ES2588905T3 - Dispositivo microfluídico de compartimentos múltiples para investigación en neurociencias - Google Patents

Dispositivo microfluídico de compartimentos múltiples para investigación en neurociencias

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ES2588905T3
ES2588905T3 ES03773139.5T ES03773139T ES2588905T3 ES 2588905 T3 ES2588905 T3 ES 2588905T3 ES 03773139 T ES03773139 T ES 03773139T ES 2588905 T3 ES2588905 T3 ES 2588905T3
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Noo Li Jeon
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Abstract

Dispositivo para cultivo neural microfluídico de compartimentos múltiples que comprende: por lo menos dos compartimentos independientes separados por una zona de barrera y formados dentro de un polímero transparente ópticamente, presentando la zona de barrera una longitud entre dichos por lo menos dos compartimentos independientes desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200 mm; una pluralidad de canales de tamaño micrométrico en dicha zona de barrera, siendo los canales tanto estrechos como delgados en la anchura de canal y la altura de canal con unas dimensiones de aproximadamente 10 mm o menos, y presentando una longitud de canal igual a la longitud de la zona de barrera; una pluralidad de orificios para servir como entradas de carga y depósitos de medio celular para el intercambio de gases y nutrientes para cada uno de dichos compartimentos independientes; y un sustrato para sellar dicho polímero transparente ópticamente con dichos por lo menos dos compartimentos independientes y dicha zona de barrera.

Description

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DESCRIPCION
Dispositivo microflufdico de compartimentos multiples para investigacion en neurociencias Campo de la invencion
La invencion descrita en la presente memoria se refiere al campo de la nanotecnologfa, concretamente a un dispositivo microflufdico de compartimentos multiples adecuado para investigacion en neurociencias.
Antecedentes
Se describio por primera vez un dispositivo de cultivo de compartimentos multiples para aislamiento neurftico por Campenot para cultivos primarios de neuronas simpaticas. En este metodo, se recubre una placa de cultivo celular con colageno y se raspan lfneas paralelas, separadas 200 p.m, a lo largo de la superficie de la placa. Se sella una pieza de teflon de tres compartimentos en una placa de Petri con grasa de silicona y se siembran en placa neuronas en la pequena camara central de la pieza de teflon. Las neuritas crecen hacia fuera y se adentran en los otros dos compartimentos a ambos lados, alineandose en paralelo a las raspaduras. Se han utilizado variaciones de la camara de Campenot en estudios de diversos tipos de neuronas de proyeccion largas. Sin embargo, la camara de Campenot no funcionaba bien cuando se utilizaba para cultivar neuronas corticales e hipocampicas.
Ivins, et al. desarrollaron una camara disenada para cultivos de neuronas corticales e hipocampicas utilizando una distancia de barrera relativamente corta (150 mm frente a 300 mm en la camara de Campenot clasica). Estas camaras utilizan un cubreobjetos de vidrio fijado a tubos de teflon sometidos a hemiseccion utilizando Sylgard 184 (Dow Corning, Corning NY). Se aplica una pequena cantidad de grasa de vacfo de silicona a la parte inferior del cubreobjetos utilizando un microscopio de diseccion y se coloca todo el aparato sobre la placa de cultivo tisular. Las neuritas se extienden a traves de la barrera de grasa de vacfo entre el poliestireno y el cubreobjetos, si la barrera de grasa de vacfo es lo suficientemente delgada. Un problema de estos dispositivos es que el procedimiento de produccion de las camaras es laborioso y su exito esta directamente relacionado con el nivel de aptitud del individuo que utiliza el dispositivo. Adicionalmente, no existe una alineacion de neuronas y el aparato no es compatible con la obtencion de imagenes de celulas vivas, por tanto, se observaron los efectos de agresiones solo tras fijarse las celulas.
El documento EP 1 174 182 A1 da a conocer un microchip para una reaccion qufmica. El microchip presenta un sustrato de diamante de tamano minusculo. Una pluralidad de partes de combinacion de reaccion qufmica y una trayectoria de comunicacion horizontal que se compone de un canal que se comunica con y conecta dicha pluralidad de partes de combinacion de reaccion qufmica entre sf se forman en la superficie del sustrato de diamante.
El documento EP 1 199 354 A1 da a conocer un metodo de formacion de un patron de celulas sobre una superficie. Se forman patrones previamente en la superficie presentando un patron de moleculas de fomento del crecimiento celular y/o moleculas de inhibicion del crecimiento celular unidas sobre la misma. Se cultivan las celulas sobre dicha superficie con patrones formados previamente de tal manera que formen un patron de celulas sobre dicha superficie.
La patente US n° 5.866.345 da a conocer un dispositivo para detectar la presencia de un analito en una muestra fluida. El dispositivo comprende un sustrato solido microfabricado para definir un orificio de entrada de muestra, un sistema de flujo a escala media que comprende un canal de flujo de muestra en comunicacion de fluido con dicho orificio de entrada, y una zona de deteccion de analito en comunicacion de fluido con dicho canal de flujo, presentando dicha zona de deteccion unas dimensiones a escala media, y una ventana de deteccion dispuesta en dicha zona de deteccion.
Sumario de la invencion
El contenido de la invencion es un dispositivo para cultivo neural microflufdico de compartimentos multiples tal como se define en las reivindicaciones independientes. Se definen las formas de realizacion de la invencion en las reivindicaciones dependientes.
Los metodos de cultivo celular son una tecnica de investigacion utilizada comunmente que permite la manipulacion sistematica del estado de crecimiento de las celulas. En cultivo celular, pueden variarse los medios de cultivo y sustrato en condiciones controladas. Con tecnicas de cultivo bien conocidas, se expone toda la celula a las mismas condiciones. Sin embargo, para la realizacion de experimentos esto no siempre es ventajoso. Algunas celulas pueden ser asimetricas y partes de la celula especializadas. Las neuronas, por ejemplo, estan polarizadas y presentan muchos procedimientos que se extienden por distancias relativamente largas (por ejemplo, axones). La invencion proporciona un dispositivo que permite al investigador modificar mediante ingenierfa microentornos a nivel celular. La capacidad para controlar propiedades flufdicas y de superficie a escala micrometrica, apropiada para la biologfa celular, utilizando procedimientos de microfabricacion proporciona nuevas oportunidades para investigar procesos biologicos fundamentales. Por ejemplo, un investigador puede aislar selectivamente y tratar partes o dominios especializados de la celula. El investigador puede dirigir los sitios de union neuronal y la orientacion y
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longitud del crecimiento de neuritas mediante tecnicas de obtencion de micropatrones tales como impresion por microcontacto. En segundo lugar, manteniendo dominios aislados de manera flmdica dentro del area de cultivo, los investigadores pueden suministrar una serie de estfmulos positivos o negativos al soma, los axones o las dendritas. Las neuronas representan un tipo celular excelente para ilustrar el concepto de aislamiento y tratamiento selectivo y, por tanto, se utilizan en la presente memoria a tttulo de ejemplo. Sin embargo, los expertos ordinarios en la materia apreciaran que las neuronas son un caso de prueba y que el dispositivo descrito en la presente memoria presenta una aplicabilidad a otros tipos de celulas o aplicaciones de tipo biologico.
Las formas de realizacion de la invencion se refieren a un dispositivo neuronal microfabricado que combina tecnicas de microfabricacion, microflmdicas y obtencion de micropatrones de superficie para crear un dispositivo de cultivo neuronal de compartimentos multiples que presenta aplicacion a lo largo de varias utilizaciones diferentes en neurociencia. Pueden obtenerse patrones en superficies de placas de cultivo de vidrio o plastico con moleculas (por ejemplo, poli-lisina y laminina) para guiar la union y el crecimiento, y se fabrica un dispositivo microfabricado con microcanales incrustados y se sella contra el sustrato con patrones. Las neuronas colocadas en el interior del dispositivo microflmdico pueden cultivarse hasta que los axones y las dendritas presentan crecimiento a lo largo de una barrera con canales incrustados, pudiendo aplicarse en ese punto estfmulos positivos o negativos a partes distales de las neuritas. Dado que el dispositivo permite un control activo y aislamiento flrndico de microentornos neuronales u otros, permite a los investigadores explorar nuevas vfas de investigacion para enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo, el investigador puede utilizar el dispositivo para imitar cambios que se predice que suceden en microentornos locales en el cerebro que envejece y enferma. El dispositivo, por ejemplo, es util en la realizacion de investigaciones sobre la enfermedad de Alzheimer (EA) cuando se desea la capacidad para revelar agresiones de manera local en partes de una neurona. Por ejemplo, utilizando el dispositivo, un investigador puede controlar los sitios de union somatica, gradientes de deposito de factores de union en el sustrato, y mantener gradientes de fase de fluido de factores troficos o agresiones neurotoxicas. Debido a que el dispositivo permite la investigacion sobre como responden las neuritas y los somas a diferentes microentornos, el dispositivo presenta una amplia aplicabilidad en otras areas de las neurociencias y es util en la realizacion de investigacion relativa a lesion de la medula espinal (SCI) y/o otras lesiones o enfermedades que afectan al sistema nervioso.
El dispositivo presenta al menos dos compartimentos conectados por una zona que presenta surcos de tamano micrometrico en la parte inferior de una zona de barrera, mientras se mantiene la integridad flmdica. La utilizacion de un polfmero opticamente transparente permite la obtencion de imagenes de celulas vivas, y la microflmdica proporciona un mecanismo para aislar dominios dentro del area de cultivo con la capacidad para suministrar estfmulos positivos o negativos al soma, los axones o las dendritas. Cuando se aplican metodos de obtencion de patrones en sustratos, el dispositivo puede configurarse para dirigir los sitios de union neuronal, orientacion y longitud de crecimiento de neuritas.
El dispositivo se fabrica en una o mas formas de realizacion utilizando tecnicas de litograffa suave, tales como polidimetilsiloxano, PDMS. Una vez producido, el dispositivo de PDMS se coloca sobre una placa de cultivo tisular (poliestireno) o un sustrato de vidrio, formando dos o mas compartimentos. Estos compartimentos estan separados por una barrera ffsica en la que estan incrustados varios surcos de tamano micrometrico para permitir que las neuritas (o alguna otra parte de un organismo celular) crezcan a lo largo de los compartimentos mientras se mantiene aislamiento flrndico. Pueden utilizarse volumenes de menos de 2 ml cada vez. Sin embargo, se considera todavfa que los dispositivos que presentan compartimentos con volumenes mayores o menores se encuentran dentro del alcance de la invencion. Pueden sembrarse en placa celulas en un compartimento somatico (cuerpo celular) y despues de un periodo de tiempo (aproximadamente 3-4 dfas), las neuritas se extienden en el compartimento mediante los surcos. Los pequenos surcos que conectan las dos camaras presentan suficiente diferencia de presion entre los dos compartimentos que puede lograrse viabilidad durante muchas horas. En una o mas formas de realizacion de la invencion, la viabilidad de las neuronas en los dispositivos es de aproximadamente entre el 50-70% despues de 7 dfas en cultivo; esto es ligeramente menor pero comparable con el control que se hace crecer sobre placas de cultivo tisular (el 70%-80%). Por tanto, es evidente una morfologfa neuronal sana tanto en los dispositivos como en los controles.
Los dispositivos que realizan uno o mas aspectos de la invencion presentan la capacidad a traves de la introduccion de presion hidrostatica de aislar las agresiones en un compartimento y, por tanto, exponer areas localizadas de neuronas a las agresiones aplicadas en forma soluble. Por ejemplo, los pequenos surcos que conectan las dos camaras (por ejemplo, somatica y neuntica) presentan suficiente resistencia que una diferencia de presion hidrostatica entre los dos compartimentos da como resultado la capacidad para contener y aislar una agresion biomolecular (es decir, beta-amiloide, MW=3-4 kD) en el compartimento de menor volumen durante muchas horas (por ejemplo, 15 o mas). Por tanto, pueden contenerse las agresiones en un compartimento (por ejemplo, el compartimento neuntico) sin fugas apreciables al compartimento somatico.
Es factible la visualizacion e identificacion de neuronas utilizando obtencion de patrones de polilisina en combinacion con el dispositivo microflmdico. En uno o mas casos, se construye el dispositivo para que presente multiples camaras. Al menos una de estas camaras esta configurada para dirigir los sitios de union neuronal y la orientacion del crecimiento de neuritas mediante tecnicas de obtencion de micropatrones, combinadas con compartimentos aislados de manera flmdica con el area de cultivo. La capacidad para dirigir los sitios de union neuronal y la
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orientacion del crecimiento de neuritas mediante tecnicas de obtencion de micropatrones, combinadas con compartimentos aislados de manera flmdica dentro del area de cultivo ofrece ventajas significativas con respecto a los metodos de cultivo abierto habituales y otros metodos convencionales para manipular distintos microentornos neuronales. El dispositivo puede presentar dos o mas compartimentos, permitiendo de ese modo la aplicacion de sustancias a mas de una ubicacion neufftica y puede aplicarse a celulas neuronales y no neuronales.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 ilustra un procedimiento para fabricar la camara neuronal configurada segun una forma de realizacion de la invencion.
La figura 2 representa la viabilidad de neuronas en el interior del dispositivo microfabricado configurado segun una forma de realizacion de la invencion.
La figura 3 ilustra el aislamiento flmdico utilizando mediciones de intensidad de fluorescencia de fluorescema (400 Da) en los compartimentos somatico y neufftico.
La figura 4 ilustra una demostracion de cultivo neuronal en el interior del dispositivo microfabricado y la eficacia de contencion de agresiones neuffticas.
La figura 5 ilustra que cuando se utiliza obtencion de micropatrones en sustratos el dispositivo microfabricado permite el crecimiento orientado de procesos neuronales a lo largo de camaras aisladas de manera flmdica.
La figura 6 ilustra un esquema de los diferentes enfoques para la obtencion de patrones en neuronas para controlar la direccion de crecimiento.
La figura 7 ilustra un diagrama esquematico de una red microflmdica y un generador microflmdico representativo.
La figura 8 ilustra micrograffas de fluorescencia que muestran gradientes de fluorescema (b) lineales y (c, d) parabolicos en disolucion.
La figura 9 ilustra micrograffas de fluorescencia de gradientes complejos posibles con el enfoque microflmdico.
La figura 10 ilustra el efecto de disminuir linealmente la concentracion de IL-8 sobre la migracion de neutrofilos.
La figura 11 ilustra una representacion esquematica del dispositivo de barrera virtual y ejemplos de barreras virtuales entre dos disoluciones marcadas con fluorescencia.
La figura 12 ilustra un esquema para la fabricacion de neurocamara microflmdica de barrera virtual.
Aunque las figuras 1 a 6 describen la presente invencion, las figuras 7 a 12 proporcionan informacion util adicional a la invencion.
Descripcion detallada de la invencion
La invencion se refiere a un dispositivo microflmdico de compartimentos multiples para neurociencias u otra investigacion. En la siguiente descripcion a fftulo de ejemplo se exponen numerosos detalles espedficos para proporcionar una comprension mas completa de formas de realizacion de la invencion. Sin embargo, resultara evidente para un experto ordinario que la presente invencion puede ponerse en practica sin incorporar todos los aspectos de los detalles espedficos descritos en la presente memoria. Las cantidades y mediciones contenidas en la presente memoria son aproximaciones que pueden variarse en algunos casos en cualquier grado que permita que la invencion logre la funcion para la que esta disenada. En otros casos, no se han descrito en detalle caracteffsticas, cantidades o mediciones espedficas bien conocidas por los expertos ordinarios en la materia de modo que no se desdibuje la invencion. Debe apreciarse, que aunque se exponen ejemplos de la invencion en la presente memoria, las reivindicaciones y el alcance total de cualquier equivalente, son lo que definen los ffmites de la invencion.
Fabricacion de dispositivos neuronales
El dispositivo de cultivo neuronal configurado segun una o mas formas de realizacion de la invencion se crea utilizando tecnicas de microfabricacion, tales como fotolitograffa, para crear un molde maestro con resolucion micrometrica. La litograffa suave es un metodo rentable utilizado para replicar camaras y dispositivos a partir de un molde “maestro”, habitualmente utilizando el elastomero, polidimetilsiloxano (PDMS). Por tanto, los dispositivos pueden fabricarse para una sola utilizacion para minimizar problemas de contaminacion y reproducibilidad. Debido a que una vez que se forma un molde, la replicacion de un dispositivo de PDMS es relativamente sencilla, el enfoque permite la fabricacion reproducible de varios dispositivos para cada serie experimental.
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La figura 1 ilustra un procedimiento para fabricar una camara neuronal configurada segun una forma de realizacion de la invencion. Los procedimientos de fabricacion ilustrados en la presente memoria son proporcionados a tftulo de ejemplo unicamente y tambien son posibles otros metodos para producir el dispositivo microflmdico descrito. Tal como se muestra en la figura 1, una pieza superior de la camara se fabrica de PDMS mediante moldeo contra un molde maestro que presenta un patron de material fotosensible de dos niveles. Las etapas A y B muestran la formacion de microsurcos (03 mm de alto y □ 10 mm de ancho) en el molde maestro utilizando una capa delgada de material fotosensible. El tamano de los surcos esta disenado para limitar las neuronas en la camara somatica mientras se permite que los procesos neunticos en crecimiento atraviesen de una camara a otra. Sin embargo, los tamanos pueden variar dependiendo de las circunstancias, y otros tamanos que tambien logran esto mismo o una funcion similar tambien se consideran parte de la invencion. Los surcos bien definidos con dimensiones controladas permiten que cada camara funcione de modo aislado de manera flrndica. Las etapas C y D muestran la etapa de fabricacion para compartimentos principales para camaras somaticas y neunticas. Dos camaras, separadas por una barrera, forman areas aisladas de manera flrndica que, por ejemplo, contienen cada una menos de 2 ml de fluido (100 mm de alto, 1500 mm de ancho y 8 mm de largo). Otras disposiciones de camaras que implican mas de 2 camaras y/o diferentes geometnas de formas tambien se contemplan comprendidas dentro del alcance de la invencion. En la forma de realizacion de la invencion ilustrada en la figura 1, la parte superior del dispositivo se forma mediante moldeo de replicas de PDMS contra el molde maestro (etapa E). El desmoldeo de PDMS y su sellado en un sustrato plano completa la fabricacion de la camara neuronal (etapa F). En al menos un caso, todo el dispositivo puede caber en un cubreobjetos de vidrio de 25,4 mm x 50,8 mm (1”x 2”) o un sustrato comparable y compatible con microscopfa de fase o DlC y de fluorescencia. El dispositivo puede unirse covalentemente al vidrio mediante tratamiento con plasma de aire o simplemente prensarse sobre placas de cultivo tisular de poliestireno para crear sellados impermeables con los sustratos.
Tal como se menciono anteriormente, el molde maestro para cada dispositivo puede fabricarse mediante la obtencion de patrones en dos capas de material fotosensible. Mas espedficamente, una impresora de alta resolucion (por ejemplo, 7874 ppcm (20.000 ppp)) puede proporcionar un mecanismo para generar una primera mascara de transparencia a partir de un archivo CAD para crear un conjunto de microcanales (por ejemplo, de aproximadamente 10 mm de ancho, separados 50 mm, aunque tambien se contemplan otras variaciones). Puede hacerse girar el material fotosensible SU-8 5 sobre una oblea de silicio limpiada con plasma de aire a una velocidad de aproximadamente 4000 rpm durante aproximadamente 60 s para obtener un grosor aproximado de 3 mm. Puede utilizarse la mascara de transparencia para obtener patrones en el material fotosensible SU-8 5 y puede utilizarse SU-8 50 como segunda capa y hacerse girar a aproximadamente 1000 rpm durante aproximadamente 60 s. Puede utilizarse una segunda mascara para crear areas de camara (por ejemplo, camaras somatica y neuntica) imprimiendo y alineando la segunda mascara con respecto al primer patron. En una forma de realizacion de la invencion, se imprime la segunda mascara a aproximadamente 2000 ppcm (5080 ppp) con una resolucion de aproximadamente 35 mm alineada con respecto al primer patron. Aunque un experto ordinario en la materia apreciara que tambien estan disponibles otras alternativas de enmascarado.
Despues del revelado, puede colocarse la oblea en una placa de Petri limpia y tratarse (por ejemplo, con (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidroxi)triclorosilano) para facilitar la retirada del PDMS del molde maestro. Puede producirse PDMS utilizando una razon 10:1 de prepolfmero y catalizador o utilizando cualquier otra tecnica de moldeo aceptable. La placa de Petri que contiene la oblea puede calentarse entonces (por ejemplo, en una estufa seca durante 1 hora a 70°C) y puede utilizarse etanol o algun otro producto qdmico con propiedades de esterilizacion para esterilizar los dispositivos. Los cubreobjetos de vidrio (22 mm - 30 mm, grosor n.° 1, apropiados) pueden limpiarse mediante sonicacion en una disolucion en etanol durante 30 min y luego tratarse en un limpiador con plasma de aire durante 10 min para retirar materiales residuales de las superficies. Las placas de cultivo tisular y los cubreobjetos de vidrio pueden recubrirse con poli-L-lisina (Sigma) a 50 mg/ml en H2O esteril durante 2 horas a temperatura ambiente. Los dispositivos y las placas de cultivo tisular se secan al aire normalmente durante un periodo de tiempo (por ejemplo, durante la noche) antes de su utilizacion.
Cultivo de neuronas corticales de rata embrionarias
El dispositivo es adaptable para su utilizacion en una variedad de entornos de cultivo y puede utilizarse, por ejemplo, para cultivar neuronas corticales de rata E18 u otras neuronas. Para fines de ilustracion, el procedimiento de utilizacion de cortezas de embriones de rata E18 se describe en la presente memoria. Sin embargo, tal como reconocera un experto en la materia a partir de la invencion descrita en la presente memoria, la invencion no se limita a este ejemplo espedfico, pero presenta utilizaciones en muchos entornos de cultivo diferentes.
En resumen, pueden diseccionarse cortezas de embriones de rata E18 en CMF-HBSS [solucion salina equilibrada de Hank libre de calcio y magnesio (HBSS) que contiene piruvato 1 mM, bicarbonato de sodio 4,2 mM y albumina serica bovina (BSA) al 0,3%], enjuagarse con CMF, y resuspenderse en una disolucion de tripsina (tripsina al 0,125% en CMF-HBSS que contiene EDTA 0,5 mM) durante 7 min a 37°C o 25 min a la temperatura ambiental. Puede anadirse sobre la tripsinizacion medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene suero de ternero fetal al 10%, luego puede centrifugarse el tejido a 1000 rpm durante 1 min, y puede resuspenderse el sedimento celular resultante en 2 ml de medio de cultivo (medio neurobasal, Gibco 21103, que contiene suplemento
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B27, Gibco i7504, GlutaMAX, Gibco 35050, y penicilina-estreptomicina, Gibco 15070). Tras la trituracion a traves de pipetas Pasteur pulidas a la llama con el diametro restringido como maximo al 50%, la suspension celular puede filtrarse a traves de un filtro celular de 40 mm, y determinarse la viabilidad con azul trfpano. Pueden sembrarse en placa celulas con densidades de desde 1 hasta 4 x 106 celulas/ml. Para sembrar en el interior de dispositivos microfabricados, puede diluirse la suspension celular 25 veces con respecto al control para obtener una densidad celular por area comparable.
Microscopia
Pueden tomarse imagenes de contraste de fase y de epifluorescencia de cultivos dentro del dispositivo utilizando un sistema de captura de imagen digital (por ejemplo, un microscopio invertido NikonTE300), una camara CCD y MetaMorph (Universal Imaging, PA). Puede utilizarse DG-4 como fuente de luz de excitacion que presenta un obturador interno controlado por MetaMorph para tomar imagenes en el transcurso del tiempo a diferentes longitudes de onda de excitacion. Tambien es factible utilizar una platina motorizada para tomar imagenes en multiples ubicaciones en la totalidad de las muestras. El beneficio de utilizar esta o cualquier otra tecnica de imagen es que permite al investigador monitorizar la actividad dentro del dispositivo microflufdico con fines de observacion. Por tanto, la invencion contempla la utilizacion de cualquier sistema de imagen adaptado para su utilizacion con el dispositivo microflufdico descrito en la presente memoria.
Obtencion de patrones en sustratos
Es factible absorber selectivamente y obtener patrones de poli-L-lisina en la superficie de placas de cultivo tisular. El molde elastomerico de PDMS, que presenta (por ejemplo) lfneas de 25 mm y espacios con una profundidad de 50 mm, puede colarse a partir de obleas de silicio con patrones generadas con SU-8 50 utilizando fotolitograffa. La mezcla 10:1 desgasificada de elastomero y agentes de curado puede verterse entonces sobre un patron maestro y curarse a 70°C durante 1 hora. Puede esterilizarse el molde de PDMS con etanol y permitirse que se seque durante al menos 1 h; puede utilizarse una placa de cultivo tisular esteril como sustrato para el molde. Puede ponerse una gota de una disolucion de 50 mg/ml de poli-L-lisina (PLL) en agua desionizada (DI) esteril en un extremo abierto de la red de canales, que llena los canales por accion capilar. Despues de llenar los canales, se incuba la disolucion durante un periodo de tiempo (por ejemplo, una hora) para permitir la absorcion sobre la superficie. Despues de esta etapa, se retira el molde de PDMS y se utiliza una disolucion tampon nueva o agua desionizada esteril para eliminar por lavado la disolucion en exceso.
Puede utilizarse impresion por microcontacto para crear poli-L-lisina sobre el cubreobjetos. La estampa elastomerica de PDMS que presenta lfneas de 25 mm y espacios con una profundidad de 10 mm puede colarse a partir de obleas de silicio con patrones generadas con SU-8 10 utilizando fotolitograffa. La mezcla 10:1 desgasificada de elastomero y agente de curado puede verterse sobre un patron maestro y curarse a 70°C durante 1 hora. La estampa de elastomero puede desprenderse del patron maestro despues de enfriamiento. Puede prepararse la tinta bajo la atmosfera ambiental utilizando una disolucion 5 mg/ml de octadeciltriclorosilano (OTS) en un disolvente de hexano. La cara con patrones de la estampa de PDMS puede recubrirse con una disolucion de OTS mediante una tecnica de recubrimiento por rotacion a 1500 rpm durante 30 segundos, secarse en una corriente de argon durante 30 segundos, y luego colocarse encima de una superficie de vidrio limpiada previamente y mantenerse en contacto con la estampa tintada durante 30 segundos. Despues de la impresion por contacto, la muestra con patrones de OTS puede enjuagarse meticulosamente con alcohol isopropflico y sumergirse en una disolucion de 50 mg/ml de PLL en agua durante 2 horas. Una vez creada, la muestra puede enjuagarse con agua y secarse. Pueden verificarse los micropatrones en los sustratos de vidrio utilizando microscopia de fluorescencia; la superficie con micropatrones puede exponerse a una disolucion de isotiocianato de fluorescefna (FITC; Molecular Probes, Eugene, OR) 10 mg/ml en PBS (pH 7,4, 50 mM) a 37°C durante 30 min: el grupo NH2 terminal reacciona con el grupo isotiocianato de FITC produciendo patrones de PLL conjugada con FITC. El sustrato de vidrio con patrones puede lavarse entonces con agua DI y etanol.
Diseno de dispositivos neuronales
En una o mas formas de realizacion de la invencion, se fabrican los dispositivos de cultivo neuronal de PDMS. Producir los dispositivos utilizando PDMS es beneficioso (pero no se requiere) porque: (1) PDMS es opticamente transparente y muy adecuado para la obtencion de imagenes de celulas vivas, (2) pueden producirse muchos moldes a partir del mismo molde maestro con resultados reproducibles, (3) PDMS puede sellarse covalentemente en vidrio utilizando union por plasma, y (4) tambien puede producirse un sellado impermeable con poliestireno u otros sustratos planos mediante contacto conforme. Pueden utilizarse placas de cultivo tisular tanto de vidrio como de poliestireno como sustratos para el dispositivo.
Es posible permanecer dentro del alcance y espfritu de la invencion adaptando la forma y disposicion generalizada de los dispositivos de cultivo neuronal descritos en la presente memoria. Cualquier dispositivo que comprenda al menos dos compartimentos independientes (por ejemplo, compartimentos neurftico y somatico) y que presente una zona central, independientemente de la forma, se encuentra dentro del alcance de la invencion. Los compartimentos
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neurftico y somatico estan conectados por una zona central que presenta varios microsurcos de una determina anchura, altura y longitud. Diversos tamanos, formas, configuraciones y numero de surcos son posibles. Por ejemplo, un dispositivo de compartimentos multiples afsla somas en un solo compartimento, mientras que permite que crezcan las neuritas a traves de una barrera con canales de tamano micrometrico incrustadas en una camara que contiene unicamente neuritas. La distancia de la zona central puede variar. Por ejemplo, cuando se utilizan cultivos de neuronas corticales e hipocampicas, puede ser necesario optimizar el crecimiento creando una camara que permite que las neuritas entren en el compartimento exterior despues de un periodo de crecimiento moderado. A veces son utiles camaras con una distancia de barrera relativamente corta (por ejemplo, □ 100 mm frente a D300 mm). Las tecnicas de microfabricacion garantizan que el dispositivo puede aislar de manera flufdica las camaras somatica y neurftica mientras que todavfa permiten que crezcan las neuritas a traves de la barrera. El dispositivo microflufdico configurado segun la invencion presenta zonas de barrera virtual o ffsica.
En una forma de realizacion de la invencion, por ejemplo, el dispositivo contiene 120 surcos, de 10 mm de ancho, 3 mm de alto y 150 mm de longitud. Los surcos pueden estar separados, por ejemplo, 50 mm para impedir que colapsen los surcos. Otros tamanos de surcos y separaciones son posibles, pero en terminos generales el tamano de los surcos debe ser lo suficientemente pequeno como para que las neuronas disociadas durante la carga no pasen al compartimento neurftico contiguo. Este diseno simplifica el procedimiento de carga y permite la colocacion selectiva de neuronas en un compartimento.
En una forma de realizacion de la invencion, se colocan orificios en cada dispositivo que sirven como entradas de carga y depositos de medio celular para el intercambio de gases y nutrientes. El dispositivo puede contener, por ejemplo, cuatro orificios (de 8 mm de diametro), dos en ambos extremos de cada compartimento. Cuando se utilizan orificios pequenos (de 2,3 mm de diametro), los dispositivos se secan rapidamente despues de unos pocos dfas. Aunque se anada frecuentemente medio de cultivo celular, existe una baja viabilidad celular con orificios tan pequenos debido al escaso intercambio de nutrientes, desechos y gases tales como CO2. En una forma de realizacion ejemplificativa, el volumen en cada compartimento cubierto (es decir, sin los depositos) es de menos de 2 ml. En comparacion, los depositos combinados para cada compartimento pueden contener hasta 400 ml. Al disponer de volumenes de cultivo tan pequenos, pueden reducirse las cantidades de reactivos con respecto a los metodos de cultivo tradicionales.
Despues de un periodo de tiempo variable (por ejemplo, de aproximadamente 3-4 dfas) de crecimiento, las neuritas del compartimento somatico se extienden en el compartimento neurftico. Aunque son factibles otras velocidades de crecimiento, la velocidad de crecimiento de neuritas en pruebas realizadas utilizando formas de realizacion de la invencion fue de entre 50 y 100 mm al dfa. Despues de una cantidad de tiempo apropiada (por ejemplo, 7 dfas, o cuando se desea una agresion), puede transferirse una cantidad de medio (por ejemplo, 15 ml) del compartimento neurftico al compartimento somatico, dejando una diferencia neta de volumen (por ejemplo, de 30 ml, suponiendo que se han equilibrado los volumenes en los dos compartimentos durante los ultimos 7 dfas). Puede administrarse entonces una disolucion (por ejemplo, 5 ml) que contiene la agresion al lado neurftico. Cuando se realizan estas operaciones, es importante proceder con precaucion cuando se anaden y retiran cantidades equivalentes a los pocillos en el mismo lado para minimizar efectos de flujo convectivo.
Barrera virtual
La barrera virtual no forma parte de la presente invencion, pero se describe con fines ilustrativos.
Las camaras de barrera virtual se basan en el hecho de que el flujo de lfquidos en capilares presenta a menudo un bajo numero de Reynolds (Re) y es laminar. Cuando confluyen dos o mas corrientes con bajo Re para proporcionar una sola corriente, las corrientes combinadas fluyen en paralelo entre sf sin mezclado turbulento. Esta capacidad para generar y sostener corrientes paralelas de diferentes disoluciones en capilares entre dos corrientes puede utilizarse como barrera virtual. Haciendo pasar corrientes de diferentes disoluciones que contienen medios (verde) y agresion (rojo) sobre las neuronas, el dispositivo puede mantener una barrera virtual y exponer solamente una parte seleccionada de la neurona a los estfmulos o la agresion. La figura 11 ilustra una representacion esquematica del dispositivo de barrera virtual y ejemplos de barreras virtuales entre dos disoluciones marcadas con fluorescencia. Puede colocarse una pieza de PDMS que contiene microcanal en forma de Y incrustado en su superficie y unirse a un cubreobjetos de vidrio para formar una red de canales. Pueden infundirse fluidos en el canal utilizando bombas de jeringa tal como se indica en el esquema. La micrograffa de fluorescencia muestra la union en la que convergen las dos corrientes, una que contiene dextrano marcado con FITC (representativo de los medios) y la otra que contiene dextrano marcado con Texas Red (representativo de la agresion). La anchura relativa de las corrientes puede controlarse ajustando las velocidades de flujo volumetricas de las corrientes. La razon volumetrica de flujo verde/rojo vario entre 1, 3 y 5 para (A), (B), (C) respectivamente. La figura 11 representa la demostracion satisfactoria de la camara de barrera virtual. El dispositivo microflufdico puede prepararse colocando una pieza de PDMS con canales incrustados (de 300 mm de ancho y 100 mm de alto) sobre un sustrato plano. Puede fabricarse una forma de realizacion como un microcanal “en forma de Y” que presentan dos entradas que convergen en un solo canal principal. Las dos entradas se conectaron a bombas de jeringa que contenfan FITC-dextrano (verde) y Texas Red-dextrano (rojo), respectivamente. Permitiendo que fluyan diferentes disoluciones desde las entradas, se crearon
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corrientes paralelas de diferentes liquidos en el canal principal. En estas condiciones, no existe turbulencia y las corrientes fluyen unas junto a otras con mezclado por difusion. La anchura de la corriente y la posicion de la interfase entre corrientes adyacentes pueden controlarse ajustando las cantidades relativas de fluido inyectado en cada entrada. A medida que se aumento la razon de velocidad de flujo para la disolucion verde/roja, aumento la anchura relativa de las disoluciones verdes de manera correspondiente tal como se muestra en la serie de micrograffas de fluorescencia en las figuras 11a a 11c.
La figura 12 ilustra un esquema para la fabricacion de una neurocamara microflufdica de barrera virtual. Este diseno utiliza un diseno de “canal en Y” que se aprovecha de las caracterfsticas de flujo laminar del comportamiento de flujo para exponer selectivamente partes de neuronas a agresiones apoptoticas. Sin embargo, son factibles disenos que presentan otras geometrfas. La rapida obtencion de prototipos de tales dispositivos a medida puede realizarse en menos de 24 horas. Por tanto, es posible probar muchas geometrfas diferentes. El procedimiento comienza con el diseno de la maqueta del dispositivo utilizando un programa CAD a partir del que se generara una fotomascara de transparencia de alta resolucion. Esta fotomascara puede utilizarse para exponer selectivamente un material fotosensible (polfmero sensible a la luz) grueso que se hizo girar sobre un sustrato plano (es decir, oblea de Si), figura 12A. El revelado del material fotosensible dejara un relieve positivo que puede servir como molde maestro que presenta un relieve positivo (150 mm) de microcanal “en forma de Y”, figura 12B. Se formara un relieve negativo de PDMS mediante colado y curado del prepolfmero de PDMS frente al molde maestro positivo, figura 12C. Esta replica de PDMS con canal incrustado puede unirse contra un sustrato de vidrio para producir las camaras y los sistemas de canales microflufdicos requeridos. Pueden perforarse orificios de entrada y salida para el fluido y las celulas a partir del PDMS utilizando una herramienta afilada, figura 12D. Debe esterilizarse el dispositivo completado utilizando etanol y secarse antes de su utilizacion.
Barrera ffsica
La fabricacion de la camara de barrera ffsica segun la presente invencion es similar a la camara de barrera virtual excepto por una etapa de fotolitograffa adicional para generar una serie de pequenos canales en la barrera que permitiran que crezcan los procesos de neuronas a lo largo de la barrera al tiempo que se minimiza el mezclado de fluidos. La primera etapa de fotolitograffa (figuras 1A y 1B) genera el relieve de canales estrechos y delgados con dimensiones de menos de 10 mm. La longitud de los canales, que define la longitud de la barrera entre las camaras somatica y neurftica, puede variar entre D50 y D200 mm. La anchura de barrera optima que permite que las neuritas crezcan a lo largo en un tiempo razonable (varios dfas) y aun realicen una funcion de barrera reproducible depende de las situaciones de la prueba. El tamano asf como la densidad de estos canales pueden variarse para un crecimiento optimo. La segunda etapa de fotolitograffa, figuras 1C y 1D, definira los microcompartimentos en los que se cultivaran las neuronas. Estas areas seran relativamente mas grandes (de 150 mm de alto, 1500 mm de ancho y 1,5 cm de largo) en comparacion con el primer patron para los canales.
Una vez que se fabrica el molde maestro, puede colarse y curarse el prepolfmero de PDMS para replicar el patron en relieve, y colocarse sobre un sustrato plano para completar el dispositivo. Antes de ensamblar el PDMS con un sustrato, pueden perforarse orificios para deposito en el PDMS utilizando una simple herramienta afilada para permitir la adicion y retirada de medios y otras agresiones. Debido a que el volumen total de lfquido para llenar la camara de este tamano es minusculo (D25 ml) en comparacion con los volumenes necesarios para una camara de Campenot o placa de Petri convencional (varios ml), la cantidad de agresiones y medios requeridos para los experimentos se reduce drasticamente.
Otro diseno serfa someter a ataque qufmicos los microcanales en el sustrato de vidrio o plastico al tiempo que se mantiene una barrera solida en PDMS. La fabricacion del dispositivo microflufdico es mas sencilla y mas facil de usar si puede utilizarse con cualquier sustrato plano. La fabricacion de canales en el sustrato requerira el acceso a salas blancas e instrumentos sofisticados a los que no tienen acceso la mayorfa de laboratorios de biologfa. Si el dispositivo de barrera ffsica no puede mantener la integridad flufdica, el investigador puede cargar diferentes cantidades de lfquido en las camaras de tal manera que el flujo lento de lfquido contrarresta el mezclado de agonistas en la camara somatica. Por ejemplo, puede anadirse ligeramente mas volumen de lfquido en la camara somatica en comparacion con la camara neurftica (en la que se introduciran agresiones) para generar presion hidrostatica de tal manera que las agresiones desde la camara neurftica no prosperen a lo largo de la barrera.
Diseno de la camara
Tal como se expone en la seccion anterior, se representan dos disenos de camara distintos, pero tambien son factibles otros disenos o un hfbrido de ambos disenos. Los dos disenos representados presentan diferentes ventajas y desventajas. Aunque el diseno y la fabricacion de la camara de barrera virtual (que no es segun la invencion) son mas sencillos, el experimento que utiliza este dispositivo requiere mas mano de obra y equipos. De la manera mas importante, esta camara requiere una bomba de jeringa dedicada (u otros modos adecuados para suministrar dos o mas corrientes que contienen medios y agresion de manera controlada) de tal manera que solo puede realizarse un experimento con un dispositivo. Puesto que la barrera virtual solo existe para la perfusion constante de fluidos, la
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cantidad de reactivos requeridos para este metodo puede ser significativa (□varios ml), comparable a lo que ocurre para metodos convencionales.
En comparacion, el diseno de barrera ffsica segun la presente invencion permite experimentos en un modo paralelo, es decir, pueden prepararse varias camaras, cargarse con neuronas, y aun puede utilizarse cada camara para someter a prueba diferentes condiciones experimentales. El principal inconveniente del diseno de barrera ffsica es que la fabricacion del molde “maestro” supone un reto mas importante y precisa esfuerzos de ingenierfa considerables para optimizar el diseno de la camara para garantizar que las camaras estan aisladas de manera flufdica. Para determinar un diseno optimo, la camara de barrera ffsica puede someterse a prueba de manera extensa utilizando colorantes fluorescentes y marcados con isotopos.
Viabilidad de neuronas en el interior del dispositivo microfabricado
La viabilidad de neuronas en el dispositivo es importante porque demuestra que las neuronas son sanas y no se ven adversamente afectadas por el microentorno del dispositivo y los materiales que se utilizaron en la fabricacion. Cuando se compara la viabilidad de neuronas en el interior del dispositivo microfabricado con un control (placa de cultivo tisular) despues de 7 dfas de cultivo, puede determinarse una estimacion en cuanto a la viabilidad. Se evaluo la viabilidad utilizando tincion de celulas vivas/muertas con homodfmero de etidio y calcefna AM (Molecular Probes). Se muestran los resultados en la figura 2. La viabilidad en el dispositivo fue aproximadamente 10-20% menor que en los controles de cultivo tisular. La viabilidad de neuronas puede ser muy sensible con respecto a la densidad celular. Para obtener datos de viabilidad exactos, se realizaron pruebas utilizando densidades celulares similares en los dispositivos y controles. Se utilizo una densidad de siembra en placa de 3 □ 106 celulas/ml para los dispositivos y se diluyo esto 1:25 para los controles de cultivo tisular que proporcionaron un promedio de 1,5 □ 105 celulas/cm2 tanto para dispositivos como para controles. Para cada experimento, se utilizaron tres dispositivos y un control. Si se considero que los tres dispositivos eran equivalentes, se realizo la tincion de celulas vivas/muertas solamente en una de las muestras. Morfologicamente, las celulas en los dispositivos eran equivalentes a los controles tal como se muestra en la figura 2A, B. La viabilidad ligeramente menor en el interior de los dispositivos puede deberse a un aumento de la concentracion de sal debido a evaporacion y un menor intercambio de gases y nutrientes debido al menor volumen total de medios. Ademas, puede quedarse atrapada una razon aumentada de celulas muertas en el dispositivo debido a la pequena altura de compartimento (100 mm).
Aplicacion dirigida, aislamiento y caracterizacion de agresiones
El dispositivo neuronal configurado segun al menos una forma de realizacion de la invencion permite a los usuarios iniciar agresiones dirigidas aislando la agresion en el compartimento neuronal utilizando presion hidrostatica o algun otro modo para minimizar la migracion/difusion a otros compartimentos (por ejemplo, el compartimento somatico). Para preparar el dispositivo para iniciar tales agresiones, el usuario sella normalmente la parte superior del dispositivo en una placa de cultivo. Por ejemplo, el usuario puede sellar por contacto el PDMS encima de la placa de cultivo tisular recubierta con polilisina. El dispositivo microfabricado puede llenarse entonces con PBS (^200 ml en cada camara somatica y neurftica) y colocarse en un incubador saturado con agua durante 12 h para que se igualen los niveles de fluido. Una vez que se prepara de manera apropiada el dispositivo, puede utilizarse el siguiente procedimiento a tftulo de ejemplo para crear presion hidrostatica entre las camaras: puede anadirse una cantidad de PBS (por ejemplo, aprox. 125 ml) al compartimento somatico, dividiendo el volumen entre los dos depositos. Luego, puede anadirse rapidamente una cantidad (por ejemplo, aproximadamente 100 ml) de fluorescefna (6 mM) en PBS al compartimento neurftico, de nuevo dividiendo el volumen entre los dos depositos. El volumen ligeramente mayor en el lado somatico provoca un flujo neto lento de lfquido del compartimento somatico al neurftico que actua en contra de las fugas o la difusion de fluorescefna del compartimento neurftico al somatico.
Para determinar la eficacia, pueden tomarse imagenes de fluorescencia cada media hora durante mas de 15 h utilizando un tiempo de exposicion de 200 ms con un filtro de FITC en tres ubicaciones independientes a cada lado de las camaras somatica y neurftica. Pueden obtenerse mediciones de intensidad registrando la lectura de intensidad promedio de cada imagen. La figura 3 ilustra el aislamiento flufdico utilizando mediciones de intensidad de fluorescencia de fluorescefna (400 Da) en los compartimentos somatico y neurftico. El lado izquierdo es la camara somatica (300), y el derecho es la camara neurftica (304). La lfnea blanca de puntos delinea los lfmites de la barrera (302). (A) La micrograffa de fluorescencia inicial (t = 1 h) muestra que la fluorescefna se afsla en el compartimento neurftico. (B) Una micrograffa de fluorescencia de la misma zona despues de 15 h muestra que la agresion esta todavfa aislada en el compartimento neurftico. (C) muestra la intensidad de fluorescencia de fluorescefna en los compartimentos somatico y neurftico en funcion del tiempo (306). La intensidad de fluorescencia en el lado somatico a niveles de fondo (por ejemplo, por debajo del 7% de la intensidad maxima (es decir, nivel de ruido)) durante mas de 15 h, indicando que no existen fugas de fluorescefna al compartimento somatico durante este periodo. La intensidad de fluorescencia de fluorescefna en el compartimento neurftico disminuye hasta el 50% del maximo debido a dilucion por el flujo neto de fluido desde el compartimento somatico. Se obtuvieron resultados similares para dispositivos con vidrio (datos no representados). El grafico indica que se afsla la fluorescefna en el lado neurftico en la totalidad del periodo de medicion, pero podrfa sostener tal aislamiento durante periodos de tiempo mas prolongados.
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Existen diversos modos de ilustrar la funcion y la eficacia del dispositivo descrito en la presente memoria. En una forma de realizacion de la invencion, pueden cultivarse neuronas en el dispositivo microfabricado de manera que permite que las neuritas se extiendan por el compartimento neurftico. La figura 4 ilustra una demostracion de cultivo neuronal en el interior del dispositivo microfabricado y la eficacia de contencion de agresiones neurfticas.
Pueden anadirse calcefna AM y Texas Red-dextrano (MW) 10 kDa) a la camara neurftica para una mejor visibilidad antes de tomar las micrograffas. Puede configurarse una diferencia de presion hidrostatica positiva entre las camaras somatica y neurftica tal como se explica en la figura 3. La figura 4A es una micrograffa de contraste de fase de las neuronas en el dispositivo microfabricado despues de un periodo de tiempo en cultivo (por ejemplo, 4 dfas). Se anadieron Texas Red-dextrano (10 kDa) y calcefna AM (1 kDa) al compartimento neurftico 1 h antes de tomar la micrograffa de fluorescencia, figura 4B. Se establecio una ligera altura piezometrica, correspondiente a un volumen diferencial de 20 ml de medio, en el lado somatico para garantizar que el dextrano o la calcefna AM no migraban del lado neurftico al somatico. Se utilizo Texas Red-dextrano para simular la agresion en el compartimento neurftico y se delinea claramente por el lfmite de la barrera (figura 4B). Puesto que se anadio calcefna AM al compartimento neurftico, solamente se iluminaron las neuronas con procesos que entran en este compartimento. La imagen de contraste de fase muestra neuronas adicionales que no se tineron con calcefna AM porque no presentaban procesos que se extiendan en el compartimento neurftico; esto ilustra que el compartimento neurftico esta aislado de manera flufdica.
Obtencion de micropatrones en sustratos
Ademas de simplemente aislar somas de sus procesos, formas de realizacion de la invencion pueden obtener patrones de crecimiento de neuritas en el sustrato en el interior del dispositivo microfabricado. La obtencion de micropatrones de las celulas y sus procesos facilita la identificacion de celulas y mejora la visualizacion de resultados. Por ejemplo, si es necesario investigar la perturbacion en el transporte de cargas celulares tales como mitocondrias despues de lesion hasta procesos neuronales distales, es de ayuda determinar la direccion de transporte identificando la posicion relativa de un soma con respecto a sus neuritas. En un cultivo al azar en una placa de cultivo tisular, debido a las neuritas y los axones en redes enmaranadas, esta simple determinacion no puede realizarse facilmente. Si el cuerpo celular esta situado en un lado del dispositivo (en el lado somatico) y se gufan y se orientan sus procesos en una direccion predeterminada, puede simplificarse enormemente la determinacion de transporte anterogrado o retrogrado.
La figura 6 ilustra un esquema de los diferentes enfoques para la obtencion de patrones en neuronas. Puede utilizarse fotolitograffa (A), micromoldeo en capilares (MIMIC) (B), impresion por microcontacto (C), y cualquier otra metodologfa que logre el mismo resultado o uno similar para obtener patrones de protefnas que fomentan la union y el crecimiento neuronales selectivos y confinan el crecimiento de neuritas.
Cuando se utiliza fotolitograffa para generar tales patrones, se reviste un sustrato de vidrio o poliestireno recubierto con poli-lisina o laminina, con una mascara (600) (por ejemplo, fotomascara de cromo sobre cuarzo) y se ilumina con luz Uv (por ejemplo, una lampara de mercurio de baja presion). Una fotomascara (600) que presenta tiras de zonas opacas da como resultado un patron positivo de tiras de protefnas protegidas. Se expondra la laminina (602) bajo el area transparente de la fotomascara a UV y se inactiva (604), perdiendo tanto su actividad de fomento del crecimiento de neuritas como gran parte de su reactividad con anticuerpos antilaminina. La poli-lisina expuesta a UV tambien muestra propiedades similares.
El micromoldeo en capilares (MIMIC) representa una alternativa a la fotolitograffa que puede producir patrones de protefnas asf como otras moleculas biologicas. En MIMIC, se coloca un molde elastomerico (PDMS) sobre el sustrato con una estructura en relieve en el molde que forma una red de canales vacfos. Con la geometrfa de canal correcta, una disolucion acuosa colocada en un lado de los canales los llenara por accion capilar. Entonces se deja la disolucion en los canales durante una cantidad de tiempo fijada para permitir la absorcion sobre la superficie.
Otro metodo a tftulo de ejemplo de obtencion de patrones, la impresion por microcontacto, puede utilizarse para crear lfneas de poli-L-lisina en el cubreobjetos. La impresion por microcontacto utiliza una estampa elastomerica (PDMS con una estructura en relieve con patrones en su superficie) para imprimir una variante de moleculas con resolucion micrometrica. Puede producirse una estampa elastomerica mediante curado de PDMS frente a un molde maestro microfabricado. La superficie se recubre con las moleculas deseadas (para impresion de protefnas, se expone la estampa de PDMS a plasma de oxfgeno para volver su superficie hidrofila) y se pone en contacto conforme con el sustrato. Si se utiliza una estampa con tiras de lfneas (regiones elevadas) separadas por espacios (regiones rebajadas) tal como se muestra en la figura, las moleculas/protefnas de la zona elevada se transferiran sobre el sustrato huesped. La impresion por microcontacto presenta la ventaja de simplicidad y conveniencia: una vez que esta disponible la estampa, pueden producirse multiples copias del patron de protefna utilizando un metodo sencillo. La impresion por microcontacto funciona particularmente bien en sustratos de vidrio debido a la superficie lisa del vidrio.
La figura 5 ilustra que cuando se utiliza obtencion de micropatrones en sustratos, el dispositivo microfabricado permite el crecimiento orientado de procesos neuronales a lo largo de camaras aisladas de manera flufdica. La
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invencion contempla diversos mecanismos para la obtencion de patrones en sustratos, sin embargo, en una forma de realizacion ejemplificativa (vease por ejemplo, la figura 5A) micrograffa de fluorescencia de lineas con patrones de polilisina conjugadas con FITC en una placa de cultivo tisular de poliestireno. Puede utilizarse MIMIC para obtener patrones en lineas con anchuras de 25 mm y una separacion de 25 mm. Las lineas brillantes indican la zona de polilisina con patrones conjugada con FITC. La figura 5B ilustra micrograffa de fluorescencia de lineas de polilisina impresas por microcontacto conjugadas con FITC en un cubreobjetos de vidrio. Puede utilizarse impresion por microcontacto para obtener patrones en lineas con anchuras de 25 mm y una separacion de 25 mm. La figura 5C representa una micrograffa de fase de neuritas que atraviesan la barrera desde la camara somatica a la neurftica mediante los surcos al tiempo que siguen el patron de polilisina en una placa de cultivo tisular con patrones mediante MIMIC (por ejemplo, lineas de 25 mm de ancho con una separacion de 25 mm).
Tal como se menciono brevemente anteriormente y se describe a continuacion con mayor detalle, formas de realizacion de la invencion utilizan MIMIC para obtener patrones en placas de cultivo tisular con polilisina. MIMIC representa una tecnica que puede obtener patrones de protefna y otras moleculas biologicas. En MIMIC, se coloca el molde de PDMS en la superficie del sustrato de plastico y entra en contacto conforme con el sustrato. La estructura en relieve en el molde forma una red de canales vacfos. Es aconsejable utilizar condiciones esteriles para crear estos patrones de MIMIC. Cuando se retira el molde de PDMS, permanece un patron de protefna en el sustrato. La figura 5A representa una micrograffa de fluorescencia de FITC, que se conjugo con grupos amina en la polilisina. La impresion por microcontacto (pCP) es un metodo eficaz para la obtencion de patrones de protefnas, polfmeros y monocapas autoensambladas (SAM). La impresion por microcontacto utiliza una estampa elastomerica (PDMS con una estructura en relieve con patrones en su superficie) para imprimir una variedad de moleculas con resolucion micrometrica. Puede producirse una estampa elastomerica mediante el curado de PDMS frente a un molde maestro microfabricado. La superficie se recubre con las moleculas deseadas (para imprimir protefnas, se expondra la estampa de PDMS a un plasma de oxfgeno para volver su superficie hidrofila) y se pone en contacto conforme en con el sustrato. Si se utiliza una estampa con tiras de zonas elevadas separadas por zonas rebajadas, las moleculas/ protefnas de la zona elevada se transfieren sobre el sustrato huesped. La figura 5B representa el patron de polilisina conjugada con FITC en vidrio utilizando impresion por microcontacto. La figura 5C representa el crecimiento de neuritas a lo largo de la barrera, mediante los surcos, a lo largo de lineas de polilisina con patrones. Puede formarse el patron de polilisina en una forma de realizacion de la invencion en una placa de cultivo tisular utilizando MIMIC. La obtencion de patrones de los sustratos con polilisina antes del ensamblaje con un dispositivo de PDMS se simplifica debido a que el patron de polilisina puede secarse e incluso esterilizarse con etanol. Esta figura ilustra que los metodos de obtencion de patrones en sustratos (por ejemplo, impresion por microcontacto y MIMIC) pueden combinarse con un dispositivo microfabricado para dirigir los sitios de union neuronal y la orientacion de crecimiento de neuritas. Combinado con compartimentos aislados de manera flufdica, este enfoque ofrece ventajas significativas con respecto a metodos de cultivo abierto habituales y otros metodos convencionales para manipular distintos microentornos neuronales.
Generador de gradientes microfluidicos
Los generadores de gradientes microfluidicos estan fuera del alcance de la presente invencion, pero se describe para ilustracion.
La figura 7 ilustra un diagrama esquematico de una red microflufdica y un generador microflufdico representativo. Los dos canales entrantes (A y B) se conectan a fuentes de fluido (por ejemplo, disoluciones de colorante). A medida que las corrientes de colorantes se desplazan por la red, se dividen repetidamente en los nodos, se combinan con corrientes vecinas y se permite que se mezclen por difusion en los canales de serpentfn. Cuando se combinan las corrientes en un solo canal ancho despues de varias generaciones de canales de ramificacion, se forma un gradiente en la concentracion del colorante a lo largo del canal en perpendicular a la direccion de flujo.
La generacion de gradientes utilizando una red de canales microfluidicos se basa en el mezclado controlado de fluidos de flujo laminar mediante division repetida, mezclado y recombinacion de corrientes de fluido. Puesto que el intercambio de moleculas entre corrientes laminares se produce exclusivamente por difusion, es importante que los canales sean estrechos (20-50 mm) y el intervalo de tiempo que dos corrientes de flujo laminar pasan fluyendo una al lado de otra en el canal de serpentfn sea lo suficientemente largo como para que los fluidos se mezclen por completo (la longitud de la zona de mezclado de serpentfn era de 10 mm, y las velocidades de flujo eran de entre 0,1-1 mm/s).
Una molecula pequena (por ejemplo, fluorescefna) difunde aproximadamente 55 mm en el plazo de un segundo (utilizando D = 5,0 x 10"6 cm2/s para fluorescefna). Al final del canal amplio, se recoge el fluido en un deposito de desechos. El perfil de concentracion en una seccion particular a lo largo de los pequenos canales de la red o el canal amplio es constante a lo largo del tiempo (es decir, las concentraciones dentro del canal estan en estado estacionario), porque las disoluciones se anaden y se retiran continuamente del sistema.
La figura 8 ilustra micrograffas de fluorescencia que muestran gradientes de fluorescefna (b) lineales y (c, d) parabolicos en disolucion. La red microflufdica utilizada para generar estos gradientes presentaba 3 entradas y 9
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salidas (a). La concentracion de las disoluciones introducidas en cada entrada de la red microflufdica se indica encima de las micrograffas. Las representaciones graficas por encima de las micrograffas muestran el perfil de intensidad de fluorescencia correspondiente (lfnea verde) a lo largo del canal amplio (900 mm de ancho) 500 mm aguas abajo (L, lfnea de puntos blanca) desde la union. Los perfiles de concentracion de fluorescefna calculados teoricamente se muestran como puntos redondos negros. Los puntos y las lfneas grises en las graficas muestran la contribucion calculada de las entradas individuales al perfil global. La velocidad de flujo en el canal amplio es de 1 mm/s. Utilizar una red de canales microflufdicos se basa en el mezclado controlado de fluidos de flujo laminar mediante la division repetida, el mezclado y la recombinacion de corrientes de fluido. La figura 8 muestra tres perfiles de concentracion distintos generados utilizando una red que presenta tres entradas y nueve salidas; los gradientes se obtuvieron permutando el orden en las entradas de tres disoluciones diferentes que contenfan fluorescefna al 100, al 50 y al 0% (fluorescefna en tampon NaHCO3 100 mM, pH 8,3). El proposito de este tipo de dispositivo microflufdico es dividir, combinar y mezclar las disoluciones introducidas en la entrada de modo controlado. Al tiempo que se mantiene bajo el numero de entradas, la division en la red piramidal aumenta el numero de corrientes que portan diferentes concentraciones y que se juntan en el canal amplio. Como resultado, pueden aproximarse gradientes complejos con gradientes escalonados compuestos por un gran numero de pequenos escalones. La variedad de formas de gradiente que pueden producirse utilizando este metodo incluye lineales, parabolicas, periodicas, y otras.
La figura 9 ilustra micrograffas de fluorescencia de gradientes complejos posibles con el enfoque microflufdico. (A) Micrograffas de dos gradientes periodicos diferentes que consisten en partes lineales (en diente de sierra) y partes parabolicas (en forma de joroba). (B) Micrograffa de gradientes periodicos, solapantes en diente de sierra de fluorescefna (verde) y rodamina (rojo). Las representaciones graficas por debajo de las micrograffas muestran el perfil de intensidad de fluorescencia correspondiente a lo largo de los canales. Los gradientes calculados (puntos redondos) y experimentales mostraron una buena concordancia en todos los experimentos. La figura 9 muestra tres ejemplos de gradientes de concentracion complejos utilizando este enfoque. Los gradientes en diente de sierra y en forma de silla de montar pueden producirse facilmente. La principal ventaja de generar gradientes qufmicos utilizando el sistema microflufdico es que pueden configurarse gradientes precisos (a escala micrometrica, relevantes para la biologfa celular) y mantenerse durante varias horas. Ademas, pueden crearse formas complejas y gradientes solapantes.
Para demostrar la factibilidad de utilizar la camara microflufdica de generador de gradientes para estudiar celulas vivas, se utilizo este dispositivo microflufdico para observar satisfactoriamente la quimiotaxia de los neutrofilos en un gradiente de quimiocina. La demostracion satisfactoria de la migracion de neutrofilos en un gradiente de IL-8 utilizando la camara de quimiotaxia microflufdica ilustra su enorme potencial en la investigacion del comportamiento de las neuronas en un entorno microflufdico controlado y el guiado del crecimiento de neuritas en un gradiente de neurotrofinas o moleculas de guiado axonal. El dispositivo microflufdico puede colocarse en un microscopio durante el experimento y tomarse micrograffas de transcurso temporal a intervalos de 15 s. Se utiliza una bomba de jeringa controlada por ordenador para infundir los medios y quimiocina en el dispositivo. Se colocaron las celulas en una banda estrecha (figuras 10A y B) a lo largo del borde izquierdo del canal al comienzo del experimento y se permitio que migrasen a lo largo del canal durante 90 minutos. El efecto de disminuir linealmente la concentracion de IL-8 sobre la migracion de neutrofilos se muestra en la figura 10A. Se colocaron inicialmente las celulas en el lado con la mayor concentracion de IL-8 y se permitio que migrasen. Despues de 90 minutos, las celulas permanecieron en el lado izquierdo del canal. En contraste nftido, la figura 10B muestra el efecto de revertir el gradiente lineal establecido en el experimento anterior. Se colocaron inicialmente las celulas en el lado izquierdo con la menor concentracion de IL-8. Noventa minutos despues de la introduccion del gradiente, la mayor parte de las celulas se movieron a lo largo del dispositivo hacia el lado con la mayor concentracion. En la figura 10C, los neutrofilos se distribuyeron inicialmente al azar en la totalidad del canal y se aplico un gradiente lineal de IL-8. Despues de 90 minutos, la mayor parte de los neutrofilos se han movido hacia el lado con la mayor concentracion de IL-8. Ademas, los datos de migracion cuantitativa obtenidos a partir de estos experimentos preliminares con neutrofilos (es decir, velocidad de migracion) concuerdan bien con los valores notificados en la bibliograffa. Las celulas de cancer humano producen quimiotaxia de manera similar cuando se exponen a gradientes de una variedad de factores de crecimiento (datos no representados). La demostracion satisfactoria de la migracion de neutrofilos en un gradiente de IL-8 utilizando la camara de quimiotaxia microflufdica ilustra su enorme potencial en la investigacion del comportamiento de las neuronas en un entorno microflufdico controlado.
Conclusion
Las formas de realizacion de la invencion se refieren a un dispositivo de cultivo neuronal microfabricado que permite el crecimiento dirigido de neuritas y el aislamiento de neuritas de sus cuerpos celulares. El dispositivo puede utilizar presion hidrostatica para aislar agresiones en un compartimento y, por tanto, exponer areas localizadas de neuronas a las agresiones. Debido a la alta resistencia de los microsurcos para el transporte de fluidos, se contienen las agresiones en el compartimento neurftico sin fugas apreciables al compartimento somatico durante un determinado periodo de tiempo (por ejemplo, mas de 15 h). Una forma de realizacion de la invencion utiliza la obtencion de patrones de polilisina en combinacion con el dispositivo microfabricado para facilitar la identificacion y visualizacion de neuronas. La capacidad para dirigir los sitios de union neuronal y la orientacion de crecimiento de neuritas mediante tecnicas de obtencion de micropatrones, combinadas con compartimentos aislados de manera flufdica
dentro del area de cultivo, ofrece ventajas significativas con respecto a metodos de cultivo abierto habituales y otros metodos convencionales para manipular distintos microentornos neuronales.

Claims (9)

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    REIVINDICACIONES
    1. Dispositivo para cultivo neural microflufdico de compartimentos multiples que comprende:
    por lo menos dos compartimentos independientes separados por una zona de barrera y formados dentro de un polfmero transparente opticamente, presentando la zona de barrera una longitud entre dichos por lo menos dos compartimentos independientes desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200 mm;
    una pluralidad de canales de tamano micrometrico en dicha zona de barrera, siendo los canales tanto estrechos como delgados en la anchura de canal y la altura de canal con unas dimensiones de aproximadamente 10 mm o menos, y presentando una longitud de canal igual a la longitud de la zona de barrera;
    una pluralidad de orificios para servir como entradas de carga y depositos de medio celular para el intercambio de gases y nutrientes para cada uno de dichos compartimentos independientes; y
    un sustrato para sellar dicho polfmero transparente opticamente con dichos por lo menos dos compartimentos independientes y dicha zona de barrera.
  2. 2. Dispositivo neural microflufdico de compartimentos multiples segun la reivindicacion 1, en el que dichos compartimentos independientes estan dispuestos paralelos entre sf y acoplados con dicha zona de barrera.
  3. 3. Dispositivo neural microflufdico de compartimentos multiples segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho sustrato es poliestireno.
  4. 4. Dispositivo neural microflufdico de compartimentos multiples segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas anchura de canal, altura de canal y longitud de canal de cada uno de dicha pluralidad de canales de tamano micrometrico es de aproximadamente 10 mm, aproximadamente 3 mm y aproximadamente 150 mm, respectivamente.
  5. 5. Dispositivo neural microflufdico de compartimentos multiples segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho sustrato es vidrio plano.
  6. 6. Dispositivo neural microflufdico de compartimentos multiples segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho polfmero transparente opticamente es el polidimetilsiloxano (PDMS).
  7. 7. Dispositivo neural microflufdico de compartimentos multiples segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los canales en dicha pluralidad de canales de tamano micrometrico estan separados aproximadamente 50 mm.
  8. 8. Dispositivo neural microflufdico de compartimentos multiples segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha zona de barrera presenta una anchura establecida de manera optima para permitir que crezcan las neuritas a lo largo de dicha zona de barrera desde un primero de dichos compartimentos independientes hasta un segundo de dichos compartimentos independientes en aproximadamente 3-4 dfas.
  9. 9. Dispositivo para cultivo neural microflufdico de compartimentos multiples que comprende:
    por lo menos dos compartimentos independientes separados por una zona de barrera y formados dentro de polidimetilsiloxano (PDMS), presentando la zona de barrera una longitud entre dichos por lo menos dos compartimentos independientes desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200 mm;
    una pluralidad de canales de tamano micrometrico en dicha zona de barrera, siendo los canales tanto estrechos como delgados con dimensiones inferiores a 10 mm, y presentando una longitud de canal igual a la longitud de la zona de barrera;
    una pluralidad de orificios para servir como entradas de carga y depositos de medio celular para el intercambio de gases y nutrientes para cada uno de dichos por lo menos dos compartimentos independientes; y
    un sustrato para sellar dicho PDMS con dichos por lo menos dos compartimentos independientes y dicha zona de barrera.
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