)", JACS 135: 7855-7860 (2013), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia, desvela la bioconjugación de moléculas individuales del fragmento de Klenow (KF) de la ADN polimerasa I en nanocircuitos electrónicos para permitir registros eléctricos de la función enzimática y la variabilidad dinámica con la resolución de acontecimientos de incorporación de nucleótidos individuales. O, por ejemplo, Hurt et al., "Specific Nucleotide Binding and Rebinding to Individual DNA Polymerase Complexes Captured on a Nanopore", JACS 131: 3772-3778 (2009), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia, desvela la medición del tiempo de permanencia de complejos de ADN con el KF encima de un nanoporo en un campo eléctrico aplicado. O, por ejemplo, Kim et al., "Detecting single-abasic residues within a DNA strand immobilized in a biological nanopore using an integrated CMOS sensor", Sens. Actuators B Chem. 177: 1075-1082 (2012), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia, desvela el uso de un sensor de medición de flujo o corriente en experimentos que implican ADN capturado en un nanoporo de a-hemolisina. O, por ejemplo, Garalde et al., "Distinct Complexes of DNA Polymerase I (Klenow Fragment) for Based and Sugar Discrimination during Nucleotide Substrate Selection", J. Biol. Chem. 286: 14480-14492 (2011), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia, desvela la distinción de complejos KF-ADN en función de sus propiedades cuando se capturan en un campo eléctrico encima de un poro de a-hemolisina. Otras referencias que desvelan mediciones que implican ahemolisina incluyen las siguientes, todas de Howorka et al., cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia: "Kinetics of duplex formation for individual DNA strands within a single protein nanopore", PNAS 98: 12996-13301 (2001); "Probing Distance and Electrical Potential within a Protein Pore with Tethered DNA", Biophysical Journal 83: 3202-3210 (2002); y "Sequence-specific detection of individual DNA strands using engineered nanopores", Nature Biotechnology 19: 636-639 (2001).

patente de los Estados Unidos n.° 8.652.779 de Turner et al., cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia, desvela composiciones y métodos de secuenciación de ácido nucleico utilizando un único complejo de enzima polimerasa que incluye una enzima polimerasa y un ácido nucleico molde unido próximo a un nanoporo y análogos de nucleótidos en solución. Los análogos de nucleótidos incluyen marcadores de bloqueo de carga que se unen a la parte de polifosfato del análogo de nucleótido de modo que los marcadores de bloqueo de carga se escinden cuando el análogo de nucleótido se incorpora a un ácido nucleico en crecimiento. Según Turner, el marcador de bloqueo de carga es detectada por el nanoporo para determinar la presencia e identidad del nucleótido incorporado y determinar de este modo la secuencia de un ácido nucleico molde. Publicación de patente de los Estados Unidos n.° 2014/0051069 de Jayasinghe et al., cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia, se refiere a construcciones que incluyen una subunidad de poros de proteína transmembrana y una enzima de manipulación de ácidos nucleicos.

Sin embargo, composiciones, sistemas y métodos previamente conocidos, tales como los descritos por Olsen, Hurt, Kim, Garalde, Howorka, Turner y Jayasinghe pueden no ser necesariamente lo suficientemente robustos, reproducibles o sensibles y pueden no tener un rendimiento suficientemente alto para la implementación práctica, p. ej., necesitando aplicaciones comerciales tales como secuenciación del genoma en entornos clínicos y de otro tipo que exigen un funcionamiento rentable y muy preciso. Por consiguiente, lo que se necesita son composiciones, sistemas y métodos mejorados para detectar acontecimientos.

Sumario

La invención se define en las reivindicaciones independientes adjuntas. Se definen características preferidas o ventajosas de la invención en las reivindicaciones dependientes.

En un aspecto de la divulgación, una composición incluye un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través de los primer y segundo lados; y una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas. La región de cabeza puede estar anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo. El cuerpo alargado que incluye una región indicadora puede ser móvil dentro de la abertura en respuesta a un primer acontecimiento que se produzca adyacente al primer lado del nanoporo. En un ejemplo no limitativo, la región de cabeza se puede anclar en una molécula, tal como una proteína, dispuesta en el primer o segundo lado del nanoporo.

En algunas realizaciones, la región indicadora es móvil de forma traslacional dentro de la abertura en respuesta al primer acontecimiento. De manera adicional, o como alternativa, la región indicadora puede ser móvil de forma rotacional dentro de la abertura en respuesta al primer acontecimiento. De manera adicional, o como alternativa, la región indicadora puede ser móvil de forma conformacional dentro de la abertura en respuesta al primer acontecimiento.

En algunas realizaciones, la región de cabeza está anclada a o adyacente al primer lado o al segundo lado del nanoporo mediante un enlace covalente. La región de cabeza se puede anclar al primer lado del nanoporo. La región de cola puede extenderse libremente hacia el segundo lado del nanoporo.

En algunas realizaciones, la región indicadora es móvil de forma traslacional hacia el primer lado del nanoporo en respuesta al primer acontecimiento. La región indicadora puede ser móvil de forma traslacional hacia el segundo lado después del primer acontecimiento. Además, la región indicadora puede ser móvil de forma traslacional hacia el primer lado en respuesta a un segundo acontecimiento que se produce adyacente al primer lado del nanoporo, siendo el segundo acontecimiento después del primer acontecimiento. Además, la región indicadora puede ser móvil de forma traslacional hacia el segundo lado después del segundo acontecimiento. En algunas realizaciones, el primer acontecimiento incluye la adición de un primer nucleótido a un polinucleótido. En realizaciones que incluyen un segundo acontecimiento, el segundo acontecimiento puede incluir la adición de un segundo nucleótido al polinucleótido.

Una característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la región indicadora puede ser diferente de una característica de bloqueo eléctrico o de flujo de otra región del cuerpo alargado.

Un sistema puede incluir una circuitería de composición y medición configurada para medir una primera corriente o flujo a través de la abertura o para medir una primera señal óptica mientras la región indicadora se mueve en respuesta al primer acontecimiento.

En algunas realizaciones, la composición incluye además una proteína dispuesta adyacente al primer lado del nanoporo y el primer acontecimiento incluye un primer cambio conformacional de la proteína. La proteína no es, en general, un componente nativo de un nanoporo.

En algunas realizaciones, la región de cabeza está anclada a la proteína. El primer cambio conformacional puede mover la región de cabeza y el movimiento de la región de cabeza puede mover de forma traslacional la región indicadora.

En algunas realizaciones, la proteína está en contacto con el primer lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la proteína puede estar anclada a o adyacente al primer lado del nanoporo.

En algunas realizaciones, la proteína incluye una enzima. Por ejemplo, la enzima puede incluir una polimerasa. El primer cambio conformacional puede producirse en respuesta a la acción de la polimerasa sobre un primer nucleótido. En algunas realizaciones, el primer cambio conformacional mueve la región de cabeza y el movimiento de la región de cabeza mueve de forma traslacional la región indicadora. El primer nucleótido puede ser identificable en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de un cambio en una corriente o flujo a través de la abertura o una primera señal óptica en respuesta al movimiento de traslación de la región indicadora.

Además, la región indicadora puede ser móvil de forma traslacional en respuesta a un segundo cambio conformacional de la polimerasa que se produce en respuesta a la polimerasa que actúa sobre un segundo nucleótido. En algunas realizaciones, el primer nucleótido es identificable en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de un primer cambio en una corriente o flujo a través de la abertura o una primera señal óptica en respuesta al movimiento de traslación de la región indicadora en respuesta al primer cambio conformacional. El segundo nucleótido puede ser identificable en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de un segundo cambio en la corriente o flujo a través de la abertura o una segunda señal óptica en respuesta al movimiento de traslación de la región indicadora en respuesta al segundo cambio conformacional. En algunas realizaciones, el primer y segundo nucleótidos son distinguibles individualmente entre sí en función del primer y segundo cambios en la corriente o flujo o en función de la primera y segunda señales ópticas.

En algunas realizaciones, la composición incluye además una polimerasa dispuesta adyacente al primer lado del nanoporo y el primer acontecimiento incluye la acción de la polimerasa sobre un primer nucleótido. El primer nucleótido puede incluir un marcador alargado que incluye un resto que interactúa con la fijación. La interacción del resto con la fijación puede mover de forma traslacional la región indicadora.

En algunas realizaciones, el cuerpo alargado de la fijación puede incluir un polímero sintético. En algunas realizaciones, la fijación incluye un primer oligonucleótido. Un nucleótido abásico del primer oligonucleótido puede definir la región indicadora. De manera adicional, o como alternativa, el resto puede incluir un segundo oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido. La hibridación del segundo oligonucleótido con el primer oligonucleótido puede acortar la fijación en una primera cantidad. En algunas realizaciones, el primer nucleótido es identificable en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de cambio en una corriente o flujo a través de la abertura o una señal óptica en respuesta al acortamiento de la fijación en la primera cantidad. En algunas realizaciones, la región indicadora es móvil además de forma traslacional hacia el primer lado en respuesta a la acción de la polimerasa sobre un segundo nucleótido. El segundo nucleótido puede incluir un tercer oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido. La hibridación del tercer oligonucleótido con el primer oligonucleótido puede acortar la fijación en una segunda cantidad. En algunas realizaciones, el primer nucleótido es identificable en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de un primer cambio en una corriente o flujo a través de la abertura o una primera señal óptica en respuesta al acortamiento de la fijación en la primera cantidad. En realizaciones que incluyen un segundo nucleótido, el segundo nucleótido puede ser identificable en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de un segundo cambio en la corriente o flujo a través de la abertura o una segunda señal óptica en respuesta al acortamiento de la fijación en la segunda cantidad. En algunas realizaciones, el primer y segundo nucleótidos son distinguibles individualmente entre sí en función del primer y segundo cambios en la corriente o flujo o en función de la primera y segunda señales ópticas.

En algunas realizaciones, la región de cabeza se ancla al primer lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la polimerasa está en contacto con el primer lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la polimerasa está anclada a o adyacente al primer lado del nanoporo.

Algunas realizaciones incluyen además una polimerasa dispuesta en el primer lado, estando la región de cabeza anclada a la polimerasa. Algunas realizaciones incluyen además un primer nucleótido y un primer y segundo polinucleótidos, cada uno en contacto con la polimerasa, la polimerasa configurada para añadir el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. En algunas realizaciones, la polimerasa se modifica para retardar la liberación de pirofosfato en respuesta a la adición del primer nucleótido al primer polinucleótido. En algunas realizaciones, la polimerasa incluye una polimerasa 029, B103, GA-1, PZA, 015, BS32, M2Y, Nf, G1, Cp-1, PRD1, PZE, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 o L17 recombinante modificada. En algunas realizaciones, la polimerasa incluye una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: una sustitución de aminoácido en la posición 484, una sustitución de aminoácido en la posición 198 y una sustitución de aminoácido en la posición 381. En algunas realizaciones, la polimerasa incluye una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en E375Y, K512Y, T368F, A484E, A484Y, N387L, T372Q, T372L, K478Y, 1370W, F198W y L381A.

En algunas realizaciones, la composición incluye además una polimerasa dispuesta en el primer lado, estando la región de cabeza anclada a la polimerasa. Algunas realizaciones incluyen además un primer nucleótido y un primer y segundo polinucleótidos, cada uno en contacto con la polimerasa, la polimerasa configurada para añadir el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. En algunas realizaciones, el primer nucleótido está acoplado a un terminador reversible que inhibe la adición por parte de la polimerasa de un segundo nucleótido al primer polinucleótido. En algunas realizaciones, el terminador reversible se puede escindir mediante exposición a la luz o al calor. En algunas realizaciones, el terminador reversible se puede escindir mediante absorción de calor de la luz. En algunas realizaciones, el terminador reversible se puede escindir mediante una reacción fotoquímica inducida por la luz. En algunas realizaciones, el terminador reversible se puede escindir mediante reacción con un agente químico. En algunas realizaciones, la composición incluye además una fuente del agente químico. En algunas realizaciones, el terminador reversible está dispuesto en el primer lado y la fuente del agente químico está dispuesta en el segundo lado de manera que el agente químico se mueva desde el segundo lado al primer lado a través de la abertura. En algunas realizaciones, el terminador reversible incluye azidometilo (CH2N3) y el agente químico incluye THP.

En algunas realizaciones, un aparato incluye una composición de este tipo, en donde la composición está presente en una celda de flujo y la celda de flujo está configurada para reponer los reactivos que están en contacto con la polimerasa.

En otro aspecto de la divulgación, un método incluye proporcionar un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través de los primer y segundo lados; y proporcionar una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas. La región de cabeza puede estar anclada a o adyacente al primer o segundo lado del nanoporo y el cuerpo alargado puede incluir una región indicadora. El método puede incluir mover el indicador dentro de la abertura en respuesta a un primer acontecimiento que se produce adyacente al primer lado del nanoporo.

En algunas realizaciones, la región indicadora se mueve de forma traslacional dentro de la abertura en respuesta al primer acontecimiento. De manera adicional, o como alternativa, la región indicadora se puede mover de forma rotacional dentro de la abertura en respuesta al primer acontecimiento. De manera adicional, o como alternativa, la región indicadora se mueve de forma conformacional dentro de la abertura en respuesta al primer acontecimiento. En algunas realizaciones, la región de cabeza está anclada a o adyacente al primer lado o al segundo lado del nanoporo mediante un enlace covalente. En algunas realizaciones, la región de cabeza se ancla al primer lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la región de cola se extiende libremente hacia el segundo lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la región indicadora se mueve de forma traslacional hacia el primer lado del nanoporo en respuesta al primer acontecimiento. Algunas realizaciones incluyen además mover de forma traslacional la región indicadora hacia el segundo lado después del primer acontecimiento. Algunas realizaciones incluyen además mover de forma traslacional la región indicadora hacia el primer lado en respuesta a un segundo acontecimiento que se produce adyacente al primer lado del nanoporo, siendo el segundo acontecimiento después del primer acontecimiento. Algunas realizaciones incluyen además mover de forma traslacional la región indicadora hacia el segundo lado después del segundo acontecimiento. En algunas realizaciones, el primer acontecimiento incluye la adición de un primer nucleótido a un polinucleótido. En algunas realizaciones, el segundo acontecimiento incluye la adición de un segundo nucleótido al polinucleótido.

En algunas realizaciones, una característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la región indicadora es diferente de una característica de bloqueo eléctrico o de flujo de otra región del cuerpo alargado.

El método puede incluir además medir una primera corriente o flujo a través de la abertura o una primera señal óptica mientras la región indicadora se mueve en respuesta al primer acontecimiento.

En algunas realizaciones, se dispone una proteína adyacente al primer lado del nanoporo y el primer acontecimiento incluye un primer cambio conformacional de la proteína. La región de cabeza se puede anclar a la proteína. El primer cambio conformacional puede mover la región de cabeza y el movimiento de la región de cabeza puede mover de forma traslacional la región indicadora.

En algunas realizaciones, la proteína está en contacto con el primer lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la proteína está anclada a o adyacente al primer lado del nanoporo.

En algunas realizaciones, la proteína incluye una enzima. Por ejemplo, la enzima puede incluir una polimerasa. El primer cambio conformacional puede producirse en respuesta a la acción de la polimerasa sobre un primer nucleótido. En algunas realizaciones, el primer cambio conformacional mueve la región de cabeza y el movimiento de la región de cabeza mueve de forma traslacional la región indicadora. Algunas realizaciones incluyen además la identificación del primer nucleótido en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de un cambio en una corriente o flujo a través de la abertura o una señal óptica en respuesta al movimiento de traslación de la región indicadora.

Algunas realizaciones incluyen además mover de forma traduccional la región indicadora en respuesta a un segundo cambio conformacional de la polimerasa que se produce en respuesta a la acción de la polimerasa sobre un segundo nucleótido. Algunas realizaciones incluyen además la identificación del primer nucleótido en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de un primer cambio en una corriente o flujo a través de la abertura o una primera señal óptica en respuesta al movimiento de traslación de la región indicadora en respuesta al primer cambio conformacional. Algunas realizaciones incluyen además la identificación del segundo nucleótido en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de un segundo cambio en la corriente o flujo a través de la abertura o una segunda señal óptica en respuesta al movimiento de traslación de la región indicadora en respuesta al segundo cambio conformacional. En algunas realizaciones, el primer y segundo nucleótidos son distinguibles individualmente entre sí en función del primer y segundo cambios en la corriente o flujo o en función de la primera y segunda señales ópticas.

Algunas realizaciones incluyen disponer una polimerasa adyacente al primer lado del nanoporo y el primer acontecimiento puede incluir la acción de la polimerasa sobre un primer nucleótido. El primer nucleótido puede incluir un marcador alargado que incluye un resto que interactúa con la fijación. La interacción del resto con la fijación puede mover de forma traslacional la región indicadora.

En algunas realizaciones, el cuerpo alargado de la fijación incluye un polímero sintético. En algunas realizaciones, la fijación incluye un primer oligonucleótido. En algunas realizaciones, un nucleótido abásico del primer oligonucleótido define la región indicadora. En algunas realizaciones, el resto incluye un segundo oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido. La hibridación del segundo oligonucleótido con el primer oligonucleótido puede acortar la fijación en una primera cantidad. Algunas realizaciones incluyen además la identificación del primer nucleótido en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de un cambio en una corriente o flujo a través de la abertura o una señal óptica en respuesta al acortamiento de la fijación en la primera cantidad. Algunas realizaciones también incluyen mover de forma traslacional la región indicadora hacia el primer lado en respuesta a la acción de la polimerasa sobre un segundo nucleótido. El segundo nucleótido puede incluir un tercer oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido. La hibridación del tercer oligonucleótido con el primer oligonucleótido puede acortar la fijación en una segunda cantidad. Algunas realizaciones incluyen además la identificación del primer nucleótido en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de un primer cambio en una corriente o flujo a través de la abertura o una primera señal óptica en respuesta al acortamiento de la fijación en la primera cantidad. Algunas realizaciones incluyen además la identificación del segundo oligonucleótido en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de un segundo cambio en la corriente o flujo a través de la abertura o una segunda señal óptica en respuesta al acortamiento de la fijación en la segunda cantidad. El primer y segundo nucleótidos pueden ser distinguibles individualmente entre sí en función del primer y segundo cambios en la corriente o flujo o en función de la primera y segunda señales ópticas.

En algunas realizaciones, la región de cabeza se ancla al primer lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la polimerasa está en contacto con el primer lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la polimerasa está anclada a o adyacente al primer lado del nanoporo.

En algunas realizaciones, el método incluye disponer una polimerasa en el primer lado, estando la región de cabeza anclada a la polimerasa. En algunas realizaciones, el método incluye además poner en contacto la polimerasa con un primer nucleótido y con un primer y segundo polinucleótidos, añadiendo la polimerasa el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. En algunas realizaciones, la polimerasa se modifica para retardar la liberación de pirofosfato en respuesta a la adición del primer nucleótido al primer polinucleótido. En algunas realizaciones, la polimerasa incluye una polimerasa 029, B103, GA-1, PZA, 015, BS32, M2Y, Nf, G1, Cp-1, PRD1, PZE, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 o L17 recombinante modificada. En algunas realizaciones, la polimerasa incluye una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: una sustitución de aminoácido en la posición 484, una sustitución de aminoácido en la posición 198 y una sustitución de aminoácido en la posición 381. En algunas realizaciones, la polimerasa incluye una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en E375Y, K512Y, T368F, A484E, A484Y, N387L, T372Q, T372L, K478Y, 1370W, F198W y L381A.

En algunas realizaciones, la polimerasa está dispuesta en el primer lado, estando la región de cabeza anclada a la polimerasa. En algunas realizaciones, el método incluye además poner en contacto la polimerasa con un primer nucleótido y con un primer y segundo polinucleótidos, añadiendo la polimerasa el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. En algunas realizaciones, el primer nucleótido está acoplado a un terminador reversible, incluyendo el método además inhibir, mediante el terminador reversible, la adición por la polimerasa de un segundo nucleótido al primer polinucleótido. En algunas realizaciones, el método incluye además escindir el terminador reversible mediante exposición a luz o calor. Algunas realizaciones incluyen escindir el terminador reversible mediante absorción de calor de la luz. Algunas realizaciones incluyen escindir el terminador reversible mediante una reacción fotoquímica inducida por la luz. Algunas realizaciones incluyen escindir el terminador reversible mediante reacción con un agente químico. Algunas realizaciones incluyen proporcionar una fuente del agente químico. Algunas realizaciones incluyen hacer fluir líquido a través de la polimerasa para eliminar el agente químico. Algunas realizaciones incluyen aportar nuevos reactivos a la polimerasa mediante flujo de líquido. En algunas realizaciones, el terminador reversible está dispuesto en el primer lado y la fuente del agente químico está dispuesta en el segundo lado, incluyendo el método mover el agente químico del segundo lado al primer lado a través de la abertura. En algunas realizaciones, el terminador reversible incluye azidometilo (CH2N3) y el agente químico incluye THP.

En aún otro aspecto de la divulgación, una composición incluye un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través de los primer y segundo lados; y una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas. La región de cabeza puede estar anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo y el cuerpo alargado puede incluir un resto. Puede disponerse una polimerasa adyacente al primer lado del nanoporo. La composición también puede incluir un primer nucleótido que incluye un primer marcador alargado. El primer marcador alargado puede incluir un primer resto que interactúa con el resto de la fijación en respuesta a la polimerasa que actúa sobre el primer nucleótido. En algunas realizaciones, la región de cabeza está anclada a o adyacente al primer lado o al segundo lado del nanoporo mediante un enlace covalente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la región de cabeza se ancla al primer lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la región de cola se extiende libremente hacia el segundo lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la región de cola es móvil entre el primer y el segundo lado del nanoporo en respuesta a una tensión aplicada. O, por ejemplo, en algunas realizaciones, la región de cabeza se ancla al segundo lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la región de cola se extiende libremente hacia el primer lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la región de cola es móvil entre el primer y el segundo lado del nanoporo en respuesta a una tensión aplicada.

La polimerasa puede estar en contacto con el primer lado del nanoporo. La polimerasa puede estar anclada a o adyacente al primer lado del nanoporo.

En algunas realizaciones, la interacción entre el primer resto y el resto de la fijación define una doble cadena. El nanoporo puede incluir además una constricción dispuesta entre el primer y el segundo lado. El anclaje de la región de cabeza a o adyacente al primer o segundo lado del nanoporo, o a la polimerasa, puede inhibir el movimiento de la doble cadena a través de la constricción. Como alternativa, o además, la doble cadena puede ser lo suficientemente grande para inhibir el movimiento de la doble cadena a través de la constricción.

En algunas realizaciones, el primer marcador alargado del primer nucleótido incluye además una primera región indicadora. Opcionalmente, la primera región indicadora puede configurarse para estar dispuesta dentro de la abertura en respuesta a la interacción del primer resto con el resto de la fijación. Un sistema puede incluir cualquier circuito de composición y medición de este tipo configurado para medir una corriente o flujo a través de la abertura o una señal óptica mientras la primera región indicadora está dispuesta dentro de la abertura. La corriente o el flujo o la señal óptica pueden basarse en una característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la primera región indicadora y el primer nucleótido puede identificarse en función de la corriente o el flujo o la señal óptica.

En algunas realizaciones, una composición incluye además un segundo nucleótido que incluye un segundo marcador alargado, incluyendo el segundo marcador alargado un segundo resto que interactúa con el resto de la fijación en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el segundo nucleótido. El segundo marcador alargado puede incluir además una segunda región indicadora. En algunas realizaciones, la segunda región indicadora está configurada para estar dispuesta dentro de la abertura en respuesta a la interacción del segundo resto con el resto de la fijación. Un sistema puede incluir cualquier circuito de composición y medición de este tipo configurado para medir una primera corriente o flujo a través de la abertura o una primera señal óptica mientras que la primera región indicadora está dispuesta dentro de la abertura y una segunda corriente o flujo a través de la abertura o una segunda señal óptica mientras la segunda región indicadora está dispuesta dentro de la abertura. La primera corriente o flujo o la primera señal óptica pueden basarse en una primera característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la primera región indicadora. El primer nucleótido puede identificarse en función de la primera corriente o flujo o la primera señal óptica. La segunda corriente o flujo o la segunda señal óptica pueden basarse en una segunda característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la segunda región indicadora. El segundo nucleótido puede identificarse en función de la segunda corriente o flujo o la segunda señal óptica. El primer y segundo nucleótidos pueden ser distinguibles individualmente entre sí en función de la primera y segunda corrientes o flujos o la primera y segunda señales ópticas.

En algunas realizaciones de las presentes composiciones, el primera marcador alargado se puede escindir del primer nucleótido en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido y el segundo marcador alargado se puede escindir del segundo nucleótido en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el segundo nucleótido.

En algunas realizaciones, el cuerpo alargado de la fijación incluye un polímero sintético. En algunas realizaciones, el resto de la fijación incluye un primer oligonucleótido. En algunas realizaciones, el primer resto incluye un segundo oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido. Un nucleótido abásico del segundo oligonucleótido puede definir la región indicadora. En algunas realizaciones, el segundo resto incluye un tercer oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido. En algunas realizaciones, el primer resto y el segundo resto son iguales entre sí. En algunas realizaciones, el cuerpo alargado de la fijación incluye además una región indicadora. La región indicadora puede disponerse en una ubicación predefinida con respecto al primer resto en respuesta a la interacción del primer resto con el resto de la fijación. La región indicadora puede ser móvil de forma traslacional dentro de la abertura en respuesta a una primera tensión aplicada. En algunas realizaciones, el nanoporo incluye además una constricción dispuesta entre el primer y el segundo lado. La región indicadora puede ser móvil de forma traslacional a una primera ubicación predeterminada con respecto a la constricción en respuesta a la primera tensión aplicada. Una característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la región indicadora puede ser diferente de una característica de bloqueo eléctrico o de flujo de otra región del cuerpo alargado.

Un sistema puede incluir un circuito de composición y medición de este tipo configurado para medir una corriente o flujo a través de la abertura o una señal óptica mientras la región indicadora está dispuesta en la primera ubicación predeterminada. La corriente o el flujo o la señal óptica pueden basarse en la característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la región indicadora y la primera ubicación predeterminada de la región indicadora, y el primer nucleótido puede identificarse en función de la corriente o el flujo o la señal óptica.

En algunas realizaciones, el primer resto y el resto de la fijación son disociables en respuesta a la primera tensión aplicada. El resto de la fijación puede ser móvil de forma traslacional a través de la constricción en respuesta a la disociación del primer resto y el resto de la fijación. En algunas realizaciones, el primer resto interactúa con el resto de la fijación en respuesta a una segunda tensión aplicada después de la primera tensión aplicada. En algunas realizaciones, la composición incluye además un segundo nucleótido que incluye un segundo marcador alargado, incluyendo el segundo marcador alargado un segundo resto que interactúa con el resto de la fijación en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el segundo nucleótido. La región indicadora puede disponerse en una ubicación predeterminada con respecto al segundo resto en respuesta a la interacción del segundo resto con el resto de la fijación. En algunas realizaciones, la región indicadora es móvil de forma traslacional dentro de la abertura en respuesta a una segunda tensión aplicada. En algunas realizaciones, el nanoporo incluye además una constricción dispuesta entre el primer y el segundo lado. La región indicadora puede ser móvil de forma traslacional a una segunda ubicación con respecto a la constricción en respuesta a la segunda tensión aplicada.

Una característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la región indicadora puede ser diferente de una característica de bloqueo eléctrico o de flujo de otra región del cuerpo alargado.

Un sistema puede incluir un circuito de composición y medición de este tipo configurado para medir una primera corriente o flujo a través de la abertura o una primera señal óptica mientras que la región indicadora está dispuesta en la primera ubicación en respuesta a la primera tensión aplicada y para medir una segunda corriente o flujo a través de la abertura o una segunda señal óptica mientras que la región indicadora está dispuesta en la segunda ubicación en respuesta a la segunda tensión aplicada. La primera corriente o flujo o primera señal óptica puede basarse en la característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la región indicadora y la primera ubicación predeterminada de la región indicadora. El primer nucleótido puede identificarse en función de la primera corriente o flujo o la primera señal óptica. La segunda corriente o flujo o segunda señal óptica puede basarse en la característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la región indicadora y la segunda ubicación predeterminada de la región indicadora. El segundo nucleótido puede identificarse en función de la segunda corriente o flujo o la segunda señal óptica. En algunas realizaciones, el primer y segundo nucleótidos son distinguibles individualmente entre sí en función de la primera corriente o flujo y la segunda corriente o flujo o en función de la primera y segunda señales ópticas. En algunas realizaciones, la primera y la segunda tensión tienen la misma magnitud entre sí y la segunda tensión es posterior a la primera tensión.

En algunas realizaciones de las presentes composiciones, el primera marcador alargado se puede escindir del primer nucleótido en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido y el segundo marcador alargado se puede escindir del segundo nucleótido en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el segundo nucleótido.

En algunas realizaciones, el cuerpo alargado de la fijación incluye un polímero sintético. En algunas realizaciones, el resto de la fijación incluye un primer oligonucleótido. Un nucleótido abásico del primer oligonucleótido puede definir la región indicadora. El primer resto puede incluir un segundo oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido. El segundo resto puede incluir un tercer oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido. El primer resto y el segundo resto pueden ser diferentes entre sí. La región indicadora puede ser móvil de manera traslacional dentro de la abertura en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido. Como alternativa, o además, la región indicadora puede ser móvil de forma rotacional dentro de la abertura en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido. Como alternativa, o además, la región indicadora puede ser móvil de forma conformacional dentro de la abertura en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido.

En algunas realizaciones, el cuerpo alargado de la fijación incluye un polímero sintético. En algunas realizaciones, el resto de la fijación incluye un primer oligonucleótido. Un nucleótido abásico del primer oligonucleótido puede definir la región indicadora. El primer resto puede incluir un segundo oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido. La hibridación del segundo oligonucleótido con el primer oligonucleótido puede acortar la fijación en una primera cantidad. El primer nucleótido puede ser identificable en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de cambio en una corriente o flujo a través de la abertura o una señal óptica en respuesta al acortamiento de la fijación en la primera cantidad.

En algunas realizaciones, el primer marcador alargado del primer nucleótido incluye además un primer compañero de par de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y la fijación incluye además un segundo compañero de par FRET. El primer compañero de par FRET y el segundo compañero de par FRET pueden interactuar entre sí en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido. Es detectable una primera longitud de onda emitida en respuesta a la interacción entre el primer compañero de par FRET y el segundo compañero de par FRET. La composición puede incluir además un segundo nucleótido que incluye un segundo marcador alargado, incluyendo el segundo marcador alargado un tercer compañero de par de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). Un sistema puede incluir una composición de este tipo. El tercer compañero de par FRET y el segundo compañero de par FRET pueden interactuar entre sí en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el segundo nucleótido. El sistema puede incluir un sistema de detección óptica configurado para detectar una segunda longitud de onda emitida en respuesta a la interacción entre el tercer compañero de par FRET y el segundo compañero de par FRET. El primer y segundo nucleótidos pueden ser distinguibles individualmente entre sí en función de la primera y segunda longitudes de onda.

En algunas realizaciones, la composición incluye además un primer y segundo polinucleótidos en contacto con la polimerasa, la polimerasa configurada para añadir el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. En algunas realizaciones, la polimerasa se modifica para retardar la liberación de pirofosfato en respuesta a la adición del primer nucleótido al primer polinucleótido. En algunas realizaciones, la polimerasa incluye una polimerasa 029, B103, GA-1, PZA, 015, BS32, M2Y, Nf, G1, Cp-1, PRD1, PZE, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 o L17 recombinante modificada. En algunas realizaciones, la polimerasa incluye una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: una sustitución de aminoácido en la posición 484, una sustitución de aminoácido en la posición 198 y una sustitución de aminoácido en la posición 381. En algunas realizaciones, la polimerasa incluye una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en E375Y, K512Y, T368F, A484E, A484Y, N387L, T372Q, T372L, K478Y, 1370W, F198W y L381A.

En algunas realizaciones, el primer resto y el resto de la fijación están configurados para hibridar entre sí para formar una estructura en horquilla. Un sistema puede incluir una composición de este tipo y una fuente de tensión configurada para aplicar una tensión a través del primer y segundo lados. El primer resto y el resto de la fijación se pueden configurar para deshibridar uno del otro en respuesta a la tensión en un proceso de dos etapas.

En algunas realizaciones, el primer marcador alargado incluye además un segundo resto, incluyendo la composición además un tercer resto anclado a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo, interactuando el segundo resto y el tercer resto en respuesta a la adición del primer nucleótido al primer polinucleótido. Un sistema puede incluir una composición de este tipo y una fuente de tensión configurada para aplicar una tensión a través del primer y segundo lados. En algunas realizaciones, el primer resto y el resto de la fijación están configurados para separarse uno del otro en respuesta a la tensión en un primer proceso y el segundo resto y el tercer resto están configurados para separarse uno del otro en respuesta a la tensión en un segundo proceso.

En algunas realizaciones, la composición incluye además un primer y segundo polinucleótidos en contacto con la polimerasa, la polimerasa configurada para añadir el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. En algunas realizaciones, el primer marcador alargado incluye además un terminador reversible que inhibe la adición por parte de la polimerasa de un segundo nucleótido al primer polinucleótido. En algunas realizaciones, el terminador reversible se puede escindir mediante exposición a la luz o al calor. En algunas realizaciones, el terminador reversible se puede escindir mediante absorción de calor de la luz. En algunas realizaciones, el terminador reversible se puede escindir mediante una reacción fotoquímica inducida por la luz. En algunas realizaciones, el terminador reversible se puede escindir mediante reacción con un agente químico. Algunas realizaciones incluyen además una fuente del agente químico. En algunas realizaciones, el terminador reversible está dispuesto en el primer lado y la fuente del agente químico está dispuesta en el segundo lado de manera que el agente químico se mueva desde el segundo lado al primer lado a través de la abertura. En algunas realizaciones, el terminador reversible incluye azidometilo (CH2N3) y el agente químico incluye THP.

En algunas realizaciones, un aparato incluye una composición de este tipo, en donde la composición está presente en una celda de flujo y la celda de flujo está configurada para reponer los reactivos que están en contacto con la polimerasa.

En otro aspecto más de la divulgación, un método incluye proporcionar un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través de los primer y segundo lados; y proporcionar una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas. La región de cabeza puede estar anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo y el cuerpo alargado puede incluir un resto. El método puede incluir además proporcionar una polimerasa dispuesta adyacente al primer lado del nanoporo y proporcionar un primer nucleótido que incluye un primer marcador alargado, incluyendo el primer marcador alargado un resto. El método puede incluir además actuar sobre el primer nucleótido con la polimerasa; e interactuar el primer resto con el resto de la fijación en respuesta a la polimerasa que actúa sobre el primer nucleótido.

En algunas realizaciones, la región de cabeza está anclada a o adyacente al primer lado o al segundo lado del nanoporo mediante un enlace covalente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la región de cabeza se ancla al primer lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la región de cola se extiende libremente hacia el segundo lado del nanoporo. Algunas realizaciones incluyen mover la región de cola entre el primer y segundo lado del nanoporo en respuesta a una tensión aplicada. O, por ejemplo, en algunas realizaciones, la región de cabeza se ancla al segundo lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la región de cola se extiende libremente hacia el primer lado del nanoporo. Algunas realizaciones incluyen mover la región de cola entre el primer y segundo lado del nanoporo en respuesta a una tensión aplicada.

En algunas realizaciones, la polimerasa está en contacto con el primer lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la polimerasa está anclada a o adyacente al primer lado del nanoporo.

En algunas realizaciones, la interacción entre el primer resto y el resto de la fijación define una doble cadena. El nanoporo puede incluir además una constricción dispuesta entre el primer y el segundo lado. El método puede incluir además inhibir el movimiento de la doble cadena a través de la constricción mediante el anclaje de la región de cabeza a o adyacente al primer o segundo lado del nanoporo. De manera adicional, o como alternativa, la doble cadena puede ser lo suficientemente grande para inhibir el movimiento de la doble cadena a través de la constricción.

En algunas realizaciones, el primer marcador alargado del primer nucleótido incluye además una primera región indicadora. Algunas realizaciones incluyen disponer la primera región indicadora dentro de la abertura en respuesta a la interacción del primer resto con el resto de la fijación. Algunas realizaciones incluyen además medir una corriente o flujo a través de la abertura o una señal óptica mientras la primera región indicadora está dispuesta dentro de la abertura. En algunas realizaciones, la corriente o el flujo o la señal óptica se basa en una característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la primera región indicadora y el primer nucleótido puede identificarse en función de la corriente o el flujo o la señal óptica. Algunas realizaciones incluyen además proporcionar un segundo nucleótido que incluye un segundo marcador alargado, incluyendo el segundo marcador alargado un segundo resto, que actúa sobre el segundo nucleótido con la polimerasa, e interactuando el segundo resto con el resto de la fijación en respuesta a la polimerasa que actúa sobre el segundo nucleótido. El segundo marcador alargado puede incluir además una segunda región indicadora. Algunas realizaciones incluyen disponer la segunda región indicadora dentro de la abertura en respuesta a la interacción del segundo resto con el resto de la fijación. Algunas realizaciones incluyen medir una primera corriente o flujo a través de la abertura o una primera señal óptica mientras que la primera región indicadora está dispuesta dentro de la abertura y medir una segunda corriente o flujo a través de la abertura o una segunda señal óptica mientras la segunda región indicadora está dispuesta dentro de la abertura. En algunas realizaciones, la primera corriente o flujo o la primera señal óptica se basa en una primera característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la primera región indicadora, el primer nucleótido puede identificarse en función de la primera corriente o flujo o la primera señal óptica, la segunda corriente o flujo o la segunda señal óptica se basa en una segunda característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la segunda región indicadora y el segundo nucleótido es identificable en función de la segunda corriente o flujo o segunda señal óptica. En algunas realizaciones, el primer y segundo nucleótidos son distinguibles individualmente entre sí en función de la primera corriente o flujo y la segunda corriente o flujo o la primera y segunda señales ópticas. Algunas realizaciones incluyen además escindir el primer marcador alargado del primer nucleótido que responde a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido y escindir el segundo marcador alargado del segundo nucleótido que responde a la acción de la polimerasa sobre el segundo nucleótido.

En algunas realizaciones, el cuerpo alargado de la fijación incluye un polímero sintético. En algunas realizaciones, el resto de la fijación incluye un primer oligonucleótido. En algunas realizaciones, el primer resto incluye un segundo oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido. En algunas realizaciones, un nucleótido abásico del segundo oligonucleótido define la región indicadora. En algunas realizaciones, el segundo resto incluye un tercer oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido. En algunas realizaciones, el primer resto y el segundo resto son iguales entre sí. En algunas realizaciones, el cuerpo alargado de la fijación incluye además una región indicadora. Algunas realizaciones incluyen además disponer la región indicadora en una ubicación predefinida en relación con el primer resto que responde a la interacción del primer resto con el resto de la fijación. Algunas realizaciones incluyen además mover de forma traslacional la región indicadora dentro de la abertura en respuesta a una primera tensión aplicada. El nanoporo puede incluir además una constricción dispuesta entre el primer y el segundo lado. La región indicadora puede moverse de forma traslacional a una primera ubicación predeterminada con respecto a la constricción en respuesta a la primera tensión aplicada. Una característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la región indicadora puede ser diferente de una característica de bloqueo eléctrico o de flujo de otra región del cuerpo alargado. Algunas realizaciones incluyen además medir una corriente o flujo a través de la abertura o una señal óptica mientras la región indicadora está dispuesta en la primera ubicación predeterminada. En algunas realizaciones, la corriente o el flujo o la señal óptica se basa en la característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la región indicadora y la primera ubicación predeterminada de la región indicadora, y el primer nucleótido puede identificarse en función de la corriente o el flujo o la señal óptica. Algunas realizaciones incluyen además disociar el primer resto y el resto de la fijación en respuesta a la primera tensión aplicada. Algunas realizaciones incluyen mover de forma traslacional el resto de la fijación a través de la constricción en respuesta a la disociación del primer resto y el resto de la fijación. Algunas realizaciones incluyen la interacción del primer resto con el resto de la fijación en respuesta a una segunda tensión aplicada después de la primera tensión aplicada.

En algunas realizaciones, el método incluye además proporcionar un segundo nucleótido que incluye un segundo marcador alargado, incluyendo el segundo marcador alargado un segundo resto que interactúa con el resto de la fijación en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el segundo nucleótido. El método puede incluir disponer la región indicadora en una ubicación predeterminada en relación con el segundo resto que responde a la interacción del segundo resto con el resto de la fijación. El método puede incluir mover de forma traslacional la región indicadora dentro de la abertura en respuesta a una segunda tensión aplicada. El nanoporo puede incluir además una constricción dispuesta entre el primer y el segundo lado. La región indicadora puede moverse de forma traslacional a una segunda ubicación con respecto a la constricción en respuesta a la segunda tensión aplicada. Una característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la región indicadora puede ser diferente de una característica de bloqueo eléctrico o de flujo de otra región del cuerpo alargado. Algunas realizaciones incluyen además medir una primera corriente o flujo a través de la abertura o una primera señal óptica mientras la región indicadora está dispuesta en la primera ubicación en respuesta a la primera tensión aplicada y medir una segunda corriente o flujo o una segunda señal óptica a través de la abertura mientras la región indicadora está dispuesta en la segunda ubicación en respuesta a la segunda tensión aplicada. En algunas realizaciones, la primera corriente o flujo o primera señal óptica se basa en la característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la región indicadora y la primera ubicación predeterminada de la región indicadora. El primer nucleótido puede identificarse en función de la primera corriente o flujo o la primera señal óptica. La segunda corriente o flujo o segunda señal óptica puede basarse en la característica de bloqueo eléctrico o de flujo de la región indicadora y la segunda ubicación predeterminada de la región indicadora. El segundo nucleótido puede identificarse en función de la segunda corriente o flujo o la segunda señal óptica. En algunas realizaciones, el primer y segundo nucleótidos son distinguibles individualmente entre sí en función de la primera corriente o flujo y la segunda corriente o flujo o en función de la primera y segunda señales ópticas. La primera y la segunda tensión pueden tener la misma magnitud entre sí y la segunda tensión puede ser posterior a la primera tensión. En algunas realizaciones, el primera marcador alargado se puede escindir del primer nucleótido en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido y el segundo marcador alargado se puede escindir del segundo nucleótido en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el segundo nucleótido.

En algunas realizaciones, el cuerpo alargado de la fijación incluye un polímero sintético. En algunas realizaciones, el resto de la fijación incluye un primer oligonucleótido. Un nucleótido abásico del primer oligonucleótido puede definir la región indicadora. El primer resto puede incluir un segundo oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido. El segundo resto puede incluir un tercer oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido. El primer resto y el segundo resto pueden ser diferentes entre sí.

En algunas realizaciones, la región indicadora es móvil de manera traslacional dentro de la abertura en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido. De manera adicional, o como alternativa, la región indicadora puede ser móvil de forma rotacional dentro de la abertura en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido. De manera adicional, o como alternativa, la región indicadora puede ser móvil de forma conformacional dentro de la abertura en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido.

El cuerpo alargado de la fijación puede incluir un polímero sintético. El resto de la fijación puede incluir un primer oligonucleótido. Un nucleótido abásico del primer oligonucleótido puede definir la región indicadora. El primer resto puede incluir un segundo oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido. La hibridación del segundo oligonucleótido con el primer oligonucleótido puede acortar la fijación en una primera cantidad. El primer nucleótido puede ser identificable en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de cambio en una corriente o flujo a través de la abertura o una señal óptica en respuesta al acortamiento de la fijación en la primera cantidad.

En algunas realizaciones, el primer marcador alargado del primer nucleótido incluye además un primer compañero de par de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y la fijación incluye además un segundo compañero de par FRET. El primer compañero de par FRET y el segundo compañero de par FRET pueden interactuar entre sí en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido. El método puede incluir además la detección de una primera longitud de onda emitida en respuesta a la interacción entre el primer compañero de par FRET y el segundo compañero de par FRET. El método puede incluir además proporcionar un segundo nucleótido que incluye un segundo marcador alargado, incluyendo el segundo marcador alargado un tercer compañero de par de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). El tercer compañero de par FRET y el segundo compañero de par FRET pueden interactuar entre sí en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el segundo nucleótido. El método puede incluir además la detección de una segunda longitud de onda emitida en respuesta a la interacción entre el tercer compañero de par FRET y el segundo compañero de par FRET. El primer y segundo nucleótidos pueden ser distinguibles individualmente entre sí en función de la primera y segunda longitudes de onda.

En algunas realizaciones, el método incluye además disponer una polimerasa en el primer lado, estando la región de cabeza anclada a la polimerasa. En algunas realizaciones, el método incluye además poner en contacto la polimerasa con un primer nucleótido y con un primer y segundo polinucleótidos, añadiendo la polimerasa el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. En algunas realizaciones, la polimerasa se modifica para retardar la liberación de pirofosfato en respuesta a la adición del primer nucleótido al primer polinucleótido. En algunas realizaciones, la polimerasa incluye una polimerasa 029, B103, GA-1, PZA, 015, BS32, M2Y, Nf, G1, Cp-1, PRD1, PZE, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 o L17 recombinante modificada. En algunas realizaciones, la polimerasa incluye una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: una sustitución de aminoácido en la posición 484, una sustitución de aminoácido en la posición 198 y una sustitución de aminoácido en la posición 381. En algunas realizaciones, la polimerasa incluye una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en E375Y, K512Y, T368F, A484E, A484Y, N387L, T372Q, T372L, K478Y, 1370W, F198W y L381A.

En algunas realizaciones, el primer resto y el resto de la fijación hibridan entre sí para formar una estructura en horquilla. En algunas realizaciones, el método incluye además aplicar una tensión a través del primer y segundo lados. En algunas realizaciones, el primer resto y el resto de la fijación se deshibridan uno del otro en respuesta a la tensión en un proceso de dos etapas.

En algunas realizaciones, el primer marcador alargado incluye además un segundo resto, un tercer resto anclado a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo, interactuando el segundo resto y el tercer resto en respuesta a la adición del primer nucleótido al primer polinucleótido. En algunas realizaciones, el método incluye además aplicar una tensión a través del primer y segundo lados. En algunas realizaciones, el primer resto y el resto de la fijación se separan uno del otro en respuesta a la tensión en un primer proceso y el segundo resto y el tercer resto se separan uno del otro en respuesta a la tensión en un segundo proceso.

En algunas realizaciones, el método incluye disponer una polimerasa en el primer lado, estando la región de cabeza anclada a la polimerasa. Algunas realizaciones incluyen poner en contacto la polimerasa con un primer nucleótido y con un primer y segundo polinucleótidos, añadiendo la polimerasa el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. En algunas realizaciones, el primer marcador alargado incluye un terminador reversible, incluyendo el método además inhibir, mediante el terminador reversible, la adición por la polimerasa de un segundo nucleótido al primer polinucleótido. Algunas realizaciones incluyen escindir el terminador reversible mediante exposición a la luz o al calor. Algunas realizaciones incluyen escindir el terminador reversible mediante absorción de calor de la luz. Algunas realizaciones incluyen escindir el terminador reversible mediante una reacción fotoquímica inducida por la luz. Algunas realizaciones incluyen escindir el terminador reversible mediante reacción con un agente químico. Algunas realizaciones incluyen proporcionar una fuente del agente químico. En algunas realizaciones, el terminador reversible está dispuesto en el primer lado y la fuente del agente químico está dispuesta en el segundo lado, incluyendo el método mover el agente químico del segundo lado al primer lado a través de la abertura. En algunas realizaciones, el terminador reversible incluye azidometilo (CH2N3) y el agente químico incluye THP.

Algunas realizaciones incluyen hacer fluir líquido a través de la polimerasa para eliminar el agente químico. Algunas realizaciones incluyen además aportar nuevos reactivos a la polimerasa mediante flujo de líquido.

En otro aspecto de la divulgación, una composición incluye un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lado. La composición también puede incluir una fijación permanente que incluya una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas, estando la región de cabeza anclada a una polimerasa, incluyendo el cuerpo alargado un resto. Puede disponerse la polimerasa adyacente al primer lado del nanoporo. La composición también puede incluir un primer nucleótido que incluye un primer marcador alargado, incluyendo el primer marcador alargado un primer resto que interactúa con el resto de la fijación en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido.

En algunas realizaciones, la región de cola incluye un primer ácido nucleico. Algunas realizaciones incluyen además un segundo ácido nucleico con el que se hibrida el primer ácido nucleico. En algunas realizaciones, la región de cabeza está dispuesta en el primer lado del nanoporo y la región de cola está dispuesta en el segundo lado. En algunas realizaciones, la región de cabeza está anclada a la polimerasa. En algunas realizaciones, la interacción entre el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico define una doble cadena. En algunas realizaciones, el nanoporo incluye además una constricción dispuesta entre el primer y el segundo lado. En algunas realizaciones, la doble cadena es lo suficientemente grande para inhibir el movimiento de la doble cadena a través de la constricción. En algunas realizaciones, la fijación que incluye la doble cadena inhibe la separación de la polimerasa del nanoporo. En otro aspecto de la divulgación, un sistema incluye un circuito de composición y medición de este tipo configurado para medir una corriente o flujo a través de la constricción o una señal óptica. En algunas realizaciones, la corriente o el flujo o la señal óptica se basa en el primer resto y el primer nucleótido es identificable en función de la corriente o el flujo o la señal óptica. En algunas realizaciones, el primer marcador alargado o el cuerpo alargado incluye además una región indicadora, la corriente o el flujo o la señal óptica se basan en que la región indicadora esté dispuesta dentro de la abertura y el primer nucleótido es identificable en función de la corriente o el flujo o la señal óptica.

En otro aspecto de la divulgación, un método incluye proporcionar un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lado. El método también puede incluir proporcionar una fijación permanente que incluya una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas, estando la región de cabeza anclada a una polimerasa, incluyendo el cuerpo alargado un resto. El método también puede incluir proporcionar la polimerasa dispuesta adyacente al primer lado del nanoporo. El método también puede incluir proporcionar un primer nucleótido que incluye un primer marcador alargado, incluyendo el primer marcador alargado un resto. El método puede incluir también actuar sobre el primer nucleótido con la polimerasa. El método también puede incluir la interacción del primer resto con el resto de la fijación en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido.

En algunas realizaciones, la región de cola incluye un primer ácido nucleico. Algunas realizaciones incluyen además la hibridación de un segundo ácido nucleico con el primer ácido nucleico. Algunas realizaciones incluyen además disponer la región de cabeza en el primer lado del nanoporo y disponer la región de cola en el segundo lado. Algunas realizaciones incluyen además anclar la región de cabeza a la polimerasa. En algunas realizaciones, la interacción entre el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico define una doble cadena. En algunas realizaciones, el nanoporo incluye además una constricción dispuesta entre el primer y el segundo lado. Algunas realizaciones incluyen además la inhibición, por un tamaño de la doble cadena, el movimiento de la doble cadena a través de la constricción. Algunas realizaciones incluyen además la inhibición, por la fijación que incluye la doble cadena, de la separación de la polimerasa del nanoporo. Algunas realizaciones incluyen además la medición de una corriente o un flujo a través de la constricción o una señal óptica. En algunas realizaciones, la corriente o el flujo o la señal óptica se basa en el primer resto, incluyendo el método además la identificación del primer nucleótido en función de la corriente o el flujo o la señal óptica. En algunas realizaciones, el primer marcador alargado o el cuerpo alargado incluye además una región indicadora, donde la corriente o el flujo o la señal óptica se basa en la región indicadora que está dispuesta dentro de la abertura, incluyendo el método además la identificación del primer nucleótido en función de la corriente o el flujo o la señal óptica.

En otro aspecto de la divulgación, un método para fabricar un dispositivo de secuenciación de nanoporos incluye proporcionar una cámara que incluye un primer medio líquido separado de un segundo medio líquido por un nanoporo, incluyendo el nanoporo un primer lado en contacto con el primer medio líquido, un segundo lado en contacto con el segundo medio líquido y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados. El método también puede incluir proporcionar una polimerasa al primer medio líquido, en donde la polimerasa incluye una fijación, incluyendo la fijación una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas, estando la región de cabeza anclada a la polimerasa. El método también puede incluir proporcionar un resto de captura al segundo medio líquido. El método también puede incluir aplicar una corriente o un flujo a través del nanoporo para trasladar la región de cola de la fijación a través del nanoporo. El método también puede incluir la unión del resto de captura a la región de cola de la fijación, reteniendo de este modo la fijación en el nanoporo. En algunas realizaciones, la fijación incluye un ácido nucleico. En algunas realizaciones, la región de cola incluye un ácido nucleico. En algunas realizaciones, el resto de captura incluye un ácido nucleico que es complementario del ácido nucleico de la región de cola. En algunas realizaciones, el resto de captura se une de forma covalente a la región de cola. En algunas realizaciones, el resto de captura se une de forma no covalente a la región de cola. Breve descripción de los dibujos

Las figs. 1A-1M ilustran esquemáticamente composiciones que incluyen diversas configuraciones de fijaciones ancladas o adyacentes a nanoporos, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 2A ilustra esquemáticamente un sistema que incluye circuitos de medición configurados para medir el movimiento de una región indicadora dentro de la abertura de un nanoporo, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 2B es un gráfico de una señal ilustrativa que se puede generar durante el uso del sistema de la fig. 2A, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 2C ilustra esquemáticamente una vista en planta de un sistema que incluye circuitos de medición configurados para medir el movimiento de las respectivas regiones indicadoras dentro de las respectivas aberturas de una matriz de nanoporos, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 3A ilustra un método para detectar un acontecimiento utilizando una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 3B ilustra un método para preparar una composición que incluye una fijación y una polimerasa adyacente a un nanoporo, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 4A ilustra un método para detectar un cambio conformacional de una molécula utilizando una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 4B ilustra un método para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido utilizando una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

Las figs. 5A-5B ilustran esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de un cambio conformacional de una molécula dispuesta adyacente al nanoporo, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La figs. 6A-6B ilustran esquemáticamente cambios conformacionales ilustrativos de una polimerasa.

Las figs. 6C-6D ilustran esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada a una polimerasa dispuesta adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de un cambio conformacional de la polimerasa en respuesta a la acción de la polimerasa sobre un nucleótido, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

Las figs. 7A-7B ilustran esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una proteína sobre un nucleótido, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 8A ilustra esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un nucleótido, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 8B ilustra esquemáticamente un nucleótido ilustrativo que incluye un marcador alargado que incluye un resto que interactúa con la fijación de la fig. 8A durante su uso para detectar la acción de una polimerasa sobre el nucleótido, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

Las figs. 9A-9B ilustran esquemáticamente el movimiento de una fijación ilustrativa en respuesta a la hibridación con un resto de un marcador alargado de un nucleótido ilustrativo durante su uso para detectar la acción de una polimerasa sobre el nucleótido, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

Las figs. 10A-10B ilustran esquemáticamente nucleótidos ilustrativos que incluyen marcadores alargados que incluyen restos respectivos que pueden interactuar con una fijación ilustrativa durante su uso para detectar la acción de una polimerasa sobre los nucleótidos, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 10C ilustra esquemáticamente una fijación ilustrativa y restos que pueden interactuar con la fijación durante su uso para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

Las figs. 11A-11D ilustran cálculos ilustrativos de interacciones entre una fijación y restos, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 12A ilustra un modelo que se puede usar para calcular interacciones entre una fijación y restos, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 12B ilustra un cálculo ilustrativo de una interacción entre una fijación y un resto, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 12C ilustra una estructura estable calculada en función del modelo de la fig. 12A.

Las figs. 13A-13E ilustran esquemáticamente interacciones entre una fijación ilustrativa y restos de nucleótidos respectivos, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 14 es un gráfico de una señal ilustrativa que se puede generar durante interacciones tales como las ilustradas en las figs. 13A-13E, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 15 ilustra un método alternativo para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido utilizando una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 16 ilustra esquemáticamente una composición alternativa que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un nucleótido, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

Las figs. 17A-17B ilustran esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un nucleótido que incluye un marcador alargado que incluye una región indicadora, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

Las figs. 18A-18D ilustran esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un nucleótido usando un cambio en el potencial de bloqueo eléctrico o de flujo a través del nanoporo, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 18E ilustra una señal ilustrativa que se puede generar durante el uso de una composición tal como se ilustra en las figs. 18A-18D, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

Las figs. 19A-19B ilustran esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada o adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un nucleótido que incluye un marcador alargado que incluye una región indicadora, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 19C ilustra esquemáticamente nucleótidos ilustrativos que incluyen marcadores alargados que incluyen regiones indicadoras y restos respectivos que pueden unirse con una fijación ilustrativa durante su uso para detectar la acción de una polimerasa sobre los nucleótidos, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

Las figs. 20A-20D ilustran esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un primer nucleótido usando un cambio en la tensión aplicada a través del nanoporo, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 20E ilustra una señal ilustrativa que se puede generar durante el uso de una composición tal como se ilustra en las figs. 20A-20D, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

Las figs. 21A-21D ilustran esquemáticamente la composición de las figs. 20A-20D configurada para su uso en la detección de la acción de la polimerasa sobre un segundo nucleótido usando un segundo cambio en la tensión aplicada a través del nanoporo, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 21E ilustra una señal ilustrativa que se puede generar durante el uso de una composición tal como se ilustra en las figs. 21A-21D, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

Las figs. 22A-22F ilustran esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un primer nucleótido usando un cambio en la tensión aplicada a través del nanoporo, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 23A ilustra esquemáticamente nucleótidos ilustrativos que incluyen marcadores alargados que incluyen regiones indicadoras y restos respectivos que pueden unirse con una fijación ilustrativa durante su uso para detectar la acción de una polimerasa sobre los nucleótidos, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 23B ilustra esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un primer nucleótido basándose en una interacción entre la fijación y una región indicadora de un nucleótido, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

La fig. 23C ilustra esquemáticamente una interacción detectable entre una de las regiones indicadoras de la fig.

23A con la fijación de la fig. 23B durante la acción de una polimerasa sobre un primer nucleótido, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

Las figs. 24A-24C ilustran un conjugado ilustrativo de proteína-fijación de ADN capturado en un nanoporo MspA y fijado utilizando un oligonucleótido de bloqueo del lado trans y la fig. 24D ilustra una señal ilustrativa de doble cadena frente al tiempo que se puede generar utilizando el conjugado ilustrado en las figs. 24A-24C, según algunas realizaciones de la presente divulgación. A continuación, se añadió al lado cis un oligonucleótido complementario de una región de la fijación de ADN. La tensión se cicló entre 120 mV y -60 mV con un periodo de aproximadamente 200 ms. (A) El conjugado tras la aplicación de tensión directa. Se ve la señal (D-2402). (B). El conjugado tras la aplicación de la tensión negativa. Se ve la señal (D-2400). (C) Tras la hibridación de un conjugado de oligonucleótidos que se atrae hacia la constricción del poro. La señal ilustrativa se ve antes de la separación (D-2401). Después de la separación, el sistema vuelve al estado mostrado en la fig. 24A mientras que la tensión todavía está en 120 mV, lo que da lugar a la señal D-2402. Los datos de la fig. 24D se filtró con un filtro de paso bajo de 2 KHz para mayor claridad visual.

La fig. 25 ilustra parámetros de reacción ilustrativos, p. ej., constantes de velocidad y tiempos de permanencia, para esquemas de reacción en los que un nucleótido sobre el que actúa respectivamente una polimerasa es compatible o no (adaptado de Johnson, "The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases", Biochim Biophys Acta 1804(5): 1041-1048 (2010), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia).

Las figs. 26A-26D ilustran estructuras ilustrativas para su uso en la modificación de una constante cinética en un esquema de reacción en el que una polimerasa actúa sobre un nucleótido, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

Descripción detallada

Las realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones, sistemas y métodos para detectar acontecimientos usando fijaciones ancladas o adyacentes a nanoporos.

Más específicamente, las presentes composiciones, sistemas y métodos adecuados se pueden utilizar para detectar acontecimientos, tales como el movimiento de una molécula o una parte de la misma, de una manera robusta, reproducible, sensible y con alto rendimiento. Por ejemplo, las presentes composiciones pueden incluir un nanoporo y una fijación permanente que está anclada a, o adyacente, al nanoporo. El nanoporo puede incluir un primer y segundo lados y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados. La fijación permanente puede incluir regiones de cabeza y cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas. Al menos una de las regiones de cabeza y cola de la fijación está anclada a, o adyacente, al primer o segundo lado del nanoporo. La fijación puede incluir una o más características que faciliten la detección de un acontecimiento que se produce adyacente al nanoporo, p. ej., en el primer o segundo lado del nanoporo.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, el cuerpo alargado de la fijación puede incluir una región indicadora, p. ej., una región que facilita la detección o caracterización de la fijación usando una técnica o un aparato de detección adecuado. La región indicadora puede ser móvil (p. ej., móvil de forma traslacional, conformacional o rotacional o una combinación de los mismos) dentro de la abertura en respuesta a un acontecimiento que se produce adyacente al primer lado del nanoporo. Los movimientos de la región indicadora son medibles y la información acerca del acontecimiento es interpretable en función de las mediciones de los movimientos. Adicionalmente, la región indicadora se puede configurar para que sea móvil repetidamente, p. ej., en respuesta a diferentes acontecimientos. Dichos acontecimientos pueden ser diferentes entre sí y pueden producirse en cualquier secuencia. En realizaciones particulares, los acontecimientos se producen en una serie de ciclos, tal como sucede en la síntesis de un polímero por adición secuencial de monómeros, o en la degradación de un polímero por eliminación secuencial de monómeros. Son polímeros particularmente útiles los ácidos nucleicos que contienen monómeros de nucleótidos. La información acerca de cada acontecimiento se puede determinar individualmente en función de la medición del movimiento de la región indicadora en respuesta a ese acontecimiento. Por ejemplo, una magnitud o una duración temporal, o ambas, de una señal basada en el movimiento de la región indicadora pueden correlacionarse individualmente con cada acontecimiento.

Un ejemplo de un acontecimiento que se puede detectar utilizando las presentes composiciones, sistemas y métodos es un cambio conformacional de una molécula que se dispone adyacente al primer lado del nanoporo. Otro ejemplo de un acontecimiento que se puede detectar utilizando las presentes composiciones, sistemas y métodos es la interacción de una molécula con otra molécula. Debe apreciarse que la interacción de una molécula con otra molécula puede provocar, aunque no necesariamente provoca, un cambio conformacional en una o ambas moléculas. Adicionalmente, un cambio conformacional de una molécula puede ser, aunque no necesariamente, sensible a la interacción de esa molécula con otra molécula. Las presentes composiciones, sistemas y métodos pueden configurarse adecuadamente para detectar cualquier interacción de este tipo, o cualquier cambio conformacional de este tipo, o una combinación de una interacción y un cambio conformacional.

Las fijaciones que tienen otras características también se pueden usar de manera adecuada para detectar acontecimientos. Por ejemplo, el cuerpo alargado de la fijación puede incluir un resto que interactúa con una primera molécula. El acontecimiento puede incluir la acción de una segunda molécula sobre la primera molécula. La fijación puede incluir una región indicadora que es móvil (p. ej., móvil de forma traslacional, conformacional o rotacional o una combinación de los mismos) en respuesta a la interacción entre el resto de la fijación y la primera molécula. Como alternativa, la región indicadora de la fijación puede disponerse en una ubicación dentro de la abertura que se basa en la interacción entre el resto de la fijación y la primera molécula. Como otra alternativa más, la primera molécula, en lugar de la fijación, puede incluir una región indicadora. La presencia de dicha región indicadora puede ser detectable en respuesta a la interacción entre el resto de la fijación y la primera molécula, o detectable en respuesta a cualquier otro estímulo adecuado. Adicionalmente, las presentes composiciones pueden utilizarse para estabilizar otras moléculas. Por ejemplo, la interacción de la fijación con otra molécula puede estabilizar esa molécula, p. ej., retener temporalmente esa molécula o una parte de la misma dentro o adyacente a un nanoporo. Se pueden prever fácilmente otras configuraciones basándose en las enseñanzas proporcionadas en el presente documento.

En primer lugar, se explicarán brevemente algunos términos utilizados en el presente documento. A continuación, se describirán algunas composiciones ilustrativas, sistemas ilustrativos que incluyen circuitos de medición (p. ej., circuitos de medición eléctricos u ópticos) que se pueden utilizar con las presentes composiciones, métodos ilustrativos que pueden utilizarse con las presentes composiciones y algunos ejemplos específicos de composiciones que pueden utilizarse durante dichos métodos.

Términos ilustrativos

Como se usa en el presente documento, se entiende que el término "poro" significa una estructura que incluye una abertura que permite que las moléculas atraviesen la misma desde un primer lado del poro hasta un segundo lado del poro. Es decir, la abertura se extiende a través del primer y segundo lados del poro. Las moléculas que pueden atravesar la abertura de un poro pueden incluir, por ejemplo, iones o moléculas hidrosolubles tales como ácidos nucleicos, proteínas, nucleótidos y aminoácidos. El poro se puede disponer dentro de una barrera. Cuando al menos una parte de la abertura de un poro tiene una anchura de 100 nm o menos, p. ej., 10 nm o menos o 2 nm o menos, el poro puede denominarse, aunque no necesariamente, "nanoporo". Opcionalmente, una parte de la abertura puede ser más estrecha que uno o ambos del primer y segundo lados del poro, en cuyo caso esa parte de la abertura puede denominarse "constricción". Como alternativa o adicionalmente, la abertura de un poro o la constricción de un poro (si está presente), o ambos, puede ser mayor de 0,1 nm, 0,5 nm, 1 nm, 10 nm o más. Un poro puede incluir múltiples constricciones, p. ej., al menos dos, tres, cuatro, cinco o más de cinco constricciones.

Como se usa en el presente documento, se entiende que una "barrera" significa una estructura que normalmente inhibe el paso de moléculas de un lado de la barrera al otro lado de la barrera. Las moléculas para las que se inhibe el paso pueden incluir, por ejemplo, iones o moléculas hidrosolubles tales como ácidos nucleicos, proteínas, nucleótidos y aminoácidos. Puede disponerse un poro dentro de una barrera y la abertura del poro puede permitir el paso de moléculas desde un lado de la barrera al otro lado de la barrera. Las barreras incluyen membranas de origen biológico y barreras no biológicas tales como membranas de estado sólido.

Como se usa en el presente documento, se entiende que "fijación" significa un miembro alargado que tiene una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado entre ellas. Una fijación puede incluir una molécula. Una fijación puede estar, aunque no necesariamente, en un estado alargado, p. ej., puede incluir una molécula alargada. Por ejemplo, un cuerpo alargado de una fijación puede tener configuraciones secundarias o terciarias tales como horquillas, pliegues, configuraciones helicoidales o similares. Las fijaciones pueden incluir polímeros tales como polinucleótidos o polímeros sintéticos. Las fijaciones pueden tener longitudes (p. ej., medidas en un estado estirado o de máxima extensión) que varían, por ejemplo, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 500 nm, p. ej., de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm. Las fijaciones pueden tener anchos que varían, por ejemplo, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 50 nm, p. ej., de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 20 nm. Las fijaciones pueden ser lineales o ramificadas. Se puede considerar que una fijación es "permanente" cuando no se elimina de una composición expuesta en el presente documento en las condiciones en las que se usa la composición, por ejemplo, en un método de detección. Una fijación que se usa en una reacción cíclica o repetida también puede considerarse "permanente" cuando no hay un cambio neto en la posición de la fijación de un ciclo al siguiente o de una reacción a una repetición de la reacción. Se entenderá que la posición de una fijación permanente puede cambiar durante un ciclo o reacción individual aunque no haya un cambio neto de posición a lo largo de los ciclos o reacciones.

Como se usa en el presente documento, se entiende que una "región de cabeza" de una fijación significa un grupo funcional de la fijación que está unido a otro miembro. Dicha unión se puede formar mediante un enlace químico, p. ej., mediante un enlace covalente, enlace de hidrógeno, enlace iónico, enlace dipolo-dipolo, fuerzas de dispersión de London o cualquier combinación adecuada de los mismos. En una realización, dicha unión puede formarse mediante la hibridación de un primer oligonucleótido de la región de cabeza con un segundo oligonucleótido de otro miembro. Como alternativa, dicha unión puede formarse mediante interacciones físicas o biológicas, p. ej., una interacción entre una primera estructura proteica de la región de cabeza y una segunda estructura proteica del otro miembro que inhibe la separación de la región de cabeza del otro miembro. Los miembros ilustrativos a los que se puede unir una región de cabeza de una fijación incluyen un poro, p. ej., el primer o segundo lado del poro, una barrera en la que se dispone el poro y una molécula, tal como una proteína, dispuesta en el primer o segundo lado del poro. Si la región de cabeza de la fijación está unida a otro miembro que está dispuesto en el primer o segundo lado del poro, se puede decir que la región de cabeza de la fijación es adyacente al poro. La región de cabeza puede estar, aunque no necesariamente, ubicada en un extremo de la fijación.

Como se usa en el presente documento, "anclado" significa una unión entre un primer miembro y un segundo miembro que es permanente, p. ej., es lo suficientemente estable para ser útil para detectar un acontecimiento o, p. ej., es móvil pero no experimenta ningún movimiento neto en las condiciones en las que se utilizan los miembros unidos. En algunas realizaciones, dicha unión permanente es normalmente irreversible en las condiciones en las que se utilizan los miembros unidos, por ejemplo, en un método de detección. En otras realizaciones, dicha unión permanente es reversible pero persiste al menos durante el periodo de tiempo en el que se utiliza para detectar un acontecimiento. Por ejemplo, una fijación puede estar unida permanentemente o adyacente a un poro durante el uso de la fijación para detectar un acontecimiento y posteriormente se puede eliminar o reemplazar con otra fijación. Los enlaces covalentes son solo un ejemplo de una unión que se puede utilizar adecuadamente para anclar un primer miembro a un segundo miembro. Otros ejemplos incluyen dobles cadenas entre oligonucleótidos, interacciones péptido-péptido y estreptavidina-biotina o estreptavidina-destiobiotina.

Como se usa en el presente documento, se entiende que una "región de cola" de una fijación significa una parte de la fijación que está dispuesta distalmente de la región de cabeza. La región de cola puede extenderse libremente lejos de la región de cabeza, p. ej., puede no estar unida a ningún otro miembro. Como alternativa, la región de cola puede estar unida. Dicha unión se puede formar mediante un enlace químico, p. ej., mediante un enlace covalente, enlace de hidrógeno, enlace iónico, enlace dipolo-dipolo, fuerzas de dispersión de London o cualquier combinación adecuada de los mismos. En una realización, dicha unión puede formarse mediante la hibridación de un primer oligonucleótido de la región de cola con un segundo nucleótido de otro miembro. Como alternativa, dicha unión puede formarse mediante interacciones físicas o biológicas, p. ej., una interacción entre una primera estructura proteica de la región de cola y una segunda estructura proteica del otro miembro que inhibe la separación de la región de cola del otro miembro. Cualquier miembro al que se una la región de cola puede ser, aunque no necesariamente, el mismo miembro al que se une la región de cabeza. La región de cola puede estar, aunque no necesariamente, ubicada en un extremo de la fijación.

Como se usa en el presente documento, se entiende que un "cuerpo alargado" significa una parte de un miembro, tal como una fijación, que sea lo suficientemente largo y estrecho para disponerse dentro de al menos una parte de una abertura de un poro. Cuando un cuerpo alargado está unido a un nucleótido sobre el que se actúa, dicho cuerpo alargado puede denominarse "marcador alargado" para facilitar la distinción de un cuerpo alargado de una fijación. Un cuerpo alargado puede estar formado por cualquier material adecuado de origen biológico un origen no biológico, o una combinación de los mismos. En un ejemplo, el cuerpo alargado incluye un polímero. Los polímeros pueden ser polímeros biológicos o sintéticos. Los polímeros biológicos ilustrativos que se pueden incluir adecuadamente dentro de un cuerpo alargado incluyen polinucleótidos, polipéptidos, polisacáridos, análogos de polinucleótidos y análogos de polipéptidos. Los polinucleótidos y análogos de polinucleótidos ilustrativos adecuados para su uso en un cuerpo alargado incluyen ADN, ADN enantiomérico, ARN, PNA (ácido nucleico peptídico), morfolinos y LNA (ácido nucleico bloqueado). Los polipéptidos sintéticos ilustrativos pueden incluir aminoácidos con carga así como restos hidrófilos y neutros. Los polímeros sintéticos ilustrativos que pueden incluirse adecuadamente dentro de un cuerpo alargado incluyen PEG (polietilenglicol), PPG (polipropilenglicol), PVA (alcohol polivinílico), PE (polietileno), LDPE (polietileno de baja densidad), HDPE (polietileno de alta densidad), polipropileno, PVC (cloruro de polivinilo), PS (poliestireno), NAILON (poliamidas alifáticas), TEFLON@ (tetrafluoroetileno), poliuretanos termoplásticos, polialdehídos, poliolefinas, poli(óxidos de etileno), poli(ésteres de ácido w-alquenoico), poli(metacrilatos de alquilo) y otros conectores químicos y biológicos poliméricos tales como los descritos en Hermanson, Bioconjugate Techniques, tercera edición, Academic Press, Londres (2013). Adicionalmente, un cuerpo alargado opcionalmente puede incluir un resto que puede interactuar con otro resto. Dichos restos pueden incluir polímeros biológicos de ADN, ARN, PNA, LNA, morfolinos o ADN enantiomérico, por ejemplo. Las regiones del cuerpo alargado pueden tener carga o ser neutras dependiendo de la implementación particular de la lectura del indicador.

Como se usa en el presente documento, se entiende que una "región indicadora" significa un resto que es, tras movimientos relativamente pequeños, detectable utilizando un método o sistema de detección adecuado. Dichos movimientos pueden ser de aproximadamente 10 nm o menos, aproximadamente 5 nm o menos, aproximadamente 2 nm o menos, aproximadamente 1 nm o menos, aproximadamente 0,5 nm o menos, aproximadamente 0,2 nm o menos o incluso aproximadamente 0,1 nm o menos, y pueden detectarse utilizando la región indicadora y un método o sistema de detección adecuado. El resto puede tener una propiedad física, química, eléctrica, óptica o biológica detectable u otra propiedad adecuada de bloqueo de flujo. Por ejemplo, el resto puede tener una propiedad óptica que facilite la detección o caracterización óptica. Las propiedades ópticas incluyen fluorescencia y generación de una señal Raman. En un ejemplo ilustrativo, el resto es un donante o aceptor de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) que interactúa con un aceptor o donante de FRET correspondiente para emitir luz de una longitud de onda particular que puede detectarse. El donante y el aceptor pueden considerarse compañeros del par FRET. O, por ejemplo, el resto puede tener una propiedad de bloqueo eléctrico o de flujo. Las propiedades de bloqueo eléctrico o de flujo incluyen carga electrostática, p. ej., una carga positiva o una carga negativa. O, por ejemplo, el resto puede tener una propiedad física. Las propiedades físicas incluyen el volumen y la forma del resto. En un ejemplo ilustrativo, el movimiento del resto dentro de la abertura provoca un cambio medible en la corriente o el flujo a través de una abertura o una constricción opcional en la misma, al modular una corriente de bloqueo o flujo a través de la abertura o constricción. O, por ejemplo, el resto puede tener una propiedad química o biológica que facilite la detección química o biológica. Las propiedades químicas o biológicas incluyen la presencia de un grupo químico o biológico, p. ej., un grupo radiactivo o un grupo que tiene actividad enzimática. Una o más propiedades eléctricas, físicas, químicas, biológicas o de otro tipo de bloqueo de flujo del resto pueden proporcionar un cambio medible en la corriente a través de una abertura o constricción, un cambio medible en el flujo de moléculas a través de una abertura o constricción o una señal óptica. En un ejemplo ilustrativo, el movimiento del resto dentro de una abertura provoca un cambio medible en una corriente a través de una abertura o constricción o provoca un cambio medible en el flujo de moléculas a través de una abertura o constricción, cambio de flujo que puede ser eléctrica, química, biológica u ópticamente detectable. Un nucleótido abásico es un ejemplo no limitante de un resto cuyo movimiento puede provocar un cambio medible en una corriente a través de una abertura o constricción o un cambio medible en el flujo de moléculas a través de una abertura o constricción.

Como se usa en el presente documento, se entiende que un "acontecimiento" significa una acción que tiene un efecto asociado. En el contexto actual, una acción puede incluir, pero sin limitación, el movimiento de una molécula o una parte de esa molécula, y el efecto puede ser cualquier resultado de dicho movimiento. El "movimiento" puede ser de traslación, rotación o conformación, o una combinación de los mismos. Un efecto ilustrativo de dicho movimiento puede incluir el movimiento de una región indicadora dentro de la abertura o constricción de un nanoporo. Por ejemplo, un acontecimiento puede incluir el movimiento de traslación de una molécula, un cambio rotacional de una molécula o un cambio conformacional de una molécula. O, por ejemplo, un acontecimiento puede incluir una interacción entre una primera molécula y una segunda molécula. Un efecto ilustrativo asociado con dicho acontecimiento puede ser un cambio conformacional de la primera molécula, de la segunda molécula o tanto de la primera y como de la segunda moléculas. Un acontecimiento también puede incluir la acción concertada de múltiples moléculas o cualquier parte de dicha acción concertada. Por ejemplo, un acontecimiento puede incluir la entrada de una molécula en un sitio activo en una proteína y la producción de un cambio conformacional de la proteína cuando actúa sobre la molécula. Un acontecimiento también puede incluir, pero sin limitación, un cambio químico en una molécula o una parte de esa molécula, y el efecto puede ser cualquier resultado asociado de dicho cambio químico. Los cambios químicos pueden incluir eliminar una parte de la molécula, añadir la molécula a otra molécula, una primera molécula que se une o se desliga de otra molécula, modificar la molécula o una parte de la misma y la formación o escisión de un enlace químico, p. ej., durante la síntesis de polinucleótidos y similares. Por ejemplo, un acontecimiento puede incluir añadir un nucleótido a un polinucleótido o hibridar o deshibridar dos oligonucleótidos. Opcionalmente, un acontecimiento puede incluir tanto el movimiento como el cambio químico de una o más moléculas. Los efectos ilustrativos de cualquiera de dichos acontecimientos pueden incluir el movimiento de una región indicadora dentro de la abertura o constricción de un poro o una región indicadora que se dispone en una ubicación particular dentro de la abertura o constricción de un nanoporo. Como ejemplos puramente ilustrativos, no limitantes, un acontecimiento puede incluir uno o más de: prueba de un nucleótido por una polimerasa, rechazo por la polimerasa de un nucleótido si el nucleótido no coincide con el siguiente nucleótido en un polinucleótido que se está secuenciando, escisión por la polimerasa de un nucleótido de un polinucleótido usando actividad exonucleasa y escisión por la polimerasa de un nucleótido de un polinucleótido usando pirofosforólisis. La fig. 25 ilustra parámetros de reacción ilustrativos, p. ej., constantes de velocidad y tiempos de permanencia, para esquemas de reacción en los que un nucleótido sobre el que actúa respectivamente una polimerasa es compatible o no (adaptado de Johnson, "The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases", Biochim Biophys Acta 1804(5): 1041-1048 (2010), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia). Las polimerasas tales como T7 Pol normalmente diferencian entre nucleótidos coincidentes y no coincidentes basándose en una combinación de mayor afinidad de unión por el nucleótido coincidente correcto (p. ej., aproximadamente 10 veces más preferencia por el correcto frente al no coincidente), velocidad catalítica muy reducida para el nucleótido no coincidente (p. ej., aproximadamente 1000 veces más lento para el no coincidente) y una tasa de disociación muy aumentada para el nucleótido no coincidente del estado catalítico cerrado (p. ej., aproximadamente 300 veces más rápido para el no coincidente).

Como se usa en el presente documento, se entiende que un "cambio conformacional" significa un cambio en la forma de una molécula (p. ej., un cambio en las coordenadas atómicas relativas de una molécula). Dicho cambio conformacional puede incluir una parte de una molécula que se mueve con respecto a otra parte de la molécula. La reactividad química de una parte de la molécula puede cambiar en respuesta al movimiento relativo de esa parte, u otra parte, de la molécula. Una molécula puede experimentar un cambio conformacional en respuesta a un estímulo. Dicho estímulo puede incluir, pero sin limitación, cambios o fuerzas aplicadas a la molécula, interacciones con otras moléculas o factores ambientales. Los cambios o las fuerzas aplicadas a la molécula pueden incluir una fuerza física aplicada a la molécula o una parte de la misma, un campo eléctrico aplicado a la molécula o una reacción química con la molécula o una parte de la misma, o una combinación de los mismos, p. ej., unión de un sustrato, catálisis y/o liberación de un producto. Las interacciones con otras moléculas pueden incluir la presencia de otra molécula, una concentración de otra molécula, una acción por o sobre otra molécula, o una combinación de las mismas. Una interacción ilustrativa con otra molécula incluye la hibridación de dos oligonucleótidos o una polimerasa que actúa sobre un nucleótido. Los factores ambientales pueden incluir un cambio de pH o un cambio de temperatura, o una combinación de los mismos.

Como se usa en el presente documento, se entiende que el término "nucleótido" significa una molécula que incluye un azúcar y al menos un grupo fosfato y opcionalmente también incluye una nucleobase. Un nucleótido que carece de una nucleobase puede denominarse "abásico". Los nucleótidos incluyen desoxirribonucleótidos, desoxirribonucleótidos modificados, ribonucleótidos, ribonucleótidos modificados, nucleótidos peptídicos, nucleótidos peptídicos modificados, nucleótidos de cadena principal de azúcar con fosfato modificado y mezclas de los mismos. Los ejemplos de nucleótidos incluyen monofosfato de adenosina (AMP), difosfato de adenosina (ADP), trifosfato de adenosina (ATP), monofosfato de timidina (TMP), difosfato de timidina (TDP), trifosfato de timidina (TTP), monofosfato de citidina (CMP), difosfato de citidina (CDP), trifosfato de citidina (CTP), monofosfato de guanosina (GMP), difosfato de guanosina (GDP), trifosfato de guanosina (GTP), monofosfato de uridina (UMP), difosfato de uridina (UDP), trifosfato de uridina (UTP), monofosfato de desoxiadenosina (dAMP), difosfato de desoxiadenosina (dADP), trifosfato de desoxiadenosina (dATP), monofosfato de desoxitimidina (dTMP), difosfato de desoxitimidina (dTDP), trifosfato de desoxitimidina (dTTP), difosfato de desoxicitidina (dCDP), trifosfato de desoxicitidina (dCTP), monofosfato de desoxiguanosina (dGMP), difosfato de desoxiguanosina (dGDP), trifosfato de desoxiguanosina (dGTP), monofosfato de desoxiuridina (dUMP), difosfato de desoxiuridina (dUDP) y trifosfato de desoxiuridina (dUTP).

También se entiende que el término "nucleótido" abarca cualquier "análogo de nucleótido" que sea un tipo de nucleótido que incluya una nucleobase, azúcar y/o resto de fosfato modificado en comparación con nucleótidos de origen natural. Las nucleobases modificadas ilustrativas que pueden incluirse en un polinucleótido, ya sea con una cadena principal nativa o estructura análoga, incluyen, inosina, xatanina, hipoxatanina, isocitosina, isoguanina, 2-aminopurina, 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, 2-aminoadenina, 6-metiladenina, 6-metilguanina, 2-propilguanina, 2-propiladenina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 2-tiocitosina, 15-halouracilo, 15-halocitosina, 5-propiniluracilo, 5-propinilcitosina, 6-azo uracilo, 6-azo citosina, 6-azo timina, 5-uracilo, 4-tiouracilo, 8-halo adenina o guanina, 8-amino adenina o guanina, 8-tiol adenina o guanina, 8-tioalquil adenina o guanina, 8-hidroxil adenina o guanina, uracilo o citosina 5-halo sustituido, 7-metilguanina, 7-metiladenina, 8-azaguanina, 8-azaadenina, 7-desazaguanina, 7-desazaadenina, 3-desazaguanina, 3-desazaadenina o similares. Como se conoce en la técnica, determinados análogos de nucleótidos no pueden incorporarse a un polinucleótido, por ejemplo, análogos de nucleótidos tales como 5'-fosfosulfato de adenosina.

Los nucleótidos ilustrativos modificados en un resto de fosfato incluyen, por ejemplo, los análogos de nucleótidos descritos por Lee et al., "Synthesis and reactivity of novel Y-phosphate modified ATP analogues", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19: 3804-3807 (2009); Kumar et al., "PEG-labeled nucleotides and nanopore detection for single molecule DNA sequencing by synthesis", Scientific Reports 2: 684 (2012); Kumar et al., "Terminal phosphate labeled nucleotides: synthesis, applications, and linker effect on incorporation by DNA polymerases", Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids 24: 401-408 (2005) y Mulder et al., "Nucleotide modification at the Y-phosphate leads to the improved fidelity of HIV-1 reverse transcriptase", Nucleic Acids Research 33: 4865-4873 (2005), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia. Lee et al. describe determinados análogos de ATP modificados con Y-fosfato ilustrativos que tienen las siguientes estructuras:

. Kumar et al. (2012) desvela marcadores de PEG-cumarina de diferentes longitudes que se pueden unir al fosfato terminal de dNTP o NTP (dNTP/NTP) o al fosfato terminal de nucleótidos tetrafosfato (dN4P/N4P). Las longitudes ilustrativas incluyen, por ejemplo, cumarina-PEGi6-dN4P/N4P, cumarina-PEG20-dN4P/N4P, cumarina-PEG24-dN4P/N4P y cumarina-PEG36-dN4P/N4P. Kumar et al. (2005) desvela nucleótidos modificados con tetra y pentafosfato que incluyen colorantes unidos con o sin conectores. Como se describe en Kumar et al. (2005) los colorantes ilustrativos unidos sin conectores incluyen DDAO, RESORUFINA, CUMARINAS, alquil-XANTENOS, nitrofenol, hidroxi-indol, ELF y BBT; los colorantes ilustrativos unidos mediante conectores incluyen R110, REG, TAMRA, ROX, colorantes Cy y colorantes ET; y los conectores ilustrativos incluyen diaminopropano, diaminoheptano, diaminododecano, EEA, PAP, diaminociclohexano, diamino-xileno y penta-lisina. Mulder et al. desvela nucleótidos químicamente modificados incluyendo 1-aminonaftaleno-5-sulfonato (ANS) unido al Y-fosfato de un nucleótido, p. ej., Y-P-aminonaftaleno-5-sulfonato desoxi o ribonucleótidos (dNTP o NTP) tales como ANS-ATP, ANS-CTP, ANS-gTp y ANS-TTP y/o las formas desoxi de estos u otros nucleótidos.

Como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido" se refiere a una molécula que incluye una secuencia de nucleótidos que están unidos entre sí. Los ejemplos de polinucleótidos incluyen ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) y análogos de los mismos. Un polinucleótido puede ser una secuencia monocatenaria de nucleótidos, tal como ARN o ADN monocatenario, una secuencia bicatenaria de nucleótidos, tal como ADN bicatenario, o puede incluir una mezcla de secuencias monocatenarias y bicatenarias de nucleótidos. El ADN bicatenario (ADNbc) incluye ADN genómico y productos de amplificación y PCR. El ADN monocatenario (ADNmc) se puede convertir en ADNbc y viceversa. La secuencia precisa de nucleótidos en un polinucleótido puede ser conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos ilustrativos de polinucleótidos: un gen o un fragmento génico (por ejemplo, una sonda, cebador, marcador de secuencia expresada (EST) o análisis en serie del marcador de expresión génica (SAGE)), ADN genómico, fragmento de ADN genómico, exón, intrón, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozima, ADNc, polinucleótido recombinante, polinucleótido sintético, polinucleótido ramificado, plásmido, vector, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sonda de ácido nucleico, cebador o copia amplificada de cualquiera de los anteriores.

Como se usa en el presente documento, se entiende que "hibridar" significa unir de forma no covalente un primer polinucleótido a un segundo polinucleótido. La fuerza de la unión entre el primer y segundo polinucleótidos aumenta con la complementariedad entre esos polinucleótidos.

Como se usa en el presente documento, se entiende que el término "proteína" significa una molécula que incluye, o consiste en, un polipéptido que se pliega en una estructura tridimensional. El polipéptido incluye restos que, cuando se pliegan en la estructura tridimensional, transmiten a la proteína actividad biológica.

Como se usa en el presente documento, se entiende que el término "enzima" significa una molécula que modifica catalíticamente otra molécula. Las enzimas pueden incluir proteínas, así como otros tipos de moléculas determinadas tales como polinucleótidos. Los ejemplos de enzimas que también son proteínas incluyen polimerasas, exonucleasas y helicasas.

Como se usa en el presente documento, se entiende que una "polimerasa" significa una enzima que tiene un sitio activo que ensambla polinucleótidos polimerizando nucleótidos en polinucleótidos. Una polimerasa puede unirse a un molde polinucleotídico monocatenario con cebador y puede añadir secuencialmente nucleótidos al cebador en crecimiento para formar un polinucleótido que tiene una secuencia que es complementaria a la del molde.

Composiciones ilustrativas

Se describirán ahora algunas composiciones ilustrativas que incluyen diversas configuraciones de fijaciones ancladas o adyacentes a nanoporos con referencia a las figs. 1A-1M. En un aspecto de la divulgación, una composición incluye un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través de los primer y segundo lados; y una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas. La región de cabeza puede estar anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo.

Por ejemplo, La fig. 1A ilustra esquemáticamente una sección transversal de una composición ilustrativa que incluye nanoporo 100 y fijación 110 permanente. El nanoporo 100 incluye el primer lado 101, el segundo lado 102, la abertura 103 y la constricción opcional 104. La fijación 110 permanente incluye la región de cabeza 111, la región de cola 112 y el cuerpo alargado 113. En la realización ilustrada en la fig. 1A, la región de cabeza 111 está anclada al primer lado 101 del nanoporo 100, la región de cola 112 está dispuesta en el primer lado 101 del nanoporo 100 y se extiende libremente hacia el segundo lado 102 del nanoporo 100, y el cuerpo alargado 113 es móvil dentro de la abertura 103 del nanoporo 100. Sin embargo, el nanoporo 100 o la fijación 110, o ambos, pueden tener configuraciones diferentes a las ilustradas en la fig. 1A, tal como se ilustra en el presente documento.

La región de cabeza 111, la región de cola 112 y el cuerpo alargado 113 de la fijación 110 pueden incluir cualquier material o combinación de materiales adecuado. Por ejemplo, la región de cabeza 111 puede configurarse para anclarse al primer lado 101 mediante un enlace químico, p. ej., mediante un enlace covalente, enlace de hidrógeno, enlace iónico, enlace dipolo-dipolo, fuerzas de dispersión de London o cualquier combinación adecuada de los mismos. Por ejemplo, la región de cabeza 111 puede incluir un primer resto que está unido, p. ej., de forma covalente, a un segundo resto del primer lado 101. Los enlaces covalentes ilustrativos que pueden anclar la región de cabeza 111 al primer lado 101 incluyen enlaces carbono-carbono, enlaces carbono-nitrógeno, enlaces carbonooxígeno, enlaces oxígeno-oxígeno, enlaces azufre-azufre, enlaces fósforo-oxígeno, enlaces fósforo-azufre, enlaces amida, enlaces de tioéter, enlaces de hidrazida, enlaces carbono-azufre y enlaces que resultan de la reacción de oxiamina con carbonilos (aldehídos y cetonas), de pares de reactivos de Staudinger, tales como fosfina y azidas, o pares de química clic, tales como azidas y alquinos. Sin embargo, no es necesario que la unión sea covalente. Por ejemplo, dicha unión puede formarse mediante la hibridación de un primer oligonucleótido de la región de cabeza con un segundo nucleótido de otro miembro. Como alternativa, dicha unión puede formarse mediante interacciones físicas o biológicas, p. ej., una interacción entre una primera estructura proteica de la región de cabeza y una segunda estructura proteica de otro miembro que inhibe la separación de la región de cabeza del otro miembro. Por ejemplo, la región de cabeza 111 puede incluir una primera hélice alfa y el primer lado 101 puede incluir una segunda hélice alfa que se bloquea en la región de cabeza 111 para inhibir la disociación de la región de cabeza 111 del primer lado 101. Las interacciones entre receptores y ligandos también son útiles, ejemplos de los cuales incluyen avidina-biotina o análogos de la misma; anticuerpo-epítopo; lectina-hidrato de carbono y similares.

El cuerpo alargado 113 se puede unir, p. ej., mediante enlace covalente, a la región de cabeza 111, y la región de cola 112 puede definir un extremo del cuerpo alargado 113 que está distal de la región de cabeza 111. El cuerpo alargado 113 puede incluir cualquier material adecuado de origen biológico o de origen no biológico, o una combinación de los mismos. Como se describe con mayor detalle a continuación, el cuerpo alargado 113 opcionalmente puede incluir una o más regiones indicadoras que facilitan la detección o el movimiento del cuerpo alargado, o puede incluir uno o más restos que interactúan con otras moléculas o puede incluir una o más de dichas regiones indicadoras y uno o más de dichos restos. Otras regiones del cuerpo alargado 113 pueden ser sustancialmente inertes, para inhibir la interacción de dichas regiones con otras moléculas de una manera que, de otro modo, puede provocar el movimiento del cuerpo alargado 113 con respecto a dichas moléculas o con respecto al nanoporo 100. Los materiales biológicos ilustrativos que pueden incluirse dentro del cuerpo alargado 113 incluyen polímeros biológicos tales como polinucleótidos, polipéptidos, polisacáridos y análogos de los mencionados anteriormente. Los polímeros sintéticos ilustrativos que pueden incluirse adecuadamente dentro del cuerpo alargado 113 incluyen PEG (polietilenglicol), PPG (polipropilenglicol), PVA (alcohol polivinílico), PE (polietileno), LDPE (polietileno de baja densidad), HDPE (polietileno de alta densidad), polipropileno, PVC (cloruro de polivinilo), PS (poliestireno), NAILON (poliamidas alifáticas), TEFLON® (tetrafluoroetileno), poliuretanos termoplásticos, polialdehídos, poliolefinas, poli(óxidos de etileno), poli(ésteres de ácido co-alquenoico), poli(metacrilatos de alquilo) y otros conectores químicos y biológicos poliméricos tales como los descritos en Hermanson et al., mencionado anteriormente.

El nanoporo 100 puede tener cualquier configuración adecuada que permita el anclaje de la región de cabeza 111 al primer lado 101 del nanoporo 100. En algunas realizaciones, el nanoporo 100 puede ser un poro biológico, poro de estado sólido o un poro híbrido biológico y de estado sólido. Se entiende que un poro biológico significa un poro que está hecho de uno o más materiales de origen biológico. "Origen biológico" se refiere a material procedente o aislado de un entorno biológico tal como un organismo o célula, o una versión fabricada sintéticamente de una estructura biológicamente disponible. Los poros biológicos incluyen, por ejemplo, poros polipeptídicos y poros polinucleotídicos.

Se entiende que un poro polipeptídico significa un poro que está hecho de uno o más polipéptidos. El o los polipéptidos pueden incluir un monómero, un homopolímero o un heteropolímero. Las estructuras de los poros polipeptídicos incluyen, por ejemplo, un poro de haz de hélice a y un poro de barril p así como todos los demás bien conocidos en la técnica. Los poros polipeptídicos ilustrativos incluyen a-hemolisina, porina A de Mycobacterium smegmatis, gramicidina A, maltoporina, OmpF, OmpC, PhoE, Tsx, pilosidad F, SP1, porina mitocondrial (VDAC), Tom40, fosfolipasa A de la membrana externa y lipoproteína autotransportadora de Neisseria (NalP). La "porina A de Mycobacterium smegmatis (MspA)" es una porina de membrana producida por micobacterias, permitiendo que las moléculas hidrófilas entren en la bacteria. MspA forma un octámero y un barril beta transmembrana que se asemeja a una copa estrechamente interconectados e incluye una constricción central. Para más detalles acerca de la ahemolisina, véase la Patente de los Estados Unidos n.° 6.015.714, cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia. Para más detalles acerca de SP1, véase Wang et al., Chem. Commun., 49: 1741-1743, 2013, cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia. Para más detalles acerca de MspA, véase Butler et al., "Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein nanopore", Proc. Natl. Acad. Sci. 105: 20647-20652 (2008) y Derrington et al., "Nanopore DNA sequencing with MspA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107: 16060-16065 (2010), cuyo contenido completo de ambos se incorpora en el presente documento por referencia. Otros poros incluyen, por ejemplo, el homólogo de MspA de Norcadia farcinica y lisenina. Para más detalles acerca de lisenina, véase la publicación PCT n.° WO 2013/153359, cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia.

Se entiende que un poro polinucleotídico significa un poro que está hecho de uno o más polímeros de ácido nucleico. Un poro polinucleotídico puede incluir, por ejemplo, un origami polinucleotídico.

Se entiende que un poro de estado sólido significa un poro que está hecho de uno o más materiales de origen distinto del biológico. "Estado sólido" se refiere a materiales que no son de origen biológico. Un poro de estado sólido puede estar hecho de materiales orgánicos o inorgánicos. Los poros de estado sólido incluyen, por ejemplo, poros de nitruro de silicio, poros de dióxido de silicio y poros de grafeno.

Se entiende que un poro híbrido biológico y de estado sólido significa un poro híbrido que está hecho de materiales de origen biológico y distinto del biológico. Los materiales de origen biológico se han definido anteriormente e incluyen, por ejemplo, polipéptidos y polinucleótidos. Un poro híbrido biológico y de estado sólido incluye, por ejemplo, un poro híbrido de polipéptido-estado sólido y un poro de polinucleótido-estado sólido.

Debería apreciarse que diferentes tipos de nanoporos pueden tener diferentes dimensiones entre sí en múltiples aspectos. Por ejemplo, como se ilustra en la fig. 1A, el nanoporo 100 se puede caracterizar por tener una primera dimensión H1 que define un grosor del nanoporo 100, p. ej., un grosor entre la superficie externa 105 del primer lado 101 y la superficie externa 106 del segundo lado 102, adyacente a la abertura 103. En realizaciones en las que el nanoporo 100 incluye una constricción 104 opcional, el nanoporo 100 también se puede caracterizar por tener una segunda dimensión H2 que define una profundidad de constricción, p. ej., una profundidad entre la superficie externa 105 del primer lado 101 y la parte más estrecha de la constricción 104, adyacente a la abertura 103. El nanoporo 100 también se puede caracterizar por tener un primer diámetro D1 que define un diámetro de abertura 103, p. ej., un diámetro de abertura 103 en el punto más ancho de la abertura. En realizaciones en las que el nanoporo 100 incluye una constricción 104 opcional, el nanoporo 100 también se puede caracterizar por tener un segundo diámetro D2 que define un diámetro de constricción, p. ej., un diámetro de constricción 104 en el punto más estrecho de la constricción. Debe apreciarse que dichas dimensiones del nanoporo 100 no deben interpretarse como limitantes y que otras dimensiones del nanoporo 100 pueden definirse de manera adecuada. Por ejemplo, la primera dimensión H1 del nanoporo 100 puede variar a lo largo de la dimensión lateral, p. ej., si el nanoporo 100 incluye una barrera relativamente delgada en la que se dispone un poro relativamente grueso, tal como se ilustra en la fig. 1K. O, por ejemplo, en realizaciones en las que el nanoporo 100 incluye una constricción 104 opcional, la segunda dimensión H2 del nanoporo 100 puede variar dependiendo de la ubicación relativa de la constricción 104 con respecto a la superficie externa 105 del primer lado 101. Es decir, la constricción 104 opcional se puede ubicar dispuesta en cualquier ubicación adecuada dentro del nanoporo 100 y, de hecho, incluso se puede colocar distal a la primera superficie externa 105 o la superficie externa 106 del segundo lado 102. Las figs. 1J y 1K, analizadas en más detalle a continuación, ilustran ubicaciones ilustrativas, no limitantes, de la constricción 104 opcional. No es necesario que la abertura 103 y la constricción 104 opcional sean de forma obligatoria perfectamente circulares y aún pueden caracterizarse por tener un diámetro aproximado o usar cualquier otra dimensión adecuada. Por otra parte, el nanoporo 100 puede incluir múltiples constricciones, cada una de los cuales se puede caracterizar adecuadamente usando dimensiones adecuadas.

En algunas realizaciones, la primera dimensión H1 del nanoporo 100 es aproximadamente 100 nm o menor, o aproximadamente 50 nm o menor, o aproximadamente 20 nm o menor, o aproximadamente 10 nm o menor, o aproximadamente 5 nm o menor o aproximadamente 2 nm o menor. Por ejemplo, H1 puede ser entre aproximadamente 2 nm y aproximadamente 100 nm, o entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 50 nm o entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 20 nm. En realizaciones que incluyen la constricción 104 opcional, la segunda dimensión H2 del nanoporo 100 es aproximadamente 100 nm o menor, o aproximadamente 50 nm o menor, o aproximadamente 20 nm o menor, o aproximadamente 10 nm o menor, o aproximadamente 5 nm o menor, o aproximadamente 2 nm o menor o aproximadamente 1 nm o menor. Por ejemplo, H2 puede ser entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 100 nm, o entre aproximadamente 2 nm y aproximadamente 50 nm o entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 20 nm. De manera ilustrativa, H1 puede ser entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 50 nm y H2 (si corresponde) puede ser entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 5 nm. En una realización ilustrativa, H1 es aproximadamente 10 nm y H2 es aproximadamente 5 nm. En otra realización ilustrativa, H1 es aproximadamente 10 nm y H2 es aproximadamente 6 nm. En otra realización ilustrativa, H1 es aproximadamente 10 nm y H2 es aproximadamente 7 nm. En otra realización ilustrativa, H1 es aproximadamente 10 nm y H2 es aproximadamente 8 nm. En otra realización ilustrativa, H1 es aproximadamente 10 nm y H2 es aproximadamente 9 nm. En otra realización ilustrativa, H1 es aproximadamente 10 nm y H2 es aproximadamente 10 nm. En otra realización ilustrativa, H1 es aproximadamente 5 nm y H2 es aproximadamente 2 nm. En otra realización ilustrativa, H1 es aproximadamente 5 nm y H2 es aproximadamente 3 nm. En otra realización ilustrativa, H1 es aproximadamente 5 nm y H2 es aproximadamente 4 nm. En otra realización ilustrativa, H1 es aproximadamente 5 nm y H2 es aproximadamente 5 nm. Se entiende que las expresiones "aproximadamente" y "alrededor de" significan en un intervalo del 10 % por encima o por debajo del valor indicado.

En algunas realizaciones, el primer diámetro D1 de la abertura 103 del nanoporo 100 es aproximadamente 100 nm o menor, o aproximadamente 50 nm o menor, o aproximadamente 20 nm o menor, o aproximadamente 10 nm o menor, o aproximadamente 5 nm o menor o aproximadamente 2 nm o menor. Por ejemplo, D1 puede ser entre aproximadamente 2 nm y aproximadamente 100 nm, o entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 50 nm o entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 20 nm. En realizaciones que incluyen la constricción 104 opcional, el segundo diámetro D2 de la constricción 104 del nanoporo 100 es aproximadamente 100 nm o menor, o aproximadamente 50 nm o menor, o aproximadamente 20 nm o menor, o aproximadamente 10 nm o menor, o aproximadamente 5 nm o menor, o aproximadamente 2 nm o menor o aproximadamente 1 nm o menor. Por ejemplo, D2 puede ser entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 100 nm, o entre aproximadamente 2 nm y aproximadamente 50 nm o entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 20 nm. De manera ilustrativa, D1 puede ser entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 50 nm y D2 (si corresponde) puede ser entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 5 nm.

En una realización ilustrativa, D1 es de aproximadamente 5 a 10 nm y D2 es de aproximadamente 1 a 1,2 nm. En otra realización ilustrativa, D1 es de aproximadamente 5 a 10 nm y D2 es de aproximadamente 1,2 a 1,4 nm. En otra realización ilustrativa más, D1 es de aproximadamente 5 a 10 nm y D2 es de aproximadamente 1,4 a 1,6 nm. En otra realización ilustrativa más, D1 es de aproximadamente 5 a 10 nm y D2 es de aproximadamente 1,6 a 1,8 nm. En otra realización ilustrativa más, D1 es de aproximadamente 5 a 10 nm y D2 es de aproximadamente 1,8 a 2,0 nm. En realizaciones ilustrativas donde el poro es MspA, D1 puede ser, por ejemplo, aproximadamente 4,8 nm, D2 puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1,1 a 1,2 nm, H1 puede ser, por ejemplo, aproximadamente 9,6 nm y H2 puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 7,9 a 8,1 nm. En realizaciones ilustrativas donde el poro es ahemolisina, D1 puede ser, por ejemplo, aproximadamente 2,6 nm, D2 puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1,4 a 1,5 nm, H1 puede ser, por ejemplo, aproximadamente 10 nm y H2 puede ser, por ejemplo, aproximadamente 5 nm. Se pueden seleccionar otras combinaciones adecuadas de dimensiones de forma adecuada para otros tipos de poros.

Las características de la fijación 110 permanente se pueden seleccionar adecuadamente en función de una o más de las dimensiones del nanoporo 100. Por ejemplo, el cuerpo alargado 113 de la fijación 110 puede tener una anchura seleccionada en función de D1 o D2 (si corresponde) o tanto D1 como D2 (si corresponde). Por ejemplo, la anchura del cuerpo alargado 113 se puede seleccionar de modo que el cuerpo alargado 113 sea móvil dentro de la abertura 103 en respuesta a un acontecimiento u otro estímulo, p. ej., el cuerpo alargado 113 tiene una anchura menor que el primer diámetro D1 de la abertura 103. En realizaciones que incluyen la constricción 104 opcional, la anchura del cuerpo alargado 113 también se puede seleccionar de modo que al menos una parte del cuerpo alargado 113 sea móvil adyacente a la constricción 104, p. ej., tiene una anchura que es igual o menor que el segundo diámetro D2. Opcionalmente, en realizaciones que incluyen la constricción 104, la anchura del cuerpo alargado 113 también se puede seleccionar de modo que al menos una parte del cuerpo alargado 113 sea móvil a través de la constricción 104, p. ej., tiene una anchura que es suficientemente menor que el segundo diámetro D2 para permitir el movimiento del cuerpo alargado 113 a través de la constricción 104, p. ej., en respuesta a un acontecimiento u otro estímulo. Si el nanoporo 100 incluye múltiples constricciones (no ilustradas específicamente), entonces la anchura del cuerpo alargado 113 puede seleccionarse de modo que el cuerpo alargado 113 sea móvil a través de algunas o todas las constricciones de este tipo, según sea adecuado.

La longitud del cuerpo alargado 113 de la fijación 110 puede seleccionarse en función de H1 o H2 (si corresponde) o tanto H1 como H2 (si corresponde). Por ejemplo, la longitud del cuerpo alargado 113 se puede seleccionar para que sea más corta que HI, de modo que la región de cola 112 no se extienda más allá de la superficie externa 106 del segundo lado 102 del nanoporo 100 incluso si el cuerpo alargado 113 se extendiera completamente a través de la constricción 104 hacia el segundo lado 102. O, por ejemplo, en realizaciones que incluyen la constricción 104 opcional, la longitud del cuerpo alargado 113 se puede seleccionar para que sea más corta que H2, de modo que la región de cola 112 no se extienda más allá de la constricción 104 del nanoporo 100 incluso si el cuerpo alargado 113 estuviera completamente extendido hacia el segundo lado 103. En otras realizaciones, la longitud del cuerpo alargado 113 se puede seleccionar para que sea más larga que HI, de modo que la región de cola 112 se extienda más allá de la superficie externa 106 del segundo lado 102 del nanoporo 100 si el cuerpo alargado 113 se extendiera completamente a través de la constricción 104 hacia el segundo lado 102. O, por ejemplo, en realizaciones que incluyen la constricción 104 opcional, la longitud del cuerpo alargado 113 se puede seleccionar para que sea más larga que H2, de modo que la región de cola 112 se extienda más allá de la constricción 104 del nanoporo 100 si el cuerpo alargado 113 estuviera completamente extendido hacia el segundo lado 103.

La longitud del cuerpo alargado 113 se puede seleccionar para permitir un movimiento relativamente libre del cuerpo alargado 113 dentro de la abertura 103, al menos en el primer lado 101 del nanoporo 100, sustancialmente sin impedimento estérico u otra interferencia provocada por el propio cuerpo alargado. Es decir, el cuerpo alargado 113 se puede configurar para que ocupe solo una parte del volumen de la abertura 103 en el primer lado 101 del nanoporo 100, p. ej., para que ocupe menos del 50 % del volumen de la abertura 103 en el primer lado 101 del nanoporo 100, o menos del 20 % del volumen de la abertura 103 en el primer lado 101 del nanoporo 100, o menos del 10 % del volumen de abertura 103 en el primer lado 101 del nanoporo 100, o menos del 5 % del volumen de la abertura 103 en el primer lado 101 del nanoporo 100 o menos del 1 % del volumen de la abertura 103 en el primer lado 101 del nanoporo 100. Adicionalmente, en la realización ilustrada en la fig. 1A, la región de cola 112 de la fijación 110 puede no estar unida al nanoporo 100 o a cualquier otro miembro, permitiendo de este modo un movimiento relativamente libre de la totalidad del cuerpo alargado 113 con respecto a la región de cabeza 111.

Aunque la fig. 1A ilustra una disposición ilustrativa de los componentes del nanoporo 100 y la fijación 110 permanente, debe entenderse que se pueden usar otras disposiciones de manera adecuada. Por ejemplo, la región de cabeza 111 de la fijación 110 permanente, en cambio, se puede anclar al segundo lado 102. O, por ejemplo, la región de cabeza 111 de la fijación 110 permanente, en cambio, se puede anclar adyacente al primer lado 101 o al segundo lado 102 del nanoporo 100. O, por ejemplo, la región de cola 112 de la fijación 110 permanente, en cambio, se puede disponer en el segundo lado 102 del nanoporo 100. O, por ejemplo, la región de cola 112 de la fijación 110 permanente, en cambio, se puede anclar al primer lado 101 o al segundo lado 102 del nanoporo 100. O, por ejemplo, el cuerpo alargado 113 de la fijación 110 permanente puede incluir una región indicadora o un resto que puede unirse a otra molécula, o tanto una región indicadora como un resto que puede unirse a otra molécula. Algunas de estas combinaciones de características se describen en el presente documento, pero debe apreciarse que todas estas combinaciones de características están contempladas y se pueden prever fácilmente basándose en las enseñanzas del presente documento.

Por ejemplo, la fig. 1B ilustra una composición alternativa que incluye el nanoporo 100 y la fijación alternativa 110' que tiene una región de cabeza 111', región de cola 112' y cuerpo alargado 113'. La región de cabeza 111' está anclada al primer lado 101 del nanoporo 100. La región de cola 112' se extiende libremente hacia el segundo lado 102 del nanoporo 100 de una manera análoga a la ilustrada en la fig. 1A, excepto que el cuerpo alargado 113' es suficientemente largo para que la región de cola 112' pueda disponerse en el segundo lado 102 del nanoporo 100. La constricción 104 es opcional.

En otro aspecto de la divulgación, una composición incluye un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través de los primer y segundo lados; y una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas. La región de cabeza puede estar anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo. El cuerpo alargado que incluye una región indicadora puede ser móvil dentro de la abertura en respuesta a un primer acontecimiento que se produzca adyacente al primer lado del nanoporo. La región indicadora puede ser móvil de forma traslacional dentro de la abertura en respuesta al primer acontecimiento. De manera adicional, o como alternativa, la región indicadora puede ser móvil de forma rotacional dentro de la abertura en respuesta al primer acontecimiento. De manera adicional, o como alternativa, la región indicadora puede ser móvil de forma conformacional dentro de la abertura en respuesta al primer acontecimiento.

Por ejemplo, la fig. 1C ilustra una composición alternativa que incluye el nanoporo 100 y la fijación alternativa 110'' que tiene una región de cabeza 111'', región de cola 112" y cuerpo alargado 113". La región de cabeza 111" está anclada al primer lado 101 del nanoporo 100. La región de cola 112" se extiende libremente hacia el segundo lado 102 del nanoporo 100 y el cuerpo alargado 113" es lo suficientemente largo para que la región de cola 112" pueda disponerse en el segundo lado 102 del nanoporo 100. Adicionalmente, el cuerpo alargado 113" incluye una primera región indicadora 114", lo que facilita la medición del movimiento de traslación, rotacional o conformacional del cuerpo alargado 113", p. ej., movimiento relativo a la constricción 104 opcional en realizaciones que incluyen dicha constricción. Por ejemplo, la primera región indicadora 114" puede tener una propiedad física, química, óptica, eléctrica, biológica u otra propiedad adecuada de bloqueo de flujo diferente que una o más de otras regiones del cuerpo alargado 113". El movimiento de traslación, rotación o conformacional de la primera región indicadora 114", representado en la fig. 1C por la flecha discontinua, puede ser detectable usando una o más técnicas descritas en el presente documento, conocidas en este campo o aún por desarrollar. Opcionalmente, el cuerpo alargado 113" puede incluir más de una región indicadora, p. ej., puede incluir la segunda región indicadora 114"'. El cuerpo alargado 113" puede incluir cualquier número adecuado de regiones indicadoras, p. ej., una, dos, tres, cuatro, cinco o más de cinco regiones indicadoras. Cada una de estas regiones indicadoras puede ser igual que las demás regiones indicadoras. Como alternativa, cada una de estas regiones indicadoras puede ser diferente de las demás regiones indicadoras. O, algunas regiones indicadoras pueden ser iguales entre sí, mientras que otras regiones indicadoras pueden ser diferentes entre sí.

En determinadas realizaciones, la primera región indicadora 114" y la segunda región indicadora 114"' opcional son móviles de forma traslacional hacia el primer lado 101 del nanoporo 100 en respuesta a un primer acontecimiento. La primera región indicadora 114" y la segunda región indicadora 114"' opcional también pueden ser móviles de forma traslacional hacia el segundo lado 102 del nanoporo 100 después del primer acontecimiento. La primera región indicadora 114" y la segunda región indicadora 114"' opcional también pueden ser móviles de forma traslacional hacia el primer lado 101 del nanoporo 100 en respuesta a un segundo acontecimiento después del primer acontecimiento y de nuevo móviles de forma traslacional hacia el segundo lado 102 del nanoporo 100 después del segundo acontecimiento. El primer o segundo acontecimiento, o ambos, pueden producirse adyacentes al primer lado del nanoporo. En realizaciones que incluyen la constricción 104 opcional, la primera región indicadora 114" puede disponerse en una ubicación a lo largo del cuerpo alargado 113" que se selecciona de manera que, en función de que el cuerpo alargado 113" esté extendido total o parcialmente, la primera región indicadora 114" se puede colocar adyacente o dentro de la constricción 104. Adicionalmente, la segunda región indicadora 114"' opcional puede disponerse en una ubicación a lo largo del cuerpo alargado 113" que se selecciona de manera que, en función de que el cuerpo alargado 113" esté extendido total o parcialmente, la segunda región indicadora 114" se puede colocar adyacente o dentro de la constricción 104. En algunas realizaciones, la primera región indicadora 114"' se puede colocar adyacente o dentro de la constricción 104 en respuesta a un primer acontecimiento y la segunda región indicadora 114"' se puede colocar adyacente o dentro de la constricción 104 en respuesta a un segundo acontecimiento, y el primer y segundo acontecimientos son distinguibles entre sí basándose en la detección de si la primera región indicadora 114" o la segunda región indicadora 114"' está dispuesta adyacente o dentro de la constricción 104. En un ejemplo no limitante, ilustrativo, el cuerpo alargado 113" incluye un polinucleótido que incluye uno o más nucleótidos abásicos que definen la primera región indicadora 114" y la segunda región indicadora 114"' opcional a lo largo de una parte de la longitud del cuerpo alargado 113". Se puede detectar un nucleótido abásico dentro de una abertura de un nanoporo como se describe, por ejemplo, en Wilson, "Electronic Control of DNA Polymerase Binding and Unbinding to Single DNA Molecules Tethered in a Nanopore", tesis doctoral, Universidad de California Santa Cruz (2009), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia. De manera ilustrativa, el movimiento o la presencia de uno o más nucleótidos abásicos u otras regiones indicadoras 114", 114"' adecuadas pueden provocar un cambio medible en una corriente a través de la abertura 103 o la constricción 104, un cambio medible en el flujo de moléculas a través de la abertura 103 o la constricción 104 o una señal óptica. Por ejemplo, un cambio en un flujo de moléculas a través de la abertura 103 o la constricción 104 se puede detectar de forma eléctrica, química, biológica u óptica.

Como ejemplo adicional, la fig. 1D ilustra una composición alternativa que incluye el nanoporo 100 y la fijación alternativa 120 que tiene una región de cabeza 121, la región de cola 122 y el cuerpo alargado 123. La región de cabeza 121 está anclada al segundo lado 102 del nanoporo 100. La región de cola 122 se extiende libremente hacia el primer lado 101 del nanoporo 100 y el cuerpo alargado 123 es lo suficientemente largo para que la región de cola 122 pueda disponerse en el primer lado 101 del nanoporo 100. Sin embargo, debería apreciarse que la región de cola 122, en cambio, puede estar dispuesta en el segundo lado 102 del nanoporo 100, p. ej., ese cuerpo alargado 123 tiene una longitud tal que la región de cola 122 está dispuesta en el segundo lado 102 del nanoporo 100 incluso si el cuerpo alargado 123 está completamente extendido. Adicionalmente, el cuerpo alargado 123 incluye la región indicadora 124, que facilita las mediciones de movimiento de traslación, rotacional o conformacional (o una combinación de los mismos) del cuerpo alargado 124, p. ej., como se representa en la fig. 1D por la flecha discontinua. En determinadas realizaciones, la región indicadora 124 es móvil de forma traslacional hacia el primer lado 101 del nanoporo 100 en respuesta a un primer acontecimiento u otro estímulo y móvil de forma traslacional hacia el segundo lado 102 del nanoporo 100 después del primer acontecimiento u otro estímulo. La región indicadora 124 también puede ser móvil de forma traslacional hacia el primer lado 101 del nanoporo 100 en respuesta a un segundo acontecimiento u otro estímulo después del primer acontecimiento u otro estímulo y de nuevo móvil hacia el segundo lado 102 del nanoporo 100 después del segundo acontecimiento u otro estímulo. El primer o segundo acontecimiento, o ambos, pueden producirse adyacentes al primer lado del nanoporo. El estímulo puede incluir, por ejemplo, una tensión aplicada a través del nanoporo 100. En realizaciones que incluyen la constricción 104 opcional, la región indicadora 124 puede, en algunas realizaciones, ser móvil adyacente o incluso a través de la constricción 104, p. ej., en respuesta a un acontecimiento u otro estímulo. Debería apreciarse que no es necesario que el cuerpo alargado 123 incluya de forma obligatoria la región indicadora 124.

Como ejemplo adicional, la fig. 1E ilustra una composición alternativa que incluye el nanoporo 100 y la fijación alternativa 120' que tiene una región de cabeza 121', región de cola 122' y cuerpo alargado 123'. La región de cabeza 121' está anclada adyacente al primer lado 101 del nanoporo 100, p. ej., está anclada a otro miembro 150' que puede tener, pero no es necesario que tenga, una posición sustancialmente fija con relación al nanoporo 100 y puede disponerse adyacente al nanoporo 100. La región de cola 122' se extiende libremente hacia el segundo lado 102 del nanoporo 100 de una manera análoga a la ilustrada en la fig. 1A. En la realización ilustrada en la fig. IE, la región de cola 122' está dispuesta en el primer lado 101 del nanoporo 100, p. ej., el cuerpo alargado 123' tiene una longitud seleccionada de modo que la región de cola 122' esté dispuesta en el primer lado 101 del nanoporo 100 incluso si el cuerpo alargado 123' está completamente extendido. Debe apreciarse que el cuerpo alargado 123', en cambio, puede ser lo suficientemente largo para que la región de cola 122' pueda disponerse en el segundo lado 102 del nanoporo 100. La constricción 104 es opcional. En cambio, la región de cabeza 121' se puede anclar a otro miembro (no ilustrado) dispuesto adyacente al segundo lado 102 del nanoporo 100.

Como ejemplo adicional, la fig. IF ilustra una composición alternativa que incluye el nanoporo 100 y la fijación alternativa 120'' que tiene una región de cabeza 121'', región de cola 122" y cuerpo alargado 123". La región de cabeza 121" está anclada adyacente al primer lado 101 del nanoporo 100, p. ej., está anclada a otro miembro 150'' que puede tener, pero no es necesario que tenga, una posición sustancialmente fija con relación al nanoporo 100 y puede disponerse adyacente al nanoporo 100. La región de cola 122" se extiende libremente hacia el segundo lado 102 del nanoporo 100 y el cuerpo alargado 123" es lo suficientemente largo para que la región de cola 122" pueda disponerse en el segundo lado 102 del nanoporo 100. Adicionalmente, el cuerpo alargado 123" incluye la región indicadora 124", lo que facilita la medición del movimiento de traslación, rotacional o conformacional del cuerpo alargado 113", p. ej., como se representa en la fig. IF por la flecha discontinua. En determinadas realizaciones, la región indicadora 124'' es móvil de forma traslacional hacia el primer lado 101 del nanoporo 100 en respuesta a un primer acontecimiento y móvil de forma traslacional hacia el segundo lado 102 del nanoporo 100 después del primer acontecimiento. La región indicadora 124" también puede ser móvil de forma traslacional hacia el primer lado 101 del nanoporo 100 en respuesta a un segundo acontecimiento después del primer acontecimiento y de nuevo móvil de forma traslacional hacia el segundo lado 102 del nanoporo 100 después del segundo acontecimiento. El primer o segundo acontecimiento, o ambos, pueden producirse adyacentes al primer lado del nanoporo. En realizaciones que incluyen la constricción 104, la región indicadora 124" puede ser móvil de forma traslacional adyacente o incluso a través de la constricción 104, p. ej., en respuesta a un acontecimiento u otro estímulo. En cambio, la región de cabeza 121'' se puede anclar a otro miembro (no ilustrado) dispuesto adyacente al segundo lado 102 del nanoporo 100.

Las longitudes de los presentes cuerpos alargados se pueden variar de forma adecuada de modo que las presentes regiones de cola puedan disponerse en cualquier ubicación adecuada con respecto al nanoporo 100. Por ejemplo, la fig. 1G ilustra una composición alternativa que incluye el nanoporo 100 y la fijación alternativa 130 que tiene una región de cabeza 131, una región de cola 132 y un cuerpo alargado 133. La región de cabeza 131 está anclada al primer lado 101 del nanoporo 100. La región de cola 132 se extiende libremente hacia el segundo lado 102 del nanoporo 100 y el cuerpo alargado 133 es lo suficientemente largo para que la región de cola 132 pueda disponerse más allá del segundo lado 102 del nanoporo 100, p. ej., más allá de la superficie externa 106 del segundo lado 102. Opcionalmente, el cuerpo alargado 133 también incluye la región indicadora 134. En cambio, la región de cabeza 131 se puede anclar al segundo lado 102 del nanoporo 100 o adyacente al primer lado 101 o al segundo lado 102 del nanoporo 100.

Adicionalmente, no es necesario que las presentes regiones de cola se extiendan libremente, sino que, en cambio, se pueden unir a cualquier miembro adecuado. Por ejemplo, la fig. 1H ilustra una composición alternativa que incluye el nanoporo 100 y la fijación alternativa 130' que tiene una región de cabeza 131', región de cola 132' y cuerpo alargado 133'. La región de cabeza 131' está anclada al primer lado 101 del nanoporo 100, aunque la región de cabeza 131', en cambio, puede estar anclada adyacente al primer lado 101 del nanoporo 100. La región de cola 132' se extiende a través de la abertura 103 del nanoporo 100 y está anclada en el segundo lado 102 del nanoporo 100, p. ej., está anclada a la superficie externa 106 del segundo lado 102, aunque la región de cola 132', en cambio, puede estar anclada adyacente al segundo lado 102 del nanoporo 100. El cuerpo alargado 133' es suficientemente largo para permitir la unión de la región de cabeza 131' a o adyacente al primer lado 101 del nanoporo 100 y la unión de la región de cola 132' a o adyacente al segundo lado 102 del nanoporo 100. Opcionalmente, el cuerpo alargado 133 también incluye la región indicadora 134'. Como alternativa, la región de cabeza 131' puede estar unida a, o adyacente, al segundo lado 102 del nanoporo 100 y la región de cola 132' puede estar unida a, o adyacente, al primer lado 101 del nanoporo 100.

Como ejemplo adicional, la fig. 1I ilustra una composición alternativa que incluye el nanoporo 100 y la fijación alternativa 130'' que tiene una región de cabeza 131'', región de cola 132" y cuerpo alargado 133". La región de cabeza 131" está anclada al primer lado 101 del nanoporo 100, aunque la región de cabeza 131'', en cambio, puede estar anclada adyacente al primer lado 101 del nanoporo 100. La región de cola 132'' se extiende a través de la abertura 103 del nanoporo 100 y está unida adyacente a o más allá del segundo lado 102 del nanoporo 100, p. ej., está anclada a otro miembro 150"' que está dispuesto adyacente a, o más allá de, la superficie externa 106 del segundo lado 102. Como alternativa, el miembro 150"' puede estar dispuesto total o parcialmente dentro de la abertura 103. El cuerpo alargado 133'' es suficientemente largo para permitir la unión de la región de cabeza 131'' a o adyacente al primer lado 101 del nanoporo 100 y la unión de la región de cola 132'' al miembro 150''', p. ej., adyacente a o más allá del segundo lado 102 del nanoporo 100, o dentro de la abertura 103. Opcionalmente, el cuerpo alargado 133 también incluye la región indicadora 134". Como alternativa, la región de cabeza 131'' puede estar unida a o adyacente al segundo lado 102 del nanoporo 100 y la región de cola 132'' puede estar unida a o adyacente al primer lado 101 del nanoporo 100, p. ej., puede estar anclada a otro miembro (no ilustrado) que está dispuesto adyacente a, o más allá de, la superficie externa 105 del primer lado 101.

Debe apreciarse que puede usarse cualquier tipo adecuado de nanoporo y cualquier tipo adecuado de fijación permanente en las realizaciones ilustradas en las figs. 1A-1I. Por ejemplo, como se ha señalado anteriormente, el nanoporo puede incluir un poro biológico, poro de estado sólido o un poro híbrido biológico y de estado sólido. La fig.

1J ilustra una composición ilustrativa que incluye un nanoporo 100' de estado sólido y una fijación 140 que tiene una región de cabeza 141, una región de cola 142 y un cuerpo alargado 143. El nanoporo 100' incluye el primer lado 101' y el segundo lado 102' que pueden incluir cualquier material de estado sólido adecuado o combinación de materiales de estado sólido. El primer lado 101' se puede definir por la capa 107' que incluye uno o más materiales de estado sólido y está dispuesto sobre el segundo lado 102', que puede incluir uno o más materiales de estado sólido. Los materiales de estado sólido ilustrativos adecuados para su uso en el primer lado 101' o el segundo lado 102', o ambos, incluyen silicio (Si), nitruro de silicio (SiN o S^íN^x), grafeno y óxido de silicio (SiO2 o SÍO^x). En la realización ilustrada, la abertura 103' se puede definir a través del segundo lado 102' y la constricción 104' se puede definir a través de la capa 107'. Sin embargo, debe apreciarse que la capa 107' y el segundo lado 102' pueden tener cualquier configuración adecuada para definir una abertura y una región de constricción. La región de cabeza 141 está anclada a la superficie externa 105' del primer lado 101' del nanoporo 100', aunque la región de cabeza 141, en cambio, puede estar anclada adyacente al primer lado 101' del nanoporo 100' o puede estar anclada a o adyacente al segundo lado 102' del nanoporo 100'. En la realización ilustrada en la fig. 1J, la región de cola 142 se extiende libremente hacia el segundo lado 102' del nanoporo 100' y el cuerpo alargado 143 es lo suficientemente largo para que la región de cola 142 pueda disponerse en el segundo lado 102' del nanoporo 100'. Como alternativa, la región de cola 142 puede extenderse libremente hacia o puede estar unida a, adyacente a o más allá del primer lado 101' o del segundo lado 102' del nanoporo 100'. Opcionalmente, el cuerpo alargado 143 también incluye la región indicadora 144. Para obtener más detalles acerca de los nanoporos de estado sólido, véanse las siguientes referencias, cuyo contenido completo de cada uno se incorpora en el presente documento por referencia: Dekker, "Solid-state nanopores", Nature Nanotechnology 2: 209-215 (2007); Schneider et al., "DNA Translocation through Graphene Nanopores", Nano Letters 10: 3163-3167 (2010); Merchant et al. Nano Letters 10: 2915-2921 (2010); y Garaj et al., "Graphene as a subnanometre trans-electrode membrane", Nature 467: 190-193 (2010).

Como ejemplo adicional, la fig. 1K ilustra una composición ilustrativa que incluye un nanoporo 100" biológico o híbrido biológico y de estado sólido y una fijación 140' que tiene una región de cabeza 141', región de cola 142' y cuerpo alargado 143'. El nanoporo 100" incluye la barrera 107" y el poro biológico 108" dispuestos dentro de la barrera 107". El poro biológico 108" incluye la abertura 103" definida a través del mismo y una o más constricciones 104". Los poros biológicos incluyen, por ejemplo, poros polipeptídicos y poros polinucleotídicos. La barrera 107" puede incluir una membrana de origen biológico o una membrana de estado sólido. Las membranas de origen biológico incluyen bicapas lipídicas. Las membranas de estado sólido incluyen silicio y grafeno. La región de cabeza 141' de la fijación 140' está anclada a o adyacente al primer lado 101" del nanoporo 100". Por ejemplo, en la realización ilustrada en la fig. 1K, la región de cabeza 141' está anclada al poro biológico 108" en el primer lado 101" del nanoporo 100", p. ej., unido covalentemente a un resto en el poro biológico 108" en el primer lado 101". La región de cabeza 141', en cambio, puede estar anclada adyacente al primer lado 101'' del nanoporo 100'', p. ej., puede estar anclada a un miembro que está adyacente al poro biológico 108" en el primer lado 101" o puede estar anclada a o adyacente al segundo lado 102" del nanoporo 100". La región de cola 142' se extiende libremente hacia el segundo lado 102'' del nanoporo 100'' y el cuerpo alargado 143' es lo suficientemente largo para que la región de cola 142' pueda disponerse en o más allá del segundo lado 102'' del nanoporo 100'', p. ej., más allá de la superficie externa 106" de la barrera 107". Como alternativa, la región de cola 142' puede extenderse libremente hacia o puede estar unida a, adyacente a o más allá del primer lado 101'' o del segundo lado 102'' del nanoporo 100''. Opcionalmente, el cuerpo alargado 143' también incluye la región indicadora 144'. Para más detalles acerca de nanoporos híbridos ilustrativos y la preparación de los mismos, véanse las siguientes referencias, cuyo contenido completo de cada uno se incorpora en el presente documento por referencia: Hall et al., "Hybrid pore formation by directed insertion of alpha hemolysin into solid-state nanopores", Nature Nanotechnology 5: 874-877 (2010) y Cabello-Aguilar et al., "Slow translocation of polynucleotides and their discrimination by a-hemolysin inside a single track-etched nanopore designed by atomic layer deposition", Nanoscale 5: 9582-9586 (2013).

Obsérvese que en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, no es necesario que el nanoporo incluya de forma obligatoria la constricción opcional. Por ejemplo, la fig. 1L ilustra una composición ilustrativa que incluye un nanoporo 100''' alternativo y una fijación 140'' que tiene una región de cabeza 141'', región de cola 142" y cuerpo alargado 143". El nanoporo 100''' incluye el primer lado 101''' y el segundo lado 102''' que pueden incluir cualquier material de estado sólido adecuado o combinación de materiales de estado sólido. El primer lado 101"' y el segundo lado 102"' pueden definirse mediante la capa 107"' que incluye uno o más materiales de estado sólido. Los materiales de estado sólido ilustrativos adecuados para su uso en la capa 107"' incluyen silicio (Si), nitruro de silicio (SiN o SiNx), grafeno, óxido de silicio (SiO2 o SiOx) o una combinación de los mismos. En la realización ilustrada, la abertura 103"' puede definirse a través del primer y segundo lados 101"', 102"' y puede carecer de una región de constricción. La región de cabeza 141'' de la fijación 140'' está anclada a la superficie externa 105''' del primer lado 101''' del nanoporo 100''', aunque la región de cabeza 141'', en cambio, puede estar anclada adyacente al primer lado 101''' del nanoporo 100''' o puede estar anclada a o adyacente al segundo lado 102''' del nanoporo 100'. En la realización ilustrada en la fig. 1L, la región de cola 142" se extiende libremente hacia el segundo lado 102'' del nanoporo 100''' y el cuerpo alargado 143" es lo suficientemente largo para que la región de cola 142" pueda disponerse en el segundo lado 102''' del nanoporo 100'''. Como alternativa, la región de cola 142'' puede extenderse libremente hacia o puede estar unida a, adyacente a o más allá del primer lado 101''' o del segundo lado 102''' del nanoporo 100'''.

Opcionalmente, el cuerpo alargado 143'' también incluye la región indicadora 144''. La región indicadora 144" puede facilitar la medición del movimiento de traslación, rotación o conformacional del cuerpo alargado 143". En una realización ilustrativa, la dimensión D1 de la abertura 103" se selecciona adecuadamente para facilitar el uso de la región indicadora para medir el movimiento del cuerpo alargado 143". Por ejemplo, la abertura 103" puede ser lo suficientemente estrecha para interactuar de forma medible con la región indicadora 144" en respuesta al movimiento de la región indicadora 144". A modo de ejemplo, la región indicadora 144" tiene una característica de bloqueo eléctrico o de flujo y la abertura 103" tiene una anchura seleccionada de modo que el movimiento de la región indicadora 144" provoque un cambio detectable en la corriente o el flujo a través de la abertura 103" con una tensión aplicada a través del nanoporo 100"'. Por ejemplo, los nucleótidos que son mayores (tales como A y G) pueden dar lugar a más bloqueo cuando se disponen en una abertura, p. ej., dispuesta en la constricción de MspA, en comparación con T, que es menor. Los intervalos ilustrativos de corrientes o flujos de bloqueo en términos de % de flujo o corriente de poro abierto incluyen de 0 a 10 %, de 10 % a 20 %, de 20 % a 30 %, de 30 % a 40 %, de 40 % a 50 %, de 60 % a 70 %, de 70 % a 80 %, de 80 % a 90 % y de 90 % a 100 %. En una realización ilustrativa, el intervalo está entre el 20 % y el 70 % para MspA en KCL 300 mM con una polarización de 180 mV y una corriente de poro abierto de 110 pA.

En otro ejemplo más, la fig. 1M ilustra una composición alternativa que incluye el nanoporo 100 y la fijación alternativa 170 que tiene una región de cabeza 171, una región de cola 172 y un cuerpo alargado 173. La región de cabeza 171 está anclada adyacente al primer lado 101 del nanoporo 100, p. ej., está anclada a otro miembro 180 que opcionalmente puede tener, pero no es necesario que tenga, una posición sustancialmente fija con respecto al nanoporo 100. La región de cola 172 se extiende a través de la abertura 103 del nanoporo 100 y está unida adyacente a o más allá del segundo lado 102 del nanoporo 100, p. ej., está anclada a otro miembro 180' que está dispuesto dentro de la abertura 103 o está dispuesto adyacente a, o más allá de, la superficie externa del segundo lado 102. El cuerpo alargado 173 es suficientemente largo para permitir la unión de la región de cabeza 171 al miembro 180 y la unión de la región de cola 172 al miembro 180'. Opcionalmente, el miembro 180 es lo suficientemente grande para no poder atravesar físicamente la totalidad de la abertura 103. De manera adicional, o como alternativa, el miembro 180' es lo suficientemente grande para no poder atravesar físicamente la totalidad de la abertura 203. Por consiguiente, la unión de la región de cabeza 171 al miembro 180 y la unión de la región de cola 172 al miembro 180' puede retener la fijación 170 en el nanoporo 100, puede retener el miembro 180 en el primer lado 101 del nanoporo 100 y puede retener el miembro 180' en el segundo lado 102 del nanoporo 100, incluso si los miembros 180 y 180' no están unidos respectivamente al primer lado 101 o al segundo lado 102 del nanoporo 100. Por consiguiente, se puede considerar que la región de cabeza 171 está anclada adyacente al primer lado 101 independientemente de si el miembro 180 está unido al primer lado 101. En un ejemplo, la composición ilustrada en la fig. 1M se puede preparar uniendo la región de cabeza 171 al miembro 180, seguido de la disposición de la región de cola 172 en el segundo lado 102, seguido de la unión de la región de cola 172 al miembro 180'. En otro ejemplo, la composición ilustrada en la fig. 1M se puede preparar uniendo la región de cola 172 al miembro 180', seguido de la disposición de la región de cabeza 171 en el primer lado 101, seguido de la unión de la región de cabeza 171 al miembro 180. Puede utilizarse cualquier unión adecuada, incluyendo las descritas en otras partes del presente documento. En una realización puramente ilustrativa, no limitante, el primer miembro 180 puede incluir una polimerasa y el segundo miembro 180' puede incluir un ácido nucleico que hibrida con un ácido nucleico de la región de cola 172. En un ejemplo, una preparación ilustrativa de dicha composición y un uso ilustrativo de dicha composición para detectar la acción de la polimerasa sobre un nucleótido, se describen con mayor detalle en el presente documento con referencia a las figs. 22A-22D.

Adicionalmente, el cuerpo alargado 173 incluye opcionalmente la región indicadora 174, lo que facilita la medición del movimiento de traslación, rotación o conformacional del cuerpo alargado 173, p. ej., como se representa en la fig.

1M por la flecha discontinua. En determinadas realizaciones, la región indicadora 174 es móvil de forma traslacional hacia el primer lado 101 del nanoporo 100 en respuesta a un primer acontecimiento y móvil de forma traslacional hacia el segundo lado 102 del nanoporo 100 después del primer acontecimiento. La región indicadora 174 también puede ser móvil de forma traslacional hacia el primer lado 101 del nanoporo 100 en respuesta a un segundo acontecimiento después del primer acontecimiento y de nuevo móvil de forma traslacional hacia el segundo lado 102 del nanoporo 100 después del segundo acontecimiento. El primer o segundo acontecimiento, o ambos, pueden producirse adyacentes al primer lado del nanoporo. En realizaciones que incluyen la constricción 104, la región indicadora 174 puede ser móvil de forma traslacional adyacente a o incluso a través de la constricción 104, p. ej., en respuesta a un acontecimiento u otro estímulo.

Adicionalmente, obsérvese que, en cualquiera de los ejemplos anteriores, así como otras composiciones no ilustradas específicamente, el cuerpo alargado de la fijación puede incluir opcionalmente un resto que interactúa con una molécula. Dicha interacción puede, por ejemplo, provocar un cambio en la posición relativa de una región indicadora para indicar de forma medible la presencia de la molécula o puede estabilizar la molécula en una posición particular con respecto a la constricción del nanoporo. Algunos ejemplos no limitantes de dichos restos, y usos de los mismos, se proporcionan adicionalmente en el presente documento.

Adicionalmente, debería apreciarse que un grupo de cabeza de una fijación se puede unir a un nanoporo de varias formas. Por ejemplo, puede utilizarse química bioconjugada bien conocida tal como la descrita por Hermanson, mencionado anteriormente. En realizaciones ilustrativas, el nanoporo incluye un resto químico para formar una unión tal como una cisteína o un conector peptídico tal como un SpyTag. Se puede encontrar más información acerca de los spytags y su uso para formar uniones, por ejemplo, en las siguientes referencias, cuyo contenido completo de cada uno se incorpora en el presente documento por referencia: Zakeri et al., "Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 109: E690-E697 (2012) y Fierer et al., "SpyLigase peptide-peptide ligation polymerases affibodies to enhance magnetic cancer cell capture", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 111: E1176-E1181 (2014).

Por otra parte, debe apreciarse que otro miembro (al que se puede unir el grupo de cabeza de la fijación) puede estar unido a o adyacente a un nanoporo de múltiples formas. Por ejemplo, el grupo de cabeza de una fijación se puede unir a otro miembro, después el otro miembro puede cargarse en o adyacente al nanoporo y el otro miembro puede después unirse a o adyacente al nanoporo usando una unión adecuada. En un ejemplo puramente ilustrativo, no limitante, el grupo de cabeza de una fijación se puede unir a una polimerasa, después la polimerasa puede cargarse en o adyacente al nanoporo y la polimerasa puede después unirse a o adyacente al nanoporo usando una unión adecuada, tal como un conector covalente bioconjugado entre la fijación y el nanoporo. De esta manera, la fijación se puede unir a la polimerasa y tanto la fijación como la polimerasa se pueden unir al nanoporo mediante un enlace en la fijación. Los ejemplos de dichos conectores incluyen: NHS-ésteres, isocianatos y conjugación de conector de isotiocianato con aminas, maleimidas con cisteínas, química clic con azidas a alquinos, uso de marcadores de fusión tales como Halotag, Spycatcher-Spytag y otros métodos similares de bioconjugación proteínaproteína. Para obtener más información acerca de enlaces ilustrativos que se pueden utilizar, véanse las siguientes referencias, cuyo contenido completo de cada uno se incorpora en el presente documento por referencia: Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2a ed., Elsevier, 2008; Zakeri et al., "Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin", PNAS 109 (12): E691-E697 (2012); y Liu et al., "Specific Enzyme Immobilization Approaches and Their Application with Nanomaterials", Topics in Catalysis 55 (16-18): 1146­ 1156 (2012).

Sistemas ilustrativos

A continuación, se describirán sistemas ilustrativos para detectar acontecimientos que utilizan fijaciones ancladas a o adyacentes a nanoporos con referencia a las figs. 2A-2C. La fig. 2A ilustra esquemáticamente un sistema que incluye un circuito de medición (p. ej., un circuito de medición eléctrico u óptico) configurado para medir el movimiento o la presencia de una región indicadora dentro de la abertura de un nanoporo. El sistema 220 incluye el nanoporo 200, la fijación 210 permanente y el circuito 230 de medición. El nanoporo 200 incluye el primer lado 201, el segundo lado 202, la abertura 203 y, opcionalmente, también incluye la constricción 204. La fijación permanente 210 incluye la región de cabeza 211, una región de cola 212 y un cuerpo alargado 213. En la realización ilustrada en la fig. 2A, la región de cabeza 211 está anclada al primer lado 201 del nanoporo 200, la región de cola 212 está dispuesta en el segundo lado 201 del nanoporo 200 y se extiende libremente hacia el segundo lado 202 del nanoporo 100 o está unido a otro miembro y el cuerpo alargado 213 es móvil dentro de la abertura 203 del nanoporo 200. Sin embargo, el nanoporo 200 o la fijación 210, o ambos, pueden tener configuraciones diferentes a las ilustradas en la fig. 2A, tal como se ilustra en el presente documento. Por ejemplo, la región de cabeza 211 puede estar anclada a o adyacente al nanoporo 200, por ejemplo, utilizando un enlace tioéter o amida. En un ejemplo no limitante, ilustrativo, se puede crear un enlace tioéter mediante un grupo maleimida en la fijación 211 que reacciona con un grupo tiol reducido en un resto de cisteína en o adyacente al nanoporo 200. La introducción de un grupo maleimida en la fijación 211 se puede lograr fácilmente usando métodos bien conocidos en la técnica. De manera ilustrativa, la región de cabeza 211 se puede unir a otro miembro (p. ej., una polimerasa) dispuesto sobre o adyacente al primer lado 201 del nanoporo 200 de una manera análoga a la descrita anteriormente con referencia a las figs. IF y 1M, o la región de cola 212 se pueden unir a otro miembro (p. ej., un ácido nucleico) dispuesto en el segundo lado 202 del nanoporo 200 (p. ej., dentro de la abertura 203) de una manera análoga a la descrita anteriormente con referencia a las figs. 1I y 1m o ambas regiones de cabeza 211 se pueden unir a otro miembro (p. ej., una polimerasa) dispuesto en o adyacente al primer lado 201 del nanoporo 200 y la región de cola 212 se puede unir a otro miembro (p. ej., un ácido nucleico) dispuesto en el segundo lado 202 del nanoporo 200 (p. ej., dentro de la abertura 203) de una manera análoga a la descrita anteriormente con referencia a la fig. 1M. Opcionalmente, uno o ambos de dichos miembros pueden ser lo suficientemente grandes para no poder pasar por completo a través de la abertura 203 del nanoporo 200.

Adicionalmente, el cuerpo alargado 213 puede incluir la región indicadora 214 que facilita la medición del movimiento de traslación, rotación o conformacional o la presencia (o una combinación de los mismos) del cuerpo alargado 213 usando el circuito 230 de medición. Por ejemplo, la región indicadora 214 puede tener una propiedad física, química, eléctrica, óptica, biológica u otra propiedad adecuada de bloqueo de flujo diferente que una o más de otras regiones del cuerpo alargado 213. En algunas realizaciones, el circuito 230 de medición se puede configurar para detectar óptica, eléctrica, química o biológicamente el movimiento de la región indicadora 214 en relación con la constricción 204, p. ej., como se representa en la fig. 2A por la flecha discontinua. Por ejemplo, un sistema puede incluir un circuito de composición y medición configurado para medir la corriente o el flujo a través de la abertura o una señal óptica mientras la región indicadora de una fijación se mueve en respuesta a un acontecimiento. En un ejemplo ilustrativo, el nanoporo 200 y la fijación 210 se pueden sumergir en un líquido conductor, p. ej., una solución salina acuosa. El circuito 230 de medición puede estar en comunicación con el primer electrodo 231 y el segundo electrodo 232 y puede configurarse para aplicar una tensión entre el primer electrodo 231 y el segundo electrodo 232 para imponer una tensión a través del nanoporo 200. Se puede utilizar adecuadamente una tensión de corriente continua (CC) o de corriente alterna (CA). En algunas realizaciones, el circuito 230 de medición puede configurarse además para usar el primer electrodo 231 y el segundo electrodo 232 para medir la magnitud de una corriente o un flujo a través de la abertura 203. En algunas realizaciones, el circuito 230 de medición puede incluir además un sensor óptico, biológico o químico configurado respectivamente para detectar óptica, biológica o químicamente la magnitud de un flujo molecular a través de la abertura 203. Los sensores ópticos ilustrativos incluyen CCD y fotodiodos. En algunas realizaciones, el circuito 230 de medición incluye uno o más agentes que reaccionan química o biológicamente con el flujo molecular a través de la abertura 203 para generar una señal ópticamente detectable.

Por ejemplo, la región indicadora 214 puede tener una propiedad física diferente a algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado 213. Por ejemplo, la región indicadora 214 puede provocar una corriente de bloqueo diferencial o un flujo a través de la abertura 203 en comparación con otras regiones del cuerpo alargado 213. De manera adicional, o como alternativa, la región indicadora 214 puede tener una propiedad eléctrica o de bloqueo de flujo diferente a algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado 213. Por ejemplo, la región indicadora 214 puede incluir una carga electrostática, mientras que algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado 213 pueden incluir una carga electrostática diferente o pueden no tener carga (p. ej., pueden ser eléctricamente neutras). O, por ejemplo, la región indicadora 214 puede no tener carga, mientras que algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado 213 pueden incluir una carga electrostática. O, por ejemplo, la región indicadora 214 puede tener una propiedad física. Las propiedades físicas incluyen el volumen y la forma de la región indicadora 214. En un ejemplo ilustrativo, el movimiento de la región indicadora 214 dentro de la abertura 203 provoca un cambio medible en la corriente o el flujo a través de la abertura, o una constricción opcional 204 en la misma, al modular una corriente de bloqueo o flujo a través de la abertura o constricción. O, por ejemplo, la región indicadora 214 puede tener una propiedad química o biológica que facilite la detección química o biológica. Las propiedades químicas o biológicas incluyen la presencia de un grupo químico o biológico, p. ej., un grupo radiactivo o un grupo que tiene actividad enzimática.

Una o más propiedades eléctricas, físicas, químicas, ópticas, biológicas u otras propiedades de bloqueo de flujo de la región indicadora 214 pueden proporcionar un cambio medible en la corriente a través de la abertura 203 o la constricción 204, un cambio medible en el flujo de moléculas a través de la abertura 203 o la constricción 204 o una señal óptica. En un ejemplo ilustrativo, el movimiento o la presencia de la región indicadora 214 dentro de la abertura 203 provoca un cambio medible en una corriente a través de la abertura 203 o la constricción 204 o provoca un cambio medible en el flujo de moléculas a través de la abertura 203 o la constricción 204, cambio de flujo que puede ser eléctrica, química, biológica u ópticamente detectable. Por ejemplo, la presencia o el movimiento de la región indicadora 214 dentro de la abertura 203 o la constricción 204 pueden provocar un bloqueo de corriente iónica o un bloqueo de flujo molecular, que se puede detectar óptica, eléctrica, química o biológicamente. De manera ilustrativa, un gradiente de una molécula en el lado trans puede crear un flujo molecular natural que puede ser parcialmente bloqueado por la región indicadora 214. El circuito 230 de medición puede configurarse para medir dicho flujo molecular de forma no eléctrica (p. ej., de forma óptica) utilizando flujos de moléculas luminiscentes (p. ej., fluorescentes o quimioluminiscentes) o flujos de reactivos que se vuelven quimioluminiscentes en presencia de otros reactivos. Por ejemplo, Ca2+ puede fluir de un lado del nanoporo al otro lado donde se encuentra con un colorante sensible al calcio, tal como Fluo-2, Fluo-4, Fluo-8 o similares, para inducir la fluorescencia. Otros pares de reactivos que pueden utilizarse incluyen, pero sin limitación, luminol y oxidantes, calcio y ecuorina o ATP y luciferasa, por nombrar algunos. Para obtener más detalles con respecto la detección óptica de flujos moleculares a través de una abertura o constricción, véase Ivankin et al., "Label-Free Optical Detection of Biomolecular Translocation through Nanopore Arrays", ACSNano 8 (10): 10774-10781 (2014), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia.

De manera ilustrativa, la magnitud de la corriente o el flujo a través de la abertura 203 o la señal óptica puede cambiar de manera medible en respuesta al movimiento de la región indicadora 214 dentro de la abertura 203 y el periodo de tiempo para dicho cambio medible en la corriente o el flujo o la señal óptica se basa en la duración del cambio de posición de la región indicadora. En un ejemplo ilustrativo, no limitante, el cuerpo alargado 213 incluye un polinucleótido que incluye uno o más nucleótidos abásicos que definen la región indicadora 214.

En una realización ilustrativa, el nanoporo 200 es un nanoporo biológico al que se une la fijación 211 usando un enlace tioéter. Los ejemplos no limitantes de nanoporos biológicos incluyen MspA y alfa hemolisina. La región indicadora 214 de la fijación 211 puede incluir uno o más restos abásicos configurados para colocarse dentro o adyacente a una o más constricciones 204 del nanoporo biológico. El movimiento de uno o más restos abásicos correctamente colocados a través de una constricción de cualquiera de los poros puede dar lugar a una señal fácilmente detectable, p. ej., un cambio detectable en la corriente o el flujo a través de la constricción o las constricciones 204 o una señal óptica. Los nanoporos biológicos tales como MspA y alfa hemolisina pueden incluir de manera útil constricciones que pueden actuar para enfocar el efecto de la región indicadora 214. Por ejemplo, MspA incluye una sola constricción con un diámetro de aproximadamente 1,2 nm y una longitud de aproximadamente 0,5 nm, puede proporcionar una resolución espacial adecuada porque la magnitud de la corriente iónica o el bloqueo de flujo a través de la constricción se basan principalmente en el segmento de cuerpo alargado enhebrado a través de la región estrecha (constricción) del nanoporo.

La fig. 2B es un gráfico de una señal ilustrativa (p. ej., señal óptica o eléctrica) que el sistema 220 ilustrado en la fig.

2A puede generar a medida que la región indicadora 214 se mueve de forma traslacional, rotacional o conformacional con el tiempo, p. ej., se mueve en respuesta a uno o más acontecimientos u otro estímulo. El valor (p. ej., la magnitud) de la señal en el momento to puede corresponder a una primera posición de traslación, rotación o conformacional de la región indicadora 214 dentro de la abertura 203. En el momento ti, el valor (p. ej., la magnitud) de la señal puede cambiar a un segundo valor, correspondiente a la región indicadora 214 que se mueve de forma traslacional, rotacional o conformacional a una segunda posición dentro de la abertura 203. La duración de tiempo entre to y ti corresponde a una cantidad de tiempo que la región indicadora 214 pasó en la primera posición. En el momento t2, el valor (p. ej., la magnitud) de la señal puede cambiar a un tercer valor, correspondiente a la región indicadora 214 que se mueve de forma traslacional, rotacional o conformacional a una tercera posición. El tiempo de duración entre ti y t2 corresponde a una cantidad de tiempo que la región indicadora 214 pasó en la segunda posición antes de moverse a la tercera posición. En el momento t3, el valor (p. ej., la magnitud) de la señal puede cambiar al primer valor, correspondiente a la región indicadora 214 que vuelve de forma traslacional, rotacional o conformacional a la primera posición. El tiempo de duración entre t2 y t3 corresponde a una cantidad de tiempo que la región indicadora 214 pasó en la tercera posición antes de volver a la primera posición. Debe apreciarse que se pretende que los valores y periodos de tiempo particulares de las señales ilustradas en la fig. 2B sean puramente ilustrativos y no limitantes de ninguna manera.

En una realización ilustrativa, la región indicadora 214 incluye una carga electrostática y la señal generada por el sistema 220 incluye la corriente o el flujo a través de la constricción 204 o la señal óptica. Sin embargo, debe entenderse que el circuito 230 de medición puede incluir, o estar en comunicación con, cualquier elemento o combinación de elementos que facilite la medición de cualquier región indicadora adecuada y no es necesario que se base de forma obligatoria en la medición de corriente o flujo a través de la constricción 204 o una señal óptica, o incluso se base en el movimiento de la región indicadora. Adicionalmente, no es necesario que la región indicadora 214 esté unida de forma obligatoria a la fijación y, en cambio, puede estar unida a un nucleótido u otra molécula sobre la que se actúa. Las propiedades particulares de la región indicadora pueden seleccionarse basándose en la configuración particular del circuito 230 de medición para facilitar la medición de esa región indicadora. Por ejemplo, la región indicadora puede tener una propiedad óptica y el circuito 230 de medición puede incluir, o estar en comunicación con, un sensor óptico configurado para medir la propiedad óptica y generar una señal basada en la presencia o el movimiento de la región indicadora. En una realización ilustrativa, la región indicadora puede incluir un primer compañero de par FRET, p. ej., un donante o aceptor de FRET, que interactúa con un segundo compañero de par FRE^t correspondiente, p. ej., un aceptor o donante de FRET, para emitir luz de una longitud de onda particular que el circuito 230 de medición está configurado para detectar. O, por ejemplo, la región indicadora puede tener una propiedad química o biológica y el circuito 230 de medición puede incluir, o estar en comunicación con, un sensor químico o biológico configurado para medir la propiedad química o biológica y que genera una señal basada en la presencia o el movimiento de la región indicadora. Como ejemplo adicional, la región indicadora puede proporcionar un bloqueo de flujo molecular que modula el flujo de moléculas a través de la abertura o constricción, flujo que se puede detectar óptica, eléctrica, química o biológicamente.

En una realización ilustrativa, la región indicadora 214 puede ser móvil de forma traslacional hacia el primer lado 201 del nanoporo 200 en respuesta a un primer acontecimiento. El primer acontecimiento puede ser identificable individualmente en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de una señal (p. ej., una señal óptica o eléctrica) generada por el sistema 220. Por ejemplo, el primer acontecimiento puede provocar que la región indicadora 214 se mueva de forma traslacional a una primera ubicación y la presencia de la región indicadora 214 en la primera ubicación provoca que la señal tenga una primera magnitud. Como tal, la señal que tiene la primera magnitud se correlaciona con la aparición del primer acontecimiento. O, por ejemplo, el primer acontecimiento puede provocar que la región indicadora se mueva de forma traslacional a la primera ubicación durante un primer periodo de tiempo y la presencia de la región indicadora 214 en la primera ubicación provoca que la señal tenga una primera duración temporal. Como tal, la señal que tiene la primera duración temporal se correlaciona con la aparición del primer acontecimiento. En un ejemplo específico, la señal tiene tanto una primera magnitud como una primera duración temporal, cada una de las cuales se basa en la presencia de la región indicadora 214 en la primera ubicación, aumentando de este modo la confianza basada en la señal en una determinación de que se ha producido un cambio de conformación. La región indicadora 214 puede permanecer en la primera ubicación después del primer acontecimiento. Como alternativa, la región indicadora 214 puede ser móvil hacia el segundo lado 202 del nanoporo 200 después del primer acontecimiento. Por ejemplo, la región indicadora 214 puede volver a una ubicación anterior o a una ubicación diferente, después del primer acontecimiento.

Adicionalmente, en algunas realizaciones, la región indicadora 214 también puede ser móvil hacia el primer lado 201 del nanoporo 200 en respuesta a un segundo acontecimiento que se produce después del primer acontecimiento. El segundo acontecimiento puede ser identificable individualmente en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de una señal (p. ej., una señal óptica o eléctrica) generada por el sistema 220. Por ejemplo, el segundo acontecimiento puede provocar que la región indicadora 214 se mueva a una segunda ubicación y la presencia de la región indicadora 214 en la segunda ubicación provoca que la señal tenga una segunda magnitud. Como tal, la señal que tiene la segunda magnitud se correlaciona con la aparición del segundo acontecimiento. O, por ejemplo, el primer acontecimiento puede provocar que la región indicadora se mueva a la segunda ubicación durante un segundo periodo de tiempo y la presencia de la región indicadora 214 en la segunda ubicación provoca que la señal tenga una segunda duración temporal. Como tal, la señal que tiene la segunda duración temporal se correlaciona con la aparición del segundo acontecimiento. En un ejemplo específico, la señal tiene tanto una segunda magnitud como una segunda duración temporal, cada una de las cuales se basa en la presencia de la región indicadora 214 en la segunda ubicación, aumentando de este modo la confianza en una determinación basada en la señal de que se ha producido un cambio de conformación. La región indicadora 214 puede permanecer en la segunda ubicación después del segundo acontecimiento. Como alternativa, la región indicadora 214 puede ser móvil hacia el segundo lado 202 del nanoporo 200 después del segundo acontecimiento. Por ejemplo, la región indicadora 214 puede volver a una ubicación original o a una ubicación diferente, después del segundo acontecimiento. El primer y segundo acontecimientos pueden ser identificables individualmente y distinguibles entre sí en función de las respectivas magnitudes medidas, o duraciones temporales, o ambas, de las señales (p. ej., señales ópticas o eléctricas) generadas por el sistema 220.

En un ejemplo no limitativo, se puede medir el movimiento conformacional. Por ejemplo, es bien sabido que la distancia entre las bases en el ADN monocatenario (ADNmc) extendido puede ser mayor que en el ADN bicatenario (ADNbc). Por ejemplo, una fijación de ADNmc que está anclada adyacente al primer lado de un nanoporo MspA biológico y se estira debido a un campo eléctrico aplicado puede tener distancias entre bases de aproximadamente 4,9 Angstroms por base. El ADN bicatenario (ADNbc), por otro lado, tiene una separación de aproximadamente 3,32 Angstroms por base. La fijación 211 puede incluir una secuencia de a Dn arbitraria y se puede anclar permanentemente al nanoporo 200 MspA de manera que bajo la fuerza aplicada creada por el campo eléctrico, la región indicadora 214 que incluye uno o más restos abásicos está dispuesta en la constricción principal de MspA. El o los restos indicadores 214 abásicos pueden estar flanqueados por restos de desoxitimidina que tienen una corriente o flujo de bloqueo muy diferente en el poro MspA al o los sitios abásicos. Puede inducirse un cambio conformacional en el cuerpo alargado 213 de la fijación 211 mediante la hibridación de un oligonucleótido complementario con la fijación. El cambio conformacional resulta de la conversión de ADNmc a ADNbc debido a las diferencias de separación entre bases entre ADNmc y ADNbc. El cambio conformacional se produce dentro del cuerpo alargado 213 que da lugar al movimiento del indicador 214 fuera de la constricción 204 hacia el primer lado y el movimiento de restos de desoxitimidina hacia la zona de constricción. Debido a las diferentes corrientes de bloqueo o flujos de estos restos, se produce un cambio en la señal de corriente o flujo, que se puede detectar fácilmente, p. ej., de forma eléctrica u óptica. Para obtener más detalles acerca de las interacciones entre MspA y ADNmc, véase Manrao et al., "Nucleotide Discrimination with DNA Immobilized in the MspA Nanopore", PLos ONE 6: e25723, 7 páginas, (2011), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia.

Obsérvese que no es necesario que la ubicación de la región indicadora 214 y la señal resultante generada por el sistema 220, responda de forma obligatoria únicamente a la aparición de un acontecimiento, sino que puede responder a cualquier estímulo adecuado. Por ejemplo, el circuito 230 de medición se puede configurar para aplicar una tensión entre el primer electrodo 231 y el segundo electrodo 232 para aplicar una tensión a través del nanoporo 200, lo que provoca que la región indicadora 214 se mueva de forma traslacional hacia una ubicación determinada, p. ej., hacia el segundo lado 202 del nanoporo 200. La aparición del acontecimiento antes o durante dicho movimiento puede definir una ubicación en la que se detiene la región indicadora 214 (incluso si es de forma transitoria), que puede definir la señal (p. ej., una señal óptica o eléctrica) que genera el sistema 220. Adicionalmente, obsérvese que, en realizaciones tales como las descritas anteriormente con referencia a la fig. 1M, en las que la región de cabeza 211 de la fijación 210 está unida a un primer miembro y la región de cola 212 de la fijación 210 está unida a un segundo miembro, no siendo necesario que ninguno de los miembros esté unido al primer o segundo lado del nanoporo, la aplicación de una tensión entre el primer electrodo 231 y el segundo electrodo 232 puede provocar un movimiento neto correspondiente de la fijación 210 y el primer y segundo miembros hacia el primer electrodo 231 o hacia el segundo electrodo 232. Opcionalmente, uno o ambos del primer y segundo miembros son lo suficientemente grandes para no poder pasar completamente a través de la abertura 203 del nanoporo 200. Por ejemplo, basándose en la aplicación de una primera tensión adecuada entre el primer electrodo 231 y el segundo electrodo 232, la fijación 210 y el primer y segundo miembros unidos a la misma pueden moverse hacia el primer electrodo 231, movimiento que puede provocar que el primer miembro (unido a la región de cabeza 211 de una manera análoga a la ilustrada en la fig. 1M) se aloje temporalmente en una primera ubicación con respecto a la abertura 203, p. ej., dispuesto adyacente a la abertura 203 en el primer lado 201 o dispuesto total o parcialmente dentro de la abertura 203 en el primer lado 201 sin pasar completamente a través de la abertura 203, inhibiendo de este modo el movimiento adicional de la fijación 210 y el primer y segundo miembros hacia el primer electrodo 231. O, por ejemplo, basándose en la aplicación de una segunda tensión adecuada entre el primer electrodo 231 y el segundo electrodo 232, la fijación 210 y el primer y segundo miembros unidos a la misma pueden moverse hacia el segundo electrodo 232, movimiento que puede provocar que el segundo miembro (unido a la región de cola 212 de una manera análoga a la ilustrada en la fig. 1M) se aloje temporalmente en una segunda ubicación con respecto a la abertura 203, p. ej., dispuesto adyacente a la abertura 203 en el segundo lado 202 o dispuesto total o parcialmente dentro de la abertura 203 sin pasar completamente a través de la abertura 203, inhibiendo de este modo el movimiento adicional de la fijación 210 y el primer y segundo miembros hacia el segundo electrodo 232. Como tal, incluso si se aplican tensiones alternas a través del primer electrodo 231 y el segundo electrodo 232, la fijación 210 y el primer y segundo miembros se pueden retener con relación al nanoporo 200. En realizaciones que incluyen la constricción 204 opcional, basándose en la anchura relativa de la región indicadora 214, la longitud del cuerpo alargado 213 y el diámetro de la constricción 204 (p. ej., la dimensión D2 ilustrada en la fig. 1A), la región indicadora 214 puede, en algunas realizaciones, ser móvil adyacente a, en o incluso a través de la constricción 204, p. ej., en respuesta a un acontecimiento u otro estímulo. Por ejemplo, la región indicadora 214 puede disponerse dentro de la constricción 204, y luego sacarse de la constricción 204 hacia el primer lado 201 en respuesta al acontecimiento u otro estímulo. O, por ejemplo, la región indicadora 214 puede disponerse en el segundo lado 202 del nanoporo 200, y luego tirarse a través de la constricción 204 y sobre el primer lado 201 del nanoporo 200 en respuesta al acontecimiento u otro estímulo.

Adicionalmente, obsérvese que el sistema 220 se puede configurar de manera adecuada para generar señales (p. ej., señales ópticas o eléctricas) en función de regiones indicadoras que están dispuestas en miembros distintos a la fijación 210 permanente. Por ejemplo, la fijación 210 puede interactuar con otra molécula a la que se une una región indicadora. Dicha interacción puede provocar que la región indicadora de la otra molécula se mueva a una ubicación y la presencia de la región indicadora en esa ubicación puede provocar que la señal generada por el sistema 220 tenga una magnitud o duración temporal, o tanto magnitud como duración temporal, que se correlaciona con la aparición de la interacción. Por ejemplo, una interacción entre la fijación 210 y otra molécula puede provocar que una región indicadora unida a esa molécula se coloque en una ubicación en la que la región indicadora es detectable por el circuito 230.

Además, debe apreciarse que se puede proporcionar una matriz de nanoporos para detectar una pluralidad de acontecimientos que se producen en paralelo entre sí. Por ejemplo, la fig. 2C ilustra esquemáticamente una vista en planta de un sistema 260 que incluye circuitos 240 de medición configurados para medir el movimiento de las respectivas regiones indicadoras dentro de las respectivas aberturas de una matriz de nanoporos. Una pluralidad de sistemas 250, que se puede configurar de forma análoga al sistema 220 descrito anteriormente con referencia a las figs. 2A-2B, pueden disponerse integralmente en un sustrato común entre sí o pueden prepararse por separado y disponerse adyacentes entre sí. Cada sistema 250 puede incluir el nanoporo 200, una fijación (fijación no ilustrada específicamente) y un electrodo 241 direccionable. El circuito 240 de medición se puede configurar de forma análoga al circuito 230 de medición, puede estar en comunicación eléctrica con cada electrodo 241 direccionable de cada sistema a través de una ruta de comunicación adecuada, p. ej., conductor (comunicación ilustrada para un solo sistema 250) y con un electrodo 242 común. El circuito 240 de medición puede configurarse para aplicar de forma seleccionable una tensión a través de cada nanoporo 200 aplicando una tensión a través del electrodo 241 direccionable de ese nanoporo y a través del electrodo 242 común y para medir de manera seleccionable una corriente o flujo a través de ese nanoporo o una señal óptica en la tensión aplicada. Se puede detectar un acontecimiento en función de dicha corriente, flujo o señal óptica, p. ej., tal como se describe en otra parte en el presente documento. Pueden concebirse fácilmente matrices análogas para otros tipos de sistemas de detección, p. ej., sistemas de detección lumínica, química o biológica.

Métodos ilustrativos y composiciones ilustrativas para su uso durante dichos métodos

Se describirán a continuación algunos métodos ilustrativos para detectar acontecimientos y composiciones ilustrativas que pueden utilizarse durante dichos métodos. En un aspecto de la divulgación, un método incluye proporcionar un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través de los primer y segundo lados; y proporcionar una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas. La región de cabeza puede estar anclada a o adyacente al primer o segundo lado del nanoporo y el cuerpo alargado puede incluir una región indicadora. El método puede incluir mover el indicador dentro de la abertura en respuesta a un primer acontecimiento que se produce adyacente al primer lado del nanoporo. En algunas realizaciones, la región indicadora se mueve de forma traslacional dentro de la abertura en respuesta al primer acontecimiento. De manera adicional, o como alternativa, la región indicadora se puede mover de forma rotacional dentro de la abertura en respuesta al primer acontecimiento. De manera adicional, o como alternativa, la región indicadora se mueve de forma conformacional dentro de la abertura en respuesta al primer acontecimiento.

Por ejemplo, la fig. 3A ilustra un método 300 ilustrativo para detectar un acontecimiento utilizando una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo. El método 300 incluye proporcionar un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados (etapa 301). El nanoporo puede tener cualquier configuración adecuada, p. ej., tal como se ha descrito anteriormente con referencia a las figs. 1A-1M. Por ejemplo, el nanoporo 100 ilustrado en la fig. 1A incluye el primer lado 101, el segundo lado 102 y la abertura 103 que se extiende a través del primer y segundo lados. O, por ejemplo, el nanoporo 100' ilustrado en la fig. 1J incluye el primer lado 101', el segundo lado 102', una abertura definida por la abertura 103' y la constricción 104'. O, por ejemplo, el nanoporo 100'' ilustrado en la fig. 1K incluye el primer lado 101'', el segundo lado 102'' y la abertura 103'' que se extiende a través del primer y segundo lados, p. ej., definidos por el poro biológico 108". O, por ejemplo, el nanoporo 100''' ilustrado en la fig. 1L incluye el primer lado 101''', el segundo lado 102''' y la abertura 103''' que se extiende a través del primer y segundo lados, p. ej., definidos a través de la capa 107"'.

La etapa 301 también puede, aunque no necesariamente, incluir la preparación del nanoporo. Por ejemplo, la etapa 301 puede incluir la definición de una barrera y disponer un nanoporo sobre o en la barrera. Se conocen en la técnica métodos para preparar nanoporos. Por ejemplo, se pueden encontrar métodos ilustrativos para preparar un nanoporo MspA en Butler et al., "Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein nanopore", Proc. Natl. Acad. Sci. 105: 20647-20652 (2008), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia. O, por ejemplo, se pueden encontrar métodos ilustrativos para preparar un nanoporo de hemolisina alfa en Howorka et al., "Sequence-specific detection of individual DNA strands using engineered nanopores", Nature Biotechnology 19: 636-639 (2001) y en Clarke et al., "Continuous base identification for single-molecule nanopore DNA sequencing", Nature Nanotechnology 4: 265-270 (2009), cuyo contenido completo de ambos se incorpora en el presente documento por referencia.

El método 300 ilustrado en la fig. 3A también incluye proporcionar una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado entre ellas, incluyendo el cuerpo alargado una región indicadora, estando la región de cabeza anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo (etapa 302). La fijación puede tener cualquier configuración adecuada, tal como se ha descrito anteriormente con referencia a las figs. 1A-1M. Por ejemplo, el cuerpo alargado puede tener una longitud más corta que una primera dimensión H1 que define un grosor del nanoporo, p. ej., tal como se ilustra en las figs. 1A, 1B y 1J. O, por ejemplo, el cuerpo alargado puede tener una longitud más larga que una primera dimensión H1 que define un grosor del nanoporo, p. ej., tal como se ilustra en las figs. 1G y 1K. O, por ejemplo, en realizaciones que incluyen una constricción, el cuerpo alargado puede tener una longitud más corta que una segunda dimensión H2 que define una profundidad de la constricción, p. ej., tal como se ilustra en la fig. 1A. O, por ejemplo, en realizaciones que incluyen una constricción, el cuerpo alargado puede tener una longitud más larga que una segunda dimensión H2 que define una profundidad de la constricción, p. ej., tal como se ilustra en las figs. 1B, 1G, 1J y 1K. O, por ejemplo, la región indicadora puede disponerse en una ubicación a lo largo del cuerpo alargado que se selecciona de manera que, en función de que el cuerpo alargado se extienda total o parcialmente cuando la región de cabeza está anclada a o adyacente al nanoporo, la región indicadora se puede colocar dentro de la abertura del nanoporo, p. ej., adyacente a o dentro de una constricción opcional, tal como se ilustra en las figs. 1C, 1J y 1K. Puede usarse cualquier combinación adecuada de dichas características.

La etapa 302 también puede, aunque no necesariamente, incluir la preparación de la fijación. Por ejemplo, la etapa 302 puede incluir la definición de un cuerpo alargado que incluye partes del mismo que definen una región de cabeza, región de cola y una o más regiones indicadoras. Por ejemplo, como se describe en otra parte en el presente documento, una fijación puede incluir ADN. Puede prepararse un oligonucleótido de ADN de longitud suficiente usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden obtener comercialmente oligonucleótidos con una amina primaria 5' o 3' de proveedores tales como Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, Iowa). El oligonucleótido se puede ordenar para incluir uno o más restos abásicos, que puede utilizarse como una o más regiones indicadoras como se describe en el presente documento. Un conector bifuncional, tal como sulfo-SMCC (sulfosuccinimidil-4-(W-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato) que incluye un grupo reactivo de amina (NHS) y un grupo de reacción de tiol (maleimida) se puede obtener fácilmente de fuentes comerciales, p. ej., de Thermo Fisher Scientific, Inc. (Rockford, Illinois). Dicho conector puede hacerse reaccionar con el oligonucleótido en condiciones de reacción adecuadas bien conocidas en la técnica para formar un enlace amida estable. Después de la purificación del oligonucleótido a partir del sulfo-SMCC sin reaccionar, el oligonucleótido modificado (que ahora es reactivo de tiol en virtud de su grupo maleimida) puede reaccionar con el nanoporo, p. ej., nanoporo proteico. El nanoporo proteico se puede preparar de antemano para incluir al menos un resto de cisteína accesible al disolvente que tiene su grupo tiol (SH) en forma reducida. La forma reducida se puede obtener mediante incubación con tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 5 mM, por ejemplo, que es un compuesto comercial fácilmente disponible. El oligonucleótido modificado se puede combinar, p. ej., en exceso molar, con el nanoporo proteico reducido y en condiciones de reacción bien conocidas en la técnica, de modo que la maleimida forme un enlace tioéter estable. El conjugado proteína-oligonucleótido puede retirarse por purificación del exceso de oligonucleótido sin reaccionar. En otro ejemplo, los compuestos adecuados para su inclusión en una fijación a base de polietilenglicol (PEG), p. ej., maleimida-PEG, están fácilmente disponibles de fuentes comerciales, tales como Laysan Bio, Inc. (Arab, Alabama). Por ejemplo, la maleimida se puede conjugar con un tiol de cisteína reducido de una manera análoga a la descrita anteriormente. Se puede definir una región indicadora adecuada dentro del PEG. En otro ejemplo, se puede preparar un enlace disulfuro entre un oligonucleótido y un nanoporo de alfa hemolisina de una manera tal como se describe en Howorka et al., "Kinetics of duplex formation for individual DNA strands within a single protein nanopore", PNAS 98: 12996-13301 (2001), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia.

De manera adicional, o como alternativa, la etapa 302 puede incluir opcionalmente en anclaje de la región de cabeza de la fijación a o adyacente al primer lado o al segundo lado del nanoporo. Por ejemplo, la región de cabeza de la fijación puede unirse a o adyacente al primer lado o al segundo lado del nanoporo usando un enlace químico, p. ej., un enlace covalente, enlace de hidrógeno, enlace iónico, enlace dipolo-dipolo, fuerzas de dispersión de London o cualquier combinación adecuada de los mismos. O, por ejemplo, la región de cabeza de la fijación se puede unir al primer lado o al segundo lado del nanoporo utilizando una interacción entre una primera estructura proteica en la región de cabeza y una segunda estructura proteica que está unida a, o adyacente, al primer o segundo lado del nanoporo. Por ejemplo, la primera y la segunda estructuras pueden incluir hélices alfa que se entrelazan entre sí. La unión de la región de cabeza de la fijación a o adyacente al primer o segundo lado del nanoporo puede ser permanente, de modo que el grupo de cabeza de la fijación se mantenga en una posición generalmente fija con respecto al primer o segundo lado del nanoporo. Por ejemplo, la región de cabeza se puede anclar al primer lado del nanoporo, p. ej., como se ilustra en las figs. 1A, 1J y 1K. O, por ejemplo, la región de cabeza se puede anclar al segundo lado del nanoporo, p. ej., como se ilustra en la fig. 1D. O, por ejemplo, la región de cabeza se puede anclar adyacente al primer lado del nanoporo, p. ej., anclada a un miembro que está dispuesto adyacente, y opcionalmente está unido, al primer lado del nanoporo tal como se ilustra en las figs. IE, IF y 1M. Obsérvese que incluso si dicho miembro se mueve de forma traslacional o conformacional adyacente al nanoporo, la fijación anclada al mismo todavía puede considerarse anclada adyacente al nanoporo. De manera análoga, la región de cabeza se puede anclar adyacente al segundo lado del nanoporo o a otro miembro que está dispuesto adyacente, y opcionalmente está unido, al segundo lado del nanoporo (no ilustrado específicamente).

En una realización ilustrativa, el grupo tiol reducido (-SH) (también llamado grupo sulfhidrilo) de un resto de cisteína se puede hacer reaccionar con una fijación que tiene un grupo reactivo con tiol. Los ejemplos de dichos grupos incluyen maleimida y yodoacetamida. Como se describe con mayor detalle en www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/thiol-reactive-probes/introductionto-thiol-modification-and-detection.html#head2, los reactivos primarios reactivos con tiol, incluyendo yodoacetamidas, maleimidas, haluros bencílicos y bromometilcetonas pueden reaccionar mediante S-alquilación de tioles para generar productos de tioéter estables; los reactivos de arilación tales como haluros de 7-nitrobenz-2,1,3-oxadiazol (NBD) pueden reaccionar con tioles o aminas mediante una sustitución similar del haluro aromático por el nucleófilo; y, debido a que el anión tiolato es un mejor nucleófilo que el tiol neutro, la cisteína es más reactiva por encima de su pKa. Adicionalmente, como se describe con mayor detalle en www.piercenet.com/method/sulfhydryl-reactivecrosslinker-chemistry, los grupos químicos reactivos con sulfhidrilo incluyen haloacetilo, maleimidas, aziridinas, acriloílos, agentes arilantes, vinilsulfonas, disulfuros de piridilo, TNB-tioles (ácido 2-nitro-5-tiobenzoico) y agentes reductores de disulfuro; dichos grupos pueden conjugarse con sulfhidrilos mediante alquilación (p. ej., mediante la formación de un enlace tioéter) o intercambio de disulfuro (p. ej., formación de un enlace disulfuro). También pueden usarse adecuadamente reacciones de intercambio de sulfhidrilo. Como alternativa, las dianas pueden ser aminas (-NH2). Por ejemplo, la amina primaria del resto de lisina y el extremo N del polipéptido son relativamente reactivos. Los restos de amina pueden ser dianas de ésteres de N-hidroxisuccinimida (ésteres de NHS), que pueden formar un enlace amida estable, o agentes de reticulación de imidoéster, que pueden reaccionar con aminas primarias para formar enlaces amidina. Existen muchos otros compuestos reactivos con amina. Por ejemplo, como se describe en www.piercenet.com/method/amine-reactive-crosslinker-chemistry, los grupos químicos sintéticos que pueden formar enlaces químicos con aminas primarias incluyen isotiocianatos, isocianatos, azidas de acilo, ésteres de NHS, cloruros de sulfonilo, aldehídos, glioxales, epóxidos, oxiranos, carbonatos, haluros de arilo, imidoésteres, carbodiimidas, anhídridos y ésteres de fluorofenilo; dichos grupos pueden conjugarse con aminas, por ejemplo, mediante acilación o alquilación. En otras realizaciones más, se puede usar un resto de aminoácido modificado para introducir una nueva funcionalidad como una azida o alquino para usar con química clic. Por ejemplo, se pueden utilizar reactividades de tiol o amina tales como las descritas anteriormente con conectores que permiten la adición de funcionalidades de azida o alquino para utilizar adicionalmente en una reacción de química clic.

En la realización ilustrada en la fig. 3A, el método 300 incluye mover la región indicadora dentro de la abertura del nanoporo en respuesta a un acontecimiento que se produce adyacente al primer lado del nanoporo (etapa 303). Dicho movimiento puede ser de traslación, rotación o conformacional o cualquier combinación adecuada de los mismos. Por ejemplo, el acontecimiento puede provocar un movimiento de traslación de la región de cabeza hacia el primer lado del nanoporo y el movimiento de traslación de la región de cabeza puede provocar el movimiento del cuerpo alargado, o una parte del mismo, y la región indicadora hacia el primer lado del nanoporo. O, por ejemplo, el acontecimiento puede provocar un movimiento de traslación de una porción del cuerpo alargado hacia el primer lado del nanoporo y el movimiento de traslación de la porción del cuerpo alargado puede provocar un movimiento de traslación de la región indicadora hacia el primer lado del nanoporo. En una realización ilustrativa, la región indicadora está inicialmente dispuesta en, o adyacente a, una constricción del nanoporo, el acontecimiento provoca que la región indicadora se aleje de la constricción hacia el primer lado, a una primera ubicación.

Opcionalmente, el método 300 también incluye mover la región indicadora hacia el segundo lado del nanoporo después del acontecimiento (no ilustrado específicamente). Por ejemplo, después del acontecimiento, la región de cabeza puede moverse de forma traslacional hacia el segundo lado del nanoporo y el movimiento de la región de cabeza puede provocar el movimiento de traslación del cuerpo alargado, o una parte del mismo, y la región indicadora hacia el segundo lado del nanoporo. O, por ejemplo, después del acontecimiento, una porción del cuerpo alargado puede moverse de forma traslacional hacia el segundo lado del nanoporo y el movimiento de la parte del cuerpo alargado puede provocar un movimiento de traslación de la región indicadora hacia el segundo lado del nanoporo. O, por ejemplo, un estímulo, tal como una tensión aplicada, puede provocar el movimiento de traslación de la región indicadora hacia el segundo lado del nanoporo. En una realización ilustrativa, después del acontecimiento, la región indicadora se mueve de forma traslacional desde una primera ubicación a la que se había movido en respuesta al primer acontecimiento, hacia el segundo lado y hacia la constricción, y opcionalmente se mueve de forma traslacional adyacente a o dentro de la constricción. Como se ha señalado anteriormente, la región indicadora puede ser móvil repetidamente, p. ej., de forma traslacional, rotacional o conformacional, dentro de la abertura en respuesta a diferentes acontecimientos, facilitando de este modo la detección de cada uno de dichos acontecimientos.

Debe apreciarse que se puede realizar la etapa 302, o se puede preparar cualquier otra composición proporcionada en este documento, utilizando cualquier combinación adecuada de etapas. Por ejemplo, la fig. 3B ilustra un método para preparar una composición que incluye una fijación y una polimerasa adyacente a un nanoporo, según algunas realizaciones de la presente divulgación. El método 310 incluye unir una región de cabeza de una fijación a uno de un primer lado o un segundo lado de un nanoporo o a un primer miembro (311). Por ejemplo, el método 310 puede incluir unir la región de cabeza de la fijación directamente al primer lado o al segundo lado de un nanoporo, de una manera análoga a la descrita anteriormente con referencia a las figs. 1A-1C, 1D o 1G-1L utilizando cualquier unión adecuada proporcionada en el presente documento o conocida de otro modo en la técnica. O, por ejemplo, el método 310 puede incluir unir la región de cabeza de la fijación directamente a un primer miembro de una manera análoga a la ilustrada en las figs. IE, IF o 1M utilizando cualquier unión adecuada proporcionada en el presente documento o conocida de otro modo en la técnica.

En realizaciones en las que la región de cabeza de la fijación está unida a un primer miembro, el método 310 ilustrado en la fig. 3B opcionalmente puede incluir unir el primer miembro a uno del primer lado o el segundo lado del nanoporo (312). Por ejemplo, un primer miembro que tiene una región de cabeza de una fijación unida al mismo, tal como se ha descrito anteriormente con referencia a las figs. IE, IF o 1M, se puede unir al primer lado o al segundo lado del nanoporo. Como alternativa, un primer miembro que tiene una región de cabeza de una fijación unida al mismo, tal como se ha descrito anteriormente con referencia a las figs. IE, IF o 1M, puede disponerse adyacente al primer lado o al segundo lado del nanoporo sin unir el primer miembro al mismo.

El método 310 ilustrado en la fig. 3B puede incluir además disponer el cuerpo alargado de una fijación dentro de una abertura del nanoporo (313). En función de la longitud del cuerpo alargado, el cuerpo alargado puede, aunque no necesariamente, Extenderse hasta el final a través de la abertura del nanoporo. Por ejemplo, en realizaciones tales como las descritas anteriormente con referencia a las figs. 1A e IE, el cuerpo alargado de la fijación opcionalmente puede ser lo suficientemente corto para que la región de cola de la fijación permanezca en el mismo lado de una constricción (si está presente) del nanoporo que la región de cabeza de la fijación. O, por ejemplo, en realizaciones tales como las descritas anteriormente con referencia a las figs. 1B-1D, IF, 1J o 1L, el cuerpo alargado de la fijación puede ser opcionalmente lo suficientemente largo para que la región de cola de la fijación permanezca dispuesta dentro de la abertura del nanoporo y, opcionalmente, puede ser lo suficientemente largo para que la región de cola de la fijación esté dispuesta en el lado opuesto de una constricción (si está presente) del nanoporo que la región de cabeza de la fijación. O, por ejemplo, en realizaciones tales como las descritas anteriormente con referencia a las figs. 1G-1I, 1K o 1M, el cuerpo alargado de la fijación puede ser opcionalmente lo suficientemente largo para que la región de cola de la fijación pueda disponerse más allá del lado opuesto del nanoporo que la región de cabeza de la fijación.

De manera ilustrativa, el cuerpo alargado de la fijación puede disponerse dentro de la abertura del nanoporo aplicando una fuerza direccional adecuada al cuerpo alargado de la fijación. Por ejemplo, se puede aplicar una tensión a través del nanoporo de una manera tal como se describe en el presente documento con referencia a las figs. 2A-2C y el cuerpo alargado de la fijación puede incluir al menos un resto con carga que, en función de la tensión, atrae la región de cola de la fijación hacia el lado del nanoporo opuesto al que está unida la región de cabeza de la fijación o en el que la región de cabeza de la fijación está unida a un primer miembro, y provoca la traslocación de la región de cola de modo que se disponga todo o una parte del cuerpo alargado de la fijación dentro de la abertura del nanoporo. Obsérvese que, en realizaciones en las que la región de cabeza de la fijación está unida a un primer miembro, dicha fuerza direccional también puede poner el primer miembro adyacente a, o dispuesto total o parcialmente dentro de, la abertura del nanoporo de una manera tal como se describe en el presente documento con referencia a la fig. 1M. Por ejemplo, la atracción de la región de cola hacia el lado del nanoporo opuesto a aquel en el que la región de cabeza de la fijación está unida a un primer miembro también puede provocar la traslocación del primer miembro a una posición adyacente a, o dispuesta total o parcialmente dentro de, la abertura del nanoporo.

El método 310 ilustrado en la fig. 3B puede incluir opcionalmente además unir la región de cola de la fijación al otro del primer lado o segundo lado del nanoporo o a un segundo miembro (314). Se puede utilizar adecuadamente cualquier unión adecuada, tal como se proporciona en el presente documento, o conocida de otro modo en la técnica. Por ejemplo, el método 310 puede incluir opcionalmente unir la región de cola de la fijación al lado del nanoporo opuesto al de la región de cabeza, tal como se ha descrito anteriormente con referencia a la fig. 1H. O, por ejemplo, el método 310 puede incluir opcionalmente unir la región de cola de la fijación a un segundo miembro dispuesto en el lado del nanoporo opuesto al de la región de cabeza, tal como se ha descrito anteriormente con referencia a las figs. 1I o 1M. Opcionalmente, el segundo miembro puede disponerse dentro de la abertura del nanoporo. Como alternativa, no es necesario realizar la etapa 314 y el método 310 puede incluir permitir que la región de cola de la fijación se extienda libremente dentro de la abertura del nanoporo, de una manera tal como la descrita anteriormente con referencia a las figs. 1A-1F, 1J o 1L, o más allá de la abertura del nanoporo, de una manera tal como la descrita anteriormente con referencia a las figs. 1G o 1K.

En algunas condiciones, la aplicación de una fuerza direccional al cuerpo alargado de una fijación puede provocar la traslocación de la región de cola de modo que se dispone toda la fijación dentro de la abertura del nanoporo. Una fuerza lo suficientemente grande puede provocar que una polimerasa (u otra proteína) que está unida a la fijación se aloje temporalmente en o sobre el nanoporo. Aunque no se pretende que sea una limitación con respecto a la configuración física, el resultado puede denominarse 'taponamiento' del nanoporo por la proteína. El taponamiento puede inhibirse o evitarse limitando la fuerza sobre la fijación (p. ej., aplicando menos de 180 mV a través del nanoporo), limitando la duración del tiempo en que se aplica fuerza sobre el sistema o utilizando una proteína lo suficientemente grande para evitar la interacción de taponamiento. Como alternativa o adicionalmente, se puede aplicar una tensión inversa al sistema para invertir la interacción entre la proteína y el nanoporo (denominado 'destaponamiento'). Otra opción para inhibir o evitar el taponamiento o facilitar el destaponamiento es eliminar los aminoácidos con carga de la abertura del nanoporo o las cargas complementarias en la superficie de la proteína, para reducir la afinidad de carga entre los dos componentes. Puede ser beneficioso además añadir enlaces cruzados a la estructura de la proteína (p. ej., pares de cisteína modificados genéticamente que forman enlaces cruzados de disulfuro o reticuladores químicos), para estabilizar la estructura globular de la proteína.

El taponamiento se puede observar basándose en una corriente o flujo o patrón óptico característico que es distinto de los patrones resultantes de otras configuraciones del sistema de nanoporos. El patrón distintivo se puede observar, por ejemplo, cuando se aplica un sesgo negativo al sistema de nanoporos. Por consiguiente, se pueden detectar patrones ópticos o de flujo o de corriente durante el ensamblaje o uso de un sistema que incluye una proteína que está localizada en un nanoporo mediante una fijación que se une a la proteína y se dispone en la luz del nanoporo. La detección de los patrones se puede usar para supervisar el ensamblaje (p. ej., para evitar el taponamiento), guiar el destaponamiento u optimizar el ensamblaje deseado.

Debe apreciarse que las presentes composiciones, sistemas y métodos adecuados se pueden utilizar para detectar muchos tipos de acontecimientos. Por ejemplo, las presentes composiciones, sistemas y métodos pueden usarse adecuadamente para detectar el movimiento de una molécula o una parte de esa molécula. En una realización ilustrativa, el movimiento incluye un cambio conformacional de la molécula. En otra realización ilustrativa, el movimiento incluye una interacción de una molécula con otra molécula, tala como la unión de una primera molécula a otra molécula, p. ej., la unión de una proteína a un nucleótido o la adición de un nucleótido a un polinucleótido. Se pueden prever otros acontecimientos.

Métodos y composiciones ilustrativos para detectar cambios conformacionales de moléculas

La fig. 4A ilustra un método 400 ilustrativo para detectar un cambio conformacional de una molécula utilizando una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo. Debe apreciarse que el método 400 se puede adaptar adecuadamente para detectar cambios conformacionales de muchos tipos de moléculas, tales como proteínas y ácidos nucleicos.

El método 400 ilustrado en la fig. 4A incluye proporcionar una composición que incluye un nanoporo, una fijación permanente y una molécula dispuesta adyacente al nanoporo (etapa 401). Una composición puede incluir un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través de los primer y segundo lados; y una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas. La región de cabeza puede estar anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo. El cuerpo alargado que incluye una región indicadora puede ser móvil dentro de la abertura en respuesta a un primer acontecimiento que se produzca adyacente al primer lado del nanoporo. Por ejemplo, las figs.

5A-5B ilustran esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de un cambio conformacional de una molécula dispuesta adyacente al nanoporo. En la realización ilustrativa ilustrada en la fig. 5A, la composición puede incluir el nanoporo 500, la fijación 510 permanente y la molécula 550. El nanoporo 500 incluye el primer lado 501, el segundo lado 502, la abertura 503 y, opcionalmente, también incluye la constricción 504. La fijación 510 permanente incluye la región de cabeza 511, la región de cola 512 y el cuerpo alargado 513 dispuesto entre ellas y que incluye la región indicadora 514 (opcionalmente, se pueden proporcionar una o más regiones indicadoras adicionales tal como se ha descrito anteriormente con referencia a la fig. 1C).

La molécula 550 puede disponerse adyacente al primer lado 501 del nanoporo 500. Por ejemplo, la molécula 550 puede estar en contacto con el primer lado 501 del nanoporo 500 y, opcionalmente, puede anclarse a o adyacente al primer lado del nanoporo 500 mediante cualquier enlace químico adecuado, interacción proteína-proteína o cualquier otra unión adecuada que normalmente sea irreversible. En una realización ilustrativa, la molécula 550 incluye una proteína. Un ejemplo de una proteína adecuada para su uso en el método 400 ilustrado en la fig. 4A es una enzima. Un ejemplo de una enzima adecuada para su uso en el método 400 ilustrado en la fig. 4A es una polimerasa. Se pueden utilizar adecuadamente otros tipos de moléculas, proteínas o enzimas. En la realización ilustrada en la fig.

5A, la región de cabeza 511 de la fijación 510 está unida a, p. ej., anclada a, la molécula 550, mediante cualquier enlace químico adecuado, interacción proteína-proteína o cualquier otra unión adecuada que sea permanente. La región de cabeza 511 se puede unir a cualquier parte adecuada de la molécula 550 que experimente un cambio conformacional que pueda provocar el movimiento de la región indicadora 514 con respecto a la constricción 504. Obsérvese que no es necesario que la molécula 550 se considere de forma obligatoria parte de la composición inventiva, sino que, en cambio, se puede considerar que está en contacto con una composición que incluye el nanoporo 500 y la fijación permanente 510. Adicionalmente, obsérvese que la molécula 550 puede estar, aunque no necesariamente, unida a o adyacente al nanoporo 500. Adicionalmente, obsérvese que la región de cola 512 opcionalmente puede unirse a una segunda molécula (no ilustrada específicamente) de una manera tal como se ha descrito anteriormente con referencia a las figs. 1I y 1M.

Haciendo referencia de nuevo a la fig. 4A, el método 400 incluye cambiar la conformación de la molécula (etapa 402). Por ejemplo, la fig. 5B ilustra esquemáticamente un cambio conformacional en la molécula 550 que provoca el movimiento de una o más regiones de la molécula 550 con respecto a una o más de otras regiones de la molécula 550. En una realización ilustrativa en la que la molécula 550 es una polimerasa, el cambio conformacional de la polimerasa puede ser en respuesta a la unión de la polimerasa a un nucleótido. Como alternativa, el cambio conformacional de la polimerasa puede ser en respuesta a la adición por la polimerasa de un nucleótido a un polinucleótido. En otras realizaciones alternativas más, el cambio conformacional de la polimerasa puede ser en respuesta a la unión de la polimerasa a un molde de ácido nucleico, liberación de un molde de ácido nucleico, liberación de un nucleótido sin incorporarlo o escisión de un nucleótido, o una combinación de los mismos.

Haciendo referencia de nuevo a la fig. 4A, el método 400 también incluye mover de forma traslacional la región de cabeza de la fijación en respuesta al cambio conformacional de la molécula (etapa 403). Por ejemplo, la fig. 5B ilustra esquemáticamente un cambio conformacional en la molécula 550 que mueve la región de cabeza 511. Dicho movimiento de región puede ser, aunque no necesariamente, lejos del nanoporo 500. Por ejemplo, en la realización ilustrada en la fig. 5B, la región de cabeza 511 se mueve tanto lateralmente con respecto a la abertura 503 como alejándose del primer lado 501 del nanoporo 500.

Haciendo referencia de nuevo a la fig. 4A, el método 400 también incluye mover de forma traslacional la región indicadora dentro de la abertura del nanoporo en respuesta al movimiento de la región de cabeza (etapa 404). Por ejemplo, la fig. 5B ilustra esquemáticamente un cambio conformacional en la molécula 550 que mueve de forma traslacional la región de cabeza 511 y el movimiento de la región de cabeza 511 mueve de forma traslacional la región indicadora 514 hacia el primer lado 501, como lo indica la flecha discontinua. Por ejemplo, la región indicadora 514 puede estar adyacente a o dispuesta dentro de la constricción opcional 504 antes del cambio conformacional, tal como se ilustra en la fig. 5A, y puede alejarse de la constricción opcional 504 hacia el primer lado 501 en respuesta al cambio conformacional. Como alternativa, un cambio conformacional en la molécula 550 puede, en cambio, mover la región de cabeza 511 de tal manera que la región indicadora 514 se mueva de forma traslacional hacia el segundo lado 502, o experimente cualquier otro movimiento de traslación, rotación o conformacional adecuada, o una combinación de los mismos, dentro de la abertura 503.

Haciendo referencia a la fig. 4A, el método 400 incluye además detectar el movimiento de la región indicadora (etapa 405). Por ejemplo, la composición puede estar en comunicación operativa con un circuito de medición tal como se ha descrito anteriormente con referencia a la fig. 2A o la fig. 2C. El circuito de medición se puede configurar para detectar el movimiento de la región indicadora dentro de la abertura. En una realización ilustrativa, el nanoporo 500, la fijación 510 y la molécula 550 se pueden sumergir en un líquido conductor, p. ej., una solución salina acuosa. Un circuito de medición configurado de manera análoga al circuito 230 de medición ilustrado en la fig. 2A o el circuito de medición 240 ilustrado en la fig. 2C puede estar en comunicación con el primer y segundo electrodos y puede configurarse para aplicar una tensión entre esos electrodos para imponer una tensión a través del nanoporo 500. El circuito de medición puede configurarse además para usar los electrodos para medir la magnitud de una corriente o flujo a través de la abertura 503 o puede incluir un sensor óptico para medir una señal óptica. La región indicadora 514 puede tener una propiedad de bloqueo de flujo o de corriente diferente, p. ej., una propiedad física, química, biológica, óptica o eléctrica diferente, a algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado 513. Por ejemplo, la región indicadora 514 puede incluir una carga electrostática, mientras que algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado 513 pueden incluir una carga electrostática diferente o pueden no tener carga (p. ej., pueden ser eléctricamente neutras). O, por ejemplo, La región indicadora puede no tener carga, mientras que algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado 513 pueden incluir una carga electrostática. La magnitud de la corriente o el flujo a través de la abertura 503 o la señal óptica puede cambiar de manera medible en respuesta a un cambio en la posición de la región indicadora 214 en relación con la constricción 204 y el periodo de tiempo para dicho cambio medible en la corriente o el flujo o la señal óptica se basa en la duración del cambio de posición de la región indicadora. En un ejemplo no limitante, ilustrativo, el cuerpo alargado 513 incluye un polinucleótido que incluye uno o más nucleótidos abásicos que definen la región indicadora 514.

El cambio en la conformación de la molécula 550 puede identificarse individualmente basándose en una magnitud medida (p. ej., medida óptica o eléctricamente) o duración temporal, o ambas, de una señal generada por dicho sistema. Por ejemplo, el cambio conformacional puede provocar que la región indicadora 514 se mueva a una primera ubicación y la presencia de la región indicadora 514 en la primera ubicación provoca que la señal (p. ej., una señal óptica o eléctrica) tenga una primera magnitud. Como tal, la señal que tiene la primera magnitud se correlaciona con la aparición del cambio de conformación. O, por ejemplo, el cambio de conformación puede provocar que la región indicadora 514 se mueva a la primera ubicación durante un primer periodo de tiempo y la presencia de la región indicadora 514 en la primera ubicación provoca que la señal tenga una primera duración temporal. Como tal, la señal que tiene la primera duración temporal se correlaciona con la aparición del cambio de conformación. En un ejemplo específico, la señal tiene tanto una primera magnitud como una primera duración temporal, cada una de las cuales se basa en la presencia de la región indicadora 514 en la primera ubicación, aumentando de este modo la confianza en una determinación basada en la señal de que se ha producido un cambio de conformación.

Como se ilustra en la fig. 4A, el método 400 puede incluir además volver a la conformación anterior de la molécula (etapa 406). El método 400 puede incluir además mover de forma traslacional la región de cabeza de la fijación en respuesta al retorno de la molécula a la conformación anterior (etapa 407). El método 400 puede incluir además mover de forma traslacional la región indicadora de la fijación dentro de la abertura del nanoporo en respuesta al movimiento de la región de cabeza (etapa 408). Por ejemplo, después del cambio conformacional ilustrado en la fig.

5B, la molécula 550 puede volver a la conformación anterior de la molécula, p. ej., tal como se ilustra en la fig. 5A. Dicho retorno puede mover la región de cabeza 511 de tal manera que la región indicadora 514 puede moverse de forma traslacional hacia el segundo lado 502, p. ej., a una ubicación adyacente a o dentro de la constricción 504. Como alternativa, en lugar de volver a la conformación anterior, la molécula, en cambio, puede cambiar a una conformación diferente que es diferente a la conformación anterior. El método 400 puede incluir además detectar el movimiento de la región indicadora (etapa 409). Dicha detección se puede realizar de forma análoga a la descrita anteriormente con referencia a la etapa 406.

Debe apreciarse que el método 400 ilustrado en la fig. 4A se puede adaptar adecuadamente para detectar acontecimientos distintos a los cambios conformacionales, p. ej., para detectar movimientos moleculares de traslación o combinaciones de diferentes tipos de movimientos moleculares. Adicionalmente, debería apreciarse que el método 400 ilustrado en la fig. 4A se puede adaptar adecuadamente para detectar dichos acontecimientos utilizando cualquier combinación adecuada de cambios traslacionales, rotacionales o conformacionales de la región indicadora de la fijación.

Secuenciación por síntesis utilizando métodos y composiciones ilustrativos basados en la detección de cambios conformacionales de una polimerasa

Debería apreciarse que el método 400 ilustrado en la fig. 4A se puede utilizar adecuadamente para detectar cualquiera de diversos cambios conformacionales. En una realización ilustrativa, no limitante, descrita a continuación con referencia a las figs. 6A-6D, el método 400 puede usarse para detectar el cambio conformacional de una polimerasa asociada con la polimerasa que actúa sobre un nucleótido. La detección de dichos cambios conformacionales puede usarse para secuenciar un primer polinucleótido sintetizando un segundo polinucleótido que es complementario del primer nucleótido, p. ej., utilizando "secuenciación por síntesis", o SBS.

Se han desarrollado métodos previamente conocidos para SBS. Por ejemplo, el ADN monocatenario (ADNmc) puede pasar a través de un nanoporo biológico, tal como un nanoporo proteico, que está incluido en una barrera tal como una bicapa lipídica, en respuesta a la aplicación de un potencial eléctrico a través del nanoporo. En lo que se puede denominar secuenciación de "hebras", a medida que los nucleótidos del ADNmc pasan a través de una constricción de poros, las combinaciones de esos nucleótidos pueden crear bloqueos de flujo o de corriente únicos correspondientes a las identidades de los nucleótidos en las combinaciones particulares que pasan a través de la constricción. Estas hebras que se están secuenciando no están unidas permanentemente al poro ni a la polimerasa. En su lugar, estas hebras se translocan a través del poro de manera que la posición neta de la hebra cambia con respecto al poro. Sin embargo, la velocidad de translocación extremadamente rápida del ADNmc (~1 nt/ps), así como la resolución nativa de la constricción que abarca una combinación de nucleótidos, en lugar de un solo nucleótido, puede dificultar la medición precisa de dichos bloqueos de corriente o flujo nucleótido a nucleótido. Se han utilizado "motores" enzimáticos para reducir la velocidad de translocación a una tasa que sea más compatible con la adquisición de datos (milisegundos por nucleótido). Sin embargo, dichos motores, cuando se utilizan en configuraciones de secuenciación de hebras, pueden introducir modos de error tales como saltos, deslizamientos e intercambios, lo que puede inhibir la detección fiable de nucleótidos en el ADNmc. Estos y otros modos de error independientes del motor que pueden producirse durante la secuenciación de hebras pueden resultar de la "flexibilidad" o elasticidad del ADNmc que reside entre el motor y la constricción del nanoporo. Dicha elasticidad puede estar en función de la secuencia del ADNmc y puede dar lugar a diferentes corrientes o flujos para la misma combinación de nucleótidos que transitan por la constricción si diferentes apariciones de esa combinación, respectivamente, están rodeadas por diferentes secuencias de ADNmc. Además, debido a que la constricción puede ser relativamente pequeña, p. ej., de aproximadamente 2 nt, y el movimiento browniano siempre está presente, la "cabeza de lectura" del poro puede tener un tamaño de aproximadamente 4 nucleótidos, p. ej., la constricción lee una combinación de aproximadamente 4 nucleótidos a la vez, lo que hace más difícil identificar de forma única cada nucleótido, ya que hay 4A4 (256) corrientes o flujos que deben diferenciarse entre sí.

En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de mejoras en SBS, p. ej., de composiciones, sistemas y métodos económicos, precisos, de lectura larga, de alto rendimiento, para s Bs . La SBS que utiliza nanoporos biológicos representa una posible solución a esta necesidad debido a la reproducibilidad a nanoescala y la facilidad de producción de estas proteínas. En conjunto, se puede esperar que un enfoque que no tiene motor (p. ej., utilizando enzimas nucleicas como un detector que está acoplado a un nanoporo en lugar de como un motor que modula el paso de una hebra diana a través de un nanoporo), más tolerante al movimiento browniano, y tiene una resolución de un solo nucleótido, avance enormemente en el campo de la secuenciación de ADN de nanoporos.

Como se ha señalado anteriormente, los métodos, composiciones y sistemas actuales pueden usarse para detectar cambios conformacionales en una molécula. En consecuencia, los métodos, composiciones y sistemas actuales se pueden aplicar para supervisar los cambios conformacionales que experimenta una ADN polimerasa cuando sintetiza ADN a partir de un molde. Por ejemplo, la polimerasa puede hacer una transición entre lo que se denomina "estado abierto", en el que la polimerasa no se une a un nucleótido, y un "estado cerrado", en el que la polimerasa se une a un nucleótido. Véase, p. ej., Xia et al., "Alteration in the cavity size adjacent to the active site of RB69 DNA polymerase changes its conformational dynamics", Nucl. Acids Res. (2013), nar.gkt674, cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia. Véase también Santoso et al., "Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET", Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 107 (2): 715-720 (2010), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia.

Se sabe que se producen cambios conformacionales del orden de varios nanómetros durante el ciclo catalítico de incorporación de nucleótidos a medida que la polimerasa pasa del estado abierto al cerrado, o a medida que la polimerasa cambia al modo de edición. Por ejemplo, las figs. 6A-6B ilustran esquemáticamente cambios de conformación de polimerasa relativamente grandes (>1 nm) en dos polimerasas diferentes. La fig. 6A ilustra la polimerasa RB69, que presenta un cambio conformacional relativamente grande que da lugar a un movimiento relativo entre el dominio de pulgar y el dominio de dedo, experimentando más de 3 nm de movimiento entre las conformaciones abierta y cerrada, como se describe en Xia et al. La fig. 6B ilustra Pol I (fragmento de Klenow o KF), que experimenta cambios conformacionales durante la incorporación de nucleótidos como se desvela en Santoso et al. La cadena principal de carbono a de la polimerasa se muestra en beis. La hebra molde de ADN está en gris oscuro, la hebra del cebador, en gris claro. El par de bases terminal en el sitio activo es magenta. Según Santoso, los carbonos p de las dos cadenas laterales se utilizaron como sitios de unión del fluoróforo, mostrados como esferas verdes y rojas, para medir los cambios conformacionales de la polimerasa. Las flechas indican la distancia en Angstroms entre las posiciones Cp verde y roja en las conformaciones abierta y cerrada. También hay pruebas de que los cambios conformacionales de una polimerasa pueden depender de la identidad del nucleótido que se incorpora, p. ej., como se describe en Olsen et al., "Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment)", JACS 135: 7855-7860 (2013), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia. En las realizaciones de nanoporos de la presente divulgación, el dominio de dedo se puede anclar a un nanoporo mientras que una fijación se une al dominio de pulgar. Como alternativa, el dominio de pulgar se puede anclar a un nanoporo mientras que una fijación se une al dominio de dedo. En cualquier construcción, el movimiento relativo que se produce entre los dominios de dedo y pulgar durante la actividad polimerasa puede detectarse como un movimiento relativo entre la fijación y el nanoporo. Se pueden utilizar químicas de unión utilizadas para unir sondas ópticas (p. ej., pares FRET) en las referencias citadas en el presente documento en las realizaciones de nanoporos expuestas en el presente documento. Se pueden utilizar otros puntos de unión en una construcción de polimerasa-nanoporo siempre que los cambios conformacionales en la polimerasa se transmitan de manera fiable como un movimiento relativo entre la fijación y el nanoporo.

Utilizando la presente composición, se pueden utilizar un nanoporo y una fijación permanente para transducir los cambios conformacionales de una polimerasa durante la SBS a una corriente eléctrica o identificación de flujo. Obsérvese que, utilizando las presentes composiciones, sistemas y métodos, no es necesario que el ADN que se secuencia durante la SBS según los presentes métodos transite por el nanoporo y puede secuenciarse nucleótido a nucleótido, distinguiendo de este modo el método de los métodos de secuenciación de hebras como se ha mencionado anteriormente y tal como se describe con mayor detalle en la publicación de patente de los Estados Unidos n.° 2014/0051096 de Jeyasinghe et al., cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia.

Más específicamente, las figs. 6C-6D ilustran esquemáticamente una composición ilustrativa que incluye una fijación permanente anclada a una polimerasa dispuesta adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de un cambio conformacional de la polimerasa en respuesta a la unión de un nucleótido. El nanoporo incluye el poro 605 biológico, que se puede disponer en una barrera (no ilustrada específicamente), p. ej., una membrana de origen biológico tal como una bicapa lipídica o una membrana de estado sólido. El poro 605 biológico incluye la abertura 603 y la constricción 604. La fijación permanente incluye la región de cabeza 611, la región de cola 612, el cuerpo alargado 613 y la región indicadora 614. Opcionalmente, la región de cola 612 se puede unir a un segundo miembro (no ilustrado específicamente) de una manera análoga a la descrita con referencia a las figs. IF y 1M. La polimerasa 650 se dispone adyacente al poro biológico 605 y, opcionalmente, se puede unir al poro biológico 605.

La polimerasa 650 está configurada para recibir un polinucleótido molde, p. ej., ADNmc circular o lineal para secuenciar, para sintetizar un polinucleótido que tiene una secuencia complementaria a la del ADNmc recibiendo, uniendo y añadiendo secuencialmente nucleótidos al polinucleótido de acuerdo con la secuencia del ADNmc. La región de cabeza 611 de la fijación permanente está anclada a una ubicación de la polimerasa 650 que experimenta un cambio conformacional, p. ej., en respuesta a la recepción de un nucleótido, la unión de un nucleótido o la adición de un nucleótido al polinucleótido 660, y que mueve la región indicadora 614 a una ubicación lo suficientemente diferente con respecto a la constricción 604 para producir una señal a partir de la cual se puede determinar individualmente la identidad de ese polinucleótido. Por ejemplo, la región de cabeza 611 se puede unir a una región de dedo de la polimerasa o un pulgar de la polimerasa. Se exponen puntos de unión ilustrativos en las regiones de dedo y pulgar de polimerasas y químicas para unir restos a estos puntos en la publicación de patente de los Estados Unidos n.° 2011/0312529 A1, cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia. Para más detalles sobre la estructura y función de polimerasas de la familia A y B, véase Patel et al., "Getting a grip on how DNA polymerases function", Nature Structural Biology 8: 656-659 (2001), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia. Para más detalles sobre la estructura y función de polimerasas tales como Pol I, véanse las siguientes referencias, cuyo contenido completo de cada uno se incorpora en el presente documento por referencia: Olsen et al., "Electronic measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment)", JACS 135: 7855-7860 (2013); Torella et al., "Identifying molecular dynamics in single-molecule FRET experiments with burst variance analysis", Biophysics J. 100: 1568-1577 (2011); Santoso et al., "Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET", Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 107 (2): 715-720 (2010), Markiewicz et al., "Single-molecule microscopy reveals new insights into nucleotide selection by DNA polymerase I", Nucleic Acids Res. 40: 7975-7984 (2012); Gill et al., "DNA Polymerase activity at the single-molecule level", Biochem. Soc. Trans. 39: 595-599 (2011) y Johnson et al., "Processive DNA synthesis observed in a polymerase crystal suggests a mechanism for the prevention of frameshift mutations", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 3895-3900 (2003). Dos restos o dominios cualesquiera que se sabe a partir de las referencias anteriores (u otras referencias citadas en el presente documento) que experimentan un cambio en la posición relativa durante la actividad polimerasa pueden actuar como puntos de unión a un nanoporo y una fijación respectivamente en una realización de la presente divulgación.

En un ejemplo, se puede aplicar una tensión a través del nanoporo 605, p. ej., utilizando el circuito 230 de medición y los electrodos 231, 232 tal como se ha descrito anteriormente con referencia a la fig. 2A o el circuito 240 de medición y los electrodos 241, 242 tal como se ha descrito anteriormente con referencia a la fig. 2C. La región indicadora 614 o el cuerpo alargado 613 incluye una carga electrostática que, en respuesta a la tensión aplicada, provoca que el cuerpo alargado 613 se extienda a través de la constricción 604 de tal manera que la región indicadora 614 esté dispuesta dentro o adyacente a la constricción 604. Opcionalmente, la tensión aplicada puede provocar que el cuerpo alargado 613 se vuelva tenso. A medida que se mueven los dominios proteicos de la polimerasa 650, p. ej., cambian de conformación, dichos movimientos pueden imponer una fuerza en la región de cabeza 611, que impone una fuerza sobre el cuerpo alargado 613, que impone una fuerza sobre la región indicadora 614, lo que da lugar a un movimiento de traslación de la región indicadora 614 dentro de la abertura 603, p. ej., movimiento relativo a la constricción 604. Como resultado, un cambio conformacional de la polimerasa 650 se puede traducir o transducir a un cambio medible en la corriente o flujo a través de la abertura 603, que también puede denominarse corriente o flujo de bloqueo. En una realización ilustrativa, la región indicadora 614 se construye utilizando uno o más nucleótidos modificados. Por ejemplo, los nucleótidos abásicos generan normalmente una corriente de bloqueo de 70 pA en comparación con los restos que incluyen bases, tales como restos de dT que generan solo una corriente de bloqueo de 20 pA en condiciones que incluyen tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico) (HEPES) 10 mM, pH 8,0, KCl 300 mM, MgCh 1 mM, DL-ditiotreitol (DTT) 1 mM, poro mutante MspA M2 (D90N, D91N, D93N, D118R, D134R y E139K), 180 mV a través de una bicapa de 1,2-difitanoilsn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC).

Los movimientos de uno o más restos abásicos en el orden, p. ej., de solo algunos Angstroms, puede provocar cambios fácilmente detectables en la corriente o el flujo, p. ej., de uno a decenas de pA. Debido a que algunas polimerasas se mueven en el orden de nanómetros y una sola base en la fijación corresponde a aproximadamente 0,5 nanómetros, se prevé que los movimientos de la fijación resultantes de cambios conformacionales en la polimerasa a la que está anclada la fijación pueden generarse y transducirse fácilmente a corrientes o flujos. Debido a que la identidad del nucleótido influye tanto en la magnitud del cambio conformacional como en el tiempo pasado en el estado abierto, se pueden generar identificaciones de flujo o corriente únicas que identifican individualmente los nucleótidos a medida que se unen o residen en el sitio activo de la polimerasa. Adicionalmente, estas identificaciones únicas de corriente o flujo pueden indicar individualmente si un nucleótido es complementario o no del siguiente nucleótido en un polinucleótido que se está secuenciando. Para más detalles con respecto a las diferencias en la conformación de la polimerasa y la cinética entre los nucleótidos coincidentes y no coincidentes, véanse las siguientes referencias, cuyo contenido completo de cada uno se incorpora en el presente documento por referencia: Freudenthal et al., "New structural snapshots provide molecular insights into the mechanism of high fidelity DNA synthesis", DNA Repair, doi:10.2016/j.dnarep/2015.04.007 (disponible en línea el 30 de abril de 2015); Freudenthal et al., "Watching a DⁿA polymerase in action", Cell Cycle 13: 691-692, doi:10.4161/cc.27789 (2014); y Freudenthal et al., "Observing a DNA polymerase choose right from wrong", Cell 154: 157-168, doi:10.1016/j.cell.2013.05.048 (2013).

Por ejemplo, como se ilustra en la fig. 6D, un cambio de conformación de la polimerasa 650 desde el estado abierto al estado cerrado puede traducirse en un movimiento "hacia arriba" de la región indicadora 614 a una primera ubicación dentro de la abertura 603 y un cambio de conformación de la polimerasa 650 desde el estado cerrado al estado abierto puede traducirse a un movimiento "hacia abajo" de la región indicadora 614 a una segunda ubicación dentro de la abertura 603, lo que da lugar a cambios detectables en la corriente o flujo de bloqueo que pueden correlacionarse con nucleótidos individuales.

Por ejemplo, puede producirse un primer cambio conformacional de la polimerasa 650 en respuesta a la unión de la polimerasa con un primer nucleótido, p. ej., nucleótido 661 ilustrado en la fig. 6D. El primer nucleótido puede identificarse individualmente en función de una magnitud o tiempo medido (p. ej., medido óptica o eléctricamente), o ambos, de una primera corriente o flujo a través de la constricción. Por ejemplo, la región indicadora 614 puede moverse hacia la polimerasa en respuesta al primer cambio conformacional, provocando un cambio en la corriente o flujo a través de la constricción 604. Adicionalmente, puede producirse un segundo cambio conformacional de la polimerasa 650 en respuesta a la unión de la polimerasa con un segundo nucleótido. El segundo cambio conformacional puede diferir del primer cambio conformacional, p. ej., en magnitud o en tiempo. El segundo nucleótido puede identificarse individualmente en función de una magnitud o tiempo medido (p. ej., medido óptica o eléctricamente), o ambos, de una segunda corriente o flujo a través de la constricción. Por ejemplo, la región indicadora 614 puede moverse hacia la polimerasa en respuesta al segundo cambio conformacional, provocando un cambio en la corriente o flujo a través de la constricción 604.

Como alternativa, o además, puede producirse un primer cambio conformacional de la polimerasa 650 en respuesta a la adición por la polimerasa de un primer nucleótido, p. ej., nucleótido 661 ilustrado en la fig. 6D, a un polinucleótido, p. ej., polinucleótido 660. El primer nucleótido puede identificarse individualmente en función de una magnitud o tiempo medido (p. ej., medido óptica o eléctricamente), o ambos, de una primera corriente o flujo a través de la constricción. Por ejemplo, la región indicadora 614 puede moverse de forma traslacional hacia al menos una parte de la polimerasa 650 en respuesta al primer cambio conformacional, provocando un cambio en la corriente o flujo a través de la constricción 604. Adicionalmente, puede producirse un segundo cambio conformacional de la polimerasa 650 en respuesta a la adición por la polimerasa de un segundo nucleótido al polinucleótido. El segundo cambio conformacional puede diferir del primer cambio conformacional, p. ej., en magnitud o en tiempo. El segundo nucleótido puede ser identificable individualmente y distinguible del primer nucleótido, en función de una magnitud o tiempo medido (p. ej., medido óptica o eléctricamente), o ambos, de una segunda corriente o flujo a través de la constricción. Por ejemplo, la región indicadora 614 puede moverse de forma traslacional hacia al menos una parte de la polimerasa 650 en respuesta al segundo cambio conformacional, provocando un cambio en la corriente o flujo a través de la constricción 604.

Como se ha señalado anteriormente, la magnitud o la duración temporal, o ambas, del cambio o los cambios conformacionales de la polimerasa pueden basarse en el nucleótido particular que la polimerasa recibe, une y añade a un polinucleótido. La tabla 1 enumera parámetros cinéticos de una sola molécula ilustrativos que se midieron para el procesamiento de fragmentos de Klenow de moldes utilizando los cambios actuales en un SWNT unido a una sola polimerasa y señalados por Olsen et al. En la tabla 1, Tlo corresponde a la duración de tiempo pasado en la conformación cerrada de la polimerasa, rlo corresponde a la varianza normalizada con respecto a la media para Tlo, ^thi corresponde a la duración de tiempo pasado en la conformación abierta de la polimerasa, rhi corresponde a la varianza normalizada con respecto a la media para Thi y la velocidad corresponde a la velocidad de procesamiento, p. ej., la rapidez con la que la polimerasa añade el nucleótido al molde. Olson et al., informan de que la magnitud H promedio es un indicador del grado de cierre mecánico por parte de la enzima. Para los presentes sistemas, métodos y composiciones, el valor H puede considerarse como el grado de cambio conformacional entre dos puntos de referencia en la polimerasa, medido en unidades de distancia.

Tabla 1

molde nucleótido Tlo (ms) n0 Thi (ms) rhi H (nA) velocidad

(1/s)

poli(dT)42 dATP 0,33 ± 0,08 0,85 ± 0,09 71,4 ± 1,4 0,95 ± 0,08 6,94 14,4 ± 2,9

poli(dA)42 dTTP 042 ± 0,09 0,83 ± 0,06 63,7 ± 1,1 0,96 ± 0,06 4,90 16,0 ± 2,9

poli(dG)42 dCTP 0,32 ± 0,07 0,78 ± 0,05 39,0 ± 5,6 0,98 ± 0,06 2,53 26,2 ± 4,4

poli(dC)42 dGTP 0,33 ± 0,05 0,78 ± 0,05 38,0 ± 5,8 1,03 ± 0,07 2,40 28,5 ± 3,5

"Valores promedios ± desviación típica.

7858 dxdoi.org/10.1021/ja311603rl J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 7855-7860

Usando las composiciones, los métodos y los sistemas proporcionados en el presente documento, se pueden usar juntos una señal que se correlaciona con la duración temporal del estado abierto Thi, la magnitud del cambio conformacional H y la velocidad de procesamiento para indicar una identificación única para cada base. Las velocidades de incorporación también pueden cambiar en gran medida por el uso selectivo de nucleótidos modificados, tales como nucleótidos de tiol alfa o gamma. Véase, por ejemplo, publicación de patente de los Estados Unidos n.° 2011/0312529 de He et al., cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia.

En una realización ilustrativa, el ADN molde está circularizado y la polimerasa 650 es una polimerasa de desplazamiento de hebra (tal como Phi29). De esta manera, el molde se puede secuenciar múltiples veces en un modo de círculo rodante tal como se conoce en la técnica. Dicha realización también puede inhibir la tracción involuntaria del ADN molde hacia o a través de la constricción 604, debido a que solo el ADNmc se puede translocar. Se espera que cualquier ADNmc extraviado que pueda encontrar su camino a través de la constricción 604 (o si se usa un molde lineal) transite rápidamente y se manifieste como ruido en la señal. Como alternativa, se puede emplear una región indicadora 614 con carga positiva en polaridad inversa de modo que solo la región indicadora se atraiga hacia la constricción 604, mientras que el ADN con carga negativa será repelido.

En algunas realizaciones, opcionalmente la polimerasa 650 se puede unir, p. ej., anclar, a la entrada del poro 605 biológico. Esto se puede lograr utilizando química de conjugación de cisteína/tiol, por ejemplo. Dicha conjugación puede proporcionar que la polimerasa 650 esté anclada en una orientación reproducible y estable que puede mejorar la transferencia del movimiento conformacional de la polimerasa 650 al movimiento de traslación de la región indicadora 614. Sin embargo, no es necesario que se requiera la conjugación de la polimerasa con el poro. Por ejemplo, la fuerza ejercida por la fijación en respuesta a la tensión aplicada puede ser suficiente para mantener la polimerasa en su sitio. En otras realizaciones, la polimerasa 650 no está unida al poro 605 biológico y la región de cola 612 puede unirse a otro miembro (tal como un oligonucleótido) para retener la polimerasa 650 en el poro 605. Adicionalmente, obsérvese que se puede utilizar una corriente CA rápida en lugar de una corriente DC para producir el campo eléctrico requerido. Esto tiene la ventaja de inhibir el agotamiento del electrodo de AgCl y prolongar el tiempo durante el que el dispositivo puede funcionar.

También debe entenderse que este enfoque puede extenderse al análisis de cualquier enzima o proteína que experimente cambios conformacionales. Como tales, puede considerarse que los presentes sistemas, métodos y composiciones proporcionan "espectroscopia de fuerza de nanoporos", y representan una herramienta que se puede utilizar para dilucidar la cinética de las enzimas a nivel de una sola molécula y puede convertirse en una herramienta importante en la investigación bioquímica, métodos de detección analítica y diagnóstico clínico.

Métodos y composiciones ilustrativos para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido Como alternativa, se pueden utilizar técnicas distintas de la medición de un cambio conformacional para detectar acontecimientos. Por ejemplo, incluso si un acontecimiento particular puede implicar un cambio conformacional de una molécula, tal como se ha descrito anteriormente, dicho acontecimiento como alternativa, o adicionalmente, se puede detectar sobre otra base. Por ejemplo, un método puede incluir proporcionar un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados; y proporcionar una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas. La región de cabeza puede estar anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo y el cuerpo alargado puede incluir un resto. El método puede incluir además proporcionar una polimerasa dispuesta adyacente al primer lado del nanoporo y proporcionar un primer nucleótido que incluye un primer marcador alargado, incluyendo el primer marcador alargado un resto. El método puede incluir además actuar sobre el primer nucleótido con la polimerasa; e interactuar el primer resto con el resto de la fijación en respuesta a la polimerasa que actúa sobre el primer nucleótido.

En un ejemplo ilustrativo, la fig. 4B ilustra un método para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido utilizando una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

El método 410 ilustrado en la fig. 4B incluye proporcionar una composición que incluye un nanoporo, una fijación permanente y una polimerasa dispuesta adyacente al nanoporo (etapa 411). Por ejemplo, las figs. 7A-7B ilustran esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la unión de un nucleótido por una proteína dispuesta adyacente al nanoporo. En la realización ilustrativa ilustrada en la fig. 7A, la composición puede incluir el nanoporo 700, la fijación 710 permanente y la polimerasa 750. El nanoporo 700 incluye el primer lado 701, el segundo lado 702, la abertura 703 y, opcionalmente, también incluye la constricción 704. La fijación 710 permanente incluye la región de cabeza 711, la región de cola 712 y el cuerpo alargado 713 dispuesto entre ellas y que incluye la región indicadora 714 (opcionalmente, se pueden proporcionar una o más regiones indicadoras adicionales tal como se ha descrito anteriormente con referencia a la fig. 1C). La polimerasa 750 está dispuesta adyacente al primer lado 701 del nanoporo 700. Por ejemplo, la polimerasa 750 puede estar en contacto con el primer lado 701 del nanoporo 700 y, opcionalmente, puede anclarse a o adyacente al primer lado del nanoporo 700 mediante cualquier enlace químico adecuado, interacción proteína-proteína o cualquier otra unión adecuada que normalmente sea irreversible. Opcionalmente, la región de cola 712 puede anclarse a otro miembro de una manera análoga a la descrita con referencia a las figs. 1I y 1M.

En la realización ilustrada en la fig. 7A, la región de cabeza 711 de la fijación 710 está unida a, p. ej., anclada a, el primer lado 701 del nanoporo 700, mediante cualquier enlace químico adecuado, interacción proteína-proteína o cualquier otra unión adecuada que normalmente sea irreversible. La región de cabeza 711 se puede unir a cualquier parte adecuada del nanoporo 700 que coloque la región indicadora 714 dentro de la abertura 703 y coloque el marcador alargado 713 lo suficientemente cerca de la polimerasa 750 para interactuar con los nucleótidos sobre los que puede actuar la polimerasa 750 y, opcionalmente, también coloca la región indicadora 714 adyacente a o dentro de la constricción 704. Por ejemplo, el nucleótido 730 puede incluir un marcador alargado 731 que incluye el resto 732 que interactúa con la fijación 710. En una realización ilustrativa, el marcador alargado 713 de la fijación 710 puede incluir un resto 715 con el que puede interactuar el resto 732 del marcador. El resto 715 se puede ubicar en cualquier posición adecuada a lo largo del marcador alargado 713, p. ej., puede ubicarse adyacente a la región de cabeza 711 tal como se ilustra en la fig. 7A o puede ser adyacente a la región de cola 712, adyacente a la región indicadora 714, entre la región de cabeza 711 y la región indicadora 714 o entre la región de cola 712 y la región indicadora 714. Obsérvese que la polimerasa 750 o el nucleótido 730, o ambos, puede considerarse, aunque no es necesario, parte de la composición, pero, en cambio, se puede considerar que está en contacto con una composición que incluye el nanoporo 700 y la fijación 710 permanente.

Haciendo referencia de nuevo a la fig. 4B, el método 410 incluye actuar sobre un nucleótido con la polimerasa (etapa 412) . Por ejemplo, la fig. 7B ilustra esquemáticamente la unión del nucleótido 730 por la polimerasa 750, pero debe entenderse que la polimerasa 750 puede actuar sobre el nucleótido 730 de diversas formas, p. ej., añadiendo el nucleótido 730 a un polinucleótido, escindiendo el nucleótido 730 de un polinucleótido existente (p. ej., mediante actividad exonucleasa o actividad de pirofosforólisis) o muestreando el nucleótido 730, p. ej., interactuando transitoriamente con el nucleótido 730 sin unirse a él. Se anticipa que el tiempo de permanencia de un nucleótido sobre el que actúa una polimerasa puede ser aproximadamente 1 ms o más, o 10 ms o más, o 20 ms o más o 50 ms o más. El nucleótido se puede modificar para extender adicionalmente dicho tiempo de permanencia, p. ej., a 50 ms o más o 100 ms o más.

El método 410 ilustrado en la fig. 4B también incluye la interacción de un resto del nucleótido con la fijación (etapa 413) . Por ejemplo, en la realización ilustrada en la fig. 7B, la polimerasa 750 que actúa sobre el nucleótido 730 puede llevar el resto 732 del nucleótido 730 a una proximidad suficientemente cercana al resto 715 para que los restos interactúen entre sí, p. ej., se unan entre sí. Dicha interacción puede ser reversible, p. ej., puede incluir la formación de un enlace de hidrógeno, enlace iónico, enlace dipolo-dipolo, fuerzas de dispersión de London, enlace covalente reversible o cualquier combinación adecuada de los mismos.

Haciendo referencia de nuevo a la fig. 4B, el método 410 también incluye mover la región indicadora con respecto a la constricción en respuesta a la interacción del resto del nucleótido con la fijación (etapa 414). Por ejemplo, la fig.

7B ilustra esquemáticamente que la interacción entre el resto 732 del nucleótido 730 y el resto 715 de la fijación 710 puede mover de forma traslacional la región indicadora 714 hacia el primer lado 701, como lo indica la flecha discontinua. Por ejemplo, la región indicadora 714 se puede disponer en una ubicación particular dentro de la abertura 703 antes de la interacción, p. ej., disponerse junto a o dentro de la constricción 704 opcional antes de la interacción, tal como se ilustra en la fig. 7A, y se puede mover de forma traslacional dentro de la abertura 703 en respuesta a la interacción entre el resto 732 y la fijación 710, p. ej., se puede mover de forma traslacional desde la constricción 704 hacia el primer lado 701. Como alternativa, la interacción entre el resto 732 y la fijación 710 puede mover la región de cabeza 711 de tal manera que la región indicadora 714 se mueve hacia el segundo lado 702. Debe apreciarse que la interacción entre el resto 732 y la fijación 710 puede provocar adecuadamente cualquier tipo de movimiento detectable de la región indicadora 714 dentro de la abertura 703, p. ej., cualquier combinación detectable de movimiento de traslación, conformacional o de rotación de la región indicadora 714.

Haciendo referencia de nuevo a la fig. 4B, el método 410 incluye además detectar el movimiento de la región indicadora dentro de la abertura del nanoporo (etapa 415). Por ejemplo, la composición puede estar en comunicación operativa con un circuito de medición tal como se ha descrito anteriormente con referencia a la fig. 2A o la fig. 2C. El circuito de medición se puede configurar para detectar el movimiento de la región indicadora dentro de la abertura del nanoporo, p. ej., en relación con la constricción. En una realización ilustrativa, el nanoporo 700, la fijación 710 y la polimerasa 750 se pueden sumergir en un líquido conductor, p. ej., una solución salina acuosa. Un circuito de medición configurado de manera análoga al circuito 230 de medición ilustrado en la fig. 2A o el circuito 240 de medición ilustrado en la fig. 2C puede estar en comunicación con el primer y segundo electrodos y puede configurarse para aplicar una tensión entre esos electrodos para aplicar una tensión a través del nanoporo 700. El circuito de medición puede configurarse además para usar los electrodos para medir la magnitud de una corriente o flujo a través de la abertura 703. La región indicadora 714 puede tener una propiedad eléctrica diferente a algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado 713. Por ejemplo, la región indicadora 714 puede incluir una carga electrostática, mientras que algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado 713 pueden incluir una carga electrostática diferente o pueden no tener carga (p. ej., pueden ser eléctricamente neutras). O, por ejemplo, la región indicadora 714 puede no tener carga, mientras que algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado 713 pueden incluir una carga electrostática. La magnitud de la corriente o el flujo a través de la abertura 703 puede cambiar de forma medible en respuesta al movimiento de traslación, rotación o conformacional de la región indicadora 714 dentro de la abertura, p. ej., en respuesta al movimiento de traslación de la región indicadora 714 con respecto a la constricción 704 opcional, y el periodo de tiempo para dicho cambio medible en la corriente o flujo puede basarse en la duración del movimiento de la región indicadora. En un ejemplo no limitante, ilustrativo, el cuerpo alargado 713 incluye un polinucleótido que incluye uno o más nucleótidos abásicos que definen la región indicadora 714.

La acción de la polimerasa 750 sobre el nucleótido 730 puede identificarse individualmente en función de una magnitud medida o duración temporal, o ambos, de una señal (p. ej., una señal óptica o eléctrica) generada por dicho sistema. Por ejemplo, la acción de la polimerasa 750 sobre el nucleótido 730 puede provocar que la región indicadora 714 se mueva de forma traslacional a una primera ubicación dentro de la abertura 703, y la presencia de la región indicadora 714 en la primera ubicación provoca que la señal tenga una primera magnitud. Como tal, la señal que tiene la primera magnitud se correlaciona con la aparición de la acción de la polimerasa 750 sobre el nucleótido 730. Obsérvese que los movimientos de la región indicadora 714 distintos del movimiento de traslación pueden ser detectables, p. ej., movimiento conformacional o movimiento de rotación, una combinación de diferentes tipos de movimiento.

Como se ilustra en la fig. 4B, el método 410 puede incluir además liberar el resto del nucleótido de la fijación (etapa 416). Por ejemplo, como la polimerasa 750 ilustrada en la fig. 7B incorpora el nucleótido 730 en un polinucleótido, la polimerasa 750 puede escindir el marcador alargado 731. Dicha escisión puede provocar la disociación de los restos 732 y 715. El método 410 puede incluir además mover la región indicadora de la fijación en respuesta a la liberación del resto de la fijación (etapa 417). Por ejemplo, en respuesta a la liberación del resto 732 del resto 715 ilustrado en la fig. 7B, la región indicadora 714 puede moverse de forma traslacional hacia el segundo lado 702, p. ej., a una ubicación adyacente a o dentro de la constricción 704. El método 410 incluye además detectar el movimiento de la región indicadora dentro de la abertura (etapa 418). Dicha detección se puede realizar de forma análoga a la descrita anteriormente con referencia a la etapa 415. Obsérvese que los movimientos de la región indicadora 714 distintos del movimiento de traslación pueden ser detectables, p. ej., movimiento conformacional o movimiento de rotación. Secuenciación por síntesis usando métodos y composiciones ilustrativos basados en la detección de la acción de las polimerasas sobre los nucleótidos

Debe apreciarse que el método 410 ilustrado en la fig. 4B se puede utilizar adecuadamente para detectar la acción de un tipo de molécula sobre cualquier otro tipo adecuado de molécula que tenga un resto unido al mismo.

En una realización ilustrativa, no limitante, descrita a continuación con referencia a las figs. 8A-14, el método 410 puede usarse para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido. La detección de dicha acción puede usarse para secuenciar un primer polinucleótido sintetizando un segundo polinucleótido que es complementario del primer nucleótido, p. ej., utilizando "secuenciación por síntesis" (SBS).

En un aspecto de la divulgación, una composición puede incluir un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados; y una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas. La región de cabeza puede estar anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo y el cuerpo alargado puede incluir un resto. Puede disponerse una polimerasa adyacente al primer lado del nanoporo. La composición también incluye un primer nucleótido que incluye un primer marcador alargado. El primer marcador alargado incluye un primer resto que interactúa con el resto de la fijación en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido.

En un ejemplo ilustrativo, la fig. 8A ilustra esquemáticamente una composición ilustrativa que incluye una fijación anclada a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un nucleótido. El nanoporo incluye el poro 805 biológico, que se puede disponer en una barrera (no ilustrada específicamente), p. ej., una membrana de origen biológico tal como una bicapa lipídica o una membrana de estado sólido. El poro 805 biológico incluye la abertura 803 y la constricción 804, aunque debe entenderse que el poro 805 biológico puede adecuadamente no incluir ninguna constricción o incluir múltiples constricciones. La fijación permanente incluye la región de cabeza 811, el cuerpo alargado 813 y la región indicadora 814. La polimerasa 850 se dispone adyacente a, y en contacto con, el poro 805 biológico y opcionalmente se puede anclar al poro 805 biológico a través de un enlace físico o químico (p. ej., usando química clic o un enlace cisteína-maleimida). La polimerasa 850 está configurada para recibir un polinucleótido 860 molde, p. ej., ADNmc circular o lineal para secuenciar, para sintetizar un polinucleótido que tiene una secuencia complementaria de la del ADNmc actuando secuencialmente sobre los nucleótidos, p. ej., uniendo los nucleótidos, añadiendo los nucleótidos a un polinucleótido de acuerdo con la secuencia del ADNmc, escindiendo los nucleótidos de un polinucleótido existente o tomando muestras de los nucleótidos, p. ej., interactuando transitoriamente con los nucleótidos sin unirlos. La región de cabeza 811 se puede anclar a cualquier parte adecuada del nanoporo 800 que coloque la región indicadora 814 dentro de la abertura 803, p. ej., adyacente a o dentro de la constricción 804 y coloca el cuerpo alargado 813 suficientemente cerca de la polimerasa 850 para interactuar con nucleótidos sobre los que puede actuar la polimerasa 850. Por ejemplo, el nucleótido 830 puede incluir un marcador alargado 831 que incluye el resto 832 que interactúa con el resto 815 de la fijación. El ADN molde que se va a secuenciar y el cebador para el polinucleótido complementario que se va a secuenciar se representan en la fig. 8A por las líneas negras (indicando la línea discontinua una distancia relativamente larga).

En un ejemplo, se puede aplicar una tensión a través del nanoporo 805, p. ej., utilizando el circuito 230 de medición y los electrodos 231, 232 tal como se ha descrito anteriormente con referencia a la fig. 2A o el circuito 240 de medición y los electrodos 241, 242 tal como se ha descrito anteriormente con referencia a la fig. 2C. La región indicadora 814 o el cuerpo alargado 813 incluye una carga electrostática que, en respuesta a la tensión aplicada, provoca que el cuerpo alargado 813 se extienda a través de la abertura 803, opcionalmente, de modo que la región indicadora 814 esté dispuesta dentro de o adyacente a la constricción 804. Opcionalmente, la tensión aplicada puede provocar que el cuerpo alargado 813 se vuelva tenso. En respuesta a la polimerasa 805 que actúa sobre el nucleótido 830, el resto 832 del nucleótido 830 puede interactuar con, p. ej., unirse de forma reversible a, el resto 815 de la fijación 832. Dicha interacción puede imponer una fuerza sobre la región indicadora 814 que da lugar al movimiento de la región indicadora 814 dentro de la abertura 803, p. ej., movimiento de traslación. Como resultado, la acción de la polimerasa 850 sobre el nucleótido 830 puede traducirse o transducirse en un cambio medible en la corriente o flujo a través de la constricción 804, que también puede denominarse corriente o flujo de bloqueo. Adicionalmente, se puede esperar que la fuerza ejercida sobre la fijación por la tensión aplicada tire del poro en lugar de la polimerasa y, por tanto, no se espera que interrumpa significativamente la actividad polimerasa.

En una realización ilustrativa, el resto 815 incluye un primer oligonucleótido y el resto 832 incluye un segundo oligonucleótido que es complementario del primer oligonucleótido, p. ej., que hibrida con el primer oligonucleótido en respuesta a la acción de la polimerasa 850 sobre el nucleótido 830. La hibridación del segundo oligonucleótido con el primer oligonucleótido puede provocar un cambio en la longitud del cuerpo alargado 813 de la fijación 810, que a su vez puede mover la región indicadora 814 a una ubicación predeterminada. La acción de la polimerasa 850 sobre el nucleótido 830 puede detectarse individualmente en función de una magnitud medida (p. ej., medida óptica o eléctricamente) o duración temporal, o ambas, de una corriente o flujo a través de la abertura 803. En una realización ilustrativa, el resto 815 incluye un primer oligonucleótido y el resto 832 incluye un segundo oligonucleótido que es complementario del primer oligonucleótido, p. ej., que hibrida con el primer oligonucleótido. La hibridación del segundo oligonucleótido con el primer oligonucleótido puede acortar el cuerpo alargado 813 de la fijación 810 en una cantidad predeterminada, que a su vez puede mover la región indicadora 814 a una ubicación predeterminada dentro de la abertura 803. La unión del nucleótido puede detectarse individualmente en función de una magnitud medida (p. ej., medida óptica o eléctricamente) o duración temporal, o ambas, de una corriente o flujo a través de la abertura 803.

Por ejemplo, la fig. 8B ilustra esquemáticamente un nucleótido ilustrativo que incluye un marcador alargado que incluye un resto que interactúa con la fijación de la fig. 8A durante su uso para detectar la acción de una polimerasa sobre el nucleótido. Como se ilustra en la fig. 8B, el marcador alargado 831 del nucleótido 830, p. ej., T, puede incluir un resto oligonucleotídico 832 unido al fosfato gamma del nucleótido 830, p. ej., a través de un enlace fosfato delta. El resto oligonucleotídico 832 puede incluir cualquier secuencia adecuada de nucleótidos seleccionada para hibridar con una secuencia correspondiente de nucleótidos dentro del resto 815 de la fijación. Por ejemplo, el resto oligonucleotídico 832 ilustrado en la fig. 8B puede incluir la secuencia ilustrativa 5' GCAT 3' y el resto 815 puede incluir la secuencia complementaria 5' ATGC 3'. Haciendo referencia de nuevo a la fig. 8A, la acción de la polimerasa 805 sobre el nucleótido 830 puede mantener el resto 832 relativamente próximo al resto 815 de la fijación, lo que da lugar a un aumento transitorio en la concentración local del resto oligonucleotídico 832 que puede inducir la hibridación entre los restos 832 y 815 preferentemente a restos que están unidos a nucleótidos sobre los que actualmente no actúa la polimerasa 805. La hibridación resultante provoca el movimiento de la fijación, p. ej., movimiento conformacional que da lugar a un acortamiento del cuerpo alargado 813 que puede mover la región indicadora 814 con respecto a la constricción 804. La polimerasa 850 puede escindir el marcador alargado 831 al incorporar el nucleótido 830 en un polinucleótido, en respuesta a lo cual el resto 832 puede disociarse del resto 815.

El cambio conformacional en la fijación se puede inducir mediante la creación de ADN bicatenario (ADNbc) a partir de ADNmc que, respectivamente, se incluye dentro de los restos 815 y 832. Por ejemplo, el ADNmc es más largo que el ADNbc en aproximadamente 1,5 Angstroms por nucleótido, lo que se encuentra dentro de los límites de resolución de los presentes sistemas, p. ej., el sistema 220 ilustrado en la fig. 2A o el sistema 250 ilustrado en la fig.

2C. Cada nucleótido puede incluir un resto oligonucleotídico 832 correspondiente que se selecciona para crear una longitud diferente de ADNbc tras la hibridación del resto 832 con el resto 815, acortando de este modo la fijación en una distancia que corresponde al nucleótido sobre el que actúa la polimerasa 850. En algunas realizaciones, la fórmula para la cantidad de acortamiento de una fijación completamente tensa, tal como una fijación extendida a través del poro en respuesta a una tensión aplicada, se puede expresar como:

Ds=N*(Lmc-Lbc) (1)

donde N es el número de bases que se hibridan, Ds es la distancia en la que se acorta la fijación, Lmc es la longitud entre nucleótidos en ADNmc (aproximadamente 5 Angstroms) y Lbc es la longitud entre nucleótidos en ADNbc (aproximadamente 3,3 Angstroms).

Las figs. 9A-9B ilustran esquemáticamente un cambio conformacional, p. ej., acortamiento, de una fijación ilustrativa en respuesta a la hibridación con un resto de un marcador alargado de un nucleótido ilustrativo durante su uso para detectar la acción de una polimerasa sobre el nucleótido. La región de cabeza 911 de la fijación está anclada al nanoporo 900 que incluye opcionalmente la constricción 904 y el cuerpo alargado 913 se extiende a través de la abertura 903, p. ej., de modo que la región indicadora 914 esté dispuesta dentro de, o adyacente a, la constricción 914. En la realización ilustrada en las figs. 9A-9B, el cuerpo alargado 913 incluye un polinucleótido tal como ADNmc, cuyos nucleótidos están representados por barras 916 horizontales. La región indicadora 914 incluye uno o más sitios abásicos del polinucleótido, p. ej., ADNmc. El resto 915 incluye una secuencia de nucleótidos que se selecciona para hibridar con un resto correspondiente, p. ej., una secuencia complementaria de nucleótidos, de un marcador alargado de un nucleótido sobre el que actúa la polimerasa 900 (el nucleótido sobre el que se actúa, y el marcador alargado del mismo, no está ilustrado específicamente en las figs. 9A-9B).

Como se ilustra en la fig. 9A, antes de la unión del resto 915 al resto correspondiente del nucleótido sobre el que se actúa, los nucleótidos 916 están separados entre sí en aproximadamente 5 Angstroms. Como se ilustra en la fig. 9B, en respuesta al resto 915 que interactúa con, p. ej., que hibrida con, el resto correspondiente del nucleótido sobre el que se actúa, p. ej., en respuesta a los restos que forman una doble cadena de ADN bicatenario, la separación entre los nucleótidos 916 dentro del resto 915 disminuye hasta aproximadamente 3,3 Angstroms. La línea vertical negra, corta, en la fig. 9B indica un acontecimiento de hibridación de 5 bases, que acorta la fijación y mueve la región indicadora 914 a una nueva ubicación. Las dobles cadenas de 6, 7 u 8 bases pueden ser incluso más cortas que las representadas en la fig. 9B, como se analiza adicionalmente más adelante.

Cada tipo diferente de nucleótido puede incluir un marcador alargado correspondiente que se une a su fosfato gamma de una manera análoga a la ilustrada en la fig. 8B, o bien se une adecuadamente de otro modo. Por ejemplo, las figs. 10A-10B ilustran esquemáticamente nucleótidos ilustrativos que incluyen marcadores alargados que incluyen restos respectivos que interactúan con una fijación ilustrativa durante el uso para detectar la unión del nucleótido por una polimerasa dispuesta adyacente a un nanoporo. Como se muestra en la fig. 10A, los nucleótidos A, T, C y G pueden incluir respectivamente marcadores alargados que incluyen restos diferentes entre sí, p. ej., representados respectivamente por el triángulo, rombo, cuadrado y círculo. Los restos particulares se pueden seleccionar de forma adecuada para que interactúen con, p. ej., hibriden con, un resto correspondiente de la fijación permanente y para inducir diferentes cambios conformacionales respectivos de la fijación. La fig. 10B ilustra ejemplos no limitantes de restos que pueden incluirse en los marcadores alargados ilustrados en la fig. 10A. Cada uno de dichos restos puede interactuar con, p. ej., hibridar con, una parte respectiva, diferente, de un resto correspondiente de la fijación permanente, para inducir un cambio conformacional respectivo, diferente, de la fijación.

Por ejemplo, la fig. 10C ilustra esquemáticamente una fijación ilustrativa que incluye la región de cabeza 1011, la región de cola 1012 y el cuerpo alargado 1013 que incluye la región indicadora 1014 y el resto 1015. La región de cabeza 1011 puede incluir un conector químico tal como un grupo maleimida 3' ("Mal") para conjugación con un resto de cisteína (Cys) en el poro. La región de cola 1012 puede incluir un grupo fosfato ("fos") 5' que tiene carga y, por tanto, ayuda a alimentar la fijación a través de la abertura del poro en respuesta a una tensión aplicada. El cuerpo alargado 1013 puede incluir un polímero, p. ej., un polinucleótido tal como se ilustra en la fig. 10C, o cualquier otro polímero adecuado, tal como un polímero biológico o un polímero sintético. La región indicadora 1014 incluye uno o más nucleótidos abásicos indicados como "X" y, en una realización ilustrativa, puede ubicarse aproximadamente a 14-15 bases de la maleimida, que puede ser aproximadamente la distancia H2 desde la entrada del poro hasta la constricción del poro para determinados tipos de nanoporos. El resto 1015 puede incluir una secuencia de nucleótidos, p. ej., GGGTATAT, con la que cada uno de los restos unidos a los nucleótidos A, T, C y G sobre los que se actúa pueden interactuar, p. ej., hibridar, de manera diferente entre sí.

Obsérvese que los restos ilustrados en las figs. 10A-10C están destinados a ser puramente ilustrativos y no limitantes de la divulgación. Sin embargo, los restos unidos a los nucleótidos sobre los que se va a actuar se pueden seleccionar de modo que satisfagan uno o más de los siguientes parámetros y, opcionalmente, todos los siguientes parámetros:

1. Los restos unidos a diferentes tipos de nucleótidos entre sí pueden interactuar con el resto de la fijación de una manera que es distinguible entre sí, p. ej., mediante medición de corriente o flujo a través de la constricción del poro.

2. La estabilidad de una doble cadena entre el resto del nucleótido y el resto correspondiente de la fijación es lo suficientemente baja para que dichos restos unidos a nucleótidos "libres" (nucleótidos sobre los que no actúa la polimerasa y, por tanto, interactúan transitoriamente con la fijación) interactúen solo brevemente con el resto de la fijación, p. ej., durante menos de 1 ms. Por ejemplo, la estabilidad de la doble cadena entre el resto del nucleótido y el resto de la fijación puede expresarse como la Tm, o temperatura de fusión, de la doble cadena. Se espera que la temperatura operativa del sistema sea de aproximadamente 20 °C o temperatura ambiente. Se espera que los restos de aproximadamente 5-8 nucleótidos de longitud tengan Tm<12°C, que puede proporcionar una estabilidad suficientemente baja a temperatura ambiente para que los restos unidos a nucleótidos "libres" interactúen solo brevemente con el resto de la fijación.

3. La estabilidad de una doble cadena entre el resto del nucleótido y el resto correspondiente de la fijación es lo suficientemente alta para que cuando la polimerasa actúe sobre el nucleótido y lo mantenga en su lugar durante varios milisegundos (1 a 30 ms, por ejemplo) durante la incorporación, dicha acción aumenta la concentración eficaz del resto del nucleótido en relación con el resto de la fijación, que impulsa la reacción entre los restos y aumenta la estabilidad de modo que la Tm eficaz de la doble cadena sea mayor de 20 °C (o la temperatura operativa anticipada del sistema), p. ej., es mayor de 30 °C, o mayor de 40 °C o mayor de 50 °C.

4. La longitud del marcador alargado del nucleótido sobre el que se actúa, p. ej., la longitud entre el resto y el fosfato gamma, puede ser lo suficientemente larga para que, cuando el resto se hibrida de forma estable con el resto correspondiente de la fijación, sustancialmente no hay fuerza sobre el nucleótido. Si esta longitud es demasiado corta, la fijación puede imponer una fuerza sobre el marcador alargado del nucleótido, lo que se espera que dé lugar a una reducción de la eficacia de la polimerasa.

Para obtener más información acerca de la hibridación de oligonucleótidos entre sí, véase la patente de los Estados Unidos n.° 8.652.779 de Turner et al., cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia. Según Turner et al., a dicha escala de tamaño, un oligonucleótido debería tomar muestras de su espacio de configuración aproximadamente 100 veces más rápido de lo que una polimerasa puede incorporar un nucleótido. Aplicando dicho principio a las presentes composiciones, se cree que es probable que el resto del nucleótido sobre el que se actúa "encuentre" fácilmente, e interactúe con, el resto correspondiente de la fijación y también se disocie de la fijación después de que el resto se escinda del nucleótido sobre el que se actúa.

Obsérvese que, en los ejemplos de restos ilustrados en la fig. 10C, cada resto unido a un nucleótido sobre el que se actúa tiene solo una única hibridación coincidente con el resto de fijación correspondiente 1015 que incluye entre 5 y 8 bases. Aunque existen otras opciones de hibridación que no provocan hibridación completa, se puede anticipar que dichas opciones serán significativamente menos estables que las opciones de longitud completa.

Las figs. 11A-11D ilustran cálculos ilustrativos de interacciones entre una fijación y restos. Se muestran opciones de hibridación para cada resto con sus energías libres previstas, basándose en la suposición de dos oligonucleótidos de difusión libre en presencia de NaCl 50 mM y Mg2+ 2 mM, un ion divalente que se sabe que aumenta la Tm y se puede utilizar a esta concentración para la actividad polimerasa. La "secuencia de fijación" ilustrada sobre las figs.

11A-11D corresponde a la secuencia de la fijación y las "secuencias marcadoras" ilustradas en las figs. 11A-11D corresponden a secuencias ilustrativas de restos que, respectivamente, pueden unirse a un nucleótido. El resto (secuencia marcadora) ilustrado en la fig. 11A tiene cinco pares de bases de longitud, mientras que el resto (secuencia marcadora) ilustrado en la fig. 11B tiene seis pares de bases de longitud y es similar al resto ilustrado en la fig. 11A pero incluye una base adicional, A, en el extremo 3'. El resto (secuencia marcadora) en la fig. 11C tiene siete pares de bases de longitud y es similar al resto ilustrado en la fig. 11B pero incluye una base adicional, T, en el extremo 3'. El resto (secuencia marcadora) en la fig. 11D tiene ocho pares de bases de longitud y es similar al resto ilustrado en la fig. 11C pero incluye una base adicional, A, en el extremo 3'.

La diferencia calculada en energía libre (AG) se ilustra respectivamente para las hibridaciones de mejor coincidencia (recuadro continuo) y segunda mejor coincidencia (recuadro discontinuo) entre la secuencia primaria y las diferentes secuencias secundarias, basándose en el supuesto de que la secuencia primaria y la secuencia secundaria respectiva se difunden libremente. Más específicamente, en la fig. 11A se puede ver que la AG calculada para la hibridación ilustrativa energéticamente más favorable ilustrada en el recuadro 1^a fue de -9,57 kcal/mol, correspondiente a la hibridación de los 5 pares de bases de la secuencia marcadora respectiva con la secuencia de fijación, mientras que la AG calculada para la segunda hibridación ilustrativa energéticamente más favorable ilustrada en el recuadro 1B fue de -3,07 kcal/mol, correspondiente a la hibridación de solo 2 pares de bases de esa secuencia marcadora con la secuencia de fijación. En la fig. 11B se puede ver que la AG calculada para la hibridación ilustrativa energéticamente más favorable ilustrada en el recuadro 2A fue de -10,53 kcal/mol, correspondiente a la hibridación de los 6 pares de bases de la secuencia marcadora respectiva con la secuencia de fijación, mientras que la AG calculada para la segunda hibridación ilustrativa energéticamente más favorable ilustrada en el recuadro 2B fue de -3,2 kcal/mol, correspondiente a la hibridación de solo 3 pares de bases de esa secuencia marcadora con la secuencia de fijación. En la fig. 11C se puede ver que la AG calculada para la hibridación ilustrativa energéticamente más favorable ilustrada en el recuadro 3A fue de -12 kcal/mol, correspondiente a la hibridación de los 7 pares de bases de la secuencia marcadora respectiva con la secuencia de fijación, mientras que la AG calculada para la segunda hibridación ilustrativa energéticamente más favorable ilustrada en el recuadro 3B fue de -3,2 kcal/mol, correspondiente a la hibridación de solo 3 pares de bases de esa secuencia marcadora con la secuencia de fijación. En la fig. 11D se puede ver que la AG calculada para la hibridación ilustrativa energéticamente más favorable ilustrada en el recuadro 4A fue de -12,96 kcal/mol, correspondiente a la hibridación de los 8 pares de bases de la secuencia marcadora respectiva con la secuencia de fijación, mientras que la AG calculada para la segunda hibridación ilustrativa energéticamente más favorable ilustrada en el recuadro 4B fue de -3,2 kcal/mol, correspondiente a la hibridación de solo 3 pares de bases de esa secuencia marcadora con la secuencia de fijación. En consecuencia, puede entenderse a partir de las figs. 11A-11D que la AG calculada es significativamente menor para la hibridación completa de cada una de las secuencias secundarias con la secuencia primaria que para una hibridación parcial de esas secuencias marcadoras con la secuencia de fijación. Además, puede entenderse a partir de las figs. 11A-11D que las temperaturas de fusión (Tm) previstas son todas inferiores a aproximadamente 11,4 °C, incluyendo para el resto con 8 bases. A 150 mM de sal (una concentración que se puede utilizar adecuadamente en sistemas configurados para medir la corriente o el flujo a través de una abertura de poro) y 2 mM de Mg2+, el resto con 8 bases tiene una Tm prevista de aproximadamente 15 °C. Por tanto, se puede esperar que los nucleótidos de difusión libre que se encuentran con la fijación no tengan estabilidad significativa a temperatura ambiente. Adicionalmente, la Tm más alta se puede reducir aún más, p. ej., en aproximadamente 5 °C, mediante el uso, por ejemplo, de formamida.

Adicionalmente, se puede esperar que las temperaturas de fusión de las dobles cadenas entre restos en nucleótidos sobre los que se actúa, y restos en la fijación, sean significativamente más estables que un par por lo demás idéntico de oligonucleótidos de difusión libre porque la fijación y el nucleótido incorporado se mantienen en una posición relativamente fija con respecto a otro, provocando un aumento eficaz de las concentraciones locales de los restos. La unión sinérgica resultante se puede producir porque el nucleótido se mantiene simultáneamente en cierta medida tanto por la polimerasa como por la interacción de hibridación. Dicha unión sinérgica puede aumentar significativamente la Tm eficaz de una doble cadena oligonucleotídica corta. La fig. 12A ilustra un modelo que se puede usar para calcular interacciones entre una fijación y restos. Dicho modelo se basa en una baliza molecular, en la que dos oligonucleótidos cortos de aproximadamente 5 o 6 bases cada uno se hibridan de forma estable entre sí en una estructura de tallo-bucle. El bucle sirve para mantener las dos piezas del tallo (los oligonucleótidos) muy próximas entre sí. Se pueden alcanzar fácilmente Tm>50°C o > 60 °C con tallos de aproximadamente 5-6 nucleótidos y bucles del orden de 10 o más nucleótidos. Debido a que los oligonucleótidos se mantienen relativamente próximos entre sí mediante el bucle ("secuencia de sonda"), su concentración eficaz aumenta y puede aumentar significativamente la Tm de hibridación entre esos nucleótidos en comparación con los nucleótidos de difusión libre.

La fig. 12B ilustra cálculos ilustrativos de interacciones entre una fijación y restos que pueden unirse a un nucleótido sobre el que actúa una polimerasa, en función del modelo de la fig. 12A, y la fig. 12C ilustra una estructura estable calculada en función del modelo de la fig. 12A. Más específicamente, usando el ejemplo de la secuencia que codifica el resto de la fig. 10B para el nucleótido "A", se utilizó el programa mFold albergado por el Instituto RNA (Facultad de Artes y Ciencias, Universidad de Albany, Universidad Estatal de Nueva York en Albany) para determinar la Tm de esta secuencia hibridada con su complemento inverso en la fijación adoptando un bucle de 10 nucleótidos de longitud. Se anticipa que dicha longitud del bucle es una aproximación razonable de la longitud de otras partes del marcador alargado del nucleótido sobre el que actúa la polimerasa. Como se muestra en la fig. 12B, la Tm prevista en presencia de MgCh 2 mM y NaCl 50 mM es de aproximadamente 49 °C, lo que indica que incluso restos relativamente cortos de 5 unidades, como se ilustra en la fig. 12C pueden tener Tm relativamente altas si la concentración efectiva de los restos entre sí es suficientemente alta. Los restos ilustrativos para las otras bases (C, G y T) ilustradas en la fig. 10B son incluso más largos y varían entre 6 y 8 nucleótidos y, por tanto, se puede esperar que tengan Tm algo mayores. Por ejemplo, se predice que "G" con un resto de 8 nucleótidos tendrá una Tm de 59 °C en Mg2+ 2 mM y NaCl 50 mM (datos no mostrados) en función del modelo ilustrado en la fig. 12A. En comparación, la fig. 10^c ilustra la Tm respectiva para formas de difusión libre de cada una de las secuencias ilustradas según lo predicho por el programa mFold en presencia de Mg2+ 1 mM y NaCl 150 mM. Obsérvese que el programa mFold no informa de valores <10 °C. Todas las Tm para formas de difusión libre están muy por debajo de la temperatura de funcionamiento esperada del sistema a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C), mientras que las Tm calculadas usando el modelo de la fig. 12A están muy por encima de la temperatura de funcionamiento esperada del sistema.

Como se ha señalado anteriormente, se pueden usar restos oligonucleotídicos de diferentes longitudes para cambiar la conformación de la fijación, p. ej., para cambiar la longitud de la fijación, p. ej., acortar la fijación, en diferentes cantidades. La aplicación de la ecuación (1) anterior a restos que varían entre 5 y 8 nucleótidos produce los resultados de la tabla 2. Se prevé que el resto que tiene 5 nucleótidos acorte la fijación en aproximadamente 8,5 Angstroms. Se prevé que el resto que tiene 6 nucleótidos acorte la fijación en aproximadamente 10,2 Angstroms. Se prevé que el resto que tiene 7 nucleótidos acorte la fijación en aproximadamente 11,9 Angstroms. Se espera que el resto que tiene 8 nucleótidos acorte la fijación en aproximadamente 13,6 Angstroms. En consecuencia, los restos acortan la fijación en cantidades respectivas que están "separadas" entre sí en aproximadamente 1,7 Angstroms.

Tabla 2: Acortamiento diferencial de marcadores de 5-8 bases.

Dichos movimientos conformacionales de la fijación en respuesta a interacciones con restos unidos a nucleótidos sobre los que actúa una polimerasa pueden proporcionar señales que faciliten la identificación de diferentes nucleótidos a medida que la polimerasa añade dichos nucleótidos a un polinucleótido, p. ej., durante la secuenciación por síntesis. Las figs. 13A-13E ilustran esquemáticamente el movimiento de una fijación ilustrativa dentro de la abertura de un poro (p. ej., nanoporo) que responde a interacciones con restos ilustrativos de nucleótidos respectivos, tales como los restos ilustrados en las figs. 10A-10C. Obsérvese que, en las figs. 13A-13E, la polimerasa no está ilustrada específicamente, pero puede ubicarse adyacente al primer lado del poro de una manera análoga a la descrita anteriormente con referencia a la fig. 8A. Adicionalmente, en las figs. 13B-13E, el nucleótido sobre el que actúa la polimerasa no se ilustra específicamente, pero puede ubicarse dentro de la polimerasa de una manera análoga a la descrita anteriormente con referencia a la fig. 8A. Se entiende que la línea de puntos en las figs. 13B-13E representa partes del marcador alargado del nucleótido sobre el que se actúa que conectan el resto con el nucleótido. Adicionalmente, en las figs. 13A-13E, los circuitos de medición configurados para medir (p. ej., medir óptica o eléctricamente) los movimientos de la región indicadora dentro de la abertura del poro no se ilustran específicamente, pero se pueden configurar de una manera análoga a la descrita anteriormente con referencia a la fig. 2A o la fig. 2C. En una realización ilustrativa, el circuito de medición está configurado para aplicar una tensión a través del poro y para medir la corriente o el flujo a través de la abertura del poro.

La fig. 13A ilustra el poro y la fijación en ausencia de un acontecimiento, que puede denominarse su estado de equilibrio. La región indicadora, p. ej., uno o más restos abásicos, indicados como "X", reside dentro de la abertura del poro, p. ej., dentro de la constricción del poro. La fig. 14 es un gráfico de una señal ilustrativa que se puede generar durante las interacciones ilustradas en las figs. 13A-13E. Como se ilustra en la fig. 14, la señal (p. ej., corriente o flujo medido óptica o eléctricamente) entre los tiempos tü y t1 puede tener un primer valor (A) correspondiente a la ubicación de la región indicadora ilustrada en la fig. 13A. La fig. 13B ilustra una interacción entre un resto oligonucleotídico ilustrativo unido a un nucleótido "dA", sobre el que actúa la polimerasa, con un resto oligonucleotídico correspondiente en la fijación en el tiempo ti. En función de la ecuación (1), se anticipa que, en respuesta a la interacción, la fijación puede cambiar de configuración, p. ej., acortarse, de tal manera que provoca que la región indicadora "X" se mueva dentro de la abertura del poro aproximadamente 8,5 Angstroms hacia el primer lado del poro, p. ej., en la dirección de la polimerasa. Como se ilustra en la fig. 14, la señal (p. ej., corriente o flujo medido óptica o eléctricamente) entre los tiempos ti y t2 puede tener un segundo valor (B) correspondiente a la ubicación de la región indicadora ilustrada en la fig. 13B. Aproximadamente en el tiempo t2, la polimerasa escinde el marcador alargado del nucleótido dA sobre el que actúa la polimerasa, en respuesta a lo cual el resto (anteriormente) del nucleótido dA se disocia de la fijación, en respuesta a lo cual la región indicadora vuelve al estado ilustrado en la fig. 13A y la señal vuelve al valor (A) hasta que la polimerasa actúa sobre otro nucleótido. Obsérvese que los cambios de señal, p. ej., cambios de corriente o flujo, en la fig. 14 se ilustran como funciones escalonadas para simplificar, pero debe apreciarse que los cambios de corriente o flujo pueden tener formas más complejas basadas en la manera particular en la que la polimerasa actúa sobre el nucleótido y, por tanto, en la manera particular en que la región indicadora se mueve dentro de la abertura del poro. Adicionalmente, puede estar presente ruido en señales tal como las ilustradas en la fig. 14 y pueden manifestarse como picos transitorios (no mostrados).

La fig. 13C ilustra una interacción entre un resto oligonucleotídico ilustrativo unido a un nucleótido "dT", sobre el que actúa la polimerasa, con el resto oligonucleotídico correspondiente en la fijación en el tiempo t3. En función de la ecuación (1), se anticipa que, en respuesta a la interacción, la fijación se acortará de tal manera que provoca que la región indicadora "X" se mueva dentro de la abertura del poro aproximadamente 10,2 Angstroms hacia el primer lado del poro, p. ej., en la dirección de la polimerasa. Como se ilustra en la fig. 14, la señal (p. ej., corriente o flujo medido óptica o eléctricamente) entre los tiempos t3 y t4 puede tener un tercer valor (C) correspondiente a la ubicación de la región indicadora ilustrada en la fig. 13C. Aproximadamente en el tiempo t4, la polimerasa escinde el marcador alargado del nucleótido dT sobre el que actúa la polimerasa, en respuesta a lo cual el resto (anteriormente) del nucleótido dT se disocia de la fijación, en respuesta a lo cual la región indicadora vuelve al estado ilustrado en la fig.

13A y la señal vuelve al valor (A).

La fig. 13D ilustra una interacción entre un resto oligonucleotídico ilustrativo unido a un nucleótido "dC", sobre el que actúa la polimerasa, con el resto oligonucleotídico correspondiente en la fijación en el tiempo t5. En función de la ecuación (1), se anticipa que, en respuesta a la interacción, la fijación se acortará de tal manera que provoca que la región indicadora "X" se mueva dentro de la abertura del poro aproximadamente 11,9 Angstroms hacia el primer lado del poro, p. ej., en la dirección de la polimerasa. Como se ilustra en la fig. 14, la señal (p. ej., corriente o flujo medido óptica o eléctricamente) entre los tiempos t5 y ta puede tener un cuarto valor (D) correspondiente a la ubicación de la región indicadora ilustrada en la fig. 13D. Aproximadamente en el tiempo ta, la polimerasa escinde el marcador alargado del nucleótido dC sobre el que actúa la polimerasa, en respuesta a lo cual el resto (anteriormente) del nucleótido dC se disocia de la fijación, en respuesta a lo cual la región indicadora vuelve al estado ilustrado en la fig.

13A y la señal vuelve al valor (A).

La fig. 13E ilustra una interacción entre un resto oligonucleotídico ilustrativo unido a un nucleótido "dG", sobre el que actúa la polimerasa, con el resto oligonucleotídico correspondiente en la fijación en el tiempo t7. En función de la ecuación (1), se anticipa que, en respuesta a la interacción, la fijación se acortará de tal manera que provoca que la región indicadora "X" se mueva dentro de la abertura del poro aproximadamente 13,6 Angstroms hacia el primer lado del poro, p. ej., en la dirección de la polimerasa. Como se ilustra en la fig. 14, la señal (p. ej., corriente o flujo medido óptica o eléctricamente) comenzando en el tiempo t7 puede tener un quinto valor (E) correspondiente a la ubicación de la región indicadora ilustrada en la fig. 13E. Aproximadamente en el tiempo te, la polimerasa escinde el marcador alargado del nucleótido dG sobre el que actúa la polimerasa, en respuesta a lo cual el resto (anteriormente) del nucleótido dC se disocia de la fijación, en respuesta a lo cual la región indicadora vuelve al estado ilustrado en la fig.

13A y la señal vuelve al valor (A) (no ilustrado específicamente en la fig. 14).

La tabla 3 enumera restos ilustrativos que se pueden incluir en el marcador alargado de cada nucleótido y que interactúa con un resto correspondiente a lo largo del cuerpo alargado de la fijación, p. ej., los restos ilustrados en las figs. 13A-13E. La tabla 3 también enumera el número de nucleótidos en el resto que hibridan ("hibridadas") con el resto correspondiente de la fijación. La tabla 3 también enumera la magnitud del cambio conformacional resultante de la fijación, p. ej., la cantidad en que se prevé que se acorte la fijación, en Angstroms. La tabla 3 también enumera la longitud diferencial esperada de la fijación con respecto al resto ilustrativo de "dA". Suponiendo que el ADN monocatenario tiene una separación de 5 Angstroms entre nucleótidos, la longitud de acortamiento equivalente medida con respecto a ADN monocatenario también se enumera en la tabla 3, así como la distancia diferencial entre nucleótidos con respecto a "dA", medida en nucleótidos ("bases delta").

Tabla 3

Adicionalmente, obsérvese que, debido a que los restos de los nucleótidos sobre los que se actúa pueden ser de diferentes longitudes, p. ej., que varían entre 5 y 8 nucleótidos, sus Tm pueden diferir algo entre sí. Se espera que la Tm y la delta G de un resto dado influya en la velocidad a la que el resto del nucleótido se disocia del resto de la fijación (también denominada velocidad de disociación). Dicha velocidad, o duración temporal, se puede utilizar potencialmente como otra característica para determinar la identidad correcta de cada nucleótido. Por ejemplo, una señal que tiene un periodo de tiempo correspondiente a la diferencia entre t1 y t2 ilustrado en la fig. 14 puede correlacionarse con la polimerasa que actúa sobre dA de una manera análoga a la ilustrada en la fig. 13B, una señal que tiene un periodo de tiempo correspondiente a la diferencia entre t3 y t4 puede correlacionarse con la polimerasa que actúa sobre dT de una manera análoga a la ilustrada en la fig. 13C, una señal que tiene un periodo de tiempo correspondiente a la diferencia entre t5 y ta puede correlacionarse con la polimerasa que actúa sobre dC de una manera análoga a la ilustrada en la fig. 13D o una señal que tiene un periodo de tiempo correspondiente a la diferencia entre t7 y ts se pueden correlacionar con la acción de la polimerasa sobre dG de una manera análoga a la ilustrada en la fig. 13E.

Obsérvese que la doble cadena formada entre el resto del marcador alargado y el resto de la fijación puede estar en equilibrio termodinámico. Debería apreciarse que una doble cadena en equilibrio termodinámico puede tener velocidades de activación y desactivación que se basan en la longitud y el carácter de la secuencia de ácido nucleico, y que la doble cadena puede disociarse de vez en cuando. Puede ser útil que el tiempo medio pasado en el estado de doble cadena (la inversa de la tasa de inactivación) sea más corto que la vida útil promedio del complejo de polimerasa-nucleótido durante el acontecimiento de incorporación, de modo que después de la incorporación y liberación del marcador del nucleótido, el marcador se difundirá y no bloqueará los marcadores de nucleótidos entrantes. La velocidad de activación efectiva puede ser lo suficientemente alta para dar lugar a una nueva unión relativamente rápida en comparación con la vida útil del complejo de polimerasa-nucleótido, de modo que se detecten acontecimientos de incorporación y de modo que la doble cadena se reforme después de cualquier acontecimiento de disociación que se produzca durante la incorporación de nucleótidos. La velocidad de activación será de pseudoprimer orden en la concentración del marcador alargado del nucleótido, lo que puede considerarse que convierte dicha disposición en un sensor estocástico de la concentración del marcador alargado. Obsérvese que los marcadores alargados de difusión libre pueden tener una concentración relativamente baja (p. ej., de 10 nM a 100 nM, o de 100 nM a 250 nM, o de 250 nM a 500 nM o de 500 nM a 1 uM), mientras que el marcador alargado del nucleótido sobre el que se actúa tendrá efectivamente una concentración relativamente alta porque se une al nucleótido que se mantiene en su lugar por la polimerasa durante la incorporación y, por tanto, no puede difundirse libremente.

En consecuencia, debería apreciarse que la región indicadora de una de las presentes fijaciones es móvil (p. ej., móvil de forma traslacional) dentro de una abertura en diferentes cantidades o durante diferentes periodos de tiempo, o ambos, en respuesta a la acción de la polimerasa sobre diferentes nucleótidos. Dichos nucleótidos pueden identificarse individualmente en función de una magnitud o duración de tiempo medida (p. ej., medida óptica o eléctricamente), o ambos, de una señal, p. ej., de una corriente o flujo a través de la abertura. Por ejemplo, el primer y segundo nucleótidos pueden unirse a restos que interactúan con la fijación de manera diferente entre sí. Por ejemplo, la fijación puede incluir un primer oligonucleótido y el resto unido al primer nucleótido puede incluir un segundo oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido para mover la región indicadora hacia el primer lado en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer oligonucleótido, p. ej., para acortar la fijación en una primera cantidad. El resto unido al segundo nucleótido puede incluir un tercer oligonucleótido que hibrida con el primer oligonucleótido para mover la región indicadora hacia el primer lado en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el segundo oligonucleótido, p. ej., para acortar la fijación en una segunda cantidad. El primer y segundo nucleótidos pueden ser distinguibles entre sí, p. ej., el primer nucleótido puede identificarse individualmente en función de una magnitud o duración de tiempo medida (p. ej., medida óptica o eléctricamente), o ambos, de una primera señal, p. ej., de una primera corriente o flujo a través de la constricción, y el segundo nucleótido puede identificarse individualmente basándose en una magnitud o duración de tiempo medida (p. ej., medida óptica o eléctricamente), o ambas, de una segunda señal, p. ej., de una segunda corriente o flujo a través de la constricción.

En las realizaciones ilustrativas descritas anteriormente con referencia a las figs. 8A-14, el cuerpo alargado de la fijación y el marcador alargado del nucleótido sobre el que actúa la polimerasa, respectivamente, pueden incluir, o pueden incluso consistir únicamente en, ADN monocatenario (ADNmc). Sin embargo, debe apreciarse que se pueden utilizar otros tipos de moléculas de manera adecuada. Por ejemplo, se puede utilizar cualquier fijación que incluya un cuerpo alargado que tenga una o más de las siguientes características y, opcionalmente, incluya todas las siguientes características:

1. El cuerpo alargado puede incluir una región que interactúa con restos unidos respectivamente a diferentes tipos de nucleótidos de manera que los restos sean distinguibles entre sí, p. ej., mediante medición de corriente o flujo a través de la constricción del poro.

2. El cuerpo alargado puede incluir una región con carga que provoca que se extraiga a través de la constricción del poro en respuesta a una tensión aplicada. El cuerpo alargado se puede mantener tenso en dicha configuración. Esta región con carga puede ubicarse adyacente a la constricción del poro para dar lugar a una fuerza neta.

3. El cuerpo alargado incluye una región indicadora que, cuando se mueve a través de la abertura del poro, p. ej., a través de la constricción del poro, produce una señal claramente distinguible. La región indicadora y la región con carga pueden ser iguales entre sí; es decir, una sola región puede ser tanto una región indicadora como una región con carga.

Un material ilustrativo que se puede incluir en el cuerpo alargado de la fijación o el marcador alargado del nucleótido sobre el que se actúa, o ambos, es un polímero. Los polímeros incluyen polímeros biológicos y polímeros sintéticos. Los polímeros biológicos ilustrativos que son adecuados para su uso en el cuerpo alargado de la fijación o el marcador alargado del nucleótido sobre el que se actúa, o ambos, incluyen polinucleótidos, polipéptidos, polisacáridos, análogos de polinucleótidos y análogos de polipéptidos. Los polinucleótidos ilustrativos y análogos de polinucleótidos adecuados para su uso en el cuerpo alargado de la fijación o el marcador alargado del nucleótido sobre el que se actúa, o ambos, incluyen ADN, ADN enantiomérico, ARN, PNA (ácido nucleico peptídico), morfolinos y LNA (ácido nucleico bloqueado). Los polipéptidos sintéticos ilustrativos pueden incluir aminoácidos con carga así como restos hidrófilos y neutros. En algunas realizaciones, la fijación no es un ácido nucleico o no incluye nucleótidos. Por ejemplo, una fijación puede excluir nucleótidos de origen natural, análogos de nucleótidos de origen no natural o ambos. Uno o más de los nucleótidos expuestos en el presente documento o conocidos de otro modo en la técnica pueden excluirse de una fijación.

Otros polímeros ilustrativos que pueden ser adecuados para su uso en el cuerpo alargado de la fijación o el marcador alargado del nucleótido sobre el que se actúa, o ambos, incluyen polímeros sintéticos tales como PEG (polietilenglicol), PPG (polipropilenglicol), PVA (alcohol polivinílico), PE (polietileno), LDPE (polietileno de baja densidad), HDPE (polietileno de alta densidad), polipropileno, PVC (cloruro de polivinilo), PS (poliestireno), NAILON (poliamidas alifáticas), TEFLON® (tetrafluoroetileno), poliuretanos termoplásticos, polialdehídos, poliolefinas, poli(óxidos de etileno), poli(ésteres de ácido w-alquenoico), poli(metacrilatos de alquilo) y otros conectores químicos y biológicos poliméricos tales como los descritos en Hermanson, mencionado anteriormente. Adicionalmente, como se ha señalado anteriormente, los restos del cuerpo alargado de la fijación o el marcador alargado del nucleótido sobre el que se actúa, o ambos, pueden ser secuencias de nucleótidos cortas individuales que interactúan entre sí. Estos restos pueden no interactuar con la polimerasa tales como marcadores de ARN, ^p N^a o LNA, morfolinos o ADN enantiomérico, por ejemplo. No es necesario que el resto esté formado por el mismo polímero que otras partes del cuerpo alargado de la fijación o el marcador alargado del nucleótido sobre el que se actúa. Los marcadores alargados se pueden unir fácilmente al fosfato gamma de nucleótidos, como se conoce bien en la técnica. Adicionalmente, en una realización ilustrativa, se pueden usar las bases isoG e isoC en los marcadores alargados de nucleótidos o en la fijación, o ambos, para inhibir la hibridación de los marcadores alargados o la fijación con el ADN que se está secuenciando. Adicionalmente, se pueden usar otros esquemas para inducir una estructura secundaria en la fijación para acortarla, tal como una horquilla.

Adicionalmente, obsérvese que la fijación puede incluir múltiples restos, cada uno de los cuales interactúa respectivamente con un resto unido a un tipo dado de nucleótido. La interacción entre el resto del nucleótido con el resto correspondiente de la fijación puede mover la región indicadora de la fijación en una cantidad correspondiente que facilita la identificación del nucleótido correspondiente a través de una señal, p. ej., a través de una corriente o flujo a través de la abertura del poro.

En una realización ilustrativa, no limitante, el poro incluye MspA, que puede proporcionar una separación satisfactoria de corrientes o flujos específicos de nucleótidos, p. ej., una separación 3,5 veces mayor de corrientes o flujos específicos de nucleótidos en comparación con la alfa-hemolisina. Sin embargo, debe apreciarse que la alfahemolisina u otros tipos de poros se pueden utilizar adecuadamente con las presentes composiciones, sistemas y métodos.

Adicionalmente, obsérvese que en realizaciones en las que se aplica una tensión a través del poro y se miden movimientos de la región indicadora (p. ej., se miden óptica o eléctricamente) a través de la corriente o el flujo a través del poro, la tensión se puede aplicar adecuadamente utilizando corriente continua (CC) o corriente alterna (CA). La corriente CA puede ayudar a prolongar la vida útil del electrodo, ayudar a expulsar los marcadores alargados escindidos del poro si los marcadores se atascan o pueden realizar parte del trabajo de tirar de la fijación contra la fuerza de la tensión aplicada. Adicionalmente, obsérvese que se puede usar una fijación con carga positiva con un sesgo inverso en el poro para inhibir que el ADN que se está secuenciando sea atraído hacia el poro. Adicionalmente, obsérvese que una fijación con carga negativa se puede enhebrar en sentido inverso a través del poro (p. ej., con la región de cabeza anclada al segundo lado del poro y la polimerasa dispuesta adyacente al primer lado del poro) con un sesgo inverso con marcadores alargados con carga negativa, para inhibir que los marcadores alargados se atasquen en la constricción e inhibir que el ADN que se está secuenciando entre en el poro.

Adicionalmente, se puede emplear un método de detección estocástica. En esta disposición, se puede usar una corriente CA para mover la doble cadena hibridada adyacente a la constricción, tal como se describe con mayor detalle a continuación con referencia a las figs. 18A-18E.

Métodos y composiciones ilustrativos para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido Debe entenderse que se pueden utilizar métodos y composiciones alternativos para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido. Por ejemplo, la fig. 15 ilustra un método alternativo para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido utilizando una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo. Por ejemplo, una composición puede incluir un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados; y una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas. La región de cabeza puede estar anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo y el cuerpo alargado puede incluir un resto. Puede disponerse una polimerasa adyacente al primer lado del nanoporo. La composición también incluye un primer nucleótido que incluye un primer marcador alargado. El primer marcador alargado incluye un primer resto que interactúa con el resto de la fijación en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido.

Por ejemplo, el método 1500 ilustrado en la fig. 15 incluye proporcionar una composición que incluye un nanoporo, una fijación permanente y una polimerasa dispuesta adyacente al nanoporo (etapa 1501). Por ejemplo, la fig. 16 ilustra esquemáticamente una composición ilustrativa que incluye una fijación anclada a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un nucleótido. En la realización ilustrativa ilustrada en la fig. 16, la composición puede incluir el nanoporo 1600, la fijación 1610 permanente y la polimerasa 1650. El nanoporo 1600 incluye el primer lado 1601, el segundo lado 1602, la abertura 1603 que se extiende a través de los lados 1601 y 1602 y opcionalmente también incluye la constricción 1604. La fijación 1610 permanente incluye la región de cabeza 1611, la región de cola 1612 y el cuerpo alargado 1613 dispuesto entre ellos. La polimerasa 1650 está dispuesta adyacente al primer lado 1601 del nanoporo 1600. Por ejemplo, la polimerasa 1650 puede estar en contacto con el primer lado 1601 del nanoporo 1600 y, opcionalmente, puede anclarse a o adyacente al primer lado del nanoporo 1600 mediante cualquier enlace químico adecuado, interacción proteína-proteína o cualquier otra unión adecuada que normalmente sea irreversible. En la realización ilustrada en la fig. 16, la región de cabeza 1611 de la fijación 1610 está unida a, p. ej., anclada a, el primer lado 1601 del nanoporo 1600, mediante cualquier enlace químico adecuado, interacción proteína-proteína o cualquier otra unión adecuada que normalmente sea irreversible. La región de cabeza 1611 se puede unir a cualquier parte adecuada del nanoporo 1600 que coloque el marcador alargado 1613 lo suficientemente cerca de la polimerasa 1650 para interactuar con los marcadores alargados de los nucleótidos respectivos sobre los que puede actuar la polimerasa 1650. Por ejemplo, el nucleótido 1630 puede incluir un marcador alargado 1631 que incluye el resto 1632 que interactúa con la fijación 1610. En una realización ilustrativa, el marcador alargado 1613 de la fijación 1610 puede incluir un resto 1615 con el que puede interactuar el resto 1632 del marcador. La región de cola 1612 puede extenderse libremente hacia el segundo lado del nanoporo y puede disponerse en el primer lado del nanoporo, tal como se describe a continuación con referencia a las figs. 17A-17B o puede disponerse en o más allá del segundo lado del nanoporo, tal como se ha descrito anteriormente con referencia a las figs. 7A-7B o puede ser móvil entre el primer y segundo lados del nanoporo, tal como se describe a continuación con referencia a las figs. 19-20B. Opcionalmente, la región de cola 1612 puede unirse a otro miembro de una manera tal como la descrita con referencia a las figs. 1I y 1M, pudiendo dicho otro miembro disponerse opcionalmente dentro de la abertura 1603. Obsérvese que la polimerasa 1650 o el nucleótido 1630, o ambos, puede ser, aunque no necesariamente, considerado parte de la composición inventiva, pero, en cambio, se puede considerar que está en contacto con una composición que incluye el nanoporo 1600 y la fijación 1610 permanente. Haciendo referencia de nuevo a la fig. 15, el método 1500 incluye actuar sobre un nucleótido con la polimerasa (etapa 1502). Por ejemplo, la fig. 16 ilustra esquemáticamente la unión del nucleótido 1630 por la polimerasa 1650, pero debe entenderse que la polimerasa 1650 puede actuar sobre el nucleótido de diversas formas, p. ej., añadiendo el nucleótido 1630 a un polinucleótido, escindiendo el nucleótido 1630 de un polinucleótido existente o tomando muestras del nucleótido 1630, p. ej., interactuando transitoriamente con el nucleótido 1630 sin unirse a él. El método 1500 ilustrado en la fig. 15 también incluye la interacción de un resto del nucleótido con la fijación (etapa 1503). Por ejemplo, en la realización ilustrada en la fig. 16, la polimerasa 1650 que actúa sobre el nucleótido 1630 puede llevar el resto 1632 del nucleótido 1630 a una proximidad suficientemente cercana al resto 1615 para que los restos interactúen entre sí, p. ej., se unan entre sí. Dicha interacción puede ser reversible, p. ej., puede incluir la formación de un enlace de hidrógeno, enlace iónico, enlace dipolo-dipolo, fuerzas de dispersión de London, enlace covalente reversible o cualquier combinación adecuada de los mismos.

Haciendo referencia de nuevo a la fig. 15, el método 1500 también puede incluir detectar la interacción del resto con la fijación de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, el marcador alargado del nucleótido puede incluir una región indicadora y el método 1500 puede incluir detectar la presencia de la región indicadora dentro de la abertura del nanoporo (etapa 1504). Por ejemplo, las figs. 17A-17B ilustran esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un nucleótido que incluye un marcador alargado que incluye una región indicadora. Como se ilustra en la fig. 17A, la composición puede incluir el nanoporo 1700, incluyendo el primer lado 1701, el segundo lado 1702, la abertura 1703 que se extiende a través del primer y segundo lados y la constricción 1704 opcional; la fijación permanente 1710 que incluye la región de cabeza 1711 anclada al primer lado 1701 del nanoporo 1700, la región de cola 1712 dispuesta en el primer lado 1702 del nanoporo 1700 y el cuerpo alargado 1713 que incluye el resto 1715 pero carece de una región indicadora; y el nucleótido 1730 que incluye el marcador alargado 1731 que incluye el resto 1732 y la región indicadora 1734.

Como se ilustra en la fig. 17B, una interacción entre el resto 1732 del nucleótido 1730 y el resto 1715 de la fijación 1710 puede disponer la región indicadora 1734 dentro de la abertura 1703. Debe apreciarse que la disposición de la región indicadora 1734 dentro de la abertura 1703 puede ser detectable de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, la composición puede estar en comunicación operativa con un circuito de medición tal como se ha descrito anteriormente con referencia a la fig. 2A o la fig. 2C. El circuito de medición puede configurarse para detectar la disposición de la región indicadora 1734 dentro de la abertura 1703. En una realización ilustrativa, el nanoporo 1700, la fijación 1710, la polimerasa 1750 y el nucleótido 1730 se pueden sumergir en un líquido conductor, p. ej., una solución salina acuosa. Un circuito de medición configurado de manera análoga al circuito 230 de medición ilustrado en la fig. 2A o el circuito de medición 240 ilustrado en la fig. 2C puede estar en comunicación con el primer y segundo electrodos y puede configurarse para aplicar una tensión entre esos electrodos para aplicar una tensión a través del nanoporo 1700. El circuito de medición puede configurarse además para usar los electrodos para medir la magnitud de una corriente o flujo a través de la abertura 1703. La región indicadora 1734 puede tener una propiedad eléctrica o de bloqueo de flujo diferente a algunas o todas las demás regiones del marcador alargado 1731. Por ejemplo, la región indicadora 1734 puede incluir una carga electrostática, mientras que algunas o todas las demás regiones del marcador alargado 1731 pueden incluir una carga electrostática diferente o pueden no tener carga (p. ej., pueden ser eléctricamente neutras). O, por ejemplo, la región indicadora 1734 puede no tener carga, mientras que algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado 1731 pueden incluir una carga electrostática. La magnitud de la corriente o el flujo a través de la abertura 1703 puede cambiar de manera medible en respuesta a la disposición de la región indicadora 1734 dentro de la abertura 1703 y el periodo de tiempo para dicho cambio medible en la corriente o el flujo puede basarse en la duración de la interacción entre los restos 1715 y 1732, que a su vez puede basarse en la duración de la acción de la polimerasa 1750 sobre el nucleótido 1730. En un ejemplo no limitante, ilustrativo, el cuerpo alargado 1731 incluye un polinucleótido que incluye uno o más nucleótidos abásicos que definen la región indicadora 1734.

En una realización ilustrativa, la formación de una doble cadena se puede supervisar utilizando secuenciación interrumpida de doble cadena tal como se describe en Derrington et al., "Nanopore DNA sequencing with MspA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107: 16060-16065 (2010), cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia. El presente sistema puede utilizar una tensión de conducción de CA cuyo periodo de tiempo es del mismo orden de magnitud que el tiempo hasta la formación de doble cadena, que se puede esperar que sea significativamente más corto que el acontecimiento de incorporación catalítica de polimerasa que se está midiendo. Véase también la publicación PCT n.° WO2011/106459 de Gundlach et al., cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia.

La acción de la polimerasa 1750 sobre el nucleótido 1730 puede ser identificable individualmente en función de una magnitud o duración temporal medida (p. ej., medida óptica o eléctricamente), o ambas, de una señal generada por dicho sistema. Por ejemplo, la acción de la polimerasa 1750 sobre el nucleótido 1730 puede provocar interacción entre los restos 1715 y 1732, lo que a su vez provoca que la región indicadora 1734 se disponga en una primera ubicación dentro de la abertura 1703 y la presencia de la región indicadora 1734 en la primera ubicación provoca que la señal tenga una primera magnitud. Como tal, la señal que tiene la primera magnitud se correlaciona con la aparición de la acción de la polimerasa 1750 sobre el nucleótido 1730.

Obsérvese que, en algunas realizaciones, las longitudes respectivas del cuerpo alargado 1713 y el marcador alargado 1731, las ubicaciones respectivas de los restos 1715 y 1732 y la ubicación respectiva de la región indicadora 1734 se seleccionan conjuntamente para inhibir la aplicación de fuerza al nucleótido 1730 mientras la polimerasa 1750 actúa sobre el nucleótido, y de este modo inhibir o evitar que dicha fuerza modifique el rendimiento de la polimerasa. En una realización ilustrativa, la interacción entre el resto 1715 y el resto 1713 forma una doble cadena. La longitud del cuerpo alargado 1713 se puede seleccionar de modo que el cuerpo alargado no se extienda sustancialmente a través de la ubicación en la que se va a disponer la región indicadora 1734. La longitud del marcador alargado 1731 se puede seleccionar para que se extienda a través de la ubicación en la que se va a disponer la región indicadora, proporcionando al mismo tiempo una holgura adicional de modo que no es necesario que el marcador alargado 1731 se tense para disponer la región indicadora 1734 en la ubicación. En algunas realizaciones, la ubicación respectiva del resto 1715 a lo largo del cuerpo alargado 1713 de la fijación 1710 y la ubicación respectiva del resto 1732 a lo largo del marcador alargado 1731 del nucleótido 1730 se seleccionan conjuntamente para proporcionar la holgura adicional en el marcador alargado 1731 en una ubicación entre la doble cadena de 1715, 1732 y la polimerasa 1750. En consecuencia, el anclaje de la región de cabeza 1711 al poro 1700 puede inhibir el movimiento de la doble cadena 1715, 1732 a través de la abertura 1703 y puede absorber fuerzas que de otro modo pueden haberse aplicado al nucleótido 1730 mediante el marcador alargado 1731.

Adicionalmente, la región indicadora 1734 puede disponerse en una ubicación adecuada a lo largo del cuerpo alargado 1731 de manera que esté dispuesta en una ubicación adecuada dentro de la abertura 1730 para facilitar la detección de la región indicadora cuando los restos 1715 y 1732 interactúan entre sí. En una realización ilustrativa, la región indicadora 1734 está dispuesta en una ubicación adecuada a lo largo del cuerpo alargado 1731 para que esté dispuesta dentro de, o adyacente a, la constricción 1704 del nanoporo 1700 cuando los restos 1715 y 1732 interactúan entre sí en respuesta a la acción de la polimerasa 1750.

Pueden usarse adecuadamente otros métodos para detectar la acción de una polimerasa 1750 sobre un nucleótido. Por ejemplo, como alternativa, el método 1500 puede incluir cambiar una tensión aplicada a través de la abertura del nanoporo (etapa 1505), disponer una región indicadora de una fijación en una ubicación dentro de la abertura en respuesta al cambio en la tensión aplicada (etapa 1506) y detectar la presencia de la región indicadora de la fijación en la ubicación dentro de la abertura (etapa 1507). Por ejemplo, las figs. 18A-18D ilustran esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un nucleótido utilizando una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo que responde a un cambio en el potencial eléctrico a través del nanoporo, y la fig. 18E ilustra una señal ilustrativa que se puede generar durante el uso de dicha composición.

La composición ilustrada en la fig. 18A incluye el nanoporo 1800 que incluye el primer lado 1801, el segundo lado 1802, la abertura 1803 que se extiende a través del primer y segundo lados y la constricción 1804 dispuesta entre el primer y segundo lados; la fijación permanente 1810 que incluye una región de cabeza (no marcada específicamente) anclada al primer lado 1801 del nanoporo 1800, una región de cola (no marcada específicamente) que es móvil entre el primer lado 1801 y el segundo lado 1802 del nanoporo 1800, y un cuerpo alargado (no marcado específicamente) que incluye la región indicadora 1814 y el resto 1815; y el nucleótido 1830 que incluye un marcador alargado (no marcado específicamente) que incluye el resto 1832 pero que carece de una región indicadora. Como se ilustra en la fig. 18A, una interacción entre el resto 1832 del nucleótido 1830 y el resto 1815 de la fijación 1810 puede disponer la región indicadora 1814 en una ubicación predeterminada con respecto al resto 1832. Opcionalmente, se puede proporcionar más de una región indicadora, p. ej., al menos dos, tres, cuatro, cinco o más de cinco regiones indicadoras. Adicionalmente, el resto 1815 se puede ubicar en cualquier posición adecuada a lo largo del marcador alargado 1813, p. ej., se puede ubicar entre la región de cabeza 1811 y la región indicadora 1814 y adyacente a la región indicadora 1814 tal como se ilustra en la fig. 18A, o puede ser adyacente a la región de cabeza 1811, adyacente a la región de cola 1812 o entre la región de cola 1812 y la región indicadora 1814.

Debe apreciarse que la disposición de la región indicadora 1814 en la ubicación predeterminada con respecto al resto 1832 puede ser detectable de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, la composición puede estar en comunicación operativa con un circuito de medición tal como se ha descrito anteriormente con referencia a la fig. 2A o la fig. 2C. El circuito de medición puede configurarse para detectar la posición de la región indicadora 1814 en relación con el resto 1832. En una realización ilustrativa, el nanoporo 1800, la fijación 1810, la polimerasa 1850 y el nucleótido 1830 se pueden sumergir en un líquido conductor, p. ej., una solución salina acuosa. Un circuito de medición configurado de manera análoga al circuito 230 de medición ilustrado en la fig. 2A o el circuito 240 de medición ilustrado en la fig. 2C puede estar en comunicación con el primer y segundo electrodos y puede configurarse para aplicar una primera tensión entre esos electrodos para aplicar una tensión a través del nanoporo 1800, representado por los signos "+" y "-" ilustrados en la fig. 18A, y usar los electrodos para medir la magnitud de una corriente o flujo a través de la abertura 1803 a la primera tensión. La parte de la fig. 18^e inmediatamente debajo de la fig. 18A ilustra una corriente o flujo ilustrativo a través de la abertura 1803 a la primera tensión. La región indicadora 1814 puede tener una propiedad de bloqueo eléctrico o de flujo diferente a algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado de la fijación (no marcada específicamente). Por ejemplo, la región indicadora 1814 puede incluir una carga electrostática, mientras que algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado pueden incluir una carga electrostática diferente o pueden no tener carga (p. ej., pueden ser eléctricamente neutras). O, por ejemplo, la región indicadora 1814 puede no tener carga, mientras que algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado pueden incluir una carga electrostática. En un ejemplo no limitante, ilustrativo, el cuerpo alargado de la fijación incluye un polinucleótido que incluye uno o más nucleótidos abásicos que definen la región indicadora 1814. La magnitud de la corriente o del flujo a través de la abertura 1803 puede cambiar de forma medible en respuesta a la ubicación relativa de la región indicadora 1814 dentro de la abertura 1803 y dicha ubicación relativa puede basarse en la tensión aplicada y en la ubicación de la región indicadora 1814 con respecto al resto 1832, que a su vez puede basarse en la acción de la polimerasa 1850 sobre el nucleótido 1830.

Más específicamente, el circuito de medición se puede configurar además para cambiar la tensión aplicada a través del nanoporo 1800 a una segunda tensión, p. ej., invirtiendo la tensión aplicada tal como se representa por la inversión de los signos "+" y "-" tal como se ilustra en la fig. 18B. Dicho cambio en la tensión aplicada puede provocar el movimiento de los restos 1815, 1832 que interactúan dentro de la abertura 1803 del nanoporo 1800. Por ejemplo, como se ilustra en la fig. 18B, el cambio en la tensión aplicada puede mover los restos 1815, 1832 que interactúan adyacentes a la constricción 1804 y puede disponer la región indicadora 1814 adyacente a o dentro de la constricción 1804. El circuito de medición puede configurarse para usar los electrodos para medir la magnitud de una corriente o flujo a través de la abertura 1803 a la segunda tensión. La parte de la fig. 18E inmediatamente debajo de la fig. 18B ilustra una corriente o flujo ilustrativo a través de la abertura 1803 a la segunda tensión. Puede verse que la corriente o flujo a la primera tensión es diferente de la corriente o flujo a la segunda tensión, y dicha corriente o flujo puede basarse en la segundo tensión y en la ubicación de la región indicadora 1814 con respecto al resto 1832, que a su vez puede basarse en la acción de la polimerasa 1850 sobre el nucleótido 1830.

La acción de la polimerasa 1850 sobre el nucleótido 1830 puede ser identificable individualmente en función de una magnitud o duración temporal medida (p. ej., medida óptica o eléctricamente), o ambas, de una señal generada por dicho sistema. Por ejemplo, la acción de la polimerasa 1850 sobre el nucleótido 1830 puede provocar interacción entre los restos 1815 y 1832, lo que a su vez provoca que la región indicadora 1814 se disponga en una primera ubicación con respecto al resto 1832, y la presencia de la región indicadora 1814 en la primera ubicación provoca que la señal, p. ej., corriente o flujo a través de la abertura 1803, tenga una primera magnitud. Como tal, la señal que tiene la primera magnitud se correlaciona con la aparición de la acción de la polimerasa 1850 sobre el nucleótido 1830. Obsérvese que una doble cadena formada entre el resto 1815 y el resto 1832 puede ser lo suficientemente grande para inhibir el movimiento de la doble cadena a través de la constricción, p. ej., a la segunda tensión.

Como se ilustra en la fig. 18C, en algunas realizaciones, la aplicación continuada de la segunda tensión puede provocar que el resto 1815 se disocie del resto 1832. Se puede considerar que dicha disociación "interrumpe" una doble cadena formada entre el resto 1815 y el resto 1832. En algunas realizaciones, la región indicadora 1814 o el resto 1815, o ambos, pueden moverse a través de la constricción 1804 de modo que queden dispuestos en el segundo lado 1802 del nanoporo 1800. La parte de la fig. 18E inmediatamente debajo de la fig. 18C ilustra una corriente o flujo ilustrativo a través de la abertura 1803 a la segunda tensión, después de la disociación del resto 1815 del resto 1832. El resto 1832 se puede configurar para que permanezca dispuesto en el primer lado del nanoporo 1800 incluso si el resto 1815 se dispone en el segundo lado del nanoporo 1800, para inhibir temporalmente la interacción entre los restos 1815 y 1832. Como se ilustra en la fig. 18D, después de dicha disociación, la tensión aplicada a través de la abertura 1803 se puede cambiar de nuevo, p. ej., se puede volver a cambiar a la primera tensión, en respuesta a lo cual, los restos 1815 y 1832 pueden interactuar entre sí. La parte de la fig. 18E inmediatamente debajo de la fig. 18D ilustra una corriente o flujo ilustrativo a través de la abertura 1803 a la primera tensión, después de la interacción del resto 1815 del resto 1832.

Obsérvese que, en algunas realizaciones, las longitudes respectivas del cuerpo alargado de la fijación y el marcador alargado del nucleótido, las ubicaciones respectivas de los restos 1815 y 1832 y la ubicación respectiva de la región indicadora 1814 se seleccionan conjuntamente para inhibir la aplicación de fuerza al nucleótido 1830 mientras la polimerasa 1850 actúa sobre el nucleótido, y de este modo inhibir o evitar que dicha fuerza modifique el rendimiento de la polimerasa. En una realización ilustrativa, la interacción entre el resto 1815 y el resto 1832 forma una doble cadena. La longitud del cuerpo alargado de la fijación, y la ubicación del resto 1815 a lo largo del cuerpo alargado, se pueden seleccionar conjuntamente de modo que el resto 1815 se pueda extender a través de la constricción 1804 en respuesta a una tensión aplicada adecuada, p. ej., para provocar la disociación entre el resto 1815 y el resto 1832. La longitud del marcador alargado del nucleótido y la ubicación del resto 1832 a lo largo del marcador alargado, pueden seleccionarse conjuntamente para proporcionar una holgura adicional de modo que no sea necesario tensar el marcador alargado para disponer la región indicadora 1814 adyacente a la constricción 1804 a la segunda tensión aplicada. El tamaño de la doble cadena 1815, 1832 puede inhibir el movimiento de la doble cadena a través de la constricción 1804 y puede proteger el nucleótido de las fuerzas que, de otro modo, podrían haberse aplicado al nucleótido 1830 mediante el marcador alargado 1831. Adicionalmente, las ubicaciones relativas de la región indicadora 1814 y las fracciones 1815 y 1832 se pueden seleccionar conjuntamente para disponer la región indicadora 1814 en una ubicación adecuada en relación con la constricción 1804 a la segunda tensión para facilitar la detección de la región indicadora cuando los restos 1815 y 1832 interactúan entre sí. En una realización ilustrativa, la región indicadora 1814 está dispuesta en una ubicación adecuada a lo largo del cuerpo alargado 1831 para que esté dispuesta dentro de, o adyacente a, la constricción 1804 del nanoporo 1800 cuando los restos 1815 y 1832 interactúan entre sí en respuesta a la acción de la polimerasa 1850.

Como otro método alternativo más para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido, el método 1500 puede incluir, como alternativa, detectar el movimiento de una región indicadora de una fijación dentro de una abertura (etapa 1508). Se han descrito además anteriormente composiciones ilustrativas para detectar el movimiento de una región indicadora de una fijación en asociación con un nucleótido que actúa sobre una polimerasa con referencia a las figs. 7A-14.

Obsérvese que después de cualquiera de las etapas 1507, 1507 o 1508, el método 1500 puede incluir además liberar el resto del nucleótido de la fijación, de una manera análoga a la descrita anteriormente con referencia a las figs. 7A-14 (etapa no ilustrada específicamente en la fig. 15). Adicionalmente, como se describe con mayor detalle a continuación con referencia a las figs. 19A-20B o anteriormente con referencia a las figs. 7A-14, las presentes composiciones y métodos pueden usarse para detectar individualmente la acción de polimerasas sobre diferentes nucleótidos.

Secuenciación por síntesis usando métodos y composiciones ilustrativos basados en la detección de la acción de las polimerasas sobre los nucleótidos

Debe apreciarse que el método 1500 ilustrado en la fig. 15 se puede utilizar adecuadamente para detectar la acción de una polimerasa sobre cualquier tipo de nucleótido que tenga un resto adecuado unido al mismo. En realizaciones ilustrativas descritas a continuación con referencia a las figs. 18-22F, el método 1500 puede usarse para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido y el uso del mismo para secuenciar un primer polinucleótido sintetizando un segundo polinucleótido que es complementario del primer nucleótido, p. ej., utilizando "secuenciación por síntesis" (SBS).

Las figs. 19A-19B ilustran esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un nucleótido que incluye un marcador alargado que incluye una región indicadora. El nanoporo incluye el poro 1905 biológico, que se puede disponer en una barrera (no ilustrada específicamente), p. ej., una membrana de origen biológico tal como una bicapa lipídica o una membrana de estado sólido. El poro 1905 biológico incluye la abertura 1903 y la constricción 1904. La fijación permanente incluye la región de cabeza 1911, el cuerpo alargado 1913 y el resto 1915. La polimerasa 1950 se dispone adyacente a, y en contacto con, el poro 1905 biológico y opcionalmente se puede anclar al poro 1905 biológico a través de un enlace físico o químico (p. ej., usando química clic o un enlace cisteínamaleimida). La polimerasa 1950 está configurada para recibir un polinucleótido 1970 molde, p. ej., ADNmc circular o lineal para secuenciar, para sintetizar un polinucleótido 1960 que tiene una secuencia complementaria a la del ADNmc recibiendo, uniendo y añadiendo secuencialmente nucleótidos al polinucleótido de acuerdo con la secuencia del ADNmc. La región de cabeza 1911 de la fijación se puede anclar a cualquier parte adecuada del poro 1905 biológico que coloque el resto 1915 lo suficientemente cerca de la polimerasa 1950 para interactuar con los restos correspondientes de nucleótidos que pueden unirse por la polimerasa 1950. Por ejemplo, como se ilustra en la fig.

19B, el nucleótido 1930 puede incluir un marcador alargado 1931 que incluye el resto 1932 que interactúa con el resto 1915 de la fijación, así como la región indicadora 1934 configurada para disponerse a través de la abertura 1903 del nanoporo 1905.

En un ejemplo, se puede aplicar una tensión a través del nanoporo 1905, p. ej., utilizando el circuito 230 de medición y los electrodos 231, 232 tal como se ha descrito más arriba con referencia a la fig. 2A o el circuito 240 de medición y los electrodos 241, 242 tal como se ha descrito más arriba con referencia a la fig. 2C. La región indicadora 1914 o el cuerpo alargado 1913 incluye opcionalmente una carga electrostática que, en respuesta a la tensión aplicada, provoca que la región de cola 1912 del cuerpo alargado 1913 se extienda hacia el segundo lado 1902 del nanoporo 1905. Adicionalmente, el marcador alargado 1931 del nucleótido 1930 incluye una carga electrostática que, en respuesta a la tensión aplicada, provoca que la región final 1933 del marcador 1931 pase a través de la constricción 1904 de modo que la región indicadora 1934 esté dispuesta dentro de o adyacente a la constricción 1904. En respuesta a la polimerasa 1950 que se une al nucleótido 1930, el resto 1932 del nucleótido 1930 se puede unir de forma reversible al resto 1915 de la fijación 1932, que puede disponer la región indicadora 1934 dentro de o adyacente a la constricción 1904. Como resultado, la unión del nucleótido 1930 por la polimerasa 1950 puede traducirse o transducirse en un cambio medible en la corriente o flujo a través de la constricción 1904, que también puede denominarse corriente o flujo de bloqueo. Adicionalmente, se espera que la fuerza ejercida sobre la fijación por la tensión aplicada tire del poro a través del resto 1915 en lugar de la polimerasa y, por tanto, no se espera que interrumpa significativamente la actividad polimerasa.

En una realización ilustrativa, el resto 1915 incluye un primer oligonucleótido y el resto 1932 incluye un segundo oligonucleótido que es complementario del primer oligonucleótido, p. ej., que hibrida con el primer oligonucleótido. La hibridación del segundo oligonucleótido con el primer oligonucleótido puede provocar que la región indicadora 1934 se disponga dentro o adyacente a la constricción 1904. La unión del nucleótido 1930 puede detectarse individualmente en función de una magnitud o duración temporal medida (p. ej., medida óptica o eléctricamente), o ambas, de una corriente o flujo a través de la constricción 1904. Por ejemplo, la fig. 19B ilustra esquemáticamente un nucleótido ilustrativo 1930, p. ej., T, que incluye un marcador alargado 1931 que incluye un resto oligonucleotídico 1932 que se puede unir al fosfato gamma del nucleótido 1930, p. ej., a través de un enlace fosfato delta. El resto oligonucleotídico 1932 puede incluir cualquier secuencia adecuada de nucleótidos seleccionada para hibridar con una secuencia correspondiente de nucleótidos dentro del resto 1915 de la fijación. Por ejemplo, el resto oligonucleotídico 1932 ilustrado en la fig. 19B puede incluir la secuencia ilustrativa TACG y el resto 1915 puede incluir la secuencia complementaria ATGC. De una manera análoga a la descrita anteriormente con referencia a las figs. 8A-14, la acción de la polimerasa 1905 sobre el nucleótido 1930 puede mantener el resto 1932 relativamente próximo al resto 1915 de la fijación, lo que da lugar a un aumento transitorio en la concentración local del resto oligonucleotídico 1932 que puede inducir la hibridación entre los restos 1932 y 1915 preferentemente a restos que están unidos a nucleótidos sobre los que actualmente no actúa la polimerasa 1905. La hibridación resultante provoca la disposición de la región indicadora 1934 adyacente a o dentro de la constricción 1904. La polimerasa 1950 puede liberar el marcador alargado 1931 al incorporar el nucleótido 1930 en un polinucleótido, en respuesta a lo cual el resto 1932 puede disociarse del resto 1915.

Cada tipo diferente de nucleótido puede incluir un marcador alargado correspondiente que se une a su fosfato gamma de una manera análoga a la ilustrada en la fig. 19B. Por ejemplo, la fig. 19C ilustra esquemáticamente nucleótidos ilustrativos que incluyen marcadores alargados que incluyen regiones indicadoras respectivas y restos que se unen a un anclaje ilustrativo durante el uso para detectar la acción de un nucleótido por una polimerasa dispuesta adyacente a un nanoporo. Como se muestra en la fig. 19C, los nucleótidos A, T, C y G pueden incluir respectivamente marcadores alargados que incluyen regiones indicadoras diferentes entre sí, p. ej., representados respectivamente por el triángulo, rombo, cuadrado y círculo. Para obtener más información acerca de regiones indicadoras que se pueden unir a los nucleótidos para permitir distinguir los nucleótidos entre sí, véase la patente de los Estados Unidos n.° 8.652.779 de Turner et al., cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia. Adicionalmente, los marcadores alargados incluyen restos que pueden seleccionarse adecuadamente para hibridar con un resto correspondiente de la fijación permanente. Sin embargo, no es necesario que los restos sean diferentes entre sí y de hecho pueden ser iguales entre sí porque los nucleótidos pueden ser distinguibles entre sí basándose en las diferencias entre sus respectivas regiones indicadoras. En una realización ilustrativa, los restos tienen longitudes de 5 a 8 nucleótidos. Se espera que las temperaturas de fusión de dobles cadenas entre los restos al incorporar nucleótidos y restos en la fijación sean significativamente más estables que un par por lo demás idéntico de oligonucleótidos de difusión libre porque la fijación y el nucleótido incorporado se mantienen en una posición relativamente fija con respecto a otro, provocando un aumento eficaz de las concentraciones locales de los restos, como se ha analizado anteriormente con referencia a las figs. 8A-14.

Se pueden utilizar otras composiciones de manera adecuada para realizar secuenciación por síntesis basada en la acción de detección de una polimerasa sobre nucleótidos. Por ejemplo, las figs. 20A-20D ilustran esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un primer nucleótido utilizando una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo que responde a un cambio en el potencial eléctrico a través del nanoporo, y la fig. 20E ilustra una señal ilustrativa que se puede generar durante el uso de dicha composición.

La composición ilustrada en la fig. 20A incluye el nanoporo 2000 que incluye el primer lado 2001, el segundo lado 2002, la abertura 2003 que se extiende a través del primer y segundo lados y la constricción 2004 dispuesta entre el primer y segundo lados; una fijación permanente (no marcada específicamente) que incluye una región de cabeza (no marcada específicamente) anclada al segundo lado 2002 del nanoporo 2000, una región de cola (no marcada específicamente) que es móvil entre el primer lado 2001 y el segundo lado 2002 del nanoporo 2000, y un cuerpo alargado (no marcado específicamente) que incluye múltiples regiones indicadoras 2014, 2024, 2034 y el resto 2015; y el nucleótido 2030 que incluye un marcador alargado (no marcado específicamente) que incluye el resto 2032 pero que carece de una región indicadora. Como se ilustra en la fig. 20^a , una interacción entre el resto 2032 del nucleótido 2030 y el resto 2015 de la fijación 2010 puede disponer cada región indicadora 2014, 2024, 2034 en una ubicación predeterminada con respecto al resto 2032. Puede proporcionarse cualquier número adecuado de regiones indicadoras, p. ej., al menos dos regiones indicadoras, tres regiones indicadoras, cuatro regiones indicadoras, cinco regiones indicadoras o más de cinco regiones indicadoras. Adicionalmente, el resto 2015 se puede ubicar en cualquier posición adecuada a lo largo del marcador alargado 2013, p. ej., puede ubicarse entre y adyacente a cada una de la región de cola 2012 y la primera región indicadora 2014 tal como se ilustra en la fig.

20A, o puede estar adyacente a la región de cabeza 2011, o entre la región de cabeza 2011 y la tercera región indicadora 2034 o entre cualquiera de las regiones indicadoras 2014, 2024 o 2034.

Debe apreciarse que la posición relativa del resto 2032 y una o más de las regiones indicadoras, p. ej., la región indicadora 2014 puede ser detectable de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, la composición puede estar en comunicación operativa con un circuito de medición tal como se ha descrito anteriormente con referencia a la fig. 2A o la fig. 2C. El circuito de medición puede configurarse para detectar la posición de la región indicadora 2014 en relación con el resto 2032. En una realización ilustrativa, el nanoporo 2000, la fijación 2010, la polimerasa 2050 y el nucleótido 2030 se pueden sumergir en un líquido conductor, p. ej., una solución salina acuosa. Un circuito de medición configurado de manera análoga al circuito 230 de medición ilustrado en la fig. 2A o el circuito 240 de medición ilustrado en la fig. 2C puede estar en comunicación con el primer y segundo electrodos y puede configurarse para aplicar una primera tensión entre esos electrodos para aplicar una tensión a través del nanoporo 2000, representado por los signos "+" y "-" ilustrados en la fig. 20A, y usar los electrodos para medir la magnitud de una corriente o flujo a través de la abertura 2003 a la primera tensión. La parte de la fig. 20^e inmediatamente debajo de la fig. 20A ilustra una corriente o flujo ilustrativo a través de la abertura 2003 a la primera tensión. La región indicadora 2014 puede tener una propiedad de bloqueo eléctrico o de flujo diferente a algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado de la fijación (no marcada específicamente), así como a algunas o todas las demás regiones indicadoras 2024, 2034. La magnitud de la corriente o del flujo a través de la abertura 2003 puede cambiar de forma medible en respuesta a la ubicación relativa de la región indicadora 2014 dentro de la abertura 2003 y dicha ubicación relativa puede basarse en la tensión aplicada y en la ubicación de la región indicadora 2014 con respecto al resto 2032, que a su vez puede basarse en la acción de la polimerasa 2050 sobre el nucleótido 2030.

Más específicamente, el circuito de medición se puede configurar además para cambiar la tensión aplicada a través del nanoporo 2000 a una segunda tensión, p. ej., invirtiendo la tensión aplicada tal como se representa por la inversión de los signos "+" y "-" tal como se ilustra en la fig. 20B. Dicho cambio en la tensión aplicada puede provocar el movimiento de los restos 2015, 2032 que interactúan dentro de la abertura 2003 del nanoporo 2000. Por ejemplo, como se ilustra en la fig. 20B, el cambio en la tensión aplicada puede mover los restos 2015, 2032 que interactúan adyacentes a la constricción 2004 y puede disponer la región indicadora 2014 adyacente a o dentro de la constricción 2004 de forma selectiva en relación con las regiones indicadoras 2024, 2034. El circuito de medición puede configurarse para usar los electrodos para medir la magnitud de una corriente o flujo a través de la abertura 2003 a la segunda tensión. La parte de la fig. 20E inmediatamente debajo de la fig. 20B ilustra una corriente o flujo ilustrativo a través de la abertura 2003 a la segunda tensión. Puede verse que la corriente o flujo a la primera tensión es diferente de la corriente o flujo a la segunda tensión, y dicha corriente o flujo puede basarse en la segundo tensión y en la ubicación de la región indicadora 2014 con respecto al resto 2032, que a su vez puede basarse en la acción de la polimerasa 2050 sobre el nucleótido 2030.

La acción de la polimerasa 2050 sobre el nucleótido 2030 puede ser identificable individualmente en función de una magnitud o duración temporal medida (p. ej., medida óptica o eléctricamente), o ambas, de una señal generada por dicho sistema. Por ejemplo, la acción de la polimerasa 2050 sobre el nucleótido 2030 puede provocar interacción entre los restos 2015 y 2032, lo que a su vez provoca que la región indicadora 2014 se disponga en una primera ubicación con respecto al resto 2032, y la presencia de la región indicadora 2014 en la primera ubicación provoca que la señal, p. ej., corriente o flujo a través de la abertura 2003, tenga una primera magnitud. Como tal, la señal que tiene la primera magnitud se correlaciona con la aparición de la acción de la polimerasa 2050 sobre el nucleótido 2030. Obsérvese que una doble cadena formada entre el resto 2015 y el resto 2032 puede ser lo suficientemente grande para inhibir el movimiento de la doble cadena a través de la constricción, p. ej., a la segunda tensión.

Como se ilustra en la fig. 20C, en algunas realizaciones, la aplicación continuada de la segunda tensión puede provocar que el resto 2015 se disocie del resto 2032. Se puede considerar que dicha disociación "interrumpe" una doble cadena formada entre el resto 2015 y el resto 2032. En algunas realizaciones, la región indicadora 2014 o el resto 2015, o ambos, pueden moverse a través de la constricción 2004 de modo que queden dispuestos en el segundo lado 2002 del nanoporo 2000. La parte de la fig. 20E inmediatamente debajo de la fig. 20C ilustra una corriente o flujo ilustrativo a través de la abertura 2003 a la segunda tensión, después de la disociación del resto 2015 del resto 2032. El resto 2032 se puede configurar para que permanezca dispuesto en el primer lado del nanoporo 2000 incluso si el resto 2015 se dispone en el segundo lado del nanoporo 2000, para inhibir temporalmente la interacción entre los restos 2015 y 2032. Como se ilustra en la fig. 20D, después de dicha disociación, la tensión aplicada a través de la abertura 2003 se puede cambiar de nuevo, p. ej., se puede volver a cambiar a la primera tensión, en respuesta a lo cual, los restos 2015 y 2032 pueden interactuar entre sí. La parte de la fig. 20E inmediatamente debajo de la fig. 20D ilustra una corriente o flujo ilustrativo a través de la abertura 2003 a la primera tensión, después de la interacción del resto 2015 del resto 2032.

Como parte de la acción de la polimerasa 2050 sobre el nucleótido 2030, la polimerasa 2050 puede, por ejemplo, escindir el marcador alargado del nucleótido 2030, provocando disociación del resto 2032 del resto 2015 y puede añadir el nucleótido 2030 al polinucleótido 2060 de acuerdo con la secuencia del molde 2070. La polimerasa 2050 puede actuar después sobre un segundo nucleótido. Por ejemplo, las figs. 21A-21D ilustran esquemáticamente la composición de las figs. 20A-20D configurada para su uso en la detección de la acción de la polimerasa sobre un segundo nucleótido utilizando la fijación anclada a o adyacente a un nanoporo que responde a un cambio en el potencial eléctrico a través del nanoporo, y la fig. 21E ilustra una señal ilustrativa que se puede generar durante el uso de dicha composición. Más específicamente, la fig. 21 ilustra la acción de la polimerasa 2050 sobre el segundo nucleótido 2030' que tiene el segundo resto 2032'. El segundo resto 2032' del segundo nucleótido 2030' interactúa con el resto 2015 de una manera diferente que el resto 2032 del primer nucleótido 2030.

Por ejemplo, como se ilustra en la fig. 21A, una interacción entre el resto 2032' del segundo nucleótido 2030' y el resto 2015 de la fijación puede disponer cada región indicadora 2014, 2024, 2034 en una ubicación predeterminada en relación con el resto 2032' que es diferente de las ubicaciones predeterminadas ilustradas en la fig. 21A debido a que el resto 2032' es diferente que el resto 2032, p. ej., interactúa con una parte diferente del resto 2015 que el resto 2023. El circuito de medición puede configurarse para detectar la posición de la región indicadora 2024 en relación con el resto 2032' en respuesta a la primera y segunda tensión aplicadas de una manera análoga a la descrita anteriormente con referencia a las figs. 20A-20E. Por ejemplo, la parte de la fig. 21E inmediatamente debajo de la fig. 21A ilustra una corriente o flujo ilustrativo a través de la abertura 2003 a la primera tensión. La región indicadora 2024 puede tener una propiedad de bloqueo eléctrico o de flujo diferente a algunas o todas las demás regiones del cuerpo alargado de la fijación (no marcada específicamente), así como a algunas o todas las demás regiones indicadoras 2014, 2034.

La magnitud de la corriente o del flujo a través de la abertura 2003 puede cambiar de forma medible en respuesta a la ubicación relativa de la región indicadora 2014 dentro de la abertura 2003 y dicha ubicación relativa puede basarse en la tensión aplicada y en la ubicación de la región indicadora 2014 con respecto al resto 2032', que a su vez puede basarse en la acción de la polimerasa 2050 sobre el nucleótido 2030'. Más específicamente, el circuito de medición se puede configurar además para cambiar la tensión aplicada a través del nanoporo 2000 a una segunda tensión, p. ej., invirtiendo la tensión aplicada tal como se representa por la inversión de los signos "+" y "-" tal como se ilustra en la fig. 21B. Dicho cambio en la tensión aplicada puede provocar el movimiento de los restos 2015, 2032' que interactúan dentro de la abertura 2003 del nanoporo 2000. Por ejemplo, como se ilustra en la fig. 21B, el cambio en la tensión aplicada puede mover los restos 2015, 2032' que interactúan adyacentes a la constricción 2004 y puede disponer la región indicadora 2024 adyacente a o dentro de la constricción 2004 de forma selectiva en relación con las regiones indicadoras 2014, 2034. El circuito de medición puede configurarse para usar los electrodos para medir la magnitud de una corriente o flujo a través de la abertura 2003 a la segunda tensión. La parte de la fig. 21E inmediatamente debajo de la fig. 21B ilustra una corriente o flujo ilustrativo a través de la abertura 2003 a la segunda tensión. Puede verse que la corriente o flujo a la primera tensión es diferente de la corriente o flujo a la segunda tensión, y dicha corriente o flujo puede basarse en la segundo tensión y en la ubicación de la región indicadora 2024 con respecto al resto 2032', que a su vez puede basarse en la acción de la polimerasa 2050 sobre el nucleótido 2030'. Por ejemplo, se puede ver que la corriente o flujo ilustrado en la fig. 21E como corresponde a la fig. 21B es mayor que la corriente o el flujo ilustrado en la fig. 20E como corresponde a la fig. 20B, debido a que la región indicadora 2024 tiene una característica notablemente diferente a la región indicadora 2014. Como tal, la magnitud de la señal, p. ej., corriente o flujo, se correlaciona con el tipo particular de nucleótido sobre el que actúa la polimerasa 2050.

Como se ilustra en la fig. 21C, en algunas realizaciones, la aplicación continuada de la segunda tensión puede provocar que el resto 2015 se disocie del resto 2032' de una manera análoga a la descrita anteriormente con referencia a la fig. 20C. La parte de la fig. 21E inmediatamente debajo de la fig. 21C ilustra una corriente o flujo ilustrativo a través de la abertura 2003 a la primera tensión, después de la interacción del resto 2015 del resto 2032'. Como se ilustra en la fig. 21D, después de dicha disociación, la tensión aplicada a través de la abertura 2003 se puede cambiar de nuevo, p. ej., se puede volver a cambiar a la primera tensión, en respuesta a lo cual, los restos 2015 y 2032' pueden interactuar entre sí de la manera descrita anteriormente con referencia a la fig. 20D. La parte de la fig. 21E inmediatamente debajo de la fig. 21D ilustra una corriente o flujo ilustrativo a través de la abertura 2003 a la primera tensión, después de la interacción del resto 2015 del resto 2032'.

Obsérvese que, en algunas realizaciones, las longitudes respectivas del cuerpo alargado de la fijación y el marcador alargado del nucleótido, las ubicaciones respectivas de los restos 2015 y 2032 y 2032' y las ubicaciones respectivas de las regiones indicadoras 2014, 2024 y 2034 se seleccionan conjuntamente para inhibir la aplicación de fuerza al nucleótido 2030 o 2030' mientras la polimerasa 2050 actúa sobre el nucleótido respectivamente y, por tanto, inhibir o evitar que dicha fuerza modifique el rendimiento de la polimerasa, así como para permitir que diferentes nucleótidos sean distinguibles individualmente entre sí. En una realización ilustrativa, la interacción entre el resto 2015 y el resto 2032 o 2032' forma una doble cadena. La longitud del cuerpo alargado de la fijación y la ubicación del resto 2015 a lo largo del cuerpo alargado, se pueden seleccionar conjuntamente de modo que el resto 2015 se pueda extender a través de la constricción 2004 en respuesta a una tensión aplicada adecuada, p. ej., para permitir la interacción entre el resto 2015 y el resto 2032 o el resto 2032'. La longitud del marcador alargado del nucleótido y la ubicación del resto 2032 o 2032' a lo largo del marcador alargado, pueden seleccionarse conjuntamente para proporcionar una holgura adicional de modo que no sea necesario tensar el marcador alargado para disponer respectivamente una de las regiones indicadoras 2014, 2024 o 2034 dentro de o adyacente a la constricción 2004 a la segunda tensión aplicada. El tamaño de la doble cadena 2015, 2032 o 2015, 2032' puede inhibir el movimiento de la doble cadena a través de la constricción 2004 y puede proteger el nucleótido 2030, 2030' respectivo de las fuerzas que, de otro modo, podrían haberse aplicado al nucleótido 2030 o 2030' mediante el marcador alargado 2031. Adicionalmente, las ubicaciones relativas de las regiones indicadoras 2014, 2024 y 2034 y los restos 2015 y 2032 y 2032' pueden seleccionarse conjuntamente para disponer una de esas regiones indicadoras en una ubicación adecuada en relación con la constricción 2004 a la segunda tensión para facilitar la detección de esa región indicadora cuando los restos 2015 y 2032 o los restos 2015 y 2032' interactúan respectivamente entre sí. En una realización ilustrativa, la región indicadora 2014 está dispuesta en una primera ubicación a lo largo del cuerpo alargado 2031 para que esté dispuesta dentro de, o adyacente a, la constricción 2004 del nanoporo 2000 cuando los restos 2015 y 2032 interactúan entre sí en respuesta a la acción de la polimerasa 2050, la región indicadora 2024 está dispuesta en una segunda ubicación a lo largo del cuerpo alargado 2031 para que esté dispuesta dentro de, o adyacente a, la constricción 2004 del nanoporo 2000 cuando los restos 2015 y 2032' interactúan entre sí en respuesta a la acción de la polimerasa 2050 y la región indicadora 2034 está dispuesta en una ubicación adecuada a lo largo del cuerpo alargado 2031 para que esté dispuesta dentro de, o adyacente a, la constricción 2004 del nanoporo 2000 cuando el resto 2015 interactúa con un resto de otro nucleótido más que responde a la acción de la polimerasa 2050. En consecuencia, debe entenderse que puede proporcionarse cualquier número adecuado de regiones indicadoras para proporcionar señales detectables correspondientes a nucleótidos particulares sobre los que actúa la polimerasa.

Obsérvese que la realización descrita más arriba con referencia a las figs. 18A-18E, en la que la región de cabeza de la fijación está anclada al primer lado del nanoporo en lugar de al segundo lado del nanoporo, se puede utilizar de manera análoga a la de las figs. 20A-21E para identificar individualmente los nucleótidos sobre los que actúa una polimerasa.

Se pueden usar todavía otras configuraciones de manera adecuada. Por ejemplo, las figs. 22A-22F ilustran esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un primer nucleótido usando un cambio en la tensión aplicada a través del nanoporo, según algunas realizaciones de la presente divulgación.

Más específicamente, la fig. 22A ilustra una composición que incluye el nanoporo 2300 que incluye el primer lado 2201, el segundo lado 2202, la abertura 2203 que se extiende a través del primer y segundo lados y la constricción 2204 dispuesta entre el primer y segundo lados. De manera ilustrativa, el nanoporo 2200 puede incluir un poro biológico, tal como un nanoporo MspA (p. ej., mutante M2-NNN MspA), dispuesto en una barrera, tal como una membrana de origen biológico p. ej., una bicapa lipídica) o una membrana de estado sólido. La composición ilustrada en la fig. 22A incluye además la fijación 2210 que incluye la región de cabeza 2211, la región de cola 2212 y el cuerpo alargado 2213 dispuesto entre ellos. La región de cabeza 2211 está anclada adecuadamente a la polimerasa 2250, p. ej., utilizando cualquier unión adecuada proporcionada en el presente documento o conocida de otro modo en la técnica. El cuerpo alargado 2213 de la fijación 2210 puede incluir un resto 2214. De manera ilustrativa, el cuerpo alargado 2213 puede incluir un polinucleótido y un primer subconjunto de los ácidos nucleicos del polinucleótido puede definir el resto 2214. Adicionalmente, la región de cola 2212 puede incluir al menos un átomo con carga de manera que, en función de una tensión que se aplica a través del nanoporo 2200 ilustrado en la fig. 22A durante la etapa 1, dicha tensión genera una primera fuerza direccional F1 que provoca la translocación de la región de cola 2212 a través de la abertura 2203 y más allá de la constricción 2204 de modo que una parte de la cola alargada 2213 queda dispuesta dentro de la abertura 2203 y la región de cola queda dispuesta más allá del segundo lado 2202 del nanoporo 2200 de una manera tal como se ilustra en la fig. 22B. Por ejemplo, dicha tensión se puede aplicar utilizando un sistema tal como se describe en el presente documento con referencia a las figs. 2A-2C. Dicha fuerza direccional F1 también provoca la translocación de la polimerasa 2250 hacia el segundo lado 2202 del nanoporo 2200 hasta que la polimerasa 2250 se detiene sobre o adyacente al primer lado 2201 del nanoporo 2200 de una manera tal como se ilustra en la fig. 22B, previniendo o inhibiendo el movimiento adicional de la polimerasa 2250 bajo la fuerza direccional F1. Obsérvese que, opcionalmente, la polimerasa puede disponerse parcialmente dentro de la abertura 2203 del nanoporo 2200.

La composición ilustrada en la fig. 22A también puede incluir otro miembro 2250' al que se puede unir la región de cola 2212 de la fijación 210 de una manera análoga a la descrita anteriormente con referencia a la fig. 1M. Por ejemplo, la composición ilustrada en la fig. 22A puede incluir uno o más polinucleótidos 2250' que tienen una secuencia que puede hibridar adecuadamente con los ácidos nucleicos correspondientes en el cuerpo alargado 2213 o en la región de cola 2212 de la fijación 2210. Por ejemplo, como se ilustra en la fig. 22B, bajo la fuerza direccional F1 que se aplica durante la etapa 1 (fig. 22A) y puede continuar durante la etapa 2 (fig. 22B), la región de cola 2212 queda dispuesta más allá del segundo lado 2202 del nanoporo 2200 y se une a, p. ej., hibrida con el miembro 2250', p. ej., un trozo complementario de ADN ("ADN de captura") presente adyacente al segundo lado 2202 (p. ej., en el lado trans) del nanoporo 2200. El enlace entre la región de cola 2212 y el miembro 2250', p. ej., hibridación entre uno o más primeros ácidos nucleicos de la región de cola 2212 y uno o más segundos ácidos nucleicos del miembro 2250' para formar una doble cadena 2212, 2250', p. ej., ADN bicatenario, es lo suficientemente fuerte para que al aplicar una fuerza direccional inversa F2 (p. ej., durante la etapa 3 ilustrada en la fig. 22C), p. ej., inversión de la tensión, la doble cadena inhibe la separación de la polimerasa del nanoporo y, como tal, la polimerasa permanece capturada en el nanoporo. Por ejemplo, la doble cadena 2212, 2250' puede incluir un número suficiente de ácidos nucleicos hibridados de manera que la doble cadena no se disocie bajo la aplicación de la fuerza F2. Adicionalmente, la doble cadena 2212, 2250' puede ser lo suficientemente grande para inhibir el movimiento de la doble cadena a través de la constricción 2204. Adicionalmente, en algunas realizaciones, las dimensiones laterales de la constricción 2204 del nanoporo 2200 se seleccionan de modo que solo un único cuerpo alargado 2213 de una única fijación 2210 pueda disponerse a través del mismo, asegurando de este modo que solo una polimerasa 2250 sea capturada en el nanoporo.

En realizaciones particulares, se puede utilizar una etapa de evaluación de la calidad para evaluar el nanoporo o la captura de polimerasa en el nanoporo. Un nanoporo que está incluido de forma adecuada en una membrana puede producir un patrón de flujo o corriente característico que es distinguible del patrón de flujo o corriente que se produce cuando no hay ningún nanoporo presente en la membrana o cuando un nanoporo no es completamente funcional. En el caso de que una evaluación de calidad indique que un nanoporo no está incluido de forma adecuada en una membrana, las etapas utilizadas para cargar el nanoporo se pueden repetir.

Una polimerasa que es capturada correctamente por un nanoporo también puede producir un patrón de flujo o corriente característico. Por ejemplo, una tensión de polarización que se aplica a un nanoporo que ha capturado una polimerasa a través de una fijación puede producir un patrón de flujo o corriente que es indicativo de la interacción entre la abertura del nanoporo y las bases de identificación en una fijación de ácido nucleico. Las tensiones de sesgo se pueden aplicar en direcciones opuestas para determinar si la fijación tiene la movilidad deseada en la luz del nanoporo de modo que las bases de identificación interactúen con la abertura como se ha predicho. En caso de que una evaluación de calidad indique que una polimerasa no ha sido capturada adecuadamente por un nanoporo, la polimerasa se puede retirar, por ejemplo, mediante la aplicación de un fuerte sesgo inverso y se pueden repetir las etapas utilizadas para capturar la polimerasa en el nanoporo.

En otra rutina de evaluación de la calidad opcional, se puede aplicar una tensión de sesgo inverso relativamente grande al sistema para determinar si la polimerasa y la fijación se eliminan del nanoporo. Normalmente, la doble cadena formada entre el miembro 2250' y 2212 será lo suficientemente fuerte para evitar la eliminación de la fijación. Esta rutina de evaluación de la calidad indicará si este es el caso. De manera similar, se pueden aplicar tensiones de polarización en esta etapa y detectar los patrones de flujo o de corriente resultantes para determinar si se produce taponamiento o destaponamiento como se ha expuesto anteriormente en el presente documento. En caso de que una evaluación de calidad indique que una polimerasa no ha sido capturada por un nanoporo con suficiente estabilidad, se pueden repetir las etapas utilizadas para capturar la polimerasa en el nanoporo.

Varias realizaciones expuestas en el presente documento se refieren a dispositivos múltiples que están cargados con múltiples nanoporos, cada uno de los cuales se desea que se una a una polimerasa. Se pueden llevar a cabo etapas de evaluación de la calidad, tales como las expuestas anteriormente, para la población múltiple. Si no se ha formado un número deseado de nanoporos funcionales en un aparato de nanoporos múltiples o si la carga fraccionada no es suficiente, entonces, el aparato puede tratarse a granel para repetir la carga de nanoporos (o polimerasa). Opcionalmente, los nanoporos (o polimerasas) se pueden eliminar antes de repetir la etapa de carga, por ejemplo, si hay presentes nanoporos o polimerasas defectuosos. Por ejemplo, se puede llevar a cabo repetición de la carga (y, opcionalmente, eliminación de nanoporos o polimerasas) si el aparato múltiple se carga a menos del 90 %, 75 %, 50 %, 30 % o menos de los sitios esperados.

En la etapa 3 ilustrada en la fig. 22C, la composición ilustrada en la fig. 22B puede someterse además a una fuerza direccional inversa F2, p. ej., inversión de la tensión relativa a la de las etapas 1 y 2, en función de la cual la polimerasa 2250 puede salir del contacto con el primer lado 2201 del nanoporo 2200 y puede ponerse en contacto con el cebador de secuenciación 2280, ADN monocatenario 2270 diana (diana) y una pluralidad de nucleótidos 2230, 2230', cada uno de los cuales incluye un marcador alargado correspondiente 2231, 2231' que incluye un resto correspondiente 2232, 2232' que interactúa con el resto de la fijación 2213 en respuesta a la polimerasa 2250 que actúa sobre ese nucleótido 2230 o 230'.

En la etapa 4 ilustrada en la fig. 22D, basada en la secuencia de la diana 2270, la polimerasa 2250 actúa sobre el primer nucleótido 2230, en función de lo cual el resto 2232 correspondiente del marcador alargado 2231 del nucleótido 2230 interactúa con el resto 2214 de la fijación 2310. Por ejemplo, la polimerasa 2250 puede unirse preferentemente al primer nucleótido 2230 con respecto al segundo nucleótido 2230' basándose en que el primer nucleótido 2230 es complementario al siguiente nucleótido en la secuencia de la diana 2270. Adicionalmente, el marcador alargado 2231 puede incluir una primera secuencia de nucleótidos y el resto 2214 del cuerpo alargado 2213 puede incluir una segunda secuencia de nucleótidos que es complementaria de la primera secuencia de nucleótidos del marcador alargado 2231, de manera que la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos hibridan entre sí. Obsérvese que la etapa 4 se puede realizar bajo la fuerza direccional inversa F2, p. ej., inversión de la tensión relativa a la de las etapas 1 y 2, de modo que no es necesario disponer la polimerasa 2250 contra el primer lado 2201 del nanoporo 2200.

En la etapa 5 ilustrada en la fig. 22E, se puede aplicar de nuevo la fuerza direccional F1, lo que puede provocar la translocación de la región de cola 2212 en una dirección alejada del primer lado 2201 del nanoporo 220 y la translocación de la polimerasa 2250 hacia el segundo lado 2202 del nanoporo 2200. Por ejemplo, una tensión a través del nanoporo 2200 se puede invertir de nuevo, p. ej., utilizando un sistema tal como se describe en el presente documento con referencia a las figs. 2A-2C. Sin embargo, la aplicación de la fuerza F1 en la etapa 5 puede no provocar necesariamente que la polimerasa 2250 se apoye en o adyacente al primer lado 2201 del nanoporo 2200 de una manera tal como se ilustra en la fig. 22B. En cambio, la aplicación de la fuerza F1 (tirando en dirección trans) puede provocar que una doble cadena definida por la interacción (p. ej., unión o hibridación) entre el resto 2214 y 2232 descanse sobre o adyacente a la constricción 2204. De manera ilustrativa, la composición se puede incluir en un sistema que incluye circuitos de medición configurados para medir una corriente o flujo a través de la constricción 2204. Durante la etapa 5, la corriente o flujo puede basarse en el primer resto 2232, p. ej., basándose en la secuencia particular del resto 2232 y el primer nucleótido 2230 puede ser identificable basándose en la corriente o flujo. Por ejemplo, el resto 2232 del primer nucleótido 2230 puede tener una secuencia diferente a la del resto 2232' del segundo nucleótido 2230' y puede unirse a una parte (resto) diferente del cuerpo alargado 2213 de la fijación 2210. De manera ilustrativa, los marcadores alargados pueden incluir cualquier secuencia polinucleotídica adecuada que facilite la distinción entre sí de los nucleótidos a los que se unen dichos marcadores, p. ej., tal como se describe en este documento con referencia a las Figs. 19A-21D.

En la etapa 6 ilustrada en la fig. 22F, bajo la aplicación continua de la fuerza direccional F1, después de un tiempo estocástico, la doble cadena entre el resto 2214 de la fijación 2210 y el resto 2232 del marcador alargado 2231 del nucleótido 2230 se disocia de una manera análoga a la descrita en Derrington et al., PNAS 2010, citado en otra parte del presente documento. Después de dicha disociación, la fuerza direccional F1 puede provocar que la polimerasa 2250 se apoye en o adyacente al primer lado 2201 del nanoporo 2200 de una manera tal como se ilustra en la fig. 22B.

Obsérvese que se pueden utilizar otras configuraciones de forma adecuada. Por ejemplo, como alternativa a las etapas 5 y 6 ilustradas respectivamente en las figs. 22E y 22F, el marcador alargado 2231 en cambio puede ser lo suficientemente corta para que la doble cadena entre el resto 2214 de la fijación 2210 y el resto 2232 del marcador alargado 2231 del nucleótido 2230 no alcance la constricción bajo la aplicación de la fuerza direccional F1 y, en cambio, la polimerasa 2250 se apoye en o adyacente al primer lado 2201 del nanoporo 2200 de una manera tal como se ilustra en la fig. 22B. En dichas realizaciones, los marcadores alargados 2231, 2231' unidos a diferentes nucleótidos 2230, 2230' que se pueden unir por la polimerasa 2250 pueden incluir los restos 2232, 2232' que son secuencias o longitudes diferentes entre sí y, por tanto, interactúan de manera diferente con, p. ej., hibridan de manera diferente con, el resto 2214 de la fijación 2210 que entre sí para provocar cambios diferentes en la longitud de la fijación 2214 de una manera análoga a la descrita en el presente documento con referencia a las figs. 7A-14. Los nucleótidos correspondientes 2230, 2230' pueden identificarse basándose en cambios en la corriente o flujo en función de la longitud de la fijación 2210 provocada por interacciones entre el resto 2214 y el resto 2232, 2232' correspondiente. Las etapas 4-6 análogas a las ilustradas en las figs. 22D-22F se pueden repetir, aplicando por lo tanto tensión CA que conserva los electrodos. En otra realización más, el marcador alargado o el cuerpo alargado pueden incluir una región indicadora tal como la proporcionada en otra parte en el presente documento, y la corriente o el flujo a través de la abertura 2203 puede basarse en la región indicadora que se dispone dentro de la abertura y el nucleótido 2230 puede ser identificable basándose en la corriente o flujo.

Adicionalmente, obsérvese que si se capturara una polimerasa disfuncional, se puede invertir la tensión a una tensión muy alta para que el ADN de captura se desprenda y se pueda capturar una nueva polimerasa (repitiendo las etapas 1-3).

La tensión, corriente o formas de onda ópticas se pueden medir para diversos estados de una fijación que pasa a través de un nanoporo. La tensión, corriente o formas de onda ópticas pueden ser útiles para determinar los resultados de un método analítico realizado en un sistema de nanoporos. Por ejemplo, las formas de onda se pueden ajustar a los datos para aumentar la precisión de las lecturas de secuenciación.

Las figs. 24A a 24C muestran tres estados potenciales para una fijación que simulan estados experimentados en un método de secuenciación de ácidos nucleicos expuesto en el presente documento. Las señales ópticas o eléctricas resultantes, p. ej., formas de onda de tensión, se muestran en la fig. 24D. Un conjugado de fijación de proteína-ADN se captura en un nanoporo MspA y se bloquea en su lugar utilizando un oligonucleótido de bloqueo del lado trans. A continuación, se añade al lado cis un oligonucleótido complementario de una región de la fijación de ADN. La tensión se cicla entre 120 mV y -60 mV con un periodo de aproximadamente 200 ms. La fig. 24A muestra el conjugado tras la aplicación de tensión directa y la señal resultante se indica en 102 de la fig. 24D. La fig. 24B muestra el conjugado tras la aplicación de la tensión negativa y la señal resultante se indica en 2400 de la fig. 24D. La fig. 24C muestra hibridación de un conjugado de oligonucleótidos que se atrae hacia la constricción del poro. La señal de doble cadena se ve antes de la separación en 2401 de la fig. 24D. Después de la separación, el sistema vuelve al estado mostrado en la fig. 24A mientras que la tensión todavía está en 120 mV, lo que da lugar a la señal 2402.

En realizaciones tales como las descritas anteriormente con referencia a las figs. 20A-22F y 24A-24D, obsérvese que el resto del marcador alargado en el nucleótido está diseñado para interactuar con el resto del cuerpo alargado de la fijación. Por ejemplo, el marcador alargado del nucleótido y el cuerpo alargado de la fijación pueden incluir polinucleótidos que se hibridan (aparean) entre sí, p. ej., pueden incluir a Dn . En dichas realizaciones, el marcador alargado del nucleótido puede incluir análogos de nucleótidos que sustancialmente no interactúan con la polimerasa. Se puede lograr diferenciación entre nucleótidos usando cuatro restos diferentes que hibridan en ubicaciones ligeramente diferentes dentro de la secuencia de fijación. Por ejemplo, en una realización ilustrativa, los 3-4 nucleótidos adyacentes a la doble cadena naciente crean corrientes o flujos de bloqueo máximamente diferentes correspondientes a los cuatro nucleótidos diferentes. Si la doble cadena está presente, la fijación puede detenerse adyacente a la constricción, de una manera análoga a la ilustrada en las figs. 18B, 20B o 21B, durante un periodo de tiempo, p. ej., durante varios milisegundos, a medida que la doble cadena se disocia (se separa) y se registra una lectura de bloqueo de flujo o corriente proporcional a los 3-4 nucleótidos adyacentes a la región de doble cadena. Tras la separación, la tensión de CA restablece la doble cadena a través de su interacción estocástica con el marcador de ADN en el nucleótido marcado bloqueado en un complejo terciario de estado cerrado. La frecuencia de la tensión de CA se puede ajustar de modo que para un ciclo de CA dado, existe una probabilidad relativamente baja de detectar un acontecimiento de difusión (nucleótidos libres) y una probabilidad relativamente alta de detectar un acontecimiento de incorporación (nucleótido unido en una estructura terciaria cerrada). Por otra parte, el número de ciclos de CA por acontecimiento de incorporación de nucleótidos puede ser del orden de sobremuestreo de 5X a 100X para distinguir adecuadamente entre acontecimientos de incorporación frente a acontecimientos de difusión. Obsérvese que en dicho modo de interacción, en lugar de depender de la velocidad de disociación intrínseca del marcador alargado del nucleótido de la fijación, los restos del marcador alargado y la fijación interactúan entre sí y después pueden separarse activamente bajo control de tensión de CA, de una manera análoga a la ilustrada en las figs. 18C, 20C o 21C. La frecuencia de la tensión de CA (es decir, ~100-200 Hz) puede ajustarse para que sea lo suficientemente larga para detectar la unión de marcadores de "concentración mM", pero significativamente más corta que el tiempo de permanencia de la incorporación. Esta separación activa de la doble cadena puede eliminar la dependencia de la distribución exponencial de la velocidad de disociación.

Como se indica en otra parte del presente documento, se pueden incluir diversas composiciones de manera adecuada en el marcador alargado del nucleótido o el cuerpo alargado de la fijación, o ambos. Dichas composiciones pueden incluir ADN, PNA, LNA, ARN, morfolinos, PEG (polietilenglicol) y similares, y pueden tener cualquier longitud adecuada. Un marcador oligonucleotídico que incluye un nucleótido modificado adecuadamente se puede ligar de manera adecuada a dichas composiciones diferentes, por ejemplo, el uso de precursores compatibles con la química clic es ideal. En un ejemplo, el nucleótido está marcado con azida, lo que facilitaría el uso de oligonucleótidos marcados con alquino que se sintetizan fácilmente. Las moléculas ilustrativas incluyen nucleótidos marcados con tetrafosfato como se muestra a continuación, en los que (A) corresponde a azida-P4O13-dTTP y (B) corresponde a alquino-P4O13-dTTP. Estos nucleótidos se pueden modificar con cualquier marcador deseado utilizando química clic convencional:

Las referencias sobre la preparación y el mareaje de nucleótidos de tetrafosfato incluyen las siguientes, cuyo contenido completo de cada uno se incorpora en el presente documento por referencia:

Kumar, S., A. Sood, J. Wegener, P. J. Finn, S. Nampalli, J. R. Nelson, A. Sekher, P. Mitsis, J. Macklin y C. W. Fuller, "Terminal phosphate labeled nucleotides: synthesis, applications, and linker effect on incorporation by DNA polymerases", Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 24 (5-7): 401-408 (2005);

Sood, A., S. Kumar, S. Nampalli, J. R. Nelson, J. Macklin y C. W. Fuller, "Terminal phosphate-labeled nucleotides with improved substrate properties for homogeneous nucleic acid assays", J Am Chem Soc 127 (8): 2394-2395 (2005);

Kumar, S., C. Tao, M. Chien, B. Hellner, A. Balijepalli, J. W. Robertson, Z. Li, J. J. Russo, J. E. Reiner, J. J. Kasianowicz y J. Ju, "PEG-labeled nucleotides and nanopore detection for single molecule DNA sequencing by synthesis", Sci Rep 2: 684 (8 páginas) (2012);

Bonnac, L., S. E. Lee, G. T. Giuffredi, L. M. Elphick, A. A. Anderson, E. S. Child, D. J. Mann y V. Gouverneur, "Synthesis and O-phosphorylation of 3,3,4,4-tetrafluoroaryl-C-nucleoside analogues", Org Biomol Chem 8 (6): 1445-1454 (2010); y

Lee, S. E., L. M. Elphick, A. A. Anderson, L. Bonnac, E. S. Child, D. J. Mann y V. Gouverneur, "Synthesis and reactivity of novel gamma-phosphate modified ATP analogues", Bioorg Med Chem Lett 19 (14): 3804-3807 (2009).

Como se indica en otra parte del presente documento, puede usarse cualquier método o sistema de detección adecuado para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido. Por ejemplo, la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) es un método de detección de base óptica que se puede usar adecuadamente con las presentes composiciones para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido. En un método ilustrativo, el primer marcador alargado del primer nucleótido incluye además un primer compañero de par de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), tal como un aceptor o donante de FRET, y la fijación incluye además un segundo compañero de par FRET, tal como un donante o aceptor de FRET. El primer compañero de par FRET y el segundo compañero de par FRET pueden interactuar entre sí en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido. El método puede incluir además la detección de una primera longitud de onda emitida en respuesta a la interacción entre el primer compañero de par FRET y el segundo compañero de par FRET. El método puede incluir además proporcionar un segundo nucleótido que incluye un segundo marcador alargado, incluyendo el segundo marcador alargado un tercer compañero de par de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), p. ej., un aceptor o donante de FRET. El tercer compañero de par FRET y el segundo compañero de par FRET pueden interactuar entre sí en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el segundo nucleótido. El método puede incluir además la detección de una segunda longitud de onda emitida en respuesta a la interacción entre el tercer compañero de par FRET y el segundo compañero de par FRET. El primer y segundo nucleótidos son distinguibles individualmente entre sí en función de la primera y segunda longitudes de onda.

Como ejemplo ilustrativo, la fig. 23A ilustra esquemáticamente nucleótidos ilustrativos que incluyen marcadores alargados que incluyen regiones indicadoras y restos respectivos que pueden unirse con una fijación ilustrativa durante su uso para detectar la acción de una polimerasa sobre los nucleótidos, según algunas realizaciones de la presente divulgación. Cada tipo diferente de nucleótido puede incluir un marcador alargado correspondiente que se une a su fosfato gamma de una manera análoga a la descrita anteriormente con referencia a las figs. 19B-19C y eso incluye un compañero correspondiente de par de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), p. ej., un aceptor o donante de FRET, que se puede utilizar como región indicadora. Por ejemplo, la fig. 23A ilustra esquemáticamente nucleótidos ilustrativos 2330 que incluyen marcadores alargados 2331 que incluyen regiones indicadoras 2334 respectivas basadas en el aceptor de FRET y, opcionalmente, también incluyen restos 2332 que pueden unirse a una fijación ilustrativa durante el uso para detectar la acción de un nucleótido por una polimerasa dispuesta adyacente a un nanoporo. Como se muestra en la fig. 23A, los nucleótidos A, T, C y G pueden incluir respectivamente marcadores alargados que incluyen regiones indicadoras basadas en aceptores de FRET diferentes entre sí, p. ej., representados respectivamente por el triángulo, rombo, cuadrado y círculo. Como alternativa, los nucleótidos A, T, C y G pueden incluir respectivamente marcadores alargados que incluyen regiones indicadoras basadas en donantes de FRET diferentes entre sí, p. ej., representados respectivamente por el triángulo, rombo, cuadrado y círculo. Para obtener más información acerca de compañeros de pares FRET, p. ej., aceptores y donantes, y sistemas y métodos para detectar emisiones de interacciones entre compañeros de pares FRET, véase la publicación de patente de los Estados Unidos n.° 2014/0087474 de Huber y la publicación de patente PCT n.° WO 2014/066902 de Huber et al., cuyo contenido completo de ambas se incorpora en el presente documento por referencia.

Opcionalmente, los marcadores alargados 2331 de los nucleótidos 2330 incluyen restos que pueden seleccionarse adecuadamente para hibridar con un resto correspondiente de la fijación permanente como se describe con mayor detalle a continuación con referencia a las figs. 23B-23C. Sin embargo, no es necesario que los restos 2332 opcionales sean diferentes entre sí y de hecho pueden ser iguales entre sí porque los nucleótidos pueden ser distinguibles entre sí basándose en las diferencias entre sus respectivas regiones indicadoras respectivas basadas en compañeros de pares FRET. En una realización ilustrativa, los restos 2315 y 2332 opcionales tienen longitudes de 5 a 8 nucleótidos. Se espera que las temperaturas de fusión de dobles cadenas entre los restos al incorporar nucleótidos y restos en la fijación sean significativamente más estables que un par por lo demás idéntico de oligonucleótidos de difusión libre porque la fijación y el nucleótido incorporado se mantienen en una posición relativamente fija con respecto a otro, provocando un aumento eficaz de las concentraciones locales de los restos, como se ha analizado anteriormente con referencia a las figs. 8A-14. Los oligonucleótidos ilustrativos que se pueden utilizar como restos se describen adicionalmente el presente documento, p. ej., con referencia a las figs. 19A-19C.

En un ejemplo, la fig. 23B ilustra esquemáticamente una composición que incluye una fijación anclada a o adyacente a un nanoporo y configurada para su uso en la detección de la acción de una polimerasa sobre un primer nucleótido basándose en una interacción entre la fijación y una región indicadora de un nucleótido, según algunas realizaciones de la presente divulgación. La fijación puede incluir un compañero de par FRET que interactúa con los respectivos compañeros de pares FRET de los nucleótidos 2331. En una realización ilustrativa, el compañero de par FRET de la fijación es un donante de FRET y los respectivos compañeros de pares FRET de los nucleótidos son aceptores de FRET. En otra realización ilustrativa, el compañero de par FRET de la fijación es un aceptor de FRET y los respectivos compañeros de pares FRET de los nucleótidos son donantes de FRET.

El nanoporo incluye el poro 2305 biológico, que se puede disponer en una barrera (no ilustrada específicamente), p. ej., una membrana de origen biológico tal como una bicapa lipídica o una membrana de estado sólido. El poro 2305 biológico incluye la abertura 2303 y la constricción 2304. La fijación permanente incluye la región de cabeza 2311, el cuerpo alargado 2313, el resto 2315 opcional y el compañero 2316 de par FREt , p. ej., donante o aceptor, opcionalmente que se puede ubicar en o adyacente a la región de cola 2312 de la fijación permanente. La polimerasa 2350 se dispone adyacente a, y en contacto con, el poro 2305 biológico y opcionalmente se puede anclar al poro 2305 biológico a través de un enlace físico o químico (p. ej., usando química clic o un enlace cisteínamaleimida). La polimerasa 2350 está configurada para recibir un polinucleótido 2370 molde, p. ej., ADNmc circular o lineal para secuenciar, para sintetizar un polinucleótido 2360 que tiene una secuencia complementaria a la del ADNmc recibiendo, uniendo y añadiendo secuencialmente nucleótidos al polinucleótido de acuerdo con la secuencia del ADNmc. La región de cabeza 2311 de la fijación se puede anclar a cualquier parte adecuada del poro 2305 biológico que coloque el compañero 2316 de par FRET lo suficientemente cerca de la polimerasa 2350 para interactuar con las regiones indicadoras 2334 basadas en compañeros de par FRET de los nucleótidos 2330 que se pueden unir por la polimerasa 2350. Por ejemplo, basándose en que el donante 2316 de FRET y la región indicadora 2334 basada en el aceptor de FRET están a una distancia de aproximadamente 70 Angstroms entre sí, se puede emitir una longitud de onda de luz característica basándose en la cual se puede identificar el nucleótido 2330. En otro ejemplo, basándose en que el aceptor 2316 de FRET y la región indicadora 2334 basada en el donante de FRET están a una distancia de aproximadamente 70 Angstroms entre sí, se puede emitir una longitud de onda de luz característica basándose en la cual se puede identificar el nucleótido 2330.

Por ejemplo, La fig. 23C ilustra esquemáticamente una interacción detectable entre una de las regiones indicadoras de la fig. 23A con la fijación de la fig. 23B durante la acción de una polimerasa sobre un primer nucleótido, según algunas realizaciones de la presente divulgación. Como se ilustra en la fig. 23C, el nucleótido 2330 puede incluir un marcador alargado 2331 que incluye la primera región indicadora 2334 basada en el compañero de par FRET que interactúa con el segundo compañero de par FRET 2316 de la fijación. En determinadas realizaciones en las que la fijación permanente incluye el resto 2315 y el marcador alargado 2331 del nucleótido incluye el resto 2332, los restos 2315 y 2332 pueden interactuar entre sí.

En algunas realizaciones, la primera región indicadora 2334 basada en compañero de par FRET y el segundo compañero 2316 de par FRET interactúan entre sí en respuesta a la polimerasa 2350 que actúa sobre el nucleótido 2330 y una primera longitud de onda emitida en respuesta a la interacción entre la primera región indicadora 2334 basada en compañero de par FRET y el segundo compañero 2316 de par FRET puede ser detectable. Por ejemplo, como se ilustra en la fig. 23c , un nucleótido 2330 ilustrativo, p. ej., T, incluye un marcador alargado 2331 que incluye la región indicadora 2334 basada en el aceptor de FRET y, opcionalmente, el resto oligonucleotídico 2332 que puede unirse al fosfato gamma del nucleótido 2330, p. ej., a través de un enlace fosfato delta. La interacción entre la región indicadora 2334 basada en el aceptor de FRET y el donante 2316 de FRET de la fijación provoca que se emita luz de una longitud de onda "At" seleccionada. Un circuito de medición adecuado tal como se ha descrito más arriba con referencia a la fig. 2A se puede utilizar para detectar la longitud de onda "A^t", en función del cual se puede identificar el nucleótido 2330, p. ej., como T. Opcionalmente, en una realización ilustrativa, el resto 2315 incluye un primer oligonucleótido y el resto 2332 incluye un segundo oligonucleótido que es complementario del primer oligonucleótido, p. ej., que hibrida con el primer oligonucleótido. La hibridación del segundo oligonucleótido con el primer oligonucleótido puede provocar que la región indicadora 2334 basada en el aceptor de FRET se disponga adyacente al donante 2316 de FRET. La acción de la polimerasa 2350 sobre el nucleótido 2330 puede detectarse individualmente basándose en la emisión de luz que tiene una longitud de onda "At" en respuesta a la interacción entre la región indicadora 2334 basada en el aceptor de FRET y el donante 2316 de FRET. Debe entenderse que la región 2334, en cambio, puede basarse en un donante de FRET y la región 2316, en cambio, puede basarse en un aceptor de FRET.

Adicionalmente, como se ilustra en la fig. 23A, cada tipo diferente de nucleótido puede incluir un marcador alargado 2331 correspondiente que incluye una región indicadora 2334 basada en el compañero de par FRET correspondiente. Cada una de dichas regiones indicadoras 2334 puede configurarse de manera que la interacción entre esa región indicadora y el compañero 2316 del par FRET emita una longitud de onda correspondiente basada en la cual se puede identificar el nucleótido correspondiente. Por ejemplo, la interacción de la región indicadora 2334 basada en el compañero del par FRET unida al nucleótido 2330 A (representado con un triángulo) con el compañero 2316 del par FRET puede provocar la emisión de luz que tiene una longitud de onda "A^a"; la interacción de la región indicadora 2334 basada en el compañero del par FRET unida al nucleótido 2330 C (representado con un cuadrado) con el compañero 2316 del par FRET puede provocar la emisión de luz que tiene una longitud de onda "A^c"; y la interacción de la región indicadora 2334 basada en el compañero del par FRET unida al nucleótido 2330 G (representado con un círculo) con el compañero 2316 del par FRET puede provocar la emisión de luz que tiene una longitud de onda "Ag". En consecuencia, la interacción de cada una de dichas regiones indicadoras 2334 con el compañero 2316 de par FRET puede facilitar la identificación del nucleótido correspondiente. Por ejemplo, un primer compañero de par FRET de un primer nucleótido y el segundo compañero de par FRET de la fijación pueden interactuar entre sí en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido. Puede detectarse una primera longitud de onda emitida en respuesta a la interacción entre el primer compañero de par FRET y el segundo compañero de par FRET. Un segundo nucleótido puede incluir un segundo marcador alargado que incluye un tercer compañero de par FRET. El tercer compañero de par FRET y el segundo compañero de par FRET de la fijación pueden interactuar entre sí en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el segundo nucleótido. Se puede configurar un sistema de detección óptica para detectar una segunda longitud de onda emitida en respuesta a la interacción entre el tercer compañero de par FRET y el segundo compañero de par FRET. El primer y segundo nucleótidos pueden ser distinguibles individualmente entre sí en función de la primera y segunda longitudes de onda.

Los marcadores alargados 2331 de los nucleótidos 2330 se pueden escindir después de la incorporación de dichos nucleótidos en el polinucleótido 2360 de una manera tal como se describe en otra parte del presente documento.

Adicionalmente, obsérvese que las funciones de donante y aceptor de FRET pueden intercambiarse adecuadamente. Por ejemplo, la fijación permanente puede incluir un aceptor de FRET y el marcador alargado 2331 de nucleótidos 2330 puede incluir regiones indicadoras 2334 basadas en donantes de FRET. O, por ejemplo, la fijación permanente puede incluir un donante de FRET y el marcador alargado 2331 de los nucleótidos 2330 puede incluir regiones indicadoras 2334 basadas en el aceptor de FRET. Las interacciones entre dichos compañeros de pares FRET pueden provocar que se emita luz basándose en la cual se puede identificar cada nucleótido correspondiente.

Modificación ilustrativa de la distribución estadística de señales

Cabe señalar que la disociación de una doble cadena, tal como se puede formar basándose en una interacción entre un primer resto de un cuerpo alargado y un segundo resto de un marcador alargado en respuesta a una tensión aplicada, se puede caracterizar por definir una primera ruta que se caracteriza por dos o más constantes cinéticas. Adicionalmente, la acción de una polimerasa sobre un nucleótido, p. ej., un cambio conformacional de la polimerasa, liberación de pirofosfato o liberación del marcador alargado del nucleótido, se puede caracterizar por definir una segunda ruta que se caracteriza por dos o más constantes cinéticas. La distribución estadística de señales medidas (p. ej., medidas óptica o eléctricamente) durante el transcurso de la obtención de mediciones de la primera ruta o la segunda ruta puede basarse en los valores relativos de estas constantes cinéticas correspondientes a esa ruta. Por ejemplo, basándose en una constante cinética dada para la primera ruta o para la segunda ruta que es significativamente mayor que otras constantes cinéticas para esa ruta, la cinética de esa ruta puede estar dominada por esa constante cinética dada y la distribución estadística resultante de señales puede describirse mediante una función exponencial. En comparación, se pueden seleccionar dos o más de las constantes cinéticas para la primera ruta o para la segunda ruta para que sean del mismo orden de magnitud entre sí o incluso para que sean sustancialmente iguales entre sí (p. ej., para diferir entre sí en un factor de cinco o menos, o cuatro o menos, o tres o menos o dos o menos), de modo que la cinética de esa ruta no esté dominada por ninguna de las constantes cinéticas y la distribución estadística resultante de las señales puede describirse mediante una función gamma, en la que sustancialmente no hay probabilidad de acontecimientos de tiempo cero o muy cortos que sustancialmente no sean observables. En comparación, con una distribución exponencial, existe una alta probabilidad de acontecimientos muy breves o de tiempo cero que sustancialmente no son observables.

Una o más de las constantes cinéticas de la primera o segunda ruta pueden modificarse de cualquier manera adecuada para que sean del mismo orden que una o más constantes cinéticas adicionales de esa ruta, o incluso para que sean sustancialmente iguales a una o más de las constantes cinéticas de esa ruta. Por ejemplo, la polimerasa de cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento se puede modificar para retardar la liberación de pirofosfato en respuesta a la incorporación de un nucleótido en el primer nucleótido, modificando de este modo al menos una constante cinética de la segunda ruta. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la polimerasa puede incluir una polimerasa 029, B103, GA-1, PZA, 015, BS32, M2Y, Nf, G1, Cp-1, PRD1, PZE, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 o L17 recombinante modificada. En algunas realizaciones, la polimerasa puede incluir una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: una sustitución de aminoácido en la posición 484, una sustitución de aminoácido en la posición 198 y una sustitución de aminoácido en la posición 381. En algunas realizaciones, la polimerasa puede incluir una a Dn polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en E375Y, K512Y, T368F, A484E, A484Y, N387L, T372Q, T372L, K478Y, 1370W, F198W y L381A. Para obtener más detalles acerca de polimerasas modificadas ilustrativas que pueden retardar la liberación de pirofosfato en respuesta a la incorporación de un nucleótido en un polinucleótido, véase la patente de los Estados Unidos n.° 8.133.672 de Bjornson et al., cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia.

Como ejemplo adicional, una o más de las constantes cinéticas de la primera ruta pueden modificarse incluyendo a lo largo de cualquiera de las fijaciones presentes un segundo resto que hibrida con el primer resto para formar una estructura en horquilla. El primer y segundo restos de la fijación se pueden configurar para deshibridar entre sí en un proceso de dos etapas en respuesta a una tensión aplicada a través del nanoporo. En la fig. 26A se muestra un nucleótido modificado con tetrafosfato ilustrativo con un marcador configurado para formar una estructura en horquilla. Tras la hibridación con la fijación, se forma una horquilla como se muestra en la fig. 26C. Se puede esperar que esta horquilla tenga dos constantes de velocidad de separación, k1 y k2, que se muestran en la fig. 26C. Estas constantes de velocidad se pueden diseñar para que tengan una magnitud similar entre sí, de modo que, cuando se suman, pueden formar una distribución gamma. En la fig. 26B se muestra un segundo nucleótido modificado con tetrafosfato ilustrativo con dos marcadores. Hay dos marcadores, cada uno configurado para interactuar con la fijación, como se muestra en la fig. 26D. Cada marcador tiene su propia constante de velocidad de separación, k1 y k2 respectivamente, y la suma de estas dos constantes de velocidad para todo el acontecimiento de separación puede producir una función gamma. Obsérvese que se puede utilizar cualquier resto de fosfato adecuado, p. ej., restos que incluyen tres, cuatro o seis fosfatos.

De manera ilustrativa, en algunas realizaciones, una composición incluye un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados; y una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas, estando la región de cabeza anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo e incluyendo el cuerpo alargado una región indicadora que es móvil dentro de la abertura en respuesta a un primer acontecimiento que se produce adyacente al primer lado del nanoporo. Se han proporcionado anteriormente realizaciones ilustrativas de dichas composiciones con referencia al menos a las figs. 1C, 1D, 1E-1M, 5A-5B, 6C-6D, 7A-7B, 8A-8B, 9A-9B, 10A-10C, 11A-11D, 12A-12C, 13A-13E, 20A-20E, 22A-22E, 23A-23C y 24A-24D.

En algunas realizaciones, dicha composición incluye además una polimerasa dispuesta en el primer lado, estando la región de cabeza anclada a la polimerasa. La composición puede incluir además un primer nucleótido y un primer y segundo polinucleótidos, cada uno en contacto con la polimerasa, la polimerasa configurada para añadir el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. Opcionalmente, la polimerasa se puede modificar para retardar la liberación de pirofosfato en respuesta a la adición del primer nucleótido al primer polinucleótido. Por ejemplo, la polimerasa puede incluir una polimerasa 029, B103, GA-1, PZA, 015, BS32, M2Y, Nf, G1, Cp-1, PRD1, PZE, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 o L17 recombinante modificada. Por ejemplo, la polimerasa puede incluir una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: una sustitución de aminoácido en la posición 484, una sustitución de aminoácido en la posición 198 y una sustitución de aminoácido en la posición 381. O, por ejemplo, la polimerasa puede incluir una a Dn polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en E375Y, K512Y, T368F, A484E, A484Y, N387L, T372Q, T372L, K478Y, 1370W, F198W y L381A.

De manera ilustrativa, en algunas realizaciones, un método puede incluir proporcionar un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados; proporcionar una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas, estando la región de cabeza anclada a o adyacente al primer o segundo lado del nanoporo, incluyendo el cuerpo alargado una región indicadora; y mover el indicador dentro de la abertura en respuesta a un primer acontecimiento que se produce adyacente al primer lado del nanoporo. Se han proporcionado anteriormente realizaciones ilustrativas de dichos métodos con referencia al menos a las figs. 3A, 4A-4B y 15.

En algunas realizaciones, el método puede incluir además disponer una polimerasa en el primer lado, estando la región de cabeza anclada a la polimerasa. El método puede incluir además poner en contacto la polimerasa con un primer nucleótido y con un primer y segundo polinucleótidos, añadiendo la polimerasa el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. Opcionalmente, la polimerasa se puede modificar para retardar la liberación de pirofosfato en respuesta a la adición del primer nucleótido al primer polinucleótido. Por ejemplo, la polimerasa puede incluir una polimerasa 029, B103, GA-1, PZA, 015, BS32, m2y , Nf, G1, Cp-1, PRD1, P^z E, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 o L17 recombinante modificada. Por ejemplo, la polimerasa puede incluir una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: una sustitución de aminoácido en la posición 484, una sustitución de aminoácido en la posición 198 y una sustitución de aminoácido en la posición 381. O, por ejemplo, la polimerasa puede incluir una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en E375Y, K512Y, T368F, A484E, A484Y, N387L, T372Q, T372L, K478Y, 1370W, F198W y L381A.

De manera ilustrativa, en algunas realizaciones, una composición puede incluir un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados; una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas, estando la región de cabeza anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo, incluyendo el cuerpo alargado un resto; una polimerasa dispuesta adyacente al primer lado del nanoporo; y un primer nucleótido que incluye un primer marcador alargado, incluyendo el primer marcador alargado un primer resto que interactúa con el resto de la fijación en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido. Se han proporcionado anteriormente realizaciones ilustrativas de dichas composiciones con referencia al menos a las figs. 7A-7B, 8A-8B, 9A-9B, 10A-10C, 11A-11D, 12A-12C, 13A-13E, 16, 17A-17B, 18A-18E, 19A-19C, 20A-20E, 21A-21E, 22A-22F, 23A-23C y 24A-24D.

En algunas realizaciones, la composición incluye además un primer y segundo polinucleótidos en contacto con la polimerasa, la polimerasa configurada para añadir el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. Opcionalmente, la polimerasa se puede modificar para retardar la liberación de pirofosfato en respuesta a la adición del primer nucleótido al primer polinucleótido. Por ejemplo, la polimerasa puede incluir una polimerasa 029, B103, GA-1, PZA, 015, BS32, M2Y, Nf, G1, Cp-1, PRD1, PZE, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 o L17 recombinante modificada. Por ejemplo, la polimerasa puede incluir una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: una sustitución de aminoácido en la posición 484, una sustitución de aminoácido en la posición 198 y una sustitución de aminoácido en la posición 381. O, por ejemplo, la polimerasa puede incluir una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en E375Y, K512Y, T368F, A484E, A484Y, N387L, T372Q, T372L, K478Y, 1370W, F198W y L381A.

De manera adicional, o como alternativa, en algunas realizaciones, el primer resto y el resto de la fijación están configurados para hibridar entre sí para formar una estructura en horquilla. Un sistema puede incluir una composición de este tipo y una fuente de tensión configurada para aplicar una tensión a través del primer y segundo lados. Se han descrito anteriormente ejemplos no limitantes de estructuras en horquilla con referencia a las figs. 26A y 26C. Se han descrito anteriormente sistemas ilustrativos con referencia a al menos las figs. 2A y 2C, y se han descrito anteriormente señales ilustrativas que se pueden producir usando dichos sistemas con referencia a al menos las figs. 2B, 14, 18E, 20E, 21E y 24D. En algunas realizaciones, el primer resto y el resto de la fijación se configuran para deshibridar uno del otro en respuesta a la tensión en un proceso de dos etapas.

De manera adicional, o como alternativa, en algunas realizaciones, el primer marcador alargado incluye además un segundo resto, incluyendo la composición además un tercer resto anclado a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo, interactuando el segundo resto y el tercer resto en respuesta a la adición del primer nucleótido al primer polinucleótido. Un sistema puede incluir una composición de este tipo y una fuente de tensión configurada para aplicar una tensión a través del primer y segundo lados. Se han descrito anteriormente ejemplos no limitantes de terceros restos con referencia a las figs. 26B y 26D. Se han descrito anteriormente sistemas ilustrativos con referencia a al menos las figs. 2A y 2C, y se han descrito anteriormente señales ilustrativas que se pueden producir usando dichos sistemas con referencia a al menos las figs. 2B, 14, 18E, 20E, 21E y 24D. En algunas realizaciones, el primer resto y el resto de la fijación están configurados para separarse uno del otro en respuesta a la tensión en un primer proceso y el segundo resto y el tercer resto están configurados para separarse uno del otro en respuesta a la tensión en un segundo proceso.

De manera ilustrativa, en algunas realizaciones, un método incluye proporcionar un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados; proporcionar una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas, estando la región de cabeza anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo, incluyendo el cuerpo alargado un resto; proporcionar una polimerasa dispuesta adyacente al primer lado del nanoporo; proporcionar un primer nucleótido que incluye un primer marcador alargado, incluyendo el primer marcador alargado un resto; actuar sobre el primer nucleótido con la polimerasa; e interactuar el primer resto con el resto de la fijación en respuesta a la polimerasa que actúa sobre el primer nucleótido. Se han descrito anteriormente métodos ilustrativos con referencia al menos a las figs. 4B y 15.

En algunas realizaciones, el método incluye disponer una polimerasa en el primer lado, estando la región de cabeza anclada a la polimerasa. El método puede incluir además poner en contacto la polimerasa con un primer nucleótido y con un primer y segundo polinucleótidos, añadiendo la polimerasa el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. Opcionalmente, la polimerasa se puede modificar para retardar la liberación de pirofosfato en respuesta a la adición del primer nucleótido al primer polinucleótido. Por ejemplo, la polimerasa puede incluir una polimerasa 029, B103, GA-1, PZA, 015, BS32, M2Y, Nf, G1, Cp-1, PRD1, PZE, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 o L17 recombinante modificada. Por ejemplo, la polimerasa puede incluir una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: una sustitución de aminoácido en la posición 484, una sustitución de aminoácido en la posición 198 y una sustitución de aminoácido en la posición 381. Por ejemplo, la polimerasa puede incluir una ADN polimerasa 029 recombinante modificada que tiene al menos una sustitución de aminoácido o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en E375Y, K512Y, T368F, A484E, A484Y, N387L, T372Q, T372L, K478Y, 1370W, F198W y L381A.

De manera adicional, o como alternativa, en algunas realizaciones, el primer resto y el resto de la fijación hibridan entre sí para formar una estructura en horquilla. Algunas realizaciones incluyen además aplicar una tensión a través del primer y segundo lados. El primer resto y el resto de la fijación se deshibridan uno del otro en respuesta a la tensión en un proceso de dos etapas.

De manera adicional, o como alternativa, en algunas realizaciones, el primer marcador alargado puede incluir además un segundo resto, incluyendo la composición además un tercer resto anclado a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo, interactuando el segundo resto y el tercer resto en respuesta a la adición del primer nucleótido al primer polinucleótido. Algunas realizaciones incluyen además aplicar una tensión a través del primer y segundo lados. El primer resto y el resto de la fijación se pueden separar uno del otro en respuesta a la tensión en un primer proceso y el segundo resto y el tercer resto se pueden separar uno del otro en respuesta a la tensión en un segundo proceso.

Modificaciones opcionales para la secuenciación por síntesis

En realizaciones en las que una polimerasa añade un primer nucleótido a un polinucleótido, p. ej., a un primer polinucleótido que es complementario de un segundo polinucleótido que se secuencia, como en secuenciación por síntesis (SBS), obsérvese que el primer nucleótido se puede acoplar a cualquier terminador reversible adecuado que inhiba la adición por la polimerasa de un segundo nucleótido al primer polinucleótido hasta que se realice una etapa de "desbloqueo".

Por ejemplo, la SBS se puede realizar disponiendo cualquier composición inventiva adecuada en una celda de flujo y los reactivos fluidos para cada etapa en el protocolo de SBS se pueden suministrar a la celda de flujo. Por ejemplo, en SBS, se supervisa la extensión de un cebador de ácido nucleico a lo largo de un molde de ácido nucleico (p. ej., un polinucleótido diana o amplicón del mismo) para determinar la secuencia de nucleótidos en el molde. El proceso químico subyacente puede incluir polimerización (p. ej., catalizada por una enzima polimerasa). En una realización particular de SBS basada en polimerasa, los nucleótidos se añaden a un cebador (extendiendo de este modo el cebador) de una manera dependiente del molde de modo que la detección del orden y el tipo de nucleótidos añadidos al cebador se puede utilizar para determinar la secuencia del molde. Como se proporciona en el presente documento, los nucleótidos pueden incluir marcadores que faciliten la identificación de esos nucleótidos, por ejemplo, usando una composición de nanoporos expuesta en el presente documento.

Las celdas de flujo proporcionan un formato conveniente para albergar una matriz de nanoporos unidos a la polimerasa que se someten a una técnica SBS que implica el suministro repetido de reactivos en ciclos. Para iniciar un primer ciclo de SBS, uno o más nucleótidos marcados pueden hacerse fluir hacia/a través de una celda de flujo que alberga una matriz de nanoporos unidos a polimerasa que han formado un complejo con un ácido nucleico molde que se hibrida con un cebador de secuenciación. Los sitios de una matriz donde la extensión del cebador hace que se incorpore un nucleótido marcado se pueden detectar utilizando composiciones, sistemas y métodos tales como los proporcionados en el presente documento. Opcionalmente, los nucleótidos pueden incluir además un terminador reversible que termina la extensión adicional del cebador una vez que se ha añadido un nucleótido a un cebador. Por ejemplo, el nucleótido que se pone en contacto con un complejo puede incluir un resto terminador reversible que se añade a un cebador de tal manera que no se puede producir extensión posterior hasta que se administra un agente de desbloqueo para eliminar el resto. Por tanto, para realizaciones que utilizan terminación reversible, se puede administrar un reactivo de desbloqueo a la celda de flujo (antes o después de que se produzca la detección). Se pueden llevar a cabo lavados entre las distintas etapas de suministro. A continuación, el ciclo se puede repetir n veces para extender el cebador en n nucleótidos, detectando de este modo una secuencia de longitud n. Se describen procedimientos de SBS, sistemas fluídicos y componentes del sistema de detección ilustrativos que pueden adaptarse fácilmente para su uso en un sistema de método de la presente divulgación, por ejemplo, en Bentley et al., Nature 456: 53-59 (2008), documentos WO 04/018497; US 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281 y US 2008/0108082, cuyo contenido completo de cada uno se incorpora por referencia en el presente documento.

En algunas realizaciones, el marcador se puede proporcionar en la posición del azúcar 3' del nucleótido de modo que el marcador se pueda utilizar para identificar el nucleótido y como un terminador reversible para inhibir la adición por la polimerasa de un segundo nucleótido al primer polinucleótido hasta que se realice una etapa de "desbloqueo".

En algunas realizaciones, se puede proporcionar un terminador reversible en la posición de azúcar 3' del nucleótido y se puede proporcionar un marcador en la base, o viceversa, para mejorar el control sobre, y la confianza en, un proceso de secuenciación de homopolímeros. Por ejemplo, en realizaciones en las que el terminador reversible se proporciona en la posición de azúcar 3' y el marcador se proporciona en la base, se puede realizar un primer proceso de "desbloqueo" para eliminar el terminador reversible y exponer el 3' OH y se puede realizar un segundo proceso de "desbloqueo" para eliminar el marcador, con cualquier orden adecuado del primer y segundo proceso de "desbloqueo". Por ejemplo, el marcador primero se puede quitar, en función de lo cual la señal asociada con dicho marcador ya no se puede observar y la presencia del terminador reversible 3' puede inhibir la adición por la polimerasa de un segundo nucleótido al primer polinucleótido hasta que se realice una segunda etapa de "desbloqueo" para ese terminador reversible. De dicha manera, basándose en la misma señal que se observa en un segundo ciclo antes de realizar la segunda etapa de desbloqueo, la ausencia de señal entre el primer y el segundo ciclos puede confirmar que el marcador se liberó al final del primer ciclo y se volvió a añadir durante el segundo ciclo, aumentando de este modo la confianza de que el polinucleótido es un homopolímero. O, por ejemplo, en realizaciones en las que el terminador reversible se proporciona en la base y el marcador se proporciona en la posición de azúcar 3', la polimerasa puede eliminar el marcador tras la incorporación del nucleótido en un polinucleótido sin necesidad de una etapa química separada.

Adicionalmente, obsérvese que se puede administrar un agente de desbloqueo desde el lado trans (el lado de la barrera opuesto al de los nucleótidos) de una manera que se puede controlar mediante la aplicación selectiva de un gradiente de tensión a través del nanoporo. Se puede esperar que el agente de desbloqueo tenga una concentración eficaz sustancialmente solo en las cercanías del primer lado del nanoporo y se puede esperar que tenga una concentración baja a medida que se difunde en la masa donde reside el conjunto de nucleótidos para no desbloquear los nucleótidos en la masa. Como alternativa, un agente que está configurado para neutralizar o desactivar el agente de desbloqueo puede estar presente en el primer lado del nanoporo. Este agente puede agotarse localmente mediante el transporte del agente de desbloqueo a través del nanoporo y se puede esperar que neutralice o desactive el agente de desbloqueo más lejos del nanoporo, p. ej., en la masa del primer lado, para inhibir el desbloqueo de los nucleótidos en la masa.

En realizaciones particulares, un grupo de bloqueo de 3' OH puede incluir uno o más restos tal como se desvela en la publicación ^pC^t n.° WO 2004/018497, cuyo contenido completo se incorpora por referencia en el presente documento. Por ejemplo, el grupo de bloqueo puede incluir azidometilo (CH2N3) o alilo y el agente de desbloqueo puede incluir un agente reductor fuerte, tal como THP (tris(hidroxipropil)fosfina). Se describen ejemplos adicionales de grupos de bloqueo útiles, por ejemplo, en las siguientes referencias, cuyo contenido completo de cada uno se incorpora por referencia en su totalidad: patente de los Estados Unidos n.° 7.816.503, patente de los Estados Unidos n.° 7.771.903, publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2008/0108082, publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2010/00317531, publicación PCT n.° WO 91/06678, publicación PCT n.° WO 04/018497 y publicación PCT n.° WO 07/123744.

De manera ilustrativa, en algunas realizaciones, una composición incluye un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados; y una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas, estando la región de cabeza anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo e incluyendo el cuerpo alargado una región indicadora que es móvil dentro de la abertura en respuesta a un primer acontecimiento que se produce adyacente al primer lado del nanoporo. La composición puede incluir además una polimerasa dispuesta en el primer lado, estando la región de cabeza anclada a la polimerasa. La composición puede incluir además un primer nucleótido y un primer y segundo polinucleótidos, cada uno en contacto con la polimerasa, la polimerasa configurada para añadir el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. Se han proporcionado anteriormente realizaciones ilustrativas de dichas composiciones con referencia al menos a las figs. 1F, 1M, 5A-5B, 6C-6D, 7A-7B, 8A-8B, 9A-9B, 10A-10C, 11A-11D, 12A-12C, 13A-13E, 20A-20E, 22A-22E, 23A-23C y 24A-24D.

Opcionalmente, el primer nucleótido está acoplado a un terminador reversible que inhibe la adición por la polimerasa de un segundo nucleótido al primer polinucleótido, opcionalmente de una manera que se controla mediante la aplicación selectiva de un gradiente de tensión a través del nanoporo. Se puede esperar que el agente de desbloqueo tenga una concentración eficaz sustancialmente solo en las cercanías del primer lado del nanoporo y se puede esperar que tenga una concentración baja a medida que se difunde en la masa donde reside el conjunto de nucleótidos. Como alternativa, un agente que está configurado para neutralizar o desactivar el agente de desbloqueo puede estar presente en el primer lado del nanoporo. Este agente puede agotarse localmente mediante el transporte del agente de desbloqueo a través del nanoporo y se puede esperar que neutralice o desactive el agente de desbloqueo más lejos del nanoporo, p. ej., en la masa del primer lado, para inhibir el desbloqueo de los nucleótidos en la masa. En algunas realizaciones, el terminador reversible se puede escindir mediante exposición a la luz o al calor. Por ejemplo, el terminador reversible puede escindirse mediante absorción de calor de la luz. En un ejemplo no limitante, el terminador reversible puede incluir una nanopartícula de oro que se calienta lo suficiente por la luz para escindir el terminador reversible. O, por ejemplo, el terminador reversible puede escindirse mediante una reacción fotoquímica inducida por la luz. O, por ejemplo, el terminador reversible puede escindirse mediante reacción con un agente químico. La composición puede incluir además una fuente del agente químico. En algunas realizaciones, el terminador reversible está dispuesto en el primer lado y la fuente del agente químico está dispuesta en el segundo lado de manera que el agente químico se mueva desde el segundo lado al primer lado a través de la abertura. En un ejemplo no limitante, el terminador reversible incluye azidometilo (CH2N3) y el agente químico incluye THP.

En algunas realizaciones, un aparato incluye cualquiera de dichas composiciones, la composición está presente en una celda de flujo y la celda de flujo está configurada para reponer los reactivos que están en contacto con la polimerasa.

De manera ilustrativa, en algunas realizaciones, un método puede incluir proporcionar un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados; proporcionar una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas, estando la región de cabeza anclada a o adyacente al primer o segundo lado del nanoporo, incluyendo el cuerpo alargado una región indicadora; y mover el indicador dentro de la abertura en respuesta a un primer acontecimiento que se produce adyacente al primer lado del nanoporo. Se puede disponer una polimerasa en el primer lado, estando la región de cabeza anclada a la polimerasa. El método puede incluir además poner en contacto la polimerasa con un primer nucleótido y con un primer y segundo polinucleótidos, añadiendo la polimerasa el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. Se han proporcionado anteriormente realizaciones ilustrativas de dichos métodos con referencia al menos a la fig. 15.

Opcionalmente, el primer nucleótido se puede acoplar a un terminador reversible y el método además puede incluir inhibir, mediante el terminador reversible, la adición por la polimerasa de un segundo nucleótido al primer polinucleótido. En algunas realizaciones, el método puede incluir escindir el terminador reversible mediante exposición a luz o calor. Por ejemplo, el método puede incluir escindir el terminador reversible mediante absorción de calor de la luz. O, por ejemplo, el método puede incluir escindir el terminador reversible mediante una reacción fotoquímica inducida por la luz. O, por ejemplo, el método puede incluir escindir el terminador reversible mediante reacción con un agente químico. El método puede incluir opcionalmente proporcionar una fuente del agente químico. El método puede incluir opcionalmente hacer fluir un líquido por la polimerasa para eliminar el agente químico. El método puede incluir opcionalmente aportar nuevos reactivos a la polimerasa mediante flujo líquido. En algunas realizaciones, el terminador reversible está dispuesto en el primer lado y la fuente del agente químico está dispuesta en el segundo lado, y el método incluye mover el agente químico desde el segundo lado al primer lado a través de la abertura. En un ejemplo no limitante, el terminador reversible incluye azidometilo (CH2N3) y el agente químico incluye THP.

De manera ilustrativa, en algunas realizaciones, una composición puede incluir un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados; una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas, estando la región de cabeza anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo, incluyendo el cuerpo alargado un resto; una polimerasa dispuesta adyacente al primer lado del nanoporo; y un primer nucleótido que incluye un primer marcador alargado, incluyendo el primer marcador alargado un primer resto que interactúa con el resto de la fijación en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido. La composición también puede incluir un primer y segundo polinucleótidos en contacto con la polimerasa, la polimerasa configurada para añadir el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. Se han proporcionado anteriormente realizaciones ilustrativas de dichas composiciones con referencia al menos a las figs. 7A-7B, 8A-8B, 9A-9B, 10A-10C, 11A-11D, 12A-12C, 13A-13E, 16, 17A-17B, 18A-18E, 19A-19C, 20A-20E, 21A-21E, 22A-22F, 23A-23C y 24A-24D.

Opcionalmente, el primer marcador alargado puede ser además un resto de un terminador reversible que inhibe la adición por la polimerasa de un segundo nucleótido al primer polinucleótido. Por ejemplo, el terminador reversible puede escindirse para eliminar el marcador alargado del complejo polimerasa-ácido nucleico. La escisión puede ser, por ejemplo, por exposición a la luz o al calor. Por ejemplo, el terminador reversible puede escindirse mediante absorción de calor de la luz. O, por ejemplo, el terminador reversible puede escindirse mediante una reacción fotoquímica inducida por la luz. O, por ejemplo, el terminador reversible puede escindirse mediante reacción con un agente químico. En algunas realizaciones, la composición incluye además una fuente del agente químico. En algunas realizaciones, el terminador reversible está dispuesto en el primer lado y la fuente del agente químico está dispuesta en el segundo lado de manera que el agente químico se mueva desde el segundo lado al primer lado a través de la abertura. En un ejemplo no limitante, el terminador reversible incluye azidometilo (CH2N3) y el agente químico incluye THP.

En algunas realizaciones, un aparato incluye cualquiera de dichas composiciones, la composición está presente en una celda de flujo y la celda de flujo está configurada para reponer los reactivos que están en contacto con la polimerasa.

De manera ilustrativa, en algunas realizaciones, un método incluye proporcionar un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados; proporcionar una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas, estando la región de cabeza anclada a o adyacente al primer lado o segundo lado del nanoporo, incluyendo el cuerpo alargado un resto; proporcionar una polimerasa dispuesta adyacente al primer lado del nanoporo; proporcionar un primer nucleótido que incluye un primer marcador alargado, incluyendo el primer marcador alargado un resto; actuar sobre el primer nucleótido con la polimerasa; e interactuar el primer resto con el resto de la fijación en respuesta a la polimerasa que actúa sobre el primer nucleótido. El método puede incluir además disponer una polimerasa en el primer lado, estando la región de cabeza anclada a la polimerasa. El método puede incluir además poner en contacto la polimerasa con un primer nucleótido y con un primer y segundo polinucleótidos, añadiendo la polimerasa el primer nucleótido al primer polinucleótido basándose en una secuencia del segundo polinucleótido. Se han descrito anteriormente métodos ilustrativos con referencia al menos a la fig. 15.

Opcionalmente, el primer marcador alargado puede incluir un terminador reversible y el método puede incluir además inhibir, mediante el terminador reversible, la adición por la polimerasa de un segundo nucleótido al primer polinucleótido. Por ejemplo, el método puede incluir escindir el terminador reversible mediante exposición a luz o calor. Por ejemplo, el método puede incluir escindir el terminador reversible mediante absorción de calor de la luz. O, por ejemplo, el método puede incluir escindir el terminador reversible mediante una reacción fotoquímica inducida por la luz. O, por ejemplo, el método puede incluir escindir el terminador reversible mediante reacción con un agente químico. El método también puede incluir proporcionar una fuente del agente químico. En algunas realizaciones, el terminador reversible está dispuesto en el primer lado y la fuente del agente químico está dispuesta en el segundo lado, incluyendo el método mover el agente químico del segundo lado al primer lado a través de la abertura. En un ejemplo no limitante, el terminador reversible incluye azidometilo (CH2N3) y el agente químico incluye THP. En algunas realizaciones, el método incluye hacer fluir un líquido por la polimerasa para eliminar el agente químico. El método también puede incluir aportar nuevos reactivos a la polimerasa mediante flujo líquido.

Otras realizaciones alternativas

Aunque se han descrito anteriormente diversas realizaciones ilustrativas de la divulgación, resultará evidente para un experto en la materia que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones sin apartarse de la divulgación. Por ejemplo, aunque determinadas composiciones, sistemas y métodos se han analizado anteriormente con referencia a la detección de acontecimientos asociados con la secuenciación de polinucleótidos tales como ADN o ARN, debe entenderse que las presentes composiciones, sistemas y métodos se pueden adaptar adecuadamente para su uso en la detección de cualquier tipo de acontecimiento, p. ej., el movimiento de una molécula, o una parte de la misma, que puede estar ligado a la presencia o el movimiento de una región indicadora adyacente a una constricción de un nanoporo.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que incluye:

un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados; una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas, estando la región de cabeza anclada a una polimerasa y dispuesta en el primer lado del nanoporo, estando la región de cola dispuesta en el segundo lado, incluyendo el cuerpo alargado un resto;

la polimerasa dispuesta adyacente al primer lado del nanoporo; y

un primer nucleótido que incluye un primer marcador alargado, incluyendo el primer marcador alargado un primer resto que interactúa con el resto de la fijación en respuesta a la acción de la polimerasa sobre el primer nucleótido.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde la región de cola comprende un primer ácido nucleico en donde la composición comprende además un segundo ácido nucleico con el que se hibrida el primer ácido nucleico.

3. La composición de la reivindicación 2, en donde la interacción entre el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico define una doble cadena,

en donde el nanoporo incluye además una constricción dispuesta entre el primer y el segundo lado,

en donde la doble cadena es lo suficientemente grande para inhibir el movimiento de la doble cadena a través de la constricción y

en donde la fijación que comprende la doble cadena inhibe la separación de la polimerasa del nanoporo.

4. Un sistema que incluye la composición de la reivindicación 3 y el circuito de medición configurado para medir una corriente o flujo a través de la constricción o una señal óptica.

5. El sistema de la reivindicación 4, en donde

(i) la corriente o el flujo se basa en el primer resto y en donde el primer nucleótido es identificable en función de la corriente o el flujo o en función de la señal óptica; o

(ii) el primer marcador alargado o el cuerpo alargado incluye además una región indicadora, en donde la corriente o el flujo o la señal óptica se basan en que la región indicadora esté dispuesta dentro de la abertura y en donde el primer nucleótido es identificable en función de la corriente o el flujo o en función de la señal óptica.

6. Un método para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido que incluye:

proporcionar un nanoporo que incluye un primer lado, un segundo lado y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados;

proporcionar una fijación permanente que incluye una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas, estando la región de cabeza anclada a una polimerasa y dispuesta en el primer lado del nanoporo, estando la región de cola dispuesta en el segundo lado, incluyendo el cuerpo alargado un resto; proporcionar la polimerasa dispuesta adyacente al primer lado del nanoporo;

proporcionar un primer nucleótido que incluye un primer marcador alargado, incluyendo el primer marcador alargado un resto;

actuar sobre el primer nucleótido con la polimerasa;

interactuar el primer resto con el resto de la fijación en respuesta a la polimerasa que actúa sobre el primer nucleótido; y

detectar la interacción del primer resto con el resto de la fijación.

7. El método para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido de la reivindicación 6, en donde la región de cola comprende un primer ácido nucleico y en donde el método comprende además hibridar un segundo ácido nucleico con el que se hibrida el primer ácido nucleico.

8. El método para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido de la reivindicación 7, que comprende disponer la región de cabeza en el primer lado del nanoporo y disponer la región de cola en el segundo lado.

9. El método para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido de la reivindicación 8, en donde la interacción entre el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico define una doble cadena;

en donde el nanoporo incluye además una constricción dispuesta entre el primer y el segundo lado;

en donde el método comprende además inhibir, por un tamaño de la doble cadena, el movimiento de la doble cadena a través de la constricción; y

en donde el método comprende además inhibir, por la fijación que comprende la doble cadena, la separación de la polimerasa del nanoporo.

10. El método para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido de la reivindicación 9, que comprende además la medición de una corriente o un flujo a través de la constricción o una señal óptica.

11. El método para detectar la acción de una polimerasa sobre un nucleótido de la reivindicación 10, en donde (i) la corriente o el flujo o la señal óptica se basa en el primer resto, comprendiendo el método además identificar el primer nucleótido en función de la corriente o el flujo o en función de la señal óptica; o

(ii) el primer marcador alargado o el cuerpo alargado incluye además una región indicadora, en donde la corriente o el flujo o la señal óptica se basa en la región indicadora que está dispuesta dentro de la abertura, comprendiendo el método además identificar el primer nucleótido en función de la corriente o el flujo o en función de la señal óptica.

12. Un método para fabricar un dispositivo de secuenciación de nanoporos, que comprende:

proporcionar una cámara que comprende un primer medio líquido separado de un segundo medio líquido por un nanoporo, comprendiendo el nanoporo un primer lado en contacto con el primer medio líquido, un segundo lado en contacto con el segundo medio líquido y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados; proporcionar una polimerasa al primer medio líquido, en donde la polimerasa comprende una fijación, comprendiendo la fijación una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado dispuesto entre ellas, estando la región de cabeza anclada a la polimerasa y dispuesta en el primer lado del nanoporo, estando la región de cola dispuesta en el segundo lado;

proporcionar un resto de captura al segundo medio líquido;

aplicar una corriente o flujo a través del nanoporo para trasladar la región de cola de la fijación a través del nanoporo; y

unir el resto de captura a la región de cola de la fijación, reteniendo de este modo la fijación en el nanoporo.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la fijación comprende un ácido nucleico.

14. El método de la reivindicación 13, en donde la región de cola comprende un ácido nucleico; en donde, opcionalmente, el resto de captura comprende un ácido nucleico que es complementario del ácido nucleico de la región de cola.