ES2326459B1 - Indolocarbazoles glicosilados, su procedimiento de obtencion y sus usos. - Google Patents
Indolocarbazoles glicosilados, su procedimiento de obtencion y sus usos. Download PDFInfo
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Abstract
Indolocarbazoles glicosilados, su procedimiento
de obtención y sus usos. Esta invención se refiere a derivados de
rebecamicina y estaurosporina obtenidos por fermentación de cepas
bacterianas recombinantes. La invención se refiere también a los
procedimientos empleados para la obtención de las cepas
recombinantes y la producción de derivados de rebecamicina y
estaurosporina. La invención también se refiere a cepas bacterianas
útiles para la producción de derivados de rebecamicina y
estaurosporina. Finalmente, los derivados de rebecamicina y
estaurosporina aquí descritos son de aplicación en el campo de la
salud humana, en concreto para fabricar medicamentos útiles en el
tratamiento de enfermedades tumorales, neurológicas e
inflamatorias.
Description
Indolocarbazoles glicosilados, su procedimiento
de obtención y sus usos.
La invención se adscribe al campo farmacéutico y
en concreto se refiere a compuestos con aplicación en oncología,
con estructura química derivada de indolocarbazol, y que se
obtienen por fermentación de microorganismos.
Más de 120 productos naturales de tipo
indolocarbazol han sido aislados a partir de bacterias, hongos e
invertebrados marinos (Studies in Natural Product Chemistry,
Elsevier, Amsterdam, vol. 12, pp. 365-409, 1993;
Chem. Rev. 2002, 102: 4303-4427; Nat.
Prod. Rep. 2006, 23, 1007-1045). Entre estos
compuestos de origen natural destacan la estaurosporina (STP, Fig.
1) y la rebecamicina (REM), que son indolocarbazoles glicosilados
producidos por bacterias del grupo de los actinomicetos (U.S. Pat.
No. 4,487,925; U.S. Pat. No 4,552,842; J. Antibiot. 1977, 30,
275-282; Tetrahedron Lett. 1985, 26,
4011-4014; J. Antibiot. 1987, 40,
668-678; Nat. Prod Rep. 2006, 23,
1007-1045). Además, se ha obtenido un elevado número
de derivados de tipo indolocarbazol, incluyendo indolocarbazoles
glicosilados, mediante síntesis química o
semi-síntesis (Studies in Natural Product
Chemistry, Elsevier, Amsterdam, vol. 12, pp.
365-409, 1993; Chem. Rev. 2002, 102:
4303-4427; Eur. J. Med. Chem. 2003, 38,
123-140; Curr. Med Chem.
Anti-cáncer Agents 2002, 2,
255-266; Anti-cáncer Drug
Design 2000, 15, 43-52; J. Med. Chem.
2005, 48, 2600-2611; U.S. Pat. No. 4,785,085;
EP0545195; EP0602597; WO9807433; WO9902532; WO9530682; US Pat. No.
5,475,110; US Pat. No. 5,468,872; U.S Pat. Num. 6,686,385; U.S Pat.
Num. 6,610,727; U.S. Pat. No. 6,855,698).
Los indolocarbazoles presentan una amplia
variedad de actividades biológicas de interés farmacéutico, con
propiedades antibacterianas, antifúngicas, antivirales,
hipotensivas, antitumorales o neuroprotectoras. Por ejemplo, la
rebecamicina (U.S. Pat. Nos. 4,487,925 y 4,552,842) y su análogo
hidrosoluble
6-(2-dietilaminoetil)-rebecamicina
(U.S. Pat. No. 4,785,085) presentan actividad antitumoral. Estas
actividades biológicas pueden ser el resultado de diferentes
mecanismos de acción, incluyendo la inhibición de proteína
quinasas, la inhibición de DNA topoisomerasas o la unión
intercalativa al DNA (Anti-cáncer Drug Design
2000, 15, 43-52; Curr. Med. Chem.
Anti-cáncer Agents 2002, 2,
255-266; Eur. J. Med Chem. 2003, 38,
123-140; Nat. Prod Rep. 2006, 23,
1007-1045). Varios derivados de indolocarbazol han
entrado en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer o de
ciertas enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson (Nat.
Prod. Rep. 2005, 22: 162-195; Nat. Prod.
Rep. 2006, 23, 1007-1045). La mayoría de estos
derivados son glicósidos, los cuales son generalmente más potentes
que los correspondientes aglicones (Eur. J. Med. Chem. 2003,
38, 123-140; J. Med. Chem. 2005, 48,
2600-2611). En los glicósidos, el azúcar puede
estar unido al indolocarbazol mediante un único enlace
N-glicosídico (como en el caso de la RBM, Fig. 1) o bien
mediante dos enlaces, que consisten en un enlace
N-glicosidico y un enlace C-N adicional (como
en la STP). Otra diferencia relevante entre las estructuras de la
RBM y la STP se encuentra en el grupo pinol, que incluye una amida
en la RBM y una imida en la STP. Estas diferencias son de gran
importancia para el mecanismo de acción del compuesto, ya que la RBM
es un inhibidor de la DNA topoisomerasa I, mientras que la STP es
un inhibidor de proteína quinasas.
Actualmente existe una gran necesidad de nuevos
agentes antitumorales, con actividad mejorada, con menos efectos
secundarios indeseables y con mayor selectividad, en comparación
con los fármacos actualmente en uso. Tradicionalmente, la industria
farmacéutica ha desarrollado nuevos fármacos mediante dos vías
fundamentales: (1) búsqueda de nuevos productos naturales, y (2)
síntesis y/o modificación química de determinados compuestos. Estos
métodos siguen siendo útiles, pero suelen requerir inversiones muy
importantes de recursos (tiempo, dinero, energía), pues normalmente
es necesario analizar miles de productos para encontrar un nuevo
compuesto prometedor. El desarrollo de la tecnología del ADN
recombinante ha abierto un interesante campo de investigación para
la generación de nuevos compuestos bioactivos mediante la
manipulación de genes implicados en la biosíntesis de agentes
antitumorales, principalmente de bacterias del grupo de los
actinomicetos (Trends Biotechnol. 2001, 19,
449-456; J. Mol. Microbiol. Biotechnol.
2005, 9, 77-85; Curr. Opin. Drug Discov.
Devel. 2005, 8, 748-756; J. Ind Microbiol.
Biotechnol 2006, 33, 560-568; Curr. Opin.
Microbiol. 2006, 9, 252-260). Estas técnicas
también pueden ser usadas para mejorar la producción de compuestos
naturales ya conocidos, pues las cepas naturales suelen producir
bajas concentraciones del metabolito de interés.
La manipulación genética de microorganismos ha
sido ya utilizada para la obtención de varias decenas de derivados
de tipo indolocarbazol (ES2255331-A1 2006;
Chem. Biol. 2002, 9, 519-531; Biosci.
Biotechnol. Biochem. 2003, 67, 127-138;
Proc. Natl. Acad Sci. USA 2005, 102, 461-466;
Mol. Microbiol. 2005, 58, 17-27). Al menos
algunos de estos derivados presentan actividad antitumoral (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102, 461-466). La
biosíntesis de indolocarbazoles glicosilados puede conseguirse
mediante la expresión de cuatro genes para la formación del aglicón,
un gen que codifica una glicosiltransferasa, y un número variable
de genes que codifican enzimas para la formación del azúcar. La
expresión de un gen adicional (staN) permite la producción
de análogos de STP, con el azúcar unido al aglicón mediante dos
enlaces (Mol. Microbiol. 2005, 58, 17-27). La
expresión de todos estos genes en una célula huésped adecuada da
lugar a una ruta biosintética como, por ejemplo, la ilustrada en la
Fig. 2.
La presente invención proporciona nuevos
compuestos derivados de Rebecamicina y Estaurosporina,
pertenecientes a la familia de indolocarbazoles glicosilados. La
presente invención también proporciona nuevas cepas bacterianas que
producen indolocarbazoles glicosilados. Estas cepas bacterianas son
obtenidas mediante la introducción de ciertos ácidos nucleicos
adicionales en cepas de Streptomyces spp. no productoras de
indolocarbazoles, en particular de Streptomyces albus. Los
ácidos nucleicos mencionados son de dos tipos. El primer tipo
consiste en ácidos nucleicos que codifican actividades enzimáticas
implicadas en la biosíntesis de Rebecamicina y Estaurosporina, y
pueden ser obtenidos a partir de Lechevalieria
aerocolonigenes ATCC39243, Streptomyces longisporoflavus
DSM10189 o de cualquier otro organismo productor de
indolocarbazoles. El segundo tipo consiste en ácidos nucleicos que
codifican actividades enzimáticas implicadas en la biosíntesis de
azúcares que forman parte de la estructura de diversos glicósidos
(glicósidos tales como RBM, STP, eritromicina, oleandomicina,
urdamicina, u otros), y pueden ser obtenidos a partir de
Lechevalieria aerocolonigenes ATCC39243, Streptomyces
longisporoflavus DSM10189, Saccharopolyspora erythraea
NRRL2338, Streptomyces antibioticus ATCC11891,
Streptomyces fradiae Tü2717 o cualquier organismo productor
de glicósidos.
La introducción de ácidos nucleicos en
Streptomyces spp. se puede realizar mediante transformación
de protoplastos, conjugación u otros métodos conocidos (tales como
los descritos en Practical Streptomyces genetics, The John
Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000), de tal forma que
los ácidos nucleicos son replicables en el organismo, bien en forma
de elemento extracromosómico o bien integrados en el cromosoma del
organismo.
Las cepas bacterianas de esta invención pueden
ser cultivadas en cualquier medio adecuado, en condiciones que
permitan su crecimiento, tal como se describe en Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 2005, 102, 461-466; Mol.
Microbiol. 2005, 58, 17-27. Tras varios días de
incubación, estos cultivos contienen una cantidad elevada de células
(micelio), junto con una mezcla de compuestos, incluyendo derivados
de indolocarbazol. A continuación, los cultivos son sometidos a
procesos para la separación de una fase liquida (sobrenadante) y
una fase sólida (micelio). Seguidamente las dos fases son
sometidas, separadamente, a diversos procedimientos que pueden
incluir extracción con diversos solventes orgánicos y varios tipos
de cromatografias (tales como HPLC, cromatografia líquida de alta
presión), con el fin de obtener los derivados de indolocarbazol en
forma de compuestos puros. Los derivados de indolocarbazol tienen
actividad antitumoral y neuroprotectora, actividad inhibidora de
proteína quinasas, actividad inhibidora de DNA topoisomerasas, y
otras.
Asimismo, la presente invención proporciona
compuestos caracterizados por las siguientes fórmulas (I) y
(II):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde
R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son, cada
uno e independientemente, hidrógeno o un grupo protector. El grupo
protector puede consistir en un grupo alquilo, un grupo
cicloalquilo, un grupo cicloalquilo heterociclico, un grupo
hidroxialquilo, un grupo alquilo halogenado, un grupo
alcoxialquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo
arilo, un grupo arilo heterociclico, un grupo alquilarilo, un grupo
éster, un grupo carbonato, un grupo ácido carboxílico, un grupo
aldehído, un grupo cetona, un grupo uretano, un grupo sililo, un
grupo sulfoxo o una combinación de ellos,
R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y
R_{10} son, cada uno e independientemente, hidrógeno, hidroxilo
(-OH) o un grupo -OR_{13}, donde R_{13} es un grupo protector
según la definición anterior,
R_{11} y R_{12} son cada uno e
independientemente hidrógeno, metilo (-CH_{3}), un grupo
hidroximetilo (-CH_{2}OH) o un grupo -CH_{2}OR_{14}, donde
R_{14} es un grupo protector según la definición anterior.
\newpage
En particular, la presente invención
proporciona, entre otros, los compuestos con las fórmulas (III),
(IV), (V), (VI), (VII), (VIII) y (IX):
El compuesto de fórmula (III) es nuevo pues
anteriormente se describió un indolocarbarzol glicosilado similar
pero cuya estereoquímica no está definida en el enlace glicosidico,
que en el caso de esta invención es de configuración 13
(Tetrahedron Lett. 2004, 45, 1095-1098).
Asimismo, la presente invención proporciona
nuevos usos para los compuestos caracterizados por las fórmulas (X)
y (XI):
donde
R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son, cada
uno e independientemente, hidrógeno o un grupo protector. El grupo
protector puede consistir en un grupo alquilo, un grupo
cicloalquilo, un grupo cicloalquilo heterociclico, un grupo
hidroxialquilo, un grupo alquilo halogenado, un grupo
alcoxialquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo
arilo, un grupo arilo heterociclico, un grupo alquilarilo, un grupo
éster, un grupo carbonato, un grupo ácido carboxílico, un grupo
aldehído, un grupo cetona, un grupo uretano, un grupo sililo, un
grupo sulfoxo o una combinación de ellos,
R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y
R_{10} son, cada uno e independientemente, hidrógeno, hidroxilo
(-OH) o un grupo -OR_{13}, donde R_{13} es un grupo protector
según la definición anterior,
R_{11} y R_{12} son cada uno e
independientemente hidrógeno, metilo (-CH_{3}), un grupo
hidroximetilo (-CH_{2}OH) o un grupo -CH_{2}OR_{14}, donde
R_{14} es un grupo protector según la definición anterior.
En particular, la presente invención proporciona
nuevos usos para, entre otros, los compuestos con las fórmulas
(XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) y (XVIII):
De todos estos compuestos, se ha descrito uso
como inhibidor de proteína quinasa C (PKC) el compuesto de fórmula
(XII), también denominado K252d, (J. Antibiot. 1986, 39,
1059-1065; J. Antibiot. 1986, 39,
1066-1071) y el compuesto de fórmula (XIV), también
denominado RK-286D, (J. Antibiot. 1990, 43,
168-173; J. Antibiot. 1990, 43,
163-167; J. Antibiot. 1992, 45,
278-279).
Los compuestos de la invención son inhibidores
de crecimiento de tumores y son por tanto útiles en el tratamiento
del cáncer.
De esta forma, son objeto de la presente
invención las composiciones farmacéuticas que comprenden una
cantidad efectiva de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas
(I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI),
(XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o ()NIII), o una sal o
solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un
excipiente farmacéuticamente aceptable.
Es también objeto de la presente invención el
uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II),
(III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII),
(XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal o solvato
farmacéuticamente aceptable del mismo, en la manufactura de un
medicamento.
Es también objeto de la presente invención el
uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II),
(III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII),
(XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal o solvato
farmacéuticamente aceptable del mismo, para inhibir el crecimiento
de un tumor.
Tal como es usado aquí, "inhibir" significa
disminuir, hacer más lento o detener. Por tanto, un compuesto de
esta invención puede disminuir, hacer más lento o detener el
crecimiento de una célula tumoral. Tal como es usado aquí,
"crecimiento" significa aumento en tamaño, o proliferación, o
ambos. Por tanto, un compuesto de esta invención puede inhibir el
aumento de tamaño de una célula tumoral y/o puede impedir que la
célula tumoral se divida y aumente el número de células tumorales.
Una "célula tumoral" es una célula que constituye un neoplasma
(crecimiento nuevo), el cual puede ser cánceroso (maligno) o no
cánceroso (benigno). Una célula tumoral cáncerosa puede invadir los
tejidos normales a su alrededor y los vasos sanguíneos/linfáticos y
formar metastasis en tejidos alejados del tumor original. Por el
contrario, una célula tumoral no cáncerosa puede crecer y comprimir
los tejidos normales adyacentes pero no puede invadir tejidos
normales y vasos sanguíneos/linfáticos, y tampoco puede formar
metástasis en tejidos alejados del tumor original.
Es también objeto de la presente invención el
uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II),
(III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII),
(XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal o solvato
farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar el cáncer.
Es también objeto de la presente invención el
uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II),
(HI), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII),
(XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal o solvato
farmacéuticamente aceptable del mismo, en la manufactura de un
medicamento con actividad antitumoral.
Es también objeto de la presente invención el
uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II),
(III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII),
(XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal o solvato
farmacéuticamente aceptable del mismo, en la manufactura de un
medicamento para el tratamiento del cáncer.
Es también objeto de la presente invención un
método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano,
diagnosticado con cáncer, que consiste en tratar a dicho mamífero
con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de
cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI),
(VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI),
(XVII) o (XVIII), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable
del mismo.
Tal como es usado aquí, un "sujeto" puede
incluir animales domesticados (por ejemplo, gatos, perros, etc.),
ganado (por ejemplo, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras,
etc.), animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, conejos,
cobayas, etc.) y pájaros. De manera preferente, el sujeto es un
mamífero tal como un primate y, con mayor preferencia, un ser
humano.
En general, una "cantidad efectiva" de un
compuesto es aquella cantidad necesaria para conseguir el resultado
deseado. Por ejemplo, la cantidad efectiva de un compuesto de la
presente invención trata el cáncer mediante la inhibición del
crecimiento de las células que constituyen el tumor, con lo que
previene la invasión de tejidos normales y vasos
sanguíneos/linfáticos por parte de las células tumorales y, por
tanto, previene metástasis. Ejemplos de cánceres que pueden ser
tratados incluyen, pero no están limitados a, pulmón, colon,
ovario, próstata, testículo, melanoma, riñón, mama, sistema
nervioso central y leucemia. La expresión "composición
farmacéutica aceptable" consiste en un material adecuado
biológicamente, es decir, que el material puede ser administrado al
sujeto sin causarle efectos biológicos sustancialmente dañinos.
Las dosis o cantidades de los compuestos de la
invención deben ser suficientemente grandes para producir el efecto
deseado. Sin embargo, la dosis no debe ser tan grande que cause
efectos secundarios adversos, por ejemplo reacciones cruzadas
indeseadas, reacciones anafilácticas y similares. Generalmente, la
dosis variará con la edad, condición, sexo y el grado de la
enfermedad del sujeto, y puede ser determinada por cualquier
experto en la materia. La dosis puede ser ajustada por cada médico,
en base a la condición clínica del sujeto implicado. La dosis,
régimen de dosificación y ruta de la administración pueden
variarse.
Es también objeto de la presente invención el
uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II),
(III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII),
(XIII), (XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal o solvato
farmacéuticamente aceptable del mismo, en la manufactura de un
medicamento para el tratamiento de enfermedades neurológicas.
Es también objeto de la presente invención un
método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano,
diagnosticado con una enfermedad neurológica, que consiste en
tratar a dicho sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de
un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III),
(IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII), (XIII),
(XIV), (XV), (XVI), (XVII) o (XVIII), o una sal o solvato
farmacéuticamente aceptable. El sujeto puede ser un mamífero,
preferentemente un ser humano, y el compuesto puede ser, entre otras
vías, administrado parenteralmente.
Ejemplos de enfermedades neurológicas que pueden
ser tratadas incluyen, pero no están limitados a, enfermedades
neurodegenerativas tales como las de Parkinson, Alzheimer, y
Huntington.
Los compuestos de la invención pueden ser útiles
para la investigación en bioquímica o biología celular. Por
ejemplo, los compuestos pueden ser eficaces para inhibir la
actividad de DNA topoisomerasas y de varias proteína quinasas en
cultivos in vitro de diversos tipos celulares. Ejemplos de
DNA topoisomerasas que pueden ser inhibidas por los compuestos de
la invención incluyen topoisomerasa I, topoisomerasa II, girasa y
otras. Ejemplos de proteína quinasas que pueden ser inhibidas por
los compuestos de la invención incluyen AurA, AurB, Chk1, Dyrk1a,
Ft13, FGFR1, HGK, Ikkb, Jak2, KDR, SYK, y otras.
Cualquiera de los compuestos de la invención
puede ser utilizado terapéuticamente formando parte de una
composición farmacéutica aceptable. Cualquier experto en la materia
puede crear composiciones farmacéuticas aceptables, las cuales
pueden consistir en soluciones estériles en agua, soluciones salinas
o soluciones tamponadas a pH fisiológico. Cualquiera de los
compuestos de la invención puede ser preparado en forma de
composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas pueden
incluir diversos agentes transportadores, espesantes, diluentes,
tamponantes, conservantes, tensoactivos y otros, además del
compuesto de la invención. Las composiciones farmacéuticas pueden
incluir también ingredientes activos tales como agentes
antimicrobianos, antiinflamatorios, anestésicos, etc.
Los compuestos de la invención pueden ser
administrados al sujeto de varias maneras distintas, dependiendo de
si se desea que el tratamiento sea local o sistémico, y dependiendo
del área a ser tratada. Así, por ejemplo, un compuesto de la
presente invención puede ser administrado en forma de solución
oftálmica, de aplicación en la superficie del ojo. Además un
compuesto puede ser administrado a un sujeto por vía vaginal,
rectal, intranasal, oral, por inhalación o por vía parenteral, ya
sea por ruta intradermal, subcutánea, intramuscular,
intraperitoneal, intrarrectal, intraarterial, intralinfática,
intravenosa, intratecal e intratraqueal. La administración
parenteral, si se emplea, se realiza generalmente mediante
inyección. Los inyectables pueden ser preparados de diversas
formas, tales como soluciones o suspensiones líquidas, formas
sólidas adecuadas para ser disueltas o puestas en suspensión antes
de la inyección, o como emulsiones. Otras formas de administración
parenteral emplean sistemas de liberación lenta o sostenida, de tal
forma que se consigue mantener una dosis constante (ver, por
ejemplo, patente US 3,710,795). Las preparaciones para la
administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas o no
acuosas, suspensiones y emulsiones, que además pueden contener
tampones y aditivos diluentes y otros. Ejemplos de solventes no
acuosos son: propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales
tales como el aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables
tales como etiloleato. Ejemplos de solventes acuosos son: agua,
soluciones alcohólico-acuosas, emulsiones o
suspensiones, incluyendo soluciones salinas y tamponadas. Ejemplos
de vehículos parenterales son: solución de cloruro sódico, dextrosa
de Ringer, cloruro de sodio y dextrosa, etc. También pueden estar
presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo,
agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, gases inertes,
etc. Las formulaciones para administración tópica pueden incluir
cremas, lociones, geles, gotas, supositorios, sprays, líquidos y
polvos. También pueden ser necesarios o deseables ciertos
transportadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas,
oleosas, o en polvo, espesantes, etc. Las composiciones para
administración oral pueden incluir polvos o gránulos, suspensiones
o soluciones en agua o medio no acuoso, cápsulas o tabletas. Puede
ser deseable la inclusión de agentes espesantes, saborizantes,
diluentes, emulsionantes, dispersantes, etc.
A los efectos de la presente invención y su
descripción, el término "derivado" de la rebecamicina o
estaurosporina debe interpretarse como un compuesto cubierto por
cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (X) o (XI). Del mismo modo,
el término "prodroga" debe interpretarse a los efectos de la
presente invención y de la descripción de la misma, como cualquier
compuesto que libere, al circular en sangre o entrar en la célula,
la rebecamicina, estaurosporina o un derivado, de acuerdo con
cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (X) o (XI), de las
mismas.
Fig. 1. Estructura química de la estaurosporina
(STP) y la rebecamicina (RBM).
Fig. 2. Biosíntesis de un indolocarbazol
glicosilado. Abreviaturas: Trp (triptófano), CPA (ácido
cromopirrólico), AF (arcyriaflavina A),
NDP-L-rham (nucleosidil difosfato
[NDP]-L-ramnosa),
Glc-1-P (glucosa
1-fosfato), IG(1N) (indolocarbazol
glicosilado con azúcar unido por un solo enlace), IG(2N)
(indolocarbazol glicosilado con azúcar unido por dos enlaces).
RebO, RebD, RebC y RebP son enzimas que participan en la
biosíntesis de rebecamicina. StaG y StaN son enzimas de la ruta de
formación de estaurosporina. OleL, OleS, OleE y OleU son enzimas
implicados en la formación de los azúcares de la oleandomicina.
Fig. 3. Plásmidos utilizados, mostrando su
composición genética. Los triángulos negros representan el promotor
P*_{ermE}.
Fig. 4A, Fig. 4B, Fig. 4C, Fig. 4D. Análisis
mediante HPLC de los cultivos de las cepas recombinantes generadas
con plásmidos que dirigen la biosíntesis de diferentes
desoxiazúcares: S. albus 16GNT(pRHAM) (Fig. 4A), S.
albus 16GNT(pLN2) (Fig. 4B), S. albus
16GNT(pLNR) (Fig. 4C) y S. albus 16GNT(pLNBIV)
(Fig. 4D). Guía de picos: (VII):
N^{12}-5'(S)-N^{13}-1'-(R)-L-ramnosilarciriaflavina
[fórmula (VII)]; (III):
N^{13}-1'-\beta-L-rhamnosilarciriaflavina
[fórmula (III)]; (VIII):
N^{12}-5'(S)-N^{13}-1'-(R)-L-olivosilarciriaflavina
[fórmula (VIII)]; (IV):
N^{13}-1'-\beta-L-olivosilarciriaflavina
[fórmula (IV)]; (VI):
N^{13}-1'-\beta-D-olivosilarciriaflavina
[fórmula (VI)]; (V):
N^{13}-1'-\beta-L-digitoxosilarciriaflavina
[fórmula (V)]; (IX):
N^{12}-5'(S)-N^{13}-1'-(R)-L-digitoxosilarciriaflavina
[fórmula (IX)].
Fig. 5. Estructuras químicas de [fórmula (III)],
[fórmula (IV)], [fórmula (V)], [fórmula (VI)], [fórmula (VII)],
[fórmula (VIII)], [fórmula (IX)], [fórmula (XII)], [fórmula
(XIII)], [fórmula (XIV)], [fórmula (XV)], [fórmula (XVI)], [fórmula
(XVII)] y [fórmula (XVIII)].
Para una mejor comprensión de la presente
invención, se exponen los siguientes ejemplos, descritos en
detalle, que deben entenderse sin carácter limitativo del alcance
de la invención.
En los siguientes ejemplos se emplean técnicas
de manipulación de DNA bien conocidas en el estado de la técnica,
tales como las descritas por Sambrook y colaboradores (Molecular
Cloning, a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York, 1989), y por Kieser y colaboradores
(Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation,
Norwich, Gran Bretaña, 2000).
En primer lugar, se construyó el plásmido
pKC16GNT, el cual codifica cuatro enzimas para la formación del
aglicón indolocarbazol (RebO, RebD, RebC y RebP), una
glicosiltransferasa para la formación del enlace
N-glicosídico (StaG), una oxigenasa de tipo
P-450 para la formación del segundo enlace
aglicón-azúcar (StaN), y una proteína que confiere
resistencia a rebecamicina (RebT). Para ello, un fragmento de DNA
incluyendo staG y staN fue obtenido por PCR (reacción
en cadena de la polimerasa) empleando DNA total de Streptomyces
longisporoflavus DSM10189 y los oligonucleótidos CS043
(5'-TATATTACTAGTCGCGGAGGCGACGTTGAC-3')
y STAN2 (5'-TATCTAGAGT
CAGTTCAGTACGGCGGGC-3'). Este fragmento de DNA fue clonado como un fragmento SpeI XbaI en los mismos sitios de LITMUS 28 (New England BioLabs), generándose el plásmido pLGTFstaN. Seguidamente, el plásmido pKC16GNT fue obtenido mediante la donación en tándem, en el sitio XbaI de pKC016 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102, 461-466), de tres fragmentos de DNA conteniendo: el promotor ermE*p (aislado como un fragmento HindIII BamHI a partir del plásmido pEM4 [Mol. Microbiol. 1998, 28, 1177-1185]), el inserto de pLGTFstaN (conteniendo staG y staN) y el gen rebT (obtenido mediante PCR de la forma descrita en Proc. Natl. Acad Sci. USA 2005, 102, 461-466), respectivamente.
CAGTTCAGTACGGCGGGC-3'). Este fragmento de DNA fue clonado como un fragmento SpeI XbaI en los mismos sitios de LITMUS 28 (New England BioLabs), generándose el plásmido pLGTFstaN. Seguidamente, el plásmido pKC16GNT fue obtenido mediante la donación en tándem, en el sitio XbaI de pKC016 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102, 461-466), de tres fragmentos de DNA conteniendo: el promotor ermE*p (aislado como un fragmento HindIII BamHI a partir del plásmido pEM4 [Mol. Microbiol. 1998, 28, 1177-1185]), el inserto de pLGTFstaN (conteniendo staG y staN) y el gen rebT (obtenido mediante PCR de la forma descrita en Proc. Natl. Acad Sci. USA 2005, 102, 461-466), respectivamente.
A continuación, se introdujo dicho plásmido
pKC16GNT en Streptomyces albus J1074 (J. Gen.
Microbiol. 1980, 116, 323-334), generándose la
cepa Streptomyces albus 16GNT. La introducción del plásmido
se realizó mediante transformación de protoplastos, siguiendo
procedimientos estándar (Kieser et al., Practical
Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, Gran
Bretaña, 2000). A partir de la cepa Streptomyces albus 16GNT
se obtuvieron las cepas bacterianas Streptomyces albus
16GNT(pRHAM), Streptomyces albus
16GNT(pLNBIV), Streptomyces albus 16GNT(pLN2) y
Streptomyces albus 16GNT(pLNR) mediante la
introducción, por separado, de cada uno de los siguientes
plásmidos: pRHAM, pLNBIV, pLN2 y pLNR, respectivamente. Estos cuatro
plásmidos han sido descritos con anterioridad (J Mol. Microbiol.
Biotechnol. 2000, 2, 271-276; Chem.
Biol. 2002, 9, 721-729; J. Nat. Prod.
2002, 65, 1685-1689), y codifican enzimas para la
biosíntesis de los siguientes azúcares (en forma de derivados NDP o
nucleosidil difosfato): L-ramnosa,
L-digitoxosa, L-olivosa y
D-olivosa, respectivamente.
Las cepas Streptomyces albus
16GNT(pRHAM) Streptomyces albus 16GNT(pLNBIV),
Streptomyces albus 16GNT(pLN2) y Streptomyces
albus 16GNT(pLNR) fueron depositadas con fecha
14/03/2008 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT),
Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot
(Valencia, España) con números de acceso CECT 7388, CECT 7389, CECT
7390 y CECT 7391, respectivamente.
La obtención de los nuevos derivados
indolocarbazólicos se realizó mediante HPLC (cromatografía líquida
de alta resolución) preparativa. Para la obtención de los ,
compuestos de fórmulas (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII) y (IX),
las cepas Streptomyces albus 16GNT(pRHAM)
Streptomyces albus 16GNT(pLNBIV), Streptomyces
albus 16GNT(pLN2) y Streptomyces albus
16GNT(pLNR) se cultivaron primeramente en 50 ml de TSB con
el marcador de resistencia adecuado y se dejaron crecer 24 horas a
30ºC y a 250 rpm. Pasadas 24 horas, a partir del
pre-inóculo se inocularon al 2,5% matraces con 400
ml de medio R5A líquido, tal como se ha descrito anteriormente
(Mol. Microbiol. 2005, 58, 17-27).
En el paso de producción, se emplearon 8
matraces Erlenmeyer de 2 litros, cada uno de ellos conteniendo 400
ml de medio, los cuales fueron incubados a 30ºC y 250 rpm, durante
4-5 días. Los cultivos se centrifugaron a 12.000 rpm
durante 30 minutos. La mayoría de estos compuestos se encuentran
tanto en el caldo como en las células. Los precipitados se
extrajeron con acetona y los sobrenadantes se filtraron usando un
cartucho Mini Profil de 1 \mum (Pall). El caldo filtrado se
sometió a extracción en fase sólida (SepPaK Vac C18, Waters). Los
compuestos retenidos se eluyeron con un gradiente lineal de metanol
y 0,1% TFA en agua (0 a 100% metanol en 60 min, a 10 ml/min),
recogiendo fracciones cada 5 minutos.
Los extractos obtenidos fueron analizados por
HPLC. Se realizó utilizando un módulo cromatográfico Alliance
acoplado a un detector de fotodiodos 2996 y a un espectrómetro de
masas ZQ4000 (Waters-Micromass). La columna
utilizada fue una Symmetry C18 (2,1 x 150 mm, Waters) utilizando
como solventes acetonitrilo y 0,1% ácido trifluoroacético en agua.
La elución empezó con 10% de acetonitrilo durante 4 minutos,
seguido por un gradiente linear hasta alcanzar el 88% en el minuto
30, finalmente se bombeó 100% acetonitrilo durante 5 minutos, con
un flujo de 0,25 ml/min. El análisis de masas se realizó mediante
ionización por electrospray (ESI) en modo positivo, con un voltaje
de capilar de 3 KV y voltajes de cono de 20, 60 y 100 V. La
longitud de onda a la que se obtuvieron los cromatogramas fue de 290
nm para los compuestos con espectro de estaurosporina y de 316 nm
para los compuestos con espectro de rebecamicina.
Tras su análisis, aquellas que contenían los
compuestos buscados se evaporaron en el rotavapor, previa adición
de 10 ml de tampón fosfato 0,1 M pH 7 a cada una de ellas. Los
extractos, previamente disueltos en un pequeño volumen de DMSO y
acetona (50:50) se cromatografiaron en un cartucho de compresión
radial \muBondapak C18 (PrepPaK Cartridge, 25 x 100 mm, Waters),
utilizando como fase móvil mezclas de acetonitrilo (o metanol) y
0,1% TFA en agua a un flujo de 10 ml/min y recogiendo los
compuestos de interés en múltiples inyecciones. En otras
purificaciones se usó una columna XTerra (7,8 x 300 mm, Waters) y se
siguió el mismo procedimiento aunque trabajando a 3 ml/min. Las
soluciones de compuesto purificado se diluyeron con tres volúmenes
de agua y se sometieron a extracción en fase sólida para eliminar
el ácido de la fase móvil y concentrar los compuestos. Finalmente,
éstos se liofilizaron para su conservación.
De esta manera se obtuvieron los siguientes
compuestos (Fig. 4). A partir de S. albus
16GNT(pRHAM): 1 mg de
N^{13}-1'-\beta-L-rhamnosilarciriaflavina
[fórmula (III)] y 1,2 mg de
N^{12}-5'(S)-N^{13}-1'-(R)-L-ramnosilarciriaflavina
[fórmula (VII)]. A partir de S. albus 16GNT(pLN2):
2,1 mg de
N^{12}-5'(S)-N^{13}-1'-(R)-L-olivosilarciriaflavina
[fórmula (VIII)] y 1,2 mg de
N^{13}-1'-\beta-L-olivosilarciriaflavina
[fórmula (IV)]. A partir de S. albus 16GNT(pLNR): 0,8
mg de
N^{13}-1'-\beta-D-olivosilarciriaflavina
[fórmula (VI)]. A partir de S. albus 16GNT(pLNBIV):
1,6 mg de
N^{13}-1'-\beta-L-digitoxosilarciriaflavina
[fórmula (V)] y 1,1 mg de
N^{12}-5'(S)-N^{13}-1'-(R)-L-digitoxosilarciriaflavina
[fórmula (IX)].
Los compuestos de fórmulas (XII), (XIII), (XIV),
(XV), (XVI) y (XVIII) se obtuvieron de forma similar, descrita en
Mol. Microbiol. 2005, 58, 17-27.
Los compuestos se identificaron inicialmente
mediante análisis por HPLC, comparando el espectro de absorción y
analizando la masa del ion molecular. El análisis de los extractos
de la cepa S. albus 16GNT (pRHAM) mostró dos picos (Fig. 4A)
con iones m/z 472 y 470, respectivamente, consistentes con la
presencia de L-ramnosa unida a uno y a ambos átomos
de nitrógeno del anillo indolocarbazol, respectivamente. El
cromatograma correspondiente a la cepa 16GNT(pLN2) también
mostró dos picos con el espectro caracteristico de indolocarbazol
(Fig. 4B), uno con ión m/z de 454 y otro con ión m/z de 456. Estas
masas son las esperadas para la incorporación de
L-olivosa unida al aglicón a través de dos y un
enlace C-N, respectivamente. En la cepa
16GNT(pLNR) se detectó un único pico (Fig. 4C) con ión m/z
de 456 consistente con la unión de D-olivosa a uno
sólo de los nitrógenos del aglicón indolocarbazol. Finalmente la
cepa 16GNT(pLNBIV) mostró dos picos (Fig. 4D) con iones m/z
456 y 454 respectivamente consistentes con la unión de
L-digitoxosa a través de uno y de dos enlaces
C-N.
La identificación definitiva se realizó mediante
Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de protón. La preparación de la
muestra se hizo disolviendo 95-160 \mug de
producto puro en 200 \mul de acetona-d_{6} y trasferido a
un tubo de RMN de 3 mm. Las señales del disolvente se utilizaron
como referencia interna. Los espectros de RMN fueron registrados a
298K en un espectrofotómetro Bruker Avance 600 equipado con una
criosonda de 5 mm TCI. Los valores típicos para experimentos 2D
fueron: COSY, 256 y 2048 puntos en F1 y F2, respectivamente, 16
transientes cada uno; HSQC-editado, 256 y 2048
puntos en F1 y F2, respectivamente, 48 transientes cada uno; HMBC,
512 y 2048 puntos en F1 y F2, respectivamente, 64 transientes cada
uno. Los tiempos de mezcla para los experimentos 1D
sel-nOe fueron 400 ms. Los experimentos de RMN
fueron procesados usando el programa Topspin 1.3 (Bruker GmbH,
Karlsruhe, Alemania). Las Tablas 1 a 7 muestran los datos obtenidos
para los compuestos de fórmulas (III), (IV), (V), (VI), (VII),
(VIII) y (IX).
Los compuestos de fórmulas (XII), (XIII), (XIV),
(XV), (XVI) y (XVIII) se caracterizaron de forma similar, tal como
se describe en Mol. Microbiol. 2005, 58,
17-27.
El análisis de actividad kinasa descrito aquí
fue realizado utilizando la tecnología LabChip (Caliper Life
Sciences), concretamente los instrumentos Caliper LC3000 y el EZ
Reader II. El ensayo kinasa utilizado mide la conversión de un
péptido fluorescente (sustrato) a un producto fosforilado. La
mezcla de reacción, en un pocillo de microplaca, se introduce
mediante un capilar en un chip donde el sustrato no fosforilado y
el producto fosforilado se separan por electroforesis y se detectan
por fluorescencia inducida por láser. La intensidad de la señal
fluorescente con el tiempo se relaciona con el progreso de la
reacción. El producto fosforilado migra más rápidamente que el
sustrato no fosforilado y las señales de las dos formas del péptido
aparecen como picos diferenciados. El software de Caliper determina
la altura de picos y calcula el ratio de producto a la suma de
picos (P/(P+S)). Este valor su usa para comparar pocillos con
compuestos y pocillos con controles y así determinar el % de
inhibición para un compuesto dado.
Las siguientes quinasas se utilizaron para los
estudios de inhibición enzimáticos, entre paréntesis el valor de la
constante de Michaelis-Menten, Km, del ATP
(Adenosina trifosfato) para cada quinasa, en \muM: obtenidas de
Carna Biosciences: MAPKAPK2 (4,6), AurA (3,6), AurB (5), PKC\zeta
(3,8), RSK1 (23,3), PRAK (5), Erk1 (33,4), PKD2 (32,1), CK1d
(16,3), CHK1 (33), ABL (61,7), FYN (36), LYNa (17), CHK2 (57,8),
MET (79,5), LCK (28,5), SRC (38), GSK3\beta (7,3), Erk2 (62,1),
PKAC\alpha (1,7), AKT2 (186,1), INSR (871,8), p38a (396,5),
AKT1(48), MSK1 (21,2), PKC\beta2 (84,8), ROCK2 (3,3), PIM2
(4,9), AMPK (38,6), KDR (164,8), IRAK4 (196,5), SGK1 (121,8), SYK
(33,5); obtenidas de Invitrogen: CDK2 (57,6), BTK (123), HGK (80);
obtenidas de Upstate: MST2 (36,6), PKG\alpha (16), PAK2 (1,9),
IGF1R (320), FGFR1 (171), MARK1 (33), CAMK2\delta (22,4),
c-TAK1 (66), DYRK1a (18,1), CaMK4 (3,9), FLT3
(350), c-Raf (6,2), P70S6K (95).
Los compuestos se disolvieron en 100% DMSO y se
diluyeron a 25 veces la concentración final deseada para el ensayo.
En el caso de la determinación de valores IC^{50}, se realizaron
diluciones seriadas para alcanzar ocho concentraciones y dar lugar
a la curva de inhibición. Se transfiere 1 \muL de cada
concentración, en duplicado, a una microplaca de 384 pocillos. Se
añade a cada pocillo 12 \muL, de tampón enzimático conteniendo
kinasa purificada (varios proveedores como se indica arriba), 100 mM
HEPES, pH 7.5, 1 mM DTT (Calbiochem), 0.002%
Brij-35 (Sigma) y también en presencia de 10 mM
MgCl_{2} como cofactor, excepto para 1NSR y IRAK4 en que se usa
10 mM MnCl_{2} en lugar del MgCl_{2}. Para las quinasas
CAMK2\delta y CAMK4 se añade además 1 mM CaCl_{2} y 6,7
\mug/mL de calmodulina. Para la quinasa KDR, se añade 0,05% del
detergente CHAPSO. Para la quinasa c-Raf se añade 10
mM MnCl_{2}. Para PKC\beta2 se añaden 0,02 \mug/mL de PS/PMA.
Para PKG\alpha se añade 10 \muM de cGMP (guanosina monofosfato
ciclico). El compuesto y el enzima se dejan 15 minutos
preincubando, y a continuación se añaden a cada pocillo 12 \muL de
tampón péptido/ATP conteniendo 100 mM HEPES, pH 7.5, 1.5 \muM
péptido marcado con fluoresceina (especifico para la kinasa
correspondiente), ATP (a la concentración K_{M}), y 0.002%
Brij-35 para iniciar la reacción. Generalmente las
reacciones se incuban durante 1-1,5 h a temperatura
ambiente para obtener una conversión adecuada
(15-40%) del péptido al producto fosforilado. Las
reacciones fueron terminadas mediante la adición de 45 \muL de
tampón conteniendo 0 mM EDTA. Las microplacas fueron leídas por el
LabChip 3000 utilizando un LabChip de 12 canales. Los valores
P/(P+S) fueron obtenidos como se describe arriba y las curvas IC50
fueron generadas usando Xlfit.
La Tabla 9a presenta los datos de IC50 obtenidos
en parejas de compuesto-quinasa seleccionadas entre
los compuestos de fórmula (VII), (VIII), (IX), (XVI), (XVII) y
(XVIII) tras realizar medidas de inhibición a 100 nM y 10 nM.
Aquéllas parejas que proveían >70% de inhibición a 10 nM se
consideraron para medir su IC50.
La Tabla 9b muestra el porcentaje de inhibición
obtenido por compuestos de fórmula (III), (IV), (V), (VI), (XII),
(XIII), (XIV) y (XV) cuando se utilizan a concentraciones 100 nM y
10 nM. Por ejemplo, la actividad de la quinasa Dyrkla es inhibida
en un 87% por el compuesto de fórmula (III) y completamente por el
compuesto de fórmula (XII) cuando se utilizan a una concentración 10
nM.
Los compuestos generados se ensayaron frente a
una serie de líneas celulares procedentes de tumores. Se determinó
cuantitativamente el crecimiento celular y la viabilidad,
utilizando un ensayo tipo colorimétrico, usando la reacción con
sulforrodamina B (SRB), según la técnica descrita por Faircloth y
colaboradores (Journal of Tissue and Culture Methods 1988,
11, 201-205). Los resultados se muestran en la
Tabla 5.
Se inoculan placas de "microtiter" de 96
pocillos, con células (5x10^{3} células por pocillo) en alícuotas
de 195 \mul de medio, incubándolas durante 18 h, en medio sin
compuesto añadido, para permitir que las células se adhieran a la
superficie. A continuación, se añaden los compuestos a ensayar, en
muestras de 5 \mul, en un rango de concentraciones de 10 a
10^{-8} \mug/ml, disueltas en DMSO/EtOH (0.2% en tampón PS).
Tras 48 h de exposición, se mide el efecto antitumoral utilizando la
técnica de Sulforodamina B (SRB): se fijan las células añadiendo 50
\mul de ácido tricloroacético frío al 50% (p/v) y se incuba
durante 60 min. a 4ºC. Las placas se lavan con agua desionizada y
se secan. Se añaden 100 \mul de solución de SRB (0.4% p/v en ácido
acético al 1%) a cada pocillo, y se incuba durante 10 min. a
temperatura ambiente. Se elimina la SRB no unida, lavando con ácido
acético al 1%. Las placas se secan al aire y el colorante unido se
disuelve con tampón Tris. Se leen las densidades ópticas en un
lector espectrofotómetro de placas automático a una longitud de onda
de 490 nm.
En la Tabla 8 se muestran los resultados de las
GI_{50} (inhibición del crecimiento) en \muM. Para los
compuestos de fórmula (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX) y
los compuestos de fórmula (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI) y
(XVIII).
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Claims (68)
1. Un compuesto con cualquiera de las fórmulas
(I) o (H)
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\vskip1.000000\baselineskip
donde
R^{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son, cada
uno e independientemente, hidrógeno o un grupo protector, el cual
puede consistir en un grupo alquilo, un grupo cicloalquilo, un grupo
cicloalquilo heterocíclico, un grupo hidroxialquilo, un grupo
alquilo halogenado, un grupo alcoxialquilo, un grupo alquenilo, un
grupo alquinilo, un grupo arilo, un grupo arilo heterocíclico, un
grupo alquilarilo, un grupo éster, un grupo carbonato, un grupo
ácido carboxílico, un grupo aldehído, un grupo cetona, un grupo
uretano, un grupo sililo, un grupo sulfoxo o una combinación de
ellos,
R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y
R_{10} son, cada uno e independientemente, hidrógeno, hidroxilo o
un grupo -OR_{13}, donde R_{13} es un grupo protector según la
definición anterior,
R_{11} y R_{12} son, cada uno e
independientemente, hidrógeno, metilo (-CH_{3}) o un grupo
hidroximetilo (-CH_{2}OH).
2. El compuesto de la reivindicación 1, con la
fórmula (III):
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\newpage
3. El compuesto de la reivindicación 1, con la
fórmula (IV):
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\vskip1.000000\baselineskip
4. El compuesto de la reivindicación 1, con la
fórmula (V):
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5. El compuesto de la reivindicación 1, con la
fórmula (VI):
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
6. El compuesto de la reivindicación 1, con la
fórmula (VII):
\vskip1.000000\baselineskip
7. El compuesto de la reivindicación 1, con la
fórmula (VIII):
\vskip1.000000\baselineskip
8. El compuesto de la reivindicación 1, con la
fórmula (IX):
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9. Cepas bacterianas derivadas de
Streptomyces albus, caracterizadas porque cada una de
dichas cepas poseen ácidos nucleicos adicionales que codifican
enzimas activos para la biosíntesis de indolocarbazoles
glicosilados, no estando estos enzimas presentes en Streptomyces
albus.
10. Una cepa bacteriana según la reivindicación
9, caracterizada porque dicha cepa es Streptomyces
albus 16GNT(pRHAM).
11. Una cepa bacteriana de la reivindicación 9,
caracterizada porque dichos ácidos nucleicos son los
plásmidos pKC16GNT y pRHAM, los cuales codifican enzimas activos
para la biosíntesis de los compuestos de fórmula (IH) y fórmula
(VII) y de sus intermediarios biosintéticos.
12. Una cepa bacteriana según la reivindicación
9, caracterizada porque dicha cepa es Streptomyces
albus 16GNT(pLNBIV).
13. Una cepa bacteriana de la reivindicación 9,
caracterizada porque dichos ácidos nucleicos son los
plásmidos pKC16GNT y pLNBIV, los cuales codifican enzimas activos
para la biosíntesis de los compuestos de fórmula (IV) y fórmula
(VIII) y de sus intermediarios biosintéticos.
14. Una cepa bacteriana según la reivindicación
9, caracterizada porque dicha cepa es Streptomyces
albus 16GNT(pLN2).
15. Una cepa bacteriana de la reivindicación 9,
caracterizada porque dichos ácidos nucleicos son los
plásmidos pKC16GNT y pLN2, los cuales codifican enzimas activos
para la biosíntesis de los compuestos de fórmula (V) y fórmula (IX)
y de sus intermediarios biosintéticos.
16. Una cepa bacteriana según la reivindicación
9, caracterizada porque dicha cepa es Streptomyces
albus 16GNT(pLNR).
17. Una cepa bacteriana de la reivindicación 9,
caracterizada porque dichos ácidos nucleicos son los
plásmidos pKC16GNT y pLNR, los cuales codifican enzimas activos
para la biosíntesis del compuesto de fórmula (VI) y de sus
intermediarios biosintéticos.
18. Un método para obtener las cepas bacterianas
de la reivindicación 9, que comprende la introducción de un ácido
nucleico en Streptomyces albus o en una cepa derivada de
Streptomyces albus.
19. El método de la reivindicación 18, donde la
introducción de un ácido nucleico comprende la introducción de los
plásmidos pKC16GNT y pRHAM en Streptomyces albus.
20. El método de la reivindicación 18, donde la
introducción de un ácido nucleico comprende la introducción de los
plásmidos pKC16GNT y pLNBIV en Streptomyces albus.
21. El método de la reivindicación 18, donde la
introducción de un ácido nucleico comprende la introducción de los
plásmidos pKC16GNT y pLN2 en Streptomyces albus.
22. El método de la reivindicación 18, donde la
introducción de un ácido nucleico comprende la introducción de los
plásmidos pKC16GNT y pLNR en Streptomyces albus.
23. Un método para producir derivados de
rebecamicina o de estaurosporina según cualesquiera de las fórmulas
(I) o (II), que comprende:
- a)
- incubar una cepa bacteriana de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17 para producir una composición que incluye un derivado de rebecamicina o de estaurosporina; y
- b)
- aislar un derivado de rebecamicina o de estaurosporina a partir de la composición producida en el paso (a).
24. Un método según la reivindicación 23,
caracterizado porque la cepa bacteriana es Streptomyces
albus 16GNT(pRHAM).
25. Un método según la reivindicación 23,
caracterizado porque la cepa bacteriana es Streptomyces
albus 16GNT(pLNBIV).
26. Un método según la reivindicación 23,
caracterizado porque la cepa bacteriana es Streptomyces
albus 16GNT(pLN2).
27. Un método según la reivindicación 23,
caracterizado porque la cepa bacteriana es Streptomyces
albus 16GNT(pLNR).
28. Un método según la reivindicación 23,
caracterizado porque el derivado de rebecamicina o de
estaurosporina es el compuesto de fórmula (III).
29. Un método según la reivindicación 23,
caracterizado porque el derivado de rebecamicina o de
estaurosporina es el compuesto de fórmula (IV).
30. Un método según la reivindicación 23,
caracterizado porque el derivado de rebecamicina o de
estaurosporina es el compuesto de fórmula (V).
31. Un método según la reivindicación 23,
caracterizado porque el derivado de rebecamicina o de
estaurosporina es el compuesto de fórmula (VI).
32. Un método según la reivindicación 23,
caracterizado porque el derivado de rebecamicina o de
estaurosporina es el compuesto de fórmula (VII).
33. Un método según la reivindicación 23,
caracterizado porque el derivado de rebecamicina o de
estaurosporina es el compuesto de fórmula (VIII).
34. Un derivado de rebecamicina o de
estaurosporina según cualesquiera de las fórmulas (I) o (II),
obtenible según el método de la reivindicación 23.
35. Un derivado de rebecamicina o de
estaurosporina según cualesquiera de las fórmulas (I) o (II),
caracterizado por ser producido por una cepa bacteriana de
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17.
36. Un derivado de rebecamicina o de
estaurosporina según cualesquiera de las fórmulas (I) o (II),
caracterizado por ser producido por la cepa Streptomyces
albus 16GNT(pRHAM) de la reivindicación 10.
37. Un derivado de rebecamicina o de
estaurosporina según cualesquiera de las fórmulas (I) o (II),
caracterizado por ser producido por la cepa Streptomyces
albus 16GNT(pLNBIV) de la reivindicación 12.
38. Un derivado de rebecamicina o de
estaurosporina según cualesquiera de las fórmulas (I) o (II),
caracterizado por ser producido por la cepa Streptomyces
albus 16GNT(pLN2) de la reivindicación 14.
39. Un derivado de rebecamicina o de
estaurosporina según cualesquiera de las fórmulas (I) o (II),
caracterizado por ser producido por la cepa Streptomyces
albus 16GNT(pLNR) de la reivindicación 16.
40. Una preparación farmacéutica que comprende,
entre otros componentes, una cantidad terapéuticamente efectiva de
un compuesto de la reivindicación 1, o una sal, solvato o prodroga
farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con uno o más
excipientes y diluyentes.
41. Una preparación farmacéutica que comprende,
entre otros componentes, una cantidad terapéuticamente efectiva de
un compuesto de la reivindicación 35, o una sal, solvato o prodroga
farmacéuticamente aceptables del mismo, junto con uno o más
excipientes y diluyentes.
42. Una preparación farmacéutica que comprende,
entre otros componentes, una cantidad terapéuticamente efectiva de
un compuesto de cualquiera de las fórmulas (X) o (XI).
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\vskip1.000000\baselineskip
donde
R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son, cada
uno e independientemente, hidrógeno o un grupo protector. El grupo
protector puede consistir en un grupo alquilo, un grupo
cicloalquilo, un grupo cicloalquilo heterocíclico, un grupo
hidroxialquilo, un grupo alquilo halogenado, un grupo
alcoxialquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo
arilo, un grupo arilo heterociclico, un grupo alquilarilo, un grupo
éster, un grupo carbonato, un grupo ácido carboxílico, un grupo
aldehído, un grupo cetona, un grupo uretano, un grupo sililo, un
grupo sulfoxo o una combinación de ellos,
R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y
R_{10} son, cada uno e independientemente, hidrógeno, hidroxilo
(-OH) o un grupo -OR_{13}, donde R_{13} es un grupo protector
según la definición anterior,
R_{11} y R_{12} son cada uno e
independientemente hidrógeno, metilo (-CH3) o un grupo
hidroximetilo (-CH_{2}OH).
43. Una preparación farmacéutica de acuerdo a la
reivindicación 41, donde el compuesto es de fórmula (XII)
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44. Una preparación farmacéutica de acuerdo a la
reivindicación 41, donde el compuesto es de fórmula (XIII)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
45. Una preparación farmacéutica de acuerdo a la
reivindicación 41, donde el compuesto es de fórmula (XIV)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
46. Una preparación farmacéutica de acuerdo a la
reivindicación 41, donde el compuesto es de fórmula (XV)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
47. Una preparación farmacéutica de acuerdo a la
reivindicación 41, donde el compuesto es de fórmula (XVI)
\vskip1.000000\baselineskip
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48. Una preparación farmacéutica de acuerdo a la
reivindicación 41, donde el compuesto es de fórmula (XVII)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
49. Una preparación farmacéutica de acuerdo a la
reivindicación 41, donde el compuesto es de fórmula (XVIII)
\vskip1.000000\baselineskip
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50. Uso de un compuesto de cualesquiera de las
fórmulas (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (XII),
(XIII), (XIV), (XV), (XVI) o (XVIII) como inhibidor de actividad
proteína quinasa.
51. Uso según la reivindicación 50,
caracterizado porque la quinasa es elegida entre el
siguiente grupo de quinasas: AurA, AurB, Chk1, Dyrk1a, Ft13, FGFR1,
HGK, Ikkb, Jak2, KDR y SYK.
52. Una preparación farmacéutica que comprende,
entre otros componentes, una cantidad terapéuticamente efectiva de
un compuesto con cualesquiera de las fórmulas (III), (IV), (V),
(VI), (VII), (VIII), (IX), (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI) o
(XVIII), o una sal, solvato o prodroga farmacéuticamente aceptable
del mismo, junto con uno o más excipientes y diluyentes.
53. Uso de un compuesto de cualesquiera de las
fórmulas (I) o (II), según la reivindicación 1, o de las fórmulas
(X) o (XI) según la reivindicación 42, o una sal, solvato o
prodroga farmacéuticamente aceptable del mismo, en la manufactura de
un medicamento útil en el tratamiento del cáncer en un sujeto
diagnosticado de dicha enfermedad.
54. Uso según la reivindicación 53, donde el
sujeto es un ser humano.
55. Uso de un compuesto con cualquiera de las
fórmulas (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (XII),
(XIII), (XIV), (XV), (XVI) o (XVIII), o una sal, solvato o prodroga
farmacéuticamente aceptable del mismo, en la manufactura de un
medicamento útil en el tratamiento del cáncer en un sujeto
diagnosticado de dicha enfermedad.
56. Uso según la reivindicación 55, donde el
sujeto es un ser humano.
57. Uso de la preparación farmacéutica de la
reivindicación 40 para preparar un medicamento destinado a tratar
el cáncer en un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad.
58. Uso según la reivindicación 57, donde el
sujeto es un ser humano.
59. Uso de la preparación farmacéutica de la
reivindicación 52 para preparar un medicamento destinado a tratar
el cáncer en un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad.
60. Uso según la reivindicación 59, donde el
sujeto es un ser humano.
61. Uso de la preparación farmacéutica de la
reivindicación 40 para preparar un medicamento destinado a tratar
una enfermedad neurológica en un sujeto diagnosticado con dicha
enfermedad.
62. Uso según de la reivindicación 61, donde el
sujeto es un ser humano.
63. Uso de la preparación farmacéutica de la
reivindicación 52 para preparar un medicamento destinado a tratar
una enfermedad neurológica en un sujeto diagnosticado con dicha
enfermedad.
64. Uso según de la reivindicación 63, donde el
sujeto es un ser humano.
65. Uso de la preparación farmacéutica de la
reivindicación 40 para preparar un medicamento destinado a tratar
una enfermedad inflamatoria en un sujeto diagnosticado con dicha
enfermedad.
66. Uso según de la reivindicación 65, donde el
sujeto es un ser humano.
67. Uso de la preparación farmacéutica de la
reivindicación 52 para preparar un medicamento destinado a tratar
una enfermedad inflamatoria en un sujeto diagnosticado con dicha
enfermedad.
68. Uso según de la reivindicación 67, donde el
sujeto es un ser humano.
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